EA014900B1 - Композиции и способы контроля специфичности передачи сигналов, опосредуемой тканевым фактором - Google Patents
Композиции и способы контроля специфичности передачи сигналов, опосредуемой тканевым фактором Download PDFInfo
- Publication number
- EA014900B1 EA014900B1 EA200801276A EA200801276A EA014900B1 EA 014900 B1 EA014900 B1 EA 014900B1 EA 200801276 A EA200801276 A EA 200801276A EA 200801276 A EA200801276 A EA 200801276A EA 014900 B1 EA014900 B1 EA 014900B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- tissue factor
- antibodies
- binding
- signal transmission
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Предложены композиции и способы лечения заболевания, зависящего от передачи сигнала через тканевый фактор/фактор VIIa, у субъекта, относящегося к млекопитающим. Указанные способы включают введение ингибитора передачи сигнала через тканевый фактор субъекту, относящемуся к млекопитающим. Указанный ингибитор эффективен в снижении числа новых случаев заболевания у субъекта, относящегося к млекопитающим. Также предложены способы скрининга для выявления модуляторов передачи сигнала через тканевый фактор/фактор VIIa.
Description
Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США, серийный номер 60/734,149 (поданной 7 ноября, 2005). Описание приоритетной заявки полностью включено в данную заявку посредством ссылки для любых целей.
Указание правительственной поддержки
Настоящее изобретение было осуществлено при поддержке правительства в рамках грантов №№ НБ60472, НЬ31950, и НЬ16411 Национального института сердца, легких и крови. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.
Область изобретения
Настоящее изобретение в целом относится к композициям и способам лечения заболевания, зависящего от передачи сигнала через тканевый фактор/фактор свертывания крови УПа (ТЕ/У11а), у субъекта, относящегося к млекопитающим. Указанные способы включают введение субъекту, относящемуся к млекопитающим, ингибитора передачи сигналов через тканевый фактор. Указанный ингибитор эффективно снижает количество случаев заболевания или исключает их, или предотвращает возникновение или рецидив, не нарушая гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим.
Уровень техники
Ферментативный комплекс рецептора клеточной поверхности - тканевого фактора (ТЕ) - с сериновой протеазой, фактором УПа, активирует физиологический гемостаз и сертывание крови и одновременно запускает активируемую протеазой передачу сигнала через рецептор при воспалении, прогрессировании опухоли и ангиогенезе. Масктап, Апетюзс1ет. ТНготЬ. Уазе. ΒίοΙ. 24: 1015-1022, 2004; Клехта1й и Ви!, С’гй. Саге 7: 123-129, 2003; ВеШпд и др., Ат1егюзс1ег. ТНготЬ. Уазе. Βίο1. 25: 1545-1550, 2005). Каким образом предшествующие пути передачи сигнала напрямую через ТЕ-УИа определяют патологию, без подавления нарабатываемыми в большом количестве протеазами, участвующими в процессе свертывания крови, оставалось фундаментальным, неразрешенным вопросом биологии сосудов. Ка^аЬа!а и др., Вг 1. РНагтасо1., 144: 212-219, 2005; Ыаткипд, е! а1. Саз1гоеп1его1оду. 126: 1844-1859, 2004; Еютисс1 и др., Ргос №П1 Асай 8с1 И8А, 98: 13936-13941, 2001; Соскз и др., ЖаЛте, 398: 156-160, 1999.
ТЕ связывает и аллостерическим образом активирует фактор У11а и способствует сборке тройного инициирующего свертывание комплекса ТЕ-У11а-Х, из которого высвобождается продукт Ха, что приводит к образованию тромбина. Жойейде и др., РгсИешз 53: 640-648, 2003. Комплекс ТЕ-У11а также непосредственно расщепляет активируемый протеазами рецептор 2 (РАВ2). Сатегег и др., Ргос. №111. Асай. δα. И8А 97: 5255-5260, 2000; В1е^а1й и Ви!, Ргос. ЫаЙ. Асай, δα. И8А 98: 7742-7747, 2001. Несмотря на хорошо известную роль опосредованной тромбином передачи сигнала через рецепторы РАВ в процессах гемостаза и воспаления, активация рецепторов РАВ другими протеазами ίη у1уо остается слабо изученной. СоидЫт, ! ТНготЬ. Наетоз! 3: 1800-1814, 2005. ТЕ и РАВ2 поскольку фосфорилирование цитоплазматического домена ТЕ происходит вслед за передачей сигналов через РАВ2, и мыши, у которых удален цитоплазматический домен ТЕ, проявляют усиленный РАВ2-зависимый ангиогенез. А Нашей и Ви!, I. Вю1. СНет. 279: 23038-23044, 2004; ВеШпд и др., №Циге Мей. 10: 502-509, 2004. Тем не менее, в настоящее время не совсем ясно, каким образом регулируется передача сигнала через ТЕ-УИа и каким образом он выполняет свои физиологические функции, независимуые от передачи сигнала на последующих этапах другими протеазами, вовлеченными в коагуляцию. На данный момент не существуют какихлибо ингибиторов ангиогенеза, одобренных Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США (ΡΌΛ) для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний. В данной области существует необходимость регулировать или ингибировать передачу сигналов через ТЕ, связанную с ангиогенезом, ростом опухолевых клеток, метастазированием опухоли или воспалением, без влияния на нормальный процесс гемостаза.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится, в общем, к композициям и способам лечения заболеваний у субъекта, относящегося к млекопитающим, например заболеваний, связанных с ангиогенезом, воспаления или неопластических заболеваний. Композиция представляет собой ингибитор передачи сигнала через тканевый фактор, который не нарушает гемостаз субъекта, относящегося к млекопитающим. Указанные способы включают введение ингибитора передачи сигналов через тканевый фактор субъекту, относящемуся к млекопитающим. Данный ингибитор эффективен для снижения количества случаев связанных с ангиогенезом болезненных состояний, воспаления или неопластических заболеваний и при этом не повышает риск ослабления свертываемости крови или усиленного кровотечения у субъекта, относящегося к млекопитающим.
Предложен способ лечения заболевания, зависящего от передачи сигнала через тканевый фактор/фактор У11а, у субъекта, относящегося к млекопитающим, включающий введение ингибитора передачи сигнала через тканевый фактор субъекту, относящемуся к млекопитающим, в количестве, эффективном для ослабления или устранения заболевания или предотвращения его возникновения или рецидива у субъекта, относящегося к млекопитающим, причем указанный ингибитор не нарушает гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим. Указанные заболевания включают, без ограничения: связанное с ангиогенезом заболевание, неопластическое заболевание или воспаление. Неопластические заболе
- 1 014900 вания или воспаление включены в связанные с ангиогенезом заболевания. В одном аспекте указанный ингибитор представляет собой антитело или низкомолекулярное соединение. В частности, указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело 10Н10 (МАТ 10Н10), продуцируемое гибридомой с номером доступа в АТСС: НВ9383.
Предложен способ идентификации соединения, которое модулирует передачу сигнала через тканевый фактор вклетках, который включает этапы осуществления контакта тестируемого соединения с тестсистемой, на основе клеток, включающей клетку, экспрессирующую тканевый фактор, способный к передаче сигнала, причем зависиая от тканевого фактора передача сигнала регулируется белком дисульфидизомеразой, обеспечения указанной тест-системы фактором МПа в количестве, выбранном таким образом, что оно является эффективным для активации зависящей от тканевого фактора передачи сигнала, и определение (детектирование) действия указанного тестируемого соединения на зависящую от тканевого фактора передачу сигнала в указанной тест-системе, при этом эффективность указанного тестируемого соединения в указанной тест-системе свидетельствует о модуляции. В одном аспекте способ дополнительно включает определение ингибиторного действия тестируемого соединения на передачу сигнала через тканевый фактор. В дополнительном аспекте указанный способ дополнительно включает определение отсутствия действия тестируемого соединения на опосредуемый тканевым фактором гемостаз. Указанные клетки включают, без ограничения, кератиноциты, клетки меланомы или эндотелия. В дополнительном аспекте указанная клеточная тест-система вызывает ответ через активируемый протеазами рецептор 2. В дополнительном аспекте указанное тестируемое соединение представляет собой антитело или малую молекулу. В частности, указанное соединение ингибирует связывание МАТ 10Н10 с тканевым фактором. В дополнительном частном аспекте указанное соединение не ингибирует связывание моноклонального антитела 509 (МАТ 509), продуцируемого гибридомой с номером доступа АТСС: НВ9382, с тканевым фактором.
Предложен способ лечения ангиогенеза у субъекта, относящегося к млекопитающим, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения, которое модулирует передачу сигнала в клетках через путь с участием тканевого фактора-фактора УПа, отличающийся тем, что указанное соединение является антагонистом передачи сигнала через тканевый фактор-фактор УПа в клеточной тестсистеме, и указанное соединение эффективно для снижения уровня или устранения ангиогенеза или предотвращения его возникновения или рецидива у субъекта, относящегося к млекопитающим. В дополнительном аспекте указанное соединение не нарушает гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим. В одном аспекте передача сигнала через тканевый фактор-фактор УПа зависит от белка дисульфидизомеразы. В другом аспекте передача сигнала через тканевый фактор-фактор УПа происходит через активируемый протеазами рецептор 2. В дополнительном аспекте указанное тестируемое соединение представляет собой антитело или малую молекулу. В частности, указанное соединение ингибирует связывание МАТ 10Н10 с тканевым фактором. В дополнительном частном аспекте указанное соединение не ингибирует связывание МАТ 509 с тканевым фактором.
Предложен способ лечения неопластического заболевания у субъекта, относящегося к млекопитающим, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения, которое модулирует передачу сигнала в клетках через путь с участием тканевого фактора-фактора УИа, отличающийся тем, что указанное соединение действует как антагонист передачи сигнала через тканевый факторфактор УИа в клеточной тест-системе, и указанное соединение эффективно для снижения уровня или устранения неопластического заболевания или предотвращения его возникновения или рецидива у субъекта, относящегося к млекопитающим. В дополнительном аспекте указанное соединение не нарушает гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим. В одном аспекте передача сигнала через тканевый фактор-фактор УИа зависит от белка дисульфидизомеразы. В другом аспекте передача сигнала через тканевый фактор-фактор УИа происходит через активируемый протеазами рецептор 2. В дополнительном аспекте указанное тестируемое соединение представляет собой антитело или малую молекулу. В частности, указанное соединение ингибирует связывание МАТ 10Н10 с тканевым фактором. В дополнительном частном аспекте указанное соединение не ингибирует связывание МАТ 509 с тканевым фактором.
Предложен способ лечения воспаления у субъекта, относящегося к млекопитающим, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения, которое модулирует передачу сигнала в клетках через путь с участием тканевого фактора-фактора УИа, отличающийся тем, что указанное соединение действует как антагонист передачи сигнала через тканевый фактор-фактор УПа в клеточной тестсистеме и указанное соединение эффективно для снижения выраженности или устранения заболевания или предотвращения его возникновения или рецидива у субъекта, относящегося к млекопитающим. В дополнительном аспекте указанное соединение не нарушает гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим. В одном аспекте передача сигнала через тканевый фактор-фактор УПа зависит от белка дисульфидизомеразы. В другом аспекте передача сигнала через тканевый фактор-фактор УПа происходит через активируемый протеазами рецептор 2. В дополнительном аспекте указанное тестируемое соединение представляет собой антитело или низкомолекулярное соединение. В частном аспекте указанное соединение ингибирует связывание МАТ 10Н10 с тканевым фактором. В дополнительном частном аспекте
- 2 014900 указанное соединение не ингибирует связывание МАТ 5С9 с тканевым фактором.
Предложен способ выявления наличия или предрасположенности к связанному с ангиогенезом болезненному состоянию у субъекта, относящегося к млекопитающим, включающий взятие образца у субъекта, относящегося к млекопитающим; введение антитела, которое иммуноспецифичным образом связывается с тканевым фактором в образце, и определение присутствия или количества антитела, связанного с тканевым фактором в образце, при этом наличие антитела, связанного с тканевым фактором, свидетельствует о наличии или предрасположенности к связанному с ангиогенезом болезненному состоянию у субъекта, относящегося к млекопитающим, причем указанное антитело ингибирует передачу сигнала через тканевый фактор и не нарушает гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим. В дополнительном аспекте указанного способа повышенный уровень антитела, связанного с тканевым фактором, указывает на наличие или предрасположенность к связанному с ангиогенезом болезненному состоянию. В частности, указанное антитело представляет собой МАТ 10Н10. В дополнительном частном аспекте указанное связанное с ангиогенезом болезненное состояние представляет собой неопластическое заболевание или воспаление.
Предложен способ выявления наличия или предрасположенности к неопластическому болезненному состоянию у субъекта, относящегося к млекопитающим, включающий взятие образца у субъекта, относящегося к млекопитающим, введение антитела, которое иммуноспецифичным образом связывается с тканевым фактором в образце, и определение присутствия или количества антитела, связанного с тканевым фактором в образце, при этом наличие антитела, связанного с тканевым фактором, свидетельствует о наличии или предрасположенности к неопластическому заболеванию у субъекта, относящегося к млекопитающим, причем указанное антитело ингибирует передачу сигнала через тканевый фактор и не нарушает гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим. В дополнительном аспекте указанного способа повышенный уровень антитела, связанного с тканевым фактором, указывает на наличие или предрасположенность к неопластическому болезненному состоянию. В частности, указанное антитело представляет собой МАТ 10Н10. В частности, указанное неопластическое болезненное состояние представляет собой солидную опухоль, доброкачественную или злокачественную раковую опухоль молочной железы, меланому, глиому, астроцитому, гематологическое злокачественное новообразование, лейкемию, рак легких, колоректальный рак, рак матки, лейомиому матки, рак яичников, рак эндометрия, синдром поликистоза яичников, полипы эндометрия, рак предстательной железы, гипертрофию предстательной железы, рак слизистой, аденомиоз, аденокарциному, менингиому, рак кости, множественную миелому, или рак центральной нервной системы.
Предложен способ выявления наличия или предрасположенности к воспалительному заболеванию у субъекта, относящегося к млекопитающим, включающий взятие образца у субъекта, относящегося к млекопитающим; введение антитела, которое иммуноспецифично связывается с тканевым фактором в образце; и установление наличия или количества антитела, связанного с тканевым фактором в образце, отличающийся тем, что наличие антитела, связанного с тканевым фактором, свидетельствует о наличии или предрасположенности к воспалительному заболеванию у субъекта, относящегося к млекопитающим, при этом указанное антитело ингибирует передачу сигнала через тканевый фактор и не нарушает гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим. В дополнительном аспекте указанного способа повышенный уровень антитела, связанного с тканевым фактором, указывает на наличие или предрасположенность к воспалительному болезненному состоянию. В частности, указанное антитело представляет собой МАТ 10Н10.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано специфичное ингибирование передачи сигнала через тканевый фактор;
на фиг. 2 показано, что передача сигнала через тканевый фактор регулируется белком дисульфидизомеразой;
на фиг. 3 - передача сигнала через усеченный тканевый фактор;
на фиг. 4 показано, что передача сигнала через ТЕ-У11а стимулирует рост опухоли;
на фиг. 5 - распределение эпитопов для МАТ 10Н10;
на фиг. 6 показано, что инактивация коагулирующей активности ТЕ зависит от оксида азота;
на фиг. 7 показано, что образование комплекса ТЕ-РАК2 необходимо для передачи сигнала через ТЕ-УПа.
Подробное описание изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает композиции и способы лечения нарушения передачи сигнала через тканевый фактор/фактор УИа (ТЕ/УНа) (например, у субъектов с избыточной передачей сигнала через ТЕ/УНа) и лечения субъектов, страдающих заболеваниями или патологическими состояниями, которые зависят от, опосредованы или связаны с передачей сигнала через ТЕ/УПа. Нарушение передачи сигнала через ТЕ/УПа относится к избыточной или недостаточной активности передачи сигнала через тканевый фактор/фактор УИа (ТЕ/УПа), по сравнению с таковой у здоровых субъектов. Заболевания, зависящие от передачи сигнала через ТЕ/УНа, охватывают любые расстройства или патологические состояния, возникновение или развитие которых опосредовано или связано с нарушением активности передачи сигнала через ТЕ/У11а. Примеры таких заболеваний включают воспаление, неопла
- 3 014900 стические заболевания и заболевания, зависимые от ангиогенеза. Заболевания, зависимые от ангиогенеза, охватывают заболевания или расстройства с избыточным ангиогенезом (например, рак, слепота, вызванная диабетом, возрастная дистрофия желтого пятна, ревматоидный артрит и псориаз) или недостаточным ангиогенезом (например, болезнь коронарных артерий, инсульт и медленное заживление ран). Обычно, композиции согласно настоящему изобретению включают ингибитор пути передачи сигнала через ТЕ/УПа, который не нарушает ТЕ-опосредуемый гемостаз (например, свертывание крови). Способы согласно настоящему изобретению включают введение эффективного количества такого ингибитора субъекту, относящемуся к млекопитающим, нуждающемуся в лечении. Указанный ингибитор эффективен для снижения количества случаев воспаления или неопластического заболевания без увеличения риска кровотечения у субъекта.
Указанный ферментативный комплекс рецептора клеточной поверхности - тканевого фактора (ТЕ) с сериновой протеазой (фактором УПа) активирует физиологический гемостаз и свертывание и одновременно запускает активируемую протеазами передачу сигнала через рецептор при воспалении, прогрессировании опухоли и ангиогенезе. Масктап, Лйепо5с1ег. ТйготЬ. Уазе. ΒίοΙ. 24: 1015-1022, 2004; К1ета1б и Ви!, Сгй. Саге 7: 123-129, 2003; ВеШпд и др., Лйегю8с1ег. ТйготЬ. Уазе. Βίο1. 25: 1545-1550, 2005. Каким образом предшествующие пути передачи сигнала напрямую через ТЕ-УПа определяют патологию, без подавления нарабатываемыми в большом количестве протеазами, участвующими в процессе свертывания крови, оставалось фундаментальным, неразрешенным вопросом биологии сосудов. Как подробно описано в примерах ниже, настоящее изобретение показывает, что внеклеточный белок дисульфидизомераза (ΡΌΙ) ассоциирует с ТЕ, обеспечивая регуляцию свертывания крови с сохранением передачи сигнала в клетке. Нарушение дисульфидной связи Суз18б-Су5209 внеклеточного ТЕ фенотипически копирует функциональные свойства регулируемого ΡΌΙ сигнального ТЕ. Таким образом, пути дисульфидного обмена действуют как внеклеточные переключатели специфичности функции рецептора. Моноклональное антитело, связывающее нативную конформацию сигнального ТЕ, ингибировало ответы клетки и рост опухоли ίη νίνο (например, опухоли молочной железы или меланомы). Прерывание патофизиологической передачи сигнала через ТЕ без нарушения индуцируемого ТЕ гемостаза является примером того, как функциональные переключатели дисульфидных связей можно применять в терапевтических целях.
Очевидно, что настоящее изобретение не ограничено перечисленными конкретными способами, реагентами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые могут, несомненно, варьировать. Также очевидно, что терминология данной заявки предназначена для описания конкретных вариантов реализации и не ограничивает изобретение. При использовании в настоящем описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают соответствующие формы множественного числа, если из контекста не следует обратное. Таким образом, например, термин клетка включает комбинацию двух или более клеток и т.д.
В данной заявке термин приблизительно по отношению к измеряемой величине, такой как количество, продолжительность по времени, и тому подобные, как подразумевается, охватывает отклонение на ±20% или на ±10%, более предпочтительно на ±5%, еще более предпочтительно на ±1% и еще более предпочтительно на ±0,1% от указанного значения, поскольку подобные отклонения подходят для выполнения изложенных способов.
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют же значения, очевидные для среднего специалиста в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя на практике для проверки настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые описаны в данной заявке, предпочтительными являются материалы и способы, описанные в данной заявке. При описании и составлении формулы настоящего изобретения будет использована следующая терминология.
Гемостаз относится к остановке кровотечения из поврежденного кровеносного сосуда, требует совместного действия сосудистых, тромбоцитарных и плазматических факторов, уравновешенного регуляторными механизмами, для ограничения накопления тромбоцитов и фибрина в области повреждения. Нарушения гемостаза могут привести к тромбозу или избыточному кровотечению.
Ангиогенез относится к росту новых кровеносных сосудов у субъекта, относящегося к млекопитающим, здорового, либо в болезненном состоянии. Ангиогенез происходит в процессе заживления раны и для восстановления кровотока к тканям после повреждения или инсульта. У женщин ангиогенез также происходит в течение ежемесячного репродуктивного цикла (для восстановления выстилки матки, для созревания ооцитов во время овуляции) и во время беременности (для формирования плаценты, кровотока между матерью и плодом). В случае, когда продукция факторов роста ангиогенеза превышает выработку ингибиторов ангиогенеза, происходит рост кровеносных сосудов. В случае, когда количество ингибиторов превышает выработку стимуляторов, ангиогенез останавливается.
Избыточный ангиогенез происходит при заболеваниях, включающих, но без ограничения, рак, воспаление, слепоту, вызванную диабетом, возрастную дистрофию желтого пятна, ревматоидный артрит и псориаз. При таких патологических состояниях новые кровеносные сосуды питают пораженные болезнью ткани, разрушают нормальные ткани и, в случае рака, позволяют опухоли метастазировать. Недос- 4 014900 таточный ангиогенез происходит при заболеваниях, включающих, без ограничения, заболевание коронарных артерий, инсульт и медленное заживлении ран. При таких патологических состояниях образуются неполноценные кровеносные сосуды и не происходит правильного восстановления кровообращения, что приводит к риску смерти тканей.
Лечение неопластического заболевания
Неопластическое заболевание относится к раку или любому злокачественному росту или опухоли, вызванным не соответствующим норме и неконтролируемым делением клеток; оно может распространяться в другие области организма через лимфатическую систему или кровоток. Солидная опухоль включает, без ограничения, саркому, меланому, карциному или другие солидные раковые опухоли.
Саркома относится к опухоли, которая состоит из такого вещества, как эмбриональная соединительная ткань, и обычно состоит из плотно уложенных клеток, окруженных фибриллярным или гомогенным веществом. Саркомы включают, без ограничения, хондросаркому, фибросаркому, лимфосаркому, меланобластому, миксосаркому, остеосаркому, саркому Абемети (АЬетеШу), злокачественную липому, липосаркому, альвеолярную саркому мягких тканей, амелобластосаркому, ботриоидную саркому, гранулоцитарную саркому, хориокарциному, эмбриональную саркому, опухоль Вильмса (АУИтк), саркому эндометрия, стромальную саркому, саркому Юинга (Етапд), фасциальную саркому, фибробластную саркому, злокачественную гигантоклеточную саркому, гранулоцитарную саркому, саркому Ходжкина (Нобдк1п), идиопатическую множественную геморрагическую саркому, иммунобластическую саркому из Вклеток, лимфому, иммунобластическую саркому Т- из клеток, саркому Йенсена (1епкеп), саркому Капоши (Карой), саркому купферовских клеток, ангиосаркому, лейкосаркому, злокачественную мезенхимому, паростальную саркому, саркому ретикулоцитов, саркому Рауса (Каик), листовидную цистосаркому, синовиальную саркому и телеангиэктатическую саркому.
Меланома относится к опухоли, происходящей из системы меланоцитов кожи и других органов. Меланомы включают, например, лентигиноз конечностей, амеланотическую меланому, доброкачественную юношескую меланому, меланому Клаудмена (С1оибтап), меланому §91, меланому Хардинга-Пасси (Нагбшд-Раккеу), юношескую меланому, ограниченный предраковый меланоз, злокачественную меланому, узелковую меланому, подногтевую меланому и меланому поверхностно распространяющегося типа.
Карцинома относится к злокачественному новообразованию, состоящему из клеток эпителия, имеет тенденцию к инфильтрации окружающих тканей и приводит к метастазам. Примеры карцином включают, например, ацинарную карциному, ацинозную карциному, аденоцистокарциному, аденокистозную карциному, аденоматозную карциному, карциному коры надпочечников, альвеолярную карциному, карциному альвеолярных клеток, карциному базальных клеток, базальноклеточную Ьакосе11и1аге карциному, базалоидную карциному, базоплоскоклеточную карциному, бронхио-альвеолярную карциному, бронхиолярную карциному, бронхогенную карциному, мозговидную карциному, холангиоцеллюлярную карциному, хориокарциному, коллоидную карциному, угревидную карциному, карциному тела, ситовидную карциному, панцирную карциному, карциному кожи, карциному цилиндрического типа, карциному цилиндрических клеток, карциному протоков, твердую карциному, эмбриональную карциному, мозговидную карциному, эпидермоидную карциному, эпителиальную аденоидную карциному, экзофитную карциному, карциному из язвы, фиброзную карциному, листовидную карциному, слизеобразующую карциному, гигантоклеточную карциному (карциному д1даи1осе11и1аге), железистую карциному, гранулезоклеточную карциному, базально-клеточную карциному, гематоидную карциному, печеночноклеточную карциному, карциному клеток Гюртле, хондрому, гипемефроидную карциному, детскую эмбриональную карциному, карциному ш кНи, внутриэпидермальную карциному, внутриэпителиальную карциному, карциному Кромпечера (Кготресйег), карциному клеток Кульчитски (Ки1сЫ17ку), крупноклеточную карциному, чечевицеобразную карциному, лентикулярную карциному (1епбси1аге), липоматозную карциному, лимфоэпителиальную карциному, медуллярную карциному (теби11аге), меланотическую карциному, мягкую карциному, слизеобразующую карциному, карциному тис1рагит, карциному слизеобразующих клеток, слизеобразующую плоскоклеточную карциному, карциному тисокит (карциному слизистых), карциному тухота!обек, назофарингиальную карциному, овсяноклеточную карциному, оссифицирующую карциному, остеоидную карциному, папиллярную карциному, перипортальную карциному, прединвазивную карциному, карциному шиловидных клеток, коллоидную карциному, светлоклеточную карциному почки, карциному резервных клеток, саркомоподобный рак, карциному слизистой оболочки носовой полости, фиброзную карциному, карциному мошонки, перстневидно-клеточную карциному, недифференцированную карциному, мелкоклеточную карциному, соленоидную карциному, карциному из сферических клеток, веретеноклеточную карциному, губчатую карциному, сквамозную карциному, плоскоклеточную карциному, нитевидную карциному, телеангиэктатическую карциному, карциному из гладких мышечных волокон и сосудистой ткани, переходно-клеточную карциному, карциному ШЬегокит, туберозную карциному, бородавчатую карциному и карциному уШокит.
Лейкемия относится к прогрессирующим, злокачественным заболеваниям органов кроветворения и обычно характеризуется измененной пролиферацией и развитием лейкоцитов и их предшественников в крови и костном мозге. Лейкемию обычно клинически классифицируют на основании (1) продолжительности и характера заболевания - острая или хроническая; (2) типа вовлеченных в ее образование клеток
- 5 014900 миелоидная (миелогенная), лимфоидная (лимфогенная) или моноцитарная и (3) наличия или отсутствия увеличения изменения числа аберрантных клеток в крови - лейкемическая или алейкемическая (сублейкемическая). Лейкемия включает, например, острый нелимфоцитарный лейкоз, хронический лимфолейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, хронический гранулоцитарный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз взрослых, алейкемический лейкоз, лейкоцитемический лейкоз, базофильный лейкоцитоз, лейкоз бластных клеток, коровий лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, лейкоз кожи, эмбриональный лейкоз, эозинофильный лейкоз, лейкоз Гросса, волосатоклеточный лейкоз, лейкоз гемобластов, лейкоз гемоцитобластов, гистиоцитарный лейкоз, недифференцируемый лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, лейкопенический лейкоз, лимфолейкоз, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, лимфогенный лейкоз, лимфоидный лейкоз, лейкоз клеток лимфосаркомы, тучноклеточный лейкоз, мегакариоцитарный лейкоз, микромиелобластный лейкоз, моноцитарный лейкоз, лейкоз миелобластов, миелоцитарный лейкоз, миелоидный гранулоцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз, лейкоз Негели (Жсдсй). плазмоклеточный лейкоз, плазмоцитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, лейкоз клеток Ридера, лейкоз Шиллинга (ЗЫШид'к), недифференцированный бластный лейкоз, сублейкемический лейкоз и лейкоз недифференцированных клеток.
Дополнительные виды рака включают, например, болезнь Ходжкина, не-ходжкинскую лимфому, множественную миелому, нейробластому, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, рабдомиосаркому, первичный тромбоцитоз, первичную макроглобулинемию, мелкоклеточные опухоли легких, первичные опухоли головного мозга, рак желудка, рак толстого кишечника, злокачественную панкреатическую инсулиному, злокачественный карциноид, рак мочевого пузыря, предзлокачественные повреждения кожи, рак яичка, лимфомы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак пищевода, рак мочеполового тракта, злокачественную гиперкальцемию, рак шейки матки, рак эндометрия, рак коры надпочечников и рак предстательной железы.
Лечение воспаления
Воспаление или воспалительное заболевание относится как к острым реакциям (т.е., к реакциям (ответам) с активными воспалительными процессами) и хроническим реакциям (т.е., к ответам, характеризующимся медленным развитием и образованием новой соединительной ткани). Острое и хроническое воспаление можно различить по типу участвующих в нем клеток. Острое воспаление часто включает полиморфоядерные нейтрофилы; тогда как хроническое воспаление обычно характеризуется лимфогистиоцитарным и/или гранулематозным ответом. Воспаление включает реакцию систем как специфической, так и неспецифической защиты. Реакция системы специфической защиты представляет собой специфический ответ иммунной системы на антиген (возможно, включающий аутоантиген). Реакция системы неспецифической защиты представляет собой воспалительную реакцию, опосредуемую лейкоцитами, не способными к иммунологической памяти. Такие клетки включают гранулоциты, макрофаги, нейтрофилы и эозинофилы. Примерами воспаления специфического типа являются диффузное воспаление, фокальное воспаление, крупозное воспаление, интерстициальное воспаление, облитерирующее воспаление, паренхиматозное воспаление, реактивное воспаление, специфическое воспаление, токсическое воспаление и травматическое воспаление.
Защита животного от заболевания, включающего воспаление, относится к снижению способности к воспалительному ответу (т.е., ответу, включающему воспаление) на воспалительный агент (т.е., агент, способный вызвать воспалительный ответ, например метахолин, гистамин, аллерген, лейкотриен, солевой раствор, гипервентиляция, физическая нагрузка, диоксид серы, аденозин, пропранолол, холодный воздух, антиген и брадикинин). Предпочтительно способность к воспалительному ответу снижена, оптимально, до такой степени, при которой животное уже не испытывает дискомфорт и/или нарушение функционирования из-за эффекта воспалительного агента. Например, защита животного может относиться к способности соединения, при введении его животному, предотвращать начало заболевания и/или излечивать или снижать выраженность симптомов, признаков или причин заболевания. В частности, защита животного относится к модуляции воспалительного ответа для подавления (например, снижения, ингибирования или остановки) чрезмерно активного или опасного воспалительного ответа. Также защита животного относится, в частности, к регуляции клеточного иммунитета и/или гуморального иммунитета (т.е., активности Т-клеток и/или активности 1дЕ). Заболевание относится к любому отклонению от нормального состояния здоровья животного и включает симптомы заболевания, а также патологические состояния, при которых отклонение (например, инфекция, генная мутация, генетический дефект и т.д.) уже произошло, но симптомы еще не проявились.
Терапия антителами
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение предусматривает способы ингибирования или подавления передачи сигнала через ТЕ/У11а у субъекта, относящегося к млекопитающим, у которого необходимо снизить или подавить сигнальную активность ТЕ/УПа (например, субъекта, страдающего от воспаления или опухоли). Указанные способы включают введение ингибитора передачи сигнала через ТЕ/УПа субъекту, относящемуся к млекопитающим, в количестве, эффективном для ингибирования или подавления передачи сигнала через ТЕ/УПа. В некоторых родственных вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способы лечения или снижения выраженности симптомов за
- 6 014900 болеваний, которые связаны или зависят от передачи сигнала через тканевый фактор/фактор VII, у субъекта, относящегося к млекопитающим. Как отмечалось выше, такие заболевания включают, например, связанные с ангиогенезом заболевания, неопластические заболевания или воспаление. Указанные способы включают введение ингибитора передачи сигнала через тканевый фактор субъекту, относящемуся к млекопитающим, в количестве, эффективном для снижения или устранения связанного с ангиогенезом заболевания, неопластического заболевания или воспаления, или предотвращения его возникновения или рецидива у субъекта, относящегося к млекопитающим. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении применяют ингибитор, который представляет собой антитело к тканевому фактору, ингибирующее передачу сигнала через тканевый фактор и не нарушающее гемостаз (например, свертывание крови) у субъекта, относящегося к млекопитающим.
Типичное антитело относится к полипептиду, включающему каркасную область гена иммуноглобулина или фрагмента иммуноглобулина, который специфическим образом связывает и узнает антиген. Известные гены иммуноглобулинов включают гены каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю константной области, а также мириады генов вариабельной области иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируюткак гамма, мю, альфа, дельта, или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов, 1дО, 1дМ, 1дА, Ι§Ό и 1дЕ, соответственно. Обычно, антигенсвязывающая область антитела является наиболее существенной для специфичности и аффинности связывания.
Антитела и полученные из антител антигенсвязывающие молекулы обозначают полипептидную цепь(и), которая проявляет сильное моновалентное, бивалентное или поливалентное связывание с данным эпитопом или эпитопами (например, ТЕ или специфический эпитоп пептида ТЕ, узнаваемый МАТ 10Н10). Если не указано другое, антитела или антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут иметь последовательности, происходящие из любого вида позвоночных, камелидов, птиц или рыб. Их можно получить с применением любой подходящей технологии, например гибридомной технологии, рибосомного дисплея, фагового дисплея, библиотеки перестановки генов, полусинтетических или полностью синтетических библиотек или их комбинаций. Как подробно описано в данной заявке, антитела или антиген-связывающие молекулы настоящего изобретения включают интактные антитела, антиген-связывающие полипептидные цепи и другие сконструированные антитела (см., например, 8етаГ1ш, I. Ыис1 Мей. 34:533-6, 1993).
Антитело или антигенсвязывающая молекула также включает фрагменты антитела, которые содержат антигенсвязывающие области интактного антитела, сохраняющие способность к связыванию своего антигена (например, ТЕ или конкретный эпитоп пептида ТЕ, узнаваемого МАТ 10Н10). Примеры таких фрагментов антител включают: (1) фрагмент ЕаЬ, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов νΕ, νΗ, СЬ и СН1; (и) фрагмент Е(аЬ')2, бивалентный фрагмент, включающий два фрагмента ЕаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ш) фрагмент Ей, состоящий из доменов νΗ и СН1; (ίν) фрагмент Еу, состоящий из доменов νΕ и νΗ одного плеча антитела, (ν) фрагмент йАЬ (\Уагй и др.., №11иге 341:544-546, 1989), который состоит из домена νΗ; и (νί) изолированный гипервариабельный участок (СОЯ). Более того, хотя два домена фрагмента Еу, νΕ и νΗ кодируются отдельными генами, их можно объединить, применяя рекомбинантные методы, с помощью синтетического линкера, который позволяет им образовать единую белковую цепь, в которой участки νΕ и νΗ соединены и образуют моновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Еу (кеЕу); см., например, Вий и др., 8с1епсе 242:423-426, 1988; и Ηυδΐοη и др., Ргос, Ыа11. Асай. δα. И8А 85:5879-5883, 1988.
Антитела или антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению дополнительно включают одну или более цепей иммуноглобулинов, которые химически конъюгированы с или экспрессируются как гибридные белки с другими белками. Они также включают биспецифические антитела. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжелых/легких цепей и два различных сайта связывания. Другие антигенсвязывающие фрагменты или участки антител согласно настоящему изобретению включают бивалентные ксЕу (диательца, й1аЬойу), биспецифические антитела ксЕу, в которых молекула антитела узнает два различных эпитопа, одиночные домены связывания (йАЬ) и миниантитела.
Различные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данной заявке, можно получить путем ферментативной или химической модификации интактных антител или синтезировать йе ηονο с применением методик рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечные Еу), либо выявить с помощью библиотек фагового дисплея (см., например, МсСаГГеПу и др., Ыа1иге 348:552-554, 1990). Например, миниантитела можно получить, применяя способы, описанные в данной области, например, ναιΐβΐιαη и 8о11аххо. СотЬ СНет Ηί§1ι ТЬгоидйри! Зсгееп. 4:417-30 2001. Биспецифические антитела можно получить множеством способов, включая слияние гибридом или сшивку фрагментов ЕаЬ'. См., например, Зопдкгуйа! & Ьасйтапп, С1т. Ехр. 1ттипо1. 79:315-321 (1990); Ко§1е1пу и др., I. 1ттипо1. 148, 15471553 (1992). Одноцепочечные антитела можно идентифицировать с применением библиотек на основе фагового дисплея или библиотек на основе рибосомного дисплея, библиотек перетасовки генов. Такие библиотеки можно сконструировать из синтетических, полусинтетических или наивных и иммунокомпе
- 7 014900 тентных материалов.
Одним конкретным примером антител, которые можно применять при осуществлении на практике приведенных выше способов терапии, является моноклональное антитело мыши, обозначенное 10Н10. Как показано в примерах ниже, МАТ 10Н10 представляет собой антитело, которое действует как ингибитор передачи сигнала через тканевый фактор без нарушения гемостаза. Это антитело было детально описано в патентах США с номерами 5223427 и 6001978. Гибридома, секретирующая это антитело, депонирована согласно требованиям Будапештской конвенции в Американской коллекции типовых культур (АТСС) (Манассас, Вирджиния) 27 марта 1987 с номером доступа НВ9383. В дополнение к антителу 10Н10, продуцируемому этой гибридомой, любое антитело, которое обладает такой же специфичностью связывания и такой же или лучшей аффинностью связывания, чем МАТ 10Н10, можно также применять в способах терапии согласно настоящему изобретению. Кроме того, в способах терапии согласно настоящему изобретению можно также применять антигенсвязывающую молекулу или фрагменты, которые получены из МАТ 10Н10, или антитело с такой же специфичностью связывания и такой же аффинностью связывания, как у МАТ 10Н10, или лучшей.
Некоторые из способов терапии согласно настоящему изобретению относятся к лечению субъектовлюдей. В таких способах предпочтительными являются гуманизированное антитело, антитело человека или химерное антитело, содержащее последовательности человека (например, в константной области). По сравнению с антителом, выделенным из организма животного, не являющегося человеком (например, мыши), такое антитело будет иметь меньшую антигенность или вообще не будет обладать антигенными свойствами при введении пациенту-человеку. Химерное антитело к ТБ (например, с такой же специфичностью связывания, как у МАТ 10Н10) можно получить из участков антитела к ТБ животного, не являющегося человеком, вместе с участками антител человека. Например, химерная тяжелая цепь может включать антигенсвязывающий участок вариабельной области тяжелой цепи антитела к ТБ мыши, как указано в примерах данной заявки, связанный с по меньшей мере частью константной области тяжелой цепи антитела человека. Такую химерную тяжелую цепь можно объединить с химерной легкой цепью, которая включает антигенсвязывающий участок вариабельной области легкой цепи антитела к ТБ мыши, связанный с по меньшей мере частью константной области легкой цепи антитела человека.
Химерные антитела к ТБ согласно настоящему изобретению можно получить в соответствии со способами, известными в данной области. См., например, ВоЫикои и др., международная публикация патента РСТ/И886/02269; Акта, и др., европейская заявка на патент 184187; ТашдисЫ, М., европейская заявка на патент 171496; Моткои и др., европейская заявка на патент 173494; №иЬегдег и др., международная заявка на патент АО 86/01533; СаЬШу и др., патент США с номером 4816567; СаЬШу и др., европейская заявка на патент 125023; Веккег и др., 8с1еисе 240:1041-1043, 1988; Ыи и др., ΡΝΑ8 84:3439-3443, 1987; Ыи и др., 1. 1ттиио1. 139:3521-3526, 1987; 8ии и др., ΡΝΑ8 84:214-218, 1987; МкЫтига и др., Саис. Век. 47:999-1005, 1987; Аоой и др., №Шге 314:446-449, 1985; 81ι;·ι\ν и др., 1. №И. Саисег 1икк. 80:15531559, 1988.
Химерные антитела, которые целиком включают вариабельные области антитела животного, не являющегося человеком, можно дополнительно гуманизировать для снижения антигенности этого антитела для человека. Гуманизацию антитела обычно выполняют путем замещения некоторых последовательностей или остатков аминокислот в вариабельных областях Бу (каркасных областях или участках, отличных от СЭВ) эквивалентными последовательностями или остатками аминокислот из вариабельных областей Бу антител человека. Такие содержащие дополнительные замены последовательности или остатки аминокислот обычно не участвуют непосредственно в связывании антигена. Чаще гуманизацию антитела животного, не являющегося человеком, проводят путем замещения только СЭВ антитела животного, не являющегося человеком, (например, анти-ТБ антитела мыши, приведенные в качестве примера в данной заявке) на СЭВ антитела человека. В некоторых случаях после этого необходимо дополнительное замещение нескольких остатков в каркасных областях антитела человека на соответствующие остатки донорного антитела животного, не являющегося человеком. Такая дополнительная пересадка (дгайтд) часто необходима для улучшения связывания с антигеном. Причиной этого является то, что гуманизированные антитела, в составе которых находятся только СЭВ, пересаженные от антитела животного, не являющегося человеком, могут иметь меньшую активность связывания, по сравнению с активностью связывания донорного антитела животного, не являющегося человеком. Таким образом, в добавление к СЭВ, гуманизированные антитела к ТБ человека согласно настоящему изобретению (например, с такой же специфичностью связывания, как у МАТ 10Н10) часто могут содержать некоторые остатки аминокислот в каркасной области антитела человека, замещенные на соответствующие остатки донорного антитела животного, не являющегося человеком (например, антитела мыши, приведенного в качестве примера в данной заявке). Способы получения гуманизированных антител путем замещения СЭВ, включая критерии отбора остатков каркасной области для замещения, хорошо известны в данной области. См., например, Ашкег и др., заявка на патент Великобритании СВ 2188638А (1987), патент США 5,225,539; 1оиек и др., №1иге 321:552-525, 1986; Уегйоеуаи и др., 8с1еисе 239:1534, 1988; ВеШ1ег и др., 1. 1ттиио1. 141:40534060, 1988; и АО 94/10332.
- 8 014900
В добавление к химерным или гуманизированным антителам к РАВ1 человека в способах терапии для лечения людей можно также применять антитела, полностью принадлежащие человеку, которые проявляют такую же специфичность связывания с антителом мыши, таким как МАТ 10Н10, и сравнимую млм лучшую аффинность. Антитела к ТР человека можно получить, применяя любой из указанных методов, которые хорошо известны в данной области, например методы фагового дисплея с применением библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. См., например, ЬоиЬегд и Ннзхаг, Ιηΐ. Ксу. 1ттипо1. 13:65-93 (1995), патенты США с номерами 4,444,887 и 4,716,111; и публикации РСТ №0 98/46645, №0 98/50433, №0 98/24893, №0 98/16654, №0 96/34096, №0 96/33735 и №0 91/10741.
Производные антитела или антигенсвязывающие молекулы, имеющие такую же специфичность связывания, что и МАТ 10Н10, и такую же или лучшую аффинность связывания, можно получить методами, хорошо известными в данной области и приведенными в качестве примеров в данной заявке. Например, антитела или иммуноглобулины - кандидаты, полученные из тканевого фактора в качестве антигена, можно подвергнуть скринингу, например, на способность конкурировать с МАТ 10Н10 за связывание с полипептидом или пептидом тканевого фактора. Полипептидные и полинуклеотидные последовательности тканевого фактора человека известны (см., например, 8сатрай и др., Вюсйет1зйу 26:5234-5238, 1987; и Е1зйет и др., ТйтотЬ. Вез. 48:89-99, 1987). Полипептиды или пептиды тканевого фактора, подходящие для скрининга, можно получить, применяя способы, хорошо известные в данной области или описанные в данной заявке. Кроме того, группа специфичных антигенных пептидов, полученных из тканевого фактора человека, была описана в данной области, например, в патентах США с номерами 5,223,427 и 6,001,978. Эти патенты также раскрывают профиль связывания МАТ 10Н10 с указанной группой пептидов тканевого фактора. Например, было показано, что МАТ 10Н10 специфично связывается с пептидом тканевого фактора с последовательностью 86ТТПТУАА¥ЫСТ№К8ТПРКТ1ТЕ№ЕРКРУ (8Е0 ΙΌ N0:1) или ЕСПЬТПЕ1УКОУКрТ¥ (8Е0 ΙΌ N0:2), но не связывается с несколькими другими антигенными пептидами, полученными из тканевого фактора человека. Последние пептиды включают, например, ТК8СО№К8КСЕУТТОТЕСОЕТОЕ1УКЭУКОТУ (8ЕС ΙΌ N0:3) или ЕАНУЕ8УРАСХУЕ8ТС8АСЕРЕУЕЖРЕЕТРУЕС (8Е0 ΙΌ N0:4). Таким образом, антитела-кандидаты (например, антитела, полученные против полипептида тканевого фактора человека) можно подвергнуть скринигу на способность блокировать связывание МАТ 10Н10 с пептидом с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:1 и/или 8Е0 ΙΌ N0:2. Антитела также можно подвергнуть скринигу на профиль связывания, идентичный или, по существу, идентичный МАТ 10Н10, по связыванию с панелью пептидов тканевого фактора человека, как описано в патенте США с номером 5223427. Способы выполнения такого скрининга хорошо известны в данной области (см., например, патенты США с номерами 5223427 и 6001978), а также описаны в данной заявке.
В добавление к скрининг-тестам ίη νίΐτο можно также применять способы идентификации антител к ТЕ (анти-ТЕ антител) ίη νίνο, которые подходят для реализации указанных способов согласно настоящему изобретению. Например, способ замены ίη νίνο вариабельной области антитела животного, не являющегося человеком, на вариабельную область антитела человека, с сохранением или обеспечением лучших характеристик связывания, был раскрыт в заявке на патент США с номером 10/778,726 (номер публикации 20050008625). Предназначенный для получения антитела человека с такой же специфичностью связывания, что и у МАТ 10Н10 мыши, и такой же или лучшей аффинностью связывания, этот способ основывается на направленной замене эпитопов вариабельных областей антитела животного, не являющегося человеком, на соответствующие участки антитела, полностью принадлежащего человеку. Полученное антитело человека обычно не имеет сходной структуры с исходным антителом животного, не являющегося человеком, но связывается с тем же эпитопом на том же антигене, что и исходное антитело.
Антитела человека с близкой или лучшей аффинностью к специфичному эпитопу, чем у исходного антитела животного, не являющегося человеком (например, МАТ 10Н10 мыши), также можно приобрести у компаний, которые обычно производят антитела человека. Например, для получения необходимого антитела человека Ка1оВюз, Ечс. (Маунтин Вью, Калифорния) применяет библиотеку акцепторных антител человека. Затем производят направленную или эпитоп-фокусированную библиотеку антител человека, которые связываются с теми же эпитопами, что и антитело животного, не являющегося человеком, хотя и с различными аффинностями. Антитела из основанной на эпитопах библиотеке затем отбирают на основании близкой или более высокой аффинности, чем аффинность исходного антитела животного, не являющегося человеком. Идентифицированные таким образом антитела человека затем подвергают дополнительному анализу на аффинность и идентичность последовательности.
В добавление к МАТ 10Н10 и антителам или антигенсвязывающим молекулам, полученным на его основе, другие антитела к ТЕ с необходимыми для реализации способов терапии соглано настоящему изобретению свойствами также легко можно получить с применением методик и способов, которые обычно осуществляют в данной области. Как очевидно специалистам в данной области, биоспецифические захватывающие реагенты включают антитела и связывающие фрагменты антител, которые связываются с тканевым фактором, например, на метастатических клетках или клетках воспаления (например, одноцепочечные антитела, фрагменты ЕаЬ', фрагменты Р(аЬ)'2 и белки зсЕν, и аффитела (АГПЬобу. ул.
- 9 014900
Текшкппдеп 30, 11оог 6, Вох 700 04, 5>1оск1ю1т 8Е-10044, Швеция; См. патент США с номером: 5831012, который включен в данную заявку посредством ссылки в полном объеме и во всех отношениях)). В зависимости от предполагаемого применения, они могут также включать рецепторы и другие белки, которые специфическим образом связывают другие биомолекулы.
Гибридные антитела и фрагменты гибридных антител включают целые молекулы антител, содержащие полноразмерные тяжелую и легкую цепи, или любые их фрагменты, такие как ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Еб, 8сЕу, легкие цепи антител и тяжелые цепи антител. Также можно применять химерные антитела, содержащие вариабельные области, как описано в данной заявке, и константные области различных видов организмов. См., например, заявку на патент США номер 20030022244.
На начальном этапе заранее выбирают целевой объект, к которому будут получать антитело. Методики получения моноклональных антител против целевых объектов хорошо известны специалистам в данной области. Примеры таких методик включают, без ограничения, методики с применением библиотек на основе дисплея, мышей хепо или НиМАЬ, гибридомы и тому подобное. Целевые объекты включают любые вещества, которые способны проявлять антигенность, и они обычно представляют собой белки или полисахариды белков. Примеры включают рецепторы, ферменты, гормоны, факторы роста, пептиды и тому подобные. Очевидно, что не только природные антитела подходят для применения в соответствии с настоящим описанием, но также можно применять и рекомбинантные антитела и фрагменты антител, направленых против заранее выбранного объекта.
Антитела (АТ), которые можно подвергнуть методикам, указанным в данной заявке, включают моноклональные и поликлональные АТ, и фрагменты антител, такие как ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Еб, 5сЕу. диабоди, легкие цепи антител, тяжелые цепи антител и/или фрагменты антител, полученные с помощью технологии фагового или фагмидного дисплея. Сначала исходное антитело получают из исходных видов. В частности, необходимо иметь последовательность нуклеиновых кислот или аминокислот вариабельной части легкой цепи, тяжелой цепи или обеих из антитела исходного вида, обладающего специфичностью к целевому антигену. Исходные виды представляют собой любые виды, которые применяют для получения антитела или библиотек антител, например крысу, мышь, кролика, цыпленку, обезьяну, человека и тому подобные. Методики для получения и клонирования моноклональных антител хорошо известны специалистам в данной области. После получения необходимого антитела вариабельные области (УН и Уь) разделяют на составные части (т.е., каркасные области (ЕВ) и СОВ), при этом СЭВ определяют любым из возможных способов (например, способу по КаЬа! в отдельности, способу по Сйо1Ыа в отдельности или с применением комбинированного способа по КаЬа! и Скобиа, и любым другим способом определения, известным специалистам в данной области). После этого необходимо выбрать каркасные области подходящих целевых видов. Один вариант реализации подразумевает выравнивание каждой отдельной каркасной области последовательности антитела исходного вида с различными последовательностями аминокислот или последовательностями нуклеиновых кислот целевого вида. Программы поиска гомологичных последовательностей хорошо известны в данной области, например ВЬА8Т и тому подобные. Например, если целевой вид представляет собой человека, источники таких последовательностей аминокислот или последовательностей нуклеиновых кислот (зародышевые или «перетасованные» последовательности антител) можно найти в любой подходящей справочной базе данных, такой как ОепЬапк, банк данных по белкам на сайте ΝΟΒΙ (Шр://псЬ1.п1т.шй.доу/ВЕА8Т/), УВА8Е, база данных генов антител человека (ййр://тетете.тгс-сре.сат.ас.ик/1т1-бос) и базе данных КаЬа! по иммуноглобулинам (ййр://те^ет.1ттипо.Ьте.пети.еби) или их транслированным продуктам. При выравнивании последовательностей нуклеотидов необходимо проанализировать выбранные гены для определения того, какие гены из этой группы имеют наибольшую гомологию аминокислот с антителом исходного вида. Предполагается, что последовательности аминокислот или последовательности нуклеиновых кислот, имеющие более высокую по сравнению с другими последовательностями в базе данных степень гомологии, можно применять и изменять в соответствии с процедурами, описанными в данной заявке. Более того, можно применять последовательности аминокислот или генов, имеющие меньшую гомологию, в случае если они кодируют продукт, который, если его изменить и отобрать необходимые варианты в соответствии с процедурами, описанными в данной заявке, проявляет специфичность к заранее выбранному целевому антигену. В некоторых вариантах реализации приемлемая степень гомологии выше, чем приблизительно 50%. Очевидно, что целевым видом может быть вид, отличный от человека.
Лечение относится к любому признаку благоприятного исхода при лечении или снижении выраженности или терапии рака или воспаления, включая любой объективный или субъективный параметр, такой как смягчение боли или выраженности симптома; ремиссия; снижение выраженности симптомов или приведение болезненного состояния к более терпимой для пациента форме; замедление скорости дегенерации или ухудшения; или снижение истощения в результате дегенарции. Лечение или снижение выраженности симптомов может быть основано на объективных или субъективных параметрах; в том числе результатах осмотра лечащим врачом. В соответствии с этим термин лечение включает введение указанных соединений или агентов согласно настоящему изобретению для предотвращения или задержки, облегчения или подавления, или ингибирования развития симптомов или патологических состояний, связанных с глазными болезнями. Термин терапевтический эффект относится к снижению, устранению
- 10 014900 или предотвращению заболевания, симптомов заболевания, или побочных эффектов заболевания у субъекта.
В комбинации с, комбинированная терапия и комбинированные продукты в некоторых вариантах реализации относятся к одновременному введению пациенту первого терапевтического препарата и соединений согласно данной заявке. При введении в комбинации компоненты можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке в различные моменты времени. Таким образом, для обеспечения желаемого терапевтического эффекта все компоненты можно вводить по отдельности, но с достаточно небольшими интервалами времени.
Лечить или лечение рака, метастатического рака или воспаления с применением указанных способов согласно настоящему изобретению включает предотвращение появления симптомов у субъекта, у которого может быть повышен риск возникновения рака или воспаления, но он еще не испытывает или не демонстрирует симптомы инфекции; подавление симптомов рака или воспаления (замедление или остановка их развития); обеспечение снижения выраженности симптомов или побочных эффектов рака или воспаления (включая паллиативное лечение), и ослабление симптомов рака или воспаления (вызывающее регрессию). Лечение относится к любому признаку благоприятного исхода при лечении или улучшении состояния или терапии рака или воспаления, включающему любой объективный или субъективный параметр, такой как смягчение боли или выраженности симптома; ремиссия; ослабление симптомов или приведение болезненного состояния к более терпимой для пациента фотме; замедление скорости дегенерации или ухудшения; или снижение истощения в результате дегенарции. Лечение или снижение выраженности симптомов может быть основано на объективных или субъективных параметрах; в том числе результатах осмотра лечащим врачом. В соответствии с этим термин лечение включает введение указанных соединений или агентов согласно настоящему изобретению для предотвращения или задержки, облегчения или подавления, или ингибирования развития симптомов или патологических состояний, связанных с глазными болезнями. Термин терапевтический эффект относится к снижению выраженности, устранению или предотвращению заболевания, симптомов заболевания или побочных эффектов заболевания у субъекта.
Единица дозирования (лекарственная форма) относится к физически раздельным единицам, подходящим в качестве единичных доз для конкретного индивида, которому необходимо лечение. Каждая единица может содержать заранее выбранное количество активного соединения(ий), расчитаное для получения желаемого терапевтического эффекта(ов), объединенное с необходимым фармацевтическим носителем. Технические требования для лекарственной формы, содержащей единичную дозу, могут определяться (а) уникальными характеристиками активного соединения(ий) и конкретным терапевтическим эффектом(ами), которого нужно достичь, и (б) характерными ограничениями в данной области на приготовление лекарственного средства из такого активного соединения(ий).
Термины идентичный или процент идентичности, в отношении двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов, относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые схожи или имеют определенное процентное содержание одинаковых остатков аминокислот или нуклеотидов (т.е., приблизительно 60% идентичности, предпочтительно 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 98, 99% или более высокий процент идентичности по всему заданному участку (например, последовательность нуклеотидов, кодирующая тканевый фактор или антитело к тканевому фактору, описанные в данной заявке, или последовательность аминокислот тканевого фактора или антитела к тканевому фактору, описанные в данной заявке), при сравнении и выравнивании по максимальному соответствию во всем окне сравнения или обозначенном участке). Еео измеряют, используя алгоритмы сравнения последовательностей ВЬА8Т или ВЬА8Т 2.0 с параметрами по умолчанию, описанными ниже, или путем выравнивания вручную и визуального изучения (см., например, вебсайт ΝΟΒΙ).
Такие последовательности считаются по существу идентичными. Этот термин также относится или может быть применен в отношении последовательности, комплементарной тестируемой. Указанный термин также включает последовательности, которые содержат делеции и/или вставки, а также последовательности, содержащие замены. Как описано ниже, предпочтительные алгоритмы могут учитывать пробелы и тому подобное. Предпочтительно идентичность существует на протяжении участка длиной по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот или нуклеотидов, или более предпочтительно на протяжении участка длиной 50-100 аминокислот или нуклеотидов.
Для сравнения последовательностей, обычно одна последовательность выступает в качестве референсной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей, тестируемые и референсную последовательности вводят в компьютер, указывают координаты подпоследовательности, если это необходимо, и указывают параметры алгоритма программы для сравнения последовательностей. Предпочтительно можно применять параметры программы по умолчанию, или можно указать альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей затем рассчитывает процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей по отношению к референсной последовательности на основании параметров программы.
- 11 014900
Окно сравнения, при использовании в данной заявке, включает обозначение сегмента из любого числа непрерывно следующих друг за другом позиций, выбранного из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно от приблизительно 50 до приблизительно 200, чаще от приблизительно 100 до приблизительно 150, в котором последовательность можно сравнить с эталонной последовательностью из такого же числа непрерывно следующих друг за другом позиций, после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей с целью сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей с целью сравнения можно провести, например, с применением алгоритма локальной гомологии по 8шйй и \Уа1сгтап. Αάν. Αρρί. МаЛ. 2: 482, 1981, с применением алгоритма гомологичного выравнивания по №еб1етап и ХУшъск 1. Μοί. Βίοί, 48:443, 1970, с применением способа поиска подобия по Реаткоп и Ыртаи, Ргос. №11. Асаб. δει. υδΑ, 85:2444, 1988, с применением компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (ОАР, ΒΕδΤΡΙΤ, ΕΑδΤΑ и ΤΕΑ8ΤΑ в пакете программного обеспечения ХУбсопщп Сепейск 8оП\таге Раскаде, Оепебск СошрШег Огоир, 575 8с1еисе Ότ., Мэдисон, Висконсин), или путем выравнивания вручную и визуального анализа (см., например, ΑιΐδΐιΛΙ и др., ред., Ситгеи! РгоЮсоб ίη Мо1еси1аг Вю1оду. 1995, приложение).
Предпочтительными примерами алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы ΒΕΑ8Τ и ΒΕΑ8Τ 2.0, которые описаны в ΑΙίδοΗπί и др., №. Ααάκ Кек, 25:3389-3402, 1977 и ΑΛ^ικΙ и др., 1. Мо1. Βώί, 215:403-410, 1990, соответственно. ΒΕΑ8Τ и ΒΕΑ8Τ 2.0 применяют с параметрами, описанными в данной заявке, для определения процента идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и белков согласно настоящему изобретению. Программное обеспечение для выполнения анализа ΒΕΑ8Τ находится в свободном доступе на сайте Национального Центра Биотехнологической Информации (1Шр://\\л\л\'.псЫ.п11п.шкдо\7). Данный алгоритм включает на первом этапе идентификацию пар последовательностей с высоким счетом (Н8Р) путем идентификации коротких слов длиной вдоль последовательности, которые либо совпадают, либо удволетворяют некоторому положительному пороговому числу Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Т называют пороговым значением для близких слов (Α1ΐ5θΗυ1 и др., выше). Такие первоначальные близкие совпадения слов служат отправными точками для обнаружения более длинных Н8Р, включающих их. Совпадающие слова продлевают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока возможно повышение суммарного счета выравнивания. Суммарный счет расчитывают с применением в случае последовательностей нуклеотидов параметров М (вознаграждение за пару совпадающих остатков; всегда > 0) и N (штраф за несовпадающие остатки; всегда < 0). В случае последовательности аминокислот для расчета суммарного счета применяют матрицу значений. Продление совпадающих слов в каждом направлении прекращается, когда суммарный счет выравнивания уменьшается на величину X относительно его максимально достигнутого значения; суммарный счет сходит к нулю или ниже, в результате накопления одного или более остатков выравнивания с отрицательным значением; или по достижении конца любой из последовательностей. Параметры алгоритма ΒΕΑ8Τ, ^, Τ и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа ΒΕΑ8ΤΝ (для последовательности нуклеотидов) использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (^), равную 11, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4, и сравнение осуществляется по обеим нитям. Для последовательностей аминокислот, программа ΒΒΑδΤΓ использует в качестве параметров по умолчанию длину слова, равную 3, и ожидание (Е), равное 10, и матрицу выравнивания ΒΕΟ8ΗΜ62 (см. НешкоГГ и НешкоГГ, Ргос. №11. Αсаб. 8ск υδΑ. 89:10915, 1989) (В), равное 50, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4, и сравнение осуществляется по обеим нитям.
Термины полипептид, пептид и белок применяются в данной заявке взаимозаменяемо для обозначения полимера из остатков аминокислот. Термины применяют к полимерам аминокислот, в которых один или более остаток аминокислоты представляет собой искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к природным полимерам аминокислот и неприродным полимерам аминокислот.
Термин аминокислота относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют сходным с природными аминокислотами образом. Природными аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые затем подвергаются модификации, например гидроксипролин, γкарбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и природные аминокислоты, т.е. α-атом углерода, связанный с атомом водорода, карбоксильную группу, аминогруппу и группу заместителя К, например гомосерин, норлейцин, сульфоксид метионина, метилсульфоний метионина. Такие аналоги имеют измененные К-группы (например, норлейцин) или измененные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, что и природные аминокислоты. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличную от общей химической структуры аминокислот, но которые функционируют сходным с природными аминокислотами образом.
Аминокислоты могут обозначаться в данной заявке либо общепринятым трехбуквенным кодом, ли
- 12 014900 бо однобуквенным кодом, рекомендованным комиссией по биохимической номенклатуре ШРАС-ШВ. Нуклеотиды также могут обозначаться общепринятым однобуквенным кодом Консервативно измененные варианты, применяется как к последовательностям аминокислот, так и нуклеиновых кислот. По отношению к конкретным последовательностям нуклеиновых кислот, консервативно измененные варианты относятся к таким нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные последовательности аминокислот, или когда нуклеиновая кислота не кодирует какую-либо последовательность аминокислот, к, по существу, идентичным последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода, любой данный белок кодируется большим числом функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, все кодоны ССА. ССС, ССС и ОСИ кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в любом положении, где аланин точно определен кодоном, сам кодон может быть любым из соответствующих указанных кодонов, при этом кодируемый полипептид не изменяется. Такие варианты нуклеиновых кислот называются молчащими вариантами, которые представляют собой один из видов консервативно измененных вариантов. Каждая последовательность нуклеиновых кислот в данной заявке, которая кодирует полипептид, также описывает любой возможный молчащий вариант нуклеиновой кислоты. Для специалиста в данной области очевидно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (кроме АИС, который обычно является единственным кодоном для метионина, и ТСС, который обычно является единственным кодоном для триптофана) можно изменить для получения функционально идентичной молекулы. В соответствии с этим, подразумевается, что каждый молчащий вариант нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включен в каждую описанную последовательность в отношении продукта экспрессии, но не самой последовательности зонда.
Что касается последовательностей аминокислот, для специалиста в данной области очевидно, что отдельные замены, делеции или вставки в последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида, или белка, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшое, в процентном отношении, количество аминокислот в кодирующей последовательности, представляют собой консервативно измененные варианты, в которых в результате изменения происходит замена одной аминокислоты на химически сходную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, указывающие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно измененные варианты являются дополнениями и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели согласно настоящему изобретению.
Каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замены друг для друга:
1) Аланин (А), Глицин (С);
2) Аспарагиновая кислота (Ό), Глутаминовая кислота (Е);
3) Аспарагин (Ν), Глутамин (О);
4) Аргинин (В), Лизин (К);
5) Изолейцин (I), Лейцин (Ь), Метионин (М), Валин (V);
6) Фенилаланин (Е), Тирозин (Υ), Триптофан (^);
7) Серин (8), Треонин (Т) и
8) Цистеин (С), Метионин (М) (см., например, Сге1дЫои, Рто1еш8 (1984)).
Макромолекулярные структуры, такие как полипептидные структуры, можно описать с точки зрения различных уровней организации. Общие сведения, касающиеся такой организации, см., например, А1Ьей8 и др., Мо1еси1аг Вю1о§у о! 1Пе Се11, 3-е изд., 1994) и СаШот и 8сЫтте1, ВюрйуЦса1 СйетМгу Рай I: ТПе СопГогтайоп о! Вю1ощса1 Мастото1есше8, 1980. Первичная структура относится к последовательности аминокислот конкретного пептида. Вторичная структура относится к локально упорядоченным, трехмерным структурам, образуемым полипептидом. Эти структуры обычно называют доменами, например ферментативными доменами, внеклеточными доменами, трансмембранными доменами, доменами, формирующими поры, и цитоплазматическими хвостовыми доменами. Домены представляют собой части полипептида, которые образуют компактные единицы полипептида и обычно имеют длину от 15 до 350 аминокислот. Примеры доменов включают домены с ферментативной активностью, например домены с киназной активностью. Типичные домены образованы из секций более низкого порядка организации, таких как участки β-слоев и α-спиралей. Третичная структура относится к полной трехмерной структуре мономера полипептида. Четвертичная структура относится к трехмерной структуре, образованной путем нековалентной ассоциации независимых имеющих третичную структуру единиц. Анизотропные термины также известны как энергетические термины.
Каждая конкретная последовательность нуклеиновых кислот также полностью охватывает варианты сплайсинга. Аналогично, любой конкретный белок, кодируемый нуклеиновой кислотой, полностью охватывает любой белок, кодируемый вариантом сплайсинга нуклеиновой кислоты. Варианты сплайсинга, как предполагает название, представляют собой продукты альтернативного сплайсинга гена. После транскрипции исходный транскрипт нуклеиновой кислоты может подвергнуться сплайсингу таким образом, что порождает различные (альтернативные) продукты сплайсинга нуклеиновых кислот, которые кодируют различные полипептиды. Механизмы получения вариантов сплайсинга различны, но включают альтернативный сплайсинг экзонов. Альтернативные полипептиды, происходящие от одной и
- 13 014900 той же нуклеиновой кислоты в результате транскрипции различных вариантов сплайсинга, также охвачены данным определением. В данное определение включены любые продукты реакции сплайсинга, включая рекомбинантные формы продуктов сплайсинга.
Термин рекомбинантный» в отношении, например, к клетке, или нуклеиновой кислоте, белку, или вектору, указывает на то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были изменены путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или варианта нативной нуклеиновой кислоты или белка, или что клетка получена из измененной таким образом клетки. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не обнаруживаются в нативной (не рекомбинантной) форме указанной клетки, или экспрессируют нативные гены, либо экспрессирую гены, экспрессия которых в обычных нерекомбинантных клетках не отвечает норме, понижена или отсутствует.
Строгие условия гибридизации относятся к условиям, при которых зонд гибридизуются с целевой подпоследовательностью, но не с другими последовательностями, обычно в сложной смеси нуклеиновых кислот. Строгие условия зависят от последовательности и будут отличаться в различных случаях. Более длинные последовательности гибридизуются специфическим образом при более высоких температурах. Полное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Туззеп, Тес11пк|иез ίη ΒίοсйепизНу апб Мо1еси1аг Βίοίοβν - ΗνόπάίζαΙίοη \νί11ι М1с1с1с РгоЬез, Оуег\зе\\· ο£ ргшс1р1ез ο£ ΗνόΓίάίζαΙίοη апб 111е 81га1еду ο£ пис1ею ас1б аззауз, 1993. Обычно, строгие условия выбрают таким образом, чтобы они были приблизительно на 5-10°С ниже, чем температура плавления (Тт) для конкретной последовательности при определенной ионной силе рН. Тт представляет собой температуру (при определенной ионной силе, рН, и концентрации нуклеиновых кислот), при которой 50% зондов, комплементарных целевой последовательности, равновесно гибридизуется с целевой последовательностью (поскольку целевые последовательности присутствуют в избытке, при Тт 50% зондов равновесно присоединены к сайтам связывания на целевых последовательностях). Строгие условия также могут быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфичной гибридизации за положительный сигнал принимают сигнал, по меньшей мере в два раза превышающий фоновый уровень, предпочтительно в 10 раз превышающий фоновый уровень гибридизации. Примером строгих условий гибридизации могут быть следующие условия: 50% формамид, 5х 88С (стандартный солевой раствор), и 1% ДСН, инкубирование при 42°С, или, 5х 88С, 1% ДСН, инкубирование при 65°С, с промывкой в 0,2х 88С, и 0,1% ДСН при 65°С.
Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом при строгих условиях, все же считаются по существу идентичными, если полипептиды, которые они кодируют, являются по существу идентичными. Это происходит, например, когда синтезируют копию нуклеиновой кислоты, используя максимальную вырожденность кодонов, разрешенную генетическим кодом. В таких случаях, нуклеиновые кислоты обычно гибридизуют при условиях гибридизации умеренной строгости. Примеры умеренных условий гибридизации включают гибридизацию в буфере, состоящем из 40% формамида, 1 М ЫаС1, 1% ДСН при 37°С, и промывку в 1х 88С при 45°С.
Положительной гибридизацией считают сигнал, уровень которого по меньшей мере в два раза превышает фоновый уровень. Для средних специалистов в данной области очевидно, что для обеспечения условий близкой степени строгости можно применять альтернативные условия гибридизации и промывки. Дополнительные рекомендации по определению параметров гибридизации приведены во многих литературных источниках, например АизиЬе1 и др., выше.
При ПЦР, для амплификации в условиях с низкой строгостью, обычно используют температуру, равную 36°С, хотя температуры отжига могут варьировать в интервале между приблизительно 32 и 48°С, в зависимости от длины праймера. Для высоко строгих условий ПЦР амплификации обычно используют температуру, приблизительно равную 62°С, хотя для высоко строгих условий температура отжига может находиться в интервале от приблизительно 50 до приблизительно 65°С, в зависимости от длины праймера и специфичности. Обычный цикл для амплификаци как с высокой, так и с низкой строгостью условий включает фазу денатурации при 90-95°С в течение 30 с-2 мин, фазу отжига, длящуюся 30 с-2 мин, и фазу элонгации при приблизительно 72°С в течение 1-2 мин. Протоколы и рекомендации по проведению реакций амплификации низкой и высокой строгости приведены, например, в 1пшз и др., РСК. Ρτοίο^Π, А Ошбе ίο Мебюбз апб АррНса1юпз, Асабетю Ргезз, 1пс. Нью-Йорк, 1990.
Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество означает вспомогательное вещество, которое можно применять для приготовления фармацевтической композиции, которое признано безопасным, нетоксичным, и желательным, и включает вспомогательные вещества, приемлемые для применения в ветеринарии, а также для фармацевтического применения для человека. Такие вспомогательные вещества могут твердыми, жидкими, полутвердыми или, в случае аэрозольных композиций, газообразными.
Фармацевтически приемлемые соли и эфиры обозначают соли и эфиры, которые фармацевтически приемлемы и имеют требуемые фармакологические свойства. Такие соли включают соли, которые могут образоваться, в случае, когда кислотные протоны, присутствующие в соединении, способны реагировать с неорганическими или органическими основаниями. Подходящие неорганические соли вклю
- 14 014900 чают соли, которые образованы с щелочными металлами, например натрием и калием, магнием, кальцием и алюминием. Подходящие органические соли включают соли, которые образованы с органическими основаниями, такими как аминовые основания, например этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, трометамин, N метилглукамин, и тому подобные. Такие соли также включают кислотно-аддитивные соли, образованные из неорганических кислот (например, соляной и бромисто-водородной кислотами) и органических кислот (например, уксусной кислоты, лимонной кислоты, малеиновой кислоты и алкан- и аренсульфоновой кислот, такими как метансульфоновая кислота и бензолсульфоновая кислота). Фармацевтически приемлемые эфиры включают эфиры, образованные из карбокси-, сульфонилокси- и фосфоноксигрупп, присутствующих в указанных соединениях, например в С1-6алкиловых эфирах. При наличии двух кислотных групп фармацевтически приемлемая соль или эфир могут представлять собой кислую однозамещенную солью или эфир или двузамещенную солью или эфиром; и аналогично, при наличии более двух кислотных групп, соль или эфир могут быть образованы с участием всех таких групп. Соединения, упомянутые в настоящем изобретении, могут присутствовать не в форме соли или эфира, или в форме соли и/или эфира, и при упоминании таких соединений подразумевается, что они включают как неизмененные (не превращенные в соль или эфир) соединения, так и их фармацевтически приемлемые соли и эфиры. Также, некоторые соединения, упомянутые в настоящем изобретении, могут присутствовать более чем в одной стереоизомерной форме, и при упоминании таких соединений подразумевается, что они включают все отдельные стереоизомеры и все смеси (рацемические или другие) таких стереоизомеров.
Фармацевтически приемлемый, физиологически переносимый и другие грамматические варианты приведенных терминов, по отношению к композициям, носителям, разбавителям и реагентам, используются взаимозаменяемо и означают, что указанные вещества можно вводить человеку (применять), не вызывая нежелательных физиологических эффектов в такой степени, которая делала бы невозможным введение композиции.
Терапевтически эффективное количество означает такое количество, которое, при введении субъекту для лечения заболевания, является достаточным, чтобы влиять на лечение этого заболевания.
Если не указано иначе, тармины субъект или пациент используются взаимозаменяемо и относятся к млекопитающим, таким как пациенты-люди и приматы, не являющиеся человеком, а также к экспериментальным животным, таким как кролики, крысы и мыши, и другим животным. В соответствии с этим указанный термин субъект или пациент в данной заявке означает любого пациента или субъекта, являющегося млекопитающим, которому можно вводить композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения пациент страдает патологическим состоянием, которое вызывает пониженную устойчивость к заболеванию, например ВИЧ. В одном примере реализации настоящего изобретения, чтобы определить пациентов для лечения фармацевтической композицией, включающей один или более коллектинов и/или поверхностных белков согласно указанным способам настоящего изобретения, применяют общепринятые способы скрининга для определения статуса существующего заболевания или патологического состояния у субъекта, или факторов риска, связанных с целевым или предполагаемым заболеванием или патологическим состоянием. Эти способы скрининга включают, например, офтальмологическое исследование, чтобы определить, страдает ли субъект от глазных заболеваний. Эти и другие стандартные способы позволяют практикующему врачу выбрать субъектов, нуждающихся в терапии. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения офтальмологические композиции для хранения, очистки, повторного увлажнения и/или дезинфецирования контактных линз, а также композиции искусственной слезы и/или контактные линзы содержат один или более коллектин и/или поверхностно-активный белок, таким образом ингибируя развитие глазных болезней у людей, которые носят контактные линзы.
Сопутствующее введение известного терапевтического препарата от рака или терапевтического препарата от воспаления с фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению означает введение указанного препарата и композиции, которая является ингибитором тканевого фактора, например антитела или низкомолекулярного соединения, в такой момент времени, когда указанный известный препарат и указанная композиция согласно настоящему изобретению будут иметь терапевтический эффект. Такое сопутствующее введение может включать введение указанного антимикробного препарата одновременно (т. е., в одно и то же время), до или после по отношению к введению соединения согласно настоящему изобретению. Для среднего специалиста в данной области не представит сложности определить подходящее время, последовательность и дозировку введения конкретных препаратов и композиций согласно настоящему изобретению.
После выбора подходящего кандидата на роль каркасного участка из того же семейства и/или того же члена семейства, вариабельные области любой из двух или обеих из тяжелой и легкой цепи получали путем прививки СИЕ от исходного вида в гибридные каркасные области. Сборка гибридных антител или гибридных фрагментов антител, имеющих гибридные вариабельные участки цепи, с учетом любого из вышеупомянутых аспектов, может быть выполнена с применением общепринятых способов, известных специалистам в данной области. Например, последовательности ДНК, кодирующие указанные гиб
- 15 014900 ридные вариабельные домены, описанные в данной заявке (т.е., каркасные области из целевого вида и СЭЯ из исходного вида), можно получить путем олигонуклеотидного синтеза и/или ПЦР. Указанную нуклеиновую кислоту, кодирующую СОЯ участки, можно также выделить из антител исходного вида, используя подходящие рестрикционные фрагменты, и лигировать с каркасной областью целевого вида путем лигирования подходящими ферментами для лигирования. В качестве альтернативы, указанные каркасные области вариабельных цепей антитела исходного вида можно изменить путем сайтнаправленного мутагенеза.
Поскольку гибриды конструируют из выбранных среди множества подходящих вариантов, соответствующих каждой каркасной области, существует множество комбинаций последовательностей, которые пригодны для конструирования в соответствии с принципами, описанными в данной заявке. В соответствии с этим, могут быть собраны библиотеки гибридов, имеющие элементы с различными комбинациями отдельных каркасных областей. Такие библиотеки могут представлять собой коллекции последовательностей в электронных базах данных или физические коллекции гибридов.
Формирование физической библиотеки антител или фрагментов антител предпочтительно выполняют с применением синтетических олигонуклеотидов. В одном примере, олигонуклеотиды разработаны таким образом, чтобы они имели перекрывающиеся участки, так что их можно спарить и заполнить с помощью полимеразы, как в методе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выполняют множество этапов удлинения перекрываний, чтобы получить У|, И УН генные вставки. Такие фрагменты сконструированы с участками перекрывания с константными доменами человека так, что их можно слить путем удлинения перекрываний для получения полноразмерных легких цепей и фрагментов тяжелой цепи Еб. Участки легкой и тяжелой Еб цепи можно сшить друг с другом путем удлинения перекрывающихся участков, чтобы получить отдельную вставку ЕаЬ библиотеки, чтобы потом клонировать ее в вектор для дисплея. Также можно применять альтернативные способы сборки генов гуманизированной библиотеки. Например, указанная библиотека может быть собрана из перекрывающихся олигонуклеотидов с применением подхода Лигазной Цепной Реакции (ЛЦР). Сйа1тег5 и др., Вю1се11пк|ис5. 30-2: 249-252, 2001.
Различные формы фрагментов антител можно получить и клонировать в подходящий вектор, чтобы создать библиотеки гибридных антител или библиотеки гибридных фрагментов антител. Например, вариабельные гены можно клонировать в вектор, который содержит, в подходящей рамке считывания, оставшуюся часть необходимого константного домена. Примеры дополнительных фрагментов, которые можно клонировать, включают целые легкие цепи, Еб часть тяжелых цепей, или фрагменты, которые содержат и легкую цепь, и Еб кодирующую последовательность тяжелой цепи. В качестве альтернативы, указанные фрагменты антител, применяемые для гуманизации, могут быть одноцепочечными антителами (бсЕу).
Любой способ отбора из системы дисплея может быть применен в отношении библиотек согласно настоящему описанию. Протоколы отбора для выделения желаемых элементов больших библиотек известны в данной области, как в примере методик фагового дисплея. Такие системы, в которых различные пептидные последовательности представлены на поверхности нитевидных бактериофагов, доказали свою пригодность для создания библиотек фрагментов антител (и последовательностей нуклеотидов, которые их кодируют) для ίη νίίτο селекции и амплификации конкретных фрагментов антител, которые связывают целевой антиген. 8сой и др., 8с1епсе, 249: 386, 1990. Указанные последовательности нуклеотидов, кодирующие участки УН и УЬ, связаны с фрагментами генов, которые кодируют лидерные сигналы, которые направляют их к периплазматическому пространству Е.сой, и, в результате, полученные фрагменты антител оказываются представленными на поверхности бактериофага, обычно как слитые с белками оболочки бактериофага (например, ρΙΙΙ или рУШ). В качестве альтернативы, фрагменты антител оказываются представленными снаружи на капсидах (оболочках фагов) фага лямбда или Т7. Преимущество основанных на фагах систем дисплея состоит в том, что, так как они представляют собой биологические системы, отобранные элементы библиотеки можно амплифицировать просто путем выращивания фага, содержащего выбранный элемент библиотеки, в бактериальных клетках. Более того, поскольку последовательность нуклеотидов, которая кодирует указанный полипептидный элемент библиотеки, содержится на фаговом или фагмидном векторе, секвенирование, экспрессия и последующие генетические манипуляции относительно просты. Способы конструирования библиотек на основе бактериофагового дисплея антител и экспрессионных библиотек на основе фага лямбда хорошо известны в данной области. МсСа££ейу и др., ЫаШге, 348: 552, 1990; Капд и др., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А., 88:4363, 1991.
Настоящее изобретение дополнительно относится к антителам и антигенраспознающим Тклеточным рецепторам (ТСЯ), которые специфично связывают полипептиды согласно настоящему изобретению. Указанные антитела согласно настоящему изобретению включают 1д0 (включая 1д01, 1дО2, 1дО3, и Ι§04), 1дА (включая 1дА1 и 1§А2), Ι§Ό, 1дЕ, или 1дМ, и ΙβΥ. При использовании в данной заявке подразумевается, что термин антитело (АТ) включает целые антитела, включая одноцепочечные целые антитела, и их антигенсвязывающие фрагменты. Наиболее предпочтительно указанные антитела представляют собой фрагменты антител, связывающие антиген человека, согласно настоящему изобретению и включают, без ограничения, ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2, Еб, одноцепочечные Εν§ (^Εν), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Ρνδ (кбЕУ), и фрагменты, включающие либо Уь, либо УН домен.
- 16 014900
Указанные антитела могут быть любого животного происхождения, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно указанные антитела представляют собой антитела человека, мыши, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади или цыпленка.
Антигенсвязывающие молекулы или фрагменты, включая одноцепочечные антитела, могут включать вариабельную область(и) в отдельности, или в комбинации с целыми или частями следующих доменов: шарнирной области, СН1, СН2, и СН3. Также включены в настоящее изобретение любые комбинации из вариабельной области(ей) и доменов шарнирной области, СН1, СН2 и СН3. Настоящее изобретение дополнительно включает моноклональные, поликлональные, химерные, гуманизированные и моноклональные и поликлональные антитела человека, которые специфично связывают полипептиды согласно настоящему изобретению Настоящее изобретение дополнительно включает антитела, антиидиотипические по отношению к антителам согласно настоящему изобретению.
Как отмечалось выше, антитела, подходящие для настоящего изобретения, могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими или обладать более высокой степенью мультиспецифичности. Мультиспецифические антитела могут быть специфичны в отношении различных эпитопов полипептида согласно настоящему изобретению или могут быть специфичны в отношении как полипептида согласно настоящему изобретению, так и гетерологичной композиции, такой как гетерологичный полипептид или вещество твердофазного носителя. См., например, XV О 93/17715; XVО 92/08802; XVО 91/00360; XV О 92/05793; Тий и др., 1. 1ттипо1. 147: 60-69, 1991; патенты США с номерами 5573920; 4474893; 5601819; 4714681; 4925648, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях; Ко§1е1пу и др., 1. 1ттипо1. 148: 1547-1553, 1992.
Антитела, подходящие для настоящего изобретения, могут быть описаны, или точно определены в контексте эпитопа(ов) или части(ей) полипептида согласно настоящему изобретению, которые опознаются или специфично связываются антителом. Указанный эпитоп(ы) или часть(и) полипептида могут быть точно определены, как описано в данной заявке, например, по их Ν-концевому и С-концевому положениям, по размеру, выраженному количеством следующих друг за другом остатков аминокислот. Антитела, которые специфическим образом связывают любой эпитоп или полипептид согласно настоящему изобретению, могут также быть исключены. Таким образом, настоящее изобретение включает антитела, которые специфично связывают полипептиды согласно настоящему изобретению, и допускает исключение таких антител.
Антитела согласно настоящему изобретению могут также быть описаны или точно определены в контексте их перекрестной реактивности. Включены антитела, которые не связывают никакого другого аналога, ортолога или гомолога полипептидов согласно настоящему изобретению. Антитела, которые не связывают полипептиды, менее чем на 95%, менее чем на 90%, менее чем на 85%, менее чем на 80%, менее чем на 75%, менее чем на 70%, менее чем на 65%, менее чем на 60%, менее чем на 55% и менее чем на 50% идентичные (расчет методами, известными в данной области и описанными в данной заявке) полипептиду согласно настоящему изобретению, также включены в настоящее изобретение. Дополнительно включены в настоящее изобретение антитела, которые связывают только полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые гибридизуются с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению при строгих условиях гибридизации (как описано в данной заявке). Антитела согласно настоящему изобретению могут также быть описаны или точно определены в контексте их аффинности связывания. Предпочтительная аффинность связывания включает такие значения, при которых константа диссоциации, или К меньше 5 х 10-6М, 10-6М, 5 х 10-7М, 10-7 М, 5 х 10-8М, 10-8М, 5 х 10-9М, 10-9М, 5 х 10-10М, 1010М, 5 х 10-11М, 10-11М, 5 х 10-12М, 10-12М, 5 х 10-13М, 10-13М, 5 х 10-14М, 10-14М, 5 х 10-15М и 10-15М.
Антитела, которые ингибируют передачу сигнала через тканевый фактор, имеют применения, которые включают, без ограничения, способы, известные в данной области для очистки, обнаружения и нацеливания на полипептиды согласно настоящему изобретению, включая методы как ίη νίίτο, так и ίη νίνο диагностики и терапии. Например, указанные антитела можно применять в иммуноанализах для качественного и количественного измерения уровней полипептидов согласно настоящему изобретению в биологических образцах. См., например, Нат1оте и Ьапе, выше, включенные в данную заявку посредством полного объема ссылок и во всех отношениях.
Антитела согласно настоящему изобретению можно применять либо отдельно, либо в комбинации с другими композициями. Указанные антитела могут быть дополнительно рекомбинантным путем присоединены к гетерологичному полипептиду на Ν- или С-конце или химически конъюгированы (включая ковалентное и нековалентное связывание) с полипептидами или другими композициями. Например, антитела согласно настоящему изобретению можно рекомбинантным способом пришить или конъюгировать с молекулами, которые применяют в качестве меток в тестах для детекции, и эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные препараты или токсины. См., например, ХХ'О 92/08495; ХХ'О 91/14438; ХХ'О 89/12624; патент США № 5314995 и ЕР 0396387, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях.
Антитела согласно настоящему изобретению можно получить любым подходящим способом, известным в данной области. Например, полипептид согласно настоящему изобретению или его антиген
- 17 014900 ный фрагмент можно ввести животному для индукции образования сыворотки, содержащей поликлональные антитела. Термин моноклональное антитело не ограничен антителами, получаемыми по гибридомной технологии. Указанный термин моноклональное антитело относится к антителу, которое получено из отдельного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, но не к способу, которым оно получено. Моноклональные антитела можно получить с применением множества методик, известных в данной области, включая применение гибридомной, рекомбинантной технологий и технологии фагового дисплея.
Гибридомные методики включают методики, известные в данной области и описанные в Наг1оте и Ьапе, выше; Наттегйпд и др., Мопос1опа1 АпИЬоб1ез апб Т-Се11 НуЬпботаз, 563-681, 1981, указанные источники полностью включены в данную заявку посредством ссылки. Фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')2 можно получить путем протеолитического расщепления, используя ферменты, такие как папаин (для получения фрагментов ) или пепсин (для получения фрагментов Е(аЬ')2).
В качестве альтернативы, антитела, которые ингибируют передачу сигнала через тканевый фактор, можно получить путем применения технологий рекомбинантной ДНК и фагового дисплея или с помощью синтетической химии, применяя методы, известные в данной области. Например, антитела согласно настоящему изобретению можно получить, применяя различные способы фагового дисплея, известные в данной области. В способах фагового дисплея функциональные домены антител выставляются на поверхности фаговой частицы, которая несет полинуклеотидные последовательности, кодирующие их. Фаги с необходимой связывающей способностью выбирали из набора или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши) путем отбора непосредственно с помощью антигена, обычно антиген связан или фиксирован на твердой поверхности или шарике. Фаги, применяемые в этих способах, обычно представляют собой нитевидные фаги, включающие Гб и М13 с ЕаЬ, Еν или со стабилизированными дисульфидными связями Еν доменами антител, рекомбинантно пришитыми либо к гену III фага, либо к продукту гена УШ. Примеры способов фагового дисплея, которые можно применять для получения антител согласно настоящему изобретению, включают те, которые раскрыты в Вппктап и др., к 1ттипо1. Мебюбз 182: 41-50, 1995; Атез и др., 1. 1ттипо1. Мебюбз 184: 177-186, 1995; Кеб1еЬогоидй и др., Еиг. 1. 1ттипо1. 24: 952-958, 1994; Регзю и др., Сепе 187: 9-18, 1997; ВигГоп и др., Абνаηсез ίη 1ттипо1оду 57: 191-280, 1994; РСТ/СВ91/01134; АО 90/02809; АО 91/10737; АО 92/01047; АО 92/18619; АО 93/11236; АО 95/15982; АО 95/20401; и в патентах США с №№ 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727 и 5733743, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях.
Как описано в упомянутых выше источниках, после отбора фагов, из фага можно выделить участки, кодирующие антитело, и использовать их для получения целого антитела, включая антитело человека, или любого другого необходимого для связывания антигена фрагмента, и экспрессировать в любом необходимом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии. Например, можно также применять методики рекомбинантного получения фрагментов ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2, с использованием методов, известных в данной области, таких как методы, раскрытые в АО 92/22324; МиШпах и др., ВюТесйтдиез 12: 864-869, 1992; и 8а^а1 и др., ΑΙΒΙ34: 26-34, 1995; и Вебег и др., 8с1епсе 240: 1041-1043, 1988.
Примеры методик, которые можно применять для получения одноцепочечных Еνз и антител, включают методики, описанные в патентах США с №№ 4946778 и 5258498, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях; НизЮп и др., Мебюбз ш Епхуто1оду, 203: 46-88, 1991; 8Ьи, Ь. и др., ΡΝΑ8 90: 7995-7999, 1993; и 8кегга и др., 8аепсе 240: 1038-1040, 1988. Для некоторых вариантов применения, включая применение антител ш νί\Ό у людей и тесты ш νίΙΐΌ для определения антител, может оказаться предпочтительным применение химерных, гуманизированных антител или антител человека. Способы получения химерных антител известны в данной области. См., например, Мотзоп, 8аепсе 229: 1202, 1985; О1 и др., ВюТесйтдиез 4: 214, 1986; С1Шез и др., 1. 1ттипо1. МеШобз, 125: 191-202, 1989 и патент США № 5807715. Антитела можно гуманизировать, применяя множество методик, включающих пересадку СОВ (ЕР 0239400; АО 91/09967; и патенты США с №№ 5530101 и 5585089), замену поверхностных аминокислот (тепееппд) или шлифовку (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Раб1ап Е.А., Мо1еси1аг 1ттипо1оду, 28: 489-498, 1991; 81ибшска и др., РгоГет Епдшееппд 7: 805-814, 1994; Водизка и др., ΡΝΑ8 91: 969-973, 1994), и перестановку цепей (патент США с номером 5,565,332). Антитела человека можно получить множеством способов, известных в данной области, включая способы фагового дисплея, описанные выше. См. также патенты США с номерами 4444887; 4716111; 5545806 и 5814318; и АО 98/46645; АО 98/50433; АО 98/24893; АО 98/16654; АО 96/34096; АО 96/33735 и АО 91/10741, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях.
Дополнительно в настоящее изобретение включены антитела, рекомбинантно слитые (гибридизованные) или химически конъюгированные (включая как ковалентную, так и нековалентную конъюгацию) с полипептидом согласно настоящему изобретению. Указанные антитела могут обладать специфичностью к антигенам, отличным от полипептидов согласно настоящему изобретению. Например, ан
- 18 014900 титела могут применять для направленной доставки полипептидов согласно настоящему изобретению к определенным типам клеток, либо ίη νίίτο, либо ίη νίνο, путем слияния или конъюгирования полипептидов согласно настоящему изобретению с антителами, специфичными к конкретным рецепторам клеточной поверхности. Антитела, слитые или конъюгированные с полипептидами согласно настоящему изобретению, также можно применять в ίη νίίτο иммуноанализах и методах очистки, применяя способы, известные в данной области. См., например, НагЬог и др., выше, и АО 93/21232; ЕР 0439095; Ыагатига и др., 1ттипо1. ЬеВ 39: 91-99, 1994; патент США № 5474981, полностью включены в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях; СШтек и др., ΡΝΑ8 89: 1428-1432, 1992; Ее11 и др., 1. 1ттипо1. 146: 2446-2452, 1991.
Настоящее изобретение дополнительно включает композиции, включающие полипептиды согласно настоящему изобретению, слитые или конъюгированные с доменами антител, отличными от вариабельных областей. Например, указанные полипептиды согласно настоящему изобретению можно гибридизовать или конъюгировать с Ес-участком антитела, или его частью. Часть антитела, слитая с полипептидом согласно настоящему изобретению, может включать указанную шарнирную область, домен СНЬ домен СН2 и домен СН3 или любую комбинацию целых доменов или их частей. Полипептиды согласно настоящему изобретению можно гибридизовать или конъюгировать с указанной выше частью антитела, чтобы увеличить время полужизни полипептидов ίη νίνο, или для применения в вариантах иммуноанализа, с применением способов, известных в данной области. Указанные полипептиды также можно «слить» (гибридизовать) или конъюгировать с указанной выше частью антитела для образования мультимеров. Например, Ес части, слитые с полипептидами согласно настоящему изобретению, могут образовывать димеры путем образования дисульфидной связи между указанными Ес частями. Мультимерные формы более высокого порядка можно получить путем гибридизации указанных полипептидов с частями 1дА и 1дМ. Способы слияния или конъюгирования полипептидов согласно настоящему изобретению с частями антител известны в данной области. См., например, патенты США с номерами 5336603; 5622929; 5359046; 5349053; 5447851; 5112946; ЕР 0307434, ЕР 0367166; АО 96/04388 и АО 91/06570, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях; Ак11кег1а/1 и др., ΡΝΑ8, 88: 10535-10539, 1991; Ζ^η§ и др., 1. ^тигок, 154: 5590-5600, 1995; и У11., ΡΝΑ8, 89: 1133711341, 1992.
Настоящее изобретение дополнительно относится к антителам, которые действуют как антагонисты передачи сигнала через тканевый фактор в настоящем изобретении. Например, настоящее изобретение включает антитела, которые нарушают взаимодействия рецептор/лиганд с уникальной конформацией полипептидов согласно настоящему изобретению, либо частично, либо полностью. Изобретение охватывает как рецептор-специфичные антитела, так и лиганд-специфичные антитела. Изобретение охватывает рецептор-специфичные антитела, которые не предотвращают связывание лиганда, но предотвращают передачу сигнала через рецептор. Передачу сигнала через рецептор можно определить с помощью методик, описанных в данной заявке, или других известных в данной области. Также изобретение охватывает рецептор-специфичные антитела, которые предотвращают как связывание лиганда, так и передачу сигнала через рецептор. Подобным образом, изобретение охватывает нейтрализующие антитела, которые связывают указанный лиганд и препятствуют связыванию лиганда с рецептором, а также антитела, которые связывают указанный лиганд, тем самым препятствуя передачи сигнала через рецептор, но не препятствуют связыванию лиганда с рецептором. Дополнительно включены антитела, которые активируют указанный рецептор. Эти антитела могут действовать как антагонисты либо всех, либо меньшего числа видов биологической активности, зависящих от опосредуемой лигандом передачи сигнала через рецептор. Указанные антитела можно точно определить как антагонисты видов биологической активности, включая специфические виды активности, раскрытые в данной заявке. Упомянутые выше антителаантагонисты можно получить, применяя методы, известные в данной области. См., например, АО 96/40281; патент США номер 5,811,097, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях; Эемд и др., Β1οοά 92: 1981-1988, 1998; Сйещ и др., Самсет Век., 58: 3668-3678, 1998; Нап-ορ и др., 1. ^тигок 161: 1786-1794, 1998; ΖΙιιι и др., Сагсег Век., 58: 3209-3214, 1998; Υοοη, и др., 1. Iттиηο1., 160: 3170-3179, 1998; Рга1 и др., 1. Се11. 8ск, 111: 237-247, 1998; РПагй и др., 1. Iттиηο1. МеОюйк, 205: 177-190, 1997; Ь1аи1агй и др., СуФктйе, 9: 233-241, 1997; ί/πΊκοη и др., 1. Βίο1. СЬет., 272: 11295-11301, 1997; Та^утаη и др., Νοικοη, 14: 755-762, 1995; Ми11ег и др., 81гис1иге, 6: 11531167, 1998; ВагЦтек и др., СуФкшет, 8: 14-20, 1996. Как обсуждалось выше, антитела, которые ингибируют передачу сигнала через тканевый фактор на неопластических клетках или воспалительных клетках, можно, в свою очередь, применять для получения антиидиотипических антител, которые имитируют полипептиды согласно настоящему изобретению, с применением методик, хорошо известных специалистам в данной области. (См., например, Οι^^ροη и др., ЕА8ЕВ 1. 7: 437-444, 1989 и Νίκκίηοίί, 1. Iттиηο1. 147: 2429-2438, 1991). Например, антитела, которые связываются с полипептидом и конкурентно ингибируют мультимеризацию полипептидов и/или связывание полипептида согласно настоящему изобретению с лигандом, можно применять для получения антиидиотипов, которые имитируют мультимеризацию полипептидов и/или домен связывания и, как следствие, связывают и нейтрализуют полипептид и/или его лиганд. Такие нейтрализующие антиидиотипы или ЕаЬ фрагменты таких антиидиоти
- 19 014900 пов можно применять в терапевтических программах для нейтрализации лиганда полипептида. Например, такие антиидиотипические антитела можно применять для связывания полипептида согласно настоящему изобретению и/или для связывания его лигандов/рецепторов, и, тем самым, блокировать их биологическую активность.
Ингибиторы, активаторы и модуляторы передачи сигнала через тканевый фактор на неопластических клетках или воспалительных клетках используют для обозначания ингибиторных, активаторных или модуляторных молекул, соответственно, определенных с применением ш νίΙΐΌ и ш у1уо тестов на связывание или передачу сигнала через тканевый фактор, например лиганды, агонисты, антагонисты, и их гомологи и миметики.
Модулятор включает ингибиторы и активаторы. Ингибиторы представляют собой агенты, которые, например, связывают, частично или полностью блокируют стимуляцию, снижают, предотвращают, задерживают активацию, инактивируют, десенсибилизируют или подавляют активность передачи сигнала через тканевый фактор, например антагонисты. Активаторы представляют собой агенты, которые, например, связывают, стимулируют, повышают, открывают, активируют, способствуют, усиливают активацию, сенсибилизируют или активиуют передачу сигнала через тканевый фактор, например, агонисты. Модуляторы включают агенты, которые, например, изменяют взаимодействие сигнального тканевого фактора с белками, которые связывают активаторы или ингибиторы, с рецепторами, включая белки, пептиды, липиды, карбогидраты, полисахариды или их комбинацию, например липобелки, гликобелки, и тому подобными. Модуляторы включают генетически измененные варианты природного сигнального тканевого фактора, например, с измененной активностью, также, как природные и синтетические лиганды, антагонисты, агонисты, низкомолекулярные соединения и тому подобные. Такие тесты на определение ингибиторов включают, например, воздействие предполагаемого модуляторного соединения на клетки, экспрессирующие сигнальный тканевый фактор и затем определение функциональных эффектов на передачу сигнала через тканевый фактор, как описано в данной заявке. Образцы или тесты, включающие тканевый фактор, которые обрабатывают потенциальным активатором, ингибитором или модулятором, сравнивают с контрольными образцами без ингибитора, активатора, или модулятора для определения степени ингибирования. Контрольным образцам (необработанным ингибиторами) можно присвоить относительное значение передачи сигнала через тканевый фактор, равное 100%. Ингибирование достигается, когда значение активности передачи сигнала через тканевый фактор по отношению к контролю приблизительно равно 80%, возможно 50 или 25-0%.
Способность молекулы связываться с сигнальным тканевым фактором можно определить, например, по способности предполагаемого лиганда связываться с сигнальным тканевым фактором на клетках.
Специфичность связывания можно определить путем сравнения связывания с клетками, в которых есть только коагуляторный тканевый фактор.
В одном варианте реализации связывание антитела с сигнальным тканевым фактором можно тестировать путем иммобилизации либо лиганда, либо рецептора. Например, указанный тест может включать иммобилизацию тканевого фактора, измененного таким образом, чтобы имитировать сигнальную конформацию, слитого с гистидиновой меткой, на Νί-активированной нитрилотриацетатной (НТА) гранулированной ионообменной смоле. Антитело можно добавить в подходящий буферный раствор с гранулами, инкубировать в течение некоторого времени при заданной температуре. После промывок для удаления несвязавшегося вещества, связанный белок можно высвободить с помощью, например, ДСН, буферных растворов с высокой рН, и тому подобных, и анализировать.
Химерные белки
Антитела к сигнальному тканевому фактору можно применять для получения химерных белков. Например, антитела согласно настоящему изобретению, слитые с другим белком, можно применять в качестве антигенной метки для очистки указанного антитела или для повышения стабильности антитела как терапевтического средства в качестве ингибитора передачи сигнала через тканевый фактор.
Примеры доменов, которые можно гибридизовать с полипептидами, включают не только гетерологичные сигнальные последовательности, но также другие гетерологичные функциональные участки. Гибридизация не обязательно должна быть непосредственной, ее можно также осуществлять через линкерные последовательности.
Для улучшения свойств полипептида можно также создать химерные белки. Например, участок из дополнительных аминокислот, замененных в конкретных положениях аминокислот, можно присоединить к Ν-концу полипептида, чтобы улучшить его стабильность и устойчивость во время выделения из клеток хозяина или последующего манипулирования и хранения. Также пептидные молекулы можно присоединить к указанному полипептиду для улучшения очистки. Такие участки можно удалить перед окончательным этапом получения полипептида. Добавление пептидных молекул для облегчения манипуляций с полипептидами требует применения лишь общеизвестных и стандартных методик в данной области.
Более того, композиции антител и композиции, которые ингибируют передачу сигнала через тканевый фактор, включая фрагменты и, в частности, эпитопы, можно объединить с частями константного домена иммуноглобулинов (1дС), что даст химерные полипептиды. Такие химерные белки улучшают
- 20 014900 очистку и имеют большее время полужизни ίη νίνο. Один из известных примеров описывает химерные белки, состоящие из первых двух доменов полипептида СЭ4 человека и нескольких доменов константных областей тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов млекопитающих. ЕР А 394,827; Тгаипескег и др., №11иге. 331: 84-86, 1988. Химерные белки, имеющие связанные дисульфидными связями димерные структуры (за счет ί§0), также могут быть более эффективны в связывании и нейтрализации других молекул, отличных от мономерного секретированного белка или белкового фрагмента по отдельности. Роип!ои1ак18 и др., 1. Вюскет. 270: 3958-3964, 1995.
Аналогичным образом, ЕР-А-0 464533 (канадский аналог: 2045869) раскрывает химерные белки, включающие различные части константной области молекул иммуноглобулинов вместе с другим белком человека или его частью. Во многих случаях Рс часть в химерном белке полезна для терапии и диагностики, и, таким образом, ее наличие может приводить, например, к улучшению фармакокинетических свойств (ЕР-А 0232262). В качестве альтернативы, осуществляют удаление части Рс после экспрессии, обнаружения и очистки химерного белка. Например, часть Рс может препятствовать терапии и диагностике, если химерный белок применяют в качестве антигена для иммунизаций. При разработке лекарственных препаратов, например, белки человека, такие как 1Ь-5 человека, гибридизовали с частями Рс для высокопроизводительного скрининга для обнаружения антагонистов 1Ь-5 человека. Веппей и др., Г Мо1еси1аг Кесодпйюп 8: 52-58, 1995; К. Фкапкоп и др., 1. Вю1. Скет., 270: 9459-9471, 1995.
Более того, полипептиды можно гибридизовать с маркерными последовательностями, такими как пептид, который улучшает очистку слитого полипептида. В предпочтительных вариантах реализации указанная маркерная последовательность аминокислот представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, имеющаяся в векторе рОЕ (ΟΙΛΟΕΝ, 1пс., 9259 ЕЮп Аνеηие, Чатсворс, Калифорния, 91311), среди остальных, многие из которых доступны для приобретения. Как описано в Сеп1х и др., Ргос. Ν;·ι11. Асай. 8ск И8А 86: 821-824, 1989, например, гексагистидин обеспечивает удобную очистку химерного белка. Другая пептидная метка, применяемая для очистки, гемагглютининовая метка (ГА), соответствует эпитопу, полученному из белка гемагглютинина вируса гриппа. ^11§оп и др., Се11 37: 767, 1984.
Таким образом, с применением полинуклеотидов или полипептидов согласно настоящему изобретению можно сконструировать любые из описанных выше слитых молекул.
Фаговые библиотеки на основе одноцепочечных ГУ (8СГУ)
Библиотеку антител ксЕу, которые ингибируют передачу сигнала через тканевый фактор у субъекта, относящегося к млекопитающим, и которые не нарушают гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим, можно применять для лечения ангиогенеза, неопластического заболевания или воспалительного заболевания. Одним подходом для определения в библиотеке на основе фагового дисплея композиции антител, которая специфическим образом связывает и ингибирует сигнальный тканевый фактор, но не повышает риск кровотечения, было применение фаговых библиотек на основе ксЕу (см., например, НикФп и др., Ргос. №Й. Асай. 8с1 И.8.А., 85: 5879-5883, 1988; Скаийкагу и др., Ргос. Ν;·ι11. Асай. 8с1 И.8.А., 87: 1066-1070, 1990. Были описаны различные варианты реализаций ксЕу библиотек, выставленные на белках оболочки бактериофагов. Усовершенствованные варианты подходов на основе фагового дисплея также известны, например, как описано в \Ч0 96/06213 и \Ч0 92/01047 (Мейюа1 Кекеагск Соипсй и др.) и XVО 97/08320 (Могркокук), которые включены в данную заявку посредством ссылки. Также известен дисплей РаЬ библиотек, например, как описано в νθ 92/01047 (САТ/МКС) и νθ 91/17271 (АГГутах).
Можно отобрать гибридные антитела или фрагменты гибридных антител, клонированные в вектор для дисплея, которые ингибируют передачу сигнала через тканевый фактор, для лечения неопластического заболевания или воспалительного заболевания, с целью определить варианты, которые сохраняли хорошую активность связывания, так как указанное антитело или фрагмент антитела будет представлен на поверхности фаговой или фагмидной частицы. См., например, ВагЬак III и др., Ркаде О18р1ау, А ЬаЬотаФту Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогаФту Ргекк, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, 2001, содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки. Например, в случае РаЬ фрагментов, продукты легкой цепи и тяжелой цепи Рй находятся под контролем 1ас промотора, и каждая цепь имеет пришитый к ней лидерный сигнал, который направляет ее в периплазматическое пространство бактерии-хозяина. Там достаточно пространства для того, чтобы фрагменты антител смогли правильно собраться. Фрагменты тяжелой цепи экспрессируются сшитыми с доменом белка оболочки фага, что позволяет собранному фрагменту антитела встроиться в оболочку вновь созданной фаговой или фагмидной частицы. Получение новых фагмидных частиц требует добавления фага-помощника, который содержит все необходимые фаговые гены. Как только библиотека фрагментов антител представлена на поверхности фага или фагмиды, следует процесс, называемый пэннингом. Это метод, в котором: ί) указанные антитела, представленные на поверхности фаговой или фагмидной частиц, связываются с нужным антигеном, ίί) несвязавшихся смывают, ίίί) связавшиеся частицы элюируют с антигена, и ίν) элюированные частицы встраивают в свежие бактерии-хозяева, чтобы амплифицировать обогащенный пул для дополнительного раунда селекции. Обычно выполняют три или четыре раунда пэннинга перед скринингом клонов антител на специфичность связывания. Таким путем, фаговые/фагмидные частицы позволяют связать фенотип свя
- 21 014900 зывания (антитело) с генотипом (ДНК), что делает успешным применение технологии дисплея антител. Тем не менее, можно применять другие виды векторов для этого процесса гуманизации, такие как клонирование библиотеки фрагментов антитела в литический фаговый вектор (системы модифицированного Т7 или Лямбда Ζηρ) для селекции и/или скрининга.
После отбора нужных гибридных антител и/или фрагментов гибридных антител предполагается, что их можно получить в большом объеме с помощью любой методики, известной специалистам в данной области, например путем экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках, и тому подобных. Например, гибридные антитела или фрагменты можно получить с применением традиционных методик конструирования экспрессионного вектора, который кодирует тяжелую цепь антитела, в которой СОК. и, если это необходимо, минимальная часть вариабельного домена каркасной области, которые необходимы для сохранения оригинальной специфичности связывания антитела того вида, от которого оно произошло (что можно разработать согласно методикам, описанным в данной заявке), получены из антитела исходного вида, и остальная часть антитела получена из иммуноглобулина целевого вида, над которым можно проводить манипуляции, как описано в данной заявке, получая тем самым вектор для экспрессии тяжелой цепи гибридного антитела.
В расширенном варианте реализации, библиотеки одноцепочечных антител Εν (ксЕу) можно сделать из лимфоцитов периферической крови 5, 10, 15, или 20 или более пациентов с различными раковыми заболеваниями. Полностью человеческие высокоаффинные антитела ксЕу затем можно отобрать, применяя синтетические сиалил-Льюис-х и Льюис-х БСА конъюгаты. В одном исследовании, эти человеческие ксЕу антитела были специфичны к сиалил-Льюис-х и Льюис-х, что показано методами твердофазного иммуноферментного анализа (ЕБ18А), В1Асоге и проточной цитометрии для связывания с клеточной поверхностью клеток панкреатической аденокарциномы. Секвенирование нуклеотидной последовательности выявило, что было получено по меньшей мере четыре уникальных ксЕу гена. Значения константы диссоциации Κι варьировались от 1,1 до 6,2 х 10-7М, что было сравнимо с аффинностями МАТ, полученных при вторичном иммунном ответе. Эти антитела могут быть значимыми реагентами для исследования структуры и функции карбогидратных антигенов и для лечения опухолевых заболеваний человека. Мао и др., Ргос. ИаИ. Асаб. 8сЕ (И8А 96: 6953-6958, 1999).
В дополнительно расширенном варианте реализации комбинаторные библиотеки антител на основе фагового дисплея можно применять для получения и отбора широкого спектра антител к подходящему антигену, например антител, которые ингибируют передачу сигнала через тканевый фактор для лечения неопластического заболевания или воспалительного заболевания. Белки оболочки фага рУИ и р1Х можно применять для дисплея гетеродимерной структуры Εν участка антитела. Перспективы данной технологии были расширены до конструирования большой библиотеки одноцепочечных антител Εν (ксЕу) человека из 4,5х109 элементов, представленных на р1Х нитевидного бактериофага. Более того, многообразие, качество и полезность указанной библиотеки были показаны путем селекции клонов ксЕу против шести различных белковых антигенов. Стоит заметить, что более чем 90% отобранных клонов проявили положительное связывание с соответствующими антигенами после всего трех раундов пэннинга. Исследованные ксЕук также имели высокую аффинность. Например, кинетический анализ (В1Асоге) выявил, что ксЕук против стафилококкового энтеротоксина В и субъединицы холерного токсина В имели наномолярные и субнаномолярные константы диссоциации, соответственно, обеспечивая аффинности, сравнимые или превосходящие таковые для МАТ, полученных при иммунизации. Высокая специфичность была также достигнута, не только между очень разными белками, но также в случае более близко родственных белков, например Ктстик соттишк (рицин) агглютининов (КСА60 и КСА120). Несмотря на >80% гомологию последовательностей этих двух белков. Указанные результаты позволили предположить, что производительность р1Х-дисплейных библиотек потенциально может превосходить таковую для библиотеки р111-дисплейного формата и делает их идеально подходящими для пэннинга широкого спектра целевых антигенов. Сао и др., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 99: 12612-12616, 2001.
Специфическое связывание между антителом или другим связывающим агентом и антигеном означает, что аффинность связывания равна по меньшей мере 10-6 М. Предпочтительные связывающиеся агенты связываются с аффинностями, равными по меньшей мере приблизительно 10-7 М, и предпочтительно от 10-8 до 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М, или 10-12 М. Термин эпитоп подразумевает антигенную детерминанту, способную специфическим образом связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфичные трехмерные структурные характеристики, также, как и специфичные зарядные характеристики. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, но не с последними, нарушается при наличии денатурирующих растворителей.
Тесты на иммунологическое связывание для определения передачи сигнала через тканевый фактор и ее модуляторов
Настоящее изобретение предусматривает способы обнаружения передачи сигнала через тканевый фактор и идентификации модуляторов передачи сигнала через тканевый фактор. Как описано более подробно ниже, некоторые из указанных способов направлены на идентификацию модуляторов передачи
- 22 014900 сигнала через тканевый фактор в тесте, основанном на клеточной системе. Некоторые другие способы направлены на идентификацию модуляторов передачи сигнала через тканевый фактор в бесклеточной системе. В некоторых вариантах реализации тестируемые соединения подвергают скринингу для идентификации модуляторов тканевого фактора, которые ингибируют или подавляют ТЕ/УПа опосредуемые сигнальные активности, но не нарушают гемостаз ίη νίνο. Такие модуляторы (например, модуляторы, представляющие собой малые молекулярные органические соединения) можно идентифицировать, используя известное соединение, которое проявляет такие желательные свойства (например, МАТ 10Н10) в ряде видов конкурентных тестов, описанных в данной заявке. Таким образом, некоторые способы скрининга, согласно настоящему изобретению, направлены на идентификацию соединения, которое ингибирует ТЕ/УПа сигналинг, но не блокирует коагуляцию. Эти способы включают измерение, в присутствии или отсутствии тестируемого соединения, связывания между (ί) антителом или антигенсвязывающей молекулой, имеющей специфичность связывания, как у МАТ 10Н10 и (ίί) полипептидом тканевого фактора, и затем определение ингибирования связывания при наличии тестируемого соединения по отношению к связыванию в отсутствие тестируемого соединения. В некоторых из этих способов используется мышиное МАТ 10Н10, продуцируемое гибридомой с номером доступа АТСС: НВ9383. В некоторых из способов скрининга применяют тестируемые соединения, которые предпочтительно представляют собой малые молекулярные органические соединения, например химические соединения с молекулярным весом не более чем приблизительно 5000, и более предпочтительно не более чем приблизительно 2,500, 1,000 или 500.
Любые из видов методик и тестов, описанных в данной заявке, можно применять для реализации этих способов. В добавление к измерению их способности конкурировать с МАТ 10Н10 за связывание с тканевым фактором модуляторы, определенные таким образом, можно дополнительно проверить на активность модулирования передачи сигнала через тканевый фактор (например, активности ингибирования передачи сигнала через ТЕ/УПа, в то же время без значительного влияния на гемостаз). Указанные соединения можно проверить на активность ингибирования любого пути передачи сигнала, опосредуемого ТЕ/УНа, как описано в данной заявке (например, фосфорилирования киназы митогенактивируемого белка (МАР киназы) или образования комплекса и передачи сигнала через активируемый протеазами рецептор 2). Тесты для измерения активностей опосредуемой ТЕ/УПа передачи сигнала хорошо известны в данной области. Как приведено в качестве примера в примере 8, ниже, активность ТЕ/УПа опосредуемой передачи сигнала можно количественного измерить с помощью теста на фосфорилирование МАР киназы, например, тестированием с помощью вестерн-блоттинга уровня фосфорилирования МАР киназы (например, ЕКК киназа) в эндотелиальных клетках пупочной вены человека НИУЕС или клетках яичников китайских хомячков СНО, стимулированных факторами УИа и X. Эти тесты можно применять в способах скрининга, описанных в данной заявке, для идентификации новых модуляторных соединений (например, ингибиторов) для передачи сигнала через ТЕ. Их также можно применять в терапевтических способах согласно настоящему изобретению для наблюдения эффекта применяемого ингибитора на передачу сигнала через ТЕ. Соединение считают ингибитором передачи сигнала через ТЕ, если указанное соединение может ингибировать активность передачи сигнала через ТЕ на по меньшей мере 50%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 90%, или на по меньшей мере 95% по отношению к передаче сигнала через ТЕ в отсутствии указанного соединения. Количественное ингибирование можно измерить с помощью любого из тестов на передачу сигнала через ТЕ, хорошо известных в данной области (см., например, АНашсй и др., Βίοοά 105:2384-91, 2005) или описанных в данной заявке, например снижение уровня фосфорилирования ЕКК в НИУЕС клетках на протяжении 6 дней при условиях, описанных в примере 8, ниже.
С применением любых способов тестирования, известных в данной области или описанных в данной заявке, соединения, идентифицированные способами скрининга, (или какой-либо ингибитор, применяемый в терапевтических способах согласно настоящему изобретению) можно дополнительно исследовать, чтобы удостовериться, что они не оказывают значительного влияния на опосредуемые тканевым фактором гомеостатические активности (например, коагуляцию). Например, ТЕ опосредуемую коагуляторную активность можно измерить путем измерения количества продукции фактора Ха в НаСаТ клетках с помощью вестерн-блоттинга, как показано в примерах ниже. Эти тесты можно применять для изучения тестируемых соединений, используемых в методах скрининга согласно настоящему изобретению или ингибиторных соединений, применяемых в терапевтических методах настоящего изобретения. Соединение не нарушает или не предотвращает активацию (т.е. не имеет значимого эффекта) ТЕопосредуемого гемостаза (например, коагуляции), если его наличие не приводит к более чем 5%, более чем 10%, более чем 15%, или более чем 25% снижению гомеостатической активности (например, коагуляторной активности, что измеряли с помощью теста на образование Ха, при условиях, описанных в данной заявке) по отношению к таковой в отсутствие указанного соединения. В некоторых вариантах реализации можно исследовать потенциальную блокирующую активность соединения на коагуляцию путем тестирования эффекта указанного соединения на связывание тканевого фактора антителом, которое, как известно, блокирует коагуляцию, опосредованную тканевым фактором. Одно такое антитело представляет собой моноклональное антитело 5С9. продуцируемое гибридомой с номером доступа
- 23 014900
АТСС: НВ9382. Ингибиторные активности этого антитела на коагуляцию и подходящие тесты раскрыты очень детально в патенте США № 5223427. Отсутствие значимого эффекта соединения на связывание МАТ 5С5 с тканевым фактором (например, снижения на по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 75% или более) свидетельствует о том, что указанное соединение скорее всего не блокирует коагуляцию, опосредованную тканевым фактором.
Передачу сигнала через тканевый фактор можно также детектировать и/или определить количественно, применяя любой из хорошо известных тестов на иммунологическое связывание (см., например, патенты США 4366241; 4376110; 4517288 и 4837168). Антитела, применимые для иммунологических тестов связывания, могут действовать как ингибиторы передачи сигнала через тканевый фактор, не нарушая гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим. Указанные тесты на иммунологическое связывание проводят с антителами для диагностики или лечения заболевания, зависящего от измененной передачи сигнала через тканевый фактор/фактор УПа у субъекта, относящегося к млекопитающим. Например, МАТ 10Н10 представляет собой антитело, которое действует как ингибитор передачи сигнала через тканевый фактор, не нарушая гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим, и оно применимо в тестах на иммунологическое связывание, как вариант реализации согласно настоящему изобретению. Для обзора стандартных способов иммуноанализа, см. также Мейюйк 1и Се11 Вю1оду: АиНЬоЛек ш Се11 Вю1оду, т. 37 (Акад изд. 1993); Ваис аий Сйшса1 1ттиио1оду (8Шек & Тегг, ред., 7-ое изд. 1991). В тестах на иммунологическое связывание (или способах иммуноанализа) обычно применяют антитело, которое специфическим образом связывается с выбранным белком или антигеном (в этом случае, с тканевым фактором или его антигенной подпоследовательностью). Указанное антитело (например, антитело к тканевому фактору) можно получить любым из множества способов, хорошо известных специалистам в данной области, и как описано выше.
В способах иммуноанализа также часто применяют агент для мечения для специфичного связывания и мечения комплекса, образованного антителом и антигеном. Указанные вещества для мечения могут сами представлять собой одни из составляющих, включенных в комплекс антитело/антиген. Таким образом, указанным веществом для мечения может быть меченый тканевый фактор. В качестве альтернативы, указанным веществом для мечения может быть другое вещество, такое как вторичное антитело, которое специфическим образом связывается с комплексами антитело/тканевый фактор (вторичное антитело обычно специфическим образом к антителу вида, от которого происходит первое антитело). Другие белки, способные специфическим образом связывать констнантные области иммуноглобулинов, такие как белок А или белок С, можно также применять в качестве вещества для мечения. Эти белки проявляют сильную неиммуногенную реактивность к констнантным областям иммуноглобулинов из множества видов (см., например, Кгоиуа1 и др., 1. 1ттиио1. 111: 1401-1406, 1973; Акегккгот и др., 1. 1ттиио1. 135: 2589-2542, 1985). Указанное вещество для мечения можно модифицировать детектируемым веществом, таким как биотин, с которым могут специфическим образом связываться другие молекулы, такие как стрептавидин. Разнообразные детектируемые молекулы хорошо известны специалистам в данной области.
При проведении исследований могут потребоваться этапы инкубации и/или промывок после каждой комбинации реагентов. Этапы инкубации могут длиться от приблизительно 5 с до нескольких часов, возможно от приблизительно 5 мин до приблизительно 24 ч. Тем не менее, время инкубации будет зависеть от характера анализа, антигена, объема раствора, концентраций, и тому подобного. Обычно анализ проводят при температуре внешней среды, хотя их можно вести в диапазоне температур, например от 10 до 40°С.
Способы анализа неконкурентного характера
Способы иммуноанализа для обнаружения передачи сигнала через тканевый фактор в образцах могут быть либо конкурентными, либо неконкурентными. Способы неконкурентного иммуноанализа представляют собой способы анализа, в которых количество антигена измеряют непосредственно. В одном предпочтительном сэндвич-анализе, например, антитела к тканевому фактору могут быть непосредственно связаны с твердым субстратом, на котором они иммобилизованы. Такие иммобилизованные антитела затем захватывают тканевый фактор, присутствующий в тестируемом образце. С тканевым фактором, иммобилизованными таким образом, затем связывается метящее вещество, такое как второе антитело к тканевому фактору, несущее метку. В качестве альтернативы, указанное второе антитело может не иметь метки, но может, в свою очередь, быть связано меченым третьим антителом, специфичным к антителам от видов, из которых происходит второе антитело Указанное второе или третье антитело обычно модифицировано детектируемым веществом, таким как биотин, с которым могут специфическим образом связываться другие молекулы, непример стрептавидин, для обеспечения обнаружения вещества.
Способы анализа конкурентного характера
В способах конкурентного анализа уровень передачи сигнала через тканевый фактор, присутствующий в образце, измеряли косвенно, путем измерения количества известного, добавленного (экзогенного) тканевого фактора, замещенного (вытесненного) из комплекса с антителом к тканевому фактору неизвестным тканевым фактором, присутствующим в образце. В одном варианте конкурентного анализа к образцу добавляли известное количество тканевого фактора и указанный образец затем приводили во
- 24 014900 взаимодействие с антителом, которое специфическим образом связывается с тканевым фактором. Количество экзогенного тканевого фактора, связавшегося с антителом, обратно пропорционально концентрации тканевого фактора, присутствующего в образце. В частном предпочтительном варианте реализации указанное антитело иммобилизовано на твердом субстрате. Количество тканевого фактора, связавшегося с антителом, можно определить либо путем измерения количества комплексов тканевый фактор/антитело либо, в качестве альтернативы, путем измерения количества оставшегося вне комплекса белка. Количество тканевого фактора можно обнаружить, обеспечивая меченую молекулу тканевого фактора.
Анализ ингибирования гаптена представляет собой другой предпочтительный конкурентный анализ. В данном анализе известный тканевый фактор иммобилизован на твердом субстрате. Известное количество антитела к тканевому фактору добавляли к образцу и указанный образец затем приводили во взаимодействие с иммобилизованным тканевым фактором. Количество антитела к тканевому фактору, связавшегося с известным иммобилизованным тканевым фактором, обратно пропорционально количеству тканевого фактора, присутствующего в указанном образце. Снова, количество иммобилизованного антитела можно определить путем детектирования либо иммобилизованной фракции антитела, либо фракции антитела, которая остается в растворе. Детектирование может быть непосредственным, когда указанное антитело помечено, или опосредованным последующим добавлением меченого вещества, которое специфическим образом связывается с антителом, как описано выше.
Определение перекрестной реактивности
Варианты иммуноанализа с применением конкурентного связывания можно также применять для определения перекрестной реактивности. Например, тканевый фактор можно иммобилизовать на твердой подложке. Белки (например, тканевый фактор и гомологичные) добавляли к тест-системе, которая обеспечивает конкурирование за связывание антисыворотки с иммобилизованным антигеном. Способность добавленных белков конкурировать за связывание антисыворотки с иммобилизованным белком сравнивали со способностью тканевого фактора конкурировать самого с собой. Подсчитывали процент перекрестной реактивности вышеперечисленных белков с применением стандартных вычислений. Антисыворотки, которые проявляли перекрестную реактивность менее 10% с каждым из добавленных белков, перечисленных выше, были выбраны и объединены. Вступающие в перекрестную реакцию антитела можно удалить из объединенной антисыворотки путем иммуноабсорбции с добавленными рассмотренными белками, например гомологами с низкой степенью родства.
Иммуноабсорбированные и объединенные антисыворотки затем использовали в иммуноанализе на конкурентное связывание, как описано выше, чтобы сравнить второй белок, считающийся возможным аллельным или полиморфным вариантом тканевого фактора, с иммуногенным белком. Чтобы провести это сравнение, каждый из двух белков тестировали в широком диапазоне концентраций и определяли количество каждого белка, необходимое для ингибирования 50% связывания антисыворотки с иммобилизованным белком. Если количество второго белка, необходимое для ингибирования 50% связывания, было меньше, чем в 10 раз большее, чем количество тканевого фактора, которое необходимо для ингибирования 50% связывания, тогда указанный второй белок считали специфическим образом связывающимся с поликлональными антителами, полученными к иммуногену тканевому фактору.
Другие варианты тестирования
Метод вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) применяли для обнаружения и расчета количества присутствующего в образце тканевого фактора. Данная методика обычно включает разделение белков образца по молекулярному весу путем гель-электрофореза, перенос разделенных белков на подходящую твердую подложку (такую как нитроцеллюлозный фильтр, нейлоновый фильтр или производный нейлоновый фильтр) и инкубирование образца с антителами, которые специфическим образом связывают тканевый фактор. Антитело к тканевому фактору специфическим образом связывается с тканевым фактором на твердой подложке. Эти антитела можно непосредственно пометить или, в качестве альтернативы, можно потом детектировать, применения меченые антитела (например, меченые антитела овцы против антител мыши), которые специфическим образом связываются с антителом к тканевому фактору.
Другие варианты теста включают варианты иммуноанализа с помощью липосом (ЫА), с применением липосом, созданных таким образом, чтобы они связывали специфические молекулы (например, антитела) и высвобождали инкапсулированные реагенты или маркеры. Высвобожденные вещества затем детектировали согласно стандартным методикам (см. Мошое и др., Атег. С1т. Ргоб. Ееу. 5: 34-41, 1986).
Снижение неспецифического связывания
Для специалиста в данной области очевидно, что часто желательно минимизировать неспецифическое связывание в иммуноанализах. В частности, если тест включает применение антигена или антитела, иммобилизованного на твердом субстрате, желательно минимизировать уровень неспецифического связывания с субстратом. Средства снижения такого неспецифического связывания хорошо известны специалистам в данной области. Обычно эта методика включает покрытие субстрата белковым составом. В частности, белковые составы, такие как бычий сывороточный альбумин (БСА), нежирное порошковое молоко и желатин, широко используются, и порошковое молоко является наиболее предпочтительным.
- 25 014900
Метки
Отдельные метки или детектируемые группы, применяемые в тесте, не являются критическим аспектом настоящего изобретения, так как они не имеют значимого влияния на специфическое связывание антитела, применяемого в тесте. Детектируемой группой может быть любой материал, имеющий детектируемые физические или химические свойства. Такие детектируемые метки достаточно хорошо разработаны в области иммуноанализа и, в общем, практически любую метку, применимую в таких методах, можно применять в настоящем изобретении. Таким образом, метка представляет собой любой состав, детектируемый спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Применимые в настоящем изобретении метки включают магнитные гранулы (например, ПУКАВЕАВЗ™), флюоресцентные красители (например, флюоресцеинизотиоцианат, техасовый красный, родамин, и тому подобные), радиоактивные метки (например 3Н, 1251, 35З, 14С или 32Р), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие, обычно применяемые в твердофазном иммуноферментном анализе ЕЫ8А), хемилюминесцентные метки и колориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветное стекло, или пластиковые гранулы (например, полистирол, полипропилен, латекс и т.д.).
Указанная метка может быть связана непосредственно или опосредованно с желаемым компонентом тест-системы согласно методам, хорошо известным в данной области. Как указано выше, можно применять широкий спектр меток, и выбор метки зависит от необходимой чувствительности, легкости конъюгирования с веществом, требования по стабильности, доступной аппаратуры и средств обеспечения утилизации.
Нерадиоактивные метки часто присоединяют непрямым путем. Обычно молекула лиганда (например, биотин) ковалентно связана с указанной молекулой. Лиганд затем связывается с другими молекулами (например, с молекулой стрептавидина), которые либо детектируемы по своему существу, либо ковалентно связаны с сигнальной системой, такой как детектируемый фермент, флюоресцентное соединение или хемилюминесцентное соединение. Указанные лиганды и их мишени можно применять в любой подходящей комбинации с антителами, которые узнают тканевый фактор, или вторичными антителами, которые узнают антитело к тканевому фактору.
Молекулы могут также быть конъюгированы непосредственно с сигнал-образующими соединениями, например, путем конъюгирования с ферментом или флюорофором. Ферментами, интересующими в качестве меток, прежде всего будут гидролазы, в частности фосфатазы, эстеразы и гликозидазы или оксидазы, в частности пероксидазы. Флюоресцентные соединения включают флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, данзил, умбеллиферон и т.д. Хемилюминесцентные соединения включают люциферин и 2,3дигидрофталазиндионы, например, люминол. Для обзора различных систем мечения или получения сигнала, которые можно применять, см. патент США № 4391904.
Средства детекции меток хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, например, если метка представляет собой радиоактивную метку, средства для ее детектирования включают сцинцилляционный счетчик или фотографическую пленку как, например, в ауторадиографии. Если метка представляет собой флюоресцентную метку, ее можно обнаружить путем возбуждения флюорохрома на подходящей длине волны света и детектировать результирующую флюоресценцию. Флюоресценцию можно обнаружить визуально путем применения электронных детекторов, таких как приборы с зарядовой связью (ПЗС) или фотоумножители, и тому подобные. Подобным образом, ферментативные метки можно обнаружить путем обеспечения подходящих субстратов для фермента и детектирования результирующего продукта реакции. Наконец, простые колориметрические метки можно обнаружить путем простого наблюдения за цветом метки. Таким образом, при различных анализах тест-полосками конъюгированное золото часто проявляется розовым, тогда как различные конъюгированные с различными соединениями гранулы проявляются цветом гранулы.
Некоторые варианты тестов не требуют применения меченых компонентов. Например, можно применять реакцию агглютинации для определения присутствия нужных антител. В этом случае покрытые антигеном частицы агглютинируются образцами, содержащами нужные антитела. В этом варианте ни один из компонентов не нужно метить, и присутствие нужного антитела обнаруживают путем обычного визуального наблюдения.
Химическая композиция с малыми молекулами
Малая молекула или низкомолекулярное соединение включает любую химическую или другую молекулу, которая может влиять на биологические процессы, при этом указанная малая молекула может действовать как ингибитор передачи сигнала через тканевый фактор без нарушения гемостаза у субъекта, относящегося к млекопитающим, применимый для лечения или диагностики заболевания у субъекта, относящегося к млекопитающим. Малые молекулы могут включать любое число терапевтических агентов, известных и используемых в настоящее время, или могут быть малыми молекулами, синтезированными в библиотеке таких молекул с целью скрининга биологической функции(й). Малые молекулы отличаются от макромолекул по размеру. Малые молекулы согласно настоящему изобретению обычно имеют молекулярный вес менее чем приблизительно 5000 дальтон (Да), предпочтительно менее чем приблизительно 2500 Да, более предпочтительно менее чем 1000 Да, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 500 Да. В современных способах лечения заболеваний, зависящих от передачи сиг
- 26 014900 нала через тканевый фактор/фактор νΐΙ;·ι у субъекта, относящегося к млекопитающим, указанное низкомолекулярное органическое соединение, пептидомиметик или миметики антител могут быть миметиками ингибитора антител, МАТ 10Η10.
Малые молекулы включают без ограничения органические соединения, пептидомиметики, миметики антител и их конъюгаты. В данной заявке термин органическое соединение или низкомолекулярное соединение относится к любому основанному на углероде соединению, отличному от макромолекул, как нуклеиновые кислоты и полипептиды. В добавление к углероду, органические соединения могут содержать кальций, хлор, фтор, медь, водород, железо, калий, азот, кислород, серу и другие элементы. Органическое соединение может быть в ароматической или алифатической форме. Неограничивающие примеры органических соединений включают ацетоны, спирты, анилины, карбогидраты, моносахариды, олигосахариды, полисахариды, аминокислоты, нуклеозиды, нуклеотиды, липиды, ретиноиды, стероиды, протеогликаны, кетоны, альдегиды, насыщенные, ненасыщенные и полиненасыщенные жиры, масла и воски, алкены, сложные эфиры, эфиры, тиолы, сульфиды, циклические соединения, гетероциклические соединения, имидизолы и фенолы. Органическое соединение в данной заявке также включает нитрованные органические соединения и галогенированные (например, хлорированные) органические соединения. Способы приготовления пептидомиметиков описаны ниже. Множество малых молекул и малых молекул, идентифицированных согласно настоящему изобретению, характеризуют методиками, такими как масс-спектрометрия с использованием ускорителя (АМ8; см. ТигкеИаиЬ и др., Сигг РНагт Эе5 6(10): 9911007, 2000, Вюапа1уйса1 аррйсакюпк оГ ассе1егаког та§8 крескготекгу Гог рЬагтасеийса1 гекеагсй; и Еп)а1Ьа1 и др., Ма§8 8рескгот Рег 19(3): 139-61, 2000, Ма§8 крескготекгу т сотЬтакопа1 сНепиЛгу).
Предпочтительные малые молекулы или низкомолекулярные соединения относительно легко и недорого производить, заключать в лекарственные формы или получать другими способами. Предпочтительные малые молекулы стабильны при множестве условий хранения. Предпочтительные малые молекулы можно включить в прочную ассоциацию с макромолекулами для образования молекул, которые биологически активны и имеют улучшенные фармацевтические свойства. Улучшенные фармацевтические свойства включают изменения времени циркуляции, распределения, метаболизма, модификации, выведения, секреции, элиминации и стабильности, которые благоприятны для нужной биологической активности. Улучшенные фармацевтические свойства включают изменения в токсикологических характеристиках и эффективности химической молекулы.
Способы анализа с высокой пропускной способностью на выявление модуляторов передачи сигнала через тканевый фактор
Как описано выше, настоящее изобретение обеспечивает способы идентификации модуляторов, например ингибиторов или активаторов, передачи сигнала через тканевый фактор, отличающиеся тем, что указанный ингибитор не нарушает гемостаз (например, у субъектов, относящихся к млекопитающим). Тестируемым соединением для применения в этих способах может быть любая малая органическая молекула или биологическое вещество, такое как белок, например антитело или пептид, сахар, низкомолекулярное соединение, нуклеиновая кислота, например антисмысловой олигонуклеотид, интерферирующая РНК, или рибозим, или липид. В качестве альтернативы модуляторами могут быть генетически измененные версии тканевого фактора. Обычно, тестируемыми соединениями будут малые органические молекулы, пептиды, антитела, липиды и аналоги липидов.
По существу, любое химическое соединение можно применять в качестве потенциального модулятора или лиганда в указанных анализах согласно настоящему изобретению, хотя наиболее часто используют соединения, которые можно растворять в водных или органических (особенно основанных на ДМСО) растворах. Указанные способы анализа разработаны таким образом, чтобы можно было провести скрининг обширных библиотек химических соединений путем автоматизации этапов теста и обеспечить вещества из любого подходящего источника для анализов, которые обычно проводят параллельно (например, в микротитрационной форме на микротитрационных планшетах в роботизированных анализах). Очевидно, что существует множество поставщиков химических соединений, включая 8щта (Сент-Луис, Миссури), А1йпсН (Сент-Луис, Миссури), 8щта-А1йпсН (Сент-Луис, Миссури), Е1ика СНепикаВюсйетка Апа1уйка (Бухс, Швейцария) и тому подобные.
В одном предпочтительном варианте реализации методы скрининга с высокой пропускной способностью включают обеспечение комбинаторных библиотек малых органических молекул или пептидов, содержащих большое количесто потенциальных терапевтических соединений (потенциальных модуляторов или лигандов). Такие комбинаторные библиотеки химических веществ или библиотеки лигандов затем подвергают скринингу в одном или более анализах, как описано в данной заявке, чтобы идентифицировать те элементы в библиотеке (отдельные виды или подклассы химических веществ), которые проявляют желаемую характеристическую активность. Соединения, идентифицированные таким образом, можно применять как стандартные соединения-прототипы или можно применять их самих в качестве потенциальных или действительных лекарств.
Комбинаторные библиотеки химических веществ представляют собой коллекции различных химических веществ, созданных либо путем химического синтеза, либо путем биологического синтеза, посредством комбинирования некоторого количества химических строительных блоков, таких как реа
- 27 014900 генты. Например, линейные комбинаторные библиотеки химических веществ, такие как библиотеки полипептидов, образованы путем комбинирования набора строительных блоков химических веществ (аминокислот) любым возможным образом для данной длины соединения (т.е., числа аминокислот в полипептидном соединении). Миллионы химических веществ можно синтезировать путем такого комбинаторного смешивания химических строительных блоков.
Получение и скрининг комбинаторных библиотек химических веществ хорошо известны специалистам в данной области. Такие комбинаторные библиотеки химических веществ включают, без ограничения, пептидные библиотеки (см., например, патент США 5010175, Еигка, Ιηΐ. 1. Рер1. Рго!. Век. 37: 487493, 1991 и НоидЫоп и др., №11иге 354: 84-88, 1991). Можно также применять другие составляющие для получения химически разнообразных библиотек. Такие составляющие включают, без ограничения: пептоиды (например, см. публикацию РСТ № \¥О 91/19735), кодированные пептиды (например, см. публикацию РСТ № XVО 93/20242), произвольные биоолигомеры (например, см. публикацию РСТ № XVО 92/00091), бензодиазепины (например, патент США № 5288514), разномеры, такие как гидантоин, бензодиазепины и дипептиды (НоЬЬк и др., Ргос. Νΐ. Аса!. 8с1. Л8А 90: 6909-6913, 1993), винилогические полипептиды (Над1йага и др., 1. Атег. Сйет. 8ос. 114: 6568, 1992), непептидные пептидомиметики с перемычками из глюкозных остатков (Нйксйтапп и др., 1. Атег. Сйет. 8ос. 114: 9217-9218, 1992), аналоговый органический синтез библиотек малых веществ (Сйеп и др., 1. Атег. Сйет. 8ос. 116: 2661, 1994), олигокарбаматы (Сйо и др., 8аепсе 261: 1303, 1993), и/или пептидил фосфонаты (СатрЬе11 и др., 1. Огд. Сйет. 59: 658, 1994), библиотеки нуклеиновых кислот (см. АикиЬе1, Вегдег и 8атЬгоок, все см. выше), библиотеки пептидных нуклеиновых кислот (см., например, патент США 5539083), библиотеки антител (см., например, Vаидйη и др., №11иге Вю1есйпо1оду, 14: 309-314, 1996 и РСТ/Л896/10287), библиотеки карбогидратов (см., например, Ыапд и др., 8с1епсе 274: 1520-1522, 1996 и патент США 5593853), библиотеки малых органических молекул (см., например, бензодиазепины, Вайт С&ЕХ 18 янв., страница 33 (1993); изопреноиды, патент США 5569588; тиазолидиноны и метатиазаноны, патент США 5549974; пирролидины, патенты США 5525735 и 5519134; морфолиновые соединения, патент США 5506337; бензодиазепины, 5288514, и тому подобные).
Приборы для получения комбинаторных библиотек коммерчески доступны (см., например, 357 МР8, 390 МР8, А!уапсе! Сйет Тесй, Луисвиль, Кентуки, 8утрйопу, Ватт, Уоборн, Массачусетс, 433А Аррйе! Вюкуйетк, Фостер-Сити, Калифорния, 9050 Р1ик, МИйроге, Бедфорд, Массачусетс). Вдобавок, различные комбинаторные библиотеки сами также коммерчески доступны (см., например, СотСепех, Принстон, Нью-Джерси, Актех, Москва, Россия, Тпрок, 1пс., Сент-Луис, Миссури, Сйет81аг, Ы!, Москва, Россия, 3Л Рйагтасеийса1к, Экстон, Пенсильвания, Майек Вюктепсек, Коламбия, Мэриленд, и т.д.).
Подходящие соединения применимы как часть стратегии для идентифицикации лекарств для лечения неопластического заболевания или воспалительного заболевания, отличающихся тем, что указанное соединение ингибирует передачу сигнала через тканевый фактор и не повышает риск кровотечения. Тестируемое соединение, которое связывается с сигнальным тканевым фактором, считают подходящим соединением.
Процедуры скрининга для идентификации подходящего или тестируемого соединения, которое связывается с тканевым фактором, или модулирует активность белков или полипептидов тканевого фактора, или их биологически активных частей, также включены в настоящее изобретение. Тестируемые соединения можно получить, применяя любой из ряда подходов в методах создания комбинаторных библиотек, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь перечисленными, биологические библиотеки; пространственно адресуемые параллельные твердофазные или жидкофазные библиотеки; методы создания синтетических библиотек, требующих деконволюцию; методы создания библиотек одна гранула одно вещество; и методы создания синтетических библиотек с отбором путем афинной хроматографии. Подход биологических библиотек можно применять, например, для создания пептидных библиотек, тогда как другие четыре подхода применимы для создания библиотек пептидных, непептидноолигомерных или низкомолекулярных соединений (Лат, Апйсапсег Лгид Лек. 12: 145, 1997). Примеры способов синтеза молекулярных библиотек можно найти в данной области, например в: Ле^111 и др., Ргос. №Й. Аса!. 8ск Л8А. 90: 6909, 1993; ЕгЬ и др., Ргос. №Й. Аса!. 8с1. Л8А 91: 11422, 1994; 2искегтапп и др., 1. Ме!. Сйет. 37: 2678, 1994; Сйо и др., 8с1епсе 261: 1303, 1993; Сагге11 и др., Апдете. Сйет. ЙЦ. е!. Епд1. 33: 2059, 1994; Саге11 и др., Апдете. Сйет. ЙЦ. е!. Епд1. 33: 2061, 1994 и Са11ор и др., 1. Ме!. Сйет. 37: 1233, 1994. В некоторых вариантах реализации указанные тестируемые соединения представляют собой активаторные варианты тканевого фактора.
Библиотеки соединений могут быть представлены в растворе (например, НоидЫеп, Вю/Тесйтс.|иек 13: 412-421, 1992), или на гранулах (Лат, №-1Шге 354: 82-84, 1991), чипах (Ео!ог, №11иге 364: 555-556, 1993), бактериях (патент США № 5223409), спорах (патенты США №№ 5571698, 5403484 и 5223409), плазмидах (Си11 и др., Ргос. Аса!. 8с1. Л8А 89: 1865-1869, 1992) или на фагах (8со11 и др., 8с1епсе 249: 386-390, 1990; Леу1т, 8с1епсе 249: 404-406, 1990; Стеи1а и др., Ргос. №Й. Аса!. 8с1. Л8А 87: 63786382, 1990; и Еейс1, 1. Мо1. Вю1. 222: 301-310, 1991).
Способность тестируемого вещества ингибировать активность передачи сигнала через тканевый фактор, или его биологически активной части, можно определить, например, путем исследования спо
- 28 014900 собности ингибировать передачу сигнала через тканевый фактор в отсутствие коагуляторной активности в присутствии тестируемого соединения. Модулирование активности тканевого фактора или его биологически активной части можно определить путем измерения передачи сигнала через тканевый фактор в отсутствие коагуляторной активности. Способность тестируемого соединения модулировать передачу сигнала через тканевый фактор, или его биологически активной части, можно также определить путем мониторинга способности тканевого фактора связываться с белком дисульфидизомеразой.
Способы анализа связывания могут быть основаны на клеточной системе или бесклеточной системе.
Способность соединения ингибировать передачу сигнала через тканевый фактор для лечения неопластического заболевания или воспалительного заболевания, не повышая риск кровотечения, можно определить одним из указанных способов, описанных в данной заявке или известных в данной области для определения прямого связывания. В одном варианте реализации способность соединения ингибировать передачу сигнала через тканевый фактор, не повышая риск кровотечения, можно определить путем мониторинга передачи сигнала через тканевый фактор в кератиноцитах или клетках эндотелия. Определение передачи сигнала через тканевый фактор может включать определение экспрессии рекомбинантного тканевого фактора, который также кодирует детектируемый маркер, такой как последовательность ЕЬАС или люциферазу. Этот тест может быть дополнительным к тесту на непосредственное связывание. Как правило, такие тесты применяют для определения способности тестируемого соединения ингибировать передачу сигнала через тканевый фактор.
Как правило, способность тестируемого вещества связываться с тканевым фактором, препятствовать передаче сигнала через тканевый фактор сравнивают с контролем, в котором связывание определяют в отсутствие тестируемого соединения. В некоторых случаях используют заранее определенное эталонное значение. Такие эталонные значения можно определить по отношению к контрольным, в этом случае значение для тестируемого образца, которое отличается от эталона, будет указывать на то, что указанное соединение связывается с интересующей молекулой (например, тканевым фактором) или модулирует зависимую от тканевого фактора передачу сигнала через РАВ2 в присутствии белка дисульфидизомеразы. Эталонное значение может также отражать уровень связывания, наблюдаемый для стандарта (например, аффинность антитела к сигнальному тканевому фактору). В этом случае, значение для тестируемого соединения, сходное (например, эквивалентное или меньшее) с эталоном, укажет на то, что соединение является подходящим соединением (например, связывается с сигнальным тканевым фактором в той же или большей степени, чем эталонное антитело).
Настоящее изобретение дополнительно относится к новым агентам, определенным путем описанных выше способов анализа посредством скрининга, и их применениям для лечения, как описано в данной заявке.
В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает варианты анализа в растворе с применением тканевого фактора, или клетки или ткани, экспрессирующей тканевый фактор, либо природные, либо рекомбинантные. В другом варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает варианты твердофазных анализов ш νίΙΐΌ с высокой пропускной способностью, при которых тканевый фактор, тканевый фактор в измененной подходящим образом конформации для иммитации сигнального пула клетки, или его лиганд присоединены к твердофазному субстрату посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий. Любые из перечисленных вариантов анализа, описанные в данной заявке, можно адаптировать для скрининга с высокой пропускной способностью.
В способах анализа с высокой пропускной способностью согласно настоящему изобретению, либо в растворе, либо в твердом состоянии, можно подвергнуть скринингу до нескольких тысяч различных модуляторов или лигандов за один день. Эту методологию можно применять для белка тканевого фактора ш уйго, или для анализов, основанных на клеточной системе или мембранной системе, включающих продукт гена тканевого фактора или белок тканевого фактора. В частности, каждую лунку микротитрационного планшета можно использовать для проведения отдельного теста с выбранным потенциальным модулятором, или, если нужно наблюдать концентрацию или эффекты от времени инкубации, в каждых 5-10 лунках можно тестировать один и тот же модулятор. Таким образом, на одном стандартном микротитрационном планшете можно тестировать приблизительно 100 (например, 96) модуляторов. При применении 1536-луночных планшетов на одном планшете можно легко тестировать от приблизительно 100 до приблизительно 1500 различных соединений. Возможно проводить тесты с большим количеством планшетов в день; возможен тестовый скрининг приблизительно до 6000, 20000, 50000 или более чем 100000 различных соединений, с применением комплексных систем согласно настоящему изобретению.
Для реакции в твердом состоянии интересующий белок или его фрагмент, например внеклеточный домен, или клетку или мембрану, включающие интересующий белок или его фрагмент как часть химерного белка, можно связать с компонентом, находящимся в твердом состоянии, непосредственно или опосредованно, через ковалентное или нековалентное связывание, например, через метку. Указанной меткой может быть любой из множества компонентов. Обычно, молекулу, связывающую метку, фиксируют на твердой подложке, и меченую интересующую молекулу присоединяют к твердой подложке посредством взаимодействия метки и молекулы, связывающей метку.
Можно применять ряд меток и молекул, связывающих метку, основанных на известных молекуляр
- 29 014900 ных взаимодействиях, хорошо описанных в литературе. Например, если метка имеет природный связыватель, например биотин, белок А, или белок С, ее можно применять в сочетании с подходящей молекулой, связывающей метку (авидином, стрептавидином, нейтравидином, Ес областью иммуноглобулинов и т.д.). Антитела к молекулам с природными связывающими молекулами, такими как биотин, также широко доступны и представляют собой подходящие связывающими метку молекулы; см. 8ЮМА каталог ^тимс^тка^ 1998 г., 8ЮМА, Сент-Луис, Миссури).
Аналогично, любое гаптенное или антигенное соединение можно применять в комбинации с подходящим антителом для образования пары метка/молекула, связывающая метку. Тысячи специфических антител коммерчески доступны и множество дополнительных антител описаны в литературе. Например, в одной общей конфигурации, метка представляет собой первое антитело и связывающая метку молекула представляет собой второе антитело, которое узнает первое антитело. В добавление к взаимодействию антитело-антиген, взаимодействия рецептор-лиганд также подходят в качестве пары метки и связывающей метку молекулы. Например, агонисты и антагонисты рецепторов клеточной мембраны (например, взаимодействия клеточный рецептор-лиганд, такие как с участием Тο11-подобных рецепторов, трансферина, с-кН. лигандов вирусного рецептора, рецепторов цитокинов, рецепторов хемокинов, рецепторов интерлейкинов, рецепторов иммуноглобулинов и антител, семейства кадгеринов, семейства интегринов, семейства селектинов, и тому подобных; см., например, ΡίβοΙΙ & Ρο\\ΌΓ Т11е Абйезюп Мο1еси1е Еас1з Βοοк I, 1993. Подобным образом, токсины и яды, вирусные эпитопы, гормоны (например, опиаты, стероиды и т.д.), внутриклеточные рецепторы (например, которые опосредуют действие различных малых лигандов, включая стероиды, тиреоидный гормон, ретиноиды и витамин Ό; пептиды), наркотические вещества, пектины, сахара, нуклеиновые кислоты (как линейные, так и циклические конфигурации полимеров), олигосахариды, белки, фосфолипиды и антитела могут все взаимодействовать с различными клеточными рецепторами.
Синтетические полимеры, такие как полиуретаны, полиэстеры, поликарбонаты, полимочевина, полиамиды, полиэтиленимин, полиариленсульфиды, полисилоксаны, полиимиды и полиацетаты также могут образовывать подходящие метку или связывающую метку молекулу. Многие другие пары метка/связывающая метку молекула также применимы в тест-системах, описанных в данной заявке, что будет очевидно для специалиста в данной области после просмотра описания изобретения.
Стандартные линкеры, такие как пептиды, полиэфиры и тому подобные, также могут служить метками и включают последовательности полипептидов, таких как последовательности полиглицина приблизительно в пределах от 5 до 200 аминокислот. Такие гибкие линкеры известны специалистам в данной области. Например, линкеры полиэтиленгликоли доступны от 811еаг\\'а1ег ΡοΕιικίΈ, 1пс. Хантсвиль, Алабама. Эти линкеры, возможно, имеют амидные связи, сульфгидрильные связи или гетерофункциональные связи.
Связывающие метку молекулы фиксируют на твердых субстратах с применением любого из множества способов, доступных на данный момент. Твердые субстраты обычно изменяют или функционализируют путем экспонирования всего или части субстрата химическому реагенту, что фиксирует на поверхности химическую группу, которая может реагировать с частью связывающей метку молекулы. Например, группы, которые подходят для присоединения к более длинной части цепи, будут включать амины, гидроксил, тиол и карбоксильные группы. Аминоалкилсиланы и гидроксиалкилсиланы можно применять для функционализации ряда поверхностей, таких как поверхности стекол. Получение такого твердофазного массива биополимеров хорошо описано в литературе. См., например, МеггШе1б, ί. Ат. С.’11ет. ^с. 85: 2149-2154, 1963 (описывающую твердофазный синтез, например, пептидов); Сеузеп и др., 1. 1ттип. Ме111. 102: 259-274, 1987 (описывающую синтез твердофазных компонентов на иглах); Егапк & Όοη^, ТеПайебгоп 44: 6031-6040, 1988 (описывающую синтез различных последовательностей пептидов на целлюлозных дисках); Εο6ογ и др., 8с1епсе 251: 767-777, 1991; ΞΙκΗοπ и др., С11шса1 Сйет1з1гу 39: 718719, 1993; и Κοζа1 и др., №11иге Мебюте 2: 753-759, 1996 (все описывают массивы биополимеров, зафиксированных на твердых субстратах). Нехимические подходы для фиксации связывающих метку молекул на субстратах включают другие общепринятые способы, такие как нагрев, перекрестная сшивка посредством облучения УФ и тому подобные.
Биспецифические соединения как модуляторы передачи сигнала через тканевый фактор
В одном аспекте предложен способ идентификации подходящих или тестируемых биспецифичных соединений, которые снижают концентрацию агента в сыворотке и/или кровотоке животного, не являющегося человеком. Соединения, выбранные или оптимизированные с помощью настоящих быстрых способов, можно применять для лечения субъектов, на которых введение такого соединения может оказать благоприятный эффект, например пациентов людей.
Подходящие соединения, которые можно тестировать при некотором варианте реализации способов согласно настоящему изобретению, представляют собой биспецифические соединения. В данной заявке термин биспецифическое соединение включает соединения, имеющие две различные специфичности связывания. Примеры биспецифичних соединений включают, например, биспецифические антитела, гетерополимеры и гетерополимеры, основанные на антигенах.
Биспецифические молекулы, которые можно тестировать при некотором варианте реализации со
- 30 014900 гласно настоящему изобретению, предпочтительно включают связывающую функциональную группу, которая специфична к тканевому фактору, белку дисульфидизомеразе, или РАК2, предпочтительно к тканевому фактору, белку дисульфидизомеразе, или РАК2 человека, перекрестно-сшитую со второй связывающей функциональной группой, специфичной к целевому агенту (например, отдельному антителу или антигену). Примеры связывающих функциональных групп, специфичных к тканевому фактору, включают, без ограничения, лиганды тканевого фактора, например в предпочтительных вариантах реализации антитела к сигнальному тканевому фактору. Указанное антитело может быть ингибитором передачи сигнала через тканевый фактор у субъекта, относящегося к млекопитающим, отличающийся тем, что указанный ингибитор не нарушает гемостаз у субъекта, относящегося к млекопитающим.
В другом варианте реализации можно идентифицировать новые молекулы, связывающие тканевый фактор, основываясь на их способности связываться с тканевым фактором и ингибировать передачу сигнала через тканевый фактор. Например, можно тестировать библиотеки соединений или низкомолекулярные соединения в бесклеточном тесте на связывание. Любое количество тестируемых соединений, например пептидомиметиков, небольших химических молекул или других лекарственных препаратов, можно применять для тестирования и можно получить их, применяя любой из ряда подходов в методах комбинаторных библиотек, известных в данной области, включая: биологические библиотеки; пространственно адресуемые параллельные твердофазные или жидкофазные библиотеки; методы создания синтетических библиотек, требующие деконволюцию; методы создания библиотек одна гранула - одно вещество; и методы создания синтетических библиотек с отбором с помощью афинной хроматографии. Методика создания биологических библиотек ограничена созданием пептидных библиотек, тогда как другие четыре подхода применимы для создания библиотек пептидных, непептидно-олигомерных или низкомолекулярных соединений (Ьат, АпБсапсег ИгидИек. 12: 145, 1997).
Во многих программах скрининга лекарственных препаратов, которыми тестируют библиотеки модулирующих агентов и природных экстрактов, желательны варианты анализа с высокой пропускной способностью, чтобы максимизировать число модулирующих агентов, исследуемых в данный промежуток времени. Способы анализа, выполненные на бесклеточных системах, такие, которые можно проводить с очищенными или полуочищенными белками, часто предпочтительны в качестве предварительного скрининга, так как они могут быть созданы таким образом, чтобы позволить быстрое проявление и относительно легкое определение изменения в молекулярной мишени, которое опосредовано тестируемым модулирующим агентом. Более того, эффекты токсичности для клеток и/или биодоступности тестируемого модулирующего агента можно обычно игнорировать в системе ίη νίΙΐΌ. данный тест вместо этого сфокусирован прежде всего на действии лекарства на молекулярную мишень, что может проявляться в изменении аффинности связывания с вышестоящими или нижестоящими элементами.
В другом варианте реализации методики фагового дисплея, известные в данной области, можно применять для обнаружения новых молекул, связывающих тканевый фактор. В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способы анализа для скрининга подходящих или тестируемых соединений, которые связываются с тканевым фактором, или с биологически активной его частью. Тесты, основанные на клеточной системе, для идентификации молекул, которые связываются с тканевым фактором, можно применять для идентификации дополнительных агентов для применения в биспецифичних соединениях согласно настоящему изобретению. Например, клетки, экспрессирующие тканевый фактор, можно применять в скрининг-тесте. Например, можно идентифицировать соединения, которые вызывают статистически значимые изменения в связывании с тканевым фактором.
В одном варианте реализации данный тест представляет собой бесклеточный тест, в котором молекулу, связывающую тканевый фактор, идентифицируют, основываясь на ее способности связываться с белком тканевого фактора ίη νίΙΐΌ. Можно получить молекулу, связывающую белок тканевого фактора, и способность белка связывать белок сигнального тканевого фактора можно тестировать с применением известных в данной области способов определения непосредственного связывания. Определение способности белка связываться с целевой молекулой можно выполнить, например, применяя технологию, такую как Анализ биомолекулярного взаимодействия (В1А) в реальном времени. 8)о1апбег и др., Апа1. СНет. 63: 2338-2345, 1991, и 8хаЬо и др., Сигг. Орт. 81гис1. Вю1. 5: 699-705, 1995. При использовании в данной заявке В1А представляет собой методику для изучения биоспецифических взаимодействий в реальном времени, без мечения любого из взаимодействующих веществ (например, В1Асоге). Изменения в оптических проявлениях поверхностного плазмонного резонанса (ППР) можно использовать как индикатор в реальном времени реакций между биологическими молекулами.
Указанные способы анализа в безклеточных системах согласно настоящему изобретению пригодны для применения как растворимых, так и/или мембраносвязанных форм белков. В случае бесклеточных анализов, в которых применяют мембраносвязанную форму белка, может быть желательным применение растворяющего агента, так чтобы мембраносвязанная форма белка поддерживалась в растворе. Примеры таких растворяющих агентов включают неионогенные детергенты, такие как п-октилглюкозид, пдодецилглюкозид, п-додецилмальтозид, октаноил-№метилглюкамид, деканоил-№метилглюкамид, Тп1оп® Х-100, Тгйоп® Х-114, ТБекй®, изотридециполи(эфир этиленгликоля)п, 3-[(3холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропан сульфонат (СНАР8), 3-[(3-холамидопропил)диметил
- 31 014900 аммоний]-2-гидрокси-1-пропан сульфонат (СНΑРδΟ) или №додецил=^№диметил-3-аммоний-1-пропан сульфонат.
Подходящие известные в данной области способы анализа, которые позволяют детектировать белок-белковые взаимодействия (например, иммунопреципитация, двухгибридный анализ и тому подобные). Путем выполнения таких способов анализа в присутствии и отсутствие тестируемых соединений, данные способы анализа можно применять для идентификации соединений, которые модулируют (например, ингибируют или усиливают) взаимодействие белка согласно изобретению с целевой молекулой(ами).
Определение способности белка связываться или взаимодействовать с целевой молекулой можно осуществить, например, посредством прямого связывания. В тестах на прямое связывание, указанный белок может быть связан с радиоизотопной или ферментативной меткой, так что связывание белка с целевой молекулой можно определить путем детектирования меченого белка в комплексе. Например, белки можно пометить 125Ι, 35δ, 14С или 3Н, либо непосредственно, либо опосредованно, и радиоизотоп обнаружить путем прямого подсчета радиоизлучения или путем счета сцинтилляций. В качестве альтернативы, молекулы можно ферментативно пометить, например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или люциферазой и ферментативную метку обнаружить путем определения преобразования подходящего субстрата в продукт.
Обычно представляется желательным иммобилизовать либо белок согласно настоящему изобретению, либо связывающий его белок, для облегчения отделения комплексов от не образовавших комплексы форм одного или обоих белков, также как для приспособления теста к автоматизации. Связывание с вышестоящим или нижестоящим элементом связывания, в присутствии и отсутствие подходящего агента, можно выполнить в любом сосуде, подходящем для содержания реактивов. Примеры включают микротитрационные планшеты, пробирки и микроцентрифужные пробирки. В одном варианте реализации, может быть предусмотрен химерный белок, который дополнительно содержит домен, позволяющий белку связаться с матрицей. Например, химерные белки глутатион-8-трансфераза/тканевый фактор можно адсорбировать на гранулах глутатион сефарозы (§1дта СЕетюа1, Сент-Луис, Миссури) или покрытых глутатионом микротитрационных планшетах, которые затем объединяют с лизатами клеток, например 35δ меченными и с тестируемым модулирующим агентом, и смесь инкубируют в условиях, приводящих к образованию комплекса, например в физиологических условиях по соли и рН, хотя можно применять немного более жесткие условия. После инкубации гранулы отмывали для удаления любой несвязавшейся метки, и матрицу иммобилизовали и радиоактивную метку определяли непосредственно (например, помещали гранулы в сцинтиллятор), или в супернатанте после того, как комплексы были диссоциированы. В качестве альтернативы, комплексы можно диссоциировать от матрицы, разделить посредством электрофореза в ПААГ-ДСН и уровень обнаруженного во фракции гранул белка, связывающего тканевый фактор, можно подсчитать в геле с применением стандартных электрофоретических методик.
Другие методики иммобилизации белков на матрицах также доступны для применения в обсуждаемом тесте. Например, биотинилированные молекулы можно приготовить из биотин-ΝΉδ (Ν-гидроксисукцинимида) с применением методик, хорошо известных в данной области (например, с помощью набора для биотинилирования, Р1егсе СЕетюа1к, Рокфорд, Иллинойс), и иммобилизовать в лунках покрытых стрептавидином 96-луночных планшетов (Р1егсе СНеписа1).
Также в объем настоящего изобретения входит определение способности соединения модулировать взаимодействие между тканевым фактором и белком дисульфидизомеразой или тканевым фактором и РΑК2, без мечения любого из взаимодействующих партнеров. Например, можно применять микрофизиометр для обнаружения взаимодействия белка согласно изобретению с его целевой молекулой без мечения белка или целевой молекулы. МсСоппе11 и др., 8аепсе 257: 1906-1912, 1992. В данной заявке микрофизиометр (например, Сукокепког) представляет собой аналитический прибор, который измеряет уровень окисления клеткой окружающей ее среды с помощью светоадресуемого потенциометрического сенсора (ΕΑ₽δ). Изменения уровня окисления можно применять как индикатор взаимодействия между соединением и рецептором.
Основанные на антигенах гетерополимеры, которые можно тестировать в рамках настоящего изобретения, предпочтительно включают участки связывания, которые специфичны к тканевому фактору, предпочтительно к тканевому фактору человека, перекрестно-сшитые с антигеном, который узнается аутоантителом. Примеры антигенов, узнаваемых аутоантителами, включают, но не ограничены любым из следующих: фактор VIII (антитела связаны с лечением гемофилии путем замещения рекомбинантного фактора VIII); мышечный рецептор ацетилхолина (антитела связаны с заболеванием миастения §πινίκ); кардиолипин (связанный с заболеванием волчанкой); тромбоцитарные белки (связаны с заболеванием идиопатической тромбоцитопенической пурпурой); множество антигенов, связанных с синдромом Шегрена; антигены, участвующие в аутоиммунных реакциях при трансплантации ткани; антигены, обнаруженные в сердечной мышце (связаны с заболеванием аутоиммунным миокардитом); антигены, связанные с иммунокомплексным заболеванием почек; днДНК и онДНК антигены (связанные с волчаночным нефритом); десмоглеины и десмоплакины (связанные с заболеваниями пемфигус и пемфигоид); или любой другой антиген, который хорошо охарактеризован и связан с патогенезом болезни.
- 32 014900
Примеры гетерополимеров и основанных на антигенах гетерополимеров для тестирования согласно настоящему изобретению и способы их приготовления известны в данной области. Например, примеры гетерополимеров сообщаются в \УО 03007971А1; И8 20020103343А1; патенте США № 5879679; патенте США № 5487890; патенте США № 5470570; №О 9522977А1; №О/02075275А3, №О/0246208А2 или А3, №О/0180883А1, №О/0145669А1, №О 9205801А1, ЬшбогТег и др., 1. ]ттипо1. МеШобк. 248: 125, 2001; Найп и др., 1. ^тпок 166: 1057, 2001; Ыагбт и др., 1. Iттиηο1. Ме11юбк. 211: 21, 1998; КиЬп и др., 1. Ιιηтипо1. 160: 5088, 1998; Тау1ог и др., Сапсег Iттиηο1. ИптипоФег. 45: 152, 1997; Тау1ог и др., 1. ^типок 159: 4035, 1997; и Тау1ог и др., 1. Iттиηο1. 148: 2462, 1992. Вдобавок, можно приготовить различные формы этих гетерополимеров. Например, в одном варианте реализации, можно применять формы биспецифичних молекул, приготовленных с применением различных связывающих элементов. Примеры реагентов, которые можно применять для перекрестной сшивки компонентов биспецифичних молекул, включают: полиэтиленгликоль, Ν-сукцинимидил 8-ацетилтиоацетат (8АТА), Ы-(4-карбоксициклогексилметил)малеинимид Ν-гидроксисукцинимидат (8МСС), а также другие известные в данной области, и доступны, например, от Р1егсе Вю1ес11по1о§у. Примеры форм биспецифичних молекул, которые можно тестировать, описаны в заявке США, серийный номер 60/411,731, поданной 16 сентября, 2002, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки.
В другом варианте реализации можно получить различные мультимерные формы биспецифичних молекул (например, димерные, тримерные, тетрамерные, пентамерные или более высокого порядка мультимерные формы). В другом варианте реализации очищенные формы биспецифичних молекул можно тестировать, например, как описано в заявке США, серийный номер 60/380,211, поданной 13 мая, 2002, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки.
В другом варианте реализации когда одна из связывающих молекул гетерополимера представляет собой антитело, можно применять антитела различных изотипов (например, ΙβΛ, Ιβϋ, ΙβΕ, ΙβΟ1, Ι§Ο2 (например, Ι^Ο^), Ι§03, Ι§Ο4 или ЦМ). В другом варианте реализации части молекулы антитела (например, ЕаЬ фрагменты) можно применять в качестве одной из связывающих молекул. В предпочтительном варианте реализации по меньшей мере одна из связывающих молекул представляет собой антитело, включающее Ес домен. В одном варианте реализации указанное антитело представляет собой антитело мыши.
В другом варианте реализации можно тестировать эффект от модификаций антител, например, можно тестировать эффект деиммунизации антитела, например, как описано в заявке США, серийный номер 60/458869, поданной 28 марта 2003.
В способах, предусмотренных настоящим изобретением, концентрация агента, например патогенного агента, в сыворотке, кровотоке и/или ткани животного, не являющегося человеком, может быть снижена на по меньшей мере, например, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 100%.
В другом варианте реализации концентрацию агента в сыворотке, кровотоке и/или ткани субъекта можно измерить опосредованно. Например, патологию, обусловленную присутствием агента в сыворотке и/или кровотоке, можно измерить, например, путем исследования образцов ткани животного. Другим непрямым способом измерения концентрации агента в сыворотке, кровотоке и/или ткани животного, не являющегося человеком, является измерение способности агента вызывать инфекцию у животного, не являющегося человеком. Например, можно измерить влияние биспецифичного соединения на клинические признаки и симптомы инфекции. Способность биспецифичного соединения ингибировать распространение инфекции, например, из одной системы органов в другую или от одного индивида к другому можно также тестировать.
В другом варианте реализации измеряли способность биспецифичного соединения связываться с клетками, несущими тканевый фактор, у животного, не являющегося человеком. Например, в одном варианте реализации определение способности биспецифичного соединения связываться с целевой молекулой тканевого фактора также может быть выполнено с применением технологии, такой как Анализ биомолекулярных взаимодействий (ΒΙΛ) в реальном времени (8)о1апбег и др., Апа1. Сйет. 63: 2338-2345, 1991 и 8хаЬо и др., Сигг. Орт. 81гис1. Βίοι. 5: 699-705, 1995). В данной заявке ВЖ' представляет собой технологию для изучения биоспецифических взаимодействий в реальном времени, без мечения любого из взаимодействующих веществ (например, ВЖсоге). Изменения в оптических проявлениях поверхностного плазмонного резонанса (ППР) можно использовать как индикатор реакций между биологическими молекулами в реальном времени.
В другом варианте реализации измеряли разрушение агента клетками животного, не являющегося человеком (например, макрофагами).
Можно выбрать соединения, которые снижают концентрацию агента в сыворотке и/или кровотоке животного, не являющегося человеком (по сравнению с концентрациями, наблюдаемыми у животного, не являющегося человеком, которое не получает биспецифичное соединение).
Соединения для тестирования в обсуждаемых анализах можно выбрать из множества протестированных соединений. В другом варианте реализации биспецифические соединения для тестирования в
- 33 014900 быстрых анализах могут быть уже определенными как способные связывать тканевый фактор, например в ш νΐΐΐΌ тесте, и могут быть дополнительно оценены или оптимизированы с применением быстрых анализов. В таких случаях, способность биспецифичного соединения снижать концентрацию агента в сыворотке и/или кровотоке можно сравнить с другим биспецифичным соединением или неоптимизированной версией того же соединения, чтобы определить его способность снижать концентрацию агента в сыворотке и/или кровотоке.
В предпочтительных вариантах реализации указанные биспецифические соединения настоящего изобретения вводили в концентрациях в диапазоне от приблизительно 1 мкг вещества/кг массы тела до приблизительно 100 мкг вещества/кг массы тела. Как определено в данной заявке, терапевтически эффективное количество биспецифичного соединения (т.е., эффективная дозировка) находится в диапазоне приблизительно от 0,01 до 5000 мкг/кг массы тела, предпочтительно приблизительно от 0,1 до 500 мкг/кг массы тела, более предпочтительно приблизительно от 2 до 80 мкг/кг массы тела и даже более предпочтительно приблизительно от 5 до 70 мкг/кг, от 10 до 60 мкг/кг, от 20 до 50 мкг/кг, от 24 до 41 мкг/кг, от 25 до 40 мкг/кг, от 26 до 39 мкг/кг, от 27 до 38 мкг/кг, от 28 до 37 мкг/кг, от 29 до 36 мкг/кг, от 30 до 35 мкг/кг, от 31 до 34 мкг/кг или от 32 до 33 мкг/кг массы тела. Для специалиста в данной области очевидно, что определенные факторы могут влиять на дозировку, необходимую для эффективного лечения субъекта, включая, но не ограничиваясь перечисленными, тяжесть заболевания или расстройства, предыдущее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта, и другие сопутствующие заболевания. Более того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством белка, полипептида или антитела может включать один прием лекарства или предпочтительно может включать серию приемов лекарства.
В предпочтительном примере указанное животное лечат биспецифичным соединением в диапазоне от приблизительно 1 до 500 мкг/кг массы тела с последующей внутривенной (ίν) инъекцией агента. Также должно быть очевидно, что эффективная дозировка биспецифичного соединения, применяемая для лечения, может повышаться или снижаться во время конкретного курса лечения. Изменения дозировки могут исходить и быть очевидными по результатам диагностических анализов, как описано в данной заявке.
Путь введения тестируемого соединения и/или агентов может быть внутривенной (ίν) инъекцией в кровоток животного. Другие пути введения включают, без ограничения, топический, парентеральный, подкожный или путем ингаляции. Термин парентерально включает инъекцию, например, посредством подкожного, внутривенного или внутримышечного пути, также включая локальное введение, например, в место заболевания или повреждения. Задержанное высвобождение вещества из имплантантов также известно в данной области. Для специалиста в данной области очевидно, что подходящие дозировки будут варьироваться в зависимости от таких факторов, как природа расстройства, от которого собираются лечить, массы тела пациента, возраста и общего состояния, и пути введения. Примерные дозы можно определить по тестам на животном и выполнить пересчет дозировок для введения человеку согласно принятой в данной области практике.
Подходящие соединения и агенты можно ввести во всем диапазоне доз животному. Если животному также вводят агент, подходящее вещество можно вводить либо перед, либо в то же время, либо после введения указанного агента.
Трансгенных животных согласно настоящему изобретению, экспрессирующих тканевый фактор, например мышей, можно применять для скрининга или оценки подходящих соединений, применимых для лечения расстройств или заболеваний у людей, которые связаны с присутствием нежелательных агентов в сыворотке и/или кровотоке субъекта, таких как аутоантитела, инфекционные агенты или токсины.
Примеры целевых агентов, которые можно связать биспецифичными соединениями согласно настоящему изобретению, включают переносимые с кровью агенты, включая, но не ограничиваясь перечисленными, любые из следующих: вирусы, опухолевые клетки, воспалительные клетки, полинуклеотиды, антитела, например аутоантитела, связанные с аутоиммунными расстройствами.
В одном варианте реализации при выполнении теста согласно настоящему изобретению указанный агент вводили трансгенному животному, например, перед, одновременно или после введения биспецифичного соединения.
Указанные биспецифические соединения согласно настоящему изобретению, или любые их части, можно изменить, чтобы увеличить их время полужизни. Пептидные аналоги обычно применяются в фармацевтической индустрии в виде непептидных лекарств со свойствами, аналогичными тем, что основываются на пептидах. Эти типы непептидных соединений названы пептидные миметики или пептидомиметики (Еаисйеге, Αбν. Эгид Вез. 15: 29, 1986; УеЬег и др., ΉΝ8 стр. 392, 1985; и Егапз и др., 1. Меб. Скет 30: 1229, 1987, которые включены в данную заявку посредством ссылки) и обычно разрабатываются с помощью компьютеризированного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые структурно схожи с терапевтически применимыми пептидами, можно применять для получения эквивалентных терапевтических или профилактических эффектов. Обычно, пептидомиметики структурно схожи с эталонным полипептидом (т.е., полипептидом, который имеет биологическую или фармако
- 34 014900 логическую активность), таким как антигенный полипептид, но который имеет одну или более пептидных связей, возможно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из: -СН2МН-, -СН2З-, -СН2СН2-, -СН=СН-(цис и транс), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -СН2ЗО-, с помощью способов, известных в данной области и дополнительно описанных в следующих материалах: ЗраФ1а, А. Е. в СЬеш1кйу опй Βίοс11ет1к1гу ο£ Αιηίηο Ас1йк, Рерййек, опй Рго1етк Аетк!ет, В., ред., Магсе1 Эеккег, Нью-Йорк, стр. 267, 1983; ЗраФ1а, А. Е., Уеда Эа!а, том 1, выпуск 3, Рерййе ΒаскЬοηе Мοй^ίϊсаίюηκ, 1983; Μοτ1ον, Тгопйк. РЬагт. Зск стр. 463-468, 1980; Нийкт и др., Ιηί. 1. Рер!. Рго£. Век. 14: 177-185, 1979 (--СН2Й1Н--, СН2СН2-); ЗраЮ1аи др., Ы£е. Зск 38: 1243-1249, 1986 (--СН2--З); Наш, I. СЬет. 8οα Регкт. Тгопк. 1: 307-314, 1982 (--СН-СН--, цис и транс); А1тс.|шк1 и др., 1. Мей. СЬет. 23: 1392-1398, 1980 (-СОСН2-); ^еηη^ηдκ-Аййе и др., Те1га11ейгог1 Ьей. 23: 2533, 1982 (-СОСН2-); 8хе1ке и др., Европейская заявка на патент № ЕР 45665 СА: 97: 39405, 1982 (-СН(ОН)СН2-); ^Пайау и др„ ΤοίταΗοάτοη. Ьей. 24: 4401-4404, 1983 (-С(ОН)СН2-); и НгиЬу, ЫГе Зст 31: 189-199, 1982 (-СН2-З-); каждый из которых включен в данную заявку посредством ссылки. В частности, предпочтительной непептидной связью является -СН2МН-. Такие пептидные миметики могут иметь значительные преимущества над полипептидными вариантами реализации, включая, например: более экономичную продукцию, более высокую химическую стабильность, улучшенные фармакологические свойства (время полужизни, абсорбцию, силу, эффективность и т.д.), измененную специфичность (например, широкий спектр биологических активностей), сниженную антигенность, и другое. Мечение пептидомиметиков обычно включает ковалентное присоединение одной или более меток, непосредственно или через спейсер (например, амидную группу), в немешающей позиции(ях) на пептидомиметике, которая предсказана расчетными данными по структуре-активности и/или молекулярным моделированием. Такие немешающие позиции обычно представляют собой позиции, в которых не образуются прямые контакты с макромолекулой(ами), с которой связывается пептидомиметик для получения терапевтического эффекта. Получение производных (например, мечение) пептидомиметиков не должно по существу мешать желаемой биологической или фармакологической активности пептидомиметика.
Систематическую замену одной или более аминокислот в последовательности аминокислот на Όаминокислоту того же типа (например, Ό-лизин на месте Ь-лизина) можно применять для получения более стабильных пептидов. Вдобавок, прочные пептиды можно получить способами, известными в данной области (Βίζο и др., Аппи. Веν. ВюсЬет. 61: 387, 1992, включены в данную заявку посредством ссылки); например, путем добавления внутренних остатков цистеина, способных образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые циклизуют пептид.
Такие измененные полипептиды можно получить в прокариотической или эукариотической клетке хозяина. В качестве альтернативы, такие пептиды можно синтезировать химическими способами. Способы экспрессии гетерологичных полипептидов у рекомбинантных хозяев, химический синтез полипептидов и трансляция ίη νίίτο хорошо известны в данной области и описаны дополнительно в Машайк и др., Μο1οα.ι1ατ ί’1οηίη§: А ^аЬο^аίο^у Мамай 2-οο изд., Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, 1989; Вегдег и др., Мейюйк ίη Еηζутο1οду, том 152, Сшйе ίο Μο1οα.ι1ατ Οοηίηβ ТесЬтдиек, 1987, Асайетю Ргекк, 1пс., СанДиего, Калифорния; МеггШе1й, I. Ат. СЬет. 8ο^ 91: 501, 1969; ΟιοίΒοη, СВС Сгй. Βеν. Вюсйет. 11: 255, 1981; Кайег и др., Заеме 243: 187, 1989; МеггШе1й, Заеме 232: 342, 1986; Коп!, Аппи. Βеν. ВюсЬет. 57: 957, 1988; и ОПЪгй, Зет^^Ье^ Рго!етк, Айеу ΡиЬ1^κй^ηд, 1980, которые включены в данную заявку посредством ссылки.
Полипептиды можно получить обычно путем прямого химического синтеза и применять в качестве связывающей части гетерополимера. Пептиды можно получить в виде измененных пептидов, с непептидными молекулами, присоединенными ковалентной связью к Ν-концу и/или С-концу. В некоторых предпочтительных вариантах реализации либо карбоксильный конец, либо аминоконец, или оба, химически изменены. Наиболее частые модификации концевых амино и карбоксильной групп представляют собой ацетилирование и амидирование, соответственно. Аминоконцевые модификации, такие как ацилирование (например, ацетилирование) или алкилирование (например, метилирование), и модификации карбоксильного конца, такие как амидирование, также как другие концевые модификации, включая циклизацию, могут быть включены в различные варианты реализации указанных тестируемых соединений. Некоторые аминоконцевые и/или карбоксиконцевые модификации и/или увеличение длины пептида до коровой последовательности могут обеспечить преимущества в физических, химических, биохимических и фармакологических свойствах, таких как: улучшение стабильности, повышение силы и/или эффективности, устойчивости к протеазам сыворотки, требуемые фармакокинетические свойства и другие.
Детектируемая метка
Отдельные метки или детектируемые группы, применяемые в тесте, можно детектировать спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Отдельный тип меток не является критичным аспектом настоящего изобретения, так как он не имеет значимого влияния на специфичное связывание антитела с сигнальным тканевым фактором, например МАТ 10Н10, применяемого в тесте. Детектируемой группой может быть любой материал, имеющий детектируемые физические или химические свойства. Такие детектируемые метки достаточно хорошо разработаны в области тестов или иммуноанализов и, в общем, практически любую метку, применимую в таких методах, можно применять в настоящем изобретении. Таким обра
- 35 014900 зом, метка представляет собой любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Применимые в настоящем изобретении метки включают магнитные гранулы (например, ПутЬсадз™), флюоресцентные красители (например, флюоресцеинизотиоцианат, техасовый красный, родамин, и тому подобные), радиоактивные метки (например, 3Н, 14С, 35δ, 125Ι, 121Ι, 112Ιη, 99тТс), другие визуализирующие агенты, такие как микропузырьки (для визуализации ультразвуком), 18Е, 11С, 15О (для позитронно-эмиссионной томографии), 99тТс, 'Ιη (для однофотонной эмиссионной томографии), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие, обычно применяемые в твердофазном иммуноферментном анализе ЕЫ8А), и калориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветное стекло, или пластиковые гранулы (например, полистирол, полипропилен, латекс, и тому подобные). Патенты, в которых описано применение таких меток, включают патенты США с номерами 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241, каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях. См. также НаηάЬοοк оГ ЕкюгезсегИ РгоЬез ηηά Везеагск Скет1са1з (6-ое изд., Мо1еси1аг РгоЬез, тс., Еидеие 0В.).
Указанная метка может быть связана непосредственно или опосредованно с желаемым компонентом тест-системы согласно методам, хорошо известным в данной области. Как указано выше, можно применять широкий спектр меток, и выбор метки зависит от необходимой чувствительности, легкости конъюгирования с указанным соединением, требования по стабильности, доступной аппаратуры и средств обеспечения утилизации.
Нерадиоактивные метки часто присоединяют непрямым путем. Обычно молекулу лиганда (например, биотин) ковалентно связывают с указанной молекулой. Лиганд затем связывается с другими молекулами (например, с молекулой стрептавидина), которые либо детектируемы по своему существу, либо ковалентно связаны с сигнальной системой, такой как детектируемый фермент, флюоресцентное соединение или хемилюминесцентное соединение. Можно применять множество лигандов и антилигандов. Если у лиганда есть природный антилиганд, например биотин, тироксин и кортизол, его можно применять в сочетании с мечеными, природными антилигандами. В качестве альтернативы, любое гаптенное или антигенное соединение можно применять в комбинации с антителом.
Указанные молекулы можно также конъюгировать непосредственно с сигнал-образующими соединениями, например путем конъюгирования с ферментом или флюорофором. Ферментами, интересующими в качестве меток, прежде всего будут гидролазы, в частности фосфатазы, эстеразы и гликозидазы, или оксидазы, в частности пероксидазы. Флюоресцентные соединения включают флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, данзил, умбеллиферон и тому подобные. Хемилюминесцентные соединения включают люциферин и 2,3-дигидрофталазиндионы, например люминол. Для обзора различных систем мечения или получения сигнала, которые можно применять, см. патент США № 4391904, полностью включенный в данную заявку посредством ссылки и во всех отношениях.
Средства детекции меток хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, например, если метка представляет собой радиоактивную метку, средства для ее детектирования включают сцинцилляционный счетчик или фотографическую пленку, как в ауторадиографии. Если метка представляет собой флюоресцентную метку, ее можно обнаружить путем возбуждения флюорохрома на подходящей длине волны света и детектировать результирующую флюоресценцию. Флюоресценцию можно обнаружить визуально посредством фотографической пленки, с использованием электронных детекторов, таких как приборы с зарядовой связью (ПЗС) или фотоумножители, и тому подобных. Подобным образом ферментативные метки можно обнаружить путем обеспечения подходящих субстратов для фермента и детектирования результирующего продукта реакции. Наконец, простые калориметрические метки можно обнаружить путем простого наблюдения за цветом метки. Таким образом, при различных анализах тест-полосками, конъюгированное золото часто проявляется розовым, тогда как различные конъюгированные гранулы проявляются цветом гранулы.
Некоторые варианты тестов не требуют применения меченых компонентов. Например, можно применять реакцию агглютинации для определения присутствия нужных антител. В этом случае покрытые антигеном частицы агглютинируются образцами, содержащими целевые антитела. В этом варианте ни один из компонентов не нужно метить, и присутствие целевого антитела обнаруживают путем обычного визуального наблюдения.
Часто указанный клеточный маркер и антитела к клеточному маркеру метят путем соединения, либо ковалентно, либо нековалентно, с веществом, которое обеспечивает детектируемый сигнал.
Наборы
Также в объем настоящего изобретения входят наборы, включающие композиции (например, моноклональные антитела, антитела к последовательностям человека, антитела человека, мультиспецифичные и биспецифические молекулы, низкомолекулярные соединения, композиции нуклеиновых кислот, например, антисмысловых олигонуклеотидов, двунитевых РНК олигонуклеотидов (интерферирующих РНК, коротких шпилечных РНК, малых интерферирующих РНК), или ДНК олигонуклеотидов или векторов, содержащих кодирующие последовательности для транскрипции молекул коротких шпилечных РНК согласно настоящему изобретению) и инструкции по применению. Набор может дополнительно
- 36 014900 содержать по меньшей мере один дополнительный реагент, или одно или более дополнительных антител человека согласно настоящему изобретению (например, антитело человека, имеющее комплементарную активность, которое связывается с эпитопом на антигене, отличном от первого антитела человека). Наборы обычно имеют этикетку, на которой указан предполагаемый способ применения содержимого набора. Термин этикетка включает любые написанные или записанные материалы, которыми снабжен набор, или которые поставляются с набором, или которые другим способом сопровождают набор.
Фармацевтические композиции
Терапевтические композиции (например, моноклональные антитела, антитела к последовательностям человека, антитела человека, мультиспецифичные и биспецифические молекулы, низкомолекулярные соединения, композиции нуклеиновых кислот, например антисмысловых олигонуклеотидов, двунитевых РНК олигонуклеотидов (интерферирующих РНК, коротких шпилечных РНК, малых интерферирующих РНК), или ДНК олигонуклеотидов или векторов, содержащих кодирующие последовательности для транскрипции молекул коротких шпилечных РНК) применимы в настоящих композициях и способах для введения человеку пациенту рег ке, в форме стереоизомера, пролекарства, фармацевтически приемлемой соли, гидрата, сольвата, гидрата кислой соли, Ν-оксида или его изоморфной кристаллической форме, или в форме фармацевтической композиции, где указанное соединение смешано с подходящими носителями или вспомогательным веществом(ами) в терапевтически эффективном количестве, например для рака или метастатического рака.
Фармацевтически приемлемые носители определяются отчасти конкретной вводимой композицией, также как и конкретным способом, применяемым для введения композиции. В соответствии с этим существует широкий спектр подходящих формул фармацевтических композиций для введения терапевтического антитела в комбинации с композициями, нацеленными на опухолевые клетки, или с композициями из малых молекул или лигандов (см., например, Веттдкои'к Р11агтасеиНса1 8с1еисек, Маск РиЬ11кЫид Со., Истон, Пенсильвания, 18-ое изд., 1990, включенный в данную заявку посредством ссылки). Фармацевтические композиции обычно включают избирательно экспрессирующийся белок, агонист или антагонист, в форме, подходящей для введения пациенту. Фармацевтические композиции обычно имеют стерильную, по существу, изотоническую форму и соответствуют нормативам надлежащей производственной практики (СМР) Управления по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США.
Режимы лечения
Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие одну или комбинацию композиций (например, моноклональные антитела, антитела к последовательностям человека, антитела человека, мультиспецифичные и биспецифические молекулы, малые молекулы, миметики лигандов, их производные и аналоги, композиции нуклеиновых кислот, например антисмысловых олигонуклеотидов, двунитевых РНК олигонуклеотидов (интерферирующих РНК, коротких шпилечных РНК, малых интерферирующих РНК), или ДНК олигонуклеотидов или векторов, содержащих кодирующие последовательности для транскрипции молекул коротких шпилечных РНК, которые специфическим образом связываются с сигнальным тканевым фактором в неопластической опухолевой клетке или воспалительной клетке, входящих в формулу вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Некоторые композиции включают комбинацию множества (например, двух или более) терапевтических препаратов на основе антител или малых молекул.
Для профилактических применений фармацевтические композиции или медикаменты вводили пациенту, восприимчивому, или по другой причине находящемуся с группе риска, к заболеванию или патологическому состоянию (например, к иммунному заболеванию), в количестве, достаточном для устранения или снижения риска, снижения тяжести или задержки начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнений и фенотипов со средней патологией, присутствующих во время развития заболевания. Для терапевтических применений, композиции или медикаменты вводили пациенту, у которого подозревали заболевание, или уже страдающему от такого заболевания, в количестве, достаточном для вылечивания, или по меньшей мере частичного купирования симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая его осложнения и фенотипы со средней патологией, во время развития заболевания. Количество, адекватное для осуществления терапевтического или профилактического лечения, определено как терапевтически или профилактически эффективная доза. Как в профилактическом, так и в терапевтическом режиме агенты обычно вводили несколькими дозами до тех пор, пока не был достигнут достаточный иммунный ответ. Обычно, за иммунным ответом следят и дают пациентам повторные дозы, если иммунный ответ начинает спадать.
Эффективные дозировки
Эффективные дозы фармацевтических композиций (например, моноклональных антител, антител к последовательностям человека, антител человека, мультиспецифичных и биспецифичных молекул, низкомолекулярных соединений, композиций нуклеиновых кислот, например антисмысловых олигонуклеотидов, двунитевых РНК олигонуклеотидов (интерферирующих РНК, коротких шпилечных РНК, малых интерферирующих РНК), или ДНК олигонуклеотидов или векторов, содержащих кодирующие последо
- 37 014900 вательности для транскрипции молекул коротких шпилечных РНК), которые ингибируют передачу сигнала через тканевый фактор, или других ингибиторов тканевого фактора, например малых молекулярных ингибиторов, для лечения неопластического заболевания или воспалительного заболевания, описанных в данной заявке, меняются в зависимости от многих различных факторов, включая средства введения, целевой мишени, физиологического состояния пациента, является ли указанный пациент человеком или животным, других вводимых медикаментов, и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно указанный пациент представляет собой человека, но также можно лечить млекопитающих, отличных от человека. Дозировки для лечения должны быть титрованы, чтобы оптимизировать безопасность и эффективность.
Для введения композиций с терапевтическими антителами или малыми молекулами дозировка должна быть в диапазоне от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг, и чаще от 0,01 до 5 мг/кг, массы тела хозяина. Например, дозировки могут быть 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в диапазоне от 1-10 мг/кг. Пример режима лечения содержит введение раз в каждые две недели или раз в месяц или раз в период от трех до шести месяцев. В некоторых способах две или более композиций терапевтических антител или малых молекул с различными специфичностями связывания мишени вводили одновременно, в этом случае введенная дозировка каждой композиции терапевтических антител или малых молекул лежит в указанном диапазоне. Композицию терапевтических антител или малых молекул обычно вводили в несколько приемов. Интервалы между отдельными дозировками могут представлять собой неделю, месяц или год. Интервалы также могут быть неравномерными, что определяют по измерениям уровней в крови пациента композиций терапевтических антител или малых молекул. В некоторых способах, дозировку подбирают для достижения концентрации в плазме композиции антител или малых молекул, равной 1-1000 мкг/мл и в некоторых способах 25-300 мкг/мл. В качестве альтернативы, композиции антител или малых молекул можно вводить в составе с замедленным высвобождением, в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частоты варьируют в зависимости от времени полужизни композиции терапевтических антител или малых молекул в пациенте. Дозировка и частота введения могут варьировать в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических применениях относительно низкие дозы вводили с относительно редкими интервалами в течение большого промежутка времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение на протяжении всей оставшейся жизни. В терапевтических применениях иногда требуются относительно высокие дозировки за относительно короткие промежутки времени, до тех пор, пока прогрессирование заболевания не замедлится или закончится, и предпочтительно до тех пор, пока пациент не проявит частичное или полное улучшении симптомов заболевания. После этого лекарство можно вводить пациенту в профилактическом режиме.
Дозы для композиции терапевтических антител или малых молекул лежат в диапазоне от приблизительно 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг, или 30-300 мкг на пациента.
Пути введения
Терапевтические композиции (например, моноклональные антитела, антитела к последовательностям человека, антитела человека, мультиспецифичные и биспецифические молекулы, низкомолекулярные соединения, композиции нуклеиновых кислот, например антисмысловых олигонуклеотидов, двунитевых РНК олигонуклеотидов (интерферирующих РНК, коротких шпилечных РНК, малых интерферирующих РНК), или ДНК олигонуклеотидов или векторов, содержащих кодирующие последовательности для транскрипции молекул коротких шпилечных РНК) для лечения неопластического заболевания или воспалительного заболевания можно вводить парентеральными, топическими, внутривенными, пероральными, подкожными, внутриартериальными, внутричерепными, интраперитонеальными, интраназальными или внутримышечными средствами, для профилактики в качестве средства для ингаляции, для терапевтических препаратов антител или малых молекул, нацеленных на неопластические заболевания или воспалительные заболевания, и/или терапевтического лечения. Наиболее типичным путем введения иммуногенного агента является подкожный путь введения, хотя другие пути введения могут быть так же эффективны. Следующим наиболее общепринятым путем введения является внутримышечная инъекция. Этот тип инъекции обычно производят в мышцы руки или ноги. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в конкретную ткань, где обнаружена опухоль, например внутричерепной инъекцией или доставкой, усиленной конвекцией. Внутримышечная инъекция или внутривенная инфузия являются предпочтительными для введения композиции антител или малых молекул. В некоторых способах отдельные композиции терапевтических антител или малых молекул доставляют непосредственно в череп. В некоторых способах композицию антител или малых молекул вводили как композицию с замедленным высвобождением или с помощью прибора с замедленным высвобождением, такого как прибор Мей1райТМ.
Агенты согласно настоящему изобретению можно вводить в комбинации с другими агентами, которые, по меньшей мере, частично эффективны для лечения различных заболеваний, включая различные заболевания, связанные с иммунной системой. В случае опухолей мозга, как первичных, так и метастатических, терапевтические композиции можно также вводить совместно с другими агентами, которые повышают прохождение агентов согласно настоящему изобретению через гематоэнцефалический барьер
- 38 014900 (ГЭБ). Например, интраназальная доставка композиции терапевтических антител или малых молекул может включать энхансеры проникновения через клеточные мембраны.
Лекарственные формы
Композиции (например, моноклональные антитела, антитела к последовательностям человека, антитела человека, мультиспецифичные и биспецифические молекулы, низкомолекулярные соединения, композиции нуклеиновых кислот, например антисмысловых олигонуклеотидов, двунитевых РНК олигонуклеотидов (интерферирующих РНК, коротких шпилечных РНК, малых интерферирующих РНК), или ДНК олигонуклеотидов или векторов, содержащих кодирующие последовательности для транскрипции молекул коротких шпилечных РНК, для лечения неопластического заболевания или воспалительного заболевания часто вводят в виде фармацевтической композиции, включающей активный терапевтический агент, например химиотерапевтический агент или противовоспалительный агент, и различные другие фармацевтически приемлемые компоненты. См. Кетшд1оп'к Р11агтассиНеа1 Баепсе (15-ое изд., Маск РиЫщЫпд Сотрапу, Истон, Пенсильвания, 1980). Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Указанные композиции могут также включать, в зависимости от нужной лекарственной формы, фармацевтически приемлемые, нетоксичные носители или разбавители, которые определены как среды, общеприменимые для составления лекарственных форм фармацевтических композиций для введения животному или человеку. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, физиологический фосфатно-солевой буферный раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнкса. Вдобавок, указанная фармацевтическая композиция или лекарственная форма могут также включать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и тому подобные.
Фармацевтическиея композиции могут также включать большие, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полигликолиевые кислоты и сополимеры (такие как функционализированная латексом Сефароза™, агароза, целлюлоза, и тому подобные), полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и агрегаты липидов (такие как масляные капли или липосомы). Вдобавок, эти носители могут действовать как иммуностимулирующие агенты (т.е., адъюванты).
Для парентерального введения композицию терапевтических антител или малых молекул можно вводить как инъецируемые дозировки раствора или суспензии вещества в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем, который может быть стерильной жидкостью, такой как вода-масло, солевой раствор, глицерин или этанол. Дополнительно, вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, поверхностно-активные вещества, вещества, забуферивающие рН, и тому подобные, могут присутствовать в композиции. Другие компоненты фармацевтических композиций имеют нефтяное, животное, растительное, или синтетическое происхождение, например арахисовое масло, соевое масло и минеральное масло. Обычно гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, являются предпочтительными жидкими носителями, в частности, для инъецируемых растворов. Композицию терапевтических антител или малых молекул можно вводить в форме инъекции вещества замедленного всасывания или имплантированного препарата, который может иметь такую лекарственную форму, которая позволила бы замедленное высвобождение активного ингридиента. Пример композиции включает композицию терапевтических антител или малых молекул в концентрации 5 мг/мл, находящейся в форме водного буферного раствора, состоящего из 50 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, подведенного до рН 6,0 с помощью НС1.
Обычно, композиции производят как инъецируемые формы, либо в форме жидких растворов, либо в форме суспензий; твердые формы, подходящие для растворения, или суспендирования, в жидких средах, также можно приготовить перед инъекцией. Препарат можно также эмульгировать или включить в липосомы или микрочастицы, такие как полилактид, полигликолид или сополимер для усиленного адъювантного действия, как обсуждалось выше. Ьапдег, 8с1епсе 249: 1527, 1990 и Напек, Абтапсеб Эгид Эебтегу Ке\зе\\ъ 28: 97-119, 1997. Агенты согласно настоящему изобретению можно вводить в форме инъекции с замедленным всасыванием или препарата для имплантации, который может иметь такую лекарственную форму, которая обеспечивает задержанное или пульсирующее высвобождение активного ингридиента.
Дополнительные лекарственные формы, подходящие для других способов введения, включают пероральные, интраназальные и внутрилегочные лекарственные формы, суппозитории и лекарственные формы для трансдермального введения.
Для суппозиториев связующие вещества и носители включают, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингридиент в количестве от 0,5 до 10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные лекарственные формы включают вспомогательные вещества, такие как фармацевтические категории маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарин натрия, целлюлоза и карбонат магния. Такие композиции применяют в форме растворов, суспензий, таблеток, пиллюль, капсул, лекарственных форм с замедленным высвобождением или порошков и содержат 10-95% активного ингридиента, предпочтительно 25-70%.
- 39 014900
Местное применение может быть осуществлено путем трансдермальной или интрадермальной доставки. Местное введение можно облегчить путем совместного введения агента с холерным токсином или его детоксифицированными производными или субъединицами, или с другими схожими бактериальными токсинами. С1епп и др., №11иге 391: 851, 1998. Совместное введение можно осущестить путем применения компонентов в виде смеси или в виде связанных молекул, полученных путем химической сшивки или экспрессии в виде химерного белка.
В качестве альтернативы, трансдермальную доставку можно осуществить, применяя трансдермальный пластырь или трансферосомы. Раи1 и др., Еиг. ί. 1ттипо1. 25: 3521-24, 1995; Сеус и др., ВюсНет. ВюрЕук. Ас1а 1368: 201-15, 1998.
Фармацевтические композиции обычно имеют лекарственную форму стерильную, по существу изотоническую, и в полном соответствии со всеми требованиями надлежащей производственной практики (СМР) Управления по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США.
Токсичность
Предпочтительно терапевтически эффективные дозы композиций (например, моноклональные антитела, антитела к последовательностям человека, антитела человека, мультиспецифичные и биспецифические молекулы, низкомолекулярные соединения, композиции нуклеиновых кислот, например антисмысловых олигонуклеотидов, двунитевых РНК олигонуклеотидов (интерферирующих РНК, коротких шпилечных РНК, малых интерферирующих РНК), или ДНК олигонуклеотидов или векторов, содержащих кодирующие последовательности для транскрипции молекул коротких шпилечных РНК), описанные в данной заявке, обеспечат терапевтическую пользу, не оказывая сущуственной токсичности.
Токсичность белков, описанных в данной заявке, можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на культуре клеток или на экспериментальных животных, например, путем определения ЬП50 (дозы, летальной для 50% популяции) или ЬО100 (дозы, летальной для 100% популяции). Отношение доз между токсичным и терапевтическим действиями представляет собой терапевтический индекс. Данные, полученные при анализе культур клеток и изучения животных, можно использовать, чтобы определить диапазон дозировок, которые не будут токсичными, для применения людьми. Дозировка белков, описанных в данной заявке, лежит предпочтительно в диапазоне циркулирующих концентраций, который включает эффективную дозу с малой или отсутствующей токсичностью. Дозировка может варьироваться в пределах этого диапазона, в зависимости от используемой дозируемой лекарственной формы и используемого пути введения. Конкретную лекарственную форму, путь введения и дозировку может подобрать лечащий врач с учетом состояния пациента (см., например, Ешд1 и др., 1975, в ТНе РНагтасо1од1са1 Вайк о£ ТЕегареиЛск, глава 1).
Следующие примеры конкретных вариантов реализации для осуществления настоящего изобретения предложены исключительно с целью иллюстрирования и не считаются ограничивающими какимлибо образом объем настоящего изобретения.
Примеры вариантов реализации
Как показано в Примерах ниже, авторы настоящего изобретения открыли, что ТЕ-УЛа опосредуемая коагуляция и передача сигнала в клетке происходят с участием различных клеточных пулов ТЕ. Было обнаружено, что поверхностно доступная внеклеточная Сук186-Сук209 дисульфидная связь ТЕ необходима для активации коагуляции, также, как и для фазы инициации коагуляции при передаче сигнала через Ха в тройном ТЕ-УЛа-Ха комплексе, но не для непосредственного расщепления РАК2 бинарным ТЕУ11а комплексом.
Нарушение этой дисульфидной связи путем мутации придает ему функциональные свойства сигнального пула ТЕ-УПа, который имеет низкую аффинность к УПа на клетках с конститутивной экспрессией ТЕ.
Кроме того, было показано, что белок дисульфидизомераза (РИ1) нарушает коагуляцию через этот дисульфид. Коагулирующая активность ТЕ подавляется при ассоциации внеклеточного РЭ1 с ТЕ, и эти пути обмена дисульфид/тиол необходимы для образования комплекса ТЕ-РАК2 и передачи сигнала через ТЕ-УЛа. Существует близкая корреляция между ассоциацией ТЕ-РЭ1 и передачей сигнала через ТЕ-УЛа в некоторых типах клеток, включая клетки рака молочной железы. Уникальное моноклональное антитело (МАТ-10Н10) узнает только не коагулянтную, латентную конформацию ТЕ. Это антитело ингибирует образование ТЕ-РАК2 комплекса и передачу сигнала через ТЕ-УЛа, но не предотвращает активацию коагуляции. Блокирование передачи сигнала через ТЕ-УЛа в этих клетках с помощью МАТ-10Н10 является событием, предшествующим блокированию коагуляции с помощью МАТ-5С9 для подавления опухолевого роста (например, опухоли груди или меланомы), что придает особое значение пути передачи сигнала через ТЕ-УЛа ΐπ у|уо. Важно заметить, что МАТ 10Н10 практически не влияет на активацию коагуляции, указывая на то, что ингибирование передачи сигнала через ТЕ-УЛа не нарушает гемостаз.
Дополнительно, было обнаружено, что РЭ1 подавляет коагулирующую активность ТЕ зависимым от оксида азота (N0) путем. Защищающий сосуды синтез N0 часто нарушен при атеросклерозе, диабете или воспалении и выключение синтеза оксида азота может сменить активность ТЕ клеточной поверхности на коагуляторную. ΝΟ-зависимое ингибирование коагулирующей активности ТЕ, тем самым, неожиданным образом связывает регуляцию способности к тромбообразованию с окислительным стрессом при
- 40 014900 сердечно-сосудистых заболеваниях и воспалении.
Пример 1. Специфичное ингибирование сигнального ТЕ
ТЕ, экспрессированный на поверхности клетки, связывает У11а с изменяющейся аффинностью, и активация коагуляции фактором ТЕ обычно насыщается при низких концентрациях УНа, по отношению к клеточному сигналингу. Ье и др., 1. Вю1. СНет. 267: 15447-15454, 1992; Н_)ог1ое и др., В1ооб 103: 30293037, 2004. Не совсем ясно, является ли избирательное связывание УНа свойственным конформации ТЕ, или оно происходит вследствие других факторов, про которые известно, что они влияют на коагулирующую активность ТЕ, включая липидное окружение, белки-шапероны, или мобилизацию кальция. 8еуткку и др., 1. Се11 Вю1. 133: 293-304, 1996; Сагкоп и др., В1ооб 84: 526-534, 1994; ВНа11асНаг|ее и др., Айепо8с1ег. ТНготН. Уакс. Вю1. 25: 1737-1743, 2005; ВасН и Мо1боте, В1ооб 89: 3270-3276, 1997. Мы обнаружили, что коагулирующие активности ТЕ оставались неизменными, несмотря на прогрессирующее снижение регуляции уровней экспрессии ТЕ до <5% в кератиноцитах человека во время блокировки роста, что подтверждается неизменным уровнем актина (фиг. 1а). В противоположность этому передача сигнала через ТЕ-УНа подавлялась в соответствии с уровнем ТЕ (фиг. 1Ь), хотя способность отвечать на РАВ не была утрачена (фиг. 1е).
Окрашивание не пермеабилизованных клеток подтвердило снижение экспрессии ТЕ на поверхности клеток (фиг. 1с), но неожиданно авторы изобретения обнаружили потерю эпитопа для МАТ-10Н10, которое связывается с карбоксильным концом ТЕ, не ингибируя ассоциацию с УНа. Ви£ и др., ВюсНет. 1. 278: 729-733, 1991. Реактивность МАТ-509, которая ингибирует коагуляцию и связывание субстрата, сохранилась, указывая на то, что МАТ 10Н10 утратило способность реагировать с остаточным пулом ТЕ, который отвечает за коагуляцию. Ниапд и др., 1. Мо1. Вю1. 275: 873-894, 1998. Эксперименты по иммунодеплеции с применением очищенного, растворенного в фосфолипидах ТЕ или лизатов экспрессирующих ТЕ клеток подтвердили, что только МАТ 509, но не МАТ 10Н10 эффективно связывалось со способствующим коагуляции ТЕ (фиг. 1б). Таким образом, различные по антигености пулы ТЕ оказались ответственными за коагуляцию, в противовес ТЕ-УНа сигналингу клетки через РАВ2 (фиг. 1е).
Вне зависимости от времени культивирования, способствующий коагуляции ТЕ имел высокую аффинность к УПа, так как уровни образования Ха имели насыщение до ~99% при 1 нМ УПа. В инициаторном комплексе коагуляции ТЕ-УПа-Х вновь образованный продукт Ха, скорее чем ТЕ-УПа, активирует РАВ. В1е^а1б и Ви£, Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А 98: 7742-7747, 2001. Низкие (1 нМ) концентрации У11а вызывали существенный сигналинг только в присутствии субстрата Х, и передача сигнала комплексом ТЕ-У11а-Ха блокировалась ингибитором Ха, NАР5 (фиг. 1ί). Передача сигнала комплексом ТЕ-У11а при 10 нМ УНа не ингибировалась NАР5, и ΝΛΕ5 имел лишь минимальный эффект на передачу сигнала, когда субстрат X добавляли вместе с 10 нМ УПа. Это показывает, что наличие субстрата не влияет на сигнальный пул ТЕ-УНа. Коагуляция и Ха-зависимая передача сигнала инициаторным комплексом коагуляции ингибировались МАТ-509, но не МАТ-10Н10. Важно заметить, что МАТ 10Н10 со слабой реакционной способностью к способствующему коагуляции ТЕ (фиг. 1с,б) блокировал передачу сигнала через ТЕ-УНа. Таким образом, мы определили специфичное ингибиторное антитело к сигнальному ТЕ, которое не нарушает инициацию коагуляции или передачу сигнала тройным комплексом ТЕ-УНа-Ха.
На фиг. 1 показано специфичное ингибирование сигнального ТЕ. а) Коагулирующая активность, экспрессия ТЕ и Ь) передача сигнала через ТЕ-УНа в клетках НаСаТ с остановленным ростом, среднее ± стандартное отклонение (п=3). Вставки: актин или ТЕ в лизатах клеток; с) определение ТЕ клеточной поверхности с помощью Е1ТС-конъюгированных МАТ-9С3 и конъюгированных с техасовым красным МАТ-509 или 10Н10; б) образование Ха растворенным в фосфолипидах ТЕ, иммунодеплетированным иммобилизованным МАТ 10Н10 или 509, по отношению к контролю; е) зависимость от РАВ2 передачи сигнала через ТЕ-УНа в клетках НаСаТ; ί) различная аффинность к У11а позволяет отличить ТЕ, который опосредует ТЕ-УНа- или Ха-зависимую передачу сигнала тройным комплексом ТЕ-УНа-Ха. МАТ-10Н10 специфическим образом ингибирует передачу сигнала через ТЕ-УНа; среднее ± стандартное отклонение (п>3).
Пример 2. Сигнальный ТЕ регулируется белком дисульфидизомеразой
Для дополнительного изучения регуляции функции ТЕ в этой модели клетки пересадили в обедненную Са2+ среду, чтобы предотвратить межклеточные контакты на 48 ч. В качестве альтернативы, среду дополняли 2 мМ Са2+ (высокое содержание Са2+) на последние 24 ч, что вызывало различную эпителиальную морфологию, не влияя на уровни экспрессии ТЕ или связывания УНа. Эквивалентную и преобладающую экспрессию ТЕ клеточной поверхности подтвердили путем поверхностного биотинилирования и иммунопреципитации с МАТ-509, которое не связывает ТЕ после биотинилирования (фиг. 2а). Тем не менее, ТЕ проявил заметные функциональные различия при этих двух условиях (фиг. 2Ь), и коагулирующая активность была в ~3-4 раза более высокой в клетках, которых растили при низком уровне Са2+. Хотя непосредственная активация РАВ2 пептидом-агонистом была сравнимой, передача сигнала через ТЕ-УНа была видна только в клетках, которых растили при высоких, но не при низких уровнях Са2+. Таким образом, изменение уровня Са2+ до высокого, похоже, индуцировало сигнальный ТЕ за счет ТЕ, способствующего коагуляции. Соответственно, блокировка белкового синтеза циклогексимидом (СНХ) во
- 41 014900 время добавления Са2+ предотвращала передачу сигнала через ТЕ-Щ1а, одновременно с блокировкой появления ТЕ клеточной поверхности с более высокой степенью гликозилирования (фиг. 2с).
Так как белок дисульфидизомераза (ΡΌΙ) индуцируется во время контактного торможения, мы пришли к выводу, что коагулирующая активность ТЕ подавлялась каскадом реакций, запускаемых ΡΌΙ, который нарушает экспонированную в растворитель Су5186-Су5209 дисульфидную связь ТЕ, необходимую для коагуляции. ЯеНетШПа и др., I. Вю1. СЬет. 266: 10294-10299, 1991. Такие дисульфидные мостики, сшивающие разные нити, подвержены восстановлению вседствие напряженной геометрии связи. Тгепйк ВюсЬет. 8сг 28: 210-214, 2003; \Уои1ег5 и др., ВюЕккаук 26: 73-79, 2004. Было обнаружено, что ΡΌΙ клеточной поверхности связывается с ТЕ, на основании мечения не проникающим через мембрану, тиол-специфическим 3-(Ы-малеимидопропионил)биоцитином (МРВ). МРВ-меченые полосы на уровне ~56 и 64 кДа специфическим образом соосаждались с ТЕ только из клеток, которых растили при высоком уровне Са2+ (фиг. 2й), но блокировка вицинальных тиолов оксидом фениларсина (РАО) нарушала мечение. Оставалась слабая, неустойчиво метящаяся полоса на уровне подходящего для ТЕ молекулярного веса, возможно свидетельствующая о неустойчивом восстановлении ТЕ. Основные МРВ-меченые полосы, соосаждающейся с ТЕ, находились на том же уровне, что и иммуноосажденный ΡΌΙ, но не на уровне его близкого гомолога ЕЯР57, и анти-ΡΌΙ антитело блокировало мечение МРВ (фиг. 2е). Нокдауном ΡΌΙ или ЕКГ57 с помощью малой интерферирующей РНК (δίΚ,ΝΛ) дополнительно подтвердили, что ΡΌΙ соосаждался с ТЕ (фиг. 2Г).
Коиммунопреципитацию ΝΗδ-биотинилированного поверхностного ΡΌΙ при 64 кДа подтвердили с помощью вестерн-блоттинга (фиг. 2д). Бацитрацин, ингибитор ΡΌΙ, предотвращал сопреципитацию ΡΌΙ с ТЕ. Мапйе1 и др., Ρπκ. №И. Асай. 8сг и. 8. А 90: 4112-4116, 1993. Бацитрацин ингибировал передачу сигнала через ТЕ-Щ1а, но не блокировал напрямую ответы ΡАΚ2 агониста или тромбина (фиг. 2Ь). Вымывание бацитрацина восстановило передачу сигнала через ТЕ-Щ1а, и МРВ-мечение поверхностного ΡΌΙ показало одновременное быстрое восстановление ассоциации ΡΌΙ с ТЕ во временных рамках этих экспериментов (фиг. 21). Таким образом, сигнальный ТЕ на клетках, которых растили при высоком уровне Са2+, находится в бацитрацин-чувствительном комплексе с ΡΌΙ.
Хотя присутствие бацитрацина несколько повышало способствующую коагуляции функцию ТЕ (фиг. 2)), его активность на клетках, которых растили при низком уровне Са2+, по сравнению с клетками, которых растили при высоком уровне Са2+, оставалась поразительно различной. Мы предполагаем, что частичный эффект на активность ТЕ от добавления бацитрацина достигается вследствие недостаточной диссоциации ΡΌΙ, связанной условиями мечения (фиг. 2д, 1). Кратковременное воздействие Η§Ο2 повышало коагулирующую активность ТЕ по существу в клетках, которых растили при высоком уровне Са2+, свидетельствуя, что ТЕ негативно регулируется каскадами реакций, ведущими к его восстановлению. Повышенная коагуляция вследствие окисления влияет на ТЕ, потому что Η§Ο2 практически не влиял на клетки, которых растили при низком уровне Са2+, не повышал коагуляцию в присутствии бацитрацина и специфическим образом нарушал ассоциацию ΡΌΙ с ТЕ, не перемещая ΡΌΙ с поверхности клетки (фиг. 2к). Более того, бацитрацин выступал обратимым ингибитором активации с помощью Η§Ο2 (фиг. 2)), но не блокировал неспецифичное, токсичное действие Η§Ο2 на клетки. Таким образом, сигнальный ТЕ теряет свою коагулирующую активность по окислительно-восстановительному механизму. Реакционная способность МАТ 10Η10, но не другого антитела, уменьшалась при поверхностном окислении, дополнительно подтверждая чувствительность к окислению-восстановлению конформации сигнального ТЕ.
На фиг. 2 показано, что сигнальный ТЕ регулируется ΡΌΙ. а) Сходную экспрессию ТЕ на клеточной поверхности при переключении на высокий уровень Са2+ подтвердили с помощью поверхностного ΝΗ8 биотинилирования, которое предотвращает иммунопреципитацию с МАТ-509. Ь) Низкая коагулирующая активность ТЕ в клетках, которых растили при высоком уровне Са2+, связана с возможностью ингибирования антителом МАТ 10Η10 передачи сигнала через ТЕ-Щ1а; *отличный от контроля(соп) с высоким уровнем Са2+, р<0,01, критерий Стьюдента, среднее ± стандартное отклонение (п>4), с) блокировка синтеза ТЕ циклогексимидом (СНХ) предотвращает передачу сигнала через ТЕ-Щ1а; й) мечение с помощью МРВ белков, соосаждающихся с ТЕ, ингибировалось 2 мкМ РАО; е) совместная миграция МРВмеченых полос в ТЕ и ΡΌΙ иммунопреципитатах. Анти-ΡΌΙ антитело 8ΡА-890 блокирует мечение МРВ; Г) нокдаун ΡΌΙ, но не ЕΚΡ57, с применением малых интерферирующих РНК предотвращает появление МРВ-меченых полос в ТЕ иммунопреципитатах; д) ингибитор ΡΌΙ - бацитрацин (3 мМ) приводит к диссоциации ΡΌΙ от ТЕ в МАТ-9С3 иммунопреципитатах поверхностно NΗ8-биотинилированных клеток; Ь) бацитрацин обратимо блокирует передачу сигнала через ТЕ-Щ1а. Смыв: клетки, предварительно инкубированные в течение 10 мин с бацитрацином, отмывали перед стимуляцией 10 нМ νΙΙη; * р<0,01 по отношению к контролю, критерий Стьюдента, среднее ± стандартное отклонение (п>4); 1) смыв бацитрацина вызывет вновь ассоциацию ΡΌΙ-ТЕ; мечение проводят в течение 10 мин после смыва; _)) эффект бацитрацина на коагулирующую активность ТЕ. Поверхность клетки окисляли 100 мкМ Η§Ο2 в течение 2 мин перед функциональным тестом. к) Окисление Η§Ο2 вызывает диссоциацию ΡΌΙ от ТЕ, не перемещая МРВ- или NΗ8-биотинилированный ΡΌΙ с поверхности клетки.
- 42 014900
Пример 3. Мутационное нарушение дисульфидной связи ТР повторяло снижение аффинности к У11а, что является признаком ТР-сигналинга
Авторы изобретения проверили, повторяло ли нарушение Сук186-Сук209 дисульфидной связи ТР сигнальные свойства РЭ1-регулируемого ТР. Мутанты с отдельными заменами аланина по дисульфидной связи вводили в ТР-отрицательные эндотелиальные клетки пупочной вены (НИУЕС) путем аденовирусной трансдукции для достижения сходной экспрессии на поверхности. Каждый мутант проявил >95% уменьшение ТР-У11а опосредуемого образования Ха, но передача сигнала через ТР-У11а сохранилась в чувствительных к агонисту РАК2 клетках, которые экспрессировали ТР с заменой С209А, но не С186А (фиг. 3а). Связывание УНа с С209А ТР, что смотрели путем непрямой иммунофлюоресценции, было сравнимо с таковым для ТР дикого типа. Передача сигнала через ТР-УПа в клетках, экспрессирующих ТР дикого типа, требовала >1 нМ УНа, и передача сигнала через тройной ТР комплекс инициации коагуляции происходила при <1 нМ У11а (фиг. 3Ь). В клетках, трансдуцированных С209А ТР, передача сигнала через ТР-УНа требовала несколько более низких концентраций УНа, по сравнению с клетками, экспрессирующими ТР дикого типа. Важно заметить, что С209А ТР-опосредуемая передача сигнала не изменялась, когда субстрат X добавляли вместе с УНа. Таким образом, образование Сук186-Сук209 дисульфидной связи было необходимым для образования высокоаффинного ТР, который вызывает не только коагуляцию, но также передачу сигнала через тройной комплекс ТР-УПа-Ха.
Авторы изобретения подтвердили, что восстановленный С209А ТР аллостерически индуцирует каталитическую активность УПа, что необходимо для передачи протеолитических сигналов в клетке. Рекомбинантный растворимый мономерный С209А ТР максимально стимулировал активность УПа при насыщении. Тем не менее, восстановленный С209А ТР имел более низкую аффинность для усиления каталитической активности УПа по отношению к растворимому, окисленному ТР дикого типа (фиг. 3с). Таким образом, мутационное нарушение дисульфидной связи в ТР повторяло сниженную аффинность к УПа, что служит признаком сигнального ТР. МАТ-10Н10 не блокировало каталитическую активность С209А ТР-УНа, исключая возможность, что указанное антитело ингибирует связывание У11а специфическим образом с сигнальным ТР. Таким образом, МАТ 10Н10, видимо, предотвращает ТР-УНа опосредуемое расщепление РАК2, образуя стерическое препятствие.
На фиг. 3 показана передача сигнала восстановленным ТР. а) Мутант С209А ТР-УПа передает сигнал, но теряет коагулирующую активность в клетках НИУЕС, экспрессирующих сходные уровни ТР дикого типа, С186А ТР или С209А ТР с таковыми для РАК2. Ь) Ответ на дозу для передачи сигнала через УПа с добавлением и без 100 нМ X в клетках НИУЕС, экспрессирующих С209А или ТР дикого типа, среднее ± стандартное отклонение (п>4). с) Рекомбинантный растворимый С209А ТР активирует УНа (40 нМ) со сниженной аффинностью по сравнению с ТР дикого типа; среднее ± стандартное отклонение (п=3). Представлен гель, показывающий гомогенность препаратов мономерного растворимого ТР; экспрессионная метка не была отщеплена от С209А ТР, что дает более высокий молекулярный вес. Нижняя диаграмма: МАТ-10Н10 не оказывал влияния на амидолитическую активность ТР-У11а.
Пример 4. Роль способствующего коагуляции ТР и сигнального ТР в прогрессировании опухоли
Специфичные антитела к способствующему коагуляции (МАТ-569) и сигнальному (МАТ 10Н10) ТР обеспечили возможность изучить роли этих активностей в прогрессировании опухоли. Специфичное нацеливание на ТР из опухолевых клеток было достигнуто в ксенотрансплантантной модели МИАМВ231 рака молочной железы. Указанные антитела показали ожидаемые значения специфичности для подавления коагуляции в случае МАТ-569, тогда как МАТ-10Н10 ингибировало передачу сигнала, включая индукцию проангиогенного интерлейкина 8 и ТК3, типичного гена раннего ответа, индуцируемого передачей сигнала через РАК (фиг. 4а,Ь). Опухолевые клетки, в которые ввели МАТ-10Н10, но не МАТ-569, образовали значительно уменьшенные по конечным размерам и весу опухоли, по сравнению с введением изотипически сходного контрольного 1д61 (фиг. 4с). Обработанные антителом клетки росли неотличимо от контрольных в культуре, в соответствии с ранее полученными результатами, показывающими, что экспрессия ТР не влияет на пролиферацию ш νίΐιυ. Уи и др., В1оой 105: 1734-1741, 2005; 2капд и др., 1. С11п. ИтсекГ 94: 1320-1327, 1994. МАТ-569 слегка уменьшало объемы опухоли, в соответствии с частично ингибиторным действием МАТ-569 на передачу сигнала через ТР-УПа 1п νίΙΐΌ.
ТР обеспечивает фазу раннего ареста экспериментального метастазирования меланомы через сигнальный путь тромбина, так как МАТ-569, но не МАТ-10Н10, подавлял метастазирование меланомы М24те1. Мие11ег и др., Ргос. №!1. Асай. 8сг И8А 89: 11832-11836, 1992. Так как режим введения антител в ранних экспериментах был недостаточным для оценки опухолевого роста метастаз, мы заново пересмотрели роль передачи сигнала через ТР в распространении опухоли в этой модели меланомы. МАТ569 замедляло первичный опухолевый рост меланомы, но МАТ 10Н10 было более действенным для снижения как конечных объемов, так и веса опухолей (фиг. 4й). В противоположность вызываемому коагуляцией гематогенному метастазированию нацеливание на передачу сигнала через ТР-УНа, таким образом, эффективно подавляло первичный рост двух независимых опухолевых моделей ш νί\Ό.
На фиг. 4 показано, что передача сигнала через ТР-УНа вызывает рост опухоли. а, Ь) Передача сигнала через ТР-УНа блокировалась антителом МАТ 10Н10, но не МАТ 569 в клетках рака молочной же
- 43 014900 лезы Μ^Α-МВ231 (*р<0,01, критерий Стьюдента, среднее ± стандартное отклонение (п>4). Вставка: показательный эксперимент. с) Первичный опухолевый рост Μ^Α-МВ231 в присутствии 1 мг контрольного ^61 (ΠΒ115), с которым совместно инъецировали ΜΑГ-569 или ΜΑΤ 10Н10 для достижения высоких локальных концентраций антитела. Вес опухолей на день умерщвления (п = 6, 2-сторонний дисперсионный анализ (ΑΝΟνΑ), Кгикка11 \Уа1Нк **р<0,001). ά) Рост опухоли для клеток меланомы М24тек, которые имплантировали без антител или с 1 мг ΜΑГ-5С9 или 10Н10 (п = 8, 2-сторонний дисперсионный анализ, Кгикка11 \Уа1Нк **р<0,001,*р<0,01).
Эти эксперименты позволяют определить молекулярный механизм, путем которого ΤΕ переключается с инициирующего кофактора каскада коагуляции на не способствующий коагуляции сигнальный корецептор, который вызывает патологию. Так как сигнальный ΤΕ-νΐΛ неэффективно связывает субстрат, он ускользает от быстрого ингибирования, по принципу обратной связи, с помощью Хазависимого ингибитора пути тканевого фактора ΤΕ (ГЕРЦ. Ниапд и др., Β^ά 90: 944-951, 1997. Тем самым, патофизиологические вышестоящие пути передачи сигнала через ΤΕ-ΥΠη продолжаются без обычных ингибиторных циклов, которые следуют за активацией коагуляции. Нацеливание на сигнальный ΤΕ подавляет рост опухоли, обеспечивая прямое доказательство того, что ΤΕ-ΥΠη опосредуемая активация РΑК2 представляет собой центральный сигнальный путь, который вызывает патологии, независимо от тромбиновой передачи сигнала ш νί\Ό. Пример ΤΕ показывает, что пути обмена дисульфидных связей могут переключать один рецептор между двумя различными биологическими функциями, и что такой регуляторный переключатель можно применять для потенциальной терапевтической пользы. Настоящее исследование должно способствовать осуществлению направленного воздействия на другие патофизиологически значимые рецепторы клеточной поверхности.
Пример 5. Распределение эпитопов для антитела, специфичного к сигнальному тканевому фактору
На фиг. 5 показано распределение эпитопов для ΜΑΤ 10Н10, моноклонального антитела, которое специфическим образом связывается с сигнальным тканевым фактором. На фигуре показана иммунопреципитация растворимого ΤΕ1-218 дикого типа или мутированного ΤΕ1-218 с указанными антителами, после которой проводили детектирование методом вестерн-блоттинга. ΜΑΤ 10Н10 не эффективно для иммунопреципитации ΤΕ, у которого есть мутация в остатках 149 и 150 (А149, А150), что свидетельствует о том, что эпитоп располагается в домене на карбоксильном конце ΤΕ, близко или непосредственно захватывая эти боковые цепи.
Пример 6. Зависимое от оксида азота (ΝΟ) подавление коагулирующей активности ΤΕ с помощью РЭ!
Как отмечалось выше, мутационный анализ показал, что нарушение Сук186-Сук209 дисульфидной связи делает ΤΕ коагуляцию неактивной, но мечение МРВ не выявило заметных свободных тиолов ΤΕ на клетках, которых растили при высоком уровне Са2+. Р^I клеточной поверхности катализирует реакции транс-нитрозилирования и денитрозилирования, и Р^I может быть δ-нитрозилирован в вицинальных тиолах. 50-100 мкМ Нд2+ требовалось для усиления коагулирующей активности ΤΕ, что является типичными концентрациями для высвобождения оксида азота (ΝΟ) из Р^I ^йккотю и др., ί. ΒωΡ СНет. 280, 8733-8741, 2005), повышая вероятность того, что активаторный эффект Нд2+ включал денитрозилирование РЭЕ Для оценки этой возможности применяли метод биотинового переключателя, чтобы обнаружить δ-нитрозилирование. После блокировки клеточных свободных тиолов Ν-этилмалеимидом (ИЕМ), клетки метили МРВ в присутствии или отсутствие аскорбиновой кислоты для высвобождения ΝΟ. Подобным образом, после блокировки свободных тиолов 1 мМ йодацетамидом, измеряли МРВ-мечение ΤΕ иммунопреципитатов в присутствии аскорбиновой кислоты.
Как показано на фиг. 6, результаты этих исследований показывают, что Р^I подавляет коагулирующую активность ΤΕ зависимым от оксида азота путем, связывая регуляцию способности к тромбообразованию ΤΕ с окислительным стрессом в сосудистой системе. На фиг. 6а показано, что метод биотинового переключателя после блокировки тиолов 1 мМ Ν-этилмалеимидом (ИЕМ) обнаруживает повышенный уровень мечения Р^I при высвобождении ΝΟ аскорбиновой кислотой (АК) специфическим образом в Р^I иммунопреципитатах из клеток, которых растили при высоком уровне Са2+. Со специфичностью для клеток, которых растили при высоком уровне Са2+, иммуноосажденный Р^I проявлял повышенное МРВ-мечение в присутствии аскорбиновой кислоты. МРВ-меченые полосы на подходящем для ΤΕ уровне молекулярного веса также становились видимыми в Р^I иммунопреципитатах. На фиг. 6Ь показано δнитрозилирование ΤΕ, детектируемое методом биотинового переключателя после блокировки тиолов 1 мМ йодацетамидом перед МРВ-мечением в присутствии или в отсутствие ΑΚ. После блокировки свободных тиолов 1 мМ йодацетамидом, МРВ-мечение ΤΕ иммунопреципитатов значительно возрастало в присутствии аскорбиновой кислоты.
Дополнительно проверили, является ли обратимой индуцированная Нд2+ активация ΤΕ. После вымывания оксиданта коагулирующая активность ΤΕ оставалась высокой. Указанные результаты, как показано на фиг. 6с, демонстрируют, что индуцированная Нд2+ активация коагулирующей активности ΤΕ обратима ΝΟ-зависимым сигнальным путем РЭР В этом эксперименте, клетки, промытые после кратковременного экспонирования 100 мкМ Нд2+, инкубировали в буферном растворе Ν-2гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфоновой кислоты (НΕРΕδ), 1.5 мМ Са2+ в присутствии 1 мМ нит
- 44 014900 ропруссида натрия (8ΝΡ), 1 мМ восстановленного глутатиона (С8Н), или 1 мМ 8-нитрозоглутатиона (С8NО) с добавлением или без 10 мкМ РАО в течение 10 мин перед тестом на образование Ха. Данные указывают на то, что добавление восстановленного глутатиона (С8Н) или NО донора, нитропруссида натрия (8ΝΡ), одного не влияло на активность ТЕ, но при их комбинации коагулирующая активность ТЕ подавлялась (фиг. 6с; *отличный контроль (р<0,05, критерий Стьюдента; среднее ± стандартное отклонение; п = 3)). Блокатор вицинальных тиолов, РАО, предотвращал инактивацию ТЕ, свидетельствуя об участии ΡΌΙ в разрыве дисульфидных связей ТЕ. NО реагирует с С8Н с выходом 8-нитрозоглутатиона, и добавления 8-нитрозоглутатиона было достаточно для подавления коагулирующей активности ТЕ.
Пример 7. Передача сигнала через ТЕ-УЛа требует образования комплекса ТЕРАВ2
Дополнительные исследования, как показано на фиг. 7, указывают на то, что передача сигнала через ТЕ-УЛа требует образования комплекса ТЕРАКТ. На фиг. 7а показано, что иммунопреципитация ΡΑВ2 антителом МАТ-5С9 из клеток, которых растили при высоком уровне Са2+, нарушалась при предварительной обработке Нд2+. На фиг. 7Ь показано, что МАТ 10Н10, но не МАТ-5С9, нарушает ТЕ-ГАВ2 комплекс. НаСаТ клетки предварительно обрабатывали указанным антителом в бессывороточной среде в течение 15 мин и обнаруживали ТЕ в ΡΑВ2 иммунопреципитате. Контроль загрузки был невозможен вследствие наличия фонового сигнала, так как не было подходящего доступного ΡΑВ2 антитела из отличного вида для проведения вестерн-блоттинга. На фиг. 7с показано, что МАТ-10Н10 не иммунопреципитирует ΡΑВ2 из НаСаТ клеток. На фиг. 7б показано, что МАТ-10Н10 не иммунопреципитирует комплекс, содержащий ΡΌΙ. МРВ-меченые клетки иммунопреципитировали с МАТ-9С3 или МАТ 10Н10 и исследовали на ΡΌΙ, ТЕ или тиол-биотинилирование с МРВ.
Как показано на фиг. 7, МАТ-5С9 не оказывало эффекта на передачу сигнала через ТЕ-УЛа, но проявляло сильную реакционную способность к способствующему коагуляции и неспособствующему коагуляции пулам ТЕ. Это антитело иммунопреципитировало комплекс ТЕ с ΡΑВ2 из НаСаТ клеток (фиг. 7а). Нд2+ обработка для освобождения поверхностного ΡΌΙ от ТЕ нарушала образование комплекса ΡΑВ2 с ТЕ в МАТ-5С9 иммунопреципитатах. Предварительная обработка клеток МАТ-5С9 не оказывала эффекта на обратную ассоциацию ТЕ с ΡΑВ2 иммунопреципитатами, но блокирующее передачу сигнала МАТ 10Н10 значительно снижало уровень ассоциации ТЕ-ГАВ2 (фиг. 7Ь). Таким образом, блокировка антителом передачи сигнала через ТЕ-УЛа коррелировало с пониженной коиммунопреципитацией ТЕΡΑВ2. В отличие от МАТ-5С9, МАТ 10Н10 не иммунопреципитировало ΡΑВ2 (фиг. 7с) или ΡΌΙ (фиг. 7б), указывая на то, что это антитело предотвращает образование комплекса, включающего ТЕ, ΡΑВ2 и ΡΌΙ. Все вместе, эти данные, описанные на фиг. 7 и фиг. 2, показывают на клеточной модели с физиологическими уровнями ТЕ и ΡΑВ2, что ΡΌΙ действует как регуляторный переключатель между прямой передачей сигнала через ТЕ-УЛа в клетке и активацией коагуляции.
Пример 8.
Материалы и методы
Реагенты
Факторы коагуляции, ингибиторы и антитела были описаны ранее или получены от следующих поставщиков: анти-ΡΌΙ ВЬ90 (А1ех1з), 8ΡΑ-890 (81гезздеп), анти-ЕВΡ57 (Ирз1а1е), №-(3-малеимидилпропионил) биоцитин (МРВ) (Мо1еси1аг Ριό^), бацитрацин, оксид фениларсина (81дта). В1е^а1б и ВиГ, Сгос. N311. Асаб. 8сг И8А 98: 7742-7747, 2001; Акатеб и ВиГ, 1. Вю1, Скет. 279: 23038-23044, 2004; 8еутзку и др., 1. Се11 Вю1. 133: 293-304, 1996; ВиГ и др., Вюскет. 1. 278: 729-733, 1991; Мотззеу и др., ТкготЬ. Вез. 52:247-61, 1988; ОогПеШпег и др., Мо1. Вю1. Се11 15: 4416-4425, 2004; и ОогПеШпег и ВиГ, В1ооб 102: 3998-4005, 2003. Бацитрацин был заново очищен путем гель-фильтрации и проверен на отсутствие разрушения ΡΌΙ. Антитела кролика анти-ΡΑВ2 были получены против связанного с гемоцианином лимфы улитки (КЬН) пептида ТИ^ТМ^^С^/СКУПСТ®! 1УТССС (8 ЕС) ΙΌ ΝΘ:5). Растворимые мутантные ТЕ экспрессировали в Е. Сой, как описано в 81опе и др., Вюскет. 1. 310: 605-614, 1995.
В добавление к описаниям в научной литературе, приведенным выше, указанные 5С9 и 10Н10 антитела также подробно описаны в патентах США 5223427 и 6001978. Гибридомы, продуцирующие эти два антитела, были депонированы согласно требованиям Будапештской конвенции в АТСС 27 марта 1987 и им были предписаны номера доступа НВ9382 и НВ9383, соответственно.
Культивирование клеток
Клетки НИУЕС растили и трансдуцировали, как описано. Акатеб и ВиГ, 1. Вю1. Скет. 279: 2303823044, 2004. Стандартное культивирование кератиноцитов человека НаСаТ проводили в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ОМЕМ), 10% эмбриональной бычей сыворотки (ЕВ8), 2 мМ глутамин. Для культур клеток с низким Са2+ клетки помещали в среду для выращивания кератиноцитов кегайпосу!е-8ЕМ (^йгодеп), с 10% ЕВ8, обедненным кальцием, на 48 ч и переключали путем добавления 2 мМ Са2+ в течение 24 ч с добавлением или без циклогексимида (50 цМ). Для нокдауна малыми интерферирующими РНК, клетки НаСаТ при 40% конфлуентности ежедневно трансфецировали 100 нМ малых интерферирующих РНК (8ап1а Сгих Вю1ескпо1оду) с применением 2 мкл Е1роГес1атш 2000 (С1Ьсо).
- 45 014900
Функциональные тесты и тесты на передачу сигнала
Для экспериментов с передачей сигнала культуры клеток уравновешивали в бессывороточных условиях в течение 5 ч в М199, 2 мМ глутамин, 10 мМ НЕРЕЗ, 1,5 мМ Са2+ (НИУЕС) или в течение 24 ч (МЭА-МВ231) или 10-20 мин (НаСаТ) в БМЕМ. 2 мМ глутамин, 10 мМ НЕРЕЗ. Ингибиторы добавляли за 10 мин до стимуляции: анти-ТЕ (50 мкг/мл), антитела кролика анти-РАВ2 (100 мкг/мл), анти-ТЕ (АТАР2, 20 мкг/мл, ^ЕЭЕ15, 40 мкг/мл), бацитрацин (3 мМ). Обычно добавляли гирудин (200 нМ), чтобы исключить тромбиновую передачу сигнала. Фосфорилирование МАР киназы через 10 мин и индукцию гена через 90 мин после стимуляции агонистом оценивали количественно с помощью вестернблоттинга или ПЦР в реальном времени. АНатей и др., В1оой 105: 2384-2391, 2005.
Мечение клеточной поверхности, иммунопреципитация, конфокальная визуализация
Клетки отмывали и метили в буферном растворе НЕРЕЗ с 1,5 мМ хлоридом кальция либо с 100 мкМ МРВ, либо с 0,5 мг/мл ЖНЗ биотина при 4°С в течение 20 мин. После гашения (1 мМ восстановленного глутатиона для МРВ, Тпз для ЖНЗ) иммунопреципитации из лизатов 50 мМ п-октил-β-Όглюкопиранозидом использовали МАТ, непосредственно сшитые с гранулами ЭупаЬеайз, для вестернблоттинга с анти-ТЕ, анти-РЭ1 ВЬ90 антителами козы, или конъюгированную со стрептавидином пероксидазу хрена для обнаружения биотина. Блоты оцифровывали для денситометрии с применением программного обеспечения N14 1таде Зсюп. Клетки окрашивали на льду непосредственно конъюгированными антителами для конфокальной микроскопии, применяя микроскоп №коп ТЕ2000-И. Оптические срезы для каждого флюорофора совмещали в программе АйоЬе РНоЮзНор.
Эксперимент на рост опухоли
2х 106 МЭА-МВ231т!р клеток или 0,5х 106 М24те! клеток смешивали с 1 мг МАТ-10Н10, МАТ-569 или изотипически сходного 1д61 (Т1В115) в 100 мкл ФБР и инъецировали подкожно в 6-недельных самок С.В-17 ЗСГО мышей (Тасошс). .Геззаш и др., Ргос. ЖаЙ. Асай. Зсг и. З. А 101: 13756-13761, 2004; Мие11ег и др., Ргос. ЖаЙ. Асай Зсг ИЗА 89: 11832-11836, 1992. Объемы опухолей измеряли с помощью кронциркуля и определяли вес опухолей при умерщвлении мышей. Дисперсионный анализ использовали для установления разницы между группами и доверительные уровни определяли по непараметрическому критерию Крускала-Уоллиса.
Если области значений применяются в данной заявке для физических свойств, таких как молекулярный вес, или химических свойств, таких как химические формулы, все комбинации и субкомбинации областей значений и конкретных вариантов реализации в этом отношении считаются включенными в данную заявку.
Все публикации, последовательности, патенты и заявки на патент, цитированные в данном описании изобретения, полностью включены в данную заявку посредством ссылки во всех отношениях, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была конкретно и индивидуально отмечена, как включенная посредством ссылки во всех отношениях.
Хотя вышеизложенное изобретение было описано в деталях путем иллюстрирования и приведения примеров, с целью улучшения понимания, для среднего специалиста в данной области должно быть очевидно в свете настоящего изобретения, что возможны некоторые изменения и модификации, не выходящие за пределы сущности и объема прилагаемой формулы изобретения.
Claims (25)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ ингибирования или подавления передачи сигнала через тканевый фактор/фактор У11а (ТЕ/У11а) с участием активируемого протеиназами рецептора 2 (РАВ2) у субъекта, относящегося к млекопитающим, включающий введение ингибитора передачи сигнала через тканевый фактор субъекту, относящемуся к млекопитающим, при этом ингибитор не нарушает гемостаз у указанного субъекта.
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный субъект страдает связанным с ангиогенезом заболеванием, неопластическим заболеванием или воспалением.
- 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный ингибитор не предотвращает активацию свертывания.
- 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что передача сигнала через ТЕ/У11а зависит от белка дисульфидизомеразы (РЭ1).
- 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что передача сигнала через ТЕ/У11а происходит через активируемый протеазами рецептор 2 (РАВ2).
- 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный ингибитор представляет собой антитело или низкомолекулярное соединение.
- 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный ингибитор представляет собой антитело или антигенсвязывающую молекулу, обладающую специфичностью связывания, как у моноклонального антитела 10Н10, продуцируемого гибридомой с номером доступа АТСС НВ9383.
- 8. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный ингибитор представляет собой моноклональное антитело 10Н10, продуцируемое гибридомой с номером доступа АТСС НВ9383.
- 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный ингибитор ингибирует связывание тканевого- 46 014900 фактора моноклональным антителом 10Н10, продуцируемым гибридомой с номером доступа АТСС НВ9383.
- 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный ингибитор не ингибирует связывание с тканевым фактором моноклонального антитела 5С9, продуцируемого гибридомой с номером доступа АТСС НВ9382.
- 11. Способ лечения или снижения выраженности симптомов заболевания, которое зависит от передачи сигнала через тканевый фактор/фактор У11а (ТЕ/У11а) с участием активируемого протеиназами рецептора 2 (РАП2), у субъекта, относящегося к млекопитающим, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения, ингибирующего передачу сигнала через ТЕ/УПа, но не нарушающего опосредуемую тканевым фактором гомеостатическую активность.
- 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой неопластическое заболевание, заболевание, связанное с ангиогенезом, или воспаление.
- 13. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой опухоль груди или меланому.
- 14. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанная гомеостатическая активность представляет собой опосредуемое ТЕ свертывание крови.
- 15. Способ по п.11, отличающийся тем, что передача сигнала через ТЕ/УПа зависит от белка дисульфидизомеразы.
- 16. Способ по п.11, отличающийся тем, что передача сигнала через ТЕ/УПа происходит через активируемый протеазами рецептор 2 (РАП2).
- 17. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанное соединение представляет собой антитело или низкомолекулярное соединение.
- 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанное соединение представляет собой антитело или антигенсвязывающую молекулу, обладающую специфичностью связывания, как у моноклонального антитела 10Н10, продуцируемого гибридомой с номером доступа АТСС НВ9383.
- 19. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанное соединение представляет собой моноклональное антитело 10Н10, продуцируемое гибридомой с номером доступа АТСС НВ9383.
- 20. Способ идентификации агента, ингибирующего передачу сигнала через ТЕ/УПа с участием активируемого протеиназами рецептора 2 (РАП2), но не блокирующего свертывание крови, включающий измерение в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения связывания (ί) антитела или антигенсвязывающей молекулы, обладающей специфичностью связывания, как у моноклонального антитела 10Н10, продуцируемого гибридомой с номером доступа АТСС НВ9383, с (ίί) полипептидом тканевого фактора; и определение ингибирования указанного связывания в присутствии тестируемого соединения относительно связывания в отсутствие тестируемого соединения, что и позволяет идентифицировать указанный агент.
- 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанное антитело или антигенсвязывающая молекула представляет собой моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой с номером доступа АТСС НВ9383.
- 22. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанное тестируемое соединение представляет собой низкомолекулярное органическое соединение.
- 23. Способ по п.20, включающий дополнительно определение ингибиторного действия идентифицированного агента на передачу сигнала через тканевый фактор.
- 24. Способ по п.20, включающий дополнительно определение отсутствия действия идентифицированного агента на опосредуемое тканевым фактором свертывание.
- 25. Способ по п.20, включающий дополнительно (ί) осуществление контакта, в присутствии и в отсутствие идентифицированного агента, полипептида тканевого фактора с моноклональным антителом 5С9, продуцируемым гибридомой с номером доступа АТСС НВ9382, и (ίί) определение отсутствия ингибирования указанным агентом связывания указанного антитела с тканевым фактором.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US73414905P | 2005-11-07 | 2005-11-07 | |
PCT/US2006/043313 WO2007056352A2 (en) | 2005-11-07 | 2006-11-06 | Compositions and methods for controlling tissue factor signaling specificity |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200801276A1 EA200801276A1 (ru) | 2009-08-28 |
EA014900B1 true EA014900B1 (ru) | 2011-02-28 |
Family
ID=38023919
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200801276A EA014900B1 (ru) | 2005-11-07 | 2006-11-06 | Композиции и способы контроля специфичности передачи сигналов, опосредуемой тканевым фактором |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100028358A1 (ru) |
EP (1) | EP1945261A4 (ru) |
JP (1) | JP5191392B2 (ru) |
CN (1) | CN101500592A (ru) |
AU (1) | AU2006311661B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0618338A2 (ru) |
CA (1) | CA2628238A1 (ru) |
EA (1) | EA014900B1 (ru) |
IL (1) | IL191321A (ru) |
NZ (1) | NZ568762A (ru) |
UA (1) | UA94922C2 (ru) |
WO (1) | WO2007056352A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200804082B (ru) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UA109633C2 (uk) * | 2008-12-09 | 2015-09-25 | Антитіло людини проти тканинного фактора | |
NZ604718A (en) | 2010-06-15 | 2015-01-30 | Genmab As | Human antibody drug conjugates against tissue factor |
US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
WO2012033518A1 (en) * | 2010-09-09 | 2012-03-15 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions for treating metabolic disorders |
US8722044B2 (en) * | 2011-03-15 | 2014-05-13 | Janssen Biotech, Inc. | Human tissue factor antibody and uses thereof |
WO2012139069A2 (en) * | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Neotope Biosciences Limited | Compositions and methods for treating diseases of protein aggregation involving ic3b deposition |
US10140146B2 (en) * | 2015-10-22 | 2018-11-27 | Genband Us Llc | Network management for elastic virtual network functions |
CN106938051B (zh) * | 2016-08-22 | 2019-10-11 | 复旦大学 | 靶向于组织因子的抗体-药物偶联物 |
EP3502141A4 (en) * | 2016-08-22 | 2020-04-08 | Fudan University | TISSUE FACTOR TARGET ANTIBODIES, PREPARATION METHOD AND USE THEREOF |
WO2019136309A1 (en) * | 2018-01-04 | 2019-07-11 | Iconic Therapeutics, Inc. | Anti-tissue factor antibodies, antibody-drug conjugates, and related methods |
CN112574286A (zh) * | 2020-01-02 | 2021-03-30 | 东莞市东阳光生物药研发有限公司 | 多肽及其应用 |
AU2021304359A1 (en) * | 2020-07-10 | 2023-03-02 | Iconic Therapeutics Llc | Inflammatory disease treatment using anti-tissue factor antibodies |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5223427A (en) * | 1987-03-31 | 1993-06-29 | The Scripps Research Institute | Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain |
WO1994005328A1 (en) * | 1992-08-28 | 1994-03-17 | The Scripps Research Institute | Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function |
WO1999003498A1 (en) * | 1997-07-18 | 1999-01-28 | Novo Nordisk A/S | USE OF FVIIa OR FVIIai FOR THE TREATMENT OF ADVERSE CONDITIONS RELATED TO THE FVIIa MEDIATED INTRACELLULAR SIGNALLING PATHWAY |
US20020193302A1 (en) * | 1999-07-14 | 2002-12-19 | Mirella Ezban | Use of FVIIa or a tissue factor antagonist for regulating gene expression and cell migration or chemotaxis |
Family Cites Families (115)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
US3939350A (en) | 1974-04-29 | 1976-02-17 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation |
US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
US4277437A (en) | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
US4444887A (en) | 1979-12-10 | 1984-04-24 | Sloan-Kettering Institute | Process for making human antibody producing B-lymphocytes |
US4391904A (en) | 1979-12-26 | 1983-07-05 | Syva Company | Test strip kits in immunoassays and compositions therein |
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
NO812612L (no) | 1980-08-06 | 1982-02-08 | Ferring Pharma Ltd | Enzym-inhibitorer. |
US4366241A (en) | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
US4517288A (en) | 1981-01-23 | 1985-05-14 | American Hospital Supply Corp. | Solid phase system for ligand assay |
US4714681A (en) | 1981-07-01 | 1987-12-22 | The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center | Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same |
US4474893A (en) | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
US4716111A (en) | 1982-08-11 | 1987-12-29 | Trustees Of Boston University | Process for producing human antibodies |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
US5506337A (en) | 1985-03-15 | 1996-04-09 | Antivirals Inc. | Morpholino-subunit combinatorial library and method |
EP0232262A4 (en) | 1985-08-15 | 1989-09-19 | Stauffer Chemical Co | MICROORGANISM PRODUCING TRYPTOPHANE. |
CA1291031C (en) | 1985-12-23 | 1991-10-22 | Nikolaas C.J. De Jaeger | Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
DE3883899T3 (de) | 1987-03-18 | 1999-04-22 | Sb2, Inc., Danville, Calif. | Geänderte antikörper. |
US6001978A (en) | 1987-03-31 | 1999-12-14 | The Scripps Research Institute | Human tissue factor related DNA segments polypeptides and antibodies |
US5258498A (en) | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
US5336603A (en) | 1987-10-02 | 1994-08-09 | Genentech, Inc. | CD4 adheson variants |
US5010175A (en) | 1988-05-02 | 1991-04-23 | The Regents Of The University Of California | General method for producing and selecting peptides with specific properties |
WO1989012624A2 (en) | 1988-06-14 | 1989-12-28 | Cetus Corporation | Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom |
US4925648A (en) | 1988-07-29 | 1990-05-15 | Immunomedics, Inc. | Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions |
US5601819A (en) | 1988-08-11 | 1997-02-11 | The General Hospital Corporation | Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
EP0768377A1 (en) | 1988-09-02 | 1997-04-16 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of recombinant varied binding proteins |
KR900005995A (ko) | 1988-10-31 | 1990-05-07 | 우메모또 요시마사 | 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법 |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
EP0394827A1 (en) | 1989-04-26 | 1990-10-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides |
IE63847B1 (en) | 1989-05-05 | 1995-06-14 | Res Dev Foundation | A novel antibody delivery system for biological response modifiers |
WO1991000360A1 (en) | 1989-06-29 | 1991-01-10 | Medarex, Inc. | Bispecific reagents for aids therapy |
US5112946A (en) | 1989-07-06 | 1992-05-12 | Repligen Corporation | Modified pf4 compositions and methods of use |
WO1991006570A1 (en) | 1989-10-25 | 1991-05-16 | The University Of Melbourne | HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES |
GB8928874D0 (en) | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
AU7247191A (en) | 1990-01-11 | 1991-08-05 | Molecular Affinities Corporation | Production of antibodies using gene libraries |
US5780225A (en) | 1990-01-12 | 1998-07-14 | Stratagene | Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules |
EP0463151B1 (en) | 1990-01-12 | 1996-06-12 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US5314995A (en) | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
EP0521985B1 (en) | 1990-03-20 | 1997-09-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region |
US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
US5349053A (en) | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
IE66205B1 (en) | 1990-06-14 | 1995-12-13 | Paul A Bartlett | Polypeptide analogs |
DK0835939T3 (da) | 1990-06-28 | 2006-03-13 | Sanofi Aventis Deutschland | Fusionsproteiner med andele af immunglobulin, deres fremstilling og anvendelse |
US5650489A (en) | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US5814318A (en) | 1990-08-29 | 1998-09-29 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5698426A (en) | 1990-09-28 | 1997-12-16 | Ixsys, Incorporated | Surface expression libraries of heteromeric receptors |
AU8869291A (en) | 1990-10-04 | 1992-04-28 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation, The | Primate erythrocyte bound monoclonal antibody heteropolymers |
JP3583420B2 (ja) | 1990-10-05 | 2004-11-04 | メダレツクス・インコーポレーテツド | 二特異的試薬を用いた標的免疫化 |
EP0557300B1 (en) | 1990-10-29 | 1997-11-19 | Chiron Corporation | Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof |
AU660297B2 (en) | 1990-11-09 | 1995-06-22 | Stephen D. Gillies | Cytokine immunoconjugates |
ES2113940T3 (es) | 1990-12-03 | 1998-05-16 | Genentech Inc | Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas. |
EP0517895B1 (en) | 1990-12-14 | 1996-11-20 | Cell Genesys, Inc. | Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways |
CA2108147C (en) | 1991-04-10 | 2009-01-06 | Angray Kang | Heterodimeric receptor libraries using phagemids |
CA2108451A1 (en) | 1991-04-26 | 1992-10-27 | Beverley J. Randle | Novel antibodies, and methods for their use |
EP0519596B1 (en) | 1991-05-17 | 2005-02-23 | Merck & Co. Inc. | A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
EP0590067A1 (en) | 1991-06-14 | 1994-04-06 | Xoma Corporation | Microbially-produced antibody fragments and their conjugates |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
ATE463573T1 (de) | 1991-12-02 | 2010-04-15 | Medimmune Ltd | Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken |
US5622929A (en) | 1992-01-23 | 1997-04-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Thioether conjugates |
US5877289A (en) * | 1992-03-05 | 1999-03-02 | The Scripps Research Institute | Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature |
CA2131528C (en) | 1992-03-05 | 2004-07-13 | Philip E. Thorpe | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
US5733743A (en) | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
US5573905A (en) | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
US5447851B1 (en) | 1992-04-02 | 1999-07-06 | Univ Texas System Board Of | Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells |
ZA932522B (en) | 1992-04-10 | 1993-12-20 | Res Dev Foundation | Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens |
CA2141602A1 (en) | 1992-08-26 | 1994-03-03 | Philip Leder | Use of the cytokine ip-10 as an anti-tumor agent |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
US5288514A (en) | 1992-09-14 | 1994-02-22 | The Regents Of The University Of California | Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support |
GB9223377D0 (en) | 1992-11-04 | 1992-12-23 | Medarex Inc | Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes |
EP0733070A1 (en) | 1993-12-08 | 1996-09-25 | Genzyme Corporation | Process for generating specific antibodies |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
SE9400088D0 (sv) | 1994-01-14 | 1994-01-14 | Kabi Pharmacia Ab | Bacterial receptor structures |
ES2247204T3 (es) | 1994-01-31 | 2006-03-01 | Trustees Of Boston University | Bancos de anticuerpos policlonales. |
US5593853A (en) | 1994-02-09 | 1997-01-14 | Martek Corporation | Generation and screening of synthetic drug libraries |
US5539083A (en) | 1994-02-23 | 1996-07-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis |
CA2183535A1 (en) | 1994-02-28 | 1995-08-31 | Ronald P. Taylor | Antigen-based heteropolymers and method for treating autoimmune diseases using the same |
US5516637A (en) | 1994-06-10 | 1996-05-14 | Dade International Inc. | Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage |
US5525735A (en) | 1994-06-22 | 1996-06-11 | Affymax Technologies Nv | Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds |
US5549974A (en) | 1994-06-23 | 1996-08-27 | Affymax Technologies Nv | Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof |
NZ292124A (en) | 1994-07-29 | 1998-10-28 | Smithkline Beecham Plc | Il-4 antagonist comprising a fusion of a mutant il-4-antibody fragment |
GB9416721D0 (en) | 1994-08-18 | 1994-10-12 | Short Brothers Plc | A bias yarn assembly forming device |
EP1978033A3 (en) | 1995-04-27 | 2008-12-24 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
AU2466895A (en) | 1995-04-28 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5804162A (en) | 1995-06-07 | 1998-09-08 | Alliance Pharmaceutical Corp. | Gas emulsions stabilized with fluorinated ethers having low Ostwald coefficients |
US5811097A (en) | 1995-07-25 | 1998-09-22 | The Regents Of The University Of California | Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling |
US5569588A (en) | 1995-08-09 | 1996-10-29 | The Regents Of The University Of California | Methods for drug screening |
EP0859841B1 (en) | 1995-08-18 | 2002-06-19 | MorphoSys AG | Protein/(poly)peptide libraries |
JP2978435B2 (ja) | 1996-01-24 | 1999-11-15 | チッソ株式会社 | アクリロキシプロピルシランの製造方法 |
US5916771A (en) | 1996-10-11 | 1999-06-29 | Abgenix, Inc. | Production of a multimeric protein by cell fusion method |
EP1500329B1 (en) | 1996-12-03 | 2012-03-21 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies that specifically bind human TNF alpha |
EP0970126B1 (en) | 1997-04-14 | 2001-04-18 | Micromet AG | Novel method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof |
US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
US6365617B1 (en) * | 1999-06-29 | 2002-04-02 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Indole and indazole urea-peptoids as thrombin receptor antagonists |
AU2593901A (en) | 1999-12-23 | 2001-07-03 | Elusys Therapeutics, Inc. | Therapeutic use of particles displaying pathogen-specific binding moieties |
US6630584B1 (en) | 2000-03-16 | 2003-10-07 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Single chain antibody against mutant p53 |
CA2405961A1 (en) | 2000-04-26 | 2001-11-01 | Elusys Therapeutics, Inc. | Bispecific molecules and uses thereof |
US7405276B2 (en) | 2000-11-01 | 2008-07-29 | Elusys Therapeutics, Inc. | Method of producing bispecific molecules by protein trans-splicing |
JP2004532626A (ja) | 2001-03-15 | 2004-10-28 | エリューシス セラピューティクス,インコーポレーテッド | 二重特異性分子のポリクローナル集団、ならびにそれらの産生方法および使用 |
JP2005504741A (ja) | 2001-07-17 | 2005-02-17 | ユニバーシティー オブ ヴァージニア パテント ファウンデーション | 改良されたヘテロポリマー複合体およびそれらの使用法 |
US20050008625A1 (en) | 2003-02-13 | 2005-01-13 | Kalobios, Inc. | Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement |
IT1395574B1 (it) | 2009-09-14 | 2012-10-16 | Guala Dispensing Spa | Dispositivo di erogazione |
JO3421B1 (ar) | 2011-06-20 | 2019-10-20 | H Lundbeck As | طريقة لإعطاء 1-((1ار.3س)-6-كلورو-3-فينيل-اندان-1-ايل)-1.2.2-ترايميثيل- بيبيرازين واملاجها لمعالجة انفصام الشخصية |
-
2006
- 2006-11-06 EA EA200801276A patent/EA014900B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-11-06 US US12/084,225 patent/US20100028358A1/en not_active Abandoned
- 2006-11-06 CN CNA2006800416063A patent/CN101500592A/zh active Pending
- 2006-11-06 CA CA002628238A patent/CA2628238A1/en not_active Abandoned
- 2006-11-06 UA UAA200807780A patent/UA94922C2/ru unknown
- 2006-11-06 JP JP2008539118A patent/JP5191392B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-06 ZA ZA200804082A patent/ZA200804082B/xx unknown
- 2006-11-06 WO PCT/US2006/043313 patent/WO2007056352A2/en active Application Filing
- 2006-11-06 AU AU2006311661A patent/AU2006311661B2/en not_active Ceased
- 2006-11-06 BR BRPI0618338-7A patent/BRPI0618338A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-11-06 EP EP20060837046 patent/EP1945261A4/en not_active Withdrawn
- 2006-11-06 NZ NZ568762A patent/NZ568762A/en not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-05-07 IL IL191321A patent/IL191321A/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5223427A (en) * | 1987-03-31 | 1993-06-29 | The Scripps Research Institute | Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain |
WO1994005328A1 (en) * | 1992-08-28 | 1994-03-17 | The Scripps Research Institute | Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function |
WO1999003498A1 (en) * | 1997-07-18 | 1999-01-28 | Novo Nordisk A/S | USE OF FVIIa OR FVIIai FOR THE TREATMENT OF ADVERSE CONDITIONS RELATED TO THE FVIIa MEDIATED INTRACELLULAR SIGNALLING PATHWAY |
US20020193302A1 (en) * | 1999-07-14 | 2002-12-19 | Mirella Ezban | Use of FVIIa or a tissue factor antagonist for regulating gene expression and cell migration or chemotaxis |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2006311661A1 (en) | 2007-05-18 |
BRPI0618338A2 (pt) | 2011-08-23 |
WO2007056352A2 (en) | 2007-05-18 |
CA2628238A1 (en) | 2007-05-18 |
WO2007056352A3 (en) | 2009-04-30 |
IL191321A (en) | 2012-05-31 |
JP2009514895A (ja) | 2009-04-09 |
EP1945261A2 (en) | 2008-07-23 |
EA200801276A1 (ru) | 2009-08-28 |
UA94922C2 (ru) | 2011-06-25 |
ZA200804082B (en) | 2010-02-24 |
AU2006311661B2 (en) | 2011-05-26 |
JP5191392B2 (ja) | 2013-05-08 |
CN101500592A (zh) | 2009-08-05 |
NZ568762A (en) | 2011-11-25 |
US20100028358A1 (en) | 2010-02-04 |
EP1945261A4 (en) | 2010-05-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA014900B1 (ru) | Композиции и способы контроля специфичности передачи сигналов, опосредуемой тканевым фактором | |
Liu et al. | Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system | |
US7728115B2 (en) | Compositions and methods useful for the diagnosis and treatment of heparin induced thrombocytopenia/thrombosis | |
EA024585B1 (ru) | Композиции, одновалентные в отношении связывания cd28, и способы их применения | |
US20110081292A1 (en) | Methods Of Treating Viral Hepatitis | |
KR20080113262A (ko) | Gm-csf 수용체에 대한 결합 성분 | |
EP2888283A1 (en) | Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis | |
KR20070047246A (ko) | 유로키나아제형 플라스미노겐 활성인자(uPA)와 그의수용체(uPAR)의 복합체에 결합하여 하류 uPAR상호작용을 억제하는 리간드의 동정 및 진단 또는치료에서의 용도 | |
JP4660189B2 (ja) | 抗血小板自己抗体およびそのインヒビターに関連する組成物、方法およびキット | |
WO2003047623A1 (en) | Treatment of prostate cancer by inhibitors of ncam2 | |
AU2008335245A1 (en) | Modulators of neuronal regeneration | |
PT1985634E (pt) | Anticorpo que se liga ao ligando 1 glicoproteico da pseletina (psgl-1) para utilização no tratamento de doença alérgica | |
EP1895017A2 (en) | Use of A33 antigens and JAM-IT | |
PL204449B1 (pl) | DNA kodujący glikoproteinę VI | |
JP2002537357A (ja) | 受容体脱感作に関連する症状を治療するための生産物及び方法 | |
JP2010506930A (ja) | Tlr14の活性を変調するための組成物および方法 | |
US20050175609A1 (en) | Placental growth factor as a target for the treatment of osteoporosis | |
US20050214219A1 (en) | 24p3 receptors and uses thereof | |
US20080014586A1 (en) | Identification of a receptor controlling migration and metastasis of skin cancer cells | |
EP2420250A1 (en) | Anti-Syndecan-4 antibodies | |
WO2001004159A1 (en) | Compositions and methods useful for the diagnosis and treatment of heparin induced thrombocytopenia/thrombosis | |
US5773293A (en) | Anti-ICAM-4 antibodies and hybridomas | |
US7306797B2 (en) | Use of a compound antagonist of ESM-1 protein for producing a medicine for treating cancer | |
Reddel et al. | 20 The Anti-Phospholipid Syndrome | |
JP5041464B2 (ja) | サイトカイン媒介疾患の治療方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |