CN109827890A - 利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置及其方法，该装置中倒置生物显微镜的操作平台上放置培养皿，超声聚焦换能器探头的前端从上方侵入培养皿内的液体中，函数发生器、RF功率放大器和超声聚焦换能器依次连接，倒置生物显微镜上还设置有连接了电脑的相机；本发明中使用超声聚焦换能器对细胞进行作用，超声聚焦换能器可以产生声辐射力，由于声辐射力小，可以减少细胞损伤，声辐射力作用于单细胞，随着输出端电压的增加，细胞变形更加明显，利用亮场成像监测细胞的形态变化，通过成像软件在电脑上观察其形变过程，实现了非接触式单声束测试方法，本发明中的装置体积小，成本低，操作简单。
Description
技术领域
本发明属于细胞力学测试技术领域，特别涉及一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置及其方法。
背景技术
生物细胞力学特性的研究成为了近年来声学领域一个新的研究热点，尤其是在癌细胞的力学特性研究方面，因为细胞力学特性的变化往往会与相关疾病的发生有着紧密的联系，所以，单个细胞力学性质的研究可能可以检测和识别少量的非正常细胞并为恶性疾病的早期诊断提供一种潜在的方法，因此这是一个很有应用前景的研究项目。在之前的细胞力学特性研究中，主要采用了微吸管法、原子力显微镜(AFM)、光镊子和磁镊子等几种方法。微吸管法是一种简单的测量单个细胞力学特性的方法，将具有几毫米内径的玻璃管一端加热，并通过抽拉装置，制成微米级的尖端，然后插在细胞培养室中，利用负压部分或全部把细胞吸入微吸管中，从而评价细胞的力学特性。但该方法有一个弊端就是在微吸管边缘存在应力集中，很容易导致细胞膜损坏。AFM使用纳米探针可以测量细胞的局部刚性，但仅限于测量杨氏模量大于50pa的细胞力学。它的缺点之一是需要探针与细胞接触，容易损坏细胞，此外，为了获得可靠的结果，需要与周围振动隔离。光镊子能够将一个单细胞困在聚焦紧密的激光束中对其施加力的作用，但是，它们可能会由于应用激光引起的温度上升而导致细胞损坏。此外，光镊子产生的力仅限于皮牛顿力范围，而且成本高，大体积也决定了应用的不便。磁镊子也是探测细胞力学特性一种很有前景的方法。利用该技术，可以量化细胞的复弹性模量，测量细胞的局部粘弹性。但这种方法一个主要的缺点就是，需要把不同直径的球形磁珠粘附在细胞的细胞质中，才能实施测量，这样一来细胞结构也容易遭到破坏。除此之外，在声学中，利用超声波技术来测量细胞力学特性，之前有研究提出一种将一个5μm纤维连接蛋白涂层的聚苯乙烯微珠吸附在目标细胞上，然后利用声镊子形成的势阱捕获微珠将其拉出，达到拉伸细胞膜的目的，从而测量出细胞的弹性性质。但这一方法也有一些局限性，这需要将微珠均匀地附着到目标细胞上，而且涂抹纤维蛋白的微珠与细胞膜之间的黏连性要远远大于细胞膜的张力，操作起来极不方便，而且成功率很低。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置及其方法，该装置及方法在倒置生物显微镜的操作平台上，采用超声聚焦换能器对生物细胞施加声辐射力的作用，并通过显微镜观察细胞的变形情况，测试细胞的力学特性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，包括函数发生器、RF功率放大器、超声聚焦换能器和倒置生物显微镜，所述倒置生物显微镜的操作平台上放置培养皿，所述超声聚焦换能器探头的前端从上方侵入培养皿内的液体中，所述函数发生器的信号输出端连接到RF功率放大器的进口端，RF功率放大器的出口端再连接到超声聚焦换能器上，所述倒置生物显微镜上还设置有连接了电脑的相机，其中：
所述函数发生器发出的信号经RF功率放大器放大后传递至超声聚焦换能器上，所述超声聚焦换能器的声辐射力对培养皿中单个细胞进行作用，所述倒置生物显微镜用于获取细胞图像，相机将获取的细胞图像传递至电脑。
所述超声聚焦换能器通过XYZ三维定位器控制位置。
所述超声聚焦换能器探头的前端与培养皿内的液面呈75°角。
所述函数发生器的输出频率为28MHz，输出电压从0-20mV。
所述RF功率放大器的频率范围是300kHz-350MHz，功率增益为55dB。
所述超声聚焦换能器的直径为5mm，声波聚焦焦距为10mm，中心频率是28±1MHz。
所述倒置生物显微镜的操作平台上方为显微镜光源，操作平台下方为显微镜物镜；优选地，所述显微镜物镜为40X物镜。
一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的方法，函数发生器发出的信号经RF功率放大器放大后传递至超声聚焦换能器上，超声聚焦换能器的声辐射力对培养皿中的细胞进行作用，倒置生物显微镜获取细胞图像，图像经相机传递至电脑成像，并描绘细胞的边界，从而计算细胞的面积和细胞变形性D；计算细胞变形性D采用以下公式：
其中，Aforce表示细胞受到声辐射力作用后形变的面积；Abefore_force表示细胞未受到声辐射力原来的面积。
所述函数发生器的输出电压以1mV为间隔从0增加至20mV，而后再回到0mv。
所述超声聚焦换能器置于培养皿之前，采用70％的乙醇对超声聚焦换能器的前端进行灭菌消毒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明中使用超声聚焦换能器对目标细胞进行作用时，超声聚焦换能器可以产生声辐射力，由于声辐射力小，可以减少细胞损伤，声辐射力作用于单细胞，随着输出端电压的增加，细胞变形更加明显，利用亮场成像监测其细胞的形态变化，通过成像软件在电脑上观察其形变过程，实现了非接触式单声束测试方法，可以更好地理解声辐射力和细胞变形程度之间的关系，本发明中的装置体积小，成本低，操作简单。
附图说明
图1是本发明的实验装置示意图；
图2是实验中输入不同电压时正常肾细胞(Nephrocyte_HK-2)的变形情况结构图；
图3是实验中输入不同电压时肾癌细胞(Renca_769-p)的变形情况结构图；
图4是实验中输入不同电压时肾癌细胞(Renca_786-0)的变形情况结构图；
图5是实验中输入不同电压时肾癌细胞(Renca_ACHN)的变形情况结构图；
其中：1-函数发生器，2-RF功率放大器，3-显微镜光源，4-相机，5-电脑，6-XYZ三维定位器， 7-超声聚焦换能器，8-培养皿，9-操作平台，10-细胞，11-显微镜物镜。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
如图1所示，一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，包括函数发生器1、RF功率放大器2、超声聚焦换能器7和倒置生物显微镜，所述倒置生物显微镜的操作平台上方为显微镜光源3，操作平台9下方为显微镜物镜11；优选地，所述显微镜物镜11为40X物镜；所述倒置生物显微镜的操作平台9上放置培养皿8，所述超声聚焦换能器7探头的前端从上方侵入培养皿8内的液体中，所述函数发生器1的信号输出端连接到RF功率放大器2的进口端，RF功率放大器2的出口端再连接到超声聚焦换能器7上，所述倒置生物显微镜上还设置有连接了电脑5的相机4，其中：所述函数发生器1发出的信号经RF功率放大器2放大后传递至超声聚焦换能器7上，所述超声聚焦换能器 7的声辐射力对培养皿8中单个细胞进行作用，所述倒置生物显微镜用于细胞形变过程的全程跟踪和图像记录，相机将获取的细胞10图像传递至电脑5成像。
所述超声聚焦换能器7的位置由XYZ三维定位器6调控，XYZ三维定位器6的功能为从XYZ三个方向上调节超声聚焦换能器7的位置，使得超声聚焦换能器7探头的前端从上方倾斜插入操作平台 9上培养皿8的液体中，并作用于单个细胞10，倾斜角度约为75°，即超声聚焦换能器7与培养皿 8内的液面呈75°角，如此设置，可以有效地防止上方的显微镜光源3被超声聚焦换能器7遮挡而影响观测细胞10，使显微镜光源3可以完全照射到细胞10上。
具体地讲，为了更好地观察细胞的形变现象，实验中函数发生器1选择的输出频率为28MHz，输出电压以1mV间隔从0缓慢增加到20mV，而后又慢慢回到0mv；所述RF功率放大器2的频率范围是300kHz-350MHz，功率增益为55dB；所述超声聚焦换能器7的直径为5mm，声波聚焦焦距为10mm，中心频率是28±1MHz。
所述超声聚焦换能器7产自于美国的Bltek公司，产品型号为AT28910，所述函数发生器1的产品型号为安捷伦33250A，所述RF功率放大器2的型号为A300，所述倒置生物显微镜的产品型号为麦克奥迪AE2000，所述相机4的产品型号为Moticam。
一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的方法中，超声聚焦换能器的原理是单束高频换能器在其焦点处对单个细胞施加力的作用，采用非接触式测试，根据输入电压的不同，测试细胞对应的形变量，具体地讲，在测试实验前，采用70％乙醇对超声聚焦换能器的前端进行灭菌消毒，并从培养室中取出装在培养皿中的细胞样品，测试实验中，把不同的细胞样品逐一放到操作平台上的培养皿中，培养皿中加满液体，通过XYZ三维定位器把超声聚焦换能器移到操作平台上方，然后慢慢靠近培养皿，超声聚焦换能器探头的前端要浸入液体，最终调节超声聚焦换能器的方位，使得超声聚焦换能器探头的前端与培养皿内液面呈75°角，函数发生器安捷伦33250A的信号经RF功率放大器 A300，频率范围：300kHz到35MHz，功率增益：55dB放大后传递至超声聚焦换能器AT28910,Bltek, Inc.USA，直径大小为5mm，焦距约为10mm，中心频率约为28MHz，超声聚焦换能器的声辐射力对培养皿中的细胞进行作用，为了更好地观察细胞的形变现象，函数信号发生器的输出频率要求调节到和超声聚焦换能器的中心频率一致为28MHz；为了保证在整个实验过程中细胞的活性，一方面，控制电压的输出，同时也为了保证超声聚焦换能器的安全，采取输出电压最大值为20mV，具体方式为：函数信号发生器的输出电压端以1mV间隔，从0缓慢增加到20mV，然后又从20mV慢慢减小到0mV；另一方面，细胞的生长是在培养室中进行的，测试实验时，细胞要脱离培养室环境，整个测试实验要求在无尘恒温37℃环境中进行，实验环境尽量做到恒温无尘，定期杀菌消毒；为了更好地观察细胞的形变现象，操作人员可以通过装有40X物镜的倒置生物显微镜麦克奥迪AE2000观察细胞的变形情况，也可以通过倒置生物显微镜上方右侧的相机Moticam记录图像，相机Moticam将图像传递至电脑，再通过操作成像软件本实验使用Moticimages plus 2.0，即可在电脑中观测到细胞图形，从实验过程可以清楚地看到，随着电压的增加，细胞外形开始缓慢变大，表面积逐渐增加，一直增加到电压最大值为止；然后随着电压缓慢减小到零时，细胞的形状也慢慢地缩小到起始状态。图2为正常肾细胞Nephrocyte_HK-2在不同输出电压情况下的形变过程，图3-5分别为肾癌细胞 Renca_769-P、Renca_786-0和Renca_ACHN在不同输出电压情况下的形变过程，细胞的形变过程清晰直观。此外，采用Photoshop软件可以描绘细胞的边界，计算细胞面积，进而采用以下公式计算细胞变形性D：
其中，Aforce表示细胞受到声辐射力作用后形变的面积；Abefore_force表示细胞未受到声辐射力原来的面积。
采用上述方法，分别对正常肾细胞Nephrocyte_HK-2和肾癌细胞769-P、786-O、ACHN进行力学特性测试，用Photoshop软件描绘正常肾细胞Nephrocyte_HK-2和肾癌细胞769-P、786-O、ACHN的边界，采用多次测量取平均的方法计算其面积，进而可得出细胞的变形量，测试结果如表格1和2。正常细胞和肾癌细胞由南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科提供。
表1细胞在不同输出电压时的面积
注：图片的长宽是300像素*300像素，细胞的面积单位是平方像素
表2细胞在不同输出电压时的形变量
如图2-5所示，输入不同电压时正常肾细胞Nephrocyte_HK-2和肾癌细胞769-P、786-O、ACHN 的变形情况，观察Renca_769-P肾细胞腺癌细胞、Renca_786-O肾透明细胞癌细胞、Renca_ACHN转移灶肾癌细胞和Nephrocyte_HK-2肾小管上皮细胞四种细胞的变形能力，随着电压的增加，细胞外形开始缓慢变大，表面积逐渐增加，一直增加到电压最大值为止；然后随着电压缓慢减小到零时，细胞的形状也慢慢地缩小到起始状态。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于：包括函数发生器、RF功率放大器、超声聚焦换能器和倒置生物显微镜，所述倒置生物显微镜的操作平台上放置培养皿，所述超声聚焦换能器探头的前端从上方侵入培养皿内的液体中，所述函数发生器的信号输出端连接到RF功率放大器的进口端，RF功率放大器的出口端再连接到超声聚焦换能器上，所述倒置生物显微镜上还设置有连接了电脑的相机，其中：
所述函数发生器发出的信号经RF功率放大器放大后传递至超声聚焦换能器上，所述超声聚焦换能器的声辐射力对培养皿中单个细胞进行作用，所述倒置生物显微镜用于获取细胞图像，相机将获取的细胞图像传递至电脑。
2.根据权利要求1所述的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于：所述超声聚焦换能器通过XYZ三维定位器控制位置。
3.根据权利要求1所述的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于：所述超声聚焦换能器探头的前端与培养皿内的液面呈75°角。
4.根据权利要求1所述的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于：所述函数发生器的输出频率为28MHz，输出电压从0-20mV。
5.根据权利要求1所述的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于：所述RF功率放大器的频率范围是300kHz-350MHz，功率增益为55dB。
6.根据权利要求1所述的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于：所述超声聚焦换能器的直径为5mm，声波聚焦焦距为10mm，中心频率是28±1MHz。
7.根据权利要求1所述的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于：所述倒置生物显微镜的操作平台上方为显微镜光源，操作平台下方为显微镜物镜，所述显微镜物镜为40X物镜。
8.一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的方法，其特征在于：函数发生器发出的信号经RF功率放大器放大后传递至超声聚焦换能器上，超声聚焦换能器的声辐射力对培养皿中的细胞进行作用，倒置生物显微镜获取细胞图像，图像经相机传递至电脑成像，并描绘细胞的边界，从而计算细胞的面积和细胞变形性D；计算细胞变形性D采用以下公式：
其中，Aforce表示细胞受到声辐射力作用后形变的面积；Abefore_force表示细胞未受到声辐射力原来的面积。
9.根据权利要求8所述的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的方法，其特征在于：所述函数发生器的输出电压以1mV为间隔从0增加至20mV，而后再回到0mv。
10.根据权利要求8所述的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的方法，其特征在于：所述超声聚焦换能器置于培养皿之前，采用70％的乙醇对超声聚焦换能器的前端进行灭菌消毒。
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