ES2617446T3 - Anticuerpo anti-cd38 y lenalidomida o bortezomib para el tratamiento del mieloma múltiple y nhl - Google Patents

Anticuerpo anti-cd38 y lenalidomida o bortezomib para el tratamiento del mieloma múltiple y nhl Download PDF

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Abstract

Una combinación sinérgica de un anticuerpo específico para CD38 que comprende una región de HCDR1 de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y (a) talidomida, lenalidomida, o pomalidomida, o (b) bortezomid, para utilizar en un método para el tratamiento del mieloma múltiple y/o linfoma no Hodgkin.

Description

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Anticuerpo anti-cd38 y lenalidomida o bortezomib para el tratamiento del mieloma multiple y nhl Antecedentes
El mieloma multiple es una malignidad de celulas B caracterizada por la acumulacion latente en la medula osea de celulas de plasma secretoras con un fndice proliferativo bajo y una larga vida util. La enfermedad en ultima instancia ataca a los huesos y la medula osea, resultando en multiples tumores y lesiones en todo el sistema esqueletico.
Aproximadamente el 1% de todos los canceres, y poco mas del 10% de todas las malignidades hematologicas, pueden atribuirse al mieloma multiple (MM). La incidencia del MM aumenta en la poblacion de edad, siendo la edad media al momento del diagnostico de 61 anos. Las terapias que se encuentran disponibles en la actualidad para el mieloma multiple incluyen quimioterapia, trasplante de celulas madre, Thalomid® (talidomida), Velcade® (bortezomib), Aredia® (pamidronato) y Zometa® (acido zoledronico). Los protocolos de tratamiento actuales, que incluyen una combinacion de agentes quimioterapeuticos como vincristina, BCNU, melfalan, ciclofosfamida, adriamicina y prednisona o dexametasona, proporcionan una tasa de remision completa de solo aproximadamente el 5% y la supervivencia media es de aproximadamente 36-48 meses desde el momento del diagnostico. Los avances recientes con el uso de una alta dosis de quimioterapia y posteriormente con el trasplante autologo de celulas de la medula osea o celulas mononucleares de sangre periferica han aumentado la tasa de remision completa y la duracion de la remision. Sin embargo, la supervivencia total solo ha registrado un leve incremento, y no se han obtenido pruebas de que exista una cura. A la larga, los pacientes con MM a menudo recaen, incluso bajo terapia de mantenimiento con interferon-alfa (IFN-a) solo o en combinacion con esteroides.
El linfoma no Hodgkin es una amplia clasificacion de linfomas, que son canceres que se originan en el sistema linfatico cuando los linfocitos (celulas B o celulas T) se vuelven malignos y se proliferan de forma incontrolable para formar una masa tumoral. En total el NHL abarca aproximadamente 30 subtipos diferentes de linfoma, incluido el linfoma difuso de celulas B grandes (DLBCL) y el linfoma folicular (FL). La incidencia de NHL alcanzara mas de 140.000 en los mercados principales para 2019. Las opciones de tratamiento disponibles incluyen Rituxan/MabThera, combinaciones de los mismos, como, R-CHOP (rituximab, ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona), R-CVP (Rituxan, ciclofosfamida, vincristina y prednisona) y quimioterapia. Ademas, despues de remision o recafda, puede considerarse el trasplante de celulas madre hematopoyeticas. A pesar de las opciones de tratamiento actuales, sin embargo, las tasas de supervivencia en grupos de alto riesgo de NHL agresivo pueden ser del 30% en 5 anos. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de tratamientos y combinacion de tratamientos efectivos que aun no ha sido satisfecha.
El CD38 es un ejemplo de antfgeno expresado en dichas celulas de plasma malignas y otros linfocitos. Las funciones adscritas al CD38 incluyen tanto en la mediacion de receptor en adhesion y eventos de senalizacion y actividad (ecto-) enzimatica. Como una ectoenzima, el CD38 utiliza NAD+ como sustrato para la formacion de ADP- ribosa cfclica (ADPRc) y ADPR, pero tambien de nicotinamida y fosfato dinucleotido de acido nicotfnico-adenina (NAADP). Se ha demostrado que la ADPRc y NAADP actuan como segundos mensajeros de la movilizacion de Ca2+. Mediante la conversion de NAD+ en ADPRc, el CD38 regula la concentracion extracelular de NAD+ y, por lo tanto, la supervivencia de las celulas mediante la modulacion de la muerte celular inducida por NAD (NCID). Ademas de la senalizacion mediante Ca2+, la senalizacion del CD38 ocurre por medio de un cruce con complejos de antfgeno-receptor en celulas T y B u otros tipos de complejos de receptor, por ejemplo moleculas MHC, y de esta forma participa en varias respuestas celulares, pero tambien en el cambio y la secrecion de IgG.
Los anticuerpos especfficos para CD38 se describen en W01999/62526 (Mayo Foundation); WO200206347 (Crucell Holland); US2002/164788 A1 (Jonathan Ellis); WO2005/103083 (MorphoSys AG), US 2010/0285004 A1, WO2006/125640 (MorphoSys AG), US 2009/0123950 A1, y WO2007/042309 (MorphoSys AG), US 8.088.896; WO2006099875 (Genmab), US 7.829.673; y WO08/047242 (Sanofi-Aventis), US 2009/030471 A1.
Las combinaciones de anticuerpos especfficas para CD38 y otros agentes se describen en los documentos WO200040265 (Research Development Foundation); WO2006099875 y WO2008037257 (Genmab); y WO2010061360, WO2010061359, WO2010061358 y WO2010061357 (Sanofi Aventis).
Es claro que a pesar del avance reciente en el descubrimiento y desarrollo de agentes anticancerfgenos, muchas formas de cancer que implican tumores que expresan CD38 continuan teniendo un mal pronostico. Por lo tanto, existe una necesidad de contar con mejores metodos para tratar dichas formas de cancer.
COMPENDIO
La presente invencion proporciona una combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HcDr1 de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region
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LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5), y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGAsL (SEQ ID NO: 6) y
(a) talidomida, lenalidomida o pomalidomida; o
(b) bortezomib,
para utilizar en un metodo de tratamiento de mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invencion se refiere a una combinacion sinergica de dicho anticuerpo especffico para CD38 y talidomida, lenalidomida o pomalidomida. En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una combinacion sinergica que comprende dicho anticuerpo especffico para CD38 y bortezomib. Dichas combinaciones son utiles en el tratamiento de canceres, como, mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Los modelos in vitro e in vivo se consideran predicciones de como se comportarfa determinado compuesto o combinacion de compuestos en humanos. En este caso, las combinaciones de un anticuerpo especffico para CD38 y lenalidomida se evaluaron en lfneas celulares de mieloma multiple humano y se identifico sinergia. Ademas, la combinacion de un anticuerpo especffico para CD38 y lenalidomida, y una combinacion de un anticuerpo especffico para CD38 y bortezomib, se evaluo en modelos de raton contra celulas de mieloma multiple y celulas de linfoma de Burkitt (una forma de NHL) y se identifico sinergia. Por lo tanto, las combinaciones seguiran siendo efectivas en el tratamiento de humanos en mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin. Ademas, el anticuerpo especffico para CD38 ejemplificado en la presente memoria descriptiva se incorpora en ensayos clfnicos, donde dichas combinaciones pueden confirmarse en seres humanos.
Cuando los compuestos se combinan ya sea in vitro o in vivo, se espera que la combinacion tenga solo efectos aditivos. De manera inesperada, los inventores encontraron que la combinacion de un anticuerpo anti-CD38 particular y lenalidomida medio un nivel sinergico de Citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos (ADCC) en las lfneas celulares de mieloma multiple AMO-1 y NCI-H929. Ademas, y tambien de manera inesperada, un anticuerpo anti-CD38 particular, en combinacion con lenalidomida o con bortezomib, medio un nivel sinergico de reduccion en lisis osea en el modelo de ratones SCID de NCI-H929 y aumento sinergicamente los dfas de supervivencia media en el modelo de raton SCID de RAMOS.
Por lo tanto, tanto la combinacion del anticuerpo especffico para CD38 ejemplificado y lenalidomida y el anticuerpo especffico para CD38 ejemplificado y bortezomib se comportaron sinergicamente en los modelos in vitro y/o in vivo correspondientes a mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Una realizacion de la presente invencion comprende una combinacion en donde el anticuerpo especffico para CD38 comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSkRpS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y el segundo agente es talidomida, lenalidomida, o pomalidomida. En aspectos preferidos, la combinacion se utiliza para el tratamiento del mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Otra realizacion de la presente invencion comprende una combinacion en donde el anticuerpo especffico para CD38 comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSkRpS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y el segundo agente es el inhibidor de proteasoma bortezomib. En aspectos preferidos, la combinacion se utiliza para el tratamiento del mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra los efectos de la lenalidomida sola en la expresion de CD38 en celulas AMO-1.
La Figura 2 muestra los efectos de la lenalidomida sola en la proliferacion celular en varias lfneas celulares de mieloma multiple. Esta medida representa la citotoxicidad relativa de lenalidomida en cada lfnea celular.
La Figura 3 muestra la mediacion de ADCC en celulas AMO-1 mediante la combinacion de MOR03087 y lenalidomida. Las PBMC y celulas AMO-1 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR03087. MOR03207 se une a lisozima y se utiliza como un control de isotipo, como lo es IgG1. LEN representa lenalidomida. "Teorico" representa la adicion del valor de MOR03087 solo y el valor de LEN solo. Los datos muestran los promedios de la Tabla 3b.
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La Figura 4 muestra la mediacion de ADCC en celulas AMO-1 mediante la combinacion de MOR03087 y lenalidomida. Solo las PBMC fueron tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR03087. MOR03207 se une a lisozima y se utiliza como un control de isotipo, como lo es IgG1. LEN representa lenalidomida. "Teorico" representa la adicion del valor de MOR03087 solo y el valor de LEN solo. Los datos muestran los promedios de la Tabla 4b.
La Figura 5 muestra los efectos de la lenalidomida sola en la expresion de CD38 en celulas NCI-H929.
La Figura 6 muestra la mediacion de ADCC en celulas NCI-H929 mediante la combinacion de MOR03087 y lenalidomida. Las PBMC y celulas NCI-H929 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR03087. Teorico representa la combinacion calculada usando el concepto de producto de fracciones de Chou et al. Los datos muestran los promedios de la Tabla 7b.
La Figura 7 muestra la mediacion de ADCC en celulas NCI-H929 mediante la combinacion de MOR03087 y lenalidomida. Solo las PBMC fueron tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR03087. Teorico representa la combinacion calculada usando el concepto de producto de fraccion de Chou et al. Los datos muestran los promedios de la Tabla 8b.
La Figura 8 muestra la inhibicion de crecimiento de varias lfneas celulares de mieloma multiple causada por bortezomib solo. La CI50 en celulas AMO-1 fue 3.9nM. La CI50 en celulas LP-1 fue 6.1nM. La CI50 en celulas NCI- H929 fue 3.3nM. La CI50 en celulas RPMI-8226 fue 9.0nM.
La Figura 9 muestra la mediacion de ADCC en celulas NCI-H929 mediante la combinacion de MOR03087 a 15pg/ml y Velcade® (bortezomib). Las dos graficas representan dos donantes diferentes.
La Figura 10 muestra la mediacion de ADCC en celulas LP-1 mediante la combinacion de MOR202 a 1|3g/ml y Velcade® (bortezomib). Las dos graficas representan dos donantes diferentes.
La Figura 11 muestra la secuencia de aminoacidos de MOR202.
La Figura 12 muestra la curva de mejor ajuste, tal como se describe en Chou et al., de la combinacion de MOR202 y lenalidomida en la mediacion de ADCc en celulas AMO-1 y tambien representa la curva de Mejor Ajuste generada para el analisis de la mediacion de ADCC en celulas NCI-H929.
Las Figuras 13-18 muestran el analisis de sinergia del factor de Chou para seis experimentos separados usando la combinacion de MOR202 y lenalidomida en la mediacion de ADCC en celulas AMO-1. La Figura 13 muestra el experimento 1. La Figura 14 muestra el experimento 2. La Figura 15 muestra el experimento 3. La Figura 16 muestra el experimento 4. La Figura 17 muestra el experimento 5. La Figura 18 muestra el experimento 6. Las Figuras 13-15 derivaron de los tres experimentos que se muestran en las Tablas 3a-c, y la Figura 3. Las Figuras 16-18 fueron derivadas de los tres experimentos que se muestran en las Tablas 4a-c, y la Figura 4.
La Figura 19 muestra el volumen oseo total medio del Escaneo MicroCT de cada uno de los grupos de estudio descritos en el Ejemplo 7, donde los resultados se muestran en la Tabla 11.
Figura 20 muestra el volumen oseo total medio del Escaneo MicroCT de cada uno de los grupos de estudio descritos en el Ejemplo 11, donde los resultados se muestran en la Tabla 17.
Descripcion detallada de la invencion
"Sinergia", "sinergica" o "sinergico" significa mas que el efecto aditivo esperado de una combinacion. La "sinergia", el "sinergismo" o el efecto "sinergico" de una combinacion se determina en la presente mediante los metodos de Chou et al. y/o Clarke et al. Ver Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006). En Chou et al., se divulgan multiples metodos para determinar la sinergia y al menos uno de estos metodos se utiliza en la presente. Ver tambien Clarke et al., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255-278 (1997).
El termino "anticuerpo" significa anticuerpos monoclonales, incluido cualquier isotipo, como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Un anticuerpo IgG comprende dos cadenas pesadas identicas y dos cadenas livianas identicas que se unen mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada y liviana contiene una region constante y una region variable. Cada region variable contiene tres segmentos denominados "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR") o "regiones hipervariables", que son responsables principalmente de la union de un epftopo de un antfgeno. Se hace referencia a los mismos como CDR1, CDR2 y CDR3, numerados secuencialmente a partir del extremo N.
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Las porciones mas altamente conservadas de las regiones variables fuera de las CDR se denominan "regiones marco". Un "fragmento de anticuerpo" significa un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' F(ab')2 u otro fragmento, que contiene al menos una cadena pesada o liviana variable, que contienen cada una CDR y regiones marco.
THALOMID® (talidomida) en combinacion con dexametasona esta indicada para el tratamiento de pacientes con mieloma multiple recien diagnosticado, y es comercializada por Celgene.
Un "analogo de talidomida" incluye, a modo no taxativo, la propia talidomida, lenalidomida (CC-5013, Revlimid™), Pomalidomida (CC4047, Actimid™) y los compuestos divulgados en los documentos WO2002068414 y WO2005016326. El termino se refiere a un compuesto quimico sintetico que utiliza la estructura de talidomida como una estructura principal (por ejemplo, se han agregado grupos secundarios o dichos grupos se han eliminado de la estructura matriz). El analogo difiere en estructura de la talidomida y sus compuestos de metabolitos por ejemplo mediante una diferencia en el largo de una cadena de alquilo, un fragmento molecular, mediante uno o mas grupos funcionales, o un cambio en la ionizacion. La expresion "analogo de talidomida" tambien incluye los metabolitos de talidomida. Los analogos de talidomida incluyen la mezcla racemica del enantiomero S y R de un compuesto respectivo y el enantiomero S o al enantiomero R individualmente. Se prefiere la mezcla racemica. Los analogos de talidomida incluyen compuestos de las siguientes estructuras:
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(Formula 1),
(B) Talidomida
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(C) Pomalidomida
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donde R21, R22, R23 y R24 son cada uno independientemente H, alcoxi, amino o alquilamina, y (E)
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donde R21, R22, R23 y R24 son cada uno independientemente H, alcoxi, amino o alquilamina.
La lenalidomida se comercializa actualmente como Revlimid® por Celgene para el tratamiento del mieloma multiple. La lenalidomida se describe que tiene al menos las siguientes propiedades en relacion al tratamiento de tumores, a) citotoxica a celulas tumorales, Gandhi et al., Lenalidomide inhibits proliferation of Namalwa CSN.70 cells and interferes with Gab1 phosphorylation and adaptor protein complex assembly, Leuk Res., 30(7):849-58 (2006); b) activa las celulas destructoras naturales (Nk), Gandhi et al., Dexamethasone synergizes with lenalidomide to inhibit multiple myeloma tumor growth, but reduces lenalidomide-induced immunomodulation of T and NK cell function, Curr Cancer Drug Targets, 1;10(2):155-67 (marzo 2010); y c) regula al alza la expresion de CD38 en celulas tumorales, ver Lapalombella et al., Lenalidomide down-regulates the CD20 antigen and antagonizes direct and antibody- dependent cellular cytotoxicity of rituximab on primary chronic lymphocytic leukemia cells, Blood, 112:13, 5180-5189 (15 de diciembre de 2008). "LEN" se utiliza para describir lenalidomida.
Tal como se describe, los analogos de talidomida regulan al alza la expresion de CD38 en celulas tumorales. Otros agentes que regulan al alza la expresion de CD38 en la superficie de celulas tumorales se describen en el documento WO00/40265, US 7.223.397 (Research Development Foundation).
Un "inhibidor de proteasoma" se refiere a un compuesto que bloquea la accion de las proteasomas, es decir, complejos celulares que descomponen protefnas, tal como por ejemplo, la protefna p53. Se conocen varias clases de inhibidores de proteasoma. La clase de los boronatos peptfdicos incluye bortezomib (INN, PS-341; Velcade®), un compuesto que esta aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de recafda de mieloma multiple. Otro boronato peptfdico es CEP-18770. Otras clases de inhibidores de proteasoma incluyen aldehfdos peptfdicos (por ejemplo, MG132), sulfonas de vinilo peptfdicas, epoxicetonas peptfdicas (por ejemplo, epoxomicina, carfilzomib), inhibidores de p lactona (por ejemplo, lactacistina, MLN 519, NPI-0052, Salinosporamida A), compuestos que crean complejos de ditiocarbamato con metales (por ejemplo, Disulfiram, un farmaco que tambien se utiliza para el tratamiento del alcoholismo cronico) y ciertos antioxidantes (por ejemplo, Epigalocatequina-3-galato) catequina-3- galato y Salinosporamida A.
"VH" se refiere a la region variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. "VL" se refiere a una region variable de una cadena liviana de inmunoglobulina de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
El termino "CD38" se refiere a la protefna conocida como CD38, que tiene los siguientes sinonimos: ADP- ribosilciclasa 1, cADPr hidrolasa 1, ADP-ribosa hidrolasa cfclica 1, T10.
El CD38 humano tiene la secuencia de aminoacidos de:
MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEM RHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLAD DLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQ PEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESI ISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI (SEQ ID NO: 7).
"MOR202", un anticuerpo anti-CD38 cuya secuencia de aminoacidos se proporciona en la Figura 11. "MOR202" y "MOR03087" se utilizan como sinonimos para describir al anticuerpo que se muestra en la Figura 11.
La secuencia de ADN que codifica el Dominio Pesado Variable MOR202 es:
CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGC CTCCGGATTTACCTTTTCTTCTTATTATATGAATTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGA GCGGTATCTCTGGTGATCCTAGCAATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATA ATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGT GATCTTCCTCTTGTTTATACTGGTTTTGCTTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (SEQ ID NO: 12)
La secuencia de ADN que codifica el Dominio Liviano Variable MOR202 es:
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GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCG AT AAT CTTCGT CATT ATT AT GTTT ATT GGT ACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTT CTTGTGATTTAT GGT G ATT CT AAGCGT CCCT CAGGCATCCCGGAACGCTTT AGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCT GACCATT AGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATT ATTATTGCCAGACTTAT ACTGGTGGT GCTT CT CTTGT GTTTGG CGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG (SEQ ID NO: 13)
El anticuerpo "Ref mAB5" es un anticuerpo anti-CD38 cuya secuencia de aminoacidos se proporciona a continuacion (las CDR aparecen en negrita y subrayadas):
VH:
QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFQGKATLTADKS SKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 21)
VL:
DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSV QAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIKRT (SEQ ID NO: 22)
Las CDR de Ref mAB5 son definidas por Kabat et al. y un anticuerpo que tiene las mismas CDR que Ref mAB5 se describe en el documento WO2008/047242, US 8.153.765.
"Region Fc" significa la region constante de un anticuerpo, que en seres humanos puede ser la subclase IgG1, 2, 3, 4 u otras. Las secuencias de las regiones Fc humanas estan disponibles en IMGT, Regiones C de IGH Humano,
http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgenes.html (recuperado el 16 de mayo de 2011).
"Mejora la actividad de ADCC" significa un aumento en la mediacion de la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos. Las modificaciones de aminoacidos dentro de la region Fc que resultan en una mejora de la actividad de ADcC se divulgan en los documentos WO200042072 Genentech, WO2004029207A2 Xencor y WO2004063351 A2 Macrogenics.
"MOR03207" es un anticuerpo cuya secuencia de aminoacidos es:
VH:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWSWIRQSPGRGLEWLGRIYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDT SKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARLDHRYHEDTVYPGMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8)
VL:
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLPAYTVTWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQ AEDEADYYCASWDPSSGVVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 9).
MOR03207 se une a lisozima, y se utiliza como un control de isotipo, como lo es IgG1.
Una "combinacion" significa mas de un artfculo, por ejemplo, un compuesto tal como un anticuerpo y lenalidomida.
La presente divulgacion tambien se refiere a combinaciones, productos farmaceuticos y composiciones farmaceuticas que contienen las combinaciones descritas. Los dos componentes de la combinacion sinergica de la presente invencion, por ejemplo, el anticuerpo especffico para CD38 y lenalidomida, pueden administrarse juntos o por separado. Cuando se administran juntos, los dos componentes pueden formularse juntos en una composicion farmaceutica, que puede incluir un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable. Alternativamente los dos componentes tambien pueden formularse en diferentes composiciones farmaceuticas. En este caso, los dos componentes pueden administrarse simultaneamente o posteriormente. En una realizacion, la talidomida, lenalidomida, o pomalidomida, se administra antes y/o por separado de la administracion del anticuerpo especffico para CD38, por ejemplo, MOR202. En una realizacion adicional, la lenalidomida se administra al menos 72 horas antes de la administracion del anticuerpo especffico para CD38, por ejemplo, MOR202. Este perfodo de tiempo permite la regulacion al alza mediada por lenalidomida de CD38 en las celulas objetivo.
Una composicion farmaceutica incluye un agente activo, por ejemplo, un anticuerpo para uso terapeutico en humanos. Una composicion farmaceutica puede incluir portadores o excipientes aceptables.
"Administrado" o "administracion" incluyen, a modo no taxativo, la administracion mediante una forma inyectable, tal como, por ejemplo, via intravenosa, intramuscular, intradermica o subcutanea o via mucosa, por ejemplo, como un espray o aerosol nasal para inhalacion o como una solucion, capsula o comprimido ingerible.
Una cantidad "terapeuticamente efectiva" de un compuesto o una combinacion se refiere a una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones clfnicas de una enfermedad o trastorno dado y sus complicaciones. La cantidad que es efectiva para un fin terapeutico particular dependera de la gravedad de la
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enfermedad o lesion asf como del peso y el estado general del sujeto. Se comprendera que la determinacion de una dosificacion apropiada puede lograrse, usando experimentacion de rutina, construyendo una matriz de valores y evaluando diferentes puntos en la matriz, lo cual se encuentra dentro de las habilidades comunes de un facultativo o cientffico clfnico capacitado.
Sorpresivamente, se encontro que la combinacion de un anticuerpo anti-CD38 particular y lenalidomida medio un nivel sinergico de citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC) en celulas de mieloma multiple AMO-1 y NCI-H929. Ademas, y tambien de manera inesperada, un anticuerpo anti-CD38 particular cuando se combino con lenalidomida medio un nivel sinergico de reduccion en lisis osea en el modelo de ratones SCID de NCI-H929 y aumento sinergicamente los dfas de supervivencia media en el modelo de raton SCID de RAMOS. Por lo tanto, la combinacion del anticuerpo especffico para CD38 ejemplificado y lenalidomida se comporto sinergicamente en los modelos in vitro e in vivo relevantes a mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin. Por lo tanto, esta combinacion proporciona resultados sinergicos en el tratamiento de mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin en humanos.
La lenalidomida es un analogo de la talidomida, por lo tanto, se espera que otros analogos de talidomida, como pomalidomida o la propia talidomida provoquen tambien efectos sinergicos cuando se utilizan en combinacion con un anticuerpo anti-CD38. Ademas, una talidomida o un analogo de la misma regula al alza la expresion de CD38 en lfneas celulares de mieloma multiple, por lo tanto, se espera que la sinergia resulte cuando otros agentes que regulan al alza la expresion de CD38 en la superficie de celulas tumorales, por ejemplo, acido trans-retinoico y anticuerpos anti-CD38 se utilizan en combinacion.
Sorprendentemente, se encontro que la combinacion de un anticuerpo anti-CD38 particular y bortezomib medio un nivel alto de citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC) en lfneas celulares de mieloma multiple NCI-H929 y LP-1. Ademas, y tambien sorpresivamente se encontro que la combinacion de un anticuerpo anti-CD38 particular y bortezomib medio un nivel sinergico de reduccion en lisis osea en el modelo de ratones SCID de NCI-H929 y aumento sinergicamente los dfas de supervivencia media en el modelo de raton SCID de RAMOS. Por lo tanto, la combinacion del anticuerpo especffico para CD38 ejemplificado y bortezomib se comporto sinergicamente en los modelos in vivo relevantes a mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin. Por lo tanto, esta combinacion proporciona resultados sinergicos en el tratamiento de mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin en humanos.
Se espera que otros inhibidores de proteasoma, como, disulfiram, epigalocatequin-3-galato y salinosporamida A produzcan efectos similares cuando se utilizan en combinacion con un anticuerpo anti-CD38.
Las "CDR" en la presente son definidas por Chothia et al., Kabat et al. o por una convencion de numeracion interna. Ver Chothia C, Lesk AM. (1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol., 196(4):901-17. Ver Kabat E.A, Wu T.T., Perry H.M., Gottesman K.S. y Foeller C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5.a edic., n.° de publicacion NIH 91-3242, US Dept. of Health and Human Services, Washington, DC.
Descripcion detallada
La presente invencion se refiere a una combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 y (a) talidomida, lenalidomida, o pomalidomida, o (b) un inhibidor de proteasoma bortezomib, para utilizar en el tratamiento de mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin, donde el anticuerpo especffico para CD38 comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTyYaDSVKG (SeQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6).
Tambien se describe en la presente, el anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia DYWMQ (SEQ ID NO: 15), una region HCDR2 de la secuencia TIYPGDGDTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 16), una region HcDr3 de la secuencia GDYYGSNSLDY (SEQ ID NO: 17), una region LCDR1 de la secuencia KASQDVSTVVA (SEQ ID NO: 18), una region LCDR2 de la secuencia SASYRYI (SEQ ID NO: 19) y una region LCDR3 de la secuencia QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 20).
En un aspecto, la combinacion se utiliza para el tratamiento del mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin. En realizaciones especfficas, la combinacion comprende lenalidomida.
Un aspecto se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden las combinaciones. Preferentemente, la composicion comprende un portador aceptable. Preferentemente, la composicion se administra en una cantidad efectiva.
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Un aspecto de la presente divulgacion comprende una combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida para el tratamiento de mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Una realizacion adicional comprende una combinacion, donde el anticuerpo comprende una cadena variable de la secuencia
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 10) y una cadena liviana variable de la secuencia
DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERSGSNSGNTATLTISGTQA EDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 11).
Tambien se describe en la presente una combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia DYWMQ (SEQ ID NO: 15), una region HCDR2 de la secuencia TIYPGDGDTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 16), una region HCDR3 de la secuencia GDYYGSNSLDY (SEQ ID NO: 17), una region LCDR1 de la secuencia KASQDVSTVVA (SEQ ID NO: 18), una region LCDR2 de la secuencia SASYRYI (SEQ ID NO: 19) y una region LCDR3 de la secuencia QQHYSpPyT (SEQ ID NO:
20) y lenalidomida para el tratamiento de mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Tambien se describe en la presente una combinacion, donde el anticuerpo comprende una cadena variable de la secuencia
QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFQGKATLTADKS SKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSV TVSS (SEQ ID NO: 21) y una cadena liviana variable de la secuencia
DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSV QAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIKRT (SEQ ID NO: 22).
Preferentemente, el anticuerpo tiene una region Fc de IgG1. Preferentemente, el anticuerpo comprende una region Fc modificada, donde dicha modificacion mejora la actividad de ADCC.
En otro aspecto, los componentes de la combinacion, el anticuerpo especffico para CD38 y lenalidomida, se administran por separado. Preferentemente, la lenalidomida se administra antes de la administracion del anticuerpo especffico para CD38. En una realizacion adicional, la lenalidomida se administra al menos 72 horas antes de la administracion del anticuerpo especffico para CD38.
En otro aspecto, la combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida es capaz de mediar la destruccion de las celulas AMO-1 que expresan CD38 y/o celulas NCI-H929 mediante ADCC en presencia de PBMC humanas aisladas con al menos una eficacia dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor que la lenalidomida sola.
En otro aspecto, la combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida es capaz de reducir la lisis osea con una eficacia al menos dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor que la lenalidomida sola.
Otro aspecto comprende un metodo de tratamiento del mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin en un individuo que lo necesita, cuyo metodo comprende la administracion de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SeQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida a un individuo que tiene mieloma multiple o linfoma no Hodgkin. En algunas realizaciones, la combinacion se administra en una cantidad efectiva.
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Otro aspecto comprende una combinacion que comprende un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTyYaDSVKG (SeQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida. En una realizacion, la combinacion se utiliza para el tratamiento de mieloma multiple y linfoma no Hodgkin.
Otro aspecto comprende una combinacion de un anticuerpo especffico para CD38 y un inhibidor de proteasoma bortezomib. En algunas realizaciones, la combinacion es sinergica. En algunas realizaciones, el anticuerpo especffico para CD38 comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDr3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6).
En un aspecto, la combinacion se utiliza para el tratamiento del mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin. En algunas realizaciones, la composicion comprende un portador aceptable. En algunas realizaciones, la composicion se administra en una cantidad efectiva.
Un aspecto de la presente divulgacion comprende una combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib para el tratamiento de mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Una realizacion adicional comprende una combinacion, donde el anticuerpo comprende una cadena variable de la secuencia
qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssyymnwvrqapgkglewvsgisgdpsntyyadsvkgrftisrdns
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 10) y una cadena liviana variable de la secuencia
dieltqppsvsvapgqtariscsgdnlrhyyvywyqqkpgqapvlviygdskrpsgiperfsgsnsgntatltisgtq
AEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 11).
En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una region Fc de IgG1. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una region Fc modificada, donde dicha modificacion mejora la actividad de ADCC.
En una realizacion, la combinacion se utiliza para el tratamiento de mieloma multiple y linfoma no Hodgkin.
En otro aspecto, los componentes de la combinacion, el anticuerpo y el inhibidor de proteasoma bortezomib, se administran por separado.
En otro aspecto, la combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib es capaz de mediar la destruccion de las celulas LP-1 que expresan CD38 y/o celulas NCI-H929 mediante ADCC en presencia de PBMC humanas aisladas con al menos una eficacia dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor que el bortezomib solo.
En otro aspecto, la combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib es capaz de reducir la lisis osea con una eficacia al menos dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor que el bortezomib solo.
En otro aspecto, la presente divulgacion comprende un metodo de tratamiento del mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin en un individuo que lo necesita, cuyo metodo comprende la administracion de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ
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ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib a un individuo que tiene mieloma multiple o linfoma no Hodgkin.
En algunas realizaciones, la combinacion se administra en una cantidad efectiva.
Otro aspecto comprende una combinacion que comprende un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTyYaDSVKG (SeQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib.
Un aspecto comprende una combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y
(a) talidomida, lenalidomida, o pomalidomida, o
(b) un inhibidor de proteasoma bortezomib,
para utilizar en el tratamiento del mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Las realizaciones comprenden una combinacion, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada variable de la secuencia
qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssyymnwvrqapgkglewvsgisgdpsntyyadsvkgrftisrdns
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 10) y una cadena liviana variable de la secuencia
dieltqppsvsvapgqtariscsgdnlrhyyvywyqqkpgqapvlviygdskrpsgiperfsgsnsgntatltisgtq
AEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 11).
Las realizaciones comprenden una combinacion, donde el anticuerpo comprende una region Fc de IgG1. Las realizaciones comprenden una combinacion, donde el anticuerpo comprende una region Fc modificada, donde dicha modificacion mejora la actividad de ADCC.
Las realizaciones comprenden una combinacion, donde dicho anticuerpo especffico para CD38 y dicha talidomida, lenalidomida, o pomalidomida, o inhibidor de proteasoma bortezomib se administran por separado.
Las realizaciones comprenden una combinacion, que es capaz de reducir la lisis osea con una eficacia al menos dos veces mejor que la lenalidomida y/o bortezomib solos.
Las realizaciones comprenden una combinacion, donde dicho anticuerpo especffico para CD38 se combina con la talidomida, lenalidomida, o pomalidomida. Las realizaciones comprenden una combinacion, donde el analogo de talidomida comprende lenalidomida. Las realizaciones comprenden una combinacion, donde la lenalidomida se administra antes de la administracion del anticuerpo especffico para CD38. Las realizaciones comprenden una combinacion, donde la lenalidomida se administra al menos 72 horas antes de la administracion del anticuerpo especffico para CD38.
Las realizaciones comprenden una combinacion de un anticuerpo especffico para CD38 y lenalidomida, que es capaz de mediar la destruccion de celulas AMO-1 y/o NCI-H929 que expresan CD38 mediante ADCC en presencia de PBMC aisladas humanas con una eficacia al menos dos veces mejor que la lenalidomida sola.
Las realizaciones comprenden una combinacion, que comprende dicho anticuerpo especffico para CD38 y un inhibidor de proteasoma bortezomib. Las realizaciones comprenden una combinacion de un anticuerpo especffico para CD38 y bortezomib, que es capaz de mediar la destruccion de celulas LP-1 y/o NCI-H929 que expresan CD38 mediante ADCC en presencia de PBMC aisladas humanas con una eficacia al menos dos veces mejor que el bortezomib solo.
Un aspecto comprende una combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTyYaDSVKG (SeQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida o pomalidomida para utilizar en el tratamiento de mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
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Un aspecto comprende una combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTyYaDSVKG (SeQ ID NO: 2), una region HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib para utilizar en el tratamiento de mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
Los siguientes ejemplos ilustran la invencion que queda cubierta por las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1: Expresion de CD38 en la superficie de varias lfneas celulares
Las lfneas celulares de la Tabla 1 se evaluaron para los niveles de expresion de CD38.
Tabla 1
Lfnea celular Suministrado por: Cultivado en:
AMO-1: Lfnea celular de mieloma multiple
DSMZ NO. de ACC 538 RPMI1640, con L-Glutamina, (PAN Biotech GmbH, Cat No.: P04-16500 medio)
LP1: Lfnea celular de mieloma multiple
DSMZ No. de ACC 41 Medio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) con GlutaMAX™ (Invitrogen, Cat No.: 31980-048)
NCI-H929: Lfnea celular de mieloma multiple
DSMZ NO. DE ACC 163 RPMI1640 (igual que AMO-1), complementado con 1 mM de Na-Piruvato, 50pM de p- Mercaptoetanol
RPMI8226: Lfnea celular de mieloma multiple
DSMZ NO. de ACC 402 RPMI1640 (igual que AMO-1)
OPM-2: Lfnea celular de mieloma multiple
DSMZ NO. de ACC 50 RPMI1640 (igual que AMO-1)
Plasmacitoma, celulas de plasma malignas
Klinikum rechts der Isar RPMI1640 (igual que AMO-1)
Se obtuvieron muestras de medula osea (4-10 ml de aspirato) de pacientes con mieloma multiple y muestras de plasmacitoma de tumor extramedular despues de recibir autorizacion de Klinikum rechts der Isar ("Krdl") (Munich, Alemania). Las muestras se sometieron a centrifugacion, y se logro mas enriquecimiento celular por medio de una clasificacion celular con activacion magnetica.
Las celulas se tineron con un anticuerpo CD38-PE directamente etiquetado como QuantiBRITETM (Becton Dickinson GmbH, Clon HB7, CAT No. 342371), que es especffico para CD38. Los "anticuerpos unidos por celula" (ABC) se determinaron utilizando citometrfa de flujo en base al sistema QuantiBRITETM, que mide la media geometrica (GeoMedia) por celula. La conversion de la GeoMedia medida en una cantidad de ABC correlativa por celula se realizo con el software GraphPad PRISMTM. Se asumio que los valores de ABC se correlacionaron con el numero de moleculas CD38 por celula, dado que QuantiBRITE™ CD38-PE transporta una molecula PE por anticuerpo. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Ejemplo 2: Evaluacion del efecto de la Lenalidomida en la regulacion al alza de CD38 en varias lfneas celulares Para determinar si la lenalidomida indujo la regulacion al alza de CD8 en las celulas de mieloma multiple y plasmacitoma de la Tabla 1, las lfneas celulares se incubaron con |1l0Dde lenalidomida y, posteriormente, se analizo la expresion de superficie de CD38 mediante FACS.
Materiales y Metodos
Aproximadamente 2x105 celulas de cada una de las lfneas celulares de la Tabla 1 se colocaron en placas de 48 pocillos en un medio de RPMI estandar. La lenalidomida, adquirida de Selleck Chemicals (LLC S1029, CAS No. 191732-6; Lote: S10290), se aplico a pocillos respectivos hasta una concentracion final de 100|M en un volumen de 750|l que contenfa
20% de fCs y 0.1 % de DMSO. Como testigo negativo, se utilizo 0.1% de DMSO en un medio complementado con FCS y las placas se incubaron durante 24h, 48h y 72h a 37°C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
Las celulas se resuspendieron colocandolas cuidadosamente en pipetas y 250|l de suspension celular por perfodo de incubacion se transfirio a un pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las celulas se lavaron mediante centrifugacion durante 1 min a 700 x g y se resuspendieron en 150|l de solucion amortiguadora FACS frfa
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(1x PBS complementado con 3% de FCS). Las celulas se granularon nuevamente mediante centrifugacion y se resuspendieron en 150pl de solucion amortiguadora FACS que contema|jgl/5nl de anticuerpo anti -CD38 (MOR202, IgG1) o anticuerpo testigo MOR03207 y se incubaron durante 1 h sobre hielo. Luego se lavaron las celulas 3 veces mediante centrifugacion y se resuspendieron en solucion amortiguadora FACS complementada con el anticuerpo secundario etiquetado como PE (fragmento PE-Fab2, anti-IgG humano de cabra, fragmento espedfico Fc; Jackson Immuno Research; CAT: 109-116-098; Lote: 80938). Las celulas se incubaron durante 45 minutos sobre hielo, luego se lavaron 3 veces mediante centrifugacion y se resuspendieron en solucion amortiguadora FACS. Las suspensiones celulares se sometieron luego a analisis FACS usando un dispositivo de arreglo FACS.
La expresion de CD38 basal de cada lmea celular y el efecto de la lenalidomida en la expresion de CD38 se muestran en la Tabla 2. Adicionalmente, el efecto de la lenalidomida en la expresion de CD38 de celulas AMO-1 se muestra en la Figura 1, y el efecto de la lenalidomida en la expresion de CD38 de celulas NCI-H929 se muestra en la Figura 5.
Tabla 2
Numero absoluto de ABC (expresion de CD38) AUMENTO Aumento en veces Efecto
Lfnea celular
Basal LEN (extrapolado)
AMO-1
25,000 115,000 90,000 4.6 Importante
LP-1
125,000 162,500 37,500 1.3 No
NCI-H929
195,000 390,000 195,000 2.0 Poco
RPMI-8226
670,000 871,000 199,000 1.3 Poco
OPM-2
38,000 98,800 60,800 2.6 Importante
Plasmacitoma
30,000 69,000 39,000 2.3 Importante
Ejemplo 3: Inhibicion de proliferacion de celulas AMO-1 utilizando lenalidomida sola
La citotoxicidad de la lenalidomida se evaluo en celulas AMO-1. Las celulas se recolectaron y distribuyeron en placas de 96 pocillos con 5000 celulas por pocillo. Se agregaron cantidades cada vez mas altas de lenalidomida a los pocillos y se incubaron las placas durante 24h, 48h y 72h a 37°C en una incubadora humidificada (5% de CO2).
Despues de la incubacion, se analizaron las placas en busca de proliferacion celular en un ensayo en base a XTT colorimetrico cuantitativo utilizando el kit de proliferacion celular II (ROCHE, Kit de proliferacion celular II, Cat. No.: 11465015001). Para mediciones posteriores las placas se sometieron a una lectora Tecan Genios y se detecto absorbancia a 492nm.
Los resultados se muestran en la Figura 2.
Ejemplo 4: Combinacion sinergica de MOR0202 y lenalidomida en celulas AMO-1
Se seleccionaron celulas AMO-1 para evaluar con la combinacion de MOR202 y lenalidomida. Las celulas AMO-1 son similares a las celulas de plasmacitoma en seres humanos porque tienen una expresion de CD38 basal baja y CD38 es significativamente regulado al alza luego del tratamiento con lenalidomida como se muestra en la Tabla 2.
Las PBMC se aislaron mediante centrifugacion con gradiente de densidad de sangre humana recien aislada. La sangre aislada de diferentes donantes se recubrio en un volumen definido de Biocoll (Biochrome AG; CAT No.:L6115; LOTE No.:1050T) en un tubo Falcon y se centrifugaron a 380g. Las PbMc se aislaron y se complementaron con un medio de RPMI.
Despues de 72h, las celulas se contaron y las PBMC se ajustaron hasta una concentracion de 6.6 x 106/ml mientras que las celulas AMO-1 se ajustaron hasta una concentracion final de 2.5 x 105/ml. Para identificacion posterior en citrometna de flujo, las celulas AMO-1 se tineron durante 3min con 0.1pg/ml de CalceinAM (Calceina: 1 mg/ml de solucion concentrada, Invitrogen, Cat No.: C3099) y se lavaron tres veces mediante centrifugacion suave. Se mezclaron 100pl de suspenon de celulas blanco con KjUDde PBMC para alcanzar una rela&ni de 1:30. El anticuerpo MOR202 o anticuerpo MOR03207 (testigo negativo) se agrego hasta una concentracion final de 15pg/ml. Las suspensiones celulares se incubaron posteriormente durante 4h a 37 °C. Para detectar las celulas AMO-1
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muertas, las suspensiones celulares se desafiaron con yodo de propidio (PI) y posteriormente se analizaron en citometrfa de flujo. Las celulas blanco se separaron mediante una abertura de las poblaciones celulares de CalceinAM, y se cuantificaron las celulas destruidas mediante ADCC.
En total se realizaron seis experimentos con el fin de determinar la mediacion de ADCC en celulas AMO-1 mediante la combinacion de MOR202 y lenalidomida. En tres experimentos, los PBMC y celulas AMO-1 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202, los resultados se muestran en las Tablas 3 a-c y la Figura 3. En tres experimentos adicionales, solo las PBMC se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202, los resultados se muestran en las Tablas 4 a-c y la Figura 4.
Tabla 3 Las celulas efectoras y AMO-1 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202. Se utilizaron dosis unicas y de combinacion de 10 pM de LEN y 15pg/ml de MOR03207 y MOR202.
Los datos se presentan en las siguientes tres formas, como a) datos sin procesar (% de celulas muertas), b) datos normalizados especfficos de destruccion, donde el grupo de tratamiento con MOR202 se fija en 1 (100%), y c) datos normalizados especfficos de destruccion, donde la combinacion teorica se fija en 1 (100%). La Tabla 3a representa datos sin procesar.
Tabla 3a
AMO-1
LEN 10pM sola MOR202 solo (15pg/ml) Combinacion de LEN (10pM) y MOR202 (15ug/ml) DMSO MOR03207 (15pg/ml) MOR03207 (15pg/ml) + DMSO LEN (0pM) LEN (10 pM) sola sin PBMC Testigo DMSO sin PBMC
Exp.1
12.89 23.69 35.98 13.10 14.15 15.12 15.45 15.41 11.07
Exp.2
10.13 22.53 29.09 7.94 10.52 6.99 13.22 8.44 8.45
Exp.3
22.80 49.56 80.39 19.93 24.04 22.24 22.63 22.38 26.43
Las unidades de los valores enumerados son % de celulas muertas. Los DMSO, MOR03207, MOR03207+DMSO, LEN0, LEN10 sin PBMC y DMSO sin grupos de PBMC son testigos.
La Tabla 3b representa los datos de la Tabla 3a, pero normalizados, donde el grupo de tratamiento de MOR202 se fija en 1 (100%).
Tabla 3b
AMO-1
MOR03207 (15pg/ml) MOR202 (15pg/ml) LEN sola (10pM) Com-binacion teorica MOR202 (15pg/ml) y LEN (10pM)
Exp.1
-0.1 1.0 0.0 1.0 2.2
Exp.2
-0.2 1.0 0.2 1.2 1.8
Exp.3
0.1 1.0 0.1 1.1 2.3
Para las Tablas 3b-c, "Combinacion teorica" representa la adicion de los valores de MOR202 solo y los valores de LEN sola. Los datos normalizados de la Tabla 3b se calculan de la siguiente forma. La Tabla 3a representa el numero de celulas muertas. Por lo tanto, los valores especfficos de destruccion de la Tabla 3b se calculan restando los valores de los testigos. Luego, los valores especfficos de destruccion se comparan con el testigo MOR202, que se fijan en 1. Los promedios de los resultados en la Tabla 3b se muestran en la Figura 3.
1. Determinacion de sinergia
1.1 Chou et al.
Los metodos de Chou-Talalay se utilizaron para determinar la sinergia. Ver Chou TC, Talalay P, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55 (1984). El analisis de sinergia se lleva a cabo utilizando el metodo de Cl-isobol.
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Ecuacion del efecto medio
Los modelos de ecuacion del efecto medio del efecto de un inhibidor (tal como un farmaco) como Fa/Fu =(D/D50)Am
donde D es la dosis, Fa y Fu es la fraccion del sistema afectada y sin afectar por la dosis D (Fa + Fu = 1); D50 es la dosis que produce el efecto medio (por ejemplo, CI50, DE50, DL50). La constante m determina la forma de la curva de dosis-efecto.
Utilizamos el software Excel Fit para llevar a cabo un calculo de regresion lineal para estimar los parametros m y D50.
Los efectos de la combinacion en celulas AMO-1 se miden en % de muerte celular como se describe anteriormente. Definimos la fraccion Fu como la relacion de % de muerte celular de la linea celular tratada expuesta a un testigo. Es decir:
Fu =% de muerte celular (linea celular tratada) / % de muerte celular (linea celular sin tratar)
Entonces el % de muerte celular de una linea celular es la constante D50 en la ecuacion de efecto medio que puede estimarse mediante la regresion lineal descrita anteriormente.
Metodo IC-isobol
El metodo IC-isobol proporciona una evaluacion cuantitativa de la sinergia entre farmacos. Un indice de combinacion (IC) se estima a partir de los datos de efecto-dosis de tratamientos de farmacos simples y combinados. Un valor de IC menor que 1 indica sinergia; IC = 1 indica efecto aditivo; e IC > 1 indica antagonismo. Los rangos sinergicos se definen mejor en Chou y Talahay para valores de IC < 0.1 como un sinergia muy fuerte, los valores de IC entre 0.1 y 0.3 como sinergia fuerte, los valores de IC de 0.3- 0.7 como sinergia, los valores de IC de 0.7-0.9 como sinergia moderada a leve. La interaccion de farmacos (sinergia o antagonismo) es mas pronunciada cuanto mas lejano sea el valor IC de 1.
Formalmente, el indice de combinacion (IC) de un tratamiento de farmacos combinado se define como
CL=D1/Dx1 + D2/DX2
Aquf, D1 y D2 son las dosis del farmaco 1 y el farmaco 2, respectivamente, en la combinacion; cada uno de Dx1 y Dx2 es la dosis de un tratamiento con solo el farmaco 1 y el farmaco 2 que producirfan el mismo efecto que el de la combinacion, respectivamente. Las dosis Dx1 y Dx2 deben estimarse a partir de los datos del efecto de dosis de tratamientos de farmaco simples. Esencialmente, una ecuacion de efecto medio se ajusta a los datos de cada farmaco. A partir de la ecuacion de efecto medio de un farmaco, se puede estimar la dosis (es decir, D) necesaria para producir un efecto (es decir, Fa, Fu). Cuanto mas alejado se encuentra un punto de la linea aditiva, mas grande sera la diferencia entre 1 e IC, y por lo tanto mas fuerte sera el efecto (sinergico o antagonistic).
El metodo anterior se describe en Chou TC, Talalay P, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55 (1984). Una descripcion adicional del metodo de Chou anterior tambien se proporciona en Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006).
Las curvas generadas para los calculos de sinergia basados en Chou se muestran en las Figuras 12-18. En la Figura 12, la curva de mejor ajuste se determino quitando los puntos de datos a) donde la concentracion de MOR202 fue demasiada baja para tener algun efecto y b) donde la concentracion estuvo cerca de la saturacion. En el punto de datos apropiado, aproximadamente un 80% de destruccion celular, el valor de IC es menor que 1, confirmando una sinergia clara. Las Figs. 13-18 representan los seis experimentos de las Tablas 3 y 4, y en cada una de la Dx1 (dosis de MOR202) necesaria para alcanzar un 100% de efecto de la combinacion de MOR 202 y lenalidomida es infinito; por lo tanto, la Di/Dxi es menor que 1 y dado que la lenalidomida no tiene efecto en las celulas AMO-1 con respecto a la destruccion celular, el valor de la Dx2 tambien se aproxima a infinito, de modo que la D2/DX2 se aproxima a 0, por lo tanto los valores de IC de cada uno de los seis experimentos es menor que 1, confirmando una sinergia clara.
La Tabla 3c representa la normalizacion de los datos, donde la combinacion teorica se fija en 1 (100%) e incluye los calculos de IC de Chou.
Lfnea celular
Experimento MOR202 (0.42jg/ml) LEN (5jM) Combinacion teorica MOR202 (0.42jg/ml) y LEN (5|jM) Indice de combinacion (IC) Conclusion
AMO-1
Experimento 1 0.6 0.4 1.0 1.0 « 0.1 * sinergia
Experimento 2
0.9 0.1 1.0 2.4 « 0.1 * sinergia
Experimento 3
0.9 0.1 1.0 1.8 « 0.1 * sinergia
PROMEDI O
0.8 0.2 1.0 1.7 - -
Los datos que se muestran en la Tabla 3c difieren de las Tablas 3a y 3b. La Tabla 3c se basa en diferentes puntos de datos sin procesar que los que se muestran en la Tabla 3a, dado que las concentraciones seleccionadas en la 5 Tabla 3c estan mas cerca que la CE50 del anticuerpo (los datos sin procesar no se muestran). "Combinacion teorica" representa la adicion de los valores de MOR202 solo y los valores de LEN sola.
Tabla 4 Celulas efectoras tratadas solo con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202. Se utilizaron dosis unicas y de combinacion de 10 pM de LEN y 15pg/ml de MOR03207 y MOR202.
10
Los datos se presentan en las siguientes tres formas, como a) datos sin procesar (% de celulas muertas), b) datos normalizados especfficos de destruccion, donde el grupo de tratamiento de MOR202 se fija en 1 (100%), y c) datos normalizados especfficos de destruccion, donde la combinacion teorica se fija en 1 (100%). La Tabla 4a representa datos sin procesar.
15
Tabla 4a
AMO-1
LEN 10jM sola MOR202 solo (15jg/ml) Combinacion de LEN (10jM) y MOR202 (15jg/ml) DMSO MOR03207 15jg/ml MOR0 3207 15jg/ ml + DMSO LEN (0jM)
Exp.1
15.33 23.09 23.46 14.62 16.17 15.97 12.87
Exp.2
12.98 21.08 25.75 10.24 12.17 11.45 9.78
Exp.3
17.93 48.28 56.49 16.75 17.42 15.77 18.16
Las unidades de los valores enumerados son % de celulas muertas. Los DMSO, MOR03207, MOR03207+DMSO, LEN0, LEN10 sin PBMC y DMSO sin PBMC son testigos.
20
Tabla________________________________________________________________________________________4b
AMO-1
MOR03207 (15jg/ml) MOR202 (15jg/ml) LEN sola (10jM) Com- binacion teorica MOR202 (15jg/ml) y LEN (10jM)
Exp.1
0.5 1.0 0.1 1.1 1.1
Exp.2
0.3 1.0 0.3 1.3 1.6
Exp.3
0.0 1.0 0.0 1.0 1.3
La Tabla 4b representa los datos de la Tabla 4a, pero normalizados, donde el grupo de tratamiento de MOR202 se fija en 1 (100%). Para las Tablas 4b-c, "Combinacion teorica" representa los valores de MOR202 solo mas los 25 valores de LEN sola.
La normalizacion de los datos como se muestra en la Tabla 4b se calcula como se describe en la Tabla 3b, restando los testigos. Los promedios de los resultados en la Tabla 4b se muestran en la Figura 4.
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Lmea celular
Experimento MOR202 (0.42pg/ml) LEN (5pM) Combinacion teorica MOR202 (0.42pg/ml) y LEN (5pM) Indice de combinacion (IC) Conclusion
AMO-1
Experimento 1 1.2 -0.2 1.0 1.7 « 0.1* sinergia
Experimento 2 0.7 0.3 1.0 1.4 « 0.1* sinergia
Experimento 3 0.8 0.2 1.0 1.3 « 0.1*' sinergia
PROMEDI O 0.9 0.1 1.0 1.5 - -
La Tabla 4c representa la normalizacion de los datos, donde la combinacion teorica se fija en 1 (100%) e incluye los calculos de IC de Chou et al. usando la metodologfa descrita anteriormente en el Ejemplo 4.
La Tabla 4c difiere de las Tablas 4a y 4b. La Tabla 4c se basa en diferentes puntos de datos sin procesar que los que se muestran en la Tabla 4a, puesto que las concentraciones seleccionadas en la Tabla 4c estan mas cerca que la CE50 del anticuerpo (los datos sin procesar no se muestran).
1. Determinacion de sinergia
1.2 Sinergia segun Clarke et al.
Cuando un farmaco tiene actividad baja, como en este caso cuando la Lenalidomida sola tiene baja citotoxicidad contra celulas AMO-1, la sinergia tambien puede determinarse mediante pruebas estadfsticas de que la combinacion es considerablemente diferente al farmaco inhibidor solo. Ver Clarke et al., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255-278 (1997). Aqrn, tanto Chou et al., como se muestra anteriormente, y los metodos de Clarke et al., se utilizaron para determinar la sinergia.
Los datos se analizan de la siguiente forma:
Antagonista (AB)/C < (A/C) x (B/C)
Aditivo (AB)/C = (A/C) x (B/C)
Sinergico (AB)/C > (A/C) x (B/C)
donde A es el tratamiento con LEN sola; B es el tratamiento con MOR202 solo; C es la respuesta al vehfculo de tratamiento; AB es la combinacion de los tratamientos A y B.
Tabla 5: Los valores de datos sin procesar en esta tabla son los mismos que se muestran en la Tabla 3a, dado que provienen de los mismos tres experimentos, donde tanto las celulas efectoras y AMO-1 fueron tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202 y se utilizaron la dosis unica y de combinacion de 10pM de LEN y 15pg/ml de MOR03207 y MOR202. Launica diferencia es que los datos se analizan usando Clarke et al. en vez de Chou et al.
Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3
A: LEN sola
15.41 8.44 22.38
B: MOR202 solo
23.69 22.53 49.56
C: testigo
11.07 8.45 26.43
AB: combinacion de LEN y MOR202
35.98 29.09 80.39
(AB)/C
3.25 3.44 3.04
(A/C) x (B/C)
2.98 2.66 1.59
A = respuesta al tratamiento solo con LEN B = respuesta al tratamiento solo con MOR202
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C = respuesta al tratamiento con testigo AB = combinacion de tratamientos A y B
Los valores de A, B, C y AB representan el % de muerte celular.
En cada experimento (AB)/C es mayor que (A/C) X (B/C), lo que demuestra una sinergia clara.
Tabla 6: Los valores de datos sin procesar en esta tabla son los mismos que se muestran en la Tabla 4a, dado que provienen de los mismos tres experimentos, donde solo las celulas efectoras fueron tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202 y se utilizaron la dosis unica y de combinacion de 10p M de LEN y 15pg/ml de MOR03207 y MOR202. La unica diferencia es que los datos se analizan usando Clarke et al. en vez de Chou et al.
Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3
A: LEN sola
15.33 12.98 17.93
B: MOR202 solo
23.09 21.08 48.28
C: testigo
15.97 11.45 15.77
AB: combinacion de LEN y MOR202
23.46 25.75 56.49
(AB)/C
1.47 2.25 3.58
(A/C) x (B/C)
1.39 2.09 3.48
A = respuesta al tratamiento solo con LEN B = respuesta al tratamiento solo con MOR202 C = respuesta al tratamiento con testigo AB = combinacion de tratamientos A y B
En cada experimento (AB)/C es mayor que (A/C) X (B/C), lo que demuestra una sinergia clara.
Resultados
Con la aplicacion del analisis de Clarke et al., LEN mejoro sinergicamente la actividad ADCC de MOR202 en celulas AMO-1 en los seis experimentos. Con la aplicacion del analisis de Chou et al., LEN mejoro sinergicamente la actividad ADCC de MOR202 en celulas AMO-1 en 6 de 6 experimentos. Esta mejora de la actividad se identifico mediante varios mecanismos incluida la citotoxicidad directa, activacion de celulas efectoras y regulacion al alza de los niveles de expresion de CD38 en celulas de MM.
Los experimentos de conformidad con el ejemplo 4 tambien se realizan con otros anticuerpos especfficos para CD38, por ejemplo, el anticuerpo "Ref mAB5".
Ejemplo 5: Inhibicion de la proliferacion de celulas NCI-H929 usando lenalidomida sola
La citotoxicidad de la lenalidomida se evaluo en NCI-H929 usando los metodos descritos en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Figura 2. En resumen, la inoculacion con lenalidomida solo inhibio considerablemente la proliferacion celular en celulas NCI-H929.
Ejemplo 6: Combinacion sinergica de MOR202 y Lenalidomida en celulas NCI-H929
Se seleccionaron celulas NCI-H929 para evaluar con la combinacion de MOR202 y lenalidomida. Las celulas NCI- H929 expresan niveles mas altos de CD38 que las celulas AMO-1, por lo tanto, son representativas de ciertos tipos de celulas que se encuentran en pacientes humanos con mieloma multiple o linfoma no Hodgkin.
En total se realizaron seis experimentos, utilizando los metodos descritos en el Ejemplo 4, con el fin de determinar la mediacion de ADCC en celulas NCI-H929 mediante la combinacion de MOR202 y lenalidomida. En tres experimentos, las PBMC y las celulas NCI-H929 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202, los resultados se muestran en las Tablas 7a-b y la Figura 6. En tres experimentos adicionales, solo las PBMC se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202, los resultados se muestran en las Tablas 8a-b y la Figura 7.
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Tanto las celulas efectoras como NCI-H929 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202. Se utilizaron dosis unicas y de combinacion de 5 pM de LEN y 15|jg/ml de MOR03207 y 0.2 o 0.07 pg/ml de MOR202 Los datos se presentan de la siguiente forma, como a) datos sin procesar (% de celulas muertas), y b) datos especfficos de destruccion normalizados, donde la combinacion del producto de la fraccion se fija en 1 (100%). La Tabla 7a representa los datos sin procesar.
Tabla 7a
NCI-H929
LEN sola 5pM MOR202 solo (0.2* o 0.07 pg/ml) Combinacion de LEN (5pM) y MOR202 (0.2* o 0.07 pg/ml) DMSO LEN (0pM) MOR03207 (15pg/ml) + DMSO MOR03207 (15pg/ml)
Exp.1
38.65 30.64* 60.20* 18.01 18.42 18.27 17.81
Exp.2
41.92 43.08 66.62 18.77 19.92 20.26 19.20
Exp.3
39.92 32.54 64.58 12.32 12.44 13.74 14.09
Las unidades de los valores enumerados son % de celulas muertas. DMSO, MOR03207, MOR03207+DMSO, LEN0, LEN10 sin PBMC y DMSO sin PBMC son testigos.
La Tabla 7b representa los datos normalizados, donde la combinacion del producto de la fraccion se fija en 1 (100%).
Tabla 7b
NCI-H929
MOR202 solo (0.2* o 0.07 pg/ml) LEN sola 5pM Combinacion basada en el concepto de producto de la fraccion Combinacion de LEN (5pM) y MOR202 (0.2* o 0.07 pg/ml) Indice de combi nacion (IC) Conclusion
Exp.1
0.42* 0.67 1.00 1.36* «0.1 sinergia
Exp.2
0.58 0.56 1.00 1.12 «0.1 sinergia
Exp.3
0.45 0.67 1.00 1.24 «0.1 sinergia
PROMEDIO
0.48 0.63 1.00 1.24
La combinacion de producto de la fraccion se calcula usando la siguiente formula 1-[(1-A)*(1-B)]=fpc(%) tal como se describe en Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006). La Tabla 7b se basa en los datos sin procesar de la Tabla 7a. La normalizacion de los datos tal como se muestra en la Tabla 7b se calcula tal como se describe en la Tabla 3b, restando los testigos. En la Tabla 7b, donde la combinacion de LEN y MOR202 es mayor que la combinacion en base al concepto de producto de la fraccion, entonces existe la sinergia clara. Ademas, los valores del Indice de Combinacion se calcularon usando los metodos de Chou et al. tal como se describe en el Ejemplo 4. Los promedios de los resultados de la Tabla 7b se muestran en la Figura 6.
Tabla 8 Celulas efectoras solo tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202. Se utilizaron dosis unicas y de combinacion de 5 pM de LEN y 15jg/ml de MOR03207 y 0.2* o 0.07 pg/m de MOR202.
Los datos se presentan de la siguiente forma, como a) datos sin procesar (% de celulas muertas), y b) datos especfficos de destruccion normalizados, donde la combinacion del producto de la fraccion se fija en 1 (100%). La Tabla 8a representa los datos sin procesar.
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NCI-H929
LEN sola 5pM MOR202 solo (0.2* o 0.07 pg/ml) Combinacion de LEN (5pM) y MOR202 (0.2* o 0.07 pg/ml) DMSO LEN (0pM) MOR03207 (15pg/ml) + DMSO MOR03207 (15pg/ml)
Exp.1
17.50 26.60* 29.11* 18.36 17.56 19.52 17.07
Exp.2
25.72 47.00 51.23 22.55 24.90 24.16 23.19
Exp.3
26.27 53.74 67.99 25.29 25.16 24.43 27.10
Las unidades de los valores enumerados son % de celulas muertas. DMSO, MOR03207, MOR03207+DMSO, LEN0, LEN10 sin PBMC y DMSO sin PBMC son testigos.
La Tabla 8b representa los datos normalizados, donde la combinacion del producto de la fraccion se fija en 1 (100%).
Tabla 8b
NCI-H929
MOR202 sola (0.2* o 0.07 pg/ml) LEN sola 5pM Combinacion basada en el concepto de producto de la fraccion Combinacion de LEN (5pM) y MOR202 (0.2* o 0.07 pg/ml) Indice de combinacion (IC) Conclusion
Exp.1
1.09* -0.10 1.00 1.10* 0.07 sinergia
Exp.2
0.91 0.12 1.00 1.03 0.81 sinergia
Exp.3
0.97 0.04 1.00 1.59 «0.1 sinergia
PROMEDIO
0.99 0.02 1.00 1.24
La Tabla 8b se basa en los datos sin procesar de la Tabla 8a. La normalizacion de los datos tal como se muestra en la Tabla 8b se calcula tal como se describe en la Tabla 3b, restando los testigos. En la Tabla 8b, donde la combinacion de LEN y MOR202 es mayor que la combinacion en base al concepto de producto de la fraccion, entonces existe la sinergia clara. Ademas, los valores del Indice de Combinacion se calcularon usando los metodos de Chou et al. tal como se describe en el Ejemplo 4. Los promedios de los resultados de la Tabla 8b se muestran en la Figura 7.
Determinacion de sinergia
1.3 Concepto de producto de la fraccion
La evaluacion de los datos en este ejemplo difiere de aquellos utilizados en el analisis del efecto de la combinacion de MOR202 y LEN en celulas AMO-1 en el Ejemplo 4. Aquf se evaluan las celulas NCI-H929 y solo LEN tiene un efecto importante en la proliferacion de las celulas NCI-H929 tal como se muestra en el Ejemplo 5, por lo tanto, se utiliza el concepto de producto de la fraccion. El concepto de producto de la fraccion se describio en Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006). Allf Chou et al. establece: Si A y B inhiben cada uno 60%, entonces es una sobresimplificacion decir que el efecto aditivo consiste en 84% de inhibicion. En base al razonamiento de Webb (1963), este tipo de problema puede resolverse mediante (1-0.6)(1-0.6)=0.16, 1-0.16=0.84. Chou y Talalay (1984) lo denominaron el metodo del producto de la fraccion. Este metodo nunca producira un efecto de combinacion que excede el 100% de inhibicion. Chou y Talalay (1984), sin embargo, tambien han demostrado que este metodo tiene validez limitada porque toma en cuenta la potencia (por ejemplo, inhibicion fraccional) pero ignora la forma de la curva de dosis-efecto (por ejemplo, hiperbolica o sigmoidal). La importancia de la "forma" en el
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analisis de dosis-efecto se muestra en la Fig. 1. Chou y Talalay (1984) indicaron que el metodo de Webb es valido solo cuando ambos farmacos tienen curvas hiperbolicas (es decir, en la cinetica simple Michaelis-Menten cuando las curvas de dosis-efecto son hiperbolicas, es decir, m =1 en la grafica de efecto medio) y no es valido cuando m no es igual a 1, como curvas sigmoidales (m > 1) o sigmodiales planas (m < 1). Asimismo, el metodo de Webb es valido cuando los efectos de dos farmacos son no exclusivos entre si (por ejemplo, totalmente independientes) y no es valido para efectos mutuamente exclusivos (por ejemplo, mecanismos o modos de accion similares, tal como se asume para el isobolograma clasico, ver mas adelante).
Clarke et al. no se utilizo dado que Clarke es mas adecuado cuando una monoterapia tiene un efecto bajo.
Ver la Figura 12, la curva de mejor ajuste se determino quitando los puntos de datos a) donde la concentracion de MOR202 era demasiado baja para tener cualquier efecto y b) donde la concentracion estuvo cerca de la saturacion. En el punto de datos apropiado, aproximadamente 80% de destruccion celular, el valor IC es menor que 1, lo que confirma una sinergia clara.
Resultados
Con la aplicacion del analisis del Concepto de Producto de la fraccion, LEN mejoro sinergicamente la actividad de MOR202 en celulas NCI-H929 en 6 de 6 experimentos. Con la aplicacion del analisis de Chou et al., LEN mejoro sinergicamente la actividad de MOR202 en celulas NCI-H929 en 6 de 6 experimentos. Ver las Tablas 7a-b y 8a-b.
Ejemplo 7: MOR202 y LEN solos y en combinacion en modelo MM de ratones SCID con lisis osea de NCI-H929
Materiales
Lenalidomida (SYNthesis med chem; Shanghai, China; Lote no: ZHM-066-051). MOR202 (MorphoSys AG, Lote 100706-5KLE18). Testigo de vehfculo: Ora-Plus: Ora-Sweet SF (Paddock Laboratories, Minneapolis, mN, USA, Lote no. 9499528). Ratones SCID (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, Cepa C.B.-17-Igh-1b- Prkdcscid). Celulas de mieloma multiple humanas NCI-H929 (ver la Tabla 1). Medio de cultivo celular RPMI 1640, Suero Bovino Fetal (FBS), Mercaptoetanol, Solucion Salina Balanceada de Hank (HBSS) y penicilina-estreptomicina de Invitrogen Australia (Mt Waverley, VIC, Australia); y azul de tripano y glucosa de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia).
Metodos
63 ratones SCID fueron inoculados el Dfa (-7) ortotopicamente en la tibia derecha con 2.5 x 106 celulas NCI-H929 de MM (en 5 pL) con el fin de inducir lisis osea. Tres dfas post inoculacion (Dfa -4), 60 de los ratones SCID fueron aleatorizados por peso corporal en los grupos que se muestran en la Tabla 13, 10 ratones por grupo. El regimen de dosificacion se proporciona en la Tabla 9. Los tratamientos con lenalidomida (Grupos A y D) y Testigo de vehfculo
(Grupo C) comenzaron el Dfa (-1). Los tratamientos con MOR202 (Grupos B y D) comenzaron tratamiento continuo durante 6 semanas. Tabla 9: Regimen de dosificacion y Grupos
el Dfa 0.
Grupo
Compuesto Tratamiento Regimen
A
Lenalidomida 50 mg/kg, via oral en 10 mL/kg una vez al dfa durante 6
semanas
B
MOR202 3 mg/kg, i.p., en 10 mL/kg 3 veces a la semana durante 6
semanas
C
Testigo de vehfculo 10 mL/kg via oral una vez al dfa durante 6
(Ora-Plus:Ora-Sweet SF semanas
(1:1, p/p))
D
Combinacion de 50 mg/kg, v. oral, en 10 mL/kg una vez al dfa durante 6
Lenalidomida /MOR202 3 mg/kg, i.p., en 10 mL/kg semanas
3 veces por semana durante 6
semanas
Se utilizo un Escaneo MicroCT para evaluar la lisis osea y se incluyo
un analisis 3-dimensional que comprendio
Volumen Oseo Total (TBV), Volumen Oseo Trabecular (Tb.BV), Factor de Patron Trabecular (Tb.Pf) e Indice del Modelo Estructural (SMI). La Tabla 10 define cada uno de estos parametros. Los resultados de cada uno de los parametros del Escaneo MicroCT se muestran en la Tabla 11. Los resultados del Volumen Oseo Total (TBV) se muestran en la Figura 19.
Tabla 10: Parametros del escaneo MicroCT Parametros: Definiciones:
Volumen oseo total Volumen oseo cortical y trabecular total dentro del volumen de interes (mm3) (seccion transversal).
Volumen
trabecular
oseo Volumen oseo trabecular dentro del volumen de interes (seccion transversal).
AFactor de patron Indice de fragmentacion; Un indice inverso de conectividad con aplicacion
trabecular (Tb.Pf) especffica al hueso trabecular. Un Tb.Pf inferior significa redes trabeculares
mejor conectadas mientras que un Tb.Pf mas alto significa una estructura trabecular mas desconectada (es decir, mas lisis osea).
** Indice de modelo Un indicador de la prevalencia relativa de varillas y placas en una estructura
estructural (SMI) 3D tal como el hueso trabecular. Este parametro es importante en la
osteolisis de los huesos que se caracteriza por una transicion de estructuras similares a placa (normal) a similares a varillas (degradacion). Una placa, cilindro y esfera ideales tienen valores de SMI de 0, 3 y 4, respectivamente. Cuanto mas alto sea el valor, mas dano existe.
Tabla 11: Resultados del Escaneo MicroCT: Volumen Oseo Total (TBV), Volumen Oseo Trabecular (Tb.BV), Factor de Patron Trabecular (Tb.Pf) e Indice de Modelo de Estructura (SMI).
Grupo Tratamiento
ID de raton Volumen oseo total (TBV) mm-3 Volumen oseo trabecular (Tb.BV) „ -2 m m Factor de patron trabecular (Tb.Pf) -1 mm Indice de modelo estructural (SMI)
38045 2.748 0.244 15.354 1.756
38596 2.839 0.295 12.373 1.542
39565 2.930 0.314 14.703 1.847
38325 2.964 0.309 13.538 1.653
Control Tibia de referencia
33746 2.751 0.293 13.270 1.624
no inoculada*
38770 2.567 0.307 13.025 1.645
37966 2.967 0.410 12.125 1.557
38604 3.087 0.327 11.902 1.658
38023 2.775 0.270 18.005 1.889
38594 2.830 0.311 13.293 1.589
Media 2.846 0.308 13.759 1.676
EEM 0.047 0.014 0.583 0.037
33150 1.604 0.107 24.329 2.679
38027 1.742 0.100 23.561 2.667
38314 2.506 0.256 22.893 2.335
38446 2.466 0.213 28.280 2.560
38562 2.688 0.385 22.213 2.086
Lenalidomida
38626 2.869 0.293 30.739 2.619
A 50 mg/kg
38748 1.786 0.114 24.016 2.562
39192 1.988 0.081 29.454 2.592
39364 1.741 0.155 24.205 2.547
39512 2.007 0.219 38.360 3.125
Media 2.140 0.192 26.805 2.577
EEM 0.143 0.031 1.584 0.083
32094 2.233 0.190 27.049 2.386
32548 2.893 0.310 15.631 1.818
33564 2.760 0.356 27.631 2.423
38016 1.635 0.118 27.523 2.450
38023 2.681 0.248 17.887 1.860
B MOR03087, 3 mg/kg
38510 1.838 0.260 21.405 2.461
38599 2.884 0.482 26.345 2.558
39086 3.068 0.566 20.327 2.247
39666 2.547 0.416 25.843 2.318
39715 2.135 0.284 22.402 2.275
Media 2.467 0.323 23.204 2.280
EEM 0.153 0.043 1.365 0.079
33090 1.821 0.159 26.537 2.714
33131 1.863 0.132 28.429 2.681
33746 1.577 0.130 29.171 2.652
C Testigo de
37966 1.865 0.234 18.276 2.327
Vehfculo
38325 2.030 0.096 30.839 2.591
(Ora Plus:Ora Sweet SF
38596 1.870 0.154 33.079 2.783
(1:1) p/p)
38604 1.904 0.232 23.234 2.607
38770 2.461 0.210 19.149 2.137
39426 1.556 0.184 21.846 2.348
39565 2.235 0.256 24.545 2.365
Media 1.918 0.179 25.510 2.521
EEM 0.087 0.017 1.567 0.067
32695 2.471 0.168 21.323 2.028
37854 2.527 0.265 15.938 1.758
38276 3.212 0.220 20.046 2.197
38550 2.833 0.186 17.907 1.892
Lenalidomida,
38594 3.044 0.268 16.530 1.787
AB 50 mg/kg
38994 2.896 0.408 14.633 1.683
/ MOR03087,
39256 2.308 0.304 24.513 2.280
3 mg/kg
39555 3.227 0.215 19.753 2.497
39677
3.205 0.548 12.313 1.799
39750
2.961 0.281 14.981 1.752
Media
2.868 0.286 17.794 1.967
EEM
0.105 0.036 1.152 0.086
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El analisis de cada parametro para actividad sinergica se realizo de conformidad con el teorema de Clarke et al. La Tabla 12 muestra los calculos realizados para determinar la sinergia de la combinacion de MOR202 y lenalidomida.
Tabla 12
Cuando el EFECTO POSITIVO tiene un valor ALTO:
Cuando el EFECTO POSITIVO tiene un valor BAJO:
Antagonista = (AB)/C < (A/C) x (B/C)
Antagonista (AB)/C > (A/C) x (B/C)
Aditivo = (AB)/C = (A/C) x (B/C)
Aditivo = (AB)/C = (A/C) x (B/C)
Sinergico = (AB)/C > (A/C) x (B/C)
Sinergico = (AB)/C < (A/C) x (B/C)
A = respuesta al tratamiento de LEN 50 mg/kg
B = respuesta al tratamiento de MOR202 3 mg/kg
C = respuesta al tratamiento con vehfculo
AB = combinacion de los tratamientos 1 y 2
BV Total BV Trabecular Factor de patron trabecular Indice de modelo estructural
A
2,14 0,192 26,805 2,577
B
2,467 0,323 23,204 2,28
C
1,918 0,179 25,51 2,521
AB
2,868 0,286 17,794 1,967
(AB)/C...
1,495307612..... es mayor que 1,597765363 es menor que 0,69753038 es menor que 0,780245934 es menor que
(NC) x (B/C)
1,44 1,94 0,96 0 92
Los valores numericos que se muestran en la Tabla 12 se toman directamente de los promedios que se muestran en la Tabla 11 para cada uno de los parametros en cada uno de los Grupos. Los Grupos descritos como A, B, C y AB son los mismos grupos de tratamiento en las Tablas 9, 11 y 12.
En total, el Volumen Oseo (AB)/C es mayor que (A/C) X (B/C) lo que muestra una clara sinergia. En el factor de patron Trabecular e Indice de Modelo Estructural, tal como se describe en la Tabla 10, un valor inferior representa menos lisis osea (eficacia de tratamiento), por lo tanto, (AB)/C menor que (A/C) X (B/C), muestra una clara sinergia en ambos parametros.
Resultados
La inoculacion de celulas de mieloma multiple NCI-H929 indujo una lisis osea importante en la tibia de ratones hembra SCID en este estudio, tal como se indica mediante la medicion de la lisis osea a traves de un escaneo microCT. El grado de lisis osea se redujo considerablemente en la tibia de ratones tratados con la combinacion de MOR202 y lenalidomida, tal como se muestra mediante escaneo microCT. En cada uno de los parametros de Escaneo MicroCT: Volumen Oseo Total (TBV), Volumen Oseo Trabecular (Tb. BV), Factor de Patron Trabecular (Tb. Pf) e Indice de Modelo estructural (SMI), la combinacion de MOR2002 y lenalidomida (Grupo AB) mostro una clara sinergia en la reduccion de la lisis osea causada por celulas de mieloma multiple NCI-H929.
Cuando los valores en la Tabla 11 se ajustan, de forma que el Grupo Testigo (Tibia contralateral no inoculada sin tumor) se considera con 0% de lisis osea, y el Grupo C (Testigo de vehfculo (0.9% de inyeccion de cloruro de sodio) se considera con 100% de lisis osea, entonces MOR202 solo redujo la lisis osea de manera dependiente de dosis hasta 55% a 12 mg/kg en comparacion con el Testigo de vehfculo. LEN solo a 50 mg/kg inhibio la lisis osea en un 20%. La combinacion de 3 mg/kg de MOR202 y 50 mg/kg de LEN suprimio por completo la lisis osea. Estos hallazgos confirman un efecto sinergico de la terapia de combinacion. Ademas, hubo una reduccion (>90%) de los niveles de suero de protefna M en el grupo de combinacion, lo que indica una reduccion importante de la carga de tumor.
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Ejemplo 8 MOR202 y lenalidomida solos y en combinacion contra tumor RAMOS de no Hodgkin humano en modelo de supervivencia de ratones SCID hembras
Materiales
Ciclofosfamida (Fluka, Buchs Suiza, Lote No. 07551661). Lenalidomida (SYNthesis Med Chem; Shanghai, China; Lote No. ZHM-066-051). MOR202 (MorphoSys AG, Lote 100706-5KLE18). Testigo de vehfculo: Ora-Plus:Ora-Sweet SF, 1:1, v/v (SYNthesis Med Chem, Shanghai, China). Ratones SCID (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, Cepa C.B.-17-Igh-1b-Prkdcscid).
Se cultivaron celulas RAMOS (Oncodesign, Dijon Cedex, Francia) en RPMI1640 + 20% de una fuente alterna inactivada de calor FBS + 1 % de Glutamax (Medio No. 2). Los reactivos para cultivo de celulas RAMOS de linfoma no Hodgkin se obtuvieron de los siguientes proveedores: Medio de cultivo celular RPMI 1640, FBS, Glutamax, HEPES, piruvato de sodio, HBSS y penicilina-estreptomicina de Invitrogen Australia (Mt Waverley, VIC, Australia); y azul de tripano y glucosa de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia).
Metodos
Sesenta y ocho ratones SCID hembras fueron pre-tratados con Ciclofosfamida (75 mg/kg, i.p., dos veces al dfa) durante dos dfas antes de la inoculacion de celulas RAMOS (Dfa -5 y -4). El dfa de la inoculacion (Dfa -3), todos los ratones fueron inoculados con 1 x 106 celulas RAMOS cada una por via intravenosa en la vena de la cola. Sesenta y cuatro de los ratones fueron aleatorizados por peso corporal en ocho grupos de ocho. El regimen de dosificacion para cada grupo se muestra en la Tabla 13.
Grupo Compuesto Tratamiento Regimen pretendido Regimen real
A
Lenalidomida 50 mg/kg,vfa oral, en 10 mL/kg Una vez al dfa (Dfa 020) Dfa 0-20
B
MOR03087 1 mg/kg, i.v., en 10 mL/kg Dos veces a la semana Dos veces a la semana (Dfa 0, 4, 7, 11, 14 y 18) ( Dfa 0, 4, 7, 11, 14 y 18)
C
Vehfculo testigo (Ora- Plus: Ora-Sweet, 1:1, v/v) via oral, 10 mL/kg Una vez al dfa (Dfa 020) Dfa 0-18
AB
Lenalidomida /MOR03087 100/1 mg/kg, via oral/i.v., en 10 mL/kg Una vez al dfa/dos veces a la semana (como anteriormente) Dfa 0-13 y 16-20/ Dfa O, 4, 7, 11, 14 y 18
El estudio continuo durante 98 dfas y el punto final medido fue la supervivencia. Los resultados de cada Grupo se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14: Numero de Supervivencia y perfodo de tiempo para cada grupo
Dfa de muerte (post-inoculacion) %ILS (en base al dfa de muerte medio) Numero de ratones vivos al final del estudio (dfa 98)
Mediana Rango Media 95% de IC
A: LEN 100 mg/kg
22 18-23 21.4 19.8-23.0 10 0/7
B: MOR202 1 mg/kg
51 35-65 49.6 41.9-57.3 155 0/8
C: Testigo de vehfculo
20 18-21 19.8 18.7-20.8 X 0/8
AB: Combo LEN/MOR
65 32-98 66.5 41.9-91.2 225 3/8
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Los analisis para actividad sinergica se realizaron de conformidad con el teorema de Clarke et al., tal como se describe en el Ejemplo 4. La Tabla 15 muestra los calculos realizados para determinar la sinergia de la combinacion de MOR202 y lenalidomida.
Tabla 15
Cuando el EFECTO POSITIVO tiene un valor ALTO:
Cuando el EFECTO POSITIVO tiene un valor BAJO:
Antagonista = (AB)/C < (A/C) x (B/C)
Antagonista = (AB)/C > (A/C) x (B/C)
Aditivo = (AB)/C = (A/C) x (B/C)
Aditivo = (AB)/C = (A/C) x (B/C)
Sinergico = (AB)/C > (A/C) x (B/C)
Sinergico = (AB)/C < (A/C) x (B/C)
A = respuesta al tratamiento con LEN 100 mg/kg
B = respuesta al tratamiento con MOR202 1 mg/kg
C = respuesta al tratamiento con vehfculo
AB = combinacion de los tratamientos A y B
Supervivencia media
A
22
B
51
C
20
AB
65
(AB)/C
3,25
es mayor que
(A/C) x (B/C)
2,805
Los valores numericos que se muestran en la Tabla 15 se toman directamente de los dfas de supervivencia media que se muestran en la Tabla 14 para cada uno de los Grupos. Los Grupos descritos como A, B, C y AB son los mismos grupos de tratamiento en las Tablas 13-15.
La inoculacion con celulas RAMOS fue letal dentro de un tiempo medio de 20 dfas en el grupo testigo. La combinacion de MOR202 y lenalidomida, sin embargo, mostro una clara sinergia en el aumento de los dfas de supervivencia media.
Ejemplo 9: Bortezomib solo inhibio la proliferacion de varias lfneas celulas de mieloma multiple.
El efecto inhibitorio de Bortezomib en la proliferacion de celulas de mieloma multiple se analizo para multiples lfneas celulares. Se aplicaron cantidades cada vez mas altas de Bortezomib (Velcade®, Lote: No.: 9AZSY00) a celulas AMO-1, LP-1, NCI-H929 y RPMI-8226 y se incubaron durante 24h, 48h y 72h. Despues de la incubacion, se analizaron las placas de los perfodos en busca de proliferacion celular en un ensayo en base a XTT colorimetrico cuantitativo utilizando el kit de proliferacion celular II (ROCHE, Kit de proliferacion celular II, Cat. No.: 11465015001). Para mediciones posteriores, las placas se sometieron a una lectora Tecan Genios y se detecto absorbancia a 492nm.
La proliferacion celular de todas las lfneas celulares evaluadas se inhibio mediante Bortezomib con una concentracion CI50 de 3.9 nM para celulas AMO-1, 6.1 nM para celulas LP-1, 3.3 nM para celulas NCI-H929 y 9.0 nM para celulas RPMI-8226, respectivamente, tal como se muestra en la Figura 8.
Ejemplo 10: ADCC utilizando la combinacion de MOR202 y Bortezomib
Usando los metodos descritos en el Ejemplo 4, se analizo el efecto ADCC de combinar bortezomib y MOR202. Aquf, las celulas blanco se trataron con bortezomib antes del tratamiento con MOR202. Ambas celulas blanco, NCI-H929 y LP-1 fueron evaluadas. Los resultados se muestran en las Figuras 9 y 10. La mejora de la actividad de MOR202 mediante bortezomib fue mediada a traves del efecto citotoxico directo en celulas de MM.
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Ejemplo 11: MOR202 y BOR solos y en combinacion en modelo de raton SCID de lisis osea de NCI-H929 de mieloma multiple humano
Materiales
Bortezomib (SYNthesis med chem., Shanghai, China, Lote No. ZHM-066-054). Bortezomib se formulo en solucion de Cloruro de Sodio al 0.9% esteril para dosificacion. MOR202 (MorphoSys AG, Lote 100706-5KLE18). Testigo de vehfculo: 0.9% de inyeccion de cloruro de sodio. Ratones SCID (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, Cepa C.B.-17-Igh-1b-Prkdcscid).
Metodos
63 ratones SCID fueron inoculados el Dfa (-7) por via intratibial con 2.5 x 106 celulas NCI-H929 de MM con el fin de inducir la lisis osea. Tres dfas post inoculacion (Dfa-4), 60 de los ratones SCID fueron aleatorizados por peso corporal en los grupos que se muestran en la Tabla 16, 10 ratones por grupo. El regimen de dosificacion se proporciona en la Tabla 16. Los tratamientos con Bortezomib (Grupos A y AB) y Testigo de vehfculo (Grupo C) comenzaron el Dfa (-1). Los tratamientos con MOR202 (Grupos B y AB) comenzaron el Dfa 0. El tratamiento continuo durante 6 semanas.
TablaJB^Rgimendedosificacion^Grupos
Grupo
Compuesto Tratamiento Regimen
A
Bortezomib 0.6 mg/kg, i.p., en 10 mL/kg dos veces por semana
B
MOR202 3 mg/kg, i.p., in 10 mL/kg tres veces por semana
C
Testigo de vehfculo (0.9% de inyeccion de cloruro de sodio) i.p., 10 mL/kg dos veces por semana
AB
Bortezomib/MOR202 0.6/3 mg/kg, i.p., en 10 mL/kg dos veces/tres veces por semana, en dfas alternados
Se utilizo un Escaneo MicroCT para evaluar la lisis osea y se incluyo un analisis 3-dimensional que comprendio el Volumen Oseo Total (TBV), Volumen Oseo Trabecular (Tb.BV), Factor de Patron Trabecular (Tb.Pf) e Indice del Modelo estructural (SMI). La Tabla 10 anterior define cada uno de estos parametros. Los resultados de cada uno de los parametros del Escaneo MicroCT se muestran en la Tabla 17. Los resultados del Volumen Oseo Total (TBV) se muestran en la Figura 20.
Tabla 17: Resultados del Escaneo MicroCT: Volumen Oseo Total (TBV), Volumen Oseo Trabecular (Tb.BV), Factor de Patron Trabecular (Tb.Pf) e Indice de Modelo estructural (SMI).
Grupo
Tratamiento ID de Volumen Volumen oseo Factor de patron Indice de
raton oseo total trabecular trabecular modelo
(TBV) mm-3 (Tb.BV) mm-2 (Tb.Pf) mm 1 estructural
mm mm mm (SMI)
Testigo:
115898 2.771 0.400 12.097 1.525
Tibia
116259 3.255 0.598 7.999 1.264
contralateral 1 no inoculada sin tumor
Tibia de referencia, un 109482 3.194 0.566 5.596 1.025
raton de los
Grupos A, B, C 107508 2.945 0.346 16.910 1.860
Y AB) _____________________________________________________________
Promedio 3.041 0.477 10.650 1.419
EEM 0.112 0.062 2.481 0.179
101426 2.351 0.307 25.893 2.443
105949 2.025 0.191 26.044 2.374
107598 3.109 0.557 16.877 2.156
109560 3.146 0.588 23.179 2.262
113302 1.790 0.067 32.463 2.700
Bortezomib, 115836 1.893 0.076 33.152 2.981
A
0.6 mg/kg, dos 116981 2.201 0.100 34.609 3.007
veces por
semana,
i.p. 117585 1.617 0.093 31.813 2.553
117750 2.300 0.284 27.147 2.337
117793 2.448 0.329 23.582 2.273
Promedio 2.288 0.259 27.476 2.509
EEM 0.162 0.061 1.756 0.094
106446 1.924 0.082 27.363 2.546
109482 1.987 0.388 19.479 2.079
112220 2.155 0.394 21.858 2.296
113668 1.958 0.276 23.814 2.429
MOR202, 115187 2.080 0.440 16.347 1.871
B
3 mg/kg, tres 115956 2.207 0.460 19.748 2.193
veces por 116312 1.885 0.234 25.212 2.368
semana,
i.p. 116798 1.882 0.254 21.276 2.436
116944 1.937 0.276 24.031 2.368
117773 1.862 0.160 25.056 2.511
Promedio 1.988 0.296 22.418 2.310
EEM 0.038 0.039 1.044 0.066
107097 1.619 0.248 22.779 2.246
112122 1.608 0.178 26.514 2.505
115971 1.637 0.241 24.603 2.485
Testigo de 116259 1.880 0.369 19.334 2.176
vehfculo: (0.9% de 116585 2.060 0.179 24.120 2.369
C
inyeccion 116779 1.624 0.190 23.909 2.417
de cloruro 117054 1.782 0.131 23.000 2.541
dos veces por 117110 1.838 0.281 22.602 2.312
semana, i.p. 117242 1.919 0.281 21.162 2.193
117375 1.899 0.283 23.455 2.338
Promedio 1.786 0.238 23.148 2.358
EEM 0.050 0.022 0.615 0.041
107508 3.303 0.927 16.902 2.158
112625 4.254 1.661 3.000 0.772
113322 3.684 1.332 3.888 0.884
116030 2.422 0.192 30.272 2.542
AB Bortezomib/MOR
116198 3.537 1.037 8.023 1.217
202, 0.6/3 mg/kg, dos/tres veces por semana, i.p
116376 1.933 0.255 22.059 2.321
116520 2.793 0.654 22.439 2.336
117077 3.402 0.658 7.207 1.241
117093 2.436 0.643 17.454 1.927
117135 3.026 0.627 13.699 1.775
Promedio 3.079 0.799 14.494 1.717
EEM 0.220 0.144 2.836 0.204
El analisis de cada parametro para actividad sinergica se realizo de conformidad con el teorema de Clarke et al., tal
como se describe en el Ejemplo 4.
La Tabla 18 muestra los calculos realizados para determinar la sinergia de la
combinacion de MOR202 y bortezomib. 5 Tabla 18
Cuando el EFECTO POSITIVO tiene un valor MAS ALTO:
Cuando el EFECTO POSITIVO tiene un valor MAS BAJO:
Antagonista = (AB)/C < (A/C) x (B/C)
Antagonista = (AB)/C > (A/C) x (B/C)
Aditivo = (AB)/C = (A/C) x (B/C)
Aditivo = (AB)/C = (A/C) x (B/C)
Sinergico = (AB)/C > (A/C) x (B/C)
Sinergico = (AB)/C < (A/C) x (B/C)
A = respuesta al tratamiento con BOR a 0.6 mg/kg B = respuesta al tratamiento con MOR202 a 3 mg/kg
C = respuesta al tratamiento con vehiculo de 0.9% de Cloruro de Sodio
AB = combinacion de los tratamientos A y B
Grupo
BV Total BV Trabecular Factor de patron trabecular indice de modelo estructural
A
2,298 0,259 27,476 2,509
B
1,988 0,296 22,418 2,31
C
1,786 0,238 23,148 2,358
AB
3,079 0,799 14,494 1,717
(AB)/C
3,357142857 0,626144807 0,728159457
es mayor que es mayor que es menor que es menor que
(A/C) x
1,353435492 1,149538246 1,042377527
Los valores numericos que se muestran en la Tabla 18 se toman directamente de los promedios que se muestran en la Tabla 17 para cada uno de los parametros en cada uno de los Grupos. Los Grupos descritos como A, B, C y AB son los mismos grupos de tratamiento en las Tablas 16-18.
10
En total, el Volumen Oseo Total y Volumen Oseo Trabecular, (AB)/C) es mayor que (A/C) X (B/C), lo que muestra una clara sinergia. En el factor de patron Trabecular e Indice de Modelo Estructural, tal como se describe en la Tabla 10, un valor inferior representa menos lisis osea (eficacia de tratamiento), por lo tanto, (AB)/C menor que (A/C) X (B/C), confirma una clara sinergia en ambos parametros.
15
Resultados
La inoculacion de celulas de mieloma multiple NCI-H929 indujo una lisis osea importante en la tibia de ratones hembra SCID en este estudio, tal como se indica mediante la medicion de la lisis osea a traves de un escaneo
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microCT. El grado de lisis osea se redujo considerablemente en la tibia de ratones tratados con la combinacion de MOR202 y bortezomib, tal como se muestra mediante escaneo microCT. En cada uno de los parametros de Escaneo MicroCT: Volumen Oseo Total (TBV), Volumen Oseo Trabecular (Tb. BV), Factor de Patron Trabecular (Tb. Pf) e Indice de Modelo estructural (SMl), la combinacion de MOR2002 y bortezomib (Grupo AB) mostro una clara sinergia en la reduccion de la lisis osea causada por celulas de mieloma multiple NCI-H929.
Cuando los valores en la Tabla 17 se ajustan, de forma que el Grupo Testigo (Tibia contralateral no inoculada sin tumor) se considera con 0% de lisis osea, y el Grupo C (Testigo de vehfculo (0.9% de inyeccion de cloruro de sodio) se considera con 100% de lisis osea, entonces MOR202 solo redujo la lisis osea de manera dependiente de dosis hasta 55% a 12 mg/kg en comparacion con el Testigo de vehfculo, BOR solo a 0.6mg/kg inhibio la lisis osea en un 40% y la combinacion de una dosis inferior de 3mg/kg MOR202 y 0.6mg/kg de BOR suprimio completamente la lisis osea. Estos hallazgos respaldan un efecto sinergico de la terapia de combinacion. Ademas, hubo una reduccion (>90%) de los niveles de suero de protefna M en el grupo de combinacion, lo que indica una reduccion importante de la carga de tumor.
Ejemplo 12 MOR202 y bortezomib solos y en combinacion contra tumor RAMOS de no Hodgkin humano en modelo de supervivencia de ratones SCID hembras
Materiales
Ciclofosfamida (Fluka, Buchs Suiza, WB10468). Bortezomib (SYNthesis med chem., Shanghai, China, Lote No. ZHM-066-054). Bortezomib se formulo en solucion de cloruro de sodio al 0.9% esteril para dosificacion. MOR202 (MorphoSys AG, Lote 100706-5KLE18). Testigo de vehfculo: 0.9% de inyeccion de cloruro de sodio. Ratones SCID (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, Cepa C.B.-17-Igh-1b-Prkdcscid).
Se cultivaron celulas RAMOS (Oncodesign, Dijon Cedex, Francia) en RPMI1640 +
20% de una fuente alterna inactivada de calor FBS + 1 % de Glutamax (Medio No. 2). Los reactivos para cultivo de celulas RAMOS de linfoma no Hodgkin se obtuvieron de los siguientes proveedores: Medio de cultivo celular RPMI 1640, FBS, Glutamax, HEPES, piruvato de sodio, HBSS y penicilina-estreptomicina de Invitrogen Australia (Mt Waverley, VIC, Australia); y azul de tripano y glucosa de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia).
Metodos
Cincuenta y cinco ratones SCID hembras fueron pre-tratados con ciclofosfamida (75 mg/kg, i.p., dos veces al dfa) durante dos dfas antes de la inoculacion de celulas RAMOS (Dfa -5 y -4). El dfa de la inoculacion (Dfa -3), los cincuenta y cinco los ratones fueron inoculados con 1 x 106 celulas RAMOS cada una (en 100|jl) por via intravenosa en la vena de la cola. Cuarenta y ocho de los ratones fueron aleatorizados por peso corporal en seis grupos de ocho. El regimen de dosificacion para cada grupo se muestra en la Tabla 19.
TabaJ^Regmendedosificacion
Grupo
Compuesto Tratamiento Regimen pretendido Regimen real
A
Bortezomib 0.6 mg/kg, i.p., en 10 Dfa -1, 3, 6, 10, 13 y 17 Dfa -1, 3, 6 y 13
mL/kg
B
MOR202 1 mg/kg, i.v., en 10 Dfa 0, 4, 7, 11, 14 y 18 Dfa 0, 4, 7, 11, 14 y
mL/kg 18
C
Testigo de vehfculo (0.9% de solucion salina i.p., 10 mL/kg Dfa -1, 3, 6, 10, 13 y 17 Dfa -1, 3, 6, 13 y 17
para inyeccion) 0.6/1 mg/kg, i.p./i.v., Dfa -1, 3, 6, 10, 13 y 17/ Dfa -1, 3, 6, 13, 17
AB
Bortezomib/MOR202 en 10 mL/kg Dfa 0, 4, 7, 11, 14 y 18 y 20/ Dfa 0, 4, 7,
11,14y18
El estudio continuo durante 98 dfas y el punto final medido fue la supervivencia. Los resultados de cada Grupo se muestran en la Tabla 20.
Dfas de muerte (post- inoculacion) % de ILS (en base al dfa de muerte medio) Numero de ratones vivos al final del estudio (dfa 98)
Mediana Rango Media 95% de IC
A: BOR 0.6 mg/kg
19 18-20 19.1 18.4 19.8 -7 0/8
B: MOR202 1 mg/kg
43.5 38-52 43.6 39.0 48.3 112 0/8
C: Testigo de vehfculo
20.5 20-22 20.8 20.0 21.5 X 0/8
AB: Combo BOR/MOR
45 29-98 61.6 19.7 103.5 120 2/5
5
10
El analisis de actividad sinergica se realizo de conformidad con el teorema de Clarke et al. La Tabla 21 muestra los calculos realizados para determinar la sinergia de la combinacion de MOR202 y bortezomib.
Tabla 21
Los valores numericos que se muestran en la Tabla 21 se toman directamente de los dfas de supervivencia media que se muestran en la Tabla 20 para cada uno de los Grupos. Los Grupos descritos como A, B, C y AB son los mismos grupos de tratamiento en las Tablas 19-21.
imagen6
La inoculacion con celulas RAMOS fue letal dentro de un tiempo medio de 20.5 dfas en el grupo testigo. La combinacion de MOR202 y bortezomib, sin embargo, mostro una clara sinergia en el aumento de los dfas de supervivencia media. Es importante senalar que con la combinacion de MOR202 y bortezomib (Grupo AB), 2 de 5 ratones sobrevivieron durante todo el estudio. Esto confirma un hallazgo sinergico de la combinacion de MOR202 y bortezomib.

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    1. Una combinacion sinergica de un anticuerpo especffico para CD38 que comprende una region de HCDR1 de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una region HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una region LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una region LCDR2 de la secuencia GdSkRPS (SEQ ID NO: 5) y una region LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y
    (a) talidomida, lenalidomida, o pomalidomida, o
    (b) bortezomid,
    para utilizar en un metodo para el tratamiento del mieloma multiple y/o linfoma no Hodgkin.
  2. 2. La combinacion para utilizar de conformidad con la reivindicacion 1, que comprende una region HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1).
  3. 3. La combinacion para utilizar de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada variable de la secuencia
    QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 10)
    y una cadena liviana variable de la secuencia
    DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQ AEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 11).
  4. 4. La combinacion para utilizar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo es una IgG.
  5. 5. La combinacion para utilizar de conformidad con la reivindicacion 4, donde dicho anticuerpo comprende una region Fc de IgGI.
  6. 6. La combinacion para utilizar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo comprende una region Fc modificada, donde dicha modificacion mejora la actividad de ADCC.
  7. 7. La combinacion para utilizar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo y dicha talidomida, lenalidomida, pomalidomida, o bortezomib se administran por separado.
  8. 8. La combinacion para utilizar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es capaz de reducir la lisis osea con una eficacia al menos dos veces mejor que la lenalidomida y/o bortezomib solos.
  9. 9. La combinacion para utilizar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo se combina con dicha talidomida, lenalidomida, o pomalidomida.
  10. 10. La combinacion para utilizar de conformidad con la reivindicacion 9, que comprende:
    (a) dicho anticuerpo y dicha lenalidomida;
    (b) dicho anticuerpo y dicha talidomida; o
    (c) dicho anticuerpo y dicha pomalidomida.
  11. 11. La combinacion para utilizar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo y dicha lenalidomida, talidomida, pomalidomida, o bortezomib se administran de forma subsecuente.
  12. 12. La combinacion para utilizar de conformidad con la reivindicacion 10 u 11, donde dicha lenalidomida, talidomida, o pomalidomida se administran antes de la administracion de dicho anticuerpo.
  13. 13. La combinacion para utilizar de conformidad con la reivindicacion 12, donde dicha lenalidomida, talidomida, o pomalidomida se administra al menos 72 horas antes de la administracion de dicho anticuerpo.
  14. 14. La combinacion para utilizar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-13, que es capaz de mediar la destruccion de celulas AMO-1 y/o NCI-H929 que expresan CD38 mediante ADCC en presencia de PBMC aisladas humanas con una eficacia al menos dos veces mejor que la lenalidomida sola.
  15. 15. La combinacion para utilizar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende dicho anticuerpo y dicho bortezomib.
  16. 16. La combinacion para utilizar de conformidad con la reivindicacion 15, que es capaz de mediar la destruccion de celulas LP-1 y/o NCI-H929 que expresan CD38 mediante ADCC en presencia de PBMC aisladas humanas con una eficacia al menos dos veces mejor que el bortezomib solo.
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