JP6389093B2 - 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法 - Google Patents

変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法 Download PDF

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Description

1. 発明の分野
本発明は、変異型Fc領域を含む分子、特にポリペプチド、さらに特定すると免疫グロブ
リン（例えば、抗体）に関し、該変異型Fc領域は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個
のアミノ酸の改変を含み、野生型Fc領域を含む対応する分子よりも高い親和性でFcγRIII
Aおよび/またはFcγRIIAと結合する。本発明の分子は、疾患、障害または感染と関連した
1以上の症状を予防し、治療し、または改善するのに特に有用である。本発明の分子は、F
cγRにより媒介されるエフェクター細胞機能（例えば、ADCC）の増大した効力が望まれる
疾患または障害（例えば、癌、感染症）を治療または予防するのに、また、治療用抗体（
その効果がADCCによって媒介される）の治療効力を高めるのに、特に有用である。
2. 発明の背景
2.1 Fc受容体と免疫系におけるその役割
抗体-抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、広範囲の応答をもたらし、その範囲
はエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害作用、肥満細胞脱顆粒、および食作用
）から免疫調節シグナル（例えば、リンパ球増殖および抗体分泌の調節）にまで及ぶ。こ
れらの相互作用はすべて、抗体または免疫複合体のFcドメインが造血細胞上の特殊な細胞
表面受容体と結合することにより開始される。抗体と免疫複合体により開始される細胞応
答の多様性は、Fc受容体の構造上の不均一性からもたらされる。Fc受容体は、細胞内シグ
ナル伝達を媒介すると思われる構造的に関連したリガンド結合ドメインを共有する。
タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであるFc受容体は、
免疫グロブリン分子のFc部分と結合することができる表面糖タンパク質である。このファ
ミリーの各メンバーは、Fc受容体のα鎖上の認識ドメインを介して１以上のアイソタイプ
の免疫グロブリンを認識する。Fc受容体は免疫グロブリンサブタイプに対するその特異性
によって定義される。IgGに対するFc受容体はFcγRと、IgEに対するFc受容体はFcεRと、
そしてIgAに対するFc受容体はFcαRと呼ばれる。さまざまなアクセサリー細胞が異なるア
イソタイプの抗体に対するFc受容体を持ち、抗体のアイソタイプが所与の応答にどのアク
セサリー細胞が関わるかを決定する（Ravetch J.V.ら 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457
-92；Gerber J.S.ら 2001 Microbes and Infection, 3:131-139；Billadeau D.D.ら 2002
, The Journal of Clinical Investigation, 2(109):161-1681；Ravetch J.V.ら 2000, S
cience, 290:84-89；Ravetch J.V.ら, 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90；Ravetch J
.V. 1994, Cell, 78(4):553-60に論評されている）。種々のFc受容体、それを発現する細
胞、およびそのアイソタイプ特異性を表１にまとめてある（「免疫生物学：健康と病気に
おける免疫系（Immunobiology: The Immune System in Health and Disease）」, 第4版.
1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New Yorkから引用）。
Fcγ受容体
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関連ドメインのC2セットに関係する細
胞外ドメイン、１回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインを持つ内在性膜糖タ
ンパク質である。３種の公知のFcγRがあり、それぞれFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）
、およびFcγRIII（CD16）と呼ばれる。３種の受容体は異なる遺伝子によりコードされる
；しかし３種のファミリーメンバー間の広範な相同性は、これらが共通の祖先から、恐ら
くは遺伝子複製により生じたことを示唆する。
FcγRII（CD32）
FcγRIIタンパク質は40Kdaの内在性膜糖タンパク質であり、モノマーIgに対して低親和
性（106M-1）であるため複合体化したIgGとだけ結合する。この受容体は、単球、マクロ
ファージ、B細胞、NK細胞、好中球、肥満細胞、および血小板を含めて、全ての造血細胞
上に存在する最も広く発現されているFcγRである。FcγRIIは、その免疫グロブリン結合
鎖中に免疫グロブリン様領域を２つだけ有し、従って、IgGに対してFcγRIより遥かに低
い親和性を有する。３種のヒトFcγRII遺伝子（FcγRII-A、FcγRII-BおよびFcγRII-C）
が存在し、それらは全て凝集体または免疫複合体のIgGと結合する。
FcγRII-AとFcγRII-Bの細胞質内ドメイン内には明確な相違があるので、受容体ライゲ
ーションに対して２つの機能的に異種の応答を創出する。基本的な相違は、Aアイソフォ
ームが細胞活性化（例えば、食作用および呼吸バースト）に至る細胞内シグナル伝達を開
始するのに対して、Bアイソフォームは抑制的シグナルを開始し、例えばB細胞活性化を抑
制する、ことにある。
FcγRを介するシグナル伝達
活性化と抑制の両方のシグナルは、ライゲーション後にFcγRを介して伝達される。こ
れらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造上の相違からもたらされる
。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の２つの異なるドメイン、すなわち、免疫受
容体チロシン系活性化モチーフ（ITAM）または免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ITIM
）が、この異なる応答の原因となる。これらの構造体への異なる細胞質酵素の動員が、Fc
γR媒介細胞応答の結果を規定する。ITAM含有FcγR複合体にはFcγRI、FcγRIIA、FcγRI
IIAが含まれるが、ITIM含有複合体にはFcγRIIBだけが含まれる。
ヒト好中球はFcγRIIA遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的抗体架橋を介するFc
γRIIAクラスター形成は、ITAMを、ITAMリン酸化を容易にする受容体関連キナーゼととも
に凝集させるように作用する。ITAMリン酸化はSykキナーゼに対するドッキング部位とし
て役立ち、Sykキナーゼの活性化は下流の基質（例えば、PI3K）の活性化をもたらす。細
胞活性化により前炎症性メディエーターが放出される。
FcγRIIB遺伝子はBリンパ球上に発現され、その細胞外ドメインはFcγRIIAと96％同一
であって、識別できない様式でIgG複合体と結合する。FcγRIIBの細胞質ドメイン中のITI
Mの存在が、FcγRの抑制サブクラスを規定する。最近、この抑制の分子的基礎が確立され
た。活性化FcγRとともに結合されると、FcγRIIB中のITIMはリン酸化されて、イノシト
ールポリリン酸5'-ホスファターゼ（SHIP）のSH2ドメインを引き付け、これがホスホイノ
シトールメッセンジャー（ITAM含有FcγR介在チロシンキナーゼ活性化の結果として放出
される）を加水分解し、その結果、細胞内Ca++の流入を抑制する。従って、FcγRIIBの架
橋は、FcγRライゲーションに対する活性化応答を消失させ、細胞応答性を抑制する。こ
のようにしてB細胞活性化、B細胞増殖および抗体分泌が停止する。
Figure 0006389093
2.2 関連疾患
2.2.1 癌
新生物または腫瘍は、異常な無制御の細胞増殖から生じる新生物塊であり、良性または
悪性でありうる。良性腫瘍は一般的に局在化したままである。悪性腫瘍は集合的に癌と呼
ばれる。用語「悪性」は一般的に、腫瘍が近隣の体構造に侵入してそれを破壊し、そして
離れた部位まで広がって死を引き起こしうることを意味する（RobbinsおよびAngell, 197
6, 「基礎病理学（Basic Pathology）」, 第2版, W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp
.68-122を参照）。癌は身体の多くの部位に生じうるのであって、その起源に依存して異
なる挙動を示す。癌細胞は、その起源となる身体部位を破壊し、次いで他の身体部分に広
がって、そこで新しい増殖を開始してさらに破壊を引き起す。
毎年120万人以上の米国人が癌を発症している。癌は米国における死因の第２位であり
、もし現在の傾向が続くと、癌は2010年には第１の死因になると予想される。肺および前
立腺癌が米国における男性の癌死因のトップである。肺および乳癌が米国における女性の
癌死因のトップである。米国の男性２人のうちの１人は、人生のある時期に癌と診断され
うる。米国の女性３人のうちの１人は、人生のある時期に癌と診断されうる。
癌の治療法はまだ見出されていない。現在の治療選択肢、例えば手術、化学療法および
放射線療法は、しばしば効果がないかまたは重大な副作用を示す。
癌治療
現在、癌治療には、患者の新生物細胞を根絶する外科手術、化学療法、ホルモン療法お
よび／または放射線療法が含まれる（例えば、Stockdale, 1998, 「癌患者管理の原理（P
rinciples of Cancer Patient Management）」, in Scientific American: Medicine, vo
l.3, RubensteinおよびFederman編、第12章、第IV節を参照）。最近では、癌治療に生物
学的療法または免疫療法も含まれると考えられる。これらの手法は全て、患者にとって大
きい欠点を有する。例えば、外科手術は、患者の健康によっては禁忌であるかまたは患者
に受け入れられない。さらに、外科手術は完全に新生物組織を除去できるわけではない。
放射線療法は、新生物組織が放射線に対して正常組織より高い感受性を有するときにのみ
有効であり、かつ放射線療法はしばしば重大な副作用を引き起こすことがある。ホルモン
療法は単独の薬物として投与することは稀であり、たとえ有効であるとしても、他の治療
法により癌細胞の大部分を除去した後に、癌の再発を予防または遅延するために用いるこ
とが多い。生物学的療法／免疫療法は数が限られており、発疹もしくは腫脹、発熱、悪寒
および疲労を含むインフルエンザ様症状、消化器問題、またはアレルギー反応などの副作
用を生じうる。
化学療法に関しては、癌治療に利用しうる様々な化学療法剤が存在する。癌化学療法剤
の大部分は、DNA合成を直接、またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸前駆体の生合成
を抑制することにより間接的に、抑制して、DNA複製および随伴する細胞分裂を妨げるこ
とにより作用する（例えば、Gilmanら, 「グッドマンとギルマンの治療薬の薬理学的基礎
（Goodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics）」, 第8版（P
ergamom Press, New York, 1990）を参照）。これらの薬剤には、アルキル化剤（例えば
ニトロソ尿素）、代謝拮抗薬（例えばメトトレキセートおよびヒドロキシ尿素）、ならび
に他の薬剤（例えばエトポシド、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダ
ウノルビシン）などが含まれ、必ずしも細胞周期特異的ではないが、DNA複製に対するそ
れらの効果ゆえにS期に細胞を死滅させる。他の薬剤、具体的にはコルヒチンおよびビン
カアルカロイド（例えばビンブラスチンおよびビンクリスチン）は、微小管アセンブリー
を妨害して有糸分裂停止をもたらす。化学療法プロトコルは一般的に、治療効力を高める
ために化学療法剤の組み合わせを投与することを含む。
様々な化学療法剤を利用しうるが、化学療法には多数の欠点がある（例えば、Stockdal
e, 1998, 「癌患者管理の原理（Principles Of Cancer Patient Management）」 in Scie
ntific American Medicine, vol.3, RubensteinおよびFederman編、第12章、第10節を参
照）。ほとんど全ての化学療法剤は毒性があり、化学療法は、厳しい吐気、骨髄抑制、免
疫抑制などの顕著なかつしばしば危険な副作用を起こす。さらに、化学療法剤を組み合わ
せて投与しても多くの腫瘍細胞は化学療法剤に耐性があるかまたは耐性を発現する。実際
、治療プロトコルで使用される特定の化学療法剤に耐性のある細胞が、特定の処置に使用
される薬物の作用機構と異なる機構により作用する他の薬物に対してさえも耐性のあるこ
とがしばしば立証されている。この現象は多面的薬剤または多剤耐性と呼ばれる。このよ
うに、薬剤耐性があるため、多くの癌は標準的な化学療法プロトコルに抵抗性のあること
が判っている。
別の癌治療法、特に標準的な癌治療、例えば外科手術、放射線療法、化学療法、および
ホルモン療法に抵抗性があることが証明されている癌の治療法の必要性は非常に大きい。
希望がもてる代替法は免疫療法であり、この方法では癌抗原特異的抗体が癌細胞を特異的
に標的とする。免疫応答の特異性を利用することに向けて鋭意努力がなされていて、例え
ばハイブリドーマ技術が腫瘍選択的モノクローナル抗体の開発を可能にしており（Green
M.C.ら, 2000 Cancer Treat Rev., 26:269-286；Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26(supp
l. 14):43-51を参照）、この数年間、米国食品医薬品局（Food and Drug Administration
）は最初の癌治療用のモノクローナル抗体：非ホジキンリンパ腫用のリツキシン（Rituxi
n）（抗CD20）および転移性乳癌用のハーセプチン（Herceptin）［抗(c-erb-2/HER-2)］
を認可している(Suzanne A. Eccles, 2001, Breast Cancer Res., 3: 86-90)。しかし、
例えば抗体依存性細胞傷害作用（「ADCC」）を媒介する、抗体エフェクター機能の能力は
、このような治療に対する妨げとなる。従って、このような免疫治療の有効性を改善する
方法が必要である。
2.2.2 炎症性疾患と自己免疫疾患
炎症は、身体の白血球と化学物質が例えば細菌やウイルスなどの外来物質による感染か
ら我々の身体を防御するプロセスである。通常、痛み、腫脹、罹患域の熱と赤みを特徴と
する。サイトカインおよびプロスタグランジンとして知られる化学物質がこのプロセスを
制御し、秩序正しいかつ自己限定的なカスケードで血液または罹患組織中に放出される。
この化学物質の放出は損傷域または感染域への血流を増加し、そして赤みと熱を生じさせ
る。化学物質のいくらかは組織中への流体の漏れを引き起こして、腫脹をもたらす。この
防御プロセスは神経を刺激して痛みを起こさせる。これらの変化は、関連領域で限られた
期間だけ起こるときは、身体の利益に働く。
自己免疫および／または炎症性障害においては、免疫系は、戦うべき外来物質が存在し
ないときに炎症性応答を誘発し、身体の通常は防御免疫系が間違って自身を攻撃すること
によりそれ自身の組織に障害を引き起こす。さまざまな方法で身体を冒す多種多様な自己
免疫疾患が存在している。例えば、多発性硬化症の個体では脳が冒され、クローン病の個
体では腸が冒され、慢性関節リウマチの個体では関節の滑膜、骨および軟骨が冒される。
自己免疫疾患は１以上のタイプの身体組織の破壊を進めるので、器官の異常な増殖、また
は器官機能の変化が生じうる。自己免疫疾患は、１つの器官もしくは組織だけを冒したり
、または複数の器官と組織を冒したりする。自己免疫疾患により通常冒される器官および
組織としては、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺（例えば、甲状腺または膵臓）、筋肉
、関節、および皮膚が挙げられる。自己免疫疾患の例としては、限定するものではないが
、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、全身エリテマ
トーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、自己免疫内耳疾患、重症筋無
力症、ライター症候群、グレーヴズ病、自己免疫肝炎、家族性腺腫様ポリープ症および潰
瘍性大腸炎が挙げられる。
慢性関節リウマチ（RA）および若年性慢性関節リウマチは炎症性関節炎のタイプである
。関節炎とは、関節における炎症を説明する一般用語である。全てではないにしても、一
部のタイプの関節炎はねらいを誤った炎症の結果起こる。慢性関節リウマチに加えて、炎
症を伴った他のタイプの関節炎としては、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎
関節炎、および痛風性関節炎が挙げられる。慢性関節リウマチは、身体の両側の関節（例
えば、両方の手、手首または膝）で起こる慢性関節炎のタイプである。この対称性が慢性
関節リウマチをその他の関節炎から区別するのに役立つ。関節を冒すだけでなく、慢性関
節リウマチは時に、皮膚、眼、肺、心臓、血液または神経をも冒しうる。
慢性関節リウマチは、世界の人口の約1％が罹患しており、不具にする可能性がある。
米国における慢性関節リウマチの発生率はほぼ290万である。女性は男性より２〜３倍多
く罹患している。慢性関節リウマチが発症する典型的な年齢は25〜50才である。若年性慢
性関節リウマチには、71,000人の若い米国人（18歳以下）が罹患しており、少女のほうが
少年より６倍多い。
慢性関節リウマチは、身体の免疫系が関節の滑液を分泌する滑膜を異物として誤って同
定する場合に起こる自己免疫疾患である。炎症が生じ、関節内および周囲の軟骨と組織が
損傷または破壊される。重症の事例では、この炎症が他の関節組織および周囲の軟骨に広
がり、骨と軟骨を侵食または破壊して関節変形をもたらしうる。身体は損傷した組織を瘢
痕組織と置き換え、その結果、関節内の正常な空間が狭小になって、骨が互いに融合する
。慢性関節リウマチは硬直、腫脹、疲労、貧血、体重減少、発熱、およびしばしば、身体
障害の痛みを生じさせる。慢性関節リウマチのいくつかの共通した症状としては、覚醒時
の１時間以上継続する関節硬直；特定の指または手首の腫脹；関節周囲の軟部組織の腫脹
；および関節の両側の腫脹が挙げられる。腫脹は痛みを伴うかまたは伴わずに起こること
もあり、かつ進行して悪化するかまたは進行前に数年間同じ状態で留まることもある。
慢性関節リウマチの診断は、複数の要因の組み合わせに基づいて行われ、その要因とし
ては、痛みのある関節の特定の位置と対称性、朝の関節硬直の存在、皮膚下の瘤および小
節（リウマチ小節）の存在、慢性関節リウマチを示すＸ線試験結果、および／またはリウ
マチ因子と呼ばれる血液試験の陽性結果が挙げられる。全てではないにしても、慢性関節
リウマチを患う多くの人は、リウマチ様因子抗体を血液中に有する。リウマチ様因子は慢
性関節リウマチを患っていない人にも存在しうる。他の疾患もリウマチ様因子を血液中に
産生させることがある。このような訳で、慢性関節リウマチの診断は複数の要因の組み合
わせに基づいて行われ、血液中のリウマチ様因子の存在だけによることはない。
典型的な経過をたどる前記疾患は、持続性であるが変動性の関節症状の１つであって、
ほぼ10年後に患者の90％は骨と軟骨に構造上の障害を示しうる。小割合は完全に消滅する
短期の病気を有し、そして他の小割合は多数の関節変形および時にはこの疾患の他の徴候
を伴う重症の疾患を有する。炎症過程は関節内の骨と軟骨の侵食または破壊を引き起こす
。慢性関節リウマチでは、持続的な抗原提示、Ｔ細胞の刺激、サイトカインの分泌、滑膜
細胞の活性化、および関節破壊からなる自己免疫周期が存在する。この疾患は個体および
社会の両方に対して大きな影響を与え、著しい痛み、損なわれた機能および身体障害だけ
でなく、数百万ドルに価する保健費用と賃金損失をも引き起こす（例えば、NIHウエブサ
イトおよびNIAIDウエブサイトを参照）。
現在、関節炎に利用しうる治療法は、抗炎症薬または免疫抑制薬を用いて関節の炎症を
軽減することに重点が置かれている。関節炎に最初に使われる治療薬は、通常、抗炎症薬
、例えばアスピリン、イブプロフェンおよびCox-2阻害剤、例えばセレコキシブおよびロ
フェコキシブである。「第二選択薬物」（second line drug）には、金、メトトレキセー
トおよびステロイドが含まれる。これらは十分確立された関節炎の治療薬であるが、これ
らの治療薬だけではごく僅かの患者しか治らない。最近、慢性関節リウマチの病因の理解
が進んで、メトトレキセートが、サイトカインに対する抗体または組換え可溶性受容体と
組み合わせて使用されるに至っている。例えば、腫瘍壊死因子（TNF）αに対する組換え
可溶性受容体が、関節炎の治療でメトトレキセートと併用されている。しかし、メトトレ
キセートと抗TNFα薬（例えば、TNF-αに対する組換え可溶性受容体）の組合わせで治療
した患者のほぼ50％しか臨床上有意な改善を示さない。多数の患者は、治療にも関わらず
不応のままである。慢性関節リウマチ患者にとって困難な治療上の問題は依然として残っ
ている。多くの現行の治療法は高度の副作用発症があるかまたは疾患進行を完全に食い止
めることができない。今までのところ、治療は理想に程遠く、しかも治癒はあり得ない。
もっと効果的に慢性関節リウマチおよび他の自己免疫疾患を治療する新規の治療薬が必要
とされている。
2.2.3 感染性疾患
疾病を引き起こす病原体は5つのグループに分けられる。すなわち、ウイルス、細菌、
真菌、原生動物、および蠕虫（虫）である。これら病原体の注目すべき変種は適応免疫の
2つのきわめて重大な特徴の自然選択をもたらした。まず第一に、広範囲のさまざまな病
原体を認識できることの利点が、BおよびT細胞上の同等またはそれ以上の多様性の受容体
を発生させた。第二に、病原体の異なる生息地および生活環が、ある範囲の異なるエフェ
クター機構によって反撃されねばならない。それぞれの病原体の顕著な特徴は、その伝播
様式、その複製機構、その病因またはそれが疾病を引き起こす手段、およびそれが誘発す
る応答にある。
天然痘、コレラ、チフス、赤痢、マラリアなどにより引き起こされるヒトの苦痛および
死の記録は、感染性疾患を名高いものにしてきた。改善された公衆衛生、免疫化、および
抗菌剤治療によりもたらされた防御の著しい成功にもかかわらず、感染性疾患は依然とし
て現代医学の共通した重大問題となっている。人間の最もありふれた疾患である風邪は感
染性疾患であり、恐れられている現代病のAIDSもそうである。以前には神経変性疾患であ
ると考えられていた、いくつかの慢性神経学的疾患も感染性であることが判明した。今後
、感染性疾患が主な医学的問題として取り上げられ続けることに疑問の余地はない。
大多数のヒトおよび動物の疾患は、上記の病原体のいずれかからの有害な感染または日
和見感染より生じる（Belshe (編) 1984 Textbook of Human Virology, PSG Publishing,
Littleton, MAを参照のこと）。
感染性疾患の1つのカテゴリーは例えばウイルス感染である。呼吸器、CNS、皮膚、尿生
殖器、眼、耳、免疫系、胃腸管、および筋骨格系を含めて、さまざまな組織のウイルス感
染が、年齢を問わず、莫大な数のヒトを冒している（WyngaardenおよびSmith, 1988, Cec
il Textbook of Medicine, 18th版, W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 1750-1753
中の表328-2を参照のこと）。効果的な抗ウイルス治療のデザインに相当な努力がつぎ込
まれてきたが、ウイルス感染は依然、世界中の何百万という人々の命を脅かし続けている
。総じて、抗ウイルス薬を開発する試みはウイルス生活環のいくつかのステージに焦点が
当てられてきた（例えば、HIVについて論じている、Mitsuyaら, 1991, FASEB J. 5: 2369
-2381を参照のこと）。しかし、多くの最近の抗ウイルス薬を使用することに伴う一般的
な欠点は、その有害な副作用、例えば宿主に対する毒性または特定のウイルス株による耐
性である。
3. 発明の概要
本発明は、一部には、酵母ディスプレイ系を用いて、FcγR受容体（例えば、活性化性F
cγR、抑制性FcγR）に対して変更された親和性を有する突然変異型ヒトIgG1重鎖Fc領域
を同定したことに基づく。したがって、本発明は、1以上の領域に1個以上のアミノ酸の改
変（例えば置換、しかし挿入や欠失も含む）を有する変異型Fc領域を含んでなる分子、好
ましくはポリペプチド、さらに好ましくは免疫グロブリン（例えば、抗体）に関する。た
だし、前記アミノ酸の改変は、FcγRに対する変異型Fc領域の親和性を変更する（例えば
、増加または減少させる）ものである。好ましくは、前記1個以上のアミノ酸の改変は、F
cγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増加させるものである
。好ましい実施形態において、本発明の分子はさらに、野生型Fc領域を含む対応する分子
（すなわち、Fc領域に1個以上のアミノ酸の改変を有することを除いて、本発明の分子と
同じアミノ酸配列を有する）がFcγRIIBと結合するより低い親和性で、FcγRIIBと特異的
に結合する。いくつかの実施形態では、本発明は、1個以上のアミノ酸の改変を有する変
異型Fc領域を含む分子を包含し、前記改変は、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて
、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を増加させ、かつFcγ
RIIBに対する変異型Fc領域の親和性を高めるものである。他の実施形態では、本発明は、
1個以上のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記改変は、野生
型Fc領域を含む対応する分子と比べて、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する変異型
Fc領域の親和性を増加させるが、FcγRIIBに対する変異型Fc領域の親和性を変更しないも
のである。
本発明は、Fc領域のホモダイマーまたはヘテロダイマーである分子を包含する。Fc領域
を含むヘテロダイマーは、2つのFc鎖が同じまたは異なる配列を有する分子を指す。ある
実施形態において、変異型Fc領域を含むヘテロダイマー分子では、各鎖が他方の鎖とは異
なる1以上の改変を有する。他の実施形態において、変異型Fc領域を含むヘテロダイマー
分子では、一方の鎖が野生型Fc領域を含み、そして他方の鎖が1以上の改変を有する。ヘ
テロダイマーのFc含有分子を作製する方法は当技術分野で公知であり、本発明の範囲に包
含される。
いくつかの実施形態において、本発明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミ
ノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変異型Fc領域は、当業者に知
られた標準的なアッセイ（例えば、in vitroアッセイ）で測定したとき、いずれのFcγR
とも結合しないか、または、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、低下した親和性
で結合する。特定の実施形態では、本発明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のア
ミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変異型Fc領域は、1つのFc
γRとのみ結合し、ここで前記FcγRはFcγRIIIAである。別の特定の実施形態では、本発
明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含
む分子を包含し、前記変異型Fc領域は、1つのFcγRとのみ結合し、ここで前記FcγRはFc
γRIIAである。さらに別の実施形態では、本発明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1
個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変異型Fc領域は、1
つのFcγRとのみ結合し、ここで前記FcγRはFcγRIIBである。
本発明の分子のFcγRに対する親和性および結合特性は、初めに、Fc-FcγR相互作用（
すなわち、Fc領域とFcγRとの特異的結合）を測定するための当技術分野で公知のin vitr
oアッセイ（生化学または免疫学に基づいたアッセイ）、例えば、限定するものではない
が、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイなどを用いて測定
される（セクション5.2.1参照）。好ましくは、本発明の分子の結合特性はまた、1以上の
FcγRメディエーターエフェクター細胞機能を測定するためのin vitro機能アッセイによ
っても測定される（セクション5.2.6参照）。最も好ましい実施形態では、本発明の分子
は、in vitro系アッセイにおける結合特性と同様の結合特性をin vivoモデル（例えば、
本明細書に記載および開示されるもの）においても示すものである。しかしながら、本発
明は、in vitro系アッセイで所望の表現型を示さないがin vivoでは所望の表現型を示す
本発明の分子を除外するものではない。
特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、該変異
型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を含み、その結果、該
ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドがFcγRIIIAと結合するより
も高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになるが、ただし、前記変異型Fc領
域は、単独で329、331もしくは332位のいずれか1つの位置での置換を有することはなく、
また、256、290、298、312、333、334、359、360、326もしくは430位のいずれにもアラニ
ンを、330位にリシンを、339位にトレオニンを、320位にメチオニンを、326位にセリンを
、326位にアスパラギンを、326位にアスパラギン酸を、326位にグルタミン酸を、334位に
グルタミンを、334位にグルタミン酸を、334位にメチオニンを、334位にヒスチジンを、3
34位にバリンを、334位にロイシンを、または335位にリシンを含まないか、あるいは単独
で前記のいずれか1つによる置換ではない、上記分子を包含する。
別の特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、該
変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を含み、その結果
、該ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドがFcγRIIAと結合するよ
りも高い親和性でFcγRIIAと特異的に結合するようになるが、ただし、前記少なくとも1
個のアミノ酸の改変は、256、290、326、255、258、267、272、276、280、283、285、286
、331、337、268、272もしくは430位のいずれにもアラニンを、268位にアスパラギンを、
272位にグルタミンを、286位にグルタミン、セリンもしくはアスパラギン酸を、290位に
セリンを、320位にメチオニン、グルタミン、グルタミン酸もしくはアルギニンを、322位
にグルタミン酸を、326位にセリン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸を、330位にリ
シンを、335位にグルタミンを、または301位にメチオニンを含まないか、あるいは単独で
前記のいずれか1つによる置換ではない、上記分子を包含する。
好ましい特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって
、該変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を含み、その
結果、該分子はFcγRに対して改変された親和性をもつようになるが、ただし、前記変異
型Fc領域は、Sondermannら(2000 Nature, 406: 267-273；その全体を参照により本明細書
に組み入れる)により開示されるような、Fc-FcγR相互作用の結晶学的構造解析に基づい
て、FcγRと直接接触する位置での置換を有しない、上記分子を包含する。FcγRと直接接
触するFc領域内の位置の例は、アミノ酸234-239（ヒンジ部）、アミノ酸265-269（B/Cル
ープ）、アミノ酸297-299 (C'/Eループ）、およびアミノ酸327-332 (F/Gループ)である。
ある実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、結晶構造解析に基づいてFcγR
と直接接触しない（例えば、Fc-FcγR結合部位内に存在しない）少なくとも1個の残基の
改変を含んでなる。
別の好ましい実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、
該変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を含み、その結
果、該分子は、野生型Fc領域を含む分子に対して変更された親和性でFcγRと結合するよ
うになるが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変は、255、256、258、267、268
、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296
、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333
、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437
、438、439位のいずれにも置換を含まないか、または単独で前記位置での置換ではない、
上記分子を包含する。特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分
子であって、該変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を
含み、その結果、該分子は、野生型Fc領域を含む分子に対して変更された親和性でFcγR
と結合するようになるが、ただし、前記変異型Fc領域は、255、258、267、269、270、276
、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、300、303、305、307、309、322
、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、434、435、437、438、439位の
いずれにも置換を含まないか、または単独で前記位置での置換ではなく、また、256、290
、298、312、333、334、359、360、326もしくは430位のいずれにもアラニンを、330位に
リシンを、339位にトレオニンを、320位にメチオニンを、326位にセリンを、326位にアス
パラギンを、326位にアスパラギン酸を、326位にグルタミン酸を、334位にグルタミンを
、334位にグルタミン酸を、334位にメチオニンを、334位にヒスチジンを、334位にバリン
を、334位にロイシンを、335位にリシンを、268位にアスパラギンを、272位にグルタミン
を、286位にグルタミン、セリンもしくはアスパラギン酸を、290位にセリンを、320位に
メチオニン、グルタミン、グルタミン酸もしくはアルギニンを、322位にグルタミン酸を
、326位にセリン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸を、330位にリシンを、335位に
グルタミンを、または301位にメチオニンを有しない、上記分子を包含する。
特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、該変異
型Fc領域が、268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303
、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430
、434、435、437、438もしくは439位のいずれにも置換を含まないか、または単独で前記
位置での置換ではなく、また、280位にヒスチジン、グルタミンもしくはチロシンを、290
位にセリン、グリシン、トレオニンもしくはチロシンを、300位にロイシンもしくはイソ
ロイシンを、294位にアスパラギンを、296位にプロリンを、298位にプロリン、アスパラ
ギン、アスパラギン酸もしくはバリンを、295位にリシンを有しない、上記分子を包含す
る。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であっ
て、該変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を含み、そ
の結果、該分子は、野生型Fc領域を含む分子と比べて低下した親和性でFcγRと結合する
ようになるが、ただし、前記変異型Fc領域は、252、254、265、268、269、270、278、289
、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338
、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438もしくは439位の
いずれにも置換を含まないか、または単独で前記位置での置換ではない、上記分子を包含
する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であ
って、該変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を含み、
その結果、該分子は、野生型Fc領域を含む分子と比べて増大した親和性でFcγRと結合す
るようになるが、ただし、前記変異型Fc領域は、280、283、285、286、290、294、295、2
98、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398も
しくは430位のいずれにも置換を含まないか、または単独で前記位置での置換ではない、
上記分子を包含する。
具体的な実施形態において、本発明の分子は、1個以上のアミノ酸の改変（例えば、置
換）を有する変異型Fc領域を含んでなり、該改変は、野生型Fc領域を含む対応する分子と
比べて、変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を少なくとも2
倍増加させるものである。特定の実施形態では、本発明の分子は、1個以上のアミノ酸の
改変（例えば、置換）を有する変異型Fc領域を含んでなり、該改変は、野生型Fc領域を含
む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和
性を2倍より高く、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも8倍、ま
たは少なくとも10倍増加させるものである。本発明の他の実施形態では、変異型Fc領域を
含む本発明の分子は、野生型Fc領域を含む分子と比べて、少なくとも65％、少なくとも75
％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも
200％高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと特異的に結合する。そのような測
定は好ましくはin vitroアッセイである。
本発明は、活性化性および/または抑制性Fcγ受容体に対して変更された親和性を有す
る分子を包含する。特に、本発明は、1個以上のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を
含んでなる分子であって、該改変が、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型
Fc領域のFcγRIIBに対する親和性を増大させるが、変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/また
はFcγRIIAに対する親和性を低下させるものである、上記分子を包含する。他の実施形態
では、本発明は、1個以上のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含んでなる分子であ
って、該改変が、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγRIIBに
対する親和性を低下させる、かつ変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対す
る親和性をも低下させるものである、上記分子を包含する。さらに別の実施形態では、変
異型Fc領域を含んでなる分子であって、該改変が、野生型Fc領域を含む対応する分子と比
べて、変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性をも低下させるが
、変異型Fc領域のFcγRIIBに対する親和性を変更しないものである、上記分子を包含する
。
特定の実施形態において、本発明の分子は、1個以上のアミノ酸の改変（例えば、置換
）を有する変異型Fc領域を含んでなり、該改変は、FcγRIIIAおよびFcγRIIBと野生型の
親和性で結合する野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγRIIIA
に対する親和性を増加させるがFcγRIIBに対する親和性を減少させるものである。ある実
施形態において、1個以上のアミノ酸の改変は、256、298、333または334位のいずれの位
置でもアラニンによる置換ではない。
別の特定の実施形態において、本発明の分子は、1個以上のアミノ酸の改変（例えば、
置換）を有する変異型Fc領域を含んでなり、該改変は、FcγRIIIAおよびFcγRIIBと野生
型の親和性で結合する野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγRI
IAに対する親和性を増加させるがFcγRIIBに対する親和性を減少させるものである。ある
実施形態において、1個以上のアミノ酸の改変は、320位でのアルギニンによる置換ではな
い。
最も好ましい実施形態において、活性化性および/または抑制性受容体に対して変更さ
れた親和性を有する変異型Fc領域を含む本発明の分子は、1個以上のアミノ酸の改変を有
し、該改変は、288位でのアスパラギンによる置換、330位でのセリンによる置換、および
396位でのロイシンによる置換 (MgFc10) (表5参照); または334位でのグルタミン酸によ
る置換、359位でのアスパラギンによる置換、366位でのセリンによる置換 (MgFc13) ; ま
たは316位でのアスパラギン酸による置換、378位でのバリンによる置換、および399位で
のグルタミン酸による置換 (MgFc27); または392位でのトレオニンによる置換、および39
6位でのロイシンによる置換 (MgFc38); または221位でのグルタミン酸による置換、270位
でのグルタミン酸による置換、308位でのアラニンによる置換、311位でのヒスチジンによ
る置換、396位でのロイシンによる置換、および402位でのアスパラギン酸による置換 (Mg
Fc42); または240位でのアラニンによる置換、および396位でのロイシンによる置換 (MgF
c52); または410位でのヒスチジンによる置換、および396位でのロイシンによる置換 (Mg
Fc53); または243位でのロイシンによる置換、305位でのイソロイシンによる置換、378位
でのアスパラギン酸による置換、404位でのセリンによる置換、および396位でのロイシン
による置換 (MgFc54); または255位でのイソロイシンによる置換、および396位でのロイ
シンによる置換 (MgFc55); または370位でのグルタミン酸による置換、および396位での
ロイシンによる置換 (MgFc59)である。
FcγR親和性が変更された（例えば、FcγRIIIA親和性が高められた）変異型Fc領域を含
んでなる分子をスクリーニングして同定するための好適な方法は、酵母表面ディスプレイ
法である（BoderおよびWittrup, 2000, Methods in Enzymology, 328: 430-444を参照さ
れたい；その全体を参照により本明細書に組み入れる）。具体的には、酵母表面ディスプ
レイ法は、Fc変異体を含むポリペプチドがFcγRと相互作用するために接近しやすい形で
酵母細胞壁上に発現される遺伝子的方法である。本発明の変異型Fc含有ポリペプチドの酵
母表面ディスプレイは、当業者に公知の技法のいずれかまたは本明細書に記載される特定
の方法に従って行なうことができる。
本発明の一態様は、望ましい結合特性（例えば、野生型Fc領域を含む対応するポリペプ
チドがFcγRIIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAと結合する変異型Fc融合タンパ
ク質の能力）を有する変異型Fc融合タンパク質を選択するための方法を提供する。変異型
Fc融合タンパク質をディスプレイする酵母細胞は、結合相互作用を評価するための当業者
に公知の生化学的または免疫学的アッセイによりスクリーニングして、特徴づけることが
できる。具体的な実施形態では、1以上の生化学的アッセイ、例えばELISAアッセイを用い
て、変異型Fc融合タンパク質のスクリーニングを行なう。
好ましい実施形態において、FcγR親和性が変更された（例えば、FcγRIIIA親和性が高
められた）変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、1以上の生化学的ア
ッセイと共に本明細書に記載の酵母ディスプレイ法を用いて、好ましくはハイスループッ
ト方式で実施する。1以上の生化学的アッセイは、Fc-FcγR相互作用（すなわち、Fc領域
とFcγRとの特異的結合）を確認するための当技術分野で公知のどのようなアッセイでも
よく、例えば、限定するものではないが、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ
、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析などがある。
いくつかの実施形態では、FcγR親和性が変更された（例えば、FcγRIIIA親和性が高めら
れた）変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、1以上の機能的アッセイ
と共に本明細書に記載の酵母ディスプレイ法を用いて、好ましくはハイスループット方式
で実施する。機能的アッセイは、1以上のFcγR媒介エフェクター細胞機能を特徴づけるた
めの当技術分野で公知のどのようなアッセイでもよく、例えば本明細書のセクション5.2.
6に記載されるものがある。本発明の方法に従って用いることのできるエフェクター細胞
機能の例としては、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）、抗体依存性食作用、食作用、オプ
ソニン化、オプソノファゴサイトーシス（opsonophagocytosis）、細胞結合、ロゼット形
成、C1q結合、および補体依存性細胞傷害作用があるが、これらに限らない。いくつかの
実施形態では、FcγR親和性が変更された（例えば、FcγRIIIA親和性が高められた）変異
型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定は、1以上の機能的アッセイと共にまた
はそれと並行して、1以上の生化学的アッセイと共に本明細書に記載の酵母ディスプレイ
法を用いて、好ましくはハイスループット方式で実施する。
本発明に従ってFcγR-Fc相互作用を測定するための好適な方法は、本発明者らが開発し
たアッセイであり、それは、受容体のそのリガンドに対する親和性がもともと弱く、例え
ばFcγRIIBおよびFcγRIIIAに対する親和性がマイクロモル範囲であるにもかかわらず、
相互作用の検出ならびに定量を可能にするものである。この方法は、複合体化していない
FcγRと比べて、Fc領域に対して改善された結合力を有するFcγR複合体（例えば、FcγRI
IIA、FcγRIIB）の形成を含む。特定の実施形態において、本発明は、モノマーFcγRのFc
領域に対する親和性と比べて、Fc領域に対する親和性が高められたテトラマーFcγR複合
体を作製する方法を包含する。前記方法は、(i)15アミノ酸AVITAG配列がFcγRの可溶性領
域に機能的に連結されるような、融合タンパク質を製造すること、(ii)得られたタンパク
質を、大腸菌BirA酵素を用いてビオチン化すること、(iii)得られたビオチン化タンパク
質をストレプトアビジン-フィコエリトリンと適切なモル比で混合して、テトラマーFcγR
複合体を形成させること、を含んでなる。
本発明の好ましい実施形態では、Fc領域を含むポリペプチドは、複合体化されていない
モノマーFcγRと結合するよりも少なくとも8倍高い親和性で、本発明の方法により形成さ
れたテトラマーFcγR複合体と結合する。Fc領域を含むポリペプチドとテトラマーFcγR複
合体との結合は、当業者に公知の標準方法、例えば蛍光活性化セルソーティング(FACS)、
ラジオイムノアッセイ、ELISAアッセイなどを用いて測定することができる。
本発明は、Fc領域を含む分子の官能性を細胞系または無細胞系アッセイで測定するため
の上記方法により形成された免疫複合体の使用を包含する。
特定の実施形態において、本発明は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性
が増大した変異型Fc領域を含む改変された免疫グロブリンを提供する。こうした免疫グロ
ブリンには、もともとFcγR結合領域（例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領
域）を含むIgG分子、またはFcγR結合領域（例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結
合領域）を含むように遺伝子操作された免疫グロブリン誘導体が含まれる。本発明の改変
された免疫グロブリンは、抗原と結合し、好ましくは免疫特異的に結合し、すなわち特異
的な抗原-抗体結合をアッセイするための当技術分野で周知のイムノアッセイで測定した
とき非特異的結合に対しては競合せず、かつFcγR結合領域（例えば、FcγRIIIAおよび/
またはFcγRIIB結合領域）を含む、あらゆる免疫グロブリン分子を包含する。かかる抗体
としては、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異的、多
重特異的、ヒト、ヒト化、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグ
メント、ジスルフィド架橋Fv、およびVLもしくはVHドメインのいずれかまたは抗原と特異
的に結合する相補性決定領域(CDR)さえも含む、特定の場合にはFcγR結合領域を含むよう
に遺伝子操作されたまたはFcγR結合領域に融合された、フラグメントが含まれる。
ある実施形態において、本発明は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が
増大した変異型Fc領域を含む免疫グロブリンであって、結果的に、増大したエフェクター
機能（例えば、抗体依存性細胞傷害作用）を有するようになる、上記免疫グロブリンを包
含する。本発明の分子のエフェクター機能は、本明細書に記載のまたは当業者に公知のア
ッセイを用いて調べることができる。いくつかの実施形態では、FcγRIIIAおよび/または
FcγRIIAに対する親和性が増大した変異型Fc領域を含む免疫グロブリンは、野生型に対し
て少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、
または少なくとも100倍増大したADCC活性を有する。
本発明は、ヒトまたはヒト化治療用抗体（例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）を
Fc領域において1個以上のアミノ酸残基の改変（例えば、置換、挿入、欠失）により操作
することを包含する。ただし、前記改変は、FcγR活性化受容体および/またはFcγR抑制
受容体に対する該治療用抗体の親和性をモジュレートするものである。一実施形態では、
本発明は、ヒトまたはヒト化治療用抗体（例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）をFc
領域において1個以上のアミノ酸残基の改変により操作することに関し、その際、前記改
変は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増大させるものである
。別の実施形態では、本発明は、ヒトまたはヒト化治療用抗体（例えば、腫瘍特異的モノ
クローナル抗体）をFc領域において1個以上のアミノ酸残基の改変により操作することに
関し、その際、前記改変は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を
増大させ、さらにFcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させるものである。操作された
治療用抗体はさらに、当業者に公知の標準的なアッセイで測定して、増大したエフェクタ
ー機能、例えば増大したADCC活性、食作用活性などを有する。
特定の実施形態において、本発明は、Her2/neu原がん遺伝子に特異的なヒト化モノクロ
ーナル抗体（例えば、Carterら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-9に開示
されるようなAb4D5ヒト化抗体）を1個以上のアミノ酸残基の改変（例えば、置換、挿入、
欠失）により操作することを包含する。ただし、前記改変は、FcγRIIIAおよび/またはFc
γRIIAに対するFc領域の親和性を増大させるものである。別の特定の実施形態では、ヒト
化Her2/neuモノクローナル抗体の改変はさらに、FcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少
させるものである。さらに別の特定の実施形態では、Her2/neuに特異的な操作されたヒト
化モノクローナル抗体はさらに、本明細書に開示しかつ例示する当技術分野で公知の標準
アッセイにより測定して、増大したエフェクター機能を有する。
別の特定の実施形態において、本発明は、マウス・ヒトキメラ抗CD20モノクローナル抗
体2H7を1個以上のアミノ酸残基の改変（例えば、置換、挿入、欠失）により操作すること
を包含する。ただし、前記改変は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親
和性を増大させるものである。別の特定の実施形態では、抗CD20モノクローナル抗体2H7
の改変はさらに、FcγRIIBに対するFc領域の親和性を減少させるものである。さらに別の
特定の実施形態では、操作された抗CD20モノクローナル抗体2H7はさらに、本明細書に開
示しかつ例示する当技術分野で公知の標準アッセイにより測定して、増大したエフェクタ
ー機能を有する。
別の特定の実施形態において、本発明は、抗FcγRIIB抗体（2002年8月12日付けの米国
仮特許出願第60/403,266号および2003年8月14日付けの米国特許出願第10/643,857号（代
理人整理番号011183-010-999）に開示される抗体を含むが、それらに限定されない）を1
個以上のアミノ酸残基の改変（例えば、置換、挿入、欠失）により操作することを包含す
る。ただし、前記改変は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対するFc領域の親和性を増
大させるものである。本発明の方法により操作しうる抗FcγRIIB抗体の例としては、ATCC
受託番号PTA-4591を有する2B6モノクローナル抗体、およびATCC受託番号PTA-4592を有す
る3H7である（ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 02209-2011に寄託され
た）。別の特定の実施形態では、抗FcγRIIB抗体の改変はさらに、FcγRIIBに対するFc領
域の親和性を減少させるものである。さらに別の特定の実施形態では、操作された抗Fcγ
RIIB抗体はさらに、本明細書に開示しかつ例示する当技術分野で公知の標準アッセイによ
り測定して、増大したエフェクター機能を有する。特定の実施形態では、2B6モノクロー
ナル抗体は、334位でのグルタミン酸、359位でのアスパラギン、および366位でのセリン
による改変 (MgFc13) ; または316位でのアスパラギン酸、378位でのバリン、および399
位でのグルタミン酸による置換 (MgFc27); または243位でのイソロイシン、378位でのロ
イシン、および420位でのバリンによる置換 (MgFc29); または392位でのトレオニン、お
よび396位でのロイシンによる置換 (MgFc38); または221位でのグルタミン酸、270位での
グルタミン酸、308位でのアラニン、311位でのヒスチジン、396位でのロイシン、および4
02位でのアスパラギン酸による置換 (MgFc42); または410位でのヒスチジン、および396
位でのロイシンによる置換 (MgFc53); または243位でのロイシン、305位でのイソロイシ
ン、378位でのアスパラ貴覧さん、404位でのセリン、および396位でのロイシンによる置
換 (MgFc54); または255位でのイソロイシン、および396位でのロイシンによる置換 (MgF
c55); または370位でのグルタミン酸、および396位でのロイシンによる置換 (MgFc59)を
含む。
本発明はまた、本発明の方法により同定された、ポリペプチドおよび抗体を含めて、本
発明の分子をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明の分子をコードするポリヌ
クレオチドは、当技術分野で公知の方法により、決定された該ポリヌクレオチドのヌクレ
オチド配列から得ることができる。本発明は、本発明の分子をコードする単離された核酸
に関する。本発明はまた、前記核酸を含有するベクターを提供する。本発明はさらに、本
発明のベクターまたはポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、本発明の分子の製造方法を提供する。本発明の分子は、ポリペプチド
および抗体を含めて、当業者に公知の方法、特に組換え発現により製造することができる
。特定の実施形態では、本発明は、本発明の分子を組換えにより製造する方法を提供し、
この方法は、(i)該分子をコードする核酸を含有する宿主細胞を培地中で、該分子の発現
に適する条件下で培養すること、(ii)該培地から該分子を回収すること、を含んでなる。
本発明の方法により同定された分子は、疾患、障害または感染に関連した1以上の症状
を予防、治療または軽減するのに有用である。本発明の分子は、FcγRにより媒介される
エフェクター細胞機能（例えば、ADCC）の増大した効力が望まれる疾患または障害（例え
ば、癌、感染性疾患）の治療または予防に特に有用であり、また、治療用抗体（その効果
がADCCにより媒介される）の治療効力を高めるのに特に有用である。
一実施形態において、本発明は、癌抗原により特徴づけられる癌を有する患者において
その癌を治療する方法を包含し、この方法は、治療に有効な量の、該癌抗原と結合する治
療用抗体（本発明の方法に従って操作されたもの）を投与することを含んでなる。特定の
実施形態では、本発明は、癌抗原により特徴づけられる癌を有する患者においてその癌を
治療する方法を包含し、この方法は、治療に有効な量の、該癌抗原と特異的に結合する治
療用抗体を投与することを含んでなり、該治療用抗体は、野生型Fc領域に対して少なくと
も1個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含み、結果的に、該治療用抗体は、野生
型Fc領域を含む治療用抗体がFcγIIIAと結合するよりも高い親和性でFcγIIIAと特異的に
結合するようになる。ただし、前記変異型Fc領域は、329、331または332位に置換を有し
ないものであり、また、256、290、298、312、333、334、359、360または430位のいずれ
にもアラニンを、330位にリシンを、339位にトレオニンを、320位にメチオニンを、326位
にセリンを、326位にアスパラギンを、326位にアスパラギン酸を、326位にグルタミン酸
を、334位にグルタミンを、334位にグルタミン酸を、334位にメチオニンを、334位にヒス
チジンを、334位にバリンを、または334位にロイシンを有しないものである。別の特定の
実施形態では、本発明は、癌抗原により特徴づけられる癌を有する患者においてその癌を
治療する方法を包含し、この方法は、治療に有効な量の、該癌抗原と特異的に結合する治
療用抗体を投与することを含んでなり、該治療用抗体は、野生型Fc領域に対して少なくと
も1個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含み、結果的に、該治療用抗体は、野生
型Fc領域を含む治療用抗体がFcγIIIAと結合するよりも高い親和性でFcγIIIAと特異的に
結合するようになり、さらに該治療用抗体は、野生型Fc領域を含む治療用抗体がFcγIIB
と結合するよりも低い親和性でFcγIIBと特異的に結合するようになる。ただし、前記変
異型Fc領域は、256、298、333または334位のいずれにもアラニンを有しないものである。
本発明は、癌抗原により特徴づけられる患者の癌を治療する方法を包含し、この方法は、
治療に有効な量の、該癌抗原と特異的に結合する治療用抗体を投与することを含んでなり
、該治療用抗体は変異型Fc領域を含み、その結果として、該抗体は増大したADCC活性をも
つようになる。
本発明は、患者において自己免疫疾患および/または炎症性疾患を治療する方法を包含
し、この方法は、患者に、治療に有効な量の変異型Fc領域を含む分子を投与することを含
んでなり、ここで、該変異型Fc領域は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸
の改変を有し、その結果、該分子は、野生型Fc領域を含む対応する分子よりも高い親和性
でFcγIIBと特異的に結合し、さらに、野生型Fc領域を含む対応する分子よりも低い親和
性でFcγIIIAと特異的に結合するようになり、そして該分子は免疫複合体（例えば、抗原
/抗体複合体）と結合する。本発明は、前記疾患の治療および/または予防に用いられる1
種以上の追加の予防剤または治療剤（例えば、免疫調節剤、抗炎症剤）を投与することを
さらに含む、自己免疫疾患および/または炎症性疾患の治療方法を包含する。
本発明はまた、被験者における感染性疾患の治療または予防方法を包含し、この方法は
、病原体またはその細胞性受容体と結合する1種以上の本発明の分子を治療または予防に
有効な量で投与することを含んでなる。本発明の分子により治療または予防しうる感染性
疾患は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物を含むがこれらに限らない病原体により引き起
こされる。
本発明の一態様によると、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、野生型Fc領域を含む対
応する分子と比べて、病原体（例えば、病原性タンパク質）に対して増大した抗体エフェ
クター機能を有する。特定の実施形態において、本発明の分子は、感染性疾患を引き起こ
す病原体の食作用および/またはオプソニン化を高めることによって、感染性疾患に対の
治療効果を増強する。別の特定の実施形態では、本発明の分子は、感染性疾患を引き起こ
す感染細胞のADCCを高めることによって、感染性疾患に対の治療効果を増強する。
いくつかの実施形態においては、本発明の分子を、治療または予防に有効な量の、感染
性疾患を治療および/または予防するための当業者に知られた1種以上の追加の治療剤と組
み合わせて投与することができる。本発明は、本発明の分子を、感染性疾患を治療および
/または予防するための当業者に知られた抗生物質と併用することを包含する。
本発明は、本発明の分子（例えば、変異型Fc領域を含むポリペプチド、変異型Fc領域を
含む免疫グロブリン、本発明に従って操作された治療用抗体）および製薬上許容される担
体を含有する医薬組成物を提供する。本発明はさらに、抗癌剤、抗炎症剤、免疫調節剤を
含むがこれらに限らない1種以上の追加の治療剤をさらに含有する医薬組成物を提供する
。
さらに具体的には、本発明は、以下の特徴を有する。
〔１〕抗原結合領域および変異型Fc領域を含んでなる抗体であって、該変異型Fc領域は
(A)抗体の野生型Fc領域に対して396位でのアミノ酸の改変を含むことにより該野生型Fc領
域とは異なり、該位置はKabatのEUインデックスに従い番号付けられており、かつ
(B)該野生型Fc領域に対して増大した親和性でFcγRと結合する、
上記抗体。
〔２〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の210位、215位、217位、246位、250位、2
55位、268位、288位、290位または419位でのさらなるアミノ酸改変を含むことにより該野
生型Fc領域と異なっている、上記〔１〕に記載の抗体。
〔３〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の210M、217S、227S、240A、242F、244H、
246T、247S、248M、250A、250S、255I、255L、258D、268D、268N、303I、305L、323I、32
6I、334N、358P、370E、375C、379M、384K、392T、400F、410H、419H、419L、または427A
でのさらなるアミノ酸改変を含むことにより該野生型Fc領域と異なっている、上記〔１〕
に記載の抗体。
〔４〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の、
(1) 221E、270E、308A、311Hおよび402D；
(2) 319Fおよび352L；
(3) 288R、307Aおよび344E；
(4) 210Mおよび261N；ならびに
(5) 243L、305I、378Dおよび404S
からなる群より選択されるさらなるアミノ酸改変を含むことにより該野生型Fc領域と異な
っている、上記〔１〕に記載の抗体。
〔５〕前記FcγRがFcγRIIIAである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の抗体。
〔６〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域と比較して、FcγRIIBに対して低下した親
和性を有する、上記〔５〕に記載の抗体。
〔７〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の、
(1) 221E、270E、308A、311H、396Lおよび402Ｄ；
(2) 243L、305I、376D、404Sおよび396L；
(3) 255Iおよび396L；
(4) 370Eおよび396L；
(5) 392Tおよび396L；ならびに
(6) 410Hおよび396L
からなる群より選択されるアミノ酸改変を含む、上記〔６〕に記載の抗体。
〔８〕前記変異型Fc領域が、野生型Fc領域よりも少なくとも2倍大きな親和性でFcγRIIIA
に特異的に結合する、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の抗体。
〔９〕前記抗原結合領域が癌抗原または感染性疾患に関連する抗原と結合する、上記〔１
〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の抗体。
〔１０〕前記抗体が癌抗原に結合し、抗体依存性細胞傷害を、野生型Fc領域を含む抗体よ
りも2倍効率的に媒介する、上記〔９〕に記載の抗体。
〔１１〕前記抗体が癌抗原に結合し、該癌抗原が、HER-2/neu、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、G
AGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、MUC-1、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、p
15、β-カテニン、ヒトパピローマウイルス-E6、またはヒトパピローマウイルス-E7であ
る、上記〔９〕に記載の抗体。
〔１２〕治療に有効な量の上記〔９〕に記載の抗体および製薬上許容される担体を含む医
薬組成物。
〔１３〕前記抗体が癌抗原に結合し、前記組成物が、化学療法剤、放射線療法剤、ホルモ
ン療法剤、および免疫療法剤からなる群より選択されるさらなる抗癌剤をさらに含む、上
記〔１２〕に記載の医薬組成物。
〔１４〕癌抗原を特徴とする癌を有する患者の癌治療での使用のための、上記〔１〕〜〔
１１〕のいずれか１つに記載の抗体または上記〔１２〕もしくは〔１３〕に記載の医薬組
成物。
〔１５〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の210位、215位、217位、246位、250位
、255位、268位、288位、290位または419位でのさらなるアミノ酸改変を含むことにより
該野生型Fc領域と異なっている、上記〔１４〕に記載の抗体または医薬組成物。
〔１６〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の210M、217S、227S、240A、242F、244H
、246T、247S、248M、250A、250S、255I、255L、258D、268D、268N、303I、305L、323I、
326I、334N、358P、370E、375C、379M、384K、392T、400F、410H、419H、419L、または42
7Aでのさらなるアミノ酸改変を含むことにより該野生型Fc領域と異なっている、上記〔１
４〕に記載の抗体または医薬組成物。
〔１７〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の、
(1) 221E、270E、308A、311Hおよび402D；
(2) 319Fおよび352L；
(3) 288R、307Aおよび344E；
(4) 210Mおよび261N；ならびに
(5) 243L、305I、378Dおよび404S
からなる群より選択されるさらなるアミノ酸改変を含むことにより該野生型Fc領域と異な
っている、上記〔１４〕に記載の抗体または医薬組成物。
〔１８〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の、
(1) 221E、270E、308A、311H、396Lおよび402Ｄ；
(2) 243L、305I、376D、404Sおよび396L；
(3) 255Iおよび396L；
(4) 370Eおよび396L；
(5) 392Tおよび396L；ならびに
(6) 410Hおよび396L
からなる群より選択されるアミノ酸改変を含む、上記〔１４〕に記載の抗体または医薬組
成物。
〔１９〕前記変異型Fc領域が、野生型Fc領域よりも少なくとも2倍大きな親和性でFcγRII
IAに特異的に結合する、上記〔１４〕〜〔１８〕のいずれか１つに記載の抗体または医薬
組成物。
〔２０〕前記抗体が、抗体依存性細胞傷害を、野生型Fc領域を含む抗体よりも2倍効率的
に媒介する、上記〔１４〕に記載の抗体または医薬組成物。
〔２１〕前記癌抗原が、HER-2/neu、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CD
K4、MUC-1、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、p15、β-カテニン、ヒトパ
ピローマウイルス-E6、またはヒトパピローマウイルス-E7である、上記〔１４〕に記載の
抗体または医薬組成物。
〔２２〕前記抗体が、感染性疾患に関連する抗原に結合する、該疾患関連抗原を特徴とす
る感染性疾患を有する患者での感染性疾患の治療での使用のための、上記〔９〕に記載の
抗体または上記〔１２〕に記載の医薬組成物。
〔２３〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の210位、215位、217位、246位、250位
、255位、268位、288位、290位または419位でのさらなるアミノ酸改変を含むことにより
該野生型Fc領域と異なっている、上記〔２２〕に記載の抗体または医薬組成物。
〔２４〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の210M、217S、227S、240A、242F、244H
、246T、247S、248M、250A、250S、255I、255L、258D、268D、268N、303I、305L、323I、
326I、334N、358P、370E、375C、379M、384K、392T、400F、410H、419H、419L、または42
7Aでのさらなるアミノ酸改変を含むことにより該野生型Fc領域と異なっている、上記〔２
２〕に記載の抗体または医薬組成物。
〔２５〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の、
(1) 221E、270E、308A、311Hおよび402D；
(2) 319Fおよび352L；
(3) 288R、307Aおよび344E；
(4) 210Mおよび261N；ならびに
(5) 243L、305I、378Dおよび404S
からなる群より選択されるさらなるアミノ酸改変を含むことにより該野生型Fc領域と異な
っている、上記〔２２〕に記載の抗体または医薬組成物。
〔２６〕前記変異型Fc領域が、前記野生型Fc領域の、
(1) 221E、270E、308A、311H、396Lおよび402Ｄ；
(2) 243L、305I、376D、404Sおよび396L；
(3) 255Iおよび396L；
(4) 370Eおよび396L；
(5) 392Tおよび396L；ならびに
(6) 410Hおよび396L
からなる群より選択されるアミノ酸改変を含む、上記〔２２〕に記載の抗体または医薬組
成物。
〔２７〕野生型Fc領域がヒトIgGのFc領域である、上記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１つ
に記載の抗体または医薬組成物。
〔２８〕前記ヒトIgG Fc領域が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域である、上記
〔２７〕に記載の抗体または医薬組成物。
〔２９〕396位での前記アミノ酸改変が該位置でのロイシンによる置換である、上記〔１
〕〜〔１１〕および〔１５〕〜〔２８〕のいずれか１つに記載の抗体。
3.1 定義
本明細書中で用いる「Fc領域」なる語は、IgG重鎖のC末端領域を定義するために用いら
れる。境界はわずかに変化しうるが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、Cys226からカルボキシ末
端にまで及ぶと定義される。IgGのFc領域は、2つの定常ドメイン、CH2およびCH3、を含む
。ヒトIgG Fc領域のCH2ドメインは、通常、アミノ酸231からアミノ酸341まで延びている
。ヒトIgG Fc領域のCH3ドメインは、通常、アミノ酸342からアミノ酸447まで延びている
。IgGのFc領域は、2つの定常ドメイン、CH2およびCH3、を含む。ヒトIgG Fc領域のCH2ド
メイン（「Cγ2」ドメインとも呼ばれる）は、通常、アミノ酸231-340まで延びている。C
H2ドメインは、それがもう一つのドメインと密接に対合していないという点でユニークで
ある。それどころか、インタクトな天然IgGの2つのCH2ドメイン間には、2つのN-結合分岐
糖鎖が介在している。
本明細書全体を通して、IgG重鎖中の残基の番号付けは、Kabatら, Sequences of Prote
ins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)（参
照により本明細書に組み入れる）におけるようなEUインデックスのそれである。「Kabat
におけるようなEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の番号付けを指す。
「ヒンジ部」は、一般的に、ヒトIgG1のGlu216からPro230までの広がりとして定義され
る。他のIgGアイソタイプのヒンジ部は、重鎖間S-S結合を形成する最初と最後のシステイ
ン残基を同じ位置に配置することにより、IgG1配列とアライメントさせることができる。
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、モノクローナル、多重特異的抗体、ヒト抗体、
ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、camelized 抗体、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、
Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合二重特異的Fv（sdFv）、細胞
内発現抗体（intrabody）、および抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば、本発明の抗
体に対する抗Idおよび抗-抗Id抗体を含む）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合
フラグメントを意味する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子
の免疫活性フラグメント、すなわち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン
分子はいずれのタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えば
、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IGA1およびIgA2）またはサブクラスであってもよい。
本明細書中で用いる、ポリペプチドまたはタンパク質に関する「誘導体」なる語は、ア
ミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入により改変されているアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドまたはタンパク質を指す。本明細書中で用いる「誘導体」はまた、改変されてい
る、すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質への任意のタイプの分子の共有結合により
改変されているポリペプチドまたはタンパク質を意味する。例えば、限定するものではな
いが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知
の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタン
パク質との結合などにより改変することができる。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質
は、限定するものでないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシ
ンの代謝的合成などを含めて、当業者に公知の技術を用いる化学的修飾により製造するこ
とができる。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが誘導される
元のポリペプチドまたはタンパク質と同様のまたは同一の機能を保持する。
本明細書中で用いる、非タンパク質誘導体に関しての「誘導体」なる語は、第１の有機
または無機分子の構造に基づいて形成された第２の有機または無機分子を意味する。有機
分子の誘導体は、限定するものではないが、例えば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カ
ルボキシルまたはアミン基の付加または欠失により、改変された分子を含む。有機分子は
また、エステル化、アルキル化および／またはリン酸化されてもよい。
本明細書中で用いる「障害」および「疾患」は、互換的に使用され、被験者の症状を意
味する。特に、用語「自己免疫疾患」は「自己免疫障害」と互換的に使用され、被験者自
身の細胞、組織および／または器官に対する被験者の免疫反応によって生じた細胞、組織
および／または器官の損傷により特徴づけられる被験者の症状を意味する。用語「炎症性
疾患」は用語「炎症性障害」と互換的に使用され、炎症、好ましくは慢性炎症により特徴
づけられる被験者の症状を意味する。自己免疫障害は炎症を伴っても伴わなくてもよい。
さらに、炎症は自己免疫障害に起因してもしなくてもよい。従って、ある特定の障害は自
己免疫と炎症性障害の両方により特徴づけられてもよい。
本明細書中で用いる「癌」なる語は、異常な無制御の細胞増殖から生じる新生物または
腫瘍を意味する。本明細書中で用いる癌は、明確に白血病およびリンパ腫を含む。いくつ
かの実施形態において、癌は局在化したままで存在する良性腫瘍を意味する。他の実施形
態において、癌は、近隣の身体構造に侵入して破壊し、離れた部位に広がる悪性腫瘍を意
味する。いくつかの実施形態では、癌は特定の癌抗原を随伴する。
本明細書中で用いる「免疫調節剤」およびその変形は、宿主の免疫系をモジュレートす
る薬剤を意味する。ある特定の実施形態においては、免疫調節剤は免疫抑制剤である。あ
る特定の実施形態においては、免疫調節剤は免疫賦活剤である。免疫調節剤としては、限
定するものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機
分子、ミメチック、および有機分子を含む。
本明細書中で用いる「エピトープ」なる語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好まし
くはヒトにおいて抗原性または免疫原性を有するポリペプチドまたはタンパク質の断片を
意味する。免疫原性を有するエピトープは、動物における抗体応答を誘発するポリペプチ
ドまたはタンパク質の断片である。抗原性を有するエピトープは、当業者に周知の方法、
例えばイムノアッセイにより確認される、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまた
はタンパク質の断片である。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。
本明細書中で用いる「断片」とは、他のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも5個
連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少なくとも15個連続した
アミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも25個連続したアミノ酸
残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続したアミノ酸残基、少
なくとも60個連続したアミノ酸残基、少なくとも70個連続したアミノ酸残基、少なくとも
80個連続したアミノ酸残基、少なくとも90個連続したアミノ酸残基、少なくとも100個連
続したアミノ酸残基、少なくとも125個連続したアミノ酸残基、少なくとも150個連続した
アミノ酸残基、少なくとも175個連続したアミノ酸残基、少なくとも200個連続したアミノ
酸残基、または少なくとも250個連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドま
たはポリペプチドを意味する。特定の実施形態においては、ポリペプチドの断片は、その
ポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持する。
本明細書中で用いる「核酸」および「ヌクレオチド配列」なる語は、DNA分子（例えば
、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（例えば、mRNA）、DNAおよびRNA分子の組合せまたは
ハイブリッドDNA/RNA分子、およびDNAまたはRNA分子の類似体を含む。このような類似体
は、例えば、限定するものではないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含むヌクレオチ
ド類似体を用いて作製することができる。このような類似体はまた、分子に有益な属性を
与える（例えば、ヌクレアーゼ耐性を付与したり、細胞膜を通過する能力を高める）改変
された骨格を有するDNAまたはRNA分子を含んでもよい。核酸またはヌクレオチド配列は一
本鎖、または二本鎖であってもよいし、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含んでもよく、
また、三本鎖部分を含んでもよい。しかし、好ましくは二本鎖DNAである。
本明細書中で用いる「治療上有効な量」とは、疾患または障害を治療または管理するの
に十分な治療剤の量を意味する。治療上有効な量は、疾患の発症を遅延させるかまたは最
小限にする（例えば、癌の拡大を遅延させるかまたは最小限にする）のに十分な治療剤の
量を指すこともある。治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を
与える治療剤の量を意味してもよい。さらに、本発明の治療剤についての治療上有効な量
は、疾患の治療または管理において治療上の利益を与える、単独でのまたは他の治療法と
組み合わせた治療剤の量を意味する。
本明細書中で用いる「予防剤」なる語は、障害の予防に、または障害の再発または拡大
の予防に使用される薬剤を意味する。予防上有効な量は、過増殖性疾患（特に癌）の再発
または拡大、または患者（限定するものではないが、過増殖性疾患の素因がある患者、例
えば、遺伝的に癌の素因があるかまたは以前に発癌物質に曝された患者を含む）における
それらの発生を予防するのに十分な予防剤の量を意味しうる。予防上有効な量はまた、疾
患の予防において予防上の利益を与える予防剤の量を意味してもよい。さらに、本発明の
予防剤についての予防上有効な量は、疾患の予防において予防上の利益を与える、単独で
のまたは他の薬剤と組み合わせた予防剤の量を意味する。
本明細書中で用いる「予防」とは、予防剤または治療剤の投与から得られる、被験者に
おける障害の１以上の症状の再発または発症の予防を意味する。
本明細書中で用いる「組み合わせて」は、２種以上の予防剤および／または治療剤の使
用を意味する。用語「組み合わせて」は、予防剤および／または治療剤を、障害のある被
験者に投与する順序を制限するものではない。第１の予防剤または治療剤は、障害のある
被験者に第２の予防剤または治療剤を投与する前（例えば5分、15分、30分、45分、1時間
、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4
週、5週、6週、8週、または12週前）に、または第２の予防剤または治療剤を投与すると
同時に、または第２の予防剤または治療剤を投与した後（例えば5分、15分、30分、45分
、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、
3週、4週、5週、6週、8週、または12週後）に、投与することができる。
組換え可溶性FcγRのSDS-PAGE解析を示す。組換え可溶性FcγRタンパク質の純度を10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した。ゲルをクーマシーブルーで染色した。レーン1: 精製した組換え可溶性FcγRIIIA；レーン2: 分子量マーカー; レーン3: 分子量マーカー; レーン4: 精製した組換え可溶性FcγRIIB。ダッシュ記号(-)はマーカーの分子量を指し、上から下へ、それぞれ98、50、36、および22 KDaの分子量に相当する。 組換え可溶性FcγRのELISAアッセイを示す。凝集IgGおよびモノマーIgGへの精製組換え可溶性FcγRIIIAの直接結合をELISAアッセイで測定した。凝集ビオチン化IgG（黒塗り四角）およびビオチン化モノマーIgG（◆）の結合を比較する。3G8抗体は凝集ビオチン化IgGのFcγRIIIAへの結合をブロックする（Ｘ）。 ELISAアッセイを用いたFcγRIIIAテトラマー複合体の特徴づけを示す。A. 可溶性テトラマーFcγRIIIA複合体は、可溶性モノマーヒトIgGと特異的に結合する。可溶性テトラマーFcγRIIIAのヒトIgGへの結合は、マウス抗FcγRIIIAモノクローナル抗体3G8（◆）によりブロックされる；D265A突然変異を有する4-4-20モノクローナル抗体は、可溶性テトラマーFcγRIIIAの凝集ヒトIgGへの結合をブロックすることができなかった（△）。B. 可溶性テトラマーFcγRIIIA複合体の可溶性モノマーヒトIgGへの結合（黒塗り四角）が、モノマー可溶性FcγRIIIAの可溶性モノマーヒトIgGへの結合（□）と比較される。 磁性ビーズアッセイを用いたFcγRIIIAテトラマー複合体の特徴づけを示す。A. FcγRIIIA複合体：2つのFcγRIIIA（黒塗りの形状）がモノクローナル抗体DJ130c（第1抗体）により結合される；抗マウスF(ab)2がPE（円）にコンジュゲートされる。B. Fc被覆ビーズに結合されたFcγRIIIAのFACS解析：(a)ビーズのみ；(b)FcγRIIIAを含まない複合体；(c)FcγRIIIAを含む複合体；(d)FcγRIIIAとLNK16を含む複合体。 Fc含有構築物の模式図を示す。 pYD1にクローニングされたIgGl Fcドメインの模式図を示す。白塗りのボックスはヒンジ-CH2-CH3ドメインを表し、平行な垂直線はCH1ドメインを表す。GIF206および227構築物の場合には、N末端アミノ酸が示される。下線の残基はヒンジ部に相当し、* はXpressエピトープタグを表し、斜線ボックスはGly4-Serリンカーを表し、点描ボックスはAga2p遺伝子を表す。 酵母細胞壁上のFc融合タンパク質のFACS解析を示す。細胞を、PEコンジュゲートポリクローナルヤギ抗ヒトFc抗体（図6A〜D）またはマウス抗ヒトIgG1 Fc(CH3)特異的モノクローナル抗体のHP6017 (Sigma)（図6E〜H）のいずれかとインキュベートした。AおよびEはベクターのみを表し、パネルBおよびFはCH1-CH3構築物を表し、パネルCおよびGはGIF227を表し、パネルDおよびHはGIF 206構築物を表す。 表面にディスプレイされたFc融合タンパク質への可溶性テトラマーFcγRIIIAの結合を示す。pYDl-CH1 (A); pYD-CHl-D265A (B); および pYDベクター(C)を含有する細胞を、細胞表面上にAga2p融合タンパク質を発現させる条件下で増殖させた。細胞をそれぞれ0.15 mM、7.5 mMおよび7.5 mMのFcγRIIIAとともにインキュベートして、FACSにより解析した。 表面にディスプレイされたFc融合タンパク質への可溶性テトラマーFcγRIIIA結合の特徴づけを示す。酵母細胞表面上のFc融合タンパク質へのFcγRIIIAテトラマー複合体の結合を解析した。PEコンジュゲートFcγRIIIAテトラマー複合体を異なる濃度の3G8（◆）、LNK（黒塗り三角）または無関係のアイソタイプ対照（黒塗り四角）とともにインキュベートし、続いて酵母細胞とインキュベートした。PE蛍光についてFACSにより細胞を解析した。FcγRIIIAテトラマー複合体と結合した細胞パーセントをy軸上にプロットした。 FcγRIIIAへの結合が増大したFc突然変異体を選択するための選別ゲート（Sort Gate）の例を示す。細胞をPEコンジュゲートFcγRIIIAテトラマー複合体（y軸）および抗Fc-FITCコンジュゲート抗体（x軸）により染色した。ボックスで囲った領域が細胞集団の約1.0％を選択するように設定された選別ゲートを表す。 FcγRIIIAテトラマー複合体に対して増大した親和性を有する、いくつかの同定されたFc突然変異体のFACS解析を示す。独立したFc突然変異を含むpYD-CH1プラスミドを保有する個々のクローンを、グルコース含有選択培地中で増殖させ、ガラクトース含有選択培地中でFc発現について誘導し、その後FACSにより解析した。図10AおよびBは野生型Fcを保有する細胞を表し、図10CおよびDは突然変異体#5を表し、図10EおよびFは突然変異体#20を表し、図10GおよびHは突然変異体#21を表し、図10IおよびJは突然変異体#24を表し、図10KおよびLは突然変異体#25を表し、図10MおよびNは突然変異体#27を表す。細胞をFcγRIIIAテトラマー複合体（図10A、C、E、G、I、KおよびM）またはFcγRIIBテトラマー複合体（図10B、D、F、H、J、LおよびN）により染色した。 4-4-20モノクローナル抗体中のFc突然変異体のELISAによる特徴づけを示す。pYD-CH1プラスミドからのFcドメインを、キメラ4-4-20モノクローナル抗体の重鎖にクローニングした。293細胞において4-4-20モノクローナル抗体を発現させ、上清を集めた。ELISAプレートにフルオレセインコンジュゲートBSAをコーティングして、キメラ4-4-20突然変異型抗体を捕捉した。その後、Fcドメインに対する変異型受容体の相対親和性を調べるために、4-4-20モノクローナル抗体を吸着させておいたELISAプレートにFcγRIIIA受容体をコーティングした。突然変異体#15および#29は、対照として加えた非結合性の分離株である。 4-4-20モノクローナル抗体中のFc突然変異体のELISAによる特徴づけを示 す。pYD-CH1プラスミドからのFcドメインを、キメラ4-4-20モノクローナル抗体の重鎖に クローニングした。293細胞において4-4-20モノクローナル抗体を発現させ、上清を集め た。ELISAプレートにフルオレセインコンジュゲートBSAをコーティングして、キメラ4-4- 20突然変異型抗体を捕捉した。その後、Fcドメインに対する変異型受容体の相対親和性を 調べるために、4-4-20モノクローナル抗体を吸着させておいたELISAプレートにFcγRIIB受容体をコーティングした。 HER2/neuヒト化モノクローナル抗体中の突然変異体のADCC活性を示す。A. 突然変異型Fc領域を含むヒト化HER2/neuモノクローナル抗体をそれらのADCC活性について評価し、野性型Her2/neu抗体のADCC活性と比較した。解析した突然変異体は次のとおりである：MGFc-5 (V379M)、MGFc-9 (F243I, V379L)、MGFc-10 (K288N, A330S, P396L)、MGFc-13 (K334E, T359N, T366S)、MGFc-27 (G316D,A378V, D399E)。B. ヒト化Her2/neuモノクローナル抗体中の追加の突然変異体のADCC活性：MGFc-37 (K248M)、MGFc-39 (E293V, Q295E, A327T)、MGFc-38 (K392T,P396L)、MGFc-41 (H268N, P396L)、MGFc-23 (K334E, R292L)、MGFc-44、MGFc-45。 BSA-FITC表面上でのキメラ4-4-20抗体の捕捉を示す。約20μg/mLの濃度の抗体6μLを、BSA-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)表面に5μL/分で注入した。BSA-FITC固定化センサーシップの表面上への突然変異型Fc領域を含むキメラ4-4-20抗体の結合のBIAcoreセンソグラム（sensogram）を示す。マーカーを野生型捕捉抗体応答に設定した。 変異型Fc領域を含むキメラ4-4-20抗体へのFcγRIIIAのリアルタイム結合のセンソグラムを示す。変異型Fc領域を含むキメラ4-4-20抗体へのFcγRIIIAの結合は200nMの濃度で解析した。野性型に対して得られたキメラ4-4-20抗体のレベルで応答を標準化した。 変異型Fc領域を含む抗体へのFcγRIIIA結合の速度論的パラメーターの解析を示す。変異型Fc領域を含む抗体へのFcγRIIIA結合の速度論的パラメーターは、200nMおよび800nMについての別個のベストフィット曲線を作成することにより得られた。実線は、32〜34秒間隔で解離曲線について計算したkoff値に基づいて得られた結合フィットを示す。Kdおよびkoff値は2つの濃度からの平均を表す。 変異型Fc領域を含む抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質のリアルタイム結合のセンソグラムを示す。変異型Fc領域を含むキメラ4-4-20抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質の結合は200nMの濃度で解析した。野性型に対して得られたキメラ4-4-20抗体のレベルで応答を標準化した。 変異型Fc領域を含む抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質の速度論的パラメーターの解析を示す。変異型Fc領域を含む抗体へのFcγRIIB-Fc結合の速度論的パラメーターは、200nMおよび800nMについての別個のベストフィット曲線を作成することにより得られた。実線は、32〜34秒間隔で解離曲線について計算したkoff値に基づいて得られた結合フィットを示す。KdおよびKoff値は2つの濃度からの平均を表す。 ADCCデータに対してプロットしたFcγRIIIAおよびFcγRIIB-FcについてのKoff(wt)/Koff(mut)比を示す。1より多い数は、野生型に対して、減少したFcγRIIIA結合の解離速度および増大したFcγRIIB-Fc結合の解離速度を示す。ボックス内の突然変異体は、FcγRIIIA結合に対してより低いoff速度およびFcγRIIB-Fc結合に対してより高いoff速度を有する。 非標識FcγRIIIAとの競合を示す。FcγRIIIA結合に対して改善されたKoff速度を有するFc領域突然変異体を同定するために速度論的スクリーニングを実施した。P396L突然変異を含むFc領域変異体のライブラリーを、0.1μMのビオチン化FcγRIIIA-リンカー-Avitagとともに1時間インキュベートし、その後洗浄した。続いて、0.8μMの非標識FcγRIIIAを標識酵母とともにさまざまな時点でインキュベートした。酵母を遠心分離し、非標識FcγRIIIAを除いた。受容体に結合した酵母をFACS解析のためにSA（ストレプトアビジン）：PE（フィコエリトリン）で染色した。 速度論的スクリーニングに基づいたFACS解析を示す。図20に示したデータから算出したKoffに基づいて、1分タイムポイント選択を選んだ。10倍過剰のライブラリーを0.1μMのビオチン化FcγRIIIA-リンカー-Avitagモノマーとともにインキュベートした。細胞を洗浄し、非標識リガンドと1分間インキュベートした。その後洗浄してからSA:PEで標識した。次に細胞をFACSで選別し、上端0.3％の結合体を選択した。非選択P396Lライブラリーを、FACSで結合の向上について選択された酵母細胞と比較した。ヒストグラムはFcγRIIIA/PEとヤギ抗ヒトFc/FITCの両方により共染色される細胞のパーセントを示す（上右）。 FcγRIIB Fc結合体の固相枯渇に基づいた選択を示す。P396Lライブラリーを、磁性ビーズを用いるFcγRIIB枯渇およびFcγRIIIA選択に基づいてスクリーニングした。磁性ビーズによるFcγRIIB枯渇を5回繰り返した。得られた酵母集団を分析すると、ヤギ抗ヒトFcで染色される細胞が50％を超え、FcγRIIIAで染色される細胞はごくわずかであることが分かった。続いて、0.1μMのビオチン化FcγRIIIA-リンカー-Avitagを用いてFACSにより細胞を2回選択した。各選別後にFcγRIIIA結合とFcγRIIB結合の両方について酵母細胞を解析し、野生型結合と比較した。 ビオチン化FcγRIIIA158F-リンカー-avitagモノマーをリガンドとして使用して、FcγRIIB減損酵母集団からFc突然変異体を選択した。上位0.25パーセントFcγRIIIA 158F結合体を選択するように、選別ゲートを設定した。得られた富化集団をFACSによって分析した(図23A)。次に個々のクローンを単離し、別種のFcγRに対するその結合性をFACSによって分析した(図23B)。 Fc突然変異体を含むキメラ4D5により媒介されるSKBR3標的細胞溶解の相対 速度を示す。試験した各Fc突然変異体について溶解の相対速度を計算した。Fc突然変異体 を含む4D5抗体の溶解速度を、野生型4D5抗体により媒介される溶解の速度で割った。少な くとも2つの独立したアッセイからのデータの平均をとり、ヒストグラムとしてプロット した。各Fc突然変異体について、2つの異なる抗体濃度からのデータを示す。抗体濃度は 、溶解が約50％となる曲線の位置を挟むように選択された。 Fc突然変異体を含むキメラ2H7により媒介されるDAUDI標的細胞溶解の相対 速度を示す。試験した各Fc突然変異体について溶解の相対速度を計算した。Fc突然変異体 を含む2H7抗体の溶解速度を、野生型2H7抗体により媒介される溶解の速度で割った。少な くとも1または2つの独立したアッセイからのデータの平均をとり、ヒストグラムとしてプ ロットした。各Fc突然変異体について、2つの異なる抗体濃度からのデータを示す。抗体 濃度は、溶解が約50％となる曲線の位置に基づいて選択された。
5. 好ましい実施形態の説明
本発明は、1以上の領域に1個以上のアミノ酸の改変（例えば置換、しかし挿入や欠失も
含まれる）を有する変異型Fc領域を含んでなる分子、好ましくはポリペプチド、さらに好
ましくは免疫グロブリン（例えば、抗体）に関する。ただし、前記アミノ酸の改変は、Fc
γRに対する変異型Fc領域の親和性を変更する（例えば、増加または減少させる）もので
ある。いくつかの実施形態では、本発明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミ
ノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含んでなる分子を提供し、該変異型Fc領域は、Fc-Fc
γR相互作用を測定するための当業者に公知の方法または本明細書に記載の方法（例えば
、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ）で測定したとき、野生型Fc領域を含む
対応する分子（すなわち、変異型Fc領域を含む前記分子と同じであるが、1個以上のアミ
ノ酸の改変を有しない）と比べて、より高い親和性でFcγRIIIAと結合する。さらに他の
実施形態では、本発明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有す
る変異型Fc領域を含んでなる分子を提供し、該変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む対応
する分子と比べて低下した親和性でFcγRIIIAと結合する。好ましい実施形態では、本発
明の分子は、野生型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIBと結合するよりも低い親和性で
、（Fc領域を介して）FcγRIIBと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明は
、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含んで
なる分子を提供し、該変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、より
高い親和性でFcγRIIIAおよびFcγRIIBと結合する。他の実施形態では、本発明は、野生
型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含んでなる分
子を提供し、該変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、より高い親
和性でFcγRIIBと結合する。他の実施形態では、本発明は、野生型Fc領域に対して少なく
とも1個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含んでなる分子を提供し、該変異型Fc
領域は、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、低下した親和性でFcγRIIBと結合す
る。
いくつかの実施形態において、本発明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミ
ノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含んでなる分子を提供し、該変異型Fc領域は、野生型
Fc領域を含む対応する分子と比べて、検出可能ないずれのFcγRへの結合も示さない（例
えば、ELISAアッセイなどで測定して、FcγRIIA、FcγRIIBまたはFcγRIIIAと結合しない
）。
特定の実施形態において、本発明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸
の改変を有する変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変異型Fc領域は、1つのFcγRとの
み結合し、ここで前記FcγRはFcγRIIIAである。別の特定の実施形態では、本発明は、野
生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含む分子を
包含し、前記変異型Fc領域は、1つのFcγRとのみ結合し、ここで前記FcγRはFcγRIIAで
ある。さらに別の実施形態では、本発明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミ
ノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変異型Fc領域は、1つのFcγR
とのみ結合し、ここで前記FcγRはFcγRIIBである。本発明は特に、治療用抗体の例えば
エフェクター機能を高める（例えば、ADCCを高める）ことにより治療用抗体の効力を増強
するための、ヒトまたはヒト化治療用抗体（例えば、腫瘍特異的抗血管新生または抗炎症
性モノクローナル抗体）の改変に関する。
本発明の分子のFcγRに対する親和性および結合特性は、初めに、Fc-FcγR相互作用（
すなわち、Fc領域とFcγRとの特異的結合）を測定するための当技術分野で公知のin vitr
oアッセイ（生化学または免疫学に基づいたアッセイ）、例えば、限定するものではない
が、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイなどを用いて測定
される（セクション5.2.1参照）。好ましくは、本発明の分子の結合特性はまた、1以上の
FcγRメディエーターエフェクター細胞機能を測定するためのin vitro機能アッセイによ
っても測定される（セクション5.2.6参照）。最も好ましい実施形態では、本発明の分子
は、in vitro系アッセイにおける結合特性と同様の結合特性をin vivoモデル（例えば、
本明細書に記載および開示されるもの）においても示すものである。しかしながら、本発
明は、in vitro系アッセイで所望の表現型を示さないがin vivoでは所望の表現型を示す
本発明の分子を除外するものではない。
いくつかの実施形態において、本発明の分子は、Fc領域のCH3ドメイン（アミノ酸342-4
47にわたると定義される）に少なくとも1個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含
む。他の実施形態では、本発明の分子は、Fc領域のCH2ドメイン（アミノ酸231-341にわた
ると定義される）に少なくとも1個のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含む。いく
つかの実施形態では、本発明の分子は少なくとも2個のアミノ酸の改変を含み、1つの改変
はCH3領域にあり、もう1つの改変はCH2領域にある。本発明はさらにヒンジ部にもアミノ
酸の改変を含む。CH2および/またはCH3ドメインに1個以上のアミノ酸の改変を有する本発
明の分子は、本明細書に記載の方法または当業者に公知の方法を用いて測定したとき、Fc
γRに対して変更された親和性を有する。
好ましい特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記
変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果
、前記分子はFcγRに対して変更された親和性をもつようになるが、ただし、前記変異型F
c領域は、Sondermannら, 2000 (Nature, 406: 267-273；その全体を参照により本明細書
に組み入れる) により開示されるようなFc-FcγR相互作用の結晶学的構造解析に基づいて
、FcγRと直接接触する位置での置換を有しないものである。FcγRと直接接触するFc領域
内の位置の例としては、アミノ酸234-239 (ヒンジ部)、アミノ酸265-269 (B/Cループ)、
アミノ酸297-299 (C'/Eループ)、およびアミノ酸327-332 (F/Gループ) がある。いくつか
の実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、結晶学的構造解析に基づくと、Fc
γRと直接接触している、少なくとも1個の残基の改変を含む。
別の好ましい実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変
異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、
前記分子は、野生型Fc領域を含む分子に比して変更された親和性でFcγRと結合するよう
になるが、ただし、前記変異型Fc領域は、255、256、258、267、268、269、270、272、27
6、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、30
3、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、33
8、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439位のいず
れにも置換を有しないか、または単独で前記置換ではない。特定の実施形態では、本発明
は、変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なく
とも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記分子は、野生型Fc領域を含む分子に比
して変更された親和性でFcγRと結合するようになるが、ただし、前記変異型Fc領域は、2
55、258、267、269、270、276、278、280、283、285、289、292、293、294、295、296、3
00、303、305、307、309、322、329、332、331、337、338、340、373、376、416、419、4
34、435、437、438、439位のいずれにも置換を有しないか、または単独で前記置換ではな
く、また、256、290、298、312、333、334、359、360、326、もしくは430位のいずれにも
アラニンを、330位にリシンを、339位にトレオニンを、320位にメチオニンを、326位にセ
リンを、326位にアスパラギンを、326位にアスパラギン酸を、326位にグルタミン酸を、3
34位にグルタミンを、334位にグルタミン酸を、334位にメチオニンを、334位にヒスチジ
ンを、334位にバリンを、334位にロイシンを、335位にリシンを、268位にアスパラギンを
、272位にグルタミンを、286位にグルタミン、セリン、もしくはアスパラギン酸を、290
位にセリンを、320位にメチオニン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはアルギニンを
、322位にグルタミン酸を、326位にセリン、グルタミン酸、もしくはアスパラギン酸を、
330位にリシンを、335位にグルタミンを、または301位にメチオニンを有しないものであ
る。
特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変異型Fc
領域は、268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、30
5、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、43
4、435、437、438もしくは439位のいずれにも置換を有しないか、または単独で前記置換
ではなく、また、280位にヒスチジン、グルタミン、もしくはチロシンを、290位にセリン
、グリシン、トレオニンもしくはチロシンを、300位にロイシンもしくはイソロイシンを
、294位にアスパラギンを、296位にプロリンを、298位にプロリン、アスパラギン、アス
パラギン酸、もしくはバリンを、295位にリシンを有しないものである。さらに別の好ま
しい実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変異型Fc領域は野
生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記分子は、野
生型Fc領域を含む分子に比して低下した親和性でFcγRと結合するようになるが、ただし
、前記変異型Fc領域は、252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295
、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382
、388、389、414、416、419、434、435、437、438、もしくは439位のいずれにも置換を有
しないか、または単独で前記置換ではない。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は
、変異型Fc領域を含む分子を包含し、前記変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくと
も1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記分子は、野生型Fc領域を含む分子に比し
て増大した親和性でFcγRと結合するようになるが、ただし、前記変異型Fc領域は、280、
283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、
334、337、340、360、378、398、もしくは430位のいずれにも置換を有しないか、または
単独で前記置換ではない。
最も好ましい実施形態において、活性化性および/または抑制性受容体に対する親和性
が変更されている、変異型Fc領域を有する本発明の分子は、1個以上のアミノ酸の改変を
有し、前記1個以上のアミノ酸の改変は、288位でのアスパラギンによる置換、330位での
セリンによる置換、および396位でのロイシンによる置換 (MgFc10) (表5参照); または33
4位でのグルタミン酸による置換、359位でのアスパラギンによる置換、および366位での
セリンによる置換 (MgFc13); または316位でのアスパラギン酸による置換、378位でのバ
リンによる置換、および399位でのグルタミン酸による置換 (MgFc27); または392位での
トレオニンによる置換、および396位でのロイシンによる置換 (MgFc38); または221位で
のグルタミン酸による置換、270位でのグルタミン酸による置換、308位でのアラニンによ
る置換、311位でのヒスチジンによる置換、396位でのロイシンによる置換、および402位
でのアスパラギン酸による置換 (MgFc42); または240位でのアラニンによる置換、および
396位でのロイシンによる置換 (MgFc52); または410位でのヒスチジンによる置換、およ
び396位でのロイシンによる置換 (MgFc53); または243位でのロイシンによる置換、305位
でのイソロイシンによる置換、378位でのアスパラギン酸による置換、404位でのセリンに
よる置換、および396位でのロイシンによる置換 (MgFc54); または255位でのイソロイシ
ンによる置換、および396位でのロイシンによる置換 (MgFc55); または370位でのグルタ
ミン酸による置換、および396位でのロイシンによる置換 (MgFc59)である。
いくつかの実施形態において、本発明は、以下の1つ以上の位置にアミノ酸の改変を有
する変異型Fc領域を含んでなる分子を包含する：185、142、192、141、132、149、133、1
25、162、147、119、166、251、292、290、291、252、288、268、256、262、218、214、2
05、215、247、275、202、289、258、219、279、222、246、233、246、268、244、217、2
53、246、224、298、280、255、218、281、284、216、223、235、221、252、241、258、2
27、231、215、274、287、244、229、287、291、240、281、232、269、225、246、246、2
93、295、248、276、268、210、288、227、221、217、261、210、242、255、240、250、2
47、258、246、282、219、225、270、263、272、292、233、247、254、243、347、339、3
92、399、301、315、383、396、385、348、333、334、310、337、371、359、366、359、3
79、330、318、395、319、380、305、309、335、370、378、394、386、377、358、384、3
97、372、326、320、375、327、381、354、385、335、387、353、375、383、397、345、3
75、389、335、394、316、399、315、394、382、390、369、377、304、323、313、388、3
39、317、365、367、340、311、312、398、343、352、362、303、308、327、307、344、3
28、393、355、360、306、361、355、415、408、409、407、424、401、402、435、421、4
31、441、440、435、431、442、400、422、406、411、422、433、406、423、420、412、4
47、443、414、433、428、446、402、419、410、404、427、417、433、436、438、416。
好ましくは、このような突然変異はFcγRに対して変更された親和性を有する分子をもた
らし、かつ/または、本明細書に開示し例示する当業者に公知の方法を用いて測定したと
き、改変されたエフェクター細胞媒介機能を有する。
本発明は、以下の表2に示した突然変異のいずれかからなるかまたはいずれかを含んで
なる変異型Fc領域を含む分子を包含する。
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
さらに他の実施形態において、本発明は、2個より多いアミノ酸の改変を有する変異型F
c領域を含む分子を包含する。そのような変異体の例を以下の表に示すが、これらに限定
されるものではない（表３）。本発明は、本明細書に開示するような1個以上のアミノ酸
の改変をさらに含む、表３に示した突然変異体を包含する。
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
いくつかの実施形態において、本発明の分子（好ましくは抗体）は、1以上のグリコシ
ル化部位をさらに含み、したがって1以上の糖鎖成分が該分子に共有結合されている。好
ましくは、Fc領域に1以上の改変および/または1以上のグリコシル化部位を有する本発明
の抗体は、増強された抗体媒介エフェクター機能、例えば、増強されたADCC活性を有する
。いくつかの実施形態において、本発明はさらに、抗体の糖鎖成分と直接的にまたは間接
的に相互作用することがわかっているアミノ酸の1個以上の改変を有する抗体を含み、そ
れらのアミノ酸は、限定するものではないが、241、243、244、245、245、249、256、258
、260、262、264、265、296、299、および301位のアミノ酸を含む。抗体の糖鎖成分と直
接的にまたは間接的に相互作用するアミノ酸は当技術分野で公知であり、例えば、Jeffer
isら, 1995 Immunology Letters, 44:111-7（その全体を参照により本明細書に組み入れ
る）を参照されたい。
本発明は、好ましくは抗体の機能性（例えば、FcγRとの結合活性）を変化させること
なく、1以上のグリコシル化部位を抗体の1以上の部位に導入することにより改変されてい
る抗体を包含する。グリコシル化部位は、本発明の抗体の可変領域および/または定常領
域に導入することができる。本明細書中で用いる「グリコシル化部位」は、オリゴ糖（す
なわち、互いに連結された2以上の単糖を含有する糖鎖）が特異的にかつ共有結合で結合
すると考えられる、抗体中の特定のアミノ酸配列を含む。オリゴ糖の側鎖は典型的には抗
体の主鎖にNまたはO結合のいずれかを介して連結される。N結合グリコシル化はアスパラ
ギン残基の側鎖へのオリゴ糖成分の結合を指す。O結合グリコシル化はヒドロキシアミノ
酸（例えば、セリン、トレオニン）へのオリゴ糖成分の結合を指す。本発明の抗体は、N
結合およびO結合グリコシル化部位を含めて、１以上のグリコシル化部位を含むことがで
きる。当技術分野で公知のN結合またはO結合グリコシル化のためのグリコシル化部位はど
れも本発明に従って利用しうる。本発明の方法に従って有用であるN結合グリコシル化部
位の例は、アミノ酸配列：Asn-X-Thr/Ser（式中、Xは任意のアミノ酸であり、Thr/Serは
トレオニンまたはセリンを示す）である。このような部位は、本発明が関わる技術分野で
周知の方法を用いて、本発明の抗体に導入することができる。例えば、"In Vitro Mutage
nesis" Recombinant DNA: A Short Course, J.D. Watson,ら, W.H. Freeman and Company
, New York, 1983, chapter 8, pp.106-116を参照されたい（その全体を参照により本明
細書に組み入れる）。本発明の抗体中にグリコシル化部位を導入する方法の例は、所望の
Asn-X-Thr/Ser配列が得られるように、抗体のアミノ酸配列を改変するかまたは突然変異
させる方法である。
いくつかの実施形態において、本発明は、グリコシル化部位を加えるかまたは欠失する
ことにより本発明の抗体の糖鎖含量を改変する方法を包含する。抗体の糖鎖含量を改変す
る方法は当技術分野で周知であり、本発明に包含される。例えば、米国特許第6,218,149
号；EP 0 359 096 B1；米国特許公開US 2002/0028486；WO 03/035835；米国特許公開US 2
003/0115614；米国特許第6,218,149号；米国特許第6,472,511号を参照されたい（これら
の全てを参照により本明細書に組み入れる）。他の実施形態において、本発明は、抗体の
１以上の内在性糖鎖成分を欠失することにより本発明の抗体の糖鎖含量を改変する方法を
包含する。特定の実施形態では、本発明は、297位に隣接する位置を改変することにより
、抗体のFc領域のグリコシル化部位をシフトすることを包含する。特定の実施形態では、
本発明は、297位ではなく296位がグリコシル化されるように296位を改変することを包含
する。
5.1 変異型Fc領域を含むポリペプチドおよび抗体
本発明は、一部には、酵母ディスプレイ系を用いて、様々なFcγR受容体に対して変更
された親和性を有する突然変異型ヒトIgG1重鎖Fc領域を同定したことに基づいている。し
たがって、本発明は、1以上の領域に1個以上のアミノ酸の改変（例えば置換、しかし挿入
または欠失も含まれる）を有する変異型Fc領域を含む分子、好ましくはポリペプチド、さ
らに好ましくは免疫グロブリン（例えば、抗体）に関する。ただし、前記改変は変異型Fc
領域のFcγRに対する親和性を変更するものである。本発明の分子のFcγRに対する親和性
および結合特性は、初めに、Fc-FcγR相互作用（すなわち、Fc領域とFcγRとの特異的結
合）を測定するための当技術分野で公知のin vitroアッセイ（生化学または免疫学に基づ
いたアッセイ）、例えば、限定するものではないが、ELISAアッセイ、表面プラズモン共
鳴アッセイ、免疫沈降アッセイなどを用いて測定される（セクション5.2.1参照）。好ま
しくは、本発明の分子の結合特性はまた、1以上のFcγRメディエーターエフェクター細胞
機能を測定するためのin vitro機能アッセイによっても測定される（セクション5.2.6参
照）。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は、in vitro系アッセイにおける結合特
性と同様の結合特性をin vivoモデル（例えば、本明細書に記載および開示されるもの）
においても示すものである。しかしながら、本発明は、in vitro系アッセイで所望の表現
型を示さないがin vivoでは所望の表現型を示す本発明の分子を除外するものではない。
A. FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増大するように改変された突然変
異体
本発明は、1以上の領域に1個以上のアミノ酸の改変（例えば、置換）を有する変異型Fc
領域を含む分子であって、前記改変により、変異型Fc領域の活性化性FcγRに対する親和
性が変更されている、上記分子を包含する。いくつかの実施形態において、本発明の分子
は、1以上の領域に1個以上のアミノ酸の改変（例えば、置換）を有する変異型Fc領域を含
み、前記改変は、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγRIIIA
および/またはFcγRIIAに対する親和性を少なくとも2倍高めるものである。別の特定の実
施形態では、本発明の分子は、1以上の領域に1個以上のアミノ酸の改変（例えば、置換）
を有する変異型Fc領域を含み、前記改変は、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、
変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を2倍以上増大させるも
のである。本発明の他の実施形態では、1個以上のアミノ酸の改変が、野生型Fc領域を含
む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和
性を少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、または10倍高めるものである。本発明のさら
に他の実施形態では、1個以上のアミノ酸の改変が、野生型Fc領域を含む対応する分子と
比べて、変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を少なくとも3
倍、4倍、5倍、6倍、8倍、または10倍低下させるものである。そのような倍率の増加はEL
ISAまたは表面プラズモン共鳴アッセイで都合よく測定できる。特定の実施形態では、1個
以上のアミノ酸の改変が、329、331、または322位のいずれか1つの位置での任意のアミノ
酸による置換を含まないか、または単独でそのような置換ではない。特定の実施形態では
、1個以上のアミノ酸の改変が、256、290、298、312、333、334、359、360、もしくは430
位のいずれか1つの位置でのアラニンによる置換、330位でのリシンによる、339位でのト
レオニンによる、320位でのメチオニンによる、326位でのセリン、アスパラギン、アスパ
ラギン酸、もしくはグルタミン酸による、334位でのグルタミン、グルタミン酸、メチオ
ニン、ヒスチジン、バリン、もしくはロイシンによる置換を含まないか、または単独でそ
のような置換ではない。別の特定の実施形態では、1個以上のアミノ酸の改変が、280、29
0、300、294、もしくは295位のいずれかでの置換を含まないか、または単独でそのような
置換ではない。別のさらに特定した実施形態では、1個以上のアミノ酸の改変が、300位で
のロイシンもしくはイソロイシンによる、295位でのリシンによる、294位でのアスパラギ
ンによる、298位でのバリン、アスパラギン酸、プロリン、アスパラギン、もしくはバリ
ンによる、280位でのヒスチジン、グルタミン、もしくはチロシンによる、290位でのセリ
ン、グリシン、トレオニン、もしくはチロシンによる置換を含まないか、または単独でそ
のような置換ではない。
別の特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、該
変異型Fc領域は野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を含み、その結果
、該ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIAと結合するよりも高い
親和性でFcγRIIAと特異的に結合するようになるが、ただし、前記変異型Fc領域は、256
、290、326、255、258、267、272、276、280、283、285、286、331、337、268、272、も
しくは430位のいずれにもアラニンを、268位にアスパラギンを、272位にグルタミンを、2
86位にグルタミン、セリン、もしくはアスパラギン酸を、290位にセリンを、320位にメチ
オニン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはアルギニンを、322位にグルタミン酸を、3
26位にセリン、グルタミン酸、もしくはアスパラギン酸を、330位にリシンを、335位にグ
ルタミンを、または301位にメチオニンを有しない。特定の実施形態では、本発明の分子
は、1以上の領域に1個以上のアミノ酸の改変（例えば、置換）を有する変異型Fc領域を含
み、前記改変は、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγRIIAに
対する親和性を少なくとも2倍増大させるものである。別の特定の実施形態では、本発明
の分子は、1以上の領域に1個以上のアミノ酸の改変（例えば、置換）を有する変異型Fc領
域を含み、前記改変は、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγ
RIIAに対する親和性を2倍以上増大させるものである。本発明の他の実施形態では、1個以
上のアミノ酸の改変が、野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγ
RIIAに対する親和性を少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、または10倍高めるものであ
る。
特定の実施形態において、本発明は、1個以上のアミノ酸の改変（例えば置換、しかし
挿入または欠失も含まれる）を有する変異型Fc領域を含む分子、好ましくはポリペプチド
、さらに好ましくは免疫グロブリン（例えば、抗体）を包含する。ただし、前記改変は、
野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγ
RIIAに対する親和性を少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも85
％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも100％、少なくとも1
50％、または少なくとも200％増大させるものである。
特定の実施形態において、変異型Fc領域の親和性を増大させる1個以上のアミノ酸の改
変は以下の置換を含むものである：347位でのヒスチジン、および339位でのバリンによる
置換; または425位でのイソロイシン、および215位でのフェニルアラニンによる置換; ま
たは408位でのイソロイシン、215位でのイソロイシン、および125位でのロイシンによる
置換; または385位でのグルタミン酸、および247位でのヒスチジンによる置換; または34
8位でのメチオニン、334位でのアスパラギン、275位でのイソロイシン、202位でのメチオ
ニン、および147位でのトレオニンによる置換; または275位でのイソロイシン、334位で
のアスパラギン、および348位でのメチオニンによる置換; または279位でのロイシン、お
よび395位でのセリンによる置換; または246位でのトレオニン、および319位でのフェニ
ルアラニンによる置換; または243位でのイソロイシン、および379位でのロイシンによる
置換; または243位でのロイシン、255位でのロイシン、および318位でのリシンによる置
換; または334位でのグルタミン酸、359位でのアスパラギン、および366位でのセリンに
よる置換; または288位でのメチオニン、および334位でのグルタミン酸による置換; また
は334位でのグルタミン酸、および380位でのアスパラギン酸による置換; または256位で
のセリン、305位でのイソロイシン、334位でのグルタミン酸、および390位でのセリンに
よる置換; または335位でのアスパラギン、370位でのグルタミン酸、378位でのバリン、3
94位でのメチオニン、および424位でのロイシンによる置換; または233位でのアスパラギ
ン酸、および334位でのグルタミン酸による置換; または334位でのグルタミン酸、359位
でのアスパラギン、366位でのセリン、および386位でのアルギニンによる置換; または24
6位でのトレオニン、および396位でのヒスチジンによる置換; または268位でのアスパラ
ギン酸、および318位でのアスパラギン酸による置換; または288位でのアスパラギン、33
0位でのセリン、および396位でのロイシンによる置換; または244位でのヒスチジン、358
位でのメチオニン、379位でのメチオニン、384位でのリシン、および397位でのメチオニ
ンによる置換; または217位でのセリン、378位でのバリン、および408位でのアルギニン
による置換; または247位でのロイシン、253位でのアスパラギン、および334位でのアス
パラギンによる置換; または246位でのイソロイシン、および334位でのアスパラギンによ
る置換; または320位でのグルタミン酸、および326位でのグルタミン酸による置換; また
は375位でのシステイン、および396位でのロイシンによる置換。FcγRIIIAに対して増大
した親和性をもたらす他のアミノ酸置換の例を、以下に記載し、表4にまとめて示す。
本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、前記変異型Fc領域が243位でのイ
ソロイシンによる置換および379位でのロイシンによる置換を有し、その結果、前記分子
は、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIIAと結合する
よりおよそ1.5倍高い親和性で、FcγRIIIAと結合するようになる、前記分子を包含する。
特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、前記変異型Fc
領域が288位でのアスパラギンによる置換、330位でのセリンによる置換、および396位で
のロイシンによる置換を有し、その結果、前記分子は、ELISAアッセイで測定して、野生
型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIIAと結合するよりおよそ5倍高い親和性で、FcγRI
IIAと結合するようになる、前記分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異
型Fc領域を含んでなる分子であって、前記変異型Fc領域が243位でのロイシンによる置換
および255位でのロイシンによる置換を有し、その結果、前記分子は、ELISAアッセイで測
定して、野生型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIIAと結合するよりおよそ1倍高い親和
性で、FcγRIIIAと結合するようになる、前記分子を包含する。特定の実施形態では、本
発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、前記変異型Fc領域が334位でのグルタ
ミン酸による置換、359位でのアスパラギンによる置換、および366位でのセリンによる置
換を有し、その結果、前記分子は、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応
する分子がFcγRIIIAと結合するよりおよそ1.5倍高い親和性で、FcγRIIIAと結合するよ
うになる、前記分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含んで
なる分子であって、前記変異型Fc領域が316位でのアスパラギン酸による置換、378位での
バリンによる置換、および399位でのグルタミン酸による置換を有し、その結果、前記分
子は、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIIAと結合す
るよりおよそ1.5倍高い親和性で、FcγRIIIAと結合するようになる、前記分子を包含する
。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、前記変異型
Fc領域が315位でのイソロイシンによる置換、379位でのメチオニンによる置換、および39
9位でのグルタミン酸による置換を有し、その結果、前記分子は、ELISAアッセイで測定し
て、野生型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIIAと結合するよりおよそ1倍高い親和性で
、FcγRIIIAと結合するようになる、前記分子を包含する。特定の実施形態では、本発明
は、変異型Fc領域を含んでなる分子であって、前記変異型Fc領域が243位でのイソロイシ
ンによる置換、379位でのロイシンによる置換、および420位でのバリンによる置換を有し
、その結果、前記分子は、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応する分子
がFcγRIIIAと結合するよりおよそ2.5倍高い親和性で、FcγRIIIAと結合するようになる
、前記分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子
であって、前記変異型Fc領域が247位でのロイシンによる置換および421位でのリシンによ
る置換を有し、その結果、前記分子は、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む
対応する分子がFcγRIIIAと結合するよりおよそ3倍高い親和性で、FcγRIIIAと結合する
ようになる、前記分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含ん
でなる分子であって、前記変異型Fc領域が392位でのトレオニンによる置換および396位で
のロイシンによる置換を有し、その結果、前記分子は、ELISAアッセイで測定して、野生
型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIIAと結合するよりおよそ4.5倍高い親和性で、Fcγ
RIIIAと結合するようになる、前記分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変
異型Fc領域を含んでなる分子であって、前記変異型Fc領域が293位でのバリンによる置換
、295位でのグルタミン酸による置換、および327位でのトレオニンによる置換を有し、そ
の結果、前記分子は、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応する分子がFc
γRIIIAと結合するよりおよそ1.5倍高い親和性で、FcγRIIIAと結合するようになる、前
記分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる分子であ
って、前記変異型Fc領域が268位でのアスパラギンによる置換および396位でのロイシンに
よる置換を有し、その結果、前記分子は、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含
む対応する分子がFcγRIIIAと結合するよりおよそ2倍高い親和性で、FcγRIIIAと結合す
るようになる、前記分子を包含する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含
んでなる分子であって、前記変異型Fc領域が319位でのフェニルアラニンによる置換、352
位でのロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換を有し、その結果、前
記分子は、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIIAと結
合するよりおよそ2倍高い親和性で、FcγRIIIAと結合するようになる、前記分子を包含す
る。
特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチ
ドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変
を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより
も高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含す
るが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が396位でのヒスチジンによる置換を
含むものである。特定の実施形態では、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離された
ポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミ
ノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペ
プチドよりも高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチ
ドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が248位でのメチオニンに
よる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチ
ドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変
を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドと同
様の親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含する
が、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が392位でのアルギニンによる置換を含
むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、
前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その
結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドと同様の親和性で
、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、
前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が315位でのイソロイシンによる置換を含むものであ
る。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型
Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記
ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドと同様の親和性で、FcγRIII
Aと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なく
とも1個のアミノ酸の改変が132位でのイソロイシンによる置換を含むものである。本発明
は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野
生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチ
ドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドと同様の親和性で、FcγRIIIAと特異的
に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個の
アミノ酸の改変が162位でのバリンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領
域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対
して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc
領域を含む対応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するよう
になる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変
が396位でのロイシンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでな
る単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくと
も1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対
応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記
ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が379位でのメ
チオニンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離された
ポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミ
ノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペ
プチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチド
を包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が219位でのチロシンによる
置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドで
あって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有
し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより高い
親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、
ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が282位でのメチオニンによる置換を含むも
のである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記
変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果
、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより高い親和性で、Fc
γRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記
少なくとも1個のアミノ酸の改変が401位でのバリンによる置換を含むものである。本発明
は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野
生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチ
ドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的
に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個の
アミノ酸の改変が222位でのアスパラギンによる置換を含むものである。本発明は、変異
型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領
域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野
生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合す
るようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸
の改変が334位でのグルタミン酸による置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域
を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対し
て少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領
域を含む対応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するように
なる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が3
77位でのフェニルアラニンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含ん
でなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少な
くとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含
む対応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、
前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が334位で
のイソロイシンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離
されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個
のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応する
ポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペ
プチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が247位でのロイシン
による置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプ
チドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改
変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドよ
り高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含す
るが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が326位でのグルタミン酸による置換
を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであっ
て、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、
その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより高い親和
性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただ
し、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が372位でのチロシンによる置換を含むものであ
る。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型
Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記
ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIII
Aと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なく
とも1個のアミノ酸の改変が224位でのロイシンによる置換を含むものである。
本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc
領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポ
リペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIA
と特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくと
も1個のアミノ酸の改変が275位でのチロシンによる置換を含むものである。本発明は、変
異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc
領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、
野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合
するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ
酸の改変が398位でのバリンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含
んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少
なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を
含む対応するポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる
、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が334位
でのアスパラギンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単
離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1
個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応す
るポリペプチドより高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリ
ペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が400位でのプロリ
ンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペ
プチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の
改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチド
より高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含
するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が407位でのイソロイシンによる置
換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであ
って、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し
、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより高い親
和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、た
だし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が372位でのチロシンによる置換を含むもので
ある。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異
型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前
記ポリペプチドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドと同様の親和性で、FcγRI
IIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少な
くとも1個のアミノ酸の改変が366位でのアスパラギンによる置換を含むものである。本発
明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が
野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプ
チドは、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより低い親和性で、FcγRIIIAと特異
的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個
のアミノ酸の改変が414位でのアスパラギンによる置換を含むものである。本発明は、変
異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc
領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、
野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドより低い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合
するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ
酸の改変が225位でのセリンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含
んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少
なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、野生型Fc領域を
含む対応するポリペプチドより低い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる
、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が377位
でのアスパラギンによる置換を含むものである。
特定の実施形態において、本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチ
ドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変
を有し、その結果、前記ポリペプチドは、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含
む対応するポリペプチドよりも約2倍高い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するように
なる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が3
79位でのメチオニンによる置換を含むものである。別の特定の実施形態では、本発明は、
変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型
Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは
、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドよりも約1.5倍高
い親和性で、FcγRIIIAと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが
、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が248位でのメチオニンによる置換を含む
ものである。
いくつかの実施形態において、本発明の分子は、Fc-FcγR相互作用（すなわち、Fc領域
とFcγRとの特異的結合）を測定するための当技術分野で公知のin vitroアッセイ（生化
学または免疫学に基づいたアッセイ）、例えば、限定するものではないが、ELISAアッセ
イ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイなどを用いて測定したとき、FcγRI
IIAおよび/またはFcγRIIAに対して変更された親和性を有する（セクション5.2.1参照）
。好ましくは、活性化性FcγR受容体に対する親和性が変更されているこれら分子の結合
特性はまた、1以上のFcγRメディエーターエフェクター細胞機能を測定するためのin vit
ro機能アッセイによって測定されるそれらの活性とも相関し（セクション5.2.6参照）、
例えば、FcγRIIIAに対して増大した親和性を有する変異型Fc領域を含む分子は、高めら
れたADCC活性を有する。最も好ましい実施形態では、in vitroアッセイで活性化性FcγR
受容体（例えば、FcγRIIIA）に対して変更された結合特性を有する本発明の分子は、in
vivoモデル（例えば、本明細書に記載および開示されるもの）においても変更された結合
特性を示すものである。しかしながら、本発明は、in vitro系アッセイでFcγR結合の変
更を示さないがin vivoでは所望の表現型を示す本発明の分子を除外するものではない。
B. FcγRIIIAに対する親和性が増大しているが、FcγRIIBに対する親和性は低下してい
るかまたは存在しない突然変異体
特定の実施形態において、本発明の分子は、1以上の領域に1個以上のアミノ酸の改変（
すなわち、置換）を有する変異型Fc領域を含み、前記改変は、野生型親和性でFcγRIIIA
およびFcγRIIBと結合する野生型Fc領域を含む対応する分子と比べて、変異型Fc領域のFc
γRIIIAに対する親和性を高め、かつ変異型Fc領域のFcγRIIBに対する親和性を減ずるも
のである。ある実施形態では、前記1個以上のアミノ酸の改変は、256、298、333、334、2
80、290、294、298、もしくは296位のいずれにもアラニンによる置換を含まないか、また
は単独で前記置換ではなく、また、298位でのアスパラギン、バリン、アスパラギン酸、
もしくはプロリンによる置換、または290位でのセリンによる置換を含まないか、または
単独で前記置換ではない。特定の実施形態では、前記1個以上のアミノ酸の改変は、変異
型Fc領域のFcγRIIIAに対する親和性を少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75
％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも10
0％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％増大させるが、変異型Fc領域
のFcγRIIBに対する親和性を少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なく
とも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも100％、少な
くとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％低下させる。
特定の実施形態において、変異型Fc領域を担うch-4-4-20抗体を用いてELISAアッセイお
よび/またはADCCに基づくアッセイで測定したとき、FcγRIIIAに対する親和性が増大して
おりかつFcγRIIBに対する親和性が低下しているかまたはまったく認められない変異型Fc
領域を含む本発明の分子は、以下の置換を含むものである：275位でのイソロイシン、334
位でのアスパラギン、および348位でのメチオニンによる置換; または279位でのロイシン
、および395位でのセリンによる置換; または246位でのトレオニン、および319位でのフ
ェニルアラニンによる置換; または243位でのロイシン、255位でのロイシン、および318
位でのリシンによる置換; または334位でのグルタミン酸、359位でのアスパラギン、およ
び366位でのセリンによる置換; または334位でのグルタミン酸、および380位でのアスパ
ラギン酸による置換; または256位でのセリン、305位でのイソロイシン、334位でのグル
タミン酸、および390位でのセリンによる置換; または335位でのアスパラギン、370位で
のグルタミン酸、378位でのバリン、394位でのメチオニン、および424位でのロイシンに
よる置換; または233位でのアスパラギン酸、および334位でのグルタミン酸による置換;
または334位でのグルタミン酸、359位でのアスパラギン、366位でのセリン、および386位
でのアルギニンによる置換; または312位でのグルタミン酸、327位でのアスパラギン、お
よび378位でのセリンによる置換; または288位でのアスパラギン、および326位でのアス
パラギンによる置換; または247位でのロイシン、および421位でのリシンによる置換; ま
たは298位でのアスパラギン、および381位でのアルギニンによる置換; または280位での
グルタミン酸、354位でのフェニルアラニン、431位でのアスパラギン酸、および441位で
のイソロイシンによる置換; または255位でのグルタミン、および326位でのグルタミン酸
による置換; または218位でのアルギニン、281位でのアスパラギン酸、および385位での
アルギニンによる置換; または247位でのロイシン、330位でのトレオニン、および440位
でのグリシンによる置換; または284位でのアラニン、および372位でのロイシンによる置
換; または335位でのアスパラギン、387位でのセリン、および435位でのグルタミンによ
る置換; または247位でのロイシン、431位でのバリン、および442位でのフェニルアラニ
ンによる置換。
特定の実施形態において、変異型Fc領域を担うch-4-4-20抗体を用いてELISAアッセイお
よび/またはADCCに基づくアッセイで測定したとき、FcγRIIIAに対する親和性が増大して
おりかつFcγRIIBに対する親和性が低下しているかまたはまったく認められない変異型Fc
領域を含む本発明の分子は、以下の置換を含むものである：379位でのメチオニンによる
置換; 219位でのチロシンによる置換; 282位でのメチオニンによる置換; 401位でのバリ
ンによる置換; 222位でのアスパラギンによる置換; 334位でのイソロイシンによる置換;
334位でのグルタミン酸による置換; 275位でのチロシンによる置換; 398位でのバリンに
よる置換。
本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc
領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポ
リペプチドは、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドよ
りも約3倍低い親和性で、FcγRIIBと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを
包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が288位でのアスパラギンによ
る置換、330位でのセリンによる置換、および396位でのロイシンによる置換を含むもので
ある。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異
型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前
記ポリペプチドは、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチ
ドよりも約10〜15倍低い親和性で、FcγRIIBと特異的に結合するようになる、前記ポリペ
プチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が316位でのアスパラ
ギン酸による置換、378位でのバリンによる置換、および399位でのグルタミン酸による置
換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであ
って、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し
、その結果、前記ポリペプチドは、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応
するポリペプチドよりも約10倍低い親和性で、FcγRIIBと特異的に結合するようになる、
前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が315位で
のイソロイシンによる置換、379位でのメチオニンによる置換、および399位でのグルタミ
ン酸による置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリ
ペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸
の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領
域を含む対応するポリペプチドよりも約7倍低い親和性で、FcγRIIBと特異的に結合する
ようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の
改変が243位でのイソロイシンによる置換、379位でのロイシンによる置換、および420位
でのバリンによる置換を含むものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離され
たポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のア
ミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチドは、ELISAアッセイで測定して、野生
型Fc領域を含む対応するポリペプチドよりも約3倍低い親和性で、FcγRIIBと特異的に結
合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミ
ノ酸の改変が392位でのトレオニンによる置換および396位でのロイシンによる置換を含む
ものである。本発明は、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前
記変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結
果、前記ポリペプチドは、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応するポリ
ペプチドよりも約5倍低い親和性で、FcγRIIBと特異的に結合するようになる、前記ポリ
ペプチドを包含するが、ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が268位でのアスパ
ラギンによる置換および396位でのロイシンによる置換を含むものである。本発明はまた
、変異型Fc領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記変異型Fc領域が野生
型Fc領域に対して少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、その結果、前記ポリペプチド
は、ELISAアッセイで測定して、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドよりも約2倍低
い親和性で、FcγRIIBと特異的に結合するようになる、前記ポリペプチドを包含するが、
ただし、前記少なくとも1個のアミノ酸の改変が319位でのフェニルアラニンによる置換、
352位でのロイシンによる置換、および396位でのロイシンによる置換を含むものである。
C. FcγRIIIAおよびFcγRIIBに対する親和性が増大している突然変異体
本発明は、1個以上のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含んでなる分子を包含し
、前記改変は、変異型Fc領域のFcγRIIIAおよびFcγRIIBに対する親和性を少なくとも65
％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95
％、少なくとも99％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくと
も400％増大させるものである。特定の実施形態では、（本明細書に記載するような、変
異型Fc領域を担うch-4-4-20抗体を用いてELISAアッセイおよび/またはADCCに基づくアッ
セイにより測定したとき）FcγRIIIAおよびFcγRIIBに対する親和性が増大している変異
型Fc領域を含む本発明の分子は、以下の改変を含んでなる：415位でのイソロイシン、お
よび251位でのフェニルアラニンによる置換; または399位でのグルタミン酸、292位での
ロイシン、および185位でのメチオニンによる置換; または408位でのイソロイシン、215
位でのイソロイシン、および125位でのロイシンによる置換; または385位でのグルタミン
酸および247位でのヒスチジンによる置換; または348位でのメチオニン、334位でのアス
パラギン、275位でのイソロイシン、202位でのメチオニン、および147位でのトレオニン
による置換; または246位でのトレオニン、および396位でのヒスチジンによる置換; また
は268位でのアスパラギン酸および318位でのアスパラギン酸による置換; または288位で
のアスパラギン、330位でのセリン、および396位でのロイシンによる置換; または244位
でのヒスチジン、358位でのメチオニン、379位でのメチオニン、384位でのリシン、およ
び397位でのメチオニンによる置換; または217位でのセリン、378位でのバリン、および4
08位でのアルギニンによる置換; または247位でのロイシン、253位でのアスパラギン、お
よび334位でのアスパラギンによる置換; または246位でのイソロイシン、および334位で
のアスパラギンによる置換; または320位でのグルタミン酸、および326位でのグルタミン
酸による置換; または375位でのシステイン、および396位でのロイシンによる置換; また
は343位でのセリン、353位でのロイシン、375位でのイソロイシン、383位でのアスパラギ
ンによる置換; または394位でのメチオニン、および397位でのメチオニンによる置換; ま
たは216位でのアスパラギン酸、345位でのリシン、および375位でのイソロイシンによる
置換; または288位でのアスパラギン、330位でのセリン、および396位でのロイシンによ
る置換; または247位でのロイシン、および389位でのグリシンによる置換; または222位
でのアスパラギン、335位でのアスパラギン、370位でのグルタミン酸、378位でのバリン
、および394位でのメチオニンによる置換; または316位でのアスパラギン酸、378位での
バリン、および399位でのグルタミン酸による置換; または315位でのイソロイシン、379
位でのメチオニン、および394位でのメチオニンによる置換; または290位でのトレオニン
、および371位でのアスパラギン酸による置換; または247位でのロイシン、および398位
でのグルタミンによる置換; または326位でのグルタミン、334位でのグルタミン酸、359
位でのアスパラギン、および366位でのセリンによる置換; または247位でのロイシン、お
よび377位でのフェニルアラニンによる置換; または378位でのバリン、390位でのイソロ
イシン、および422位でのイソロイシンによる置換; または326位でのグルタミン酸、およ
び385位でのグルタミン酸による置換; または282位でのグルタミン酸、369位でのイソロ
イシン、および406位でのフェニルアラニンによる置換; または397位でのメチオニン、41
1位でのアラニン、および415位でのアスパラギンによる置換; または223位でのイソロイ
シン、256位でのセリン、および406位でのフェニルアラニンによる置換; または298位で
のアスパラギン、および407位でのアルギニンによる置換; または246位でのアルギニン、
298位でのアスパラギン、および377位でのフェニルアラニンによる置換; または235位で
のプロリン、382位でのメチオニン、304位でのグリシン、305位でのイソロイシン、およ
び323位でのイソロイシンによる置換; または247位でのロイシン、313位でのアルギニン
、および388位でのグリシンによる置換; または221位でのチロシン、252位でのイソロイ
シン、330位でのグリシン、339位でのトレオニン、359位でのアスパラギン、422位でのイ
ソロイシン、および433位でのロイシンによる置換; または258位でのアスパラギン酸、お
よび384位でのリシンによる置換; または241位でのロイシン、および258位でのグリシン
による置換; または370位でのアスパラギン、および440位でのアスパラギンによる置換;
または317位でのアスパラギンによる置換および423位での欠失; または243位でのイソロ
イシン、379位でのロイシン、および420位でのバリンによる置換; または227位でのセリ
ン、および290位でのグルタミン酸による置換; または231位でのバリン、386位でのヒス
チジン、および412位でのメチオニンによる置換; または215位でのプロリン、274位での
アスパラギン、287位でのグリシン、334位でのアスパラギン、365位でのバリン、および3
96位でのロイシンによる置換; または293位でのバリン、295位でのグルタミン酸、および
327位でのトレオニンによる置換; または319位でのフェニルアラニン、352位でのロイシ
ン、および396位でのロイシンによる置換; または392位でのトレオニン、および396位で
のロイシンによる置換; または268位でのアスパラギン、および396位でのロイシンによる
置換; または290位でのトレオニン、390位でのイソロイシン、および396位でのロイシン
による置換; または326位でのイソロイシン、および396位でのロイシンによる置換; また
は268位でのアスパラギン酸、および396位でのロイシンによる置換; または210位でのメ
チオニン、および396位でのロイシンによる置換; または358位でのプロリン、および396
位でのロイシンによる置換; または288位でのアルギニン、307位でのアラニン、344位で
のグルタミン酸、および396位でのロイシンによる置換; または273位でのイソロイシン、
326位でのグルタミン酸、328位でのイソロイシン、および396位でのロイシンによる置換;
または326位でのイソロイシン、408位でのアスパラギン、および396位でのロイシンによ
る置換; または334位でのアスパラギン、および396位でのロイシンによる置換; または37
9位でのメチオニン、および396位でのロイシンによる置換; または227位でのセリン、お
よび396位でのロイシンによる置換; または217位でのセリン、および396位でのロイシン
による置換; または261位でのアスパラギン、210位でのメチオニン、および396位でのロ
イシンによる置換; または419位でのヒスチジン、および396位でのロイシンによる置換;
または370位でのグルタミン酸、および396位でのロイシンによる置換; または242位での
フェニルアラニン、および396位でのロイシンによる置換; または255位でのロイシン、お
よび396位でのロイシンによる置換; または240位でのアラニン、および396位でのロイシ
ンによる置換; または250位でのセリン、および396位でのロイシンによる置換; または24
7位でのセリン、および396位でのロイシンによる置換; または410位でのヒスチジン、お
よび396位でのロイシンによる置換; または419位でのロイシン、および396位でのロイシ
ンによる置換; または427位でのアラニン、および396位でのロイシンによる置換; または
258位でのアスパラギン酸、および396位でのロイシンによる置換; または384位でのリシ
ン、および396位でのロイシンによる置換; または323位でのイソロイシン、および396位
でのロイシンによる置換; または244位でのヒスチジン、および396位でのロイシンによる
置換; または305位でのロイシン、および396位でのロイシンによる置換; または400位で
のフェニルアラニン、および396位でのロイシンによる置換; または303位でのイソロイシ
ン、および396位でのロイシンによる置換; または243位でのロイシン、305位でのイソロ
イシン、378位でのアスパラギン酸、404位でのセリン、および396位でのロイシンによる
置換; または290位でのグルタミン酸、369位でのアラニン、393位でのアラニン、および3
96位でのロイシンによる置換; または210位でのアスパラギン、222位でのイソロイシン、
320位でのメチオニン、および396位でのロイシンによる置換; または217位でのセリン、3
05位でのイソロイシン、309位でのロイシン、390位でのヒスチジン、および396位でのロ
イシンによる置換;または246位でのアスパラギン、419位でのアルギニン、および396位で
のロイシンによる置換; または217位でのアラニン、359位でのアラニン、および396位で
のロイシンによる置換; または215位でのイソロイシン、290位でのバリン、および396位
でのロイシンによる置換; または275位でのロイシン、362位でのヒスチジン、384位での
リシン、および396位でのロイシンによる置換; または334位でのアスパラギンによる置換
; または400位でのプロリンによる置換; または407位でのイソロイシンによる置換; また
は372位でのチロシンによる置換; または366位でのアスパラギンによる置換; または414
位でのアスパラギンによる置換; または352位でのロイシンによる置換; または225位での
セリンによる置換; または377位でのアスパラギンによる置換; または248位でのメチオニ
ンによる置換。
D. いずれのFcγRとも結合しない突然変異体
いくつかの実施形態において、本発明は、野生型Fc領域に対して少なくとも1個のアミ
ノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含んでなる分子であって、前記変異型Fc領域が、本明
細書に記載する当技術分野で公知の標準アッセイで測定したとき、野生型Fc領域を含む対
応する分子と比べて、いずれのFcγRとも結合しない、上記分子を包含する。特定の実施
形態では、あらゆるFcγRへの結合を完全に破壊する1個以上のアミノ酸の改変は、以下の
改変を含んでなる： 232位でのセリン、および304位でのグリシンによる置換; または269
位でのリシン、290位でのアスパラギン、311位でのアルギニン、および433位でのチロシ
ンによる置換; または252位でのロイシンによる置換; または216位でのアスパラギン酸、
334位でのアルギニン、および375位でのイソロイシンによる置換; または247位でのロイ
シン、406位でのフェニルアラニンによる置換、または335位でのアスパラギン、387位で
のセリン、および435位でのグルタミンによる置換; または334位でのグルタミン酸、380
位でのアスパラギン酸、および446位でのバリンによる置換; または303位でのイソロイシ
ン、369位でのフェニルアラニン、および428位でのロイシンによる置換; または251位で
のフェニルアラニン、および372位でのロイシンによる置換; または246位でのグルタミン
酸、284位でのメチオニン、および308位でのアラニンによる置換; または399位でのグル
タミン酸、および402位でのアスパラギン酸による置換; または399位でのグルタミン酸、
および428位でのロイシンによる置換。
D. 変更されたFcγR媒介エフェクター機能を有する突然変異体
特定の実施形態において、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増大して
いる本発明の免疫グロブリンは、本明細書に記載するADCC活性アッセイを用いて測定した
とき、増大したFcγR媒介エフェクター機能を有する。本発明の分子により媒介されうる
エフェクター機能の例としては、限定するものではないが、Clq結合、補体依存性細胞傷
害作用、抗体依存性細胞傷害作用 (ADCC)、食作用などが挙げられる。本発明の分子のエ
フェクター機能は、当技術分野で公知の標準方法を用いてアッセイすることができ、かか
る方法の例をセクション5.2.6に記載する。特定の実施形態では、FcγRIIIAおよび/また
はFcγRIIAに対する親和性が増大している変異型Fc領域を含む本発明の免疫グロブリンは
、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンと比べて、2倍効果的に抗体依存性細胞傷害作用 (A
DCC)を媒介する。他の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が
増大している変異型Fc領域を含む本発明の免疫グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グ
ロブリンと比べて、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍
、少なくとも1000倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍効果的に抗体依存性細胞傷害作
用 (ADCC)を媒介する。別の特定の実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対
する親和性が増大している本発明の免疫グロブリンは、変更されたClq結合活性を有する
。いくつかの実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増大して
いる本発明の免疫グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンよりも、少なくとも
2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも10
00倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍高いC1q結合活性を有する。さらに別の特定の
実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増大している本発明の
免疫グロブリンは、変更された補体依存性細胞傷害作用を有する。さらに別の特定の実施
形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増大している本発明の免疫
グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンと比べて、増大した補体依存性細胞傷
害作用を有する。いくつかの実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親
和性が増大している本発明の免疫グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンより
も、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍
、少なくとも1000倍、少なくとも104倍、少なくとも105倍高い補体依存性細胞傷害作用を
有する。
他の実施形態において、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増大してい
る本発明の免疫グロブリンは、当業者に公知のまたは本明細書に記載の標準アッセイで測
定したとき、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンと比べて、増大した食作用活性を有する
。いくつかの実施形態では、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性が増大して
いる本発明の免疫グロブリンは、野生型Fc領域を含む免疫グロブリンよりも、少なくとも
2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍高い食作用活性を有する。
特定の実施形態において、本発明は、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性
が増大している、1個以上のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領域を含み、その結果、増
大したエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害作用または食作用を有する免疫グ
ロブリンを包含する。特定の実施形態では、変異型Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγ
RIIAに対する親和性を増大し、かつ免疫グロブリンのADCC活性を増大する1個以上のアミ
ノ酸の改変は、以下の改変を含んでなる： 379位でのメチオニンによる置換; または243
位でのイソロイシン、および379位でのロイシンによる置換; または288位でのアスパラギ
ン、330位でのセリン、および396位でのロイシンによる置換; または243位でのロイシン
、および255位でのロイシンによる置換; または334位でのグルタミン酸、359位でのアス
パラギン、および366位でのセリンによる置換; または288位でのメチオニン、および334
位でのグルタミン酸による置換; または334位でのグルタミン酸、および292位でのロイシ
ンによる置換; または316位でのアスパラギン酸、378位でのバリン、および399位でのグ
ルタミン酸による置換; または315位でのイソロイシン、379位でのメチオニン、および39
9位でのグルタミン酸による置換; または243位でのイソロイシン、379位でのロイシン、
および420位でのバリンによる置換; または247位でのロイシン、および421位でのリシン
による置換; または248位でのメチオニンによる置換; または392位でのトレオニン、およ
び396位でのロイシンによる置換; または293位でのバリン、295位でのグルタミン酸、お
よび327位でのトレオニンによる置換; または268位でのアスパラギン、および396位での
ロイシンによる置換; または319位でのフェニルアラニン、352位でのロイシン、および39
6位でのロイシンによる置換。
別の特定の実施形態において、免疫グロブリンのADCC活性を増大する1個以上のアミノ
酸の改変は、以下の表4に示す突然変異のいずれかである。
Figure 0006389093
Figure 0006389093
本発明は、2nd-4th-ラウンドのソーティング後に突然変異体の酵母ライブラリーから本
発明の方法を用いて同定されたFc領域の特定の変異体を包含する。表5に、本発明の方法
を用いて同定された種々の突然変異体をまとめてある。これらの突然変異体は、FcγRIII
AおよびFcγRIIBへの結合を測定するためのELISAアッセイを用いて測定した。突然変異体
はまた、本明細書に記載し例示する方法を用いてFc変異体をch 4-4-20抗体にクローニン
グすることにより、ADCCアッセイにおいても試験した。太字の項目は実験を指しており、
その際、ADCCアッセイ前にch 4-4-20抗体を精製した。用いた抗体濃度は0.5〜1.0μg/mL
の範囲であった。
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
好ましい実施形態において、本発明は、1個以上のアミノ酸の改変を有する変異型Fc領
域を含む改変された免疫グロブリン分子（例えば、抗体）であって、前記1個以上のアミ
ノ酸の改変が、該分子のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を増大するもの
である、上記分子を提供する。そのような免疫グロブリンには、天然でFcγR結合領域（
例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領域）を含むIgG分子、またはFcγR結合領
域（例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領域）を含むように遺伝子操作された
免疫グロブリン誘導体が含まれる。本発明の改変された免疫グロブリンは、抗原と結合し
、好ましくは免疫特異的に結合し、すなわち、特異的な抗原-抗体結合をアッセイするた
めの当技術分野で周知のイムノアッセイで測定したとき非特異的結合に対しては競合せず
、かつFcγR結合領域（例えば、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIB結合領域）を含む、ど
のような免疫グロブリン分子も包含する。かかる抗体としては、限定するものではないが
、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異的、多重特異的、ヒト、ヒト化、キメラ抗
体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、ジスルフィド架橋Fv、およ
びVLもしくはVHドメインのいずれかまたは抗原と特異的に結合する相補性決定領域(CDR)
さえも含む、特定の場合にはFcγR結合領域を含むように遺伝子操作されたまたはFcγR結
合領域に融合された、フラグメントが含まれる。
いくつかの実施形態において、本発明の分子は、Fc領域の部分を含んでなる。本明細書
中で用いる「Fc領域の部分」とは、Fc領域の断片、好ましくはエフェクター活性および/
またはFcγR結合活性を有する部分（またはそのような活性を欠く突然変異体の対応領域
）を意味する。Fc領域の断片は、5アミノ酸から、全Fc領域より1アミノ酸を除いたものま
でのサイズ範囲でありうる。Fc領域の部分は、N末端またはC末端から最大10、最大20、最
大30アミノ酸を欠失していてもよい。
本発明のIgG分子はIgG1サブクラスであることが好ましいが、所与の動物のどのような
他のIgGサブクラスであってもよい。例えば、ヒトでは、IgGクラスにIgGl、IgG2、IgG3、
およびIgG4が含まれ、マウスでは、IgGクラスにIgGl、IgG2a、IgG2b、IgG2cおよびIgG3が
含まれる。
免疫グロブリン（および本明細書において用いる他のポリペプチド）は、鳥類や哺乳類
を含めて、どのような動物に由来するものであってもよい。好ましくは、抗体はヒト、げ
っ歯類（例えば、マウス、ラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ
、ウマまたはニワトリのものである。本明細書中で用いる「ヒト」抗体には、ヒト免疫グ
ロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単
離された抗体、または、以下に記載されまた例えばKucherlapatiらによる米国特許第5,93
9,598号に記載されるような、1以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックで
ありかつ内在性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。
本発明の抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的、またはそれ以上の多重特異的
でありうる。多重特異的抗体は、1つのポリペプチドの異なるエピトープに特異的であっ
ても、固相支持材料や異種ポリペプチドのような異種エピトープに特異的であってもよい
。例えば、PCT公開 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tuttら, J.
Immunol., 147: 60-69, 1991; 米国特許第4,474,893号; 第4,714,681号; 第4,925,648号
; 第5,573,920号; 第5,601,819号; Kostelnyら, J. Immunol., 148: 1547-1553, 1992を
参照されたい。
本発明の抗体には、他の方法で修飾されている誘導体、すなわち、抗体への任意のタイ
プの分子の共有結合により修飾された誘導体が含まれる。ただし、その共有結合は、抗体
が抗原と結合したりおよび/または抗イディオタイプ応答を生成したりするのを妨げない
ものである。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体には、グリコシル化、アセチ
ル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タ
ンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより修飾されて
いる抗体が含まれる。多数の化学的修飾のうちのどれを公知の技法で行なってもよく、例
えば、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに限らない。さらに、抗体誘導体は古典的アミノ酸以外のアミノ酸を1
個以上含んでいてもよい。
抗体のヒトでのin vivo使用およびin vitro検出アッセイを含めて、いくつかの用途に
おいては、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を用いることが好ましい。キメラ抗体は、抗
体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗
体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有する抗体などである。キメラ
抗体の作製方法は当技術分野で公知である。例えば、Morrison, Science, 229: 1202, 19
85; Oiら, BioTechniques, 4: 214 1986; Gilliesら, J. Immunol. Methods, 125: 191-2
02, 1989; 米国特許第5,807,715号; 第4,816,567号; および第4,816,397号を参照された
い（これらをそのまま参照により本明細書に組み入れる）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来
の1以上の相補性決定領域(CDR)と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域お
よび定常ドメインとを有する、所望の抗原と結合する非ヒト種由来の抗体分子である。往
々にして、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基をCDRドナー抗体由来の対応す
る残基で置換すると、抗原結合が改変される（好ましくは改善される）だろう。こうした
フレームワーク置換は当技術分野で公知の方法により確認することができ、例えば、抗原
結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するには、CDRとフレームワーク残基との
相互作用のモデリングを行い、また、特定の位置にある特異なフレームワーク残基を同定
するには、配列比較を行う。例えば、Queenら, 米国特許第5,585,089号; Riechmannら, N
ature, 332: 323, 1988を参照されたい（これらをそのまま参照により本明細書に組み入
れる）。抗体は、当技術分野で公知の様々な技法によりヒト化することができ、例えば、
以下の方法が含まれる： CDR-グラフティング(EP 239,400; PCT公開WO 91/09967; 米国特
許第5,225,539号; 第5,530,101号および第5,585,089号)、ベニアリング(veneering)また
はリサーフェシング(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immun
ology, 28(4/5): 489-498, 1991; Studnickaら, Protein Engineering, 7(6): 805-814,
1994 ;Roguskaら, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91: 969-973, 1994)、およびチェーンシ
ャフリング(chain shuffling) (米国特許第5,565,332号) （これら全てをそのまま参照に
より本明細書に組み入れる）。
ヒト患者の治療には、完全にヒトの抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、当技術分野で公
知の様々な方法で作製することができ、例えば、ヒト免疫グロブリン配列から誘導された
抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ法がある。米国特許第4,444,887
号および第4,716,111号; ならびにPCT公開WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO
98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; およびWO 91/10741を参照されたい（これらをそ
のまま参照により本明細書に組み入れる）。
また、ヒト抗体は、トランスジェニックマウスを用いて製造することができ、かかるマ
ウスは、機能的な内因性の免疫グロブリンを発現する能力がないが、ヒト免疫グロブリン
遺伝子を発現することができる。ヒト抗体を製造するための当該技術の概要については、
LonbergおよびHuszar, Int. Rev. Immunol., 13: 65-93, 1995を参照されたい。ヒト抗体
およびヒトモノクローナル抗体を製造するための当該技術の詳細、ならびに前記抗体を製
造するためのプロトコルについては、PCT公開WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096;
WO 96/33735; ヨーロッパ特許第0 598 877号; 米国特許第5,413,923号; 第5,625,126号;
第5,633,425号; 第5,569, 825号; 第5,661,016号; 第5,545,806号; 第5,814,318号; 第5,
885,793号; 第5,916,771号; および第5,939,598号を参照されたい（これらをそのまま参
照により本明細書に組み入れる）。さらに、Abgenix, Inc. (Freemont, CA)、Medarex (N
J) および Genpharm (San Jose, CA)といった会社は、上記の技法と類似した方法を用い
て、所定の抗原に対するヒト抗体を提供することを請け負っている。
所定のエピトープを認識する完全にヒトの抗体は、「guided selection」と呼ばれる技
法を用いて作製することができる。この方法では、同じエピトープを認識する完全ヒト抗
体の選択を案内するために、所定の非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を
用いる (Jespersら, Bio/technology, 12: 899-903, 1988)。
本発明は、ヒトまたはヒト化治療用抗体（例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）の
Fc領域を、少なくとも1個のアミノ酸残基の改変（例えば、置換、挿入、欠失）により操
作することを包含し、ただし前記改変は、Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対
する親和性を増大させるものである。別の実施形態では、本発明は、ヒトまたはヒト化治
療用抗体（例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）のFc領域を、少なくとも1個のアミ
ノ酸残基の改変により操作することに関し、ただし前記改変は、Fc領域のFcγRIIIAおよ
び/またはFcγRIIAに対する親和性を増大させ、かつFc領域のFcγRIIBに対する親和性を
減少させるものである。操作された治療用抗体はさらに、当業者に公知の標準アッセイで
測定して、増大したエフェクター機能（例えば、増大したADCC活性、食作用活性など）を
もちうる。
特定の実施形態において、本発明は、Her2/neuプロトオンコジーン（がん原遺伝子）に
特異的なヒト化モノクローナル抗体（例えば、Carterら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89: 4285-9に記載されるようなAb4D5ヒト化抗体）を、少なくとも1個のアミノ酸残
基の改変（例えば、置換、挿入、欠失）により操作することを包含し、ただし前記改変は
、Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を増大させるものである。別
の特定の実施形態では、ヒト化Her2/neuモノクローナル抗体の改変はさらに、Fc領域のFc
γRIIBに対する親和性を減少させうるものである。さらに別の特定の実施形態では、操作
された、Her2/neuに特異的なヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり本明
細書にも開示する標準アッセイで測定して、増大したエフェクター機能をさらにもちうる
。
別の特定の実施形態においては、本発明は、マウスとヒトのキメラ抗CD20モノクローナ
ル抗体2H7を、少なくとも1個のアミノ酸残基の改変（例えば、置換、挿入、欠失）により
操作することを包含し、ただし前記改変は、Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに
対する親和性を増大させるものである。別の特定の実施形態では、抗CD20モノクローナル
抗体2H7の改変はさらに、Fc領域のFcγRIIBに対する親和性を減少させうるものである。
さらに別の特定の実施形態では、操作された抗CD20モノクローナル抗体2H7は、当技術分
野で公知であり本明細書にも開示する標準アッセイで測定して、増大したエフェクター機
能をさらにもちうる。
別の特定の実施形態においては、本発明は、抗FcγRIIB抗体（2002年8月12日付の米国
仮特許出願第60/403,266号および代理人整理番号011183-010-999を有する2003年8月14日
付の米国特許出願第10/643,857号に開示される抗体を含むが、それらに限らない）を、少
なくとも1個のアミノ酸残基の改変（例えば、置換、挿入、欠失）により操作することを
包含し、ただし前記改変は、Fc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を
増大させるものである。本発明の方法に従って操作しうる抗FcγRIIB抗体の例は、ATCC受
託番号PTA-4591を有する2B6モノクローナル抗体およびATCC受託番号PTA-4592を有する3H7
である（寄託：10801 University Boulevard, Manassas, VA 02209-2011）。別の特定の
実施形態では、抗FcγRIIB抗体の改変はさらに、Fc領域のFcγRIIBに対する親和性を減少
させうるものである。さらに別の特定の実施形態では、操作された抗FcγRIIB抗体は、当
技術分野で公知であり本明細書にも開示する標準アッセイで測定して、増大したエフェク
ター機能をさらにもちうる。特定の実施形態では、2B6モノクローナル抗体は、334位での
グルタミン酸、359位でのアスパラギン、および366位でのセリンによる改変(MgFcl3); ま
たは316位でのアスパラギン酸、378位でのバリン、および399位でのグルタミン酸による
置換(MgFc27); または243位でのイソロイシン、379位でのロイシン、および420位でのバ
リンによる置換(MgFc29); または392位でのトレオニン、および396位でのロイシンによる
置換(MgFc38); または221位でのグルタミン酸、270位でのグルタミン酸、308位でのアラ
ニン、311位でのヒスチジン、396位でのロイシン、および402位でのアスパラギン酸によ
る置換(MgFc42); または410位でのヒスチジン、および396位でのロイシンによる置換(MgF
c53); または243位でのロイシン、305位でのイソロイシン、378位でのアスパラギン酸、4
04位でのセリン、および396位でのロイシンによる置換(MgFc54); または255位でのイソロ
イシン、および396位でのロイシンによる置換(MgFc55); または370位でのグルタミン酸、
および396位でのロイシンによる置換(MgFc59)を含む（表5参照）。
5.1.1 ポリペプチドおよび抗体コンジュゲート
変異型Fc領域を含む本発明の分子（すなわち、ポリペプチド、抗体）は、融合タンパク
質を作製するために、異種ポリペプチド（すなわち、無関係なポリペプチドまたはその部
分、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも
50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90または少なくとも100ア
ミノ酸のポリペプチド）と組換えにより融合させたり、または化学的に結合させたり（共
有結合と非共有結合の両方を含む）することができる。融合は必ずしも直接である必要は
なく、リンカー配列を介して行なってもよい。
さらに、変異型Fc領域を含む本発明の分子（すなわち、ポリペプチド、抗体）は、治療
薬または所与の生物学的応答を改変する薬物成分とコンジュゲートさせることができる。
治療薬または薬物成分は古典的な化学治療薬に限定されると解釈されるべきでない。例え
ば、薬物成分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよ
い。このようなタンパク質の例としては、以下のものが挙げられる：毒素、例えばアブリ
ン、リシンA、シュードモナス外毒素（すなわち、PE-40）、またはジフテリア毒素、リシ
ン（ricin）、ゲロニン（gelonin）、およびヤマゴボウ（pokeweed）抗ウイルスタンパク
質、腫瘍壊死因子のようなタンパク質、α-インターフェロン（IFN-α）、β-インターフ
ェロン（IFN-β）を含むがこれらに限らないインターフェロン、神経成長因子（NGF）、
血小板由来成長因子（PDGF）、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、アポトーシス
薬（例えば、TNF-α、TNF-β、PCT公開WO 97/33899に開示されたAIM I）、AIM II（PCT公
開WO 97/34911）、Fasリガンド（Takahashiら, J. Immunol., 6:1567-1574, 1994）、お
よびVEGI（PCT公開WO 99/23105）、血栓薬または抗血管形成薬（例えば、アンギオスタチ
ンまたはエンドスタチン）、または生物学的応答改変剤、例えば、リンホカイン（例：イ
ンターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）
、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および顆粒球コロニー刺激因子（
G-CSF）)、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、または増殖因子、例えば成長ホ
ルモン（GH）；プロテアーゼ、またはリボヌクレアーゼ。
本発明の分子（すなわち、ポリペプチド、抗体）は、マーカー配列、例えば精製を容易
にするペプチド、と融合させることができる。好ましい実施形態においては、マーカーア
ミノ酸配列はヘキサ-ヒスチジンペプチド、例えば、とりわけ、pQEベクター（QIAGEN, In
c., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）中に提供されるタグであり、これらの
多くは市販されている。Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824, 1989に記
載の通り、例えば、ヘキサ-ヒスチジンは融合タンパク質の精製を容易にする。精製に有
用な他のペプチドタグとしては、限定するものではないが、インフルエンザヘマグルチニ
ンタンパク質から誘導されるエピトープに対応するヘマグルチニン「HA」タグ（Wilsonら
, Cell, 37: 767 1984）および「flag」タグ（Knappikら, Biotechniques, 17(4):754-76
1, 1994）が挙げられる。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子-シャフリング、モチーフ-シャフリング、エキソン
-シャフリング、および/またはコドン-シャフリング（まとめて「DNAシャフリング」と呼
ぶ）の技術を介して作製することができる。DNAシャッフリングを用いて本発明の分子の
活性を改変することができる（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度をもつ抗
体）。一般的には、米国特許第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,2
52号；および第5,837,458号、ならびにPattenら, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:7
24-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76；Hansson,ら, 1999, J. Mol. Biol.
287:265；ならびにLorenzoおよびBlasco, 1998, BioTechniques 24:308を参照されたい(
これらの特許および刊行物をそのまま参照により本明細書に組み入れる)。変異型Fc領域
を含む本発明の分子、または本発明の分子をコードする核酸は、組換えに先立って、誤り
がちなPCRによる無作為突然変異誘発、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法に供する
ことによりさらに改変することができる。本発明の分子をコードするポリヌクレオチドの
１以上の部分を、１以上の異種分子のモチーフ、セクション、パーツ、ドメイン、フラグ
メントなどの１以上の成分と組換えることもできる。
本発明はまた、診断薬もしくは治療薬とコンジュゲートされた、または血清半減期の増
加が所望されかつ/または特定の細胞のサブセットにターゲッティングされるいずれか他
の分子とコンジュゲートされた、変異型Fc領域を含む本発明の分子（すなわち、抗体、ポ
リペプチド）を包含する。本発明の分子を診断に用いて、例えば、所与の治療計画の効力
を調べるために、臨床試験操作の一部として疾患、障害または感染の発生または進行をモ
ニターすることができる。本発明の分子を検出可能な物質とカップリングさせることによ
り、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、各種酵素、補欠分子
団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、ポジトロン放出金属、および非放
射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質を、直接的にまたは間接的に中間体
（例えば、当技術分野で公知のリンカー）を介して、当技術分野で公知の技術により本発
明の分子とカップリングまたはコンジュゲートすることができる。例えば、本発明に従っ
て診断薬として使用される抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンに関しては
、米国特許第4,741,900号を参照されたい。かかる診断および検出は、本発明の分子を、
検出可能な物質にカップリングすることにより実施することができる。検出可能な物質と
しては、以下のものが挙げられる：酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含むが
、これらに限定されない；補欠分子団複合体、例えば、ストレプトアビジン/ビオチンお
よびアビジン/ビオチンを含むが、これらに限定されない；蛍光物質、例えば、ウンベリ
フェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロ
トリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含むが、こ
れらに限定されない；発光物質、例えば、ルミノールを含むが、これに限定されない；生
物発光物質、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含むが、これ
らに限定されない；放射性物質、例えば、ビスマス（213Bi）、炭素（14C）、クロム（51
Cr）、コバルト（57Co）、フッ素（18F）、ガドリニウム（153Gd、159Gd）、ガリウム（6
8Ga、67Ga）、ゲルマニウム（68Ge）、ホルミウム（166Ho）、インジウム（115In、113In
、112In、111In）、ヨウ素（131I、125I、123I、121I）、ランタン（140La）、ルテチウ
ム（177Lu）、マンガン（54Mn）、モリブデン（99Mo）、パラジウム（103Pd）、リン（32
P）、プラセオジム（142Pr）、プロメチウム（149Pm）、レニウム（186Re、188Re）、ロ
ジウム（105Rh）、ルテニウム（97Ru）、サマリウム（153Sm）、スカンジウム（47Sc）、
セレン（75Se）、ストロンチウム（85Sr）、硫黄（35S）、テクネチウム（99Tc）、タリ
ウム（201Tl）、スズ（113Sn、117Sn）、トリチウム（3H）、キセノン（133Xe）、イッテ
ルビウム（169Yb、175Yb）、イットリウム（90Y）、亜鉛（65Zn）；様々なポジトロン放
出断層撮影に用いるポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオン。
変異型Fc領域を含む本発明の分子（すなわち、ポリペプチド、抗体）は、治療成分、例
えば細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制薬または殺細胞薬）、治療薬または放射性元素（例
えば、α線放射体、γ線放射体など）とコンジュゲートすることができる。細胞毒素また
は細胞毒性薬には、細胞に有害であればいずれの薬剤も含まれる。例としては、パクリタ
キセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン
、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビ
シン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマ
イシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカ
イン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならび
にそれらの類似体または同族体が挙げられる。治療薬としては、限定するものではないが
、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シ
タラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン
、チオエパクロランブシル（thioepa chlorambucil）、メルファラン、カルムスチン（BS
NU）およびロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファ
ン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis-ジクロ
ロジアミン白金(II)（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシ
ン（旧名称ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイ
シン（旧名称アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマ
イシン（AMC））、および抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン
）が挙げられる。
さらに、本発明の分子は、治療成分、例えば放射性物質または大環状キレート剤（放射
性金属イオン（放射性物質の例については上記参照）をコンジュゲートするために有用で
ある）にコンジュゲートすることができる。ある特定の実施形態においては、大環状キレ
ート剤は、リンカー分子を介して抗体と結合することができる1,4,7,10-テトラアザシク
ロドデカン-N,N’,N’’,N’’’-四酢酸（DOTA）である。このようなリンカー分子は当
技術分野では公知であり、Denardoら, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90；Petersonら,
1999, Bioconjug. Chem. 10:553；およびZimmermanら, 1999, Nucl. Med. Biol. 26: 94
3-50に記載されていてる（それぞれ、参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。
このような治療成分を抗体とコンジュゲートする技術は周知であり、例えば、Arnonら,
「癌治療法における薬物の免疫ターゲティング用のモノクローナル抗体（Monoclonal Ant
ibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy）」, Monoclonal Antibodie
s And Cancer Therapy, Reisfeldら(編), 1985, pp.243-56, Alan R. Liss, Inc.；Hells
tromら,「薬物送達用の抗体（Antibody For Drug Delivery）」, Controlled Drug Deliv
ery (第2版), Robinsonら(編), 1987, pp.623-53, Marcel Dekker, Inc.)；Thorpe, 「癌
治療法における細胞毒性薬の抗体キャリアー：総説（Antibody Careeres Of Cytotoxic
Agents In Cancer Therapy: A Review）」, Monoclonal Angibodies '84: Biological An
d Clinical Applications, Pincheraら(編), 1985, pp.475-506；「癌治療法における放
射性標識抗体の治療用途の分析、結果、ならびに将来予測（Analysis, Results, And Fut
ure Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therap
y）」, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編), 19
85, pp.303-16, Academic Press；およびThorpeら, Immunol. Rev., 62:119-58, 1982を
参照されたい。
一つの実施形態において、本発明の分子が変異型Fc領域を含む抗体である場合、かかる
抗体は、それにコンジュゲートされた治療成分を伴ってまたは伴わないで、単独で投与す
ることができるし、または治療薬として用いるための細胞毒性因子および/またはサイト
カインと組み合わせて投与することもできる。あるいは、本発明の抗体を第２の抗体とコ
ンジュゲートさせて、米国特許第4,676,980号（参照によりその全体を本明細書に組み入
れる）においてSegalにより記載された抗体へテロコンジュゲートを作製することができ
る。本発明の抗体はまた、固相支持体に結合させてもよく、これはイムノアッセイまたは
標的抗原の精製に特に有用である。このような固相支持体としては、ガラス、セルロース
、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレン
が挙げられる。
5.2 変異型Fc領域を含む分子の、増大したFcγRIII結合についてのスクリーニング、な
らびにその特性決定
好ましい実施形態では、本明細書に記載した酵母ディスプレイ技術と1種以上の生化学
的アッセイを、好ましくはハイスループット法において併用し、変更されたFcγR親和性(
例えば、増大したFcγRIIIA親和性)を持つ変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよ
び同定を実施する。1種以上の生化学的アッセイとしては、Fc-FcγR相互作用、すなわちF
c領域のFcγRへの特異的結合を同定するための、当技術分野で知られているあらゆるアッ
セイが可能であり、限定するわけではないが、ELISAアッセイ、表面プラズモン共鳴アッ
セイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティクロマトグラフィー、および平衡透析が含まれる
。いくつかの実施形態では、本明細書に記載した酵母ディスプレイ技術と1種以上の機能
的アッセイを、好ましくはハイスループット法において併用し、変更されたFcγR親和性(
例えば、増大したFcγRIIIA親和性)を持つ変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよ
び同定を実施する。機能的アッセイとは、本明細書中、セクション5.2.6に記載するもの
などの、1種以上のFcγR介在エフェクター細胞機能を特定するための、当技術分野で知ら
れているどんなアッセイでもよい。本発明の方法に従って使用することができるエフェク
ター細胞機能の非限定例として、限定するわけではないが以下が含まれる：抗体依存性細
胞傷害作用(ADCC)、抗体依存性食作用、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、細
胞結合、ロゼット化、Clq結合、および補体依存性細胞傷害。いくつかの実施形態では、
本明細書に記載した酵母ディスプレイ技術と1種以上の生化学的アッセイを、1種以上の機
能的アッセイと組み合わせるか、同時進行させて、好ましくはハイスループット手法で併
用して、変更されたFcγR親和性(例えば、増大したFcγRIIIA親和性)を持つ変異型Fc領域
を含む分子のスクリーニングおよび同定を実施する。
Fc領域のFcγRへの「特異的結合」との用語は、Fc領域と、例えば、ELISAまたは表面プ
ラズモン共鳴アッセイ(例えば、BIAcoreTM)を使用して測定して、モノマーFcγRIIIAの場
合ならば少なくとも約150nM、ダイマーFcγRIIBの場合ならば少なくとも約60nMの親和定
数を持つ、特定のFcγRとの相互作用である。モノマーFcγRIIIAに対するFc領域の親和定
数は、150nM、200nMまたは300nMでよい。ダイマーFcγRIIBに対するFc領域の親和定数は
、60nM、80nM、90nM、または100nMでよい。本発明の方法で使用するためのダイマーFcγR
IIBは、当業者に知られた方法を使用して作製することができる。典型的には、FcγRIIB
の細胞外領域を、ダイマー化が可能な異種ポリペプチドに共有結合させて、生成する融合
タンパク質がダイマーとなるようにする。例えば、2003年1月13日付け出願の米国特許出
願 No.60/439,709(代理人整理番号 11183-005-888)を参照されたい。その全体を参照によ
り本明細書に組み入れる。特異的相互作用は一般的に、例えば以下のような生理学的条件
下で安定である：ヒトまたはその他の脊椎動物もしくは無脊椎動物などの生命体中に見出
される条件、ならびに細胞培養中に見出される条件、例えば哺乳動物細胞またはその他の
脊椎動物組織もしくは非脊椎動物組織からの細胞を維持および培養するために使用される
条件。
特定の実施形態では、変異型Fc領域と変更されたFcγR親和性を含む分子のスクリーニ
ングおよび同定として以下が含まれる：変異型Fc領域を含む分子の酵母表面での提示；な
らびに、Fc-FcγR相互作用の測定のための生化学的アッセイ、好ましくはELISAアッセイ
を使用する、変異型Fc領域を含む分子のFcγR(1個またはそれ以上)への結合の特定。少な
くとも1種の生化学的アッセイ、例えばELISAアッセイによって、変異型Fc領域を含む分子
を1種以上のFcγRとのその相互作用について特性決定し、1種以上のFcγRに対して変更さ
れた親和性を持つことを判定した後、当技術分野で既知の標準的組換えDNA技法を使用し
て、その分子を完全免疫グロブリン中に導入し、さらに生化学的に特性決定するため、こ
の変異型Fc領域を含む免疫グロブリンを哺乳動物細胞中で発現させる。本発明の変異型Fc
領域を導入する(例えば、免疫グロブリンのFc領域を置換する)ことができる免疫グロブリ
ンは、限定するわけではないが、以下を含むどんな免疫グロブリンでもよい：ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、ヒト化抗体、および
キメラ抗体。好ましい実施形態では、変異型Fc領域を、細胞表面受容体、腫瘍抗原、また
は癌抗原に対して特異的な免疫グロブリン中に導入する。本発明の変異型Fc領域をその中
に導入することができる免疫グロブリンは、癌または腫瘍抗原に特異的に結合することが
できるものであり、それらの抗原として、限定するわけではないが、例えば以下が含まれ
る：KS 1/4汎癌腫抗原(Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667；Bumal,
1988, Hybridoma 7 (4): 407-415)、卵巣癌抗原(CA125)(Yuら、1991, Cancer Res. 51 (2
): 468-475)、前立腺酸性ホスフェート(Tailorら、1990, Nucl. Acids Res. 18 (16): 49
28)、前立腺特異的抗原(Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160 (
2):903-910；Israeliら、1993, Cancer Res. 53: 227-230)、黒色腫関連抗原p97(Estinら
、1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6): 445-446)、黒色腫抗原gp75(Vijayasardahlら
、1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380)、高分子量黒色腫抗原(HMW-MAA)(Nataliら、1
987, Cancer 59: 55-63；Mittelmanら、1990, J. Clin. Invest. 86: 2136-2144)、前立
腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原(CEA)(Foonら、1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:
294)、多形性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結直腸腫瘍関連抗原（例えばCEA、TAG
-72(Yokataら、1992, Cancer Res. 52: 3402-3408)、C017-lA (Ragnhammarら、1993, Int
. J. Cancer 53: 751-758)；GICA 19-9(Herlynら、1982, J. Clin. Immunol. 2: 135)、C
TA-1およびLEA）、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19(Ghetieら、1994, Blood 83: 13
29-1336)、ヒトBリンパ腫抗原-CD20(Reffら、1994, Blood 83: 435-445)、CD33(Sgouros
ら、1993, J. Nucl. Med. 34: 422-430)、黒色腫特異的抗原（例えばガングリオシドGD2(
Salehら、1993, J. Immunol., 151, 3390-3398)、ガングリオシドGD3(Shitaraら、1993,
Cancer Immunol. Immunother. 36: 373-380)、ガングリオシドGM2(Livingstonら、1994,
J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044)、ガングリオシドGM3(Hoonら、1993, Cancer Res. 53:
5244-5250)）、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原(TSTA)、ウイルス誘発腫瘍抗原など（例え
ばDNA腫瘍ウイルスのT抗原およびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原）、腫瘍胎児抗原-
アルファフェトプロテイン（例えば結腸のCEA、膀胱腫瘍胎児抗原(Hellstromら、1985, C
ancer. Res. 45: 2210-2188)）、分化抗原（例えばヒト肺癌抗原 L6、L20(Hellstromら、
1986, Cancer Res. 46: 3917- 3923)）、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原-Gp37(Bh
attacharya-Chatterjeeら、1988, J of Immun. 141: 1398-1403)、新生糖タンパク質、ス
フィンゴリピド、乳癌抗原（例えばEGFR(上皮成長因子受容体)）、HER2抗原(pl85HER2)、
多形上皮ムチン(PEM)(Hilkensら、1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17: 359)、悪性ヒ
トリンパ球抗原-APO-1(Bernhardら、1989, Science 245: 301-304)、分化抗原(Feizi, 19
85, Nature 314: 53-57)（例えば胎児赤血球中のI抗原）、着床前胚、成体赤血球中の初
期内皮I抗原、胃腺癌中のI(Ma)、M18、乳房上皮中のM39、骨髄細胞中のSSEA-1、VEP8、VE
P9、Myl、VIM-D5、結直腸癌中のD156-22、TRA-1-85(血液型H)、結腸腺癌中のC14、肺腺癌
中のF3、胃癌中のAH6、胚性癌細胞中のYハプテン、LeY、TL5(血液型A)、A431細胞中のEGF
受容体、膵癌中のElシリーズ(血液型B)、胚性癌細胞中のFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中のC
O-514(血液型Lea)、腺癌中のNS-10、CO-43(血液型Leb)、A431細胞のEGF受容体中のG49、
結腸腺癌中のMH2(血液型ALeb/Ley)、結腸癌、胃癌ムチン中の19.9、骨髄細胞中のT5A7、
黒色腫中のR24、胚性癌細胞中の4.2、GD3、Dl.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびMl:22
:25:8、ならびに4〜8細胞期の胚中のSSEA-3およびSSEA-4。一実施形態では、抗原は皮膚T
細胞リンパ腫からのペプチドに由来するT細胞受容体である(Edelson, 1998, The Cancer
Journal 4: 62、参照)。
いくつかの実施形態では、本発明の変異型Fc領域を抗フルオレセインモノクローナル抗
体、4-4-20(Kranzら、1982 J. Biol. Chez. 257(12): 6987-6995；その全体を参照により
本明細書に組み入れる)中に導入する。別の実施形態では、本発明の変異型Fc領域をマウ
ス-ヒトキメラ抗CD20モノクローナル抗体2H7中に導入する。これはB細胞上のCD20細胞表
面リンタンパク質を認識する(Liuら、1987, Journal of Immunology, 139: 3521-6；その
全体を参照により本明細書に組み入れる)。さらに別の実施形態では、本発明の変異型Fc
領域をヒト表皮成長因子受容体2(pi 85 HER2)に対するヒト化抗体(Ab4D5)中に導入する。
これについては、Carterらの記載がある(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-9
；その全体を参照により本明細書に組み入れる)。さらに別の実施形態では、本発明の変
異型Fc領域をヒト化抗TAG72抗体(CC49)中に導入する(Shaら、1994 Cancer Biother. 9(4)
: 341-9)。別の実施形態では、本発明の変異型Fc領域をリチュキサン(Rituxan)（リンパ
腫の治療に使用される）中に導入する。
別の特定の実施形態では、限定するわけではないが、本発明は以下に開示されたいず
れかの抗体を含む抗FcγRIIB抗体を、少なくとも1個のアミノ酸残基の修飾(例えば、置換
、挿入、欠損)によって、操作することを包含する：米国仮出願No.60/403,266(2002年8月
12日出願)、および米国出願(2003年8月14日出願、代理人整理番号 011183-010-999)。こ
の修飾は、そのFc領域のFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を増大させるも
のとする。本発明の方法に従って操作することができる抗FcγRIIB抗体の例は、2B6モノ
クローナル抗体(ATCC受託番号 PTA-4591)および3H7(ATCC受託番号 PTA-4592)である。別
の特定の実施形態では、抗FcγRIIB抗体の修飾によって、さらにそのFc領域のFcγRIIBに
対する親和性を減少させる。また別の特定の実施形態では、操作された抗FcγRIIB抗体は
、当技術分野で既知であるか、本明細書中に開示および例示された標準的アッセイによっ
て判定したときに、増大したエフェクター機能をさらに有する。いくつかの実施形態では
、本発明の変異型Fc領域を、限定するわけではないが以下を含む、癌抗原または細胞表面
受容体に特異的な治療用モノクローナル抗体中に導入する：ErbituxTM(IMC-C225としても
知られている)(ImClone Systems Inc.)(EGFRに対するキメラ化モノクローナル抗体)；HER
CEPTIN(登録商標)(Trastuzumab)(Genentech, CA)(転移性乳癌の患者の治療用のヒト化抗H
ER2モノクローナル抗体)；REOPRO(登録商標)(アブシキシマブ)(Centocor)(血餅形成抑制
用の血小板上の抗糖タンパク質IIb/IIIa受容体)；ZENAPAX(登録商標)(ダクリズマブ)(Roc
he Pharmaceuticals, Switzerland)(急性腎同種移植片拒絶抑制用の免疫抑制性のヒト化
抗CD25モノクローナル抗体)。その他の例は、以下のものである：ヒト化抗CD18F(ab')2(G
enentech)；CDP860(ヒト化抗CD18F(ab')2)(Celltech, UK)；PR0542(CD4と融合した抗HIVg
pl20抗体)(Progenics/Genzyme Transgenics)；C14(抗CD14抗体)(ICOS Pharm)；ヒト化抗V
EGFIgGl抗体(Genentech)；OVAREXTM(マウス抗CA125抗体)(Altarex)；PANOREXTM(マウス抗
17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体)(Glaxo Wellcome/Centocor)；IMC-C225(キメラ抗EGFRIgG抗
体)(ImClone System)；VITAXINTM(ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体)(Applied Molecular
Evolution/MedImmune)；Campath1H/LDP-03(ヒト化抗CD52IgGl抗体)(Leukosite)；SmartM
195(ヒト化抗CD33IgG抗体)(Protein Design Lab/Kanebo)；RITUXANTM(キメラ抗CD20IgGl
抗体)(IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDETM(ヒト化抗CD22IgG抗体)(I
mmunomedics)；SmartID 10(ヒト化抗HLA抗体)(Protein Design Lab)；ONCOLYMTM(Lym-1)(
放射性標識マウス抗HLADR抗体)(Techniclone)；抗CD1 la(ヒト化IgGl抗体)(Genetech/Xom
a)；ICM3(ヒト化抗ICAM3抗体)(ICOS Pharm)；IDEC-114(霊長類化抗CD80抗体)(IDEC Pharm
/Mitsubishi)；ZEVALINTM(放射性標識マウス抗CD20抗体)(IDEC/Schering AG)；IDEC-131(
ヒト化抗CD40L抗体)(IDEC/Eisai)；IDEC-151(霊長類化抗CD4抗体)(IDEC)；IDEC-152(霊長
類化抗CD23抗体)(IDEC/Seikagaku)；SMART 抗CD3(ヒト化抗CD3IgG)(Protein Design Lab)
；5Gl.l(ヒト化抗補体因子5(C5)抗体)(Alexion Pharm)；IDEC-151(霊長類化抗CD4IgGl抗
体)(IDECPharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4(ヒト抗CD4IgG抗体)(Medarex/Eisai/Genma
b)；CDP571(ヒト化抗TNF-αIgG4抗体)(Celltech)；LDP-02(ヒト化抗α4β7抗体)(LeukoSi
te/Genentech)；OrthoClone OKT4A(ヒト化抗CD4IgG抗体)(Ortho Biotech)；ANTOVATM(ヒ
ト化抗CD40LIgG抗体)(Biogen)；ANTEGRENTM(ヒト化抗VLA-4IgG抗体)(Elan)；MDX-33(ヒト
抗CD64(FcγR)抗体)(Medarex/Centeon)；rhuMab-E25(ヒト化抗IgEIgGl抗体)(Genentech/N
orvartis/Tanox Biosystems)；IDEC-152(霊長類化抗CD23抗体)(IDEC Pharm)；ABX-CBL(マ
ウス抗CD-147 IgM抗体)(Abgenix)；BTI-322(ラット抗CD2 IgG抗体)(Medimmune/Bio Trans
plant)；OrthoClone/OKT3(マウス抗CD3 IgG2a抗体)(ortho Biotech)；SIMULECTTM(キメラ
抗CD25IgGl抗体)(Novartis Pharm)；LDP-01(ヒト化抗β2-インテグリンIgG抗体)(LeukoSi
te)；抗LFA-1(マウス抗CD18 F(ab')2)(Pasteur-Merieux/Immunotech)；CAT-152(ヒト抗TG
F-β2抗体)(Cambridge Ab Tech)；およびCorsevin M(キメラ抗因子VII抗体)(Centocor)。
本発明の変異型Fc領域は、好ましくは免疫グロブリンと関係するが、これを1種以上
の生化学的アッセイおよび/または1種以上の機能的アッセイで、好ましくはハイスループ
ット法で、さらに特性決定する。別の実施形態では、本発明の変異型Fc領域を免疫グロブ
リン中に導入しないで、これを1種以上の生化学的アッセイおよび/または1種以上の機能
的アッセイで、好ましくはハイスループット法において、さらに特性決定する。この1種
以上の生化学的アッセイは、Fc-FcγR相互作用を同定するための、当技術分野で既知のい
ずれのアッセイでもよく、限定するわけではないが、以下が含まれる：ELISAアッセイ、
ならびにFc-FcγR相互作用の速度論的パラメーターを判定するための表面プラズモン共鳴
アッセイ、例えばBIAcoreアッセイ。この1種以上の機能的アッセイは、当業者に知られて
いるか、または本明細書に記載した1種以上のFcγRが介在するエフェクター細胞機能を特
性決定するための、当技術分野で既知のいずれのアッセイでもよい。特定の実施形態では
、変異型Fc領域を含む免疫グロブリンを、1種以上のFcγR、例えばFcγRIIIA、FcγRIIA
、FcγRIIAとの結合についてELISAアッセイで、その後1種以上のADCCアッセイでアッセイ
する。いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含む免疫グロブリンを、表面プラズモン
共鳴アッセイ、例えばBIAcoreをさらに使用して、アッセイする。表面プラズモン共鳴ア
ッセイは当技術分野で周知であり、セクション5.2.7でさらに考察し、本明細書中、実施
例6.8で例示することとする。
変異型Fc領域を含む免疫グロブリンを特性決定するための代表的なハイスループットア
ッセイには、以下が含まれる：例えば、標準的組換えDNA技法によって、4-4-20抗体中に
本発明の変異型Fc領域を導入し；変異型Fc領域を含む4-4-20抗体の、FcγR(例えば、Fcγ
RIIIA、FcγRIIB)への特異的結合をELISAアッセイによって特性決定し；変異型Fc領域を
含む4-4-20抗体を(本明細書に開示する方法を使用して)ADCCアッセイで特性決定し、この
際、標的細胞は変異型Fc領域を含む4-4-20抗体でオプソニン化され；その後変異型Fc領域
を第2免疫グロブリン、例えば4D5、2H7中にクローニングし、この第2免疫グロブリンをAD
CCアッセイで特性決定し、この際、標的細胞は変異型Fc領域を含む第2抗体でオプソニン
化される。次に、この変異型Fc領域を含む第2抗体を、ELISAアッセイを使用して分析して
、FcγRへの特異的結合を確認する。
好ましくは、本発明の変異型Fc領域は、ELISAアッセイで判定して、野生型Fc領域より
も高親和性で、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに結合する。最も好ましくは、本発明の
変異型Fc領域は、ELISAアッセイで判定して、野生型Fc領域よりも高親和性で、FcγRIIIA
および/またはFcγRIIAに、そしてより低親和性でFcγRIIBに結合する。いくつかの実施
形態では、変異型Fc領域は、ELISAアッセイで判定して、野生型Fc領域よりも少なくとも2
倍、少なくとも4倍、さらに好ましくは6倍、最も好ましくは8〜10倍高い親和性で、FcγR
IIIAおよび/またはFcγRIIAに、そして野生型Fc領域よりも少なくとも2倍、少なくとも4
倍、さらに好ましくは6倍、最も好ましくは8〜10倍低い親和性でFcγRIIBに結合する。
変異型Fc領域を含む免疫グロブリンは、本明細書に開示した方法と当業者に既知の方法
を使用して、Fc-FcγR相互作用の速度論的パラメーターを確定するため、どの時点でも、
表面プラズモン共鳴アッセイ、例えばBIAcoreを使用して、分析することができる。好ま
しくは、本発明の変異型Fc領域のモノマーFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAへの結合につ
いてのKdは、BIAcore分析によって判定したときに、約100nM、好ましくは約70nM、最も好
ましくは約40nMであり、本発明の変異型Fc領域のダイマーFcγRIIBへの結合についてのKd
は、約80nM、約100nM、より好ましくは約200nMである。
最も好ましい実施形態では、変異型Fc領域を含む免疫グロブリンを、FcγRとの相互作
用について、動物モデル中でさらに特性決定する。本発明の方法での使用に好ましい動物
モデルは、例えば、ヒトFcγRを発現するトランスジェニックマウス、例えば、米国特許
第5,877,397号(その全体を参照により本明細書に組み入れる)に記載されている、いずれ
かのマウスモデルである。本発明の方法で使用するためのトランスジェニックマウスとし
て、限定するわけではないが、以下が含まれる：ヒトFcγRIIIAを保有するヌードノック
アウトFcγRIIIAマウス；ヒトFcγRIIAを保有するヌードノックアウトFcγRIIIAマウス；
ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγRIIIAを保有するヌードノックアウトFcγRIIIAマウス；ヒト
FcγRIIBおよびヒトFcγRIIAを保有するヌードノックアウトFcγRIIIAマウス。
5.2.1 FcγR-Fc結合アッセイ
変異型Fc領域を含む本発明の分子のFcγRへの結合を判定するため、FcγR-Fc結合アッ
セイを開発して、この受容体のリガンドに対する親和性が本来弱く、例えば、FcγRIIBお
よびFcγRIIIAについてμM程度であっても、相互作用の検出および定量を行うことを可能
にした。その方法には、複合体化しないFcγRに比較して、Fc領域に対する結合活性が向
上したFcγR複合体の形成が含まれる。本発明によれば、好ましい分子複合体は、以下を
含むテトラマー免疫複合体である：(a)FcγRの可溶性領域(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIA
またはFcγRIIBの可溶性領域)；(b)FcγRの可溶性領域(例えば、FcγRIIIA、FcγRIIAま
たはFcγRIIBの可溶性領域)のC末端に機能し得るように連結されたビオチン化15アミノ酸
AVITAG配列(AVITAG)；および(c)ストレプトアビジン-フィコエリトリン(SA-PE)；テトラ
マーFcγR複合体を形成するモル比(好ましくは5：1のモル比)とする。本発明の好ましい
実施形態によれば、融合タンパク質を酵素的に、例えばE.coli Bir A酵素（15アミノ酸AV
ITAG配列中のリシン残基を特異的にビオチン化するビオチンリガーゼの1つ）を使用して
ビオチン化する。本発明の特定の実施形態では、当業者に知られた標準的な方法、限定す
るわけではないがストレプトアビジンシフトアッセイなどで判定して、融合タンパク質の
85%をビオチン化する。本発明の好ましい実施形態によると、ビオチン化した可溶性FcγR
タンパク質を、1X SA-PE：5Xビオチン化可溶性FcγRのモル比でSA-PEと混合して、テトラ
マーFcγR複合体を形成させる。
本発明の好ましい実施形態では、Fc領域を含むポリペプチドは、本発明の方法に従って
形成させたテトラマーFcγR複合体と、モノマー性非複合体化FcγRよりも少なくとも8倍
高い親和性で結合する。Fc領域を含むポリペプチドのテトラマーFcγR複合体への結合は
、例えば以下のような当業者に知られた標準的技術を用いて判定することができる：蛍光
活性化細胞選別(FACS)、放射性イムノアッセイ、ELISAアッセイ、その他。
本発明は、細胞に基づく、または無細胞アッセイでFc領域を含む分子の機能性を判定す
るための、上記の方法に従って形成させた、免疫複合体の使用を包含する。
便宜上、変異型Fc領域を含む分子がFcγRテトラマー複合体に結合する能力をアッセイ
するために、試薬をアッセイキット、すなわち、一括して配合された試薬として供給する
ことができる。Fc-FcγR相互作用の判定での使用のため、その他の形態の分子複合体も本
発明の方法で使用することを想定している。例えば、米国仮出願 60/439,709(2003年1月1
3日出願)(代理人整理番号 11183-005-888)(その全体を参照により本明細書に組み入れる)
の記載に従って形成させた融合タンパク質である。
5.2.2 突然変異誘発および酵母ディスプレイライブラリーの構築
変異型Fc領域を含む分子の最初のライブラリーは、当技術分野で既知の、任意のランダ
ム突然変異誘発技術を使用して、製造する。当業者には、Fc領域のアミノ酸配列変異型が
当業者に既知のどの突然変異誘発技術を使用しても取得することができることが理解され
るはずである。これらの技術のいくつかを簡単に本明細書に記載したが、別の操作法でも
同等の結果が得られることが認識されるであろう。好ましい実施形態では、変異型Fc領域
を含む本発明の分子を、下記実施例6に例示するエラープローン（error-prone）PCRによ
って、調製する(Leungら、1989, Technique, 1：11、参照)。本発明の方法での使用につ
いては、2〜3 bp/Kbのエラー率を持つものが特に好ましい。一実施形態では、エラープロ
ーンPCRを使用して、2〜3突然変異/kbの突然変異頻度が得られる。
突然変異誘発は、限定するわけではないが、以下を含む当技術分野で既知のいずれの技
術によっても実施することができる：修飾すべきFc領域(例えば、CH2もしくはCH3ドメイ
ン)を含んでなる抗体またはポリペプチドのFc領域の配列内で、1種以上の修飾を持つオリ
ゴヌクレオチドの合成。部位特異的突然変異誘発では、所望の突然変異を持つDNA配列と
ともに、十分な数の隣接ヌクレオチド（掛け渡される欠損部の両側に安定な二重鎖を形成
するのに十分なサイズおよび配列複雑性を有するプライマー配列を提供する）をコードす
る特定のオリゴヌクレオチド配列の使用によって、突然変異体の製造が可能になる。典型
的には、長さが約30〜約45ヌクレオチドまたはそれ以上で、変更された配列の連結部の両
側に約10〜約25またはそれ以上の残基を持つプライマーが好ましい。1以上の位置で別種
の多様な突然変異を導入する多数のこうしたプライマーを使用して、突然変異体のライブ
ラリーを作製することができる。
部位特異的突然変異誘発の技術は、各種刊行物に例示されているように、当技術分野で
周知である(例えば、Kunkelら、Methods Enzymol., 154: 367-82, 1987(その全体を参照
により本明細書に組み入れる)、参照)。一般的には、部位特異的突然変異誘発は、最初に
所望のペプチドをコードするDNA配列をその配列内に含んでいる一本鎖ベクターを取得す
るか、二本鎖ベクターの2つの鎖を分離させることによって実施する。所望の突然変異配
列を保有しているオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的には合成によって調製する。
このプライマーを次に一本鎖ベクターとともにアニールし、突然変異保有鎖の合成を完遂
させるため、DNAポリマー化酵素、T7 DNAポリメラーゼなどで処理する。こうして、一方
の鎖が当初の非突然変異配列をコードし、第2鎖が所望の突然変異を保有しているヘテロ
二本鎖が形成される。次にヘテロ二本鎖ベクターを使用してE. coli細胞などの適切な細
胞を形質転換するか、これにトランスフェクトし、突然変異した配列配置を保有する組換
えベクターを含んでいるクローンを選択する。理解されるように、この技術では、典型的
には一本鎖および二本鎖の両方の形態で存在するファージベクターを利用する。部位特異
的突然変異誘発に有用な典型的なベクターとして、M13ファージなどのベクターが含まれ
る。これらのファージは容易に市販品として入手でき、その使用は一般的に当業者に周知
である。二本鎖プラスミドも部位特異的突然変異誘発で常套的に使用され、これによりプ
ラスミドからファージへの目的の遺伝子の移動段階が省略できる。
別法として、Taq DNAポリメラーゼなどの市販の熱安定性酵素でのPCRTMを使用して、突
然変異性オリゴヌクレオチドプライマーを増幅したDNA断片中に組み入れて、次にこれを
適切なクローニングまたは発現ベクター中にクローニングすることができる。例えば、PC
RTM利用突然変異誘発操作法について、Tomicら、Nucleic Acids Res., 18 (6): 1656,198
7、およびUpenderら、Biotechniques, 18(1) : 29-30,32, 1995(その全体を参照により本
明細書に組み入れる)を参照されたい。熱安定性ポリメラーゼに加えて熱安定性リガーゼ
を使用するPCRTMも使用して、リン酸化した突然変異性オリゴヌクレオチドを増幅したDNA
断片中に組み入れることができ、次にこれを適切なクローニングまたは発現ベクター中に
クローン化することができる(例えば、Michael, Biotechniques, 16 (3): 410-2,1994(そ
の全体を参照により本明細書に組み入れる)参照)。
本発明で使用する変異型を調製するための別の方法は、Wellsら(1985, Gene, 34: 315)
が記載している技術に基づくカセット突然変異誘発である。その出発物質は、突然変異さ
せるタンパク質をコードする所望のDNA(例えば、Fc領域を含むポリペプチドをコードする
DNA)を含むプラスミドである。突然変異させるDNA配列中のコドン(群)が同定される；同
定された突然変異部位(群)のそれぞれの端部には固有の制限エンドヌクレアーゼ部位が必
要である。こうした制限部位が存在しない場合は、これをオリゴヌクレオチド特異的突然
変異誘発によって作製することができる。制限部位をプラスミド中に導入した後、プラス
ミドをこれらの部位で切断し、線状化する。当業者に知られた標準的操作法を使用して、
制限部位の間のDNAの配列をコードするが突然変異を含有する二本鎖オリゴヌクレオチド
を合成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。このカセットは、プラ
スミドに直接連結できるように、線状化プラスミドの末端と適合する3'および5'末端を持
つように設計される。
Fc領域を含む抗体またはポリペプチドのFc領域の配列変異体を製造するため、当業者に
知られたその他の方法を使用することができる。例えば、その抗体または断片の不変ドメ
インのアミノ酸配列をコードする組換えベクターを突然変異誘発因子（ヒドロキシルアミ
ンなど）で処理して、配列変異体を取得することができる。
記載した方法に従って突然変異体ライブラリーを製造した後、この突然変異させたライ
ブラリーを、当業者に知られた標準的酢酸リチウム形質転換プロトコルを使用して、酵母
菌株、好ましくはEBY100(Invitrogen)、MATa ura3-52 trpl leu2Δl his3Δ200pep4::HIS
3 prblΔl.6R canl GAL::GAL-AGAI中に形質転換する(参照あり)。
当業者であれば、所望の結合特性を持つ本発明の分子(例えば、少なくとも1個のアミノ
酸修飾がある変異型Fc領域を持つ分子であって、その修飾によって、野生型Fc領域を含む
対照分子に比較して、変異型Fc領域のFcγRIIIに対する親和性が強化されたもの)を本発
明の方法に従って同定した(セクション5.1および表2参照)後、標準的組換えDNA技術およ
びこのセクションに記載したいずれかの既知の突然変異誘発技術を使用して、別の分子(
すなわち、治療用抗体)を操作して、同定された突然変異部位を保有する操作された分子
を製造することができることを、理解できるであろう。
5.2.3 酵母表面ディスプレイ
変更されたFcγR親和性(すなわち、強化されたFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIA親和性
)を持つ変異型Fc領域を含む分子のスクリーニングおよび同定のための好ましい方法は、
酵母表面ディスプレイ法(総説として、Boder and Wittrup, 2000, Methods in Enzymolog
y, 328: 430-444を参照、その全体を参照により本明細書に組み入れる)である。これは、
細胞外翻訳後修飾タンパク質の結合相互作用のスクリーニングのための先行技術の欠陥に
取り組むものである。具体的には、酵母表面ディスプレイとは、Fc突然変異型を含むポリ
ペプチドを、FcγRとの相互作用が可能になる形態で、酵母細胞壁上に発現させるための
遺伝学的方法である。本発明の突然変異型Fc含有ポリペプチドの酵母表面ディスプレイは
、当業者に知られたいずれの技術によっても実施することができる。米国特許第6,423, 5
38；6,114, 147；および6,300, 065号(これらの全体を参照により本明細書中に組み入れ
る)を参照されたい。以下を参照のこと：Boderら、1997 Nat. Biotechnol., 15: 553-7；
Boderら、1998 Biotechnol. Prog., 14: 55-62；Boderら、2000 Methods Enzymol., 328:
430-44；Boderら、2000 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97: 10701-5；Shusta
ら、1998 Nat. Biotechnol., 1998, 16 : 773-7；Shustaら、1999 J. Mol. Biol., 292:
949-56；Shustaら、1999 Curr. Opin. Biotechnol., 10: 117-22；Shustaら、2000 Nat.
Biotechnol., 18: 754-9；Wittrupら、1994 Ann. N. Y. Acad. Sci., 745: 321-30；Witt
rupら、1994 Cytometry, 16: 206-13；Wittrup, 1995 Curr. Opin. Biotechnol., 6: 203
-8；Wittrup, 1999 Trends Biotechnol., 17: 423-4；Wittrup, 2000 Nat. Biotechnol.,
18: 1039-40；Wittrup, 2001 Curr. Opin. Biotechnol., 12: 395-9。
本発明は、セクション5.2.2に記載したようにして突然変異させた、Fc領域を含む分子
を提示するために、酵母中にFc突然変異体ライブラリーを構築する方法を提供する。好ま
しくは、本発明の方法で使用するためのFc突然変異体ライブラリーは、少なくとも107細
胞から、109細胞までを含有する。本発明の方法で使用するFcライブラリーを構築するた
めの代表的な1つの方法は、以下を含む：Fc領域を含む分子をコードする核酸を、酵母複
製ベクターに由来するベクター（例えば、pCT302）中のマルチクローニングサイトにクロ
ーニングし；Fcをコードする核酸が、GAL1ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に、
かつAga2p（交雑させるアグルチニン細胞壁タンパク質）をコードするヌクレオチド配列
とインフレームで発現できるようにする。好ましい実施形態では、Fc領域を含む分子をコ
ードする核酸をAga2pコード領域のC末端にクローニングし、その結果、Fc領域-Aga2p融合
タンパク質がコードされるようなる。本発明の好ましい構築物を使用して、Aga2pタンパ
ク質およびFc領域を含むポリペプチドを含む融合タンパク質は細胞外に分泌され、固有細
胞壁タンパク質であるAga1pタンパク質へのジスルフィド結合によって、細胞壁上に提示
されるようにする。別の実施形態では、構築物はさらに、エピトープタグをコードするヌ
クレオチド配列を含む。本発明に従って、当業者に知られたどのエピトープタグヌクレオ
チドコード配列を使用してもよく、限定するわけではないが以下をコードするヌクレオチ
ド配列が含まれる：ヘマグルチニン(HA)、c-myc Xpress TAG、His-TAG、またはV5TAG。酵
母細胞表面上の融合タンパク質の存在は、FACS分析、共焦点蛍光顕微鏡法または標準的免
疫染色方法を使用して検出することができる。これらのすべてが当業者に知られている。
一実施形態では、酵母細胞表面上の本発明のFc融合タンパク質の存在を、以下を使用して
検出することができる：Fc-特異的モノクローナル抗体(CH3特異的)、例えば、限定するわ
けではないがIgGl Fc-特異的モノクローナル抗体、HP6017(Sigma)、JL512(Immunotech)、
およびPartridgeら、1986, Molecular Immunology, 23(12): 1365-72(その全体を参照に
より本明細書に組み入れる)に開示されたいずれかの抗体。別の実施形態では、本発明のF
c融合タンパク質の存在を、当業者に知られた技術を使用して、エピトープタグの免疫蛍
光標識によって検出する。内部対照として、Fc融合タンパク質をコードする核酸に隣接さ
せたエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を使用して、融合タンパク質が一部タ
ンパク質分解された形態で細胞壁上に提示されていないかどうかを検出することは、特に
有用な本発明の方法である。
5.2.4 酵母ディスプレイライブラリーのスクリーニング
本発明は、限定するわけではないが、細胞に基づくアッセイ、溶液アッセイ、および固
相アッセイを含む免疫学的アッセイを使用する、酵母ディスプレイライブラリーのスクリ
ーニングを包含する。
いくつかの実施形態では、本発明は、当業者に既知で、かつ本明細書に包含される親和
性成熟（affinity maturation）法を用いた、改変されたFcγR親和性を持つFc突然変異体
の同定を包含する。概説すると、親和性成熟とは、突然変異体ライブラリー中に存在する
個々の突然変異をランダムに組み合わせることによって、新規な対立遺伝子を創生するこ
とである。例えば以下を参照されたい：Hawkinsら、1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896
；Stemmerら、1994 Nature, 370: 389-91(この両著の全体を参照により本明細書に組み入
れる)。これを使用して、抗体、T細胞受容体およびその他のタンパク質の親和性を増加さ
せるのに成功している。本発明は、強化された表現型を持つ新しい突然変異体ライブラリ
ーを構築するための基礎として、増強されたFcγR結合性を示す突然変異誘発の使用を包
含する。本発明の方法を使用して、FcγR、例えばFcγRIIIAに対する結合性の増強につい
て、酵母表面ディスプレイによって富化されたIgGl Fc突然変異体の1集団を選択すること
ができる。DNA調製の後、当業者に知られ、かつ本明細書中で例示もしくは開示された方
法を使用して、約700 bpまでの、Fcの突然変異させる領域を選択的に増幅する、隣接プラ
イマーを使用するPCRによって、Fc領域を増幅することができる。こうして、例えば以下
に開示された方法などを使用する、増幅したDNAのDNAseI処理および断片の単離による、F
c領域の突然変異の再シャッフルによって、新規な突然変異体を構築することができる：S
temmerら、1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51(その全体を参照により本明
細書に組み入れる)。次に当業者に知られた方法を使用して、断片を再連結し、入れ子式
（nested）プライマーとともにPCR増幅し、酵母提示ベクター、例えばpYDl中にクローニ
ングする。次に、組み換えられたライブラリーを酵母Fcディスプレイスクリーニングで再
選択することができる。以下に開示されたものなどの当技術分野で知られた方法を使用し
て、KDが10nMに低下するまで、Fc受容体からのFcγRIIIAリガンドの解離速度の低下に基
づいた親和性をさらに増加させるための条件を樹立することができる：Boderら、1998, B
iotechnol. Prog 14: 55-62(その全体を参照により本明細書に組み入れる)。本発明は、
酵母ライブラリーの速度論的スクリーニングを包含する。速度論的スクリーニングは、Fc
提示細胞を標識したリガンド、例えば蛍光リガンドで飽和まで標識した後、既定の時間、
過剰の非標識リガンドとともにインキュベートすることによって、確立することができる
。過剰のバッファー(例えば、1X PBS, 0.5 mg/ml BSA)の添加によって、反応を停止させ
た後、細胞をFACSおよび選択用の選別ゲートセットによって分析する。各富化ラウンド後
、個別の突然変異体を親和性の増加倍数について試験し、分散について順位化する。この
in vitro組換え工程を反復してもよい。いくつかの実施形態では、in vitroで少なくとも
3回反復する。
本発明のFc変異型の選択は、限定するわけではないが、FcγRの遺伝子多型変異型を含
むあらゆるFcγRを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、158位にフ
ェニルアラニンを含有するFcγRIIIAの多形変異型を使用して、Fc変異型の選択を実施す
る。別の実施形態では、158位にバリンを含有するFcγRIIIAの多型変異型を使用して、Fc
変異型の選択を実施する。FcγRIIIA 158Vは、158FよりもIgGlに対して高い親和性および
増加したADCC活性を示す(例えば、Koeneら、1997, Blood, 90: 1109-14；Wuら、1997, J.
Clin. Invest. 100:1059-70(この両著の全体を参照により本明細書に組み入れる)参照)
。この残基は、IgGl-FcγRIIIA共結晶化研究によって最近示されたように、IgGlのヒンジ
領域下流側と事実上直接相互作用する。例えば、Sondermanら、2000, Nature, 100: 1059
-70(その全体を参照により本明細書に組み入れる)を参照されたい。研究によれば、いく
つかの症例中、治療用抗体がFcγRIIIA-158Vホモ接合患者で向上した効力を有している。
例えば、ヒト化抗CD20モノクローナル抗体Rituximabが、FcγRIIIA 158Fホモ接合患者に
比較して、FcγRIIIA158Vホモ接合患者で治療上より効果的であった(例えば、Cartronら
、2002 Blood, 99(3): 754-8、参照)。特定の作用機構に束縛される意図はないが、FcγR
IIIA 158Fアロタイプを用いた本発明のFc変異型の選択が、治療用抗体中に組み込まれた
ときに、FcγRIIIA 158Fホモ接合患者に対して臨床上より有効に働く変異型を提供する可
能性がある。
本発明は、FcγRIIIAに対する親和性が増大しているだけでなく、FcγRIIBに対する親
和性が低下したFc突然変異体を選択するための、FcγRIIB減損（depletion）およびFcγR
IIIA選択に基づく酵母ライブラリーのスクリーニングを包含する。酵母ライブラリーを、
順次減損法、例えば、酵母ライブラリーをFcγRIIBでコーティングした磁気ビーズととも
にインキュベートすることによって、FcγRIIBに対する親和性が低下したクローンについ
て富化することができる。FcγRIIB減損は、好ましくはFcγRIIBに対する親和性が低下し
たクローンについてライブラリーが富化されるように、順次実施する。いくつかの実施形
態では、FcγRIIB減損ステップの結果、細胞の1集団で、30%、好ましくは10%、より好ま
しくは5%、最も好ましくは1%未満のみがFcγRIIBと結合するようにする。いくつかの実施
形態では、FcγRIIB減損は少なくとも3サイクル、少なくとも4サイクル、少なくとも6サ
イクル実施する。FcγRIIB減損ステップは好ましくは、例えばFcγRIIIAに対して増大し
た親和性を持つFc変異型を選択するための、FACS選別を用いたFcγRIIIA選択ステップと
組み合わせる。
5.2.4.1 FACSアッセイ；固相アッセイおよび免疫学的アッセイ
本発明は、セクション5.2.3に記載した方法に従って、酵母表面細胞壁上に提示された
突然変異Fc融合タンパク質の特性決定を包含する。本発明の一態様は、所望の結合特性を
持つ突然変異Fc融合タンパク質、具体的には、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチド
がFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合するよりも大きい親和性で、FcγRIIIAおよび/
またはFcγRIIAと結合する突然変異Fc融合タンパク質の能力について選択するための方法
を提供する。別の実施形態では、本発明は、所望の結合特性を持つ突然変異Fc融合タンパ
ク質、具体的には、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドがFcγRIIIAおよび/または
FcγRIIAと結合するよりも大きい親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合し、さ
らに野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドがFcγRIIBと結合するよりも小さい親和性
でFcγRIIBと結合する突然変異Fc融合タンパク質、の能力について選択するための方法を
提供する。本発明の方法を使用して、いずれの分子のFc領域中の突然変異についても、ど
のような所望の結合特性でも同定およびスクリーニングすることができることが、当業者
には理解されるであろう。
突然変異Fc融合タンパク質を提示する酵母細胞は、結合相互作用を評価するため、当業
者に知られたいずれの生化学的アッセイまたは免疫学的アッセイによっても、スクリーニ
ングおよび特性決定することができる。
好ましくは、酵母細胞表面に提示された突然変異Fc融合タンパク質を、FcγRIIIA、好
ましくはFcγRIIIAテトラマー複合体、または場合によってはFcγRIIBとの結合について
スクリーニングするため、当業者に知られた技術のいずれかを使用する蛍光活性化細胞選
別(FACS)を使用する。フローソーター(flow sorters)は、ライブラリーインサートを含有
する多数の細胞を迅速に試験することができる(例えば、10-100 x 106細胞/時間)(Shapir
oら、Practical Flow Cytometry, 1995)。その上、特異的結合特性、例えば、野生型Fc領
域を含む対応するポリペプチドに比較してFcγRIIIAに対して高い親和性を持つFc融合タ
ンパク質を提示する細胞を選択するため、限定するわけではないが、リガンド濃度(すな
わち、FcγRIIIAテトラマー複合体)、速度論的競合時間、またはFACSストリンジェンシー
を含む、最適化のために使用する特定のパラメーターを変更することができる。生物細胞
を選別および試験するためのフローサイトメーターは当技術分野で周知である。既知のフ
ローサイトメーターは例えば以下に記載されている：米国特許第4,347,935；5,464,581；
5,483,469；5,602,039；5,643,796；および6,211,477号(これらの全内容を参照により本
明細書中に組み入れる)。その他の既知のフローサイトメーターはBecton Dickinson and
Company製のFACS Vantageシステム、およびUnion Biometrica製のCOPASTMシステムである
。
本発明の好ましい実施形態によれば、酵母細胞を蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分
析する。最も好ましい実施形態では、酵母細胞のFACS分析を反復形式で、少なくとも2回
、少なくとも3回、または少なくとも5回、実施する。選択の各ラウンドの間に、細胞を再
増殖させ、最大数の酵母細胞表面上にFc領域が提示されるように誘導する。特定の作用様
式に拘泥する意図はないが、反復工程は、特定の表現型、例えばFcγRIIIAに対して高結
合性を持つ細胞の集団を富化する助けとなる。
好ましい実施形態では、本発明のFc変異型のスクリーニングは、複数ラウンドのスクリ
ーニング、例えば少なくとも2ラウンドのスクリーニングによる選択工程を含む。一実施
形態では、FcγRIIIAに対して増大した親和性を持つFc変異型のスクリーニングは以下の
ステップを含む：スクリーニングの第1ラウンド中、酵母細胞のライブラリー（例えば107
細胞の天然ライブラリー）を、例えば標識したテトラマーFcγRIIIAを使用して、FACSに
よって、好ましくは反復形式で富化し、FcγRIIIAに対して増大した親和性を持つFc変異
型について選択する；所望の表現型（例えばFcγRIIIAに対して増大した結合性について
選択された変異型Fc領域）を、次に抗体（例えば4-4-20抗体）中に導入し、この操作され
た抗体を、第2次スクリーニング、例えば、FcγRへの結合についてのELISAを用いてアッ
セイする。スクリーニングの第2ラウンドにおいては、第1次スクリーニングに基づいて単
一の突然変異ライブラリーを創生し、その結果Fc領域がFcγRIIIAに対して増大した親和
性を示す変異型を保有するようになる；そして例えば、標識したモノマーFcγRIIIAを標
識しない受容体の存在または不在中の両方で使用するFACSによって、富化する；そして次
に変異型Fc領域を、抗体、例えば4-4-20抗体中に導入し、この操作された抗体を、第2次
スクリーニング、例えば、FcγRへの結合についてのELISAを使用して、アッセイする。い
くつかの実施形態では、第2次スクリーニングはさらに、本明細書に開示した方法を使用
するADCCまたはBIAcoreを基礎とするアッセイでの、Fc変異型を含む抗体の特性決定を含
む。
本発明は、平衡状態または速度論的条件下での突然変異酵母ライブラリーのFACSスクリ
ーニングを包含する。スクリーニングを平衡条件下で実施する場合、過剰のFc突然変異体
保有酵母ライブラリーを、Kdよりも5〜10倍低い濃度のFcγRIIIA、好ましくは標識したFc
γRIIIAとともに、少なくとも1時間インキュベートして、平衡条件下でのFc突然変異体の
FcγRIIIAへの結合を可能にする。スクリーニングを速度論的条件下で実施する場合、突
然変異酵母ライブラリーを標識したFcγRIIIAとともにインキュベートし；次にこの細胞
を等モル量の非標識FcγRIIIAとともに既定時間インキュベートし、次に結合したFcγRII
IAをモニターする。
突然変異Fc融合タンパク質を発現する酵母細胞をFACSによって分析するための代表的な
1つの方法は、PEなどの蛍光標識で標識したFcγRIIIA-テトラマー複合体を持つ細胞と、
蛍光標識したF(ab)2抗Fcなどの抗Fc抗体との同時染色である。本発明の方法に従って作製
された酵母ライブラリーの蛍光測定は、好ましくは対照との比較を含む。例えば、Fc領域
を含む分子をコードするインサートを欠如している酵母細胞(陰性対照)である。フローソ
ーターは細胞内の蛍光シグナルを迅速に測定するだけでなく、特定の蛍光特性を持つ細胞
を回収する能力も持っている。本発明の好ましい実施形態ではこの特徴を利用して、野生
型Fc領域を含む対照のポリペプチドに比較して、特異的結合特性、例えば、FcγRIIIAに
対する高い親和性を持つFc融合タンパク質を発現する細胞について、当初のライブラリー
集団を富化することができる。本発明の好ましい実施形態では、酵母細胞を、酵母細胞表
面上のFc発現量に比してFcγRIIIAとの最大の親和性を示す細胞を選択するように樹立し
たFACSおよび選別ゲートによって、分析する。好ましい実施形態によれば、4種の順次選
別を設け、この場合、各順次選別のゲートは5.5%、1%、0.2%、および0.1%である。本発明
の方法に従って形成された酵母ディスプレイライブラリーは、希少クローンを単離する確
率を向上させるため、少なくとも10倍過剰のクローンを試験する(例えば、107クローンの
ライブラリーに由来する〜108細胞を分析する)ことが好ましい。あるいは、所望の表現型
の細胞を選択するために、2〜5選別を設ける。選別ゲートは当業者が経験によって設ける
ことができる。
別の好ましい実施形態では、酵母細胞表面上に提示された突然変異Fc融合タンパク質を
、FcγR、例えばFcγRIIIAへの結合について、固相アッセイ、例えばDyna1が供給するも
のなどの磁気ビーズを使用するアッセイを、好ましくはハイスループット法で使用して、
スクリーニングする。一実施形態では、磁気ビーズアッセイを使用して、FcγRIIIAに対
する増大した親和性および/またはFcγRIIBに対する低下した親和性を持つ突然変異体を
同定することができる。FcγRIIIAに対する増大した親和性およびFcγRIIBに対する低下
した親和性を持つ突然変異体を同定するための代表的なアッセイは、FcγRIIBでコーティ
ングした磁気ビーズを使用する順次固相減損による突然変異体の選択と、その後のFcγRI
IIAでコーティングした磁気ビーズでの選択を含む。例えば、アッセイの1つは以下のステ
ップを含む：本発明の方法に従って作製した酵母細胞のライブラリーとFcγRIIBでコーテ
ィングした磁気ビーズとのインキュベーション；混合物を磁場に置くことによる、ビーズ
に結合した酵母細胞の非結合画分からの分離、非結合酵母細胞の除去、および別の培地中
への移動；酵母細胞とFcγRIIIAでコーティングしたビーズとの結合、混合物を磁場に置
くことによる、ビーズに結合した酵母細胞の非結合画分からの分離、非結合酵母細胞の除
去；激しいボルテックスによる結合細胞の除去；回収された細胞のグルコース含有培地中
での増殖；ガラクトースを含有する選択培地中での再誘導。この選択工程を少なくとも1
回反復する。次に当技術分野で知られた一般的な方法論、例えばPCRを使用して、Fcドメ
インを含有するインサートを増幅し、さらに特性決定するため、既述の方法によって抗体
中に導入する。
別の実施形態では、酵母に基づかないシステムを使用して、本発明の分子の結合性を特
性決定する。本発明の分子を特性決定するための代表的なシステムの1つは、抗フルオレ
セインモノクローナル抗体4-4-20の重鎖であって、その中に変異型Fc領域を持つ本発明の
分子をコードする核酸がクローニングされているもの、を含有する哺乳動物発現ベクター
を含む。結果として得られた組換えクローンを哺乳動物宿主細胞系統(すなわち、ヒト腎
細胞系293H)中で発現させ、得られた組換え免疫グロブリンを、当業者に知られた標準的
アッセイのいずれか、限定するわけではないが、ELISAおよびFACSなどを使用して、FcγR
との結合について分析する。
本発明の分子(例えば、抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子)は多様な方法で特
性決定することができる。特に、修飾されたFc領域を含む本発明の分子を、リガンド、例
えばFcγRIIIAテトラマー複合体に免疫特異的に結合する能力についてアッセイすること
ができる。こうしたアッセイは、溶液中(例えば、Houghten, Bio/Techniques, 13: 412-4
21, 1992)、ビーズ上(Lam, Nature, 354: 82-84, 1991)、チップ上(Fodor, Nature, 364:
555-556, 1993)、細菌上(米国特許第5,223,409号)、胞子上(米国特許第5,571,698；5,40
3,484；および5,223,409号)、プラスミド上(Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
1865-1869, 1992)、またはファージ上(Scott and Smith, Science, 249: 386-390, 1990
；Devlin, Science, 249: 404-406, 1990 ；Cwirlaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87
: 6378-6382, 1990；およびFelici, J；Mol. Biol., 222: 301-310, 1991)(これらそれぞ
れの全体を参照により本明細書中に組み入れる)において実施することができる。リガン
ド、例えばFcγRIIIAに免疫特異的に結合することが同定された分子を、その後リガンド
に対する特異性および親和性についてアッセイすることができる。
修飾されたFc領域を含むように操作された(例えば、治療用抗体)か、酵母ディスプレイ
システム中で所望の表現型を持つことが同定された(セクション5.1参照)本発明の分子を
、抗原(例えば癌抗原)に対する免疫特異的結合およびその他の抗原(例えばFcγR)との交
差反応性について、当技術分野で知られた方法のいずれによっても、アッセイすることが
できる。免疫特異的結合および交差反応性を分析するために使用することができるイムノ
アッセイとして、限定するわけではないが、以下に数例を示す技術を使用する競合および
非競合アッセイシステムが含まれる：ウエスタンブロット、放射性イムノアッセイ、ELIS
A(酵素結合免疫吸着剤アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ
、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、
免疫放射性測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Aイムノアッセイ。こうした
アッセイは、常套的であって、当技術分野で周知である(例えば、Ausubelら編集、1994,
Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yor
k(その全体を参照により本明細書中に組み入れる)参照)。
修飾されたFc領域を含む本発明の分子のリガンド、例えばFcγRテトラマー複合体に対
する結合親和性および相互作用の消失速度を、競合結合アッセイによって、測定すること
ができる。競合結合アッセイの一例は、放射性イムノアッセイであり、標識(例えば3Hま
たは125I)したテトラマーFcγRなどのリガンドと目的の分子(例えば、修飾されたFc領域
を含む本発明の分子)との、漸次的に増加させたテトラマーFcγRなどの非標識リガンドの
存在中でのインキュベーション、および標識リガンドと結合した分子の検出を含む。本発
明の分子のリガンドへの親和性および結合の消失速度を、飽和データから、スキャッチャ
ード(Scatchard)分析によって、測定することができる。
好ましい実施形態では、BIAcore速度論的分析を使用して、本発明の分子のFcγRなどの
リガンドへの結合速度および解離速度を判定することができる。BIAcore速度論的分析は
、表面に固定化された分子(例えば、修飾されたFc領域を含む分子)を持つチップへのリガ
ンドの結合およびこれからの解離の分析を含む。
5.2.5 突然変異体の配列決定
当技術分野で知られた多様な配列決定反応のいずれを使用しても、変異型Fc領域を含む
本発明の分子を直接配列決定することができる。配列決定反応の例として、以下によって
開発された技術を基礎とするものが含まれる：Maxim and Gilbert(Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 74: 560, 1977)またはSanger(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463, 1977)。
多様な自動配列決定操作法を利用することができることも想定されている(BiolTechnique
s, 19: 448, 1995)。これにはマススペクトル分析による配列決定が含まれる(例えば、PC
T公報No. WO 94/16101、Cohenら、Adv. Chromatogr., 36: 127-162, 1996、およびGriffi
nら、Appl. Biochem. Biotechnol., 38: 147-159, 1993)。
5.2.6 変異型Fc領域を持つ分子の機能性アッセイ
本発明は、本発明の分子(例えば、上記の酵母ディスプレイ法によって同定された変異
型Fc領域を含む抗体；または本発明の方法に従って操作された治療用モノクローナル抗体
)についての、この分子のエフェクター細胞機能を同定するための当業者に知られたアッ
セイを使用した、特性決定を包含する。特に、本発明は、本発明の分子のFcγRが介在す
るエフェクター細胞機能の特性決定を包含する。本発明に従ってアッセイすることができ
るエフェクター細胞機能の例として、限定するわけではないが、以下が含まれる：抗体依
存性細胞傷害、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、Clq結合、および補体依存
性細胞傷害。エフェクター細胞機能活性を判定するために、当業者に知られた細胞に基づ
いた、または無細胞アッセイのいかなるものでも使用することができる(エフェクター細
胞アッセイについては、以下を参照：Prussiaら、2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-9
2；Baggioliniら、1998 Experientia, 44(10): 841-8；Lehmannら、2000 J. Immunol. Me
thods, 243(1-2): 229-42；Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64；Munnら
、1990 J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majidら、2002 Scand. J. Immunol. 55: 70
-81；Dingら、1998, Immunity 8:403-411(これらそれぞれの全体を参照として本明細書中
に組み入れる))。
1つの実施形態では、本発明の分子をヒト単球中のFcγR介在食作用についてアッセイす
ることができる。あるいは、本発明の分子のFcγR介在食作用をその他の食細胞、例えば
、好中球(多形核白血球；PMN)；ヒト末梢血単球、単球由来マクロファージ中でアッセイ
してもよい。これらは当業者に知られた標準的操作法を使用して取得することができる(
例えば、Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-164、参照)。一実施形態では、
本発明の分子の機能を、既述の方法(Tridandapaniら、2000, J. Biol. Chem. 275: 20480
-7)により、フルオレセイン化IgG-オプソニン化ヒツジ赤血球細胞(SRBC)を貪食するTHP-1
細胞の能力を測定することによって、特性決定する。例えば、FcγRIIIAに対して強化さ
れた親和性を持つ変異型Fc領域を含む本発明の分子の食作用を測定するための代表的なア
ッセイは、以下を含む：THP-1細胞を本発明の分子またはFcγRIIIAに結合しない対照抗体
で処理し、この細胞の活性レベルを比較する、ここで、細胞の活性(例えば、ロゼット形
成活性(IgG-コーティングSRBCと結合したTHP-1細胞の数)、接着活性(THP-1細胞に結合し
たSRBCの総数)、および食細胞率)の差異が本発明の分子の機能性を示唆することとなる。
当業者は、この代表的なアッセイを使用して、本発明の方法によって同定される分子のい
ずれについてもアッセイすることができることを理解するはずである。
本発明の分子の食作用を判定するための別の代表的なアッセイは、抗体依存性オプソニ
ン食作用アッセイ(ADCP)であり、これは以下を含む：エシェリキア・コリ(Escherichia c
oli)-標識FITC(Molecular Probes)またはスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococc
us aureus)-FITCなどの標的生体粒子を、(i)FcγR依存性ADCPについての対照抗体として
の、野生型4-4-20抗体(フルオレセインに対する抗体)(Bedzykら、1989, J. Biol. Chem,
264(3): 1565-1569(その全体を参照により本明細書に組み入れる)参照)または(ii)FcγR
依存性ADCPについてのバックグラウンド対照としての、FcγRIIIへの結合をノックアウト
するD265A突然変異を保有する4-4-20抗体、(iii)本発明の方法によって同定し、実施例6.
6に例示するようにして製造した、変異型Fc領域を保有する4-4-20抗体、でコーティング
し；そしてオプソニン化した粒子を形成させ；記載したオプソニン化粒子(i〜iii)のいず
れかをTHP-1エフェクター細胞(単球細胞系、ATCCより入手可能)に60：1の比率で添加して
、FcγR介在食作用を発生させ；好ましくはこの細胞とE. coli-FITC/抗体を37℃で1.5時
間インキュベートし；インキュベーション後、細胞にトリパンブルーを添加(好ましくは
室温で2〜3分)して、内部に取り込まれないで細胞表面の外側に接着した細菌の蛍光を消
失させ；細胞をFACSバッファー(例えば、0.1%BSA、0.1%アジ化ナトリウム、PBS中)中に移
動させ、FACS(例えば、BD FACS Calibur)を使用して、THP1細胞の蛍光を分析する。好ま
しくは、アッセイに用いられるTHP-1細胞を、FACSにより細胞表面上のFcγRの発現につい
て分析する。THP-1細胞はCD32AおよびCD64の両方を発現する。CD64は、本発明の方法のAD
CPアッセイを実行する際にブロックされる、高親和性FcγRである。THP-1細胞を、好まし
くは100μg/mL可溶性IgG1または10%ヒト血清でブロックする。ADCPの程度を分析するため
、ゲートを好ましくはTHP-1細胞についてセットし、蛍光強度の中央値を測定する。個々
の突然変異体についてのADCP活性を算出し、得られた野生型chMab 4-4-20に対する標準化
した数値として記録する。オプソニン化した粒子をTHP-1細胞に、THP-1細胞に対するオプ
ソニン化した粒子の比率が30：1または60：1になるように、添加する。最も好ましい実施
形態では、ADCPアッセイを以下のような対照とともに実行する：培地中のE.coli-FITC、E
.coli-FITCおよびTHP-1細胞(FcγR非依存性ADCP活性として役立てるため)、E.coli-FITC
、THP-1細胞および野生型4-4-20抗体(FcγR依存性ADCP活性として役立てるため)、E.coli
-FITC、THP-1細胞、4-4-20 D265A(FcγR依存性ADCP活性についてのバックグラウンド対照
として役立てるため)。
別の実施形態では、本発明の分子を、当業者に知られた標準的な方法のいずれかを使用
して、エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞中で、FcγR介在ADCC活性につい
てアッセイすることができる(例えば、Perussiaら、2000, Methods Mol. Biol. 121: 179
-92、参照)。本発明の分子のADCC活性を判定するための代表的なアッセイは、以下を含む
5lCr放出アッセイである：標的細胞を[51Cr]Na2CrO4で標識し(この細胞膜透過性分子が標
識用に一般的に使用される。なぜならば、これは細胞質タンパク質と結合し、細胞から速
度論的に緩慢に放出されるが、標的細胞の壊死後、大量に放出されるからである)；変異
型Fc領域を含む本発明の分子で標的細胞をオプソニン化し；オプソニン化した放射性標識
標的細胞とエフェクター細胞を、エフェクター細胞に対する標的細胞の適切な比率で、マ
イクロタイタープレート中で混合し；細胞の混合物を16〜18時間、37℃でインキュベート
し；上清を回収し；そして放射活性を分析する。その後、本発明の分子の細胞傷害を、例
えば以下の数式を使用して、判定することができる: 溶解% = (実験cpm - 標的漏出cpm)/
(界面活性剤溶解cpm - 標的漏出cpm) x 100%、あるいは、溶解% =(ADCC-AICC)/ (最大放
出 - 自発的放出)。特異的溶解は以下の数式を使用して算出することができる：特異的溶
解 = 本発明の分子存在中での溶解% - 本発明の分子不在中での溶解%。標的：エフェクタ
ー細胞の比率または抗体濃度のいずれかを変更することによって、グラフを作成すること
ができる。
さらに別の実施形態では、本発明の分子を、抗体依存性細胞傷害(ADCC)について特性決
定する。例えば、Dingら、Immunity, 1998, 8: 403-11(その全体を参照により本明細書に
組み入れる)を参照されたい。
好ましくは、本発明のADCCで使用する細胞は末梢血単核細胞(PBMC)である。これは好ま
しくは、当業者に知られた標準的方法、例えばFicoll-Paque密度勾配遠心分離を使用して
、正常ヒト血液から精製される。本発明の方法で使用するための好ましいエフェクター細
胞は、別種のFcγR活性化受容体を発現する。本発明は、Fc抗体突然変異体が野生型IgGl
抗体に比較して増加したADCC活性および食作用を示すかどうかを判定するための、エフェ
クター細胞、FcγRI、FcγRIIAおよびFcγRIIBを発現するTHP-1、ならびにFcγRIIIAおよ
びFcγRIIBの両方を発現する、ヒト全血から誘導した単球由来の一次マクロファージを包
含する。
ヒト単球細胞系、THP-1は、高親和性受容体FcγRIおよび低親和性受容体FcγRIIAの発
現を介して食作用を活性化する(Fleitら、1991, J. Leuk. Biol. 49: 556)。THP-1細胞は
、FcγRIIAまたはFcγRIIBを構成的（constitutively）には発現しない。サイトカインを
用いたこれらの細胞の刺激はFcγR発現パターンに影響する(Pricopら、2000 J. Immunol.
166: 531-7)。サイトカインIL4の存在下でのTHP-1細胞の成長はFcγRIIB発現を誘発し、
FcγRIIAおよびFcγRI発現の減退をもたらす。FcγRIIB発現も細胞密度の増加によって、
増大させることができる(Tridandapaniら、2002, J. Biol Chem. 277: 5082-9)。対照的
に、IFNγはFcγRIIIAの発現を導くことができることが報告されている(Pearseら、1993
PNAS USA 90: 4314-8)。細胞表面上の受容体の存在または不在は、当業者に知られた一般
的方法を使用して、FACSによって判定することができる。サイトカインが誘発する細胞表
面上のFcγRの発現は、FcγRIIBの存在中での活性化および抑制の両方を試験するシステ
ムを提供する。THP-1細胞がFcγRIIBを発現することができない場合は、本発明は別のヒ
ト単球細胞系、U937をも包含する。これらの細胞は、IFNγおよびTNFの存在中で、最終的
にマクロファージに分化する(Korenら、1979, Nature 279: 328-331)。
FcγR依存性腫瘍細胞の死滅は、マウス腫瘍モデル中でマクロファージおよびNK細胞に
よって仲介される(Clynesら、1998, PNAS USA 95 : 652-656)。本発明は、食作用およびA
DCCアッセイの両方で、標的細胞の細胞傷害を誘発するFc突然変異体の効力を分析するた
め、エフェクター細胞としてドナーからの分離された単球の使用を包含する。FcγRI、Fc
γRIIIA、およびFcγRIIBの発現パターンは、異なる増殖条件によって影響を受ける。凍
結被分離単球、新鮮被分離単球、10% FBS中に維持した単球、FBS + GM-CSF中および/また
はヒト血清中で培養した単球からのFcγR発現を、当業者に知られた一般的方法を使用し
て、判定することができる。例えば、細胞をFcγR特異的抗体で染色し、FACSによって分
析して、FcγR特性を判定することができる。その後、マクロファージのin vivo FcγR発
現を最もよく模倣する条件を本発明の方法で使用する。
いくつかの実施形態では、本発明は、特に適合するFcγR特性を持つヒト細胞を取得す
ることができない場合には、マウス細胞の使用を包含する。いくつかの実施形態では、本
発明は、ヒトFcγRIIIAでトランスフェクトすることができるマウスマクロファージ細胞
系RAW264.7(ATCC)、および当技術分野で知られた方法を使用して単離された安定な形質転
換体を包含する(例えば、Ralphら、J. Immunol. 119: 950-4、参照)。形質転換体を、通
常の実験操作を用いたFACS分析によって、FcγRIIIA発現について定量し、高発現体を本
発明のADCCアッセイに使用することができる。別の実施形態では、本発明は、本明細書で
開示したものなどのノックアウトトランスジェニックマウスからの、ヒトFcγRを発現す
る脾臓腹腔マクロファージの単離を包含する。
リンパ球は、Ficoll-Paque勾配(Pharmacia)を使用して、ドナーの末梢血(PBM)から回収
することができる。単離された細胞の単核集団内で、大多数のADCC活性は、その表面にFc
γRIIIAを含むがFcγRIIBは含まないナチュラルキラー細胞(NK)を介して起こる。これら
の細胞での結果は、NK細胞 ADCCの誘発に対する突然変異体の効力を示唆し、分離単球で
の試験用の試薬を確立する。
本発明のADCCアッセイで使用する標的細胞として、限定するわけではないが、以下が含
まれる：乳癌細胞系、例えばSK-BR-3(ATCC受託番号 HTB-30)(例えば、Trempら、1976, Ca
ncer Res. 33-41、参照)；Bリンパ球；バーキットリンパ腫由来の細胞、例えばRaji細胞(
ATCC受託番号 CCL-86)(例えば、Epsteinら、1965, J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240
、参照)、およびDaudi細胞(ATCC受託番号 CCL-213)(例えば、Kleinら、1968, Cancer Res
. 28: 1300-10、参照)。標的細胞はアッセイすべき免疫グロブリンの抗原結合部位によっ
て認識されるものでなければならない。
ADCCアッセイは、アポトーシス経路によって細胞死を仲介するNK細胞の能力に基づいて
いる。NK細胞は部分的に、細胞表面の抗原に結合したIgGをFcγRIIIAが認識することによ
って、細胞死を仲介する。本発明の方法に従って使用するADCCアッセイは、放射性アッセ
イまたは蛍光アッセイでもよい。変異型Fc領域を含む本発明の分子を特性決定するために
使用するADCCアッセイは以下を含む：標的細胞、例えばSK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji、
Daudi細胞を標識し；標的細胞を、抗原結合部位を介して標的細胞上の細胞表面受容体を
認識する抗体でオプソニン化し；標識したオプソニン化標的細胞とエフェクター細胞を適
切な比率(これは通常の実験操作によって決定することができる)で混合し；細胞を回収し
；使用した標識に基づく適切な検出スキームを使用して、溶解した標的細胞の上清中の標
識を検出する。標的細胞は当技術分野で知られた標準的方法を使用して、放射性標識また
は蛍光標識のいずれかで標識することができる。例えば、標識として、限定するわけでは
ないが以下が含まれる：[51Cr]Na2Cr04 ；および蛍光強化リガンド、2,2':6',2’’-テル
ピリジン-6-6’’-ジカルボキシラート(TDA)、のアセトキシメチルエステル。
特定の好ましい実施形態では、蛍光強化リガンド、2,2':6',2’’-テルピリジン-6-6’
’-ジカルボキシラート(TDA)、のアセトキシメチルエステルで標識した標的細胞に対する
ADCC活性を測定するため、時間分解蛍光分光アッセイを使用する。こうした蛍光分光アッ
セイは、当技術分野で知られている。例えば、Blombergら、1996, Journal of Immunolog
ical Methods, 193: 199-206(その全体を参照により本明細書に組み入れる)を参照された
い。簡単に述べると、標的細胞を膜透過性TDAのアセトキシメチルジエステル(ビス(アセ
トキシメチル)2,2':6',2’’-テルピリジン-6-6’’-ジカルボキシラート(BATDA))で標識
する。これは生存細胞の細胞膜を通過して迅速に拡散する。細胞内エステラーゼがエステ
ル基を切り離し、再生された膜非透過性TDA分子は細胞の内側に捕捉される。エフェクタ
ーおよび標的細胞を例えば、少なくとも2時間、長くとも3.5時間、37℃、5% CO2下でイン
キュベートした後、溶解標的細胞から放出されたTDAをEu3+とキレート化させ、生成した
ユーロピウム-TDAキレートの蛍光を時間分解蛍光光度計(例えば、Victor 1420, PerkinEl
mer/Wallac)で定量する。
別の特定の実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子を特性決定するために使用
するADCCアッセイは以下のステップを含む： 好ましくは4-5x106標的細胞(例えば、SK-BR
-3、MCF-7、OVCAR3、Raji細胞)をビス(アセトキシメチル)2, 2':6',2’’-テルピリジン-
t-6’’-ジカルボキシラート(DELFIA BATDA Reagent, Perkin Elmer/Wallac)で標識する
。最適標識効率のため、ADCCアッセイで使用する標的細胞の数は、好ましくは5x106を超
えないようにすべきである。この細胞にBATDA試薬を添加し、混合物を37℃、好ましくは5
%CO2下で、少なくとも30分間インキュベートする。次に細胞を生理学的バッファー、例え
ば0.125mMスルフィンピラゾールを含むPBS、および0.125mMスルフィンピラゾールを含有
する培地で洗浄する。次に標識した標的細胞を、変異型Fc領域を含む本発明の分子、すな
わち限定するわけではないが、以下のものなどの、本発明の変異型Fc領域を含む免疫グロ
ブリンでオプソニン化(コーティング)する：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
二重特異的抗体、多重特異的抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体。好ましい実施形態で
は、ADCCアッセイで使用する変異型Fc領域を含む免疫グロブリンは、細胞表面受容体、腫
瘍抗原、または癌抗原に対して特異的である。本発明の変異型Fc領域を中に導入する免疫
グロブリンは、セクション5.4に列挙するものなどのいずれかの癌または腫瘍抗原と特異
的に結合することができる。その上、本発明の変異型Fc領域を中に導入する免疫グロブリ
ンはセクション5.4に列挙するものなどの癌抗原の1つに特異的ないずれかの治療用抗体で
ある。いくつかの実施形態では、ADCCアッセイで使用する変異型Fc領域を含む免疫グロブ
リンは以下のものである：抗フルオレセインモノクローナル抗体、4-4-20(Kranzら、1982
J. Biol.Chez. 257 (12): 6987-6995)、マウス-ヒトキメラ抗CD20モノクローナル抗体2H
7(Liuら、1987, Journal of Immunology, 139: 3521-6)、またはヒト表皮成長因子受容体
2(p185 HER2)に対するヒト化抗体(Ab4D5)(Carterら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 4285-9)。ADCCアッセイ中の標的細胞は、免疫グロブリンが標的細胞の細胞表面受容
体と特異的に結合するように、本発明の変異型Fc領域を導入した免疫グロブリンに応じて
、選択される。好ましくは、本発明のADCCアッセイを、本発明のFc変異型を保有している
1種以上の操作された抗体、例えば、抗Her2/neu、4-4-20、2B6、Rituxan、および2H7を使
用して実施する。最も好ましい実施形態では、本発明のFc変異型を少なくとも3抗体中に
導入して、そのADCC活性を試験する。特定の作用機構によって束縛される意図はないが、
これらの機能的アッセイで少なくとも3抗体を実験することで、有効なFc突然変異を誤っ
て排除する機会は減少するものと思われる。
オプソニン化した標的細胞をエフェクター細胞、例えばPBMCに、エフェクター：標的の
比率が約50：1、75：1、または100：1になるように添加する。特定の実施形態では、変異
型Fc領域を含む免疫グロブリンが4-4-20の可変性ドメインを持つ場合、エフェクター: 標
的 は75: 1である。エフェクターおよび標的細胞を少なくとも2時間、長くとも3.5時間、
37℃、5% CO2下でインキュベートする。細胞上清を回収し、酸性ユーロピウム溶液(例え
ば、DELFIA Europium Solution, Perkin Elmer/Wallac)に添加する。生成したユーロピウ
ム-TDAキレートの蛍光を、時間分解蛍光光度計(例えば、Victor 1420, Perkin Elmer/Wal
lac)で定量する。最大放出(MR)および自発放出(SR)を、標的細胞と1% TX-100および培地
のみのそれぞれとのインキュベーションによって、測定する。抗体非依存性細胞傷害(AIC
C)を、抗体不在中での標的とエフェクター細胞とのインキュベーションによって、測定す
る。各アッセイは、好ましくは3回ずつ実施する。特異的溶解の平均パーセントを以下に
よって算出する：実験放出値(ADCC)-AICC)/ (MR-SR) x 100。
5.2.7 その他のアッセイ
変異型Fc領域を含む本発明の分子を、Fc-FcγR相互作用性結合の速度論的パラメーター
の特性決定について、当技術分野で知られた表面プラズモン共鳴アッセイのいずれかを使
用して、アッセイすることもできる。限定するわけではないが以下を含む市販のSPR装置
を本発明で使用することができる：Biacore AB製BIAcore Instruments(Uppsala, Sweden)
；Affinity Sensors製IAsys装置(Franklin, MA. )；Windsor Scientific Limited製IBIS
システム(Berks, UK)；Nippon Laser and Electronics Labpep製SPR-細胞IA システム(Ho
kkaido, Japan)；およびTexas Instruments製SPR DetectorSpreeta(Dallas, TX)。SPRに
基づく技法の概説については、以下を参照されたい：Mulletら、2000, Methods 22: 77-9
1；Dongら、2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23；Fivashら、1998, Current Op
inion in Biotechnology 9:97-101；Richら、2000, Current Opinion in Biotechnology
11: 54-61(その全体を参照により本明細書中に組み入れる)。さらに、米国特許第6,373,5
77；6,289,286；5,322,798；5,341,215；6,268,125号に記載されたタンパク質-タンパク
質相互作用を測定するためのSPR装置およびSPRに基づく方法のいずれをも、本発明の方法
中に含むことを意図する(その全体を参照により本明細書中に組み入れる)。
簡単に述べると、SPRに基づくアッセイは、結合する対の一方を表面に固定化し、その
結合対の他方との溶液中での相互作用をリアルタイムでモニターすることを含む。SPRは
、複合体の生成または解離時に出現する表面付近での溶媒の屈折率の変化の測定に基づく
ものである。固定化を行う表面はセンサーチップであって、これがSPR技法の心臓部とな
るものである。これは金の薄層で被覆されたガラス表面により構成され、分子の表面への
結合を最適化するように設計される種々の特異化された表面の土台を形成する。特に上記
の会社から、多様なセンサーチップが市販されており、これらのすべてを本発明の方法で
使用することができる。センサーチップの例としてBIAcore AB, Inc.から市販されている
もの、例えばSensor Chip CM5、SA、NTA、およびHPAが含まれる。本発明の分子は、限定
するわけではないが、以下を含む、当技術分野で知られた固定化方法および化学のいずれ
を使用しても、センサーチップの表面に固定化することができる：アミン基を介した直接
共有結合、スルフヒドリル基を介した直接共有結合、アビジン被覆表面へのビオチン接着
、炭水化物基へのアルデヒド結合、およびヒスチジンタグを介したNTAチップとの接着。
いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子、例えば変異型Fc領域を含
む免疫グロブリンのFcγRとの結合の速度論的パラメーターを、BIAcore装置(例えば、BIA
core装置1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ)を使用して、測定することができる。任
意のFcγRを使用して、変異型Fc領域を含む本発明の分子との相互作用を評価することが
できる。特定の実施形態では、FcγRはFcγRIIIA、好ましくは可溶性モノマーFcγRIIIA
である。例えば、1つの実施形態では、可溶性モノマーFcγRIIIAは、リンカー-AVITAG配
列に連結されたFcγRIIIAの細胞外領域である(米国仮出願 No. 60/439, 498、2003年1月9
日出願(代理人整理番号 11183-004-888)および米国仮出願 No. 60/456,041、2003年3月19
日出願(これらの全体を参照により本明細書中に組み入れる)、参照)。別の特定の実施形
態では、FcγRはFcγRIIB、好ましくは可溶性ダイマーFcγRIIBである。例えば、一実施
形態では、可溶性ダイマーFcγRIIBタンパク質を以下に記載された方法に従って調製する
：米国仮出願 No. 60/439,709、2003年1月13日出願(その全体を参照により本明細書に組
み入れる)。
変異型Fc領域を含む分子が4-4-20抗体である場合に、分子のFcγRに対する速度論的パ
ラメーターを測定するための、BIAcore装置を用いた代表的なアッセイは、以下を含む：B
SA-FITCをセンサーチップ表面の4つのフロー細胞の1つに、好ましくはアミン連結化学方
法を介して、約5000応答単位(RU)のBSA-FITCが表面に固定化されるように、固定化する。
好適な表面を調製した後、Fc突然変異を保有する4-4-20抗体を、好ましくは20μg/mL溶液
の流速5μL/mLでの1分間の注入によって、表面を通過させる。表面に結合した4-4-20抗体
のレベルは、400〜700RUの範囲である。次に、HBS-Pバッファー(20mM HEPES, 150mM NaCl
, 3mM EDTA, pH 7.5)中の受容体(FcγRIIAおよびFcγRIIB-Fc融合タンパク質)の一連の希
釈物を表面上に100μL/分で注入する。別種の受容体希釈間にわたる抗体の再生は、好ま
しくは100mM NaHCO3 pH 9.4；3M NaClの1回の5秒間注入によって行われる。当技術分野で
知られたいずれの再生技術も、本発明の方法中に想定されている。
全てのデータセットを取得した後、生成する結合曲線を、SPR装置製造元、例えばBIAco
re, Inc.(Piscataway, NJ)から供給されているコンピュータアルゴリズムを使用して、大
まかにフィット(fit)させる。これらのアルゴリズムでは、KonおよびKoffの両方を算出し
、これらから見かけの平衡結合定数、Kdを、2つの速度定数の比として演繹する(すなわち
、Koff/Kon)。個々の速度定数をどのようにして誘導するかについてのさらに詳細な処理
法は、BIAevaluaion Software Handbook(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)から得られる
。作成したデータの分析は、当技術分野に知られたどの方法を使用しても実施することが
できる。作成した速度論的データの解釈のための各種の方法の概説については、以下を参
照されたい：Myszka, 1997, Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7；Fisherら、19
94, Current Opinion in Biotechnology 5: 389-95；O'Shannessy, 1994, Current Opini
on in Biotechnology, 5:65-71；Chaikenら、1992, Analytical Biochemistry, 201: 197
-210；Mortonら、1995, Analytical Biochemistry 227: 176-85；O'Shannessyら、1996,
Analytical Biochemistry 236: 275-83(これらの全体を参照により本明細書中に組み入れ
る)。
好ましい実施形態では、SPR分析、例えばBIAcoreを使用して測定した速度論的パラメー
ターを、本発明の分子が機能的アッセイ、例えばADCC中で、どのように機能するかを予測
する指標として使用することができる。SPR分析から取得した速度論的パラメーターに基
づいて本発明の分子の効力を予測するための代表的な方法は、以下を含む：本発明の分子
のFcγRIIIAおよびFcγRIIBとの結合についてのKoff値を測定し；ADCCデータに対して、(
1) FcγRIIIAについてのKoff(wt)/Koff(mut)；(2) FcγRIIBについてのKoff(mut)/Koff(w
t)をプロットする。野生型に比較して、1よりも高い数値がFcγRIIIAについて減少した解
離速度、そしてFcγRIIBについて増加した解離速度を示し、増大したADCC機能を有するこ
とを示す。
5.3 本発明の分子の組換えによる製造方法
5.3.1 本発明の分子をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の方法によって同定される本発明のポリペプチドおよび抗体などの分
子をコードするポリヌクレオチドも含む。当技術分野で知られたどんな方法によっても、
本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列を決定することができる。
本発明の方法によって同定された分子(例えば、抗体)のヌクレオチド配列を決定した後
、そのヌクレオチド配列を当技術分野で周知の方法、例えば、組換えDNA技術、部位特異
的突然変異誘発、PCR、その他を使用して操作し(例えば以下に記載された技術を参照され
たい：Sambrookら、2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；およびAusubelら編集、1998, Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(これらの両方の全体を参照
により本明細書に組み入れる))、例えばアミノ酸の置換、欠損、および/または挿入を作
製することによって、例えば別種のアミノ酸配列を持つ抗体を作製することができる。
特定の実施形態では、核酸が抗体をコードする場合、通常の組換えDNA技術を使用して
、フレームワーク領域内に1以上のCDRを挿入する。フレームワーク領域は天然に生起する
ものでも共通フレームワーク領域でもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である(
ヒトフレームワーク領域の一覧については、例えば、Chothiaら、1998, J. Mol. Biol. 2
78: 457-479を参照)。
別の実施形態では、ヒトライブラリーまたは当技術分野で利用し得るその他のあらゆる
ライブラリーを当技術分野で知られた標準的技術によってスクリーニングして、本発明の
分子をコードする核酸をクローニングすることができる。
5.3.2 本発明の分子の組換え発現
本発明の分子（すなわち、抗体）をコードする核酸配列が得られたら、該分子を産生す
るためのベクターを、組換えDNA技術により当技術分野で周知の技術を用いて作ることが
できる。当業者に周知の方法を利用して、本発明の分子をコードする配列および適当な転
写・翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法と
しては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組換えが挙げ
られる（例えば、Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubelら編, 1998,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載される技術を
参照されたい）。
本発明の方法により同定された分子（すなわち、抗体）のヌクレオチド配列を含む発現
ベクターは、通常の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェク
ション、およびリン酸カルシウム沈降）により宿主細胞に導入し、次いでトランスフェク
トした細胞を従来の技法により培養して、本発明の分子を産生させることができる。特定
の実施形態においては、本発明の分子の発現を構成的、誘導性、または組織特異的なプロ
モーターにより制御する。
本発明の方法により同定された分子を発現させるために利用する宿主細胞は、細菌細胞
、例えば大腸菌（Escherichia coli）であるか、または好ましくは、特に組換え免疫グロ
ブリン分子を発現させるためには、真核細胞でありうる。特に、哺乳動物細胞、例えばチ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初
期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと一緒になって、免疫グロブリンのため
の有効な発現系である（Foeckingら, 1998, Gene 45:101；Cockettら, 1990, Bio/Techno
logy 8:2）。
様々な宿主-発現ベクター系を利用して、本発明の方法により同定された分子を発現さ
せることができる。このような宿主-発現系は、本発明の分子のコード配列を産生し、続
いて精製することができるビヒクルを表すが、また、適当なヌクレオチドコード配列によ
り形質転換またはトランスフェクトされると本発明の分子をin situで発現することがで
きる細胞も表す。これらとしては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：
例えば、本発明の方法により同定された分子のコード配列を含有する組換えバクテリオフ
ァージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換された微生物
、例えば大腸菌（E.coli）や枯草菌（B. subtilis）のような細菌；本発明の方法により
同定された分子のコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（
例えば、サッカロミセス属、ピキア属）；本発明の方法により同定された分子のコード配
列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆
虫細胞系；本発明の方法により同定された分子のコード配列を含有する組換えウイルス発
現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）およびタバコモザイクウイ
ルス（TMV））を感染させたまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミ
ド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例
えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例
えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有
する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、293T、
3T3細胞、リンパ球（米国特許第5,807,715号を参照）、Per C.6細胞（Crucellにより開発
されたヒト網膜細胞））。
細菌系においては、発現される分子に対して意図される用途に応じて、いくつかの発現
ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を調製するために大
量のこのようなタンパク質を産生させる必要がある場合には、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが望ましい。このようなベクターとして
は、限定するものではないが、抗体コード配列をベクター中でlacZコード領域とインフレ
ームで個々にライゲートして融合タンパク質が産生されるようにする大腸菌（E.coli）発
現ベクターpUR278（Rutherら, 1983, EMBO J. 2: 1791）；pINベクター（Inouye & Inouy
e, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. C
hem. 24:5503-5509）などが挙げられる。また、pGEXベクターを用いると、外来ポリペプ
チドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させる
ことができる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から
、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズへの吸収および結合、続いて遊離グルタ
チオンの存在下での溶出により容易に精製することができる。pGEXベクターはトロンビン
または因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むように設計されており、その結果、クローニン
グされた標的遺伝子産物をGST成分から切り離すことが可能である。
昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Autographa
californica nuclear polyhedrosis virus）（ACNPV）が外来遺伝子を発現させるための
ベクターとして利用される。このウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。
抗体コード配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクロ
ーニングして、AcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配
置する。
哺乳動物宿主細胞においては、いくつかのウイルスに基づく発現系を利用することがで
きる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、目的の抗体コード配列を、
アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３分節（triparti
te）リーダー配列とライゲートすることができる。このキメラ遺伝子を次いでアデノウイ
ルスゲノムにin vitroまたはin vivo組換えにより挿入する。ウイルスゲノムの非必須領
域（例えば、E1またはE3領域）への挿入により、感染した宿主内で生存可能でありかつ免
疫グロブリン分子を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、Logan &
Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359を参照されたい）。特定の開始シ
グナルも、挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要でありうる。これらのシ
グナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全インサート
の翻訳を確実にするために、目的のコード配列のリーディングフレームと同じフェーズに
なければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源の
ものであってよく、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレ
メント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強することができる（Bittnerら,
1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照されたい）。
さらに、挿入配列の発現をモジュレートしたり、遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾
またはプロセシングしたりする宿主細胞株を選択することができる。このようなタンパク
質産物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）はタンパク質の
機能にとって重要でありうる。それぞれの宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻
訳後プロセシングおよび修飾に対する特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株ま
たは宿主系を選ぶことにより、発現される外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを
確実にすることができる。このために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物の
グリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を持つ真核宿主細胞を用いることができる
。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、CHO、VERY、BHK、He
la、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL703
0およびHs578Bstが挙げられる。
組換えタンパク質を長期間、高収率で産生させるためには、安定した発現が好ましい。
例えば、本発明の抗体を安定に発現する細胞株を遺伝子工学的に作製することができる。
ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使うよりもむしろ、宿主細胞は、選択マー
カーおよび適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写
ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるDNAで形質転換しうる。外
来DNAを導入した後に、遺伝子操作した細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで
選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与す
るので、細胞が安定してプラスミドをその染色体中に組み込み、増殖して巣を形成し、続
いてクローニングして細胞株に増やすことが可能である。この方法は、本発明の抗体を発
現する細胞株を遺伝子工学的に作製するために有利に使用することができる。このような
遺伝子工学的に作製された細胞株は、本発明の抗体と直接的にまたは間接的に相互作用す
る化合物をスクリーニングして評価する上で特に有用である。
いくつかの選択系を利用することができ、それらには、限定するものではないが、以下
のものが含まれる：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:
223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szyba
lski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）遺伝子はそれぞれtk-、hgprt-またはap
rt-細胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性は以下の遺伝子を選択
するための基礎として用いることができる：メトトレキセート耐性を与えるdhfr（Wigler
ら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hareら, 1981, Proc. NATL. Acad. S
ci. USA 78: 1527）；ミコフェノール酸耐性を与えるgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc
. NATL. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo（Clinica
l Pharmacy 12:488-505；WuおよびWu, 1991, 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Ph
armacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；ならびにMorga
nおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIB TECH 11(5):
155-215)；ヒグロマイシン耐性を与えるhygro（Santerreら, 1984, Gene 30:147）。組換
えDNA技術の分野で公知であって利用しうる方法は、Ausubelら編, 1993, Current Protoc
ols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, Gene Transfer a
nd Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；ならびに第12および13章,
Dracopoliら(編), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, N
Y；Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。
本発明の抗体の発現レベルはベクター増幅により増加させることができる（概要につい
ては、BebbingtonおよびHentschel, 「DNAクローニングにおける哺乳動物細胞でのクロー
ン化遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの利用（The use of vectors bas
ed on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells i
n DNA cloning）」, Vol.3, Academic Press、New York、1987を参照されたい）。抗体を
発現するベクター系中のマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在する
阻害剤のレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数が増加するだろう。増幅され
た領域は抗体のヌクレオチド配列と結びついているので、抗体の産生も増加するだろう（
Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、すなわち、重鎖由来のポリペプチドをコー
ドする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターで同時
トランスフェクトすることができる。これら２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプ
チドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい。あるいは、重鎖お
よび軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを用いてもよい。このような状
況では、軽鎖を重鎖の前に配置して毒性の遊離重鎖が過剰になるのを避けるべきである（
Proudfoot, 1986, Nature 322: 52；Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 21
97）。重鎖および軽鎖をコードする配列は、cDNAでもゲノムDNAでもよい。
本発明の分子（すなわち、抗体）が組換えにより発現されたら、これを、当技術分野で
公知の、ポリペプチドまたは抗体を精製するための方法で精製することができる。かかる
精製方法として、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、
特にプロテインA後の特異的抗原に対するアフィニティーによる、およびサイジングカラ
ムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはポリペプチドや抗体を精製する
ための他の標準技術がある。
5.4 予防および治療方法
本発明は、疾患、障害または感染に関連した1以上の症状を予防し、治療し、または軽
減するために、1種以上の本発明の分子（すなわち、抗体）を動物、好ましくは哺乳動物
、最も好ましくはヒトに投与することを包含する。本発明の分子は、FcγRにより媒介さ
れるエフェクター細胞機能（例えば、ADCC）の増大した効力が望まれる疾患または障害を
治療または予防するのに特に有用である。本発明の方法および組成物は、原発性または転
移性の新生物疾患（すなわち、癌）および感染性疾患の治療または予防に特に有用である
。本発明の分子は、当技術分野で知られているかまたは本明細書に記載されるような、医
薬として許容される組成物の形で提供されうる。以下に詳述するように、本発明の分子は
、癌（特に、受動免疫療法による）、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を治
療または予防する方法に使用することができる。
本発明の分子はまた、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を治療または
予防するための当技術分野で公知の他の治療薬と組み合わせて、有利に使用することもで
きる。特定の実施形態では、本発明の分子を、例えば、該分子と相互作用して免疫応答を
高めるエフェクター細胞の数または活性を増加させるのに役立つ、モノクローナルもしく
はキメラ抗体、リンホカインまたは造血性増殖因子（例えば、IL-2、IL-3およびIL-7など
）と併用してもよい。本発明の分子はまた、疾患、障害、または感染を治療するために用
いる1種以上の薬物、例えば抗癌剤、抗炎症剤または抗ウイルス剤と組み合わせて有利に
利用することもでき、これらは、例えば、以下のセクション5.4.1.2および5.4.2.1に詳述
される。
5.4.1 癌
本発明は、被験体に治療上有効な量の変異型Fc領域を含む1種以上の分子を投与するこ
とを含む、その被験体の癌または転移の治療または予防のための方法および組成物を包含
する。
変異型Fc領域を含む本発明の分子(すなわち、ポリペプチド、抗体)を使用して、原発腫
瘍の増殖または癌性細胞の転移を予防し、抑制し、または減少させることができる。1つ
の実施形態では、本発明の分子は、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドがFcγRIII
Aおよび/またはFcγRIIAと結合するよりも高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcaRIIA
と結合する変異型Fcを含み、かつ/またはその変異型Fc領域は増強したエフェクター機能
、例えば、ADCC、CDC、食作用、オプソニン作用、その他を有する。こうした分子を単独
で使用して、癌を治療または予防することができる。別の実施形態では、本発明の分子は
、野生型Fc領域を含む対応するポリペプチドがFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合す
るよりも高い親和性でFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAと結合し、さらに野生型Fc領域を
含む対応するポリペプチドがFcγRIIBと結合するよりも低い親和性でFcγRIIBと結合する
変異型Fcを含み、かつ/またはその変異型Fc領域は増強したエフェクター機能、例えば、A
DCC、CDC、食作用、オプソニン作用、その他を有する。こうした分子を単独で使用して、
癌を治療または予防することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、FγRIIIA-158VまたはFcγRIIIA-158F対立遺伝子
についてのホモ接合のようなFcγR遺伝子多型を持つ被験体の癌の治療または予防のため
の方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療用抗体、例え
ば本発明の方法の腫瘍特異的モノクローナル抗体の操作を包含し、操作された抗体はFcγ
RIIIAの低親和性対立遺伝子(158F)についてのホモ接合患者において増大した効力を持つ
。別の実施形態では、本発明は、治療用抗体、例えば本発明の方法の腫瘍特異的モノクロ
ーナル抗体の操作を包含し、操作された抗体はFcγRIIIAの高親和性対立遺伝子(158V)に
ついてのホモ接合患者において増大した効力を持つ。
いくつかの実施形態では、本発明の操作された抗体は非ホジキンリンパ腫(NHL)の治療
および/または予防に特に有効である。本発明の操作された抗体は、限定するわけではな
いが、抗CD20 mAbであるRituximabを使用する化学療法および免疫療法を含む、NHLのため
の現行の治療方式よりも、治療上有効である。抗CD20モノクローナル抗体の効力は、しか
しながら、被験体のFcγR遺伝子多型に依存する(Cartonら、2002 Blood, 99: 754-8；Wen
gら、2003 J Clin Oncol. 21(21): 3940-7(この両者の全体を参照により本明細書に組み
入れる))。これらの受容体はエフェクター細胞の表面上に発現し、ADCCを仲介する。低親
和性活性化受容体の高親和性対立遺伝子は、エフェクター細胞の、ADCCを仲介する能力を
向上させる。本発明の方法によって、Fc突然変異を有する抗CD20抗体を操作して、その変
更されたFcドメインによってエフェクター細胞上のFcγRに対するその親和性を増大させ
ることが可能になる。本発明の操作された抗体は、患者についてそのFcγR遺伝子多型に
かかわらず、よりよい免疫療法試薬を提供する。
被験体中での操作された抗CD20抗体の効力を判定するための代表的な方法は、以下を含
む：Fc突然変異を持ち、ADCCにおいて実質的に増大した殺傷性を示すキメラ抗HER2/neu重
鎖遺伝子を有するプラスミドを、Rituximab重鎖遺伝子に由来する可変ドメイン中へ移す
ための骨格として使用することができる。抗HER2/neu Fc変異型に由来する可変部は、Rit
uximab由来の可変部で置き換えられる。野生型FcドメインもしくはFcγR結合性を無効に
するD265A突然変異、または抗CD20 Fc変異体を含有するプラスミドを、Rituximab軽鎖遺
伝子とともに馴化（conditioned）培地中の293H細胞に一時的に同時トランスフェクトし
、通常の手法を用いて、抗体をタンパク質Gカラムにより精製する。
Fc変異型を有する抗CD20mAbを、培養したB細胞系を用いたADCCによって試験して、Fc突
然変異体のADCCを増大させる能力を判定する。本明細書に開示した方法を使用して、標準
的ADCCを実施する。Ficoll-Paque勾配(Pharmacia)を使用して、リンパ球を末梢血から採
取する。標的Daudi細胞（CD20を発現するB細胞系統）にユーロピウム(PerkinElmer)を負
荷し、エフェクターとともに37℃で4時間インキュベートする。蛍光プレートリーダー(Wa
llac)を使用して、放出されたユーロピウムを検出する。得られたADCCデータは、NK細胞
介在細胞傷害を誘発するFc変異型の効力を示し、どの抗CD20 Fc変異体が患者サンプルお
よび分離単球の両方について試験されるべきかを立証する。その後、抗CD20抗体の効力を
増大させるのに最大の能力を示すFc変異型を、患者由来のPBMCを用いたADCCアッセイで試
験する。健康なドナー由来のPBMCがエフェクター細胞として用られる。抗CD20変異型およ
びRituximabを用いたin vitro ADCCアッセイは、甲状腺リンパ腫の患者由来の原発リンパ
腫細胞中で行われる。当技術分野で知られた方法を使用して、ドナーの特異的FcγR遺伝
子多型を判定し、リストを作成する。ADCCアッセイは、異なるFcγRIIIAおよびFcγRIIA
遺伝子型を持つ患者由来のエフェクター細胞によって行われる。
本発明の一態様によれば、変異型Fc領域を含む本発明の分子(例えば、抗体)は、野生型
Fc領域を含有する分子に比較して、抗体エフェクター機能、例えば、ADCC、CDC、食作用
、オプソニン作用その他の能力を増大させることによって、癌免疫療法の効力を増強する
。特定の実施形態では、変異型Fc領域を持つ本発明の分子を使用して、抗体依存性細胞傷
害性および/または腫瘍細胞の食作用が増強される。本発明の分子は、少なくとも1つの抗
体介在エフェクター機能を強化することによって、免疫療法による癌治療の効力を増強す
ることができる。特定の一実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、補体依存
性カスケードを強化することによって、免疫療法による治療の効力を増強する。本発明の
別の実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、標的腫瘍細胞の食作用および/
またはオプソニン作用を強化することによって、免疫療法による治療の効力を増強する。
本発明の別の実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、標的腫瘍細胞の破壊に
おける抗体依存性細胞傷害性(“ADCC”)を強化することによって、治療の効力を増強する
。
本発明はさらに、例えば治療用抗体のエフェクター機能(例えば、ADCC)を強化すること
によって、治療用抗体の治療効力を増強するための、治療用抗体(例えば、腫瘍特異的モ
ノクローナル抗体)の操作を想定する。好ましくはその治療用抗体は細胞傷害性および/ま
たはオプソニン作用性抗体である。当業者は、本発明の方法に従って、所望の結合特性を
持つ本発明の分子(例えば、少なくとも1個のアミノ酸修飾がある変異型Fc領域を有する分
子であって、この修飾が、野生型Fc領域を含む対応する分子に比較して、FcγRIIIAおよ
び/またはFcγRIIAに対する変異型Fc領域の親和性を強化するもの)を同定した(セクショ
ン5.2および表5参照)後、セクション5.2.2に記載したように、標準的組換えDNA技術およ
び任意の既知の突然変異誘発技術を使用して、治療用抗体を操作し、同定された所望の結
合特性を持つ突然変異部位を保有する、操作された治療薬を製造することができることを
理解できるはずである。癌治療での治療上の有用性が証明されている、表6に列挙した治
療用抗体のいずれも、本発明の方法に従って操作することができ（例えば、野生型Fc領域
を持つ治療用抗体に比較して、FcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対して増大した親和性
を持つようにFc領域を修飾することによって）、かつ癌抗原によって特徴付けられる癌の
治療および/または予防のために使用することができる。
本発明はまた、限定するわけではないが、ENBRELなどの、治療上の有用性を有するFc領
域を含むその他のあらゆるポリペプチドを本発明の方法に従って操作することを含み、該
操作は、例えばFc領域を含むポリペプチドのエフェクター機能を強化することによって、
こうしたポリペプチドの治療効力を増強するためのものである。
Figure 0006389093
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従って本発明は、癌抗原に結合し、細胞傷害性であり、本発明に従ってFc領域中の1以
上の部位が修飾されることによって元の治療用抗体よりも高い親和性でFcγRIIIAおよび/
またはFcγRIIAと結合し、かつ/または、より有効にエフェクター機能(例えば、ADCC、食
作用)を仲介する治療用抗体を使用する、癌抗原により特徴付けられる癌の予防または治
療方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、癌抗原に結合し、細胞傷害性であり、
本発明に従って操作されることによって元の治療用抗体よりも高い親和性でFcγRIIIAお
よび/またはFcγRIIAと結合し、そしてより低い親和性でFcγRIIBと結合し、かつ/または
、より有効にエフェクター機能(例えば、ADCC、食作用)を仲介する治療用抗体を使用する
、癌抗原により特徴付けられる癌の予防または治療方法を提供する。本発明に従って操作
された治療用抗体は、増大した細胞傷害活性(例えば、増大した腫瘍細胞殺傷および/また
は例えば増大したADCC活性もしくはCDC活性)を持つので、癌の予防または治療のために有
用である。
癌抗原が関係する癌は、癌抗原に結合し、細胞傷害性であり、本発明の方法に従って操
作されることにより、例えば増大したエフェクター機能を有する治療用抗体の投与によっ
て、治療または予防することができる。特定の一実施形態では、本発明の方法によって操
作された治療用抗体は、特定の癌抗原に特異的な抗体の、抗体介在細胞傷害効果を増強す
る。例えば、限定するわけではないが、以下の癌抗原が関係する癌を本発明の方法および
組成物によって治療または予防することができる：KS 1/4 汎癌腫抗原(Perez and Walker
, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667；Bumal, 1988, Hybridoma 7(4): 407-415)、卵巣
癌抗原(CA125)(Yuら、1991, Cancer Res. 51(2): 468-475)、前立腺酸性ホスフェート(Ta
ilorら、1990, Nucl. Acids Res. 18(16): 4928)、前立腺特異的抗原(Henttu and Vihko,
1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910；Israeliら、1993, Cancer Res.
53 :227-230)、黒色腫関連抗原p97(Estinら、1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6): 4
45-446)、黒色腫抗原gp75(Vijayasardahlら、1990, J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380)、
高分子量黒色腫抗原(HMW-MAA)(Nataliら、1987, Cancer 59: 55-63；Mittelmanら、1990,
J. Clin. Invest. 86: 2136-2144)、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原(CEA)(Foonら、
1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294)、多形性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪小球
抗原、結直腸腫瘍関連抗原（例えばCEA、TAG-72(Yokataら、1992, Cancer Res. 52: 3402
-3408)、C017-lA(Ragnhammarら、1993, Int. J.Cancer 53: 751-758)；GICA 19-9(Herlyn
ら、1982, J. Clin. Immunol. 2: 135)、CTA-1およびLEA）、バーキットリンパ腫抗原-38
.13,CD19(Ghetieら、1994, Blood 83: 1329-1336)、ヒトB-リンパ腫抗原-CD20(Reffら、1
994, Blood 83: 435-445)、CD33 (Sgourosら、1993, J. Nucl. Med. 34: 422-430)、黒色
腫特異的抗原（例えばガングリオシドGD2(Salehら、1993, J. Immunol., 151,3390-3398)
、ガングリオシドGD3(Shitaraら、1993, Cancer Immunol. Immunother. 36: 373-380)、
ガングリオシドGM2(Livingstonら、1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044)、ガングリオ
シドGM3(Hoonら、1993, Cancer Res. 53: 5244-5250)）、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原
(TSTA)（例えばDNA腫瘍ウイルスのT抗原およびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を始
めとするウイルス誘発腫瘍抗原など）、腫瘍胎児抗原-アルファフェトプロテイン（例え
ば結腸のCEA）、膀胱腫瘍胎児抗原(Hellstromら、1985, Cancer. Res. 45: 2210-2188)、
分化抗原（例えばヒト肺癌抗原L6、L20(Hellstromら、1986, Cancer Res. 46: 3917- 392
3)）、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjeeら、1988,
J of Immun. 141: 1398-1403)、新生糖タンパク質、スフィンゴリピド、乳癌抗原（例え
ばEGFR(上皮成長因子受容体)）、HER2抗原(pl85HER2)、多形上皮ムチン(PEM)(Hilkensら
、1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17: 359)、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1 (Bernhard
ら、1989, Science 245: 301-304)、分化抗原(Feizi, 1985, Nature 314: 53-57)（例え
ば胎児赤血球および初期内胚葉中のI抗原）、胃腺癌中のI(Ma)、乳房上皮中のM18およびM
39、骨髄細胞中のSSEA-1、結直腸癌中のVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5およびD156-22、TRA-1-
85(血液型H)、結腸腺癌中のC14、肺腺癌中のF3、胃癌中のAH6、胚性癌細胞中のYハプテン
であるLeY、TL5(血液型A)、A431細胞中のEGF受容体、膵癌中のElシリーズ(血液型B)、胚
性癌細胞中のFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中のCO-514 (血液型Lea)、腺癌中のNS-10、CO-43
(血液型Leb)、G49、EGF受容体、結腸腺癌中のMH2(血液型ALeb/Ley)、結腸癌、胃癌ムチン
中の19.9、骨髄細胞中のT5A7、黒色腫中のR24、胚性癌細胞中の4.2、GD3、Dl.1、OFA-1、
GM2、OFA-2、GD2、およびMl:22:25:8、ならびに4〜8細胞胚中のSSEA-3およびSSEA-4。別
の実施形態では、抗原は皮膚T細胞リンパ腫のペプチドに由来するT細胞受容体である(Ede
lson, 1998, The Cancer Journal 4: 62参照)。
本発明の方法および組成物によって治療または予防することができる癌および関連疾患
には、限定するわけではないが、以下が含まれる：白血病（限定するものではないが、急
性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球
性、単球性、赤白血球性白血病、および脊髄形成異常症候群など）、慢性白血病（限定す
るわけではないが、慢性骨髄性(顆粒球)白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白血病な
ど））；真性赤血球増加症；リンパ腫（限定するわけではないが、ホジキン病、非ホジキ
ン病など）;多発骨髄腫（限定するわけではないが、非定型的多発骨髄腫、非分泌性骨髄
腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫など）
；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；特徴未確定の単クローングロブリン血症
；良性単クローングロブリン血症；重鎖病；骨および結合組織肉腫（限定するわけではな
いが、骨部肉腫, 骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊
索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管腫 (血管肉腫)、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫
、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫など）；脳腫瘍（限定する
わけではないが、グリオーマ、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣細胞腫、希突起グリオ
ーマ、非グリア腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、
初発脳リンパ腫など）；乳癌（限定するわけではないが、腺癌、小葉(小細胞)癌、管内癌
、髄様乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、乳頭癌、ページェット病、および炎症性乳癌など）；
副腎癌、（限定するわけではないが、クロム親和性細胞腫および副腎皮質癌など）；甲状
腺癌（限定するわけではないが、乳頭性もしくは小胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未
分化甲状腺癌など）；膵癌、（限定するわけではないが、膵島細胞腫、ガトリノーマ、グ
ルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドもしくは膵島細
胞腫瘍など）；下垂体癌（限定するわけではないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫
瘍、末端肥大症、および尿崩症など）；眼の癌（限定するわけではないが、虹彩黒色腫、
脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫などの眼部黒色腫、および網膜芽腫など）；膣癌（限
定するわけではないが、扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫など）；外陰部癌（限定するわ
けではないが、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびページェット病な
ど）；子宮頚部癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌、および腺癌など）；子宮癌（
限定するわけではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫など）；卵巣癌（限定するわけでは
ないが、卵巣上皮癌、境界性腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質腫瘍など）；食道癌（限定す
るわけではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、
黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、および燕麦細胞(小細胞)癌など）；胃癌（限定するわけで
はないが、腺癌、菌状(ポリープ状)、潰瘍性、表在性、拡散性、悪性リンパ腫、脂肪肉腫
、線維肉腫、および癌肉腫など）；結腸癌；直腸癌；肝癌（限定するわけではないが、肝
細胞癌および肝芽腫など）；胆嚢癌（限定するわけではないが、腺癌など）；胆管癌（限
定するわけではないが、乳頭様、結節性、および拡散性など）；肺癌（限定するわけでは
ないが、非小細胞肺癌、扁平上皮癌(表皮癌)、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌など）；
精巣癌（限定するわけではないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化性、古典的(典型的)、精子
細胞、非精上皮腫、胎児性癌、奇形腫、絨毛癌(卵黄のう腫瘍)など）；前立腺癌（限定す
るわけではないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫など）；陰茎癌；口腔癌（限定
するわけではないが、扁平上皮癌など）；基底癌；唾液腺癌（限定するわけではないが、
腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌など）；咽頭癌（限定するわけではないが、扁平上
皮癌、および疣状癌など）；皮膚癌（限定するわけではないが、基底細胞癌、扁平上皮癌
および黒色腫、表在性黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫など
）；腎癌（限定するわけではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行性細胞癌
(腎骨盤および/または子宮)）；ウィルムス腫瘍；膀胱癌（限定するわけではないが、移
行性細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫など）。さらに、癌は以下を含む：粘液肉腫、骨
原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌
、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌(こうした疾患の総説について
は、以下を参照されたい：Fislunanら、1985, Medicine, 第2版, J. B. Lippincott Co.,
Philadelphia およびMurphyら、1997, Informed Decisions: The Complete Book of Can
cer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A.,Inc
., United States of America)。
従って、本発明の方法および組成物は、(限定するわけではないが)以下を含む多様な癌
またはその他の異常増殖疾患の治療または予防においても有用である：癌（膀胱、乳房、
結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、前立腺、子宮頚部、甲状腺および皮膚の癌を含
む）；扁平上皮癌など；リンパ造血系腫瘍、例えば白血病、急性リンパ性白血病、急性リ
ンパ芽球白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫など；骨髄造血系
腫瘍、例えば急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病など；間葉起源の腫瘍
、例えば線維肉腫および横紋筋肉腫など；その他の腫瘍、例えば黒色腫、精上皮腫、奇形
癌、神経芽腫およびグリオーマなど；中枢および末梢神経系の腫瘍、例えば星状細胞腫、
神経芽腫、グリオーマ、および神経鞘腫など；間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫、横紋筋
肉腫、および骨肉腫など；ならびにその他の腫瘍、例えば黒色腫、色素性乾皮症(、角化
棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺小胞癌および奇形癌など。アポトーシスの異常に起因する癌
も、本発明の方法および組成物によって治療されることが想定されている。こうした癌と
して、限定するわけではないが以下が含まれる：小胞腫、p53突然変異を伴う癌、乳房、
前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに家族性腺腫様ポリープ症および脊髄形
成異常症候群などの前癌性病変。特定の実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮
膚、膵臓または子宮中で、悪性もしくは増殖異常変化(異形成および形成不全など)、また
は過剰増殖疾患を、本発明の方法および組成物によって治療または予防する。別の特定の
実施形態では、肉腫、黒色腫、または白血病を、本発明の方法および組成物によって、治
療または予防する。
特定の実施形態では、本発明の分子(例えば、変異型Fc領域を含む抗体、または本発明
の方法に従って操作した治療用モノクローナル抗体)は、原発腫瘍の増殖または癌性細胞
の転移を、この本発明の分子の非存在下での原発腫瘍の増殖または転移に比較して、少な
くとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくと
も75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%
、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%、ま
たは少なくとも10%、抑制するか減少させる。
5.4.1.1 併用療法
本発明はさらに、限定するわけではないが、現行の標準的および実験的化学療法、ホル
モン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法を含む、癌の治療または予防について当
業者に知られたその他の療法と併用して、本発明の分子を投与することを包含する。いく
つかの実施形態では、本発明の分子を、治療上または予防上有効な量の1種以上の抗癌剤
、治療用抗体(例えば、表6に列挙した抗体)、または癌の治療および/または予防について
当業者に知られたその他の薬剤(セクション5.4.1.2参照)と併用して、投与することがで
きる。
いくつかの実施形態では、1種以上の本発明の分子を、癌の治療に有用なその他の1種以
上の治療薬と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。「同時に」なる用語は、予
防または治療薬の正確な同時投与に限定するものではなく、むしろ本発明の分子およびそ
の他の薬剤を哺乳動物に順次または一定の時間間隔以内に投与して、本発明の分子がその
他の薬剤と同時に作用して、これらを別の方法で投与した場合よりも増大した利益を提供
するようにしたものを意味する。例えば、予防または治療用(例えば、化学療法、放射線
療法、ホルモン療法または生物学的療法)薬のそれぞれを、同時に、または任意の順序で
順次、別の時点で投与することができる。しかし、同時に投与しない場合は、所望の治療
または予防効果が提供されるように、時間的に十分近接させて投与すべきである。各治療
薬は、任意の適切な形態で、かつ任意の好適な経路で、別々に投与することができる。種
々の実施形態では、予防または治療薬を以下のように投与する：1時間未満の間隔、約1時
間間隔、約1時間〜約2時間間隔、約2時間〜約3時間間隔、約3時間〜約4時間間隔、約4時
間〜約5時間間隔、約5時間〜約6時間間隔、約6時間〜約7時間間隔、約7時間〜約8時間間
隔、約8時間〜約9時間間隔、約9時間〜約10時間間隔、約10時間〜約11時間間隔、約11時
間〜約12時間間隔、24時間間隔以下または48時間間隔以下。好ましい実施形態では、2以
上の成分を患者の同一来診時に投与する。
別の実施形態では、予防または治療薬を、約2〜4日間隔、約4〜6日間隔、約1週間間隔
、約1〜2週間間隔、2週間以上の間隔で、投与する。好ましい実施形態では、予防または
治療薬を、両方の薬剤が依然活性である時間枠内に、投与する。当業者ならば、投与する
薬剤の半減期を測定することによって、こうした時間を決定することができるはずである
。
ある実施形態では、本発明の予防または治療薬を、被験体に周期的に投与する。周期治
療には、第1薬剤をある期間投与した後、第2薬剤および/または第3薬剤をある期間投与し
、この順次投与を反復することを含む。周期治療は、1種以上の療法に対する耐性の進行
を減少させ、療法の1つの副作用を回避するかまたは減少させ、かつ/あるいは治療の効力
を向上させることができる。
ある実施形態では、予防または治療薬を、約3週間未満、約2週間毎に1回、約10日毎に1
回、または約1週間毎に1回、の周期で投与する。1周期には、周期毎に約90分間、周期毎
に約1時間、周期毎に約45分間かけて注入することによる、治療または予防薬の投与が含
まれる。各周期は少なくとも1週間の休止、少なくとも2週間の休止、少なくとも3週間の
休止期を含む。投与の周期の回数は約1〜約12周期、より典型的には約2〜約10周期、より
典型的には約2〜約8周期である。
さらに別の実施形態では、本発明の治療および予防薬を、メトロノーム的投薬方式で、
長期の休止期間を置かずに、連続注入または頻繁投与のいずれかによって、投与する。こ
うしたメトロノーム的投与には、休止期間のない、一定の間隔での投薬が含まれうる。典
型的には、治療薬、特に細胞傷害薬を低用量で使用する。こうした投薬方式には、長期間
の比較的低用量の連日投与が含まれる。好ましい実施形態では、低用量の使用は、毒性副
作用を最少にし、休止期間を排除することができる。ある実施形態では、治療および予防
薬は、以下の範囲で、連日低用量投与または連続注入によって、送達される：約24時間〜
約2日、〜約1週間、〜約2週間、〜約3週間、〜約1ヶ月、〜約2ヶ月、〜約3ヶ月、〜約4ヶ
月、〜約5ヶ月、〜約6ヶ月。こうした投薬方式のスケジュールは腫瘍専門家が最適化する
ことができる。
別の実施形態では、複数の治療方針を、1の哺乳動物に同時に適用する。すなわち、個
々の用量の治療薬を別々に投与するけれども、本発明の分子が別の薬剤または薬剤群と協
同して作用できる時間間隔内になるようにする。例えば、1成分を1週間に1回投与し、そ
れと組み合わせて、別の成分は2週間毎に1回、または3週間毎に1回投与してもよい。言い
換えれば、治療薬を同時にまたは患者の同一来診時に投与しなくても、治療薬の複数の投
与方式を同時に実行する。
その他の予防および/または治療薬と併用する場合、本発明の分子ならびにその他の予
防および/または治療薬は相加的に、あるいはより好ましくは、相乗的に作用することが
できる。1つの実施形態では、本発明の分子を1以上の治療薬とともに同一の医薬組成物中
で同時に投与する。別の実施形態では、本発明の分子を1以上の治療薬とともに別の医薬
組成物中で同時に投与する。さらに別の実施形態では、本発明の分子を、その他の予防ま
たは治療薬の投与前、またはその後に投与する。本発明は、同一または異なる投与経路、
例えば経口および腸管外で、本発明の分子をその他の予防または治療薬と併用して投与す
ることを想定している。ある実施形態では、本発明の分子を、限定するわけではないが、
毒性などの有害副作用をもたらす可能性があるその他の予防または治療薬と同時に投与す
る場合、その予防または治療薬を、有害副作用が誘発される閾値より低い用量で投与する
のが有益である。
本明細書で提供する投薬量および投与頻度には、「治療上有効な」および「予防上有効
な」の意味が包含されている。投薬量および頻度はさらに、典型的には各患者に特異的な
要因に従って、投与する特定の治療または予防薬、癌の重篤度およびタイプ、投与経路、
ならびに患者の年齢、体重、応答度、および過去の病歴に応じて、変更されるべきもので
ある。好適な方式は、こうした要因を考慮し、例えば文献に報告され、また以下で推奨さ
れている投薬量にしたがうことによって、当業者が選択し得るものである：Physician's
Desk Reference (第56版, 2002)。
5.4.1.2 その他の治療/予防薬
特定の実施形態では、本発明の方法は、1以上の本発明の分子と、癌の治療および/また
は予防のために使用される1以上の治療薬との投与を包含する。1つの実施形態では、血管
形成阻害薬を本発明の分子と併用して投与することができる。本発明の方法および組成物
中で使用することができる血管形成阻害薬として、限定するわけではないが以下が含まれ
る：アンギオスタチン(Angiostatin)(プラスミノーゲン断片)；抗血管形成抗トロンビンI
II；アンギオザイム(Angiozyme)；ABT-627；Bay 12-9566；ベネフィン(Benefin)；ベバシ
ズマブ(Bevacizumab)；BMS- 275291；軟骨由来阻害薬(CDI)；CAI；CD59 補体断片；CEP-7
055；Col 3；コンブレタスタチン(Combretastatin)A-4；エンドスタチン(Endostatin)(コ
ラーゲンXVIII断片)；フィブロネクチン(Fibronectin)断片；グロベータ(Gro-beta)；ハ
ロフギノン(Halofuginone)；ヘパリナーゼ類；ヘパリン6サッカライド断片；HMV833；ヒ
ト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)；IM-862；インターフェロンアルファ/ベータ/ガンマ；イ
ンターフェロン誘導性タンパク質 (IP-10)；インターロイキン-12；クリングル(Kringle)
5(プラスミノーゲン断片)；マリマスタット(Marimastat)；金属プロテイナーゼ阻害薬(TI
MPs)；2-メトキシエストラジオール；MMI 270(CGS 27023A)；MoAbIMC-1C11；ネオバスタ
ット(Neovastat)；NM-3；パンゼム(Panzem)-S；テトラチオモリブダート；サリドマイド
；トロンボスポンジン-1(TSP-1)；TNP-470；トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-
b)；バスキュロスタチン(Vasculostatin)；バソスタチン(Vasostatin)(カルレチキュリン
断片)；ZD6126；ZD 6474；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬(FTI)；およびビスホ
スホナート類。
本発明の医薬組成物および投与剤形ならびにキットを含む、本発明の各種の実施形態中
で本発明の分子と併用して使用することができる抗癌薬として、限定するわけではないが
以下が含まれる：アシビシン(acivicin)；アクラルビシン(aclarubicin)；塩酸アコダゾ
ール(acodazole)；アクロニン(acronine)；アドゼレシン(adozelesin)；アルデスロイキ
ン(aldesleukin)；アルトレタミン(altretamine)；アンボマイシン(ambomycin)；酢酸ア
メタントロン(ametantrone)；アミノグルテチミド(aminoglutethimide)；アンサクリン(a
msacrine)；アナストロゾール(anastrozole)；アントラマイシン(anthramycin)；アスパ
ラギナーゼ；アスペルリン(asperlin)；アザシチジン(azacitidine)；アゼテパ(azetepa)
；アゾトマイシン(azotomycin)；バチマスタット(batimastat)；ベンゾデパ(benzodepa)
；ビカルタミド(bicalutamide)；塩酸ビサントレン(bisantrene)；ジメシル酸ビスナフィ
ド(bisnafide)；ビゼレシン(bizelesin)；硫酸ブレオマイシン(bleomycin)；ナトリウム
ブレキナル(brequinar)；ブロピリミン(bropirimine)；ブスルファン(busulfan)；カクチ
ノマイシン(cactinomycin)；カルステロン(calusterone)；カラセミド(caracemide)；カ
ルベチメル(carbetimer)；カルボプラチン(carboplatin);カルムスチン(carmustine) ；
塩酸カルビシン(carubicin)；カルゼレシン(carzelesin)；セデフィンゴル(cedefingol)
；クロランブシル(chlorambucil)；シロレマイシン(cirolemycin)；シスプラチン(cispla
tin)；クラドリビン(cladribine)；メシル酸クリスナトル(crisnatol)；シクロホスファ
ミド；シタラビン(cytarabine)；ダカルバジン(dacarbazine)；ダクチノマイシン(dactin
omycin)；塩酸ダウノルビシン(daunorubicin)；デシタビン(decitabine)；デキソルマプ
ラチン(dexormaplatin)；デザグアニン(dezaguanine)；メシル酸デザグアニン(dezaguani
ne)；ジアジクオン(diaziquone)；ドセタキセル(docetaxel)；ドキソルビシン(doxorubic
in)；塩酸ドキソルビシン(doxorubicin)；ドロロキシフェン(droloxifene)；クエン酸ド
ロロキシフェン(droloxifene)；プロピオン酸ドロモスタノロン(dromostanolone)；ジュ
アゾマイシン(duazomycin)；エダトレキサート(edatrexate)；塩酸エフロルニチン(eflor
nithine)；エルサミトルシン(elsamitrucin)；エンドプラチン(enloplatin)；エンプロマ
ート(enpromate)；エピプロピジン(epipropidine)；塩酸エピルビシン(epirubicin)；エ
ルブロゾール(erbulozole)；塩酸エソルビシン(esorubicin)；エストラムスチン(estramu
stine)；リン酸エストラムスチン(estramustine)ナトリウム；エタニダゾール(etanidazo
le)；エトポシド(etoposide)；リン酸エトポシド(etoposide)；エトプリン(etoprine)；
塩酸ファドロゾール(fadrozole)；ファザラビン(fazarabine)；フェンレチニド(fenretin
ide)；フロキシウリジン(floxuridine)；リン酸フルダラビン(fludarabine)；アルオロウ
ラシル；フルロシタビン(flurocitabine)；フォスキドン(fosquidone)；ナトリウムフォ
ストリエシン(fostriecin)；ゲムシタビン(gemcitabine)；塩酸ゲムシタビン(gemcitabin
e)；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン(idarubicin)；イフォスファミド(ifosfamide)
；イルモフォシン(ilmofosine)；インターロイキンII(組換えインターロイキンII、また
はrIL2を含む)、インターフェロンアルファ-2a；インターフェロンアルファ-2b；インタ
ーフェロンアルファ-nl；インターフェロンアルファ-n3；インターフェロンベータ-Ia；
インターフェロンガンマ-Ib；イプロプラチン(iproplatin)；塩酸イリノテカン(irinotec
an)；酢酸ランレオチド(lanreotide)；レトロゾール(letrozole)；酢酸ロイプロリド(leu
prolide)；塩酸リアロゾール(liarozole)；ロメトレキソル(lometrexol)ナトリウム；ロ
ムスチン(lomustine)；塩酸ロソキサントロン(losoxantrone)；マソプロコル(masoprocol
)；メイタンシン(maytansine)；塩酸メクロレタミン(mechlorethamine)；酢酸メゲストロ
ル(megestrol)；酢酸メレンゲストロル(melengestrol)；メルファラン(melphalan)；メノ
ガリル(menogaril)；メルカプトプリン ；メトトレキサート；ナトリウムメトトレキサー
ト；メトプリン(metoprine)；メツレデパ(meturedepa)；ミチンドミド(mitindomide)；ミ
トカルシン(mitocarcin)；ミトクロミン(mitocromin)；ミトギリン(mitogillin)；ミトマ
ルシン(mitomalcin)；マイトマイシン；ミトスペル(mitosper)；ミトタン(mitotane)；塩
酸ミトキサントロン(mitoxantrone)；ミコフェノール酸(mycophenolic acid)；ノコダゾ
ール(nocodazole)；ノガラマイシン(nogalamycin)；オルマプラチン(ormaplatin)；オキ
シスラン(oxisuran)；パクリタキセル(paclitaxel)；ペガスパルガーゼ(pegaspargase)；
ペリオマイシン(peliomycin)；ペンタムスチン(pentamustine)；硫酸ペプロマイシン(pep
lomycin)；ペルホスファミド(perfosfamide)；ピポブロマン(pipobroman)；ピポスルファ
ン(piposulfan)；塩酸ピロキサントロン(piroxantrone)；プリカマイシン(plicamycin)；
プロメスタン(plomestane)；ポルフィマー(porfimer)ナトリウム；ポルフィロマイシン(p
orfiromycin)；プレドニムスチン(prednimustine)；塩酸プロカルバジン(procarbazine)
；ピューロマイシン(puromycin)；塩酸ピューロマイシン(puromycin)；ピラゾフリン(pyr
azofurin)；リボプリン(riboprine)；ログレチミド(rogletimide)；サフィンゴル(safing
ol)；塩酸サフィンゴル(safingol)；セムスチン(semustine)；シントラゼン(simtrazene)
；ナトリウムスパルフォサート(sparfosate)；スパルソマイシン(sparsomycin)；塩酸ス
ピロゲルマニウム(spirogermanium)；スピロムスチン(spiromustine)；スピロプラチン(s
piroplatin)；ストレプトニグリン(streptonigrin)；ストレプトゾシン(streptozocin)；
スロフェヌル(sulofenur)；タリソマイシン(talisomycin);テコガラン(tecogalan) ナト
リウム；テガフル(tegafur)；塩酸テロキサントロン(teloxantrone)；テモポルフィン(te
moporfin)；テニポシド(teniposide)；テロキシロン(teroxirone)；テストラクトン(test
olactone)；チアミプリン(thiamiprine)；チオグアニン(thioguanine)；チオテパ(thiote
pa)；チアゾフリン(tiazofurin)；チラパザミン(tirapazamine)；クエン酸トレミフェン(
toremifene)；酢酸トレストロン(trestolone)；リン酸トリシリビン(triciribine)；トリ
メトレキサート(trimetrexate)；グルクロン酸トリメトレキサート(trimetrexate)；トリ
プトレリン(triptorelin)；塩酸ツブロゾール(tubulozole)；ウラシルマスタード(uracil
mustard)；ウレデパ(uredepa)；バプレオチド(vapreotide)；ベルテポルフィン(vertepo
rfin)；硫酸ビンブラスチン(vinblastine)；硫酸ビンクリスチン(vincristine)；ビンデ
シン(vindesine)；硫酸ビンデシン(vindesine)；硫酸ビンエピジン(vinepidine)；硫酸ビ
ングリシナート(vinglycinate)；硫酸ビンレウロシン(vinleurosine)；酒石酸ビノレルビ
ン(vinorelbine)；硫酸ビンロシジン(vinrosidine)；硫酸ビンゾリジン(vinzolidine)；
ボロゾール(vorozole)；ゼニプラチン(zeniplatin)；ジノスタチン(zinostatin)；塩酸ゾ
ルビシン(zorubicin)。その他の抗癌薬として、限定するわけではないが、以下が含まれ
る:20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3 ；5-エチニルウラシル；アビラテロン(abirate
rone)；アクラルビシン(aclarubicin)；アシルフルベン(acylfulvene)；アデシペノル(ad
ecypenol)；アドゼレシン(adozelesin)；アルデスロイキン(aldesleukin)；ALL-TK拮抗薬
；アルトレタミン；アンバムスチン(ambamustine)；アミドックス(amidox)；アミフォス
チン(amifostine)；アミノレブリン酸；アンルビシン(amrubicin)；アンサクリン(amsacr
ine)；アナグレリド(anagrelide)；アナストロゾール(anastrozole)；アンドログラホリ
ド(andrographolide)；血管形成阻害薬；拮抗薬D；拮抗薬G；アンタレリクス(antarelix)
；抗背方化形態発生タンパク質-1 ；抗アンドロゲン前立腺癌；抗エストロゲン；抗ネオ
プラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィジコリン(aphidicolin
)；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；ア
ラ-CDP-DL-PTBA；アルギニンデアミナーゼ；アシュラクリン(asulacrine)；アタメスタン
(atamestane)；アトリムスチン(atrimustine)；アキシナスタチン(axinastatin)1；アキ
シナスタチン2 ；アキシナスタチン3 ；アザセトロン(azasetron)；アザトキシン(azatox
in)；アザチロシン(azatyrosine)；バッカチンIII誘導体；バラノル(balanol)；バチマス
タット(batimastat)；BCR/ABL拮抗薬；ベンゾクロリン類；ベンゾイルスタウロスポリン(
benzoylstaurosporine)；ベータラクタム誘導体；ベータアレチン(beta-alethine)；ベー
タクラマイシン(betaclamycin)B；ベチュリン酸；bFGF阻害薬；ビカルタミド(bicalutami
de)；ビサントレン(bisantrene)；ビサジリジニルスペルミン(bisaziridinylspermine)；
ビスナフィド(bisnafide)；ビストラテン(bistratene)A；ビゼレシン(bizelesin)；ブレ
フラート(breflate)；ブロピリミン(bropirimine)；ブドチタン(budotitane)；ブチオニ
ンスルホキシイミン(buthionine sulfoximine)；カルシポトリオル(calcipotriol)；カル
ホスチン(calphostin)C；カンプトテシン(camptothecin)誘導体；カナリポクス(canarypo
x)IL-2；カペシタビン(capecitabine)；カルボキサミド-アミノ-トリアゾール；カルボキ
シアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；軟骨由来阻害薬；カルゼレシン(carzeles
in)；カゼインキナーゼ阻害薬(ICOS)；カスタノスペルミン(castanospermine)；セクロピ
ン(cecropin)B；セトロレリクス(cetrorelix)；クロルン(chlorlns)；クロロキノキサリ
ンスルホンアミド;シカプロスト(cicaprost)；シスポルフィリン；クラドリビン(cladrib
ine)；クロミフェン(clomifene)類似体；クロトリマゾール(clotrimazole)；コリスマイ
シン(collismycin)A；コリスマイシンB；コンブレタスタチン(combretastatin)A4；コン
ブレタスタチン類似体；コナゲニン(conagenin)；クランベシジン(crambescidin)816；ク
リスナトル(crisnatol)；クリプトフィシン(cryptophycin)8；クリプトフィシンA誘導体
；キュラシン(curacin)A；シクロペンタアントラキノン類；シクロプラタム(cycloplatam
)；シペマイシン(cypemycin)；シタラビンオクホスファート(cytarabineocfosfate)；細
胞溶解因子；シトスタチン(cytostatin)；ダクリキシマブ(dacliximab)；デシタビン(dec
itabine)；デヒドロジデムニン(dehydrodidemnin)B；デスロレリン(deslorelin)；デキサ
メタゾン(dexamethasone)；デキシホスファミド(dexifosfamide)；デクスラゾキサン(dex
razoxane)；デクスベラパミル(dexverapamil)；ジアジクオン(diaziquone)；ジデミン(di
demnin)B ；ジドクス(didox)；ジエチルノルスペニン(diethylnorspennine)；ジヒドロ-5
-アザシチジン；ジヒドロタキソール,9- ；ジオキサマイシン(dioxamycin)；ジフェニル
スピロムスチン(diphenyl spiromustine)；ドセタキセル(docetaxel)；ドコサノル(docos
anol)；ドラセトロン(dolasetron)；ドキシフルリジン(doxifluridine)；ドロロキシフェ
ン(droloxifene)；ドロナビノル(dronabinol)；ジュオカルマイシン(duocarmycin)SA；エ
ブセレン(ebselen)；エコムスチン(ecomustine)；エデルフォシン(edelfosine)；エドレ
コロマブ(edrecolomab)；エフロルニチン(eflornithine)；エレメン(elemene)；エミテフ
ル(emitefur)；エピルビシン(epirubicin)；エプリステリド(epristeride)；エストラム
スチン(estramustine)類似体；エストロゲン作動薬；エストロゲン拮抗薬；エタニダゾー
ル(etanidazole)；リン酸エトポシド(etoposide)；エキセメスタン(exemestane)；ファド
ロゾール(fadrozole);ファザラビン(fazarabine)；フェンレチニド(fenretinide)；フィ
ルグラスチム(filgrastim)；フィナステリド(finasteride)；フラボピリドル(flavopirid
ol)；フレゼラスチン(flezelastine)；フルアステロン(fluasterone)；フルダラビン(flu
darabine) ；塩酸フルロダウノルニシン(fluorodaunorunicin)；ホルフェニメクス(forfe
nimex)；ホルメスタン(formestane)；ホストリエシン(fostriecin)；ホテムスチン(fotem
ustine)；テキサフィリンガドリニウム(gadoliniu
m texaphyrin)；硝酸ガリウム；ガロシタビン(galocitabine)；ガニレリクス(ganirelix)
；ゲラチナーゼ阻害薬；ゲムシタビン(gemcitabine)；グルタチオン阻害薬；ヘプスルフ
ァム(hepsulfam)；ヘレグリン(heregulin)；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ハイペリ
シン(hypericin)；イバンドロン酸；イダルビシン(idarubicin)；イドキシフェン(idoxif
ene)；イドラマントン(idramantone)；イルモフォシン(ilmofosine)；イロマスタット(il
omastat)；イミダゾアクリドン類；イミキモド(imiquimod)；免疫刺激ペプチド類；イン
スリン様成長因子-1受容体阻害薬；インターフェロン作動薬；インターフェロン類；イン
ターロイキン類；イオベングアン(iobenguane)；ヨードドキソルビシン(iododoxorubicin
)；イポメアノル(ipomeanol),4-；イロプラクト(iroplact)；イルソグラジン(irsogladin
e)；イソベンガゾール(isobengazole)；イソホモハリコンドリン(isohomohalicondrin)B
；イタセトロン(itasetron)；ジャスプラキノリド(jasplakinolide)；カハラリド(kahala
lide)F；3酢酸ラメラリン(lamellarin)-N；ランレオチド(lanreotide)；レイナマイシン(
leinamycin)；レノグラスチム(lenograstim)；硫酸レンチナン(lentinan)；レプトルスタ
チン(leptolstatin)；レトロゾール(letrozole)；白血病抑制因子；白血球アルファイン
ターフェロン；ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステロン；ロイプロレリン(leuprorel
in)；レバミソール(levamisole)；リアロゾール(liarozole)；線状ポリアミン類似体；親
油性ジサッカライドペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド(lissoclinamide)7；
ロバプラチン(lobaplatin)；ロンブリシン(lombricine)；ロメトレキソル(lometrexol)；
ロニダミン(lonidamine)；ロソキサントロン(losoxantrone)；ロバスタチン(lovastatin)
；ロキソリビン(loxoribine)；ルルトテカン(lurtotecan);テキサフィリンルテチウム(lu
tetium texaphyrin)；リソフィリン(lysofylline) ；溶解性ペプチド類；マイタンシン(m
aitansine)；マンノスタチン(mannostatin)A；マリマスタット(marimastat)；マソプロコ
ル(masoprocol)；マスピン(maspin)；マトリリシン(matrilysin)阻害薬；マトリックス金
属プロテイナーゼ阻害薬；メノガリル(menogaril)；メルバロン(merbarone)；メテレリン
(meterelin)；メチオニナーゼ；メトクロプラミド(metoclopramide)；MIF阻害薬；ミフェ
プリストン(mifepristone)；ミルテホシン(miltefosine)；ミリモスチム(mirimostim)；
ミスマッチ二本鎖RNA；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトラクトル(mitolactol)；マイト
マイシン類似体；ミトナフィド(mitonafide)；マイトトキシン線維芽成長因子-サポリン(
saporin)；ミトキサントロン(mitoxantrone)；モファロテン(mofarotene)；モルグラモス
チム(molgramostim)；モノクローナル抗体、ヒト絨毛ゴナドトロフィン；モノホスホリル
リピドA+ミオバクテリウム細胞壁sk；モピダモル(mopidamol)；多重薬剤耐性遺伝子阻害
薬；多発性腫瘍抑制因子1-に基づく薬剤；マスタード抗癌薬；マイカペルオキシドB；マ
イコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン(myriaporone)；N-アセチルジナリン(acetyl
dinaline)；N-置換ベンズアミド類；ナファレリン(nafarelin)；ナグレスチップ(nagrest
ip)；ナロキソン(naloxone)+ペンタゾシン(pentazocine)；ナパビン(napavin)；ナフテル
ピン(naphterpin)；ナルトグラスチム(nartograstim)；ネダプラチン(nedaplatin)；ネモ
ルビシン(nemorubicin)；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド(nilutami
de)；ニサマイシン(nisamycin)；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド抗酸化剤；ニ
トルリン(nitrullyn)；06-ベンジルグアニン；オクトレオチド(octreotide)；オキセノン
(okicenone)；オリゴヌクレオチド類；オナプリストン(onapristone)；オンダンセトロン
(ondansetron)；オンダンセトロン(ondansetron)；オラシン(oracin)；経口サイトカイン
誘導薬；オルマプラチン(ormaplatin)；オサテロン(osaterone)；オキサリプラチン(oxal
iplatin)；オキサウノマイシン(oxaunomycin)；パクリタキセル(paclitaxel)；パクリタ
キセル類似体；パクリタキセル誘導体類 ；パラウアミン(palauamine)；パルミトイルリ
ゾキシン(palmitoylrhizoxin)；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン(pano
mifene)；パラバクチン(parabactin)；パゼリプチン(pazelliptine)；ぺグアスパルガー
ゼ(pegaspargase)；ペルデシン(peldesine)；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントス
タチン(pentostatin)；ペントロゾール(pentrozole)；パーフルブロン(perflubron)；パ
ーホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン(phenazinomycin)；酢酸フェ
ニル；リン酸塩阻害薬；ピシバニル(picibanil)；塩酸ピロカルピン(pilocarpine)；ピラ
ルビシン(pirarubicin)；ピリトレキシム(piritrexim)；プラセチン(placetin)A；プラセ
チンB；プラスミノーゲン活性化因子阻害薬；白金複合体；白金化合物；白金-トリアミン
複合体；ポルフィマー(porfimer)ナトリウム；ポルフィロマイシン(porfiromycin)；プレ
ドニゾン(prednisone)；プロピルビスアクリドン；プロスタグランジンJ2；プロテアソー
ム阻害薬；タンパク質Aに基づく免疫モジュレーター；タンパク質キナーゼC阻害薬；タン
パク質キナーゼC阻害薬、ミクロアルガル(microalgal)；タンパク質チロシンホスファタ
ーゼ阻害薬；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害薬；プルプリン類；ピラゾロアクリ
ジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；raf拮抗薬；ラ
ルチトレキセド(raltitrexed)；ラモセトロン(ramosetron)；rasファルネシルタンパク質
トランスフェラーゼ阻害薬；ras阻害薬；ras-GAP阻害薬；脱メチル化レテリプチン(retel
liptine)；レニウムRe186エチドロナート；リゾキシン(rhizoxin)；リボザイム類；RIIレ
チナミド(retinamide)；ログレチミド(rogletimide)；ロヒツキン(rohitukine)；ロムル
チド(romurtide)；ロキニメクス(roquinimex)；ルビギノン(rubiginone)Bl；ルボキシル(
ruboxyl)；サフィンゴル(safingol)；サイントピン(saintopin)；SarCNU；サルコフィト
ル(sarcophytol)A；サルグラモスチン(sargramostim)；Sdi 1模倣体；セムスチン(semust
ine)；セネセンス誘導阻害薬1；センスオリゴヌクレオチド類；シグナル導入阻害薬；シ
グナル導入モジュレーター；一本鎖抗原結合性タンパク質；シゾフィラン(sizofiran)；
ソブゾキサン(sobuzoxane)；ボロカプト酸ナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベ
ロル(solverol)；ソマトメジン結合性タンパク質；ソネルミン(sonermin)；スパルホジン
酸(sparfosic acid)；スピカマイシンD；スピロムスチン(spiromustine)；スプレノペン
チン(splenopentin)；スポンギスタチン(spongistatin)1；スクアラミン；幹細胞阻害薬
；幹細胞分割阻害薬；スチピアミド(stipiamide)；ストロメリシン(stromelysin)阻害薬
；スルフィノシン(sulfinosine)；高作用性血管作用性腸内ペプチド拮抗薬；スラジスタ(
suradista)；スラミン(suramin)；スウェインソニン(swainsonine)；合成グリコサミンオ
グリカン；タリムスチン(tallimustine)；タモキシフェンメチオジド(tamoxifen methiod
ide)；タウロムスチン(tauromustine)；タザロテン(tazarotene);塩化テコガラン(tecoga
lan)；テガフル(tegafur)；テルラピリリウム(tellurapyrylium)；テロメラーゼ阻害薬;
テモポルフィン(temoporfin)；テモゾロミド(temozolomide)；テニポシド(teniposide)；
テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン(tetrazomine)；タリブラスチン(thaliblastin
e)；チオコラリン(thiocoraline)；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマル
ファシン(thymalfasin)；チモポエチン(thymopoietin)受容体作動薬；チモトリナン(thym
otrinan) ；甲状腺刺激ホルモン；チエニルエチオプルプリン；2塩化チタノセン；トプセ
ンチン(topsentin)；トレミフェン(toremifene)；全能性幹細胞因子；翻訳阻害薬；トレ
チノイン(tretinoin)；トリアセチルウリジン；トリシリビン(triciribine)；トリメトレ
キサート；トリプトレリン(triptorelin)；トロピセトロン(tropisetron)；ツロステリド
(turosteride)；チロシンキナーゼ阻害薬；チルホスチン類；UBC阻害薬；ウベニメクス(u
benimex)；尿生殖洞由来成長抑制因子；ウロキナーゼ受容体拮抗薬；バプレオチド(vapre
otide)；バリオリン(variolin)B；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療薬；ベラレソル(
velaresol)；ベラミン(veramine)；ベルジン類；ベルテポルフィン(verteporfin)；ビノ
レルビン(vinorelbine)；ビンキサルチン(vinxaltine)；ビタキシン(vitaxin)；ボロゾー
ル(vorozole)；ザノテロン(zanoterone)；ゼニプラチン(zeniplatin)；ジラスコルブ(zil
ascorb)；およびジノスタチンスチマラマー(zinostatin stimalamer)。好ましいその他の
抗癌薬は5-フルオロウラシルおよびロイコボリン(leucovorin)である。
本発明の方法で使用することができる治療用抗体の例として、限定するわけではないが
、以下が含まれる：ZENAPAXS(daclizumab)(Roche Pharmaceuticals, Switzerland)(急性
腎同種移植片拒絶反応の予防用の、免疫抑制性ヒト化抗CD25モノクローナル抗体)；PANOR
EXTM(マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体)(Glaxo Wellcome/Centocor)；BEC2(マウス抗
イディオタイプ(GD3エピトープ)IgG抗体)(ImClone System)；IMC-C225(キメラ抗EGFR IgG
抗体)(Clone System)；VITAXBSFM(ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体)(Applied Molecular
Evolution/MedImmune)；SmartM195(ヒト化抗CD33 IgG抗体)(Protein Design Lab/Kanebo
)；LYMPHOCIDETM(ヒト化抗CD22 IgG抗体)(Immunomedics)；ICM3(ヒト化抗ICAM3抗体(ICOS
Phann)；IDEC-114(霊長類化抗CD80抗体)(IDECPharm/Mitsubishi)；IDEC-131(ヒト化抗CD
40L抗体)(IDEC/Eisai)；IDEC-151(霊長類化抗CD4抗体)(IDEC);IDEC-152(霊長類化抗CD23
抗体)(IDEC/Seikagaku)；SMART抗CD3(ヒト化抗CD3 IgG)(Protein Design Lab)；5G1.1(ヒ
ト化抗補体因子5(C5)抗体)(Alexion Pharm)；D2E7(ヒト化抗TNF-α抗体)(CAT/BASF)；CDP
870(ヒト化抗TNF-αFab断片)(Celltech)；IDEC-151(霊長類化抗CD4 IgGl抗体)(IDECPharm
/SmithKline Beecham)；MDX-CD4(ヒト抗CD4 IgG抗体)(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571(
ヒト化抗TNF-αIgG4抗体)(Celltech)；LDP-02(ヒト化抗α4β7抗体)(LeukoSite/Genentec
h)；OrthoClone OKT4A(ヒト化抗CD4 IgG抗体)(Ortho Biotech)；ANTOVATM(ヒト化抗CD40L
IgG抗体)(Biogen)；ANTEGRENTM(ヒト化抗 VLA-4 IgG抗体)(Elan)；およびCAT-152(ヒト
抗TGF-β2抗体)(Cambridge Ab Tech)。本発明に従って使用することができる治療用抗体
のその他の例を表6に示す。
5.4.2 自己免疫疾患および炎症性疾患
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、変異型Fc領域を含み、1以上の領域内に1以
上のアミノ酸改変を有し、該改変は該変異型Fc領域の、FcγRIIBに対する親和性を増大さ
せるが、該変異型Fc領域の、FcγRIIIAおよび／またはFcγRIIAに対する親和性を減少さ
せる。そのような結合特性を有する本発明の分子は、例えば自己免疫疾患または炎症性疾
患に関連する免疫反応の阻害のような、免疫反応の制御において有用である。いかなる作
用機構にもとらわれることを意図するものではないが、FcγRIIBに対する増大した親和性
および、FcγRIIIAおよび／またはFcγRIIAに対する減少した親和性を有する本発明の分
子は、FcγRの活性化反応を鈍らせ、かつ細胞の反応性の阻害につながる可能性がある。
いくつかの実施形態では、変異型Fc領域を含む本発明の分子は、免疫グロブリンではな
く、少なくとも1つのアミノ酸改変を含み、該改変は、野生型Fc領域を含む分子と比較し
て、該変異型Fc領域の、FcγRIIBに対する親和性を増大させるものである。他の実施形態
では、該分子はさらに1以上のアミノ酸改変を含み、該改変は活性化FcγRへの当該分子の
親和性を減少させるものである。いくつかの実施形態では、該分子は可溶性（すなわち、
膜結合型でない）Fc領域である。本発明は、該可溶性Fc領域内の他のアミノ酸改変を意図
するものであり、該改変は、本明細書中に記載されているような、当業者に公知のものを
含む、種々のFc受容体に対する該領域の親和性をモジュレートするものである。他の実施
形態では、該分子（例えば、1以上のアミノ酸改変を含むFc領域）は、当業者に公知の技
術を用いて、本明細書に記載されているように改変され、それにより、当該Fc領域のin v
ivoでの半減期が延びる。そのような分子は、自己免疫障害の治療および／または阻止に
おいて、治療上の有用性を有する。いかなる作用機構にもとらわれることを意図するもの
ではないが、FcγRIIBに対する増大した親和性を有するそのような分子は、受容体の活性
化を鈍らせ、従って免疫反応を鈍らせることにつながり、自己免疫障害の治療および／ま
たは予防において、治療上の有効性を有する。
ある実施形態では、変異型Fc領域のFcγRIIBに対する親和性を増大させ、一方で、変異
型Fc領域のFcγRIIIAに対する親和性を減少させる1以上のアミノ酸改変は、以下の改変を
含む：246位でのトレオニンへの置換および396位でのヒスチジンへの置換；または268位
でのアスパラギン酸への置換および318位でのアスパラギン酸への置換；または217位での
セリンへの置換、378位でのバリンへの置換、および408位でのアルギニンへの置換；また
は375位でのシステインへの置換および396位でのロイシンへの置換；または246位でのイ
ソロイシンへの置換および334位でのアスパラギンへの置換。1つの実施形態では、変異型
Fc領域のFcγRIIBに対する親和性を増大させ、一方で、変異型Fc領域のFcγRIIIAに対す
る親和性を減少させる1以上のアミノ酸改変は、247位でのロイシンへの置換を含む。他の
実施形態では、変異型Fc領域のFcγRIIBに対する親和性を増大させ、一方で、変異型Fc領
域のFcγRIIIAに対する親和性を減少させる1以上のアミノ酸改変は、372位でのチロシン
への置換を含む。また別の実施形態では、変異型Fc領域のFcγRIIBに対する親和性を増大
させ、一方で、変異型Fc領域のFcγRIIIAに対する親和性を減少させる1以上のアミノ酸改
変は、326位でのグルタミン酸への置換を含む。1つの実施形態では、変異型Fc領域のFcγ
RIIBに対する親和性を増加させ、一方で、変異型Fc領域のFcγRIIIAに対する親和性を減
少させる1以上のアミノ酸改変は、224位でのロイシンへの置換を含む。
野生型Fc領域を有する対応する分子に比べて、FcγRIIBに対する増大した親和性および
、FcγRIIIAおよび／またはFcγRIIAに対する減少した親和性を有する変異型Fc領域は、
自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する、または予防するのに用いられてもよい。本発
明は、被験体の、自己免疫障害または炎症性障害に関する1以上の症状を防ぐ、治療する
、または管理する方法を提供し、該方法は、野生型Fc領域を有する対応する分子に比べて
、FcγRIIBに対する増大した親和性および、FcγRIIIAおよび／またはFcγRIIAに対する
減少した親和性を有する変異型Fc領域を含む本発明の1種以上の分子の、治療上、または
予防上有効な量を、該被験体に投与することを含む。
本発明はまた、被験体における、炎症性障害に関する1以上の症状を防ぐ、治療する、
または管理する方法を提供し、該方法は、1以上の抗炎症薬の、治療上、または予防上有
効な量を該被験体に投与することをさらに含む。本発明はまた、自己免疫疾患に関する1
以上の症状を防ぐ、治療する、または管理する方法を提供し、該方法は、1以上の免疫調
節薬の、治療上、または予防上有効な量を該被験体に投与することをさらに含む。セクシ
ョン5.4.2.1は、抗炎症薬および免疫調節薬の限定されるものでない例を掲げる。
本発明の分子を投与することにより治療できる自己免疫障害の例は、限定されるもので
ないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自
己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および睾丸炎、自己免
疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎
（celiac sprue-dermatitis）、慢性疲労免疫機能障害症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄
性多発性神経障害、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝
集素病、クローン病、円板状狼蒼、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋
炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギヤン-バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発
性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メ
ニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、I型または免疫を介する糖尿病、重症筋無
力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウ
マチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性
胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サ
ルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマト
ーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、
ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎のような血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症を
含む。炎症性障害の例は、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉
塞性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、
未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的なウイルスまたは細菌感染から生じ
る慢性炎症を含む。本明細書のセクション2.2.2に記載の通り、いくつかの自己免疫障害
は炎症性症状と関連している。このように、自己免疫障害と考えられる障害と炎症性障害
の間には重複がある。従って、いくつかの自己免疫障害は炎症性障害としても特徴付けら
れる。本発明の方法によって予防、治療または管理することができる炎症性障害の例とし
ては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）
、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節
炎、炎症性骨溶解、および慢性的なウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が挙げら
れる。
野生型Fc領域を有する対応する分子に比べて、FcγRIIBに対する増大した親和性および
、FcγRIIIAに対する減少した親和性を有する変異型Fc領域を含む本発明の分子はまた、
炎症性障害の動物、特に哺乳動物が感じる炎症を軽減することも可能である。特定の実施
形態では、本発明の分子は動物の炎症を、前記分子を投与されてない動物の炎症と比較し
て、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80
％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも45
％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、少なくとも30％、少なくとも25
％、少なくとも20％,または少なくとも10％軽減する。
野生型Fc領域を有する対応する分子に比べて、FcγRIIBに対する増大した親和性および
、FcγRIIIAに対する減少した親和性を有する変異型Fc領域を含む本発明の分子はまた、
移植組織の拒絶を防ぐために用いることもできる。
本発明は、自己免疫疾患または炎症性疾患の治療および／または予防用の当技術分野に
おいて公知のあらゆる抗体の操作をさらに意図するものであり、それにより該抗体が、野
生型Fc領域を有する対応する分子に比べて、FcγRIIBに対する増大した親和性および、Fc
γRIIIAに対する減少した親和性を有することが本発明の方法により示されている1以上の
アミノ酸改変を含む変異型Fc領域を含むようにする。本発明に従って操作を加えることが
できる、炎症性障害を治療または予防するために使用される抗体の限定されるものでない
例を表７Aに掲げ、自己免疫障害を治療または予防するために使用される抗体の限定され
るものでない例を表７Bに掲げる。
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
5.4.2.1 免疫調節薬と抗炎症薬
本発明は、自己免疫疾患および炎症性疾患に対する治療法を提供し、該方法は、FcγRI
IBに対する増大した親和性および、FcγRIIIAおよび／またはFcγRIIAに対する減少した
親和性を有する変異型Fc領域を持つ分子を、他の治療薬と併せて投与することを含む。免
疫応答調節薬の例は、限定されるものでないが、メトトレキセート、エンブレル（ENBREL
）、レミケード（REMICADETM）、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンA
、およびマクロライド抗生物質（例えば、FK506（タクロリムス））、メチルプレドニゾ
ロン（MP）、副腎皮質ステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイ
シン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン（deoxyspergualin）、ブレ
キナル（brequinar）、マロノニトリルアミド（例えば、レフルノマイド）、T細胞受容体
モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーターを含む。
抗炎症薬は、炎症性および自己免疫障害の治療に成功をおさめており、現在、このよう
な障害のための共通かつ標準の治療薬となっている。当業者に周知のいずれの抗炎症薬を
本発明の方法に使用してもよい。抗炎症薬の限定されるものでない例は、非ステロイド抗
炎症薬（NSAID）、ステロイド抗炎症薬、β作動薬、抗コリン作動薬、およびメチルキサ
ンチンを含む。NSAIDの例は、限定されるものでないが、アスピリン、イブプロフェン、
セレコキシブ（CELEBREXTM）、ジクロフェナク（VOLTARENTM）、エトドラク（LODINETM）
、フェノプロフェン（NALFONTM）、インドメタシン（INDOCINTM）、ケトロラク（TORADOL
TM）、オキサプロジン（DAYPROTM）、ナブメトン（RELAFENTM）、スリンダク（CLINORILT
M）、トルメチン（TOLECTINTM）、ロフェコキシブ（VIOXXTM）、ナプロキセン（ALEVETM
、NAPROSYNTM）、ケトプロフェン（ACTRONTM）およびナブメトン（RELAFENTM）を含む。
このようなNSAIDはシクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、COX-1および／またはCOX-2）を
阻害することにより機能する。ステロイド抗炎症薬の例は、限定されるものでないが、グ
ルココルチコイド、デキサメタゾン（DECADRONTM）、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プ
レドニゾン（DELTASONETM）、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、お
よびエイコサノイド、例えばプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエ
ンを含む。
5.4.3 感染症
本発明はまた、被験体における感染症の治療または予防の方法を包含し、該方法は、本
発明の1種以上の分子を、治療上または予防上有効な量、投与することを含む。本発明の
分子によって治療または予防しうる感染症は、これに限定されるものではないが、ウイル
ス、細菌、真菌、原虫、およびウイルスを含む感染因子により引き起こされる。
本発明の方法に関連して、本発明の分子を用いて治療または予防しうるウイルス性疾患
は、限定されるものでないが、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、
インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、I型単純ヘルペスウイルス（H
SV-I）、II型単純ヘルペスウイルス（HSV-II）、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコー
ウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス
、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（echinovirus）、アルボウイルス、ハンタウ
イルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス
、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、エプスタイン-バーウイルス、I型ヒト免疫不全ウイ
ルス（HIV-I）、II型ヒト免疫不全ウイルス（HIV-II）、および髄膜炎、脳炎、デング熱
または天然痘のようなウイルス性疾患の因子により引き起こされるものを含む。
本発明の方法に関連して、本発明の分子を用いて治療または予防しうる細菌性疾患は、
限定されるものでないが、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア
、肺炎球菌（S. pneumonia）、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）（ライム病）
、炭疽菌（炭疽病）、破傷風菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバク
テリウム、破傷風菌、百日咳菌、コレラ菌、ペスト菌、ジフテリア菌、クラミジア、黄色
ブドウ球菌（S. aureus）およびレジオネラ菌を含む細菌により引き起こされるものを含
む。
本発明の方法に関連して、本発明の分子を用いて治療または予防しうる原虫性疾患は、
限定されるものでないが、リーシュマニア、kokzidioa、トリパノソーマまたはマラリア
原虫を含む原虫により引き起こされる。
本発明の方法に関連して、本発明の分子を用いて治療または予防しうる寄生虫性疾患は
、限定されるものでないが、クラミジアおよびリケッチアを含む寄生虫により引き起こさ
れる。
本発明の1つの態様によれば、変異型Fc領域を有する本発明の分子は、野生型Fc領域を
含む対応する分子と比べて、例えば病原性タンパク質のような感染因子に対する増強され
た抗体エフェクター機能を有する。具体的な実施形態では、本発明の分子は、感染症を引
き起こす感染因子の貪食および／またはオプソニン作用を増強することで、感染症の治療
効力を高める。他の具体的な実施形態では、本発明の分子は、感染症を引き起こす感染さ
れた細胞のADCCを増強することで、感染症の治療効力を高める。
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、感染症の治療および／または予防のために
、当業者に公知の1種以上のさらなる治療薬の治療上または予防上有効な量と組み合わせ
て投与してもよい。本発明は、感染症の治療および／または予防のための、当業者に公知
の抗生物質と組み合わせた本発明の分子の使用を意図する。本発明の分子と組み合わせて
用いることができる抗生物質は、限定されるものでないが、マクロライド（例えばトブラ
マイシン（TobiTM）、セファロスポリン（例えばセファレキシン（ケフレックスTM）、セ
フラジン（VelocefTM）、セフロキシム（セフチンTM）、セフプロジル（セフジルTM）、
セファクロール（CeclorTM）、セフィキシム（SupraxTM）またはセファドロキシル（Duri
cefTM））、クラリスロマイシン（例えばクラリスロマイシン（バイアキシンTM）、エリ
スロマイシン（例えばエリスロマイシン（EMycinTM）、ペニシリン（例えば、ペニシリン
V（V-Cillin KTMまたはPen Vee KTM））またはキノロン（例えばオフロキサシン（フロキ
シンTM）、シプロフロキサシン（CiproTM）またはノルフロキサシン（NoroxinTM））、ア
ミノ配糖体系抗生物質（例えばアプラマイシン、アルベカシン、バンバーマイシン（bamb
ermycin）、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート
、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチ
ノマイシン）、アンフェニコール（amphenicol）系抗生物質（例えばアジダムフェニコー
ル（azidamphenicol）、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェ
ニコール）、アンサマイシン系抗生物質（例えばリファマイド（riphamide）およびリフ
ァンピン）、カルバセフェム系（例えばロラカルベフ）、カルバペネム系（例えばビアペ
ネムおよびイミペネム）、セファロスポリン系（例えばセファクロール、セファドロキシ
ル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン（cefazedone）、セフォゾプラン
、セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム）、セファマイシン系（例えばセフ
ブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス）、モノバクタム系（例えばアズトレ
オナム、カルモナム、およびチゲモナム（tigemonam））、オキサセフェム系（例えばフ
ロモキセフ、およびモキサラクタム）、ペニシリン系（例えばアムジノシリン（amdinoci
llin）、アムジノシリンピボキシル（amdinocillin pivoxil）、バカンピシリン、ベンジ
ルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロ
キサシリン、ペナムシリン、ペネタメートヒドリオダイド（penethamate hydriodide）、
ペニシリンo-ベネタミン、ペニシリンO、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシ
リンVヒドラバミン（penicillin V hydrabamine）、ペニメピシクリン（penimepicycline
）、およびフェンシヒシリン（phencihicillin）カリウム）、リンコサミド系（例えばク
リンダマイシン、およびリンコマイシン）、アンフォマイシン、バシトラシン、カプレオ
マイシン、コリスチン、エンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン系（例
えばアピサイクリン（apicycline）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、およ
びデメクロサイクリン）、2,4-ジアミノピリミジン系（例えばブロジモプリム（brodimop
rim））ニトロフラン系（例えばフラルタドン、および塩化フラゾリウム（furazolium ch
loride））、キノロンおよびその類似体（例えばシノキサシン、クリナフロキサシン、フ
ルメキン、およびグレパグロキサシン（grepagloxacin））、スルホンアミド系（例えば
アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルフアミド、ノプリルスルフアミド、フ
タリルスルフアセトアミド、スルフアクリソイジン（sulfachrysoidine）、およびスルフ
ァシチン（sulfacytine））、スルホン系（例えばジアチモスルホン（diathymosulfone）
、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン（solasulfone））、シクロセリン、
ムピロシンおよびチュベリン（tuberin）を含む。
ある実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の1種以上の抗真菌
剤と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いることができ
る抗真菌剤は、これに限定されるものでないが、アンフォテリシンB、イトラコナゾール
、ケトコナゾール、フルコナゾール、イントラセカル（intrathecal）、フルシトシン、
ミコナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、ニスタチン、テルコナゾール、チオ
コナゾール、シクロピロクス、エコナゾール、ハロプログリン（haloprogrin）、ナフチ
フィン、テルビナフィン、ウンデシレネート、およびグリセオフルビンを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の1種以上の
抗ウイルス薬と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いる
ことができる有効な抗ウイルス薬は、限定されるものでないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌ
クレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびヌクレオシド類似
体である。抗ウイルス薬の例は、限定されるものでないが、ジドブジン、アシクロビル、
ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびリバビリン、
同様にホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アン
プレナビル、ロピナビル、リトナビル、αインターフェロン；アデフォビル、クレバジン
（clevadine）、エンテカビル、プレコナリルを含む。
5.5 ワクチン療法
本発明は、本発明の組成物を用いて、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答を誘
発することをさらに包含し、該物質は、限定されるものでないが、癌抗原および感染症抗
原（これらの例は後述する）を含む。本発明のワクチン組成物は、それに対する免疫応答
が希望されるような1以上の抗原性または免疫原性物質を含み、該1以上の抗原性または免
疫原性物質は、FcγRIIIAに対する増大した親和性を有する本発明の変異型抗体によりコ
ーティングされている。特定の作用機構にとらわれることを意図するものではないが、Fc
γRIIIAに対する増大した親和性を有する本発明の変異型抗体による抗原性または免疫原
性物質のコーティングは、体液性の、または細胞を介した反応を引き起こすことにより、
目的の抗原性または免疫原性物質に対する免疫反応を増強する。本発明のワクチン組成物
は、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答、好ましくは防御性免疫応答を引き起こ
すのに特に有効である。
いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物における抗原性または免疫原性物質
は、それに対する免疫応答が望まれるようなウイルスを含む。該ウイルスは組換え体また
はキメラでもよく、好ましくは弱毒化されている。組換え体、キメラ、および弱毒化ウイ
ルスの産生は、当業者に公知の標準的な手法を用いて行われうる。本発明は、本発明に従
って設計されるべき生組み換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンを
包含する。生ワクチンが好ましく、なぜなら宿主内での複製が、自然な感染において起こ
るのと同種かつ同程度の持続的な刺激をもたらし、従って十分な、長期的な免疫を付与す
るためである。そのような生組換えウイルスワクチン製剤の生産は、細胞培養またはニワ
トリ胚尿嚢中でのウイルス増殖と、それに続く精製を含む従来の方法を用いて実現しうる
。
具体的な実施形態では、組換えウイルスは、それが投与される被験体に対して非病原性
である。これに関して、ワクチン用途での遺伝的に操作されたウイルスの使用は、これら
のウイルス種における弱毒化特性の存在を必要とする。トランスフェクションに用いる鋳
型に対する適当な変異（例えば欠失）の導入は、弱毒化特性を有する新規のウイルスを提
供しうる。例えば、温度感受性または寒冷適応に関する特定のミスセンス変異を、欠失変
異中に導入することができる。これらの変異は、寒冷または温度感受性変異体に関連する
点突然変異よりも安定であるはずであり、復帰変異の頻度が極めて低いはずである。組換
えウイルスを作製するための組換えDNA技術は、当業者に公知であり、本発明に包含され
る。例えば、負鎖RNAウイルスの改変のための技術が当技術分野において公知であり、例
えば、米国特許第5,166,057号を参照されたい（その全文を参照により本明細書に組み入
れる）。
代わりに、「自殺」特性を有するキメラワクチンが、本発明の皮内ワクチン製剤におけ
る使用のために構築されうる。そのようなウイルスは、宿主内でわずかに1〜数回の複製
しか行うことがない。ワクチンとして用いたときには、該組換えウイルスは限られた複製
サイクルを行い、免疫応答には十分なレベルを誘発するが、ヒト宿主中で行き過ぎて病気
を引き起こすことはない。一方で、不活化（死滅）ウイルスを本発明に従って製剤化する
ことができる。不活化ワクチン製剤は、キメラウイルスを「死滅させる」従来の方法を用
いて調製することが可能である。不活化ワクチンは、その感染性が破壊されているという
意味で「死んで」いる。理想的には、ウイルスの感染性は、免疫原性を損なうことなく破
壊されている。不活化ワクチンを調製するために、キメラウイルスは細胞培養もしくはニ
ワトリ胚尿嚢中で生育され、ゾーン超遠心により精製され、ホルムアミドもしくはβ-プ
ロピオラクトンにより不活化され、そしてプールされる。
ある実施形態では、完全に外来性のエピトープ（他のウイルス性または非ウイルス性病
原体に由来する抗原を含む）が本発明の皮内ワクチン製剤における使用のためのウイルス
に組み込みまれうる。例えば、例えばHIV（gp160、gp120、gp41）のような非関連ウイル
スの抗原、寄生虫抗原（例えばマラリア）、細菌もしくは真菌抗原または腫瘍抗原を、弱
毒化したウイルス種内に組み込むことができる。
ほとんどあらゆる異種起源の遺伝子配列が、皮内ワクチン製剤での使用するための本発
明のキメラウイルスに組み込まれうる。好ましくは、異種起源の遺伝子配列は、生物学的
反応の修飾因子として働きうる部分またはペプチドである。好ましくは、あらゆる種類の
病原体に対する防御性免疫反応を引き起こすエピトープ、または中和抗体に結合する抗原
が、キメラウイルスによって、またはその一部として発現される。例えば、本発明のキメ
ラウイルスに組み込むことができる異種起源の遺伝子配列は、限定されるものでないが、
インフルエンザおよびパラインフルエンザの血球凝集素、ノイラミニダーゼおよび融合糖
タンパク質（例えばヒトPIV3のHNおよびF遺伝子）を含む。また別の実施形態では、キメ
ラウイルスに組み込むことができる異種起源の遺伝子配列は、免疫修飾活性を有するコー
ドタンパク質を含む。免疫修飾タンパク質の例は、限定されるものでないが、サイトカイ
ン、I型インターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-
1、-2、-4、-5、-6、-12、およびこれらの物質のアンタゴニストを含む。
また別の実施形態では、本発明は変異型抗体をその表面に発現する病原細胞またはウイ
ルス、好ましくは弱毒化ウイルスを包含する。
代わりの実施形態では、本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質がFcγ
RIIIAに対する増大した親和性を有する本発明の変異型抗体と機能しうる形で連結されて
いる融合ポリペプチドを含む。本発明のワクチン組成物における使用のための融合ポリペ
プチドの作製は、慣例的な組換えDNA技術の方法を用いて行われるものであり、通常の技
能の範囲内である。
本発明は、本発明の組成物を投与することにより、被験体中での耐性を誘発する方法を
さらに包含する。好ましくは、被験体中での耐性を誘発するのに好適な組成物は、本発明
の変異型抗体によってコーティングされた抗原性または免疫原性物質を含み、該変異型抗
体はFcγRIIBに対してより高い親和性を有するものである。特定の作用機構にとらわれる
ことを意図するものではないが、そのような組成物はFcγRIIBを介した阻害経路を活性化
することにより、耐性を誘発するのに有効である。
5.6 組成物および投与の方法
本発明は、変異型Fc領域を含む本発明の分子（すなわち抗体、ポリペプチド）を含む方
法および医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾患、障害または感染に関連する1以上
の症状を治療、予防、および改善する方法であって、被験体に有効な量の本発明の融合タ
ンパク質もしくは複合分子、または本発明の融合タンパク質もしくは複合分子を含む医薬
組成物を投与することによる上記方法も提供する。好ましい態様では、抗体、融合タンパ
ク質、または複合分子は、実質的に精製されている(すなわち、その効果を限定するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。具体的な実施形態では、被
験体は動物、好ましくは哺乳類動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ
、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザルおよびヒト）で
ある。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。また別の好ましい実施形態では、本
発明の抗体は被験体と同じ種に由来するものである。
様々な送達系が公知であり、変異型Fc領域を含む本発明の分子（すなわち抗体、ポリペ
プチド）を含む組成物を投与するために利用することができ、例えばリポソーム、微粒子
、マイクロカプセル中の封入、抗体または融合タンパク質を発現することができる組換え
細胞、受容体を介するエンドサイトーシス（例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432を参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築
などがある。本発明の分子を投与する方法は、限定されるものでないが、非経口投与（例
えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔
内および口腔経路）を含む。具体的な実施形態では、本発明の分子を筋肉内、静脈内、ま
たは皮下に投与する。組成物をいずれの都合のよい経路により、例えば、注入またはボー
ラス注射により、上皮または皮膚粘膜上皮（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など
）を介する吸収により投与してもよく、かつ他の生物学的活性薬と一緒に投与してもよい
。投与は全身に対してでもまたは局所に対してであってもよい。さらに、例えば、吸入器
または噴霧器の使用により、およびエアロゾル化剤を用いる製剤化により肺投与を採用す
ることもできる。例えば、米国特許第6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,
874,064；5,855,913；5,290,540；および4,880,078号；ならびにPCT公開WO 92/19244；WO
97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；およびWO 99/66903を参照（これらそれぞれの全
体を参照により本明細書に組み入れる）。
本発明はまた、変異型Fc領域を含む本発明の分子（すなわち抗体、ポリペプチド）を、
密閉容器、例えば、アンプルまたは小袋中にパッケージし、抗体の量を表示して提供する
。一実施形態では、本発明の抗体を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として
密閉容器に入れて供給し、そして例えば水または生理食塩水を用いて被験体に投与するた
めに適当な濃度に再構築してもよい。好ましくは、本発明の分子を、乾燥した無菌凍結乾
燥粉末または無水濃縮物として密閉容器に入れて少なくとも5mg、さらに好ましくは少な
くとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少な
くとも50mg、または少なくとも75mgの単位用量にて供給する。凍結乾燥した本発明の分子
はその元来の容器中で2〜8℃の間で貯蔵しなければならず、かつ該分子は、再構築後12時
間以内、好ましくは6時間以内、5時間以内、3時間以内、または1時間以内に投与しなけれ
ばならない。代わりの実施形態では、本発明の分子を、液剤形で、密閉容器に入れて、分
子、融合タンパク質、または複合分子の量および濃度を表示して供給する。好ましくは、
本発明の分子の液剤形を、密閉容器に入れて、少なくとも1mg/ml、さらに好ましくは少な
くとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくと
も15mg/kg、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも100mg/ml、少なくとも1
50mg/ml、少なくとも200mg/mlにて供給する。
障害に関連する1以上の症状の治療、予防または改善するために有効でありうる本発明
の組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。製剤化において用いる
べき正確な用量はまた、投与経路、および病状の重篤度にも依存しうるものであり、医師
の判断およびそれぞれの患者の環境によって決定しなければならない。有効な用量をin v
itroまたは動物モデル試験系から誘導した用量-応答曲線から推定することができる。
本発明に包含される抗体について患者に投与される投与量は、典型的には、0.0001mg/k
g〜100mg/kg患者体重である。好ましくは、患者に投与される用量は、0.0001mg/kg〜20mg
/kg、0.0001mg/kg〜10mg/kg、0.0001mg/kg〜5mg/kg、0.0001〜2mg/kg、0.0001〜1mg/kg、
0.0001mg/kg〜0.75mg/kg、0.0001mg/kg〜0.5mg/kg、0.0001mg/kg〜0.25mg/kg、0.0001〜0
.15mg/kg、0.0001〜0.10mg/kg、0.001〜0.5mg/kg、0.01〜0.25mg/kgまたは0.01〜0.10mg/
kg患者体重である。一般的に、外来ポリペプチドに対する免疫応答のために、ヒト抗体は
ヒト体内において他種由来の抗体より長い半減期を有する。従って、ヒト抗体は投与量の
低減および投与頻度の低減がしばしば可能である。さらに、例えば、脂質化などの修飾に
より抗体の取込みおよび組織浸透を増強することにより、本発明の抗体またはそのフラグ
メントの投与の量と頻度を低減することができる。
一実施形態では、患者に投与される本発明の分子の投与量は、単一薬治療として用いる
とき、0.01mg〜1000mg/日である。他の実施形態では、本発明の分子を他の治療組成物と
一緒に用い、患者に投与される投与量は上記分子を単一薬治療法として用いるときより低
い。
具体的な実施形態では、本発明の医薬組成物を治療の必要な領域に局所投与することが
所望されうる；これは、例えば、限定されるものでないが、局所注入により、注射により
、またはシラスチック（sialastic）メンブランなどのメンブランまたは繊維を含む多孔
質、非孔質、またはゼラチン状材料からなる移植片を用いて達成することができる。好ま
しくは、本発明の分子を投与するとき、該分子を吸収しない材料を使うように注意しなけ
ればならない。
他の実施形態では、組成物を小胞、特にリポソームに入れて送達することができる（La
nger, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatら, in 「感染症と癌の治療法におけるリポ
ソーム（Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer）」, Lopez-Ber
estein and Fidler (編), Liss, New York, pp.353-365 (1989)；Lopez-Berestein, 前掲
, pp.3 17-327 を参照；一般的には前掲を参照）。
さらに他の実施形態では、組成物を制御放出または持続放出系で送達することができる
。本発明の1以上の分子を含む持続放出製剤を作るために、当業者に公知のいずれの技術
を用いてもよい。例えば、米国特許第4,526,938号；PCT公開WO 91/05548；PCT公開WO 96/
20698；Ningら, 1996,「持続放出ゲルを用いたヒト大腸癌異種移植片の腫瘍内放射免疫治
療（Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a S
ustained-Release Gel）」 Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Songら, 1995, 「長
循環エマルジョンの抗体を介する肺ターゲティング（Antibody Mediated Lung Targeting
of Long-Circulating Emulsions）」 PDA Journal of Pharmaceutical Science & Techn
ology 50:372-397；Cleekら, 1997, 「心血管応用のためのbFGF抗体に対する生物分解性
ポリマー担体（Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovas
cular Application）」 Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854
；およびLamら, 1997, 「局所送達のための、組換えヒト化モノクローナル抗体のマイク
ロカプセル化（Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody fo
r Local Delivery）」 Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を
参照、これらはそれぞれ参照により本明細書にその全文が組み入れられる。一実施形態で
は、ポンプを制御放出系に用いる（Langer, 前掲；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biome
d. Eng. 14:20；Buchwaldら, 1980, Surgery 88:507；およびSaudekら, 1989, N. Engl.
J. Med. 321:574を参照）。他の実施形態では、ポリマー材料を用いて抗体の制御放出を
達成することができる（例えば「制御放出の医療応用（Medical Applications of Contro
lled Release）」, LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；
「制御放出薬生物学的活性、医薬品設計と性能（Controlled Drug Bioavailability, Dru
g Product Design and Performance）」, Smolen およびBall (編), Wiley, New York (1
984)；RangerおよびPeppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61；
（またLevyら, 1985, Science 228:190；Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard
ら, 1989, J. Neurosurg. 7 1:105も参照）；米国特許第5,679,377号；米国特許第5,916,
597号；米国特許第5,912,015号；米国特許第5,989,463号；米国特許第5,128,326号；PCT
公開WO 99/15154；およびPCT公開WO 99/20253を参照）。持続放出製剤に使用されるポリ
マーの例としては、限定されるものでないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)
、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポ
リ(メタクリル酸)、ポリグリコリド（PLG）、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、
ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチ
ド（PLA）、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）、およびポリオルトエステルが挙げ
られる。さらに他の実施形態では、制御放出系を治療標的（例えば、肺）の近位に配置し
て、その結果、全身用量の一部分しか必要としないようにすることができる（例えば、Go
odson, in 「制御放出の医療応用（Medical Applications of Controlled Release）」,
前掲, vol. 2, pp.115-138 (1984)を参照）。他の実施形態では、制御放出移植片として
有用なポリマー組成物が、Dunnら（米国特許第号5,945,155を参照）に従い用いられる。
この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性物質のin situ制御放出の治療効果に基づ
く。移植は一般的に、治療処置を必要とする患者体内のいずれの場所において行われても
よい。他の実施形態では非ポリマー持続送達系を使用し、この場合、被験体体内の非ポリ
マー移植片を薬物送達系として利用する。体内に移植すると、移植片の有機溶媒は周囲組
織液中に散逸、分散または浸出して非ポリマー材料が徐々に凝集または沈降し、固体のミ
クロ多孔質マトリックスを形成する（米国特許第5,888,533号を参照）。
制御放出系は、Langer（1990, Science 249:1527-1533）による総説において論じられ
ている。本発明の1以上の治療薬を含む持続放出製剤を作るために、当業者に公知のいず
れの技術を用いてもよい。例えば、米国特許第4,526,938号；国際公開WO 91/05548および
WO 96/20698；Ningら, 1996, RadioTherapy & Oncology 39:179-189；Songら, 1995, PDA
Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleekら, 1997, Pro.
Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；およびLamら, 1997, Proc. I
nt'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照、これらはそれぞれ参照
により本明細書にその全文が組み入れられる。
具体的な実施形態では、本発明の組成物が抗体をコードする核酸である場合、核酸をin
vivo投与してそのコードされた抗体の発現を促進することができる；それを適当な核酸
発現ベクターの部分として構築しかつそれを細胞内に取込まれるように投与することによ
り、例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第4,980,286号を参照）、
または直接インジェクションにより、または微粒子ボンバードメントの使用により（例え
ば、遺伝子銃；Biolistic、Dupont）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトラ
ンスフェクション試薬を用いてコーティングすることにより細胞内に取り込まれ、または
核に進入することが知られるホメオボックス様ペプチドと連結して投与すること（例えば
、Joliotら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照）などにより、発
現を促すことができる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、宿主細胞DNAに組込んで相同
的組換えにより発現させてもよい。
抗体について、被験体に投与される治療上または予防上有効な投与量は、典型的には、
0.1mg/kg〜200mg/kg被験体体重である。好ましくは、被験体に投与される投与量は、0.1m
g/kg〜20mg/kg被験体体重、そしてさらに好ましくは1mg/kg〜10mg/kg被験体体重である。
本発明の抗体の投与の用量と頻度はまた、例えば脂質化などの修飾による抗体または融合
タンパク質の取込みおよび組織浸透（例えば、肺中への）の増強によって低減することも
できる。
本発明の分子の治療上または予防上有効な量を用いる被験体の治療は、単回治療を含む
ことができ、または、好ましくは、一連の治療を含んでもよい。好ましい例においては、
約0.1〜30mg/kg体重の本発明の分子を用いて、毎週1回、約1〜10週間にわたって、好まし
くは約2〜8週間にわたって、さらに好ましくは約3〜7週間にわたって、そしてなおさらに
好ましくは約4、5、または6週間にわたって、被験体を治療する。他の実施形態では、本
発明の医薬組成物を1日1回、1日2回、または1日3回投与する。他の実施形態では、医薬組
成物を毎週1回、毎週2回、毎2週1回、毎月1回、毎6週1回、毎2月1回、毎年2回または毎年
1回投与する。治療に使用する分子の有効な投与量は、特定の治療のコースにわたって増
加または減少することもまた適当であろう。
5.6.1 医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用であるバルク薬組成物（例えば、不純なま
たは非滅菌の組成物）および単位投与剤形の調製に利用することができる医薬組成物（す
なわち、被験体または患者に投与するのに好適である組成物）を含む。そのような組成物
は、本明細書中に開示した予防および／または治療薬の予防上または治療上有効な量また
はそれらの薬剤と製薬上許容される担体の組合せを含む。好ましくは本発明の組成物は、
予防上または治療上有効な量の1以上の本発明の分子および製薬上許容される担体を含む
。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、変異型Fc領域を含む1以上の本発明の分子を
治療上有効な量含み、該変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIIA
および／またはFcγRIIAと結合するのよりも大きな親和性をもってFcγRIIIAおよび／ま
たはFcγRIIAと結合し、かつ／または該変異型Fc領域は野生型Fc領域を含む対応する分子
よりも少なくとも2倍効果的なエフェクター機能を仲介し、かつ該医薬組成物は製薬上許
容される担体を含む。他の実施形態では、医薬組成物は変異型Fc領域を含む1以上の本発
明の分子を治療上有効な量含み、該変異型Fc領域は、野生型Fc領域を含む対応する分子が
FcγRIIIAと結合するのよりも大きな親和性をもってFcγRIIIAと結合し、かつ該変異型Fc
領域は、野生型Fc領域を含む対応する分子がFcγRIIBと結合するのよりも小さな親和性を
もってFcγRIIBと結合し、かつ／または該変異型Fc領域は野生型Fc領域を含む対応する分
子よりも少なくとも2倍効果的なエフェクター機能を仲介し、かつ該医薬組成物は製薬上
許容される担体を含む。他の実施形態では、前記医薬組成物は1種以上の抗癌薬をさらに
含む。
本発明はまた、治療用抗体（例えば腫瘍特異的モノクローナル抗体）を含む医薬組成物
を包含し、該抗体は特定の癌抗原に特異的であり、本発明により規定されるFc領域におけ
る1以上のアミノ酸改変を有し、かつ該医薬組成物は製薬上許容される担体を含む。
具体的な実施形態では、「製薬上許容される」との用語は、動物、特にヒトにおける使
用について、連邦または州政府の規制当局により認可された、または米国薬局方もしくは
他の一般的に認められた薬局方に掲げられたことを意味する。「担体」との用語は、治療
薬がそれらとともに投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバン
ト（完全および不完全）、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような製薬担体は、
水および油などの無菌液であってもよく、石油、動物、植物または合成起源の、例えばピ
ーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの無菌液を含む。医薬組成物を静脈内投与する
とき、水は好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロー
ル水溶液を液状担体、特に注射溶液として利用することができる。好適な製薬腑形剤は、
デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョ
ーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、
塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタ
ノールなどを含む。所望であれば、組成物はまた、小量の湿潤剤もしくは乳化剤、または
pH緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カ
プセル、粉末、持続放出製剤などの剤形をとりうる。
一般的に、本発明の組成物の成分は、別々にまたは一緒に混合して単位投与剤形で、例
えば、乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、密閉容器、例えばアンプルまたは
小袋に入れ、活性薬の量を表示して供給される。組成物を注入により投与する場合、無菌
製薬品質の水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて調剤してもよい。組成物を
注射により投与する場合、無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを提供して、その
成分が投与前に混合されるようにすることができる。
本発明の組成物を、中性または塩形態として製剤してもよい。製薬上許容される塩とし
ては、限定されるものでないが、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などか
ら誘導されるアニオンと形成した塩、およびカチオン、例えばナトリウム、カリウム、ア
ンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エ
チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたカチオンと形成した
塩を含む。
5.6.2 遺伝子治療
具体的な実施形態では、本発明の分子をコードする配列を含む核酸を投与して、遺伝子
治療法の方法により、疾患、障害、または感染に関連する1以上の症状を治療、予防、ま
たは改善する。遺伝子治療法は、発現されたまたは発現されうる核酸の被験体への投与に
より実施する治療法を意味する。本発明のこの実施形態では、核酸はそのコードした抗体
または融合タンパク質を産生して治療または予防効果を媒介する。
当技術分野で利用しうるいずれの遺伝子治療用の方法も本発明に従って使用することが
できる。方法の例を以下に記載する。
遺伝子治療法の方法の一般的総括については、Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy
12:488-505；WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. P
harmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；およびMorga
n and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIBTECH 11 (5) :
155-215を参照。利用することができる組換えDNA技術の技術分野で公知の方法は、Ausube
lら (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；
およびKriegler, Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual, Stockton Pres
s, NY (1990)に記載されている。
好ましい態様では、本発明の組成物は抗体をコードする核酸を含み、上記核酸は好適な
宿主中において抗体を発現する発現ベクターの一部分である。特に、このような核酸は、
抗体コード領域と機能しうる形で連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーター
を有し、上記プロモーターは、誘導可能な、構成的な、かつ場合によっては、組織特異的
なものである。他の特定の実施形態では、抗体コード配列および他のいずれか所望の配列
がゲノム内の所望の部位における相同的組換えを促進する領域に連結され、その結果、抗
体をコードする核酸の染色体内発現を可能にするような核酸分子が使用される（Kollerお
よびSmithies, 1989, Proc. Natl. ACAD. Sci. USA 86:8932-8935；ならびにZijlstraら,
1989, Nature 342:435-438）。
他の好ましい態様では、本発明の組成物は融合タンパク質をコードする核酸を含み、上
記核酸は好適な宿主において融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部分である。特
に、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域と機能しうる形で連結されたプロモ
ーター、好ましくは異種プロモーターを有し、上記プロモーターは、誘導可能な、構成的
な、かつ場合によっては、組織特異的なものである。他の特定の実施形態では、融合タン
パク質のコード配列および他のいずれか所望の配列がゲノム内の所望の部位における相同
的組換えを促進する領域と連結し、その結果、融合タンパク質をコードする核酸の染色体
内発現を可能にするような核酸分子が使用される。
核酸の被験体への送達は、直接的（この場合には被験体を核酸または核酸を運ぶベクタ
ーに直接曝す）または間接的（この場合には細胞を最初に核酸にin vitroで形質転換し、
次いで被験体中に移植する）のいずれであってもよい。これらの2つの手法は、それぞれ
、in vivoまたはex vivo遺伝子治療法として公知である。
具体的な実施形態では、核酸配列を直接in vivoに投与し、そこで発現してコードされ
た産物を産生する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより、実施する
ことができる；例えば、それを適当な核酸発現ベクターの部分として構築しかつそれを細
胞内に取込まれるように投与することにより、例えば、欠陥または弱毒化レトロウイルス
または他のベクターを使った感染により（米国特許第4,980,286号を参照）、または裸のD
NAの直接インジェクションにより、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；
Biolistic、Dupont）により、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェ
クション試薬を用いたコーティング、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル内
への封入により細胞内に取り込まれ、またはそれらを核に進入することが知られるペプチ
ドと連結して投与すること、受容体を介するエンドサイトーシスを受けるリガンドと連結
して投与すること（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）
（この方法は受容体を特異的に発現する細胞型を標的とするために用いることができる）
などにより、実施することができる。別の実施形態では、核酸-リガンド複合体（このリ
ガンドはエンドソームを破壊する融合性ウイルスペプチドを含む）を形成させて、核酸の
リソソームでの分解を回避させることができる。さらに別の実施形態では、核酸は、特異
的受容体を標的とすることにより、in vivoでの細胞特異的取込みと発現に向かわせられ
ることができる（例えば、PCT公開WO 92/06180；WO 92/22635；W092/20316；W093/14188
；WO 93/20221を参照）。あるいは、核酸を細胞内に導入し、そして相同的組換えによっ
て発現のために宿主細胞DNA内に組込ませることができる（Koller and Smithies, 1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 ；およびZijlstraら, 1989, Nature 342:435
-438）。
具体的な実施形態では、本発明の分子（例えば抗体または融合タンパク質）をコードす
る核酸配列を含有するウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベクター
を利用することができる（Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599を参照）。これ
らのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞
DNA中への組込みのために必要な成分を含有する。遺伝子治療法に利用する抗体または融
合タンパク質をコードする核酸配列は1以上のベクター中にクローニングされ、これによ
りヌクレオチド配列の被験体中への送達を容易にする。レトロウイルスベクターについて
のさらなる詳細は、Boesenら、（1994, Biotherapy 6:291-302）に見出すことができ、こ
れは、化学治療にさらに耐性のある幹細胞を作る目的でmdr 1遺伝子を造血性幹細胞へ送
達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療法におけるレトロウ
イルスベクターの使用を説明する他の参考文献には以下のものがある：Clowesら, 1994,
J. Clin. Invest. 93:644-651；Kleinら, 1994, Blood 83:1467-1473；SalmonsおよびGun
zberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；ならびにGrossmanおよびWilson, 1993, C
urr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114。
アデノウイルスは、遺伝子治療に利用しうる他のウイルスベクターである。アデノウイ
ルスは、遺伝子を呼吸器上皮に送達する媒体として特に興味をそそる。アデノウイルスは
元来、呼吸器上皮に感染して軽度の疾患を引き起す。アデノウイルスに基づく送達系の他
の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは非分裂細
胞に感染することができるので有利である。KozarskyおよびWilson（Current Opinion in
Genetics and Development 3:499-503, 1993）はアデノウイルスに基づく遺伝子治療法
の総説を報じている。Boutら（Human Gene Therapy, 5:3-10,1994）は、遺伝子をアカゲ
ザルの呼吸器上皮へ導入するためのアデノウイルスベクターの利用を実証した。遺伝子治
療におけるアデノウイルスの利用の他の例は、Rosenfeldら, 1991, Science 252:431-434
；Rosenfeldら, 1992, Cell 68 :143-155；Mastrangeliら, 1993, J. Clin. Invest. 91:
225-234；PCT公開W0 94/12649；ならびにWangら, 1995, Gene Therapy 2:775-783に見出
すことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが用いられる。
アデノ随伴ウイルス（AAV）も遺伝子治療における利用が提案されている（例えば、Wal
shら, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300および米国特許第5,436,146号を
参照）。
遺伝子治療に対する他のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、
リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により
、組織培養物中の細胞に遺伝子を導入することを含む。通常、導入の方法は、選択可能な
マーカーの細胞への導入を含む。次いで細胞を選択に供し、回収し、かつ導入した遺伝子
を発現する細胞を単離する。次いでそれらの細胞は被験体に送達される。
この実施形態では、核酸を細胞中に導入した後に、得られる組換え細胞をin vivo投与
する。このような導入は、当技術分野で公知のいずれかの方法、例えば、限定されるもの
でないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融
合、染色体を介した遺伝子導入（chromosome-mediated gene transfer）、微小細胞を介
した遺伝子導入（microcell mediated gene transfer）、スフェロプラスト融合などによ
り実施することができる。外来遺伝子を細胞中に導入するための多数の技術は当技術分野
で公知であり（例えば、Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohen
ら, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；およびClin. Pharma. Ther. 29:69-92,1985を
参照）、受容細胞の必要な発達および生理学的機能が破壊されないことを条件として本発
明に従って利用することができる。その技術は核酸の細胞への安定な導入を提供して、そ
れにより核酸が細胞により発現可能になり、そして好ましくはその細胞子孫に遺伝してか
つ発現されうるものでなければならない。
得られる組換え細胞は、当技術分野で公知の様々な方法により被験体に送達することが
できる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは、静脈内
に投与される。使用のために予測される細胞量は、所望の効果、患者状態などに依存し、
当業者が決定することが可能である。
遺伝子治療の目的で核酸を導入する相手の細胞は、いずれの所望の、利用しうる細胞型
をも包含し、限定されるものでないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細
胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞、例えばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、
好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；様々な幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または
前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるものを含む。
好ましい実施形態では、遺伝子治療に使用される細胞は被験体自身に由来するものであ
る。
組換え細胞を遺伝子治療に使用する一実施形態では、抗体または融合タンパク質をコー
ドする核酸配列を細胞中に導入して、その細胞またはその子孫により発現されうるように
し、次いでその組換え細胞をin vivoで投与して治療効果を与える。具体的な実施形態で
は、幹細胞または前駆細胞を用いる。単離してin vitroで維持することができるいずれの
幹細胞および／または前駆細胞も、潜在的に、本発明のこの実施形態に従って利用するこ
とができる（例えば、PCT公開WO 94/08598；StempleおよびAnderson, 1992, Cell 7 1:97
3-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A :229；ならびにPittelkowおよびScott,
1986, Mayo Clinic Proc. 61:771を参照）。
具体的な実施形態では、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域と機能しう
る形で連結された誘導可能なプロモーターを含み、それにより適当な転写誘導物質の存在
または不在を制御することにより核酸の発現を制御しうる。
5.6.3 キット
本発明は、本発明の分子（すなわち、変異型Fc領域を含む抗体、ポリペプチド）を充填
した1以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用
な1以上の他の予防または治療薬を、医薬パックまたはキット中に含んでもよい。本発明
はまた、本発明の医薬組成物の1以上の成分を充填した1以上の容器を含む医薬パックまた
はキットも含む。場合によってはこのような容器に、医薬または生物学的製品の製造、使
用または販売を規制する政府当局が指示した形式であって、ヒト投与用の製造、使用また
は販売行政当局による認可を反映する注意書きを添付してもよい。
本発明は、上記の方法で使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キ
ットは1以上の本発明の分子を含む。他の実施形態では、キットはさらに、1以上の容器中
に、癌の治療用に有用な1以上の他の予防または治療薬を含む。別の実施形態では、キッ
トはさらに、癌に関連する1以上の癌抗原と結合する1以上の細胞傷害性抗体を含む。ある
実施形態では、他の予防または治療薬は化学治療薬である。他の実施形態では、予防また
は治療薬は生物学的またはホルモン治療薬である。
5.7 治療上の有用性の特徴付けおよび実証
本発明の医薬組成物、予防または治療薬の複数の態様は、好ましくは、in vitro、例え
ば細胞培養系で、および動物モデル生物で、例えばげっ歯類動物モデル系で所望の治療活
性について試験した後に、ヒトに使用する。例えば、特定の医薬組成物の投与が適切なも
のかどうかを確認するために用いることができるアッセイは、細胞培養アッセイを含み、
該アッセイにおいては、患者組織サンプルを培養で増殖し、本発明の医薬組成物に曝すか
または別の方法で接触させ、そして組織サンプルに対するこのような組成物の効果を観察
する。組織サンプルは患者から生検により得ることができる。この試験により、個々の患
者に対して治療上最も有効な予防または治療分子を同定することができる。様々な具体的
実施形態では、in vitroアッセイを、自己免疫性または炎症性障害に関わる細胞型の代表
的細胞（例えば、T細胞）を用いて実施し、本発明の医薬組成物がそのような細胞型に対
して所望の効果を有するかを確認することができる。
予防および／または治療薬の組合せは、ヒトで使用する前に、適当な動物モデル系で試
験することができる。このような動物モデル系としては、限定されるものでないが、ラッ
ト、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野
で周知のいずれの動物系を使用してもよい。本発明の具体的な実施形態では、予防および
／または治療薬の組合せはマウスモデル系で試験する。このようなモデル系は広く使用さ
れていて、当業者に周知である。予防および／または治療薬は、反復して投与することが
できる。手順の複数の態様は、多様でありうる。該態様は、予防および／または治療薬の
投与の時間的管理、およびこのような薬剤を別々にまたは混合物として投与するかのいず
れかを含む。
本発明の方法に使用する好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上に
FcγRを発現するトランスジェニックマウスであり、例えば、米国特許第5,877,396号（そ
の全体を参照により本明細書に組み入れる）に記載されたいずれかのマウスモデルを本発
明に用いることができる。本発明の方法に使用するトランスジェニックマウスとしては、
限定されるものでないが、ヒトFcγRIIIAを保有するマウス；ヒトFcγRIIAを保有するマ
ウス；ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγRIIIAを保有するマウス；ヒトFcγRIIBおよびヒトFc
γRIIAを保有するマウスが挙げられる。
好ましくは、上記の機能的アッセイにおいて最大レベルの活性を示した変異を、ヒトで
の使用に先立って動物モデル研究における使用のためにテストする。本発明の方法を用い
て同定され、ADCCアッセイにおいてテストされたFc変異体を有する抗体は、2つの抗Erb-B
2抗体ch4D5およびch520C9、および抗TAG72抗体chCC49を含み、それらは既に異種移植マウ
スモデルにおいて用いられているので、動物モデルにおける使用に好ましい（Hudsiakら,
1989, Mol. Cell Biol. 9:1165-72；Lewisら, 1993, Cancer Immunol. Immunother. 37:
255-63；Bergmanら, 2001 Clin. Cancer Res. 7: 2050-6；Johnsonら, 1995, Anticance
r Res. 1387-93）。十分量の抗体を、上記の方法を用いて、動物モデルにおける使用のた
めに調整することが可能であり、例えば本明細書において開示され、例示されている哺乳
類発現系およびIgG精製法を用いて調製することができる。典型的な実験は、少なくとも
約5.4mgの変異型抗体を必要とする。この計算は、8〜10匹の30gのマウスを、負荷用量4μ
g/g、週維持用量2μg/gで10週間保護するのに必要な野生型抗体の平均量に基づくもので
ある。本発明は、異種移植腫瘍の供給源としての腫瘍細胞株、例えば乳腺腺癌の患者に由
来するSK-BR-3、BT474およびHT29細胞を包含する。これらの細胞はErb-B2およびプロラク
チン受容体の両者をその細胞表面に有する。SK-BR-3細胞は、ADCCおよび異種移植腫瘍モ
デルの両者において既に用いられ、成功を収めている。他のアッセイにおいては、ヒト卵
巣腺癌由来のOVCAR3細胞を用いることができる。これらの細胞は、TAG72抗原を細胞表面
に発現しており、chCC49抗体と併せて用いることができる。異なる抗体および複数の腫瘍
モデルの使用は、抗体特異な的Fc変異体の不適合によるあらゆる特異的変異の取りこぼし
を回避するであろう。
マウス異種移植モデルは、腫瘍特異的標的に対して作製された抗体の効力を調べるため
に用いることができ、該効力は抗体分子のCDR領域の親和性および特異性、および免疫反
応を引き起こす抗体のFc領域の能力に基づいて調べられる（Wuら, 2001, Trends Cell Bi
ol. 11: S2-9）。マウスエフェクター細胞上にヒトFcγRを発現するトランスジェニック
マウスは、類のないものであり、ヒトFc-FcγR結合の効力をテストするためにあつらえた
動物モデルである。Dr. Jeffrey Ravetchの研究室で作製されたFcγRIIIA、FcγRIIBおよ
びFcγRIIAトランスジェニックマウス系統のつがいが利用可能であり（Rockefeller大学
およびSloan Kettering Cancer centerとのライセンス契約を介して）、以下の表に挙げ
られているようなものである。
Figure 0006389093
好ましくは、FcγRIIIAに対する増大した結合およびFcγRIIBに対する減少した結合、A
DCCおよび貪食アッセイにおける増大した活性の両者を示すFc変異体が、動物モデル実験
においてテストされる。動物モデル実験は、生来の抗体を投与された対照との比較におい
て、FcγRIIIAトランスジェニック、ヌードmCD16AノックアウトマウスにおけるFc変異体
を有する抗体の効力の増加を検討する。好ましくは、8〜10匹のマウス群が標準的なプロ
トコルによって調べられる。典型的な動物モデル実験は、以下のステップを含みうる：乳
癌モデルにおいて、〜2x106個のSK-BR-3細胞を、マトリゲル（Becton Dickinson）と混合
したPBS 0.1mLと共に1日目に皮下注入する。初めに野生型キメラ抗体およびアイソタイプ
対照を、見積もり治療用量の曲線を設定するために、1日目に初期用量4μg/gの4D5の静脈
内注入、続いて週1回の2μg/gの注入により投与する。病気の進行を測定するために、腫
瘍容量を6〜8週間にわたってモニターする。アイソタイプ対照を注入した動物においては
、腫瘍容量は時間に対して直線的に増加するはずである。それに対して、4D5を注入した
群では非常にわずかな腫瘍増殖しか起こらないはずである。標準用量試験の結果は、Fc変
異体をテストする実験のための上限を設定するのに用いられる。これらの試験はFc変異体
を含む抗体を治療量以下用いて行われる。FcγRIIBノックアウトマウスにおいて行われる
実験では、異種移植モデルにおいて1／10の用量が用いられ（Clynesら, 2000, Nat. Med.
6: 443-6を参照）、結果として腫瘍細胞の増殖が阻止される。本発明の変異体は好まし
くはFcγRIIIA活性化の増大およびFcγRIIB結合の減少を示すものであるので、変異体は1
／10の治療用量で調べられる。異なる間隔での腫瘍サイズの検査は、より低い用量での抗
体の効力を表すものである。t-テストを用いたデータの統計学的解析は、データが顕著か
どうかを決める方法を提供する。増大した効力を示すFc変異体は、漸次的に低い用量にし
てテストされ、それらの効力の尺度としての最小可能投与量が決められる。
本発明の組合せ治療法の抗炎症性活性は、当技術分野で公知の、かつCrofford L. J.お
よびWilder R. L.「動物の関節炎と自己免疫（Arthritis and Autoimmunity in Animals
）」 in 「関節炎と近縁症状：リウマチ学の教科書（Arthritis and Allied Conditions:
A Textbook of Rheumatology）」, McCartyら (編), 第30章(Lee and Febiger, 1993)に
記載の様々な炎症性関節炎の実験動物モデルを利用して決定することができる。炎症性関
節炎および自己免疫リウマチ疾患の実験的および自然発生的動物モデルはまた、本発明の
組合せ治療法の抗炎症性活性を評価するために利用することもできる。以下は例として掲
げたいくつかのアッセイであり、限定されるものではない。
当技術分野で公知の、かつ広く利用される関節炎または炎症性疾患用の主な動物モデル
は、以下のものを含む：アジュバント誘導関節炎ラットモデル、コラーゲン誘導関節炎ラ
ットおよびマウスモデル、ならびに、抗原誘導関節炎ラット、ウサギおよびハムスターモ
デル、これらは全て、Crofford L. J. and Wilder R. L.「動物の関節炎と自己免疫（Art
hritis and Autoimmunity in Animals）」 in 「関節炎と近縁症状：リウマチ学の教科書
（Arthritis and Allied Conditions:A Textbook of Rheumatology）」, McCartyら (編)
, 第30章(Lee and Febiger), 1993に記載されている（その全体を参照により本明細書に
組み入れる）。
本発明の組合せ治療法の抗炎症性活性は、カラゲナン誘導関節炎ラットモデルを用いて
評価することができる。カラゲナンが誘導する関節炎はまた、慢性関節炎または炎症の研
究において、ウサギ、イヌおよびブタにおいても利用されている。定量的な組織形態計測
的評価が治療効力の決定に用いられる。このようなカラゲナン誘導関節炎モデルを利用す
る方法は、Hansra P.ら,「ラットにおけるカラゲナン誘導関節炎（Carrageenan-induced
Arthritis in the Rat）」, Inflammation, 24(2):141-155, (2000)に記載されている。
また、ザイモサン誘導炎症動物モデルも一般的に利用され、かつ当技術分野で公知である
。
本発明の組合せ治療法の抗炎症性活性はまた、カラゲナンが誘導するラットの足浮腫（
paw edema）の抑制を、Winter C. A.ら,「抗炎症薬用アッセイとしての、カラゲナンが誘
導するラット後足浮腫（Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Ass
ay for Anti-inflammatory Drugs）」Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547, (1962)
に記載の方法の改変法を用いて測定することにより評価することもできる。このアッセイ
はほとんどのNSAIDの抗炎症性活性に対する一次in vivoスクリーニングとして用いられて
おり、ヒトでの効力を予測すると考えられている。テスト予防薬または治療薬の抗炎症性
活性は、ビヒクルを投与した対照グループと比較した試験グループの後足重量増加の抑制
パーセントとして表現される。
さらに、炎症性腸疾患の動物モデルを、本発明の組合せ治療法の効力を評価するのに用
いることもできる（Kimら, 1992, Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537；Strober, 1985
, Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S）。潰瘍性大腸炎およびクローン病はヒト炎症性
腸疾患であり、動物に誘導することができる。硫酸化多糖類（限定されるものでないが、
アミロペクチン、カラゲーン、硫酸アミロペクチンおよび硫酸デキストランを含む）また
は化学刺激剤（限定されるものでないが、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）および
酢酸を含む）を動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘導することができる。
自己免疫障害用の動物モデルもまた、本発明の組合せ治療法の効力を評価するのに用い
ることができる。自己免疫障害、例えばI型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマト
ーデス、および糸球体腎炎に対する動物モデルが開発されている（Flandersら, 1999, Au
toimmunity 29:235-246；Kroghら, 1999, Biochimie 81:511-515；Foster, 1999, Semin.
Nephrol. 19:12-24）。
さらに、当業者に公知のいずれのアッセイを、自己免疫および／または炎症性疾患に対
する本発明に開示した組合せ治療法の予防および／または治療効用の評価に用いてもよい
。
本発明の予防および／または治療プロトコルの毒性および効力は、細胞培養または実験
動物における標準的な薬学的手法により確認することができ、例えば、LD50（集団の50％
に対する致死用量）およびED50（集団の50％における治療上有効な用量）を決定する手法
により確認することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、LD50/ED5
0比として表現される。大きな治療指数を示す予防および／または治療薬が好ましい。毒
性副作用を表す予防および／または治療薬を使用することはできるが、このような薬物を
罹患組織の部位を標的に定める送達系を設計して非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小
化し、それにより、副作用を軽減するように注意しなければならない。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトに使用する予防および／また
は治療薬の投与量の範囲を決定するのに利用することができる。このような薬物の投与量
は、好ましくは、毒性が低いか全くなく、ED50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は
、採用された投与剤形および利用する投与経路に依存して変わりうる。本発明の方法に使
用するいずれの薬物に対しても、治療上有効な用量はまず細胞培養アッセイから推定する
ことができる。用量は、細胞培養で決定したIC50（すなわち、症状の半値抑制（half-max
imal inhibition）を達成する試験化合物の濃度）を含むような循環血漿濃度範囲を達成
するように、動物モデルにおいて決定してもよい。このような情報を、ヒトにおいて有用
な投与量をさらに正確に決定するのに用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、
高速液体クロマトグラフィにより測定することができる。
本発明に従って使用される治療法の抗癌活性はまた、癌研究用の様々な実験動物モデル
、例えばSCIDマウスモデルまたはトランスジェニックマウスまたはヒト異種移植片をもつ
ヌードマウス、動物モデル、例えば、ハムスター、ウサギなどを用いることにより決定す
ることもでき、これらは当技術分野で公知であり、かつ「抗癌剤開発用腫瘍モデルの関連
性（Relevance of Tumor Models for Anticancer Development）」 (1999, 編 Fiebigお
よびBurger)；「腫瘍学に対する貢献（Contributions to Oncology）」 (1999, Karger)
；「腫瘍学研究におけるヌードマウス（The Nude Mouse in Oncology Research）」 (199
1, 編 Boven and Winograd)；およびAnticancer Drug Development Guide (1997 編 Teic
her）（これらの全体を参照により本明細書に組み入れる）に記載されている。
本発明の分子の治療効力を決定するのに好ましい動物モデルは、マウス異種移植モデル
である。異種移植腫瘍の供給源として用いることができる腫瘍細胞株は、限定されるもの
でないが、SKBR3およびMCF7細胞を含み、それらは乳腺腺癌の患者に由来しうる。これら
の細胞は、erbB2およびプロラクチン受容体の両者を有する。SKBR3細胞は、ADCCおよび異
種移植腫瘍モデルとして、当技術分野において通常用いられている。代わりに、ヒト卵巣
腺癌に由来するOVCAR3細胞を、異種移植腫瘍の供給源として用いることができる。
本発明のプロトコルと組成物は、ヒトで使用する前に、好ましくは、in vitroで、次い
でin vivoで、所望の治療または予防活性について試験する。治療薬および治療法は、腫
瘍または悪性培養細胞株の細胞を用いてスクリーニングすることができる。当技術分野に
おいて標準的な多くのアッセイを、このような生存および／または増殖を評価するのに用
いることができる；例えば、細胞増殖は3H-チミジン組込みを測定することにより、直接
細胞計数より、プロトオンコジーン（例えば、fos、myc）または細胞周期マーカーなどの
公知の遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができる；細胞生存率
はトリパンブルー染色により評価することができ、分化は形態の変化、軟寒天中での増殖
および／またはコロニー形成の減少または3次元基底膜または細胞外マトリックス調製物
中の管状ネットワーク形成などに基づいて視覚的に評価することができる。
治療に用いる化合物は、ヒトで試験する前に好適な動物モデル系で試験することができ
、動物は、限定されるものでないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、
ハムスターなどを含み、例えば、上記の動物モデルで試験することができる。化合物はそ
の後、適当な臨床試験に使用することができる。
さらに、当業者に公知のいずれかのアッセイを、癌、炎症性障害、または自己免疫疾患
の治療または予防について本明細書に開示した組合せ治療法の予防および／または治療効
用を評価するのに用いることができる。
6. 実施例
酵母ディスプレイシステムを用いて、突然変異体ヒトIgGl重鎖Fc領域を、各種のFc受容
体に対する改変された親和性についてスクリーニングした。特に、突然変異体Fcライブラ
リーをエラープローンPCR(Genemorph, Stratagene)によって作製し、その後、この突然変
異体Fcタンパク質をAga2p細胞壁タンパク質に融合させた。これによって、融合タンパク
質が細胞外に分泌されて、酵母細胞壁上に提示されるようになった。
可溶性形態のヒト受容体(FcγRIIIAおよびFcγRIIB)をクローニングした。しかし、酵
母細胞表面上でのIgGl Fcドメインの検出は、FcγRのそのリガンドに対する低親和性のた
めに、阻止された。この制限を回避するため、AVITAGを使用して、FcγRテトラマー複合
体を形成させた。これは、酵素によってビオチン化し、続いてフィコエリトリンとコンジ
ュゲート化したストレプトアビジン(SA-PE；Molecular Probes)と反応させて、可溶性テ
トラマーFcγR複合体を形成するものである。ELISAアッセイで、モノマーFcγRに比較し
て、可溶性FcγRテトラマー複合体がヒトIgGlに対して高い結合性を持つことが確認され
た。FACS分析での評価によれば、酵母細胞表面上のFc融合タンパク質も可溶性FcγRテト
ラマー複合体と結合した。
酵母細胞表面上に発現させたFc融合タンパク質類の可溶性テトラマーFcγR複合体類と
の結合性の差異を、FACS分析によってモニターした。こうして、1以上の可溶性テトラマ
ーFcγR複合体に対して変更された親和性を持つFc融合タンパク質を同定し、次に完全免
疫グロブリン中に組み込み、哺乳動物細胞中で発現させた。哺乳動物が発現した産物をEL
ISAアッセイで使用して、酵母表面ディスプレイシステムで得られた結果を確認した。最
後に、突然変異体Fc領域を配列決定して、変更された残基(群)を確認した。
6.1 FcγRIIIAのクローニング、発現および精製
材料および方法
可溶性FcγRIIBおよびFcγRIIIAを以下のようにしてクローニングした。ヒトFcγR遺伝
子(FcγRIIBおよびFcγRIIIA)のcDNAクローンを得た(Ravetch labより寄贈)。FcγRIIIA
遺伝子の可溶性領域(アミノ酸7-203)をPCRによって増幅し(表9)、BamHI/HindIIIで消化し
、pET25ベクター(Novagen)中に連結した。このベクターをSalI/NotIで消化し、断片(370)
をゲル単離した。ベクターhu3A(J. Ravetchより寄贈)をBamHI/SalIで消化し、FcγRIIIA
のN末端を含有する断片(270)を単離した。両断片をBamHI/NotIで切断したpcDNA3中に同時
連結し、pcDNA3-FcγRIIIA(アミノ酸1-203)を作製した。FcγRIIBの可溶性領域(アミノ酸
33-180)をPCRによって増幅し(表9)、BglII/HindIIIで消化し、pET25b(+)(Novagen)中に連
結した。このベクターをBamHI/NotIで消化し、断片(140)をゲル単離した。ベクターhuRII
bl(J. Ravetchより寄贈)をBamHI/EcoRIで消化し、440 bpのN末端FcγRIIB断片を単離した
。両断片をBamHI/NotIで切断したpcDNA3中に同時連結し、pcDNA3-FcγRIIB(アミノ酸1-18
0)を作製した。組換えクローンを293H細胞中にトランスフェクトし、細胞培養物から上清
を回収し、IgGセファロースカラムで可溶性組換えFcγR(rFcγR)タンパク質を精製した。
結果
組換え可溶性FcγRIIIA(rFcγRIIIA)および組換え可溶性FcγRIIB(rFcγRIIB)の均質にな
るまで精製した
組換えFcγRタンパク質の発現およびIgGセファロースカラムでの精製に続いて、SDS-PA
GEによって、組換え精製可溶性受容体タンパク質の純度および見かけの分子量を決定した
。図1に示すように、可溶性rFcγRIIIA(図1、レーン1)は予測した見かけの分子量が〜35K
Daであり、可溶性rFcγRIIB(図1、レーン4)は予測した見かけの分子量が〜20KDaであった
。図1に示すように、可溶性rFcγRIIIAは拡散性の「ファジー」バンドとして移動するが
、これはFcγRIIIAに通常見られる高度のグリコシル化に起因している(Jefferisら、1995
Immunol Lett. 44, 111-117)。
6.1.1 精製した組換え可溶性FcγRIIIAの特性決定
材料および方法
上記のようにして取得した精製可溶性rFcγRIIIAを、ヒトモノマーまたは凝集IgGに対
する直接結合性について、ELISAを用いて分析した。プレートを1X PBS中で一晩、可溶性r
FcγRIIIA 10 ngでコーティングした。コーティング後、プレートを1X PBS/0.1% Tween20
で3回洗浄した。ヒトIgG（ビオチン化モノマーIgGまたはビオチン化凝集IgGのいずれか）
を、0.03 mg/mL〜2 mg/mLの濃度範囲でウェルに添加し、可溶性rFcγRIIIAと結合させた
。反応を37℃で1時間行った。プレートを再度1X PBS/0.1% Tween20で3回洗浄した。ヒトI
gGの可溶性rFcγRIIIAとの結合を、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコン
ジュゲートを用いて、650nmでの吸光度をモニターすることにより検出した。650nmでの吸
光度は結合した凝集IgGに比例する。
ブロッキングELISA実験で、FcγRIIIAモノクローナル抗体3G8、マウス抗FcγRIIIA抗体
(Pharmingen)について、受容体の凝集IgGへの結合をブロックする能力をモニターする。
洗浄およびインキュベーション条件は上記と同一とした。ただし、IgG添加の前に、5倍モ
ル過剰の3G8を添加し、37℃で30分間インキュベートした。
結果
精製組換え可溶性FcγRIIIAは凝集IgGに特異的に結合する。
精製組換え可溶性FcγRIIIAの凝集IgGおよびモノマーIgGとの直接結合を、ELISAアッセ
イを用いて試験した(図2)。2μg/mlのIgG濃度で、凝集IgGとの強い結合が観察された。し
かし、同様の濃度で、モノマーIgGとの結合は検出されなかった。凝集IgGとの結合は、リ
ガンド結合部位をブロックするマウス抗FcγRIIIAモノクローナル抗体である3G8によって
ブロックされ、このことは、凝集IgGの結合が普通のFcγRIIIAリガンド結合部位を介する
ことを示している(図2)。可溶性rFcγRIIBも特性決定したところ、可溶性rFcγRIIIAと同
様の特徴でIgGと結合することが示された(データは示していない)。
6.2 可溶性FcγRテトラマー複合体の形成
材料および方法
AVITAGペプチドに融合させた可溶性FcγRIIIAおよびFcγRIIBの発現のためのプラスミド
の構築
可溶性FcγRテトラマー複合体を作製するため、ヒトFcRgIIIA遺伝子の可溶性領域(アミ
ノ酸7-203)をPCRによって増幅し(表9)、BamHI/HindIIIで消化し、pET25b(+)(Novagen)中
に連結した。このベクターをSalI/NotIで消化し、アガロースゲル電気泳動によって、370
bpの断片を単離した。ベクターhu3A(J.Ravetchより寄贈)をBamHI/SalIで消化し、FcγRII
IAのN末端を含有する270bpの断片を単離した。両断片を、BamHI/NotIで消化しておいたpc
DNA3.1(Invitrogen)中に同時連結し、pcDNA3-FcRgIIIA(アミノ酸1-203)を作製した。
FcγRIIBの可溶性領域(アミノ酸33-180)をPCRによって増幅し(表9)、BglII/HindIIIで
消化し、pET25b(+)(Novagen)中に連結した。このベクターをBamHI/NotIで消化し、アガロ
ースゲル電気泳動によって、140bpの断片を単離した。ベクターhuRIIb1(J.Ravetchより寄
贈)をBamHI/EcoRIで消化し、440bpのFcγRIIBのN末端断片を単離した。これらの両断片を
、BamHI/NotIで消化しておいたpcDNA3.1(Invitrogen)中に同時連結し、pcDNA3-FcγRIIB(
アミノ酸1-180)を作製した。その後、リンカー-AVITAG配列をFcγRIIIAおよびFcγRIIBの
両方のC末端に融合させた。FcγRIIIA-リンカー-avitagおよびFcγRIIB-リンカー-avitag
構築物を作製するため、pcDNA3.1 FcγRIIIAおよびFcγRIIB構築物をNotIおよびXbaI(両
方ともベクター配列中で切断される)で消化し、このベクター中に、5’末端のNotI部位お
よび3’末端のXbaIにより構成される86塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを連結した。
この86bp断片は、NotIおよびXbaIのための制限部位を持つようにあらかじめ設計した、2
つの5’リン酸化逆相補オリゴヌクレオチド(表9中に5’および3’リンカーavitagプライ
マーとして示した)をアニールすることによって作製した。100ng/μlの等容量の各プライ
マーを混合し、DNAを90℃で15分間加熱し、室温にて1時間冷却して、アニールさせた。こ
れによって、対応する酵素で消化したpcDNA3.1-FcγRIIIAおよびFcγRIIB構築物に連結す
る準備ができた二本鎖DNA断片が作製された。従って、pcDNA3.1-FcRγIIIA-リンカー-AVI
TAGおよびpcDNA3.1-FcRγIIB-リンカー-AVITAGが構築された。
Figure 0006389093
BirAによるビオチン化
可溶性Fc受容体(FcγR)であって、pcDNA3.1中にクローニングしたこのタンパク質のC末
端に15アミノ酸のAVITAG配列(Avidity, CO)(Schatz P. J., 1993, Biotechology, 11: 11
38-1143)を融合させたものを、リポフェクタミン(Lipofectamine)2000試薬(Invitrogen,
CA)を使用して、293H細胞に一時的にトランスフェクトすることによって、作製した。培
養物から上清を回収し、この上清をIgGセファロースカラムに通すことによって、可溶性F
cγRタンパク質を精製した。可溶性FcγR-AVITAG融合タンパク質の濃度を280nmでの吸光
度によって定量した。可溶性FcγRタンパク質上に存在するAVITAGを、ビオチンリガーゼ
の1つであるE.coli BirA酵素で、製造者のプロトコル(Avidity, CO)に従って、ビオチン
化した。タンパク質の分解を防止するため、プロテアーゼ阻害剤混合物(Sigma catalog #
P8849)の1:100最終希釈物および最終濃度1mg/mlのロイペプチン(Leupeptin)(Sigma L-851
1)を混合物に添加した。このBirA反応物を室温で一晩インキュベートし、その後Biomax 1
OK-超遠心分離機(Millipore)を使用し、4℃、3500rpmでの遠心分離によって、溶液を濃縮
した。タンパク質をTris-HCl(20mM, pH 8.0)、50mM NaCl中で、FPLC Superdex 200 HR 10
/30カラム(Pharmacia Biotech)に付加して、標識した可溶性FcγRを遊離のビオチンから
分離した。
ストレプトアビジンシフトアッセイによるビオチン化の程度の測定
約80〜85%のタンパク質がBirA酵素(Avidity, CO)によってビオチン化された。ストレプ
トアビジンシフトアッセイを用いて、タンパク質のビオチン化の程度を測定した。ビオチ
ン化タンパク質を各種の比率でストレプトアビジン(MW 60,000ダルトン)とともにインキ
ュベートした。ビオチン化の程度を測定するため、非ビオチン化タンパク質単独およびス
トレプトアビジン単独を対照として含ませた。インキュベーションは氷上、4℃で2時間ま
たは一晩、行った。サンプルを、4-12% SDS-PAGE Bis-Tris(Invitrogen, CA)を用いて、
還元剤あり、サンプルの沸騰なしで分析した。ストレプトアビジンと結合したビオチン化
タンパク質は高分子量バンドとして移動する。ビオチン化の程度を、サンプル中に残った
モノマータンパク質の量によって評価した。モノマー低分子量体の不在およびストレプト
アビジン単独よりも大きい分子量の複合体の存在が、高度のビオチン化を示す。
FcγRテトラマー複合体の形成
FcγRテトラマー複合体の形成を、MHCクラスIテトラマー類についてすでに確立されて
いる方法論に従って実施した(Busch, D. H.ら、1998 Immunity 8: 353-362；Altman, J.
D. ら、1996, Science 274: 94-96、参照)。ビオチン化モノマーFcγRの濃度を、280nmで
の吸光度に基づいて算出した。1分子のストレプトアビジン-フィコエリトリン(SA-PE)(Mo
lecular Probes, OR)は、4分子のビオチンと結合する能力を持っている。SA-PEに対して
モノマービオチン化FcγRを5: 1のモル比(5Xモノマービオチン化FcγR: 1X SA-PE)を使用
して、過剰のビオチン化タンパク質となることを確実にした。SA-PEの算出分子量は300,0
00ダルトンであり、従って、1mg/mLストレプトアビジン-PE溶液303mLは1ナノモルのSA-PE
を含有し、これを5ナノモルのタンパク質に添加した。テトラマータンパク質の効率的な
形成には、SA-PEの段階的増加が必要である。4℃、暗所で、SA-PEの半量を最初に添加し
、残りのSA-PEを20〜30分毎に少量ずつ添加した。残りのSA-PEの添加の間隔は適宜とする
。SA-PEの添加が完了した後、溶液を濃縮し、リン酸緩衝生理食塩液中、pH 7.4で、上記
のように、FPLCサイズ除外カラムに付加した。SA-PE単独よりも大きい分子量の空隙容量
中に溶出した画分を回収した。タンパク質の分解を防止するため、プロテアーゼ阻害剤を
補充した。溶液を濃縮し、保存のため、最終複合体にさらにプロテアーゼ阻害剤を添加し
た。可溶性FcγRテトラマー複合体の最終濃度を、ビオチン化モノマータンパク質の出発
濃度に基づいて算出した。例えば、500μgのビオチン化タンパク質を使用してテトラマー
複合体を形成させ、最終濃縮されたテトラマーが500μLの容量である場合、濃度は約1mg/
mLであると見積もられる(濃縮中に生じる損失は考慮に入れていない。なぜならば、テト
ラマー形成の各ステップでどれだけの損失となるかを正確に判定するのは困難だからであ
る。また、PEからの妨害があるので、濃度を測定するために280nmでの吸光度を採用する
ことも不可能である)。長期保存のため、可溶性FcγRテトラマー複合体をプロテアーゼ阻
害剤とともに-80℃で、少量アリコートに分割した。これらの調製物にアジ化ナトリウム
は添加しなかった。なぜならば、このテトラマーを酵母ディスプレイライブラリーのスク
リーニングのために使用するからである。1アリコートを融解後、テトラマーを1週間まで
は4℃で保存した。
テトラマーFcγR複合体を特性決定するためのELISAアッセイ
ELISAを用いて、テトラマーFcγR複合体を特性決定した。Maxisorb F96ウェルプレート
(Nunc)をPBSバッファー中のヒトIgG 25ngでコーティングし、4℃で一晩インキュベートし
た。プレートをPBS/0.5% BSA/0.1% Tween 20(洗浄および希釈バッファー)で洗浄した後、
FcγRIIIAテトラマーおよび試験抗体の混合物を添加して、以下に記載するように、3G8、
マウス抗ヒトFcγRIIIA抗体、によるブロッキングを判定した。ブロッキングステップは
以下のように実施した: 最終濃度0.5 mg/mlに固定した可溶性FcγRIIIAテトラマーを、バ
ッファー、PBS/0.5% BSA/0.1% Tween 20中、抗体とともに室温で1時間、予備インキュベ
ートした。抗体の最終濃度を60mg/mL〜0.25mg/mLの範囲とした。3G8はマウス抗ヒトFcγR
IIIA抗体の1つであり、この実験の目的のためには、キメラ体、すなわち抗体の可変部が
マウス抗ヒトFcγRIIIAであり、重鎖および軽鎖の不変部がIgG1ヒト領域からのものを使
用した。キメラ体4.4.20.D265Aもこの実験で使用した。これは、抗フルオレセイン抗体で
あって、そのFc領域の位置265に突然変異を含み、ここでアスパラギン酸がヒトIgGl中の
アラニンで置換されているもので、その結果、FCγRとの結合性が低下するようにしたも
のである。この抗体はすでに特性決定されている(Clynesら、2000, Nat. Med. 6: 443-44
6；Shieldsら、2001, J. Biol. Chem., 276: 6591-6604、参照)。この抗体を陰性アイソ
タイプ対照として使用した。
抗体を、FcγRIIIAテトラマーと、室温で1時間、予備インキュベートすることによって
、結合させた。次に洗浄したプレート上のIgGに混合物を添加し、室温でさらに1時間イン
キュベートした。プレートをバッファーで洗浄し、DJ130c(マウス抗ヒトFcγRIIIA抗体、
DAKO, Denmarkより入手可能；このエピトープは3G8抗体のものとは識別される)を、1:500
0の希釈率で添加し、結合したFcγRIIIAテトラマーを検出するために、室温で1時間イン
キュベートした。結合しない抗体をバッファーで洗浄除去し、ヤギ抗マウスペルオキシダ
ーゼ(Jackson laboratories)によって、DJ130cを検出した。この試薬がヒトFcを検出する
ことはない。結合しないペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体を洗浄除去した後、基質
、TMB試薬(BioFx)を添加して、アイソタイプ対照に対する3G8のブロッキングの程度を検
出し、発色を650nmで読み取った。
ELISAによる可溶性テトラマーFcγRIIIAのIgGへの直接結合のため、上記のように、max
isorbプレートをIgG 25ngでコーティングした。可溶性テトラマーFcγRIIIAを20mg/mL〜0
.1mg/mL添加し、ビオチン化モノマー可溶性FcγRIIIAは20mg/mL〜0.16mg/mLの範囲の濃度
で添加した。検出は上記のDJ130cの場合と同様とし、ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ抗体
を添加した。TMB試薬で発色させ、プレートを650nmで読み取った。
結果
可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体は、モノマーヒトIgGに、その正常リガンド結合部位を
介して結合する
可溶性FcγRIIIA-AVITAG融合タンパク質を、材料および方法のセクションに記載したよ
うに、ELISAアッセイを用いて、作製、単離、および分析し、AVITAGを含まない可溶性Fc
γRIIIAタンパク質と同様の性質を持つことが示された(データは示していない)。この融
合タンパク質を上記のようにビオチン化し、そのテトラマー複合体を作製した。
次に、この可溶性FcγRテトラマー複合体を、ELISAアッセイを使用して、そのリガンド
、モノマーヒトIgGとの結合について評価した。ELISAによる分析で、可溶性テトラマーFc
γR複合体がモノマーヒトIgGと特異的に結合することが示された。図3Aに示すように、65
0nmでの吸光度によってモニターすると、可溶性テトラマーFcγRIIIAのモノマーヒトIgG
との結合は、マウス抗ヒトFcγRIIIAモノクローナル抗体である3G8によってブロックされ
る。一方、D265A突然変異を保有する4-4-20モノクローナル抗体は、可溶性テトラマーFc
γRIIIAのモノマーヒトIgGとの結合をブロックすることができなかった(図3A)。こうして
、この実験で、可溶性テトラマーFcγRIIIA複合体の結合は天然のリガンド結合部位を介
して起こることが確認された。
可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体は、モノマー可溶性FcγRIIIAよりも大きい結合活性で
モノマーヒトIgGに結合する
ELISAアッセイを用いて、可溶性テトラマーFcγRIIIAの凝集ヒトIgGへの直接の結合を
評価し、可溶性モノマーFcγRIIIAのモノマーヒトIgGへの結合と比較した。図3Bに示すよ
うに、450nmでの吸光度によってモニターすると、可溶性FcγRIIIAテトラマーは、可溶性
モノマー受容体よりも大きい結合活性(8〜10倍)でヒトIgGに結合する。
また、可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体の結合を、IgG1から精製したFc断片でコーテ
ィングした磁性ビーズを用いてアッセイした(図4)。可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体は
、モノマーの結合が検出されない条件下で、IgG1Fcコーティングビーズに結合する。この
受容体複合体と、Fc結合をブロックする抗FcγRIIIAモノクローナル抗体LNK16とをプレイ
ンキュベートすることによって、結合の特異性が示された。このアッセイではさらに、可
溶性FcγRIIIAテトラマー複合体が、モノマーヒトIgGにその正常リガンド結合部位を介し
て結合すること、およびこの受容体の結合活性は、複合体内の複数の結合部位のために増
大すること、が確認された。
6.3 突然変異型IgG1 Fcドメインの提示のための酵母菌株の構築
材料および方法
pYDlベクター(Invitrogen)を酵母複製ベクターであるpCT302(Shustaら、2000 Nat. Bio
technol. 18: 754-759)から直接誘導した。これは、T細胞受容体および多数のscFVの提示
に使用されて、成功しているものである。このプラスミドはセントロメア性であり、TRP1
遺伝子を保有し、trp1酵母菌株中で、1細胞について1〜2のプラスミドの比較的一定の数
のコピーを可能にする。ポリリンカー内への特異的クローニングによって、目的の遺伝子
をGAL1プロモーターの制御下およびAGA2のフレーム内に置いた。IgG Fcドメインの酵母Ag
a2pとの融合の結果、Aga2-Fc融合タンパク質の細胞外分泌がもたらされ、それによって内
在性細胞壁タンパク質である酵母Agalpタンパク質とのジスルフィド結合を介して、細胞
壁上のFcタンパク質の提示をもたらす。
提示レベルを最適化するため、IgGl重鎖に由来する各種の断片をPCRによって増幅し、p
YDl中にクローニングした。具体的には、IgGl重鎖(アロタイプIGlm(a);アミノ酸206-447)
のFc領域を、IMAGEクローン 182740からのPCRによって増幅し(表9)、EcoRI/SalIで消化し
、pYDlベクター(Invitrogen)中に連結した。IMAGEからの当初のクローンは、319位に1個
のヌクレオチドの欠損を有していたので、これをin vitro部位特異的突然変異誘発によっ
て補正して、pYD-GIF206を構築した(Quickchange, Stratagene)。
5'オリゴ(mcr025；chl(f))および3'オリゴ(H021)を使用して、pCINEOベクター中のMAb
B6.2の重鎖クローンから、CH1-CH3断片(アミノ酸118-447)を増幅した(表9参照)。断片をB
amHI/NotIで消化し、pYDlベクター中に連結して、pYD-CHlを構築した。
図5はこの構築物の模式図を示す。CH1-CH3構築物は、重鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインに
加えてCH1ドメインを含有し、GIF206はヒンジの上流に6アミノ酸残基を含有し、GIF227は
ヒンジ領域内の内在性タンパク質切断部位で開始する(Jendebergら、1997 J. Immunol. M
eth. 201: 25-34)。
6.4 酵母細胞壁上のFcドメインの免疫学的局在化および特性決定
材料および方法
標準的な酢酸リチウム酵母形質転換プロトコル(Gietzら、1992 Nucleic Acids Res. 20
: 1425)を用いて、Aga2p-Fc融合タンパク質を含有する構築物、およびどのインサートも
欠如している対照ベクター、pYDIを、以下の酵母菌株中に形質転換した：EBY100 (Invitr
ogen)、MATa ura3-52 trpl leu2Δl his3Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL::GAL-A
GA1。その後、所定の培地で、トリプトファン原栄養体を選択した。グルコース中で増殖
後、主要炭素源としてガラクトースを含有する培地中、20℃で、24〜48時間の培養によっ
て、独立した細胞集団の増幅ならびにAgalpおよびAga2p-Fc融合タンパク質の誘導を行っ
た。ガラクトース中での増殖はGAL1プロモーターを介したAga2-Fc融合タンパク質の発現
を誘導し、その後このFc融合タンパク質の酵母細胞表面上の提示をもたらす。
結果
Fc融合タンパク質のFACS分析
酵母細胞表面上のFc融合タンパク質の発現を、PE-コンジュゲート化ポリクローナルF(a
b)2ヤギ抗ヒトFcγRおよびHP6017(Sigma)抗体(Jackson Immununoresearch Laboratories,
Inc.)を用いる免疫染色によって分析した。蛍光顕微鏡観察で、3つのFc融合タンパク質
について周辺染色が示された。ベクターのみを保有する対照菌株は、ほとんどまたは全く
染色されなかった(データは示していない)。FACS分析を使用して、染色を定量化した(図6
)。CH1-CH3融合物を含有する酵母菌株は、両抗体で染色された細胞の割合が最高であるこ
とを証明した(図6BおよびF)。GIF227構築物は最大の平均蛍光強度を示した(図6、パネルC
およびG)。
酵母細胞表面で発現させたFc融合タンパク質の結合の特性決定
FcおよびFcγRタンパク質の自然な状況では、この受容体は細胞表面上にあり、Fcは可
溶性リガンドである。しかし、酵母Fcの表面提示は自然の相互作用の幾何学構造を逆転さ
せる。酵母細胞壁の表面上のIgG1 Fcタンパク質の検出は、FcγRのそのリガンドに対する
低親和性と、このディスプレイシステムに固有の逆幾何学構造の両方によって、複雑化す
る。後者は変更することができないが、リガンドの結合活性は、上に説明したように、可
溶性FcγRテトラマー複合体を形成させることによって改良された。これは、酵母細胞壁
の表面に発現したFc融合タンパク質へのFcγRの結合の検出を可能にする。
可溶性テトラマーFcγR複合体の表面提示Fc融合タンパク質への結合を特性決定するた
め、多様なFc構築物を発現する酵母細胞を、可溶性rFcγRIIlAテトラマー複合体とともに
インキュベートし、FACSによって分析した。FACS分析が示すように、pYD-CHlを保有し、
野生型CH1-CH3構築物を提示する酵母細胞に、可溶性rFcγRIIIAテトラマー複合体が結合
した。しかし、FACS分析によれば、GIF206およびGIF227菌株は、可溶性rFcγRIIIAテトラ
マー複合体との結合をほとんどまたは全く示さなかった(データは示していない)。
FcγRとの結合をブロックする、Fc領域中の突然変異型が同定されている(Shieldsら、2
001；J Biol. Chem. 276: 6591-6604)。これらの突然変異型の1つであるD265Aを、pYD-CH
1中に組み込み、この突然変異体を酵母細胞表面上で発現させた。これらの細胞を、高濃
度のリガンドを使用して、可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体とともにインキュベートし
た(Fc 0.15 mM、D265A 7.5 mM)。FACS分析は、可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体は野生
型Fcと結合した(図7A)が、可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体はD265A-Fc突然変異体と結
合しなかったことを示し、これは、FcγRが下流側ヒンジ-CH2領域中の正常FcγR結合部位
と相互作用することを示している(図7B)。
FACSによって分析したところ、FcγRIIIAリガンド結合部位に対する抗体は、可溶性Fc
γRIIIAテトラマー複合体が酵母細胞表面壁に提示された野生型Fcタンパク質と結合する
のをブロックした(図8)。可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体の結合は、3G8抗体、同様にL
NK16抗体（別の抗FcγRIIIAモノクローナル抗体(Advanced Immunologicals)(Tamら、1996
J. Immunol. 157:, 1576-1581)）によってブロックされたが、無関係なアイソタイプ対
照によってはブロックされなかった。従って、可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体の酵母
細胞表面上に提示されたFcタンパク質への結合は、正常リガンド結合部位を介して起こる
。このFcγRIIIAテトラマー複合体の限定的な結合は、細胞の1亜集団が、FcγRに接近可
能なように適正に折りたたまれたFcを持つことを意味している。なぜ細胞の1亜集団のみ
がリガンドと結合できるかという理由は多数あるが、例えば、これらは異なる細胞周期の
段階であるか、または融合タンパク質が外に輸送されないのかもしれない。
FcγRIIIA-テトラマーの酵母細胞表面上のFc融合タンパク質との結合の解離定数を測定
するため、FACSを使用して、ある範囲のFcγRIIIAテトラマー複合体の結合を分析した。F
cγRIIIAテトラマー複合体を1.4μM〜0.0006μMの濃度で、力価測定した。結合親和性の
尺度として平均蛍光強度と非線形回帰分析を使用して、KDを0.006μM(+/-0.001)と決定し
た(データは示していない)。
6.5 Fc突然変異体ライブラリーの構築
Fc-CH1構築物中のFc断片に隣接するプライマーおよびエラープローンPCR(Genemorph, S
tratagene)を使用して、突然変異体Fcライブラリーを構築した。ベクターpYD-CHI中のCH1
-CH3インサートを、突然変異誘発PCR(Genemorph, Stratagene)を使用して増幅した。pYD-
上流およびpYD-下流プライマー(Invitrogen)を使用して、5反応を実施した。生成した増
幅断片をXhoI/BamHIで消化し、pYDl中に連結した。次に、連結反応物をXL10ウルトラコン
ピテントセル(Stratagene)中に形質転換し、その結果、〜1 x 106形質転換体が得られ、
その形質転換体の80%がインサートを含有していた。
ライブラリーからの28の任意のプラスミドの配列分析から、突然変異頻度が〜2ないし3
突然変異/kbであり、その保存ヌクレオチドの40%が機能停止し、突然変異の60%がアミノ
酸変化をもたらしたことが示された。
ライブラリーを、30の独立した形質転換反応で、〜3.3 x105形質転換物/μgの高効率で
、酵母菌株EBY100、MATα ura3-52 trpl leu2Δl his3Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can
l GAL::GAL-AGA 1::URA3中に形質転換して、合計〜107酵母形質転換物を作製した(Gietz
ら、1992, Nucleic acids Res. 20: 1425)。このライブラリーを集めて、グルコース中で
の増殖によって、増幅させた。
6.6 Fc突然変異体の選択および分析
材料および方法
Fc突然変異体のスクリーニングのためのELISAアッセイ
ELISAプレート(Nunc F96 MaxiSorp Immunoplate)を、4℃で、50ml/ウェルの炭酸塩バッ
ファー中の0.5mg/ml BSA-FITCでコーティングし、一晩インキュベートした。プレートを1
X PBS/0.1% Tween 20(PBST)で3回洗浄した。200ml/ウェルのPBST/0.5% BSAを添加し、プ
レートを室温で30分間インキュベートした。プレートをPBSTでさらに3回洗浄した。PBST/
0.5% BSA中の馴化培地からの、野生型またはFc突然変異体を含有する4-4-20抗体(約3mg/m
L、最終濃度0.7〜0.8mg/ウェル)の1: 4希釈物を、50ml/ウェルで添加し、室温で2時間イ
ンキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した。精製し、ビオチン化したモノマーFc
γRIIIA 3mg/ml(PBST/0.5% BSA中)をプレートに添加し(50μl/ウェル)、室温で1.5時間イ
ンキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した。PBST/0.5% BSA中のストレプトアビジ
ン-HRP(Pharmacia, RPN 123v)の1: 5000希釈物を、50ml/ウェルで添加し、プレートを室
温で30分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した。次に80ml/ウェルのTMB
試薬(BioFX)をプレートに添加し、室温で10〜15分、暗所でインキュベートした。40ml/ウ
ェルの停止溶液(0.18M硫酸)の添加によって、反応を最終的に停止させた。次に、プレー
トを450nmでの吸光度についてモニターした。この1次スクリーニング後、興味ある候補を
、免疫複合体による結合性ELISAで、4-4-20-Fc突然変異体の一連の力価測定によって、さ
らに確認した。このELISA中、2〜3の改変を行った。プレートのコーティングのため、2mg
/ml BSA-FITCを使用した。IgG定量結果に基づいて、PBST-/0.5% BSA中で希釈した、馴化
培地からの4-4-20Fc(野生型または突然変異体)を、1、0.5、0.25、0.125、0.063、および
0mg/mlの最終濃度で添加した。
細胞表面提示Fcタンパク質についてのFACSスクリーニング
細胞を、グルコースを含む少なくとも10mlのHSM-Trp-Ura pH 5.5中で、16〜24時間、ま
たはOD600が2.0を超えるまで、増殖させた。細胞を〜2000 rpmで5分間、遠心沈殿させた
。細胞を、ガラクトースを含む等容量のHSM-Trp-Ura、pH 7.0中に再懸濁した。125mlフラ
スコ中で、ガラクトース培地36mlを添加し、培養物9mlを接種し、振盪しながら20℃で24
〜48時間、インキュベートした。8〜16時間間隔でOD600を測定することによって、増殖を
モニターした。2Krpm、5分間の遠心沈殿で細胞を回収し、等容量の1XPBS、pH 7.4中に再
懸濁させた。
平衡スクリーニング：
適切な量の細胞を、過剰のリガンドを維持しながら、インキュベートした。例えば、ラ
イブラリーの10倍の割合を確実にするために必要な数の細胞で開始するのが好ましい。10
7形質転換物を含有するライブラリーについての1次選別のためには、108細胞を使用すべ
きである。実際上は、染色プロトコル中の損失を補填するため、109細胞で開始するのが
最良である。
インキュベーションを、典型的にはローテーター上、4℃、暗所で1時間、1.5mL試験管
中20〜100mlの容量で実施した(インキュベーションバッファー: 1XPBS pH7.4；1mg/ml BS
A)。細胞をインキュベーションバッファー500mlで1回洗浄し、4Krpmで2.5分間、遠心沈殿
させた。細胞をインキュベーションバッファー10 ml中に再懸濁させ、2次染色試薬ととも
にインキュベートした。Fc-CH1については、F(ab)2ヤギ抗hFc F(ab)2-FITC抗体(Jackson
Immunoresearch Laboratories,Inc.)を使用して、CH1発現について染色することができる
。染色は1mLで30分間実施した。細胞をインキュベーションバッファー500mLでさらに洗浄
し、4Krpmで2.5分間、遠心沈殿させ、1mL IX PBS、1mg/mL BSAに再懸濁させ、FACSによっ
て分析した。
典型的な平衡スクリーニング選別ゲートおよび回収した細胞の数を表10に示す。
Figure 0006389093
3次および4次選別後、細胞を直接-trp-uraプレートに入れ、個々の突然変異体を同定し
た。これによって典型的には〜200-400コロニー/プレートが再生した。回収後、細胞を50
mL円錐管中のグルコース培地10mLに入れ、30℃で増殖させた。全操作を反復した。
結果
Fc突然変異体のFACS分析
ガラクトース培地での誘導後、細胞を回収し、可溶性FcγRJIlAテトラマー複合体-PE標
識物およびマウス抗ヒトFcのF(ab2)-FITC標識物とともに同時染色した(Jackson Immunore
search Laboratories, Inc.)。細胞をFACSによって分析し、選別ゲートを使用して、細胞
表面上のFc発現の量に比較して、可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体に対して最高の親和
性を示す細胞を選択した(図9)。例えば、可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体により良好に
結合する突然変異体Fcを含有する細胞でも、酵母細胞表面上ではFc融合タンパク質をわず
かしか発現しないかも知れず、その細胞は選別ゲートの下方左側の隅に置かれることにな
る。
可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体に対して最高の親和性を示す突然変異体を富化する
ため、4回の連続的選別を実施した。各逐次選別のゲートを5.5%、1%、0.2%および0.1%と
した。最後の選別後、細胞を選択培地にプレーティングし、個々のコロニーを単離した。
個々のコロニーのそれぞれが、Aga2-Fc融合タンパク質内に単一のFc突然変異体を保有す
る細胞のクローン集団に相当した。最初に、32の独立したコロニーを取り出し、可溶性Fc
γRIIIAテトラマー複合体との結合性について、FACSによって試験した(図10)。可溶性Fc
γRIIIAテトラマー複合体に結合した細胞のパーセンテージおよび結合した細胞の平均蛍
光強度によって測定して、18の突然変異体が結合強度の増加を示した。
FcγRIIIAとの結合性の増加を示す突然変異を、可溶性FcγRIIBテトラマー複合体との
結合性についても試験した(図10)。可溶性FcγRIIIAテトラマー複合体との結合性の増加
につながる突然変異の大部分はまた、FcγRIIBテトラマー複合体染色の検出をもたらした
(図10)。既存の物理的および遺伝学的データに基づいて、FcγRIIIAとの結合性を増加さ
せる突然変異のいくつかが、FcγRIIBとの結合性も増加させることが予想される(Shields
ら、2001, J Biol. Chem. 276: 6591-6604；Sondermannら、2000, Nature 406: 267-273)
。
ヒト細胞系中で産生させた4-4-20 Mab中の突然変異体の分析
酵母系中での突然変異体の単離および分析によって、新規突然変異体対立遺伝子の迅速
な同定が可能になる。突然変異体を単離するための異種系の使用は、誤った折りたたみを
もたらす改変、または酵母に特異的なグリコシル化の改変によって、結合性を増大させる
突然変異の同定をもたらしうる。ヒト細胞中で産生される免疫グロブリン分子中のFc突然
変異を分析するため、突然変異体を、抗フルオレセインモノクローナル抗体、4-4-20の重
鎖を含有する哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングした(Kranzら、1982 J. Biol.
Chem, 257(12): 6987-6995)。突然変異体4-4-20重鎖をヒト腎細胞系統(293H)中で一時的
に軽鎖クローンと同時発現させ、上清を回収して、ELISAによって分析した(図11)。
ELISAアッセイによれば、2次FACS分析で、可溶性モノマーFcγRIIIA複合体に対して強
化された親和性を持つとして同定された突然変異体の大多数は、ヒト細胞系中で産生され
た4-4-20モノクローナル抗体のFc領域に存在する場合には、可溶性FcγRIIIAテトラマー
複合体との結合性の増加をも示した(図11)。しかし、2つの突然変異体、16番および19番
は、可溶性FcγRIIIAモノマー複合体との結合性の減少を示した。
表11は、酵母ディスプレイに基づくアッセイおよびELISAの両方によって判定して同定
された突然変異、ならびにFcγRIIIAおよびFcγRIIBに対するそれぞれの結合特性をまと
めたものである。表11中、記号は以下を表す: 野生型Fc領域を含む対照の分子に比較して
、・親和性の1倍増加；+ 親和性の50%増加；- 親和性の1倍減少；→親和性の変化なし。
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
Figure 0006389093
可溶性FcγRlIBテトラマー複合体の結合性の分析で、可溶性FcγRIIIAテトラマー複合
体との結合の増加を示した8突然変異体のうち7つが、可溶性FcγRIIBテトラマー複合体に
ついても増加した結合性を持つことが示された(図12)。1突然変異体、8番は、可溶性Fcγ
RIIBテトラマー複合体との結合性の減少を示した。突然変異体のうちの3つが可溶性FcγR
IIIAテトラマー複合体または可溶性FcγRIIBテトラマー複合体とのいずれの結合性にも差
異を示さず、おそらく酵母に特異的な結果をもたらす突然変異によるものである。
6.7 Fc突然変異体のADCCアッセイ
エフェクター細胞の調製:
正常ヒト末梢血(Biowhittaker/Poietics,1W-406)から、Ficoll-Paque(Pharmacia, 17-1
440-02)Ficoll-Paque密度勾配遠心分離によって、末梢血単核細胞(PBMC)を精製した。血
液を同日に環境温度で移送し、PBSおよびグルコース(1g/1L)中で1：1に希釈し、15mL円錐
管(3mL Ficoll；4mL PBS/血液)または50mL円錐管(15mL:Ficoll；20mL PBS/血液)中のFico
llに重層した。1500rpm(400rcf)で、室温で40分間、遠心分離した。PBMC層を取り出し(50
mL 円錐管から約4〜6mL)、50mL円錐管中でPBS(Ca2+もMg2+も含有しない)中1：10に希釈し
、さらに室温で10分間、1200rpm(250rcf)で遠心沈殿させた。上清を除去し、ペレットをP
BS(Ca2+もMg2+も含有しない)10〜12mLに再懸濁させ、15mL円錐管に移し、さらに室温で10
分間、1200rpmで遠心沈殿させた。上清を除去し、ペレットを最少容量(1〜2mL)の培地(Is
ocove培地(IMDM) + 10%ウシ胎仔血清(FBS), 4mM Gln, ペニシリン/ストレプトマイシン(P
/S))に再懸濁させた。再懸濁させたPBMCをADCCアッセイのために適切な容量に希釈した；
2倍希釈物についてELISA 96ウェルプレート(Nunc F96 MaxiSorp Immunoplate)中で実施し
た。PBMCの収量は全血40〜50mLについて約3〜5x107細胞だった。
標的細胞の調製:
このアッセイで使用した標的細胞は以下のものであり：SK-BR-3(ATCC受託番号 HTB-30
；Trempeら、1976, Cancer Res. 33-41)、Raji(ATCC受託番号 CCL-86；Epsteinら、1965,
J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-40)、またはDaudi細胞(ATCC受託番号 CCL-213；Klein
ら、1968, Cancer Res. 28: 1300-10)(IMDM培地0.5mL中に再懸濁させる)、これらをユー
ロピウムキレートビス(アセトキシメチル)2,2’’:6',2’’テルピリジン6,6'ジカルボキ
シラート(BATDA試薬；Perkin Elmer DELFIA試薬；C136-100)で標識した。K562細胞(ATCC
受託番号CCL-243)をNK活性についての対照細胞として使用した。DaudiおよびRaji細胞を
遠心沈殿させた。SK-BR-3細胞を、37℃、5% C02中で、2〜5分間、トリプシン処理し、培
地を中和した後、200〜350Gで遠心沈殿させた。このアッセイで使用した標的細胞の数は
約4〜5x106細胞であり、5x106を超えることはなかった。なぜならば、標識効率は2x106細
胞の少数で最善であったからである。細胞を遠心沈殿させた後、培地を15mL Falcon管中
で0.5mLまで吸引除去した。BATDA試薬2.5μlを添加し、混合物を37℃、5%C02中で30分間
インキュベートした。細胞をlOmLのPBSおよび0.125mMスルフィンピラゾール(“SP”；SIG
MA S-9509)で2回、そしてアッセイ培地(細胞培地 + 0.125 mMスルフィンピラゾール)10mL
で2回、洗浄した。細胞をアッセイ培地1mLに再懸濁させ、計数して、希釈した。
最初のPBS/SP洗浄後に標的細胞としてSK-BR-3細胞を使用する場合は、PBS/SPを吸引除
去し、SP、Gln、およびP/Sを含有するIMDM培地中のFITC 500μg/mL(PIERCE 461110)を添
加し、37℃、5%C02中で30分間インキュベートした。細胞をアッセイ培地で2回洗浄し、ア
ッセイ培地1mLに再懸濁させ、計数して、希釈した。
抗体によるオプソニン化:
標的細胞を上記のように調製した後、これを適切な抗体によってオプソニン化した。Fc
変異型の場合、50μLの1x105細胞/mLを、2x濃度のFc変異型保有抗体に添加した。最終濃
度は以下の通りである：Ch-4-4-20の最終濃度は0.5〜1μg/mL；およびCh4D5の最終濃度は
30ng/mL〜1ng/mL。
Fc変異型を持つ4-4-20抗体の場合、オプソニン化した標的細胞をエフェクター細胞に、
エフェクター：標的の比率が75：1となるように、添加した。Fc変異型を持つCh4D5抗体の
場合は、エフェクター：標的の比率を50：1または75：1とした。このアッセイについて有
効なPBMC勾配は100：1から1：1の範囲である。自発的放出(SR)を、アッセイ培地100μLを
細胞に添加することによって、測定した。最大放出(MR)は、4% TX-100の添加によって、
測定した。細胞を、Beckman遠心分離機中、57G、室温で1分間、200rpmで遠心沈殿させた
。細胞を37℃、5%CO2中で、3〜3.5時間、インキュベートした。インキュベーション後、B
eckman遠心分離機(約220xg)中、10℃で5分間、1000rpmで、細胞を遠心分離した。上清20
μlを回収し、Eu溶液200μLを添加し、混合物をロータリー振盪機で、室温で15分間、120
rpmで振盪した。時間分解蛍光測定機(Victor 1420, Perkin Elmer)で、蛍光を定量した
。
結果
上記のようにして、変異型Fc領域を、抗フルオレセインモノクローナル抗体、4-4-20の
重鎖を含有する哺乳動物発現ベクター(Kranzら、1982 J. Biol. Chem. 257 (12): 6987-6
995)中にサブクローニングした。ヒト腎細胞系統(293H)中で、変異型4-4-20重鎖を軽鎖ク
ローンとともに一時的共発現させた。上清を回収し、ADCCアッセイを使用して分析した。
図13は、突然変異体のADCC活性が濃度依存性であることを示している。表12に総括したよ
うに、5種の変異型Fc領域を持つ免疫グロブリンが、野生型ch 4-4-20に比較して、増大し
たADCC活性を持っていた。その5種の突然変異体は以下のものである：MGFc-27(G316D, A3
78V, D399E)；MGFc-31(P247L, N421K)；MGFc-10(K288N, A330S, P396L)；MGFc-28(N315I,
V379M, T394M)；MGFc-29(F243I, V379L, G420V)。
その他の変異型Fc領域を持つ4-4-20免疫グロブリンを、野生型Fc領域を持つ4-4-20免疫
グロブリンに比較したこれらのADCC活性について、アッセイした。その結果を表12にまと
めた。
4-4-20抗体についても、前記と同様のプロトコルを用いて、ADCCアッセイを実施した。
ただし、ヒト表皮成長因子受容体2(HER2/neu)に特異的なヒト化抗体(Ab4D5)中に、変異型
Fc領域をクローニングした。この場合、変異型Fc領域を保有するHER2/neu抗体でオプソニ
ン化したSK-BR-3細胞を、標的細胞として使用した。HER2/neuはSK-BR-3細胞により内在性
に発現されるので、これらの細胞の表面に存在する。図13は、変異型Fc領域を保有するHE
R2/neu抗体のADCC活性を示す。表13は、HER2/neu抗体に関しての突然変異体のADCC活性の
結果を総括するものである。一定の細胞溶解比率の数値を得るために必要な突然変異体の
濃度を野生型抗体と比較することによって、標準化した。
図13Aに示すように、ヒト化抗HER2/neu抗体中にクローニングした、MGFc-5(V379M)、MG
Fc-9(P243I, V379L)、MGFc-10(K288N, A330S, P396L)、MGFc-13(K334E, T359N, T366S)、
およびMGFc-27(G316D, A378V, D399E)突然変異体が、野生型抗体よりも高いSK-BR-3細胞
の%溶解率を示した。
Figure 0006389093
Figure 0006389093
6.8 Fc突然変異体の速度論的パラメーターの分析
Fc突然変異体を保有するch4-4-20抗体のFcγRIIIAおよびFcγRIIBへの結合性の速度論
的パラメーターを、BIAcoreアッセイ(BIAcore 装置1000, BIAcore Inc., Piscataway, N.
J.)を用いて分析した。このアッセイで使用したFcγRIIIAは、上記セクション6.2に記載
した、リンカー-AVITAG配列に連結させたFcγRIIIAの細胞外領域である、可溶性モノマー
タンパク質である。このアッセイで使用したFcγRIIBは、以下に記載された方法論に従っ
て調製した、可溶性ダイマータンパク質である：米国仮出願 No. 60/439,709(2003年1月1
3日出願、参照により本明細書中に組み入れる)。簡単に述べると、使用したFcγRIIBはヒ
トIgG2のヒンジ-CH2-CH3ドメインに融合させたFcγRIIBの細胞外ドメインである。
BSA-FITC(lOmM酢酸バッファー、pH 5.0中、36μg/mL)を、センサーチップ表面の4種の
フローセルの1つ(フローセル2)に、アミンカップリング化学結合を介して(NHS/EDCの混合
物によるカルボキシルメチル基の修飾によって)固定化し、約5000応答単位(RU)のBSA-FIT
Cが表面に固定化されるようにした。この後、1M Et-NH2の注入によって、未反応の活性エ
ステルを「キャップオフ(capped off)」した。好適な表面を調製した後、Fc突然変異を保
有するch 4-4-20抗体を、流速5μL/mLで、溶液20μg/mLを1分間で注入することにより、
表面を通過させた。表面に結合したch-4-4-20抗体のレベルは400から700RUの範囲だった
。次に、HBS-Pバッファー(lOmM HEPES、150mM NaCI、0.005% Surfactant P20、3mM EDTA
、pH 7.4)中の受容体 (FcγRIIIAおよびFcγRIIB-Fc融合タンパク質)の一連の希釈物を、
表面に100μL/分で注入した。各種受容体希釈物間での抗体の再生を、1OOmM NaHC03 pH 9
.4；3M NaCIの1回の5秒間注入によって、実施した。
アッセイの最初および最後に、対照注入として、ch-4-4-20抗体を全く含まないBSA-FIT
C表面上に、受容体の同率希釈物を注入した。
全データセットを採取した後、製造者のBIAcore, Inc.(Piscataway, NJ)が提供するコ
ンピュータアルゴリズムを使用して、生成した結合曲線を大まかにフィットさせた。これ
らのアルゴリズムでKonおよびKoffの両方が算出され、これから見かけの平衡結合定数、K
Dが、2つの速度定数の比(すなわち、Koff/Kon)として演繹される。個々の速度定数をどの
ようにして導くかのさらに詳細な処理法は、BIAevaluaion Software Handbook (BIAcore,
Inc., Piscataway, NJ)から得られる。
2種の濃度(FcγRIIIAで200nMおよび800nM、ならびにFcγRIIB融合タンパク質で200nMお
よび400nM)についての結合曲線をアラインして、応答を同一レベルの捕捉抗体に揃え、さ
らに実験曲線から対照曲線を差し引いた。会合および解離相は別々にフィッティングした
。解離速度定数は解離相の32〜34秒の間隔において得られ；会合相のフィットは1：1 Lan
gmuirモデルによって取得し、基底フィットはRmax およびchi2指標を基準にして選択した
。
結果
図14は、BSA-FTIC-固定化したセンサーチップ上の、突然変異体Fc領域を持つch 4-4-20
抗体の捕捉を示す。BSA-FITC表面上に、濃度約20μg/mLの抗体6μLを、5μL/分で注入し
た。図15は、変異型Fc領域を保有するch-4-4-20抗体へのFcγRIIIAのリアルタイム結合の
センソグラム(sensogram)である。FcγRIIIAの結合について200nMの濃度で分析し、共鳴
シグナル応答を、野生型ch-4-4-20抗体について取得した応答のレベルで標準化した。Fc
γRIIIAのch-4-4-20抗体への結合についての速度論的パラメーターを、2種のFcγRIIIA濃
度、200および800nMで取得したデータにフィットさせることにより取得した(図16)。実線
は、解離曲線について32〜34秒の間隔において算出したKoff値に基づいて取得した、会合
フィットを表す。KDおよびKoffは、使用した2種のFcγRIIIA濃度から算出した。図17は、
変異型Fc領域を保有するch-4-4-20抗体へのFcγRIIB-Fc融合タンパク質のリアルタイム結
合のセンソグラムである。FcγRIIB-Fc融合タンパク質の結合を200nMの濃度で分析し、共
鳴シグナル応答を、野生型ch-4-4-20抗体について取得した応答のレベルで標準化した。F
cγRIIB-Fc融合タンパク質のch-4-4-20抗体への結合についての速度論的パラメーターを
、2種のFcγRIIB-Fc融合タンパク質濃度、200および400nMで取得したデータにフィットさ
せることによって、取得した(図18)。実線は、解離曲線について32〜34秒の間隔において
で算出したKoff値に基づいて取得した、会合フィットを表す。KDおよびKoffは、使用した
2種のFcγRIIB-Fc融合タンパク質濃度から算出した。
分析から決定した速度論的パラメーター(KonおよびKoff)は、ELISAアッセイによって判
定したその突然変異体の結合特性およびADCCアッセイで判定したその突然変異体の機能性
活性と相関があった。具体的には、表14に見られるように、野生型タンパク質に比較して
強化されたADCC活性を持ち、かつELISAアッセイで判定してFcγRIIIAに対する強化された
結合性を持つ突然変異体は、FcγRIIIAについて改善されたKoff(すなわち、より低いKoff
)を有していた。従って、ある突然変異体Fcタンパク質について、野生型タンパク質に比
較してより低いFcγRIIIAに対するKoff値であるものは、強化されたADCC機能を有するも
のと見られる。反対に、表15に見られるように、野生型タンパク質に比較して強化された
ADCC活性を持ち、かつELISAアッセイで判定してFcγRIIB-Fc融合タンパク質に対して低下
した結合性を持つ突然変異体は、FcγRIIB-Fc融合タンパク質について高いKoffを有して
いた。
こうして、FcγRIIIAおよびFcγRIIBについてのKoff値を、ある突然変異体がADCCなど
の機能アッセイでどのように挙動するかの予測的尺度として用いることができる。実際に
、野生型タンパク質に対するその突然変異体のFcγRIIIAおよびFcγRIIB-Fc融合タンパク
質についてのKoff値の比率をADCCデータに対してプロットした(図19)。具体的には、Fcγ
RIIIAについてのKoff値の場合、比率 Koff(野生型)/Koff(突然変異体)をADCCデータに対
してプロットし、FcγRIIBについてのKoff値の場合は、比率 Koff(突然変異体)/Koff(野
生型)をADCCデータに対してプロットした。1より高い数は、野生型に比較して、FcγRIII
Aについての減少した解離速度およびFcγRIIB-Fcについての増加した解離速度を示す。指
し示されたボックス内に入る突然変異体は、FcγRIIIA結合についてのより低い消失速度
とFcγRIIB-Fc結合についてのより高い消失速度を持ち、そして増大したADCC機能を有す
る。
Figure 0006389093
ハイライトを付けた突然変異体はELISAまたはADCCデータによる群にフィットしない。
Figure 0006389093
6.9 固相アッセイを用いた複数ラウンドの富化による、Fc突然変異体についてのスクリ
ーニング
以下の突然変異体スクリーニングは、FcγRIIIAに対して改善された結合性およびFcγR
IIBに対して低下した結合性を示す、別のセットの突然変異体の同定を目指したものであ
る。選択されたFc変異型の第2次スクリーニングをELISAによって実施した後、4-4-20系統
中でADCCについて試験した。突然変異体を、標的としてフルオレセインでコーティングし
たSK-BR3細胞およびエフェクター細胞集団としてヒトドナーから単離したPBMCを使用して
、主として4-4-20を経由してADCCを媒介するその能力に基づいて選択した。次に、ADCCで
相対的増強、例えば2つのうちの1つの因子の強化を示したFc突然変異体を抗HER2/neuまた
は抗CD20chAb中にクローニングし、標的として適切な腫瘍細胞を使用するADCCアッセイで
試験した。この突然変異体をBIAcoreによって分析して、その相対的Koffを測定した。
スクリーニング1: FcγRIIBでコーティングした磁気ビーズを用いた順次固相減損および
選択後の、FcγRIIIAでコーティングした磁気ビーズによる選択
このスクリーニングの目的は、FcγRIIBと結合しなくなったか、FcγRIIBに対して低下
した結合性を示すFc突然変異体の同定である。10倍過剰の天然ライブラリー(〜107細胞)
をFcγRIIBでコーティングした磁気ビーズ("My One", Dynal)とともにインキュベートし
た。混合物を含有する試験管を磁場に置くことによって、ビーズに結合した酵母を非結合
画分から分離した。ビーズと結合しなかった酵母細胞を取り出し、新鮮な培地に入れた。
これを次に、FcγRIIIAでコーティングしたビーズと結合させた。混合物を含有する試験
管を磁場に置くことによって、ビーズに結合した酵母を非結合画分から分離した。ビーズ
と結合しなかった酵母細胞を除去し、ビーズに結合した酵母を激しいボルテックスによっ
て取り出した。回収した細胞をグルコース含有培地で再増殖させ、ガラクトースを含有す
る選択培地で再誘導した。この選択工程を反復した。その後、最終培養物を使用して、DN
Aを回収した。Fcドメインを含有するインサートをPCRによって増幅し、4-4-20中にクロー
ニングした。4-4-20 ELISAおよびADCCアッセイによって、約90のFc突然変異体をスクリー
ニングした。得られた陽性突然変異体を表16に示す。
Figure 0006389093
スクリーニング2および3: FACS、平衡スクリーニングおよび速度論的スクリーニングによ
って選択した突然変異体:
一次ライブラリースクリーニングで、396位での、プロリンからロイシンへのアミノ酸
の変化がある突然変異(P396L)が同定された。このFc変異型はFcγRIIIAおよびFcγRIIBの
両方に対して増大した結合性を示した。基準としてP396Lを使用し、第2のライブラリーを
構築した。PCR突然変異誘発を使用して、それぞれがP396L突然変異を含有し、かつその他
のヌクレオチド変化を持つ〜107の突然変異体を作製した。2セットの条件を使用して、P3
96Lライブラリーをスクリーニングした。
既述の方法を用い、モノマーとしてビオチン化FcγRIIIA-リンカー-avitagを使用して
、平衡スクリーニングを実施した。約10倍過剰のライブラリー(108細胞)を、約7nMのFcγ
RIIIA 0.5mLとともに1時間インキュベートした。結合体の上位1.2%を選択するFACSによっ
て、混合物を選別した。選択した酵母細胞を、グルコース含有選択培地で増殖させ、ガラ
クトース含有選択培地で再誘導した。平衡スクリーニングをもう一度繰り返し、結合体の
上位0.2%を回収するように、選別ゲートを設定した。次に、選択した酵母細胞をグルコー
ス中の選択条件下で増殖させた。その後、この培養物を用いてDNAを回収した。Fcドメイ
ンを含有するインサートをPCRによって増幅し、既述の方法を用いて、4-4-20可変ドメイ
ンをコードするヌクレオチド配列中にクローニングした。4-4-20 ELISAおよびADCCアッセ
イによって、約90のFc突然変異体をスクリーニングした。得られた陽性突然変異体を表17
に示す。
Figure 0006389093
FcγRIIIAとの結合について改善されたKoffを持つ突然変異体を同定するために、速度
論的スクリーニングも実施した。酵母表面に提示されたP396L Fc変異型を持つ菌株を用い
て、P396Lライブラリーをスクリーニングするための条件を確立した。簡単に述べると、
誘導条件下で増殖させた細胞を、0.1μMビオチン化FcγRIIIA-リンカー-avitagモノマー
とともに1時間、インキュベートした。細胞を洗浄して、標識したリガンドを除去した。
次に、標識した細胞を0.1μM非標識FcγRIIIA-リンカー-avitagモノマーとともにさらに
時間をとってインキュベートし、洗浄し、その後FACS分析のためにSA：PEで染色した(図2
0)。細胞をヤギ抗ヒトFcでも染色して、Fc提示がこの実験中維持されることを示した。
競合実験に基づき、1分間のインキュベーションの結果、約50%の細胞染色の損失となる
ことが決定された。P396Lライブラリーを使用する速度論的スクリーニングのために、こ
の時点を選定した。約10倍過剰のライブラリー(108細胞)を0.1μMビオチン化FcγRIIIA-
リンカー-avitagモノマーとともに0.5mL容量中でインキュベートした。細胞を洗浄して、
その後非標識リガンドとともに1分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、SA：P
Eで標識した。混合物を結合体の上位0.3%を選択するFACSによって選別した。選択した酵
母細胞を、グルコース含有選択培地で増殖させ、ガラクトース含有選択培地で再誘導した
。速度論的スクリーニングをもう一度繰り返し、結合体の上位0.2%を回収するように、選
別ゲートを設定した。FACSでの改善された結合について、選択されなかったP396Lライブ
ラリーを選択された酵母細胞と比較した(図21)。ヒストグラムは、FcγRIIIA/PEおよびヤ
ギ抗ヒトFc/FITCの両方でともに染色された細胞のパーセンテージを示す(上部右側)。
次に、第2次選別で選択された酵母細胞を、グルコース中、選択条件下で増殖させた。
次にこの培養物を使用して、DNAを回収した。Fcドメインを含有するインサートをPCRによ
って増幅し、上記の方法を使用して、4-4-20可変ドメインをコードするヌクレオチド配列
中にクローン化した。4-4-20 ELISAおよびADCCによって、約90のFc突然変異体をスクリー
ニングした。得られた陽性突然変異体を表18に示す。
Figure 0006389093
スクリーニング4および5: FcγRIIIA 158V対立遺伝子を用いた、固相FcγRIIB減損ステッ
プとFACs選別によるFcγRIIIA選択の連携
スクリーニング1により得られたFc変異型の分析で、第2次スクリーニングで選択された
突然変異体がFcγRIIIAおよびFcγRIIBの両方に対して改善された結合性を持つことが示
された。従って、そのデータから、確立された条件下での磁気ビーズ(固相)を用いた順次
減損および選択は、FcγRIIIAおよびFcγRIIBに対する差異がある結合について、効果的
な選択ではないことが示唆された。従って、FcγRIIIAと結合する一方でFcγRIIBとは結
合性が低下するかまたは結合しない突然変異体についてより効果的にスクリーニングする
ために、固相FcγRIIB減損ステップをFACS選別によるFcγRIIIA選択と連携させた。この
連携で、野生型Fcより大きいか同等の親和性でFcγRIIIAに結合するFc変異型が同定され
た。
10倍過剰の天然ライブラリー(〜107細胞)をFcγRIIBでコーティングした磁気ビーズと
ともにインキュベートした。混合物を含有する試験管を磁場に置くことによって、ビーズ
に結合した酵母を非結合画分から分離した。ビーズと結合しなかった酵母細胞を取り出し
、新たな培地に入れ、その後ガラクトースを含有する選択培地で再誘導した。この磁気ビ
ーズによるFcγRIIB減損を5回反復した。得られた酵母集団を分析して、50%を超える細胞
がヤギ抗ヒトFcで染色され、ごくわずかなパーセンテージの細胞がFcγRIIIAで染色され
ることを示すことがわかった。次にこれらの細胞を、0.1μMビオチン化FcγRIIIAリンカ
ー-avitagを用いたFACS選別によって2回選択した(データは示していない)。そのFcγRIII
Aは158Vアロタイプである。各選別後、FcγRIIIAおよびFcγRIIB結合性の両方について酵
母細胞を分析し、野生型Fcドメインによる結合性と比較した(図22)。
次に、第2次選別で選択された酵母細胞を、グルコース中、選択条件下で増殖させた。
次にこの培養物を用いてDNAを回収した。Fcドメインを含有するインサートをPCRによって
増幅し、4-4-20可変ドメインをコードするヌクレオチド配列中にクローニングした。4-4-
20 ELISAおよびADCCによって、約90のFc突然変異体をスクリーニングした。得られた陽性
突然変異体を表19に示す(突然変異体61〜66)。
Figure 0006389093
FcγRIIIAの158F対立遺伝子を用いたFc突然変異体スクリーニング:
IgGl Fcドメインについて異なる結合親和性を持つ、2種のFcγRIIIA受容体の対立遺伝
子が存在する(Koeneら、1997, Blood 90: 1109-1114；Wuら、1997, J. Clin. Invest. 10
0: 1059-70)。158F対立遺伝子は158V対立遺伝子よりも5〜10倍低い結合定数でFcドメイン
と結合する。以前には、酵母ディスプレイを使用するFcスクリーニングはすべて、この高
結合性158V対立遺伝子をリガンドとして使用して行われた。この実験では、ビオチン化Fc
γRIIIA158F-リンカー-avitagモノマーをリガンドとして使用して、FcγRIIB減損酵母集
団からFc突然変異体を選択した。上位0.25パーセントFcγRIIIA 158F結合体を選択するよ
うに、選別ゲートを設定した。得られた富化集団をFACSによって分析した(図23A)。次に
個々のクローンを単離し、別種のFcγRに対するその結合性をFACSによって分析した(図23
B)。この集団からの個々のクローンの分析の結果、5突然変異を保有する1個の突然変異体
、MgFc67(V284M, S298N, K334E, R355W, R416S)が同定された。これらはFcγRIIIAに対し
て強化された結合性とFcγRIIBに対して低下した結合性を有していた。
スクリーニング1、2、および3のための、ADCCアッセイによる突然変異体の2次スクリーニ
ング:
上記のスクリーニングで選択された突然変異体を、次に、標準的ADCCアッセイを用いて
分析して、Fc突然変異体を保有するch4-4-20が介在する溶解の比率を判定した。上記の方
法を使用して、Fc変異型を保有するch4-4-20抗体を構築した。標的としてSK-BR3細胞を使
用し、そしてエフェクター細胞は上記(セクション6.7)のようにFicoll勾配を使用してド
ナーから単離したPBMCとした。この突然変異体のADCC活性の結果を表20に総括する。
表20からわかるように、FcγRIIB減損およびFcγRIIIA選択に基づいて上記の1次および
2次スクリーニングを使用して単離した突然変異体は、野生型に比較して強化されたADCC
活性を示した。
Figure 0006389093
0.5μg/mL ch4-4-20を使用して、突然変異体、37、38、39、41、43を分析した。その他
のすべての抗体は、1μg/mLで試験した。すべての比率を野生型ch4-4-20(IgGl)に対して
標準化した。
突然変異体をさらに、抗腫瘍モノクローナル抗体 4D5(抗HER2/neu)および抗CD20モノク
ローナル抗体2H7の重鎖中に、これらのモノクローナル抗体のFcドメインと置き換えるこ
とによりクローニングした。293H細胞中への一時的トランスフェクションとタンパク質G
カラム上での精製による標準的方法を使用して、これらのキメラモノクローナル抗体を発
現させ、精製して、ADCCアッセイにより試験した。キメラ4D5抗体は標的としてSK-BR3細
胞を用いてADCCアッセイで試験し(図24)、一方キメラ2H7抗体は標的としてDaudi細胞を用
いてADCCアッセイで試験した(図25)。
BIAcoreによる突然変異体の2次スクリーニング:
上記のスクリーニングで選択した突然変異体をBIAcoreによって分析し、FcγRIIIA(158
V)およびFcγRIIBへの結合についての速度論的パラメーターを決定した。使用した方法は
上記セクション6.8に開示したものと同様である。
提示したデータは、ch4-4-20モノクローナル抗体中でFc突然変異体を使用する実験から
測定した、野生型の消失速度に相対させたKoff値である。1より大きい相対数字はKoff率
の低下を示す。1より小さい数字は消失速度の増加を示す。
FcγRIIIAについて消失速度の低下を示した突然変異体は以下のものである： MgFc38(K
392, P396L)、MgFc43(Y319F, P352L, P396L)、MgFc42(D221E, D270E, V308A, Q311H, P39
6L, G402D)、MgFc43b(K288R, T307A, K344E, P396L)、MgFc44(K334N, P396L)、MgFc46(P2
17S, P396L)、MgFc49(K261N, K210M, P396L)。FcγRIIBについて消失速度の低下を示した
突然変異体は以下のものである：MgFc38(K392, P396L)、MgFc39(E293V, Q295E, A327T)、
MgFc43(K288R, T307A, K344E, P396L)、MgFc44(K334N, P396L)。BIAcoreデータを表21に
まとめた。
Figure 0006389093
本明細書および特許請求の範囲に記載した本発明は、本明細書に開示した特定の実施形
態によって範囲を限定されるものではない。なぜならば、これらの実施形態は本発明のい
くつかの態様を説明することを意図しているからである。あらゆる等価な実施形態が本発
明の範囲内であることを想定している。実際、当業者には、前記の説明から、本明細書に
示し、かつ記載したものに加えて、多様な本発明の改変が明らかであろう。こうした改変
もまた、添付する特許請求の範囲内に入ることを想定している。
この出願中で、各種の刊行物を引用している。これらの内容の全体をすべての目的のた
めに、参照により、本出願中に組み入れるものとする。

Claims (8)

  1. 抗原結合領域および変異型Ｆｃ領域を含んでなる抗体であって、前記変異型Ｆｃ領域は
    （Ａ）抗体の野生型Ｆｃ領域に対して、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従い番号付けられた３９６位でのアミノ酸のロイシンによる置換を含むことにより前記野生型Ｆｃ領域とは異なり、
    （Ｂ）前記野生型Ｆｃ領域と比較して増大した親和性でＦｃγＲIIIＡと結合し、
    前記抗体は癌抗原と結合することを特徴とする、
    抗体。
  2. 前記癌抗原が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＭＵＣ−１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ｐ１５、β−カテニン、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、またはヒトパピローマウイルス−Ｅ７である、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記癌抗原が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項２に記載の抗体。
  4. 前記癌抗原が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頚部癌、および膵臓癌からなる群から選択される癌に関連する抗原である、請求項１に記載の抗体。
  5. 前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１に記載の抗体。
  6. 治療上有効な量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体および製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
  7. 前記組成物が、化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、および免疫療法剤からなる群より選択されるさらなる抗癌剤をさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 野生型Ｆｃ領域がヒトＩｇＧのＦｃ領域である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物。
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