JP2016507521A - 抗ｃｄ８３抗体及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＣＤ８３に結合するタンパク質、及び例えば治療、予防、診断、または予後におけるその使用に関する。【選択図】なし

Description

本開示は、ＣＤ８３に結合するタンパク質、及び例えば治療、予防、診断、または予後におけるその使用に関する。
ＣＤ８３
ＣＤ８３は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する、４５ｋＤａのＩ型膜貫通型糖タンパク質（ｔｙｐｅ−Ｉ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。ＣＤ８３は成熟樹状細胞（ＤＣ）上で優勢に発現する細胞表面マーカーである。ＣＤ８３は未熟血管樹状細胞（ＢＤＣ）及び単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）での発現は最小限である。成熟樹状細胞上で優勢に発現するため、ＣＤ８３は免疫療法での魅力的な標的となっている。
樹状細胞、並びに自然免疫反応及び獲得免疫反応の制御
樹状細胞は自然免疫系及び後天性（獲得）免疫系と結合する。自然免疫は異物に反応する非特異的免疫活性化の第一因子である。未熟樹状細胞は抗原の取り込みを専門とし、末梢組織を経由して運搬され、抗原の監視を連続して行うことができる。最初のＴ細胞の応答を惹起できる能力のためにプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる樹状細胞は、免疫活性を開始させる最低量の抗原を必要とするだけである。
未熟樹状細胞は感染性物質及び異物からの様々なシグナルに順応し、樹状細胞の分化及び成熟（活性化としても知られる）を引き起こす。成熟樹状細胞は抗原を捕捉することができるが、この活性化プロセスは、これらの細胞が抗原を取り込む能力を低下させ、その代わりにサイトカイン放出を上方制御し、マーカー発現を活性化し、かつ抗原に対する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の提示を処理する。処理された抗原を有する成熟樹状細胞は効率的にＴ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球細胞、及び自然免疫系の他の細胞を補充し、抗原への応答を増幅させる。
樹状細胞の分化及び活性化において発現した分子は、自然免疫及び獲得免疫の結合に役立つ。成熟樹状細胞はケモカイン受容体の発現及びＣＤ５４等の接着分子の上方制御を行い、リンパ球との相互作用を増加させるために、リンパ節の樹状細胞の移動を促進する。ＣＤ８０及びＣＤ８６等の副刺激分子の発現は、Ｔ細胞活性化及び抗原特異的免疫応答の開始に必要な共刺激性シグナルを提供する。
ＣＤ４０のライゲーションは共刺激性分子の発現を向上し、ＩＬ−１２の放出を誘起して、Ｔ細胞の活性化を促進する；分化したＴ細胞は次いで、獲得免疫応答の複雑な相互作用を指示する。
樹状細胞は免疫応答制御を行うため、活性化樹状細胞は、悪性腫瘍及び自己免疫疾患を含む多くの免疫疾患に介入する標的と見なすことができる。
上述より、当業者には、樹状細胞を標的とする化合物は免疫応答を調節し得ることが明らかとなるであろう。したがって、例えば治療、予防、診断及び予後の使用のために、樹状細胞を結合する化合物が望ましい。
本開示は発明者らの、ＣＤ８３に特異的に結合するヒト抗体（３Ｃ１２ ｍＡｂ）の産生を基にしている。３Ｃ１２ ｍＡｂはヒトｓｃＦｖ配列のファージディスプレイライブラリーに由来する：得られたｓｃＦｖファージクローンをＩｇＧｌ ｍＡｂとして再編成した。
３Ｃ１２ ｍＡｂは競合結合アッセイにおいて、そのポリクロナール等価体であるＲＡ８３を負かし、ヒトＰＢＭＣを異種移植したＳＣＩＤマウス中の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の開始を遅らせることが示された。
３Ｃ１２ ｍＡｂの治療効果を向上させるために、発明者らは軽鎖の親和性成熟を行い、３Ｃ１２ ｍＡｂのＣＤ８３への親和性を向上させた。異なる軽鎖可変領域（ＶＬ）配列及び野生型ｓｃＦｖと比較して向上した結合特性を有する、４つの新しい３Ｃ１２ｓｃＦｖ変異体（３Ｃ１２．Ｂ、３Ｃ１２．Ｃ、３Ｃ１２．Ｄ及び３Ｃ１２．Ｅ）が得られた。親和性成熟抗体では、ＶＬのフレームワーク（ＦＲ）領域及び相補性決定領域（ＣＤＲ）の置換が行われていた。これらの置換の効果は予測不可能であった。
発明者らはまた、ポリクローナル抗体であるＲＡ８３に匹敵する力価を有する脱フコシル化３Ｃ１２．Ｃ ｍＡｂにより、向上したエフェクター機能レベルを誘導可能な３Ｃ１２ ｍＡｂの形態も産生した。
本開示は概して、ＣＤ８３に特異的に結合する抗原結合領域を含むＣＤ８３結合タンパク質に関する。
一実施例において、本開示は、ＣＤ８３に特異的に結合する抗原結合領域を含むＣＤ８３結合タンパク質を提供する。ここで結合タンパク質は、配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
一実施例において、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号：１に示すアミノ酸配列のフレームワーク領域と少なくとも９０％同一である配列を含む。
本開示は更にまたは代わりに、ＣＤ８３に特異的に結合する抗原結合領域を含むＣＤ８３結合タンパク質を提供する。ここで、結合タンパク質は配列番号：１に示すアミノ酸配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
一実施例において、ＶＨ ＣＤＲ１は配列番号：１のアミノ酸３１〜３５を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号：１のアミノ酸５０〜５９を含み、及びＶＨ ＣＤＲ３は配列番号：１のアミノ酸９９〜１０６を含む。
一実施例において、ＶＨ ＣＤＲ１は配列番号：２に示すアミノ酸配列からなり、ＶＨ ＣＤＲ２は配列番号：３に示すアミノ酸配列からなり、及びＶＨ ＣＤＲ３は配列番号：４に示すアミノ酸配列からなる。
本開示は更にまたは代わりに、ＣＤ８３に特異的に結合する抗原結合領域を含むＣＤ８３結合タンパク質を提供する。ここで、結合タンパク質は以下を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む：
（ｉ） 配列番号：５、６、７、８、もしくは９に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも９０％同一である配列；または
（ｉｉ） 配列番号：５、６、７、８、もしくは９に示すアミノ酸配列のいずれか一つにある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または
（ｉｉｉ）配列番号：１０に示すコンセンサス配列、または
（ｉｖ） ３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号：２６、２７もしくは２８に示すコンセンサス配列である）。
一実施例において、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号：５、６、７、８、または９に示すアミノ酸配列のいずれか一つのフレームワーク領域と少なくとも９０％同一である配列からなる。
一実施例において、ＶＬ ＣＤＲ１は配列番号：５、６、７、８、または９のアミノ酸２４〜３４からなり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号：５、６、７、８、または９のアミノ酸５０〜５６からなり、及びＶＬ ＣＤＲ３は配列番号：５、６、７、８、または９のアミノ酸８９〜９７からなる。
一実施例において、ＶＬ ＣＤＲ１は配列番号：１１、１４，１７、２０、または２３に示すアミノ酸配列からなり、ＶＬ ＣＤＲ２は配列番号：１２、１５，１８、２１、または２４に示すアミノ酸配列からなり、及びＶＬ ＣＤＲ３は配列番号：１３、１６、２９、２２、または２５に示すアミノ酸配列からなる。
一実施例において、ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、位置２にアラニン（Ａ）もしくはスレオニン（Ｔ）、及び／または位置７にリジン（Ｋ）もしくはセリン（Ｓ）もしくはアルギニン（Ｒ）、及び／または位置８にアスパラギン（Ｎ）もしくはセリン（Ｓ）、及び／または位置９にチロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）もしくはトリプトファン（Ｗ）、及び／または位置１０にフェニルアラニン（Ｆ）もしくはロイシン（Ｌ）を含む。
一実施例において、ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は位置２にスレオニン（Ｔ）もしくはアラニン（Ａ）、及び／または位置４にアスパラギン（Ｎ）もしくはセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）を含む。
一実施例において、ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、位置２にグルタミン（Ｑ）もしくはリジン（Ｋ）、及び／または位置３にロイシン（Ｌ）もしくはバリン（Ｖ）もしくはシステイン（Ｃ）、及び／または位置４にグリシン（Ｇ）もしくはアスパラギン（Ｎ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）もしくはセリン（Ｓ）、及び／または位置５にアラニン（Ａ）もしくはセリン（Ｓ）もしくはアルギニン（Ｒ）、及び／または位置６にチロシン（Ｙ）もしくはフェニルアラニン（Ｆ）もしくはアラニン（Ａ）、及び／または位置８にチロシン（Ｙ）もしくはロイシン（Ｌ）を含む。
一実施例において、ＶＨ及びＶＬは単一ポリペプチド鎖である。例えば、ＣＤ８３結合タンパク質は
（ｉ） 一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；または
（ｉｉ） 二量体ｓｃＦｖ（ジ‐ｓｃＦｖ）；または
（ｉｉｉ） Ｆｃまたは重鎖定常領域（ＣＨ）２及び／もしくはＣＨ３に結合した（ｉ）または（ｉｉ）；または
（ｉｖ） 免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に結合した（ｉ）または（ｉｉ）
である。
別の例において、ＶＬ及びＶＨは別々のポリペプチド鎖である。例えば、ＣＤ８３結合タンパク質は
（ｉ） 二重特異性抗体；または
（ｉｉ） 三重特異性抗体；または
（ｉｉｉ） 四重特異性抗体；または
（ｉｖ） Ｆａｂ；または
（ｖ） Ｆ（ａｂ’）２；または
（ｖｉ） Ｆｖ；または
（ｖｉｉ） ＦｃまたはＣＨ２及び／もしくはＣＨ３に結合した（ｉ）〜（ｖｉ）の一つ；または
（ｖｉｉｉ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に結合した（ｉ）〜（ｖｉ）の一つ
である。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質はＣＤ８３への抗体の結合を競合的に阻害する抗原結合領域からなり、該抗体は、配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３０に示す軽鎖配列を含む。
本開示の代表的なＣＤ８３結合タンパク質は、本開示のＶＨ、及びキメラ化、脱免疫化、ヒト化、ヒト、シンヒューマナイズドまたは霊長類化した軽鎖もしくはＶＬからなる。
本開示の代表的な一形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は抗体である。抗体は以下を含んでよい：
（ｉ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：５に示すＶＬ配列；または
（ｉｉ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：６に示すＶＬ配列；または
（ｉｉｉ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：７に示すＶＬ配列；または
（ｉｖ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：８に示すＶＬ配列；または
（ｖ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：９に示すＶＬ配列；または
（ｖｉ） 配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３０に示す軽鎖配列；または
（ｖｉｉ） 配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３１に示す軽鎖配列；または
（ｖｉｉｉ）配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３２に示す軽鎖配列；または
（ｉｘ） 配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３３に示す軽鎖配列；または
（ｘ） 配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３４に示す軽鎖配列。
一実施例において、抗体は、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞（ＤＣ））及び／またはリンパ球（例えばＴ細胞）等の免疫細胞と結合する細胞を枯渇させる。
本明細書の開示から当業者には明らかとなるとおり、代表的なＣＤ８３結合タンパク質は、毒性化合物と結合せずに該タンパク質が結合する細胞を枯渇させることができる。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質は、エフェクター機能、例えば抗体が結合する細胞を殺すエフェクター機能を誘発することができる。代表的なエフェクター機能としては、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が挙げられる。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質はＡＤＣＣを誘発することができる。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質はエフェクター機能を誘発することができる抗体Ｆｃ領域を含む。例えば、前記エフェクター機能はＦｃによって仲介されるエフェクター機能である。一実施例において、Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域もしくはＩｇＧ３ Ｆｃ領域、またはハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ２ Ｆｃ領域である。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質は野生型ヒトＩｇＧ１及び／またはヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域として、類似（例えば顕著に異なるわけではない、もしくは約１０％以内）の、または同一レベルのエフェクター機能を誘発することができる。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質はレベルが向上したエフェクター機能を誘発することができる。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質により誘発されたエフェクター機能のレベルは、ＣＤ８３結合タンパク質が野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む場合、ＣＤ８３結合タンパク質のそれに比例して向上する。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質は脱フコシル化される、または脱フコシル化したＦｃ領域を含む。
別の実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質の脱フコシル化の程度は、タンパク質のフコシル化の程度を低下させるために、変質していないヒトまたはＣＨＯ細胞により産生された抗体と比較して、低い。本実施例によれば、フコシル化の程度が低いことは、ＣＤ８３結合タンパク質を含む組成物中において、フコシル化ＣＤ８３結合タンパク質の割合（例えば、フコースを含む抗体のＡｓｎ２９７に付着したグリコシル基）は、タンパク質のフコシル化の程度を低下させるために、変質していないヒトまたはＣＨＯ細胞により産生された場合より低いことを意味すると理解されよう。
例えば、ＣＤ８３結合タンパク質は、配列番号：１に示す（または配列番号：３５に記述されているヌクレオチド配列によりコードされた）アミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号：５、６、７、８、もしくは９のいずれかに示す（または配列番号：３６、３７、３８、３９、もしくは４０に示すヌクレオチド配列によりコードされた）アミノ酸配列を含むＶＬを含む脱フコシル化抗体である。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質は、配列番号：１に示す（または配列番号：３５に示されるヌクレオチド配列によりコードされた）アミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号：５、６、７、８、もしくは９のいずれかに示す（または配列番号：３６、３７、３８、３９、もしくは４０に示すヌクレオチド配列によりコードされた）アミノ酸配列を含むＶＬを含み、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の検出レベルを発現しない（またはそれを低いレベルで発現する）哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）により発現される、またはキフネンシン等のＮ−グリカン処理の阻害剤により処理される。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質は、抗体により誘発されるエフェクター機能を高める１つ以上のアミノ酸配列の置換を含むＦｃ領域を含む。例えば、１つ以上のアミノ酸配列の置換は、置換を含まないＦｃ領域と比較して、Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）に対するＦｃ領域の親和性を高める。例えば、置換を含まないＦｃ領域と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ及びＦｃγＲＩＩＩａからなる群から選択されるＦｃγＲに対するＦｃ領域の親和性を高める。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は裸の抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は完全長抗体である。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、平衡解離定数（ＫＤ）が５×１０−７Ｍ以下、例えば４．５×１０−７Ｍ以下、例えば４×１０−７Ｍ以下、例えば３．５×１０−７Ｍ以下、例えば３×１０−７Ｍ以下、例えば２．５×１０−７Ｍ以下、例えば２×１０−７Ｍ以下、例えば１．５×１０−７Ｍ以下、例えば１×１０−７Ｍ以下、例えば９．５×１０−８Ｍ以下、例えば９×１０−８Ｍ以下、例えば８．５×１０−８Ｍ以下、例えば８×１０−８Ｍ以下、例えば７．５×１０−８Ｍ以下、例えば７×１０−８Ｍ以下、例えば６．５×１０−８Ｍ以下、例えば６×１０−８Ｍ以下、例えば５．５×１０−８Ｍ以下、例えば５×１０−８Ｍ以下、例えば４．５×１０−８Ｍ以下、例えば４×１０−８Ｍ以下、例えば３．５×１０−８Ｍ以下、例えば３×１０−８Ｍ以下、例えば２．５×１０−８Ｍ以下、例えば２×１０−８Ｍ以下、例えば１．５×１０−８Ｍ以下、例えば１×１０−８Ｍ以下、例えば９．５×１０−９Ｍ以下、例えば９×１０−９Ｍ以下、例えば８．５×１０−９Ｍ以下、例えば８×１０−９Ｍ以下、例えば７．５×１０−９Ｍ以下、例えば７×１０−９Ｍ以下、例えば６．５×１０−９Ｍ以下、例えば６×１０−９Ｍ以下、例えば５．５×１０−９Ｍ以下、例えば５×１０−９ＭのＣＤ８３に結合する。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、ＫＤが約６×１０−９Ｍ以下、例えば６．１×１０−９ＭのＣＤ８３に結合する。
一実施例において、ＫＤは約５．５×１０−９Ｍと約６．５×１０−９Ｍの間、例えば約６×１０−９Ｍである。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、結合速度（Ｋｏｎ）が５×１０６Ｍ−１ｓ−１以下、例えば４．５×１０６Ｍ−１ｓ−１以下、例えば４×１０６Ｍ−１ｓ−１以下、例えば３．５×１０６Ｍ−１ｓ−１以下、例えば３×１０６Ｍ−１ｓ−１以下、例えば２．５×１０６Ｍ−１ｓ−１以下、例えば２×１０６Ｍ−１ｓ−１以下、例えば１．５×１０６Ｍ−１ｓ−１以下、例えば１×１０６Ｍ−１ｓ−１以下、例えば９．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば９×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば８．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば８×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば７．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば７×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば６．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば６×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば５．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば４．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば４×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば３．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば３×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば２．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば２×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば１．５×１０５Ｍ−１ｓ−１以下、例えば１×１０５Ｍ−１ｓ−１のＣＤ８３と結合する。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質はＫｏｎが約１．５×１０６Ｍ−１ｓ−１以下のＣＤ８３と結合する。一実施例において、ＫＤは約１．２×１０６Ｍ−１ｓ−１ １．６×１０６Ｍ−１ｓ−１の間、例えば約１．３×１０６Ｍ−１ｓ−１である。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、解離速度（Ｋｏｆｆ）が１．５×１０−１ｓ−１以下、例えば１×１０−１ｓ−１以下、例えば９．５×１０−２ｓ−１以下、例えば９×１０−２ｓ−１以下、例えば８．５×１０−２ｓ−１以下、例えば８×１０−２ｓ−１以下、例えば７．５×１０−２ｓ−１以下、例えば７×１０−２ｓ−１以下、例えば６．５×１０−２ｓ−１以下、例えば６×１０−２ｓ−１以下、例えば５．５×１０−２ｓ−１以下、例えば５×１０−２ｓ−１以下、例えば４．５×１０−２ｓ−１以下、例えば４×１０−２ｓ−１以下、例えば３．５×１０−２ｓ−１以下、例えば３×１０−２ｓ−１以下、例えば２．５×１０−２ｓ−１以下、例えば２×１０−２ｓ−１以下、例えば１．５×１０−２ｓ−１以下、例えば１×１０−２ｓ−１以下、例えば９．５×１０−３ｓ−１以下、例えば９×１０−３ｓ−１以下、例えば８．５×１０−３ｓ−１以下、例えば８×１０−３ｓ−１以下、例えば７．５×１０−３ｓ−１以下、例えば７×１０−３ｓ−１であるＣＤ８３から解離する。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、Ｋｏｆｆが約８×１０−３ｓ−１以下であるＣＤ８３から解離する。
一実施例において、ＫＤは約７×１０−３ｓ−１及び約９×１０−３ｓ−１の間、例えば約８×１０−３ｓ−１である。
本開示はまた、本開示の抗体の断片、変異体及び誘導体を含む。
一実施例において、本開示は、本開示にしたがったＣＤ８３結合タンパク質、及び適当なキャリア、例えば製薬上許容できるキャリア、希釈剤又は付形剤からなる製薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＣＤ８３結合タンパク質をコードする単離又は組換え核酸を提供する。
代表的な核酸配列は本開示のＣＤ８３結合タンパク質をコードする文脈で議論され、本開示の現在の例にmutatis mutandisを利用することとなっている。
一実施例において、本開示の核酸は配列番号：３５〜４６のいずれか一つに示すヌクレオチド配列を含む。
本開示はまた、中程度又は高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下にて、本開示の核酸をハイブリダイゼーション可能な核酸を提供する。
本開示はまた、本開示の単離核酸の断片、同族体、及び誘導体を含む。
本開示はまた、本開示の単離したまたは組み換えを行った核酸、及び核酸に作用可能に結合したプロモーター等の１つ以上の追加のヌクレオチド配列からなる遺伝子構築物を提供する。
一実施例において、遺伝子構造は発現ベクター、及び本開示の単離したまたは組み換えを行った核酸を含む発現構築物である。ここで、前記単離したまたは組み換えを行った核酸は前記発現ベクター内の１つ以上の調節核酸に作用可能に結合する。
一実施例において、本開示の遺伝子構造は、プロモーターに作用可能に結合したポリペプチド（例えばＶＨを含む）をコードする核酸、及びプロモーターに作用可能に結合した別のポリペプチド（例えばＶＬを含む）をコードする核酸を含む。
別の実施例において、遺伝子構造は、例えば５’から３’の方向に作用可能に結合した以下の成分を含むバイシストロニックな遺伝子構造である：
（ｉ） プロモーター；
（ｉｉ） 第一のポリペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）内部リボソーム進入部位；及び
（ｉｖ） 第二のポリペプチドをコードする核酸。
例えば、第一のポリペプチドはＶＨを含み、第二のポリペプチドはＶＬを含む、または第一のポリペプチドはＶＬを含み、第二のポリペプチドはＶＨを含む。
本開示はまた、一方が第一のポリペプチド（例えばＶＨを含む）をコードし、もう一方が第二のポリペプチド（例えばＶＬを含む）をコードする別々の遺伝子構築物を考慮する。例えば、本開示はまた、
（ｉ） プロモーターに作用可能に結合したポリペプチド（ＶＨを含む）をコードする核酸を含む第一の遺伝子構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作用可能に結合したポリペプチド（ＶＬを含む）をコードする核酸を含む第二の遺伝子構築物
からなる組成物を提供する。
本開示はまた、本開示に従った遺伝子構築物を含む細胞を提供する。
一実施例において、本開示は、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を発現させる単離細胞、または本発明のＣＤ８３結合タンパク質を発現させる遺伝子組み換え細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）を提供する。
一実施例において、前記細胞は本開示の遺伝子構築物、または
（ｉ） プロモーターに作用可能に結合したポリペプチド（ＶＨを含む）をコードする核酸を含む第一の遺伝子構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作用可能に結合したポリペプチド（ＶＬを含む）をコードする核酸を含む第二の遺伝子構築物
を含み、ここで、第一及び第二のポリペプチドは本開示の抗体または抗原結合断片を形成する。
遺伝子構築物は細胞内へと組み込むことができる、またはエピソームに残ることができる。
本開示の細胞の例としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞が挙げられる。
本開示は更に、本開示のＣＤ８３結合タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、ＣＤ８３結合タンパク質の産生にとって十分な条件下にて本開示の遺伝子構築物を保持することからなる。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質の製造方法は、本開示の細胞を、ＣＤ８３結合タンパク質の産生に十分な条件下にて培養すること、及び任意に分泌させることを含む。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質の製造方法は更に、ＣＤ８３結合タンパク質を単離することを含む。
本開示は更に、組み換えＣＤ８３結合タンパク質の製造方法を提供し、該方法は
（ｉ） 前記宿主細胞内で組み換え免疫グロブリンまたは抗体が発現するように、本開示による発現ベクター含有細胞を培養すること；及び
（ｉｉ）組み換えＣＤ８３結合タンパク質を単離すること
の工程を含む。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質の製造方法は更に、ＣＤ８３結合タンパク質を製薬上許容できるキャリアと配合することを含む。
本開示はまた、被験体の疾患または状態の治療方法または予防的治療方法を提供し、該方法は、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を被験者に投与することで、疾患または状態を治療または予防することを含む。
一実施例において、被験体は哺乳類である。
一実施例において、哺乳類はヒトである。
一実施例において、哺乳類は治療または予防を必要としている。
一実施例において、必要な哺乳類は疾患または状態に苦しんでいる。
一実施例において、必要な哺乳類は疾患もしくは状態の進展、またはその再発の危険性を有する。
本開示は更に、本開示のＣＤ８３結合タンパク質の使用、または薬剤での本開示の組成物を提供する。
本開示は更にまたは代わりに、被験体の疾患または状態の治療用薬剤の製造における本開示のＣＤ８３結合タンパク質の使用を提供する。
本開示はまた、被験体の疾患または状態の治療に使用する本開示のＣＤ８３結合タンパク質を提供する。
一実施例において、疾患または状態はＣＤ８３が媒介する疾患または状態である。
一実施例において、疾患または状態は自己免疫疾患もしくは状態、または炎症性疾患もしくは状態である。例えば、疾患または状態には重症筋無力症、多発性硬化症、血管炎、クローン病または潰瘍性大腸炎等の慢性炎症性腸疾患、ベヒテレフ病、及び全身性エリテマトーデス等のＨＬＡ Ｂ２７が関連する自己免疫疾患、乾癬等の皮膚病、関節リウマチ、及びインスリン依存性真性糖尿病がある。
一実施例において、疾患または状態は、被験体内の免疫系の機能障害もしくは好ましくない機能、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞（ＤＣ））及び／もしくはリンパ球（例えばＴ細胞）が関係する細胞応答が原因である。
別の実施例において、疾患または状態は組織移植片または臓器移植片の拒絶である。例えば、移植片対宿主病または臓器移植における拒絶反応（ｈｏｓｔ ｖｅｒｓｕｓ ｇｒａｆｔ ｄｉｓｅａｓｅ）の結果、組織または臓器移植の拒絶が生じる。
別の実施例において、疾患または状態は幹細胞移植、例えば造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）または臍帯血移植（ＵＣＢＴ）の拒絶である。例えば、移植片対宿主病または臓器移植における拒絶反応（ｈｏｓｔ ｖｅｒｓｕｓ ｇｒａｆｔ ｄｉｓｅａｓｅ）の結果、幹細胞移植の拒絶が生じる。ＨＳＣＴは、例えば骨髄から直接行ってもよく、または骨髄から細胞動員を行った末梢血（例えばＧ−ＣＳＦ）から行ってもよい。
一実施例において、該方法は、有効量のＣＤ８３結合タンパク質、例えば治療上有効な量のＣＤ８３結合タンパク質をドナー及び／またはレシピエントに投与することを含む。移植片は、移植の前または後に、有効量のＣＤ８３結合タンパク質とエクスビボまたはインビボで接触してよい。
本開示はまた、同種異系移植片の、免疫活性の下方制御方法を提供し、該方法は、移植片をＣＤ８３結合タンパク質または本開示の組成物と接触させることを含む。
一実施例において、同種異系移植片は造血幹細胞移植片である。
一実施例において、移植片はＣＤ８３結合タンパク質または本開示の組成物とエクスビボで接触する。
別のまたは追加の例において、移植片のレシピエントには、移植片の移植前、及び／または同時に、及び／または後でＣＤ８３結合タンパク質または本開示の組成物が投与される。
３Ｃ１２ ＩｇＧ１の発現及び精製の分析 （Ａ）非還元（ＮＲ）及び２−メルカプトエタノールで還元した（Ｒ）培養上清液の試料（ｉ、ｉｉｉ）、並びに５μｇのアフィニティー精製材料（ｉｉ、ｉｖ）を４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブルーＲ２５０で染色した。（Ｂ）プロテインＡで精製した組み換え３Ｃ１２抗体の、２８０ｎｍ（上面）及び２１５ｎｍ（中面）の両方における分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、並びに２１５ｎｍ（下面）におけるゲル濾過標準。試料は、検出可能な凝集がないこと、及び１４５ｋＤａの予測分子量を示す。 抗ヒトＣＤ８３ ＩｇＧである精製３Ｃ１２の機能分析 （Ａ）２５μｇ．ｍＬ−１の３Ｃ１２ ＩｇＧ１がＣＤ８３＋細胞系のＫＭ−Ｈ２及びＬ４２８、並びにヒトＣＤ８３を導入したＦＤＣＰ１細胞（ＦＤＣＰ１ ＴＦ）に結合する。非導入ＦＤＣＰ１細胞（ＣＤ８３−）では、３Ｃ１２とアイソタイプＩｇＧ１対照との間に違いは見られない。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（Ｂ）３Ｃ１２ ＩｇＧ１は、エフェクターと標的細胞の比率が５：１において、ＣＤ１６非依存性メカニズムにより、ハーセプチン（陰性対照）と比較して、ＫＭ−Ｈ２細胞系の著しい細胞溶解を引き起こした。統計的有意性は、両方向ＡＮＯＶＡにより求めた。エラーバーは５回の反復試験の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。 ３Ｃ１２は別のＣＤ８３抗体とオーバーラップする立体構造エピトープを認識する （Ａ）５μｇの（ｉ）変性した、または（ｉｉ）天然組み換えヒトＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓを検出するために、ＣＤ８３抗体のウェスタンブロットを使用した。非変性ＣＤ８３は１２％ゲル上に３つのスメアバンド（３０ｋＤａ、２２ｋＤａ、１９ｋＤａ）として現れる。これは、３つの潜在的Ｎ−結合グリコシル化モチーフのグリコシル化におけるホモ二量体化及び変動性の結果である。抗ヒトＩｇＧ ＩＲＤ８００二次抗体のみを陰性対照として使用した。（表を挿入）。ＫＭ−Ｈ２細胞へのＣＤ８３抗体の同時添加の効果、並びに３Ｃ１２及び他の抗体の平均蛍光強度において得られた変化を、割合の低下で示す。 ３Ｃ１２ ｍＡｂは異種ＧＶＨＤモデルにおけるＳＣＩＤマウスのインビボでの生存を高める ＣＤ８３抗体またはアイソタイプをマッチさせた対照を、ヒトＰＢＭＣを移植したＳＣＩＤマウスに０日目に投与した後の、動物の生存。コホート当たりに使用する動物の数を括弧内に示し、有意差（ｐ＜０．０５）にはアスタリスクを付けている。（Ａ）アイソタイプコントロール（抗ヒトＨＥＲ２；ハーセプチンＩｇＧ）と比較した、３Ｃ１２ ＩｇＧの投与量最適化。（Ｂ）ウサギポリクロナールＲＡ８３抗体または非特異的ヒウサギウサギＩｇＧ（ＲＡｎｅｇ）と、３Ｃ１２ ＩｇＧ ０．１２５ｍｇの投与量との比較。表示したデータは、それぞれが各コホートに最低５匹の動物を含む、５つの独立した実験からプールする。（Ｃ）投与量１ｍｇのＣＤ８３抗体、並びに投与量を組み合わせた３Ｃ１２及びＲＡ８３治療の投与。 キフネンシンによる３Ｃ１２の糖修飾により、低フコースＩｇＧが得られる （Ａ）フコースは、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析により求めた対照３Ｃ１２トランスフェクション（３Ｃ１２．ＷＴ；下面）内に存在する糖の大きな成分であるが、２μｇ．ｍＬ−１のキフネンシン（３Ｃ１２．kｉｆ；上面）の存在下での３Ｃ１２の産生はフコースの添加を阻害する。優勢な各シグナルにて通常産生される構造を注記として入れ、フコース（三角形）、ＧｌｃＮＡＣ（正方形）、マンノース（ダークグレーの円）、及びガラクトース（ライトグレーの円）により概略的に示している。（Ｂ）３Ｃ１２．ＷＴ及び３Ｃ１２．Ｋｉｆは標準的なＩｇＧの分子量であり（１５０ｋＤａ非還元（ＮＲ）、及び５０ｋＤａ、２５ｋＤａバンドが還元（Ｒ）して観察された）、かつ（Ｃ）キフネンシン処理は、アイソタイプコントロール（ＭＦＩ＝３３５、グレーフィル）に対する３Ｃ１２．ＷＴ（ＭＦＩ＝２５８１、灰色線に重なり合う黒色線）と比較して、３Ｃ１２．kｉｆ ＩｇＧ（ＭＦＩ＝２５７３、灰色線）の、ＣＤ８３＋細胞系であるＫＭ−Ｈ２への結合活性を変化させない。 ＶＬをシャッフルしたライブラリーから、ヒトＣＤ８３への親和性が向上したｓｃＦｖを選択する （Ａ）ＶＬをシャッフルした３Ｃ１２ ｓｃＦｖを示す酵母を、各回で示した濃度でｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓにより染色し、比較のため、高親和性回収ゲートＰ２及び比較的厳格でないゲートＰ３にソートした。Ｐ２及びＰ３にソートした全細胞の割合をゲート内に示す。ソートラウンド３では、解離速度の遅いクローンの選択が組み込まれている。（Ｂ）３Ｃ１２のＶＬアミノ酸配列アラインメント及び親和性向上ＶＬ変異体の推定フレームワーク（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）．（Ｃ）０．２ｎＭのｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓに結合している、野生型（３Ｃ１２．ＷＴ）、及び親和性向上３Ｃ１２変異体（３Ｃ１２．Ｂ〜Ｅ）を発現するモノクロナール酵母の比較。 ＶＬをシャッフルしたライブラリーから、ヒトＣＤ８３への親和性が向上したｓｃＦｖを選択する （Ａ）ＶＬをシャッフルした３Ｃ１２ ｓｃＦｖを示す酵母を、各回で示した濃度でｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓにより染色し、比較のため、高親和性回収ゲートＰ２及び比較的厳格でないゲートＰ３にソートした。Ｐ２及びＰ３にソートした全細胞の割合をゲート内に示す。ソートラウンド３では、解離速度の遅いクローンの選択が組み込まれている。（Ｂ）３Ｃ１２のＶＬアミノ酸配列アラインメント及び親和性向上ＶＬ変異体の推定フレームワーク（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）．（Ｃ）０．２ｎＭのｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓに結合している、野生型（３Ｃ１２．ＷＴ）、及び親和性向上３Ｃ１２変異体（３Ｃ１２．Ｂ〜Ｅ）を発現するモノクロナール酵母の比較。 再フォーマットした３Ｃ１２ ＶＬをシャッフルした変異体Ｆａｂの分類 （Ａ）ＢｉａＣｏｒｅが３Ｃ１２．ＷＴ（上面）及び３Ｃ１２．Ｃ（下面）の結合を追跡し表示させます（ｔｒａｃｅｓ ｓｈｏｗ）。３分間のＦａｂの定量注入（１８０秒、結合段階）、及びそれに続く、１０分間緩衝液の注入（６００秒、解離段階）の間に、Ｆａｂ断片をｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｆcに固定させる。２倍のＦａｂ希釈用液を、特定の希釈系列に対して調製した。（Ｂ）３Ｃ１２．ＷＴ（円）、３Ｃ１２．Ｃ（正方形）、及びＣＤ８３＋細胞系のＫＭ−Ｈ２に結合するＩｇＧアイソタイプコントロール（三角形）の希釈系列。 糖修飾及び親和性成熟がＣＤ８３ｍＡｂのインビトロでの活性を高める インビトロでの３Ｃ１２．ＷＴ、３Ｃ１２．Ｃ、及び３Ｃ１２．kｉｆの比較潜在能。（Ａ）抗体及びＮＫ細胞（エフェクタ−と標的細胞の比率５：１）による、３７℃での４時間のインキュベーション後の、ＣＤ８３をトランスフェクトしたＢＢ８８細胞の特異的細胞溶解。ハーセプチン＝ヒトＩｇＧ １κアイソタイプコントロール。（Ｂ）（ｉ）３Ｃ１２変異体の抗増殖効果、及び（ｉｉ）２方向ＭＬＲでのＲＡ８３と比較した抗増殖効果。示すデータは、５回の繰り返しの平均±ＳＥＭであり、２〜４回の独立した実験を代表する。 インビトロで遺伝子操作された抗ＣＤ８３ ｍＡｂにより、ＣＤ８３の鮮やかな血液樹状細胞が標的とされる ３日間にわたる、５μｇ．ｍＬ−１の３Ｃ１２．Ｃ、ＩｇＧ１ｋアイソタイプコントロール、またはｎｉｌ抗体処理によるＰＢＭＣ培養後の、ヒト血液樹状細胞への影響。（ｉ）生きており（７ＡＡＤ−）活性化した血液樹状細胞を、ＣＭＲＦ−４４及びＣＤ８３を共発現する系列−ＨＬＡ−ＤＲ＋（ＨＬＡ−ＤＲのゲーティングは図示せず）細胞（＝全樹状細胞）と定義する。（ｉｉ）活性化した樹状細胞ゲート内の数は、全樹状細胞に対する割合である。各実験条件を３とおりで行い、示す結果は４つの独立した実験を代表するものである。 ＣＤ８３抗原の濃度はＧＦＰの発現レベル及びインビトロでのＡＤＣＣ潜在能と関連している 様々なレベルのＣＤ８３発現を有するＢＢ８８のトランスフェクタントの分類；ＢＢ８８−ＣＤ８３−ＴＦ．５Ｋ（５，４００ＭＰＣ）、ＢＢ８８−ＣＤ８３ＴＦ．３Ｋ（３，６００ＭＰＣ）、またはＢＢ８８−ＣＤ８３ＴＦ．２Ｋ（＜２，３００ＭＰＣ）。（Ａ）ＧＦＰ（左）及びＢＢ８８のトランスフェクタント上のＨＢ１５ａにより検出されたＣＤ８３（右）の発現レベル。（Ｂ）エフェクタ−と標的細胞の比率が５：１において、（ｉ）３Ｃ１２．Ｃ、（ｉｉ）３Ｃ１２．Ｋｉｆ、または（ｉｉｉ）ＢＢ８８のトランスフェクタント上の３Ｃ１２．Ｃ．Ｋｉｆによる、クロムリリースアッセイにて誘発されたＡＤＣＣ。データは５回の反復試験の平均±ＳＥＭとして表示し、示す結果は２つの独立した実験を代表するものである。 ３Ｃ１２．ＣはインビボでＲＡ８３と同等の潜在能を有する 異種ヒトＰＢＭＣを移植し、０日目における０．１２５ｍｇのＣＤ８３抗体、またはアイソタイプをマッチさせた抗体対照の投与後のＳＣＩＤマウスの生存。表示したデータは、異なるヒトＰＢＭＣドナーを使用した２つの実験からプールする（各コホートで使用する動物の総数は、コホートの説明後の括弧内に表示される。有意差（ｐ＜０．０５）にはアスタリスクを付けている。
概要
本明細書を通して、別で特に明記しない限り、または文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一の工程、組成物、一まとまりの工程または一まとまりの組成物は、１つまたは複数の（すなわち、１つ以上の）工程、組成物、一まとまりの工程または一まとまりの組成物を包含しなければならない。したがって、本発明で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明記しない限り複数のアスペクトを含む。例えば、「ａ」への言及は単数に加えて２つ以上も含む；「ａｎ」への言及は単数に加えて２つ以上も含む；「ｔｈｅ」への言及は単数に加えて２つ以上等も含む。
本明細書に記載される本開示の各実施例は、別途特に明記しない限り、他の各実施例に準用して適用される。
当業者は、本明細書における開示が、具体的に記載される以外の変形及び修正の影響を受けることを理解するであろう。本開示は、かかる変形及び修正を全て包含することを当業者は理解すべきである。本開示はまた、本明細書にて個別に、または一括して言及または示す全ての工程、特徴、組成物、及び化合物、並びに該工程または特徴の全てまたは２つ以上の組み合わせも含む。
本開示は、本明細書に記載した特定の実施例によりその範囲を制限されるべきではない。これらは例示としての目的を意図しているだけである。上述のとおり、機能上同等の生成物、組成物、及び方法は明らかに本開示の範囲内である。
本開示は、特に断りのない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組み換えＤＮＡ技術、ペプチド液相合成法（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ペプチド固相合成法、及び免疫学を用いる過度な実験をすることなく実施される。
かかる手順は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ全巻；ＢｅｎｎｙＫ．Ｃ．Ｌｏ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（２００４）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｖｏｌ．２４８；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，１９８５），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、全文；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ，１９８４）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，前文、並びに特に、Ｇａｉｔ，ｐｐｌ−２２；Ａｔｋｉｎｓｏｎｅｔ ａｌ．，ｐｐ３５−８１；Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，ｐｐ８３−１１５；及びＷｕ ｅｔ ａｌ．，ｐｐ１３５−１５１の論文；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５） ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全文；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８６） ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全文；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），全シリーズ；Ｊ．Ｆ．Ｒａｍａｌｈｏ Ｏｒｔｉｇａｏ，”Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｉｎ：Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｗｅｂｓｉｔｅ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３：３３６−３４２，１９７６；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４，１９６３；Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９７９） ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ （Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｊ．ｅｄｓ．），ｖｏｌ．２，ｐｐ．１−２８４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１２．Ｗｕｎｓｃｈ，Ｅ．，ｅｄ．（１９７４）Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ ｉｎ Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ Ｍｅｔｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍuｌｅｒ，Ｅ．，ｅｄ．），ｖｏｌ．１５，４ｔｈ ｅｄｎ．，Ｐａｒｔｓ １ ａｎｄ ２，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４） Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．＆ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２５：４４９−４７４，１９８５；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ． Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；並びにＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，３ｒｄ ｅｄｎ（Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ，ｅｄ．，２０００），ＩＳＢＮ ０１９９６３７９７０，全文に記載されている。
用語「及び／または」、例えば「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解しなければならず、両方の意味またはいずれかの意味を明示的に支持すると考えなければいけない。
本明細書を通して、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べた要素、整数、もしくは工程、または一まとまりの要素、整数もしくは工程を含めるが、任意の他の要素、整数、もしくは工程、または一まとまりの要素、整数もしくは工程を除外しないことを意味する、と理解しなければならない。
選択的定義
ＣＤ８３は一回膜貫通型Ｉ型タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。異なるアイソフォームをコードする３つのヒト転写変異体が発見されている。命名法の目的、かつ非限定的目的のため、ヒトＣＤ８３（ｈＣＤ８３）アイソフォームは、配列番号：４７（ＮＰ＿００４２２４．１；アイソフォームａ）、配列番号：４８（ＮＰ＿００１０３５３７０．１；アイソフォームｂ）、及び配列番号：４９（ＮＰ＿００１２３８８３０．１；アイソフォームｃ）に示す。したがって、一実施例において、ヒトＣＤ８３のアミノ酸配列は、配列番号：４７、４８、または４９に示すアミノ酸配列からなる。ＣＤ８３の同族体は、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（ＸＰ＿５１８２４８．２）、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔｏ（ＸＰ＿００１０９３５９１．１）、Ｃａｍｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（ＸＰ＿８５２６４７．１）、Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ（ＮＰ＿００１０４００５５．１）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ （ＮＰ＿０３３９８６．１）、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ＮＰ＿００１１０１８８０．１）、及びＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ（ＸＰ＿４１８９２９．１）で発見することができる。
本開示の代表的なＣＤ８３結合タンパク質は、組み換え形態（ｒｈＣＤ８３）を含むｈＣＤ８３に結合、または特異的に結合する。
用語「単離したタンパク質」または「単離したポリペプチド」は、その誘導の起点または出所のため、天然状態にて付随する、自然と関係する成分に関連せず、実質的に同じ出所からの別のタンパク質を含まないタンパク質またはポリペプチドを意味することを目的としている。
タンパク質は、当該技術分野において既知の技術を使用して、実質的に自然に関係する成分を含まない加工をしても、単離により実質的に精製してもよい。「実質的に精製」とは、タンパク質が実質的に汚染物質を含まない、例えば、少なくとも約７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、汚染物質を含まないことを意味する。
用語「組み換え」とは、人工的な遺伝子組み換え製品を意味すると理解されなければならない。したがって、抗原結合領域を含む組み換えタンパク質の文脈においては、本用語は、Ｂ細胞の成熟中に発生する自然組み換えの製品である被験体の体内で自然発生する抗体は含まない。しかし、かかる抗体が単離した場合、それは抗原結合領域を含む単離タンパク質であると考えるべきである。同様に、タンパク質をコードする核酸が組み換え手段を用いて単離して発現した場合、得られたタンパク質は、抗原結合領域を含む組み換えタンパク質である。組み換えタンパク質はまた、そのタンパク質が、例えばそれが発現する細胞、組織、被験体内に存在する時、人工的な組み換え手段により発現したタンパク質を含む。
用語「ＣＤ８３結合タンパク質」は、単一ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合により連結した一連の連続アミノ酸）、または、本明細書において記述及び／または請求される方法でＣＤ８３に結合可能な、互いに共有結合または非共有結合した一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体もしくはタンパク質）を含むと理解しなければならない。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合またはジスルフィド結合を用いて、共有結合することが可能である。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファン・デル・ワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。
用語「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」は、前述の段落から、ペプチド結合により連結した一連の連続アミノ酸を意味すると理解されよう。
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合領域」は、抗原、すなわちＶＨもしくはＶＬ、またはＶＨ及びＶＬの両方を含むＦｖに特異的に結合可能な抗体の領域を意味すると理解されなければならない。
抗原結合領域は、抗体全体を意味する必要はない。例えば、単離（例えば領域抗原）または別の形態（例えばｓｃＦｖ）とすることができる。
本開示の目的のために、用語「抗体」は、Ｆｖ内に含まれる抗原結合領域によって、１つまたは少数の密接に関係した抗原（例えばＣＤ８３）に特異的に結合可能なタンパク質を含む。この用語は四鎖抗体（例えば２つの軽（Ｌ）鎖及び２つの重（Ｈ）鎖）、組み換えまたは修飾抗体（例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、シンヒューマナイズド抗体、半抗体、二重特異的抗体）を含む。抗体は通常定常領域を含み、定常部または定常断片もしくは結晶性フラグメント（Ｆｃ）中に組み込むことが可能である。抗体の代表的な形態は、基本単位として四鎖構造を含む。完全長抗体は、共有結合した２つの重鎖（それぞれ〜５０から７０ｋＤａ）、及び２つの軽鎖（それぞれ〜２３ｋＤａ）を含む。軽鎖は一般に、可変領域（存在する場合）及び定常領域からなり、哺乳類では、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかである。
重鎖は一般に可変領域、及びヒンジ領域により追加の定常領域に連結した１つまたは２つの定常領域からなる。哺乳類の重鎖は、以下のα、δ、ε、γ、μの種類のいずれかである。各軽鎖もまた、重鎖の１つに共有結合している。例えば、２つの重鎖、並びに重鎖及び軽鎖は鎖間ジスルフィド結合により、及び非共有相互作用により互いに結合している。鎖間ジスルフィド結合の数は、異なる種類の抗体間で変化する。各鎖はＮ末端可変領域（それぞれのアミノ酸長が〜１１０であるＶＨまたはＶＬ）、及びＣ末端に１つ以上の定常領域を有する。軽鎖の定常領域（長さが〜１１０のアミノ酸であるＣＬ）は、重鎖の第一の定常領域（長さが３３０〜４４０のアミノ酸であるＣＨ1）と配向し、ジスルフィド結合している。軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と配向している。抗体重鎖は、２つ以上の更なるＣＨ領域（ＣＨ２，ＣＨ３等）を含むことができ、ＣＨ１定常領域とＣＨ２定常領域との間にヒンジ領域を含むことができる。抗体は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであることができる。一実施例において、抗体はネズミ（マウスもしくはラット）抗体、または霊長類（例えばヒト）抗体である。一実施例において、抗体はヒト化、シンヒューマナイズド、キメラ、ＣＤＲ移植または脱免疫化抗体（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）である。
用語「裸の抗体」は、他の化合物、例えば毒性化合物または放射線標識と結合してない抗体を意味する。
本明細書で使用する場合、「可変領域」とは、抗原に特異的に結合可能な、本明細書で定義する抗体の軽鎖及び／または重鎖の一部を意味し、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、すなわちＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。例えば、可変領域は、３つのＣＤＲと結合した４つのＦＲ（例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び所望によりＦＲ４）を含む。ＶＨとは、重鎖の可変領域を意味する。ＶＬとは、軽鎖の可変領域を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「相補性決定領域」（同義語：ＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原への特異的結合に主に寄与するものが存在する抗体可変部のアミノ酸残基を意味する。各可変領域（ＶＨまたはＶＬ）、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と表される３つのＣＤＲ領域を有する。一実施例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられたアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７及び１９９１（本明細書においてはまた、「Ｋａｂａｔナンバリングシステム」とも呼ばれる）に従って定義される。別の実施例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられたアミノ酸の位置は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に従って定義される。Ｋａｂａｔナンバリングシステムによると、ＶＨのＦＲ及びＣＤＲは、以下のとおり位置する：残基１〜３０（ＦＲ１）、３１〜３５（ＣＤＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、５６〜６５（ＣＤＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、９５〜１０２（ＣＤＲ３）、及び１０３〜１１３（ＦＲ４）。Ｋａｂａｔナンバリングシステムによると、ＶＬのＦＲ及びＣＤＲは、以下のとおり位置する：残基１〜２３（ＦＲ１）、２４〜３４（ＣＤＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、８９〜９７（ＣＤＲ３）、及び９８〜１０７（ＦＲ４）。本開示は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムで定義されるＦＲ及びＣＤＲに限定されないが、標準ナンバリングシステム、またはＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６： ９０１−９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３，１９８９；及び／もしくはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８，１９９７のナンバリングシステム；Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ ａｎｄ Ｐｌuｋｔｈｕｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０，２００１のナンバリングシステム；またはＧｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２０６−２１１ １９９７で議論されているＩＭＧＴシステムを含む、全てのナンバリングシステムを含む。一実施例において、ＣＤＲはＫａｂａｔナンバリングシステムに従って定義される。所望により、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる重鎖ＣＤＲ２は本明細書に記載されている５つのＣ末端アミノ酸を含まない、またはこれらのアミノ酸の１つ以上が他の自然発生するアミノ酸と置換される。更なる、または代わりの選択肢として、軽鎖ＣＤＲ１は本明細書に記載した４つのＮ末端アミノ酸を含まない、またはこれらのアミノ酸の１つ以上が他の自然発生するアミノ酸と置換される。これに関し、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１３３−１３９，１９９５は、重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端アミノ酸、及び／または軽鎖ＣＤＲ１の４つのＮ末端アミノ酸は一般に、抗原結合に関係しないことを確立した。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｖ」は、複数のポリペプチドであれ単一のポリペプチドであれ、その中でＶＬ及びＶＨが結合して、抗原に特異的に結合可能な抗原結合領域を有する複合体を形成する、あらゆるタンパク質を意味すると理解されなければならない。
抗原結合領域を形成するＶＨ及びＶＬは、単一ポリペプチド鎖または異なるポリペプチド鎖とすることができる。更に、本開示のＦｖ（同様に、本開示の任意のタンパク質）は、同一の抗原に結合し得る、または結合しない複数の抗原結合領域を有してよい。本用語は、抗体から直接誘導される断片、並びに組み換え手段を使用して産生したかかる断片に対応するタンパク質を包含すると理解されなければならない。幾つかの実施例では、ＶＨは重鎖定常領域（ＣＨ）１に結合してない、またはＶＬは軽鎖定常領域（ＣＬ）に結合していない。代表的なＦｖ含有ポリペプチドまたはタンパク質としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体もしくはそれ以上の高次複合体、またはその定常部もしくは領域、例えばＣＨ２もしくはＣＨ３領域に結合した、前述のいずれか、例えば低分子抗体が挙げられる。
「Ｆａｂ断片」は、免疫グロブリンの一価の抗原結合断片からなり、抗体全体を酵素のパパインで分解することにより産生をし、無傷の軽鎖、及び重鎖の一部からなる断片を得ることができる、または組み換え手段を使用して産生することができる。
抗体の「Ｆａｂ’断片」は、抗体全体をペプシンで処理し、続いて還元により処理することで得られ、無傷の軽鎖、並びに、ＶＨ及び単一の定常領域を含む重鎖の一部からなる分子を得る。２つのＦａｂ’断片は、このようにして処理した抗体１つから得られる。Ｆａｂ’断片はまた、組み換え手段により産生することができる。
抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２個のジスルフィド結合によって結合している２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、抗体分子全体を酵素のペプシンにより処理し、その後の還元を行わずに得られる。
「Ｆａｂ２」断片は、例えばロイシンジッパーまたはＣＨ３ドメインを使用して２つのＦａｂ断片からなる組み換え断片である。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変部及び重鎖の可変部が好適な可動性ペプチドリンカーにより共有結合している抗体の可変部断片（Ｆｖ）を含む、組み換え分子である。
本明細書で使用する場合、ＣＤ８３結合タンパク質またはその抗原結合領域と、抗原との相互作用に関する用語「結合する」は、該相互作用が抗原中の特定構造（例えば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存していることを意味する。例えば、抗原は一般に、タンパク質ではなく特定のタンパク質の構造を認識し、結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、標識した「Ａ」及び抗体を含む反応において、エピトープ「Ａ」（または遊離した非標識の「Ａ」）を含む分子の存在により、抗体に結合した標識した「Ａ」の量が減少する。
本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合する」は、本開示のタンパク質がより長い期間及び／またはより高い親和性で、より頻繁に、より速く、特定の抗原または細胞と反応または結合する、また同様に代わりの抗原または細胞と反応または結合することを意味する、と理解されなければならない。例えば、抗原に特異的に結合するタンパク質は、他の抗原に結合する場合よりも、該抗原により高い親和性、アビディティで、より速く、及び／またはより長い期間結合する例えば、タンパク質はＣＤ８３（例えばｈＣＤ８３）に、他の免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドに結合する時よりも、物理的により高い親和性で結合する、または、多反応性自然抗体により（すなわち、ヒトの体内で自然に発見される様々な抗原に結合すると知られている自然発生抗体により）、一般に認識される抗原に結合する。本定義を読むことにより、例えば、第一の抗原に特異的に結合するタンパク質は、第二の抗原に特異的に結合し得る、または結合しないこともまた理解される。そのようなものであるため、「特異的結合」は必ずしも、他の抗原の独占結合または検出できない結合が必要であるわけではない。これは、用語「選択的結合」が意味する。一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質の抗原への「特異的結合」は、タンパク質が、平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ＫＤ）が１００ｎＭ以下、例えば５０ｎＭ以下、例えば２０ｎＭ以下、例えば１５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または５００ｐＭ以下、または４００ｐＭ以下、または３００ｐＭ以下、または２００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下である抗原に結合することを意味する。
本発明で使用する場合、用語「エピトープ（同義語：「抗原決定基」）は、抗原の抗原結合領域を含むタンパク質が結合するＣＤ８３の領域を意味すると理解されなければならない。
本用語は、タンパク質が接触する特定の残基または構造に必ずしも限定されない。例えば、本用語は、タンパク質により接触したアミノ酸、及び／または本領域の外にある少なくとも５〜１０、もしくは２〜５、もしくは１〜３のアミノ酸にまたがる領域を含む。幾つかの実施例では、エピトープは線状アミノ酸である。
エピトープは更に、ＣＤ８３が折りたたまれた時に、互いに密接に位置する一連の不連続なアミノ酸、すなわち「立体構造エピトープ」を含んでよい。
当業者はまた、用語「エピトープ」はペプチドまたはポリペプチドに限定されないことに気付くであろう。例えば、用語「エピトープ」は糖側鎖、ホスホリル側鎖、またはスルホニル側鎖等の分子の、化学的に活性な表面グループを含み、ある種の実施形態において、特定の三次元構造特性、及び／または特定の電荷特性を有してよい。これらを含むエピトープまたはペプチドもしくはポリペプチドを動物に投与して、エピトープに対する抗体を作製することができる。
用語「競合的に阻害する」は、本開示のＣＤ８３結合タンパク質が、列挙した抗体のＣＤ８３、例えばｈＣＤ８３への結合を低減または防止することを意味すると理解されなければならない。これは、同一の、または重なり合ったエピトープに抗体として結合しているタンパク質（または抗原結合領域）によるものであり得る。前述より、タンパク質は必ずしも完全に抗体の結合を阻害するわけではなく、むしろ、結合を低減させるには、統計的に有意な量、例えば少なくとも１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または９５％が必要なだけであることが明らかとなろう。結合の競争的阻害を定める方法は、当技術分野において既知である、及び／または本明細書に記載される。例えば、抗体をタンパク質の存在下または不存在下にてＣＤ８３に曝露させる。タンパク質の不存在下よりも、タンパク質の存在下でのほうが抗体の結合が少ない場合、タンパク質は、抗体の結合を競争的に阻害すると考えられる。一実施例において、結合の競争的阻害は、抗体の抗原結合領域と重なり合ったＣＤ８３上のタンパク質の抗原結合領域に起因する。
２つのエピトープの文脈において「重なり合った」とは、２つのエピトープが十分な数のアミノ酸残基を共有し、１つのエピトープに結合する本開示のタンパク質が結合して、列挙した抗体が、別のエピトープに結合するＣＤ８３に結合することの競争的阻害を可能にすることを意味する。例えば、「重なり合った」エピトープは少なくとも１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５、または１６、または１７、または１８、または１９、または２０個のアミノ酸を共有する。
本明細書で使用する場合、「ＣＤ８３が関係する状態または疾患」とは、ＣＤ８３、またはＣＤ８３発現細胞が原因である、または関係する任意の状態または疾患を意味する。当事者は、本明細書における開示に基づき、及び／またはＣＤ８３が関係する状態または疾患を診断するアッセイを行うことで、かかる状態または疾患を速やかに決定することが可能になるであろう。これに関し、幾つかの実施例では、状態または疾患は炎症性の状態もしくは疾患、または自己免疫状態もしくは疾患である。代表的な状態及び疾患の説明は本明細書に含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「予防すること」、「予防する」、または「予防」は、本開示のタンパク質を投与することにより、少なくとも１つの状態または疾患の症状の進行を停止または妨げることを含む。本用語はまた、再発を予防または防止するための、寛解期の被験体の治療も包含する。例えば、再発寛解型多発性硬化症を患う被験体は、寛解中に治療をして再発を予防する。
本明細書で使用する場合、用語「治療すること」、「治療する」、または「治療」は、本明細書に記載されたタンパク質を投与することにより、特定の状態または疾患の少なくとも１つの症状を低減するまたは取り除くことを含む。
本明細書で使用する場合、用語「被験体」は、哺乳類等の任意の動物を意味すると理解されなければならない。一実施例において、哺乳類はヒトまたは非ヒト霊長類である。一実施例において、哺乳類はヒトである。
本明細書における「サンプル」の言及については、体液（例えば、血液、または血清もしくは血漿等の血液分画物、涙、尿、滑液、または脳脊髄液）、細胞材料（例えば組織吸引物）、組織生検標本または外科標本等の被験体に由来する任意のサンプルを指すと理解されなければならないが、これらに限定されない。幾つかの実施例では、「サンプル」は血清、血漿、ＰＢＭＣ、または軟膜の一部のいずれか１つである。
本明細書で使用する場合、用語「診断」、及び「診断する」、「診断した」、または「診断すること」等のその異形（これらに限定されるわけではない）は、任意の臨床状態の一次診断、または再発病の診断を含む。
本明細書で使用する「予後」、「予後の」、及びその異形は、疾患の起こり得る結果または経過を意味し、回復もしくは再発の見込み、または治療の結果を含む。
用語「発現構築物」は幅広い文脈で理解されるべきであり、本明細書で記載される１つ以上の核酸と作用可能に結合した、１つ以上のプロモーター配列を含む核酸を含む。
用語「発現ベクター」とは、発現可能なフォーマット内で核酸の保存及び／または複製が更に可能な発現構築物を含む核酸を意味する。例えば、発現ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスサブゲノム断片またはウイルスゲノム断片を含んでよい。適切なベクターの選択は、当業者の知見の範囲内である。
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は幅広い文脈で理解されるべきであり、ＴＡＴＡボックスまたはイニシエーターエレメントを含むゲノム遺伝子の転写制御配列を含み、例えば成長及び／もしくは外部刺激に対応して、または組織に特定の方法で核酸の発現を変更する更なる制御因子（例えば上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）を用いたまたは用いない、正確な転写の開始に必要である。
本文脈では、用語「プロモーター」はまた、作用可能に結合する核酸の発現を行う、活性化させる、または向上する、組み換え型、合成もしくは融合核酸または誘導体を表現するために使用される。代表的なプロモーターは、前記核酸の発現を更に高め、かつ／またはその空間的発現及び／もしくは一時的発現を変更するために、１つ以上の特定の制御因子の更なるコピーを含むことができる。
本明細書で使用する場合、用語「に作用可能に結合した」は、核酸の発現がプロモーターにより調整されるように、核酸に対するプロモーターの位置決めをすることを意味する。プロモーターは様々な核酸に、例えば内部リボソーム侵入部位を介して、作用可能に結合することができる。
抗原結合領域を含むタンパク質
抗体
ライブラリーに基づく方法
本開示はまた、抗体またはその抗原結合領域からなる（例えばその可変部からなる）タンパク質をスクリーニングし、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を同定することも含む。例えば、本開示のＶＨ及び複数のＶＬ領域からなるライブラリーをスクリーニングし、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を同定することができる。
本開示で考慮されるライブラリーの例としては、ナイーブライブラリ−（未処置の被験体から）、免疫化ライブラリー（抗原で免疫化した被験体から）、または合成ライブラリーが挙げられる。抗体または抗体の領域（例えば可変部）をコードする核酸は、従来技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ，ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に開示されているもの）によってクローンされ、当該技術分野において公知の方法を使用して、タンパク質をコードしてディスプレイするために使用される。タンパク質のライブラリーを作製する他の技術は、例えばＵＳ６３０００６４（例えば、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧのＨｕＣＡＬライブラリー）、ＵＳ５８８５７９３、ＵＳ６２０４０２３、ＵＳ６２９１１５８、またはＵＳ６２４８５１６に開示されている。
本開示によるＣＤ８３結合タンパク質は可溶性分泌タンパク質であり得る、または細胞上の表面上の融合タンパク質、もしくは粒子（例えばファージもしくは他のウイルス、リボソームまたはスポア）として提示される。様々なディスプレイライブラリーフォーマットが、当技術分野において知られている。例えば、ライブラリーはインビトロディスプレイライブラリー（例えば、リボソームディスプレイライブラリー、共有結合ディスプレイライブラリー、またはｍＲＮＡディスプレイライブラリー、例えばＵＳ７２７０９６９に開示されているもの）である。更に別の実施例において、ディスプレイライブラリーは、例えば、ＵＳ６３０００６４、ＵＳ５８８５７９３、ＵＳ６２０４０２３、ＵＳ６２９１１５８、またはＵＳ６２４８５１６に開示されているような、抗体の抗原結合領域を含むタンパク質がファージ上に発現する、ファージディスプレイライブラリーである。
他のファージディスプレイ法は当技術分野において既知であり、本開示により考慮される。同様に、細胞ディスプレイ法、例えば、ＵＳ５５１６６３７に開示されている細菌ディスプレイライブラリー；例えば、ＵＳ６４２３５３８に開示されている酵母ディスプレイライブラリー；または哺乳類ディスプレイライブラリーも本開示により開示される。
スクリーニングディスプレイライブラリーの方法は、当技術分野において既知である。一実施例において、本開示のディスプレイライブラリーを、例えばＳｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４内）に記載されている、親和性精製を使用してスクリーニングする。親和性精製の方法には通常、ライブラリーによりディスプレイした抗原結合領域を含むタンパク質を、標的抗原（例えばＣＤ８３）に接触させ、続いて洗浄し、抗原に結合して残留しているこれらの領域を溶出させることを伴う。
必要に応じて、スクリーニングにより識別される任意の可変領域またはｓｃＦｖを速やかに、完全抗体内に修飾させる。
可変部またはｓｃＦｖを完全抗体内に修飾または再編成する代表的な方法は、例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５４：８５−９０，２０１０；またはＪｏｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８９：６５−８０，２００４に記載されている。あるいは、または更に、 例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ ０４７ １５０３３８，１９８７内）、及び／またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１内）に記載されている、標準クローニング法を使用する。
一実施例において、本開示は、ディスプレイライブラリーのスクリーニング、例えばファージディスプレイライブラリー、例えばＵＳ６３０００６４及び／またはＵＳ５８８５７９３に開示されているようなものによる、本開示のＣＤ８３結合タンパク質の産生または単離方法を提供する。例えば、本発明者らは、ヒトＣＤ８３の組み換え細胞外領域に対して選択を３ラウンド行い、ヒトｓｃＦｖ免疫グロブリン遺伝子ライブラリーのバイオパニングでｓｃＦｖを単離した。一度単離されれば、本発明のＣＤ８３結合タンパク質をクローン化して発現させ、及び所望により当該技術分野における既知の方法を使用して、例えばＩｇＧ１抗体の再編成することが可能である。
一実施例において、本開示は、ＣＤ８３結合タンパク質の産生方法を提供し、該方法は
（ｉ） ＣＤ８３の細胞外領域、例えば組み換えヒトＣＤ８３の細胞外領域に結合する結合タンパク質に対するＣＤ８３結合タンパク質調製物またはライブラリーのスクリーニング；及び
（ｉｉ）ＣＤ８３の細胞外領域に対して所望の結合親和性を有するＣＤ８３結合タンパク質の単離
からなる。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質調製物をスクリーニングする。ＣＤ８３の細胞外領域と反応する抗体を産生するために、ＣＤ８３製剤を、例えばＣＤ８３抗原で動物を免疫化することにより作製してよい。
別の実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質ライブラリーをスクリーニングする。ライブラリーはファージライブラリー、例えばｓｃＦｖファージライブラリー、またはＦａｂファージライブラリーであってよい。
一実施例において、該方法は、標的ＣＤ８３エピトープまたは抗原に対する様々な結合特性を有する多くの結合分子を、その表面にディスプレイする多くのファージ粒子に産生することを含む。かかるファージ粒子は、結合タンパク質をコードする核酸を含むファージミドゲノムからなる。この核酸を組み換えシステム内で単離、クローン化及び発現して、本発明のＣＤ８３結合タンパク質を産生することができる。
脱免疫化、キメラ、ヒト化、シンヒューマナイズド、霊長類化、ヒト及び複合ＣＤ８３結合タンパク質
本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、ヒト抗体のＦＲ上に移植した、またはその中に挿入した、非ヒト種（例えばマウスもしくはラット、または非ヒト霊長類）の抗体のＣＤＲを含むＣＤＲ移植タンパク質 、または別のタイプの抗体（例えば別のタイプのヒト抗体）のＦＲ上に移植した、またはその中に挿入した、あるタイプの抗体（例えばあるタイプのヒト抗体）の抗体（ｆｒｏｍ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒｏｍ ｏｎｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）のＣＤＲを含むＣＤＲ移植タンパク質であってよい。本用語はまた、例えば１つ以上のＣＤＲ移植可変領域、及び１つ以上の、例えばヒト可変領域、キメラ可変領域、シンヒューマナイズド可変領域、または霊長類化可変領域からなる複合タンパク質も包含する。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質はヒト化タンパク質であってよい。
用語「ヒト化タンパク質」は、ヒト様可変領域を含むタンパク質を意味すると理解されるべきであり、非ヒト抗体（このタイプの抗体はまた、「ＣＤＲ移植抗体」とも称される）のＦＲ上に移植した、またはその中に挿入した、非ヒト種（ｈｕｍａｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えばマウスもしくはラット、または非ヒト霊長類）の抗体のＣＤＲを含む。ヒト化タンパク質は更に、ヒトタンパク質の１つ以上の残基が、１つ以上のアミノ酸置換基により修飾されたタンパク質、及び／またはヒトタンパク質の１つ以上のＦＲ残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられたタンパク質も包含する。ヒト化タンパク質は更に、ヒト抗体、または非ヒト抗体のいずれにも見出されない残基を含んでよい。更なるタンパク質の領域（例えばＦｃ領域）は全て、通常ヒトである。
ヒト化は、当該技術分野において公知の方法、例えばＵＳ５２２５５３９、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ７５６６７７１、またはＵＳ５５８５０８９に記載されているものを使用して行うことができる。用語「ヒト化タンパク質」はまた、スーパーヒト化タンパク質、例えばＵＳ７７３２５７８に記載されているものを包含する。本用語はまた、例えば１つ以上のヒト化可変領域、及び１つ以上の、例えばヒト可変領域、キメラ可変領域、シンヒューマナイズド可変領域、または霊長類化可変領域からなる複合タンパク質も包含する。
一実施例において、ヒト化ＣＤ８３結合タンパク質は、本明細書にて開示された軽鎖配列における２７ｄ及び３４、５０及び５５、並びに８９及び９６；並びに本明細書にて開示された重鎖配列における３１及び３５ｂ、５０及び５８、並びに９５及び１０１の間の領域（Ｋａｂａｔナンバリングシステムによるナンバリング）を含む。これに関し、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１３３−１３９，１９９５は、これらの領域が最も抗原に結合または接触しやすいものである証拠を示している。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質はヒトタンパク質であってよい。用語「ヒトタンパク質」は本発明で使用する場合、ヒト、例えばヒト生殖細胞系もしくは体細胞に見出される、または抗体領域を使用して作製したライブラリーから見出される、可変、及び任意に定常抗体領域を有するタンパク質を意味する。「ヒト」抗体は、ヒト配列によりコードされていない、例えばインビトロでのランダム突然変異または部位特異的突然変異により導入された突然変異（特に、保存的置換が関係する突然変異、又はタンパク質の少数の残基、例えばタンパク質の１、２、３、４、もしくは５つの残基における突然変異）によるアミノ酸残基を含むことができる。これらの「ヒト抗体」は必ずしもヒトの免疫応答の結果として生成される必要はなく、むしろ、これらは組み換え手段（例えばファージディスプレイライブラリーのスクリーニング）により、並びに／またはヒト抗体定常及び／もしくは可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えばマウス）により、並びに／または誘導選択（例えばＵＳ５５６５３３２に記載されているもの）を使用して、生成することができる。本用語はまた、かかる抗体の親和性成熟形態も包含する。本開示の目的のために、ヒトタンパク質はまた、ヒト抗体のＦＲ、またはヒトＦＲのコンセンサス配列からの配列を含み、その中の１つ以上のＣＤＲが、例えばＵＳ６３０００６４及び／もしくはＵＳ６２４８５１６に記載されているように、ランダムもしくはセミランダムであるＦＲを含むタンパク質を含むと考えられる。
代表的なヒトＣＤ８３結合タンパク質は、以下の対の可変領域を含む抗体である：
（ｉ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：５に示すＶＬ配列；または
（ｉｉ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：６に示すＶＬ配列；
（ｉｉｉ）配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：７に示すＶＬ配列；または
（ｉｖ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：８に示すＶＬ配列；または
（ｖ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：９に示すＶＬ配列。
一実施例において、ＶＬ配列はＣ末端リジン残基を欠いている。本開示のＣＤ８３結合タンパク質のＶＬ配列のＣ末端リジンを例えば、ＣＤ８３結合タンパク質の産生もしくは精製中に、またはＣＤ８３結合タンパク質のＶＬをコードする核酸の遺伝子組み換え操作により除去してよい。したがって、ＣＤ８３結合タンパク質はＶＬのＣ末端リジン残基が全て除去された集団、ＶＬのＣ末端リジン残基が除去されていない集団、またはＶＬのＣ末端リジン残基があるタンパク質、及びそれがないタンパク質の混合物を有する集団を含んでよい。幾つかの実施例では、タンパク質の集団は更に、２つのＶＬ（その中の１つのＶＬにおいて、Ｃ末端リジン残基が除去されている）を有するタンパク質を含んでよい。同様に、タンパク質組成物はＶＬのＣ末端リジン残基があるタンパク質、もしくはそれがないタンパク質集団の同一または類似の混合物を含んでよい。
所望により、ＶＨは重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１重鎖定常領域に結合する。一実施例において、重鎖定常領域はＣ末端リジン残基を欠いている。
所望により、ＶＬは軽鎖定常領域に結合する。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質はシンヒューマナイズドタンパク質であってよい。
用語「シンヒューマナイズドタンパク質」とは、ＵＳ２００８００９５７６７に記載されている方法により作製したタンパク質を意味する。シンヒューマナイズドＣＤ８３結合タンパク質は抗体の可変領域を含み、該可変領域は、新世界霊長類抗体可変領域のＦＲ、及び非新世界霊長類抗体可変領域のＣＤＲからなる。例えば、シンヒューマナイズドＣＤ８３結合タンパク質は抗体の可変領域を含み、該可変領域は新世界霊長類抗体可変領域のＦＲ、及びマウスまたはラット抗体のＣＤＲからなる。一実施例において、シンヒューマナイズドＣＤ８３結合タンパク質は可変領域の１つまたは両方がシンヒューマナイズドされたＣＤ８３結合抗体である。本用語はまた、例えば１つ以上のシンヒューマナイズド可変領域、及び１つ以上の、例えばヒト可変領域またはヒト化可変領域またはキメラ可変領域からなる複合タンパク質を包含する。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質は霊長類化タンパク質であってよい。「霊長類化タンパク質」は、以下の非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）への免疫化により発生した抗体の可変領域を含む。所望により、非ヒト霊長類抗体の可変領域をヒト定常部に結合させ、霊長類化抗体を産生する。代表的な霊長類化抗体の産生方法は、ＵＳ６１１３８９８に記載されている。本用語はまた、例えば、１つ以上の霊長類化可変領域、及び１つ以上の、例えばヒト可変領域またはヒト化可変領域またはキメラ可変領域からなる複合タンパク質も包含する。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質はキメラタンパク質である。用語「キメラタンパク質」は、抗原結合領域が特定の種（例えばマウスまたはラット等のネズミ）からのものである、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する一方で、タンパク質の残部が別の種（例えばヒトまたは非ヒト霊長類）に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属するタンパク質からのものであるタンパク質を意味する。一実施例において、キメラタンパク質は非ヒト抗体（例えばネズミ抗体）のＶＨ及び／またはＶＬを含むキメラ抗体であり、抗体の残りの領域はヒト抗体である。かかるキメラタンパク質の産生は当該技術分野において公知であり、標準的な手段（例えばＵＳ６３３１４１５；ＵＳ５８０７７１５；ＵＳ４８１６５６７、及びＵＳ４８１６３９７に記載されている）により達成され得る。本用語はまた、例えば、１つ以上のキメラ可変領域及び１つ以上の、例えばヒト可変領域またはヒト化可変領域またはキメラ可変領域からなる複合タンパク質も包含する。
本開示はまた、例えばＷＯ２０００／３４３１７及びＵＳ２００７０２９２４１６に開示されている脱免疫化ＣＤ８３結合タンパク質も考慮する。
脱免疫化抗体及びタンパク質では１つ以上のエピトープ、例えばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープが除去される（すなわち突然変異する）ことにより、その被験体の抗体またはタンパク質に対する免疫応答の上昇可能性を低下させる。例えば、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を分析し、１つ以上のＢまたはＴ細胞エピトープ、及びエピトープ内の１つ以上のアミノ酸残基が突然変異したことにより、ＣＤ８３結合タンパク質の免疫原性が低下したことを同定した。
前述の開示から、当業者には「複合」タンパク質は一形態（例えばヒト）のＶＨ、及び別の形態（例えばヒト化）のＶＬを含むことが明らかとなるであろう。本開示はＶＨ及びＶＬの全ての形態の組み合わせを明確に包含する。
抗原結合領域を含むその他のＣＤ８３結合タンパク質
本開示はまた、抗体の可変領域または抗原結合領域からなる他のＣＤ８３結合タンパク質も包含し、例えば以下のようなものがある：
（ｉ） 例えばＵＳ６２４８５１６に記載されるような、抗体のＶＨまたはＶＬの全てまたは一部を含む単一ポリペプチド鎖である、単一領域抗体；
（ｉｉ） 例えばＵＳ５８４４０９４及び／またはＵＳ２００８１５２５８６に記載されている二重特異性抗体、三重特異性抗体、及び四重特異性抗体；
（ｉｉｉ） 例えばＵＳ５２６０２０３に記載されているｓｃＦｖ；
（ｉｖ） 例えばＵＳ５８３７８２１に記載されている低分子抗体；
（ｖ） 例えばＵＳ５７３１１６８に記載されている、「鍵と鍵穴モデルの（ｋｅｙ ａｎｄ ｈｏｌｅ）」二重特異的タンパク質類；
（ｖｉ） 例えばＵＳ４６７６９８０に記載されている、ヘテロ結合タンパク質；
（ｖｉｉ） 例えばＵＳ４６７６９８０に記載されている化学クロスリンカーを使用して産生するヘテロ結合タンパク質；
（ｖｉｉｉ）例えばＳｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５，１９９２に開示されているＦａｂ’−ＳＨ断片；または
（ｉｘ） 例えばＥＰ１９９３０３０２８９４に開示されているＦａｂ３。
定常領域の融合
本開示は、抗体の抗原結合領域、及び定常領域またはＦｃもしくはその領域、例えばＣＨ２及び／またはＣＨ３領域からなるＣＤ８３結合タンパク質を包含する。好適な定常部及び／または領域は当業者に明らかとなるであろう。かつ／またはかかるポリペプチドの配列は一般に利用可能なデータベースから速やかに入手可能である。Ｋａｂａｔらはまた、幾つかの好適な定常部／領域の説明を行っている。
その定常部及び／または領域は、二量化、血清の半減期の延長（例えばＦｃＲｎへの結合により）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）等の生物活性を付与するのに有用である。
本開示はまた、例えばＵＳ７２１７７９７；ＵＳ７２１７７９８；またはＵＳ２００９００４１７７０（増加した半減期を有する）もしくはＵＳ７３５５００８ （増加したＡＤＣＣ）に記載されている、突然変異型定常部または領域からなるＣＤ８３結合タンパク質を考慮する。
定常領域またはＦｃを含む本開示のＣＤ８３結合タンパク質の重鎖定常領域のＣ末端リジンを、例えば、ＣＤ８３結合タンパク質の産生もしくは生成中に、またはＣＤ８３結合タンパク質の重鎖をコードする核酸の遺伝子組み換え操作により、除去してよい。したがって、ＣＤ８３結合タンパク質は、重鎖定常領域の全てのＣ末端リジン残基を除去した集団、重鎖定常領域のＣ末端リジン残基を除去しない集団、または重鎖定常領域のＣ末端リジン残基がある、及びそれがないタンパク質の混合物を有する集団を含んでよい。幾つかの実施例では、タンパク質集団は更に、重鎖定常領域の一方において重鎖定常領域のＣ末端リジン残基が除去された、２つの重鎖定常領域を有するタンパク質を含んでよい。同様に、タンパク質組成物は、重鎖定常領域のＣ末端リジン残基がある、またはそれがないタンパク質集団の同一または類似の混合物を含んでよい。
エフェクター機能の向上
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質はエフェクター機能または向上したエフェクター機能を誘発する。
本開示との関係においては、「エフェクター機能」とは、細胞を殺すことになる抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域もしくはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に結合する細胞またはタンパク質により仲介される、これらの生物活性を意味する。抗体により誘発されるエフェクター機能の例としては、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；及びＢ細胞活性化が挙げられる。
「抗体依存性細胞傷害」またはＡＤＣＣ」とは、結合した抗体のＦｃ領域を認識するＦｃレセプターを有するエフェクター細胞（例えばナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞、好中球及びマクロファージ）による、抗体被覆標的細胞の細胞溶解を意味する。関係する分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロでのＡＤＣＣアッセイを実施してよい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、ヒト末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）及びＮＫ細胞が挙げられる。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ等のエフェクター機能を誘発することが可能な方法で細胞表面上のＣＤ８３に結合する。
例えば、ＣＤ８３結合タンパク質は細胞表面上のＣＤ８３に十分な時間結合し続け、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ等のエフェクター機能を誘発する。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、例えば修飾Ｆｃ領域により、または免疫エフェクター細胞に結合可能な領域を含むことにより、向上したエフェクター機能を誘発することができる。例えば、エフェクター機能のレベルは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３ Ｆｃ領域により誘発されるレベルと比較して増加する。本開示のＣＤ８３結合タンパク質により誘発されたエフェクター機能の向上は、例えば状態の原因となる、例えば炎症性及び／もしくは自己免疫性状態または疾患における、異常または不必要な免疫応答を調節する細胞、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞（ＤＣ））及び／もしくはリンパ球（例えばＴ細胞）を殺すまたは枯渇させることによる、治療または予防効果の向上をもたらし得る。一実施例において、例えば、同種異系Ｔ細胞を刺激するＣＤ８３＋細胞を殺すまたは枯渇させることで、エフェクター機能の向上によりＴ細胞の同種異系間刺激が妨げられる。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質のＦｃ領域を修飾して、修飾しないＦｃ領域と比較して誘発可能なエフェクター機能のレベルを向上させる。かかる修飾は、アミノ酸レベル、及び／もしくは二次構造レベル、及び／もしくは三次構造レベルにて、並びに／またはＦｃ領域のグリコシル化に行うことが可能である。
当業者は、より大きなエフェクター機能が任意の多数の方法で、例えば、より大きな効果のレベルで、より効果が持続して、またはより速い効果速度で発生することを理解するであろう。
一実施例において、Ｆｃ領域は、向上したエフェクター機能を誘発する能力を高める、１つ以上のアミノ酸の修飾を含む。一実施例において、Ｆｃ領域は１つ以上のＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩに、より高い親和性で結合する。一実施例において、Ｆｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによりナンバリングされた２３０、２３３、２３４、２３５、２３９、２４０、２４３、２６４、２６６、２７２、２７４、２７５、２７６、２７８、３０２、３１８、３２４、３２５、３２６、３２８、３３０、３３２、及び３３５：からなる群から選択される位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換基を含む。一実施例において、Ｆｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによりナンバリングされた以下のアミノ酸置換基Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを含む。このＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較してＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性が約１４倍増加し、野生型Ｆｃ領域と比較して約３．３倍増加したＡＤＣＣの誘発能力を有する。一実施例において、Ｆｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによりナンバリングされた以下のアミノ酸置換基Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含む。このＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較してＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性が約１３８倍増加し、野生型Ｆｃ領域と比較して約３２３倍増加したＡＤＣＣ誘発能力を有する。
Ｆｃ領域の能力を増加させてエフェクター機能を誘発する追加のアミノ酸置換基は、当技術分野において既知である、及び／または例えばＵＳ６７３７０５６もしくはＵＳ７３１７０９１に記載されている。
一実施例において、Ｆｃ領域のグリコシル化を変質させて、向上したエフェクター機能を誘発する能力を高める。これに関し、哺乳類細胞により産生された天然抗体は通常、Ｎ結合によりＦｃ領域のＣＨ２領域のＡｓｎ２９７に通常結合した、分枝状の二分枝オリゴ糖（ｂｒａｎｃｈｅｄ， ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含む。オリゴ糖は例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分枝オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃに結合したフコース等の種々の炭化水素を含んでよい。幾つかの実施例では、本開示のＦｃ領域はＦｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を含む、すなわち、Ｆｃ領域が「脱フコシル化」している、または「アフコシル化」している。かかる変異体は、ＡＤＣＣを誘発する向上した能力を有する。脱フコシル化抗体の産生方法としては、抗体またはその抗原結合断片を、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を発現できない細胞株内で発現させること（例えば、Ｙｕｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８７：６１４−６２２，２００４に記載されている）、抗体またはその抗原結合断片を、ＦＵＴ８に対して低分子干渉ＲＮＡを発現する細胞内で発現させること（例えば、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．，８８：９０１−９０８，２００４に記載されている）、抗体またはその抗原結合断片を、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）−マンノース４，６−ヒドラターゼ（ＧＭＤ）を発現できない細胞内で発現させること（例えば、Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３０：３００−３１０，２００７に記載されている）が挙げられる。本開示はまた、例えばβ−（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を発現するように修飾した細胞株（例えばＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０，１９９９に記載されている）を用いて生産した、フコシル化のレベルが低下した抗体またはその抗原結合断片の使用を考慮する。
一実施例において、本開示の抗体は脱フコシル化している。例えば、 抗体は、ＦＵＴ８を発現しない、またはキフネンシン等のＮ−グリカン処理の阻害剤により処理した細胞中（例えばＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞）にて産生される。
他の方法としては、Ｆｃにより仲介される向上したエフェクター機能を誘発可能な抗体を固有に産生する細胞株（例えば、ウイルス性ワクチン作製用のアヒル胚由来の幹細胞、ＵＳ２０１０００６２４８９；トリＥＢＸ(登録商標)細胞内での組み換えタンパク質の産生、ＵＳ２０１００２２６９１２）の使用が挙げられる。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質はまた、バイセクトオリゴ糖、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分枝オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分割されたオリゴ糖のタンパク質を含む。
かかる免疫グロブリンはフコシル化を低下させる、及び／またはＡＤＣＣ機能を向上させる。かかる抗体またはその抗原結合断片の例は例えば、ＵＳ６６０２６８４及びＵＳ２００５０１２３５４６に記載されている。
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有するＣＤ８３結合タンパク質もまた、考慮される。
かかる免疫グロブリンは向上したＣＤＣ機能を有し得る。かかる免疫グロブリンは例えば、ＷＯ１９９７／３００８７及びＷ０１９９９／２２７６４に記載されている。
ＣＤ８３結合タンパク質はまた、レベルが向上したＣＤＣを誘発可能なＦｃ領域も含むことができる。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３のハイブリッドはＣＤＣ活性が向上した抗体を産生する（Ｎａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：３８６３−３８７２，２００８）。
ＣＤ８３結合タンパク質はまた、または代わりに、例えばＣＤ３またはＣＤ１６に結合することによって免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質（例えば抗体の可変領域）に縮合または結合することができる。
エフェクター機能の決定方法は、当技術分野において既知である。一実施例において、ＡＤＣＣ活性のレベルを、５１Ｃｒリリースアッセイ、ユーロピウムリリースアッセイ、または３５Ｓリリースアッセイを使用して評価する。これらのアッセイのそれぞれにおいて、ＣＤ８３を発現する細胞を１つ以上の列挙した化合物により、しばらくの間、化合物が細胞により十分に占有される条件化にて培養する。３５Ｓリリースアッセイの場合、細胞を３５Ｓラベルしたメチオニン及び／またはシステインにより、ラベルしたアミノ酸が新たに合成したタンパク質中に取り込まれるための十分な時間の間、培養することができる。
細胞を次いで、タンパク質の存在下または不存在下にて、並びに免疫エフェクター細胞、例えばＰＢＭＣ及び／もしくはＮＫ細胞の存在下で培養する。細胞培養培地中の５１Ｃｒ、ユーロピウム及び／または３５Ｓを次いで検出し、免疫グロブリンの不存在下と比較した、タンパク質の存在下での増加により、結合分子／剤がエフェクター機能を有することが示される。
免疫グロブリンにより誘発されたＡＤＣＣのレベルを評価するアッセイを開示している代表的な出版物としては、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９−７０６３，１９８６、及びＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１，１９８７が挙げられる。
免疫グロブリンにより誘発されたＡＤＣＣのレベルを評価する別のアッセイとしては、ＡＣＴＩＴＭ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＣｙｔｏＴｏｘ ９６(R)Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）が挙げられる。
あるいは、または更に、１つ以上のＦｃγＲ、例えばＵＳ７３１７０９１に記載されているものに対する親和性を求めることにより、ＣＤ８３結合タンパク質のエフェクター機能を評価する。
ＣＤ８３結合タンパク質がＣ１ｑに結合可能であり、かつＣＤＣを誘発し得ることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイもまた実施してよい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３，１９９６を参照のこと）。
別の実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質はタンパク質の半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換基を含む。
例えば、ＣＤ８３結合タンパク質は、胎生Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）に対する定常部の親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換基からなる定常部を含む。例えば、定常部は低ｐＨ、例えばｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対する親和性を増加させ、エンドソーム中でのＦｃ／ＦｃＲｎ結合を促進する。一実施例において、定常部は、ｐＨ約６でのＦｃＲｎに対する親和性が、ｐＨ約７．４での親和性と比較して増加し、Ｆｃの血液中への再放出に続く細胞の再利用を促進する。これらのアミノ酸置換基は、血液からのクリアランスを減少させることで、ＣＤ８３結合タンパク質の半減期の延長に有用である。
代表的なアミノ酸置換基としては、ＥＵナンバリングシステムによるＴ２５０Ｑ及び／またはＭ４２８ＬまたはＴ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ及びＴ２６６ＦまたはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６ＥまたはＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆが挙げられる。
更なるまたは代わりのアミノ酸置換基は、例えばＵＳ２００７０１３５６２０またはＵＳ７０８３７８４に記載されている。
変異ＣＤ８３結合タンパク質
本開示はまた、本明細書にて開示した配列と少なくとも８０％は同一の配列をコードするＣＤ８３結合タンパク質または核酸を提供する。一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質または核酸は、本明細書にて開示された配列に、少なくとも約８０％、または８１％、または８２％、または８３％、または８４％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７、または９８％、または９９％同一の配列を含み、ここでタンパク質はＣＤ８３に特異的に結合する。
あるいは、または更に、ＣＤ８３結合タンパク質は、本明細書に記載された任意の実施例のＶＨまたはＶＬのＣＤＲと、少なくとも約３０％、または３５％、または４０％、または４５％、または５０％、または５５％、または６０％、または６５％、または７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一のＣＤＲ（例えば３つのＣＤＲ）を含む。ここでタンパク質はＣＤ８３に特異的に結合可能である。これに関し、発明者らはＣＤＲ内に多様な配列を有する多数の抗体を作製した。タンパク質ＣＤ８３の結合を求める方法は、本明細書に記載される。
例えば、発明者らは軽鎖ＣＤＲ１内で少なくとも約６０％の同一性を共有する、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる、軽鎖ＣＤＲ１内で少なくとも約６５％、または７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％の同一性を有するＣＤ８３結合タンパク質の群を同定した。
発明者らはまた、軽鎖ＣＤＲ２内で７０％の同一性を共有する、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる、軽鎖ＣＤＲ２内で少なくとも約７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％の同一性を有するＣＤ８３結合タンパク質の群を同定した。
発明者らはまた、軽鎖ＣＤＲ３内で３０％の同一性を共有する、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより、軽鎖ＣＤＲ３内で少なくとも約３５％、または４０％、または４５％、または５０％、または５５％、または６０％、または６５％、または７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％の同一性を有するＣＤ８３結合タンパク質を同定した。
本明細書で論ずるとおり、軽鎖ＣＤＲ１の４つのＮ末端アミノ酸を削除することができる、または１つ以上のこれらのアミノ酸を、他の自然発生するアミノ酸によって置換することができる（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１３３−１３９，１９９５）。したがって、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、本明細書にて開示された軽鎖ＣＤＲ１配列と少なくとも約７０％の同一性を有するＣＤＲ１を含むことができる。
別の実施例において、 本開示の核酸は本明細書にて開示された配列と、少なくとも約８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一であり、ＣＤ８３に特異的に結合可能なＣＤ８３結合タンパク質をコードする配列を含む。本開示はまた、本開示のＣＤ８３結合タンパク質をコードする核酸も含み、遺伝暗号の縮退の結果、本明細書で例示される配列とは異なる。
核酸またはポリペプチドの同一性％は、ギャップ開始ペナルティ＝５、ギャップ伸張ペナルティ＝０．３としたＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３，１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）により求められる。クエリー配列は少なくとも長さで５０個の残基であり、ＧＡＰ分析が２つの配列を、少なくとも５０個の残基の領域にわたって割り当てる。例えば、クエリー配列は少なくとも長さで１００個の残基であり、ＧＡＰ分析が２つの配列を、少なくとも１００個の残基の領域にわたって割り当てる。例えば、２つの配列はその長さ全体にわたって割り当てられる。
上述のように、本開示はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にて、本明細書に記載されるＣＤ８３結合タンパク質をコードする核酸、例えば、抗体３Ｃ１２、３Ｃ１２．Ｂ、３Ｃ１２．Ｃ、３Ｃ１２．Ｄ、または３Ｃ１２．ＥのＶＨまたはＶＬをコードする核酸にハイブリダイズする核酸も考慮する。
「適度なストリンジェンシー」は、本明細書では、４５℃〜６５℃の範囲の温度における２×ＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ内、または同等の条件にて実施する、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄状態として定義される。「高ストリンジェンシー」は本明細書では、０．１×ＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、もしくは更に低い塩濃度、かつ少なくとも６５℃の温度、または同等の条件にて実施されるハイブリダイゼーション及び／または洗浄状態として定義される。
本明細書における、特定のレベルのストリンジェンシーへの言及は、当業者に知られている、ＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリダイゼーション溶液を使用した同等の条件を含む。例えば、二本鎖核酸の鎖が解離する温度（融解温度、またはＴｍとしても知られている）の計算方法は、当技術分野において既知である。核酸のＴｍに類似（例えば５℃以内、もしくは１０℃以内）または等しい温度は、高ストリンジェンシーであると考えられる。中ストリンジェンシーは、核酸の計算したＴｍの１０℃〜２０℃、または１０℃〜１５℃以内であると考えるべきである。
本開示はまた、本明細書で説明した配列と比較して、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む本開示のＣＤ８３結合タンパク質の突然変異型を考慮する。
幾つかの実施例では、ＣＤ８３結合タンパク質は１０個以下の、例えば９、または８、または７、または６、または５、または４、または３、または２、または１個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖及び／または疎水性及び／または親水性を有するアミノ酸残基によって置き換えられている置換である。
類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当該技術で定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。疎水性指標は例えば、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２，１９８２に記載されており、親水性指標は例えば、ＵＳ４５５４１０１に開示されている。
本開示はまた、非保存的アミノ酸の変更も考慮する。例えば、特に興味深いのは、荷電アミノ酸と、他の荷電アミノ酸、及び中性または正荷電アミノ酸との置換である。幾つかの実施例では、ＣＤ８３結合タンパク質は、１０個以下、例えば９、または８、または７、または６、または５、または４、または３、または２、または１個の非保存的アミノ酸置換を含む。
一実施例において、突然変異は、本開示のＣＤ８３結合タンパク質の抗原結合領域のＦＲ内で発生する。別の実施例において、突然変異は本開示のＣＤ８３結合タンパク質のＣＤＲ内で発生する。
ＣＤ８３結合タンパク質の突然変異型の代表的な作製方法としては、以下が挙げられる：
・ ＤＮＡの突然変異誘発（Ｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２５：３０９−３２２，２００９）またはＲＮＡの突然変異誘発（Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０７：１６３−１６８，２００６；Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：１８，２００７；及びＷＯ １９９９／０５８６６１）；
・ ポリペプチドをコードする核酸を突然変異誘発細胞、例えばＸＬ−１ Ｒｅｄ、ＸＬ−ｍｕｔＳ及びＸＬ−ｍｕｔＳ−Ｋａｎｒ細菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に導入すること；
・ ＤＮＡシャッフリング、例えばＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−９１，１９９４に記載されているもの；並びに
・ 部分特異的突然変異誘発、例えばＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（ｅｄ）及びＤｖｅｋｓｌｅｒ（ｅｄ）（（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５内）に記載されているもの。
本開示の突然変異型ＣＤ８３結合タンパク質の生物活性を求める代表的な方法は当事者に明らかとなるであろう、及び／または本明細書に記載される、例えば抗原結合である。例えば、抗原結合、結合の競争的阻害、親和性、会合、解離及び治療効果の測定方法は本明細書に記載される。
代表的なＣＤ８３結合タンパク質
発明者らにより作製されたＣＤ８３結合タンパク質を含む代表的な可変領域、及びそれらをコードする核酸は表１及び２に記載されている。
タンパク質の産生方法
組み換え発現
本明細書で論ずるとおり、本開示のＣＤ８３結合タンパク質及び／または１つ以上のそのポリペプチドをコードする核酸を、プロモーターに作用可能に結合して発現を促進するように、発現構築物内に導入する。発現構築物の作製方法、例えば発現構築物／ベクター内にクローニングすることは、当技術分野において既知である、かつ／またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ ０４７ １５０３３８，１９８７内）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１内）並びにＵＳ７２７０９６９に記載されている。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は細菌細胞内に発現する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．からなる群から選択される細菌細胞等の細菌細胞内での発現に好適な、典型的なプロモーターとしては、ｌａｃｚ、Ｉｐｐ、感温性ＬまたはＲプロモーター、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６またはＩＰＴＧを誘導可能なｔａｃプロモーターもしくはｌａｃＵＶ５プロモーター等の準人工プロモーター等のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質は酵母細胞内に発現する。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅ等の酵母細胞内での発現に好適な典型的なプロモーターとしては、以下の遺伝子、ＡＤＨ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＣＵＰ１、ＰＨＯ５、ｎｍｔ、ＲＰＲ１、またはＴＥＦ１からのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
更なる実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質は昆虫細胞内に発現する。昆虫細胞、または昆虫内での発現に好適な典型的なプロモーターとしては、ＯＰＥＩ２プロモーター、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｕｒｉから単離した昆虫アクチンプロモーター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐ．ｄｓｈプロモーター（Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：，１３−２５， ２０００）が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質はまた、植物細胞内に発現することもできる。植物細胞内でペプチドを発現させるためのプロモーターは、当技術分野において既知であり、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅアミラーゼ遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子プロモーター、並びにアウキシン誘発性植物プロモーターＰ１及びＰ２が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は哺乳動物細胞内または哺乳類内に発現する。哺乳動物細胞内での発現に好適な典型的なプロモーターとしては、例えばレトロウイルス型ＬＴＲ因子、ＳＶ４０ ｅａｒｌｙプロモーター、ＳＶ４０ ｌａｔｅプロモーター、ＣＭＶ ＩＥ（サイトメガロウイルスｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーター、ＥＦ１プロモーター（ヒト延長因子１から）、ＥＭ７プロモーター、ＵｂＣプロモーター（ヒトユビキチンＣ）からなる群から選択されるプロモーターが挙げられる。有用な哺乳類宿主細胞株としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株；ヒト胎児腎臓細胞株（ＨＥＫ−２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞株（ＢＨＫ）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；または骨髄腫細胞（例えばＮＳ／０細胞）が挙げられる。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質の発現に使用される代表的な細胞はＣＨＯ細胞、骨髄腫またはＨＥＫ細胞である。細胞は更に、修飾した抗体の発現を促進する１つ以上の遺伝子変異及び／または欠失を含んでよい。１つの非限定的例としては、発現した免疫グロブリンまたは抗体のフコシル化に必要な酵素をコードする遺伝子の欠失がある。例えば、欠失遺伝子はＦＵＴ８をコードする。ＦＵＴ８を欠失したＣＨＯ細胞の市販元は、Ｂｉｏｗａ（ＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔＴＭ細胞）である。例えば、脱フコシル化した免疫グロブリンまたは抗体の発現に使用する細胞は、ＢｉｏｗａのＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔＴＭ細胞等の、ＦＵＴ８を欠失したＣＨＯ細胞である。
発現構築物／ベクターの他の因子は、当技術分野において既知であり、例えば、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化配列、選択可能または検出可能なマーカー、及び複製起点をコードする核酸が挙げられる。
一実施例において、発現構築物バイシストロニックな発現構築物である。「バイシストロニックな」とは、核酸の異なる領域から２つの別のポリペプチドをコード可能な単一の核酸分子、例えば、ＶＨ含有ポリペプチド及びＶＬ含有ポリペプチドを異なるポリペプチドしてコード可能な、単一の核酸を意味する。
一般に、それぞれ異なるポリペプチドをコードする領域は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により分離されており、かつＩＲＥＳの５’領域は転写終結配列を含まない。代表的なＩＲＥＳは、例えばＵＳ２００９０２４７４５５に記載されている。
好適な発現構築物の作製の後、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、発現構築物を好適な細胞内に組み込む。代表的な方法としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランにより仲介されるトランスフェクション、例えば、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）及び／またはリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用することによる、リポソームにより仲介されるトランスフェクション、ＰＥＧにより仲介されるＤＮＡの取り込み、例えば、ＤＮＡをコーティングしたタングステン、または金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用することによる、電気穿孔法及び微粒子衝突法等が挙げられる。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質の産生に使用する細胞を次いで、当該技術分野において公知の条件下にて培養し、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を産生する。
無細胞発現系、例えば、ＴＮＴ Ｔ７及びＴＮＴ Ｔ３系（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴ及びｐＥＸＰ２−ＤＥＳＴ ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もまた、本開示にて考慮される。
タンパク質精製
産生／発現の後、当該技術分野において公知の方法を使用して、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を精製する。かかる精製は、非特異的なタンパク質、酸、脂質、炭化水素等を実質的に含まない、本開示のタンパク質を提供する。一実施例において、タンパク質を調製し、調製中のタンパク質の約９０以上（例えば９５％、９８％、または９９％）は本開示のＣＤ８３結合タンパク質である。
単離した本開示のＣＤ８３結合タンパク質を得るためにペプチド精製の標準的な方法を用いる。様々な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及びサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、相分離法、電気泳動分離、沈殿法、塩析法（ｓａｌｔｉｎｇｉｎ／ｏｕｔ ｍｅｔｈｏｄ）、免疫クロマトグラフィー等のＨＰＬＣでないポリペプチド分離プロトコール、並びに／または他の方法を含むが、これらに限定されない。
一実施例において、親和性精製は標識を含む融合タンパク質の分離に有用である。親和性クロマトグラフィーを使用したタンパク質の分離方法は、当技術分野において既知であり、例えばＳｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４内）に記載されている。
例えば、標識に結合する抗体または化合物（ポリヒスチジンタグの場合、標識は例えばニッケル−ＮＴＡである）は固体の支持体上に固定される。タンパク質を含むサンプルを次いで、しばらくの間、結合を発生させるのに十分な条件下で、不動化抗体または化合物と接触させる。洗浄して、結合していない、または非特異的に結合しているタンパク質を全て除去し、タンパク質を溶出する。
抗体のＦｃ領域を含むＣＤ８３結合タンパク質の場合、プロテインＡもしくはタンパク質Ｇまたはその修飾形態を、親和性精製に使用することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖Ｆｃ領域を含む精製タンパク質の分離に有用である。タンパク質Ｇは、全てのマウスＦｃアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される。
結合
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は化合物に結合する。例えば、化合物は放射性同位体、検出可能な標識、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、被験体内のＣＤ８３結合タンパク質の半減期を増加させる化合物、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
化合物はＣＤ８３結合タンパク質に直接的にまたは間接的に結合することができる（例えば間接結合の場合、リンカーを含むことができる）。化合物の例としては、放射性同位体（例えばヨウ素１３１、イットリウム９０またはインジウム１１１）、検出可能な標識（例えば蛍光色素分子または蛍光性ナノ結晶）、治療用化合物（例えば化学療法用化合物または抗炎症化合物）、コロイド（例えば金）、毒素（例えばリシンまたは破傷風トキソイド）、核酸、ペプチド（例えば血清アルブミン結合ペプチド）、タンパク質（抗体の抗原結合領域または血清アルブミンを含むタンパク質）、被験体内のＣＤ８３結合タンパク質の半減期を増加させる化合物（例えば本活性を有するポリエチレングリコールまたは他の水溶性ポリマー）、及びこれらの混合物が挙げられる。本開示のＣＤ８３結合タンパク質に結合可能な代表的な化合物、及びかかる結合の方法は、当技術分野において既知であり、例えばＵＳ２０１０２２１２６２に記載されている。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質に結合可能な幾つかの代表的な化合物を表３に記載する。
スクリーニングアッセイ
本開示のＣＤ８３結合タンパク質を速やかに、生物活性のために、例えば後述のようにスクリーニングする。
結合アッセイ
アッセイの一形態は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４内）に記載されている抗原結合アッセイである。かかる方法は一般に、ＣＤ８３結合タンパク質をラべリングすること、及びそれを不動化抗原接触させることを伴う。非特異的に結合したタンパク質を洗浄した後、標識の量、及び結果として結合したタンパク質を検出する。もちろん、ＣＤ８３結合タンパク質を固定して抗原を標識することもできる。例えば本明細書に記述または例示されるパニング型アッセイも使用することができる。あるいは、または更に、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することができる。
一実施例において、ＣＤ８３のエピトープを含むペプチドにより結合アッセイを実施する。このようにして、ＣＤ８３の特定領域に結合するＣＤ８３結合タンパク質を選択する。
生体内アッセイ
本開示のＣＤ８３結合タンパク質はまた、状態、例えばＣＤ８３により仲介された状態の動物モデルにおける治療効果の評価を行うことができる。例えば、ＣＤ８３結合タンパク質を、炎症性腸疾患または大腸炎（例えばデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）により誘発される大腸炎、もしくは大腸炎のＣＤ４５Ｒｂ養子免疫伝達モデル（例えばＫａｎａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．１２： ８９−９９，２００６））のモデルに投与する。別の実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質を、多発性硬化症のモデル、例えば、マウスまたはラットがミエリン鞘タンパク質またはそこから誘導したペプチド（例えばＭＯＧ、ＭＢＰまたはＰＬＰ）により免疫化され、免疫応答をタンパク質に対して発生することにより、多発性硬化症のモデルを誘発するＥＡＥモデルに投与する。代表的なＥＡＥモデルは例えば、Ｔｓｕｎｏｄａ ａｎｄ Ｆｕｊｉｎａｍｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５５：６７３−６８６，１９９６にて考察されている。
ＣＤ８３結合タンパク質はまた、または代わりに、関節炎モデル、例えばＳＫＧ株のマウス（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２６：４５４−４６０，１９９５）、 ラットＩＩ型コラーゲン関節炎モデル、マウスＩＩ型コラーゲン関節炎モデル、もしくは抗原誘発性関節炎モデル（Ｂｅｎｄｅｌｅ Ｊ．Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ．Ｎｅｕｒｏｎ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１：３７７−３８５，２００１）、及び／または炎症性呼吸器疾患症候群モデル（例えばＯＶＡチャレンジもしくはゴキブリ抗原チャレンジ）でテストすることもできる。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質の治療効果はまた、または代わりに、移植片対宿主反応、例えばある動物からの脾細胞が同種異系動物（例えばＭＨＣまたはＨＬＡが一致しない動物）に注入されたモデルで評価することもできる。一実施例において、全身への亜致死照射により、ヒト樹状細胞を必要とする移植片対宿主反応が仲介する致死ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発した後、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、例えば腹腔内注射により異種ＳＣＩＤマウスモデルに移植する。本開示のＣＤ８３結合タンパク質による治療を、例えばＰＢＭＣ移植の日（０日目）に腹腔内注射によりマウスに投与することができる。マウスのＧＶＤＨの臨床症状をスコアづけた。
競合結合アッセイ
本開示の抗体の結合を競合的に阻害するＣＤ８３結合タンパク質を求めるためのアッセイは当業者に明らかとなるであろう。例えば、本開示の抗体を検出可能な標識、例えば蛍光標識または放射性標識と結合する。標識した抗体及び試験ＣＤ８３結合タンパク質を次いで混合し、ＣＤ８３またはそのエピトープを含むペプチドと接触させる。標識した抗体を次いで求め、ＣＤ８３結合タンパク質の不存在下で、標識した抗体をＣＤ８３またはそのエピトープを含むペプチドと接触させる時に、求めたレベルと比較する。ＣＤ８３結合タンパク質の不存在下と比較して、ＣＤ８３結合タンパク質の存在下において、標識した抗体のレベルが減少した場合、ＣＤ８３結合タンパク質は抗体を競合的に阻害する。
所望により、ＣＤ８３結合タンパク質を該抗体と異なる標識と結合させる。これにより、ＣＤ８３結合タンパク質の、ＣＤ８３またはエピトープを有するペプチドとの結合レベルの検出が可能となる。
別の実施例において、ＣＤ８３またはペプチドを本明細書に記載される抗体と接触させる前に、ＣＤ８３結合タンパク質をＣＤ８３またはそのエピトープを含むペプチドと結合することができる。ＣＤ８３結合タンパク質の不存在下と比較して、ＣＤ８３結合タンパク質の存在下において結合抗体の量が低下することは、ＣＤ８３結合タンパク質が、抗体のＣＤ８３への結合を競合的に阻害することを示す。標識したＣＤ８３結合タンパク質を使用して、正逆交雑アッセイもまた行うことができ、抗体がＣＤ８３またはペプチドに結合することをまず可能にする。この場合、抗体の不存在化と比較して、抗体の存在下において、ＣＤ８３またはペプチドに結合した、標識したＣＤ８３結合タンパク質の量が低下することは、ＣＤ８３結合タンパク質が、抗体のＣＤ８３への結合を競合的に阻害することを示す。
エピトープマッピングアッセイ
別の実施例において、本明細書に記載されたタンパク質により結合したエピトープをマッピングする。エピトープのマッピング方法は当業者に明らかとなるであろう。例えば、関係するペプチド、例えば１０〜１５個のアミノ酸を含むペプチドからなるＣＤ８３配列またはその領域にまたがる一連の重なり合ったペプチドを作製する。ＣＤ８３結合タンパク質を次いで、各ペプチドまたはその組み合わせと接触させ、タンパク質が結合するペプチドを求める。これにより、ＣＤ８３結合タンパク質が結合するエピトープを含むペプチドの決定が可能になる。複数の不連続ペプチドがタンパク質により結合すると、タンパク質は立体構造エピトープを結合する。
あるいは、または更に、ＣＤ８３内のアミノ酸残基を、例えばアラニン走査変異誘発により突然変異させ、タンパク質の結合を低減または妨げる突然変異体を求める。ＣＤ８３結合タンパク質の結合を低減または妨げるあらゆる突然変異体はタンパク質により結合したエピトープ内に存在する傾向にある。
更なる方法は、ＣＤ８３またはその領域を、不動化した本開示のＣＤ８３結合タンパク質に結合し、得られたプロテアーゼとの複合物を温浸することを伴う。
不動化タンパク質に結合したままのペプチドを次いで、例えば、質量分析を用いて単離及び分析し、その配列を求める。
更なる方法は、ＣＤ８３内の水素またはその領域を重水素原子に転換し、得られたタンパク質を不動化した本開示のＣＤ８３結合タンパク質に結合することを伴う。重水素原子を次いで転換して水素に戻し、ＣＤ８３またはその領域を単離し、酵素で温浸し、例えば、質量分析を用いて分析して、本明細書に記載されるＣＤ８３結合タンパク質の結合により水素への転換を保護された重水素を含む領域を同定した。
半減期アッセイ
本開示により包含される幾つかのＣＤ８３結合タンパク質は向上した半減期を有する、例えば、改質をして、改質をしていないＣＤ８３結合タンパク質と比較して半減期を長くしている。半減期が向上したＣＤ８３結合タンパク質を求める方法は、当業者に明らかとなるであろう。例えば、ＣＤ８３結合タンパク質が胎生Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に結合する能力を評価する。これに関し、ＦｃＲｎに対する結合親和性の向上は、ＣＤ８３結合タンパク質の血清半減期を増加させた（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４： ２４２９，１９９４）。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質の半減期もまた、薬物動態学的研究により、例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：５４２，１９９４に記載されている方法に従って測定することができる。本方法によれば、放射性標識したＣＤ８３結合タンパク質をマウスに静脈内注射し、マウスの血漿濃度を、例えば注射後３分から７２時間まで、時間に応じて定期的に測定した。こうして得られたクリアランス曲線は二相性でなければならない、すなわち、α相とβ相を有する。ＣＤ８３結合タンパク質のインビボでの半減期の測定のため、β相内でのクリアランス率を計算し、野生型または非改質のＣＤ８３結合タンパク質のクリアランス率と比較する。
安定性アッセイ
本開示のＣＤ８３結合タンパク質の安定性は、様々なアッセイのいずれかにより測定することができる。例えば、ＣＤ８３結合タンパク質をある状態、例えば熱もしくは酸にさらす、または室温にてしばらくの間（例えば１ヶ月）保管する。
ＣＤ８３結合タンパク質の凝集を次いで、濁度測定（不安定度を示す状態への曝露後の濁度の増加による）、サイズ排除クロマトグラフィー、非還元ゲル電気泳動または本明細書に記載された結合もしくは中和研究により評価することができる。
医薬組成物及び治療方法
本開示のＣＤ８３結合タンパク質、またはそれをコードする核酸もしくはそれを発現する細胞（同義語：有効成分）は、予防または治療処置のための非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経口、もしくは局所（ｌｏｃａｌ）投与エアロゾル投与、または経皮投与に対して有用である。
投与のためのＣＤ８３結合タンパク質、またはそれをコードする核酸もしくはそれを発現する細胞の製剤は、投与経路及び選択する製剤（例えば溶液、エマルション、カプセル）により異なる。
投与のためのＣＤ８３結合タンパク質、またはそれをコードする核酸もしくはそれを発現する細胞を含む適切な医薬組成物は、生理学的に許容できるキャリア内で調製することができる。
ＣＤ８３結合タンパク質の混合物もまた使用することができる。溶液またはエマルションに対する好適なキャリアとしては、例えば、水溶液またはアルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられ、生理食塩水及び緩衝培養液を含む。非経口賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル油または不揮発性油を挙げることができる。水、緩衝水、緩衝生理食塩水、ポリオール類（グリセロール、グリセロール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液及びグリシンを含む好適な様々な水性キャリアが当業者に知られている。
静脈内賦形剤は、様々な添加剤、防腐剤、または液体、栄養素もしくは電解質補液（通常、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０を参照のこと）を含むことができる。前記組成物は所望により、適切な生理学的条件のために必要な、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、並びに毒性調整剤等の製薬上許容できる補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムを含むことができる。本開示のＣＤ８３結合タンパク質を、当業者に既知の冷凍保存及び再構成技術に従って使用する前に、保存のために冷凍保存し、好適なキャリア内で再構成することができる。
選択した培地中の有効成分の最適濃度は実験的に、当業者によく知られている手順により求めることができ、最終的な所望の製剤処方によって決まる。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質投与の用量範囲は、所望の効果を生み出すのに十分広い範囲となっている。例えば、組成物は、治療的または予防的に有効量のＣＤ８３結合タンパク質、またはそれをコードする核酸もしくはそれを発現する細胞を含有する。
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、被験体内でのＣＤ８３活性を誘発する／増加させるまたは阻害する／低下させる／妨げるのに十分な量のＣＤ８３結合タンパク質、核酸または細胞を意味すると理解されなければならない。当業者は、かかる量は例えば、ＣＤ８３結合タンパク質、核酸もしくは細胞、及び／または特定の被験体、及び／または治療条件のタイプもしくは厳しさに応じて変化することに気付くであろう。したがって、本用語は開示を特定の量、例えばＣＤ８３結合タンパク質、核酸、または細胞の重量または数に制限すると解釈すべきではない。
本明細書で使用する場合、用語「治療的有効量」は、状態の１つ以上の症状を低減または阻害するのに十分な量のＣＤ８３結合タンパク質、核酸、または細胞を意味すると理解されなければならない。
本明細書で使用する場合、用語「予防的有効量」は、状態の１つ以上の検出可能な症状の開始を妨げる、または阻害する、または遅らせるのに十分な量のＣＤ８３結合タンパク質、核酸、または細胞を意味すると理解されなければならない。
用量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全等の副作用を引き起こすほど多くするべきではない。一般に、用量は年齢、状態、性別、及び患者の疾患の程度と共に変化し、当業者により決定することができる。合併症の場合、用量は個々の医師により調節することが可能である。用量は、１日または数日間における毎日の１回以上の用量投与において、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇで、例えば約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで変化することができる。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質を皮下または静脈内投与する。
幾つかの実施例では、ＣＤ８３結合タンパク質または他の有効成分を、後続（維持量）よりも大きな初回量で投与する。
例えば、結合分子を、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの間の初回量で投与する。結合分子を次いで、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの維持量にて投与する。維持量は７〜３５日毎に、例えば、１４日、または２１日、または２８日毎に投与してよい。
幾つかの実施例では、用量増加レジメン（ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅ）を使用し、ここでは、ＣＤ８３結合タンパク質または他の有効成分を、後続の用量で使用するより低用量で最初に投与する。この用量レジメンは、最初に副作用に苦しむ被験体の場合に有用である。
治療に十分に対応しない被験体の場合、一週間に複数回用量を投与してよい。あるいは、または更に、増加用量で投与してもよい。
１つ以上の本開示のＣＤ８３結合タンパク質を、適切な経路により、単独でまたは別の薬剤もしくは作用物質組み合わせて（前に、同時に、もしくは後に）のいずれかで、個々に投与することができる。例えば、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を、ＴＮＦ拮抗物質、抗ＩＬ−１２／２３抗体、抗炎症剤、コルチコステロイド、メトトレキサートまたは鎮痛剤等のタンパク質と組み合わせて使用することもできる。本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、抗生物質及び／または抗菌剤と組み合わせて別々に投与する所与の組成物として使用することが可能である。
本開示のＣＤ８３結合タンパク質を、本開示の発現構築物または本開示のＣＤ８３結合タンパク質を発現する細胞を投与することにより被験体内に導入してよいことが、当業者により理解されよう。抗体をコードする核酸をインビボの表劇細胞に導入するために、様々な方法を使用することができる。例えば、裸の核酸を標的部位に注入してもよく、リポソーム内に封入してもよく、またはウイルスベクターにより導入してもよい。
ＣＤ８３検出アッセイ
以下のアッセイを本開示のＣＤ８３結合タンパク質、例えば、本明細書内で論じた検出可能な標識と結合したＣＤ８３結合タンパク質で実施してよい。本明細書に記載されるアッセイによるＣＤ８３の検出は、状態の診断または予後に有用である。
イムノアッセイは、被験体の状態の診断、またはサンプル内のＣＤ８３の検出のための代表的なアッセイフォーマットである。本開示は、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、競合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、フロースルーイムノアッセイ、電気化学発光アッセイ、比濁分析型アッセイ、濁度測定型アッセイ、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）型アッセイを含む任意の形態のイムノアッセイを考慮する。
好適なイムノアッセイの一形態は、例えばＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡである。
一形態において、かかるアッセイは、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を固体マトリックス、例えばポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェルもしくはディップスティック、メンブレン、またはガラス支持体（例えばスライドガラス）等の上に固定化することを伴う。試験用サンプルを次いでＣＤ８３結合タンパク質と直接接触させ、サンプル内のＣＤ８３を結合または捕捉する。サンプル内の非結合のあらゆるタンパク質を洗浄して除去した後、特定のエピトープにてＣＤ８３に結合するタンパク質を、捕捉したＣＤ８３と直接接触させる。検出タンパク質は通常、例えば、ＥＬＩＳＡの場合、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、もしくはβ−ガラクトシダーゼ）、またはＦＬＩＳＡの場合、蛍光色素分子等の検出可能なレポーター分子により標識する。あるいは、検出タンパク質に結合する第二の標識タンパク質を使用することができる。全ての非結合タンパク質を洗浄して除去した後、ＥＬＩＳＡの場合、例えば過酸化水素、ＴＭＢ、またはトルイジン、または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａｌ）等の基質を添加することにより、検出可能なレポーター分子を検出する。もちろん、固定化した（捕捉）タンパク質及び検出タンパク質を逆に使用してもよい。
次いで、サンプル内の抗原のレベルを、既知の量のマーカーを使用して作製した検量線を使用して、または対照サンプルとの比較により求める。
上述のアッセイを速やかに修正して、検出基準として化学発光または電気化学発光を使用する。
当業者に明らかとなるとおり、免疫吸着アッセイに基づく他の検出法は、本開示の実施に有用である。
例えば、上述に基づく免疫吸着法は検出用放射線標識、または検出用金標識（例えばコロイド金）、または、例えば検出用ＮＡＤ＋封入リポソーム、またはアクリジニウム結合免疫吸着アッセイを用いる。
幾つかの実施例では、ＣＤ８３のレベルを、表面プラズモン共鳴検出器（例えばＢＩＡｃｏｒｅTM，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、フロースルーデバイス、例えばＵＳ７２０５１５９に記載されるもの、マイクロもしくはナノイムノアッセイデバイス（例えばＵＳ７２７１００７に記載されているもの）、ラテラルフローデバイス（例えば、ＵＳ２００４０２２８７６１もしくはＵＳ２００４０２６５９２６に記載されているもの）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ、例えば、ＵＳ４５９３０８９またはＵＳ４７５１１９０に記載されているもの）、または免疫比濁アッセイ（例えば、ＵＳ５５７１７２８またはＵＳ６２４８５９７に記載されているもの）を使用して求める。
状態または疾患
本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、ＣＤ８３が関係する状態または疾患の治療、防止、診断、または予後に使用することができる。
本開示の方法を実施することにより治療、予防、診断、または予測可能な疾患の代表的な状態としては、炎症性または自己免疫性状態または疾患が挙げられる。
代表的な状態及び疾患としては、アレルギー、ぜんそく、移植片拒絶、重症筋無力症等の自己免疫性状態、多発性硬化症、血管炎、クローン病または潰瘍性大腸炎等の慢性炎症性腸疾患、ベヒテレフ病、及び全身性エリテマトーデス等のＨＬＡ Ｂ２７関連自己免疫疾患、乾癬等の皮膚病、関節リウマチ、インスリン依存性真性糖尿病、並びにＡＩＤＳが挙げられる。
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞（ＤＣ））及び／またはリンパ球（例えばＴ細胞）等の免疫細胞を枯渇させ、例えば、炎症性及び／または自己免疫性状態もしくは疾患における異常または不必要な免疫応答を調節する。
一実施例において、ＣＤ８３結合タンパク質は、ＡＰＣ及び／またはリンパ球の表面に特異的に結合し、かつ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によりＡＰＣ及び／またはリンパ球を枯渇させる抗体である。一実施例において、ＡＤＣＣはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により仲介される。
移植片拒絶
一実施例において、本開示のＣＤ８３結合タンパク質を使用して、ＡＰＣ及び／またはリンパ球等の免疫細胞を枯渇させ、例えば、移植片対宿主病または臓器移植における拒絶反応等による移植片拒絶に関連する免疫応答を調節することができる。一実施例において、移植片は臓器または組織もしくは細胞移植片である。一実施例において、移植片は同種異系移植片である。一実施例において、移植片は造血幹細胞移植片である。
移植片対宿主病により、免疫担当移植片、例えば同種異系の造血幹細胞移植片が実際的かつ機能的免疫細胞と共にレシピエント、例えば組織不適合レシピエント投与され、かつ免疫細胞が移植片、例えば移植レシピエントのＴ細胞、攻撃組織内に存在する箇所が生じる。
臓器移植における拒絶反応により、同種異系移植片由来の抗原が、ドナーまたはレシピエントのＡＰＣのいずれかにより、レシピエントも免疫細胞、例えばＴ細胞に提示され、次いで活性化によりエフェクター免疫細胞、例えば移植体を攻撃する移植細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）となる箇所が生じる。
「同種異系移植片」とは、同一種の遺伝子が同一でないドナー（例えば組織不適合ドナー）からの移植片である。
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）
「造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）」とは、例えば骨髄または末梢血から誘導することができる多能性造血幹細胞を含む移植片である。移植組織としては、幾つかの非幹細胞、例えば樹状細胞及び／またはリンパ球を含むＡＰＣを挙げて良い。
「造血幹細胞」は自己複製をし、分化して骨髄系（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞）、赤血球系（赤血球）、巨核球系（血小板）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞種を生じさせることができる。
分化を通して、多能性造血幹細胞はまず自己複製能を失い、次いで成熟エフェクター細胞になるにつれ、少しずつリネージュポテンシャルを失う。通常、Ｌｉｎ−、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−人細胞が多能性造血幹細胞である。一実施例において、ＣＤ３４の発現は、ヒトドナーから単離した末梢血中の造血幹細胞の同定に使用される。
ＨＳＣＴは、幹細胞移植を必要とする疾患及び状態の治療に使用可能である。例えば、幹細胞は正常な血液細胞産生及び成熟不全もしくは機能障害、造血器悪性腫瘍、自己免疫疾患、肝疾患、または免疫不全（例えばＸ線照射、化学療法、もしくは病原体による感染を理由とする）の治療に使用可能である。
幹細胞は、被験体への投与の前にエクスビボで膨張または分化してよい。
同種異系の造血幹細胞移植は、以下の１つ以上の状態の治療に使用され得る：急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、赤芽球癆、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、重症型地中海貧血、鎌形赤血球貧血、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、先天性代謝異常（例えばムコ多糖症、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー及び副腎白質ジストロフィー）。
キット
本開示は更に、以下の１つ以上からなるキットを含む：
（ｉ） 本開示のＣＤ８３結合タンパク質もしくはそれをコードする発現構築物；
（ｉｉ） 本開示の細胞；または
（ｉｉｉ）本開示の医薬組成物。
ＣＤ８３検出キットの場合、キットは更に、例えば本開示のＣＤ８３結合タンパク質に結合した検出手段を含むことができる。
治療用／予防用使用のためのキットの場合、キットは更に製薬上許容できるキャリアを含む。
所望により、本開示のキットは、任意の実施例による本明細書に記載された方法での使用のための取扱説明書を同梱する。
本開示は以下の非限定的実施例から構成される。
実施例１ 材料及び方法
発現ベクターのデザイン
一般に入手可能なヒト定常部重鎖（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４サブタイプ）及び軽鎖配列を使用して、ｍＡｂＸｐｒｅｓｓベクターを集めた。哺乳類での発現のため、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｇｅｒｍａｎｙ）により必要なＤＮＡを合成し、コドン最適化を行った。３つのカセットを次いで、哺乳類細胞内での発現、選択及び増幅のための配列を含む哺乳類発現ベクター（Ａｃｙｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の中に配置した。単一のＳａｃＩ部位を発現ベクター内に含め、可変領域の直鎖化及びＩｎＦｕｓｉｏｎTM（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）クローニングを促進した。
ＣＤ８３に対するファージディスプレイパニング及びｓｃＦｖの結紮独立Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ TM クローニング
ヒトＣＤ８３の細胞内ドメインをＣＨＯ細胞で発現させ、ＩＭＡＣにより精製した。本プレパラートを使用して、公表済みのヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーからバインダーを単離した（Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９５（１１）：６１５７−６２，１９９８）。組み換えＣＤ８３に対する幾つかの独自のバインダーを単離し、クローン３Ｃ１２をクローニング及び発現用に選択した。各鎖の５’及び３’フレームワーク領域に対するプライマーを使用して、重鎖及び軽鎖の両方用の可変領域をファージミドベクターからＰＣＲ増幅した。追加の１５個の塩基対を、デスティネーションベクターの上方制御塩基及び下方制御塩基に対応する各ベクターに含み、結紮独立Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎTMクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｅｈ）を可能にする。重鎖用の代表的なプライマーは、３Ｃ１２＿ＶｈＦｏｒ ５’−ＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号：５０）及び３Ｃ１２＿ＶｈＲｅｖ ５’−ＧＣＧＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号：５１）であり、軽鎖用の代表的プライマーは３Ｃ１２＿ＶｋＦｏｒ ５’−ＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：５２）及び３Ｃ１２＿ＶｋＲｅｖ ５’−ＧＣＣＡＣＧＧＴＣＣＧＣＴＴＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’（配列番号：５３）であった。
下線を引いた領域は、ｓｃＦｖ特異的な配列を示し、クローンに応じて異なる。非精製のＰＧＲ生成物を、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎTMシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、メーカーの取扱説明書どおりに、ｍＡｂＸｐｒｅｓｓＩｇＧ１重鎖及びκ軽鎖ベクターに挿入した。抗体のトランスフェクション及び精製を後述のように実施した。
哺乳動物細胞の発現
抗体発現のために、重鎖及び軽鎖配列を組み込んだｍＡｂＸｐｒｅｓｓプラスミドを、水中で調製したポリエチレンイミン（ＰＥＩ）Ｍａｘを使用して、同時トランスフェクションした。トランスフェクション複合体を、ＰＥＩ：ＤＮＡ＝３．５：１の割合で調製した。懸濁適応性ＣＨＯ一過性トランスフェクションを、０．７５：０．２５ｖ／ｖの細胞比率を用いて実施した：ＣＤ−ＣＨＯ培地内の各７５０μＬの細胞（１．５×１０６ｃｅｌｌｓ．ｍＬ−１）を意味するトランスフェクション複合体を、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ培地２５０ｍｌ中でＤＮＡ１．６μｇ及びＰＥＩ５．６μｇでトランスフェクションした。細胞懸濁液に添加する前に分裂をさせることなく、室温にて１５分間複合体をインキュベートした。トランスフェクション後の４時間にて、培養液を加湿インキュベーター（３２℃、ＣＯ２ ７．５％）に移して７〜１４日間振盪（１６０〜２５０ｒｐｍ、容器及び振盪機のスローレシオによる）する前に、ＣＤ−ＣＨＯ及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）により、総体積を二倍にして細胞を０．１ｍｇ．Ｌ−１に希釈した。発現調査は通常、小（２ｍＬ）、中（３０ｍＬ）または大（４００ｍＬ）スケールにて実施した。遠心分離により細胞残屑を除去し、分泌した抗体をプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。
免疫グロブリンのプロテインＡ精製及びＩｇ融合タンパク質
１ｍＬのプロテインＡ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２０カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳによりポンプ洗浄した。ヒトＩｇＧ１またはＣＤ８３−Ｆｃ融合タンパク質を含む上清（２０ｍＬ〜１．２Ｌの体積で変化する）を、毎分１ｍＬの流速で投与した。各部分１ｍＬが各４０μＬの中和緩衝液に溶出した、１０ＣＶのプロテインＡ溶出緩衝液を投与する前に、カラムを２０〜５０ＣＶのＰＢＳで洗浄し、ｐＨを７．０に戻した。
ｍＡｂＸｐｒｅｓｓに発現した抗体の分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣには、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷｘｌ ３０ｃｍ×７．８ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ上で、ホスフェート１００ｍＭの移動相（ｐＨ６．７）、ＮａＣｌ ２００ｍＭと合わせて用い、０．２２μｍのフィルターに通して濾過した。流速は０．８ｍＬ．ｍｉｎ−１であった。ゲル濾過標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してキャリブレーションを行った。本システムを使用した一過性トランスフェクションの実験での一般的な収率は、２０〜６０ｍｇ．Ｌ−１の範囲である。
ＣＤ８３ウェスタンブロット
抗-ＣＤ８３ｍＡｂが直線状または立体構造エピトープを認識するかどうかを評価するために、組み換えｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製した。ｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓ ５μｇを含む非変性サンプル（すなわち、メルカプトエタノール中での煮沸により変性していない）をウェルに直接ロードし、一方で変性サンプルにはβ−メルカプトエタノール２．５％を含ませ、ロード前に９５℃にて１０分間加熱した。Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して１００ボルトで４５分間、ニトロセルロースメンブレンに移動する前に、タンパク質を、２００ボルトにて５０分間運転することにより１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。一次抗体の添加前に、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１時間塗布した。一次抗体を５μｇ．ｍＬ−１の３Ｃ１２ ＩｇＧ、または１：２，０００で希釈した抗ヒトＣＤ８３試薬であるＨＢ１５ｅ−ＰＥのいずれかで構成した。それぞれは０．５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で１時間、ＰＢＳ中で調製した。ＰＢＳＴで２回洗浄した後、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ）で洗浄及び可視化する前に、赤外ＩＲＤ８００抗ヒトまたはマウスＦｃ抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を１：１０，０００に希釈して４５分間投与した。
細胞膜ＣＤ８３の数量化
ヒトＰＢＭＣの細胞株及び血液樹状細胞上に存在する細胞表面ＣＤ８３分子の数を、標準ＱＩＦＩＫＩＴ（Ｄａｋｏ）プロトコール（Ｓｅｒｋｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３３（２）：１７９−８７，１９９８）を使用して推定した。細胞株及びトランスフェクト細胞の場合には、 ０．５×１０６個の細胞を非結合の抗ＣＤ８３ｍＡｂであるＨＢ１５ａ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）２０μｇ．ｍＬ−１で４℃にて４５分間染色し、かつ１：５０で希釈したいずれかのキットにより、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ又は抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を提供した。活性樹状細胞上でのＣＤ８３レベルの数量化のため、１×１０６個のＰＢＭＣを一晩培養し、ＣＤ８３を上方制御した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（８）：３８２１−３５，１９９５）。細胞を次いで、２０μｇ．ｍＬ−１のＨＢ１５ａで染色し、その後上述の検出を行った。残っている非結合抗マウスＦＩＴＣを全てブロックするため、１０％のマウス血清５０μｇを添加し、４℃にて２０分間インキュベートした。ＰＥに結合し、メーカーの推奨で投与されるＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ５６抗体からなる混合リネージを、ＨＬＡ−ＤＲ−ａｐｃ−Ｃｙ７及びビオチン化ＣＭＲＦ−４４ １５０μｇ．ｍＬ−１と共に添加し、次いで１：５０に希釈したストレプトアビジン−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅにより検出した。細胞は各工程間で２ｍＬのＭＡＣ緩衝液で洗浄し、１０００×ｇで２分間、後述のように遠心分離した。活性化したヒト樹状細胞を、リネージ−ＨＬＡ− ＤＲ＋ＣＭＲＦ−４４＋ＨＢ１５ａ＋としてゲーティングした。検量線を作成し、ＱＩＦＩＫＩＴが提供するプロトコール内にまとめられたＣＤ８３表面の密度を推定した。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析用の細胞を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、ｐＨ７．２のＰＢＳ中のＥＤＴＡ ２ｍＭからなる、冷却磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）緩衝液、または、ＰＢＳ中にＦＣＳ ０．５％、アジ化ナトリウム（Ａｊａｘ Ｆｉｎｅｃｈｅｍ）０．０５％を含む蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）緩衝液内で洗浄した。洗浄した細胞を数え、２×１０５〜２×１０６個の細胞をポリスチレン丸底チューブ５ｍＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に分配した。細胞ペレットの遠心分離に関係する全工程は、ＤｉａＣｅｎｔ−１２ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ遠心分離器（ＤｉａＭｅｄ）内で、１０００×ｇで２分間行った。細胞は、特に指示しない限り、蛍光性一次または二次抗体結合体と共に、５０μＬの最終体積で氷上で３０〜６０分間染色した。細胞を、３ｍＬのＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ペレットに配置した。本工程は、複数工程の染色手順のため繰り返した。洗浄し２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁する前に、細胞を、染色完了の３時間以内に分析した、または１％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）２００μＬを３０分間投与することで、固定した。死細胞を７−ＡＡＤ染色により評価する場合、分析前に細胞を、最大２時間氷上に残した。細胞を、データを収集するＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いるＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ ４色フローサイトメーター、またはＦＡＣＳＤｉｖａ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１ソフトウェアを用いるＬＳＲＩＩフローサイトメーターシステム（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかを使用して分析した。 ＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ８．８．６、またはＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３ ソフトウェア（ＤｅＮｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）上でデータ分析を行った。
ｍＡｂのＲ−フィリコエリトリン（ＲＰＥ）への化学結合
ＰＢＳで精製した３Ｃ１２、またはヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールのハーセプチン（６０μｇ）を、Ｌｙｎｘ Ｒａｐｉｄ ＲＰＥ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ）を用いて、メーカーの仕様書どおりに１００μｇのＲＰＥに共有結合した。フローサイトメトリー実験での使用の前に、抗体を０．５〜５０μｇ．ｍＬ−１で滴定し、５μｇ．ｍＬ−１を、ＫＭ−Ｈ１２細胞上でのＣＤ８３の染色に最適な作業濃度として求めた。
脱フコシル化ＩｇＧの調製
形質転換複合体添加の約４〜６時間後に、キフネンシン２μｇ．ｍＬ−１（ＧｌｙｃｏＦｉｎｅＣｈｅｍ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を、前述で概略を述べた標準プロトコールどおりにトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に添加することにより、非フコシル化抗体を得た。標準培養の６〜７日後に、上記のプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して培養液をハーベストした。抗体が関係するオリゴ糖の含有量を確認するために、メーカーの取扱説明書どおりに固定角遠心分離器内でＵｌｔｒａ−４ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して、精製タンパク質を２ｍｇ．ｍＬ−１へと濃縮した。５０μＬのサンプルを、重炭酸アンモニウム、５０ｍＭ中の２−メルカプトエタノール ０．２５％、ＳＤＳ０．２５％により、１００℃にて２０分間還元した。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を添加して、ＳＤＳとの複合体を０．５％とし、次いで１ユニットのＮ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。試料を、希釈前にインバータ電子レンジ内で４分間温浸し、０．５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化し、黒鉛化炭素固相抽出（ＳＰＥ）クロマトグラフィーにより精製した。精製したサンプルをフリーズドライして５０ｍＭのＮａＣｌ内で再懸濁し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ中のポジティブ・リフレクトロン・モデル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ ｍｏｄｅｌ）の超高純度２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ｓＤＨＢ；Ｓｉｇｍａ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳマトリックス中で分析した。質量分析による脱フコシル化ＩｇＧの確認をその後に実施した。
親和性成熟用のＶ Ｌ シャッフルライブラリーの構築
３Ｃ１２ ｓｃＦｖの重鎖（ＶＨ）ＤＮＡを、２．５ユニットの高忠実度Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、ｐＨＥＮ１ファージミドベクター（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（１５）：４１３３−７，１９９１）から増幅し、キットが提供するプロトコール、制限酵素切断部位（下線部）を有するプライマー及びベクターに重なり合った更なる５’配列を使用して、ギャップリペアークローニング（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｃｋ，１９８３；Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｓｔｌ １９９１）
３Ｃ１２ＶＨ５’ ５’−
ＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧ−３’（配列番号：５４）
Ｍｏｄ３Ｃ１２ＶＨ３’ ５’−
−ＧＴＴＧＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＴＡＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＣ−３’（配列番号：５５）
を０．５μＭの最終濃度にて可能にする。
３Ｃ１２ーＶＬシャッフルライブラリーを、以下の修正を加えた前述の方法（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０４（１）：８８−９９，２０１０）に基づき、インビボでの相同組み換えを使用して構築した。手短に言えば、ゲル精製した（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ Ｔｕｒｂｏ，Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）３Ｃ１２ ＶＨ断片ＤＮＡ １０μｇを、約１０７個のヒトＶＬ遺伝子配列を含む、Ｎｃｏｌ−Ｓａｌｌで温浸したｐＹＤ４ベクター５０μｇと合わせて、ＥＢＹ１００酵母細胞の標準的な酢酸リチウム形質転換法（酵母ディスプレイを使用した抗体エピトープマッピング（Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｃ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｍａｒｋｓ ＪＤ，ｅｄｓ，２０１０），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）内で使用した。形質転換した酵母ライブラリーを、他で定義した（酵母ディスプレイを使用した抗体エピトープマッピング（Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｃ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｍａｒｋｓ ＪＤ，ｅｄｓ，２０１０），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）とおりに、酵母の最小培地である選択的成長デキストロースカザミノ酸培地（ＳＤ−ＣＡＡ）５００ｍＬ中で培養した。培養条件は、特に指示しない限り、３０℃にて２５０ｒｐｍであった。ライブラリーのサイズは、ＳＤ−ＣＡＡプレート上で形質転換した酵母の連続希釈をプレーティングすることにより推定した。形質転換の４８時間後に、ライブラリーの最大多様性の１０倍超過（すなわち１０８）を示すサンプルを、１８℃にて４８時間、選択的成長ガラクトースカザミノ酸（ＳＧ−ＣＡＡ）内で誘発した。
ＦＡＣＳを使用した酵母ディスプレイによるＶ Ｌ シャッフルライブラリーの選別
ディスプレイした３Ｃ１２ ＶＬシャッフルライブラリーに、３ラウンドの細胞選別を実施した。各ラウンドには４℃にて１時間、可溶性ｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓによるインキュベーションを伴った。ディスプレイした抗体クローンに結合するために使用した、選択した種々のラウンドにおける抗原の濃度は、一回目から三回目のラウンドまでそれぞれ、ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した２０ｎＭ、２．５ｎＭ、及び０．５ｎＭのｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓであった。解離速度が小さいクローンを選択するために、三回目及び最終の選別ラウンドには、ｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓ抗原による染色の後、ＦＡＣＳ緩衝液中での一晩の洗浄工程も組み込んだ。各選択工程において、それぞれ、抗マウスＩｇＧ１ Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ、または抗ウサギＦｃ特異的ＦＩＴＣ（共にＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：５００の希釈により捕捉した抗ＣＤ８３抗体（１００μｇ．ｍＬ−１のマウスモノクローナル抗体であるｍＢ４、または１μｇ．ｍＬ−１のポリクローナル抗体であるＲＡ８３のいずれか）を使用して、抗原結合を検出した。酵母の表面上におけるｓｃＦｖの発現は、抗−ＳＶ５−Ａｌｅｘａ ６４７を使用して各ラウンド中に評価した。冷却したＦＡＣＳ緩衝液中で１〜５×１０７ｃｅｌｌｓ．ｍＬ−１に希釈した細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、図６Ａに示すようにＰ２及びＰ３ゲートに選別した。選別の次のラウンドのためにガラクトース含有ＳＧ−ＣＡＡ液体培地（酵母ディスプレイを使用した抗体エピトープマッピング（Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｃ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｍａｒｋｓ ＪＤ，ｅｄｓ，２０１０），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）で表面ディスプレイを誘発する前に、回収ゲートからの産出量を、１×１０４〜１×１０５ｃｅｌｌｓ．ｍＬ−１のＳＤ−ＣＡＡ液体培地（酵母ディスプレイを使用した抗体エピトープマッピング（Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｃ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｍａｒｋｓ ＪＤ，ｅｄｓ，２０１０），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）にて４８時間培養した。三回目のラウンドで選別したクローンの産出量をＳＤ−ＣＡＡ上でプレーティングした。更に１８時間ＳＧ−ＣＡＡ培地内で誘発する前に、合計９０個のそれぞれのクローンをＳＤ−ＣＡＡ内で一晩培養した。ｓｃＦｖを示す増幅した酵母を０．２ｎＭのｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓで染色し、野生型３Ｃ１２ｓｃＦｖを示す酵母（ｙｅａｓｔ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｗｉｌｄｔｙｐｅ ３Ｃ１２ ｓｃＦｖ）と比較した。このＦＡＣＳ分析より、抗原結合強度が明らかに増加した２０個のそれぞれのクローンを配列決定のために選択した。ＤＮＡ塩基配列決定法により、４つの優性ＶＬ鎖配列（３Ｃ１２．Ｂ、３Ｃ１２．Ｃ、３Ｃ１２．Ｄ及び３Ｃ１２．Ｅ）が明らかとなり、上述に記載のように、ヒトＩｇＧ１κ（ｍＡｂＸｐｒｅｓｓベクター、ＡＣＹＴＥ Ｂｉｏｔｅｃｈ）として再フォーマットした。
ＣＤ８３発現のレベルが異なる安定したトランスフェクタントの生成
完全長ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＮＭ＿００４２３３．３）を、バイシストロニックな内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ベクターであるｐＭＸＩＥ．２中にクローニングした。プラスミドＤＮＡ（１０μｇ）を使用し、コンフルエントＧＰ＋Ｅ８６レトロウイルスパッケージング細胞をＴ２５フラスコ内で、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してメーカーのプロトコールどおりにトランスフェクションした。安定的にトランスフェクションしたＧＰ＋Ｅ８６パッケージング細胞のコンフルエンスが８０％に達した時に、パッケージング細胞を２０００ｃＧｙで照射して拡大を阻害し、５×１０５ｃｅｌｌｓ．ｍＬ−１のＢＢ８８懸濁細胞株を同時培養のために、ウイルス感染のエンハンサーとしての２〜４μｇ．ｍＬ−１の臭化ヘキサジメトリン（Ｓｉｇｍａ）と共に添加した。
３７℃、ＣＯ２５％での４８時間の培養後、ＢＢ８８懸濁細胞を除去し、ＧＦＰ発現のためにＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ機器を使用して保存した。後続の選別ラウンドを実施し、ＧＦＰ／ＣＤ８３の発現が向上した形質転換細胞を選別した。選別した細胞のフローサイトメトリー染色により、ＣＤ８３の発現を確認した。細胞のモノクロナール培養液を限界希釈によりクローニングした。
ＣＤ８３ｍＡｂにより活性化したＣＤ８３の枯渇
凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩ−１０内で一晩培養し、ＣＤ８３の上方制御を誘発した（Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｔｅｄｄｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（８）：３８２１−３５，１９９５）。２×１０６ｃｅｌｌｓ．ｍＬ−１の細胞を、１ｍＬの最終体積で、６，０００のＩＵ．ｍＬ−１の組み換えＩＬ−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の存在下にて、滅菌したキャップ付き５ｍＬＦＡＣＳチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内で培養し、ＮＫ細胞、及び５μｇ．ｍＬ−１の３Ｃ１２．Ｃ ＩｇＧまたはヒトＩｇＧ１κのいずれかを活性化する。フローサイトメトリー染色、及び活性化した樹状細胞集団の評価分析の前に、細胞を３〜４日間培養した。
異種ＳＣＩＤマウス ＧＶＨＤのモデル
動物は全て、クイーンズランド大学動物倫理委員会により認可されている。週齢５週間のＳＣＩＤマウスをアニマル・リソース・センター（西オーストラリア）から入手し、実験研究の前に１週間、無菌状態で飼育した。使用した異種モデルは前述のとおりである（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６（２）：３８７−９８，２００９）。手短に言えば、１日目に３２５ｃＧｙの照射を行った状態のマウスに、アシアロＧＭ１（ＡＳＧＭ−１）に対する抗体を投与し、ＮＫ細胞及び他の白血球を枯渇させ、０日目における腹腔内注射による５０×１０６個のヒトＰＢＭＣの移植を促進した。ＰＢＭＣ移植の日（０日目）に、図の一覧に規定された投与量で抗体治療薬をマウスに、腹腔内注射によっても投与した。マウスには移植後３０日間毎日、ＧＶＨＤの各臨床症状のため、先入観を取り除くために治療群に対する知識を持たずに、最小変化量を０．５として、０．０（健康）〜２．０（劣悪な状態）の範囲で変動するスコアを付けた。スコアリングの基準は体重減少、姿勢、活動性、毛皮のきめ、皮膚及び眼の健全性、並びに下痢であった。どれか１つの基準で２．０を記録した、または累積スコアが＞５．０である動物は、頚椎脱臼した。２０日後に生存していた動物の脾臓、骨髄及び腹腔を洗い流して収集し、抗ヒト及び抗マウスＣＤ４５抗体によるフローサイトメトリー染色で評価を行い、移植したヒト細胞の存在を確認した。
生存曲線の比較を、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０１内で実施した。
Ｆａｂの調製及び親和性分析
キットが提供するプロテインＡを、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲＥ樹脂によって置き換えたことを除いてメーカーの取扱説明書どおりに、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆａｂ ＭｉｃｒｏＦａｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔでのパパイン分解によりＦａｂ断片を調製した。
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｎＭのＥＤＴＡ、及び０．００５％のポリソルベート２０ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からなるＨＢＳ−ＥＰ緩衝液内でＦａｂを希釈した。動力学分析ウィザードプロトコールを用いて、ｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質の１００レゾナンスユニット（ＲＵ）と一体化したＣＭ５チップを備えるＢｉａＣｏｒｅ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）機器を使用して、希釈したＦａｂの親和性を評価した。物質移動制限を有する内蔵１：１結合モデルを使用するＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、動力学的速度を推定した。
細胞
リンパ腫細胞株のＫＭ−Ｈ２及びＬ４２８、並びに懸濁チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｓ）、並びにマウス細胞、株のＢＢ８８及びＦＤＣＰ１を含むトランスフェクションの影響を受けやすい細胞株を、Ｍａｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの在庫から入手した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｍａｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓのヒト研究倫理委員会に従って募集した、血液またはアフェレーシス生成物を寄付する健康なボランティアから入手した。ヒトの健康なドナーサンプルは全て、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎Ｂ及びＣ、ヒトＴリンパ好性ウイルス並びに梅毒のスクリーニングを行った。
細胞培養培地及び溶液
使用前にヒト細胞株及びヒトＰＢＭＣを、１×ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び５６℃にて３０分間加熱不活性化した１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地内で培養した（ＲＰＭＩ−１０、全ての成分はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）。マウス細胞株ＢＢ８８及びＦＤＣＰ１細胞を、ペニシリン−ストレプトマイシン、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ＨＥＰＥＳ、及び１０％の（ＤＭＥＭ−１０）を補充したＦＣＳダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。完全長ヒトＣＤ８３を導入したＦＤＣＰ１細胞を、Ｇ４１８ジェネテシン１００μｇ．ｍＬ−１の存在下にて更に培養した。細胞は全て、３７℃、ＣＯ２ ５％のインキュベーター内で加湿し、適切に継代した。
末梢血及びアフェレーシス生成物からのＰＢＭＣのＦｉｃｏｌｌ調製
血液製剤からのＰＢＭＣの精製に、密度勾配遠心分離を使用した。手短に言えば、末梢血のサンプル４００ｍＬを滅菌した室温のＰＢＳにより１：１で希釈し、一方で濃縮したアフェレーシス生成物をＰＢＳにより１：２０で希釈した。滅菌した５０ｍＬチューブ内で、６００×ｇで２０分間遠心分離を行う前に遠心分離器ブレーキのスイッチを切って、希釈した血液製剤３５ｍＬを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１５ｍＬの下に配置した。
パスツールピペットを使用し、Ｆｉｃｏｌｌ界面の細胞を収集して３〜５分間ＰＢＳで洗浄し、汚染血小板を除去した。血球計算器を使用して細胞の数を数え、機能アッセイで培養、凍結保存、または使用のいずれかを行った。
哺乳類細胞の凍結保存及び復活
３００×ｇで５分間遠心分離し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）１０％及びＦＣＳ ９０％からなる溶液中で、５０×１０6ｃｅｌｌｓ．ｍＬ−１の最終濃度で再懸濁させることで、凍結保存のためにＰＢＭＣを調製した。他の細胞は通常全て、ＤＭＳＯ ８％、調整培地５０％、及び新鮮な培地からなる溶液中で再懸濁した。
細胞を１ｍＬの滅菌クライオバイアルに一定量入れ、クライオ１℃ 凍結容器（Ｎａｌｇｅｎｅ）に配置し、直ちに−８０℃の一時貯蔵場所に移し、２４〜４８時間以内に液体窒素貯蔵所（−１９６℃）に再移動した。必要に応じて、細胞を３７℃の水浴にて解凍し、予め温めた培地１５ｍＬ内で直ちに希釈した。細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、更に使用または培養するため、１０ｍＬの培養液中で再懸濁した。
リンホカイン活性キラー（ＬＡＫ）細胞の生成
新鮮または解凍したＰＢＭＣ（＜２×１０９個の細胞）を洗浄し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５％と、ｐＨ７．２のＰＢＳ中のＥＤＴＡ ２ｍＭを含む、冷却したＭＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。
ヒトＣＤ５６マイクロビーズをメーカーの推奨どおりに添加し、ＬＳカラムを備えたＶａｒｉｏＭＡＣＳセパレーター（全てＭｉｌｔｅｎｙｉ）上で、細胞に正の選択を行った。ＮＫ細胞の純度を確認するために、ポジティブ及びネガティブフラクションの両方を、ＣＤ５６蛍光性抗体コンジュゲート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＬＡＫ細胞を、３７℃、ＣＯ２ ５％にて２〜７日間、６０００ＩＵ．ｍＬ−１のヒトＩＬ−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の存在下にて培養した。上清除去の前に、細胞をインキュベーションにより氷上で、続いて３０分間、ＥＤＴＡ ２％を含む冷却したＰＢＳの氷上で、３０分間ハーベストした：添加前及びＲＰＭＩ−１０中での再懸濁の前（ｂｅｆｏｒｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｂｅｆｏｒｅ ｒｅｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ）に、ハーベストした細胞は全て二度洗浄した。
クロムリリースアッセイ
ｍＡｂの能力を測定し、ＬＡＫエフェクタ−細胞によりＡＤＣＣを誘発するために、クロム標識した標的として、安定的にヒトＣＤ８３を導入したＫＭ−Ｈ２細胞株または細胞株を使用して、クロムリリースアッセイを行った。 最大１×１０６ｃｅｌｌｓ．ｍＬ−１を、ＴＤ緩衝液中の５１Ｃｒ １００μＣｉにより４５分間、３７℃、ＣＯ２ ５％で、１０分毎に穏やかに撹拌して標識した。細胞をＲＰＭＩ−１０で２回洗浄した。ＬＡＫエフェクタ−細胞及び１〜５×１０３個の５１Ｃｒ標識標的細胞を、図の一覧に規定したエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でＶ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）内に配置した。抗体処理剤を規定されているとおりに添加した。ブロッキング実験のため、非結合抗ヒトＣＤ１６クローン３Ｇ８またはＩｇＧ１κアイソタイプコントロール１５μｇ．ｍＬ−１を添加して、最終体積を１５０μＬにした。ＲＰＭＩ−１０（すなわち自然放出）または１．６７％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（全放出）のいずれかに標的細胞を含有する追加のウエルを調製した。各条件を５回の反復試験で実施した。室温にて３００×ｇで５分間遠心分離する前に、プレーティングした細胞を４時間インキュベーションした。各ウェルの上清（５０μＬ）を１５０μＬのＯｐｔｉＰｈａｓｅ「ＳｕｐｅｒＭｉｘ」と混合し、Ｔｒｉｌｕｘ １４５０−ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター（共にＷａｌｌａｃ製）により、カウント・パー・ミニッツ（ｃｐｍ）で５１Ｃｒを分析した。特定の細胞溶解を、標準式を使用して計算した：％細胞溶解＝［（試験用サンプル放出量−自然放出量）／（総放出量−自然放出量）*１００］。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０１ソフトウエアを使用して、データ及び標準誤差をグラフ化した。
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
二人のヒトドナーから凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、２０μｇ．ｍＬ−１のＤＮＡａｓｅｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加して細胞凝集を防止した。一方向性ＭＬＲのため、ＭＬＲ「刺激物質」として機能するように選択した１つのドナーからの細胞を、３０００ｃＧｙで照射した。９６ウェルＵ底プレート（Ｎｕｎｃ）中に刺激物質細胞（１×１０５個の細胞）を、条件ごとに５回の反復試験において最終体積が１８０μＬとなる試験用抗体と共に、非照射「応答物質」細胞と同数添加した。
両方向性ＭＬＲのため、両方のドナーの細胞を照射せず、同種異系活性化を行った。３７℃、ＣＯ２ ５％における４日間のインキュベーション後、トリチウム標識チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）１μＣｉを２０μＬの体積に添加した。細胞を更に１６時間インキュベーションし、次いでＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して濾過マットに移した。５ｍＬのＢｅｔａｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔ（Ｗａｌｌａｃ）を投与し、Ｔｒｉｌｕｘ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンターを読み取る前に濾過マットを完全に乾燥させた。生データをｎｉｌ抗体対照ウェルに対して標準化し、最大増殖の割合として報告した。
実施例２ ３Ｃ１２ ｍＡｂの生成と性質決定
ｓｃＦｖファージクローンを、組み換えｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓに対する三ラウンドの選択による、大型のヒトナイーブｓｃＦｖ免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをバイオパニングすることにより（Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９５（１１）：６１５７-６２，１９９８）得た。各可変領域に対して近接する半保存フレームワーク領域に結合し、必要なベクターのオーバラップも含むプライマーを使用して、このクローンをＰＣＲにより増幅し、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎTMシステムを使用してｍＡｂＸｐｒｅｓｓベクター内にクローニングした。再フォーマットしたＩｇＧ１ ｍＡｂをＣＨＯ細胞内に発現させ、続いてプロテインＡに基づく精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣによる分析（図１）は、分子が本一過性発現システム内で、観察可能な劣化または凝集を伴わず十分に発現したことを示した。再フォーマットした抗体は、細胞株ＫＭ−Ｈ２に由来するヒトホジキンリンパ腫により発現した細胞表面のＣＤ８３に特異的に結合したことを示した（図２）。
抗ＣＤ８３ｓｃＦｖを、ＡＤＣＣ応答を特異的に提供するＩｇＧ１κとして再フォーマットした。得られた抗体が機能的であることを示すために、生成した組み換え抗ＣＤ８３抗体（すなわち３Ｃ１２ ｍＡｂ）をフローサイトメトリーに使用し、ＣＤ８３＋ヒト細胞株及びｈＣＤ８３トランスフェクト細胞への結合を示した（図２Ａ）。更に、クロムリリース機能アッセイ（ｃｈｒｏｍｉｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓａｙ）において、活性化したナチュラルキラー（ＮＫ）エフェクター細胞の存在下において、３Ｃ１２ ｍＡｂはＫＭ−Ｈ２細胞の細胞溶解を著しく誘発した（図２Ｂ）。しかしこの抗体誘発性細胞溶解は、抗ＣＤ１６ ｍＡｂである３Ｇ８によるＦｃγＩＩＩＲａ（ＣＤ１６）のブロックにより抑止され、クロムリリースアッセイにおいて３Ｃ１２のインビトロでの作用機序におけるＣＤ１６の必要性を示している。
実施例３ 抗ＣＤ８３ ｍＡｂ、３Ｃ１２の性質決定
抗ヒトＣＤ８３ ｍＡｂである３Ｃ１２を性質決定し、結合親和性及び特異性を評価した（表４）。３Ｃ１２はＣＤ８３＋細胞株であるＫＭ−Ｈ２に結合し、ＭＬＲにおいて同種異系Ｔ細胞刺激を抑制した。
非還元条件下において、３Ｃ１２はウェスタンブロットで組み換えヒトＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓを検出したが、３Ｃ１２の結合は、ＣＤ８３が加熱及びジスルフィド結合反応により変性した際に破壊された。この観察は、市販の抗体であるＨＢ１５ｅに対しても実施した（図３Ａ）。従って、３Ｃ１２及びＨＢ１５ｅは共に、加熱及びジスルフィド還元により破壊された立体構造エピトープを結合するようである。ＣＤ８３ ｍＡｂが他の抗ＣＤ８３試薬に競合的に、または独立して結合したかどうかを求めるために、３Ｃ１２ ＩｇＧをＲＰＥに結合させ、ＦＩＴＣに結合した市販の抗体ＦＩＢ１５ａ及びＨＢ１５ｅ、並びに抗ウサギＩｇで検出したＲＡ８３ポリクローナル抗体により競合的にアッセイした。ＨＢ１５ｅの完全阻害、並びにＨＢ１５ａ及びＲＡ８３結合の部分的阻害が３Ｃ１２の存在下において観察されたため（図３内の表）、３Ｃ１２による競合的阻害が、抗体の同時添加により明らかとなった。これは、３Ｃ１２エピトープが他の抗体のエピトープと共有されているまたは重なり合っていることを示す。調査した条件下にて、３Ｃ１２の結合は任意の抗ＣＤ８３試薬の転化により最小限の変化しか起こらず、ＲＡ８３による競合において観察された３Ｃ１２シグナルの周辺での減少が生じただけであった。この発見は、３Ｃ１２抗体が抗原結合のための他の抗ＣＤ８３試薬と競合していること、かつ３Ｃ１２エピトープが、抗体生成のための従来のアプローチに由来する抗体に類似していることを示している。
実施例４ インビボでの３Ｃ１２ ｍＡｂの評価
インビボでのＧＶＨＤを防止する３Ｃ１２ ｍＡｂの能力を評価するため、ヒトＰＢＭＣの異種移植組織を取り入れたＳＣＩＤマウスに投与した。３Ｃ１２抗体の用量を、ウサギポリクローナル抗体ＲＡ８３（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．２０６（２）：３８７−９８，２００９）用に以前に求めた最適投与量０．１２５ｍｇの３倍以下〜３倍以上で変更した。ＲＡ８３で観察したとおり、 ３Ｃ１２を０．１２５ｍｇ投与すると、アイソタイプコントロールと比較して異種ＧＶＨＤモデルにおける生存が著しく向上した（図４Ａ）。３Ｃ１２ ＩｇＧの投与量を０．３７５ｍｇに増加させることにより治療効果の低下に繋がったが、この傾向は重大なものではなかった。６１％が生存した、ウサギポリクロナールＲＡ８３抗体の標準０．１２５ｍｇ投与量と比較して、等価投与量の３Ｃ１２ ＩｇＧはさほど強力ではなく、ＧＶＨＤに罹ったマウスの３９％を保護した（図４Ｂ）。ＲＡ８３の投与量を１ｍｇに増加させることによる１００％が生存したが、３Ｃ１２抗体を同じだけ増加させることにより、モノクローナル抗体の効果が消滅した（図４Ｃ）。３Ｃ１２ ＩｇＧ １ｍｇと合わせ、ＲＡ８３の標準投与量（０．１２５ｍｇ）による動物の共治療もまた、効果がなかった。これは、ＲＡ８３の効果が高用量の３Ｃ１２の存在によって阻害されたことを示す。インビボにおける３Ｃ１２の標準及び低投与量は効果的であったが、ＲＡ８３よりも強力ではなかったことから、３Ｃ１２抗体に、ｍＡｂ潜在能を改善するように設計された、更なる抗体エンジニアリングを施した。
実施例５ ＣＤ８３ ｍＡｂの糖鎖エンジニアリング
ＡＤＣＣの潜在能力を向上する目的のためにアフコシル化抗体を生成するため、３Ｃ１２をコードしたｃＤＮＡによるＣＨＯ細胞のトランスフェクションの最中に、強力なグリコシダーゼ阻害剤である阻害剤を添加した。図５は、質量分析により評価したとおり、トランスフェクション中にキフネンシンが存在することで、３Ｃ１２抗体（すなわち３Ｃ１２．Ｋｉｆ）への抗体添加を効果的に阻害することを示す。Ｎ−グリコシダーゼＦの温浸により３Ｃ１２．Ｋｉｆサンプルから放出したグリカンは、ハイマンノースグリカンの処理が行われないことが予想されたとおり、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ９に対応して、約１９０５ｍ／ｚにおいて優性シグナルを生成した。ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ８及びＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ７にそれぞれ対応して、１７４２ｍ／ｚ及び１５８０ｍ／ｚにおいてより小さなシグナルも存在した。比較すると、野生型３Ｃ１２は、フコース含有炭水化物に対応して１４８５ｍ／ｚにて優性シグナルを生成した。糖鎖修飾は、野生型３Ｃ１２の分子量、特異性及び機能的親和性を大幅に変更せずに行った（図５Ｂ、Ｃ）。
実施例６ 軽鎖シャッフリングによるＣＤ８３ ｍＡｂの親和性設計
軽鎖シャッフリングによる親和性成熟を利用して、機能性向上の戦略として抗原−抗体の強度を改善した。ここで、３Ｃ１２ ＶＨ ＤＮＡ配列をヒトＶＬ配列のｃＤＮＡライブラリーにクローニングし、約１０７個の独自のＶＨ−ＶＬの対合の得られたライブラリーを細胞表面上にディスプレイし、親和性選択（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｒｉｖｅｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ）を行った。タンパク質のレベルにおいて、これらの対合の多くは、３Ｃ１２がＣＤ８３に結合する能力にとって有害であり、酵母選別の第一ラウンドでは、ディスプレイしたｓｃＦｖの１％未満が、抗原結合に対して陽性のままであった（図６Ａ）。組み換えＣＤ８３抗原に対して向上した親和性を有するクローンを、酵母増殖により選択し、酵母表面上で、ｓｃＦｖの発現レベルと比較してｈＣＤ８３ＥＣＤ−Ｈｉｓに強力に結合したｓｃＦｖをディスプレイし、各ｓｃＦｖのＣ末端で発現したＳＶ５タグの蛍光強度を検出することにより求めた。本方法によるｓｃＦｖクローンの選択により異なるＶＬ配列を有する、４つの新しい３Ｃ１２ ｓｃＦｖ変異体が生成され、野生型ｓｃＦｖと比較して結合特性が向上した（図６Ｂ、Ｃ）。
パパイン分解を使用したＦａｂ結合剤として調製した際、ＢｉａＣｏｒｅ ＳＰＲにより求めたとおり、ヒトＩｇＧ１により再フォーマットした親和性成熟３Ｃ１２ ｍＡｂ全体が、野生型（３Ｃ１２．ＷＴ）と比較して３〜２０倍の親和性向上を有することが推定された（表５）。抗体結合に対する最大の改善は、より遅くの動力学的解離速度に起因し、クローンは観察したＫｏｆｆに対して８〜１５倍の改善を示した。抗体の結合速度は３Ｃ１２野生型と同様のままであり（Ｋｏｎ＝９．０×１０５Ｍ−１ｓ−１）、ほとんどのクローンは１．４倍を超える改善を示し、あるクローン（３Ｃ１２．Ｂ）はおよそ、３倍の結合速度の減少（Ｋｏｎ＝３．２×１０５Ｍ−１ｓ−１）であった。全体的な親和性向上の観点からすると、変異型３Ｃ１２．Ｃは、最高（すなわち最も遅い）解離速度（Ｋｏｆｆ＝７．８×１０−３ｓ−１）を含む、ＣＤ８３に対して観察した最大の親和性（ＫＤ＝６．１×１０−９Ｍ）を有し、更に特性決定した。図７Ａは、３Ｃ１２．ＷＴに対する３Ｃ１２．Ｃ結合のこれらの向上をグラフにより強調表示し、Ｋｏｆｆ及びＫｏｎ依存性結合フェーズの間に高い結合シグナル強度（すなわちＲＵ）を、ＶＬシャッフル変異型の低下した濃度を使用して達成した。同様に、Ｋｏｆｆ依存性解離フェーズの間に、３Ｃ１２．Ｃ Ｆａｂでより遅い解離速度を観察する。ＩｇＧ分子全体として、親和性が向上した３Ｃ１２．Ｃ ＩｇＧはまた、３Ｃ１２．ＷＴ ＩｇＧと比較してＫＭ−Ｈ２に対する優れた結合を示した（図７Ｂ）。
実施例７：糖鎖及び親和性エンジニアリングを行った３Ｃ１２変異体がインビトロでの効果を向上する
糖鎖エンジニアリングを行った３Ｃ１２．kｉｆの機能活性のための改善、及び親和性を向上した３Ｃ１２．Ｃ抗体をＡＤＣＣアッセイにより、ＭＬＲ中に評価した。クロムリリースアッセイにおいて、３Ｃ１２．Ｃ及び３Ｃ１２．Ｋｉｆの両方が１０％を超えて増加した最大のＮＫ仲介ＡＤＣＣを生成し、３Ｃ１２．ＷＴよりも２５倍を超える潜在能を有した（図８Ａ）。同様に、ＭＬＲ中の同種異系刺激によりもたらされる細胞増殖は、３Ｃ１２．ＷＴより５倍以上増加した潜在能を有する３Ｃ１２．Ｃ及び３Ｃ１２．Ｋｉｆにより阻害された（図８Ｂ）。
優れた活性が３Ｃ１２．Ｃに観察され、これはポリクローナル抗体のＲＡ８３に匹敵する潜在能を示した。
実施例８：遺伝子組み換えをした抗ＣＤ８３ ｍＡｂのインビトロでの作用メカニズム
一次血液樹状細胞の抗ＣＤ８３ ｍＡｂの効果を求めるため、ＩＬ−２の存在下においてＣ１２．Ｃ抗体を培養ＰＢＭＣに投与し、ＮＫ細胞を活性化した。活性化マーカーＣＭＲＦ−４４及びＣＤ８３による評価のとおり、３Ｃ１２．Ｃ ＩｇＧの存在下で培養した細胞は、ｎｉｌ細胞またはアイソタイプコントロール細胞（＞８０％）とは対照的に、活性樹状細胞の割合が低下した（５８％）（処理抗体との競合による検出シグナル強度のいずれかの低下の可能性を取り除くため、ＦＩＴＣ結合３Ｃ１２．Ｃではなく、非結合３Ｃ１２．Ｃ及び二次抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣにより検出した：図９）。また、３Ｃ１２．Ｃ処理後のｎｉｌ及びアイソタイプ処理コントロールの両方においてＣＤ８３ｂｒｉｇｈｔ発現樹状細胞の集団は存在せず、一方で樹状細胞のＣＤ８３ｄｉｍ集団のみが観察された。細胞表面でのＣＤ８３の発現レベルが、ＡＤＣＣを誘発する３Ｃ１２．Ｃの能力に寄与する要因であるかどうかを求めるため、安定的に導入した、様々なＣＤ８３の発現レベルを有するＢＢ８８細胞を使用した。間接免疫蛍光法フローサイトメトリーアッセイを使用して、これらの細胞におけるＣＤ８３分子の数、及び他のＣＤ８３発現細胞株の数を定量化したところ、ＢＢ８８のトランスフェクタントは、５，４００ＭＰＣ〜＜２，３００ＭＰＣのＣＤ８３抗原を発現したことを示した（表６）。したがって、不死化細胞株及び一次血液樹状細胞の発現レベル（１０，０００〜５０，０００ＭＰＣ）と比較して、トランスフェクタントははるかに低いレベルのＣＤ８３を有する。ＢＢ８８、ＣＤ８３を導入した細胞株はそれぞれ、遺伝子組み換えした３Ｃ１２変異体により特異的に溶解し、ＡＤＣＣを誘発するには、低レベルの細胞表面のＣＤ８３のみが必要であることを示している。更に、３Ｃ１２ ｍＡｂ変異体により誘発された溶解の程度は、細胞表面に発現したＣＤ８３分子の数に対して大きな影響を受けた。これは図１０に示されており、ここでは、５〜２５倍に増加した特異的細胞溶解と関連し、抗原濃度が＜２，３００から３，６００、及び５，４００まで増加している。
実施例９：成熟抗ＣＤ８３ ｍＡｂ、３Ｃ１２．Ｃは異種ＧＶＨＤモデルに有効である
インビボでのＧＶＨＤを予防するための親和性向上３Ｃ１２．Ｃを評価するために、ＶＬをシャッフルした３Ｃ１２変異型を標準０．１２５ｍｇ投与量において、ヒトＰＢＭＣを移植してＳＣＩＤマウスに投与した。マウスの４５％（５／１１）を保護したポリクロナール試薬ＲＡ８３と比較して、３Ｃ１２．Ｃ ＩｇＧは同等の潜在能を示してマウスの５４％（６／１１）でＧＶＨＤを予防し、２７％（４／１５）の生存であった３Ｃ１２．ＷＴよりも高い潜在能を有した（図１１）。ＲＡ８３及び３Ｃ１２．ＷＴが通常はそれぞれ＞６０、及び４０％の生存をもたらすとおり、全てのコホートでの有効性は、以前の発見（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０６（２）：３８７−９８．，２００９）と比較して低下した。これらの実験条件下において、３Ｃ１２．Ｃのみがアイソタイプコントロールに対して大きく異なっていた。

Claims (28)

  1. ＣＤ８３に特異的に結合する抗原結合領域を含む、単離または組み換えＣＤ８３結合タンパク質であって、ここで、前記結合タンパク質が
    （ｉ） 配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列；または
    （ｉｉ）配列番号：１に示すアミノ酸配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）
    を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、前記単離または組み換えＣＤ８３結合タンパク質。
  2. 前記結合タンパク質が更に、
    （ｉ） 配列番号：５、６、７、８、もしくは９に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも９０％同一である配列；または
    （ｉｉ） 配列番号：５、６、７、８、もしくは９に示すアミノ酸配列のいずれか一つにある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または
    （ｉｉｉ）配列番号：１０に示すコンセンサス配列、または
    （ｉｖ） ３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号：２６、２７もしくは２８に示すコンセンサス配列である）。
    を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  3. 前記結合タンパク質が更に、配列番号：７に示すＶＬ配列を含む、請求項１に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  4. 前記ＶＬ及びＶＨが単一ポリペプチド鎖中に存在する、請求項２または請求項３に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  5. （ｉ） 一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；もしくは
    （ｉｉ） 二量体ｓｃＦｖ（ジ‐ｓｃＦｖ）；または
    （ｉｉｉ）Ｆｃまたは重鎖定常領域（ＣＨ）２及び／もしくはＣＨ３に結合した（ｉ）または（ｉｉ）；または
    （ｉｖ） 免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に結合した（ｉ）または（ｉｉ）
    である、請求項４に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  6. 前記ＶＬ及びＶＨが分離したポリペプチド鎖中に存在する、請求項２または請求項３に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  7. （ｉ） 二重特異性抗体；または
    （ｉｉ） 三重特異性抗体；または
    （ｉｉｉ） 四重特異性抗体；または
    （ｉｖ） Ｆａｂ；または
    （ｖ） Ｆ（ａｂ’）２；または
    （ｖｉ） Ｆｖ；または
    （ｖｉｉ） ＦｃまたはＣＨ２及び／もしくはＣＨ３に結合した（ｉ）〜（ｖｉ）の一つ；または
    （ｖｉｉｉ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に結合した（ｉ）〜（ｖｉ）の一つ
    である、請求項６に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  8. 抗体である、請求項７に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  9. 前記抗体が
    （ｉ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：５に示すＶＬ配列；または
    （ｉｉ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：６に示すＶＬ配列；または
    （ｉｉｉ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：７に示すＶＬ配列；または
    （ｉｖ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：８に示すＶＬ配列；または
    （ｖ） 配列番号：１に示すＶＨ配列及び配列番号：９に示すＶＬ配列；または
    （ｖｉ） 配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３０に示す軽鎖配列；または
    （ｖｉｉ） 配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３１に示す軽鎖配列；または
    （ｖｉｉｉ）配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３２に示す軽鎖配列；または
    （ｉｘ） 配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３３に示す軽鎖配列；または
    （ｘ） 配列番号：２９に示す重鎖配列及び配列番号：３４に示す軽鎖配列
    を含む、請求項８に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  10. キメラ、脱免疫化、ヒト化、シンヒューマナイズド、ヒト、霊長類化、または複合タンパク質である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  11. ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して、向上したレベルのエフェクター機能を誘発可能、かつ／またはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比較して延長した半減期を付与可能なＦｃ領域を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  12. 配列番号：２９に示す重鎖配列、及び配列番号：３０に示す軽鎖配列を含む抗体の、ＣＤ８３への結合を競合的に阻害する、または前記抗体としてのＣＤ８３の同一のエピトープに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  13. 化合物に結合した、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  14. 裸の結合タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質。
  15. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質をコードする、またはそのポリペプチドをコードする、単離したまたは組み換えを行った核酸。
  16. 配列番号：３５〜４６のいずれか一つに示すヌクレオチド配列、または中〜高ストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸を含む、請求項１５に記載の核酸。
  17. プロモーターに作用可能に結合する、請求項１６に記載の核酸を含む発現構築物。
  18. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質を発現する単離細胞、または遺伝子組み換えを行い請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質を発現する組み換え細胞。
  19. 請求項１５もしくは１６に記載の核酸、または請求項１７に記載の発現構築物を含む、請求項１８に記載の細胞。
  20. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質、及び適当なキャリアからなる組成物。
  21. 前記キャリアが製薬上許容できる、請求項２０に記載の組成物。
  22. 被験体内のＴ細胞及び／もしくは樹状細胞が関与する細胞免疫応答の機能障害または好ましくない機能に起因する疾患または状態の治療または予防方法であって、該方法が、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質、または請求項２１に記載の組成物を該被験体に投与することからなる、前記方法。
  23. 被験体内のアレルギー、ぜんそく、組織または臓器移植片の拒絶、重症筋無力症等の自己免疫性状態、多発性硬化症、血管炎、クローン病または潰瘍性大腸炎等の慢性炎症性腸疾患、ベヒテレフ病及び全身性エリテマトーデス等のＨＬＡ Ｂ２７関連自己免疫疾患、乾癬等の皮膚病、関節リウマチ、インスリン依存性真性糖尿病、並びにＡＩＤＳの治療または予防方法であって、該方法が、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質、または請求項２１に記載の組成物を該被験体に投与することからなる、前記方法。
  24. 組織または臓器移植の拒絶が移植片対宿主病の結果として生じる、請求項２３に記載の方法。
  25. 同種異系移植片の免疫活性を下方制御する方法であって、該方法が、該移植片を請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質、または請求項２１に記載の組成物と接触させることからなる方法。
  26. 薬剤中での、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質、または請求項１５もしくは１６に記載の核酸、または請求項１７に記載の発現構築物、または請求項１８もしくは１９に記載の細胞、または請求項２０もしくは２１に記載の組成物の使用。
  27. アレルギー、ぜんそく、組織または臓器移植片の拒絶、重症筋無力症等の自己免疫性状態、多発性硬化症、血管炎、クローン病または潰瘍性大腸炎等の慢性炎症性腸疾患、ベヒテレフ病及び全身性エリテマトーデス等のＨＬＡ Ｂ２７関連自己免疫疾患、乾癬等の皮膚病、関節リウマチ、インスリン依存性真性糖尿病、並びにＡＩＤＳの治療または予防のための薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質、または請求項１５もしくは１６に記載の核酸、または請求項１７に記載の発現構築物、または請求項１８もしくは１９に記載の細胞、または請求項２０もしくは２１に記載の組成物の使用。
  28. アレルギー、ぜんそく、組織または臓器移植片の拒絶、重症筋無力症等の自己免疫性状態、多発性硬化症、血管炎、クローン病または潰瘍性大腸炎等の慢性炎症性腸疾患、ベヒテレフ病及び全身性エリテマトーデス等のＨＬＡ Ｂ２７関連自己免疫疾患、乾癬等の皮膚病、関節リウマチ、インスリン依存性真性糖尿病、並びにＡＩＤＳの治療または予防での使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＤ８３結合タンパク質、または請求項１５もしくは１６に記載の核酸、または請求項１７に記載の発現構築物、または請求項１８もしくは１９に記載の細胞、または請求項２０もしくは２１に記載の組成物。
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