JP4381140B2 - 免疫応答を調節するための二重特異性抗体の使用 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、哺乳動物免疫系の細胞の、活性、発達、分化、増殖速度、および遊走を制御するための方法に関する。特に、本発明は、二重特異性抗体を用いて、阻害性レセプターを活性化レセプターと架橋するための方法に関する。この架橋は、活性化レセプターの阻害をもたらす。

（発明の背景）
免疫系は、細菌、ウイルスおよび外来多細胞生物、ならびに癌細胞と戦うために用いられる。免疫応答は、骨髄、脾臓、および他の組織の細胞によって提供される。あいにく、免疫系の不適切な調節は、多数の障害または病理学的状態をもたらし得る。これらの障害または状態としては、慢性炎症、自己免疫疾患、および外来粒子または外来組織に対する望ましくないアレルギー反応が挙げられる。

免疫系の細胞は、レセプターとして役立つ、多くの型の膜結合型タンパク質を保有する。これらのレセプターに対するリガンドは、低分子、タンパク質（例えば、サイトカインもしくはケモカイン）、または別個の細胞上に存在する膜結合型タンパク質であり得る。そのリガンドによるレセプターの占拠、可溶性抗体によるレセプターの結合、同様のレセプターの互いの架橋、および似ていないレセプターの互いの架橋は、細胞活性の変化をもたらし得る。これらの事象のうちのいくつかは、「細胞活性化」をもたらし、一方、他の事象は、「細胞阻害」をもたらす。

免疫細胞およびそれらの活性化もしくは阻害の研究は、以下に関連してきた：原形質膜に対する酵素の補充；細胞膜における「脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ）」に対する酵素の補充（ＹａｎｇおよびＲｅｉｎｈｅｒｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６６，１８７７５（２００１））、および原形質膜に対する膜結合型レセプターの補充。脂質ラフトは、原形質膜のうちの、脂質分子の流動性が低下した領域である。細胞の活性化または阻害はまた、以下に関連する：レセプターのリン酸化状態における変化；細胞の増殖状態における変化；カルシウム流；遺伝的発現における変化；分泌もしくは脱顆粒における変化；細胞の分化；細胞の増殖速度における変化；細胞遊走における変化；および走化性における変化。細胞活性化はまた、Ｔ細胞アネルギーの逆転を包含し得る（例えば、Ｌｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１９９１４（１９９８）；ならびにＳｕｎｄｅｒ−ＰｌａｓｓｍａｎおよびＲｅｉｎｈｅｒｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２４２４９（１９９８）を参照のこと）。

上記の変化のうちのいずれかをもたらすシグナル伝達事象が、活性化性であるかまたは阻害性であるかについての問題は、個々の基礎に基づいて決定され得る。例えば、未同定のレセプターの占拠が、サイトカインｍＲＮＡの遺伝的発現、炎症性サイトカインの分泌（または脱顆粒）、放出、食作用活性もしくは溶解活性の増大をもたらすならば、この未同定のレセプターは、活性化レセプターと命名され得る。同様に、未同定のレセプターの占拠が既知の活性化レセプターに依存する活性を阻害するならば、その未同定のレセプターは、阻害性レセプターと命名され得る。

レセプターが活性化性であるかまたは阻害性であるかの決定は、このレセプターのポリペプチド配列によって予測され得、ここで、このレセプターはタンパク質である。以下の２つの異なるモチーフに対して注目が集まった：ＩＴＩＭおよびＩＴＡＭ。ＩＴＩＭは、免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフを表し、一方、ＩＴＡＭは、免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフを表す。このレセプターの細胞質ゾル領域中の１以上のＩＴＩＭモチーフを保有する多数のポリペプチドレセプターが、阻害性であることが見出されており、一方、細胞質ゾル領域中に１以上のＩＴＡＭ配列を保有する多数のポリペプチドレセプターは、活性化性であることが見出されている。

阻害性レセプターと活性化レセプターとの架橋は、この活性化レセプターの阻害をもたらし得る。伝統的には、架橋は、３つの成分の使用を含み、ここで、これらの成分は、培養細胞（例えば、培養されるＴ細胞または肥満細胞）を含むインキュベーション培地中に添加される。一般に、これらの成分のうちの２つは、抗体であり、ここで各抗体は、その細胞表面の異なる抗原を認識する。第３の成分はしばしば、２つの第１抗体の定常領域を認識する、第３の独立した抗体である。

多成分架橋系は、培養細胞を用いて調査実験を実施する際に、効率的かつ制御された研究を可能にする。しかし、多成分架橋系は、薬学的介入についても薬物治療についても実用的方法ではない。１つの欠点は、三成分系を用いた架橋が、４つの異なる結合反応を必要とすることである。第２の欠点は、レセプターを架橋するために３つの抗体を使用することが、治療的に実現可能でないことである。

本発明は、１つの二重特異性抗体を提供することによって、これらの課題に取り組み、この二重特異性抗体は、免疫系の細胞上の活性化レセプターおよび阻害性レセプターに結合し得、そして生理学的に影響を与え得る。

（発明の要旨）
本発明は、二重特異性抗体を用いて細胞活性または活性化レセプター活性を低減するための方法を提供し、ここで、この二重特異性抗体は、以下に結合する：（ａ）活性化レセプター；および（ｂ）阻害性レセプター。さらなる実施形態では、この阻害性レセプターは、ＩＴＩＭモチーフを含み、そして以下からなる群より選択され得る：ＦｃγＲＩＩＢ、ＬＡＩＲ−１、ＫＩＲ、ＯＸ２Ｒ、ＯＸ２Ｒａ、ＤＳＰ−１、ＣＤ５、ＭＡＦＡ、ＣＴＬＡ−４、ＨＭ１８、Ｌｙ４９、およびｇｐ４９Ｂ１。別の実施形態では、この活性化レセプターは、ＩＴＡＭモチーフを含み、そして以下からなる群より選択され得る：ＦｃεＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、Ｔ細胞レセプター、ＴＲＥＭ−１、ＴＲＥＭ−２、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ２、およびＤＡＰ−１２。別の実施形態では、この活性化レセプターは、ＦｃεＲＩであり、そしてこの阻害性レセプターは、ＯＸ２Ｒａである。

本発明は、この二重特異性抗体が、二重特異性抗体に共有結合によって取り込まれた化学的連結剤を含むことを意図する。別の実施形態では、この二重特異性抗体は、単一ポリペプチド鎖抗体であるかまたはヒト化されている。

さらなる実施形態では、この二重特異性抗体は、阻害性レセプターまたは活性化レセプターの発現を刺激する因子とともに投与される。この因子は、顆粒球コロニー刺激因子およびインターフェロン−γからなる群より選択される。この二重特異性抗体が、抗炎症剤、化学療法剤、免疫抑制剤、および抗マラリア剤からなる群より選択される治療剤とともに投与されることもまた意図される。さらなる実施形態では、この抗炎症剤は、コルチコステロイド、グルココルチコイド、可溶性腫瘍壊死因子レセプター、および腫瘍壊死因子に対する抗体からなる群より選択される。なお別の実施形態では、この化学療法剤は、メトトレキサート、ビンクリスチン、およびシクロホスファミドからなる群より選択される。

本発明は、受容可能なキャリアとともに請求項１に記載の二重特異性抗体を含む、組成物を提供する。別の実施形態では、この二重特異性抗体は、インビボにおいて、または培養細胞に対して投与される。

本発明は、１区画内のこの二重特異性抗体；および使用説明書を備えるキットを提供する。

（詳細な説明）
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で用いられる場合、用語の単数形（例えば、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、それらの対応する複数形の言及を包含する。

（定義）
「抗体」または「抗体分子」は一般に、２つの重鎖および２つの軽鎖からなり、ここで、通常、各軽鎖は、ジスルフィド結合によって重鎖に連結しており、そしてここで通常、２つの重鎖は、ジスルフィド結合によって一緒に連結されている（Ｂｒｏｄｙ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７，２４７（１９９７））。軽鎖は、κまたはλのいずれかと分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεと分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定する。軽鎖内および重鎖内では、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、この重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む（Ａｂｂａｓら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａ．（２０００），４１−６２頁）。

「二重特異性抗体」とは、２つの異なる抗体由来のビンディング（ｖｉｎｄｉｎｇ）フラグメント、２つの異なる抗体由来のヒト化結合フラグメント、または２つの異なる抗体由来の結合フラグメントのペプチド模倣物をいう。各結合フラグメントは、異なるレセプター（例えば、阻害性レセプターおよび活性化レセプター）を認識する。二重特異性抗体は通常、２つの別個の抗原に対する特異的結合を示す。

用語「カクテル」とは、アリコートが取り出され得、次いで反応混合物または細胞インキュベーション混合物中に移され得る、溶液をいう。いくつかの場合、このカクテルは、架橋反応を開始する目的のために、異なる抗体の混合物を供給し得る。他の場合には、このカクテルは、この反応混合物に対して補助的化合物の混合物（例えば、プロテアーゼインヒビターの組み合わせ）を供給し得る。カクテルは、試薬を移すのがより迅速かつより正確に行われるのを可能にする、予め混合された試薬の組み合わせである。

「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合し得る、任意のタンパク質決定基を包含する。エピトープ決定基は通常、分子のうちの化学的に活性な表面グループ分け（例えば、アミノ酸または糖側鎖）からなり、通常、特異的三次元構造特性ならびに特異的電荷特徴を有する。

用語「レセプターの発現」とは、転写（ｍＲＮＡ合成）の速度、翻訳（ポリペプチド合成）の速度、細胞内区画から細胞外区画へのレセプターポリペプチドの移動速度、または［細胞外］／［細胞内＋細胞外］区画において生じるレセプターポリペプチドの比を言及し得る。

用語「レセプター」とは、生物学的リガンドまたはそのアナログ（例えば、ホルモン、サイトカイン、抗体、別の細胞の膜結合型タンパク質、または別の細胞の膜に結合したリガンド）と会合し得る、あるクラスのタンパク質（細胞の膜結合型タンパク質を包含する）を言及する。この膜結合型レセプターは、原形質膜に存在してもよく、または、原形質膜中に最終的に挿入されることになっている細胞内小胞上に存在してもよい。リガンドは、このレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして役立ち得る（Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．）。このリガンドとレセプターとの間の会合は、一時的であっても永続的であってもよく、そしてこれは、非共有結合的連結または共有結合的連結を包含し得る。多くのレセプターを用いて、細胞の挙動または細胞のシグナル伝達事象を制御し得る。リガンドとレセプターとの会合が細胞事象における増大を誘発する場合、このレセプターは、「活性化」レセプターと呼ばれる。リガンドとレセプターとの会合が細胞事象における減少を誘発する場合、このレセプターは、「阻害性」と呼ばれ得る。いくつかのレセプターの場合、種々のリガンドは、このレセプターの活性化または阻害のいずれかを誘発し得、ここで、このレセプターは、そのリガンドが最も頻繁に用いられる生理学的状況に依存して、「活性化性」または「阻害性」と命名され得る。タンパク質または他の高分子は、レセプターと呼ばれ得る。なぜなら、これは、天然に存在するリガンドに結合するからであるが、これは、合成リガンドまたは非生理学的リガンド（例えば、薬物または実験プローブ）にも結合するからでもある。

用語「活性化レセプター」は、リガンド結合領域および細胞質ゾルシグナル伝達領域を含む単一ポリペプチド鎖、またはリガンド結合ポリペプチドおよび細胞質ゾルシグナル伝達ポリペプチドを含むポリペプチド複合体を言及するために、最も正確に用いられる。しかし、細胞生物学または生化学の考察を容易にする目的で、複数ポリペプチド活性化レセプターのポリペプチドのうちのいずれか１つは、「活性化レセプター」と命名され得る。「阻害性レセプター」は、多数の異なる活性化レセプターに対して、すなわち、１種類の活性化レセプターに対してだけでなく、その阻害効果を発揮し得る。

レセプターは、活性化性および阻害性の両方であり得、ここで、活性化効果または阻害効果は、細胞生理機能に依存する。例えば、ＣＤ２２（ヒトおよびマウスのＢ細胞のタンパク質）は、ＩＴＡＭモチーフ（活性化モチーフ）およびＩＴＩＭモチーフ（阻害性モチーフ）の両方を含み、そしてそのＢ細胞の生理機能および環境に依存して、Ｂ細胞レセプターに対して活性化効果または阻害効果を発揮し得る（Ｇｅｒｇｅｌｙら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６８，３（１９９９）；Ｓａｔｏら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５，５５１（１９９６））。任意の所定のレセプターが阻害性であるかまたは活性化性であるかの問題は、リガンドに依存し得る（例えば、１種のマイトジェン対別の種類のマイトジェン（Ｓａｔｏら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５，５５１（１９９６））。

細胞活性化において用いられるポリペプチドレセプターが活性化ドメインを含まないが、活性化ドメインを含む第二のポリペプチドに結合する場合、以下の３つの実体の各々を「活性化レセプター」と言及することが受け入れられ得る：（１）その活性化ドメインを含まないポリペプチドレセプター；（２）その活性化ドメインを含むポリペプチド；および（３）上記の２つのポリペプチドの複合体全体。

用語「レセプター」は、薬学的因子によって標的とされ得るが、必ずしも生理学的リガンドによる標的ではない、膜結合型または膜会合型の高分子を包含するように広範に定義される。用語「レセプター」はまた、原形質膜の外表面と共有結合しているかまたは非共有結合的に会合しているが、原形質膜のリン脂質二重層に必ずしも挿入されていない、高分子を包含する。

「モチーフ」とは、ポリペプチド内のアミノ酸配列であって、この配列が、特定の特性をそのポリペプチドに与える配列をいう。

（概論）
本発明は、細胞の２つの別個のレセプターに特異的に結合し得る二重特異性抗体を提供する。免疫学の分野では、２種類のモチーフを保有する２種類のレセプターは、白血球の多数の膜結合型レセプターにおいて遭遇する。これらのレセプターおよびそれらのそれぞれのモチーフは、ＩＴＡＭおよびＩＴＩＭと呼ばれる。コンセンサスＩＴＡＭ配列は、ＹｘｘＬ／Ｉｘ_６〜８ＹｘｘＬ／Ｉであり、ここで（Ｙ）は、リン酸化されて、活性化レセプターおよび／または補助タンパク質の、シグナル伝達特性における変化をもたらし得る。このＩＴＡＭモチーフは、活性化レセプター自体内、またはこの活性化レセプターに結合し、従って、この活性化レセプターに対して活性化特性を付与する、補助タンパク質内に生じ得る。ＩＴＡＭレセプターは以下に記載される。

このＩＴＩＭモチーフは、細胞質ドメインにおけるコンセンサス配列Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＬ／Ｖによって規定され、ここで、（Ｙ）は、リン酸化されて、このこのＩＴＩＭモチーフを保有するポリペプチドが、種々の酵素を補充する能力をもたらし得、ここで、これらの酵素は、阻害シグナルを細胞に対して中継するのを補助する（Ｓａｔｈｉｓｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，１７６３（２００１））。

阻害性レセプターの例としては、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＬＡＩＲ、ＦＤＦ０３、ＫＩＲ、ｇｐ４９Ｂ、ＩＬＴ２５、ＰＩＲ−Ｂ、Ｌｙ４９、ＣＴＬＡ４、ＤＳＰ−１、ＣＤ２００Ｒａ／ＯＸＲａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ−Ｅ、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＰＩＲＩ、ＳＩＲＰα、ＨＭ１８、ＬＲＣ、ＩＬＴ、ＫＩＲ、ＬＩＲ、ＭＩＲ、およびＭＡＦＡが挙げられる（例えば、Ｌｏｎｇ（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８７５；Ｌａｎｉｅｒ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：３７１；Ｎｅｗｔｏｎ−ＮａｓｈおよびＮｅｗｍａｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６８２；Ａｚｚａｍら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５４６４；Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｌｌａｒら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２９０３；Ｓｉｎｃｌａｉｒ（１９９９）Ｓｃａｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５０：１０；Ｐａｎら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：４９５；Ｔｏｍａｓｅｌｌｏら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２１４７；Ａｒｍら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：２３４２；Ｂｏｒｇｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５１９２；Ｙｏｕｎｇら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：３９３３；Ｌａｆｏｎｔら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：７１９０；Ｕｈｒｂｅｒｇら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：３９２３；ＺｌｏｔらＷＯ ０１／３６４６３；Ｇｕｔｈｍａｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：９３９７；ならびにＢｌａｓｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６４５１を参照のこと）。

活性化レセプターとしては、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ１０、ＣＤ１６１、ＤＡＰ−１２、ＫＡＲ、ＫＡＲＡＰ、ＦｃεＲＩ、ＦｃＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、Ｔｒｅｍ−１、Ｔｒｅｍ−２、ＣＤ２８、ｐ４４、ｐ４６、Ｂ細胞レセプター、ＬＭＰ２Ａ、ＳＴＡＭ、ＳＴＡＭ−２、ＧＰＶＩおよびＣＤ４０が挙げられる（例えば、Ａｚｚｏｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３４９３；Ｋｉｔａら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６９０１；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７４：９１１５；Ｐａｎｄｅｙら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８６３３；Ｚｈｅｎｇら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６：１２９９９；Ｐｒｏｐｓｔら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２２１４を参照のこと）。

（架橋研究）
ＫＩＲ（阻害性）とＦｃεＲＩ（活性化性）との架橋。以下の研究（ＫＩＲでトランスフェクトされた肥満細胞様細胞株に関する）は、ＫＩＲ（阻害性）のＦｃεＲＩ（活性化性）に対する架橋が、細胞阻害をもたらすことを明らかにした。研究された細胞は、人工的構築物であった。ＦｃεＲＩのＦｃεＲＩに対する（それ自身に対する）架橋は、細胞活性化をもたらした。ＦｃεＲＩがＦｃεＲＩに対して（それ自体に対して）架橋され、そしてＦｃεＲＩがまたＫＩＲに架橋された混合状況は、細胞活性化の阻害をもたらした。この混合された状況は、ＫＩＲの阻害効果を実証する。以下の制御実験もまた行われた。ＦｃεＲＩがＦｃεＲＩ（それ自身に対して）結合され、そしてＫＩＲがＫＩＲに架橋された混合状況は、阻害効果をもたらさなかった（Ｂｌｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，８９８９（１９９７））。

架橋反応の詳細は以下のとおりである。第一工程では、ＦｃεＲＩは、マウスＩｇＥを添加することによってタグ化された。ここで、ＦｃεＲＩは、ＩｇＥによって結合されるようになった。第二工程では、１つのマウスＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体が、ロバ抗マウスＦ（ａｂ）’_２を用いて別のマウスＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体に架橋された。ここまで記載したシナリオは、細胞活性化のみをもたらす。

第三の実験工程では、ＫＩＲ（阻害性）が、マウスＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体に対して架橋された。ここで、ＫＩＲが、マウス抗ヒトＧＬ１８３ Ｆ（ａｂ）’_２を用いて最初にタグ化された。次いで、マウス抗ヒトＧＬ１８３ Ｆ（ａｂ）’_２／ＫＩＲ複合体が、架橋抗体（ロバ抗マウスＤＡＭ Ｆ（ａｂ）’_２）を用いてマウスＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体に対して架橋された。この第三の工程の結果は、細胞活性化の阻害であった（Ｂｌｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，８９８９（１９９７））。

ＫＩＲ（阻害性）とＣＤ２５／ＣＤ３ζ（活性化性）との架橋。ＫＩＲの架橋は、ＣＤ２５／ＣＤ３ζ依存性Ｔ細胞活性の阻害をもたらし得る（Ｂｌｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，８９８９（１９９７））。ＣＤ２５／ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζに融合された、ＣＤ２５の膜外（ｅｃｔｏｍｅｍｂｒａｎｅ）ドメインおよび膜貫通ドメインから構成される、キメラ分子である（Ｄｏｎｎａｄｉｅｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２６９，３２８２８（１９９４））。ＫＩＲとＣＤ２５／ＣＤ３ζとの架橋は、ＣＤ２５／ＣＤ３ζ媒介細胞活性化を阻害し得る。ＣＤ２５／ＣＤ３ζ単独の刺激は、カルシウム流およびセロトニン放出をもたらし得る。しかし、ＫＩＲ（阻害性レセプター）とＣＤ２５／ＣＤ３ζ（活性化レセプター）との同時架橋は、ＣＤ２５／ＣＤ３ζ媒介カルシウム流およびセロトニン放出を低減または防止し得る。架橋カクテルは、ＩｇＥ（ＣＤ２５／ＣＤ３ζを標的とする）、ＧＬ１８３（ＫＩＲを標的とする）、およびロバ抗ラットＩｇ Ｆ（ａｂ）’_２を含んでいた（Ｂｌｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，８９８９（１９９７））。

Ｇｐ４９Ｂ１（阻害性）とＦｃεＲＩ（活性化性）との架橋。Ｇｐ４９Ｂ１は、マウス細胞のタンパク質であって、ヒト細胞のタンパク質ではない。Ｇｐ４９Ｂ１は、マウス肥満細胞上に、ならびにＩＬ−２で刺激したマウスＮＫ細胞上に生じる（Ｗａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，１３（１９９７））。ｇｐ４９Ｂ１についての生理学的リガンドは、ＭＨＣクラスＩ分子である。Ｇｐ４９Ｂ１は、ＩＴＩＭモチーフを含む。Ｇｐ４９Ｂ１は、ヒトタンパク質ＫＩＲと３５％のアミノ酸同一性を共有する。ｇｐ４９Ｂ１のヒトホモログ（ＨＭ１８と呼ばれる）は、ヒト肥満細胞、ヒト単球、およびヒトＮＫ細胞上に生じる。

マウス肥満細胞上でのｇｐ４９Ｂ１およびＦｃεＲＩの架橋が、ラットＩｇＥ、ラットＩｇＭ抗ｇｐ４９Ｂ１、抗ｇｐ４９Ｂ１、およびＦ（ａｂ’）_２マウス抗ラットＩｇＧを含む架橋カクテルを用いて研究された（Ｌｕ−Ｋｕｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，５７９１（１９９９））。ｇｐ４９Ｂ１とＦｃεＲＩとの架橋は、ＳＨＰ−１（ホスファターゼ）とｇｐ４９Ｂ１との会合をモニタリングすること、カルシウム流を測定すること、および酵素分泌を測定することによって測定されたところ、細胞活性化が阻害された。

ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とＦｃεＲＩ（活性化性）との架橋。以下の研究（トランスフェクトされたＦｃγＲＩＩＢを有する肥満細胞様細胞株に関する）は、ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）のＦｃεＲＩ（活性化性）に対する架橋が、細胞阻害をもたらすことを実証した。人工的構築物を用いた細胞株。ＦｃεＲＩのＦｃεＲＩに対する（それ自身に対する）架橋は、細胞活性化をもたらす。ＦｃεＲＩをＦｃεＲＩに対して（それ自身に対して）架橋し、そしてＦｃεＲＩをＦｃγＲＩＩＢに対して架橋した混合状況は、低減した細胞活性化をもたらす。この混合状況は、ＦｃγＲＩＩＢの阻害効果を実証する（Ｂｌｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，８９８９（１９９７））。

架橋は以下の通りに実証された。第一段階では、ＦｃεＲＩが、マウスＩｇＥを添加することによってタグ化された。ここで、ＦｃεＲＩは、ＩｇＥによって結合されるようになる。第二工程では、１つのマウスＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体が、ロバ抗マウスＦ（ａｂ）’_２を用いて別のマウスＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体に対して架橋される。ここまで記載したシナリオは、細胞活性化のみをもたらす。

第三の実験工程では、ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）が、マウスＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体に対して架橋された。ここで、ＦｃγＲＩＩＢが、２．４Ｇ２を用いて最初にタグ化されて、２．４Ｇ２／ＦｃγＲＩＩＢ複合体が得られた。次いで、ラット２．４Ｇ２／ＦｃγＲＩＩＢ複合体が、架橋抗体（ＴＮＰ−Ｆ（ａｂ）’_２ ＭＡＲ）を用いてマウスＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体に対して架橋された。言い換えると、ＴＮＰ−Ｆ（ａｂ）’_２ ＭＡＲを用いて、マウス抗ＴＮＰ ＩｇＥおよびラット抗ＦｃγＲＩＩ ２．４Ｇ２が架橋される。この第三工程の結果は、細胞活性化の阻害である（Ｂｌｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，８９８９（１９９７））。

ＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩとの架橋は、多数の他の研究者によって特徴付けられている。１つの研究では、架橋は、ＩｇＥおよびＲＡＭ ＩｇのＦ（ａｂ’）_２フラグメントを含むカクテルによって行われた（Ｍａｌｂｅｃら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，１６４７（１９９８））。同様の研究では、架橋は、ＩｇＥ抗ＤＮＰ、２．４Ｇ２ Ｆ（ａｂ’）_２、およびＴＮＰ−ＭＡＲ Ｆ（ａｂ’）_２を含むカクテルによって行われた（Ｌｅｓｏｕｒｎｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，６３２７（２００１））。

ヒト好塩基球はまた、ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とＦｃεＲＩ（活性化性）との架橋の影響を例示するために用いられた。これらの研究は、架橋が阻害性効果を有することを明らかにした（Ｄａｅｒｏｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３，６３５（１９９５）における図１Ａ）。

ＦＤＦ０３（阻害性）とＦｃγＲＩＩ（活性化性）との架橋。ＦＤＦ０３は、単球、マクロファージ、顆粒球、および単球由来樹状細胞において見出される、ヒト膜結合型タンパク質である。ＦＤＦ０３は、ＩＴＩＭモチーフをその細胞質領域に含み、従ってＦＤＦ０３−ＩＴＩＭと省略され得る。

ヒトにおけるＦｃγＲＩＩは、３つの形態で生じ、ここで、１つは阻害性レセプターであり、２つは活性化レセプターである。ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＣは活性化性であり、そしてＩＴＡＭモチーフを含み、従ってＦｃγＲＩＩＡ−ＩＴＡＭおよびＦｃγＲＩＩＣ−ＩＴＡＭと表され得る。対照的に、ＦｃγＲＩＩＢは阻害性であり、そしてＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭと表され得る（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，４２５３（１９９９））。以下で報告された研究は、ＦｃγＲＩＩの活性化形態のうちの１つに関し、ここで、正確な形態は述べられなかった。

Ｕ９３７細胞中にトランスフェクトされたＦＤＦ０３を含む人工的構築物が作製された。ＦＤＦ０３およびＦｃγＲＩＩ（活性化性）は、架橋カクテルを用いて互いに架橋された。この架橋カクテルは、ｍＡＢＩＶ．３（ＦｃγＲＩＩを結合する）、ｍＡＢ３６Ｈ２（ＦＤＦ０３を結合する）、およびヤギＦ（ａｂ’）_２抗マウスＩｇ（上記の２つの抗体／抗原複合体を架橋する）を含んでいた。抗ＦｃγＲＩＩを単独でこの細胞に対して添加することは、カルシウム流を誘発した。しかし、架橋カクテル全体を添加することは、カルシウム流をもたらさなかった。この結論は、ＦＤＦ０３のＦｃγＲＩＩに対する架橋は、ＦｃγＲＩＩ媒介性細胞活性化の阻害をもたらすということである（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，１１９７（２０００））。

ＬＡＩＲ−１（阻害性）とＦｃγＲＩＩ（活性化性）との架橋。ＬＡＩＲ−１は、ＩＴＩＭモチーフを含み、それゆえ、ＬＡＩＲ−１−ＩＴＩＭと省略され得る。ＬＡＩＲ−１（阻害性）およびＦｃγＲＩＩ（活性化性）を、架橋カクテルを用いて互いに架橋した。この架橋カクテルは、ｍＡｂＩＶ．３（ＦｃγＲＩＩを結合する）、ｍＡｂ ＤＸ２６（ＬＡＩＲ−１を結合する）、およびヤギＦ（ａｂ’）_２抗マウスＩｇを含んでいた。抗ＦｃγＲＩＩを単独でこの細胞に対して添加することは、カルシウム流を誘発した。しかし、架橋カクテル全体を添加することは、カルシウム流をもたらさなかった。この結論は、ＬＡＩＲ−１のＦｃγＲＩＩに対する架橋が、抗ＦｃγＲＩＩ単独の使用を用いて見られるＦｃγＲＩＩ媒介性細胞活性化を阻害するということである（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら，１６５，１１９７（２０００））。カルシウム流の妨害に加えて、１つの効果は、この細胞の分化の阻害である。これらの細胞が単球である場合、ＦｃγＲＩＩのＬＡＩＲ−１との架橋は、単球の樹状細胞への分化を阻害した（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら，１６５，１１９７（２０００））。

ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とＢ細胞レセプター（活性化性）との架橋。ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂとも呼ばれる）は、Ｂ細胞の膜結合型タンパク質である。Ｂ細胞は、外来抗原に対する曝露に応答して、増殖し、そして抗体を分泌する。Ｂ細胞によって分泌される抗体は、このＢ細胞に対してフィードバック効果を発揮し、ここで、そのネガティブフィードバック効果は、この抗体とＦｃγＲＩＩｂおよびＢ細胞レセプターとの接触による。薬学的手段によるＦｃγＲＩＩｂ（阻害性）の刺激は、Ｂ細胞活性が害を及ぼす疾患状態において有用であると期待される。これらとしては、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ）が挙げられる。マウスを用いた研究は、Ｂ細胞欠損マウスが実験的関節炎を発症しないことを明らかにした（Ｓｖｅｎｓｓｏｎら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１，５２１（１９９８））。この知見と一貫しているのは、ＦｃγＲＩＩｂが欠損しているマウスが、増大した関節炎を有することである（ＦｃγＲＩＩｂが存在しないこと、従ってその阻害効果を発揮できないことに明らかに起因する）（Ｙｕａｓａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，１８７（１９９９））。

ＦｃγＲＩＩＢが、Ｂ細胞だけでなく、肥満細胞およびマクロファージにも存在し、ここで、ＦｃγＲＩＩＢがまた阻害効果を発揮することもまた注目され得る（Ｄａｅｒｏｎら，３，６３５（１９９５）；Ｕｊｉｋｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，１５７３（１９９９））。

ＦｃγＲＩＩＢは、ＩＴＩＭモチーフをその細胞質領域に保有する。ＦｃγＲＩＩＢは、ヒトにおいて２つの形態（すなわち、ＦｃγＲＩＩＢ１およびＦｃγＲＩＩＢ２）で生じる（Ｂｒｕｈｎｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３７３５７（２０００））。このＢ細胞レセプターは、ｍＩｇ（これは、この抗原を結合する）、Ｉｇ−α（シグナル伝達ユニットの一部）、およびＩｇ−β（シグナル伝達ユニットの一部）の複合体である。

Ｉｇ−αおよびＩｇ−βは各々、ＩＴＡＭモチーフを含む。多価抗原による、１つのＢ細胞レセプターの別のＢ細胞レセプターへの架橋は、細胞活性化をもたらす。しかし、Ｂ細胞レセプターのＦｃγＲＩＩＢへの架橋は、上記の通り、阻害性である。これらの２つのレセプターの架橋（同時連結）は、ＩＴＩＭモチーフにおけるチロシン残基のリン酸化をもたらし、ＦｃγＲＩＩｂ−ＩＴＩＭのＦｃγＲＩＩｂ−ＩＴＩＭ−ホスフェートへの転換をもたらす（Ｇｅｒｇｅｌｙら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６８，３（１９９９）；Ｃｏｇｇｅｓｈａｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，３０６（１９９８）；Ｓａｒｍａｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３０４９９（１９９６））。

これらの２つのレセプターの実験的架橋は、細胞に対して以下を添加することによって達成され得る：（１）インタクトなＩｇＧ抗ＩｇＭ；（２）凝集したＩｇＧ＋抗Ｉｇ；または（３）抗ＦｃγＲＢＩＩ（抗ＣＤ３２ＢＩ）を添加し、続いてビオチン化抗マウスＩｇＧおよびビオチン化抗ヒトＩｇ＋アビジンを添加すること（Ｓａｒｍａｙら（１９９６））。

ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とＣＤ３ε（活性化性）（Ｔ細胞レセプターの一成分）との架橋は、培養された細胞株ＲＭＡ細胞および２Ｂ４細胞において示された。この研究は、ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とＣＤ３ε（活性化性）とを架橋することが、ＣＤ３ε媒介活性化の阻害をもたらすことを実証した（Ｄａｅｒｏｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３，６３５（１９９５）における図２Ｃ）。

ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とＦｃγＲＩＩＡ（活性化性）との架橋。トランスフェクトされた細胞を用いた研究は、ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とＦｃγＲＩＩＡ（活性化性）との架橋が、ＦｃγＲＩＩＡ媒介活性化の阻害をもたらすことを実証した（Ｄａｅｒｏｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３，６３５（１９９５）における図１Ｃ）。

ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とｃ−ｋｉｔ（活性化性）との架橋。ｃ−Ｋｉｔは、活性化レセプターとして機能する膜結合型タンパク質である。ｃ−Ｋｉｔは、ＩＴＡＭモチーフを含まない。このタンパク質は、肥満細胞上に生じ、ここで、これは、肥満細胞のＦｃεＲＩ（これは、ａｄａｐｔｉｖｅ免疫機構において機能する）とは対照的に、先天免疫機構において機能する（Ｌｕ−Ｋｕｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，６０２２（２０００））。ｃ−Ｋｉｔは、コロニー刺激因子／血小板由来増殖因子レセプターサブファミリーに属し、ここで、上記のタンパク質は、ＲＴＫファミリー（レセプターチロシンキナーゼファミリー）に属する（Ｍｏｒｉｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３３４７（１９９６））。

肥満細胞を用いての研究は、ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とｃ−ｋｉｔ（活性化性）との架橋が、ｃ−ｋｉｔ媒介性細胞増殖を阻害したことを明らかにした。架橋は、ＡＣＫ２−ビオチン＋抗ビオチンを添加することによって達成された（Ｍａｌｂｅｃら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，４４２４（１９９９））。研究の詳細は、以下の通りであった。コントロール研究では、細胞を、２．４Ｇ２（抗体）（ＦｃγＲＩＩＢの結合部位をブロックする抗体）を用いて前処理し、ＦｃγＲＩＩＢを不活化レセプターとして非機能的にした。細胞を、ブロッキング抗体を用いて前処理し、続いて、ＡＣＫ２−ビオチン＋抗ビオチンを添加したところ、細胞の増殖が誘導された（Ｍａｌｂｅｃら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，４４２４（１９９９）の図４）。

ＣＤ５（阻害性）とＣＤ３（活性化性）との架橋。ＣＤ５は、Ｔ細胞上およびＢ細胞の部分集団上に見出された膜結合型タンパク質である。ＣＤ５は、スカベンジャーレセプターシステインリッチ（ＳＲＣＲ）ファミリーに属する。このファミリーとしては、ＣＤ５、ＣＤ６、ＷＣ１、Ｍ１３０、Ｓｐα、Ｐｅｍａ−ＳＴＥＧ、Ｅｂｎｅｒｉｎ、ＣＰＲ−ｄｕｃｔｉｎ、ヘンシン（ｈｅｎｓｉｎ）、および膀胱ムチンが挙げられる（Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｌｌａｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，２９０３（１９９９））。ＣＤ５の細胞質ドメインは、ＩＴＡＭ様配列およびＩＴＩＭ様配列を含む。Ｔ細胞を用いての研究は、ＣＤ５の阻害特性を例示した。なぜなら、これらは、Ｔ細胞レセプターに、より詳細には、Ｔ細胞レセプターのＣＤ３成分に関連するからである。

ＣＤ５（阻害性）とＴ細胞レセプター（活性化性）との架橋は、ビオチン化抗ＣＤ３、ビオチン化抗ＣＤ５、およびアビジンを含む架橋カクテルを用いて達成された。架橋は、Ｃａ^２＋レベルの測定によって示されるように、Ｔ細胞レセプター依存性細胞活性化における減少をもたらした（Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｌｌａｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，２９０３（１９９９））。

（二重特異性抗体の産生）
本発明は、２つの異なる抗原結合部位が単一分子中に取り込まれた二重特異性抗体を提供する。二重特異性抗体は、化学的架橋（Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，８１（１９８５）；Ｒａｓｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２７６２３（１９９７））、ジスルフィド交換、ハイブリッド−ハイブリドーマ（クアドローマ）の産生、二重特異性抗体を具体化する単一ポリペプチド鎖を産生する転写および翻訳によって、または共有結合して二重特異性抗体を産生し得る、１より多くのポリペプチド鎖を産生する転写および翻訳によって、調製され得る。意図される二重特異性抗体はまた、化学的合成によって完全に作製され得る。この二重特異性抗体は、２つの異なる可変領域、２つの異なる定常領域、１つの可変領域および１つの定常領域、または他の改変体を含み得る。

単一ポリペプチド鎖の二重特異性抗体を産生する転写／翻訳の使用の例は、以下の通りである。特定の動物（ラクダ；ラマ；ヒトコブラクダ）は、重鎖抗体を産生し、ここで、会合する軽鎖は存在しない。これらの抗体は、単一の可変領域を有し、これは、抗原に結合し得る。２つの可変領域（２つの異なる重鎖抗体由来）＋リンカー領域（ラマの上のヒンジ由来）を含む組換え二重特異性抗体が産生されている。得られる複合体（ＶＨ_１−ＬＨ−ＶＨ_２）は、細菌において発現され得る（Ｃｏｎｒａｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，７３４６（２００１））。ラクダ重鎖抗体に基づくこの二重特異性抗体のヒト化対応物が意図される。

単鎖可変フラグメントは、以下の種々の技術によって互いに連結されて、二重特異性抗体を形成する：Ｃ末端システイン残基の架橋、４つのヘリックス束由来の天然で会合するへリックスを付加すること、ロイシンジッパーを付加すること、相互作用表面にてノブもしくは穴のいずれかを有するＣＨ３ドメインを付加すること、またはＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインをそれぞれのｓｃＦＶフラグメントに連結すること（Ｃｏｎｒａｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，７３４６（２００１））。

化学的に構築された二重特異性抗体は、化学物質（例えば、ヘテロ二重官能性試薬スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）−プロピオネート（ＳＰＤＰ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）によって異種のＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントを化学的に架橋することによって調製され得る。ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、インタクトな抗体をそれぞれ、パパインまたはペプシンで消化することによって、インタクトな抗体から入手され得る（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０，１６８６（１９８４）；Ｔｉｔｕｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，４０１８（１９８７））。

オリゴペプチドおよびポリペプチドは、２つの異なる抗体または抗体鎖を一緒に連結するために用いられ得る。オリゴペプチドおよびポリペプチドは、液相技術または固相技術によって合成され得る。これらとしては、例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ならびにＭｏｌｉｎａら，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．９，１５１（１９９６））に記載されるプロセスが挙げられる。例えば、アジドプロセス、酸塩化物プロセス、酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、またはシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化的−還元的プロセス、またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）／添加プロセスが用いられ得る。

クアドローマは、２つの異なる抗原に対する２つの異なる種類の抗体を分泌するハイブリドーマを融合することによって構築され得る（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５，５３７（１９８３）；Ｋｕｒｏｋａｗａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，１１６３（１９８９））。二重特異性抗体はまた、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，１２０２（１９８５））によって調製され得る。本発明は、さらに、ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／１１１６１およびＨｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４（１９９３）に記載されるように、組換え微生物宿主内で産生された二重特異性抗体構造体を包含する。また含まれるのは、二重特異性線状分子（例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０，３６５５（１９９１）によって記載される、いわゆる「ヤヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」構造）である。これは、モノマー単鎖抗原結合タンパク質をコードする遺伝子の終わりの終止コドンを遺伝的に除去し、そしてリンカー、および第二の単鎖抗原結合タンパク質をコードする遺伝子を挿入することによって達成され得る（ＷＯ ９３／１１１６１）。

大部分の抗体の抗原認識部位は、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域から構成される。これらの可変領域は両方とも、互いに密接に接触しており、そして抗原認識部位を形成する。単鎖抗体は、１つのポリペプチド鎖に２つの可変領域を含み、ここで、一方の可変領域は、従来の軽鎖の可変領域と等価であり、そして他方の可変領域は、従来の重鎖に等価である。単鎖抗体の設計は、ポリペプチド領域を連結することについての注意を含み、これは、２つの可変領域を連結する。単鎖抗体は、化学的手段によって、または単一のオープンリーディングフレームを用いた翻訳によって合成され得る。単鎖抗体の合成についての詳細は、Ｌａｄｎｅｒらに対して発行された米国特許第４，９４６，７７８号に記載される。

さらなるアプローチでは、二重特異性抗体は、成分の抗体をロイシンジッパーペプチドに対して連結することによって形成される（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７（１９９２）；ｄｅ ＫｒｕｉｆおよびＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，７６３０（１９９６））。ロイシンジッパーは、一般的構造式（ロイシン−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６）_ｎを有し、ここでＸは、従来の２０アミノ酸のうちのいずれかであり得る（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））が、高いα−ヘリックス形成可能性を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびリジン）である可能性が最も高く（ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１６４８（１９８８））、そしてｎは３以上であり得るが、代表的にはｎは４または５である。ロイシンジッパーは、種々の真核生物ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−ｆｏｓ遺伝子産物（Ｆｏｓ）、ｃ−ｊｕｎ遺伝子産物（Ｊｕｎ）、およびｃ−ｍｙｃ遺伝子産物）中に生じる。これらのタンパク質では、ロイシンジッパーは、ダイマー形成界面を作製し、ここで、ロイシンジッパーを含むタンパク質は、安定なホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーを形成し得る。

本発明において使用するためのロイシンジッパーは好ましくは、対（ｐａｉｒｗｉｓｅ）親和性を有する。対親和性は、ロイシンジッパーの１つの種（例えば、Ｆｏｓロイシンジッパー）が別の種のロイシンジッパー（例えば、Ｊｕｎロイシンジッパー）とヘテロダイマーを優先的に形成し、その結果、２種のロイシンジッパーが十分な濃度で存在する場合にヘテロダイマー形成がホモダイマー形成よりも好適である能力として規定される（Ｓｃｈｕｅｍａｎｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，７３９（１９９１））。従って、ヘテロダイマーの優先的形成は、代表的に５０〜７５パーセント、好ましくは７５〜８５パーセント、そして最も好ましくは８５より多くのパーセントがヘテロダイマーである、ダイマー集団をもたらす。合成ペプチドのアミノ末端が各々システイン残基を含んで分子間ジスルフィド結合を可能にする場合、ヘテロダイマー形成は、ホモダイマー形成に対して実質的排除を生じる。

二重特異性抗体の形成において、成分抗体の結合フラグメントは、第１のロイシンジッパーおよび第２のロイシンジッパーに対してインフレームで融合される。適切な結合フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または重鎖を含む。これらのジッパーは、抗体結合フラグメントの重鎖または軽鎖に対して連結され得、そして通常、Ｃ末端に対して連結される。定常領域または定常領域の一部分が存在する場合、このロイシンジッパーは好ましくは、定常領域またはその一部分に対して連結される。例えば、Ｆａｂ’−ロイシンジッパー融合体において、このジッパーは、通常、ヒンジのＣ末端に融合される。それぞれの成分の抗体フラグメントに対して融合されたロイシンジッパーを含むことは、このジッパーのアニーリングによるヘテロダイマーフラグメントの形成を促進する。成分抗体が定常領域の一部分（例えば、Ｆａｂ’フラグメント）を含む場合、ジッパーのアニーリングはまた、定常領域を近位にもたらすために役立ち、それにより、（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントにおける）定常領域の結合を促進する。代表的なヒト定常領域は、それぞれの鎖のヒンジ領域の間での２つのジスルフィド結合の形成によって結合される。この結合は、さらなるシステイン残基をそれぞれのヒンジ領域中に操作してさらなるジスルフィド結合の形成を可能にすることによって強化され得る。

抗体結合フラグメントに連結されたロイシンジッパーは、種々の方法で産生され得る。例えば、ロイシンジッパーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、細胞宿主によって、またはインビトロ翻訳系において、発現され得る。あるいは、ロイシンジッパーおよび／または抗体結合フラグメントは、化学的ペプチド合成によって、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の発現によって、またはロイシンジッパーを含む他のタンパク質、抗体、もしくは高分子種からの切断およびその後の精製によってのいずれかにより、別個に産生され得る。このような精製されたポリペプチドは、介在スペーサーアミノ酸配列を有するかもしくは有さないペプチド結合によって、介在スペーサー分子を有するかもしくは有さない非ペプチド共有結合によって、連結され得、このスペーサー分子は、アミノ酸または他の非アミノ酸化学的構造体のいずれかである。連結の方法および種類にかかわらず、このような結合は可逆性であり得る。例えば、化学的に不安定な結合（ペプチジルまたは他のもののいずれか）は、自然に切断されてもよく、または熱、電磁放射腺、プロテアーゼもしくは化学薬剤を用いた処理によって切断されてもよい。このような可逆的結合の２つの例は、以下である：（１）ヒドロキシルアミンによって切断され得る、Ａｓｎ−Ｇｌｙペプチド結合を含む結合、および（２）還元剤によって切断され得る、ジスルフィド結合による結合。

成分抗体フラグメント−ロイシンジッパー融合タンパク質は、両方の融合タンパク質を同じ細胞株中で発現することによってアニールされ得る。あるいは、融合タンパク質は、別個の細胞株中で発現され得、そしてインビトロで混合され得る。成分抗体フラグメントが定常領域の部分を含む場合（例えば、Ｆａｂ’フラグメント）、このロイシンジッパーは、アニーリングが生じた後に切断され得る。この成分抗体は、定常領域を介して二重特異性抗体中に連結したままである。

モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、当業者に周知の種々の技術によって入手され得る。手短に述べると、所望の抗原で免疫した動物由来の脾臓細胞は、通常、骨髄腫細胞との融合によって不死化される（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１（１９７６））。代替的不死化方法としては、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、癌遺伝子、もしくはレトロウイルス、または当該分野で周知の他の方法での形質転換が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、その抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされる。このような細胞によって産生されるＭＡｂの収率は、脊椎動物宿主の腹膜腔内への注射を含む種々の技術によって増強され得る。

動物由来の抗体のヒト化は、ヒト身体における低減した免疫原性、増大した半減期、および休止Ｔ細胞のより低い活性化をもたらし得る。所望の抗体が、マウスにおいて見出されているかまたは産生されている場合、この抗体は、マウス抗体の相補性決定領域をヒト抗体配列中にグラフト化することによってヒト化され得る。言い換えれば、マウス抗体の定常領域は、ヒト定常領域で置き換えられる。さらなる有用な改変は、Ｆｃ領域に、その抗体の、そのヒトＦｃレセプターに対するより少ない結合をもたらす変異を導入することである（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，６２０５（２０００）；Ｈｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，１０２９（１９９８））。

以下は、二重特異性抗体の多数の意図される実施形態を明らかにする。これらの実施形態では、用語「抗」とは、意図される標的に特異的に結合する、ポリペプチド、ポリペプチド領域、またはポリペプチドフラグメントをいう。特定の実施形態が、架橋領域またはヒンジ領域、シグナル配列によって、グリコシル基、ホスホリル基、スルフェート基、もしくはアセチル基によって、カルボキシル化グルタメート残基（Ｇｌａ）によって、ジスルフィド結合によって、精製タグ（例えば、オリゴ−ヒスチジンもしくはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）によって、ペプチド結合の切断によって、検出可能なリガンド（例えば、蛍光タグもしくは放射性タグ（^３５Ｓ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３３Ｐ、^３２Ｐ、^１２５Ｉ））によって、ビオチン化によって、または身体中での安定性を促進することが意図された薬剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；ペグ化抗体）によって改変され得ることが意図される。

意図される二重特異性抗体は、抗ＫＩＲおよび抗ＣＤ２、抗ＫＩＲおよび抗ＣＤ３、抗ＫＩＲおよび抗ＤＡＰ−１２、抗ＫＩＲおよび抗ＫＡＲ、抗ＫＩＲおよび抗ＫＡＲＡＰ、抗ＫＩＲおよび抗ＦｃεＲＩ、抗ＫＩＲおよび抗ＦｃγＲＩＩＡ、抗ＫＩＲおよび抗ＦｃγＲＩＩＣ、抗ＫＩＲおよび抗ＦｃγＲＩＩＩ、抗ＫＩＲおよび抗Ｔｒｅｍ−１、抗ＫＩＲおよび抗ＣＤ２８、抗ＫＩＲおよび抗Ｔ細胞レセプター、または抗ＫＩＲおよび抗Ｂ細胞レセプターから構成され得る。

意図された二重特異性抗体が抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＣＤ２、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＣＤ３、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＤＡＰ−１２、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＫＡＲ、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＫＡＲＡＰ、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＦｃεＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＦｃγＲＩＩＡ、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＦｃγＲＩＩＣ、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＦｃγＲＩＩＩ、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗Ｔｒｅｍ−１、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗ＣＤ２８、抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗Ｔ細胞レセプター、または抗ＦｃγＲＩＩＢおよび抗Ｂ細胞レセプターから構成され得ることがさらに意図される。

（用途）
本発明の二重特異性抗体は、免疫障害、異常な細胞増殖などの処置または診断において有用である。このような障害としては、活性化レセプターおよび／または阻害性レセプターを保有する細胞に関与する疾患（例えば、ＩｇＥ依存性状態、皮膚もしくは粘膜の炎症状態、自己免疫状態（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｄｔｉｏｎ）、神経系および筋肉系の免疫障害、全身の炎症、ならびに移植関連免疫疾患）が挙げられる（例えば、ＳａｌｖｉおよびＢａｂｕ（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：１２９２；Ｓａｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５６２４；Ｂａｒｎｅｓ（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３４１：２００６；Ｋｉｔａら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６９０１；Ｔａｒｇａｎら（１９９７）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１０２９；Ｓｉｍｐｓｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１２２５；ＴｏｂｅｒｔおよびＫｕｐｐｅｒ（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：３４０；ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＤｉａｍｏｎｄ（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：３４０；ＲｏｓｅおよびＭａｃｋａｙ（編）Ｔｈｅ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｆａｌｋ（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１１８２；Ｍｉｌｌｓ（１９９４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３：１８７１；ならびにＢｌａｚａｒら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１５７：７９を参照のこと）。

（二重特異性抗体の治療組成物および投与）
二重特異性抗体の治療処方物は、所望の程度の純度を有する抗体を、任意の生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤（Ｇｅｍｍａｒｐ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第２０版，Ｐｈｉｌａ．（２０００））と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、貯蔵のために調製される。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量および濃度にて、レシピエントに対して無毒性であり、これらとしては、以下が挙げられる：緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸を含む）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび、ならびに他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。

インビボで投与するために用いられるべき二重特異性抗体は、無菌でなければならない。滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成され得る。この二重特異性抗体は通常、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存される。治療二重特異性抗体組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿孔され得るストッパを有するバイアル）中に配置される。

投与経路は、公知の方法（例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内もしくは病巣内の経路によるか、または持続放出系による、注射または注入）に従う。

持続放出調製物の適切な例としては、成形品の形態の半透膜ポリマーマトリクス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）が挙げられる。持続放出マトリクスとしては、以下が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，１６７（１９８１））；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，９８（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，９８（１９８２））、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）。持続放出二重特異性抗体組成物としてはまた、リポソームに封入された抗体が挙げられる。抗体を含むリポソームが調製され得る（Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４０３０（１９８０）；ＥＰ ５２，３２２；ＥＰ ３６，６７６；ＥＰ ８８，０４６；ＥＰ １４３，９４９；ＥＰ １４２，６４１；米国特許第４，４８５，０４５号；米国特許第４，５４４，５４５号；ＥＰ １０２，３２４）。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）の単層型のリポソームであり、ここで、脂質含量は、約３０ｍｏｌ．％ コレステロールよりも高く、選択された比率は、最適な抗体治療について調整される。

この二重特異性抗体はまた、吸入によって投与され得る。液体処方物用の市販のネブライザー（ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む）は、投与のために有用である。液体処方物は、直接的に噴霧され得、そして凍結乾燥粉末は、再構成後に噴霧され得る。あるいは、二重特異性抗体は、フルオロカーボン処方物および用量計量（ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｓｅ）吸入器を用いてエアゾールにされ得るか、または凍結乾燥および粉砕された粉末として吸入され得る。

治療的に用いられるべき二重特異性抗体の「有効量」は、例えば、治療の目的、投与経路、用いる二重特異性抗体の種類、および患者の状態に依存する。従って、治療者が、投薬量を力価測定し、そして必要に応じて投与経路を改変して最適な治療効果を得ることが必要である。代表的に、臨床家は、投薬量が所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、この二重特異性抗体を投与する。この治療の進展は、従来のアッセイによって容易にモニタリングされる。

二重特異性抗体による障害の処置および予防において、この抗体組成物は、優良医薬品製造基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）に合致した様式で、処方、投薬および投与される。この状況において考慮される要因としては、以下が挙げられる：処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、この障害の原因、抗体の送達部位、抗体の特定の種類、投与方法、投与スケジュール、および医療実践者に公知の他の要因。投与されるべき「治療的に有効な量」の抗体は、このような考慮されるべき事項によって支配され、そして炎症障害を予防、改善または処置するために必要な最小の量である。

（治療適用）
本発明は、免疫系の細胞に関与する疾患または病理学的状態の処置のために貴重な試薬および治療剤を提供する。この試薬は、二重特異性抗体を含む。この二重特異性抗体は、２つの異なる領域を含み、これらの領域の各々は、抗原を認識し、そして結合する。一般に、この抗原は、免疫学的細胞の原形質膜に存在するかまたはその付近に存在する、膜結合型タンパク質の一部分として生じる。一般に、これらの抗原は、レセプター（例えば、サイトカインについてのレセプター、抗体についてのレセプター（例えば、Ｆｃレセプター）、または外来抗原についてのレセプター（外来抗原についてのＴ細胞レセプター）である。この二重特異性抗体が２つの異なる細胞表面抗原を同時に結合する場合、この２つの抗原は、一緒に係留され得、そして２つの抗原（この２つのレセプター）が密接に近接することは、この２つのレセプターの間での機能的連絡をもたらし得る。係留が活性化レセプターおよび阻害性レセプターを含む場合、最終的な結果は、その後の細胞活性阻害を伴った、活性化レセプターの阻害であり得る。細胞活性は、カルシウム流、このレセプターの細胞質部分のリン酸化状態における変化、活性化レセプターまたは阻害性レセプターのいずれかに対する細胞内タンパク質の補充における変化、および細胞膜中の「ラフト」に対する酵素またはタンパク質の補充によって評価され得る（ＹａｎｇおよびＲｅｉｎｈｅｒｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１８７７５（２００１））。細胞活性における変化はまた、細胞の分化状態、細胞の増殖状態、または細胞が標的細胞を溶解する能力によって評価され得る。

（治療剤と組み合わせた二重特異性抗体の投与）
治療剤と組み合わせて二重特異性抗体を使用することが意図される。これらの薬剤のうちのいくつかは、その薬剤を用いた治療に応答する特定の疾患とともに、以下の通りである。乾癬は、紫外光とともに、コルチコステロイド、メトトレキサート、シクロスポリン、アレファセプト（ａｌｅｆａｃｅｐｔ）、およびメトキサレン（ソラレン）を用いて処置され得る（Ｇｒａｎｓｔｅｉｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５，２８４（２００１））。慢性関節リウマチは、グルココルチコイド、プレドニゾロン、ヒドロキシクロロキン、およびスルファサラジンを用いて処置され得る（Ｋｉｒｗａｎら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３，１４２（１９９５））。慢性関節リウマチはまた、腫瘍壊死因子−αに対する抗体（インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、ＣＤＰ５７１、Ｄ２Ｅ７、ＣＤＰ８７０）（ＦｅｌｄｍａｎｎおよびＭａｉｎｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，１６３（２００１））および可溶性形態の腫瘍壊死因子−αレセプター（エタナーセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、レナーセプト（ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、ペグ化短縮型ｐ５５ ＴＮＦ−Ｒ）（ＦｅｌｄｍａｎｎおよびＭａｉｎｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，１６３（２００１）；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２，８１０（２０００））を用いて処置され得る。クローン病は、プレドニゾン、メルカプトプリン、アザチオプリン、インフリキシマブ、メトトレキサート、ブデソニド、シクロスポリン、５−アセチルサリチル酸、および成長ホルモンを用いて処置され得る（Ｓａｒｔｏｒ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２，１６６４（２０００））。全身性エリテマトーデスは、アスピリンまたは他の非ステロイド性抗炎症性治療剤、ヒドロキシクロロキンまたは他の抗マラリア治療剤、キナクリン、ダンゾール（ｄａｎｚｏｌ）、ビンクリスチン、およびシクロホスファミドを用いて処置され得る（Ｍｉｌｌｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０，１８７１（１９９４））。アレルギー性喘息は、抗ＩｇＥ、グルココルチコイド、またはβ_２−アドレナリン作用性レセプターアゴニスト（ＳａｌｖｉおよびＢａｂｕ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２，１２９２（２０００））、ブデソニド（コルチコステロイド）、テルブタリン（β_２−アゴニスト）を用いて処置され得る（Ｈａａｈｔｅｌａら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１，７００（１９９４））。Ｂ細胞応答を目的とした薬剤としては、シクロホスファミド、メトトレキサート、レフルノミド、ブレキナル、および１５−デオキシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）が挙げられる（ＡｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓおよびＳａｃｈｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，４３３（１９９８））。ヒスチジンレセプター（例えば、Ｈ_１−レセプター）のアンタゴニストは、多数のアレルギー性障害（慢性蕁麻疹（Ｇｒｅａｖｅｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２，１７６７（１９９５））、アレルギー性鼻炎、喘息、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー鼻結膜炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、アナフィラキシー、およびかゆみ（ｐｒｕｒｉｔｉｓ）を含む）の処置に用いられる（ＳｉｍｏｎｓおよびＳｉｍｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０，１６６３（１９９４））。これらのアンタゴニストとしては、フェクソフェナジン（ｆｅｘｏｆｅｎａｄｉｎｅ）（Ｋａｙ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４，１０９（２００１））、テルフェナジン、アステミゾール、ロラタジン（ｌｏｒａｔｉｄｉｎｅ）、セチリジン、アクリバスチン、レボカバスチン、アゼラスチン、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、ドキセピン、トリプロリジン、およびクロルフェニラミンが挙げられる（Ｇｒｅａｖｅｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２，１７６７（１９９５））。

免疫抑制因子（例えば、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、抗リンパ球グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン、シクロスポリン、アザチオプリン、ステロイド、リンパ照射（ｌｙｍｐｈｏｉｃ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）（Ｋａｗａｕｃｈｉら，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１０６，７７９（１９９３）；Ｍａｔｓｕｍｉｙａら，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３，７６（１９９６））、シクロホスファミド、ミコフェノール酸（Ｚｈｏｎｇら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ．２８，７６２（１９９６））、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）（Ｒｕｚｉｃｋａら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７，８１６（１９９７））、ラパマイシン、ＦＫ５０６（Ｂｌａｚａｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，５３５５（１９９８））とともに二重特異性抗体を使用することが意図される。

（キットおよび定量）
本発明の二重特異性抗体分子は、キットおよびアッセイ方法において特に有用である。
例えば、これらの方法はまた、培養細胞に対する結合活性および阻害活性についてスクリーニングするために適用される。アッセイを自動化するいくつかの方法は、近年開発されており、その結果、１年あたり何万という化合物のスクリーニングが可能である（ＢＩＯＭＥＫ自動化ワークステーション，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，およびＦｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１，７６７（１９９１））。後者は、固体基材上で合成された複数の規定のポリマーによって結合を試験するための手段を記載する。候補標的タンパク質についてスクリーニングするために適切なアッセイの開発は、（例えば、本発明によって提供される）多量の精製二重特異性抗体の入手可能性によって大いに促進され得る。

本発明はまた、免疫系の細胞を検出するための種々の診断キットおよび診断方法における二重特異性抗体の使用を意図し、ここで、この細胞の活性は、この二重特異性抗体の添加によって阻害され得る。代表的には、このキットは、１以上のレセプターに存在する少なくとも２つのエピトープを認識する、いずれかの規定の二重特異性抗体を含む区画を有する。試薬を含む区画、および指示書が通常提供される。

二重特異性抗体は、上昇したレベルのレセプターの存在を検出するための診断適用において、そしてそのレセプターのリガンドに対する、任意の所定のレセプターの増大した感度において、有用である。このリガンドまたはこの二重特異性抗体自体に対する、任意の増大した感度は、この二重特異性抗体のインビボでの使用の治療結果の予想である。増大した感度は、生物学的アッセイによって、または結合によって評価され得る。患者の細胞に対するこの二重特異性抗体の結合は、放射標識二重特異性抗体を用いることによって直接的に、または生物学的応答を測定することによって間接的に、検出され得る。抗体への標識の導入が記載されている（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１および定期補充物））。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、以下が挙げられる：米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号。また、組換え免疫グロブリンおよび結合フラグメントが産生され得る（Ｍｏｏｒｅら，米国特許第４，６４２，３３４号；Ｃａｂｉｌｌｙ，米国特許第４，８１６，５６７号）。

頻繁に、診断アッセイのための試薬は、アッセイの感度を最適にするように、キットにおいて供給される。本発明については、アッセイの性質、プロトコル、および標識に依存して、標識されているかまたは標識されていないかのいずれかの二重特異性抗体が提供される。これは通常、他の添加剤（例えば、緩衝剤、安定剤、シグナル産生に必要な物質（例えば、酵素についての基質）など）に関連する。好ましくは、このキットはまた、適切な使用および内容物の使用後の廃棄についての指示を含む。代表的に、このキットは、各有用な試薬についての区画を有し、そして試薬の適切な使用および廃棄についての指示を含む。望ましくは、この試薬は、乾燥した凍結乾燥粉末として提供され、ここでこの試薬は、このアッセイを実施するために適切な濃度で、水性媒体中で再構成され得る。

診断アッセイの上記の構成要素は、改変することなく用いられてもよく、あるいは、種々の方法で改変されてもよい。例えば、標識は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に提供する部分を共有結合または非共有結合によって連結することによって達成され得る。直接的標識についての可能性としては、以下が挙げられる：標識基：放射性標識（例えば、^１２５Ｉ）、酵素（米国特許第３，６４５，０９０号）（例えば、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ）ならびに蛍光強度、波長シフトまたは蛍光偏光における変化をモニタリングし得る蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号）。両方の特許は、本明細書中に参考として援用される。間接的標識の可能性としては、１つの構成要素のビオチン化、続いて上記の標識基のうちの１つにカップリングされたアビジンへの結合が挙げられる。

タンパク質またはフラグメントを種々の標識に対して連結するための方法は、文献において広範に報告されており、ここでは詳細な考察を必要としない。多くの技術は、連結のための、カルボジイミドまたは活性なエステルのいずれかを使用してペプチド結合を形成することによる活性化カルボキシル基の使用、メルカプト基と活性化ハロゲン（例えば、クロロアセチル）または活性化オレフィン（例えば、マレイミド）との反応によるチオエーテルの形成などを含む。融合タンパク質もまた、これらの適用において用途を見出す。

他のマーカーの定性的または定量的な存在についても試験する診断キットもまた意図される。診断または予後は、マーカーとして用いられる複数の指標の組み合わせに依存し得る。従って、キットは、マーカーの組み合わせについて試験し得る（Ｖｉａｌｌｅｔら，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．１，８９（１９８９））。

本発明は、ある特定の実施例を参照することにより、より良く理解される。これらの実施例は、例示目的であることが意図され、他に指定しない限り、限定されることを意図しない。

（Ｉ．一般的方法）
以下の標準的方法の多くは、記載されるかまたは参照される（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９）；Ａｕｓｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（２０００）およびより前の巻；Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９９８）およびより前の巻；Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０））。タンパク質精製のための方法としては、硫酸アンモニウム沈澱、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などのような方法が挙げられる（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８２巻およびこのシリーズの他の巻；ならびにタンパク質精製製品の使用についての製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．またはＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の文献。標準的免疫学的技術が記載される（Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびより前の巻；Ｈｅｒｔｚｅｎｂｅｒｇら，Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第１〜４巻，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第７０、７３、７４、８４、９２、９３、１０８、１１６、１２１、１３２、１５０、１６２、および１６３巻；Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ（１９９３））。

（ＩＩ．喘息の処置のための、ＮＫ細胞のＫＩＲ（阻害性）およびＦｃγＲＩＩＩＡ（≡ＣＤ１６）（活性化性）を認識する二重特異性抗体）
ＮＫ細胞は、喘息に寄与することが見出されている。研究は、ＮＫ細胞がＩＬ−５を産生し、これは次いで、好酸球浸潤および実験的喘息の発症に寄与することを明らかにした（Ｗａｌｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１，１９６２（１９９８））。

ＫＩＲは、ＮＫ細胞上およびＴ細胞サブセット（ＣＤ８^＋記憶Ｔ細胞）上に生じる（Ｖｅｌｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，２４８７（２００１）；Ｍｉｎｇａｒｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １９，１５３（１９９８））。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、ヒトＮＫ細胞上に生じる（Ｐａｌｍｉｅｒｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，７１８１（１９９９））。ＫＩＲおよびＦｃγＲＩＩＩＡを結合する二重特異性試薬は、喘息の処置のために意図される。

ＣＤ９４／ＮＫＧ２−Ａは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２−ＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡを結合するヒトＮＫ細胞上に生じる（Ｐａｌｍｉｅｒｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，７１８１（１９９９））。ＣＤ９４／ＮＫＧ２−ＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡを結合する、意図される二重特異性試薬は、喘息の処置のために意図される。

ＬＡＩＲ−１は、ＮＫ細胞上に生じる（Ｍｅｙａａｒｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，５８００（１９９９））。ＬＡＩＲ−１およびＦｃγＲＩＩＩＡを結合する、意図される二重特異性試薬は、喘息の処置のために意図される。

（ＩＩＩ．慢性関節リウマチの処置のための、ＬＡＩＲ−１（阻害性）およびＦｃγＲＩＩ（活性化性）を認識する二重特異性抗体）
ＬＡＩＲ−１（阻害性）のＦｃγＲＩＩ（活性化性）に対する架橋は、ＦｃγＲＩＩ（活性化性）媒介細胞活性の阻害をもたらす（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，１１９７（２０００））。阻害された活性としては、カルシウム流、ならびに単球の樹状細胞への分化が挙げられる（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，１１９７（２０００））。

ＬＡＩＲ−１は、単球上に生じる（Ｍｅｙａａｒｄら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７，２８３（１９９７））。ＦｃγＲＩＩＡは、ヒト単球上に生じる（Ｃｏｏｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，８４４（２００１））。それゆえ、単球によって媒介される疾患状態は、意図される二重特異性抗体によって処置され得、ここで、この疾患は、単球のＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢの刺激によって開始または悪化される。

慢性関節リウマチは、炎症性関節が単球および単球由来サイトカインを含む、自己免疫疾患である。単球由来サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子−α）に対する抗体の治療的使用は、疾患の有効な処置である（ＭａｃＤｏｎａｌｄら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００，２４０４（１９９７））。単球由来サイトカインが慢性関節リウマチにおける局所炎症応答を導く主な因子であるというなんらかの考察が存在する（ＭａｃＤｏｎａｌｄら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００，２４０４（１９９７））。ＬＡＩＲ−１およびＦｃγＲＩＩＡまたはＣを架橋するための意図される二重特異性抗体試薬は、慢性関節リウマチを処置する際に有効であると予想される。

（ＩＶ．好酸球のＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）とＦｃγＲＩＩＡまたはＣ（活性化性）とを架橋することによる喘息の処置）
ＦｃγＲＩＩに対する抗体は、ヒト好酸球を活性化することが報告されている。この抗体は、活性化性であると考えられた。なぜなら、これは、好酸球アポトーシスおよび長期の細胞生存を阻害したからであり、そして架橋形態の抗体はまた、好酸球の生存を長期化したからである（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，４２５３（１９９９））。ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）、ＦｃγＲＩＩＡ（活性化性）、およびＦｃγＲＩＩＣ（活性化性）は全て、ヒト好酸球において生じる（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，４２５３（１９９９））。好酸球は、喘息の発症に寄与する（ＢｕｓｓｅおよびＬｅｍａｎｓｋｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４，３５０（２００１）；Ｃｈａｎ−ＹｅｕｎｇおよびＭａｌｏ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３，１０７（１９９５））。

（Ｖ．肥満細胞のＭＡＦＡ（阻害性）とＦｃεＲＩ（活性化性）とを架橋することによるアレルギーの処置）
肥満細胞は、ＭＡＦＡを含む（Ｇｕｔｈｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，９３９７（１９９５））。肥満細胞はまた、ＦｃεＲＩを含む（Ｋａｌｅｓｎｉｋｏｆｆら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４，８０１（２００１））。ＦｃεＲＩは、ＩｇＥについての高親和性レセプターであり、ヒト肥満細胞上で発現される。ＦｃεＲＩを介してのヒト肥満細胞の活性化は、アレルゲン依存性アレルギー応答を担うと考えられ、ここで、この相互作用は、Ｔｈ２環境において生じる（Ｏｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，４７０５（２００１））。肥満細胞の表面上のＩｇＥに対する抗原の結合の際に、ＦｃεＲＩは、架橋されることになり、ここで、架橋は、ヒスタミン、サイトカイン、プロスタグランジン、およびロイコトリエンの分泌をもたらす（ＢｕｓｓｅおよびＬｅｍａｎｓｋｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４，３５０（２００１））。意図される二重特異性抗体は、ＭＡＦＡおよびＦｃεＲＩを架橋して、肥満細胞活性の阻害およびアレルギー応答の処置をもたらすために有用であると考えられる
肥満細胞のＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃεＲＩを結合する二重特異性抗体試薬（Ｈａｍａｎａｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，６１１３（２０００））もまた、アレルギー応答の処置に有用であると予想される。

（ＶＩ．ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）と好中球上のＣＸＣＲ１（活性化性）とを架橋することによる敗血症の処置）
以下の考察は、ＩＬ−８（リガンド）およびＩＬ−８レセプター（ＣＸＣＲ１）に関する。ＣＸＣＲ１は、好中球の活性化レセプターである。ＣＸＣＲ−１は、ＩＬ−８を高親和性で結合するが、他のＣＸＣケモカインを低親和性で結合する。好中球が阻害性レセプターであるＦｃγＲＩＩＢを保有することが報告されている（ＲａｖｅｔｃｈおよびＣｌｙｎｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，４２１（１９９８）；Ｌｏｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，８７５（１９９９））。敗血症では、好中球は、感染に対する防御の望ましい役割を果たす。しかし、好中球はまた、複数器官機能不全症候群および急性呼吸窮迫症候群に寄与する、望ましくない効果を有する（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，２３４１（１９９９））。ＦｃγＲＩＩＢ（不活化）およびＣＸＣＲ１（活性化レセプター）に結合する二重特異性抗体を敗血症の処置のために使用することが意図される。

（ＶＩＩ．ＫＩＲ（阻害性）およびＦｃεＲＩ（活性化性）を架橋する二重特異性抗体による全身性エリテマトーデスの処置）
トランスフェクトされたレセプターを保有する細胞を用いた研究は、抗体カクテルによってＫＩＲ（阻害性）およびＦｃεＲＩ（活性化性）を架橋することが、ＦｃεＲＩ依存性細胞活性化を阻害し得ることを実証した（Ｂｌｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，８９８９（１９９７））。ＫＩＲは、Ｔ細胞上に生じる（Ｂｒｕｈｎｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，３１６８（１９９９））。ＦｃεＲＩもまた、Ｔ細胞上に生じ（ＰｅｔｅｒｓｓｏｎおよびＩｖａｒｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，６６１６（２００１））、ここで、以下の報告は、Ｔ細胞ＦｃεＲＩの活性化が、狼瘡の存在学においてある部分を果たし得ることを示す。全身性エリテマトーデスを有する患者の大部分由来のＴ細胞は、増大したＦｃεＲＩγ発現を示すことが見出されている。簡単に述べると、ＦｃεＲＩγの発現は、正常被験体由来のＴ細胞においてと比較して、上記の疾患を有する患者のＴ細胞において約４倍高かった（Ｅｎｙｅｄｙら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４４，１１１４（２００１）；Ｔｓｏｋｏｓら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１２，３５５（２０００））。ＦｃεＲＩを介した抗原−レセプターシグナル伝達は、狼瘡において異常であることが見出されている（Ｔｓｏｋｏｓら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１２，３５５（２０００））。上記の注釈は、ＦｃεＲＩのγ鎖に適用され、ＦｃεＲＩのγ鎖は、ＩＴＡＭモチーフ（活性化モチーフ）を含み、そしてＴ細胞レセプターと会合する能力を有するようである（Ｅｎｙｅｄｙら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４４，１１１４（２００１））。手短に述べると、特定の条件下では、ＦｃεＲＩのγ鎖は、ＦｃεＲＩとではなく、その代わりに、Ｔ細胞レセプターとともに機能し得る。ＫＩＲ（不活化性）およびＦｃεＲＩ（活性化性）に結合する二重特異性抗体を、狼瘡の処置に用いることが意図される。

（ＶＩＩＩ．ＦｃγＲＩＩＢ（阻害性）およびＢ細胞レセプター（活性化性）を架橋する二重特異性抗体による慢性関節リウマチの処置）
慢性関節リウマチでは、Ｂ細胞は関節に蓄積し、関節では、これらのＢ細胞は、リウマチ因子を産生する。リウマチ因子は、ＩｇＧのＦｃ部分に特異的な抗体からなり、ここで、ＩｇＧは、高親和性型のものである。これらの高親和性リウマチ因子は、慢性関節リウマチの炎症に寄与する（Ｋｙｂｕｒｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３，３１１６（１９９９））。ＦｃγＲＩＩＢおよびＢ細胞レセプターは両方とも、Ｂ細胞上に生じる。Ｂ細胞上のＦｃγＲの主な種は、ＦｃγＲＩＩＢ１であるようである（Ａｓｈｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，５（１９９６））。Ｂ細胞レセプターとＦｃγＲＩＩＢとの架橋は、Ｂ細胞増殖のアポトーシスおよび阻害をもたらす（Ｆｏｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，４４５３（２０００））。ＦｃγＲＩＩＢは関節炎に関連するので、ＦｃγＲＩＩＢの阻害効果は、ＦｃγＲＩＩＢ欠損マウスを用いた研究において実証された。ＦｃγＲＩＩＢ欠損マウスは、コラーゲン誘発性関節炎の重篤度が増大している（Ｙｕａｓａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，１８７（１９９９））。コラーゲン誘発性関節炎は、慢性関節リウマチの、通常用いられる動物モデルである。ＦｃγＲＩＩＢ（不活化性）およびＢ細胞レセプター（活性化性）に結合する二重特異性抗体を関節炎の処置のために用いることが意図される。

（ＩＸ．乾癬の処置のためのＣＤ５（阻害性）およびＴ細胞レセプターの架橋）
Ｔ細胞は、乾癬に寄与すると同定されており、ここで、Ｔ細胞の刺激は、Ｔ細胞レセプターによるペプチドの認識によるであるようである（Ｃｏｓｔｅｌｌｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，２８７８（２００１））。ＣＤ５は、ビオチン化抗ＣＤ５、ビオチン化抗ＣＤ３、およびアビジンから構成されるカクテルを架橋することを用いた研究によって示されるように、Ｔ細胞の阻害性レセプターである（Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｌｌａｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，２９０３（１９９９））。ＣＤ５およびＴ細胞レセプターを認識する二重特異性抗体が、乾癬の処置のために意図される。ＣＤ５およびＣＤ３（Ｔ細胞レセプターの一成分）を認識する二重特異性抗体もまた、乾癬の処置のために意図される。

（Ｘ．乾癬の処置のためのＬＡＩＲ−１（阻害性）およびＴ細胞レセプターの架橋）
Ｔ細胞は、乾癬に寄与すると同定されており、ここで、Ｔ細胞の刺激因子は、Ｔ細胞レセプターによるペプチドの認識を介してであるようである（Ｃｏｓｔｅｌｌｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，２８７８（２００１））。ＬＡＩＲ−１（阻害性）は、Ｔ細胞上に同定されている（Ｍｅｙａａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，５００（１９９９）。Ｔ細胞レセプターおよびＬＡＩＲ−１およびＴ細胞レセプターを認識する二重特異性抗体試薬を、乾癬の処置のために使用することが意図される。

ＫＩＲ（阻害性）は、Ｔ細胞サブセット上に生じる（Ｖｅｌｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，２４８７（２００１））。それゆえ、ＫＩＲおよびＴ細胞レセプターを認識する二重特異性抗体試薬を、乾癬の処置のために用いることが意図される。

（ＸＩ．乾癬の処置のためのＬＡＩＲ−１（阻害性）およびＣＤ２（活性化）の架橋）
ＣＤ２は、Ｔ細胞上に存在する活性化レセプターである（Ｗｉｌｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３，２０６４（１９９９））。上記のように、ＣＤ２は、Ｔ細胞レセプター依存性経路およびＴ細胞レセプター非依存性経路の両方において機能する。ＣＤ２は、乾癬において主な部分を果たすようである。なぜなら、ＣＤ２を標的とする薬物は、この疾患を処置するために用いられ得るからである（Ｅｌｌｉｓら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５，２４８（２００１））。ＬＡＩＲ−１（阻害性）は、Ｔ細胞上で生じる（Ｍｅｙａａｒｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，５８００（１９９９））。ＣＤ２およびＬＡＩＲ−１の両方を認識する二重特異性抗体試薬を乾癬の処置のために使用することが意図される。

ＫＩＲ（阻害性）は、Ｔ細胞サブセット上に生じる（Ｖｅｌｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，２４８７（２００１）；Ｕｈｒｂｅｒｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，３９２３（２００１））。ＣＤ２およびＫＩＲの両方を認識する二重特異性抗体試薬を乾癬の処置のために使用することが意図される。

ＮＫＧ２Ａ（阻害性）は、Ｔ細胞サブセット上に見出され得、ここで、これは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ複合体として生じる（Ｕｈｒｂｅｒｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，３９２３（２００１））。ＣＤ２およびＮＫＧ２Ａの両方を認識する二重特異性抗体試薬を乾癬の処置のために使用することが意図される。

（ＸＩＩ．脱顆粒の刺激およびアッセイ）
肥満細胞を、９６ウェルＦａｌｃｏｎ平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）にプレーティングし、そして１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地中でインキュベートした。細胞を一般に、例えば、抗ｍｕＣＤ２００Ｒ抗体（抗体ＤＸ１０９）、アイソタイプコントロール抗体（ラットＩｇＧ_１）、マウスＣＤ２００ Ｉｇ融合タンパク質（Ｈｏｅｋら，前出）、またはコントロールＩｇ融合タンパク質（０．００２ｍｇ／ｍｌ）の存在下で、２×１０^５細胞／ウェルにてプレーティングした。

ＦｃεＲ（またはＦｃεＲ／ＩｇＥ複合体）をＣＤ２００Ｒａ、ＤＳＰ−１、ＬＡＩＲ−１と同時連結するアッセイでは、マウス抗体およびラット抗体の両方に結合するヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（カタログ番号１１５−００６−０６２，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を０．０２０ｍｇ／ｍｌにて添加した。３７℃でのさらなるインキュベーションは、脱顆粒またはサイトカイン分泌を可能にし、そしてこのインキュベーションを続けた。上清（０．０２ｍｌ）を取り出し、そして基質に対して添加して、脱顆粒または分泌を評価した。

脱顆粒および分泌を、別個の方法によって測定した。脱顆粒を、以下の通りに測定した。上清（０．０２ｍｌ）を、例えば、コントロール抗体または実験抗体を添加した１時間後に取り出し、そして０．１Ｍクエン酸（ｐＨ４．５）中の１．３ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェノール−Ｎ−アセチル−Ｂ−Ｄ−グルコサミド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．０６ｍｌ）に移した。３７℃にて３〜４時間後、０．１ｍｌの停止溶液（０．２Ｍグリシン，０．２ Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ １０．７）を添加し、そしてＡｂｓ_{４０５−６５０}をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を用いて測定した。細胞を、上清の除去後２回洗浄した。サイトカイン分泌を以下の通りに測定した。肥満細胞の上清中に存在する腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。上清を、刺激の１８〜３０時間後に収集した。

（ＸＩＩＩ．ＯＸ２Ｒａ（阻害性）およびＦｃεＲＩ（活性化性）の架橋ならびに肥満細胞の阻害）
マウスＣＤ２００Ｒａは、阻害性レセプターであり、長い細胞質テールを有するが、これは、古典的ＩＴＩＭモチーフを欠く。マウスＣＤ２００Ｒｂ、マウスＣＤ２００Ｒｃ、およびマウスＣＤ２００Ｒｄは活性化性であり、そして短い細胞質テールおよび荷電したアミノ酸をその膜貫通領域に有し、これらは、ＤＡＰ−１２と対を形成し得る。これらのレセプターを誘発することは、種々のサイトカインの分泌をもたらす。ヒトＣＤ２００Ｒｂは、マウスＣＤ２００Ｒｂと同様に、ＤＡＰ−１２と対を形成する。

マウス肥満細胞にＩｇＥを単独で提供することは脱顆粒を刺激し、一方、細胞にＩｇＥおよび抗ＣＤ２００Ｒａを提供すること、ならびにこれらの２つの抗体を架橋することは、脱顆粒を阻害する。ヒトＣＤ２００Ｒａは、マウスＣＤ２００Ｒａに対して相同である。

マウス肥満細胞を、示したように、以下の条件に曝露し、続いて脱顆粒の評価（短期間のインキュベーション）または腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）分泌の評価（長期間のインキュベーション）を行った。培地のみ（０％ ｄｅｇｒａｎ．；０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α）；ＩｇＥのみ（１００％ ｄｅｇｒａｎ．；７．３ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α）；抗ＣＤ２００Ｒａ抗体のみ（０％ ｄｅｇｒａｎ．；０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α）；ＩｇＥ＋抗ＣＤ２００Ｒａ抗体（１００％ ｄｅｇｒａｎ．；７．２ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α）、およびＩｇＥ＋抗ＣＤ２００Ｒａ抗体＋架橋剤ヤギ抗マウスＩｇ（１７％ ｄｅｇｒａｎ．；０．１８ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α）。脱顆粒およびＴＮＦ−α産生を、細胞をそれぞれ１時間および６時間インキュベートした後に測定した。「０」は、再現可能な検出のレベル未満であることを意味する。

（ＸＩＶ．ＣＤ２００Ｒａ（阻害性）およびＦｃεＲＩ（活性化性）の架橋、ならびにヒト肥満細胞の阻害）
ヒト肥満細胞による脱顆粒および分泌を、抗ＩｇＥレセプター抗体（これは、ＩｇＥレセプターに結合する）の添加、抗ＣＤ２００Ｒ抗体（これは、ＣＤ２００Ｒに結合する）の添加、およびヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（これは、抗ＩｇＥ抗体（ＩｇＥレセプターに付着する）および抗ＣＤ２００Ｒ抗体（ＣＤ２００Ｒに付着する）に結合する）の添加を含むプロトコルによって測定した。コントロール実験は、このプロトコルのバリエーションを含んでいた。

臍帯血細胞全体を、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＩＬ−６を補充したＹｓｓｅｌｓ培地中で４〜６週間にわたって培養した。ＩＬ−４およびＩｇＥを、さらに２週間にわたって培養物に添加した。次いで、細胞を、９６ウェル平底プレートにおいて１０^６細胞／ウェルでプレーティングした。次いで、阻害性抗体（抗ＣＤ２００Ｒａ抗体）またはコントロール抗体（マウスＩｇ）を添加した。した。２０分間のインキュベーション後、抗ＩｇＥレセプター抗体を添加して濃度が２０ｎｇ／ｍｌになるようにした。２０分間のさらなるインキュベーション後、ウェルを洗浄し、そして架橋剤（ヤギ抗マウス抗体）を添加した。混合物を１時間にわたってインキュベートし、そして上清を取出し、そしてトリプターゼ放出によって評価したように、脱顆粒アッセイのために用いた。トリプターゼアッセイを、基質Ｎ−α−ベンジル−ＤＬ−アルギニンｐ−ニトロアニリドヒドロクロリド（ＢＡＰＮＡ）を用い、４０５〜５７０ｎｍにて色を測定して行った。

脱顆粒（トリプターゼ放出）は、抗ＩｇＥレセプター抗体およびコントロール抗体（マウスＩｇ）を添加して最大であった。これらの条件下では、最大のトリプターゼ放出は、Ａｂｓ．_{４０５−５７０}＝０．４４〜０．５１をもたらした。コントロール抗体ではなく、抗ＣＤ２００Ｒａを用いたインキュベーションでは、力価測定レベルの抗ＣＤ２００Ｒａ抗体を用いた（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２０００Ｒａ抗体）。異なるレベルの抗体を、別個のインキュベーション混合物において用いた。漸増する抗ＣＤ２００Ｒａ抗体レベルの使用は、トリプターゼ放出の漸増阻害をもたらし、ここで、最大阻害（Ａｂｓ．_{４０５−５７０}＝０．０５）は、約１０００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２００Ｒａ抗体を用いて生じた。最大の２５％のトリプターゼ放出をもたらす阻害は、約２００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２００Ｒａ抗体にて生じた。この結果は、ＣＤ２００ＲａとＩｇＥレセプターとを架橋することがＩｇＥレセプター依存性脱顆粒を防止することを実証する。

（ＸＶ．ＤＳＰ−１（阻害性）およびＦｃεＲＩ（活性化性）の架橋、ならびにヒト肥満細胞の阻害）
細胞を調製し、そして添加した阻害性抗体が、抗ＣＤ２００Ｒ抗体ではなく抗ＤＳＰ−１抗体であること以外は、アッセイを上記（実施例Ｖ）の通りに行った。脱顆粒（トリプターゼ放出）は、抗ＩｇＥレセプター抗体＋コントロール抗体（マウスＩｇ）の添加を用いて最大であった。これらの条件下で、最大のトリプターゼ放出は、Ａｂｓ．_{４０５−５７０}＝０．４４〜０．５１をもたらした。力価測定レベルの抗ＤＳＰ−１抗体を用いた（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ抗ＤＳＰ−１抗体）。異なるレベルの抗ＤＳＰ−１抗体が、別個のインキュベーション混合物において生じた。漸増する抗ＤＳＰ−１レベルの使用は、トリプターゼ放出の漸増的阻害をもたらし、ここで、最大阻害（Ａｂｓ_{４０５−５７０}＝０．０８）は、約４０ｎｇ／ｍｌ抗ＤＳＰ−１抗体、ならびにより高濃度の抗ＤＳＰ−１抗体で生じた。最大の２５％のトリプターゼ放出をもたらす阻害は、約８ｎｇ／ｍｌの抗ＤＳＰ−１抗体にて生じた。この結果は、ＤＳＰ−１とＩｇＥレセプターとの架橋が、ＩｇＥレセプター依存性脱顆粒を防止することを実証する。

（ＸＶＩ．ＬＡＩＲ−１（阻害性）およびＦｃεＲＩ（活性化性）の架橋、ならびにヒト肥満細胞の阻害）
細胞を調製し、そして抗ＬＡＩＲ−１抗体を用いたこと以外は、アッセイを上記（実施例ＶおよびＶＩ）の通りに行った。抗ＬＡＩＲ−１抗体を２つの濃度（０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌ）でのみ用いた。インキュベーションが添加された活性化抗体（抗ＩｇＥレセプター抗体）のみを含んだ場合、トリプターゼ放出は、約Ａｂｓ_{４０５−５７０}＝０．６９（最大と規定される）であった。インキュベーションが活性化抗体（抗ＩｇＥレセプター）＋抗ＬＡＩＲ−１抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）を含んだ場合、トリプターゼ放出が阻害され、そしてこれは最大の約１０％であった（Ａｂｓ_{４０５−５７０}＝０．０７）。抗ＤＳＰ−１を含むかまたは含まず、活性化抗体を含まないコントロールインキュベーションは、全て、非常に少ないトリプターゼ放出をもたらした（Ａｂｓ_{４０５−５７０}＝０．０６）。この結果は、ＬＡＩＲ−１とＩｇＥレセプターとの架橋が、ＩｇＥレセプター依存性脱顆粒を防止することを実証する。

本発明の多くの改変およびバリエーションは、当業者に明らかなように、本発明の目的、趣旨および範囲を保つように、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの工程に適合するようにされ得る。阻害性レセプターおよび活性化レセプターの多くが乱交雑であり、このことは、任意の所定の阻害性レセプターが、種々の異なる活性化レセプターのうちのいずれか１つの活性を阻害し得ること、および任意の所定の活性化レセプターが多数の異なる阻害性レセプターのうちのいずれか１つによって阻害され得ることを意味する。このような全ての改変は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に添付した特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示のためにのみ提供され、そして本発明は、添付の特許請求の範囲が権利を与える等価物の範囲全体とともに、添付の特許請求の範囲の用語によって限定されるべきである；そして本発明は、例示によって本明細書中に提示されている特定の実施形態によって限定されるべきでない。

Claims (11)

1. 細胞活性または活性化レセプター活性を低減するのに使用するための組成物であって、該組成物は、二重特異性抗体を含み、ここで、該二重特異性抗体は、以下：
   （ａ）ＦｃεＲＩ活性化レセプター；および
   （ｂ）ＯＸ２Ｒａ（ＣＤ２００Ｒａ）阻害性レセプター
   に結合する、組成物。
2. 前記二重特異性抗体が、該二重特異性抗体に共有結合的に取り込まれた化学的連結剤を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記二重特異性抗体が、単一ポリペプチド鎖抗体である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記二重特異性抗体が、ヒト化されている、請求項１に記載の組成物。
5. 前記組成物が、前記阻害性レセプターまたは前記活性化レセプターの発現を刺激する因子とともに投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
6. 前記因子が、顆粒球コロニー刺激因子およびインターフェロン−γからなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
7. 前記組成物が、抗炎症剤、化学療法剤、免疫抑制剤、および抗マラリア剤からなる群より選択される治療剤とともに投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
8. 前記抗炎症剤が、コルチコステロイド、グルココルチコイド、可溶性腫瘍壊死因子レセプター、および腫瘍壊死因子に対する抗体からなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
9. 前記化学療法剤が、メトトレキサート、ビンクリスチン、およびシクロホスファミドからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
10. 受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
11. 前記組成物が、インビボにおいてかまたは培養細胞に対して投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。