CN111208132B - 植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，主要包括植株花序处理、配置琼脂糖溶液、溶液水浴、低温琼脂糖固定对植株花序固定、观察等步骤。本测定技术制备的样品不需要对植物茎顶端分生组织进行物理切割，因此不会组织损伤而对实验结果产生影响；②本测定技术植株花序可以维持正常状态7h左右；这完全满足实验测定的需要，而且实验结果真实可靠；③本测定技术摆脱了共聚焦显微镜对实验的限制；在大大减少工作量的同时，节约了时间和经济成本。

Description

植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术
技术领域
本发明涉及植物茎顶端分生组织干细胞测定技术领域，尤其涉及植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术。
背景技术
植物由于组织细胞自身结构的原因，相对于动物学和微生物学发展一直比较缓慢。干细胞由于受时间和空间等条件的限制，科研进展尤为缓慢。研究更是随着生物科学和技术的不断创新，人们不再局限于利用生物学、生物化学、分子生物学等技术对植物干细胞的研究。交叉学科的应用大大推动了人们对植物干细胞的认知。利用力学对植物干细胞的研究就是其中的一个方向，这需要对植物干细胞区域的力学性能有比较清楚的认识。
传统测定植物茎顶端分生组织干细胞的方法是将干细胞进行荧光标记，然后利用切片机将整个顶端分生组织切下来，采用共聚焦显微镜和原子力显微镜联用的方法对顶端分生组织进行观察。但是，测定过程中植物茎顶端分生组织不能维持较长时间正常状态(植物茎顶端分生组织长时间的暴露在空气中容易发蔫，研究发现组织样品发蔫等产生质壁分离会导致实验测定结果偏小，因此不能长时间的测定。对整个顶端分生组织进行弹性模量测定需要至少需要2-3h)，只能进行局部区域位置点的测定，而不能对整个分生组织区域弹性模量的测定；再者，传统获取植物茎顶端分生组织表面信息的方式是转基因荧光标记法，而普通荧光标签在干细胞中信号表达很弱，转基因成功率不高，影响后续的实验观测。同时在切片制备过程中，茎顶端分生组织只有100μm，与其周围的附属器官大小很相近。需要在显微镜下筛选大量的切片，才能得到真正的且完整的茎顶端分生组织切片。实验过程中还需要用到激光共聚焦设备。这需要较高的时间和经济成本。基于此如何设计一种实验结果真实可靠、工作量小、成本低的植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术是本发明所要解决的技术问题。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种实验结果真实可靠、工作量小、成本低的植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，包括以下步骤：
a.将生长旺盛的植株花序摘下，在解剖镜下用镊子将中央顶端分生组织周围的花苞和花原基剥离干净，使顶端分生组织完全暴露出来；
b.在50mL离心管中配制琼脂糖溶液，然后将盛有琼脂糖溶液的离心管放入水浴锅中沸水浴20-30min，使胶状溶液变得透亮；
c.将盛有琼脂糖溶液的离心管从水浴锅中取出并转移到65℃恒温箱中放置，使琼脂糖溶液的温度降下并稳定到65℃；
d.将琼脂糖溶液倒入直径60mm的培养皿中，用镊子将步骤a处理过的植株花序垂直插入到琼脂糖溶液中，植株花序顶端露在琼脂糖溶液外，用镊子将植株花序固定在琼脂糖溶液中，待琼脂糖溶液冷却凝固后再将镊子移开，然后在胶上滴加3mL的1/2MS培养液；
e.使用金相显微镜对植株花序进行观察，拍摄照片记录顶端分生组织的位置；
f.观察后继续往培养皿中加入1/2MS培养液，使溶液完全将植株花序浸没，将培养皿放置到原子力显微镜样品台，在其光镜下找到样品的位置，根据金相显微镜所得的图象确定样品中顶端分生组织的位置，确定60×60μm的测定区域，然后利用水下测定模式对该区域进行测定。
优选的，所述的植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，步骤b中，配制的琼脂糖溶液为浓度17％的琼脂糖溶液。
优选的，所述的植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，步骤c中，盛有琼脂糖溶液的离心管在65℃恒温箱中放置时间为30min。
优选的，所述的植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，步骤e中，观察时，金相显微镜采用20倍镜。
本发明的优点在于：①本测定技术制备的样品不需要对植物茎顶端分生组织进行物理切割，因此不会组织损伤而对实验结果产生影响；②本测定技术利用琼脂糖固定并浸泡在1/2MS培养液中，花序可以维持正常状态7h左右；这完全满足实验测定的需要，而且实验结果真实可靠；③本测定技术利用解剖镜显微操作，只需要将处于花序中央位置的分生组织完全暴露出来即可，不需要制备成切片；利用金相显微镜反射光成像原理进行三维景深拍摄方法就可以获取分生组织表面信息，从而摆脱了共聚焦显微镜对实验的限制；在大大减少工作量的同时，节约了时间和经济成本。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，包括以下步骤：
a.将生长旺盛的植株花序摘下，在解剖镜下用镊子将中央顶端分生组织周围的花苞和花原基剥离干净，使顶端分生组织完全暴露出来；
注意，为了方便处理，避免损坏分生组织，处理时，选用尖端较细的镊子；
b.在50mL离心管中配制低温琼脂糖溶液，然后将盛有低温琼脂糖溶液的离心管放入水浴锅中沸水浴20-30min，使胶状溶液变得透亮；
c.将盛有琼脂糖溶液的离心管从水浴锅中取出并转移到65℃恒温箱中放置，使琼脂糖溶液的温度降下并稳定到65℃；
d.将琼脂糖溶液倒入直径60mm的培养皿中，用镊子将步骤a处理过的植株花序垂直插入到琼脂糖溶液中，植株花序顶端露在琼脂糖溶液外，用镊子将植株花序固定在琼脂糖溶液中，待琼脂糖溶液冷却凝固后再将镊子移开，然后在胶上滴加3mL的1/2MS培养液，
注意，滴加3mL的1/2MS培养液时，切勿让溶液浸没过植株花序顶端；
e.使用金相显微镜对植株花序进行观察，拍摄照片记录顶端分生组织的位置；
f.观察后继续往培养皿中加入1/2MS培养液，使溶液完全将植株花序浸没，将培养皿放置到原子力显微镜样品台，在其光镜下找到样品的位置，根据金相显微镜所得的图象确定样品中顶端分生组织的位置，确定60×60μm的测定区域，然后利用水下测定模式对该区域进行测定。
优选的，步骤b中，配制的低温琼脂糖溶液为浓度17％的低温琼脂糖溶液。
优选的，步骤c中，盛有琼脂糖溶液的离心管在65℃恒温箱中放置时间为30min。
优选的，步骤e中，观察时，金相显微镜采用20倍镜。
①本测定技术制备的样品不需要对植物茎顶端分生组织进行物理切割，因此不会组织损伤而对实验结果产生影响；②本测定技术利用低温琼脂糖固定并浸泡在1/2MS培养液中的花序可以维持正常状态7h左右；这完全满足实验测定的需要，而且实验结果真实可靠；③本测定技术利用解剖镜显微操作，只需要将处于花序中央位置的分生组织完全暴露出来即可，不需要制备成切片；利用金相显微镜反射光成像原理进行三维景深拍摄方法就可以获取分生组织表面信息，从而摆脱了共聚焦显微镜对实验的限制；在大大减少工作量的同时，节约了时间和经济成本。
需要说明的是，在本文中，如若存在第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，其特征在于，包括以下步骤：
a.将生长旺盛的植株花序摘下，在解剖镜下用镊子将中央顶端分生组织周围的花苞和花原基剥离干净，使顶端分生组织完全暴露出来；
b.在50mL离心管中配制琼脂糖溶液，然后将盛有琼脂糖溶液的离心管放入水浴锅中沸水浴20-30min，使胶状溶液变得透亮；
c.将盛有琼脂糖溶液的离心管从水浴锅中取出并转移到65℃恒温箱中放置，使琼脂糖溶液的温度降下并稳定到65℃；
d.将琼脂糖溶液倒入直径60mm的培养皿中，用镊子将步骤a处理过的植株花序垂直插入到琼脂糖溶液中，植株花序顶端露在琼脂糖溶液外，用镊子将植株花序固定在琼脂糖溶液中，待琼脂糖溶液冷却凝固后再将镊子移开，然后在胶上滴加3mL的1/2MS培养液；
e.使用金相显微镜对植株花序进行观察，拍摄照片记录顶端分生组织的位置；
f.观察后继续往培养皿中加入1/2MS培养液，使溶液完全将植株花序浸没，将培养皿放置到原子力显微镜样品台，在其光镜下找到样品的位置，根据金相显微镜所得的图象确定样品中顶端分生组织的位置，确定60×60μm的测定区域，然后利用水下测定模式对该区域进行测定。
2.根据权利要求1所述的植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，其特征在于：步骤b中，配制的琼脂糖溶液为浓度17％的琼脂糖溶液。
3.根据权利要求1所述的植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，其特征在于：步骤c中，盛有琼脂糖溶液的离心管在65℃恒温箱中放置时间为30min。
4.根据权利要求1所述的植物茎顶端分生组织干细胞弹性模量测定技术，其特征在于：步骤e中，观察时，金相显微镜采用20倍镜。
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