MX2013003304A - Anticuerpo anti-cd38 y lenalidomida o bortezomib para el tratamiento del mieloma multiple y nhl. - Google Patents

Abstract

La presente divulgación describe una combinación farmacéutica de un anticuerpo anti-CD38 y lenalidomida y una combinación farmacéutica de un anticuerpo anti-CD38 y bortezomib.

Description

ANTICUERPO ANTI-CD38 Y LENALIDOMIDA O BORTEZOMIB PARA EL TRATAMIENTO DEL MIELOMA MÚLTIPLE Y NHL Referencia a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los EE.UU. número de serie 61/486,814, presentada el 17 de mayo de 2011, la solicitud provisional de los EE.UU. número de serie 61/468,607, presentada el 29 de marzo 2011, la solicitud provisional de los EE.UU. número de serie 61/437,696, presentada el 31 de enero de 2011, y la solicitud provisional de los EE.UU. número de serie 61/386,619, presentada el 27 de setiembre de 2010, las cuales se incorporan a modo de referencia en tu totalidad.

Antecedentes El mieloma múltiple es una malignidad de células B caracterizada por la acumulación latente en la médula ósea de células de plasma secretoras con un índice proliferativo bajo y una larga vida útil. La enfermedad en última instancia ataca a los huesos y la médula ósea, resultando en múltiples tumores y lesiones en todo el sistema esquelético.

Aproximadamente el 1% de todos los cánceres, y poco más del 10% de todas las malignidades hematológicas , pueden atribuirse al mieloma múltiple (MM) . La incidencia del MM aumenta en la población de edad, siendo la edad media al momento del diagnóstico de 61 años. Las terapias que se encuentran disponibles en la actualidad para el mieloma múltiple incluyen quimioterapia, trasplante de células madre, Thalomid® (talidomida) , Velcade® (bortezomib) , Aredia® (pamidronato) y Zometa® (ácido zoledrónico) . Los protocolos de tratamiento actuales, que incluyen una combinación de agentes quimioterapéuticos como vincristina, BCNU, melfalán, ciclofosfamida, adriamicina y prednisona o dexametasona, proporcionan una tasa de remisión completa de solo aproximadamente el 5% y la supervivencia media es de aproximadamente 36-48 meses desde el momento del diagnóstico. Los avances recientes con el uso de una alta dosis de quimioterapia y posteriormente con el trasplante autólogo de células de la médula ósea o células mononucleares de sangre periférica han aumentado la tasa de remisión completa y la duración de la remisión. Sin embargo, la supervivencia total solo se ha registrado un leve incremento, y no se han obtenido pruebas de que exista una cura. A la larga, los pacientes con MM a menudo recaen, incluso bajo terapia de mantenimiento con interferón-alfa (IFN-a) solo o en combinación con esteroides.

El linfoma no Hodgkin es una amplia clasificación de linfomas, que son cánceres que se originan en el sistema linfático cuando los linfocitos (células B o células T) se vuelven malignos y se proliferan de forma incontrolable para formar una masa tumoral. En total el NHL abarca aproximadamente 30 subtipos diferentes de linfoma, incluido el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) y el linfoma folicular (FL) . La incidencia de NHL alcanzará más de 140.000 en los mercados principales para 2019. Las opciones de tratamiento disponibles incluyen Rituxan/MabThera, combinaciones de los mismos, como, R-CHOP (rituximab, ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) , R- CVP (Rituxan, ciclofosfamida, vincristinay prednisona) y quimioterapia. Además, después de remisión o recaída, puede considerarse el trasplante de células madre hematopoyéticas . A pesar de las opciones de tratamiento actuales, sin embargo, las tasas de supervivencia en grupos de alto riesgo de NHL agresivo pueden ser del 30% en 5 años. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de tratamientos y combinación de tratamientos efectivos que aún no ha sido satisfecha.

El CD38 es un ejemplo de antígeno expresado en dichas células de plasma malignas y otros linfocitos. Las funciones adscritas al CD38 incluyen tanto en la mediación de receptor en adhesión y eventos de señalización y actividad (ecto-) enzimática. Como una ectoenzima, el CD38 utiliza NAD+ como sustrato para la formación de ADP-ribosa cíclica (ADPRc) y ADPR, pero también de nicotinamida y fosfato dinucleótido de ácido nicotínico-adenina (NAADP) . Se ha demostrado que la ADPRc y NAADP actúan como segundos mensajeros de la movilización de Ca2+. Mediante la conversión de NAD+ en ADPRc el CD38 regula la concentración extracelular de NAD+ y, por lo tanto, la supervivencia de las células mediante la modulación de la muerte celular inducida por NAD (NCID) . Además de la señalización mediante Ca2+, la señalización del CD38 ocurre por medio de un cruce con complejos de antígeno-receptor en células T y B u otros tipos de complejos de receptor, por ejemplo moléculas MHC, y de esta forma participa en varias respuestas celulares, pero también en el cambio y la secreción de IgG.

Los anticuerpos específicos para CD38 se describen en 01999/62526 (Mayo Foundation); O200206347 (Crucell Holland) US2002164788 (Jonathan Ellis) , que se incorporan a modo de referencia en su totalidad; WO2005/103083 (MorphoSys AG) , No. de serie de los EE.UU. 10/588,568, que se incorpora a modo de referencia en su totalidad, WO2006/125640 (MorphoSys AG) , No. de serie de los EE.UU. 11/920,830, que se incorpora a modo de referencia en su totalidad, y WO2007/042309 (MorphoSys AG) , No. de serie de los EE.UU. 12/089,806, que se incorpora a modo de referencia en su totalidad; WO2006099875 (Genmab) , No de serie de los EE.UU. 11/886,932, que se incorpora a modo de referencia en su totalidad; y WO08/047242 (Sanofi-Aventis ) , No. de serie de los EE.UU. 12/441,466, que se incorpora a modo de referencia en su totalidad.

Las combinaciones de anticuerpos especificas para CD38 y otros agentes se describen en los documentos WO200040265 (Research Development Foundation) ; WO2006099875 y WO2008037257 (Genmab); y WO2010061360, WO2010061359, WO2010061358 y WO2010061357 (Sanofi Aventis), que se incorporan a modo de referencia en su totalidad.

Es claro que a pesar del avance reciente en el descubrimiento y desarrollo de agentes anticancerigenos , muchas formas de cáncer que implican tumores que expresan CD38 continúan teniendo un mal pronóstico. Por lo tanto, existe una necesidad de contar con mejores métodos para tratar dichas formas de cáncer.

COMPENDIO En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 y talidomida o un análogo de la misma, por ejemplo, lenalidomida . En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una combinación sinérgica que comprende un anticuerpo especifico para CD38 y bortezomib u otro inhibidor de proteasoma. Dichas combinaciones son útiles en el tratamiento de cánceres, como, mieloma múltiple y/o linfoma no Hodgkin.

Los modelos in vitro e in vivo se consideran predicciones de cómo se comportaría determinado compuesto o combinación de compuestos en humanos. En este caso, las combinaciones de un anticuerpo específico para CD38 y lenalidomida se evaluaron en líneas celulares de mieloma múltiple humano y se identificó sinergia. Además, la combinación de un anticuerpo específico para CD38 y lenalidomida, y una combinación de un anticuerpo específico para CD38 y bortezomib, se evaluó en modelos de ratón contra células de mieloma múltiple y células de linfoma de Burkitt (una forma de NHL) y se identificó sinergia. Por lo tanto, las combinaciones seguirán siendo efectivas en el tratamiento de humanos en mieloma múltiple y linfoma no Hodgkin. Además, el anticuerpo específico para CD38 ejemplificado en la presente memoria descriptiva se incorpora en ensayos clínicos, donde dichas combinaciones pueden confirmarse en seres humanos.

Cuando los compuestos se combinan ya sea in vitro o in vivo, se espera que la combinación tenga solo efectos aditivos. De manera inesperada, los inventores encontraron que la combinación de un anticuerpo anti-CD38 particular y lenalidomida medió un nivel sinérgico de Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) en las líneas células de mieloma múltiples AMO-1 y NCI-H929. Además, y también de manera inesperada, un anticuerpo anti-CD38 particular, en combinación con lenalidomida o con bortezomib, medió un nivel sinérgico de reducción en lisis ósea en el modelo de ratones SCID de NCI-H929 y aumentó sinérgicamente los días de supervivencia media en el modelo de ratón SCID de RAMOS.

Por lo tanto, tanto la combinación del anticuerpo especifico para CD38 ejemplificado y lenalidomida y el anticuerpo especifico para CD38 ejemplificado y bortezomib se comportaron sinérgicamente en los modelos in vitro y/o in vivo correspondientes a mieloma múltiple y/o linfoma no Hodgkin .

Un aspecto de la presente divulgación comprende una combinación en donde el anticuerpo especifico para CD38 comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3) , una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y la talidomida o un análogo de la misma es lenalidomida. En aspectos preferidos, la combinación se utiliza para el tratamiento del mieloma múltiple y/o linfoma no Hodgkin.

Un aspecto de la presente divulgación comprende una combinación en donde el anticuerpo específico para CD38 comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID- O: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y el inhibidor de proteasoma es bortezomib. En aspectos preferidos, la combinación se utiliza para el tratamiento del mieloma múltiple y/o linfoma no Hodgkin.

Descripción de los dibujos La Figura 1 muestra los efectos de la lenalidomida sola en la expresión de CD38 en células A O-1.

La Figura 2 muestra los efectos de la lenalidomida sola en la proliferación celular en varias lineas celulares de mieloma múltiple. Esta medida representa la citotoxicidad relativa de lenalidomida en cada linea celular.

La Figura 3 muestra la mediación de ADCC en células AMO-1 mediante la combinación de MOR03087 y lenalidomida. Las PBMC y células AMO-1 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR03087. MOR03207 se une a lisozima y se utiliza como un control de isotipo, como lo es lgGl . LEN representa lenalidomida. "Teórico" representa la adición del valor de MOR03087 solo y el valor de LEN solo. Los datos muestran los promedios de la Tabla 3b.

La Figura 4 muestra la mediación de ADCC en células AMO-1 mediante la combinación de MOR03087 y lenalidomida. Solo las PBMC fueron tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR03087. MOR03207 se une a lisozima y se utiliza como un control de isotipo, como lo es lgGl. LEN representa lenalidomida. "Teórico" representa la adición del valor de MOR03087 solo y el valor de LEN solo. Los datos muestran los promedios de la Tabla 4b.

La Figura 5 muestra los efectos de la lenalidomida sola en la expresión de CD38 en células NCI-H929.

La Figura 6 muestra la mediación de ADCC en células NCI-H929 mediante la combinación de OR03087 y lenalidomida. Las PBMC y célulasNCI-H929 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR03087. Teórico representa la combinación calculada usando el concepto de producto de fracciones de Chou et al. Los datos muestran los promedios de la Tabla 7b.

La Figura 7 muestra la mediación de ADCC en células NCI-H929 mediante la combinación de MOR03087 y lenalidomida. Solo las PBMC fueron tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR03087. Teórico representa la combinación calculada usando el concepto de producto de fracción de Chou et al. Los datos muestran los promedios de la Tabla 8b.

La Figura 8 muestra la inhibición de crecimiento de varias lineas celulares de mieloma múltiple causada por bortezomib solo. La CI50 en células AMO-1 fue 3.9nM. La CI50 en células LP-1 fue 6.1nM. La CI50 en células NCI-H929 fue 3.3nM. La CI50 en células RPMI-8226 fue 9.0nM.

La Figura 9 muestra la mediación de ADCC en células NCI- H929 mediante la combinación de MOR03087 a 15 g/ml y Velcade® (bortezomib) . Las dos gráficas representan dos donantes diferentes .

La Figura 10 muestra la mediación de ADCC en células LP-1 mediante la combinación de MOR202 a 15µ?/??1 y Velcade® (bortezomib) . Las dos gráficas representan dos donantes diferentes .

La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de MOR202.

La Figura 12 muestra la curva de mejor ajuste, tal como se describe en Chou et al., de la combinación de MOR202 y lenalidomida en la mediación de ADCC en células AMO-1 y también representa la curva de Mejor Ajuste generada para el análisis de la mediación de ADCC en células NCI-H929.

Las Figuras 13-18 muestran el análisis de sinergia del factor de Chou para seis experimentos separados usando la combinación de MOR202 y lenalidomida en la mediación de ADCC en células AMO-1. La Figura 13 muestra el experimento 1. La Figura 14 muestra el experimento 2. La Figura 15 muestra el experimento 3. La Figura 16 muestra el experimento 4. La Figura 17 muestra el experimento 5. La Figura 18 muestra el experimento 6. Las Figuras 13-15 derivaron de los tres experimentos que se muestran en las Tablas 3a-c, y la Figura 3. Las Figuras 16-18 fueron derivadas de los tres experimentos que se muestran en las Tablas 4a-c, y la Figura 4.

La Figura 19 muestra el volumen óseo total medio del Escaneo MicroCT de cada uno de los grupos de estudio descritos en el Ejemplo 7, donde los resultados se muestran en la Tabla 11.

Figura 20 muestra el volumen óseo total medio del Escaneo MicroCT de cada uno de los grupos de estudio descritos en el Ejemplo 11, donde los resultados se muestran en la Tabla 17.

Descripción detallada de la invención "Sinergia", "sinérgica" o "sinérgico" significa más que el efecto aditivo esperado de una combinación. La "sinergia", el "sinergismo" o el efecto "sinérgico" de una combinación se determina en la presente mediante los métodos de Chou et al. y/o Clarke et al. Ver Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad. En Chou et al., se divulgan múltiples métodos para determinar el sinergia y al menos uno de estos métodos se utiliza en la presente. Ver también Clarke et al., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cáncer and other models, Breast Cáncer Research and Treatment 46:255-278 (1997), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad.

El término "anticuerpo" significa anticuerpos monoclonales , incluido cualquier isotipo, como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Un anticuerpo IgG comprende dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas livianas idénticas que se unen mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada y liviana contiene una región constante y una región variable. Cada región variable contiene tres segmentos denominados "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR") o "regiones hipervariables " , que son responsables principalmente de la unión de un epitopo de un antigeno. Se hace referencia a los mismos como CDR1, CDR2 y CDR3, numerados secuencialmente a partir del extremo N. Las porciones más altamente conservadas de las regiones variables fuera de las CDR se denominan "regiones marco". Un "fragmento de anticuerpo" significa un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab ' F(ab')2 u otro fragmento, que contiene al menos una cadena pesada o liviana variable, que contienen cada una CDR y regiones marco.

THALOMID® ( talidomida) en combinación con . dexametasona está indicada para el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple recién diagnosticado, y es comercializada por Celgene .

Un "análogo de talidomida" incluye, a modo no taxativo, la propia talidomida, lenalidomida (CC-5013, Revlimid™) , Pomalidomida (CC4047, Actimid™) y los compuestos divulgados en los documentos WO2002068414 y WO2005016326, que se incorporan a modo de referencia .en su totalidad. El término se refiere a un compuesto químico sintético utilizando la estructura de talidomida como una estructura principal (por ejemplo, se han agregado grupos secundarios o dichos grupos se han eliminado de la estructura matriz) . El análogo difiere en estructura de la talidomida y . sus compuestos de metabolitos por ejemplo mediante una diferencia en el largo de una cadena de alquilo, un fragmento molecular, mediante uno o más grupos funcionales, o un cambio en la ionización. La expresión "análogo de talidomida" también incluye los metabolitos de talidomida. Los análogos de talidomida incluyen la mezcla racémica del enantiómero S y R de un compuesto respectivo y el enantiómero S al enantiómero R individualmente. Se prefiere la mezcla racémica. Los análogos de talidomida incluyen compuestos de las siguientes estructuras : (A) Lenalidomida 1) ( Fórmula 2) , Pomalidomida ( Fórmula 3) , ( (Fórmula 4) , donde R21, R22, R23 y R24 son cada uno independientemente H, alcoxi, amino o alquilamina, y (E) (Fórmula 5) donde R21, R22, R23 y R24 son cada uno independientemente H, alcoxi, amino o alquilamina. La lenalidomida es comercializada actualmente como Revlimid® por Celgene para el tratamiento del mieloma múltiple. La lenalidomida se describe que tiene al menos las siquientes propiedades en relación al tratamiento de tumor, a) citotóxica a células tumorales, Gandhi et al., Lenalidomide inhibits proliferation of Namalwa CSN.70 cells and interferes with Gabl phosphorylation and adaptor protein complex assembly, Leuk Res., 30(7):849-58 (2006) , que se incorpora a modo de referencia en su totalidad; b) activa las células destructoras naturales (Nk) , Gandhi et al., Dexamethasone synergizes with lenalidomide to inhibit múltiple myeloma tumor growth, but reduces lenalidomide-induced immunomodulation of T and NK cell function, Curr Cáncer Drug Targets, 1 ; 10 (2) : 155-67 (marzo 2010), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad; y c) regula al alza la expresión de CD38 en células tumorales, ver Lapalombella et al., Lenalidomide down-regulates the CD20 antigen and antagonizes direct and antibody-dependent cellular cytotoxicity of rituximab on primary chronic lymphocytic leukemia cells, Blood, 1 12:13, 5180-5189 (15 de diciembre de 2008), que se incorpora a modo de referencia en tu totalidad. "LEN" se utiliza para describir lenalidomida .

Tal como se describe, los análogos de talidomida regulan al alza la expresión de CD38 en células tumorales. Otros agentes que regulan al alza la expresión de CD38 en la superficie de células tumorales se describen en el documento WO00/40265, No. de serie de los Estados Unidos 09/226,895, que se incorpora a modo de referencia en su totalidad (Research Development Foundation) .

Un "inhibidor de proteasoma" se refiere a un compuesto que bloquea la acción de las proteasomas, es decir, complejos celulares que descomponen proteínas, tal como por ejemplo, la proteina p53. Se conocen varias clases de inhibidores de proteasoma. La clase de los boronatos peptidicos incluye bortezomib (INN, PS-341 ; Velcade®) , un compuesto que está aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de recaída de mieloma múltiple. Otro boronato peptídico es CEP-18770.

Otras clases de inhibidores de proteasoma incluyen aldehidos peptidicos (por ejemplo, MG132) , sulfonas de vinilo peptídicas, epoxicetonas peptídicas (por ejemplo, epoxomicina, carfilzomib) , inhibidores de ß lactona (por ejemplo, lactacistina, LN 519, NPI-0052, Salinosporamida A), compuestos que crean complejos de ditiocarbamato con metales (por ejemplo, Disulfiram, un fármaco que también se utiliza para el tratamiento del alcoholismo crónico) y ciertos antioxidantes (por ejemplo, Epigalocatequina-3-galato) catequina-3-galato y Salinosporamida A.

"VH" se refiere a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. "VL" se refiere a una región variable de una cadena liviana de inmunoglobulina de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El término "CD38" se refiere a la proteína conocida como CD38, que tiene los siguientes sinónimos: ADP-ribosilciclasa 1, cADPr hidrolasa 1, ADP-ribosa hidrolasa cíclica 1, TIO.

El CD38 humano tiene la secuencia de aminoácidos de: MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGTTK RFPETVLARCVKYTEIHPE RHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVP CNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKD CSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEA WVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESI ISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI (SEQ ID NO: 7) .

"MOR202", un anticuerpo anti-CD38 cuya secuencia de aminoácidos se proporciona en la Figura 11. " OR202" y "MOR03087" se utilizan como sinónimos para describir al anticuerpo que se muestra en la Figura 11.

La secuencia de ADN que codifica el Dominio Pesado Variable OR202 es: CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGA GCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTTCTTCTTATTATATGAATTGGGTGCGCCAAGCCCC TGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGTATCTCTGGTGATCCTAGCAATACCTATTATGCG GATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCTTCCTCT TGTTTATACTGGTTTTGCTTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTA GCTCA (SEQ ID NO: 12) La secuencia de ADN que codifica el Dominio Liviano Variable MOR202 es: GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGT ATCTCGTGTAGCGGCGATAATCTTCGTCATTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCG GGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGGTGATTCTAAGCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACG CTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAA GACGAAGCGGATTATTATTGCCAGACTTATACTGGTGGTGCTTCTCTTGTGTTTGGCGGCG GCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG (SEQ ID NO: 13) El anticuerpo "Ref mAB5" es un anticuerpo anti-CD38 cuya secuencia de aminoácidos se proporciona a continuación (las CDR aparecen en negrita y subrayadas) : VH: QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLE IGTIYPGDGD TGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTV SS (SEQ ID NO: 21) VL: DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTWAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIG VPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIKRT (SEQ ID NO: 22) Las CDR de Ref mAB5 son definidas por Kabat et al. y un anticuerpo que tiene las mismas CDR que Ref mAB5 se describe en el documento WO2008/047242, US 12/441,466, que se incorpora a modo de referencia en su totalidad.

"Región Fe" significa la región constante de un anticuerpo, que en seres humanos puede ser la subclase lgGl, 2, 3, 4 u otras. Las secuencias de las regiones Fe humanas están disponibles en IMGT, Regiones C de IGH Humano, http: //www. imgt . org/IMGTrepertoiré/Proteins/protein/human/IGH /IGHC/Hu_IGHCallgenes . html (recuperado el 16 de mayo de 2011) "Mejora la actividad de ADCC" significa un aumento en la mediación de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. Las modificaciones de aminoácidos dentro de la región Fe que resultan en una mejora de la actividad de ADCC se divulgan en los documentos WO200042072 Genentech, WO2004029207A2 Xencor y WO2004063351 A2 Macrogenics, que se incorporan a modo de referencia en su totalidad.

"MOR03207" es un anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos es : VH: QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWSWIRQSPGRGLEWLGRIYYRS KWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARLDHRYHEDTVYPGM DVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLPAYTVTWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSGI PERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCASWDPSSGVVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 9) .

MOR03207 se une a lisozima, y se utiliza como un control de isotipo, como lo es lgGl.

Una "combinación" significa más de un articulo, por ejemplo, un compuesto tal como un anticuerpo y lenalidomida .

La presente divulgación también se refiere a combinaciones, productos farmacéuticos y composiciones farmacéuticas que contienen las combinaciones descritas. Los dos componentes de la combinación sinérgica de la presente invención, por ejemplo, en anticuerpo especifico para CD38 y lenalidomida, pueden administrarse juntos o por separado. Cuando se administran juntos, los dos componentes pueden formularse juntos en una composición farmacéutica, que puede incluir un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Alternativamente los dos componentes también pueden formularse en diferentes composiciones farmacéuticas. En este caso, los dos componentes pueden administrarse simultáneamente o posteriormente. En una realización, la talidomida o un análogo de la misma, por ejemplo, lenalidomida, se administra antes y/o por separado de la administración del anticuerpo especifico para CD38, por ejemplo, MOR202. En una realización adicional, la lenalidomida se administra al menos 72 horas antes de la administración del anticuerpo especifico para CD38, por ejemplo, MOR202. Este periodo de tiempo permite la regulación al alza mediada por lenalidomida de CD38 en las células obj etivo .

Una composición farmacéutica incluye un agente activo, por ejemplo, un anticuerpo para uso terapéutico en humanos. Una composición farmacéutica puede incluir portadores o excipientes aceptables.

"Administrado" o "administración" incluyen, a modo no taxativo, la administración mediante una forma inyectable, tal como, por ejemplo, vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea o vía mucosa, por ejemplo, como un espray o aerosol nasal para inhalación o como una solución, cápsula o comprimido ingerible.

Una cantidad "terapéuticamente efectiva" de un compuesto o una combinación se refiere a una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones clínicas de una enfermedad o trastorno dado y sus complicaciones. La cantidad que es efectiva para un fin terapéutico particular dependerá de la gravedad de la enfermedad o lesión así como del peso y el estado general del sujeto. Se comprenderá que la determinación de una dosificación apropiada puede lograrse, usando experimentación de rutina, construyendo una matriz de valores y evaluando diferentes puntos en la matriz, lo cual se encuentra dentro de las habilidades comunes de un facultativo o científico clínico capacitado.

Sorpresivamente, se encontró que la combinación de un anticuerpo anti-CD38 particular y lenalidomida medió un nivel sinérgico de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en células de mieloma múltiple AMO-1 y NCI-H929. Además, y también de manera inesperada, un anticuerpo anti-CD38 particular cuando se combinó con lenalidomida medió un nivel sinérgico de reducción en lisis ósea en el modelo de ratones SCID de NCI-H929 y aumentó sinérgicamente los dias de supervivencia media en el modelo de ratón SCID de FIAMOS. Por lo tanto, la combinación del anticuerpo especifico para CD38 ejemplificado y lenalidomida se comportó sinérgicamente en los modelos in vitro e in vivo relevantes a mieloma múltiples y/o linfoma no Hodgkin. Por lo tanto, esta combinación proporciona resultados sinérgicos en el tratamiento de mieloma múltiple y linfoma no Hodgkin en humanos .

La lenalidomida es un análogo de la talidomida, por lo tanto, se espera que otros análogos de talidomida, como pomalidomida o la propia talidomida provoquen efectos sinérgicos cuando se utilizan en combinación con un anticuerpo anti-CD38. Además, una talidomida o un análogo de la misma regula al alza la expresión de CD38 en lineas celulares de mieloma múltiple, por lo tanto, se espera que el sinergia resulte cuando otros agentes que regulan al alza la expresión de CD38 en la superficie de células tumorales, por ejemplo, ácido trans-retinoico y anticuerpos anti-CD38 se utilizan en combinación.

Sorprendentemente, se encontró que la combinación de un anticuerpo anti-CD38 particular y bortezomib medió un nivel alto de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en células de mieloma múltiple NCI-H929 y LP-1. Además, y también sorpresivamente e encontró que la combinación de un anticuerpo anti-CD38 particular y bortezomib medió un nivel sinérgico de reducción en lisis ósea en el modelo de ratones SCID de NCI-H929 y aumentó sinérgicamente los días de supervivencia media en el modelo de ratón SCID de RAMOS. Por lo tanto, la combinación del anticuerpo especifico para CD38 ejemplificado y bortezomib se comportó sinérgicamente en los modelos in vivo relevantes a mieloma múltiples y/o linfoma no Hodgkin. Por lo tanto, esta combinación proporciona resultados sinérgicos en el tratamiento de mieloma múltiple y linfoma no Hodgkin en humanos .

Se espera que otros inhibidores de proteasoma, como, disulfiram, epigalocatequin-3-galato y salinosporamida A produzcan efectos similares cuando se utilizan en combinación con un anticuerpo anti-CD38.

Las "CDR" en la presente son definidas por Chothia et al.., Kabat et al. por una convención de numeración interna. Ver Chothia C, Lesk AM. (1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins . J Mol Biol., 196 ( ): 901-17 , que se incorpora a modo de referencia en su totalidad. Ver Kabat E.A, u T.T., Perry H.M., Gottesman K.S. y Foeller C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5ta edic, NIH Publication no. 91-3242, US Dept . of Health and Human Services, Washington, DC, que se incorpora a modo de referencia en su totalidad.

Realizaciones Un aspecto de la presente divulgación comprende una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 y (a) talidomida o un análogo de la misma, o (b) un inhibidor de proteasoma, para utilizar en el tratamiento de mieloma múltiple y/o linfoma no hodgkin.

Un aspecto de la presente divulgación comprende una combinación de . un anticuerpo especifico para CD38 y talidomida o un análogo de la misma. En algunas realizaciones, la combinación es sinérgica.

En algunas realizaciones, el anticuerpo especifico para CD38 comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDRl de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) .

En algunas realizaciones, el anticuerpo especifico para CD38 comprende una región CDR1 de la secuencia DYWMQ (SEQ ID NO: 15), una región HCDR2 de la secuencia TIYPGDGDTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 16), una región HCDR3 de la secuencia GDYYGSNSLDY (SEQ ID NO: 17), una región LCDRl de la secuencia KASQDVSTVVA (SEQ ID NO: 18), una región LCDR2 de la secuencia SASYRYI (SEQ ID NO: 19) y una región LCDR3 de la secuencia QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 20) .

En un aspecto, la combinación se utiliza para el tratamiento del mieloma múltiple y/o linfoma no Hodgkin. Las realizaciones comprenden una combinación, donde el análogo de talidomida es lenalidomida .

Un aspecto se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden las combinaciones. En algunas realizaciones, la composición comprende un portador aceptable. En algunas realizaciones, la composición se administra en una cantidad efectiva.

Un aspecto de la presente divulgación comprende una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida para el tratamiento de mieloma múltiples y/o linfoma no hodgkin.

Una realización adicional comprende una combinación, donde el anticuerpo comprende una cadena variable de la secuencia QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 10) y una cadena liviana variable de la secuencia DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGI PERS GSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ ( SEQ ID NO: 11) .

Una aspecto de la presente divulgación comprende una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia DYWMQ (SEQ ID NO: 15), una región HCDR2 de la secuencia TIYPGDGDTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 16), una región HCDR3 de la secuencia GDYYGSNSLDY (SEQ ID NO: 17), una región LCDR1 de la secuencia KASQDVSTVVA (SEQ ID NO: 18), una región LCDR2 de la secuencia SASYRYI (SEQ ID NO: 19) y una región LCDR3 de la secuencia QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 20) y lenalidomida para el tratamiento de mieloma múltiples y/o linfoma no hodgkin.

Una realización adicional comprende una combinación, donde el anticuerpo comprende una cadena variable de la secuencia QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDY MQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYA QKFQGKATLTADKSSKTVY HLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSV TVSS (SEQ ID NO: 21) y una cadena liviana variable de la secuencia DIV TQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDR FTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIKRT (SEQ ID NO: 22) .

En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene región Fe de lgGl. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región Fe modificada, donde dicha modificación mejora la actividad de ADCC.

En otro aspecto, los componentes de la combinación, el anticuerpo especifico para CD38 y lenalidomida, se administran por separado. En una realización, la lenalidomida se administra antes de la administración del anticuerpo especifico para CD38. En una realización adicional, la lenalidomida se administra al menos 72 horas antes de la administración del anticuerpo especifico para CD38.

En otro aspecto, la combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYY N (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida es capaz de mediar de destrucción de las células AMO-1 que expresan CD38 y/o células NCI-H929 mediante ADCC en presencia de PBMC humanas aisladas con al menos una eficacia dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor que la lenalidomida sola .

En otro aspecto, la combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida es capaz de reducir la lisis ósea con una eficacia al menos dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor que la lenalidomida sola.

Otro aspecto comprende un método de tratamiento del mieloma múltiple y/o linfoma no-hodgkin en un individuo que lo necesita, cuyo método comprende la administración de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida a un individuo que tiene mieloma múltiple o linfoma no hodgkin. En algunas realizaciones, la combinación se administra en una cantidad efectiva.

Otro aspecto comprende una combinación que comprende un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida. En una realización, la combinación se utiliza para el tratamiento del cáncer. En otra realización, el cáncer se selecciona de mieloma múltiple y linfoma no hodgkin.

Otro aspecto comprende una combinación de un anticuerpo especifico para CD38 y un inhibidor de proteasoma. En algunas realizaciones, la combinación es sinérgica. En algunas realizaciones, el anticuerpo especifico para CD38 comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) .

En un aspecto, la combinación se utiliza para el tratamiento del mieloma múltiple y/o linfoma no Hodgkin. En algunas realizaciones, la combinación comprende un inhibidor de proteasoma, que es bortezomib. Un aspecto se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden las combinaciones. En algunas realizaciones, la composición comprende un portador aceptable. En algunas realizaciones, la composición se administra en una cantidad efectiva.

Un aspecto de la presente divulgación comprende una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib para el tratamiento de mieloma múltiples y/o linfoma no hodgkin.

Una realización adicional comprende una combinación, donde el anticuerpo comprende una cadena variable de la secuencia QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMN VRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 10) y una cadena liviana variable de la secuencia DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERF SGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 11) · En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene región Fe de lgGl . En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región Fe modificada, donde dicha modificación mejora la actividad de ADCC.

En una realización, la combinación se utiliza para el tratamiento del cáncer. En otra realización, el cáncer se selecciona de mieloma múltiple y linfoma no hodgkin.

En otro aspecto, los componentes de la combinación, el anticuerpo y el inhibidor de proteasoma, se administran por separado .

En otro aspecto, la combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia- GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib es capaz de mediar de destrucción de las células LP-1 que expresan CD38 y/o células NCI-H929 mediante ADCC en presencia de PBMC humanas aisladas con al menos una eficacia dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor que la bortezomib sola .

En otro aspecto, la combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib es capaz de reducir la lisis ósea con una eficacia al menos dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor que la bortezomib sola.

En otro aspecto, la presente divulgación comprende un método de tratamiento del mieloma múltiple y/o linfoma no-hodgkin en un individuo que lo necesita, cuyo método comprende la administración de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia OTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib a un individuo que tiene mieloma múltiple o linfoma no hodgkin.

En algunas realizaciones, la combinación se administra en una cantidad efectiva.

Otro aspecto comprende una combinación que comprende un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia OTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib.

Un aspecto comprende una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYY N (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia OTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y (a) talidomida o un análogo de la misma, o (b) un inhibidor de proteasoma, para utilizar en el tratamiento del mieloma múltiples y/o linfoma no-hodgkin.

Las realizaciones comprenden una combinación, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada variable de la secuencia QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYY NWVRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAY GQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 10) y una cadena liviana variable de la secuencia DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERF SGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 11) · Las realizaciones comprenden una combinación, donde el anticuerpo comprende una región Fe de IgGl. Las realizaciones comprenden una combinación, donde al anticuerpo comprende una región Fe modificada, donde dicha modificación mejora la actividad de ADCC .

Las realizaciones comprenden una combinación, donde dicho anticuerpo especifico para CD38 y dicha talidomida o un análogo de la misma o inhibidor de proteasoma se administran por separado.

Las realizaciones comprenden una combinación, que es capaz de reducir la lisis ósea con una eficacia al menos dos veces mejor que la lenalidomida y/o bortezomib sola.

Las realizaciones comprenden una combinación, donde dicho anticuerpo especifico para CD38 se combina con la talidomida o un análogo de la misma. Las realizaciones comprenden una combinación, donde el análogo de talidomida comprende lenalidomida. Las realizaciones comprenden una combinación, donde la lenalidomida se administra antes de la administración del anticuerpo específico para CD38. Las realizaciones comprenden una combinación, donde la lenalidomida se administra al menos 72 horas antes de la administración del anticuerpo específico para CD38.

Las realizaciones comprenden una combinación de un anticuerpo específico para CD38 y lenalidomida, que es capaz de mediar la destrucción de células AMO-1 y/o NCI-H929 que expresan CD38 mediante ADCC en presencia de PB C aisladas humanas con una eficacia al menos dos veces mejor que la lenalidomida sola.

Las realizaciones comprenden una combinación, que comprende dicho anticuerpo específico para CD38 y un inhibidor de proteasoma. En algunas realizaciones, el inhibidor de proteasoma es bortezomib. Las realizaciones comprenden una combinación de un anticuerpo específico para CD38 y bortezomib, que es capaz de mediar la destrucción de células LP-1 y/o NCI-H929 que expresan CD38 mediante ADCC en presencia de PBMC aisladas humanas con una eficacia al menos dos veces mejor que la bortezomib solo.

Un aspecto comprende una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia OTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida u otro análogos de talidomida para utilizar en el tratamiento de mieloma múltiples y/o linfoma no hodgkin.

Un aspecto comprende una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY ( SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia OTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib u otro inhibidor de proteasoma para utilizar en el tratamiento de mieloma múltiples y/o linfoma no hodgkin.

Ejemplos Ejemplo 1: Expresión de CD38 en la superficie de varias lineas celulares Las lineas celulares de la Tabla 1 se evaluaron para los niveles de expresión de CD38.

Tabla 1 Se obtuvieron muestras de médula ósea (4-10 mi de aspirato) de pacientes con mieloma múltiples y muestras de plasmacitoma de tumor extramedular después de recibir autorización de Klinikum rechts der Isar ("Krdl") (Munich, Alemania) . Las muestras se sometieron a centrifugación, y se logró más enriquecimiento celular por medio de una clasificación celular con activación magnética.

Las células se tiñeron con un anticuerpo CD38-PE directamente etiquetado como QuantiBRITETM (Becton Dickinson GmbH, Clon HB7, CAT No. 342371), que es especifico para CD38.

Los "anticuerpos unidos por célula" (ABC) se determinaron utilizando citometria de flujo en base al sistema QuantiBRITETM, que mide la media geométrica (GeoMedia) por célula. La conversión de la GeoMedia medida en una cantidad de ABC correlativa por célula se realizó con el software GraphPad PRISMTM. Se asumió que los valores de ABC se correlacionaron con el número de moléculas CD38 por célula, dado que QuantiBRITE™ CD38-PE transporta una molécula PE por anticuerpo. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Ej emplo 2 : Evaluación del efecto de la Lenalidomida en la regulación al alza de CD38 en varias lineas celulares Para determinar si la lenalidomida indujo la regulación al alza de CD8 en las células de mieloma múltiple y plasmacitoma de la Tabla 1, las lineas celulares se incubaron con ???µ? de lenalidomida y, posteriormente, se analizó la expresión de superficie de CD38 mediante FACS.

Materiales y Métodos Aproximadamente 2xl05 células de cada una de las lineas ¦ .- celulares de la Tabla 1 se colocaron en placas de 48 pocilios en un medio de RPMI estándar. La lenalidomida, adquirida de Selleck Chemicals (LLC S1029, CAS No. 191732-6; Lote: S10290) , se aplicó a pocilios respectivos hasta una concentración final de ???µ? en un volumen de 750µ? que contenia 20% de FCS y 0.1 % de D SO. Como testigo negativo, se utilizó 0.1% de DMSO en un medio complementado con FCS y las placas se incubaron durante 24h, 48h y 72h a 37 °C y 5% de C02 en una incubadora humidificada .

Las células se resuspendieron colocándolas cuidadosamente en pipetas y 250µ? de suspensión celular por periodo de incubación se transfirió a un pocilio de una placa de fondo redondo de 96 pocilios. Las células se lavaron mediante centrifugación durante 1 min a 700 x g y se resuspendieron en 150µ? de solución amortiguadora FACS fría (lx PBS complementado con 3% de FCS) . Las células se granularon nuevamente mediante centrifugación y se resuspendieron en 150µ? de solución amortiguadora FACS que contenia 15 µg/ml de anticuerpo anti-CD38 (MOR202, lgGl) o anticuerpo testigo MOR03207 y se incubaron durante 1 h sobre hielo. Luego se lavaron las células 3 veces mediante centrifugación y se resuspendieron en solución amortiguadora FACS complementada con el anticuerpo secundario etiquetado como PE (fragmento PE-Fab2, anti-IgG humano de cabra, fragmento especifico Fe; Jackson Immuno Research; CA : 109-1 16-098; Lot : 80938) . Las células se incubaron durante 45 minutos sobre hielo, luego se lavaron 3 veces mediante centrifugación y se resuspendieron en solución amortiguadora FACS. Las suspensiones celulares se sometieron luego a análisis FACS usando un dispositivo de arreglo FACS.

La expresión de CD38 basal de cada linea celular y el efecto de la lenalidomida en la expresión de CD38 se muestran en la Tabla 2. Adicionalmente, el efecto de la lenalidomida en la expresión de CD38 de células AMO-1 se muestra en la Figura 1, y el efecto de la lenalidomida en la expresión de CD38 de células NCI-H929 se muestra en la Figura 5.

Tabla 2 5 15 20 Ejemplo 3: Inhibición de proliferación de células AMO-1 utilizando lenalidomida sola La citotoxicidad de la lenalidomida se evaluó en células AMO-1. Las células se recolectaron y distribuyeron en placas de 96 pocilios con 5000 células por pocilio. Se agregaron cantidades cada vez más altas de lenalidomida a los pocilios y placas se incubaron durante 24h, 48h y 72h a 37°C en una incubadora humidificada (5% de CO2) .

Después de la incubación, se analizaron las placas en busca de proliferación celular en un ensayo en base a XTT colorimétrico cuantitativo utilizando el kit de proliferación celular II (ROCHE, Kit de proliferación celular II, Cat . No.: 11465015001). Para mediciones posteriores las placas se sometieron a una lectora Tecan Genios y se detectó absorbancia a 492nm.

Los resultados se muestran en la Figura 2.

Ejemplo 4: Combinación sinérgica de MOR0202 y lenalidomida en células AMO-1 Se seleccionaron células AMO-1 para evaluar con la combinación de MOR202 y lenalidomida. Las células AMO-1 son similares a las células de plasmacitoma en seres humanos porque tienen una expresión de CD38 basal baja y CD38 es significativamente regulado al alza luego del tratamiento con lenalidomida como se muestra en la Tabla 2.

Las PBMC se aislaron mediante centrifugación con gradiente de densidad de sangre humana recién aislada. La sangre aislada de diferentes donantes se recubrieron en un volumen definido de Biocoll (Biochrome AG; CAT No.:L61 15; LOT No.:1050T) en un tubo Falcon y se centrifugaron a 380g. Las PBMC se aislaron y se complementaron con un medio de RPMI .

Después de 72h, las células se contaron y las PBMC se ajustaron hasta una concentración de 6.6 x 106/ml mientras que las células AMO-1 se ajustaron hasta una concentración final de 2.5 x 105/ml. Para identificación posterior en citrometria de flujo, las células AMO-1 se tiñeron durante 3min con 0.1pg/ml de CalceinAM (Calceina: 1 mg/ml de solución concentrada, Invitrogen, Cat No.: C3099) y se lavaron tres veces mediante centrifugación suave. Se mezclaron ???µ? de suspensión de células blanco con ???µ? de PBMC para alcanzar una relación de 1:30. El anticuerpo MOR202 o anticuerpo MOR03207" (testigo negativo) se agregó hasta una concentración final de 15 g/ml. Las suspensiones celulares se incubaron posteriormente durante 4h a 37 °C. Para detectar las células AMO-1 muertas, las suspensiones celulares se desafiaron con yodo de propidio (PI) y posteriormente se analizaron en citometria de flujo. Las células blanco se separaron mediante una abertura de las poblaciones celulares de CalceinAM, y se cuantificaron las células destruidas mediante ADCC.

En total se realizaron seis experimentos con el fin de determinar la mediación de ADCC en células AMO-1 mediante la combinación de MOR202 y lenalidomida . En tres experimentos, los PBMC y células AMO-1 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202, los resultados se muestran en las Tablas 3 a-c y la Figura 3. En tres experimentos adicionales, solo las PBMC se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202, los resultados se muestran en las Tablas 4 a-c y la Figura 4.

Tabla 3 Las células efectoras y AMO-1 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202. Se utilizaron dosis únicas y de combinación de 10 µ? de LEN y 15 g/ml de MOR03207 y MOR202.

Los datos se presentan en las siguientes tres formas, como a) datos sin procesar (% de células muertas) , b) datos normalizados específicos de destrucción, donde el grupo de tratamiento con MOR202 se fija en 1 (100%), y c) datos normalizados específicos de destrucción, donde la combinación teórica se fija en 1 (100%) . La Tabla 3a representa datos sin procesar.

Tabla 3a 5 10 15 20 Las unidades de los valores enumerados son % de células muertas. Los DMSO, MOR03207, MOR03207+DMSO, LE O, LEN10 sin PBMC y DMSO sin grupos de PBMC son testigos.

La Tabla 3b representa los datos de la Tabla 3a, pero normalizados, donde el grupo de tratamiento de MOR202 se fija en 1 (100%) .

Tabla 3b Para las Tablas 3b-c, "Combinación teórica" representa la adición de los valores de MOR202 solo y los valores de LEN sola. Los datos normalizados de la Tabla 3b se calculan de la siguiente forma. La Tabla 3a representa el número de células muertas. Por lo tanto, los valores específicos de destrucción de la Tabla 3b se calculan restando los valores de los testigos. Luego, los valores específicos de destrucción se comparan con el testigo MOR202, que se fijan en 1. Los promedios de los resultados en la Tabla 3b se muestran en la Figura 3. 1. Determinación de sinergia 1.1 Chou et al.

Los métodos de Chou-Talalay se utilizaron para determinar el sinergia. Ver Chou TC, Talalay P, Quantitative analysis of dose-effect relationships : the combined effects of múltiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55 (1984), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad. El análisis de sinergia se lleva a cabo utilizando el método de CI-isobol.

Ecuación del efecto medio Los modelos de ecuación del efecto medio del efecto de un inhibidor (tal como un fármaco) como Fa/Fu =(?/?50)?p? donde D es la dosis, Fa y Fu es la fracción del sistema afectada y sin afectar por la dosis D (Fa + Fu = 1) ; D50 es la dosis que produce el efecto medio (por ejemplo, CI50, DE50, DL50) .

La constante m determina la forma de la curva de dosis-efecto.

Utilizamos el software Excel Fit para llevar a cabo un cálculo de regresión lineal para estimar los parámetros m y D50.

Los efectos de la combinación en células AMO-1 se miden en % de muerte celular como se describe anteriormente.

Definimos la fracción Fu como la relación de % de muerte celular de la linea celular tratada expuesta a un testigo. Es decir: Fu =% de muerte celular (linea celular tratada) / % de muerte celular (linea celular sin tratar) Entonces el % de muerte celular de una linea celular es la constante D50 en la ecuación de efecto medio que puede estimarse mediante la regresión lineal descrita anteriormente .

Método IC-isobol El método IC-isobol proporciona una evaluación cuantitativa del sinergia entre fármacos. Un índice de combinación (IC) se estima a partir de los datos de efecto-dosis de tratamientos de fármacos simples y combinados. Un valor de IC menor que 1 indica sinergia; IC = 1 indica efectos aditivo; y IC > 1 indica antagonismo. Los rangos sinérgicos se definen mejor en Chou y Talahay para valores de IC < 0.1 como un sinergia muy fuerte, los valores de IC entre 0.1 y 0.3 como sinergia fuerte, los valores de IC de 0.3- 0.7 como sinergia, los valores de IC de 0.7-0.9 como sinergia moderado a leve. La interacción de fármacos (sinergia o antagonismo) es más pronunciada cuanto más lejano sea el valor IC de 1.

Formalmente, el índice de combinación (IC) de un tratamiento de fármacos combinado se define como CL=Di/Dxi + D2/Dx2 Aquí, DI y D2 son las dosis del fármaco 1 y el fármaco 2, respectivamente, en la combinación; cada uno de Dxl y Dx2 es la dosis de un tratamiento con solo el fármaco y el fármaco 2 que producirían el mismo efecto que el de la combinación, respectivamente. Las dosis Dxl y Dx2 deben estimarse a partir de los datos del efecto de dosis de tratamientos de fármaco simples. Esencialmente, una ecuación de efecto medio se ajusta a los datos de cada fármaco. A partir de la ecuación de efecto medio de un fármaco, se puede estimar la dosis (es decir, D) necesaria para producir un efecto (es decir, Fa, Fu) . Cuanto más alejado se encuentra un punto de la línea aditiva, más grande será la diferencia entre 1 y IC, y por lo tanto más fuerte será el efecto (sinérgico o antagonístico) El método anterior se describe en Chou TC, Talalay P, Quantitative analysis of dose-effect relationships : the combined effects of múltiple drugs or enzyme inhibitors . Adv Enzyme Regul 22: 27-55 (1984), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad. Una descripción adicional del método de Chou anterior también se proporciona e Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad.

Las curvas generadas para los cálculos de sinergia basados en Chou se muestran en las Figuras 12-18. En la Figura 12, la curva de mejor ajuste se determinó quitando los puntos de datos a) donde la concentración de MOR202 fue demasiada baja para tener algún efecto y b) donde la concentración estuvo cerca de la saturación. En el punto de datos apropiado, aproximadamente un 80% de destrucción celular, el valor de IC es menor que 1, confirmando una sinergia clara. Las Figs . 13-18 representan lo seis experimentos de las Tablas 3 y 4, y en cada una de la Dxl (dosis de MOR202) necesaria para alcanzar un 100% de efecto de la combinación de MOR 202 y lenalidomida es infinito; por lo tanto, la Di/Dxi es menor que 1 y dado que la lenalidomida no tiene efecto en las células AMO-1 con respecto a la destrucción celular, el valor de la Dx2 también se aproxima a infinito, de modo que la D2/DX2 se aproxima a 0, por lo tanto los valores de IC de cada uno de los seis experimentos es menor que 1, confirmando una sinergia clara.

La Tabla 3c representa la normalización de los datos, donde la combinación teórica se fija en 1 (100%) e incluye los cálculos de IC de Chou.

Tabla 3c: 5 15 20 Los datos que se muestran en la Tabla 3c difieren de las Tablas 3a y 3b. La Tabla 3c se basa en diferentes puntos de datos sin procesar que los que se muestran en la Tabla 3a, dado que las concentraciones seleccionadas en la Tabla 3c están más cerca que la CE50 el anticuerpo (los datos sin procesar no se muestran) . "Combinación teórica" representa la adición de los valores de MOR03087 solo y los valores de LEN sola.

Tabla 4 Células efectoras tratadas solo con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202. Se utilizaron dosis únicas y de combinación de 10 µ? de LEN y 15 g/ml de OR03207 y MOR202.

Los datos se presentan en las siguientes tres formas, como a) datos sin procesar (% de células muertas), b) datos normalizados específicos de destrucción, donde el grupo de tratamiento de OR202 se fija en 1 (100%), y c) datos normalizados específicos de destrucción, donde la combinación teórica se fija en 1 (100%) . La Tabla 4a representa datos sin procesar.

Tabla 4a 15 20 Las unidades de los valores enumerados son % de células muertas. Los DMSO, MOR03207, MOR03207+DMSO, LEÑO, LEN10 sin PBMC y DMSO sin PBMC son testigos.

Tabla 4b La Tabla 4b representa los datos de la Tabla 4a, pero normalizados, donde el grupo de tratamiento de MOR202 se fija en 1 (100%) . Para las Tablas 4b-c, "Combinación teórica" representa los valores de MOR202 solo más los valores de LEN sola.

La normalización de los datos como se muestra en la Tabla 4b se calcula como se describe en la Tabla 3b, restando los testigos. Los promedios de los resultados en la Tabla 4b se muestran en la Figura 4.

Tabla 4c 5 10 20 La Tabla 4c representa la normalización de los datos, donde la combinación teórica se fija en 1 (100%) e incluye los cálculos de IC de Chou et al. usando la metodología descrita anteriormente en el Ejemplo 4.

La Tabla 4c difiere de las Tablas 4a y 4b. La Tabla 4c se basa en diferentes puntos de datos sin procesar que los que se muestran en la Tabla 4a, como las concentraciones seleccionadas en la Tabla 4c están más cerca que la CE50 el anticuerpo (los datos sin procesar no se muestran) . 1. Determinación de sinergia 1.2 Sinergia según Clarke et al.

Cuando un fármaco tiene actividad baja, como en este caso cuando la Lenalidomida sola tiene baja citotoxicidad contra células AMO-1, la sinergia también puede determinarse mediante pruebas estadísticas de que la combinación es considerablemente diferente al fármaco inhibidor solo. Ver Clarke et al., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cáncer and other models, Breast Cáncer Research and Treatment 46:255-278 (1997), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad. Aquí, tanto Chou et al., como se muestra anteriormente, y los métodos de Clarke et al., se utilizaron para determinar el sinergia .

Los datos se analizan de la siguiente forma: Antagonista (AB) /C < (A/C) x (B/C) Aditivo (AB)/C < (A/C) x (B/C) Sinérgico (AB) /C < (A/C) x (B/C) donde A es el tratamiento con LEN sola; B es el tratamiento con MOR202 solo; C es la respuesta al vehículo de tratamiento; AB es la combinación de los tratamientos A y B.

Tabla 5: Los valores de datos sin procesar en esta tabla son los mismos que se muestran en la Tabla 3a, dado que provienen de los mismos tres experimentos, donde tanto las células efectoras y AMO-1 fueron tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202 y se utilizaron la dosis única y de combinación de 10 µ? de LEN y 15pg/ml de MOR03207 y MOR202. La única diferencia es que los datos se analizan usando Clarke et al. en vez de Chou A = respuesta al tratamiento solo con LEN B = respuesta al tratamiento solo con MOR202 C = respuesta al tratamiento con testigo AB = combinación de tratamientos A y B Los valores de A, B, C y AB representan el % de muerte celular.

En cada experimento (AB) /C es mayor que (A/C) X (B/C) , lo que demuestra una sinergia clara.

Tabla 6: Los valores de datos sin procesar en esta tabla son los mismos que se muestran en la Tabla 4a, dado que provienen de los mismos tres experimentos, donde solo las células efectoras fueron tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202 y se utilizaron la dosis única y de combinación de 10 µ de LEN y 15pg/ml de MOR03207 y MOR202. La única diferencia es que los datos se analizan usando Clarke et al. en vez de Chou et al.

A = respuesta al tratamiento solo con LEN B = respuesta al tratamiento solo con OR202 C = respuesta al tratamiento con testigo AB = combinación de tratamientos A y B En cada experimento (AB) /C es mayor que (A/C) X (B/C) , lo que demuestra una sinergia clara.

Resultados Con la aplicación del análisis de Clarke et al., LEN mejoró sinérgicamente la actividad ADCC de OR202 en células AMO-1 en los seis experimentos. Con la aplicación del análisis de Chou et al., LEN mejoró sinérgicamente la actividad ADCC de MOR202 en células AMO-1 en 6 de 6 experimentos. Esta mejora de la actividad se identificó mediante varios mecanismos incluida la citotoxicidad directa, activación de células efectoras y regulación al alza de los niveles de expresión de CD38 en células de MM.

Los experimentos de conformidad con el ejemplo 4 también se realizan con otros anticuerpos específicos para CD38, por ejemplo, el anticuerpo "Ref mAB5".

Ej emplo 5 : Inhibición de la proliferación de células NCI-H929 usando lenalidomida sola La citotoxicidad de la lenalidomida se evaluó en NCI-H929 usando los métodos descritos en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Figura 2. En resumen, la inoculación con lenalidomida solo inhibió considerablemente la proliferación celular en células NCI-H929.

Ejemplo 6: Combinación sinérgica de MOR202 y Lenalidomida en células NCI-H929 Se seleccionaron células NCI-H929 para evaluar con la combinación de MOR202 y lenalidomida. Las células NCI-H929 expresan niveles más altos de CD38 que las células AMO-1, por lo tanto, son representativas de ciertos tipos de células que se encuentran en pacientes humanas con mieloma múltiples o linfoma no Hodgkin.

En total se realizaron seis experimentos, utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4, con el fin de determinar la mediación de ADCC en células NCI-H929 mediante la combinación de MOR202 y lenalidomida. En tres experimentos, las PBMC y las células NCI-H929 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202, los resultados se muestran en las Tablas 7a-b y la Figura 6. En tres experimentos adicionales, solo las PBMC se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202, los resultados se muestran en las Tablas 8a-b y la Figura 7.

Tabla 7 Tanto las células efectoras como NCI-H929 se trataron con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202. Se utilizaron dosis únicas y de combinación de 5 µ? de LEN y 15pg/ml de OR03207 y 0.2 o 0.07 ng/ml de MOR202.

Los datos se presentan de la siguiente forma, como a) datos sin procesar (% de células muertas) , y b) datos específicos de destrucción normalizados, donde la combinación del producto de la fracción se fija en 1 (100%) La Tabla 7a representa los datos sin procesar.

Tabla 7a 5 10 20 Las unidades de los valores enumerados son % de células muertas. DMSO, MOR03207, MOR03207+D SO, LEÑO, LEN10 sin PBMC y DMSO sin PBMC son testigos.

La Tabla 7b representa los datos normalizados, donde la combinación del producto de la fracción se fija en 1 (100%) Tabla 7b 5 15 20 La combinación de producto de la fracción se calcula usando la siguiente fórmula 1- [ ( 1-A) * ( 1-B) ] =fpc (% ) tal como se describe en Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad. La Tabla 7b se basa en los datos sin procesar de la Tabla 7a. La normalización de los datos tal como se muestra en la Tabla 7b se calcula tal como se describe en la Tabla 3b, restando los testigos. En la Tabla 7b, donde la combinación de LEN y MOR202 es mayor que la combinación en base al concepto de producto de la fracción, entonces existe la sinergia clara. Además, los valores del índice de Combinación se calcularon usando los métodos de Chou et al. tal como se describe en el Ejemplo 4. Los promedios de los resultados de la Tabla 7b se muestran en la Figura 6.

Tabla 8 Células efectoras solo tratadas con lenalidomida antes del tratamiento con MOR202. Se utilizaron dosis únicas y de combinación de 5 µ? de LEN y 15ug/ml de MOR03207 y 0.2* o 0.07 ng/ml de MOR202.

Los datos se presentan de la siguiente forma, como a) datos sin procesar (% de células muertas) , y b) datos específicos de destrucción normalizados, donde la combinación del producto de la fracción se fija en 1 (100%) La Tabla 8a representa los datos sin procesar.

Tabla 8a 5 10 20 Las unidades de los valores enumerados son % de células muertas. DMSO, MOR03207, MOR03207+DMSO, LE O, LEN10 sin PBMC y DMSO sin PBMC son testigos.

La Tabla 8b representa los datos normalizados, donde la combinación del producto de la fracción se fija en 1 (100%) Tabla 8b 15 20 La Tabla 8b se basa en los datos sin procesar de la Tabla 8a. La normalización de los datos tal como se muestra en la Tabla 8b se calcula tal como se describe en la Tabla 3b, restando los testigos. En la Tabla 8b, donde la combinación de LEN y MOR202 es mayor que la combinación en base al concepto de producto de la fracción, entonces existe la sinergia clara. Además, los valores del índice de Combinación se calcularon usando los métodos de Chou et al tal como se describe en el Ejemplo 4. Los promedios de los resultados de la Tabla 8b se muestran en la Figura 7.

Determinación de sinergia 1.3 Concepto de producto de la fracción La evaluación de los datos en este ejemplo difiere de aquellos utilizados en el análisis del efecto de la combinación de MOR202 y LEN en células AMO-1 en el Ejemplo 4. Aqui se evalúan las células NCI-H929 y solo LEN tiene un efecto importante de la proliferación de las células NCI-H929 tal como se muestra en el Ejemplo 5, por lo tanto, se utiliza el concepto de producto de la fracción. El concepto de producto de la fracción se describió en Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006), que se incorpora a modo de referencia en su totalidad. Allí Chou et al. establece: Si A y B inhiben cada uno 60%, entonces es una sobresimplificación decir que el efecto aditivo consiste en 84% de inhibición. En base al razonamiento de Webb (1963), este tipo de problema puede resolverse mediante (1-0.6) (1-0.6)=0.16, 1-0.16=0.84. Chou y Talalay (1984) lo denominaron el método del producto de la fracción. Este método nunca producirá un efecto de combinación que excede el 100% de inhibición. Chou y Talalay (1984), sin embargo, también han demostrado que este método tiene validez limitada porque toma en cuenta la potencia (por ejemplo, inhibición fraccional) pero ignora la forma de la curva de dosis-efecto (por ejemplo, hiperbólica o sigmoidal) . La importancia de la "forma" en el análisis de dosis-efecto se muestra en la Fig. 1. Chou y Talalay (1984) indicaron que el método de Webb es válido solo cuando ambos fármacos tienen curvas hiperbólicas (es decir, en la cinética simple Michaelis-Menten cuando las curvas de dosis-efecto son hiperbólicas, es decir, m =1 en la gráfica de efecto medio) y no es válido cuando m no es igual a 1, como curvas sigmoidales (m > 1) o sigmodiales planas (m < 1) . Asimismo, el método de Webb es válido cuando los efectos de dos fármacos son no exclusivos entre si (por ejemplo, totalmente independientes) y no es válido para efectos mutuamente exclusivos (por ejemplo, mecanismos o modos de acción similares, tal como se asume para el isobolograma clásico, ver más adelante) .

Clarke et al. no se utilizó dado que Clarke es más adecuado cuando una monoterapia tiene un efecto bajo.

Ver la Figura 12, la curva de mejor ajuste se determinó quitando los puntos de datos a) donde la concentración de OR202 era demasiado baja para tener cualquier efecto y b) donde la concentración estuvo cerca de la saturación. En el punto de datos apropiado, aproximadamente 80% de destrucción celular, el valor IC es menor que 1, lo que confirma una sinergia clara.

Resultados Con la aplicación del análisis del Concepto de Producto de la fracción, LEN mejoró sinérgicamente la actividad de MOR202 en células NCI-H929 en 6 de 6 experimentos. Con la aplicación del análisis de Chou et al., LEN mejoró sinérgicamente la actividad de OR202 en células NCI-H929 en 6 de 6 experimentos. Ver las Tablas 7a-b y 8a-b.

Ejemplo 7: MOR202 y LEN solos y en combinación en modelo M de ratones SCID con lisis ósea Materiales Lenalidomida (SYNthesis med chem; Shanghai, China; Lote no: ZHM-066-051) .

MOR202 (MorphoSys AG, Lote 100706-5KLE18 ) . Testigo de vehículo: Ora-Plus: Ora-Sweet SF (Paddock Laboratories, Minneapolis, MN, USA, Lote no. 9499528) . Ratones SCID (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, Cepa C . B . -17-lgh-lb-Prkdcscid) .

Células de mieloma múltiple humanas NCI-H929 (ver la Tabla 1) . Medio de cultivo celular RPMI 1640, Suero Bovino Fetal (FBS) , Mercaptoetanol , Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) y penicilina-estreptomicina de Invitrogen Australia (Mt Waverley, VIC, Australia) ; y azul de tripano y glucosa de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia) .

Métodos 63 ratones SCID fueron inoculados el Dia (-7) ortotópicamente en la tibia derecha con 2.5 x 106 células NCI-H929 de MM (en 5 L) con el fin de inducir lisis ósea. Tres días post inoculación (Día-4), 60 de los ratones SCID fueron aleatorxzados por peso corporal en los grupos que se muestran en la Tabla 13, 10 ratones por grupo. El régimen de dosificación se proporciona en la Tabla 9. Los tratamiento con lenalidomida (Grupos A y D) y Testigo de vehículo (Grupo C) comenzaron el Día (-1) . Los tratamientos con MOR202 (Grupos B y D) comenzaron el Día 0. El tratamiento continuó durante 6 semanas.

Tabla 9: Régimen de dosificación y Grupos Grupo Compuesto Tratamiento Régimen A Lenalidomida 50 mg/kg, vía oraluna vez al día en 10 mL/kg durante 6 semanas B MOR202 3 mg/kg, i.p., en3 veces a la 10 mL/kg semana durante 6 semanas C Testigo delO mL/kg vía oral una vez al día vehículo durante 6 semanas (Ora-Plus :Ora- Sweet SF (1:1, P/P) ) D Combinación de50 mg/kg, v.una vez al día Lenalidomida oral., en 10 mL/kg durante 6 semanas /MOR202 3 mg/kg, i.p., en3 veces por semana 10 mL/kg durante 6 semanas Se utilizó un Escaneo MicroCT para evaluar la lisis ósea y se incluyó un análisis 3-dimensional que comprendió el Volumen Óseo Total (TBV) , Volumen Óseo Trabecular (Tb.BV), Factor de Patrón Trabecular (Tb.Pf) e índice del Modelo Estructural (SMI) . La Tabla 10 define cada uno de estos parámetros. Los resultados de cada uno de los parámetros del Escaneo MicroCT se muestran en la Tabla 11. Los resultados del Volumen Óseo Total (TBV) se muestran en la Figura 19.

Tabla 10: Parámetros del escaneo MicroCT Parámetros: Definiciones: Volumen óseo Volumen óseo cortical y trabecular total total (mm3) dentro del volumen de interés (sección transversal) .

Volumen óseo Volumen óseo trabecular dentro del volumen trabecular de interés (sección transversal) .

AFactor de índice de fragmentación; Un índice inverso patrón de conectividad con aplicación específica trabecular al hueso trabecular. Un Tb.Pf inferior (Tb.Pf) significa redes trabeculares mejor conectadas mientras que un Tb.Pf más alto significa una estructura trabecular más desconectada (es decir, más lisis ósea) . ** índice de Un indicador de la prevalencia relativa de modelo varillas y placas en una estructura 3D tal estructural como el hueso trabecular. Este parámetro (SMI) es importante en la osteolisis de los huesos que se caracteriza por una transición de estructuras similares a placa (normal) a similares a varillas (degradación) . Una placa, cilindro y esfera ideales tienen valores de SMI de 0, 3 y 4, respectivamente. Cuanto más alto sea el valor, más daño existe.

Tabla 11 : Resultados del Escaneo MicroCT : Volumen Óseo Total (TBV ) , Volumen Óseo Trabecul (Tb.BV) , Factor de Patrón Trabecular (Tb. Pf) e índice de Modelo de Estructura (SMIJ I .

Grupo Tratamiento ID de ratón Volumen óseo Volumen óseo Factor de índice d 5 total (TBV) trabecular patrón modelo mm"3 (Tb.BV) trabecular estructur mm (Tb.Pf) (SMI) mm"1 38045 2.748 0.244 15.354 1.756 10 38596 2.839 0.295 12.373 1.542 39565 2.930 0.314 14.703 1.847 38325 2.964 0.309 13.538 1.653 Control Tibia de 33746 2.751 0.293 13.270 1.624 referencia no 15 inoculada* 38770 2.567 0.307 13.025 1.645 37966 2.967 0.410 12.125 1.557 38604 3.087 0.327 11.902 1.658 38023 2.775 0.270 18.005 1.889 20 38594 2.830 0.311 13.293 1.589 Media 2.846 0.308 13.759 1.676 EEM 0.047 0.014 0.583 0.037 33150 1.604 0.107 24.329 2.679 38027 1.742 0.100 23.561 2.667 38314 2.506 0.256 22.893 2.335 38446 2.466 0.213 28.280 2.560 38562 2.688 0.385 22.213 2.086 Lenalidomida 38626 2.869 0.293 30.739 2.619 A 50 mg/kg 38748 1.786 0.114 24.016 2.562 39192 1.988 0.081 29.454 2.592 39364 1.741 0.155 24.205 2.547 39512 2.007 0.219 38.360 3.125 Media 2.140 0.192 26.805 2.577 EEM 0.143 0.031 1.584 0.083 32094 2.233 0.190 27.049 2.386 32548 2.893 0.310 15.631 1.818 33564 2.760 0.356 27.631 2.423 38016 1.635 0.118 27.523 2.450 38023 2 ,.681 0..248 17.887 1..860 MOR03087, 3 mg/kg 38510 1. .838 0. .260 21 .405 2. .461 38599 2 , .884 0. .482 26 .345 2. .558 39086 3. .068 0. .566 20 .327 2. .247 39666 2 , .547 0 , .416 25 .843 2. .318 39715 2 , .135 0 , .284 22 .402 2. .275 Media 2. .467 0 .323 23 .204 2. .280 EEM 0 .153 0 .043 1. 365 0. .079 33090 1. .821 0 , .159 26 .537 2. .714 33131 1. .863 0. .132 28 .429 2. .681 33746 1. .577 0. .130 29 .171 2. .652 C Testigo de 37966 1. .865 0. .234 18 .276 2. .327 Vehículo 38325 2. .030 0. .096 30 .839 2. .591 (Ora Plus: Ora Sweet SF 38596 1 , .870 0. .154 33 .079 2. .783 (1:1) p/p) 38604 1. .904 0. .232 23 .234 2. .607 38770 2. .461 0. .210 19 .149 2. .137 39426 1. .556 0. .184 21 .846 2. .348 39565 2. .235 0. .256 24 .545 2. .365 Media 1. .918 0. .179 25 .510 2. .521 EEM 0.087 0.017 1.567 0.067 32695 2.471 0.168 21.323 2.028 37854 2.527 0.265 15.938 1.758 38276 3.212 0.220 20.046 2.197 38550 2.833 0.186 17.907 1.892 Lenalidomida, 38594 3.044 0.268 16.530 1.787 50 mg/kg 38994 2.896 0.408 14.633 1.683 OR03087, 39256 2.308 0.304 24.513 2.280 3 rtig/kg 39555 3.227 0.215 19.753 2.497 39677 3.205 0.548 12.313 1.799 39750 2.961 0.281 14.981 1.752 Media 2.868 0.286 17.794 1.967 EEM 0.105 0.036 1.152 0.086 El análisis de cada parámetro para actividad sinérgica se realizó de conformidad con teorema de Clarke et al. La Tabla 12 muestra los cálculos realizados para determinar sinergia de la combinación de MOR202 y lenalidomida. 20 Tabla 12 10 15 20 Los valores numéricos que se muestran en la Tabla 12 se toman directamente de los promedios que se muestran en la Tabla 11 para cada uno de los parámetros en cada uno de los Grupos. Los Grupos descritos como A, B, C y AB son los mismos grupos de tratamiento en las Tablas 9, 11 y 12.

En total, el Volumen Óseo (AB) /C es mayor que (A/C) X (B/C) lo que muestra un claro sinergia. En el factor de patrón Trabecular e índice de Modelo Estructural, tal como se describe en la Tabla 10, un valor inferior representa menos lisis ósea (eficacia de tratamiento) , por lo tanto, (AB) /C menor que (A/C) X (B/C) , muestra un claro sinergia en ambos parámetros .

Resultados La inoculación de células de mieloma múltiple NCI-H929 indujo una lisis ósea importante en la tibia de ratones hembra SCID en este estudio, tal como se indica mediante la medición de la lisis ósea a través de un escaneo microCT. El grado de lisis ósea se redujo considerablemente en la tibia de ratones tratados con la combinación de MOR202 y lenalidomida, tal como se muestra mediante escaneo microCT. En cada uno de los parámetros de Escaneo MicroCT: Volumen Óseo Total (TBV) , Volumen Óseo Trabecular (tb. BV) , Factor de Patrón Trabecular (Tb. Pf) e índice de Modelo estructural (SMI), la combinación de MOR2002 y lenalidomida (Grupo AB) mostró una clara sinergia en la reducción de la lisis ósea causada por células de mieloma múltiple NCI-H929.

Cuando los valores en la Tabla 11 se ajustan, de forma que el Grupo Testigo (Tibia contralateral no inoculada sin tumor) se considera con 0% de lisis ósea, y el Grupo C (Testigo de vehículo (0.9% de inyección de cloruro de sodio) se considera con 100% de lisis ósea, entonces MOR202 solo redujo la lisis ósea de manera dependiente de dosis hasta 55% a 12 mg/kg en comparación con el Testigo de vehículo. LEN solo a 50mg/kg inhibió la lisis ósea en un 20%. La combinación de 3mg/kg de MOR202 y 50 mg/kg de LEN suprimió por completo la lisis ósea. Estos hallazgos confirman un efecto sinérgico de la terapia de combinación. Además, hubo una reducción (>90%) de los niveles de suero de proteína M en el grupo de combinación, lo que indica una reducción importante de la carga de tumor.

Ejemplo 8 MOR202 y lenalidomida solos y en combinación contra tumor RAMOS de no-hodgkin humano en modelo de supervivencia de ratones SCID hembras Materiales Ciclofosfamida (Fluka, Buchs Switzerland, Lote No. 07551661) . Lenalidomida (SYNthesis Med Chem; Shanghai, China; Lote No. ZHM-066-051 ) . MOR202 (MorphoSys AG, Lote 100706-5KLE18) . Testigo de vehículo: Ora-Plus : Ora-Sweet SF, 1 :1, v/v (SYNthesis Med Chem, Shanghai, China). Ratones SCID (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, Cepa C . B . -17-lgh-lb-Prkdcscid) .

Se cultivaron células RAMOS (Oncodesign, Dijon Cedex, Francia) en RPMI1640 + 20% de una fuente alterna inactivada de calor FBS + 1 % de Glutamax (Medio No. 2). Los reactivos para cultivo de células RAMOS de linfoma no hodgkin se obtuvieron de los siguientes proveedores: Medio de cultivo celular RPMI 1640, FBS, Glutamax, HEPES, piruvato de sodio, HBSS y penicilina-estreptomicina de Invitrogen Australia (Mt Waverley, VIC, Australia) ; y azul de tripano y glucosa de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia) .

Métodos Sesenta y ocho ratones SCID hembras fueron pre-tratados con Ciclofosfamida (75 mg/kg, i.p., dos veces al día) durante dos días antes de la inoculación de células RAMOS (Dia-5 y-4) . El día de la inoculación (Dia-3) , todos los ratones fueron inoculados con 1 x 106 células RAMOS cada una por vía intravenosa en la vena de la cola. Sesenta y cuatro de los ratones fueron aleatorizados por peso corporal en ocho grupos de ocho. El régimen de dosificación para cada grupo se muestra en la Tabla 13.

Tabla 13: Régimen de dosificación Grupo Compuesto Tratamiento Régimen Régimen real pretendido A Lenalidomida 50 mg/kg, vía Una vez al Día 0-20 oral, en 10 día (Día 0- mL/kg 20) B MOR03087 1 mg/kg, Dos veces a Dos veces a i . v. , en 10 la semana la semana mL/kg (Día 0, 4, 7, (Día 0, 4, 7, 11, 14 y 18) 11, 14 y 18) C Vehículo vía oral, 10 Una vez al Día 0-18 testigo mL/kg día (Día 0- (Ora-Plus : 20) Ora-S eet, 1:1, v/v) AB Lenalidomida 100/1 mg/kg, Una vez al Día 0-13 y /MQR03087 vía día/dos veces 16-20/ Día O, oral/i . v . , a la . semana 4,7, 11, 14 y en 10 mL/kg (como 18 anteriormente El estudio continuó durante 98 días y el punto final medido fue la supervivencia. Los resultados de cada Grupo se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14 : Número de¦ Supervivencia y periodo de tiempo para cada grupo Los análisis para actividad sinérgica se realizaron de conformidad con el teorema de Clarke et al., tal como se describe en el Ejemplo 4. La Tabla 15 muestra los cálculos realizados para determinar la sinergia de la combinación de MOR202 y lenalidomida .

Tabla 15 10 15 20 10 15 20 Los valores numéricos que se muestran en la Tabla 15 se toman directamente de los días de supervivencia media que se muestran en la Tabla 14 para cada uno de los Grupos. Los Grupos descritos como A, B, C y AB son los mismos grupos de tratamiento en las Tablas 13-15.

La inoculación con células RAMOS fue letal dentro de un tiempo medio de 20 días en el grupo testigo. La combinación de MOR202 y lenalidomida, sin embargo, mostró una clara sinergia en el aumento de los días de supervivencia media.

Ejemplo 9: Bortezomib solo inhibió la proliferación de varias lineas células de mieloma múltiple.

El efecto inhibitorio de Bortezomib en la proliferación de células de mieloma múltiple se analizó para múltiples lineas celulares. Se aplicaron cantidades cada vez más altas de Bortezomib (Velcade®, Lote: No.: 9AZSY00) a células AMO-1, LP-1, NCI-H929 y RPMI-8226 y se incubaron durante 24h, 48h y 72h. Después de la incubación, se analizaron las placas de los periodos en busca de proliferación celular en un ensayo en base a XTT colorimétrico cuantitativo utilizando el kit de proliferación celular II (ROCHE, Kit de proliferación celular II, Cat. No.: 11465015001). Para mediciones posteriores, las placas se sometieron a una lectora Tecan Genios y se detectó absorbancia a 492nm.

La proliferación celular de todas las lineas celulares evaluadas se inhibió mediante Bortezomib con una concentración CI50 de 3.9 nM para células AMO-1, 6.1 nM para células LP-1, 3.3 nM para células NCI-H929 y 9.0 nM para células RPMI-8226, respectivamente, tal como se muestra en la Figura 8.

Ejemplo 10: ADCC utilizando la combinación de MOR202 y Bortezomib Usando los métodos descritos en el Ejemplo 4, se analizó el efecto ADCC de combinar bortezomib y MOR202. Aquí, las células blanco se trataron con bortezomib antes del tratamiento con MOR202. Ambas células blanco, NCI-H929 y LP-1 fueron evaluadas. Los resultados se muestran en la Figura 9. La mejora de la actividad de MOR202 mediante bortezomib fueron mediados a través del efecto citotóxico directo en células de MM.

Ejemplo 11: MOR202 y BOR solos y en combinación en modelo de ratón SCID de lisis ósea de NCI-H929 de mieloma múltiple Materiales Bortezomib (SYNthesis med chem. , Shanghai, China, Lote No. ZHM-066-054 ) .

Bortezomib se formuló en solución de Cloruro de Sodio al 0.9% estéril para dosificación. MOR202 (MorphoSys AG, Lote 100706-5KLE18) . Testigo de vehículo: 0.9% de inyección de cloruro de sodio. Ratones SCID (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, Cepa C.B.-17-lgh-lb-Prkdcscid) .

Métodos 63 ratones SCID fueron inoculados el Día (-7) por vía intratibial con 2.5 x 106 células NCI-H929 de MM con el fin de inducir la lisis ósea. Tres días post inoculación (Día-4), 60 de los ratones SCID fueron aleatorizados por peso corporal en los grupos que se muestran en la Tabla 16, 10 ratones por grupo. El régimen de dosificación se proporciona en la Tabla 16. Los tratamientos con Bortezomib (Grupos A y AB) y Testigo de vehículo (Grupo C) comenzaron el Día (-1). Los tratamientos con MOR202 (Grupos B y AB) comenzaron el Día 0. El tratamiento continuó durante 6 semanas .

Tabla 16: Régimen de dosificación y Grupos Grupo Compuesto Tratamiento Régimen A Bortezomib 0.6 mg/kg, dos veces por i .p. , en 10 semana mL/kg B MOR202 3 mg/kg, i.p., tres veces por in 10 mL/kg semana C Testigo de i.p., 10 mL/kg dos veces por vehículo (0.9% de semana inyección de cloruro de sodio) ?? Bortezomib/MOR202 0.6/3 mg/kg, dos veces/tres i.p., en 10 veces por mL/kg semana, en días alternados Se utilizó un Escaneo MicroCT para evaluar la lisis ósea y se incluyó un análisis 3-dimensional que comprendió el Volumen Óseo Total (TBV) , Volumen Óseo Trabecular (Tb.BV) , Factor de Patrón Trabecular (Tb. Pf) e índice del Modelo estructural (SMI) . La Tabla 10 anterior define cada uno de estos parámetros. Los resultados de cada uno de los parámetros del Escaneo MicroCT se muestran en la Tabla 17. Los resultados del Volumen Óseo Total (TBV) se muestran en la Figura 20.

Tabla 17: Resultados del Escaneo MicroCT: Volumen Óseo Total (TBV), Volumen Óseo Trabecular (Tb.BV), Factor de Patrón Trabecular (Tb.Pf) e índice de Modelo estructural (SMI) .

Grupo Tratamiento ID de ratón Volumen Volumen Factor de índice d óseo total óseo patrón modelo (TBV) rom"3 trabecular trabecular estructur (Tb.BV) (Tb.Pf) (SMI) mm una Testigo : 115898 771 0.400 12.097 1.525 Tibia 116259 255 0.598 7.999 1.264 contralateral Tibia de 109482 194 0.566 5.596 1.025 no inoculada referencia, sin tumor Grupos A, B, C 107508 945 0.346 16.910 1.860 Y AB) Promedio 3.041 0.477 10.650 1.419 EEM 0.112 0.062 2.481 0.179 101426 2.351 0.307 25.893 2.443 105949 2.025 0.191 26.044 2.374 107598 3.109 0.557 16.877 2.156 109560 3.146 0.588 23.179 2.262 113302 1.790 0.067 32.463 2.700 Bortezomib, 115836 1.893 0.076 33.152 2.981 O .6 mg/kg, dos 116981 2.201 0.100 34.609 3.007 veces por semana, i.p. 117585 1.617 0.093 31.813 2.553 117750 2.300 0.284 27.147 2.337 117793 2.448 0.329 23.582 2.273 Promedio 2.288 0.259 27.476 2.509 EEM ' 0.162 0.061 1.756 ? ?~94~ 10 106446 1.924 0.082 27.363 2.546 109482 1.987 0.388 19.479 2.079 112220 2.155 0.394 21.858 2.296 113668 1.958 0.276 23.814 2.429 MOR202 , 115187 2.080 0.440 16.347 1.871 3 mg/kg, tre 115956 2.207 0.460 19.748 2.193 veces por 116312 1.885 0.234 25.212 2.368 semana, 116798 1.882 0.254 21.276 2.436 20 116944 1.937 0.276 24.031 2.368 117773 1. 862 0 .160 25.056 2. 511 Promedio 1. 988 0 .296 22.418 2. 310 EEM 0. 038 0 .039 1.044 0. ,066 107097 1. 619 0. 248 22.779 2. .246 112122 1. 608 0. 178 26.514 2 , .505 115971 1. 637 0. 241 24.603 2 , .485 Testigo de 116259 1. 880 0. 369 19.334 2 , .176 vehículo : 116585 2. 060 0. 179 24.120 2 , .369 (0,9% de 116779 1. 624 0. 190 23.909 2 , .417 inyección 117054 1. 782 0. 131 23.000 2 , .541 de cloruro 117110 1. 838 0. 281 22.602 2. .312 de sodio: 117242 1. 919 0. 281 21.162 2 , .193 dos veces por 117375 1. 899 0. 283 23.455 2, .338 semana , i.p.

Promedio 1. 786 0. 238 23.148 2, .358 EEM 0. 050 0. 022 0.615 0, .041 107508 3.303 0.927 16.902 2.158 112625 4.254 1.661 3.000 0.772 113322 3.684 1.332 3.888 0.884 116030 2.422 0.192 30.272 2.542 Bortezomib/MOR20 116198 3.537 1.037 8.023 1.217 2, 0.6/3 mg/kg, dos/tres veces por semana , i . p 116376 1.933 0.255 22.059 2.321 116520 2.793 0.654 22.439 2.336 117077 3.402 0.658 7.207 1.241 117093 2.436 0.643 17.454 1.927 117135 3.026 0.627 13.699 1.775 Promedio 3.079 0.799 14.494 1.717 EEM 07220' ????? 2.836 " oT204~ El análisis de cada parámetro para actividad sinérgica se realizó de conformidad con el teorema de Clarke et al., tal como se describe en el Ejemplo 4. La Tabla 18 muestra los cálculos realizados para determinar la sinergia de la combinación de MOR202 y bortezomib.

Tabla 18 10 15 20 5 10 20 Los valores numéricos que se muestran en la Tabla 18 se toman directamente de los promedios que se muestran en la Tabla 17 para cada uno de los parámetros en cada uno de los Grupos. Los Grupos descritos como A, B, C y AB son los mismos grupos de tratamiento en las Tablas 16-18.

En total, el Volumen Óseo Total y Volumen Óseo Trabecular, (AB) /C) es mayor que (A/C) X (B/C) , lo que muestra un claro sinergia. En el factor de patrón Trabecular e índice de Modelo Estructural, tal como se describe en la Tabla 10, un valor inferior representa menos lisis ósea (eficacia de tratamiento), por lo tanto, (AB) /C menor que (A/C) X (B/C) , confirma un claro sinergia en ambos parámetros .

Resultados La inoculación de células de mieloma múltiple NCI-H929 indujo una lisis ósea importante en la tibia de ratones hembra SCID en este estudio, tal como se indica mediante la medición de la lisis ósea a través de un escaneo microCT. El grado de lisis ósea se redujo considerablemente en la tibia de ratones tratados con la combinación de MOR202 y bortezomib, tal como se muestra mediante escaneo microCT. En cada uno de los parámetros de Escaneo MicroCT: Volumen Óseo Total (TBV) , Volumen Óseo Trabecular (tb. BV) , Factor de Patrón Trabecular (Tb. Pf) y índice de Modelo estructural (SMI) , la combinación de MOR2002 y bortezomib (Grupo AB) mostró una clara sinergia en la reducción de la lisis ósea causada por células de mieloma múltiple NCI-H929.

Cuando los valores en la Tabla 11 se ajustan, de forma que el Grupo Testigo (Tibia contralateral no inoculada sin tumor) se considera con 0% de lisis ósea, y el Grupo C (Testigo de vehículo (0.9% de inyección de cloruro de sodio) se considera con 100% de lisis ósea, entonces MOR202 solo redujo la lisis ósea de manera dependiente de dosis hasta 55% a 12 mg/kg en comparación con el Testigo de vehículo, BOR solo a 0.6mg/kg inhibió la lisis ósea en un 40% y la combinación de una dosis inferior de 3mg/kg MOR202 y 0.6mg/kg de BOR suprimió completamente la lisis ósea. Estos hallazgos respaldan un efecto sinérgico de la terapia de combinación. Además, hubo una reducción (>90%) de los niveles de suero de proteína M en el grupo de combinación, lo que indica una reducción importante de la carga de tumor Ejemplo 12 OR202 y bortezomib sola y en combinación contra tumor RAMOS de no-hodgkin humano en modelo de supervivencia de ratones SCID hembras Materiales Ciclofosfamida (Fluka, Buchs Suiza, WB10468) . Bortezomib (SYNthesis med chem. , Shanghai, China, Lote No.

ZHM-066-054 ) . Bortezomib se formuló en solución de cloruro de sodio al 0.9% estéril para dosificación. MOR202 (MorphoSys AG, Lote 100706-5KLE18 ) . Testigo de vehículo: 0.9% de inyección de cloruro de sodio. Ratones SCID (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, Cepa C . B . -17-lgh-lb-Prkdcscid) .

Se cultivaron células RAMOS (Oncodesign, Dijon Cedex, Francia) en RPMI1640 + 20% de una fuente alterna inactivada de calor FBS + 1 % de Glutamax (Medio No. 2) . Los reactivos para cultivo de células RAMOS de linfoma no hodgkin se obtuvieron de los siguientes proveedores: Medio de cultivo celular RPMI 1640, FBS, Glutamax, HEPES, piruvato de sodio, HBSS y penicilina-estreptomicina de Invitrogen Australia (Mt Waverley, VIC, Australia) ; y azul de tripano y glucosa de Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia) .

Métodos Cincuenta y cinco ratones SCID hembras fueron pre-tratados con ciclofosfamida (75 mg/kg, i.p., dos veces al día) durante dos días antes de la inoculación de células RAMOS (Día-5 y-4). El día de la inoculación (Día-3) , los cincuenta y cinco los ratones fueron inoculados con 1 x 106 células RAMOS cada una (en ???µ?) por vía intravenosa en la vena de la cola. Cuarenta y ocho de los ratones fueron aleatorizados por peso corporal en seis grupos de ocho. El régimen de dosificación para cada grupo se muestra en la Tabla 19.

Tabla 19: Régimen de dosificación Grupo Compuesto Tratamiento Régimen Régimen pretendido real A Bortezomib 0.6 mg/kg, Día-¦i, 3, 6, Día-1, 3, 6 i.p., en 10 10, 13 y 17 y 13 mL/kg B MOR202 1 mg/kg, Día 0, 4, 7, Día 0, 4, i . v . , en 10 11/ 14 y 18 7, 11, 14 y mL/kg 18 C Testigo de i.p., 10 Día-¦i, 3, 6, Día-1, 3, vehículo (0.9% mL/kg 10, 13 y 17 6, 13 y 17 de solución salina para inyección) 0.6/1 mg/kg, Día-¦i, 3, 6, Día-1, 3, AB Bortezomib/MOR i.p./i.v. , 10, 13 y 17/ 6, 13, 17 y 202 en 10 mL/kg Día 0, 4, 7, 20/ Día 0, 11, 14 y 18 4, 7, 11, 14 y 18 El estudio continuó durante 98 días y el punto final medido fue la supervivencia. Los resultados de cada Grupo se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20: Número de Supervivencia y periodo de tiempo para cada grupo 15 El análisis de actividad sinérgica se realizó de conformidad con el teorema de Clarke et al. La Tabla 21 muestra los cálculos realizados para determinar la sinergia de la combinación de MOR202 y bortezomib.

Tabla 21 Cuando el EFECTO POSITIVO tiene un valor MÁS ALTO: Antagonista = ( AB) /C < (A/C) x (B/C) Aditivo = (AB) /C = (A/C) x (B/C) Sinérgico (AB) /C > (A/C) x (B/C) A = respuesta al tratamiento con BOR 0.6 mg/kg B = respuesta al tratamiento con MOR202 1 mg/kg C = respuesta al tratamiento con vehículo de 0.9% de Cloruro de Sodio AB = combinación de los tratamientos A y B Supervivencia media A 19 B 43, 5 C 20, 5 AB 45 (AB) /C 2, 195121951 es mayor que (A/C) x (B/C) 1, 966686496 Los valores numéricos que se muestran en la Tabla 21 se toman directamente de los días de supervivencia media que se muestran en la Tabla 20 para cada uno de los Grupos. Los Grupos descritos como A, B, C y AB son los mismos grupos de tratamiento en las Tablas 19-21.

La inoculación con células RAMOS fue letal dentro de un tiempo medio de 20.5 días en el grupo testigo. La combinación de MOR202 y bortezomib, sin embargo, mostró una clara sinergia en el aumento de los días de supervivencia media. Es importante señalar que con la combinación de MOR202 y bortezomib (Grupo AB) , 2 de 5 ratones sobrevivieron durante todo el estudio. Esto confirma un hallazgo sinérgico de la combinación de MOR202 y bortezomib Debe comprenderse que la descripción y los ejemplos y datos específicos, a pesar de que indican realizaciones ejemplares, se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención. Será evidente para los expertos en la técnica que pueden realizarse varios cambios y modificaciones a la presente invención a partir de la descripción, divulgación y datos contenidos en la presente, y de esta forma, se consideran parte de la invención .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región de HCDR1 de la secuencia GFTFSSYY N (SEQ ID NO: 1) o SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y (a) talidomida o un análogo de la misma, o (b) un inhibidor de proteasoma, para utilizar en el tratamiento del mieloma múltiples y/o linfoma no-hodgkin.

2. Una combinación de conformidad con la reivindicación 2, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada variable de la secuencia QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 10) y una cadena liviana variable de la secuencia DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 11) .

3. Una combinación de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, donde el anticuerpo comprende una región Fe de IgGI.

4. Una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo comprende una región Fe modificada, donde dicha modificación mejora la actividad de ADCC.

5. Una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo especifico para CD38 y dicha talidomida o análogo de la misma o un inhibidor de proteasoma se administran por separado.

6. Una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es capaz de reducir la lisis ósea con una eficacia al menos dos veces mejor que la lenalidomida y/o bortezomib solos.

7. Una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo especifico para CD38 se combina con talidomida o un análogo de la misma.

8. Una combinación de conformidad con la reivindicación 7, donde el análogo de talidomida comprende lenalidomida .

9. Una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la lenalidomida se administra antes de la administración del anticuerpo especifico para CD38.

10. Una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la lenalidomida se administra al menos 72 horas antes de la administración del anticuerpo especifico para CD38.

11. Una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, que es capaz de mediar la destrucción de células AMO-1 y/o NCI-H929 que expresan CD38 mediante ADCC en presencia de PBMC aisladas humanas con una eficacia al menos dos veces mejor que la lenalidomida sola.

12. Una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende dicho anticuerpo especifico para CD38 y un inhibidor de proteasoma.

13. Una combinación de conformidad con la reivindicación 12, donde dicho inhibidor de proteasoma es bortezomib .

14. Una combinación de conformidad con las reivindicaciones 12 o 13, que es capaz de mediar la destrucción de células LP-1 y/o NCI-H929 que expresan CD38 mediante ADCC en presencia de PB C aisladas humanas con una eficacia al menos dos veces mejor que la bortezomib solo.

15. Una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región de HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y lenalidomida u otro análogo de talidomida para utilizar en el tratamiento de mieloma múltiple y/o linfoma de no-hodgkin .

16. Una combinación sinérgica de un anticuerpo especifico para CD38 que comprende una región de HCDR1 de la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), una región HCDR2 de la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y bortezomib u otro inhibidor de proteasoma para utilizar en el tratamiento de mieloma múltiple y/o linfoma de no-hodgkin .