KR102204127B1 - 항-cd83 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD83과 결합하는 단백질 그리고 예를 들어, 요법, 예방, 진단, 또는 예후에서, 이의 용도와 관련된다.

Description

항-CD83 항체 및 이의 용도{ANTI-CD83 ANTIBODIES AND USE THEREOF}
분야
본 발명은 CD83과 결합하는 단백질 그리고 예를 들어, 요법, 예방, 진단, 또는 예후에서, 이의 용도와 관련된다.
배경
CD83
CD83은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 45 kDa, 유형-I 막 글리코단백질이다. CD83은 성숙한 수지상 세포 (DC) 상에서 주로 발현되는 세포 표면 마커이다. CD83은 미성숙한 혈액 DC (BDC) 및 단핵구 유래 DC (MoDC) 상에서 최소한으로 발현된다. 성숙한 DC 상에서 이의 우선적인 발현으로 인하여, CD83은 면역요법에 있어 유인적인 표적이다.
선천적 및 후천적 면역 반응의 수지상 세포 및 대조
DC는 선천적 및 동족 (후천적) 면역계와 관련된다. 선천적 면역은 외래 물질에 대한 반응에서 비-특이적 면역 활성화의 주된 동인이다. 미성숙한 DC는 항원의 내재화를 특수화하고 지속적인 항원 감시를 허용하는 주변 조직을 통해 분배된다. 일차 T 세포 반응을 유도하는 능력에 대한 전문적인 항원 제시 세포 (APC)로 불리우는, DC는 면역 활성화를 개시하기 위해 오로지 항원의 최소량을 요구한다.
미성숙한 DC는 감염성 물질 및 외래 물질로부터의 여러 가지 신호에 대해 조정되며, 상기 신호는 DC의 분화 및 성숙 (또한 활성화로도 공지됨)을 촉발한다. 성숙한 DC가 항원을 포획할 수 있지만, 이 활성화 과정은 상향조절 사이토카인 방출, 활성화 마커 발현 및 주조직 적합 복합체 (MHC) 제시를 위한 항원의 가공처리 대신에, 항원을 내재화하는 이들 세포의 능력을 감소시킨다. 가공처리된 항원으로 로딩된 성숙한 DC는 항원에 대한 반응을 증폭시키기 위해 T 세포, B 세포, 과립구, 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구 및 선천적 면역계의 다른 세포를 효과적으로 모집할 수 있다.
DC 분화 및 활성화시 발현되기 시작하는 분자는 선천적 면역과 후천적 면역을 연결하는 것을 보조한다. 성숙한 DC는 림프구와의 증가된 상호작용을 위해 림프절로 DC 이동을 촉진하는, 케모카인 수용체 및 부착 분자, 가령 CD54의 발현을 상향-조절한다. 공동자극 분자, 가령 CD80 및 CD86의 발현은 T 세포 활성화 및 항원-특이적 면역 반응의 개시에 필요한 공동자극 신호를 제공한다. CD40의 결찰은 공동-자극 분자의 발현을 증진시키고 IL-12의 방출을 유도하여 T 세포 활성화를 촉진한다; 이후 분화된 T 세포는 후천적 면역 반응의 복합 상호작용을 편성한다.
DC가 면역 반응에 대한 통제를 발휘하기 때문에, 활성화된 DC는 악성 질병 및 자가면역 질병을 비롯한 다수의 면역학적 질병에 걸쳐 중재를 위한 표적으로서 검토될 수 있다.
DC를 표적하는 화합물이 면역 반응을 조절할 수 있다는 점이 전술로부터 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 것이다. 이에 따라, DC를 결합시키는 화합물이 예를 들어 치료적, 예방적, 진단적 및 예후적 용도를 위해 바람직하다.
요약
본 발명은 CD83과 특이적으로 결합하는 인간 항체 (3C12 mAb)의 발명자 생산에 기반한다. 3Cl2 mAb는 인간 scFv 서열의 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)로부터 유래되었다; 얻은 scFv 파지 클론은 IgG1 mAb로서 재구성되었다.
3C12 mAb는 경쟁적 결합 어세이에서 이의 다클론 등가물, RA83을 경쟁에서 앞서고 인간 PBMC의 이종 이식편이 이식된 SCID 생쥐에서 이식편 대 숙주병 (GVHD)의 개시를 지연시키는 것으로 나타났다.
3C12 mAb의 치료학적 효능을 개선시키기 위하여, 발명자는 경쇄의 친화도 성숙을 수행하여 CD83에 대한 3C12 mAb의 친화도를 개선시켰다. 야생형 scFv에 비하여 별개의 경쇄 가변 영역 (VL) 서열 및 증진된 결합 특성을 가진 4개의 새로운 3C12 scFv 변이체 (3C12.B, 3C12.C, 3C12.D 및 3C12.E)가 수득되었다. 친화도 성숙 항체는 VL의 프레임워크 (FR) 및 상보성 결정 영역 (CDR)에서의 치환을 포함하였다. 이들 치환의 효과는 예측이 가능하지 않았다.
발명자는 또한 증진된 수준의 효과기 기능을 유도할 수 있는 3C12 mAb의 형태를 만들었고, 여기서 탈푸코실화된 3C12.C mAb는 다클론 항체, RA83에 필적하는 효력을 갖는다.
본 발명은 광범위하게, CD83과 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한 CD83 결합 단백질에 관한 것이다.
한 가지 예시에서, 본 발명은 CD83과 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한 CD83 결합 단백질을 제공하며, 여기서 결합 단백질은 서열 번호:1에서 나타난 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 한 가지 예시에서, 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열 번호:1에서 나타난 아미노산 서열의 프레임워크 영역과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
본 발명은 CD83과 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한 CD83 결합 단백질을 추가로 또는 대안으로 제공하며, 여기서 결합 단백질은 서열 번호:1에서 나타난 아미노산 서열의 세 가지 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
한 가지 예시에서, VH CDR1은 서열 번호:1의 아미노산 31 내지 35개를 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:1의 아미노산 50 내지 59개를 포함하고 그리고 VH CDR3은 서열 번호:1의 아미노산 99 내지 106개를 포함한다.
한 가지 예시에서, VH CDR1은 서열 번호:2에서 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2는 서열 번호:3에서 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 및 VH CDR3은 서열 번호:4에서 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 CD83과 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한 CD83 결합 단백질을 추가로 또는 대안으로 제공하며, 여기서 결합 단백질은 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다:
(i) 서열 번호:5, 6, 7, 8, 또는 9에서 나타난 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열; 또는
(ii) 서열 번호:5, 6, 7, 8, 또는 9에서 나타난 아미노산 서열 중 어느 하나의 세 가지 상보성 결정 영역 (CDR); 또는
(iii) 서열 번호: 10에서 나타난 바와 같은 공통 서열; 또는
(iv) 세 가지 CDR, 여기서 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 아미노산 서열은 서열 번호:26, 27, 또는 28에서 나타난 공통 서열임.
한 가지 예시에서, 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열 번호:5, 6, 7, 8, 또는 9에서 나타난 아미노산 서열 중 어느 하나의 프레임워크 영역과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
한 가지 예시에서, VL CDR1은 서열 번호:5, 6, 7, 8, 또는 9의 아미노산 24 내지 34개를 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:5, 6, 7, 8, 또는 9의 아미노산 50 내지 56개를 포함하고 그리고 VL CDR3은 서열 번호:5, 6, 7, 8, 또는 9의 아미노산 89 내지 97개를 포함한다.
한 가지 예시에서, VL CDR1은 서열 번호:11, 14, 17, 20, 또는 23에서 나타난 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2는 서열 번호:12, 15, 18, 21, 또는 24에서 나타난 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VL CDR3은 서열 번호:13, 16, 19, 22, 또는 25에서 나타난 아미노산 서열을 포함한다.
한 가지 예시에서, VL CDR1의 아미노산 서열은 위치 2에서 알라닌 (A) 또는 트레오닌 (T) 및/또는 위치 7에서 리신 (K) 또는 세린 (S) 또는 아르기닌 (R) 및/또는 위치 8에서 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S) 및/또는 위치 9에서 타이로신 (Y) 또는 히스티딘 (H) 또는 트립토판 (W) 및/또는 위치 10에서 페닐알라닌 (F) 또는 류신 (L)을 포함한다.
한 가지 예시에서, VL CDR2의 아미노산 서열은 위치 2에서 트레오닌 (T) 또는 알라닌 (A) 및/또는 위치 4에서 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)을 포함한다.
한 가지 예시에서, VL CDR3의 아미노산 서열은 위치 2에서 글루타민 (Q) 또는 리신 (K)을 및/또는 위치 3에서 류신 (L) 또는 발린 (V) 또는 시스테인 (C) 및/또는 위치 4에서 글리신 (G) 또는 아스파라긴 (N) 또는 아스파르트산 (D) 또는 세린 (S) 및또는 위치 5에서 알라닌 (A) 또는 세린 (S) 또는 아르기닌 (R) 및/또는 위치 6에서 타이로신 (Y) 또는 페닐알라닌 (F) 또는 알라닌 (A) 및/또는 위치 8에서 타이로신 (Y) 또는 류신 (L)을 포함한다.
한 가지 예시에서, VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 있다. 예를 들어, CD83 결합 단백질은 다음과 같다:
(i) 단쇄 Fv 단편 (scFv); 또는
(ii) 이합체 scFv (di-scFv); 또는
(iii) 중쇄 불변 도메인 (CH) 2 및/또는 CH3과 결합한 단백질에 연결된 (i) 또는 (ii); 또는
(iv) 면역 효과기 세포와 결합한 단백질에 연결된 (i) 또는 (ii).
또 다른 예시에서, VL 및 VH는 별개의 폴리펩티드 사슬 내에 있다. 예를 들어, CD83 결합 단백질은 다음과 같다:
(i) 디아바디; 또는
(ii) 트리아바디; 또는
(iii) 테트라바디; 또는
(iv) Fab; 또는
(v) F(ab')2; 또는
(vi) Fv; 또는
(vii) Fc 또는 a CH2 및/또는 CH3에 연결된 (i) 내지 (vi) 중 하나; 또는
(viii) 면역 효과기 세포와 결합한 단백질에 연결된 (i) 내지 (vi) 중 하나.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 CD83과 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항원 결합 도메인을 포함하며, 항체는 서열 번호:29에서 나타난 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호:30에서 나타난 바와 같은 경쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 예시적인 CD83 결합 단백질은 본 발명의 VH 및 키메라, 탈-면역화, 인간화, 인간, 유사인간화(synhumanized) 또는 영장류화 경쇄 또는 VL을 포함한다.
본 발명의 예시적인 형태에서, CD83 결합 단백질은 항체이다. 항체는 다음을 포함할 수 있다:
(i) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:5에서 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(ii) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:6에서 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(iii) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:7에서 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(iv) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:8에서 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(v) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:9에서 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(vi) 서열 번호:29에서 나타난 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호:30에서 나타난 바와 같은 경쇄 서열; 또는
(vii) 서열 번호:29에서 나타난 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호:31에서 나타난 바와 같은 경쇄 서열; 또는
(viii) 서열 번호:29에서 나타난 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호:32에서 나타난 바와 같은 경쇄 서열; 또는
(ix) 서열 번호:29에서 나타난 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호:33에서 나타난 바와 같은 경쇄 서열; 또는
(x) 서열 번호:29에서 나타난 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 번호:34에서 나타난 바와 같은 경쇄 서열.
한 가지 예시에서, 항체는 이에 결합하는 세포, 예를 들어, 면역 세포, 가령 항원 제시 세포 (APC) (가령, 수지상 세포 (DC)) 및/또는 림프구 (가령, T 세포)를 고갈시킨다.
본 명세서에서의 개시가 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해지는 것과 같이, 예시적인 CD83 결합 단백질은 독성 화합물에 접합되는 것 없이 그들이 결합하는 세포를 고갈시킬 수 있다.
한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질은 효과기 기능, 예를 들어 항체가 결합하는 세포의 살해를 야기하는 효과기 기능을 유도할 수 있다. 예시적인 효과기 기능은 항체-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존 세포-매개 식균 작용 (ADCP) 및/또는 보체-의존 세포독성 (CDC)를 포함한다.
한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질은 ADCC를 유도할 수 있다.
한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질은 효과기 기능을 유도할 수 있는 항체 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, 효과기 기능은 Fc-매개 효과기 기능이다. 한 가지 예시에서, Fc 영역은 IgG1 Fc 영역 또는 IgG3 Fc 영역 또는 혼성체 IgG1/IgG2 Fc 영역이다.
한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질은 야생형 인간 IgG1 및/또는 인간 IgG3 Fc 영역과 유사한 (가령, 유의적으로 상이하지 않은 또는 약 10% 내에서) 또는 동일한 수준의 효과기 기능을 유발할 수 있다.
한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질은 증진된 수준의 효과기 기능을 유도할 수 있다.
한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질에 의해 유도되는 효과기 기능의 수준은 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함할 때의 CD83 결합 단백질의 것과 비교하여 증진된다.
한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질은 탈푸코실화되거나 탈푸코실화된 Fc 영역을 포함한다.
또 다른 예시에서, CD83 결합 단백질은 단백질의 푸코실화 수준을 감소시키도록 변경되지 않았던 인간 또는 CHO 세포에 의해 생성된 항체와 비교하여 더 낮은 수준의 푸코실화를 갖는다. 이 실시예에 따라, 더 낮은 수준의 푸코실화는 CD83 결합 단백질을 포함하는 조성물에서, 푸코실화된 CD83 결합 단백질 (가령, 푸코오스를 포함하는 항체의 Asn297에 부착된 글리코실기)의 백분율이 단백질의 푸코실화 수준을 감소시키도록 변경되지 않았던 인간 또는 CHO 세포에 의해 생성된 것보다 더 낮다는 점을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
예를 들어, CD83 결합 단백질은 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함한 (또는 서열 번호:35에서 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된) VH 그리고 서열 번호:5, 6, 7, 8, 또는 9 중 어느 하나에서 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함한 (또는 서열 번호:36, 37, 38, 39, 또는 40 중 어느 하나에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된) VL를 포함한 탈푸코실화된 항체이다.
하나의 예시에서, CD83 결합 단백질은 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함한 (또는 서열 번호:35에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된) VH 그리고 서열 번호:5, 6, 7, 8, 또는 9 중 어느 하나에서 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함한 (또는 서열 번호:36, 37, 38, 39, 또는 40 중 어느 하나에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된) VL를 포함하고 그리고 검출 가능한 수준의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 (FUT8)를 발현하지 않는 (또는 감소된 수준을 발현하는) 포유류 세포 (가령, CHO 세포)에 의해 발현되고 또는 N-글리칸 가공처리, 가령 키푸넨신(kifunensine)의 저해제로 처리된다.
하나의 예시에서, CD83 결합 단백질은 항체에 의해 유도되는 효과기 기능을 증진시키는 하나 이상의 아미노산 서열 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 서열 치환은 치환을 포함하지 않은 Fc 영역과 비교하여 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 Fc 영역의 친화도를 증가시킨다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환은 치환을 포함하지 않은 Fc 영역과 비교하여 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc 및 FcγRIIIa로 구성된 군에서 선택된 Fcγ에 대한 Fc 영역의 친화도를 증가시킨다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 네이키드 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 전장 항체이다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 5x10-7 M 미만, 가령 4.5x10-7 M 미만, 가령 4x10-7 M 미만, 가령 3.5x10-7 M 미만, 가령 3x10-7 M 미만, 가령 2.5x10-7 M 미만, 가령 2x10-7 M 미만, 가령 1.5x10-7 M 미만, 가령 1x10-7 M 미만, 가령 9.5x10-8 M 미만, 가령 9x10-8 M 미만, 가령 8.5x10-8 M 미만, 가령 8x10-8 M 미만, 가령 7.5x10-8 M 미만, 가령 7x10-8 M 미만, 가령 6.5x10-8 M 미만, 가령 6x10-8 M 미만, 5.5x10-8 M 미만, 가령 5x10-8 M 미만, 가령 4.5x10-8 M 미만, 가령 4x10-8 M 미만, 가령 3.5x10-8 M 미만, 가령 3x10-8 M 미만, 가령 2.5x10-8 M 미만, 가령 2x10-8 M 미만, 가령 1.5x10-8 M 미만, 가령 1x10-8 M 미만, 가령 9.5x10-9 M 미만, 가령 9x10-9 M 미만, 가령 8.5x10-9 M 미만, 가령 8x10-9 M 미만, 가령 7.5x10-9 M 미만, 가령 7x10-9 M 미만, 가령 6.5x10-9 M 미만, 가령 6x10-9 M 미만, 가령 5.5x10-9 M 미만, 가령 5x10-9 M의 평형 해리 상수 (KD)를 가진 CD83과 결합한다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 약 6x10-9 M 미만, 예를 들어, 6.1x10-9 M의 KD를 가진 CD83과 결합한다. 한 가지 예시에서, KD는 약 5.5x10-9 M 내지 약 6.5x10-9 M이고, 예를 들어, 약 6x10-9 M이다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 5x106 M-1s-1 미만, 가령 4.5x106 M-1s-1 미만, 가령 4x106 M-1s-1 미만, 가령 3.5x106 M-1s-1 미만, 가령 3x106 M-1s-1 미만, 가령 2.5x106 M-1s-1 미만, 가령 2x106 M-1s-1 미만, 가령 1.5x106 M-1s-1 미만, 가령 1x106 M-1s-1 미만, 가령 9.5x105 M-1s-1 미만, 가령 9x105 M-1s-1 미만, 가령 8.5x105 M-1s-1 미만, 가령 8x105 M-1s-1 미만, 가령 7.5x105 M-1s-1 미만, 가령 7x105 M-1s-1 미만, 가령 6.5x105 M-1s-1 미만, 가령 6x105 M-1s-1 미만, 가령 5.5x105 M-1s-1 미만, 가령 5x105 M-1s-1 미만, 가령 4.5x105 M-1s-1 미만, 가령 4x105 M-1s-1 미만, 가령 3.5x105 M-1s-1 미만, 가령 3x105 M-1s-1 미만, 가령 2.5x105 M-1s-1 미만, 가령 2x105 M-1s-1 미만, 가령 1.5x105 M-1s-1 미만, 가령 lx105 M-1s-1의 결합 속도 (Kon)를 가진 CD83과 결합한다.
한 가지의 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 약 1.5x106 M-1s-1 미만의 Kon을 가진 CD83과 결합한다. 한 가지 예시에서, KD는 약 1.2x106 M-1s-1 내지 약 1.6x106 M-1s-1이고, 예를 들어, 약 1.3x106 M-1s-1이다.
한 가지의 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 1.5x10-1 s-1 미만, 가령 1x10-1 s-1 미만, 가령 9.5x10-2 s-1 미만, 가령 9x10-2 s-1 미만, 가령 8.5x10-2 s-1 미만, 가령 8x10-2 s-1 미만, 가령 7.5x10-2 s-1 미만, 가령 7x10-2 s-1 미만, 가령 6.5x10-2 s-1 미만, 가령 6x10-2 s-1 미만, 가령 5.5x10-2 s-1 미만, 가령 5x10-2 s-1 미만, 가령 4.5x10-2 s-1 미만, 가령 4x10-2 s-1 미만, 가령 3.5x10-2 s-1 미만, 가령 3x10-2 s-1 미만, 가령 2.5x102 s-1 미만, 가령 2x10-2 s-1 미만, 가령 1.5x10-2 s-1 미만, 가령 1x10-2 s-1 미만, 가령 9.5x10-3 s-1 미만, 가령 9x10-3 s-1 미만, 가령 8.5x10-3 s-1 미만, 가령 8x10-3 s-1 미만, 가령 7.5x10-3 s-1 미만, 가령 7x10-3 s-1의 해리 속도 (Koff)를 가진 CD83으로부터 해리된다.
한 가지의 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 약 8x10-3 s-1 미만의 Koff를 가진 CD83으로부터 해리된다. 한 가지의 예시에서, KD는 약 7x10-3 s-1 내지 약 9x10-3 s-1이고, 예를 들어, 약 8x10-3 s-1이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다.
한 가지 예시에서, 본 발명은 본 발명에 따라 CD83 결합 단백질을 포함하는 제약학적 조성물 및 적합한 담체, 예를 들어, 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 CD83 결합 단백질을 인코딩하는 단리된 또는 재조합 핵산을 제공한다.
핵산의 예시적인 서열은 본 발명의 CD83 결합 단백질을 인코딩하는 맥락에서 논의되며 본 발명의 현재 예시에 필요한 부분만 약간 수정하여(mutatis mutandis) 적용되는 것으로 받아들여진다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 핵산은 서열 번호: 35 내지 46에서 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 중간 내지 높은 엄격성 혼성화 조건 하에 본 발명의 핵산에 혼성화할 수 있는 핵산을 또한 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단리된 핵산의 단편, 동족체 및 유도체를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단리된 또는 재조합 핵산 및 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드 서열, 가령 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함하는 유전자 구조체 제공한다.
한 가지 예시에서, 유전자 구조체는 발현 벡터 및 본 발명의 단리된 또는 재조합 핵산을 포함한 발현 구조체이고, 여기서 상기 단리된 또는 재조합 핵산은 상기 발현 벡터내 하나 이상의 조절 핵산에 작동가능하게 연결된다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 유전자 구조체는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 폴리펩티드 (가령, VH를 포함)를 인코딩하는 핵산 및 프로모터에 작동가능하게 연결되는 또 다른 폴리펩티드 (가령, VL을 포함)를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 예시에서, 유전자 구조체는 예를 들어, 5'에서 3'으로의 순서로 하기 작동가능하게 연결된 성분을 포함한 바이시스트로닉(bicistronic) 유전자 구조체다:
(i) 프로모터;
(ii) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산;
(iii) 내부 리보좀 유입점; 및
(iv) 제2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
예를 들어, 제1 폴리펩티드는 VH를 포함하고 제2 폴리펩티드는 VL을 포함하고, 또는 제1 폴리펩티드는 VL을 포함하고 제2 폴리펩티드는 VH를 포함한다.
본 발명은 또한, 별개의 유전자 구조체를 고려하며, 이들 중 하나는 제1 폴리펩티드 (가령, VH를 포함)를 인코딩하고 이들 중 또 다른 것은 제2 폴리펩티드 (가령, VL을 포함)를 인코딩한다. 예를 들어, 본 발명은 다음을 포함하는 조성물을 또한 제공한다:
(i) 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드 (가령, VH를 포함)를 인코딩하는 핵산을 포함한 제1 유전자 구조체; 및
(ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드 (가령, VL을 포함)를 인코딩하는 핵산을 포함한 제2 유전자 구조체.
본 발명은 또한, 본 발명에 따라 유전자 구조체를 포함한 세포를 제공한다.
한 가지 예시에서, 본 발명은 본 발명의 CD83 결합 단백질을 발현하는 단리된 세포 또는 본 발명의 CD83 결합 단백질을 발현하도록 유전적으로-변형된 재조합 세포를 제공한다.
한 가지 예시에서, 세포는 본 발명의 유전자 구조체 또는 다음을 포함한다:
(i) 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드 (가령, VH를 포함)를 인코딩하는 핵산을 포함한 제1 유전자 구조체; 및
(ii) 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드 (가령, VL을 포함)를 인코딩하는 핵산을 포함한 제2 유전자 구조체,
여기서 제1 및 제2 폴리펩티드는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 형성함.
유전적 구조체는 세포 내로 통합될 수 있거나 에피좀에 남아있을 수 있다.
본 발명의 세포의 예시는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 CD83 결합 단백질을 생성하기 위한 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 생성되어야 할 CD83 결합 단백질에 충분한 조건 하에 본 발명의 유전자 구조체(들)를 유지시키는 단계를 포함한다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질을 생성하기 위한 방법은 생성되어야 할, 그리고 선택적으로, 분비되어야 할 CD83 결합 단백질에 충분한 조건 하에 본 발명의 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질을 생성하기 위한 방법은 CD83 결합 단백질을 단리시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 재조합 CD83 결합 단백질을 생성하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(i) 본 발명에 따라 발현 벡터를 함유한 세포를 배양하여 재조합 면역글로불린 또는 항체가 상기 숙주 세포에서 발현되도록 하는 단계; 및
(ii) 재조합 CD83 결합 단백질을 단리시키는 단계.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질을 생성하기 위한 방법은 제약학적으로 허용되는 담체로 CD83 결합 단백질을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한, 대상에서 질병 또는 질환의 치료학적 또는 예방적 처리의 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상에게 본 발명의 CD83 결합 단백질 투여하여 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함한다.
한 가지 예시에서, 대상은 포유류이다.
한 가지 예시에서, 포유류는 인간이다.
한 가지 예시에서, 포유류는 치료 또는 예방이 필요한 포유류이다.
한 가지 예시에서, 치료 또는 예방이 필요한 포유류는 질병 또는 질환으로 고통 받는다.
한 가지 예시에서, 치료 또는 예방이 필요한 포유류는 질병 또는 질환이 발병할 위험이 있거나 이의 재발의 위험이 있다.
본 발명은 또한, 의학에서 본 발명의 CD83 결합 단백질 또는 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 대상에서 질병 또는 질환의 치료를 위해 약물의 제조에서 본 발명의 CD83 결합 단백질의 용도를 추가로 또는 대안으로 제공한다.
본 발명은 또한, 대상에서 질병 또는 질환의 치료에서의 이용을 위해 본 발명의 CD83 결합 단백질을 제공한다.
한 가지 예시에서, 질병 또는 질환은 CD83 매개 질병 또는 질환이다.
한 가지 예시에서, 질병 또는 질환은 자가면역 질병 또는 질환, 또는 염증 질병 또는 질환이다. 예를 들어, 질병 또는 질환은 중증 근무력증, 다발성 경화증, 혈관염, 만성 염증성 장 질병, 가령 크론 병(Morbus Crohn) 또는 궤양성 결장염, HLA B27-연관된 자가면역 질환, 가령 베크테로 병(Morbus Bechterew), 및 전신 홍반성 루푸스, 피부병, 가령 건선, 류마티스 관절염, 및 인슐린-의존 진성 당뇨병이다.
한 가지 예시에서, 질병 또는 질환은 대상에서 항원 제시 세포 (APC) (가령, 수지상 세포 (DC)) 및/또는 림프구 (가령, T 세포)와 관련된 면역계 또는 세포 반응의 기능장애 또는 바람직하지 않은 기능에 의해 야기된다.
또 다른 예시에서, 질병 또는 질환은 조직 또는 기관 이식편의 거부이다. 예를 들어, 조직 또는 기관 이식의 거부는 이식편 대 숙주병 또는 숙주 대 이식편 병의 결과로서 일어난다.
또 다른 예시에서, 질병 또는 질환은 줄기 세포 이식편, 예를 들어, 조혈모 줄기세포 이식 (HSCT) 또는 제대혈 이식 (UCBT)의 거부이다. 예를 들어, 줄기 세포 이식의 거부는 이식편 대 숙주병 또는 숙주 대 이식편 병의 결과로서 일어난다. HSCT는 예를 들어, 직접적으로 골수로부터 또는 (가령 G-CSF의 투여에 의해) 골수로부터의 세포의 이동 후 말초 혈액으로부터 유래될 수 있다.
한 가지 예시에서, 방법은 공여자 및/또는 수여자에게 유효량의 CD83 결합 단백질, 가령 치료학적 유효량의 CD83 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 이식편은 이식되기에 앞서 또는 이식된 후 생체외 또는 생체내 유효량의 CD83 결합 단백질과 접촉될 수 있다.
본 발명은 또한, 동종이계 이식편의 면역활성을 하향-조절하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 이식편을 본 발명의 CD83 결합 단백질 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
한 가지 예시에서, 동종이계 이식편은 조혈모 줄기세포 이식편이다.
한 가지 예시에서, 이식편은 생체 외에서 본 발명의 CD83 결합 단백질 또는 조성물과 접촉된다.
또 다른 또는 추가적인 예시에서, 이식편의 수여자에게 이식편의 이식에 앞서 및/또는 이식편의 이식과 동시에 및/또는 이식편의 이식 후 본 발명의 CD83 결합 단백질 또는 조성물이 투여된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 3C12 IgG1의 발현 및 정제의 분석
(A) 배양 상청액의 비-감소 (NR) 및 2-머캅토에탄올 감소된 (R) 샘플 (i, iii) 그리고 5 μg 친화도 정제된 물질 (ii, iv)이 4-12% SDS-PAGE 상에서 분리되었고 쿠마시 블루(Coomassie Blue) R250으로 염색되었다. (B) 280 nm (상부 패널) 및 215 nm (중간 패널) 둘 모두에서 단백질-A 정제된 재조합 3C12 항체의 분석적인 크게 배제 크로마토그래피 (SEC), 그리고 215 nm (하부 패널)에서 겔 여과 표준법. 샘플은 검출 가능한 응집이 없고 145kDa의 예측 분자량을 보여준다.
도 2: 정제된 3C12 , 항-인간 CD83 IgG의 기능 분석
(A) 25 μg.mL-1 3C12 IgG1은 CD83+ 세포주 KM-H2 및 L428을 결합시키고 또한 인간 CD83 (FDCP1 TF)으로 형질감염된 FDCP1 세포를 결합시킨다. 비-형질감염된 FDCP1 세포 (CD83-) 상에서 3C12 및 동종형 IgG1 대조 사이의 어떠한 차이도 보이지 않는다. MFI = 평균 형광 강도. (B) 5:1의 효과기 대 표적 세포 비에서 CD16-의존 메커니즘을 통해 헤르셉틴 (음성 대조)에 비해 KM-H2 세포주의 3C12 IgG1 유도된 유의적인 용균. 통계적 유의성은 쌍-방향 ANOVA에 의해 결정되었다. 오차 막대는 5번의 반복실험의 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타낸다.
도 3: 3C12는 다른 CD83 항체와 중첩되는 입체형태 에피토프를 인식한다
(A) 5μg의 (i) 변성된 또는 (ii) 고유 재조합 인간 CD83ECD-His을 검출하는 데에 이용되는 CD83 항체의 웨스턴 블롯. 비-변성된 CD83은 세 가지 잠재적인 N-연결된 글리코실화 모티프의 글리코실화에서 호모-이합체화 및 가변성의 결과인, 12% 겔 상에서의 세 개의 얼룩진 밴드 (30 kDa, 22 kDa, 19 kDa)를 나타낸다. 항-인간 IgG IRD800 이차 항체는 단독으로 음성 대조로서 이용되었다 (덧붙인 표). KM-H2 세포에 CD83 항체의 동시 첨가의 효과 그리고 감소 퍼센트로서 보고된 3C12 및 다른 항체에 대한 평균 형광 강도에서의 결과적 변화.
도 4: 3C12 mAb는 이종 GVHD 모델에서 SCID 생쥐의 생체내 생존을 개선시킨 다
제0일에 인간 PBMC가 이식된 SCID 생쥐에게 CD83 항체 또는 동종형 정합된 대조의 투여 후 동물의 생존. 코호트당 이용된 동물의 수는 괄호 안에 나타나고 유의적인 차이 (p<0.05)에는 별표가 있다. (A) 동종형 대조 (항-인간 Her2; 헤르셉틴 IgG)와 비교하여 3C12 IgG의 용량 최적화. (B) 토끼 다클론 RA83 항체 또는 비-특이적 토끼 IgG (RAneg)과 0.125 mg 용량의 3C12 IgG의 비교. 나타난 데이터는 5번의 독립된 실험으로부터 풀링되고 각각의 실험은 각각의 코호트에서 최소 다섯 마리의 동물을 포함한다. (C) 1 mg 용량의 CD83 항체 및 복합된 용량의 3C12 및 RA83 치료제의 투여.
도 5: 키푸네신으로 3C12의 글리코변형은 저-푸코오스 IgG를 야기한다
(A) 2 μg.mL-1 키푸넨신 (3C12.kif; 상부 패널)의 존재에서 3C12의 생성은 푸코오스의 첨가를 저해하고, 한편 푸코오스는 MALDI TOF/TOF 질량 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 대조 3C12 형질감염 (3C12.WT; 하부 패널) 내에서 존재하는 당의 주된 성분이다. 각각의 우세한 신호에 의해 전형적으로 생성된 구조가 주해되고 푸코오스 (삼각형), GlcNAC (사각형), 만노오스 (진회색 원형), 및 갈락토오스 (연회색 원형)로써 도식적으로 나타난다. (B) 3C12.WT 및 3C12.Kif는 표준 IgG 분자량 (150 kDa 비-감소 (NR), 및 감소 (R)에서 관찰된 50 kDa, 25 kDa 밴드)이고 그리고 (C) 키푸넨신 처리는 동종형 대조 (MFI = 335, 회색 속(fill))에 비해 3C12.WT (MFI = 2581, 회색 선에 겹쳐진 흑색 선)와 비교하여 CD83+ 세포주, KM-H2에 대한 3C12.kif IgG (MFI = 2573, 회색 선)의 결합 활성을 변경하지 않는다.
도 6: V L 셔플된 (shuffled) 라이브러리로부터 인간 CD83에 대한 개선된 친화 도를 가진 scFv의 선별
(A) VL 셔플된 3C12 scFv를 디스플레이하는 효모는 각각의 라운드에 대해 명시된 농도에서 hCD83ECD-His로 염색되고 비교를 위해 고 친화도 수집 게이트(Gate) P2 및 덜 엄격한 게이트 P3으로 분류되었다. P2 및 P3으로 분류된 총 세포의 백분율은 게이트 내에서 디스플레이된다. 분류 라운드 3은 더 느린 해리-속도를 가진 클론에 대한 선별을 포함한다. (B) 3C12 및 친화도-개선된 VL 변이체의 VL 아미노산 서열 정렬의 연역된 프레임워크 (FR) 및 상보성 결정 영역 (CDR). (C) 0.2 nM hCD83ECD-His와 결합하는 야생형 (3C12.WT) 및 친화도-개선된 3C12 변이체 (3C12.B-E)를 발현하는 단클론 효모의 비교.
도 7: 재구성된 3C12 V L 셔플된 변이체 Fab의 특징분석
(A) BiaCore 트레이스(trace)는 3분 (180초; 회합 단계) 동안 Fab의 지속적인 주사 그 다음 10분 (600초; 해리 단계) 동안에 완충액의 주사 동안 고정된 hCD83ECD-Fc와 3C12.WT (상부 패널) 및 3C12.C (하부 패널) Fab 단편의 결합을 보여준다. 명시화된 농도 시리즈에 걸쳐 농도 Fab의 2-배 희석이 준비되었다. (B) CD83+ 세포주, KM-H2와 결합하는 3C12.WT (원형), 3C12.C (사각형) 및 IgG 동종형 대조 (삼각형)의 희석 시리즈.
도 8: 글리코변형 및 친화도 성숙은 CD83mAb의 시험관내 활성을 증진시킨다
시험관내 3C12.WT, 3C12.C, 및 3C12.kif의 비교 효력. (A) 37 ℃에서 항체 및 NK 세포와의 4시간 인큐베이션 후 CD83 형질감염된 BB88 세포의 특이적 용균 (5:1 효과기 대 표적 세포 비). 헤르셉틴 = 인간 IgG1κ 동종형 대조. (B) (i) 3C12 변이체의 항-증식 효과 및 (ii) 쌍-방향 MLR로 RA83과 비교한 항 증식 효과. 나타난 데이터는 2-4번의 독립된 실험을 나타내는, 5번의 반복실험의 평균 ± SEM이다.
도 9: CD83 밝은 혈액 수지상 세포는 시험관내 조작된 항-CD83 mAb에 의해 표적된다
3일에 걸쳐 5 μg.mL-1 3C12.C, 인간 IgG1κ 동종형 대조 또는 무(nil) 항체 처리를 한 PBMC를 배양한 후 혈액 DC에 미치는 영향. (i) 살아있는 (7AAD-), 활성화된 혈액 DC는 CMRF-44 및 CD83을 공동-발현하는 계통- HLA-DR+ (HLA-DR 게이팅은 나타나지 않음) 세포 (= 총 DC)로서 정의된다. (ii) 활성화된 DC 게이트 내에서의 숫자는 총 DC의 백분율이다. 각각의 실험 조건은 삼중복으로 수행되었고 제시된 결과는 4번의 독립된 실험을 나타낸다.
도 10: CD83 항원의 밀도는 GFP 발현 수준 및 시험관내 ADCC 효력과 관련이 있다
변화하는 수준의 CD83 발현이 있는 BB88 형질감염체의 특징분석; BB88-CD83-TF.5K (5,400MPC), BB88-CD83TF.3K (3,600MPC), 또는 BB88-CD83TF.2K (<2,300MPC). (A) BB88 형질감염체 상에서 HB15a에 의해 검출된 GFP (왼쪽) 및 CD83 (오른쪽)의 발현 수준. (B) 5:1의 효과기 대 표적 세포 비로 BB88 형질감염체 상에서 (i) 3C12.C, (ii) 3C12.Kif 또는 (iii) 3C12.C.Kif에 의한 크롬 방출 어세이에서 유도되는 ADCC. 데이터는 5번의 반복실험의 평균 ± SEM으로서 나타나고 제시된 결과는 2번의 독립된 실험을 나타낸다.
도 11: 3C12.C는 생체내 RA83과 동등한 효력을 갖는다
제0일에 이종 인간 PBMC 이식 그리고 0.125 mg CD83 항체 또는 동종형 정합된 항체 대조의 투여 후 SCID 생쥐의 생존. 데이터는 상이한 인간 PBMC 공여자를 이용한 2번의 실험으로부터 풀링된다 (각각의 코호트에서 이용된 동물의 총 수는 코호트 설명 다음의 괄호 안에 나타난다). 유의적인 차이 (p<0.05)에는 별표가 있다.
Figure 112015084258850-pct00001
Figure 112015084258850-pct00002
상세한 설명
일반
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 명시되지 않는 한 또는 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일 단계에 대한 언급, 물질의 조성물, 단계의 군 또는 물질의 조성물의 군은 하나 및 다수 (즉 하나 이상)의 이들 단계, 물질의 조성물, 단계의 군 또는 물질의 조성물의 군을 아우르는 것으로 간주될 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 달리 명확하게 명시되지 않는 한 복수의 측면을 포함한다. 예를 들어, "a"에 대한 언급은 단일 그리고 둘 이상을 포함하고; "an"에 대한 언급은 단일 그리고 둘 이상을 포함하고; "the"에 대한 언급은 단일 그리고 둘 이상 등을 포함한다.
본 명세서에서 설명된 본 발명의 각각의 예시는 달리 구체적으로 명시되지 않는 한 필요한 부분만 약간 수정하여 각기 모든 다른 예시에 적용되기 위함이다.
해당 분야의 통상의 기술자는 본 명세서내 발명이 구체적으로 설명된 것들 외에 변이 및 변형에 영향을 받기 쉽다는 점을 인식할 것이다. 본 발명은 이러한 변이 및 변형을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본 발명은 본 명세서에서 개별적으로 또는 총괄적으로 언급되거나 명시된 단계, 특징, 조성물 및 성분 모두, 그리고 상기 단계 또는 특징의 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 둘 이상을 포함한다.
본 발명은 본 명세서에서 설명된 특정 예시의 의해 범위가 제한되지 않아야 하고, 이는 오로지 예시화의 목적으로만 의도된다. 기능적으로-동등한 산물, 조성물 및 방법은 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 명확하게 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명은 달리 명시되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액내 펩티드 합성, 고체상 펩티드 합성, 및 면역학의 기존 기술을 이용하여, 과도한 실험 없이 수행된다. 이러한 절차는 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vols I, II, 및 III 전체; Benny K.C.Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, (2004) Humana Press, Vol. 248; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, 전문; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, 전문, 및 특히 Gait, ppl-22; Atkinson et al., pp35-81; Sproat et al.,pp 83-115; 및 Wu et al., pp 135-151에 의한 그 안에 있는 논문; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, 전문; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, 전문; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), 전체 시리즈; J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara Biochem. Biophys. Res. Commun. 73: 336-342, 1976; Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1963; Barany and Merrifield (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Miiler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky Int. J. Peptide Protein Res. 25: 449-474, 1985; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); 그리고 Animal Cell Culture: Practical Approach, 3rd edn (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, 전문에서 설명된다.
용어 "및/또는", 가령, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 중 하나를 의미하는 것으로 이해될 것이고 그리고 둘 모두의 의미 또는 둘 중 하나의 의미에 대한 명확한 뒷받침을 제공하는 것으로 간주될 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 단어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형어는 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 군의 포함을 암시하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 군의 배제는 암시하지 않는 것으로 이해될 것이다.
선택된 정의
CD83은 단일-패스 유형 I 막 단백질 및 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. 상이한 이소폼을 인코딩하는 세 가지 인간 전사체 변종이 발견되었다. 제한이 아닌 명명법의 목적을 위하여, 인간 CD83 (hCD83) 이소폼의 아미노산 서열은 서열 번호:47 (NP_004224.1; 이소폼 a), 서열 번호:48 (NP_001035370.1; 이소폼 b) 및 서열 번호:49 (NP_001238830.1; 이소폼 c)에서 나타난다. 이에 따라, 한 가지 예시에서, 인간 CD83의 아미노산 서열은 서열 번호:47, 48, 또는 49에서 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. CD83의 동족체는 판 트로글로디테(Pan troglodytes) (XP_518248.2), 마카카 물라토(Macaca mulatto) (XP_001093591.1), 캄스 루퍼스 패밀리아리스(Cams lupus familiaris ) (XP_852647.1), 보스 타우루스(Bos Taurus) (NP_001040055.1), 무스 무스쿨러스(Mus musculus ) (NP_033986.1), 랫터스 노르베기커스(Rattus norvegicus ) (NP_001101880.1) 및 갈루스 갈루스(Gallus gallus) (XP_418929.1)에서 발견될 수 있다. 본 발명의 예시적인 CD83 결합 단백질은 재조합 형태 (rhCD83)를 비롯하여, hCD83과 결합하거나 특이적으로 결합한다.
용어 "단리된 단백질" 또는 "단리된 폴리펩티드"는 이의 파생 기원 또는 근원에 의해, 이의 고유 상태에서 이를 수반하는 자연적으로-연관된 성분과 연관되지 않는; 동일한 근원으로부터의 다른 단백질이 실질적으로 없는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 의도된다. 단백질은 자연적으로 연관되는 성분이 실질적으로 없게 될 수 있거나 해당 분야에 공지된 단백질 정제 기술을 이용하여, 단리에 의해 실질적으로 정제될 수도 있다. "실질적으로 정제된"에 의하면 단백질은 실질적으로, 오염 물질이 없는 예를 들어, 오염 물질이 적어도 약 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 없는 것을 의미한다.
용어 "재조합"은 인공의 유전자 재조합의 산물을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 이에 따라, 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질의 맥락에서, 이 용어는 B 세포 성숙 동안 발생한 천연 재조합의 산물이자 대상의 신체 내에서 자연적으로-발생하는 항체를 아우르지 않는다. 하지만, 이러한 항체가 단리된다면, 항원 결합 도메인을 포함한 단리된 단백질인 것으로 간주되어야 한다. 유사하게, 단백질을 인코딩하는 핵산이 재조합 수단을 이용하여 단리되고 발현된다면, 결과적 단백질은 항원 결합 도메인을 포함한 재조합 단백질이다. 재조합 단백질은 예를 들어, 단백질이 발현되는 세포, 조직 또는 대상 내에 있을 때 인공 재조합 수단에 의해 발현되는 단백질을 또한, 아우른다.
용어 "CD83 결합 단백질"은 단일 폴리펩티드 사슬 (즉, 펩티드 결합에 의해 연결되는 일련의 근접 아미노산), 또는 본 명세서에서 설명된 및/또는 주장된 방식으로 CD83과 결합할 수 있는 서로 (즉, 폴리펩티드 복합체 또는 단백질)에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연결되는 일련의 폴리펩티드를 포함하는 것으로 간주될 것이다. 예를 들어, 일련의 폴리펩티드 사슬은 적합한 화학 결합 또는 디설파이드 결합을 이용하여 공유결합으로 연결될 수 있다. 비-공유결합의 예시는 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스(Van der Waals) 힘, 그리고 소수성 상호작용을 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 사슬"은 펩티드 결합에 의해 연결되는 일련의 근접 아미노산을 의미하는 것으로 전술한 문단으로부터 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 도메인"은 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 영역, 즉, VH 또는 VL 또는 VH 및 VL을 모두 포함한 Fv를 의미하는 것으로 간주될 것이다. 항원 결합 도메인은 전체 항체의 맥락내 있을 필요는 없고, 예를 들어, 상기 도메인은 단리 (가령, 도메인 항체)로 또는 또 다른 형태 (가령, scFv)로 있을 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 용어 "항체"는 Fv 내에 함유된 항원 결합 도메인에 의해 하나 또는 몇 개의 매우 관련된 항원 (가령, CD83)과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 이 용어는 4개의 사슬 항체 (가령, 2개의 경쇄 (L) 및 2개의 중쇄 (H)), 재조합 항체 또는 변형된 항체 (가령, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-이식된 항체, 영장류화 항체, 탈-면역화 항체, 유사인간화 항체, 반-항체, 이중특이적 항체)를 포함한다. 항체는 일반적으로 불변 도메인을 포함하고, 이는 불변 영역 또는 불변 단편 또는 결정화시킬 수 있는 단편 (Fc) 내로 배열될 수 있다. 항체의 예시적인 형태는 그들의 기본 단위로서 네 개-사슬 구조를 포함한다. 전장 항체는 공유결합으로 연결된 2개의 중쇄 (각각 ~50 내지 70 kDa) 그리고 2개의 경쇄 (각각, ~23 kDa)를 포함한다. 경쇄는 일반적으로 가변 영역 (존재한다면) 및 불변 도메인을 포함하고 그리고 포유류에서 κ 경쇄 또는 λ 경쇄 중 하나이다. 중쇄는 일반적으로, 힌지 영역에 의해 추가적인 불변 도메인(들)에 연결된 가변 영역 및 1개 또는 2개의 불변 도메인(들)을 포함한다. 포유류의 중쇄는 다음 유형 α, δ, ε, γ 또는 μ 중 하나의 것이다. 각각의 경쇄는 또한, 중쇄들 중 하나에 공유결합으로 연결된다. 예를 들어, 2개의 중쇄 및 중쇄와 경쇄는 사슬-간 디설파이드 결합에 의해 그리고 비-공유결합 상호작용에 의해 서로 뭉쳐있다. 사슬-간 디설파이드 결합의 수는 상이한 유형의 항체에 따라 달라질 수 있다. 각각의 사슬은 N-말단 가변 영역 (VH 또는 VL, 여기서 각각은 ~110개의 아미노산 길이임) 및 C-말단에서 하나 이상의 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인 (~110개의 아미노산 길이인 CL)은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (330 내지 440개의 아미노산 길이인 CH1)과 정렬되고 그리고 상기 도메인과 디설파이드 결합된다. 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변 영역과 정렬된다. 항체 중쇄는 2개 이상의 추가적인 CH 도메인 (가령, CH2, CH3 등)을 포함할 수 있고 그리고 CH1과 CH2 불변 도메인 사이에서 힌지 영역을 포함할 수 있다. 항체는 임의의 유형 (가령, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 종류 (가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위종류의 항체일 수 있다. 한 가지 예시에서, 항체는 쥣과 (생쥐 또는 랫트) 항체 또는 영장류 (가령, 인간) 항체이다. 한 가지 예시에서, 항체는 인간화되고, 유사인간화되고, 키메라이고, CDR-이식되고 또는 탈면역화된다.
용어 "네이키드 항체"는 또 다른 화합물, 예를 들어 독성 화합물 또는 방사성표지에 접합되지 않는 항체를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "가변 영역"은 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 나타내고 그리고 프레임워크 영역 (FR) 및 상보성 결정 영역 (CDR), 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 가변 영역은 3개의 CDR과 함께 3개 또는 4개의 FR (가령, FR1, FR2, FR3 및 선택적으로 FR4)를 포함한다. VH는 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. VL은 경쇄의 가변 영역을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역" (동의어 CDR, 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항체 가변 영역의 아미노산 잔기를 나타내고 이의 존재는 특이적 항원 결합에 대한 주요 기여자이다. 각각의 가변 영역 도메인 (VH 또는 VL)은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 식별되는 세 가지 CDR 영역을 갖는다. 한 가지 예시에서, CDR 및 FR에 배정되는 아미노산 위치는 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991 (또한 본 명세서에서 "카바트 넘버링 시스템(Kabat numbering system)"라고도 언급됨)에 따라 정의된다. 또 다른 예시에서, CDR 및 FR에 배정되는 아미노산 위치는 Enhanced Chothia Numbering Scheme (http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)에 따라 정의된다. 카바트의 넘버링 시스템에 따르면, VH FR 및 CDR은 다음과 같이 위치된다: 잔기 1 내지 30 (FR1), 31 내지 35 (CDR1), 36 내지 49 (FR2), 50 내지 65 (CDR2), 66 내지 94 (FR3), 95 내지 102 (CDR3) 및 103 내지 113 (FR4). 카바트의 넘버링 시스템에 따르면, VL FR 및 CDR은 다음과 같이 위치된다: 잔기 1 내지 23 (FR1), 24 내지 34 (CDR1), 35 내지 49 (FR2), 50 내지 56 (CDR2), 57 내지 88 (FR3), 89 내지 97 (CDR3) 및 98 내지 107 (FR4). 본 발명은 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 FR 및 CDR에 제한되지 않지만, 표준 넘버링 시스템 또는 Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989; 및/또는 Al- Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948, 1997의 넘버링 시스템; Honnegher and Plukthun J. Mol. Biol. 309: 657-670, 2001의 넘버링 시스템; 또는 Giudicelli et al., Nucleic Acids Res. 25: 206-211 1997에서 논의된 IMGT 시스템을 비롯한, 모든 넘버링 시스템을 포함한다. 한 가지 예시에서, CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 정의된다. 선택적으로, 카바트 넘버링 시스템에 따른 중쇄 CDR2는 본 명세서에 열거된 5개의 C-말단 아미노산을 포함하지 않고 또는 이들 아미노산 중 임의의 하나 이상은 또 다른 자연적-발생 아미노산으로 치환된다. 추가적인, 또는 대안적인 옵션에서, 경쇄 CDR1은 본 명세서에서 열거된 4개의 N-말단 아미노산을 포함하지 않고 또는 이들 아미노산 중 임의의 하나 이상은 또 다른 자연적-발생 아미노산으로 치환된다. 이에 관련하여, Padlan et al., FASEB J., 9: 133-139, 1995는 중쇄 CDR2의 C-말단 아미노산 5개 및/또는 경쇄 CDR1의 N-말단 아미노산 4개가 일반적으로 항원 결합에 관여되지 않는다는 점을 확립하였다.
"프레임워크 영역" (FR)은 CDR 잔기 외의 이들 가변 영역 잔기이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fv"는 다중 폴리펩티드 또는 단일 폴리펩티드로 구성되는 것에 상관 없이, 임의의 단백질을 의미하는 것으로 간주될 것이고, 이때 VL 및 VH는 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 갖는 복합체와 연관되고 상기 복합체를 형성한다. 항원 결합 도메인을 형성하는 VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 또는 상이한 폴리펩티드 사슬 내에 있을 수 있다. 더욱이, 본 발명의 Fv (뿐만 아니라, 본 발명의 임의의 단백질)는 동일한 항원을 결합시키거나 결합시킬 수 없는 다수의 항원 결합 도메인을 가질 수 있다. 이 용어는 재조합 수단을 이용하여 생성되는 이러한 단편에 상응하는 단백질 뿐만 아니라 항체로부터 직접적으로 유래된 단편을 아우르는 것으로 이해될 것이다. 몇몇 예시에서, VH는 중쇄 불변 도메인 (CH) 1에 연결되지 않고 및/또는 VL은 경쇄 불변 도메인 (CL)에 연결되지 않는다. 폴리펩티드 또는 단백질을 함유한 예시적인 Fv는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 고차 복합체, 또는 이의 불변 영역 또는 도메인, 예를 들어 CH2 또는 CH3 단백질, 예를 들어, 미니바디에 연결된 전술한 것 중 어느 하나를 포함한다.
"Fab 단편"은 면역글로불린의 1가 항원-결합 단편으로 구성되고, 그리고 효소 파파인으로 전체 항체의 분해에 의해 생성되어 완전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성되는 단편을 수득할 수 있고 또는 재조합 수단을 이용하여 생성될 수 있다.
항체의 "Fab' 단편"은 펩신으로 전체 항체를 처리함으로써, 그 다음 환원시킴으로써 수득되어 완전한 경쇄 및 VH 및 단일 불변 도메인을 포함한 중쇄의 일부로 구성된 분자를 얻을 수 있다. 2개의 Fab' 단편은 이 방식으로 처리된 항체에 따라 얻어진다. Fab' 단편은 또한, 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다.
항체의 "F(ab')2 단편"은 2개의 디설파이드 결합에 의해 서로 뭉쳐있는 2개의 Fab' 단편의 이합체로 구성되고, 그리고 차후 환원 없이, 효소 펩신으로 전체 항체 분자를 처리함으로써 얻어진다.
"Fab2" 단편은 예를 들어 류신 지퍼 또는 CH3 도메인을 이용하여 연결된 2개의 Fab 단편을 포함한 재조합 단편이다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역이 적합하고 유연한 폴리펩티드 링커(linker)에 의해 공유결합으로 연결되는 항체의 가변 영역 단편 (Fv)을 함유한 재조합 분자이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항원과 CD83 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 도메인의 상호작용에 관하여 용어 "결합하다"는 상호작용이 항원에서의 특정한 구조 (가령, 항원 결정부 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 점을 의미한다. 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질 보다는 특이적인 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"와 결합한다면, 표지된 "A"와 항체를 함유한 반응에서, 에피토프 "A" (또는 유리(fee), 비표지된 "A")를 함유한 분자의 존재는 항체와 결합된 표지된 "A"의 양을 감소시킬 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적으로 결합한다"는 본 발명의 단백질이 대안적인 항원 또는 세포가 그러한 것과 동일하게 발현하는 특정한 항원 또는 세포와 더 긴 지속 기간으로 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 연관된다는 점을 의미하는 것으로 간주될 것이다. 예를 들어, 항원과 특이적으로 결합하는 단백질은 더 큰 친화도, 친화력을 가진 항원을 더욱 쉽게, 및/또는 다른 항원과 결합하는 것보다 더 긴 지속기간을 가진 항원을 결합시킨다. 예를 들어, 단백질은 다른 면역글로불린 슈퍼패밀리 리간드와 결합하는 것보다 실질적으로 더 큰 친화도를 가진 CD83 (가령, hCD83)과 또는 다중반응 천연 항체 (즉, 인간에서 자연적으로 발견되는 여러 가지 항원과 결합하는 것으로 공지되는 자연 발생 항체에 의해)에 의해 일반적으로 인식되는 항원과 결합한다. 이 정의를 독해함으로써, 예를 들어 일차 항원과 특이적으로 결합하는 단백질은 이차 항원과 특이적으로 결합할 수 있거나 결합할 수 없다는 점이 또한 이해된다. 따라서, "특이적 결합"은 또 다른 항원의 독점적인 결합 또는 비-검출성 결합을 필수적으로 요구하지 않으며, 이것은 용어 "선별적인 결합"을 의미한다. 한 가지 예시에서, 항원과 본 발명의 CD83 결합 단백질의 "특이적 결합"은 단백질이 100 nM 미만, 가령 50 nM 미만, 예를 들면, 20 nM 미만, 가령, 15 nM 미만 또는 10 nM 미만 또는 5 nM 미만 또는 1 nM 미만 또는 500 pM 미만 또는 400 pM 미만 또는 300 pM 미만 또는 200 pM 미만 또는 100 pM 미만의 평형 상수 (KD)을 가진 항원과 결합한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프" (동의어 "항원 결정부")는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한 단백질이 결합하는 CD83의 영역을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 이 용어는 단백질이 접촉하는 특이적 잔기 또는 구조에 필수적으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이 용어는 단백질에 의해 접촉되는 영역 스패닝(spanning) 아미노산 및/또는 이 영역의 바깥 쪽에 있는 적어도 5 내지 10개 또는 2 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산을 포함한다. 몇몇 예시에서, 에피토프는 선형 시리즈 아미노산이다. 에피토프는 또한, CD83이 접힐 때 서로 가까이 위치되는 일련의 비연속적 아미노산, 즉, "입체형태 에피토프"를 포함할 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 또한, 용어 "에피토프"가 펩티드 또는 폴리펩티드에 제한되지 않는다는 점을 인지할 것이다. 예를 들어, "에피토프"는 당 곁사슬, 포스포릴 곁사슬 또는 설포닐 곁사슬과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화(grouping)를 포함하고, 그리고 특정한 예시에서, 특이적인 3차원 구조 특징, 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프 또는 이를 포함한 펩티드 또는 폴리펩티드는 에피토프에 대한 항체를 발생시키기 위해 동물에게 투여될 수 있다.
용어 "경쟁적으로 저해한다"는 본 발명의 CD83 결합 단백질이 CD83, 예를 들어 hCD83과 열거된 항체의 결합을 감소시키거나 예방한다는 점을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 이것은 항체와 결합하는 단백질 (또는 항원 결합 도메인) 또는 항체로서 중첩 에피토프 때문일 수 있다. 단백질은 항체의 결합을 완전하게 저해할 필요는 없고, 오히려 결합을 통계적으로 유의적인 양만큼, 예를 들어, 적어도 약 10% 또는 20% 또는 30% 또는 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 95%만큼 오로지 감소시킬 필요가 있다는 점이 전술로부터 명확해질 것이다. 결합의 경쟁적인 저해를 결정하기 위한 방법은 해당 분야에 공지되고 및/또는 본 명세서에서 설명된다. 예를 들어, 항체는 단백질의 존재 또는 부재에서 CD83에 노출된다. 단백질의 부재에서보다 단백질의 존재에서 더 적은 항체가 결합된다면, 단백질은 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것으로 간주된다. 한 가지 예시에서, 결합의 경쟁적 저해는 항체의 항원 결합 도메인과 중첩되는 CD83 상에서 단백질의 항원 결합 도메인에 의해 야기된다.
2개의 에피토프의 맥락에서 "중첩"은 2개의 에피토프가 충분한 수의 아미노산 잔기를 공유하여 하나의 에피토프와 결합하는 본 발명의 결합 단백질이 다른 에피토프와 결합하는 CD83과 열거된 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하도록 한다는 점을 의미한다. 예를 들어, "중첩" 에피토프는 적어도 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10 또는 11 또는 12 또는 13 또는 14 또는 15 또는 16 또는 17 또는 18 또는 19 또는 20개의 아미노산을 공유한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CD83 연관된 질환 또는 질병"은 CD83 또는 CD83을 발현하는 세포에 의해 야기되거나 이와 연관되는 임의의 질환 또는 질병을 나타낸다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 본 발명에 기반하여 및/또는 CD83 연관 질환 또는 질병을 진단하기 위한 어세이를 수행함으로써 이러한 질환 또는 질병을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 이에 관련하여, 몇몇 예시에서 질환 또는 질병은 염증 질환 또는 질병, 또는 자가면역 질환 또는 질병이다. 예시적인 질환 또는 질병의 설명은 본 명세서에서 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"은 본 발명의 단백질을 투여하여 그렇게 함으로써 질환 또는 질병의 적어도 한 가지 증상의 발생을 멈추거나 방지하는 것을 포함한다. 이 용어는 또한, 재발을 예방하거나 방지하기 위해 병에 차도가 있는 대상의 치료를 아우른다. 예를 들어, 재발-경감 다발성 경화증으로 고통 받는 대상은 차도가 있는 동안 치료되어 그렇게 함으로써 재발을 예방한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 본 명세서에서 설명된 단백질을 투여하여 그렇게 함으로써 명시된 질환 또는 질병의 적어도 한 가지 증상을 감소시키거나 제거하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상"은 임의의 동물, 가령 포유류를 의미하는 것으로 간주될 것이다. 한 가지 예시에서, 포유류는 인간 또는 비-인간 영장류이다. 한 가지 예시에서, 포유류는 인간이다.
"샘플"에 대한 본 명세서에서의 언급은 체액 (가령, 혈액 또는 혈액 단편, 가령 혈청 또는 혈장, 눈물, 소변, 관절 낭액 또는 뇌척수액), 세포 물질 (가령 조직 흡인물), 조직 생검 표본 또는 수술 적출물과 같이 대상으로부터 유래된 임의의 샘플에 대한 언급으로서 이해되어야 하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 예시에서, "샘플"은 임의의 하나 이상의 혈청, 혈장, PBMC, 또는 연막 단편이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "진단", 및 "진단하다", "진단된" 또는 "진단하는"과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 이의 변형어는 임상 상태의 임의의 일차 진단 또는 재발한 질병의 진단을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "예후", "예후하는" 및 이의 변형어는 회복 또는 재발의 가능성을 비롯한, 질병의 있을 수 있는 결과 또는 과정 또는 치료의 결과를 나타낸다.
용어 "발현 구조체"는 이의 광범위한 문맥에서 쓰이기 위함이고 본 명세서에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 핵산과 작동가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터 서열을 포함한 핵산을 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 발현가능한 형식으로 추가로, 핵산을 유지하고 및 또는 복제할 수 있는 발현 구조체를 포함한 핵산을 나타낸다. 예를 들어, 발현 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 파지미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 바이러스 하위-게놈 또는 게놈 단편을 포함할 수 있다. 적절한 벡터의 선별은 해당 분야의 통상의 기술자들의 지식 내에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 이의 광범위한 문맥에서 쓰이기 위함이고 그리고 예를 들어, 발달 자극 및/또는 외부 자극에 대한 반응으로, 또는 조직 특이적 방식으로, 핵산의 발현을 변경하는 추가적인 조절 요소 (가령, 상류 활성 서열, 전사 인자 결합 부위, 인핸서(enhancer) 및 사일런서(silencers))와 함께 또는 상기 조절 요소 없이, 정확한 전사 개시를 위해 요구되는 TATA 박스 또는 개시 요소를 비롯한 게놈 유전자의 전사성 조절 서열을 포함한다. 본 맥락에서, 용어 "프로모터"는 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현에 기여하고, 상기 발현을 활성화하거나 증진시키는 재조합, 합성, 또는 융합 핵산 또는 유도체를 설명하는 데에 또한 사용된다. 예시적인 프로모터는 상기 핵산의 발현을 추가로 증진시키고 및/또는 상기 핵산의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경하기 위해 하나 이상의 특이적인 조절 요소의 추가적인 복사체를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현이 프로모터에 의해 조절되도록 핵산에 관하여 프로모터를 위치화하는 것을 의미한다. 프로모터는 예를 들어, 내부 리보좀 유입점을 통하여, 수많은 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다.
항원 결합 도메인을 포함한 단백질
항체
라이브러리-기반 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 CD83 결합 단백질을 식별하기 위해 항체 또는 이의 항원 결합 도메인 (가령, 이의 가변 영역을 포함)을 포함한 단백질의 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 VH 그리고 다수의 VL 영역을 포함한 라이브러리는 본 발명의 CD83 결합 단백질을 식별하기 위해 스크리닝될 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 라이브러리의 예시는 미경험(naive) 라이브러리 (비공격된 대상으로부터 나옴), 면역화된 라이브러리 (항원으로 면역화된 대상으로부터 나옴) 또는 합성 라이브러리를 포함한다. 핵산 인코딩 항체 또는 이의 영역 (가령, 가변 영역)은 기존 기술 (가령, Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에서 개시된 바와 같음)에 의해 클로닝되고 해당 분야에 공지된 방법을 이용하여 단백질을 인코딩하고 디스플레이하는 데에 이용된다. 단백질의 라이브러리를 생성하기 위한 다른 기술은 예를 들어, US6300064 (가령, Morphosys AG의 HuCAL 라이브러리), US5885793, US6204023, US6291158, 또는 US6248516에서 설명된다.
본 발명에 따라 CD83 결합 단백질은 용해성 분비 단백질일 수 있고 또는 세포, 또는 입자 (가령, 파지 또는 다른 바이러스, 리보좀 또는 포자)의 표면 상에 융합 단백질로서 제시될 수 있다. 다양한 디스플레이 라이브러리 형식은 해당 분야에 공지된다. 예를 들어, 라이브러리는 시험관내 디스플레이 라이브러리 (가령, US7270969에서 설명된 바와 같은, 리보좀 디스플레이 라이브러리, 공유결합 디스플레이 라이브러리 또는 mRNA 디스플레이 라이브러리)이다. 또 다른 예시에서, 디스플레이 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리이고 여기서 항체의 항원 결합 도메인을 포함한 단백질은 예를 들어, US6300064, US5885793, US6204023, US6291158, 또는 US6248516에서 설명된 바와 같이, 파지 상에서 발현된다. 다른 파지 디스플레이 방법은 해당 분야에 공지되고 본 발명에 의해 고려된다. 유사하게, 세포 디스플레이 방법은 본 발명, 예를 들어, US5516637에서 설명된 바와 같은 박테리아 디스플레이 라이브러리; 예를 들어, US6423538에서 설명된 바와 같은 효모 디스플레이 라이브러리; 또는 포유류 디스플레이 라이브러리에 의해 고려된다.
디스플레이 라이브러리를 스크리닝하기 위한 방법은 해당 분야에 공지된다. 한 가지 예시에서, 본 발명의 디스플레이 라이브러리는 예를 들어, Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)에서 설명된 바와 같은 친화도 정제를 이용하여 스크리닝된다. 친화도 정제의 방법은 라이브러리에 의해 디스플레이되는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질을 표적 항원 (가령, CD83)과 접촉시키는 단계 그리고, 세척 후, 항원과 결합된 채로 남아있는 이들 도메인을 용리시키는 단계를 포함한다.
스크리닝에 의해 식별되는 임의의 가변 영역 또는 scFv는 요망되는 경우, 완전 항체로 쉽게 변형된다. 가변 영역 또는 scFv를 완전 항체로 변형하거나 재구성하기 위한 예시적인 방법은 예를 들어, Jones et al., J. Immunol. Methods 354: 85-90, 2010; 또는 Jostock et al., J. Immunol. Methods, 289: 65-80, 2004에서 설명된다. 대안으로, 또는 추가로 표준 클로닝 방법은 가령, Ausubel et al., (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987), 및/또는 (Sambrook et al., (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)에서 설명되는 바와 같이 이용된다.
한 가지 예시에서, 본 발명은 예를 들어, US6300064 및/또는 US5885793에서 설명된 바와 같은 디스플레이 라이브러리, 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 본 발명의 CD83 결합 단백질을 생성하거나 단리시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 발명자는 인간 CD83의 재조합 세포외 도메인에 대한 세 라운드의 선별로 인간 scFv 면역글로불린 유전자 라이브러리를 바이오패닝함으로써 scFv를 단리시켰다. 일단 단리되고 나면, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 클로닝되고 발현되고 그리고 해당 분야에 공지된 방법을 이용하여 예를 들어, IgG1 항체로서 선택적으로 재구성될 수 있다.
한 가지 예시에서, 본 발명은 CD83 결합 단백질을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(i) CD83 결합 단백질 제조물 또는 CD83의 세포외 도메인, 예를 들어, 재조합 CD83의 세포외 도메인과 결합하는 결합 단백질에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및
(ii) CD83의 세포외 도메인에 대한 바람직한 친화도를 갖는 CD83 결합 단백질을 단리시키는 단계.
한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질 제조물이 스크리닝된다. CD83 제조물은 CD83의 세포외 도메인과 반응하는 항체를 생성하기 위하여 예를 들어, CD83 항원으로 동물을 면역시킴으로써 만들어질 수 있다.
또 다른 예시에서, CD83 결합 단백질 라이브러리는 스크리닝된다. 라이브러리는 파지 라이브러리, 예를 들어, scFv 파지 라이브러리 또는 Fab 파지 라이브러리일 수 있다.
한 가지 예시에서, 방법은 표적 CD83 에피토프 또는 항원에 대해 결합 특이성의 범위를 갖는 결합 분자의 모집단을 그들 표면에 디스플레이하는 파지 입자의 모집단을 생성하는 단계를 포함한다. 이러한 파지 입자는 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한 파지미드 게놈을 포함한다. 이 핵산은 재조합 시스템에서 단리되고, 클로닝되고 그리고 발현되어 본 발명의 CD83 결합 단백질을 생성할 수 있다.
탈면역화 , 키메라 , 인간화, 유사인간화, 영장류화 , 인간 및 합성 CD83 결합 단백질
본 발명의 CD83 결합 단백질은 인간 항체로부터의 FR에 이식되거나 안으로 삽입된 비-인간 종 (가령, 생쥐 또는 랫트 또는 비-인간 영장류)의 항체로부터의 CDR을 포함하는 또는 한 가지 유형의 항체 (가령, 한 가지 유형의 인간 항체)로부터의 FR에 이식되거나 안으로 삽입된 또 다른 유형의 항체 (가령, 또 다른 유형의 인간 항체)로부터의 CDR을 포함하는 CDR 이식된 단백질일 수 있다. 이 용어는 예를 들어, 하나 이상의 CDR 이식된 가변 영역 그리고 예를 들어, 하나 이상의 인간 가변 영역, 키메라 가변 영역, 유사인간화 가변 영역, 또는 영장류화 가변 영역을 포함하는 합성 단백질을 아우른다.
본 발명의 CD83 결합 단백질은 인간화 단백질일 수 있다.
용어 "인간화 단백질"은 인간-유사 가변 영역을 포함한 단백질을 나타내는 것으로 이해될 것이고, 이때 상기 단백질은 비-인간 항체 (이러한 유형의 항체는 "CDR-이식된 항체"로도 또한 언급됨)로부터의 FR에 이식되거나 안으로 삽입된 인간 종 (가령, 생쥐 또는 랫트 또는 비-인간 영장류)의 항체로부터의 CDR을 포함한다. 인간화 단백질은 인간 단백질의 하나 이상의 잔기가 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형되고 및/또는 인간 단백질의 하나 이상의 FR 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체되는 단백질을 또한 포함한다. 인간화 단백질은 인간 항체에서 또는 비-인간 항체에서 발견되는 잔기를 또한 포함할 수 있다. 단백질의 임의의 추가적인 영역 (가령, Fc 영역)은 일반적으로 인간이다. 인간화는 예를 들어, US5225539, US6054297, US7566771, 또는 US5585089에서 설명된 바와 같이, 해당 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 용어 "인간화 단백질"은 예를 들어 US7732578에서 설명된 바와 같은, 슈퍼-인간화 단백질을 또한 아우른다. 이 용어는 예를 들어 하나 이상의 인간화 가변 영역 및 예를 들어 하나 이상의 인간 가변 영역, 키메라 가변 영역, 유사인간화 가변 영역 또는 영장류화 가변 영역을 포함하는 합성 단백질을 아우른다.
한 가지 예시에서, 인간화 CD83 결합 단백질은 본 명세서에서 개시된 경쇄 서열에서 27d 내지 34, 50 내지 55, 그리고 89 내지 96 사이; 그리고 본 명세서에서 개시된 중쇄 서열에서 31 내지 35b, 50 내지 58, 그리고 95 내지 101 사이의 영역을 포함한다 (카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링함). 이에 관련하여, Padlan et al., FASEB J., 9: 133-139, 1995는 이들 영역이 항원을 결합시키거나 접촉시킬 가능성이 가장 높은 것들이라는 증거를 제시한다.
본 발명의 CD83 결합 단백질은 인간 단백질일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 단백질"은 인간에서, 예를 들어, 인간 생식세포주 또는 체세포에서 발견되는 가변 항체 영역 및 선택적으로, 불변 항체 영역을 가진 단백질 또는 이러한 영역을 이용하여 생성되는 라이브러리로부터의 단백질을 나타낸다. 용어 "인간" 항체는 인간 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기, 예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 위치 지정 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이 (특히 적은 수의 단백질 잔기, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단백질 잔기에서의 돌연변이 또는 보존적 치환을 포함하는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 이들 "인간 항체"는 인간의 면역 반응의 결과로서 발생되어야 할 필요가 꼭 있는 것이 아니고, 이보다는 그들이 재조합 수단 (가령, 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝)을 이용하여 및/또는 인간 항체 불변 및/또는 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함한 형질전환 동물 (가령, 생쥐)에 의해 및/또는 (가령, US5565332에서 설명된 바와 같은) 안내된 선별법을 이용하여 발생될 수 있다. 이 용어는 또한, 이러한 항체의 친화도 성숙 형태를 아우른다. 본 발명의 목적을 위하여, 인간 단백질은 또한, 인간 항체로부터의 인간 FR의 공통 서열로부터의 서열을 포함한 FR 또는 FR을 포함한 단백질을 포함하는 것으로 간주될 것이고, 여기서 하나 이상의 CDR은 예를 들어, US6300064 및/또는 US6248516에서 설명되는 바와 같이, 무작위이거나 반무작위이다.
예시적인 인간 CD83 결합 단백질은 가변 영역의 다음 쌍을 포함하는 항체이다:
(i) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:5에서 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(ii) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:6에서 나타난 바와 같은 VL 서열;
(iii) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:7에서 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(iv) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:8에서 나타난 바와 같은 VL 서열; 또는
(v) 서열 번호:1에서 나타난 바와 같은 VH 서열 및 서열 번호:9에서 나타난 바와 같은 VL 서열.
한 가지 예시에서, VL 서열은 C-말단 리신 잔기가 결핍되어있다. 본 발명의 CD83 결합 단백질의 VL 서열의 C-말단 리신은 예를 들어, CD83 결합 단백질의 생성 또는 정제 동안, 또는 CD83 결합 단백질의 VL을 인코딩하는 핵산을 재조합으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 이에 따라, CD83 결합 단백질은 제거된 VL의 C-말단 리신 잔기를 가진 모집단, 제거된 VL의 C-말단 리신 잔기가 없는 모집단, 또는 C-말단 리신 잔기를 가진 및 상기 잔기가 없는 단백질의 혼합물을 가진 모집단을 포함할 수 있다. 몇몇 예시에서, 단백질 모집단은 2개의 VL을 가진 단백질을 추가로 포함하고 이때 C-말단 리신 잔기는 VL들 중 하나에서 제거된다. 유사하게, 단백질의 조성물은 VL C-말단 리신 잔기를 가진 또는 상기 잔기가 없는 단백질 모집단의 동일하거나 유사한 혼합물을 포함할 수 있다.
선택적으로, VH는 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1 중쇄 불변 영역에 연결된다. 한 가지 예시에서, 중쇄 불변 영역은 c-말단 리신 잔기가 결핍되어 있다.
선택적으로, VL은 경쇄 불변 영역에 연결된다.
본 발명의 CD83 결합 단백질은 유사인간화 단백질일 수 있다. 용어 "유사인간화 단백질"은 US20080095767에서 설명된 방법에 의해 제조된 단백질을 나타낸다. 유사인간화 CD83 결합 단백질은 항체의 가변 영역을 포함하며, 여기서 가변 영역은 뉴 월드(New World) 영장류 항체 가변 영역으로부터의 FR 및 비- 뉴 월드 영장류 항체 가변 영역으로부터의 CDR을 포함한다. 예를 들어, 유사인간화 CD83 결합 단백질은 항체의 가변 영역을 포함하며, 여기서 가변 영역은 뉴 월드 영장류 항체 가변 영역으로부터의 FR 및 생쥐 또는 랫트 항체로부터의 CDR을 포함한다. 한 가지 예시에서, 유사인간화 CD83 결합 단백질은 가변 영역 중 하나 또는 둘 모두가 유사인간화 CD83 결합 단백질이다. 또한, 이 용어는 예를 들어, 하나 이상의 유사인간화 가변 영역 및 예를 들어, 하나 이상의 인간 가변 영역 또는 인간화 가변 영역 또는 키메라 가변 영역을 포함한 합성의 단백질을 아우른다.
본 발명의 CD83 결합 단백질은 영장류화 단백질일 수 있다. "영장류화 단백질"은 비-인간 영장류 (가령, 사이노몰구스 마카크(cynomolgus macaque))의 면역화 후 발생된 항체로부터의 가변 영역(들)을 포함한다. 선택적으로, 비-인간 영장류 항체의 가변 영역은 영장류화 항체를 생성하기 위해 인간 불변 영역에 연결된다. 영장류화 항체를 생성하기 위한 예시적인 방법은 US6113898에서 설명된다. 또한, 이 용어는 예를 들어, 하나 이상의 영장류화 가변 영역 및 예를 들어, 하나 이상의 인간 가변 영역 또는 인간화 가변 영역 또는 키메라 가변 영역을 포함하는 합성 단백질을 아우른다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 키메라 단백질이다. 용어 "키메라 단백질"은 항원 결합 도메인이 특정한 종 (가령, 생쥐 또는 랫트와 같은 쥣과)로부터 나온 또는 특정한 항체 종류 또는 하위종류에 속하는 단백질을 나타내는 반면에, 나머지 단백질은 또 다른 종 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류)로부터 유래된 단백질로부터 나온 것이거나 또 다른 항체 종류 또는 하위종류에 속한다. 한 가지 예시에서, 키메라 단백질은 비-인간 항체 (가령, 쥣과 항체)로부터의 VH 및/또는 VL을 포함하는 키메라 항체이고 항체의 남아 있는 영역은 인간 항체로부터 나온 것이다. 이러한 키메라 단백질의 생성은 해당 분야에 공지되고, (가령, US6331415; US5807715; US4816567 및 US4816397에서 설명된 바와 같은) 표준 수단에 의해 성취될 수 있다. 또한, 이 용어는 예를 들어, 하나 이상의 키메라 가변 영역 및 가령, 하나 이상의 인간 가변 영역 또는 인간화 가변 영역 또는 키메라 가변 영역을 포함하는 합성 단백질을 아우른다.
본 발명은 예를 들어, WO2000/34317 및 US20070292416에서 설명되는 바와 같은 탈면역화 CD83 결합 단백질을 또한 고려한다. 탈-면역화 항체 및 단백질은 하나 이상의 에피토프, 예를 들어 제거된 (즉, 돌연변이된) B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 가지며 그렇게 함으로써 대상이 항체 또는 단백질에 대한 면역 반응을 높일 가능성을 감소시킨다. 예를 들어, 본 발명의 CD83-결합 단백질은 하나 이상의 B 또는 T 세포 에피토프를 식별하기 위해 분석되고 그리고 에피토프 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 돌연변이되어 그렇게 됨으로써 CD83 결합 단백질의 면역원성을 감소시킨다.
"합성" 단백질은 하나의 형태의 VH (가령, 인간) 및 또 다른 형태의 VL (가령, 인간화)을 포함한다는 점이 전술 개시로부터 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 것이다. 본 발명은 VH 및 VL의 형태의 모든 조합을 명확하게 포함한다.
항원 결합 도메인 을 포함하는 다른 CD83 결합 단백질
본 발명은 또한 다음과 같은, 항체의 가변 영역 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 다른 CD83 결합 단백질을 고려한다:
(i) 예를 들어, US6248516에서 설명된 바와 같은 항체의 VL 또는 VH 전체 또는 이의 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬인, 단일-도메인 항체);
(ii) 예를 들어, US5844094 및/또는 US2008152586에서 설명된 바와 같은 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디;
(iii) 예를 들어, US5260203에서 설명된 바와 같은 scFv;
(iv) 예를 들어, US5837821에서 설명된 바와 같은 미니바디;
(v) 예를 들어, US5731168에서 설명된 바와 같은 "키와 홀(key and hole)" 이중특이성 단백질;
(vi) 예를 들어, US4676980에서 설명된 바와 같은 헤테로접합 단백질;
(vii) 예를 들어, US4676980에서 설명된 바와 같은 화학적 가교제(cross-linker)를 이용하여 생성된 헤테로접합 단백질;
(viii) 예를 들어, Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225, 1992에서 설명된 바와 같은 Fab'-SH 단편; 또는
(ix) 예를 들어, EP19930302894에서 설명된 바와 같은 Fab3.
불변 도메인 융합
본 발명은 항체의 항원 결합 도메인 및 불변 영역 또는 Fc 또는 이의 도메인, 예를 들면, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함한 CD83 결합 단백질을 포함한다. 적합한 불변 영역 및/또는 도메인은 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확할 것이고 및/또는 이러한 폴리펩티드의 서열은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스로부터 쉽게 이용가능하다. Kabat et al.은 또한, 몇 가지 적합한 불변 영역/도메인의 설명을 제공한다.
불변 영역 및/또는 이의 도메인은 생물학적 활성, 가령 이합체화, (가령, FcRn와 결합함으로써) 연장된 혈청 반감기, 항체-의존 세포 세포독성 (ADCC), 보체 의존 세포독성 (CDC), 항체-의존 세포 식균작용 (ADCP)을 제공하는 데에 유용하다.
본 발명은 예를 들어, US7217797; US7217798; 또는 US20090041770 (증가된 반감기를 가짐) 또는 US7355008 (증가된 ADCC)에서 설명된 바와 같은 돌연변이 불변 영역 또는 도메인을 포함하는 CD83 결합 단백질을 또한 고려한다.
불변 영역 또는 Fc를 포함하는 본 발명의 CD83 결합 단백질의 중쇄 불변 영역의 C-말단 리신은 예를 들어, CD83 결합 단백질의 생성 또는 정제 동안에, 또는 CD83 결합 단백질의 중쇄를 인코딩하는 핵산을 재조합으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 이에 따라, CD83 결합 단백질은 제거된 중쇄 불변 영역의 모든 C-말단 리신 잔기를 가진 모집단, 제거된 중쇄 불변 영역의 C-말단 리신 잔기를 가지지 않은 모집단, 또는 중쇄 불변 영역 C-말단 리신 잔기를 가진 및 가지지 않은 단백질의 혼합물을 갖는 모집단을 포함할 수 있다. 몇몇 예시에서, 단백질 모집단은 중쇄 불변 영역 C-말단 리신 잔기가 중쇄 불변 영역들 중 하나에서 제거된 2개의 중쇄 불변 영역을 갖는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 단백질의 조성물은 중쇄 불변 영역 C-말단 리신 잔기를 가진 또는 가지지 않은 단백질 모집단의 동일하거나 유사한 혼합물을 포함할 수 있다.
효과기 기능을 증진시킴
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 효과기 기능 또는 증진된 효과기 기능을 유도할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "효과기 기능"은 세포의 살해를 야기하는 항체의 Fc 영역 (고유 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이 Fc 영역)과 결합하는 세포 또는 단백질에 의해 매개된 이들 생물학적 활성을 나타낸다. 항체에 의해 유도되는 효과기 기능의 예시는 다음을 포함한다: 보체 의존 세포독성 (CDC); 항체-의존-세포-매개 세포독성 (ADCC); 항체-의존-세포-식균작용 (ADCP); 및 B-세포 활성화.
"항체-의존-세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 결합된 항체의 Fc 영역을 인식하는 Fc 수용체를 가진 효과기 세포 (가령, 자연 살해 ("NK") 세포, 중성구 및 대식 세포)에 의해 항체 코팅된 표적 세포의 용균을 나타낸다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 시험관내 ADCC 어세이가 수행될 수 있다. 이러한 어세이에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 ("PBMC") 및 NK 세포를 포함한다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 효과기 기능, 가령 ADCC 및/또는 CDC를 유도할 수 있는 이러한 방식으로 세포의 표면 상에서 CD83과 결합한다.
예를 들어, CD83 결합 단백질은 효과기 기능, 가령 ADCC 및/또는 CDC를 유도하는 데에 충분한 시간 동안 세포의 표면 상에서 CD83과 결합된 채로 남아있다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 예를 들어, 변형된 Fc 영역에 의해 또는 면역 효과기 세포와 결합할 수 있는 영역을 포함함으로써 증진된 효과기 기능을 유도할 수 있다. 예를 들어, 효과기 기능의 수준은 인간 IgG1 또는 IgG3 Fc 영역에 의해 유도되는 수준과 비교하여 증가된다. 본 발명의 CD83 결합 단백질에 의해 유도되는 효과기 기능을 증진시키는 것은 예를 들어, 질환을 일으키는 세포, 가령, 예를 들면 염증 및/또는 자가면역 질환 또는 질병에서 비정상적인 또는 원치 않는 면역 반응을 조절하는 항원 제시 세포 (APC) (가령, 수지상 세포 (DC)) 및/또는 림프구 (가령, T 세포)를 살해하거나 고갈시킴으로써 증진된 치료 효과 또는 예방 효과를 야기할 수 있다. 한 가지 예시에서, 효과기 기능을 증진시키는 것은 예를 들어, 동종이계 세포를 자극하는 CD83+ 세포를 살해하거나 고갈시킴으로써, T 세포의 동종이계 세포 자극을 예방한다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질의 Fc 영역은 변형 없는 Fc 영역과 비교하여 유도될 수 있는 효과기 기능의 수준을 증가시키도록 변형된다. 이러한 변형은 아미노산 수준 및/또는 이차 구조 수준 및/또는 삼차 구조 수준에서 일어날 수 있고 및/또는 Fc 영역의 글리코실화에 대해 일어날 수 있다.
해당 분야의 통상의 기술자는 더 큰 효과기 기능이 다수의 방식 중 어느 하나에서 더 큰 효과 수준, 더욱 지속되는 효과 또는 더 빠른 효과 속도로서 명시될 수 있다는 점을 인식할 것이다.
한 가지 예시에서, Fc 영역은 증진된 효과기 기능을 유도하는 이의 능력을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 한 가지 예시에서, Fc 영역은 하나 이상의 FcγR, 가령 FcγRIII과 더 큰 친화도를 가지고 결합한다. 한 가지 예시에서, Fc 영역은 다음으로 구성된 군에서 선택된 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 카바트의 EU 지표에 따라 넘버링된, 230, 233, 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 272, 274, 275, 276, 278, 302, 318, 324, 325, 326, 328, 330, 332, 및 335. 한 가지 예시에서, Fc 영역은 카바트의 EU 지표에 따라 넘버링된, 다음 아미노산 치환 S239D/I332E를 포함한다. 이 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교하여 FcγRIII에 대한 친화도가 약 14배 증가하고 야생형 Fc 영역과 비교하여 ADCC를 유도하는 능력이 약 3.3배 증가한다. 한 가지 예시에서, Fc 영역은 카바트의 EU 지표에 따라 넘버링된, 다음 아미노산 치환 S239D/A330L/I332E를 포함한다. 이 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교하여 FcγRIII에 대한 친화도가 약 138배 증가하고 야생형 Fc 영역과 비교하여 ADCC를 유도하는 능력이 약 323배 증가한다.
효과기 기능을 유도하는 Fc 영역의 능력을 증가시키는 추가적인 아미노산 치환은 해당 분야에 공지되고 및/또는 예를 들어, US6737056 또는 US7317091에서 설명된다.
한 가지 예시에서, Fc 영역의 글리코실화는 증진된 효과기 기능을 유도하는 이의 능력을 증가시키도록 변경된다. 이에 관련하여, 포유류 세포에 의해 생성되는 고유 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드를 전형적으로 포함한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산, 그리고 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "스템(stem)"내 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 몇몇 예시에서, 본 발명에 따른 Fc 영역은 Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 결핍된 탄수화물 구조를 포함하고, 즉 Fc 영역은 "탈푸코실화" 또는 "비푸코실화"된다. 이러한 변이체는 ADCC를 유도하는 개선된 능력을 가질 수 있다. 탈푸코실화된 항체를 생성하기 위한 방법은 α-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 (FUT8)를 발현시킬 수 없는 세포주에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계 (가령 Yumane-Ohnuki et al., Biotechnol. Bioengineer. 87: 614-622, 2004에서 설명된 바와 같음), FUT8에 대하여 작은 간섭 RNA를 발현하는 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계 (가령, Mori et al., Biotechnol. Bioengineer., 88: 901-908, 2004에서 설명된 바와 같음), 구아노신 디포스페이트 (GDP)-만노오스 4,6-디하이드라타아제 (GMD)를 발현할 수 없는 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계 (가령, Kanda et al., J. Biotechnol., 130: 300-310, 2007에서 설명된 바와 같음)를 포함한다. 본 발명은 예를 들어, β-(l,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III (GnT-III)를 발현시키도록 변경된 세포주를 이용하여 생성된, 감소된 푸코실화 수준을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 또한 고려한다 (가령, Umana et al., Nat. Biotechnol. 17: 176-180, 1999에서 설명된 바와 같음).
한 가지 예시에서, 본 발명에 따른 항체는 탈푸코실화된다. 예를 들어, 항체는 FUT8을 발현하지 않는 세포 (가령, 포유류 세포, 가령 CHO 세포)에서 생성되고 또는 키푸네신과 같은 N-글리칸 가공처리의 저해제로 처리된다.
다른 방법은 증진된 Fc-매개된 효과기 기능을 유도할 수 있는 항체를 선천적으로 생성하는 세포주의 용도를 포함한다 (가령, 바이러스 백신의 생산을 위한 오리 배아 유래 줄기 세포, US20100062489; 조류 EBX® 세포에서 재조합 단백질 생성, US20100226912).
본 발명의 CD83 결합 단백질은 바이안테너리 올리고사카라이드를 가진 것들을 또한 포함하며, 예를 들어, 여기서 Fc 영역에 부착되는 바이안테너리 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 양분된다. 이러한 면역글로불린은 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 예시는 예를 들어, US6602684 및 US20050123546에서 설명된다.
Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에서 적어도 하나의 갈락토오스 잔기를 가진 CD83 결합 단백질이 또한 고려된다. 이러한 면역글로불린은 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 면역글로불린은 예를 들어, WO1997/30087 및 WO1999/22764에서 설명된다.
CD83 결합 단백질은 또한, 증진된 수준의 CDC를 유도할 수 있는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, IgG1 및 IgG3의 혼성체는 증진된 CDC 활성을 갖는 항체를 생성한다 (Natsume et al., Cancer Res. 68: 3863-3872, 2008).
또한 또는 대안으로, CD83 결합 단백질은 예를 들어, CD3 또는 CD16과 결합함으로써, 면역 효과기 세포와 결합하는 단백질 (가령, 항체 가변 영역)에 융합되거나 접합될 수 있다.
효과기 기능을 결정하기 위한 방법은 해당 분야에 공지된다. 한 가지 예시에서, ADCC 활성의 수준은 51Cr 방출 어세이, 유로퓸 방출 어세이 또는 35S 방출 어세이 를 이용하여 평가된다. 이들 어세이 각각에서, CD83을 발현하는 세포는 세포에 의해 흡수되도록 화합물에 충분한 시간 동안 그리고 조건 하에 열거된 화합물들 중 하나 이상과 함께 배양된다. 35S 방출 어세이의 경우에, 세포는 새롭게 합성되는 단백질 내로 편입되도록 표지된 아미노산에 충분한 시간 동안 S-표지된 메티오닌 및/또는 시스테인과 함께 배양될 수 있다. 이후 세포는 단백질의 존재 또는 부재에서 그리고 효과기 세포, 예를 들면, PBMC 및/또는 NK 세포의 존재에서 배양된다. 이후 세포 배양 배지내 51Cr, 유로퓸 및/또는 35S의 양이 검출되고, 그리고 면역글로불린의 부재에서와 비교하여 단백질의 존재에서 증가는 결합 분자/작용제가 효과기 기능을 갖는다는 점을 명시한다. 면역글로불린에 의해 유도된 ADCC의 수준을 평가하기 위한 어세이를 개시하는 예시적인 간행물은 Hellstrom et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83: 7059-7063, 1986 및 Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361, 1987을 포함한다.
면역글로불린에 의해 유도되는 ADCC의 수준을 평가하기 위한 다른 어세이는 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비방사성 세포독성 어세이 (CellTechnology, Inc. CA, USA) 또는 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 어세이 (Promega, WI, USA)를 포함한다.
대안으로, 또는 추가로, CD83 결합 단백질의 효과기 기능은 예를 들어, US7317091에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 FcγR에 대한 이의 친화도를 결정함으로써 평가된다.
C1q 결합 어세이는 또한, CD83 결합 단백질이 C1q를 결합시킬 수 있고 그리고 CDC를 유도할 수 있다는 점을 확인하기 위하여 수행될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 어세이가 수행될 수 있다 (가령, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163, 1996을 참고).
또 다른 예시에서, CD83 결합 단백질은 단백질의 반감기를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, CD83 결합 단백질은 신생아 Fc 영역 (FcRn)에 대한 불변 영역의 친화도를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 불변 영역은 엔도좀에서 Fc/FcRn 결합을 촉진시키기 위해 더 낮은 pH, 예를 들어, 약 pH 6.0에서 FcRn에 대한 증가된 친화도를 갖는다. 한 가지 예시에서, 불변 영역은 약 pH 6에서 FcRn에 대한 친화도가 약 pH 7.4에서 이의 친화도와 비교하여 증가하였고, 이는 세포 재이용 후 혈액 내로 Fc의 재-방출을 촉진한다. 이들 아미노산 치환은 혈액으로부터 클리어런스(clearance)를 감소시킴으로써, CD83 결합 단백질의 반감기를 연장시키기는 데에 유용하다.
예시적인 아미노산 치환은 EU 넘버링 시스템에 따라 T250Q 및/또는 M428L 또는 T252A, T254S 및 T266F 또는 M252Y, S254T 및 T256E 또는 H433K 및 N434F를 포함한다. 추가적인 또는 대안적인 아미노산 치환은 예를 들어, US20070135620 또는 US7083784에서 설명된다.
돌연변이 CD83 결합 단백질
본 발명은 또한 본 명세서에서 개시된 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 인코딩하는 CD83 결합 단백질 또는 핵산을 제공한다. 한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질 또는 핵산은 본 명세서에서 개시된 서열과 적어도 약 80% 또는 81% 또는 82% 또는 83% 또는 84% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
대안으로, 또는 추가로, CD83 결합 단백질은 임의의 예시에 따라 본 명세서에서 설명된 바와 같은 VH 또는 VL의 CDR(들)과 적어도 약 30% 또는 35% 또는 40% 또는 45% 또는 50% 또는 55% 또는 60% 또는 65% 또는 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 CDR (가령, 세가지 CDR)을 포함하고, 여기서 단백질은 CD83과 특이적으로 결합할 수 있다. 이에 관련하여, 발명자는 항체의 CDR 내에서 다양한 서열을 갖는 수많은 항체를 생산시켰다. 단백질 CD83의 결합을 결정하기 위한 방법은 본 명세서에서 설명된다.
예를 들어, 발명자는 그들의 경쇄 CDR1에서 적어도 약 60% 동일성을 공유하는, 예를 들어, 카바트 넘버링 시스템에 따라 그들의 경쇄 CDR1에서 적어도 약 65% 또는 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일성을 갖는 CD83 결합 단백질의 군을 식별하였다.
발명자는 또한, 그들의 경쇄 CDR2에서 70% 동일성을 공유하는, 예를 들어, 카바트 넘버링 시스템에 따라 그들의 경쇄 CDR2에서 적어도 약 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일성을 갖는 CD83 결합 단백질의 군을 식별하였다.
발명자는 또한, 그들의 경쇄 CDR3에서 30% 동일성을 공유하는, 예를 들어, 카바트 넘버링 시스템에 따라 그들의 경쇄 CDR3에서 적어도 약 35% 또는 40% 또는 45% 또는 50% 또는 55% 또는 60% 또는 65% 또는 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일성을 갖는 CD83 결합 단백질의 군을 식별하였다.
본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 경쇄 CDR1의 네 가지 N-말단 아미노산은 삭제될 수 있고 또는 이들 아미노산 중 임의의 하나 이상은 또 다른 자연-발생 아미노산으로 치환될 수 있다 (Padlan et al., FASEB J., 9: 133-139, 1995). 따라서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 본 명세서에서 개시된 경쇄 CDR1 서열과 적어도 약 70% 동일성을 갖는 CDR1을 포함할 수 있다.
또 다른 예시에서, 본 발명의 핵산은 본 명세서에서 개시된 서열과 적어도 약 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하고 그리고 CD83과 특이적으로 결합할 수 있는 CD83 결합 단백질을 인코딩한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 CD83 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 이는 유전자 코드의 축퇴의 결과로서 본 명세서에서 예시화된 서열과 다르다.
핵산 또는 폴리펩티드의 동일성 %는 갭 형성 패널티=5, 그리고 갭 연장 패널티=0.3을 가진 GAP (Needleman and Wunsch. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970) 분석 (GCG 프로그램)에 의해 결정된다. 쿼리 서열(query sequence)은 길이가 적어도 50개 잔기이고, 그리고 GAP 분석은 적어도 50개 잔기의 영역에 걸쳐 2개의 서열을 정렬시킨다. 예를 들어, 쿼리 서열은 길이가 적어도 100개 잔기이고 그리고 GAP 분석은 적어도 100개 잔기의 영역에 걸쳐 2개의 서열을 정렬시킨다. 예를 들어, 2개의 서열은 그들의 전체 길이에 걸쳐 정렬된다.
상기 논의되는 바와 같이, 본 발명은 또한, 본 명세서에서 설명된 CD83 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, 항체 3C12, 3C12.B, 3C12.C, 3C12.D, 또는 3C12.E의 VH 또는 VL을 인코딩하는 핵산에 대한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화되는 핵산을 고려한다. "중간 엄격성"은 2 x SSC 완충액, 0.1% (w/v) SDS에서 45℃ 내지 65℃ 범위의 온도에서, 또는 동등한 조건에서 수행되는 혼성화 및/또는 세척이 이루어지는 것으로서 본 명세서에서 정의된다. "높은 엄격성"은 0.1 x SSC 완충액, 0.1% (w/v) SDS, 또는 더 낮은 염 농도에서, 그리고 적어도 65℃의 온도에서, 또는 동등한 조건에서 수행되는 혼성화 및/또는 세척이 이루어지는 것으로서 본 명세서에서 정의된다. 특정한 수준의 엄격성에 대한 본 명세서내 참조는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 SSC 외에도 세척/혼성화 방법을 이용하는 동등한 조건을 포함한다. 예를 들어, 이중 가닥 핵산의 가닥이 해리될 온도 (용융 온도, 또는 Tm으로도 공지됨)를 계산하기 위한 방법이 해당 분야에 공지된다. 핵산의 Tm와 유사한 (가령, 5℃ 내에서 또는 10℃ 내에서) 또는 동일한 온도는 높은 엄격성이 되는 것으로 간주된다. 중간 엄격성은 10℃ 내지 20℃ 또는 10℃ 내지 15℃의 핵산의 계산된 Tm 내에서 이루어지는 것으로 간주되어야 한다.
본 발명은 또한, 본 명세서에서 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 CD83 결합 단백질의 돌연변이 형태를 고려한다. 몇몇 예시에서, CD83 결합 단백질은 10개 이하, 예를 들어, 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 유사한 곁사슬 및/또는 소수성 및/또는 친수성을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다.
염기성 곁사슬 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 곁사슬 (가령, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 곁사슬 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 곁사슬 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 0-분지형 곁사슬 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 곁사슬 (가령, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 비롯한, 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 해당 분야에서 정의되었다. 소수성 지표는 예를 들어, Kyte and Doolittle J. Mol. Biol., 157: 105-132, 1982에서 설명되고 그리고 친수성 지표는 예를 들어, US4554101에서 설명된다.
본 발명은 또한, 비-보존적 아미노산 변화를 고려한다. 예를 들어, 특정한 관심은 전하된 아미노산이 또 다른 전하된 아미노산으로 또는 중성 또는 양성으로 전하된 아미노산으로 치환하는 것이다. 몇몇 예시에서, CD83 결합 단백질은 10개 이하, 예를 들어, 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1개의 비-보존적 아미노산 치환을 포함한다.
한 가지 예시에서, 돌연변이(들)는 본 발명의 CD83 결합 단백질의 항원 결합 도메인의 FR 내에서 일어난다. 또 다른 예시에서, 돌연변이(들)는 본 발명의 CD83 결합 단백질의 CDR 내에서 일어난다.
CD83 결합 단백질의 돌연변이 형태를 생성하기 위한 예시적인 방법은 다음을 포함한다:
● DNA (Thie et al., Methods Mol. Biol. 525: 309-322, 2009) 또는 RNA (Kopsidas et al., Immunol. Lett. 107:163-168, 2006; Kopsidas et al. BMC Biotechnology, 7: 18, 2007; 및 WO1999/058661)의 돌연변이 유발;
● 돌연변이 유발 세포, 예를 들어, XL-1Red, XL-mutS 및 XL-mutS-Kanr 박테리아 세포 (Stratagene) 내로 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 도입;
● 예를 들어, Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994에서 개시된 바와 같은 DNA 셔플링; 그리고
● 예를 들어, Dieffenbach (ed) and Dveksler (ed) (In: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995)에서 설명된 바와 같은 위치 지정 돌연변이.
본 발명의 돌연변이 CD83 결합 단백질의 생물학적 활성을 결정하기 위한 예를 들어, 항원 결합을 위한 예시적인 방법은 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확할 것이고 및/또는 본 명세서에서 설명될 것이다. 예를 들어, 항원 결합, 결합의 경쟁적 저해, 친화도, 회합, 해리 및 치료학적 효능을 결정하기 위한 방법이 본 명세서에서 설명된다.
예시적인 CD83 결합 단백질
발명자에 의해 생성되는 CD83 결합 단백질 및 그들의 인코딩 핵산을 함유한 예시적인 가변 영역이 표 1과 2에서 설명된다.
Figure 112015084258850-pct00003
Figure 112015084258850-pct00004
단백질을 생성하기 위한 방법
재조합 발현
본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 본 발명의 CD83 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 이의 하나 이상의 폴리펩티드는 발현 구조체 내로 도입되고, 따라서 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그렇게 됨으로써 이의 발현을 촉진시킨다. 발현 구조체를 생성하기 위한, 예를 들어 발현 구조체/벡터 내로 클로닝하기 위한 방법은 해당 분야에 공지되고 및/또는 Ausubel et al, (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987), 및 (Sambrook et al., (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001) 및 US7270969에서 설명된다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 박테리아 세포에서 발현된다. 예를 들어 에스케리치아 콜리(E. coli), 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 코리네박테리움(Corynebacterium sp .), 살모넬라 속(Salmonella sp .), 바실루스 속(Bacillus sp .), 및 슈도모나스 속(Pseudomonas sp .)을 포함한 군에서 선택된 박테리아 세포와 같은 박테리아 세포에서 발현에 적합한 전형적인 프로모터는 lacz, Ipp, 온도-민감성 L 또는 R 프로모터, T7, T3, SP6과 같은 프로모터 또는 IPTG-유도성 tac 프로모터 또는 lacUV5 프로모터와 같은 반-인공 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 예시에서, CD83 결합 단백질은 효모 세포에서 발현된다. 효모 세포, 가령 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 및 스키조사카로마이세스 폼베(S. pombe)에서의 발현에 적합한 전형적인 프로모터는 다음 유전자, ADH1, GAL1, GAL4, CUP1, PHO5, nmt, RPR1, 또는 TEF1로부터의 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가적인 예시에서, CD83 결합 단백질은 곤충 세포에서 발현된다. 곤충 세포에서 또는 곤충에서의 발현에 적합한 전형적인 프로모터는 OPEI2 프로모터, 봄빅스 뮤리(Bombyx muri)로부터 단리된 곤충 액틴 프로모터, 드로소필라 속(Drosophila sp.) dsh 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (Marsh et al., Hum. Mol. Genet. 9:, 13-25, 2000).
본 발명의 CD83 결합 단백질은 식물 세포에서도 또한 발현될 수 있다. 식물 세포내 펩티드를 발현시키기 위한 프로모터는 해당 분야에 공지되고, 그리고 호르데움 불가레 아밀라제(Hordeum vulgare amylase) 유전자 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 노팔린(nopaline) 합성효소 (NOS) 유전자 프로모터, 및 옥신 유도성 식물 프로모터 P1 및 P2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 포유류 세포에서 또는 포유류에서 발현된다. 포유류 세포에서의 발현에 적합한 전형적인 프로모터는 예를 들어, 레트로바이러스 LTR 요소, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, CMV IE (사이토메갈로바이러스 즉시 초기) 프로모터, (인간 신장 인자 1로부터의) EF1 프로모터, EM7 프로모터, (인간 유비퀴틴 C로부터의) UbC 프로모터로 구성된 군에서 선택된 프로모터를 포함한다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예시는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7); 인간 배아 신장 라인 (HEK-293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 중국 햄스터 난소 세포 (CHO); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 또는 골수종 세포 (가령, NS/0 세포)를 포함한다.
본 발명의 CD83 결합 단백질을 발현하기 위해 이용되는 예시적인 세포는 CHO 세포, 골수종 세포 또는 HEK 세포이다. 세포는 변형된 항체의 발현을 촉진하는 하나 이상의 유전자 돌연변이 및/또는 삭제를 추가로 포함할 수 있다. 한 가지 비-제한 예시는 발현되는 면역글로불린 또는 항체의 푸코실화를 위해 요구되는 효소를 인코딩하는 유전자의 삭제이다. 예를 들어, 삭제된 유전자는 FUT8을 인코딩한다. FUT8-삭제된 CHO 세포의 상업적으로 이용가능한 공급원은 Biowa (PotelligentTM 세포)이다. 예를 들어, 탈푸코실화된 면역글로불린 또는 항체의 발현을 위해 이용되는 세포는 FUT8-삭제된 CHO 세포, 가령 Biowa의 PotelligentTM 세포이다.
발현 구조체/벡터의 다른 요소는 해당 분야에 공지되고 그리고 예를 들어, 인핸서, 전사 종결자, 폴리아데닐화 서열, 선별 가능하거나 검출 가능한 마커를 인코딩하는 핵산 및 복제 개시점을 포함한다.
한 가지 예시에서, 발현 구조체는 바이시스트로닉(bicistronic) 발현 구조체이다. "바이시스트로닉"에 의하면, 단일 핵산 분자가 핵산의 상이한 영역으로부터의 두 가지 별개의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 단일 핵산, 예를 들어, 별개의 폴리펩티드로서 VH 함유 폴리펩티드 및 VL 함유 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 단일 핵산을 의미한다. 일반적으로, 각각의 별개의 폴리펩티드를 인코딩하는 영역은 내부 리보좀 유입점 (IRES)에 의해 분리되고 IRES의 영역 5'은 전사 종결 서열을 포함하지 않는다. 예시적인 IRES는 예를 들어, US20090247455에서 설명된다.
적합한 발현 구조체의 생성 후, 구조체는 해당 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 적합한 세포 내로 도입된다. 예시적인 방법은 미량주사법, DEAE-덱스트란에 의해 매개된 형질감염, 리포펙타민 (Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴 (Gibco, MD, USA)을 이용하는 것에 의한 것과 같은 리포좀에 의해 매개된 형질감염, PEG-매개된 DNA 흡수, 전기천공법 그리고 DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 입자 (Agracetus Inc., WI, USA)를 이용하는 것에 의한 것과 같은 미세입자 충격법 등을 포함한다.
본 발명의 CD83 결합 단백질을 생성하는 데에 이용되는 세포는 이후, 본 발명의 CD83 결합 단백질을 생성하기 위해 해당 분야에 공지된 조건 하에 배양된다.
무세포 발현 시스템, 예를 들어 TNT T7 및 TNT T3 시스템 (Promega), pEXPl-DEST 및 pEXP2- DEST 벡터 (Invitrogen)이 또한, 본 발명에 의해 고려된다.
단백질 정제
생성/발현 후, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 해당 분야에 공지된 방법을 이용하여 정제된다. 이러한 정제는 비특이적 단백질, 산, 지질, 탄수화물 등이 실질적으로 없는 본 발명의 단백질을 제공한다. 한 가지 예시에서, 단백질은 제조물 안에 있을 것이고, 여기서 제조물내 약 90% 초과 (가령, 95%, 98% 또는 99%)의 단백질은 본 발명의 CD83 결합 단백질이다.
다양한 고-압 (또는 성능) 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 비-HPLC 폴리펩티드 단리 프로토콜, 가령 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합-모드 크로마토그래피, 상 분리법, 전기영동 분리, 침전법, 염용/염석법, 면역크로마토그래피, 및/또는 다른 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 펩티드 정제의 표준 방법이 본 발명의 단리된 CD83 결합 단백질을 얻기 위해 이용된다.
한 가지 예시에서, 친화도 정제는 표지를 포함한 융합 단백질을 단리시키는 데에 유용하다. 친화 크로마토그래피를 이용하여 단백질을 단리시키기 위한 방법은 해당 분야에 공지되고 예를 들어, Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)에서 설명된다. 예를 들어, 표지 (폴리히스티딘 태그의 경우에 이것은 예를 들어, 니켈-NTA일 수 있음)와 결합하는 항체 또는 화합물은 고형 지지체 상에 고정된다. 이후, 단백질을 포함하는 샘플은 결합이 일어나는 데에 충분한 시간 동안 그리고 조건 하에 고정된 항체 또는 화합물에 접촉된다. 임의의 결합되지 않은 또는 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거하기 위해 세척을 한 후, 단백질은 용리된다.
항체의 Fc 영역을 포함하는 CD83 결합 단백질의 경우에, 단백질 A 또는 단백질 G 또는 이의 변형된 형태가 친화도 정제를 위해 이용될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄 Fc 영역을 포함한 정제된 단백질을 단리시키는 데에 유용하다. 단백질 G는 모든 생쥐 Fc 동종형 및 인간 γ3에 권장된다.
접합체
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 화합물에 접합된다. 예를 들어, 화합물은 방사성 동위원소, 검출 가능한 표지, 치료학적 화합물, 콜로이드, 독소, 핵산, 펩티드, 단백질, 대상에서 CD83 결합 단백질의 반감기를 증가시키는 화합물 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된다.
화합물은 CD83 결합 단백질과 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다 (가령, 간접적인 결합의 경우에 링커를 포함할 수 있다). 화합물의 예시는 방사성 동위원소 (가령, 아이오딘-131, 이트륨-90 또는 인듐-111), 검출 가능한 표지 (가령, 형광단 또는 형광 나노크리스탈), 치료학적 화합물 (가령, 화학요법 화합물 또는 항-염증성 화합물), 콜로이드 (가령, 금), 독소 (가령, 리신 또는 파상풍 톡소이드), 핵산, 펩티드 (가령, 혈청 알부민 결합 펩티드), 단백질 (가령, 항체 또는 혈청 알부민의 항원 결합 도메인을 포함한 단백질), 대상에서 CD83 결합 단백질의 반감기를 증가시키는 화합물 (가령, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이 활성을 가진 폴리머를 용해시키는 다른 물) 및 이의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 CD83 결합 단백질에 접합될 수 있는 예시적인 화합물 및 이러한 접합을 위한 방법이 해당 분야에 공지되고 예를 들어, US2010221262에서 설명된다.
본 발명의 CD83 결합 단백질에 접합될 수 있는 몇몇 예시적인 화합물은 표 3에서 열거된다.
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스크리닝 어세이
본 발명의 CD83 결합 단백질은 예를 들어, 하기 설명된 바와 같은 생물학적 활성을 위해 쉽게 스크리닝된다.
결합 어세이
한 가지 형태의 어세이는 예를 들어, Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)에서 설명딘 바와 같은 항원 결합 어세이이다. 이러한 방법은 일반적으로, CD83 결합 단백질을 표지하는 단계 그리고 상기 단백질을 고정된 항원과 접촉시키는 단계를 포함한다. 비-특이적 결합 단백질을 제거하기 위해 세척한 후, 표지의 양 그리고 결과로서, 결합된 단백질이 검출된다. 물론, CD83 결합 단백질은 고정될 수 있고, 항원은 표지될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 설명되거나 예시화된 바와 같은 패닝(panning)-유형 어세이가 또한 이용될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 표면 플라스몬 공명 어세이가 이용될 수 있다.
한 가지 예시에서, 결합 어세이는 CD83의 에피토프를 포함한 펩티드로 수행된다. 이 방식으로, CD83의 특이적인 영역과 결합하는 CD83 결합 단백질이 선별된다.
시험관내 어세이
본 발명의 CD83 결합 단백질은 또한, 동물 모델의 조건, 예를 들어 CD83 매개 조건에서 치료학적 효능에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, CD83 결합 단백질은 염증성 장 질환 또는 대장염 (가령, 덱스트란 황산 나트륨 (DSS)-유도된 대장염 또는 CD45Rb 양자 전이 모델의 대장염의 모델에게 투여된다 (가령, Kanai et al., Inflamm. Bowel Dis. 12: 89-99, 2006). 또 다른 예시에서, CD83 결합 단백질은 다발성 경화증의 모델, 예를 들어, 생쥐 또는 랫트가 수초 단백질 또는 이로부터 파생된 펩티드 (가령, MOG, MBP 또는 PLP)로 면역화된 EAE 모델에게 투여되고 그리고 면역 반응이 단백질에 대하여 발생되어 그렇게 됨으로써 다발성 경화증의 모델을 유발시킨다. 예시적인 EAE 모델은 예를 들어, Tsunoda and Fujinami, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55: 673-686, 1996에서 검토된다. CD83 결합 단백질은 또한 또는 대안으로, 관절염의 모델에서, 예를 들어, 생쥐의 SKG 계통 (Sakaguchi et al., Nature 426: 454-460, 1995), 랫트 유형 II 콜라겐 관절염 모델, 생쥐 유형 II 콜라겐 관절염 모델 또는 항원 유도된 관절염 모델 (Bendele J. Musculoskel. Neuron. Interact. 1: 377-385, 2001) 및/또는 염증성 기도 질환의 모델 (예를 들어, OVA 공격 또는 바퀴벌레 항원 공격)에서 검사될 수 있다.
본 발명의 CD83 결합 단백질의 치료 효능은 또한 또는 대안으로, 예를 들어, 한 마리 동물로부터의 지라세포가 동종이계 동물 (가령, MHC 또는 HLA 부정합 동물) 내로 주사되는, 이식편-대-숙주-반응의 모델에서 평가될 수 있다. 한 가지 예시에서, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 인간 DC를 필요로 하는 치명적인 인간 CD4+ T 세포 매개된 이식편 대 숙주 반응을 유도하는 거의 치사량에 가까운 전신 방사선 조사 후 예를 들어, 복강내 주사를 통해 이종 SCID 생쥐 모델 내로 이식된다. 본 발명의 CD83 결합 단백질로의 처리는 예를 들어, PBMC 이식일 (제0일)에 복강내 주사에 의해 생쥐에게 투여될 수 있고 생쥐는 GVDH의 임상적 징후를 나타냈다.
경쟁적 결합 어세이
본 발명의 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 CD83 결합 단백질을 결정하기 위한 어세이는 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출가능한 표지, 예를 들어, 형광 표지 또는 방사성 표지에 접합된다. 표지된 항체 및 검사 CD83 결합 단백질은 이후, 혼합되고 CD83 또는 이의 에피토프를 포함한 펩티드와 접촉된다. 이후 표지된 항체의 수준이 결정되고 그리고 표지된 항체가 CD83 결합 단백질의 부재에서 CD83 또는 이의 에피토프를 포함한 펩티드와 접촉될 때 결정된 수준과 비교된다. 표지된 항체의 수준이 CD83 결합 단백질의 부재와 비교하여 CD83 결합 단백질의 존재에서 감소된다면, CD83 결합 단백질은 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다.
선택적으로, CD83 결합 단백질은 항체와는 다른 표지에 접합된다. 이것은 CD83 및 에피토프 함유 펩티드와 CD83 결합 단백질의 결합 수준의 검출을 허용한다.
또 다른 예시에서, CD83 결합 단백질은 CD83 또는 펩티드를 본 명세서에서 설명된 항체와 접촉시키기에 앞서 CD83 및 이의 에피토프를 포함한 펩티드와 결합되는 것이 허용된다. CD83 결합 단백질의 부재에서와 비교하여 CD83 결합 단백질의 존재에서 결합된 항체의 양의 감소는 CD83 결합 단백질이 CD83과 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다는 점을 명시한다. 상호간 어세이는 또한, 표지된 CD83 결합 단백질을 이용하여 그리고 우선, 항체가 CD83 및 펩티드와 결합하도록 하여 수행될 수 있다. 이 경우에, 항체의 부재에서와 비교하여 항체의 존재에서 CD83 또는 펩티드와 결합된 표지된 CD83 결합 단백질의 감소된 양은 CD83 결합 단백질이 CD83과 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다는 점을 명시한다.
에피토프 맵핑 어세이
또 다른 예시에서, 본 명세서에서 설명된 단백질에 의해 결합된 에피토프가 맵핑된다. 에피토프 맵핑 방법은 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 것이다. 예를 들어, CD83 서열 또는 관심 에피토프를 포함한 이의 영역을 스패닝하는 일련의 중첩 펩티드, 예를 들어 10 내지 15개의 아미노산을 포함한 펩티드가 생성된다. 이후, CD83 결합 단백질은 각각의 펩티드 또는 이의 조합에 접촉되고 그리고 이에 결합하는 펩티드(들)가 결정된다. 이것은 CD83 결합 단백질이 결합하는 에피토프를 포함한 펩티드(들)의 결정을 허용한다. 다수의 비-근접 펩티드가 단백질에 의해 결합된다면, 단백질은 입체형태 에피토프를 결합시킬 수 있다.
대안으로, 또는 추가로, CD83 내에서 아미노산 잔기는 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의해 돌연변이가 되고, 그리고 단백질 결합을 감소시키거나 방지하는 돌연변이가 결정된다. CD83 결합 단백질의 결합을 감소시키거나 방지하는 임의의 돌연변이는 단백질에 의해 결합되는 에피토프 내에 있을 가능성이 있다.
추가적인 방법은 본 발명의 고정된 CD83 결합 단백질과 CD83 또는 이의 영역을 결합시키는 단계 그리고 결과적인 복합체를 프로테아제로 분해시키는 단계를 포함한다. 이후, 고정된 단백질과 결합된 채로 남아있는 펩티드는 예를 들어, 질량 분석법을 이용하여, 단리되고 분석되어 그들의 서열이 결정된다.
추가적인 방법은 CD83 또는 이의 영역내 수소를 듀테륨 원자로 전환시키는 단계 및 본 발명의 고정된 CD83 결합 단백질과 결과적 단백질을 결합시키는 단계를 포함한다. 듀테륨 원자는 이후, 수소로 다시 전환되고, CD83 또는 이의 영역은 단리되고 효소로 분해되고 그리고 예를 들어, 질량 분석법을 이용하여 분석되어, 본 명세서에서 설명된 CD83 결합 단백질의 결합에 의해 수소로 전환되는 것으로부터 보호되었던, 듀테륨을 포함한 이들 영역을 식별한다.
반감기 어세이
본 발명에 포함된 몇몇 CD83 결합 단백질은 개선된 반감기를 갖는다, 예를 들면, 변형되어 변형되지 않은 CD83 결합 단백질과 비교하여 그들의 반감기가 연장된다. 개선된 반감기를 가진 CD83 결합 단백질을 결정하기 위한 방법은 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 것이다. 예를 들어, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와 결합시키는 CD83 결합 단백질의 능력이 평가된다. 이에 관련하여, FcRn에 대한 증가된 결합 친화도는 CD83 결합 단백질의 혈청 반감기를 증가시켰다 (예를 들어, Kim et al., Eur. J. Immunol., 24: 2429, 1994를 참고).
또한, 본 발명의 CD83 결합 단백질의 반감기는 예를 들어, Kim et al, Eur. J. of Immunol. 24: 542, 1994에서 설명된 방법에 따라, 약동학 연구에 의해 측정될 수 있다. 이 방법에 따르면, 방사성표지된 CD83 결합 단백질은 생쥐의 정맥 내로 주사되고 그리고 이의 혈장 농도는 시간의 함수로서, 예를 들면 주사 후 3분 내지 72 시간에 주기적으로 측정된다. 따라서 얻은 클리어런스 곡선은 이상(biphasic), 즉 알파상 및 베타상이어야 한다. CD83 결합 단백질의 생체내 반감기의 결정을 위하여, 베타-상에서 클리어런스 율이 계산되고 그리고 야생형 또는 변형되지 않은 CD83 결합 단백질의 것과 비교된다.
안정도 어세이
본 발명의 CD83 결합 단백질의 안정도는 임의의 다양한 어세이에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, CD83 결합 단백질은 조건, 예를 들어, 열 또는 산성에 노출되고 또는 실온에서 시간 (가령 1달)의 기간 동안 저장된다. 이후, CD83 결합 단백질의 응집은 (불안정성을 나타내는 조건에 노출 후 혼탁도에서의 증가로) 혼탁도를 결정하는 것에 의해, 크기 배제 크로마토그래피에 의해, 비-감소 겔 전기영동에 의해 또는 본 명세서에서 설명된 결합 또는 중성화 연구에 의해 평가될 수 있다.
제약학적 조성물 및 치료 방법
본 발명의 CD83 결합 단백질 또는 이를 인코딩하는 핵산 또는 이를 발현하는 세포 (동의어 유효 성분)는 예방적 또는 치료학적 처리를 위해 비경구, 국소, 경구, 또는 국부 투여, 에어로졸 투여, 또는 경피 투여에 유용하다.
CD83 결합 단백질 또는 이를 인코딩하는 핵산 또는 이를 발현하는 세포의 투여되어야 할 제제는 투여 경로 및 선택된 제제 (가령, 용액, 에멀젼, 캡슐)에 따라 달라질 것이다. CD83 결합 단백질 또는 이를 인코딩하는 핵산 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는, 투여되어야 할, 적절한 제약학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체에서 제조될 수 있다. CD83 결합 단백질의 혼합물이 또한 이용될 수 있다. 용액 또는 에멀젼의 경우, 적절한 담체는 예를 들어, 염분 배지 및 완충 배지를 비롯한, 수성 또는 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화 나트륨 용액, 링거(Ringer) 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화 나트륨, 젖산 링거액 또는 고정유를 포함할 수 있다. 물, 완충된 물, 완충 식염수, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜), 덱스트로오스 용액 및 글리신을 비롯한, 여러 가지 적절한 수성 담체는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된다. 정맥내 비히클은 다양한 첨가제, 보존제, 또는 액체, 영양소 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다 (일반적으로 Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980을 참고). 조성물은 대략적인 생리학적 조건에 요구되는 바와 같은 제약학적으로 허용되는 보조 물질, 가령 pH 조절제 및 완충액 및 독성 조절제, 예를 들면, 아세트산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 및 젖산 나트륨을 선택적으로 함유할 수 있다. 본 발명의 CD83 결합 단백질은 해당 분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술에 따라 사용하기 전에 저장을 위해 동결건조될 수 있고 그리고 적합한 담체 안에 재구성될 수 있다.
선택된 배지내 유효 성분(들)의 최적 농도는 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지된 절차에 따라, 실증적으로 결정될 수 있고, 그리고 바람직한 최종 제약학적 제제에 의존할 것이다.
본 발명의 CD83 결합 단백질의 투여를 위한 투여량 범위는 바람직한 효과를 생성하는 데에 충분하게 광범위하다. 예를 들어, 조성물은 치료학적 또는 예방적 유효량의 CD83 결합 단백질 또는 이를 인코딩하는 핵산 또는 이를 발현하는 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 대상에서 CD83 활성을 유도하고/증가시키고 또는 저해하고/감소시키고/방지하는 데에 충분한 CD83 결합 단백질, 핵산, 또는 세포 양을 의미하는 것으로 간주될 것이다. 해당 분야의 통상의 기술자는 이러한 양은 예를 들어, CD83 결합 단백질, 핵산, 또는 세포 및/또는 특정한 대상 및/또는 치료되어야 할 질환의 유형 또는 중증도에 따라 달라질 것이라는 점을 인지할 것이다. 이에 따라, 이 용어는 본 발명을 특정한 양, 예를 들어, CD83 결합 단백질, 핵산, 또는 세포의 수 또는 무게에 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료학적 유효량"은 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 저해하는 데에 충분한 CD83 결합 단백질, 핵산, 또는 세포 양을 의미하는 것으로 간주될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방학적 유효량"은 질환의 하나 이상의 검출가능 증상의 개시를 예방하거나 저해하거나 지연시키는 데에 충분한 CD83 결합 단백질, 핵산 또는 세포 양을 의미하는 것으로 간주될 것이다.
투여량은 유해한 부작용, 가령 과다 점성 증후군, 폐부종, 울혈성 심부전 등을 야기하는 만큼 많아서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 연령, 상태, 성별 및 환자에서의 질병의 정도에 따라 달라질 것이고 그리고 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 합병증 사건에서 개인 의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 1일 이상 동안, 매일 1회 이상의 투여로, 약 0.1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 예를 들어, 약 0.2 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 가령, 약 0.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg에서 달라질 수 있다.
한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질은 피하로 또는 정맥 내로 투여된다.
몇몇 예시에서, CD83 결합 단백질 또는 다른 유효 성분은 차후 (유지 용량)보다 더 높은 초기 (또는 로딩) 용량으로 투여된다. 예를 들어, 결합 분자는 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 초기 용량으로 투여된다. 결합 분자는 이후, 약 0.0001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg의 유지 용량으로 투여된다. 유지 용량은 매 7 내지 35일 마다, 가령, 매 14 또는 21 또는 28일 마다 투여될 수 있다.
몇몇 예시에서, CD83 결합 단백질 또는 다른 유효 성분이 차후 용량에서 이용되는 것보다 더 낮은 용량으로 초기에 투여되는, 용량 증가법이 이용된다. 이 투여량법은 초기에 부작용으로 고통 받는 대상의 경우에 유용하다.
치료에 적절하게 반응하지 않은 대상의 경우, 한 주에 다중 용량이 투여될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 증가하는 용량이 투여될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 CD83 결합 단백질은 단독으로 또는 또 다른 약물 또는 작용제와 조합하여 (전에, 동시에, 또는 후에), 적절한 경로에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 또한, 단백질, 예를 들면, TNF 길항제, 항-IL-12/23 항체, 항-염증제, 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트 또는 진통제와 조합하여 이용될 수 있다. 본 발명의 CD83 결합 단백질은 항생제 및/또는 항미생물제와 함께 주어진, 개별적으로 투여된 조성물로서 이용될 수 있다.
본 발명의 CD83 결합 단백질이 본 발명의 발현 구조체 또는 본 발명의 CD83 결합 단백질을 발현하는 세포를 투여함으로써 대상 내로 도입될 수 있다는 점이 해당 분야의 통상의 기술자에게 인식될 것이다. 항체를 인코딩하는 핵산을 생체내 표적 세포 내로 도입시키기 위해 여러 가지 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 네이키드 핵산이 표적 부위에 주사될 수 있고, 리포좀 내로 캡슐화될 수 있고, 또는 바이러스 벡터에 의해 도입될 수 있다.
CD83 검출 어세이
다음 어세이는 본 발명의 CD83 결합 단백질, 예를 들어, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 검출가능 표지에 접합된 CD83 결합 단백질로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 어세이로 CD83의 검출은 질환을 진단하거나 예후하는 데에 유용한다.
면역어세이는 대상에서 질환을 진단하기 위한 또는 샘플내 CD83을 검출하기 위한 예시적인 어세이 형식이다. 본 발명은 웨스턴 블롯팅, 효소-연결된 면역흡착 어세이 (ELISA), 형광-연결된 면역흡착 어세이 (FLISA), 경쟁 어세이, 방사성면역어세이, 측방 유동 면역어세이, 관류(flow-through) 면역어세이, 전기화학발광 어세이, 비탁-기반 어세이, 탁도-기반 어세이, 및 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)-기반 어세이를 비롯한, 임의의 형태의 면역 어세이를 고려한다.
적절한 면역어세이의 한 가지 형태는 예를 들어, ELISA 또는 FLISA이다.
한 가지 형태에서, 이러한 어세이는 고형 매트릭스, 예를 들어 폴리스티렌 또는 폴리카르보네이트 마이크로웰 또는 딥스틱(dipstick), 막, 또는 유리 지지체 (가령, 슬라이드 글라스) 상에 본 발명의 CD83 결합 단백질을 고정시키는 단계를 포함한다. 검사 샘플은 이후, CD83 결합 단백질과 직접적으로 접촉되고 그리고 샘플내 CD83이 결합되거나 포획된다. 샘플에서 임의의 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위한 세척 후, 별개의 에피토프에서 CD83과 결합한 단백질은 포획된 CD83과 직접적으로 접촉된다. 일반적으로, 이 검출 단백질은 예를 들어, ELISA의 경우 효소 (가령 겨자무 과산화효소 (HRP)), 알칼리성 포스파타아제 (AP) 또는 P-갈락토시다아제) 또는 FLISA의 경우 형광단과 같은 검출 가능한 리포터 분자로 표지된다. 대안으로, 검출 단백질과 결합하는 이차 표지된 단백질이 이용될 수 있다. 임의의 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위한 세척 후, 검출 가능한 리포터 분자는 ELISA의 경우, 예를 들어, 과산화 수소, TMB, 또는 톨루이딘과 같은 기질, 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-베타-D-갈락토피라노시드 (x-gal)의 첨가에 의해 검출된다. 물론, 고정된 (포획) 단백질 및 검출 단백질은 반대 방식으로 이용될 수도 있다.
이후 샘플내 항원 수준은 대조 샘플과 비교함으로써 또는 공지된 양의 마커를 이용하여 생성되었던 표준 곡선을 이용하여 결정된다.
상기 설명된 어세이는 검출의 기본으로서 화학발광 또는 전기화학발광을 이용하도록 쉽게 변형된다.
해당 분야의 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이, 면역흡착 어세이에 기반한 다른 검출 방법도 본 발명의 수행에서 유용하다. 예를 들어, 검출용 방사성표지, 또는 검출용 금 표지 (가령, 콜로이드성 금), 또는 예를 들어 검출용 NAD+를 캡슐화하는 리포좀을 이용한 상기 설명에 기반한 면역흡착 방법 또는 아크리디늄 연결된 면역흡착 어세이.
본 발명의 몇몇 예시에서, CD83의 수준은 표면 플라스몬 공명 검출기 (가령, BIAcore™, GE Healthcare, Piscataway, N.J.), 예를 들어, US7205159에서 설명된 바와 같은 관류 장치, 마이크로- 또는 나노-면역어세이 장치 (가령, US7271007에서 설명된 바와 같음), 측방 유동 장치 (가령, US20040228761 또는 US20040265926 에서 설명된 바와 같음), 형광 분극화 면역 어세이 (가령, US4593089 또는 US4751190에서 설명된 바와 같은 FPIA), 또는 면역탁도 어세이 (가령, US5571728 또는 US6248597에서 설명된 바와 같음)를 이용하여 결정된다.
질환 또는 질병
본 발명의 CD83 결합 단백질은 CD83 연관된 질환 또는 질병의 치료, 방지, 진단, 또는 예방에 이용될 수 있다.
본 발명의 방법을 수행함으로써 치료되고, 예방되고, 진단되고, 또는 예후될 수 있는 예시적인 질환 또는 질병은 염증성 또는 자가 면역 질환 또는 질병을 포함한다.
예시적인 질환 및 질병은 알러지, 천식, 이식편 거부, 자가면역 질환, 가령 중증 근무력증, 다발성 경화증, 혈관염, 만성 염증성 장 질병, 가령 크론 병 또는 궤양성 결장염, HLA B27-연관된 자가면역 질환, 가령 베크테로 병, 및 전신 홍반성 루푸스, 피부병, 가령 건선, 류마티스 관절염, 인슐린-의존 진성 당뇨병 및 AIDS를 포함한다.
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 예를 들어, 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 질병에서 비정상적인 또는 원치 않는 면역 반응을 조절하기 위해 면역 세포, 가령 항원 제시 세포 (APC) (가령, 수지상 세포 (DC)) 및/또는 림프구 (가령, T 세포)를 고갈시킨다. 한 가지 예시에서, CD83 결합 단백질은 APC 및/또는 림프구의 표면에 특이적으로 결합하는 항체이고 그리고 항체 의존 매개 세포독성 (ADCC)을 통해 단백질은 APC 및/또는 림프구를 고갈시킨다. 한 가지 예시에서, ADCC는 자연 살해 (NK) 세포에 의해 매개된다.
이식편 거부
한 가지 예시에서, 본 발명의 CD83 결합 단백질은 예를 들어, 이식편 대 숙주 병 또는 숙주 대 이식편 병에 의한, 예를 들어 이식편 거부와 연관된 면역 반응을 조절하기 위해 APC 및/또는 림프구와 같은 면역 세포를 고갈시키는 데에 이용될 수 있다. 한 가지 예시에서, 이식편은 기관 또는 조직 또는 세포 이식편이다. 한 가지 예시에서, 이식편은 동종이식편이다. 한 가지 예시에서, 이식편은 조혈모세포 이식편이다.
이식편 대 숙주 병은 면역적격 이식편, 예를 들어 동종이계 조혈모세포 이식편이 수여자, 예를 들어, 조직-비양립 수여자에게 가변적이고 기능적인 면역 세포와 함께 투여되고, 그리고 이식편내 존재하는 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 이식 수여자의 조직을 공격한다는 결과를 가져올 수 있다.
숙주 대 이식편 병은 동종이계 이식편으로부터 유래된 항원이 공여자 또는 수여자 APC에 의해 수여자의 면역 세포, 예를 들어, T 세포에 제시되는 결과를 가져올 수 있고, 상기 T 세포는 결과적으로 효과기 면역 세포, 예를 들어, 세포독성 T 림프구 (CTL)가 되도록 활성화되고 상기 림프구는 이후 이식물을 공격한다.
"동종이계 이식편"은 동일한 종의 유전적으로 비-동일 공여자 (가령, 조직-비양립 공여자)로부터의 이식편이다.
조혈모세포 이식 ( HSCT )
"조혈모세포 이식 (HSCT)"은 예를 들어, 골수 또는 말초 혈액으로부터 유래될 수 있는 다분화능 조혈모세포을 포함하는 이식이다. 이식물은 몇몇 비-줄기 세포, 예를 들어, DC 및/또는 림프구를 비롯한 APC를 포함할 수 있다.
"조혈모세포"는 골수성 (단핵구 및 대식세포, 중성구, 호염기성 세포, 호산구 수지상 세포), 적혈구성 (적혈구), 거핵구성 (혈소판) 및 림프구성 계통 (T-세포, B-세포, NK-세포)를 비롯한 모든 혈액 세포 유형을 생기게 하기 위해 자가 분열하고 분화할 수 있다. 분화를 통해, 조혈모세포는 우선, 이의 자가-분열 능력을 상실하고, 그 다음 성숙 효과기 세포로 되게끔 하면서 단계적으로 계통 잠재성을 상실한다. 전형적으로, Lin-, CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA- 인간 세포는 조혈모세포이다. 한 가지 예시에서, CD34의 발현은 인간 공여자로부터 단리된 말초 혈액내 조혈모세포를 식별하는 데에 이용된다.
HSCT는 줄기 세포 이식을 필요로 하는 질병 및 질환의 치료에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 정상 혈액 세포 생성 및 성숙의 부전 또는 기능장애, 조혈 악성종양, 자가면역 질병, 간 질병, 또는 면역결핍증 (예를 들어, 방사선 조사, 화학요법 또는 병원균으로의 감염의 원인에 의한 것임)의 치료를 위해 이용될 수 있다.
줄기 세포는 대상에게 투여하기에 앞서 생체 외에서 확장되거나 분화될 수 있다.
동종이계 조혈모세포 이식은 다음 질환 중 하나 이상을 치료하는 데에 이용될 수 있다: 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수 증식성 질환, 골수 이형성 증후군, 다발성 골수종, 비-호지킨(Hodgkin) 림프종, 호지킨병, 재생불량성 빈혈, 진성 적혈구계 무형성증, 발작성 야간혈색소 요증, 판코니(Fanconi) 빈혈, 탈라세미아 메이저(Thalassemia major), 겸상 적혈구 빈혈증, 중증 복합성 면역결핍 (SCID), 비스코트-올드리치(Wiskott-Aldrich) 신드롬, 혈구탐식성 림프조직구증후군 (HLH), 선천성 대사이상 (가령, 점액성 다당류증,, 고쉐(Gaucher) 병, 이염성백질이영양증 및 부신백질 이영양증).
키트
본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 키트를 추가로 포함한다:
(i) 본 발명의 CD83 결합 단백질 또는 이를 인코딩하는 발현 구조체(들);
(ii) 본 발명의 세포; 또는
(iii) 본 발명의 제약학적 조성물.
CD83을 검출하기 위한 키트의 경우, 키트는 예를 들어, 본 발명의 CD83 결합 단백질에 연결되는 검출 수단을 추가로 포함한다.
치료학적/예방적 용도를 위한 키트의 경우, 키트는 제약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
선택적으로 본 발명의 키트는 임의의 예시에 따라 본 명세서에서 설명된 방법으로 이용하기 위한 설명서와 함께 포장된다.
본 발명은 다음 비-제한 예시를 포함한다.
실시예
실시예 1 재료 및 방법
발현 벡터 설계
공개적으로 이용가능한 인간 불변 영역 중쇄 (IgG1 및 IgG4 아형) 및 κ 경쇄 서열을 이용하여 mAbXpress 벡터를 조립하였다. 요구되는 DNA를 합성하고 Geneart AG (Germany)로 포유류 발현에 코돈-최적화시켰다. 이후 이들 카세트를 포유류 세포에서의 발현, 선별 및 증폭을 위한 서열을 함유한, 포유류 발현 벡터 내로 배치시켰다 (Aeyte Biotech, Australia). 단일 SacI 부위를 발현 벡터 안에 포함시켜 선형화 및 가변 영역의 In Fusion™ (ClonTech) 클로닝을 촉진시켰다.
CD83에 대한 파지-디스플레이 패닝 및 scFv의 결찰-비의존성 , In Fusion™ 클로닝
인간 CD83의 세포외 도메인은 CHO 세포에서 발현되었고 IMAC으로 정제시켰다. 이 제조물은 공개된 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 결합제를 단리시키는 데에 이용하였다 (Sheets et al., Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A 95(11): 6157-62, 1998). 재조합 CD83에 대한 여러 가지 특유의 결합제를 단리시켰고 그리고 클로닝 및 발현을 위해 클론 3C12를 선별하였다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대한 가변 영역을 각각의 사슬의 5' 및 3' 프레임워크 영역에 대한 프라이머를 이용하여 파지미드 벡터로부터 PCR 증폭시켰다. 추가적인 15bp를 목적지 벡터(destination vector)의 상류 및 하류 염기에 상응하는 각각의 프라이머 상에 포함시켜 결찰-비의존성 In Fusion™ 클로닝 (Clontech)을 가능하게 하였다. 중쇄에 대한 예시 프라이머는 다음과 같고: 3C12_VhFor 5'-CAGGTGTCCACTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAG-3' (서열 번호:50) 및 3C12_VhRev 5'-GCGGAGGACACGGTGAGCGTGGTCCCTTGGCCC-3' (서열 번호:51), 그리고 경쇄의 경우 프라이머는 다음과 같다: 3C12_VkFor 5'-CCGGCGTGCACTCCGAGATCGTGATGACCCAG-3' (서열 번호:52), 및 3C12_VkRev 5'-GCCACGGTCCGCCTTGAGTTCCAGCTTGGTCCC-3' (서열 번호:53). 밑줄 친 영역은 scFv-특이적 서열을 나타내고, 이는 클론에서마다 달라질 수 있다. 제조자의 지시에 따라, In Fusion™ 시스템 (Clontech)을 이용하여, 정제되지 않은 PCR 산물을 mAbXpress IgG1 중쇄 및 κ 경쇄 벡터 내로 삽입시켰다. 하기 설명된 바와 같이 항체의 형질감염 및 정제를 수행하였다.
포유류 세포 발현
항체 발현을 위하여, 물에서 제조된 폴리에틸렌이민 (PEI)-Max (Polysciences Inc.)를 이용하여 중쇄 및 경쇄 서열을 가진 mAbXpress 플라스미드를 공동-형질감염시켰다. 3.5:1의 PEI:DNA 비로 형질감염 복합체를 제조하였다. 0.75:0.25 v/v의 세포: 형질감염 복합체 비를 이용하여 현탁액-개작 CHO의 일시적인 형질감염을 수행하였고, 이는 CD-CHO 배지에서 각각의 750 μL 세포 (1.5x106개 세포.mL-1)를 250 μL의 OptiPro SFM 배지 (Invitrogen)에서 1.6 μL DNA 및 5.6 μL PEI로 형질감염시킨다는 것을 의미한다. 세포 현탁액에 첨가하기 전 교란 없이 실온에서 15분 동안 복합체를 인큐베이션하였다. 형질감염-후 4시간에, 7-14일 동안 흔들림 (용기 및 쉐이커 투사율에 따라, 160-250 rpm)이 있는 32℃ 및 7.5% CO2에서의 가습 인큐베이터로 배양물을 옮기기 전에 0.1 mg.L-1에서의 CD-CHO 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1)로 총 부피를 배증시킴으로써 세포를 희석시켰다. 소규모 (2 mL), 중간규모 (30 mL), 대규모 (400 mL)로 발현 연구를 전형적으로 수행하였다. 원심분리로 세포 파편을 제거하였고 그리고 분비된 항체를 단백질-A 크로마토그래피로 정제시켰다.
면역글로불린 및 Ig-융합 단백질의 단백질 A 정제
1 mL 단백질 A HiTrap 칼럼 (GE Healthcare)을 20 칼럼 부피 (CV)의 PBS로 펌핑 세척하였다. 20 mL-1.2L의 부피 범위에서, 인간 IgG1 또는 CD83-Fc 융합 단백질을 함유한 상청액을 분 당 1 mL의 유속으로 적용시켰다. 7.0까지 pH를 복구하기 위해 40 μL 중성화 완충액 내로 용리된 각각의 1 mL 분획으로 10 CV의 단백질 A 용리 완충액을 적용시키기에 앞서 20-50 CV PBS로 칼럼을 세척하였다.
mAbXpress에서 발현된 항체의 분석적인 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
SEC을 위하여, 0.22 μm 여과기를 통해 여과된, 100 mM 포스페이트 pH 6.7, 200 mM NaCl의 이동상으로 Agilent 1200 시리즈 LC 상에서 TSK-GEL G3000SWxl 30 cm x 7.8 mm 칼럼 (Tosoh Bioseienee)을 이용하였다. 유속은 0.8 mL.분-1이었다. 겔 여과 표준 (Bio-Rad)을 이용하여 캘리브레이션(calibration)을 수행하였다. 이 시스템을 이용한 일시적인 형질감염 실험으로부터의 전형적인 산출량은 범위가 20-60 mg.L-1였다.
CD83 웨스턴 블롯
항-CD83 mAb가 선형 또는 입체 형태의 에피토프를 인식하는 지에 대해 평가하기 위하여, SDS-PAGE를 위해 재조합 hCD83ECD-His 단백질을 제조하였다. 5 μg hCD83ECD-His를 함유한 비-변성 샘플 (즉, 머캅토에탄올에서 끓임으로써 변성되지 않음)을 직접적으로 웰에 로딩하였고, 반면에 변성 샘플은 2.5% β-머캅토에탄올을 포함하였으며 로딩하기에 앞서 10분 동안 95℃에서 가열시켰다. 트랜스블롯 시스템(Transblot System) (BioRad)을 이용하여 100 볼트에서 45분 동안 니트로셀룰로오스 막으로 옮기기에 앞서 50분 동안 200 볼트에서 러닝시킴으로써 단백질을 12% NuPAGE 겔 (Invitrogen) 상에 분리시켰다. 일차 항체의 첨가에 앞서 1시간 동안 오디세이 블로킹 완충액(Odyssey Blocking buffer) (Li-Cor Biosciences)를 적용시켰다. 일차 항체는 5 μg.mL-1 3C12 IgG 또는 1:2,000 희석의 항-인간 CD83 시약, HB15e-PE로 구성되었고, 이때 각각은 1시간 동안 0.5% 트윈-20을 가진 PBS (PBST)에서 제조되었다. PBST로 2회 세척한 후, 오디세이 적외선 이미징 시스템(Odyssey Infrared Imaging System) (Li-Cor) 상에서 세척 및 시각화하기에 앞서 적외선 IRD800 항-인간 또는 생쥐 Fc 항체 (Li-Cor)를 45분 동안 1:10,000 희석으로 적용시켰다.
세포막 CD83의 정량화
표준 QIFIKIT (Dako) 프로토콜 (Serke S et al., Cytometry 33(2): 179-87, 1998)을 이용하여 인간 PBMC로부터의 세포주 및 혈액 DC에 존재하는 세포 표면 CD83 분자의 수를 추정하였다. 세포주 및 형질감염된 세포의 경우에, 0.5x106개의 세포를 4℃에서 45분 동안 20 μg.mL-1의 비접합 항-CD83 mAb, HB15a (Immunotech)로 염색하였고 그리고 항-생쥐 IgG-FITC 또는 항-생쥐 IgG-PE (Chemicon)가 제공된 키트로 1:50 희석하였다. 활성화된 DC 상에서 CD83 수준의 정량화를 위해, 1x106개의 PBMC를 하룻밤 동안 배양하여 CD83을 상향-조절하였다 (Zhou et al., J. Immunol. 154(8): 3821-35, 1995). 이후 세포를 20 μg.mL-1 HB15a로 염색하였고 그 다음 상기 명시된 바와 같이 검출하였다. 임의의 남아있는 비결합 항-생쥐 FITC를 차단시키기 위하여, 50 μL의 10% 생쥐 혈청을 첨가하고 20분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. PE에 접합되고 제조자의 권고로 적용된 CD3, CD14, CD19, CD20 및 CD56 항체로 구성된 계통 혼합물을 HLA-DR-apc-Cy7 및 150 μg.mL-1의 비오틴화된 CMRF-44와 함께 첨가하였고, 차후, 1:50 희석의 스트렙타비딘-퍼시픽 블루로 검출하였다. 각각의 단계 사이에서 세포를 2 mL MACS 완충액으로 세척하였고 그리고 하기 설명된 바와 같이, 2분 동안 1000 x g으로 원심분리하였다. 활성화된 인간 DC를 계통-HLA-DR+CMRF-44+HB15a+로서 게이팅하였다. 표준 곡선을 만들어 QIFIKIT 제공된 프로토콜에서 약술된 바와 같이 CD83 표면 밀도를 추정하였다.
유세포 분석법
유세포 분석을 위해 pH 7.2 PBS내 2 mM EDTA와 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA; Invitrogen)으로 구성된 차가운 자성-활성화된 세포 분류 (MACS) 완충액, 또는 PBS내 0.5% FCS, 0.05% 아지드화 나트륨 (Ajax Finechem)을 함유한 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 완충액에서 세포를 세척하였다. 세척된 세포의 수를 세었고 그리고 2x105 - 2x106개의 세포를 5 mL 폴리스티렌 둥근-바닥 튜브 (BD Biosciences)에 분배하였다. 세포 펠렛의 원심분리를 포함한 모든 단계를 2분 동안 1000 x g로 DiaCent-12 Benchtop 원심분리 (DiaMed)에서 수행하였다. 50 μL의 최종 부피에서 달리 명시되지 않는 한 얼음에서 30-60분 동안 세포를 형광 일차 또는 이차 항체 접합체로 염색시켰다. 세포를 3 mL FACS 또는 MACS 완충액으로 세척하였고 펠렛으로 만들었다. 다중 단계-염색 절차를 위해 이 단계를 반복하였다. 세포를 염색 완료 3시간 이내에 분석하였고 그렇지 않으면 세척 및 200 μL FACS 완충액에서 재현탁하기 전에, 30분 동안 200 μL 1% 파라포름알데하이드 (PFA)의 적용으로 고정시켰다. 죽은 세포를 7-AAD 염색으로 평가하는 경우에, 세포를 분석에 앞서 최대 2시간 동안 얼음 상에 두었다. 데이터를 얻기 위한 CellQuest 소프트웨어를 이용하는 FACS Calibur 4-색 유세포 분석기, 또는 FACSDiva 버전 6.1 소프트웨어를 이용한 LSRII 유세포 분석기 (모두 BD Biosciences)를 이용하여 세포를 분석하였다. FlowJo 버전 8.8.6 또는 FCS Express 3 소프트웨어(DeNovo Software) 상에서 데이터 분석을 수행하였다.
R-피코에리트린 ( RPE )에 mAb의 화학적 접합
PBS에서 정제된 3C12 또는 인간 IgG1 동종형 대조 mAb, 헤르셉틴 (60 μg)을 제조자의 설명에 따라 Lynx Rapid RPE 항체 접합 (AbDSerotec)으로 100 μg RPE에 공유 결합시켰다. 유세포 분석 실험에서 이용하기에 앞서, 항체를 0.5-50 μg.mL-1에서 적정하였고, 여기서 5 μg.mL- 1는 KM-H2 세포에서 CD83을 염색하기 위한 최적의 작업 농도로서 결정되었다.
탈푸코실화된 IgG의 제조
형질전환 복합체의 첨가 후 대략 4-6시간에, 상기 약술된 표준 프로토콜에 따라 형질감염된 CHO 세포에 2 μg.mL-1 키푸넨신 (GlycoFineChem, New Zealand)을 첨가함으로써 비-푸코실화된 항체를 얻었다. 배양물을 6-7일의 표준 배양 후 수확하였고 그리고 상기 설명된 바와 같은 단백질-A 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 항체-연관 올리고사카라이드의 함량을 확인하기 위하여, 정제된 단백질을 제조자의 설명에 따라 고정각 원심분리에서 울트라-4 원심분리 여과 장치 (Amicon)를 이용하여 2 mg.mL-1까지 농축시켰다. 20분 동안 100℃에서 50 mM 암모늄 비카보네이트, 0.25% SDS내 0.25% 2-머캅토에탄올로 50 μL의 샘플을 환원시켰다. 트리톤-X-100을 SDS와의 0.5% 복합체에 첨가하였고 차후 1U의 N-글리코시다아제 F (Roche)를 첨가하였다. 희석 및 0.5% 트리플루오로아세트산 (TFA)을 이용한 산성화에 앞서 변환 전자레인지(inverter microwave)에서 4분 동안 샘플을 분해시키고, 그리고 흑연화 탄소 고체 상 추출 (SPE) 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 샘플을 동결 건조시키고, 50 mM NaCl에서 재현탁하고 그리고 Bruker Ultraflex에서의 양성 리플렉트론(reflectron) 모델에서 슈퍼-2,5-디하이드록시벤조산 (sDHB; Sigma) MALDI-MS 매트릭스에서 분석하였다. 차후에 질량 분석법으로 탈푸코실화의 확인을 수행하였다.
친화도 성숙을 위한 V L 셔플된 라이브러리의 제작
프로토콜이 제공된 키트를 이용하여 2.5 U의 고충실도 Pfu 폴리머라아제 (Stratagene)를 가진 pHEN1 파지미드 벡터 (Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19(15): 4133-7, 1991) 그리고 및 갭 수복 클로닝 (Orr-Weaver and Szostack, 1983; Gietz and Schiestl 1991)을 허용하기 위해 벡터와 중첩되는 추가적인 5' 서열 및 (밑줄친) 제한 부위를 가진 프라이머로부터 3C12 scFv의 중쇄 (VH) DNA를 0.5 μM의 최종 농도에서 증폭시켰다:
3C12VH5' 5'- GACTATGCAGCTAGCGGTGCCATGGCAGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3' (서열 번호:54)
Mod3C12VH3' 5'- GTTGAGCCTCCGGACTTAAGGTCGACTGAGGACACGGTGAGCGTGGTCC-3' (서열 번호:55). 다음과 같은 변형과 함께 이전에 설명된 방법 (Zhou et al., J. Mol. Biol. 404(1): 88-99, 2010)에 기반한, 생체내 상동 재조합을 이용하여 3C12-VL 셔플된 라이브러리를 제작하였다. 간단히 하자면, 10 μg의 겔 정제된 (GeneClean Turbo, Qbiogene) 3C12 VH 단편 DNA를 대략 107개의 인간 VL 유전자 서열의 라이브러리를 함유한 50 μg의 NcoI - SalI 분해된 pYD4 벡터와 함께 EBY100 효모 세포 (Antibody Epitope Mapping using Yeast Display (Garcia-Rodriguez C, Zhou Y, Marks JD, eds, 2010), Springer)의 표준 리튬 아세테이트 형질전환에서 이용하였다. 다른 곳 (Antibody Epitope Mapping using Yeast Display (Garcia-Rodriguez C, Zhou Y, Marks JD, eds, 2010), Springer)에서 정의된 바와 같이, 500 mL 효모 최소 배지, 선택 성장 덱스트로오스 카사미노산 배지 (SD-CAA)에서 형질전환된 효모 라이브러리를 배양하였다. 배양 조건은 달리 명시되지 않는 한 30℃에서 250 rpm으로 흔드는 것이다. SD-CAA 플레이트 상에 계열 희석(serial dilution)한 형질전환된 효모를 도말함으로써 라이브러리의 크기를 추정하였다. 형질전환-후 48시간에, 10배 초과의 최대 라이브러리 다양성 (즉, 108)을 나타내는 샘플을 48시간 동안 18℃에서의 선택 성장 갈락토오스 카사미노산 배지 (SG-CAA)에서 유발시켰다.
FACS를 이용한 효모 디스플레이에 의한 V L 셔플된 라이브러리의 분류
디스플레이된 3C12 VL 셔플된 라이브러리에 세 라운드의 세포 분류를 시행하였다. 각각의 라운드는 4℃에서 1시간 동안 용해성 hCD83ECD-His와의 인큐베이션을 포함한다. 여러 라운드의 선별에서 디스플레이된 항체 클론과 결합하는 데에 이용되는 항원의 농도는 첫 번째 라운드 내지 세 번째 라운드에 대하여, 각각, FACS 완충액에서 희석된 20 nM, 2.5 nM 및 0.5 nM의 hCD83ECD-His였다. 세 번째 및 최종 라운드의 분류는 또한, 더 느린 해리 속도를 가진 클론을 선별하기 위하여 hCD83ECD-His 항원으로 염색한 후 FACS 완충액으로 하룻밤 동안의 세척 단계를 포함하였다. 각각, 항-생쥐 IgG1 Fc 특이적-FITC 또는 항-토끼 Fc 특이적-FITC (두 가지 모두 Jackson Immunoresearch)의 1:500 희석으로 포획된 항-CD83 항체 (100 μg.mL-1 생쥐 단클론 항체, mB4 또는 1 μg.mL-1 다클론 항체, RA83 중 하나)를 이용하여 각각의 선별 단계에서 항원 결합을 검출하였다. 항-SV5-알렉사 647을 이용하여 각각의 라운드 동안 효모의 표면 상에서 scFv의 발현을 평가하였다. 차가운 FACS 완충액에서 1-5x107개 세포.mL-1까지 희석된 세포를 FACSAriaII 기기 (BD Biosciences)에서 분석하였고 그리고 도 6A에서 나타난 바와 같이, P2 및 P3 콜렉션 게이트 내로 분류하였다. 다음 라운드의 분류를 위해 갈락토오스-함유 SG-CAA 액상 배지 (Antibody Epitope Mapping using Yeast Display (Garcia-Rodriguez C, Zhou Y, Marks JD, eds, 2010), Springer)로 표면 디스플레이를 유도하기에 앞서 48시간 동안 SG-CAA 액상 배지 (Antibody Epitope Mapping using Yeast Display (Garcia-Rodriguez C, Zhou Y, Marks JD, eds, 2010), Springer)에서 1x104 - 1x105개 세포.mL-1로 콜렉션 게이트로부터의 결과물을 배양하였다. 클론이 분류되는 세 번째 라운드의 결과물을 SD-CAA 상에 도말하였다. 총 90개의 개별적인 클론을 추가적인 18시간 동안 SG-CAA 배지에서의 유도에 앞서 하룻밤 동안 SD-CAA에서 배양하였다. 증폭된 효모 디스플레잉 scFv를 0.2 nM hCD83ECD-His로 염색시키고 효모-디스플레이된 야생형 3C12 scFv와 비교하였다. 이 FACS 분석으로부터, 서열화를 위해 항원 결합 강도에서의 명확한 증가를 보인 20개의 개별적인 클론을 선별하였다. DNA 서열화는 네 가지 우세한 VL 사슬 서열 (3C12.B, 3C12.C. 3C12.D 및 3C12.E)을 나타내었고, 이는 상기 설명된 바와 같은 인간 IgG1κ (mAbXpress 벡터, ACYTE Biotech)로서 재구성되었다.
변화하는 수준의 CD83 발현이 있는 안정한 형질감염체의 생성
바이-시스트로닉 내부 리보솜 유입점 (IRES)-녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 벡터, pMXIE.2내로 전장 cDNA (Genbank 수탁번호 제NM_004233.3호)를 클로닝하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙타민 (Invitrogen)을 이용하여 T25 플라스크에서 합류 GP+E86 레트로바이러스 패키징 세포를 형질감염시키는 데에 플라스미드 DNA (10 μg)를 이용하였다. 안정하게 형질감염된 GP+E86 패키징 세포가 80% 합류에 도달하였을 때, 패키징 세포에 2000cGy의 방사선을 조사하여 확장을 저해하였고, 그리고 바이러스 감염의 인핸서로서 2-4 μg.mL-1의 헥사디메트린 브로마이드 (Sigma)와 함께 공동-배양을 위해 5 x 105개 세포.mL-1의 BB88 현탁액 세포를 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 48시간의 배양 후, BB88 현탁액 세포를 제거하였고 FACSAriaII 기기를 이용하여 GFP 발현에 대해 분류하였다. 차후 분류 라운드를 수행하여, 증진된 GFP/CD83 발현이 있는 형질감염체를 선별하였다. 분류된 세포의 유세포 분석 염색으로 CD83 발현을 확인하였다. 한계 희석법으로 세포의 단클론 배양물을 클로닝하였다.
CD83 mAb를 가진 활성화된 수지상 세포의 고갈
동결건조된 PBMC를 해동시키고 RPMI-10에서 하룻밤 동안 배양하켜 CD83의 상향-조절을 유도하였다 (Zhou and Tedder, J. Immunol. 154(8): 3821-35, 1995). 6,000 IU.mL-1 재조합 IL-2 (Boehringer Mannheim)의 존재에서 멸균 밀봉된 5mL FACS 튜브 (BD Biosciences)에서의 1mL의 최종 부피로 2x106개 세포.mL-1의 세포를 배양하여 NK 세포 및 5 μg.mL-1 3C12.C IgG 또는 인간 IgG1κ 동종형 대조를 활성화시켰다. 유세포 분석 염색 및 활성화된 DC 모집단을 평가하기 위한 분석에 앞서 3-4일 동안 세포를 인큐베이션하였다.
GVHD의 모델인, 이종 SCID 생쥐
모든 동물 작업은 퀸즈랜드 대학의 동물 윤리 위원회(University of Queensland Animal Ethics Committee)에 의해 승인되었다. 동물 자원 센터(Animal Resources Centre) (Western Australia)로부터 5주령 SCID 생쥐를 얻었고, 실험에 앞서 일주일 동안 무-병원균 환경에서 수용하였다. 이용되는 이종 모델은 이전에 설명되었다 (Wilson et al., J. Exp. Med. 206(2): 387-98, 2009). 간단히 하자면, 제-1일에 325cGy 방사선으로 조건화된 생쥐에게 NK 세포 및 다른 백혈구를 고갈시키는 asialoGM1 (ASGM-1)에 대한 항체를 투여하여 제0일에 50x106 인간 PBMC의 복강내 주사의 접종을 촉진시켰다. 항체 치료를 도면 범례에서 명시화된 용량으로 PBMC 이식일 (제0일)에, 또한 복강내 주사를 통해 생쥐에게 투여하였다. 편향을 제거하기 위해 처리군에 대한 지식 없이 이식-후 30일 동안 GVHD의 각각의 임상 징후에 대해 0.5 최소 증분으로 0.0 (건강) 내지 2.0 (좋지 않은 상태)의 측량 범위에서 매일 생쥐의 점수를 매겼다. 점수 기준은 무게 감소, 자세, 활동, 털의 질감, 피부 및 눈의 완전성 및 설사이다. 어느 하나의 기준에 대해 2.0 점수를 받거나 >5.0의 누적 점수를 가진 동물은 경추 파열법으로 희생시켰다. 과거 제20일에 생존한 동물은 주입된 인간 세포의 존재를 확인하기 위해 항-인간 및 항-생쥐 CD45 항체로 유세포 분석 염색을 위해 수집되고 평가되는 비장, 골수 및 복강 세척을 받았다. 로그-순위 (Mantel-Cox) 검정을 이용하여 GraphPad Prism 버전 5.01에서 생존 곡선 비교를 수행하였다.
Fab 제조 및 친화도 분석
키트-제공된 단백질 A 수지를 MAbSelect SuRE 수지로 교체하였다는 점을 제외하고 제조자의 지시에 따라, Pierce Fab MicroFab 제조 키트를 이용하여 파파인 분해로 Fab 단편을 만들었다 (Seldon et al., J. Biomol. Tech. 22: 50-2, 2011). 10 mM 헤페스(Hepes), 150 mM 염화 나트륨, 3 mM EDTA, 및 0.005% 폴리소르베이트 20 (GE Elealthcare)으로 구성된 HBS-EP 완충액에서 Fab을 희석시켰다. 동력학 분석 위저드 프로토콜을 이용하여, 100 공명 단위 (RU)의 hCD83ECD-His 단백질과 커플링되는 CM5 칩이 장착된 BiaCore3000 (GE Healthcare) 기기를 이용하여 희석된 Fab의 친화도 평가하였다. 물질 전달 한계(mass transfer limitation)가 있는 내재된 1:1 결합 모델을 이용하는 BiaEvaluation 소프트웨어 (GE Healthcare)를 이용하여 운동률을 추정하였다.
세포
메이터 의학 연구 기관(Mater Medical Research Institute) 재고로부터 림프종 세포주, KM-H2와 L428, 그리고 현탁액 중국 햄스터 난소 (CHO-S)를 비롯한, 형질감염을 할 수 있는 세포주 그리고 생쥐 세포주 BB88과 FDCP1을 얻었다. 메이터 의료 서비스 인간 연구 윤리 위원회(Mater Health Services Human Research Ethics Committee_에 따라 모집된 바와 같이, 혈액 또는 성분채집 산물을 공여하는 건강한 지원자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 얻었다. 인간 면역결핍 바이러스, 간염 B 및 C, 인간 T-림프친화 바이러스 및 매독에 대해 건강한 인간 공여자의 모든 샘플을 스크리닝하였다
세포 배양 배지 및 용액
이용하기에 앞서 30분 동안 56℃에서 열-비활성화되었던 lx 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM GlutaMAX, 25 mM HEPES 및 10% 송아지 태아 혈청 (FCS)으로 보충된 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI) 배지에서 인간 세포주 및 인간 PBMC를 배양하였다 (RPMI-10, Invitrogen으로부터의 모든 성분). 생쥐 세포주 BB88 및 FDCP1 세포를 페니실린-스트렙토마아신, GlutaMAX, HEPES 및 10% FCS로 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글 배지 (Invitrogen)에서 배양하였다 (DMEM-10). 전장 인간 CD83으로 형질감염된 FDCP1 세포를 100 μg.mL- 1 G418 Geneticin 선별 항생제의 존재에서 추가로 배양하였다. 모든 세포를 가습 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하고 적절하게 계대하였다.
말초 혈액 및 성분채집 산물로부터 PBMC의 피콜 제조
혈액 산물로부터 PBMC의 정제에서 밀도 구배 원심분리를 활용하였다. 간단히 하자면, 400 mL의 말초 혈액 샘플을 멸균 실온 PBS로 1:1 희석하였고, 반면에 농축된 성분채집 산물은 PBS로 1:20 희석하였다. 브레이크 스위치가 꺼진 원심분리기로 20분 동안 600 x g으로 원심분리하기에 앞서 멸균 50 mL 튜브에서, 35 mL의 희석된 혈액 산물을 15 mL의 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) 밑에 깔리게 하였다. 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 이용하여, 피콜 접점에 있는 세포를 수집하고 PBS로 3-5회 세척하여 오염된 혈소판을 제거하였다. 혈구계산기를 이용하여 세포의 수를 계산하였고 그리고 배양하고, 동결전조하고 또는 기능 어세이에서 이용하였다.
포유류 세포의 동결보존 및 소생
5분 동안 300 x g에서의 원심분리로 그리고 10% 디메틸 설폭시드 (DMSO; Sigma) 및 90% FCS로 구성된 용액에서 50x106개 세포.mL-1의 최종 밀도에서 재현탁함으로써 동결보존을 위한 PBMC를 제조하였다. 다른 모든 세포를 전형적으로, 8% DMSO, 50% 조건화 배지 및 42% 신선한 배지를 함유한 용액에서 재현탁하였다. 크라이오 1℃ 프리징 컨테이너(Cryo 1℃ Freezing Container) (Nalgene)에 위치한, 1 mL 멸균 냉동바이알(cryovial) 내로 세포를 분취하였고, 그리고 -80℃에서 임시 저장고 내로 즉시 옮겼으며, 여기서 액체 질소 저장고 (-196℃) 내로의 재배치가 24-48 시간 내에 일어난다. 요구한 대로, 세포를 37℃ 수조에서 해동시켰고 그리고 미리-데워둔 15 mL 배지에 즉시 희석시켰다. 세포를 5분 동안 300 x g에서 원심분리하였고 그리고 추가적인 이용 또는 배양을 위해 10 mL 배지에 재현탁하였다.
림포카인 활성화 살해 ( LAK ) 세포의 발생
신선한 또는 해동된 PBMC (< 2 x 109개 세포)를 세척하고 PBS pH7.2내 2 mM EDTA와 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA; Invitrogen)으로 구성된 차가운 MACS 완충액에서 재현탁하였다. 인간 CD56 MicroBead를 제조자의 권고에 따라 첨가하였고 그리고 LS 칼럼이 장착된 VarioMACS 분리기 상에서 세포를 양성 선택하였다 (모두 Miltenyi). NK 세포의 순도를 확인하기 위하여, 양성 및 음성 분획 둘 모두를 CD56 형광 항체 접합체 (BD Biosciences)로 염색하였고 그리고 유세포 분석기로 분석하였다. 2-7일 동안 37℃, 5% CO2에서 6000IU.mL-1 인간 IL-2 (Boehringer Mannheim)의 존재에서 LAK 세포를 배양하였다. 상청액 제거 전, 얼음 상에서 30분 동안, 그 다음 얼음 상에서의 2% EDTA를 함유한 차가운 PBS에서 30분 동안 인큐베이션으로 세포를 수확하였다; RPMI-10에서 재현탁하기 전 첨가에 앞서 수확된 모든 세포를 2회 세척하였다.
크로뮴 방출 어세이
LAK 효과기 세포로 ADCC를 유발시키는 mAb의 능력을 결정하기 위하여, 크로뮴-표지된 표적으로서 인간 CD83으로 안정하게 형질감염된 KM-H2 세포주 또는 BB88 세포주를 이용하여 크로뮴 방출 어세이를 수행하였다. 10분 마다 부드럽게 교반하면서 37℃, 5% CO2에서 45분 동안 TD 완충액에서 100 μCi 51Cr으로 최대 1x106개 세포 mL- 1를 표지하였다. RPMI-10으로 세포를 2회 세척하였다. 도면 범례에서 명시화된 효과기:표적 (E:T) 비율로 V-바닥 96 웰 플레이트 (Nunc)에 LAK 효과기 세포 및 1-5 x 103 51Cr-표지된 표적 세포를 도말하였다. 명시된 바와 같이 항체 처리를 추가하였다. 차단 실험을 위하여, 15 μg.mL-1 비접합 항-인간 CD16 클론 3G8 또는 생쥐 IgG1k 동종형 대조를 150 μL의 최종 부피까지 첨가하였다. RPMI-10 (즉 자발적인 방출) 또는 1.67% 트리톤-X-100 (전체 방출) 중 하나에서 표적 세포를 함유하는 추가 웰을 제조하였다. 각각의 조건은 5회의 반복실험으로 러닝하였다. 실온에서 5분 동안 300 x g으로 원심분리하기에 앞서 도말된 세포를 4시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰로부터의 상청액 (50 μL)을 150 μL OptiPhase "SuperMix"와 혼합하였고 그리고 Trilux 1450-MicroBeta 신틸레이션 계수기로 분 당 51Cr 계수 (cpm)에 대해 분석하였다 (둘 모두 Wallac). 표준 공식: 용균 % = [(검사 샘플 cpm - 자발적 cpm)/(전체 cpm - 자발적 cpm)* 100]을 이용하여 특이적 세포 용균을 계산하였다. 데이터 및 평균의 표준 오차를 그래프로 나타내는 데에 GraphPad Prism 버전 5.01 소프트웨어를 이용하였다.
혼합된 림프구 반응 ( MLR )
2명의 인간 공여자로부터의 동결보존 PBMC를 해동시키고 20 μg.mL-1 DNAaseI (Roche)를 첨가하여 세포 응집을 예방하였다. 단-방향 MLR의 경우, MLR "자극물질"로서 역할하는 것으로 선별된 한 명의 공여자로부터의 세포에 3000cGy로 방사선을 조사하였다. 자극 세포 (1 x 105개 세포)를 조건 당 5번의 반복실험으로 180 μL의 최종 부피에서 검사되어야 할 항체와 함께, 96-웰 U-바닥 플레이트내 동일한 수의 비-방사선조사된 "응답" 세포에 첨가하였다. 쌍-방향 MLR의 경우, 둘 모두의 공여자로부터의 세포에 비-방사선조사 처리하였고 상기 세포는 동종이계 활성화에 기여한다. 37℃, 5% CO2에서 4일간 인큐베이션한 후, 20 μL의 부피의 1 μCi의 삼중 수소화된 티미딘 (Perkin Elmer)을 첨가하였다. 추가적인 16시간 동안 세포를 인큐베이션하고 이후, FilterMate 수확기 (PerkinElmer)를 이용하여 필터매트(filtermat)에 옮겼다. 5mL Betaplate Scint (Wallac)를 적용하고 Trilux 1450 Microbeta 계수기로 판독하기 전에 필터매트를 완전히 건조시켰다. 미가공 데이터를 무 항체 대조 웰에 대하여 표준화시키고 최대 증식 백분율로서 보고하였다.
실시예 2 3C12 mAb의 발생 및 특징분석
재조합 hCD83ECD-His에 대한 세 라운드의 선별로 거대 인간 미경험 scFv 면역글로불린 유전자 라이브러리 (Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95(11): 6157- 62, 1998)를 바이오패닝함으로써 scFv 파지 클론을 얻었다. 각각의 가변 영역에 대해 반-보존된 플랭킹 프레임워크 영역을 결합시키고, 그리고 또한 필수 벡터 중첩을 가진 프라이머를 이용하여, 이 클론을 PCR로 증폭시키고 그리고 In Fusion™ 시스템을 이용하여 mAbXpress 벡터 내로 클로닝하였다. 재구성된 IgG1 mAb를 CHO 세포에서 발현시키고, 그 다음 단백질-A 기반 정제를 시행하였다. SDS-PAGE 및 SEC에 의한 분석 (도 1)은 분자가 관찰 가능한 분해 또는 응집 없이, 이 일과성 발현 시스템에서 잘 발현되었다는 점을 보여주었다. 재구성된 항체는 인간 호지킨 림프종 유래 세포주, KM-H2에 의해 발현되는 세포 표면 CD83과의 특이적인 결합을 입증하였다 (도 2).
IgG1κ로서 항-CD83 scFv를 특이적으로 재구성하여 ADCC 반응을 제공하였다. 결과적 항체가 기능적이라는 점을 보여주기 위하여, 정제된 재조합 항-CD83 항체 (즉, 3C12 mAb)를 유세포 분석기에서 이용하여 CD83+ 인간 세포주 및 hCD83-형질감염된 세포와의 결합을 입증하였다 (도 2A). 추가로, 크로뮴 방출 기능 어세이에서, 3C12 mAb는 활성화된 천연 살해 (NK) 세포의 존재에서 KM-H2 세포의 유의적인 세포용해를 유도하였다 (도 2B). 하지만, 항-CD16 mAb, 3G8로 FcγIIIRa (CD16)의 차단시 이 항체-유도된 용균을 저지되었고, 이는 크로뮴 방출 어세이에서 3C12 작용의 시험관내 메커니즘에서 CD16에 대한 필요성을 입증한다.
실시예 3 항 -CD83 mAb , 3C12의 특징 분석
항-인간 CD83 mAb, 3C12의 특징을 지어 결합 친화도 및 특이성을 평가하였다 (표 4). 3C12는 CD83+ 세포주, KM-H2와 결합하였고 그리고 MLR에서 동종이계 T 세포 자극을 억제하였다.
Figure 112015084258850-pct00006
비-환원 조건 하에, 3C12는 웨스턴 블롯에서 재조합 인간 CD83ECD-His를 검출하지만, CD83이 열과 디설파이드 결합 환원에 의해 변성되었을 때 3C12 결합은 파괴된다. 이 관찰은 또한 상업적 항체 HB15e에도 해당된다 (도 3A). 결과적으로, 3C12 및 HB15e는 열과 디설파이드 환원에 의해 파괴되는 입체형태 에피토프와 결합하는 것으로 나타난다. CD83 mAb가 다른 항-CD83 시약과 관계 없이 또는 경쟁적으로 결합하는 지에 대해 결정하기 위하여, 3C12 IgG를 RPE에 접합시키고 그리고 FITC-접합된 상업적 항체 FIB15a 및 HB15e, 그리고 항-토끼-Ig로 검출된 RA83 다클론 항체와 경쟁적으로 어세이하였다. 3C12로의 경쟁적 차단은 HB15e의 전체 저해로서, 항체의 동시 첨가시 명확해졌고, 그리고 3C12의 존재에서 HB15a 및 RA83 결합의 부분적 저해가 관찰되었다. (도 3 덧붙인 표). 이것은 3C12 에피토프가 다른 항체의 것과 중첩되거나 공유된다는 점을 명시한다. 검사된 조건 하에, 임의의 항-CD83 시약의 첨가로 3C12 결합을 최소한으로 변경하였고, 여기서 3C12 신호의 미미한 감소만이 RA83의 경쟁에서 관찰되었다. 이러한 발견은 3C12 항체가 항원 결합을 위해 다른 항-CD83 시약과 경쟁하고 3C12 에피토프가 항체 발생에 대한 전통적인 기법으로부터 유래된 항체의 것과 유사하다는 점을 입증한다.
실시예 4 3C12 mAb의 생체내 평가
생체내 GVHD를 예방하는 3C12 mAb의 능력을 평가하기 위하여, 인간 PBMC의 이종 이식을 받은 SCID 생쥐에게 항체를 투여하였다. 3C12 항체의 투여량은 토끼 다클론 항체 RA83에 대해 이전에 결정된 0.125 mg의 최적 용량의 3배 초과 및 미만에서 달라졌다 (Wilson et al., Med. 206(2): 387-98, 2009). RA83에 대해 관찰된 바와 같이, 0.125 mg 3C12의 투여는 이종 GVHD에서, 이의 동종형 대조에 비해, 생존을 유의적으로 개선한다 (도 4A). 3C12 IgG의 용량을 0.375 mg까지 증가시키는 것은 감소된 치료 효능을 야기하였지만, 이러한 경향이 유의적이진 않았다. 61% 생존을 야기하는, 표준 0.125 mg 용량의 토끼 다클론 RA83 항체와 비교하여, 동일한 용량에서의 3C12 IgG는 효력이 덜하였으며, GVHD를 앓는 생쥐의 39%를 보호하였다 (도 4B). RA83의 용량을 1 mg까지 증가시키는 것은 100% 생존을 야기하였지만, 3C12 항체에 대한 동일한 증가는 단클론 항체의 효능을 없앴다 (도 4C). 1 mg의 3C12 IgG와 표준 용량 (0.125 mg)의 RA83으로 동물을 공동-치료하는 것도 또한, 효과적이지 않았다. 이것은 RA83의 영향이 고용량의 3C12의 존재에 의해 저해되었다는 점을 명시한다. 표준 이하 용량의 3C12가 효과적이었지만 생체내 RA83보다는 효력이 덜하였기 때문에, 3C12 항체는 mAb 효력을 개선키도록 설계된 항체 조작을 추가로 거쳤다.
실시예 5 mAb의 글리코-조작
ADCC에 대한 잠재적인 비푸코실화 항체를 만들기 위하여, 3C12-인코딩 cDNA로 CHO 세포 형질감염 동안에 강력한 글리코시다아제 저해제인, 키푸넨신을 첨가하였다. 도 5는 형질감염 동안 키푸넨신의 존재가 질량 분석법으로 평가된 바와 같이, 3C12 항체 (즉, 3C12.Kif)의 푸코오스 첨가를 효과적으로 차단한다는 점을 입증한다. N-글리코시다아제 F 분해에 의해 3C12.Kif 샘플로부터 방출되는 글리칸은 고 만노오스 글리칸의 가공처리가 없는 것으로 예상되는 바와 같이, GlcNAc2Man9에 상응하는, 대략 1905 m/z에서 우세한 신호를 생성하였다. 각각, GlcNAc2Man8 및 GlcNAc2Man7에 상응하는, 1742 m/z 및 1580 m/z에서의 더 작은 신호도 또한 있었다. 대조적으로, 야생형 3C12는 푸코오스-함유 탄수화물에 상응하는, 1485m/z에서 우세한 신호를 생성한다. 야생형 3C12의 분자량, 특이성 및 기능적 친화도를 구별할 수 있게 변경하는 것 없이 글리코-변형이 이루어졌다 (도 5B, C).
실시예 6 경쇄 셔플링에 의한 CD83 mAb의 친화도-조작
경쇄 셔플링에 의한 친화도 성숙을 활용하여 기능성을 증진시키기 위한 전략으로서 항원-항체 상호작용의 강도를 개선시켰다. 여기서, 3C12 VH DNA 서열을 인간 VL 서열의 cDNA 라이브러리 내로 클로닝하였고, 그리고 대략 107개의 특유의 VH-VL 쌍의 결과적 라이브러리가 친화도 유도 선별을 허용하도록 효모 세포의 표면 상에 디스플레이되었다. 단백질 수준에서, 다수의 이들 쌍은 CD83 항원과 결합하는 3C12의 능력에 유해한데, 그 이유는 <1%의 디스플레이된 scFv가 첫 번째 라운드의 효모 분류에서 항원 결합에 양성인 채로 남아있었기 때문이다 (도 6A). 각각의 scFv의 C-말단에서 발현된 SV5 태그의 형광 강도를 검출함으로써 결정되는, 효모의 표면 상에서의 scFv 발현 수준에 비해 hCD83ECD-His를 강하게 결합시키는 scFv를 디스플레이하는, 효모에 대해 강화시킴으로써, 재조합 CD83 항원에 대한 개선된 친화도를 가진 클론을 선별하였다. 이 방법에 의한 scFv 클론의 선별은 별개의 VL 서열을 가진 4개의 새로운 3C12 scFv 변이체를 생성하였고 그리고 야생형 scFv에 비해 결합 특성을 증진시켰다 (도 6B, C).
파파인 분해를 이용한 Fab 결합제로서 제조될 때, 친화도 성숙 3C12 mAb가 재구성된 전체 인간 IgG1은 Biacore SPR에 의해 결정된 바와 같이, 야생형 (3C12.WT)에 비해 3-20배 친화도 개선이 있을 것으로 추정하였다 (표 5). 항체 결합에 대한 가장 큰 개선은 동역학 해리-속도에 기인하며, 여기서 클론은 관찰된 koff에 대해 8 내지 15배 개선을 입증한다. 항체 결합-속도는 3C12 야생형 (Kon = 9.0 x 105M-1S- 1)의 것과 유사하게 남아있었으며, 여기서 대부분의 클론이 <1.4-배 개선을 나타내고 그리고 하나의 클론 (3C12.B)만이 결합-속도에서 대략 3-배 감소를 나타내었다 (Kon = 3.2 x 105 M-1S-1). 전반적인 친화도 개선에 관하여, 변이체 3C12.C는 최적 (즉, 가장 느린) 해리-속도 (Koff = 7.8 x 10-3s-1)를 비롯한 CD83에 대한 가장 높은 관찰 친화도 (KD = 6.1 x 10-9M)를 가졌고 그리고 추가로 특징지어졌다. 도 7A는 3C12.WT에 비해 3C12.C 결합의 이러한 개선이, 더 높은 결합 신호 강도 (즉, RU)로서, Koff 및 Kon-회합 단계 동안 VL 셔플된 변이체의 감소된 농도를 이용하여 성취된다는 점을 도표로 강조한다. 유사하게, Koff-의존 해리 단계 동안 3C12.C Fab의 경우 더 느린 해리-속도가 관찰된다. 전체 IgG 분자로서, 친화도 개선된 3C12.C IgG는 또한 3C12.WT IgG에 비해 KM-H2 세포와의 더 우수한 결합을 입증하였다 (도 7B).
Figure 112015084258850-pct00007
실시예 7: 글리코 - 및 친화도 조작된 3C12 변이체는 시험관내 효능을 개선시 킨다
글리코-조작된 3C12.kif 및 친화도 증진된 3C12.C 항체의 기능적 활성에 대한 개선을 ADCC 어세이로 그리고 MLR 내에서 평가하였다. 3C12.C 및 3C12.Kif 둘 모두는 크로뮴 방출 어세이에서 >10% 증가된 최대 NK-매개 ADCC를 생산하고, 그리고 3C12.WT보다 >25-배의 효력을 가졌다 (도 8A). 이와 유사하게, MLR 내에서 동종이계 자극의 결과로서 세포 증식은 3C12.WT보다 >5-배 증가된 효력을 가진 3C12.C 및 3C12.Kif IgG에 의해 저해되었다 (도 8B). 3C12.C의 경우 더 우수한 활성이 관찰되었으며, 이는 다클론 항체, RA83에 대해 필적하는 효력을 입증하였다.
실시예 8: 조작된 항-CD83 mAb 작용의 시험관내 메커니즘
주요 혈액 DC에 미치는 항-CD83 mAb의 효과를 결정하기 위하여, NK 세포를 활성화하기 위한 IL-2의 존재에서, 배양된 PBMC에 3C12.C 항체를 적용시켰다. 3C12.C IgG의 존재에서 배양된 세포는 활성화 마커 CMRF-44 및 CD83 (처리 항체와의 경쟁으로 인한 검출 신호 강도에서의 어떠한 감소에 대한 가능성을 제거하기 위하여, FITC-접합 3C12.C보다는, 비접합 3C12.C 및 이차 항-인간 Fc-FITC에 의해 검출됨; 도 9)에 의해 평가된 바와 같이, 무 또는 동종형 대조 처리 세포 (>80%)와는 대조적으로 활성화된 DC의 백분율 (58%)을 감소시켰다. 또한, 무 및 동종형-처리된 대조에서 존재하는 CD83밝은 발현 DC의 모집단은 3C12.C 처리 후 부재하였지만, 오로지 DC의 CD83어두운 모집단만이 관찰되었다. 세포 표면 CD83 발현 수준이 ADCC를 유도하는 3C12.C의 능력에 대한 기여 인자인지 결정하기 위하여, 변화하는 수준의 CD83 발현이 있는 안정하게 형질감염된 BB88 세포를 이용하였다. 이들 세포 그리고 다른 CD83-발현 세포주에 있는 CD83 분자의 수를 간접 면역형광 유세포 분석기를 이용하여 정량화하였고, 이는 BB88 형질감염체가 세포당 5,400개 분자 (MPC)에서 <2,300개 MPC의 CD83 항원으로 발현한다는 점을 보여주었다 (표 6). 따라서, 형질감염체는 불멸화된 세포주 및 주요 혈액 DC에서의 발현 수준 (10,000-50,000개 MPC)과 비교하여 훨씬 더 낮은 수준의 CD83을 보유한다. 조작된 3C12 변이체로 BB88 CD83 형질감염 세포주 각각을 특이적으로 용균시켰고, 이는 단지 낮은 수준의 세포 표면 CD83만이 ADCC를 촉발시키는 데에 요구된다는 점을 입증한다. 추가로, 3C12 mAb 변이체에 의해 유도되는 용균의 정도는 세포 표면 상에서 발현되는 CD83 분자의 수에 민감하다. 이것은 도 10에서 예시화되며, 여기서 <2,300개에서 3,600개 및 5,400개로 증가하는 항원 밀도는 증가된 5-25-배의 증가된 특이적 용균과 관련 있었다.
Figure 112015084258850-pct00008
실시예 9 친화도 성숙 항-CD83 mAb , 3C12.C는 이종 GVHD 모델에서 효과적이 다
생체내 GVHD를 예방하도록 친화도 증진된 3C12.C mAb를 평가하기 위하여, 인간 PBMC로 이식된 조건화 SCID 생쥐에게 VL 셔플된 3C12 변이체를 표준 0.125mg 용량으로 투여하였다. 45% (5/11) 생쥐가 보호된 다클론 시약, RA83과 비교하여, 3C12.C IgG는 54% (6/11)의 생쥐에서 GVHD를 예방한다는, 동일한 효력을 입증하였고, 그리고 27% (4/15) 생존을 보인 3C12.WT보다는 더 높은 효력을 입증하였다 (도 11). RA83 및 3C12.WT는 전형적으로 각각, >60% 및 40% 생존을 제공하므로 모든 코호트의 효능은 이전 발견 (Wilson et al, J. Exp. Med. 206(2): 387- 98., 2009)과 비교하여 감소된 것으로 나타났다. 이들 실험 조건 하에 오로지 3C12.C만이 동종형 대조와 유의적으로 상이하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Transbio Ltd The University of Queensland University of California <120> ANTI-CD83 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 514630 <150> US 61/759,780 <151> 2013-02-01 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 2 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT 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600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 tcctctcccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 47 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Met Ser Arg Gly Leu Gln Leu Leu Leu Leu Ser Cys Ala Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Ala Pro Ala Thr Pro Glu Val Lys Val Ala Cys Ser Glu Asp Val Asp 20 25 30 Leu Pro Cys Thr Ala Pro Trp Asp Pro Gln Val Pro Tyr Thr Val Ser 35 40 45 Trp Val Lys Leu Leu Glu Gly Gly Glu Glu Arg Met Glu Thr Pro Gln 50 55 60 Glu Asp His Leu Arg Gly Gln His Tyr His Gln Lys Gly Gln Asn Gly 65 70 75 80 Ser Phe Asp Ala Pro Asn Glu Arg Pro Tyr Ser Leu Lys Ile Arg Asn 85 90 95 Thr Thr Ser Cys Asn Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Leu Gln Asp Pro 100 105 110 Asp Gly Gln Arg Asn Leu Ser Gly Lys Val Ile Leu Arg Val Thr Gly 115 120 125 Cys Pro Ala Gln Arg Lys Glu Glu Thr Phe Lys Lys Tyr Arg Ala Glu 130 135 140 Ile Val Leu Leu Leu Ala Leu Val Ile Phe Tyr Leu Thr Leu Ile Ile 145 150 155 160 Phe Thr Cys Lys Phe Ala Arg Leu Gln Ser Ile Phe Pro Asp Phe Ser 165 170 175 Lys Ala Gly Met Glu Arg Ala Phe Leu Pro Val Thr Ser Pro Asn Lys 180 185 190 His Leu Gly Leu Val Thr Pro His Lys Thr Glu Leu Val 195 200 205 <210> 48 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Ser Arg Gly Leu Gln Leu Leu Leu Leu Ser Cys Ala Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Ala Pro Ala Thr Pro Glu Val Lys Val Ala Cys Ser Glu Asp Val Asp 20 25 30 Leu Pro Cys Thr Ala Pro Trp Asp Pro Gln Val Pro Tyr Thr Val Ser 35 40 45 Trp Val Lys Leu Leu Glu Gly Gly Glu Glu Arg Met Glu Thr Pro Gln 50 55 60 Glu Asp His Leu Arg Gly Gln His Tyr His Gln Lys Gly Gln Asn Gly 65 70 75 80 Ser Phe Asp Ala Pro Asn Glu Arg Pro Tyr Ser Leu Lys Ile Arg Asn 85 90 95 Thr Thr Ser Cys Asn Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Leu Gln Asp Pro 100 105 110 Asp Gly Gln Arg Asn Leu Ser Gly Lys Val Ile Leu Arg Val Thr Gly 115 120 125 Cys Pro Ala Gln Arg Lys Glu Glu Thr Phe Lys Lys Tyr Arg Ala Glu 130 135 140 Ile Val Leu Leu Leu Ala Leu Val Ile Phe Tyr Leu Thr Leu Ile Ile 145 150 155 160 Phe Thr Cys Phe Ala Arg Leu Gln Ser Ile Phe Pro Asp Phe Ser Lys 165 170 175 Ala Gly Met Glu Arg Ala Phe Leu Pro Val Thr Ser Pro Asn Lys His 180 185 190 Leu Gly Leu Val Thr Pro His Lys Thr Glu Leu Val 195 200 <210> 49 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Glu Thr Pro Gln Glu Asp His Leu Arg Gly Gln His Tyr His Gln 1 5 10 15 Lys Gly Gln Asn Gly Ser Phe Asp Ala Pro Asn Glu Arg Pro Tyr Ser 20 25 30 Leu Lys Ile Arg Asn Thr Thr Ser Cys Asn Ser Gly Thr Tyr Arg Cys 35 40 45 Thr Leu Gln Asp Pro Asp Gly Gln Arg Asn Leu Ser Gly Lys Val Ile 50 55 60 Leu Arg Val Thr Gly Cys Pro Ala Gln Arg Lys Glu Glu Thr Phe Lys 65 70 75 80 Lys Tyr Arg Ala Glu Ile Val Leu Leu Leu Ala Leu Val Ile Phe Tyr 85 90 95 Leu Thr Leu Ile Ile Phe Thr Cys Lys Phe Ala Arg Leu Gln Ser Ile 100 105 110 Phe Pro Asp Phe Ser Lys Ala Gly Met Glu Arg Ala Phe Leu Pro Val 115 120 125 Thr Ser Pro Asn Lys His Leu Gly Leu Val Thr Pro His Lys Thr Glu 130 135 140 Leu Val 145 <210> 50 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 caggtgtcca ctccgaggtg cagctgcagg ag 32 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gcggaggaca cggtgagcgt ggtcccttgg ccc 33 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ccggcgtgca ctccgagatc gtgatgaccc ag 32 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 gccacggtcc gcttgagttc cagcttggtc cc 32 <210> 54 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gactatgcag ctagcggtgc catggcagag gtgcagctgc aggagtcggg 50 <210> 55 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gttgagcctc cggacttaag gtcgactgag gacacggtga gcgtggtcc 49

Claims (28)

  1. CD83과 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한 단리된 또는 재조합 CD83 결합 단백질로서,
    상기 결합 단백질은 (a) 서열 번호:1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 (b) 서열 번호:7에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 CD83 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, VL 및 VH는 단일 폴리펩티드 사슬 내에 있는 것인 CD83 결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    (i) 단쇄 Fv 단편 (scFv); 또는
    (ii) 이합체 scFv (di-scFv); 또는
    (iii) Fc 또는 중쇄 불변 도메인 (CH) 2 및/또는 CH3에 연결된 (i) 또는 (ii); 또는
    (iv) 면역 효과기 세포와 결합한 단백질에 연결된 (i) 또는 (ii)인 것인,
    CD83 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, VL 및 VH는 별개의 폴리펩티드 사슬 내에 있는 것인 CD83 결합 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    (i) 디아바디; 또는
    (ii) 트리아바디; 또는
    (iii) 테트라바디; 또는
    (iv) Fab; 또는
    (v) F(ab')2; 또는
    (vi) Fv; 또는
    (vii) Fc 또는 CH2 및/또는 CH3에 연결된 (i) 내지 (vi) 중 하나; 또는
    (viii) 면역 효과기 세포와 결합한 단백질에 연결된 (i) 내지 (vi) 중 하나인 것인 CD83 결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 항체인 것인 CD83 결합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 키메라, 탈-면역화, 인간화, 유사인간화(synhumanized), 인간, 영장류화, 또는 합성 단백질인 것인 CD83 결합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 인간 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증진된 수준의 효과기 기능을 유도할 수 있고 및/또는 인간 IgG1 Fc 영역과 비교하여 연장된 반감기를 부여할 수 있는 Fc 영역을 포함하는 것인 CD83 결합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 서열 번호: 29에 나타낸 중쇄 서열 및 서열 번호: 32에 나타낸 경쇄 서열을 포함한 항체와 CD83의 결합을 경쟁적으로 저해하거나, 또는 상기 항체와 동일한, CD83내 에피토프와 결합하는 것인 CD83 결합 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 화합물과 접합되는 것인 CD83 결합 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 네이키드(naked) 결합 단백질인 것인 CD83 결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 CD83 결합 단백질을 인코딩하는 단리된 또는 재조합 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 서열 번호: 35 또는 44에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호: 35 또는 44에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 핵산을 포함하는 것인 핵산.
  14. 프로모터와 작동가능하게 연결되는 제13항의 핵산을 포함하는 발현 구조체.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 CD83 결합 단백질을 발현하는 단리된 세포 또는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 CD83 결합 단백질을 발현하도록 유전적으로-변형된 재조합 세포.
  16. 제15항에 있어서, 서열 번호: 35 또는 44에 나타낸 뉴클레오티드 서열를 포함하는 세포.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 CD83 결합 단백질 및 적합한 담체를 포함하는, 대상에서 알러지, 천식, 조직 또는 기관 이식편의 거부, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 혈관염, 크론 병(Morbus Crohn), 궤양성 결장염, 베크테로 병(Morbus Bechterew), 전신 홍반성 루푸스, 건선, 류마티스 관절염, 인슐린-의존 진성 당뇨병 및 AIDS로 구성된 군에서 선택된 CD83-관련 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 담체는 제약학적으로 허용되는 것인 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조직 또는 기관 이식편의 거부는 이식편 대 숙주 병의 결과로서 발생하는 것인 약학 조성물.
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