CN114441412A - 利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置及测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置及测试方法，所述装置，包括超声模块、测试模块和分析模块；所述测试模块包括倒置生物显微镜，细胞培养皿可移动地放置于操作平台上，沿操作平台中垂线上方设置有自上而下的照射光源，下方设置有与分析模块相连的镜筒；所述超声模块与超声聚焦换能器连接；所述超声聚焦换能器前端探头由操作平台上方倾斜浸入培养皿中；所述分析模块从镜筒中采集图像，并实现图像信号实时动态采集和处理；通过超声模块驱动超声聚焦换能器，产生声辐射力，捕获细胞培养皿中的目标细胞，并对目标细胞施加力的作用，由分析模块捕捉并提取细胞形变图像，并绘制细胞边界图，进而计算出细胞形变量。
Description
技术领域
本发明涉及细胞力学测试技术领域，主要涉及利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置及测试方法。
背景技术
生物细胞力学特性的研究成为了近年来声学领域一个新的研究热点，尤其是在癌细胞的力学特性研究方面，因为细胞力学特性的变化往往会与相关疾病的发生有着紧密的联系，所以，单个细胞力学性质的研究可能可以检测和识别少量的非正常细胞并为恶性疾病的早期诊断提供一种潜在的方法，因此这是一个很有应用前景的研究项目。在之前的细胞力学特性研究中，主要采用了微吸管法、原子力显微镜(AFM)、光镊子和磁镊子等几种方法。微吸管法是一种简单的测量单个细胞力学特性的方法，将具有几毫米内径的玻璃管一端加热，并通过抽拉装置，制成微米级的尖端，然后插在细胞培养室中，利用负压部分或全部把细胞吸入微吸管中，从而评价细胞的力学特性。但该方法有一个弊端就是在微吸管边缘存在应力集中，很容易导致细胞膜损坏。AFM使用纳米探针可以测量细胞的局部刚性，但仅限于测量杨氏模量大于50pa的细胞力学。它的缺点之一是需要探针与细胞接触，容易损坏细胞，此外，为了获得可靠的结果，需要与周围振动隔离。光镊子能够将一个单细胞困在聚焦紧密的激光束中对其施加力的作用，但是，它们可能会由于应用激光引起的温度上升而导致细胞损坏。此外，光镊子产生的力仅限于皮牛顿力范围，而且成本高，大体积也决定了应用的不便。磁镊子也是探测细胞力学特性一种很有前景的方法。利用该技术，可以量化细胞的复弹性模量，测量细胞的局部粘弹性。但这种方法一个主要的缺点就是，需要把不同直径的球形磁珠粘附在细胞的细胞质中，才能实施测量，这样一来细胞结构也容易遭到破坏。除此之外，在声学中，还可利用超声波技术来测量细胞力学特性，现有技术中提出一种将一个5μm纤维连接蛋白涂层的聚苯乙烯微珠吸附在目标细胞上，然后利用声镊子形成的势阱捕获微珠将其拉出，达到拉伸细胞膜的目的，从而测量出细胞的弹性性质。但这一方法也有局限性，这要将微珠均匀地附着到目标细胞上，而且涂抹纤维蛋白的微珠与细胞膜之间的黏连性要远远大于细胞膜的张力，操作起来极不方便，而且成功率很低。
中国专利号CN101313196A公开了利用空间调制的光学力显微术检测细胞变形性的设备和方法，包括：低相干光源；全息光肼装置，物镜，显微镜，激光衰减器等。该方法只能实现对黏附细胞的变形性定量检测，不能实现对悬浮生物细胞的自动捕获和受力变形检测，而且光学力热效应明显容易损伤细胞。
2016年，JaeYoun Hwang等人在Scientificreports的Cell Deformation bySingle-beam Acoustic Trapping:A Promising Tool for Measurements of CellMechanics文章中，将超声换能器引入测试细胞力学特性中，方案中换能器探头采用自上垂直放置，探头与汞灯光源分别位于细胞操作平台上下两侧，照明光路为自行搭建，采用自下而上方式，仪器设备需借助于光学操作平台搭建，该方案成本较高、体积大、结构笨重且较复杂。
发明内容
发明目的：针对上述背景技术中存在的问题，本发明提供了一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置及测试方法。该装置及测试方法基于商用的倒置生物显微镜，结构简单，优化了平台搭建，采用了超声聚焦换能器探头与液面倾斜角度设计，实现对生物细胞的捕获和力的作用，并通过计算机软件自动提取细胞的变形图像，测试出细胞的变形量。超声聚焦换能器产生的声辐射力小，热效应不明显，可减少对细胞的损伤，实现了非接触式无损单声束测试方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，包括超声模块、测试模块和分析模块；所述测试模块包括倒置生物显微镜，细胞培养皿可移动地放置于操作平台上，沿操作平台中垂线上方设置有自上而下的照射光源，下方设置有与分析模块相连的镜筒；所述超声模块与超声聚焦换能器连接；所述超声聚焦换能器前端探头由操作平台上方倾斜浸入培养皿中；所述分析模块从镜筒中采集图像，并实现图像信号实时动态采集和处理。
进一步地，所述超声聚焦换能器与培养皿液面的倾斜角θ满足0°＜θ＜90°。
进一步地，所述超声聚焦换能器与培养皿液面的倾斜角θ采用XYZ三维定位器控制。
进一步地，所述超声模块输出调制脉冲信号，频率与超声聚焦换能器中心频率一致，输出电压范围0-20mV。
进一步地，所述镜筒采用40X倍物镜头。
采用上述生物细胞力学特性测试装置的测试方法，采用XYZ三维定位器将超声聚焦换能器从操作台上方倾斜插入细胞培养皿中，所述超声模块输出调制脉冲信号，驱动超声聚焦换能器产生声辐射力，捕获细胞培养皿中的目标细胞，并对目标细胞施加力的作用；分析模块通过镜筒实时监测并采集培养皿中细胞的形态变化，基于自编程序提取细胞形变图像，并绘制细胞边界图，进而计算出细胞形变量，实现图像信号的动态采集和处理。
进一步地，所述超声聚焦换能器与培养皿液面的倾斜角θ计算方法如下：
其中，D为超声聚焦换能器直径，F为声聚焦焦距；倾斜角度θ优选75°。
进一步地，所述超声模块输出电压最大值为20mV；输出电压首先以匀速从0mV增加至20mV，随后从20mV匀速降低至0mV，实现循环。
有益效果：
本发明中使用斜置的超声聚焦换能器对目标细胞进行作用时，超声聚焦换能器可以产生声辐射力，实现对目标细胞的捕获和作用。在商用的倒置生物显微镜的操作平台上，探头从斜上方浸入培养皿时，采取倾斜方位设计，换能器的倾斜角度由XYZ三维定位器调控，利用其产生的声辐射力捕获生物细胞并对其进行力的作用，可以避免光路的影响。由于声辐射力小，热效应小，可以减少细胞损伤，且随着超声模块输出的脉冲信号变化，细胞的外形也发生变化。利用商用的倒置生物显微镜成像监测其细胞的形态变化，通过计算机自编程序对图像信号实时动态采集和处理，实现了非接触式无损单声束测试细胞方法，可以更好地理解声辐射力和细胞变形程度之间的关系，本发明中的装置体积小、成本低、易操作、实验精度高。
附图说明
图1是本发明提供的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置结构示意图；
图2是本发明提供的XYZ三维定位器示意图；
图3是本发明提供的超声聚焦换能器倾斜设计方法示意图；
图4是本发明实施例中测试正常肾细胞HK-2的细胞形变示意图；
图5是本发明实施例中测试肾癌细胞769-P的细胞形变示意图；
图6是本发明实施例中测试肾癌细胞786-0的细胞形变示意图；
图7是本发明实施例中测试肾癌细胞ACHN的细胞形变示意图。
附图标记说明：
1-超声模块；2-测试模块；3-分析模块；2-1-照射光源；2-2-XYZ三维定位器；2-3-超声聚焦换能器；2-4-操作平台；2-5-细胞培养皿；2-6-镜筒；2-7-生物细胞；
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置具体结构如图1所示，包括超声模块1、测试模块2和分析模块3。测试模块2主体部分为倒置的商用望远镜。其中细胞培养皿2-5可移动地放置于操作平台2-4上。沿操作平台中垂线上方设置有自上而下的照射光源2-1，下方设置有与分析模块相连的镜筒2-6；优选地，本实施例采用的商用倒置生物显微镜物镜为40X倍物镜头。超声模块1与超声聚焦换能器2-3连接，超声聚焦换能器前端探头由操作平台上方倾斜浸入培养皿中。
声聚焦换能器的原理是单束高频换能器在其焦点处捕获单个细胞并对其施加力的作用，采用非接触式测试，根据输入电压的不同，测试细胞对应的形变量。本发明中超声聚焦换能器2-3采用XYZ三维定位器2-2控制，具体定位器结构如图2所示，超声聚焦换能器2-3前段探头从上方倾斜插入位于操作平台2-4上的细胞培养皿2-5中，捕获目标细胞2-7后并对其施加力的作用。
为了避免对垂直光源2-1的影响，本实施例中超声聚焦换能器与培养皿液面的倾斜角θ满足0°＜θ＜90°。具体计算方法如图3所示：
其中，D为超声聚焦换能器直径，F为声聚焦焦距；本实验中经计算倾斜角θ为75°最佳。
超声模块1与超声聚焦换能器2-3相连，输出调制脉冲信号，驱动超声聚焦换能器产生声辐射力，捕获细胞培养皿中的目标细胞，并对目标细胞施加力的作用；分析模块3通过镜筒实时监测并采集培养皿中细胞的形态变化，基于自编程序提取细胞形变图像，并绘制细胞边界图，进而计算出细胞形变量，实现图像信号的动态采集和处理。
本实施例中采用的超声聚焦换能器2-3产自于美国的Bltek公司，产品型号为AT28910，直径为5mm，超声波聚焦焦距为10mm，中心频率是28±1MHz；采用的商用倒置生物显微镜产品型号为中国产的麦克奥迪AE2000。分析模块3中计算机图像处理软件为Moticimages plus 2.0。
下面具体给出测试方法即实验结果分析。
测试实验前，采用75％以上乙醇对超声聚焦换能器的前端进行灭菌消毒，并从培养室中取出装在培养皿中的细胞样品。测试实验中，把装有不同细胞样品的培养皿逐一放到操作平台上，通过XYZ三维定位器把超声聚焦换能器移到操作平台上方，然后慢慢靠近培养皿，超声聚焦换能器探头的前端要浸入液面，最终调节超声聚焦换能器的方位，使得超声聚焦换能器探头的前端与培养皿内液面呈75°角，超声模块1产生脉冲信号驱动超声聚焦换能器，超声聚焦换能器产生声辐射力捕获培养皿中的目标细胞并对其施加力的作用。为了保证在整个实验过程中细胞的活性，一方面，控制电压的输出，同时也为了保证超声聚焦换能器的安全，超声模块产生的脉冲信号输出电压最大值为20mV，具体方式为：输出电压端以1mV间隔，从0缓慢增加到20mV，然后又从20mV慢慢减小到0mV。此外，由于细胞的生长是在培养室中进行的，测试实验时，细胞要脱离培养室环境，整个测试实验要求在无尘恒温(37摄氏度)环境中进行，实验环境尽量做到恒温无尘，定期杀菌消毒。为了更好地观察细胞的形变现象，操作人员通过装有40X以上物镜的商用的倒置生物显微镜观察细胞的变形情况，分析模块利用计算机软件(本实验使用Motic images plus 2.0)提取细胞形变图像，描绘出细胞的边界，从而计算出细胞的变形量，实现图像信号实时动态采集和处理。
从实验过程可以清楚地看到，随着电压的增加，细胞外形开始缓慢变大，表面积逐渐增加，一直增加到电压最大值为止；然后随着电压缓慢减小到零时，细胞的形状也慢慢地缩小到起始状态。图3为正常肾细胞(Nephrocyte_HK-2)在不同输出电压情况下的形变过程，图4-图6分别为肾癌细胞769-P、786-0和ACHN在不同输出电压情况下的形变过程，细胞的形变过程清晰可见。利用计算机软件自动提取图像并描绘出细胞的边界，计算出细胞的变形量。
采用上述方法，分别对正常肾细胞(Nephrocyte_HK-2)和肾癌细胞(769-P、786-O、ACHN)进行力学特性测试，利用自编程序自动描绘正常肾细胞(Nephrocyte_HK-2)和肾癌细胞(769-P、786-O、ACHN)的边界，实现对图像的自动采集、分析及处理，实时给出细胞外形面积和变形量，测试结果分别如下表1和表2所示。
表1不同细胞在不同输出电压时的面积
注：图片的长宽是(300像素*300像素)，细胞的面积单位是平方像素。
表2不同细胞在不同输出电压时的形变量
本实验中研究了三种恶性程度依次增强的肾癌细胞(769-P、786-O、ACHN)和一种正常的肾细胞(HK-2)。观察769-P(肾细胞腺癌细胞)、786-O(肾透明细胞癌细胞)、ACHN(转移灶肾癌细胞)和HK-2(肾小管上皮细胞)四种细胞的变形能力，正常细胞和肾癌细胞由南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科提供。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于，包括超声模块、测试模块和分析模块；所述测试模块包括倒置生物显微镜，细胞培养皿可移动地放置于操作平台上，沿操作平台中垂线上方设置有自上而下的照射光源，下方设置有与分析模块相连的镜筒；所述超声模块与超声聚焦换能器连接；所述超声聚焦换能器前端探头由操作平台上方倾斜浸入培养皿中；所述分析模块从镜筒中采集图像，并实现图像信号实时动态采集和处理。
2.根据权利要求1所述的一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于，所述超声聚焦换能器与培养皿液面的倾斜角θ满足0°＜θ＜90°。
3.根据权利要求2所述的一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于，所述超声聚焦换能器与培养皿液面的倾斜角θ采用XYZ三维定位器控制。
4.根据权利要求1所述的一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于，所述超声模块输出调制脉冲信号，频率与超声聚焦换能器中心频率一致，输出电压范围0-20mV。
5.根据权利要求1所述的一种利用声辐射力测试生物细胞力学特性的装置，其特征在于，所述镜筒采用40X倍物镜头。
6.一种利用权利要求1-5中任一项所述生物细胞力学特性测试装置的测试方法，其特征在于，采用XYZ三维定位器将超声聚焦换能器从操作台上方倾斜插入细胞培养皿中，所述超声模块输出调制脉冲信号，驱动超声聚焦换能器产生声辐射力，捕获细胞培养皿中的目标细胞，并对目标细胞施加力的作用；分析模块通过镜筒实时监测并采集培养皿中细胞的形态变化，基于自编程序提取细胞形变图像，并绘制细胞边界图，进而计算出细胞形变量，实现图像信号的动态采集和处理。
7.根据权利要求6所述的生物细胞力学特性测试方法，其特征在于，所述超声聚焦换能器与培养皿液面的倾斜角θ计算方法如下：
其中，D为超声聚焦换能器直径，F为声聚焦焦距；倾斜角度θ优选75°。
8.根据权利要求6所述的生物细胞力学特性测试方法，其特征在于，所述超声模块输出电压最大值为20mV；输出电压首先以匀速从0mV增加至20mV，随后从20mV匀速降低至0mV，实现循环。
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2022
- 2022-01-26 CN CN202210094933.6A patent/CN114441412A/zh active Pending
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