JP5105485B2 - 変異型Fc領域を有する抗体の同定および工学的改変およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、変異型Fc領域を含む分子、特にポリペプチド、より詳細には免疫グロブリン(例えば、抗体)に関し、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、この変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べてより高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合する。本発明の分子は、疾患、障害または感染に伴う1種または複数の症状を予防、治療または回復するのに特に有用である。本発明の分子は、特に、FcγRによって媒介されるエフェクター細胞機能(例えば、ADCC)の効率が向上することが望ましい疾患または障害、例えば、癌、感染症を治療または予防するのに、またその効果がADCCによって媒介される治療用抗体の治療効率を向上させる上で有用である。
2.1 Fc受容体および免疫系におけるその役割
抗体抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、幅広い一連の応答をもたらし、これは、抗体依存性細胞傷害、肥満細胞脱顆粒、食作用などのエフェクター機能から、例えば、リンパ球増殖および抗体分泌を調節する免疫調節シグナルにまで及ぶ。こうした相互作用はすべて、抗体または免疫複合体のFcドメインが、造血細胞上の特殊化した細胞表面受容体に結合することによって開始される。抗体および免疫複合体によって誘発される細胞応答の多様性は、Fc受容体の構造不均一性から生じる。Fc受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介すると推定される構造的に関係したリガンド結合ドメインを共有する。
このファミリーの各メンバーは、C2セットの免疫グロブリン関連ドメインに関係する細胞外ドメイン、1回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインを有する内在性膜糖タンパク質である。3種のFcγRが知られており、それぞれFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII(CD16)と称される。3種の受容体は異なる遺伝子によってコードされるが、3種のファミリーメンバー間の相同性が高いことは、これらが共通の祖先からおそらく遺伝子重複によって生じたことを示唆する。
FcγRIIタンパク質は、40KDaの内在性膜糖タンパク質であり、単量体モノマーIgに対する親和性が低いので(106M-1)、複合体化したIgGにのみ結合する。この受容体は、最も広く発現されているFcγRであり、単球、マクロファージ、B細胞、NK細胞、好中球、肥満細胞、および血小板を含めたすべての造血細胞上に存在する。FcγRIIは、その免疫グロブリン結合鎖中に免疫グロブリン様領域を2つしか有していないので、IgGに対する親和性がFcγRIよりもはるかに低い。3種のヒトFcγRII遺伝子(FcγRII-A、FcγRII-B、FcγRII-C)が存在し、これらはすべて集合体または免疫複合体のIgGに結合する。
活性化シグナルおよび抑制性シグナルはいずれも、連結後にFcγRを介して伝達される。こうした正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造的相違から生じる。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の2種の異なるドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)または免疫受容体チロシン抑制性モチーフ(ITIM)と呼ばれ、この異なる応答の原因となる。こうした構造に異なる細胞質内酵素が動員されることにより、FcγRによって媒介される細胞応答の結果が決まる。ITAM含有FcγR複合体はFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIAを含むが、ITIM含有複合体はFcγRIIBしか含まない。
2.2.1 癌
新生物または腫瘍は、制御されない異常な細胞増殖から生じる新生物塊であり、良性または悪性であり得る。良性腫瘍は通常、局在化したままである。悪性腫瘍はまとめて癌と称される。用語「悪性」は一般に、腫瘍が、隣接する体構造に侵入し、これを破壊し、離れた部位に広がって死を引き起こす恐れがあることを意味する(総説として、Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122を参照されたい)。癌は、身体の多数の部位で生じ、その起源に応じて異なる挙動を示し得る。癌性細胞は、それが発生した身体の部分を破壊し、次いで身体の(複数の)他の部分に広がり、そこで新たな増殖を開始し、さらに破壊を引き起こす。
現在、癌治療は、患者の新生細胞を根絶するための外科手術、化学療法、ホルモン療法および/または放射線治療を含み得る(例えば、Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", in Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Chapter 12, Section IVを参照されたい)。最近では、癌治療に生物学的療法または免疫療法も含まれると考えられる。こうした手法にはすべて、患者にとって重大な欠点が伴う。例えば、外科手術は、患者の健康状態によって禁忌であるか、または患者にとって容認できないものである可能性もある。さらに、外科手術では、新生物組織が完全に除去されない可能性もある。放射線療法は、放射線に対して新生物組織が正常組織よりも高い感受性を示す場合にのみ有効であり、放射線療法は、しばしば重大な副作用を誘発することがある。ホルモン療法は、単剤として投与されることはまれであり、有効であり得るが、他の治療で癌細胞の大部分を除去した後に癌の再発を予防または遅延するのに使用されることが多い。生物学的療法/免疫療法は数が限定されており、発疹もしくは腫脹、発熱、悪寒および疲労を含めたインフルエンザ様症状、消化管問題、またはアレルギー反応などの副作用を生じる恐れがある。
炎症は、身体の白血球および化学物質が細菌、ウイルスなどの生体異物による感染から我々の身体を防御する過程である。炎症は通常、患部の疼痛、腫脹、温感および発赤を特徴とする。サイトカインおよびプロスタグランジンとして知られる化学物質がこの過程を制御し、規則正しく自己限定的なカスケードで血液または患部組織中に放出される。この化学物質の放出は、傷害または感染の部位への血流を増加させ、発赤および温感をもたらすこともある。この化学物質の中には、組織中への体液の漏出を引き起こして腫脹をもたらすものもある。この防御過程は、神経を刺激し、疼痛を引き起こす恐れがある。こうした変化は、関連する部位で限定された期間に起こると身体の有益に働く。
疾患を引き起こす病原体は、5つの群:ウイルス、細菌、真菌、原生動物および蠕虫(寄生虫)に分類される。こうした病原体の注目すべき変種は、適応免疫の2種の決定的な特徴の自然選択をもたらした。第一に、広範囲の様々な病原体を認識することができる利点が、同等またはそれ以上の多様性を有するB細胞およびT細胞上の受容体を発達させた。第二に、病原体の異なる生息地および生活環が、ある範囲の異なるエフェクター機構によって妨害されなければならない。各病原体の特性は、その伝染様式、その複製機構、その病因またはそれが疾患を引き起こす手段、およびそれが誘発する応答である。
本発明は、酵母ディスプレイ法を使った、FcγR受容体(例えば、活性化FcγR、抑圧性FcγR)に対する親和性が改変された突然変異型ヒトIgG1重鎖Fc領域の同定に一部基づいている。in vivo動物モデリングおよび臨床的実験により、Fc領域は、モノクローナル抗体療法の結果を判定する上で必須の役割を果たすことが示される。治療用モノクローナル抗体およびFc領域に融合した可溶性ポリペプチドにおけるFc領域機能(例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)活性)を最適化する現在の手法は、構造解析および/またはコンピュータ支援設計に基づく限定された数の単一アミノ酸変化に焦点を当てている。Fc領域を工学的に改変する際の代替の手法は、Fc領域機能を最適化するためのFc領域のグリコシル化に焦点を当てている。本発明は部分的に、Fc変異型の無作為のライブラリーから可能な突然変異体を、それだけには限定されないがADCC、CDCなどの、1種または複数のFc機能活性の改変について選択することに基づく。本発明は、Fc領域を工学的に改変し、構造的試験によって同定された期待される領域の外側で新規Fc変異体を同定およびスクリーニングするための方法を提供する。期待される領域は、本明細書では、構造的および/または生化学的試験に基づいて、Fcリガンドと接触する領域を指す。
ロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および292位でのプロリンによる置換、または243位でのロイシンによる置換、または273位でのフェニルアラニンによる置換である、1つまたは複数のアミノ酸改変を有する。関連する実施形態では、変異型Fc領域は、下記の表5、6、7および8で開示される1つまたは複数アミノ酸改変をさらに含む。
プロリンによる、および300位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および292位でのプロリンによる置換、または243位でのロイシンによる置換、または273位でのフェニルアラニンによる置換を含む。関連する実施形態では、変異型Fc領域は、下記の表5、6、7および8で開示される1つまたは複数アミノ酸改変をさらに含む。
本明細書では、用語「Fc領域」は、IgG重鎖のC末端領域を定義するために使用される。境界はわずかに変化し得るが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、Cys226からカルボキシ末端に及ぶと定義される。IgGのFc領域は、2つの定常ドメイン、CH2およびCH3を含む。ヒトIgG Fc領域のCH2ドメイン(「Cγ2」ドメインとも称される)は通常、アミノ酸231からアミノ酸338までにある。ヒトIgG Fc領域のCH3ドメインは通常、アミノ酸342から447までにある。CH2ドメインは、別のドメインと密接に対合していないという点で独特である。それどころか、完全な天然IgGの2つのCH2ドメイン間に、2つの分枝したN結合型糖鎖が介在している。
本発明は、変異型Fc領域を含み、その改変がFcγRに対する前記変異型Fc領域の親和性を改変する、例えば、増大させるまたは減少させる、1つまたは複数の領域に1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換であるが、挿入または欠失も含む)を有する分子、好ましくはポリペプチド、さらに好ましくは免疫グロブリン(例えば、抗体)に関する。いくつかの実施形態では、2004年1月9日出願の米国特許出願第10/754,922号、2003年1月9日出願の米国特許仮出願第60/439,498号、2003年3月19日出願の米国特許仮出願第60/456,041号、2003年10月23日出願の米国特許仮出願第60/514,549号、2004年7月12日出願の米国特許仮出願第60/587,251号に開示された改変のいずれも含むがこれに限定されることはない前記Fc領域への改変を含む。上記出願のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、Fc-FcγR相互作用を決定するための当業者に公知の方法および本明細書に開示の方法、例えば、ELISAアッセイまたは表面プラズモン共鳴アッセイにより決定した場合、その変異型Fc領域が、変異型Fc領域はあるが前記1つまたは複数のアミノ酸改変を有していない前記分子と同じであり、前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて大きな親和性でFcγRIIIAに結合する分子を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が前記野生型Rc領域を含む比較可能な分子と比べて低下した親和性でFcγRIIIAに結合する分子を包含する。好ましい実施形態では、本発明の分子は、前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIBに結合するよりも低い親和性で、さらに特異的にFcγRIIBに(前記Fc領域を介して)結合する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて大きな親和性でFcγRIIIAおよびFcγRIIBに結合する分子を包含する。他の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて大きな親和性でFcγRIIBに結合する分子を包含する。別の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、その変異型Fc領域が前記野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて低下した親和性でFcγRIIBに結合する分子を包含する。
ロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および292位でのプロリンによる置換、または243位でのロイシンによる置換、または273位でのフェニルアラニンによる置換である、1つまたは複数のアミノ酸改変を有する。
本発明は、酵母ディスプレイ法を使った、異なるFcγR受容体に対する親和性が改変された突然変異型ヒトIgG1重鎖Fc領域の同定に一部基づいている。したがって、本発明は分子、好ましくはポリペプチド、およびさらに好ましくは、1つまたは複数の領域に、その改変がFcγRに対する変異型Fc領域の親和性を改変する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換、しかし挿入または欠失も含む)を有する変異型Fc領域を含む免疫グロブリン(例えば、抗体)に関する。
本発明は、1つまたは複数の領域で1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、そのような改変が活性化FcγRに対する変異型Fc領域の親和性を改変する変異型Fc領域を含む分子を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域で1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも2倍増大させる変異型Fc領域を含む。別の特定の実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域で1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有し、その改変がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて2倍よりも多く増大させる変異型Fc領域を含む。本発明の他の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する前記変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、または10倍増大させる。本発明のさらに別の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する前記変異型Fc領域の親和性を、野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、または10倍減少させる。そのような倍増は、好ましくはELISAまたは表面プラズモン共鳴アッセイにより決定される。特定の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、いずれのアミノ酸でも329位、331位もしくは322位のいずれか1つで置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。ある実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、256位、290位、298位、312位、333位、334位、359位、360位、もしくは430位のアラニンのいずれか1つによる、330位でのリシンによる、339位でのスレオニンによる、320位でのメチオニンによる、326位でのセリン、アスパラギン、アスパラギン酸、もしくはグルタミン酸による、334位でのグルタミン、グルタミン酸、メチオニン、ヒスチジン、バリン、もしくはロイシンによる置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。別の特定の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、280位、290位、300位、294位、もしくは295位のいずれかで置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。別のさらに特定の実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、300位でのロイシンもしくはイソロイシンによる、295位でのリシンによる、294位でのアスパラギンによる、298位でのバリン、アスパラギン酸プロリン、アスパラギン、もしくはバリンによる、280位でのヒスチジン、グルタミン、もしくはチロシンによる、290位でのセリン、グリシン、セオニン、もしくはチロシンによる置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。
IIAに結合するように、前記変異型Fc領域が316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約1倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が315位でのイソロイシンによる、379位でのメチオニンによる、および399位でのグルタミン酸による置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約2.5倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が243位でのイソロイシンによる、379位でのロイシンによる、および420位でのバリンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約3倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が247位でのロイシンによる、および421位でのリシンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約4.5倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換を含む、分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子であって、ELISAアッセイにより決定される場合、前記分子が、野生型Fc領域を含む比較可能な分子がFcγRIIIAに結合するよりも約1.5倍高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域が293位でのバリンによる、295位でのグルタミン酸による、および327位でのスレオニンによる置換を含む、分子を包含する。
特定の実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域に1つまたは複数のアミノ酸改変(すなわち、置換)を有し、その1つまたは複数の改変が、FcγRIIIAおよびFcγRIIBに野生型の親和性で結合する野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べて、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増大させ、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を減少させる変異型Fc領域を含む。ある実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、256位、298位、333位、334位、280位、290位、294位、298位、もしくは296位のいずれかでアラニンによる置換、または298位でのアスパラギン、バリン、アスパラギン酸、もしくはプロリンによる置換、または290位でのセリンによる置換を1個だけ含むことはなく、または1個だけの置換ではない。ある実施形態では、前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、FcγRIIIAに対する変異型Fc領域の親和性を少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%増大させ、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%減少させる。
本発明は、1つまたは複数のアミノ酸改変を有し、その改変がFcγRIIIAおよびFcγIIBに対する変異型Fc領域の親和性を、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%増大させ、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%減少させる、変異型Fc領域を含む分子を包含する。特定の実施形態では、(ELISAアッセイおよび/またはch-4-4-20抗体を使ったADCCベースのアッセイ、もしくは、本明細書に記載の変異型Fc領域を坦持するキメラ4D5抗体を使った表面プラズモン共鳴アッセイに基づいて決定される場合)、FcγRIIIAに対する親和性は増強されFcγRIIBに対する親和性は増強された変異型Fc領域を含む本発明の分子は、415位でのイソロイシンによる、および251位でのフェニルアラニンによる置換、または399位でのグルタミン酸による、292位でのロイシンによる、および185位でのメチオニンによる置換、または408位でのイソロイシンによる、215位でのイソロイシンによる、および125位でのロイシンによる置換、または385位でのグルタミン酸による、および247位でのヒスチジンによる置換、または348位でのメチオニンによる、334位でのアスパラギンによる、275位でのイソロイシンによる、202位でのメチオニンによる、および147位でのスレオニンによる置換、または246位でのスレオニンによる、および396位でのヒスチジンによる置換、または268位でのアスパラギン酸による、および318位でのアスパラギン酸による置換、または288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または244位でのヒスチジンによる、358位でのメチオニンによる、379位でのメチオニンによる、384位でのリシンによる、および397位でのメチオニンによる置換、または217位でのセリンによる、378位で
のバリンによる、および408位でのアルギニンによる置換、または247位でのロイシンによる、253位でのアスパラギンによる、および334位でのアスパラギンによる置換、または246位でのイソロイシンによる、および334位でのアスパラギンによる置換、または320位でのグルタミン酸による、および326位でのグルタミン酸による置換、または375位でのシステインによる、および396位でのロイシンによる置換、または343位でのセリンによる、353位でのロイシンによる、375位でのイソロイシンによる、および383位でのアスパラギンによる置換、または394位でのメチオニンによる、および397位でのメチオニンによる置換、または216位でのアスパラギン酸による、345位でのリシンによる、および375位でのイソロイシンによる置換、または288位でのアスパラギンによる、330位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または247位でのロイシンによる、および389位でのグリシンによる置換、または222位でのアスパラギンによる、335位でのアスパラギンによる、370位でのグルタミン酸による、378位でのバリンによる、および394位でのメチオニンによる置換、または316位でのアスパラギン酸による、378位でのバリンによる、および399位でのグルタミン酸による置換、または315位でのイソロイシンによる、379位でのメチオニンによる、および394位でのメチオニンによる置換、または290位でのスレオニンによる、および371位でのアスパラギン酸による置換、または247位でのロイシンによる、および398位でのグルタミンによる置換、または326位でのグルタミンによる、334位でのグルタミン酸による、359位でのアスパラギンによる、および366位でのセリンによる置換、または247位でのロイシンによる、および377位でのフェニルアラニンによる置換、または378位でのバリンによる、390位でのイソロイシンによる、および422位でのイソロイシンによる置換、または326位でのグルタミン酸による、および385位でのグルタミン酸による置換、または282位でのグルタミン酸による、369位でのイソロイシンによる、および406位でのフェニルアラニンによる置換、または397位でのメチオニンによる、411位でのアラニンによる、および415位でのアスパラギンによる置換、または223位でのイソロイシンによる、256位でのセリンによる、および406位でのフェニルアラニンによる置換、または298位でのアスパラギンによる、および407位でのアルギニンによる置換、または246位でのアルギニンによる、298位でのアスパラギンによる、および377位でのフェニルアラニンによる置換、または235位でのプロリンによる、382位でのメチオニンによる、304位でのグリシンによる、305位でのイソロイシンによる、および323位でのイソロイシンによる置換、または247位でのロイシンによる、313位でのアルギニンによる、および388位でのグリシンによる置換、または221位でのチロシンによる、252位でのイソロイシンによる、330位でのグリシンによる、339位でのスレオニンによる、359位でのアスパラギンによる、422位でのイソロイシンによる、および433位でのロイシンによる置換、または258位でのアスパラギン酸による、および384位でのリシンによる置換、または241位でのロイシンによる、および258位でのグリシンによる置換、または370位でのアスパラギンによる、および440位でのアスパラギンによる置換、または317位でのアスパラギンによる置換、および423位での欠失、または243位でのイソロイシンによる、379位でのロイシンによる、および420位でのバリンによる置換、または227位でのセリンによる、および290位でのグルタミン酸による置換、または231位でのバリンによる、386位でのヒスチジンによる、および412位でのメチオニンによる置換、または215位でのプロリンによる、274位でのアスパラギンによる、287位でのグリシンによる、334位でのアスパラギンによる、365位でのバリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または293位でのバリンによる、295位でのグルタミン酸による、および327位でのスレオニンによる置換、または319位でのフェニルアラニンによる、352位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または392位でのスレオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または268位でのアスパラギンによる、および396位でのロイシンによる置換、または290位でのスレオニンによる、390位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または326位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または268位でのアスパラギン酸による、および396位でのロイシンによる置換、または210位でのメチオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または358位でのプロリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または288位でのアルギニンによる、307位でのアラニンによる、344位でのグルタミン酸による、および396位でのロイシンによる置換、または273位でのイソロイシンによる、326位でのグルタミン酸による、328位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または326位でのイソロイシンによる、408位でのアスパラギンによる、および396位でのロイシンによる置換、または334位でのアスパラギンによる、および396位でのロイシンによる置換、または379位でのメチオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または227位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または217位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または261位でのアスパラギンによる、210位でのメチオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または419位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換、または370位でのグルタミン酸による、および396位でのロイシンによる置換、または242位でのフェニルアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または255位でロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または240位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または250位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または247位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または410位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換、または419位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または427位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または258位でのアスパラギン酸による、および396位でのロイシンによる置換、または384位でのリシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または323位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または244位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換、または305位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または400位でのフェニルアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または303位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、378位でのアスパラギン酸による、404位でのセリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または290位でのグルタミン酸による、369位でのアラニンによる、393位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または210位でのアスパラギンによる、222位でのイソロイシンによる、320位でのメチオニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または217位でのセリンによる、305位でのイソロイシンによる、309位でのロイシンによる、390位でのヒスチジンによる、および396位でのロイシンによる置換、または246位でのアスパラギンによる、419位でのアルギニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または217位でのアラニンによる、359位でのアラニンによる、および396位でのロイシンによる置換、または215位でのイソロイシンによる、290位でのバリンによる、および396位でのロイシンによる置換、または275位でのロイシンによる、362位でのヒスチジンによる、384位でのリシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または334位でのアスパラギンによる置換、または400位でのプロリンによる置換、または407位でのイソロイシンによる置換、または372位でのチロシンによる置換、または366位でのアスパラギンによる置換、または414位でのアスパラギンによる置換、または352位でのロイシンによる置換、または225位でのセリンによる置換、または377位でのアスパラギンによる置換、または248位でのメチオニンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、305位でのイソロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、292位でのプロリンによる、300位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または243位でのロイシンによる、および396位でのロイシンによる置換、または292位でのプロリンによる、および305位でのイソロイシンによる置換を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含み、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、当技術分野で公知のおよび本明細書で開示している標準的アッセイにより決定する場合、その変異型Fc領域が野生型Fc領域を含む比較可能な分子と比べてどのFcγRにも結合しない、分子を包含する。特定の実施形態では、すべてのFcγRへの結合を無効にする前記1つまたは複数のアミノ酸改変は、232位でのセリンによる、および304位でのグリシンによる置換、または269位でのリシンによる、290位でのアスパラギンによる、311位でのアルギニンによる、および433位でのチロシンによる置換、または252位でのロイシンによる置換、または216位でのアスパラギン酸による、334位でのアルギニンによる、および375位でのイソロイシンによる置換、または247位でのロイシンによる、および406位でのフェニルアラニンによる置換、または335位でのアスパラギンによる、387位でのセリンによる、および435位でのグルタミンによる置換、または334位でのグルタミン酸による、380位でのアスパラギン酸による、および446位でのバリンによる置換、または303位でのイソロイシンによる、369位でのフェニルアラニンによる、および428位でのロイシンによる置換、または251位でのフェニルアラニンによる、および372位でのロイシンによる置換、または246位でのグルタミン酸による、284位でのメチオニンによる、および308位でのアラニンによる置換、または399位でのグルタミン酸による、および402位でのアスパラギン酸による置換、または399位でのグルタミン酸による、および428位でのロイシンによる置換を含む。
本発明は、エフェクター機能が改変されたFc変異体を含む免疫グロブリンを包含する。いくつかの実施形態では、Fc変異体を含む免疫グロブリンは、当技術分野で公知のおよび本明細書で例証されているアッセイ法を使って決定した場合、エフェクター細胞の存在の下ではエフェクター機能をより効果的に媒介する。他の実施形態では、Fc変異体を含む免疫グロブリンは、当技術分野で公知のおよび本明細書で例証されているアッセイ法を使って決定した場合、エフェクター細胞の存在の下ではエフェクター機能をより非効果的に媒介する。特定の実施形態では、本発明のFc変異体は、組合せが相加的、相乗的効果を有するように、エフェクター機能を改変する他の既知のFc改変と組み合わせてもよい。本発明のFc変異体は、in vitroおよび/またはin vivoにおいてエフェクター機能を改変している。
有する。いくつかの実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増強された本発明の免疫グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンよりも、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍高い補体依存性細胞傷害を有する。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDTYPNYNKKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYSGMDYWGQGTTVTVSS(配列番号3)
を含むVH鎖および/またはVHドメインを有する。
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKEVSESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEIK(配列番号8)
を含むVL鎖および/またはVLドメインを有する。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDTYPNYNKKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYSGMDYWGQGTTVTVSS(配列番号3):
を含むVH鎖および/またはVHドメイン、ならびに、アミノ酸配列(H2B6VL-5):
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKEVSESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEIK(配列番号8):
を含むVL鎖および/またはVLドメインを有する。
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCEASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRNKAKNHATYYAESVIGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCGALGLDYWGQGTTLTVSS(配列番号9)
を含むVHドメインおよび/またはVH鎖を有する。
DIQMTQSPSSLLAALGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSESGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYFSYPLTFGAGTKLELK(配列番号10)
を含むVLドメインおよび/またはVL鎖を有する。
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCEASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRNKAKNHATYYAESVIGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCGALGLDYWGQGTTLTVSS(配列番号9、図2参照)
を含むVHドメインおよび/またはVH鎖、ならびにアミノ酸配列(8B5.3.4 VL、図1参照):
DIQMTQSPSSLLAALGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSESGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYFSYPLTFGAGTKLELK(配列番号10)
を含むVLドメインおよび/またはVL鎖を有する。
変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、ポリペプチド、抗体)は、融合タンパク質を作製するために、異種ポリペプチド(すなわち、無関係なポリペプチド、またはその部分、好ましくは前記ポリペプチドの少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100アミノ酸)に組換えで融合させても、または化学的にコンジュゲートさせ(共有結合的および非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む)てもよい。前記融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して起きてもよい。
好ましい実施形態では、改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、好ましくは高処理能の形で、1つまたは複数の生化学に基づくアッセイと組み合わせた本明細書に記載の酵母ディスプレイ技術を使用して行われる。1つまたは複数の生化学アッセイは、それだけに限らないが、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析を含めて、Fc-FcγR相互作用、すなわちFc領域とFcγRの特異的結合の同定について当技術分野で知られている任意のアッセイでよい。いくつかの実施形態では、改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、好ましくは高処理能の形で、1つまたは複数の機能に基づくアッセイと組み合わせた本明細書に記載の酵母ディスプレイ技術を使用して行われる。機能に基づくアッセイは、本明細書の第5.2.7節に記載のものなどの1つまたは複数のFcγR媒介性エフェクター細胞機能の特徴付けについて当技術分野で知られている任意のアッセイでよい。本発明の方法に従って使用することができるエフェクター細胞機能の非限定的な例には、それだけに限らないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性食作用、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、C1q結合、および補体依存性細胞媒介性細胞傷害がある。いくつかの実施形態では、改変されたFcγR親和性(例えば、増強されたFcγRIIIA親和性)を有する変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、好ましくは高処理能の形で、1つまたは複数の機能に基づくアッセイと組み合わせたまたはそれと並行した1つまたは複数の生化学に基づくアッセイと組み合わせた本明細書に記載の酵母ディスプレイ技術を使用して行われる。
ロープ抗原を含めたウイルスによって誘導される腫瘍抗原などの細胞表面抗原の腫瘍特異的移植型(TSTA)、結腸のCEAなどの癌胎児性抗原α-フェトプロテイン、膀胱癌癌胎児性抗原(Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188)、ヒト肺癌抗原L6、L20などの分化抗原(Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46: 3917-3923)、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141:1398-1403)、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、EGFR(上皮成長因子受容体)などの乳癌抗原、HER2抗原(p185HER2)、多型上皮ムチン(PEM)(Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359)、悪性ヒトリンパ球抗原APO-1(Bernhard et al., 1989, Science 245: 301-304)、胎児赤血球中に認められるI抗原、成体赤血球、着床前胚中に認められる初期内胚葉I抗原、胃腺癌中に認められるI(Ma)、乳房上皮中に認められるM18、M39、骨髄球中に認められるSSEA-1、結腸直腸癌中に認められるVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22、TRA-1-85(血液型H)、結腸腺癌中に認められるC14、肺腺癌中に認められるF3、胃癌中に認められるAH6、Yハプテン、胚性癌細胞中に認められるLey、TL5(血液型A)、A431細胞中に認められるEGF受容体、膵癌中に認められるE1シリーズ(血液型B)、胚性癌細胞中に認められるFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中に認められるCO-514(血液型Lea)、腺癌中に認められるNS-10、CO-43(血液型Leb)、A431細胞のEGF受容体中に認められるG49、結腸腺癌中に認められるMH2(血液型ALeb/Ley)、結腸癌中に認められる19.9、胃癌ムチン、骨髄球中に認められるT5A7、黒色腫中に認められるR24、4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8、ならびに4〜8細胞期胚中に認められるSSEA-3およびSSEA-4などの分化抗原(Feizi, 1985, Nature 314: 53-57)を含めた癌または腫瘍抗原に特異的に結合することができる。一実施形態では、抗原は、皮膚T細胞リンパ腫のT細胞受容体由来ペプチドである(Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62を参照されたい)。
標)(Elan); ヒト抗CD64(FcγR)抗体であるMDX-33(Medarex/Centeon);; ヒト化抗IgE IgG1抗体であるrhuMab-E25(Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems); 霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152(IDEC Pharm); マウス抗CD-147 IgM抗体であるABX-CBL(Abgenix); ラット抗CD2 IgG抗体であるBTI-322(Medimmune/Bio Transplant); マウス抗CD3 IgG2a抗体であるOrthoclone/OKT3(Ortho Biotech); キメラ抗CD25 IgG1抗体であるSIMULECT(商標)(Novartis Pharm); ヒト化抗β2-インテグリンIgG抗体であるLDP-01(LeukoSite); マウス抗CD18F(ab')2であるAnti-LFA-1(Pasteur-Merieux/Immunotech); ヒト抗TGF-β2抗体であるCAT-152(Cambridge Ab Tech); およびキメラ抗第VII因子抗体であるCorsevin M(Centocor)である。
本発明は、それだけに限らないが、コンピュータによる設計戦略、ライブラリー生成方法、ならびに実験的作製およびスクリーニング方法を含めたFc変異体を生成する工学的改変方法を包含する。これらの戦略を個々にまたは様々な組合せで適用して、本発明のFc変異体を工学的に改変することができる。
変異型Fc領域を含む本発明の分子とFcγRの結合を決定するためにFcγR-Fc結合アッセイを開発し、それによって、そのリガンドについての受容体の親和性が本質的に弱く、例えばFcγRIIBおよびFcγRIIIAについてはμM程度であるにもかかわらず、相互作用の検出および定量が可能となった。その方法では、非複合体化FcγRと比べてFc領域についての高い結合活性を有するFcγR複合体を形成する。本発明によれば、好ましい分子複合体は、(a)FcγRの可溶性領域(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIAまたはFcγRIIBの可溶性領域); (b)FcγRの可溶性領域(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIAまたはFcγRIIBの可溶性領域)のC末端に作動可能に連結したビオチン化15アミノ酸AVITAG配列(AVITAG); および(c)ストレプトアビジン-フィコエリスリン(SA-PE)を、四量体FcγR複合体を形成するモル比で(好ましくは5:1のモル比で)含む四量体免疫複合体である。本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、15アミノ酸AVITAG配列中のリシン残基を特異的にビオチン化する大腸菌Bir A酵素というビオチンリガーゼを使用して融合タンパク質を酵素によりビオチン化する。本発明の特定の実施形態では、融合タンパク質の85%をビオチン化し、それは、ストレプトアビジンシフトアッセイを含むがそれだけに限らない、当業者に知られている標準的な方法によって決定される。本発明の好ましい実施形態によれば、ビオチン化可溶性FcγRタンパク質をSA-PEと1× SA-PE:5×ビオチン化可溶性FcγRのモル比で混合して四量体FcγR複合体を形成する。
IgG FcとFc受容体の分子相互作用は、構造的な技術と遺伝的な技術の両方によって以前から研究されている。これらの研究から、異なるFcγRとFcの機能的結合に決定的に重要なアミノ酸残基が同定された。これらの変化のうち、動物モデルにおいて治療用抗体のヒトFcγR媒介性効果を高めることが示されているものはない。これらの残基または他の潜在的に重要な残基での潜在的なアミノ酸変化すべての完全な分析は報告されていない。本明細書に記載の基盤(platform)は、すべての考えられるアミノ酸変化を有する突然変異ライブラリーを両方とも構築し、複数の機能アッセイを使用してライブラリーをスクリーニングし、関連するヒト化動物モデルで最後にライブラリーを分析する能力がある。
改変されたFcγR親和性(すなわち、増強されたFcγRIIIA親和性および/またはFcγRIIA)を有する変異型Fc領域を含む分子をスクリーニングおよび同定する好ましい方法は酵母表面ディスプレイ技術(総説については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているBoder and Wittrup, 2000, Methods in Enzymology, 328: 430-444を参照されたい)であり、それは、細胞外翻訳後修飾タンパク質の結合相互作用についてスクリーニングする従来技術の欠陥に対処するものである。具体的には、酵母表面ディスプレイは遺伝学的方法であり、それによって、Fc突然変異体を含むポリペプチドが、FcγRとの相互作用に利用可能な形で酵母細胞壁上に発現される。本発明の突然変異型Fc含有ポリペプチドの酵母表面ディスプレイは、当業者に知られている技術のいずれかに従って行うことができる。すべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第6,423,538号; 第6,114,147号; および第6,300,065号を参照されたい。Boder et al., 1997 Nat. Biotechnol., 15:553-7; Boder et al., 1998 Biotechnol. Prog., 14:55-62; Boder et al., 2000 Methods Enzymol., 328:430-44; Boder et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97:10701-5; Shusta et al., 1998 Nat. Biotechnol., 1998, 16:773-7; Shusta et al., 1999 J. Mol. Biol., 292:949-56; Shusta et al., 1999 Curr. Opin. Biotechnol., 10:117-22; Shusta et al., 2000 Nat. Biotechnol., 18:754-9; Wittrup et al., 1994 Ann. N.Y. Acad. Sci., 745:321-30; Wittrup et al., 1994 Cytometry, 16:206-13; Wittrup, 1995 Curr. Opin. Biotechnol., 6:203-8; Wittrup, 1999 Trends Biotechnol., 17:423-4; Wittrup, 2000 Nat. Biotechnol., 18:1039-40; Wittrup, 2001 Curr. Opin. Biotechnol., 12:395-9を参照されたい。
3特異的)を使用して検出される。他の実施形態では、本発明のFc融合タンパク質の存在は、当業者に知られている技術を使用するエピトープタグの免疫蛍光標識によって検出される。部分的にタンパク質分解された形で細胞壁上に融合タンパク質が提示されるどうかを検出する内部標準として、Fc融合タンパク質をコードする核酸に隣接するエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を使用することは、本発明の方法で特に有用である。
本発明は、それだけに限らないが、細胞に基づくアッセイ、溶液に基づくアッセイ、および固相に基づくアッセイを含めた免疫学に基づくアッセイを使用して、酵母ディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを包含する。
本発明は、第5.2.3節に記載の方法による、酵母表面細胞壁上に提示された突然変異型Fc融合タンパク質の特徴付けを包含する。本発明の一態様は、所望される結合特性、具体的には、突然変異型Fc融合タンパク質の、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合する能力を有する突然変異型Fc融合タンパク質を選択する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、所望される結合特性、具体的には、突然変異型Fc融合タンパク質の、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合するより大きい親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合する能力、さらに、突然変異型Fc融合タンパク質の、野生型Fc領域を含む比較可能なポリペプチドがFcγRIIBと結合するより低い親和性でFcγRIIBと結合する能力を有する突然変異型Fc融合タンパク質を選択する方法を提供する。任意の所望の結合特性を有する、分子のFc領域中での任意の突然変異の同定およびスクリーニングに本発明の方法を使用できることが当業者には理解されるであろう。
当技術分野で知られている様々な配列決定反応のいずれかを使用して、変異型Fc領域を含む本発明の分子の配列を直接決定することができる。配列決定反応の例には、MaximおよびGilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:560, 1977)またはSanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463, 1977)によって開発された技術に基づくものがある。質量分析による配列決定を含めて(例えば、PCT国際公開第94/16101号、Cohen et al., Adv. Chromatogr., 36:127-162, 1996、およびGriffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 38:147-159, 1993を参照されたい)、様々な自動化配列決定手順のいずれかを利用することができる(Bio/Techniques, 19:448, 1995)ことも企図される。
本発明は、分子のエフェクター細胞機能を同定する、当技術分野で知られているアッセイを使用した、本発明の分子(例えば、上記に記載の酵母ディスプレイ技術によって同定された変異型Fc領域を含む抗体; または本発明の方法に従って工学的に改変された治療用モノクローナル抗体)の特徴付けを包含する。具体的には、本発明は、FcγR媒介性エフェクター細胞機能についての本発明の分子の特徴付けを包含する。本発明に従ってアッセイを行うことができるエフェクター細胞機能の例には、それだけに限らないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、C1q結合、および補体依存性細胞媒介性細胞傷害がある。エフェクター細胞機能活性を決定する、当業者に知られている任意の細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイを使用することができる(エフェクター細胞アッセイについては、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44(10): 841-8; Lehmann et al., 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al., 1990 J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al., 1998, Immunity 8:403-411を参照されたい)。
当技術分野で知られている、表面プラズモン共鳴に基づく任意のアッセイを使用して変異型Fc領域を含む本発明の分子のアッセイを行って、Fc-FcγR相互作用の結合の動態パラメーターを特徴付けることもできる。それだけに限らないが、Biacore AB (Uppsala, Sweden)から入手可能なBIAcore機器; Affinity Sensors (Franklin, MA.)から入手可能なIAsys機器; Windsor Scientific Limited (Berks, UK)から入手可能なIBISシステム、Nippon Laser and Electronics Lab (Hokkaido, Japan)から入手可能なSPR-CELLIAシステム、およびTexas Instruments (Dallas, TX)から入手可能なSPR Detector Spreetaを含めた市販されている任意のSPR機器を本発明で使用することができる。SPRに基づく技術の総説については、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61を参照されたい。さらに、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第6,373,577号; 第6,289,286号; 第5,322,798号; 第5,341,215号; 第6,268,125号に記載のタンパク質とタンパク質の相互作用を測定するSPR機器およびSPRに基づく方法のいずれかが本発明の方法で企図される。
5.3.1 本発明の分子をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の方法によって同定された本発明のポリペプチドおよび抗体を含めた分子をコードするポリヌクレオチドをも含む。当技術分野で知られている任意の方法によって、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを得、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。
本発明の分子(すなわち、抗体)をコードする核酸配列を得た後、分子を産生するベクターを、当技術分野で周知の技術を使用して、組換えDNA技術によって作製することができる。当業者に周知である方法を使用して、本発明の分子のコード配列ならびに適当な転写および翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、および in vivo遺伝子組換えがある(例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照されたい)。
本発明は、疾患、障害、または感染に関係する、1つまたは複数の症状を予防、治療、または回復するために、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトに、本発明の1種または複数の分子(例えば、抗体)を投与することを包含する。本発明の分子は、FcγRによって媒介されるエフェクター細胞機能(例えば、ADCC)の効力の増強が望ましい疾患または障害の治療または予防に特に有用である。本発明の方法および組成物は、原発性または転移性腫瘍性疾患(すなわち癌)および感染性疾患の治療または予防に特に有用である。本発明の分子は、当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている、薬学的に許容される組成物中に提供することができる。以下に詳述するように、本発明の分子は、癌(特に受動免疫療法において)、自己免疫疾患、炎症性障害または感染性疾患を治療または予防する方法において用いることができる。
本発明は、治療上有効量の、変異型Fc領域を含む1種または複数の分子を対象に投与することを含む、対象における癌または転移の治療または予防のための方法および組成物を包含する。
本発明はさらに、それだけに限らないが、現在標準的で実験的な化学療法、ホルモン療法、生物療法、免疫療法、放射線療法、または外科手術を含めた、癌の治療または予防について当業者に知られている他の療法と組み合わせて、本発明の分子を投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、治療または予防的有効量の1種または複数の抗癌剤、治療用抗体(例えば、表9に列挙した抗体)、または癌の治療および/または予防について当業者に知られている他の薬剤(節5.4.1.2を参照)と組み合わせて投与することができる。
特定の実施形態では、本発明の方法は、癌の治療および/または予防に用いられる1種または複数の治療剤とともに、1種または複数の本発明の分子を投与することを包含する。一実施形態では、血管新生阻害剤を本発明の分子と組み合わせて投与することができる。本発明の方法および組成物に用いることのできる血管新生阻害剤として、それだけに限らないが、アンジオスタチン(プラスミノーゲン断片);抗血管新生アンチトロンビンIII;アンギオザイム(angiozyme);ABT-627; Bay 12-9566;ベネフィン;ベバシズマブ;BMS-275291;軟骨由来阻害剤(CDI);CAI;CD59補体断片;CEP-7055;Col 3;コンブレタスタチンA-4;エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片);フィブロネクチン断片;Gro-β;ハロフギノン;ヘパリナーゼ;ヘパリンヘキササッカリド断片;HMV833;ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG);IM-862;インターフェロンα/β/γ;インターフェロン誘導性タンパク質(IP-10);インターロイキン-12;クリングル5(プラスミノーゲン断片);マリマスタット;メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMPs);2-メトキシエストラジオール;MMI 270(CGS 27023A);MoAb IMC-1C11;ネオバスタット;NM-3;パンゼム;PI-88;胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;血小板因子-4(PF4);プリノマスタット;プロラクチン16kD断片;プロリフェリン関連タンパク質(PRP);PTK 787/ZK 222594;レチノイド;ソリマスタット(solimastat);スクアラミン;SS 3304;SU 5416;SU6668;SU11248;テトラヒドロコルチゾール-S;テトラチオモリブデート;サリドマイド;トロンボスポンジン-1(TSP-1);TNP-470;トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-b);バスクロスタチン(vasculostatin);バソスタチン(カルレティキュリン断片);ZD6126;ZD 6474;ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(FTI);およびビスホスホネートが挙げられる。
ン;インターロイキンII(組換えインターロイキンII、すなわちrIL2を含めて)、インターフェロンα-2a;インターフェロンα-2b;インターフェロンα-n1;インターフェロンα-n3;インターフェロンβ-Ia;インターフェロンγ-Ib;イプロプラチン;塩酸イリノテカン;酢酸ランレオチド;レトロゾール;酢酸ロイプロリド;塩酸リアロゾール; ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;塩酸ロソキサントロン;マソプロコール;マイタンシン;塩酸メクロレタミン;酢酸メゲストロール;酢酸メレンゲストロール;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキセート;メトトレキセートナトリウム;メトプリン(metoprine);メツレデパ;ミチンドミド;ミトカルシン(mitocarcin);ミトクロミン;マイトジリン(mitogillin);ミトマルシン(mitomalcin);マイトマイシン;ミトスペル(mitosper);ミトタン;塩酸ミトキサントロン;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリタキセル;ペガスパルガーゼ;ペリオマイシン(peliomycin);ペンタムスチン(pentamustine);硫酸ペプロマイシン;ペルホスフアミド(perfosfamide);ピポブロマン;ピポスルファン;塩酸ピロキサントロン;プリカマイシン;プロメスタン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン(prednimustine);塩酸プロカルバジン;ピューロマイシン;塩酸ピューロマイシン;ピラゾフリン;リボプリン;ログレチミド;サフィンゴール;塩酸サフィンゴール;セムスチン;シムトラゼン;スパルフォセートナトリウム;スパルソマイシン;塩酸スピロゲルマニウム;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;スロフェヌル;タリソマイシン;テコガランナトリウム(tecogalan sodium);テガフール;塩酸テロキサントロン;テモポルフィン;テニポシド;テロキシロン;テストラクトン;チアミプリン;チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン;クエン酸トレミフェン;酢酸トレストロン(trestolone acetate);リン酸トリシリビン;トリメトレキセート;グルクロン酸トリメトレキセート;トリプトレリン;塩酸ツブロゾール;ウラシルマスタード;ウレデパ;バプレオチド;ベルテポルフィン;硫酸ビンブラスチン;硫酸ビンクリスチン;ビンデシン;硫酸ビンデシン;硫酸ビネピジン(vinepidine sulfate);硫酸ビングリシナート(vinglycinate sulfate); 硫酸ビンロイロシン(vinleurosine sulfate);酒石酸ビノレルビン;硫酸ビンロシジン(vinrosidine sulfate);硫酸ビンゾリジン(vinzolidine sulfate);ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;塩酸ゾルビシンが挙げられる。
他の抗癌薬として、それだけに限らないが、20-epi-1,25 ジヒドロキシビタミンD3;5-エチニルウラシル;アビラテロン;アクラルビシン;アシルフルベン;アデシペノール(adecypenol);アドゼレシン;アルデスロイキン;ALL-TKアンタゴニスト;アルトレタミン;アンバムスチン;アミドクス(amidox);アミホスチン;アミノレブリン酸;アムルビシン;アムサクリン;アナグレリド;アナストロゾール;アンドログラホリド;血管新生阻害剤;アンタゴニストD;アンタゴニストG;アンタレリクス(antarelix);抗背方化形態形成タンパク質-1;抗アンドロゲン、前立腺癌;抗エストロゲン剤;アンチネオプラストン;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アフィディコリングリシナート;アポトーシス遺伝子モジュレーター;アポトーシスレギュレーター;アプリン酸;ara-CDP-DL-PTBA;アルギニンデアミナーゼ;アスラクリン(asulacrine);アタメスタン;アトリムスチン;アキシナスタチン(axinastatin)1;アキシナスタチン2;アキシナスタチン3;アザセトロン;アザトキシン(azatoxin);アザチロシン;バッカチンIII誘導体;バラノール;バチマスタット;BCR/ABLアンタゴニスト;ベンゾクロリン;ベンゾイルスタウロスポリン;βラクタム誘導体;β-アレチン(alethine);ベタクラマイシン(betaclamycin)B;ベツリン酸;bFGF阻害剤;ビカルタミド;ビサントレン;ビスアジリジニルスペルミン;ビスナフィド;ビストラテン(bistratene)A;ビセレシン;ブレフラート(breflate);ブロピリミン;ブドチタン;ブチオニンスルホキシイミン;カルシポトリオール;カルホスチンC;カンプトテシン誘導体;カナリア痘IL-2;カペシタビン;カルボキサミド-アミノ-トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール;CaRest M3;CARN 700;軟骨由来阻害剤;カルゼレシン;カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS);カスタノスペルミン;セクロピンB;セトロレリクス;クロルルンス(chlorlns);クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト;シス-ポルフィリン;クラドリビン;クロミフェン類似体;クロトリマゾール;コリスマイシン(collismycin)A;コリスマイシンB;コンブレタスタチンA4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン;クランベスシジン(crambescidin)816;クリスナトール;クリプトフィシン8;クリプトフィシンA誘導体;キュラシンA;シクロペンタントラキノン;シクロプラタム(cycloplatam);シペマイシン(cypemycin);シタラビンオクホスフェート(ocfosfate);細胞溶解因子;サイトスタチン(cytostatin);ダクリキシマブ(dacliximab);デシタビン;デヒドロジデムニン(dehydrodidemnin)B;デスロレリン;デキサメタゾン;デキシホスファミド(dexifosfamide);デキスラゾキサン;デキスベラパミル(dexverapamil);ジアジクォン;ジデムニンB;ジドックス(didox);ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ-5-アザシチジン;ジヒドロタキソール,9-;ジオキサマイシン(dioxamycin);ジフェニルスピロムスチン;ドセタキセル;ドコサノール;ドラセトロン;ドキシフルリジン;ドロロキシフェン;ドロナビノール;デュオカルマイシンSA;エブセレン;エコムスチン;エデルホシン; エドレコロマブ;エフロールニチン;エレメン;エミテフール;エピルビシン;エプリステリド;エストラムスチン類似体;エストロゲンアゴニスト;エストロゲンアンタゴニスト;エタニダゾール;リン酸エトポシド;エキセメスタン;ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フィルグラスチム;フィナステリド;フラボピリドール;フレゼラスチン;フルアステロン(fluasterone);フルダラビン;塩酸フルオロダウノルニシン(fluorodaunorunicin hydrochloride);ホルフェニメクス;フォルメスタン;ホストリエシン;ホテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン;硝酸ガリウム;ガロシタビン;ガニレリクス;ゼラチナーゼ阻害剤;ゲムシタビン;グルタチオン阻害剤;ヘプスルファム(hepsulfam);ヘレグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド;ヒペリシン;イバンドロン酸;イダルビシン;イドキシフェン;イドラマントン;イルモホシン;イロマスタット;イミダゾアクリドン(imidazoacridone);イミキモド;免疫賦活ペプチド;インスリン様成長因子-1受容体阻害剤;インターフェロンアゴニスト;インターフェロン;インターロイキン;イオベングアン;ヨードドキソルビシン;イポメアノール, 4-;イロプラクト(iroplact);イルソグラジン;イソベンガゾール(isobengazole);イソホモハリコンドリン(isohomohalicondrin)B;イタセトロン;ジャスプラキノリド;カハラリド(kahalalide)F;ラメラリン-Nトリアセテート;ランレオチド;レイナマイシン;レノグラスチム;硫酸レンチナン;レプトルスタチン(leptolstatin);レトロゾール;白血病抑制因子;白血球αインターフェロン;ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステロン;リュープロレリン;レバミソール;リアロゾール;直鎖ポリアミン類似体;親油性ジサッカライドペプチド;親油性白金化合物;リソクリンアミド(lissoclinamide)7;ロバプラチン;ロンブリシン(lombricine);ロメトレキソール;ロニダミン;ロソキサントロン;ロバスタチン;ロキソリビン;ルルトテカン(lurtotecan);ルテチウムテキサフィリン;リソフィリン(lysofylline);溶解ペプチド;マイタンシン;マンノスタチン(mannostatin)A;マリマスタット;マソプロコール;マスピン;マトリライシン阻害剤;基質メタロプロテイナーゼ阻害剤;メノガリル;メルバロン;メテレリン(meterelin);メチオニナーゼ;メトクロプラミド;MIF阻害剤;ミフェプリストーン;ミルテホシン;ミリモスチム;ミスマッチ二重鎖RNA;ミトグアゾン;ミトラクトール;マイトマイシン類似体;ミトナフィド(mitonafide);ミトトキシン(mitotoxin)線維芽細胞成長因子-サポリン;ミトキサントロン;モファロテン;モルグラモスチム;モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン;モノホスホリル脂質A+ミオバクテリウム(myobacterium)細胞壁sk;モピダモール;多剤耐性遺伝子阻害剤;多発性腫瘍サプレッサー1をベースとする療法(multiple tumor suppressor 1-based therapy);マスタード抗癌剤;ミカペルオキシド(mycaperoxide)B;マイコバクテリア(mycobacterial)細胞壁抽出物;ミリアポロン(myriaporone); N-アセチルジナリン;N-置換ベンズアミド;ナファレリン;ナグレスチプ(nagrestip);ナロキソン+ペンタゾシン;ナパビン(napavin);ナフテルピン;ナルトグラスチム;ネダプラチン;ネモルビシン(nemorubicin);ネリドロン酸;中性エンドペプチダーゼ;ニルタミド;ニサマイシン(nisamycin);一酸化窒素モジュレーター;ニトロキシド抗酸化剤;ニトルリン(nitrullyn);O6-ベンジルグアニン;オクトレオチド;オキセノン(okicenone);オリゴヌクレオチド;オナプリストン;オンダンセトロン;オンダンセトロン;オラシン(oracin);経口サイトカイン誘導因子;オルマプラチン;オサテロン;オキサリプラチン;オキサウノマイシン(oxaunomycin);パクリタキセル;パクリタキセル類似体;パクリタキセル誘導体;パラウアミン(palauamine);パルミトイルリゾキシン(palmitoylrhizoxin);パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン;パラバクチン(parabactin);パゼリプチン;ペガスパルガーゼ;ペルデシン;ペントサン多硫酸ナトリウム;ペントスタチン;ペントロゾール(pentrozole);ペルフルブロン;ペルホスフアミド(perfosfamide);ペリリルアルコール;フェナジノマイシン;フェニル酢酸塩;ホスファターゼ阻害剤;ピシバニール;塩酸ピロカルピン;ピラルビシン;ピリトレキシム;プラセチン(placetin)A;プラセチンB;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;白金錯体;白金化合物;白金-トリアミン錯体;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニゾン;プロピルビス-アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害剤;タンパク質Aをベースとする免疫モジュレーター;タンパク質キナーゼC阻害剤;タンパク質キナーゼC阻害剤類、微細藻類;タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤;プルプリン;ピラゾロアクリジン(pyrazoloacridine);ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート(pyridoxylated hemoglobin polyoxyethylene conjugate);rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド;ラモセトロン;rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;ras阻害剤;ras-GAP阻害剤;脱メチルレテリプチン;エチドロン酸レニウム Re 186;リゾキシン;リボザイム;RII レチナミド(retinamide);ログレチミド;ロヒツキン(rohitukine);ロムルチド;ロキニメックス(roquinimex);ルビギノン(rubiginone)B1;ルボキシル(ruboxyl);サフィンゴール;サイントピン(saintopin);SarCNU;サルコフィトール(sarcophytol)A;サルグラモスチム;Sdi 1模倣剤;セムスチン;老化由来阻害剤(senescence derived inhibitor)1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シグナル伝達モジュレーター;単鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン;ソブゾキサン;ナトリウムボロカプテート(sodium borocaptate);フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール(solverol);ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン(sonermin);スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン(splenopentin);スポンジスタチン(spongistatin)1;スクアラミン;幹細胞阻害剤;幹細胞分裂阻害剤;スチピアミド(stipiamide);ストロメライシン阻害剤;スルフィノシン(sulfinosine);超活性型(superactive)血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト;スラジスタ(suradista);スラミン;スウェインソニン;合成グリコサミノグリカン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム(tecogalan sodium);テガフール;テルラピリリウム(tellurapyrylium);テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン(tetrazomine);タリブラスチン(thaliblastine);チオコラリン(thiocoraline);トロンボポエチン;トロンボポエチン模倣剤;チマルファシン;サイモポエチン受容体アゴニスト;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;スズエチルエチオプルプリン(tin ethyl etiopurpurin);チラパザミン;二塩化チタノセン;トプセンチン(topsentin);トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキセート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害剤;チロホスチン;UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来成長阻害因子;ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド;バリオリン(variolin)B;ベクター系、赤血球遺伝子療法;ベラレソール;ベラミン(veramine);ベルジン(verdin);ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン(vinxaltine);バイタクシン(vitaxin);ボロゾール;ザノテロン(zanoterone);ゼニプラチン;ジラスコルブ;およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。好ましいさらなる抗癌薬は、5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、1つまたは複数の領域中に1つまたは複数のアミノ酸改変を有し、この改変により、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性が増加するが、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性が減少する、変異型Fc領域を含む。このような結合特性を有する本発明の分子は、免疫応答を制御することにおいて、例えば、自己免疫疾患または炎症性疾患に関連する免疫応答を抑制することにおいて有用である。任意の作用機序によって制約されることを意図していないが、FcγRIIBに対する増強された親和性ならびにFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する低減された親和性を有する本発明の分子は、FcγRへの活性化応答の減衰および細胞応答性の抑制をもたらすことができる。
本発明は、FcγRIIBに対する増強された親和性ならびにFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する低減された親和性を有する変異型Fc領域を有する分子を他の治療剤とともに投与することを含む、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療方法を提供する。免疫調節剤の例として、それだけに限らないが、メトトレキセート、ENBREL、REMICADE(商標)、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA、およびマクロライド系抗生物質(例えば、FK506 (タクロリムス))、メチルプレドニゾロン(MP)、コルチコステロイド、ステリオド(steriod)、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン (シロリムス)、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)、ブレキナル、マロノニトリロアミンド(malononitriloaminde)(例えば、レフルナミド(leflunamide))、T細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーターが挙げられる。
本発明は、治療上または予防上有効量の1種または複数の本発明の分子を投与することを含む、対象における感染性疾患を治療または予防する方法を包含する。本発明の分子によって治療または予防することのできる感染性疾患は、それだけに限らないが、ウイルス、バクテリア、菌類、プロトザエ(protozae)、およびウイルスを含めた病原体に起因する。
セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム)、セファマイシン(例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、カルモナム、およびチゲモナム(tigemonam))、オキサセフェム(例えば、フロモキセフ、およびモキサラクタム)、ペニシリン(例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン(fenbenicillin)、フロキサシリン、ペナムクシリン(penamccillin)、ペネタメートヨウ化水素酸塩(penethamate hydriodide)、ペニシリンo-ベネタミン、ペニシリン0、ペニシリンV、ペニシリンV ベンザチン、ペニシリンV ヒドラバミン、ペニメピサイクリン(penimepicycline)、およびフェンシヒシリンカリウム(phencihicillin potassium))、リンコサミド(例えば、クリンダマイシン、およびリンコマイシン)、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンデュラシジン(enduracidin)、エンビオマイシン、テトラサイクリン(例えば、アピサイクリン(apicycline)、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン(clomocycline)、およびデメクロサイクリン)、2,4-ジアミノピリミジン(例えば、ブロジモプリム)、ニトロフラン(例えば、フラルタドン、および塩化フラゾリウム)、キノロンおよびその類似体(例えば、シノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、およびグレパグロキサシン(grepagloxacin))、スルホンアミド(例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド(noprylsulfamide)、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジン、およびスルファシチン(sulfacytine))、スルホン(例えば、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン)、サイクロセリン、ムピロシンおよびツベリンが挙げられる。
本発明はさらに、それだけに限らないが、癌抗原および感染性疾患抗原(この例は以下に開示される)を含めた抗原剤または免疫原剤に対する免疫応答を誘発するために、本発明の組成物を用いることを包含する。本発明のワクチン組成物は、免疫応答が望まれる1種または複数の抗原剤または免疫原剤を含み、この1種または複数の抗原剤または免疫原剤は、FcγRIIIAに対する増強された親和性を有する本発明の変異抗体で被覆されている。特定の作用機序によって制約されることを意図していないが、抗原剤または免疫原剤を、FcγRIIIAに対する増強された親和性を有する本発明の変異抗体で被覆することにより、体液応答および細胞媒介応答を誘発することによって、所望の抗原剤または免疫原剤に対する免疫応答が増強される。本発明のワクチン組成物は、免疫応答、好ましくは抗原剤または免疫原剤に対する防御免疫応答を誘発することにおいて特に有効である。
本発明は、変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、抗体、ポリペプチド)を含む方法および医薬組成物を提供する。本発明はまた、有効量の本発明の融合タンパク質またはコンジュゲート分子、あるいは本発明の融合タンパク質またはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を対象へ投与することによって、疾患、障害または感染に関係する1つまたは複数の症状を治療、予防、および回復する方法を提供する。好ましい態様では、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、実質的に精製されている(すなわち、その効果を制限するか、または望まれない副作用を生じる物質が、実質的に存在しない)。特定の実施形態では、対象は、動物、好ましくは、非霊長類(例えば、雌ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)および霊長類(例えば、カニクイザルなどのサルおよびヒト)などの哺乳動物である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、対象と同じ種に由来する。
74を参照)。別の実施形態では、抗体の制御放出を達成するために、ポリマー材料を用いることができる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61;を参照。また、Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); 米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号; PCT国際公開第99/15154号;およびPCT国際公開第99/20253号を参照)。徐放製剤において用いられるポリマーの例として、それだけに限らないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(polyglycolide)(PLG)、ポリアンヒドリド(polyanhydride)、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、およびポリオルトエステルが挙げられる。さらに別の実施形態では、制御放出系は、治療標的(例えば、肺)の近くに配置することができ、したがって全身的用量の何分の1かが必要であるにすぎない(例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照)。別の実施形態では、制御放出インプラントとして有用なポリマー組成物は、Dunnら(米国5,945,155を参照)に従って用いられる。この特別な方法は、ポリマー系からの生理活性物質のin situ制御放出の治療効果に基づいている。植込みは、一般に、治療処置の必要な患者の身体のどこにでも行うことができる。別の実施形態では、非ポリマー持続性送達系が用いられ、それによって、対象の身体における非ポリマーインプラントが、薬物送達系として用いられる。身体に植え込むと、インプラントの有機溶媒が、組成物から周囲の組織液に散逸、分散、または浸出し、非ポリマー材料は、徐々に凝固または凝結して固体の微孔質の基質を形成するだろう(米国5,888,533参照)。
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用な原体薬剤組成物(例えば、不純または非滅菌組成物)および単位剤形の調製に用いることのできる医薬組成物(すなわち、対象または患者への投与に適した組成物)を含む。このような組成物は、予防または治療上有効量の本明細書に開示した予防剤および/または治療剤あるいはこれらの薬剤の組合せ、ならびに薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防または治療上有効量の1種または複数の本発明の分子および薬学的に許容される担体を含む。
特定の実施形態では、本発明の分子をコードする配列を含む核酸が、遺伝子治療によって、疾患、障害または感染に関係する1つまたは複数の症状を治療、予防または回復するために投与される。遺伝子治療は、対象への発現した核酸または発現できる核酸の投与によって行われる療法を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、治療または予防効果を媒介する、そのコードされた抗体または融合タンパク質を産生する。
本発明は、本発明の分子(すなわち、変異型Fc領域を含む抗体、ポリペプチド)で満たされた1つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な1種または複数の他の予防剤または治療剤も、この医薬パックまたはキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の1種または複数の成分で満たされた1つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。必要に応じてこのような容器(複数も)に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を管理する政府機関によって定められた形式での注意書を加えることができ、この注意書は、機関によるヒト投与のための製造、使用または販売の認可を反映する。
本発明の医薬組成物、予防剤または治療剤のいくつかの態様は、好ましくは、ヒトでの使用の前に所望の治療活性について、細胞培養系において、および齧歯動物モデル系などの動物モデル生体において、in vitroで試験される。例えば、特定の医薬組成物の投与が望ましいかどうかを判定するのに用いることのできるアッセイには、患者の組織試料を培養で成長させ、本発明の医薬組成物に曝すか、または別の方法で接触させ、組織試料に対するそのような組成物の効果を観察する、細胞培養アッセイが含まれる。組織試料は、患者から生検によって得ることができる。この試験は、それぞれ個々の患者に対する、治療上最も有効な予防用または治療用分子(複数も)の同定を可能にする。様々な特定の実施形態では、in vitroアッセイは、自己免疫障害または炎症性障害に関与する細胞型の代表的な細胞(例えば、T細胞)を用いて行うことができ、本発明の医薬組成物が、そのような細胞型に対して所望の効果を有するかどうかを判定する。
酵母ディスプレイ系を使用して、異なるFc受容体に対する改変された親和性について突然変異ヒトIgG1重鎖Fc領域をスクリーニングした。特に、エラープローンPCR(Genemorph、Stratagene)により突然変異型Fcライブラリーを作製し、次に突然変異型Fcタンパク質をAga2p細胞壁タンパク質と融合させた。これにより、融合タンパク質は細胞外に分泌され、酵母細胞壁上に提示された。
材料と方法
可溶性FcγRIIBおよびFcγRIIIAを以下のようにクローニングした。ヒトFcγR遺伝子(FcγRIIBおよびFcγRIIIA)についてのcDNAクローンを得た(Ravetch研究所からの贈与)。FcγRIIIA遺伝子の可溶性領域(アミノ酸7〜203)をPCRにより増幅させ(表12)、BamHI/HindIIIで消化し、pET25ベクター(Novagen)に連結した。このベクターをSal1/Not1で消化し、370by断片をゲルで単離した。ベクターhu3A(J. Ravetchからの贈与)をBamHI/Sal1で消化し、FcγRIIIAのN末端を有する270by断片を単離した。BamH/NotIで切断したpcDNA3.1に両方の断片を同時連結し、pcDNA3-FcγRIIIA(アミノ酸1〜203)を作った。FcγRIIBの可溶性領域(アミノ酸33〜180)をPCRにより増幅し(表12)、BglII/HindIIIで消化し、pET25b(+)(Novagen)に連結した。このベクターをBamHI/NotIで消化し、140bp断片をゲルで単離した。ベクターhuRIIb1(J. Ravetchからの贈与)をBamHI/EcoRIで消化し、440bpのN-末端FcγRIIB断片を単離した。これらの断片の両方をpcDNA3.1に共連結し、BamHI/NotIで切断し、pcDNA3-FcγRIIB(アミノ酸1〜180)を作った。組換えクローンを293H細胞にトランスフェクトし、細胞培養液から上清を収集し、可溶性組換えFcγR(rFcγR)タンパク質をIgGセファロースカラムで精製した。
組換え可溶性FcγRIIIA(rFcγRIIIA)および組換え可溶性FcγRIIB(rFcγRIIB)を均一になるまで精製した
組換え可溶性FcγRタンパク質の発現およびIgGセファロースカラムでの精製の後に、精製された組換え可溶性受容体タンパク質の純度およびみかけの分子量をSDS-PAGEで決定した。図3に示すように、可溶性rFcγRIIIA(図3、レーン1)は約35KDaの予想されるみかけの分子量を有し、可溶性rFcγRIIB(図3、レーン4)は約20KDaの予想されるみかけの分子量を有した。図3に示すように、可溶性rFcγRIIIAは広がった「不明瞭な(fuzzy)」バンドとなって泳動しているが、これはFcγRIIIAに通常みられる高度のグリコシル化が原因とされた(Jefferis, et al., 1995 Immunol Lett.44、111-117)。
材料と方法
ELISAアッセイを使用して、ヒト単量体型IgGまたは凝集型IgGに対する直接結合について、上記のように得られた精製可溶性rFcγRIIIAを分析した。1×PBS中の可溶性rFcγRIIIA、10ngで、プレートを一晩被覆する。被覆に続いて、1×PBS/0.1% Tween20でプレートを3回洗浄する。ビオチン化単量体型IgGまたはビオチン化凝集型IgGのいずれかであるヒトIgGを0.03mg/mLから2mg/mLの範囲の濃度でウェルに加え、可溶性rFcγRIIIAに結合させる。反応を37℃で1時間行う。再度1×PBS/0.1% Tween20でプレートを3回洗浄する。ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて650nmでの吸光度をモニターすることにより、可溶性rFcγRIIIAへのヒトIgGの結合を検出する。650nmでの吸光度は、結合した凝集型IgGに比例する。
精製組換え可溶性FcγRIIIAは特異的に凝集型IgGに結合する。
材料と方法
AVITAGペプチドに融合した可溶性FcRγIIIAおよびFcRγIIBの発現のためのプラスミドの構築
可溶性FcγR四量体型複合体を発生させるために、ヒトFcRgIIIA遺伝子の可溶性領域(アミノ酸7〜203)をPCRにより増幅し(表12)、BamHI/HindIIIで消化し、pET25b(+)(Novagen)に連結した。このベクターをSalI/Not1で消化し、370bpの断片をアガロースゲル電気泳動で単離した。ベクターhu3A(J. Ravetchからの贈与)をBamHI/SalIで消化し、FcRγIIIAのN末端を有する270bpの断片を単離した。BamH/NotIで消化したpcDNA3.1(Invitrogen)に両断片を同時連結し、pcDNA3-FcRgIIIA(アミノ酸1〜203)を作った。
Lipofectamine2000試薬(Invitrogen、カリフォルニア州)を使用して293H細胞を一過性トランスフェクトすることによって、可溶性Fc受容体(FcγR)のC末端でアミノ酸15個のAVITAG配列(Avidity、コロラド州)に融合したこのタンパク質(Schatz P.J., 1993, Biotechology, 11:1138-1143)をpcDNA3.1にクローニングしたものを作製した。培養液から上清を収集し、上清にIgGセファロースカラムを通過させることによって可溶性FcRタンパク質を精製した。可溶性FcR-AVITAG融合タンパク質の濃度は280nmでの吸光度から定量した。可溶性FcRタンパク質上に存在するAVITAGを、ビオチンリガーゼである大腸菌BirA酵素を用いて製造業者のプロトコール(Avidity、コロラド州)通りにビオチン化した。プロテアーゼ阻害剤(Sigmaカタログ番号P8849)および終濃度1mg/mlのロイペプチン(Sigma L-8511)の終希釈1:100の混液をこの混合物に添加し、これらのタンパク質の分解を阻害した。BirA反応物を室温で一晩インキュベートし、続いてBiomax 10K-限外濾過装置(Millipore)を使用して4℃で3500rpmで遠心分離することによりこの溶液を濃縮した。このタンパク質をTris-HCl(20mM、pH8.0)、50mM NaCl中でFPLC Superdex 200HR10/30カラム(Pharmacia Biotech)に負荷し、標識可溶性FcγRを遊離ビオチンと分離した。
BirA酵素(Avidity、コロラド州)により約80〜85%のタンパク質をビオチン化した。ストレプトアビジン-シフトアッセイを使用して、タンパク質のビオチン化度を決定した。ビオチン化タンパク質をストレプトアビジン(MW60000ダルトン)とともに種々の比でインキュベートした。ビオチン化度を決定するための対照として未ビオチン化タンパク質単独およびストレプトアビジン単独を含める。氷上で2時間または4℃で一晩インキュベーションを行う。還元剤の存在下で試料を沸騰させずに4〜12% SDS-PAGE Bis-Tris(Invitrogen、カリフォルニア州)で試料を分析する。ストレプトアビジンと結合したビオチン化タンパク質は、高分子量のバンドとして泳動する。ビオチン化の程度は、試料に残る単量体タンパク質の量により推定する。単量体低分子量種の不在およびストレプトアビジン単独よりも大きい分子量を有する複合体の存在は、高度のビオチン化を示す。
FcγR四量体型複合体の形成は、MHCクラスI四量体について以前に確立された方法通りに行った(Busch, D. H. et al., 1998 Immunity 8:353-362; Altman, J. D. et al., 1996, Science 274: 94-96参照)。ビオチン化単量体型FcγRの濃度は280nmの吸光度に基づき計算した。1分子のストレプトアビジン-フィコエリトリン(SA-PE) (Molecular Probes、オレゴン州)は、4分子のビオチンと結合する能力を有する。過剰のビオチン化タンパク質を確実にするために、モル比5:1の単量体性ビオチン化FcγRおよびSA-PE(5×単量体性ビオチン化FcγR:1×SA-PE)を使用した。SA-PEの計算上の分子量が300000ダルトンであることから、ストレプトアビジン-PEの1mg/mL溶液303mLは1nmolのSA-PEを有し、これを5nmolのタンパク質に添加した。四量体型タンパク質の効率的な形成には、SA-PEを段階的に漸増して添加する必要がある。半量のSA-PEを前もって添加し、残りのSA-PEは、暗条件で4℃で20〜30分毎に少量ずつ添加した。残りのSA-PEの添加間隔は自由に変えられる。SA-PEの添加が完了後に、溶液を濃縮し、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水中で上記FPLCサイズ排除カラムに負荷した。SA-PE単独よりも大きな分子量で間隙容量に溶出した画分を収集した。プロテアーゼ阻害剤を補充してタンパク質の分解を阻害した。この溶液を濃縮し、最終的な複合体に追加的なプロテアーゼ阻害剤を添加して保存に供した。可溶性FcγR四量体型複合体の終濃度は、ビオチン化単量体型タンパク質の出発濃度に基づき計算した。例えば、四量体型複合体を製造するためにビオチン化タンパク質500μgを使用し、最終的な濃縮四量体が体積500μLであったならば、濃度は約1mg/mLと推定される(四量体の各形成段階にどれだけ多くの損失があったかを正確に決定することが困難であることから、濃縮の間に被った損失は考慮しない。PEからの妨害が原因で、280nmでの吸光度を採用して濃度を測定することもまた不可能である)。プロテアーゼ阻害剤とともに長期保存するために、可溶性FcγR四量体型複合体を-80℃で少量ずつ分配した。四量体を酵母ディスプレイライブラリーのスクリーニングに使用することから、これらの調製物にアジ化ナトリウムは添加しなかった。一定分量を解凍した場合、この四量体は4℃で最長1週間保存した。
ELISAを使用して四量体型FcγR複合体の特徴付けを行った。PBS緩衝液中のヒトIgG、25ngでMaxisorb F96ウェルプレート(Nunc)を被覆し、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBS/0.5% BSA/0.1% Tween20(洗浄および希釈緩衝液)で洗浄してから、FcγRIIIA四量体および被験抗体の組合せを添加し、下記のように3G8マウス抗ヒトFcγRIIIA抗体を用いたブロッキングを決定した。以下のようにブロッキング段階を行った。緩衝液PBS/0.5% BSA/0.1% Tween20中で一定の終濃度0.5mg/mlの可溶性FcγRIIIA四量体を抗体とともに室温で1時間予備インキュベートした。抗体の終濃度は60mg/mLから0.25mg/mLの範囲であった。3G8はマウス抗ヒトFcγRIIIA抗体であり、この実験のためにキメラ型、すなわち抗体の可変領域がマウス抗ヒトFcγRIIIAであり、重鎖および軽鎖の定常領域がIgG1ヒト領域由来である抗体を使用した。アスパラギン酸がヒトIgG1におけるアラニンと置換されていることにより、FcγRへの結合低下を招く突然変異をFc領域が位置265に有する抗フルオレセイン抗体であるキメラ4.4.20.D265Aもまたこの実験に使用した。この抗体は、以前に特徴付けられている(Clynes et al., 2000, Nat. Med. 6: 443-446; Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 6591-6604参照)。この抗体を陰性アイソタイプ対照として使用した。
可溶性FcγRIIIA四量体型複合体はその通常のリガンド結合部位を介して単量体型ヒトIgGと結合する
ELISAアッセイを使用して材料と方法の節に記載したように可溶性FcγRIIIA-AVITAG融合タンパク質を発生させ、単離し、分析した。この融合タンパク質は非AVITAG可溶性FcγRIIIAタンパク質と類似の性質を有することが示された(データは示さず)。この融合タンパク質をビオチン化し、上記のように四量体型複合体を発生させた。
ELISAアッセイを使用して凝集型ヒトIgGへの可溶性四量体FcγRIIIAの直接結合を評価し、単量体型ヒトIgGへの可溶性単量体FcγRIIIAの直接結合と比較した。図5Bに示すように、可溶性四量体FcγRIIIAは、450nmでの吸光度によりモニターされたように可溶性単量体性受容体よりも高いアビディティー(8〜10倍)でヒトIgGに結合する。
材料と方法
pYD1ベクター(Invitrogen)は、T細胞受容体およびいくつかのscFVを提示するためにうまく使用された酵母複製ベクターpCT302(Shusta, et al., 2000 Nat. Biotechnol. 18: 754-759)から直接得られる。このプラスミドは動原体性であり、trpl酵母株で細胞1個当たり1〜2個のプラスミドという比較的一定のコピー数を可能にするTRP1遺伝子を有する。ポリリンカーへの定方向クローニングは、GAL1プロモーターの制御下でAGA2のフレーム内に関心対象の遺伝子を置く。酵母Aga2pとのIgG Fcドメインの融合は、Aga2-Fc融合タンパク質の細胞外分泌と、それに続いて内在性細胞壁タンパク質である酵母Aga lpタンパク質へのジスルフィド結合を介した、細胞壁上のFcタンパク質の提示とを招く。
材料と方法
標準的な酢酸リチウム酵母形質転換プロトコールを使用して、Aga2p-Fc融合タンパク質を有する構築物および挿入部を全く欠如した対照ベクターpYDIを酵母株EBY100(Invitrogen)(MATa ura3-52 trpl leu2Δl his3Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL::GAL-AGA1)に形質転換した(Gietz et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20: 1425)。続いて、所定の培地でトリプトファン原栄養株を選択した。グルコース中で生育させ、続いて主炭素源としてガラクトースを含有する培地中で20℃で24〜48時間生育させることによって、独立した細胞集団の増幅、ならびにAga1p-FcおよびAga2p-Fc融合タンパク質の誘導を果たした。ガラクトース中での生育は、GAL1プロモーターを介したAga2-Fc融合タンパク質の発現を誘導し、それは続いて酵母細胞表面でのFc融合タンパク質のディスプレイを引き起こす。
Fc融合タンパク質のFACS分析
PEコンジュゲートポリクローナルF(ab)2ヤギ抗ヒトFcγRおよびHP6017(Sigma)抗体(Jackson Immununoresearch Laboratories, Inc.)を使用した免疫染色により、酵母細胞壁上でのFc融合タンパク質の発現を分析した。蛍光顕微鏡観察により、3つのFc融合タンパク質についての末梢染色が示される。ベクター単独を有する対照株は、ほとんどまたは全く染色を示さない(データは示さず)。この染色を定量するためにFACS分析を使用した(図8)。CH1-CH3融合を有する酵母株は、両抗体で染色された細胞を最高率で示した(図8BおよびF)。GIF227構築物は最大の平均蛍光強度を示した(図8、CおよびG欄)。
自然の状況のFcタンパク質およびFcγRタンパク質は、この受容体を細胞表面に、そしてFcを可溶性リガンドとして置いている。しかし、Fcの酵母表面の提示は自然の相互作用の幾何的関係から逆転している。酵母細胞壁表面でのIgG1 Fcタンパク質の検出は、FcγRのリガンドに対するFcγRの低親和性と、ディスプレイ系固有の逆の幾何的関係との両方により複雑になっている。後者のポイントを変えることはできないが、リガンドのアビディティーは、可溶性FcγR四量体型複合体を形成させることにより上に説明したように改善した。それにより、酵母細胞壁表面に発現したFc融合タンパク質へのFcγRの結合を検出できるようになる。
Fc-CH1構築物のFc断片に隣接するプライマーおよび誤りがちなPCR(Genemorph、Stratagene)を使用して、突然変異型Fcライブラリーを構築した。ベクターpYD-CHIでのCH1-CH3挿入部を突然変異誘発PCR(Genemorph、Stratagene)を使用して増幅した。pYD-上流プライマーおよびpYD-下流プライマー(Invitrogen)を使用して5つの反応を行った。結果として生じた増幅断片をXHOI/BamHIで消化し、pYD1に連結した。次に、連結反応物をXL10ウルトラコンピテント細胞(Stratagene)に形質転換し、それにより約1×106個の形質転換体が生じ、その形質転換体の80%が挿入部を有した。
材料と方法
Fc突然変異体をスクリーニングするためのELISAアッセイ
50ml/ウェルの炭酸塩緩衝液中の0.5mg/ml BSA-FITCでELISAプレート(Nunc F96 MaxiSorp Immunoplate)を4℃で被覆し、一晩インキュベートさせた。プレートを1×PBS/0.1% Tween20(PBST)で3回洗浄した。200ml/ウェルのPBST/0.5% BSAを添加し、プレートを室温で30分間インキュベートした。プレートをPBSTでさらに3回洗浄した。野生型か、Fc突然変異体を有するかのいずれかの4-4-20抗体を、馴化培地からPBST/0.5% BSAに1:4希釈(約3mg/mLであり、終濃度は0.7〜0.8mg/ウェルとなる)して50ml/ウェル添加し、室温で2時間インキュベートさせた。プレートをPBSTで3回洗浄した。(PBST/0.5% BSA中の)3mg/mlの精製ビオチン化単量体型FcγRIIIAをプレートに添加し(50μl/ウェル)、室温で1.5時間インキュベートさせた。プレートをPBSTで3回洗浄した。PBST/0.5% BSAに1:5000希釈したストレプトアビジン-HRP(Pharmacia、RPN 123v)を50ml/ウェル添加し、プレートを室温で30分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した。次に、80ml/ウェルのTMB試薬(BioFX)をプレートに添加し、暗い場所で室温で10〜15分間インキュベートさせた。停止溶液(0.18M硫酸)を40ml/ウェル添加することにより反応を最終的に停止させた。次に、450nmでの吸光度についてプレートをモニターした。最初のスクリーニング後に、免疫複合体に基づく結合ELISAでの4-4-20-Fc突然変異体の段階タイトレーションにより、関心対象の候補をさらに確認した。このELISAで少数の改変を行った。プレートの被覆には2mg/ml BSA-FITCを使用した。IgGの定量結果に基づいて、PBST-/0.5% BSAに終濃度1、0.5、0.25、0.125、0.063、および0mg/mlとなるように馴化培地から希釈した4-4-20Fc(野生型または突然変異体)を添加した。
少なくとも10mlのHSM-Trp-Ura(pH5.5)中でグルコースとともに16〜24時間、またはOD600が2.0を超えるまで細胞を生育させた。約2000rpmで5分間細胞を遠心沈殿させた。ガラクトースを有する等体積のHSM-Trp-Ura(pH7.0)に細胞を再懸濁した。125ml容フラスコ中で、ガラクトース培地36mlを添加し、培養液9mlを接種し、それを振盪しながら20℃で24〜48時間インキュベートした。8〜16時間間隔でOD600を測定することにより生育をモニターした。2000rpm、5分間で細胞を採集し、等体積の1×PBS(pH7.4)に再懸濁した。
過剰のリガンドを維持しながら、適切な量の細胞をインキュベートした。例えば、ライブラリーの10倍のカバー度を確実にするために必要な細胞数で開始することが好ましい。107個の形質転換体を有するライブラリーを用いた最初の分取のために、108個の細胞を使用すべきである。実際は、染色プロトコールの間の損失を代償するために109個の細胞で始めることが最良である。
Fc突然変異体のFACS分析
ガラクトース培地での誘導後に、細胞を採集し、PE標識した可溶性FcγRIIIA四量体型複合体およびFITC標識したマウス抗ヒトFcのF(ab2)(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)とともに同時染色した。細胞をFACSにより分析し、分取ゲートを使用して、細胞表面のFc発現量に対して、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体に対する最高の親和性を示す細胞を選択した(図11)。例えば、可溶性FcγRIIIA四量体型複合体によく結合する突然変異型Fcを有する細胞の方が、酵母細胞表面で少ないFc融合タンパク質を発現することがあるが、この細胞は分取ゲートの左下側の隅に入るであろう。
酵母系での突然変異の単離および分析は、新規な突然変異対立遺伝子の迅速同定を可能にする。突然変異を単離するために異種系を使用する結果として、誤った折り畳みを招く改変または酵母に特異的なグリコシル化の改変により結合が高まる突然変異を同定することがができるであろう。ヒト細胞で産生される免疫グロブリン分子のFc突然変異を分析するために、抗フルオレセインモノクローナル抗体4-4-20の重鎖を有する突然変異体を哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした(Kranz et al., 1982 J.Biol.Chem, 257(12): 6987-6995)。ヒト腎臓細胞系(293H)で突然変異4-4-20重鎖を軽鎖クローンとともに一過性同時発現させた。上清を収集し、ELISAにより分析した(図13)。
エフェクター細胞の調製物:
末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll-Paque(Pharmacia、17-1440-02)のFicoll-Paque密度勾配遠心分離により、正常ヒト末梢血(Biowhittaker/Poietics、1W-406)から精製した。同じ日に血液を外界温度で輸送し、PBSおよびグルコース(1g/1L)に1:1希釈し、15mL容コニカル試験管中のFicoll(3mL Ficoll;4mL PBS/血液)または50mL容コニカル試験管中のFicoll(15mL:Ficoll;20mL PBS/血液)に重層した。遠心分離を室温で1500rpm(400rcf)で40分間行った。PBMC層を取り出し(50mLコニカル試験管から約4〜6mL)、50mL容コニカル試験管中でPBS(Ca2+およびMg2+を含有しない)で1:10希釈し、室温で1200rpm(250rcf)でさらに10分間回転させた。上清を除去し、ペレットをPBS(Ca2+およびMg2+を含有しない)10〜12mLに再懸濁し、15mL容コニカル試験管に移し、室温で1200rpmでもう10分間回転させた。上清を除去し、ペレットを最小体積(1〜2mL)の培地(Isocove培地(IMDM)+10%ウシ胎児血清(FBS)、4mM Gln、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S))に再懸濁した。再懸濁したPBMCを適切な体積に希釈し、ADCCアッセイに供した。ELISA用96ウェルプレート(Nunc F96 MaxiSorp Immunoplate)の中で2倍希釈を行った。PBMCの収量は、全血40〜50mL当たり約3〜5×107細胞であった。
アッセイに使用した標的細胞は、SK-BR-3細胞(ATCC受託番号HTB-30; Trempe et al., 1976, Cancer Res. 33-41)、Raji細胞(ATCC受託番号CCL-86; Epstein et al., 1965, J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-40)、またはDaudi細胞(ATCC受託番号CCL-213; Klein et al., 1968, Cancer Res. 28: 1300-10)(IMDM培地0.5mLに再懸濁)であり、これらの細胞はユーロピウムキレートであるビス(アセトキシメチル) 2,2":6',2"テルピリジン6,6'ジカルボキシレート(BATDA試薬; Perkin Elmer DELFIA試薬; C136-100)で標識した。K562細胞(ATCC受託番号CCL-243)はNK活性についての対照細胞として使用した。Daudi細胞およびRaji細胞を遠心沈殿させ、SK-BR-3細胞は37℃、5% CO2で2〜5分間トリプシン処理し、培地を中和してから200〜350Gで遠心沈殿させた。標識効率が2×106細胞という少数で最高であったことから、アッセイに使用した標的細胞数は約4〜5×106細胞であり、5×106細胞を超えなかった。細胞を遠心沈殿させると培地を15mL容Falcon試験管に0.5mLまで吸引した。BATDA試薬2.5μlを添加し、この混合物を37℃、5% CO2で30分間インキュベートした。細胞をPBSおよび0.125mMスルフィンピラゾール(sulfinpyrazole)(「SP」;SIGMA S-9509)10mL中で2回、およびアッセイ培地(細胞培地+0.125mMスルフィンピラゾール)10mL中で2回洗浄した。細胞をアッセイ培地1mLに再懸濁し、計数し、希釈した。
標的細胞を上記のように調製すると、それらの細胞を適切な抗体でオプソニン化した。Fc変異体の場合、Fc変異体を有する2×濃度の抗体に50μLの1×105細胞/mLを添加した。終濃度は以下の通りであった。Ch-4-4-20の終濃度は0.5〜1μg/mLであり、Ch4D5の終濃度は30ng/mL〜1ng/mLであった。
上記のように、抗フルオレセインモノクローナル抗体4-4-20の重鎖を有する哺乳動物発現ベクターに変異型Fc領域をサブクローニングした(Kranz et al., 1982 J.Biol.Chem, 257(12): 6987-6995)。ヒト腎臓細胞系(293H)に、変異型4-4-20重鎖を軽鎖クローンとともに一過性に同時発現させた。上清を収集し、ADCCアッセイを使用して分析した。図14は突然変異体のADCC活性が濃度依存的であることを示している。表8にまとめるように、変異型Fc領域を有する5つの免疫グロブリンは、野生型ch4-4-20に比べて高いADCC活性を有した。5つの突然変異体は以下の通りであった: MGFc-27(G316D、A378V、D399E);MGFc-31(P247L、N421K);MGFc-10(K288N、A330S、P396L);MGFc-28(N315I、V379M、T394M);MGFc-29(F243I、V379L、G420V)。
FcγRIIIAおよびFcγRIIBへの、Fc突然変異体を有するch4-4-20抗体の結合の動力学パラメーターは、BIAcoreアッセイ(BIAcore装置1000、BIAcore Inc.、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)を使用して分析した。このアッセイで使用したFcγRIIIAは、FcγRIIIA細胞外領域が上記6.2節に記載したリンカー-AVITAG配列に連結している可溶性単量体タンパク質であった。このアッセイに使用したFcγRIIBは、参照により本明細書に組み込まれている、2003年1月13日に出願された米国仮出願第60/439,709号に記載された方法通りに調製された可溶性二量体タンパク質であった。簡潔には、使用したFcγRIIBは、ヒトIgG2のヒンジ-CH2-CH3ドメインに融合したFcγRIIB細胞外ドメインであった。
図16に、BSA-FTIC固定化センサーチップ上への突然変異型Fc領域を有するch4-4-20抗体の捕捉を示す。約20μg/mLの濃度の抗体6μLを5μL/minでBSA-FITC表面にインジェクトした。図17は、変異型Fc領域を担持するch-4-4-20抗体へのFcγRIIIAのリアルタイム結合のセンサーグラムである。FcγRIIIAの結合を200nM濃度で分析し、野生型ch-4-4-20抗体について得られた反応レベルに共鳴シグナル反応を基準化した。ch-4-4-20抗体へのFcγRIIIAの結合についての動力学的パラメーターは、2つの異なるFcγRIIIA濃度である200および800nMで得られたデータをあてはめることによって得た(図18)。実線は、32〜34秒間の解離曲線について計算したKoff値に基づいて得られた会合のあてはめを表す。KDおよびKoffは、使用した2つの異なるFcγRIIIA濃度から計算した平均に相当する。図19は、変異型Fc領域を担持するch-4-4-20抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質のリアルタイム結合のセンサーグラムである。FcγRIIB-Fc融合タンパク質の結合を200nM濃度で分析し、野生型ch-4-4-20抗体について得られた反応レベルに共鳴シグナル応答を基準化した。ch-4-4-20抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質の結合についての動力学的パラメーターは、2つの異なるFcγRIIB-Fc融合タンパク質濃度である200および800nMで得られたデータをあてはめることによって得た(図20)。実線は、32〜34秒間の解離曲線について計算したKoffに基づいて得られた会合のあてはめを表す。KDおよびKoffは、使用した2つの異なるFcγRIIB-Fc融合タンパク質濃度からの平均に相当する。
以下の突然変異体のスクリーニングは、FcγRIIIAへの結合向上およびFcγRIIBへの結合減少を示す追加の組の突然変異体を同定することを目的にした。選択されたFc変異体の2次スクリーニングは、ELISAに続いて4-4-20系でADCCについて試験することにより行った。次に、標的としてフルオレセイン被覆SK-BR3細胞およびエフェクター細胞集団としてヒトドナーから単離したPBMCを使用して、突然変異体が4-4-20を介したADCCを媒介する能力に主に基づいて、その突然変異体を選択した。次に、ADCCの相対的増大、例えば係数2の増強を示したFc突然変異体を抗HER2/neuまたは抗CD20 chAbにクローニングし、標的として適切な腫瘍細胞を使用したADCCアッセイで試験した。この突然変異体もまたBIAcoreにより分析し、それらの相対Koffを決定した。
このスクリーニングの目的は、FcγRIIBにもはや結合しないか、FcγRIIBへの結合減少を示すかのいずれかのFc突然変異体の同定であった。10倍過剰の未処理ライブラリー(約107細胞)を、FcγRIIBで被覆した磁気ビーズ(「My One」、Dynal)とともにインキュベートした。ビーズに結合した酵母は、磁場中にこの混合物を含む試験管を置くことにより未結合画分から分離した。ビーズに結合しなかった酵母細胞を取り出し、新鮮培地に入れた。次に、これらの細胞をFcγRIIIA被覆ビーズに結合させた。ビーズに結合した酵母は、磁場中にこの混合物を含む試験管を置くことにより未結合画分から分離した。未結合の酵母を除去し、結合した細胞をボルテックスで激しく撹拌することにより取り出した。回収した細胞はグルコース含有培地の中で再生育させ、ガラクトースを含有する選択培地中で再誘導した。この選択工程を繰り返した。次に、最終的な培養物をDNAの採集に使用した。Fcドメインを有する挿入部をPCRにより増幅し、4-4-20にクローニングした。約90個のFc突然変異体を4-4-20 ELISAアッセイおよびADCCアッセイによりスクリーニングし、結果として得られた陽性突然変異体を表19に示す。
最初のライブラリースクリーニングから、位置396でアミノ酸がプロリンからロイシンに変化した(P396L)突然変異を同定した。このFc変異体は、FcγRIIIAおよびFcγRIIBの両方に増大した結合を示した。2番目のライブラリーは、ベースラインとしてP396Lを使用して構築した。PCR突然変異誘発を使用して、それぞれP396L突然変異を有し、追加のヌクレオチド変化を有する約107個の突然変異体を発生させた。2組の条件を使用してP396Lライブラリーをスクリーニングした。
スクリーニング1からのFc変異体の分析は、2回目のスクリーニングから選択された突然変異が、FcγRIIIAおよびFcγRIIBの両方に結合向上を有したことを示した。したがって、確立した条件で磁気ビーズ(固相)を使用した連続枯渇および選択がFcγRIIIAおよびFcγRIIBの結合の差について効率的に選択しなかったことを示唆した。したがって、FcγRIIIAに結合するが、FcγRIIBもは結合減少を有するか、または結合しない突然変異体についてさらに効果的にスクリーニングするために、固相FcγRIIB枯渇段階をFACs分取によるFcγRIIIA選択と組合せた。この組合せによって、野生型Fcよりも大きいまたは等しい親和性でFcγRIIIAに結合するFc変異体を同定した。
IgG1 Fcドメインに異なる結合親和性を有する、FcγRIIIA受容体の2つの異なる対立遺伝子が存在する(Koene et al., 1997, Blood 90: 1109-1114; Wu et al., 1997, J. Clin. Invest. 100: 1059-70)。158F対立遺伝子は158V対立遺伝子の5〜10分の1の結合定数でFcドメインに結合する。以前に、リガンドとして高結合性158V対立遺伝子を使用して、酵母ディスプレイを用いたFcスクリーニングの全てが行われた。この実験では、リガンドとしてビオチン化FcγRIIIA 158F-リンカー-avitag単量体を使用して、FcγRIIB枯渇酵母集団からFc突然変異体を選択した。FcγRIIIA 158F結合細胞の上位0.25%を選択するように分取ゲートを設定した。結果として得られた濃縮集団をFACSにより分析した(図24B)。次に、個別のクローンを単離し、異なるFcγRへの個のクローンの結合をFACSにより分析した(図24B)。この集団からの個別のクローンの分析は、5つの突然変異を有する単一の突然変異体MgFc67(V284M、S298N、K334E、R355W、R416S)の同定を招いた。この突然変異体は、FcγRIIIAへの結合増強およびFcγRIIBへの結合減少を有した。
次に、標準的なADCCアッセイを使用して、上記スクリーニングで選択した突然変異体を分析し、Fc突然変異体を有するch4-4-20により媒介された溶解の相対速度を決定した。すでに上に記載した方法を使用して、Fc変異体を担持するch4-4-20抗体を構築した。上記(6.7節)のように、SK-BR3細胞を標的として使用し、エフェクター細胞は、Ficoll勾配を使用してドナーから単離したPBMCであった。突然変異体についてのADCC活性の結果を表23にまとめる。
次に、上記スクリーニングで選択された突然変異体をBIAcoreにより分析し、FcγRIIIA(158V)およびFcγRIIBへの結合についての動力学的パラメーターを決定した。使用した方法は、上記6.8節に開示した方法に類似していた。
材料と方法
FcγRIIIAへの結合向上を示すFc変異体を、60:1のエフェクター:標的比を用いたPBMCに基づくADCCにより試験した。2つの異なる腫瘍モデル系SK-BR3(抗HER2/neu)およびDaudi(抗CD20)を標的として使用した。各突然変異体について比溶解率を定量した。最大溶解率を100%に設定して、一次回帰分析を用いてデータをプロットした。
Fc突然変異体はSK BR3細胞において向上したPBMC媒介性ADCC活性を示した(図29)。このプロットは、標準ADCCアッセイの一次回帰分析を示す。エフェクター:標的比を75:1で使用して、対数が3の範囲で抗体をタイトレーションした。溶解率(%)=(実験での放出-SR)/(MR-SR)×100。
マウス腫瘍モデルにおいて、FcγR依存的腫瘍細胞殺滅はマクロファージおよびNK細胞によって媒介される(Clynes et al., 1998, PNAS USA, 95: 652-6)。ドナーから精製した単球をエフェクター細胞として使用して、Fc突然変異体がADCCアッセイにおいて標的細胞の細胞傷害をトリガーする効率を分析した。FcγRI、FcγR3A、およびFcγR2Bの発現パターンは、異なる生育条件により影響される。凍結した単球を、異なる組合せのサイトカインおよびヒト血清を含有する培地中で培養したものからのFcγRの発現を、FcR特異的MAbを使用したFACSにより調べた(図31)。培養細胞をFcγR特異的抗体で染色し、FACSにより分析してMDM FcγRプロファイルを決定した。マクロファージのin vivoのFcγR発現を最もよく模倣する条件、すなわちCD16およびCD32Bを発現している細胞が最大画分を示した条件を、単球由来マクロファージ(MDM)に基づくADCCアッセイに使用した。図31での実験について、水ひした単球を凍らせたものを、M-CSF(条件1)またはGM-CSF(条件2)のいずれかを含有するDMEMおよび20% FBS中で8日間生育させた。図32の実験について、水ひした単球を凍らせたものを、GM-CSF、IL-2、およびIFNγを含有するDMEMおよび20% FBS中で2日間培養してからADCCアッセイを行った。高レベルのCD16およびCD32Bを発現させる無血清条件もまた開発した(データは示さず)。簡潔には、精製単球を、GM-CSF、M-CSF、IL-6、IL-10、およびIL-1βを含有するMacrophage-SFM(Invitrogen)中で6〜8日間生育させた。これらの培養液中のCD32B+/CD16+細胞の存在度は、サイトカインの混合物を使用したときに最高であるが、2つ以上のサイトカインの組合せは、FcγRの発現もまた高めるものである(M-CSF/IL-6、M-CSF/IL-10;またはM-CSF/IL-1β)。ADCCアッセイのために最終の24〜48時間にIFNγを添加する。
Fc突然変異体は、FcγRIIIAへのその結合増大に基づき最初に同定した。続いて、全ての低親和性受容体についての親和性向上および多くの場合でPBMCにより媒介されるADCCにおける活性向上について、これらの突然変異体を確認した。in vivo抗体媒介性細胞傷害は、複数のメカニズムにより起こることがある。ADCCに加えて、その他の可能性のあるメカニズムには、補体依存性細胞傷害(CDC)およびアポトーシスがある。免疫グロブリンのFc領域へのC1qの結合は、CDCにより細胞溶解を生じるカスケードとして開始する。C1qとFcとの相互作用は、一連のFc突然変異体で研究されている。これらの実験結果は、C1qおよび低親和性FcRがFcの重複する領域に結合するが、Fc内の正確な接触残基は変動することを示す。
Fc突然変異体を試験するために抗CD20および標的としてDaudi細胞を用いたCDCアッセイを使用した。モルモット血清(US Biological)を補体原として使用した。CDCアッセイはPBMCに基づくADCCに類似していた。標的細胞にユーロピウムを負荷し、ChMAbでオプソニン化した。しかし、補体であるモルモット血清をエフェクター細胞の代わりに添加した。図33はアッセイのフローチャートを示す。3オーダーの強度にわたり抗CD20 ChMabをタイトレーションした。溶解率(%)を計算した。Daudi細胞(3×106個)をBADTA試薬で標識した。1×104細胞を96ウェルプレートのウェルに分取した。3倍希釈を用いて抗体をウェルにタイトレーションした。オプソニン化反応は、5% CO2中で37℃で30〜40分間進行させた。モルモット血清を終濃度20%まで添加した。反応は5% CO2中で37℃で3.5時間進行させた。続いて、細胞培養液100ulを反応物に添加し、細胞を遠心沈殿させた。検出のために、上清20ulをユーロピウム溶液200ulに添加し、プレートをVictor2(Wallac)で読み取った。
活性化FcRまたはC1qのいずれかに対する結合向上を示す全ての突然変異体を、CDCアッセイに配置した(図34)。FcγRIIIAへの結合増強を示したFc突然変異体は、補体活性の向上もまた示した。各突然変異体は、野生型に比べて高い補体活性を示す。試験した突然変異体は二重突然変異体である。それぞれの場合で、存在する突然変異の1つはP396Lである。
FcγRIIBへの結合を減少させ、FcγRIIA 131Hへの結合を増大させるFc突然変異体についての選択に基づいて、D270Eを含むいくつかの突然変異を同定した。低親和性Fc受容体およびその対立遺伝子変異体への結合について各突然変異を個別に試験した。
表26および27、ならびに図38および39に示すように、D270E突然変異の付加は、FcγRIIIAおよびFcγRIIA H131の結合を高め、FcγRIIBへの結合を減少させる。図40は、選択された突然変異体についてのCD32A H131Hの結合について決定された、Koffに対するMDM ADCCデータのプロットを示す。
2つのアロタイプのFcγRIIIA、FcγRIIA 131H、およびFcγRIIBにFc突然変異体を有するキメラ4D5抗体の結合の動力学的パラメーターは、上記6.8節に開示した方法に類似した方法を用いてBIAcoreにより分析した。2つのアロタイプのFcγRIIIA、すなわちFcγRIIIA 158V、およびFcγRIIIA 158Fを上記6.9節にさらに詳細に述べる。
このアッセイに使用した両アロタイプのFcγRIIIAは、可溶性単量体タンパク質であり、FcγRIIIAの細胞外領域は、6.2節に記載するようにリンカー-AVITAG配列に連結している。このアッセイに使用したFcγRIIBおよびFcγRIIAは、可溶性二量体タンパク質であり、すなわちFcγRIIBまたはFcγRIIAの細胞外ドメインは、上記6.8節に記載されたヒトIgG2のヒンジ-CH2-CH3ドメインに融合していた。
FcγRIIIAのアロタイプ158Vおよび158F、FcγRIIB、ならびにFcγRIIA 131Hの結合を分析し、野生型キメラ4D5抗体について得られた反応レベルに共鳴反応を基準化した。キメラ4D5抗体へのFcγRの結合についての動力学的パラメーターは、2つの異なるFcγR濃度、すなわちFcγRIIIA V158およびFcγRIIIA 158Fの両方について400nMおよび800nM;FcγRIIAおよびFcγRIIBの両方について100nMおよび200nMでデータをあてはめることにより得た。
実施例6.14で、FcγIIIAおよび/またはFcγIIAに対して増大した親和性を含むと同定されたFc突然変異の相対ADCC活性についてそれらの突然変異体を分析した。
ADCCアッセイに関する詳細は、6.7節に見出される。このアッセイでは、インジウム-111を負荷したHT29結腸癌細胞(ATCC受託番号HTB-38)を標的として使用し、エフェクター細胞は、Ficoll勾配を用いてドナーから単離されたPBMCであった。標的細胞は、変異型Fc領域を含む終濃度2〜5000ng/mlのキメラ4D5抗体でオプソニン化した。次に、オプソニン化した標的細胞をエフェクター細胞に添加して、エフェクター:標的比を50:1とし、37℃、5% CO2で18時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞を約220×gで10℃で5分間遠心分離した。上清中のインジウム-111のレベルをガンマカウンターで記録した。
変異型Fc領域であるMGFc88(F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L)、MGFc88A(F243L、R292P、Y300L、P396L)、およびMGFc155(F243L、R292P、Y300L)を含むキメラ4D5抗体を、FcγRIIIAおよび/またはFcγIIAに対する結合増強に基づいて選択し、それらのADCC活性について試験した。図41AおよびBは、試験したFc変異体が、20ng/mlを超えるオプソニン化濃度で濃度依存的に野生型抗体に比べて高いADCC活性を示すことを示している。このデータは、FcγRIIIAに対して増大した親和性を含むと同定されたFc突然変異体が、高いADCC活性もまた示すと考えられることを示している。
in vivo腫瘍モデル系を用いて、FcγIIIAおよび/またはFcγIIAに対して高い親和性を含むと同定されたFc突然変異体を、腫瘍制御の相対有効性についてさらに分析した。
マウス異種移植系での抗腫瘍活性についてFc突然変異体を有する抗体を試験した。Balbc/ヌードマウスにDaudi細胞5×106個を皮下注射し、続いて病気の全身徴候、例えば体重増加/減少およびグルーミング活動についてモニターした。無処置では、このモデル系は腫瘍細胞接種から約2週間の平均生存期間で100%の死亡率を生じる。処置は、1週間間隔で適用した野生型抗体または変異型Fc領域を含む抗体の投与からなる。同間隔で緩衝液単独を投与した動物を対照とする。式(幅2×長さ)/2により推定した皮下の腫瘍の体積に基づいて腫瘍重量を計算する。
Daudi細胞を接種したマウスに、1週間間隔で野生型ヒト化2B6(「h2B6」)、突然変異型FcMG0088(F243L、R292P、Y300L、V305I P396L)を含むヒト化2B6(「h2B6 0088」)、または緩衝液単独を投与した。野生型およびFc突然変異型h2B6抗体は、試験した最高用量スケジュールである1週間用量25μgで類似のレベルの腫瘍抑制を示した(図42AおよびB)。しかし、抗体の有効性の有意差は、用量を減らしたときに観察された。野生型h2B6の投薬量を100分の1および10分の1に減らすと、緩衝液単独の投与よりも大きい腫瘍制御はもたらされなかった(図42A)。対照的に、h2B6 0088は、2.5μgの1週間用量で有意な防御を、および0.25μgの1週間用量で少なくとも限定された防御をもたらした(図42B)。
Claims (39)
- 変異型Fc領域を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドの前記変異型Fc領域が、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む場合に示す結合親和性と比べて高い親和性でFcγRIIIAに結合するように、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比べてアミノ酸改変を含み、前記アミノ酸改変は、
(1)243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、300位でのロイシンによる置換、305位でのイソロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;
(2)243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、300位でのロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;
(3)243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および300位でのロイシンによる置換;
(4)243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および396位でのロイシンによる置換;
(5)243位でのロイシンによる置換、292位でのプロリンによる置換、および305位でのイソロイシンによる置換;または
(6)243位でのロイシンによる置換および292位でのプロリンによる置換;
(ここで、該位置はKabatにあるようなEUインデックスに従い番号付けされる)
を含む、前記ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドの前記変異型Fc領域が、前記ポリペプチドが野生型Fc領域を含む場合に示す結合親和性と比べて改変された親和性でさらにFcγRIIBに特異的に結合する、請求項1に記載のポリペプチド。
- Fc領域がヒトIgG Fc領域である、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- ヒトIgG Fc領域がヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域である、請求項3に記載のポリペプチド。
- 前記変異型Fc領域を含む抗体または抗体の断片である、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項5に記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体がヒト化抗体である、請求項5に記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体がCD16AまたはCD32Bに結合する可変ドメインを含む、請求項5に記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体が2B6である、請求項5に記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体が2B6のヒト化型である、請求項5に記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体が2B6抗体のCD32Bとの結合を競合的に阻害する、請求項5に記載の抗体またはその断片。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- 請求項12に記載の核酸を含むベクター。
- 発現ベクターである、請求項13に記載のベクター。
- 請求項12に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドを組換えによって産生するための方法であって、(i)培地中で、前記ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること、および(ii)前記ポリペプチドを前記培地から回収することを含む、前記方法。
- 請求項5に記載の抗体またはその断片であって、前記抗体または断片がさらに癌抗原に特異的に結合した、前記抗体またはその断片。
- 野生型Fc領域を含む比較可能な治療用抗体と比べて増強された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を媒介する、請求項17に記載の抗体またはその断片。
- 前記治療用抗体が、トラスツズマブ、リツキシマブ、抗CD14抗体、エドレコロマブ、抗EGFR IgG抗体、抗CD14抗体、抗αVβ3インテグリン抗体、抗CD52 IgG1抗体、抗CD22抗体、または抗CD20抗体である、請求項17に記載の抗体またはその断片。
- 前記癌抗原が、KS1/4全癌腫抗原、黒色腫関連抗原、黒色腫特異抗原、卵巣癌抗原(CA125)、前立腺特異抗原、前立腺特異膜抗原、直腸結腸腫瘍関連抗原、腫瘍特異移植型の細胞表面抗原(TSTA)、分化抗原、上皮成長因子受容体(EGFR) 抗原、HER2/neu抗原、多形性上皮ムチン(PEM) 抗原、悪性ヒトリンパ球(APO-1)抗原、または皮膚T細胞リンパ腫抗原である、請求項17に記載の抗体またはその断片。
- 前記癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者の癌を治療するための医薬品の製造における請求項17に記載の抗体またはその断片の使用。
- 前記癌抗原が、KS1/4全癌腫抗原、黒色腫関連抗原、黒色腫特異抗原、卵巣癌抗原(CA125)、前立腺特異抗原、前立腺特異膜抗原、直腸結腸腫瘍関連抗原、腫瘍特異移植型の細胞表面抗原(TSTA)、分化抗原、上皮成長因子受容体(EGFR) 抗原、HER2/neu抗原、多形性上皮ムチン(PEM) 抗原、悪性ヒトリンパ球(APO-1)抗原、または皮膚T細胞リンパ腫抗原である、請求項21に記載の使用。
- 前記癌抗原が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、または膵癌の抗原である、請求項21に記載の使用。
- 前記医薬品が、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、または免疫療法用の組成物をさらに含む、請求項21に記載の使用。
- 前記患者がヒトである、請求項21に記載の使用。
- 治療上有効量の請求項1または2に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 治療上有効量の請求項5に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 治療上有効量の請求項6に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 治療上有効量の請求項17に記載の治療用抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 1つまたは複数の追加の抗癌剤をさらに含む、請求項29に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数の抗癌剤が、化学療法剤、放射線治療剤、ホルモン療法剤、または免疫療法剤である、請求項30に記載の組成物。
- 請求項5に記載の抗体またはその断片の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- 請求項32に記載の核酸を含むベクター。
- 発現ベクターである、請求項33に記載のベクター。
- 請求項32に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項5に記載の抗体またはその断片を組換えによって産生するための方法であって、
(i)培地中で、
(a)前記抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、
(b)前記抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、
を含む宿主細胞を前記抗体の発現に適した条件下で培養すること、および、
(ii)前記抗体を前記培地から回収すること、
を含む、前記方法。 - 癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者の癌を治療または管理するための医薬品の製造における請求項1に記載のポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドが前記癌抗原に結合する、前記使用。
- 前記抗体またはその断片が、野生型Fc領域を含む場合の前記抗体のADCC活性と比べて増強されたADCC活性を有する、請求項5に記載の抗体。
- 前記変異型Fc領域が、表5、6、7または8に挙げられたアミノ酸改変のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1または2に記載のポリペプチド。
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