JP7358369B2 - Ｃｄ８３結合キメラ抗原受容体 - Google Patents

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Description

関連出願に対する相互参照
本願は、それらの全体において本明細書により参照によって本明細書中に組み込まれる２０１８年２月２３日提出の米国特許仮出願第６２／６３４，４３５号及び２０１８年５月３０日提出の同第６２／６７７，７８３号の優先権を主張する。
配列リスト
本願は、２０１９年２月２１日作成の「３２０８０３＿２２００＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」の題名のＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出される配列リストを含有する。配列リストの内容はその全体において本明細書中に組み込まれる。
背景
同種造血細胞移植（ＨＣＴ）は血液悪性腫瘍に対する有効な治療法であるが、急性移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）により限界がある。ＧＶＨＤはドナーＴ細胞が宿主細胞において遺伝的に定められるタンパク質に応答する場合に生じ、ＨＣＴに付随する高い死亡率の極めて重要な一因である。樹状細胞（ＤＣ）は、ＧＶＨＤを引き起こす同種Ｔ細胞刺激において主要な役割を果たす。ドナーＤＣは移植後の同種抗原の間接的提示に関与する一次抗原提示細胞であり、この過程は移植のほぼ直後に開始される。ＧＶＨＤを制御するための現在の免疫抑制処置はＴ細胞を標的としているが、患者において移植後免疫を損なう。
概要
ドナーＴ細胞などのアロ反応性細胞を抑制するための養子細胞移植とともに使用され得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを開示する。開示されるＣＡＲポリペプチドは、外部ドメインにおいて、ＣＤ８３発現細胞に結合し得る抗ＣＤ８３結合物質を含有する。開示されるＣＡＲポリペプチドを発現させるために遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞も開示する。
抗ＣＤ８３結合物質は、いくつかの実施形態では、ＣＤ８３に特異的に結合する抗体断片である。例えば、抗原結合ドメインは、ＣＤ８３に特異的に結合する抗体のＦａｂ又は１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。抗ＣＤ８３結合物質は、いくつかの実施形態では、ＣＤ８３に特異的に結合するアプタマーである。例えば、抗ＣＤ８３結合物質は、そのＣＤ８３結合能に基づくランダム配列プールから選択されるペプチドアプタマーであり得る。抗ＣＤ８３結合物質は、ＣＤ８３に結合可能な、ＣＤ８３又はそれらの変異体及び／又は断片の天然リガンドでもあり得る。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ ｓｃＦｖは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインとを含み得る。
例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＧＦＳＩＴＴＧＧＹＷＷＴ（配列番号１）、ＳＤＧＩＳ（配列番号７）又はＳＮＡＭＩ（配列番号１３）を含み；ＶＨドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＧＹＩＦＳＳＧＮＴＮＹＮＰＳＩＫＳ（配列番号２）、ＩＩＳＳＧＧＮＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号８）又はＡＭＤＳＮＳＲＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号１４）を含み；ＶＨドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＣＡＲＡＹＧＫＬＧＦＤＹ（配列番号３）、ＶＶＧＧＴＹＳＩ（配列番号９）又はＧＤＧＧＳＳＤＹＴＥＭ（配列番号１５）を含み；ＶＬのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＴＬＳＳＱＨＳＴＹＴＩＧ（配列番号４）、ＱＳＳＱＳＶＹＮＮＤＦＬＳ（配列番号１０）又はＱＳＳＱＳＶＹＧＮＮＥＬＳ（配列番号１６）を含み；ＶＬドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＶＮＳＤＧＳＨＳＫＧＤ（配列番号５）、ＹＡＳＴＬＡＳ（配列番号１１）又はＱＡＳＳＬＡＳ（配列番号１７）を含み；ＶＬドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＧＳＳＤＳＳＧＹＶ（配列番号６）、ＴＧＴＹＧＮＳＡＷＹＥＤＡ（配列番号１２）又はＬＧＥＹＳＩＳＡＤＮＨ（配列番号１８）を含む。
例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＧＦＳＩＴＴＧＧＹＷＷＴ（配列番号１）を含み、ＶＨドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＧＹＩＦＳＳＧＮＴＮＹＮＰＳＩＫＳ（配列番号２）を含み、ＶＨドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＣＡＲＡＹＧＫＬＧＦＤＹ（配列番号３）を含み、ＶＬのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＴＬＳＳＱＨＳＴＹＴＩＧ（配列番号４）を含み、ＶＬドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＶＮＳＤＧＳＨＳＫＧＤ（配列番号５）を含み、ＶＬドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＧＳＳＤＳＳＧＹＶ（配列番号６）を含む。
例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＳＤＧＩＳ（配列番号７）を含み、ＶＨドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＩＩＳＳＧＧＮＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号８）を含み、ＶＨドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＶＶＧＧＴＹＳＩ（配列番号９）を含み、ＶＬのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＱＳＳＱＳ ＶＹＮＮＤＦＬＳ（配列番号１０）を含み、ＶＬドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＹＡＳＴＬＡＳ（配列番号１１）を含み、ＶＬドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＴＧＴＹＧＮＳＡＷＹＥＤＡ（配列番号１２）を含む。
例えば、いくつかの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＳＮＡＭＩ（配列番号１３）を含み、ＶＨドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＡＭＤＳＮＳＲＴＹＹＡＴＷＡＫＧ（配列番号１４）を含み、ＶＨドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＧＤＧＧＳＳＤＹＴＥＭ（配列番号１５）を含み、ＶＬのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＱＳＳＱＳＶＹＧＮＮＥＬＳ（配列番号１６）を含み、ＶＬドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＱＡＳＳＬＡＳ（配列番号１７）を含み、ＶＬドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＬＧＥＹＳＩＳＡＤＮＨ（配列番号１８）を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖ ＶＨドメインは、アミノ酸配列：
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重鎖及び軽鎖は、好ましくはリンカーにより分離される。ｓｃＦｖ抗体に対する適切なリンカーは当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含む。
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：
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他のＣＡＲを用いた場合、開示されるポリペプチドは、免疫エフェクター細胞を活性化可能である膜貫通ドメイン及び内部ドメインも含有し得る。例えば、内部ドメインは、シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の同時刺激シグナル伝達領域を含有し得る。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、同時刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はそれらの組み合わせの細胞質ドメインを含む。一部の例では、同時刺激シグナル伝達領域は、１つ以上の細胞内シグナル伝達及び／又は同時刺激分子の１、２、３又は４個の細胞質ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、同時刺激シグナル伝達領域は、シグナル伝達を促進するＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢの細胞質ドメインにおいて１個以上の突然変異を含有する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは不完全な内部ドメインを含有する。例えば、ＣＡＲポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメイン又は同時刺激ドメインのみを含有し得るが、両方を含有することはない。これらの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、そのＣＡＲポリペプチド及び、欠損ドメインを含有する第２のＣＡＲポリペプチド（又は内在性Ｔ細胞受容体）が両者ともそれらのそれぞれの抗原に結合しない限り、活性化されない。従って、いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含有するが、同時刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）を含有しない。他の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はそれらの組み合わせの細胞質ドメインを含有するが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）を含有しない。
開示されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離核酸配列、これらの単離核酸を含むベクター及びこれらのベクターを含有する細胞も開示される。例えば、この細胞は、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞及び制御Ｔ細胞からなる群から選択される免疫エフェクター細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、この細胞は、ＣＡＲの抗原結合ドメインがＣＤ８３に結合する場合、アロ反応性ドナー細胞、例えばＴ細胞などを抑制する。
開示されるＣＤ８３特異的なＣＡＲで遺伝子改変された有効量の免疫エフェクター細胞を対象に投与することを含む対象においてＧＶＨＤを予防する方法も開示される。いくつかの実施形態では、対象は組織移植を受けている。いくつかの実施形態では、組織移植は骨髄移植を含む。いくつかの実施形態では、組織移植は、顔面移植、腹壁移植、四肢移植、上肢移植、血管柄付複合組織同種移植又は全組織移植を含むが限定されない固体臓器移植を含む。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患、敗血症、リウマチ性疾患、糖尿病及び／又は喘息に罹患している。開示されるＣＤ８３特異的ＣＡＲで遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の有効量を対象に投与することを含む、対象において自己免疫を処置する方法も開示する。開示されるＣＤ８３特異的ＣＡＲで遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の有効量を対象に投与することを含む、対象における固体臓器同種移植片及び既製のＣＡＲ－Ｔ細胞の拒絶を予防する方法も開示する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を添付の図面及び以下の説明で示す。本発明の他の特性、目的及び利点は、記載及び図面から、及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
図面の説明
図１は、本明細書中で開示される一実施形態によるヒトＣＤ８３ ＣＡＲコンストラクトの模式図である。抗ＣＤ８３ １本鎖可変断片には、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン並びに４１ＢＢ同時刺激ドメイン及びＣＤ３ζ活性化ドメインが続く。ＣＡＲの３’末端に蛍光レポーターをタグ付加する。ＣＡＲレポーター遺伝子をＳＦＧレトロウイルスベクターにクローニングする。 図２Ａ～２ＥはヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の特徴を示す。図２Ａは、モック形質導入（ｅＧＦＰ陰性）又はＣＤ８３ ＣＡＲ（ｅＧＦＰ陽性）Ｔ細胞間での、産生後、ｅＧＦＰレポーターを発現するＴ細胞の量（平均±ＳＥＭ）を示す棒グラフである。図２Ｂは、モック形質導入又はＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞間での、ＣＤ４又はＣＤ８発現の相対量（平均±ＳＥＭ）を示す棒グラフである。シダック検定。図２Ｃは、ＣＤ８３＋ＤＣでの刺激後にモック形質導入Ｔ細胞又はＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞により放出されるＩＦＮγの量を示す。図２Ｄは、リアルタイム細胞分析系において測定される、ＣＤ８３＋ＤＣと同時培養したＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞又はモック形質導入Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。２つ組ウェルに対する経時的な平均正規化セルインデックスとしてデータを提示する。Ｔ細胞添加後第１日である正規化時点でのセルインデックスにより、ある一定の時点でのセルインデックスを除したものとして、正常化セルインデックスを計算する。２つのうち１つの代表的実験を示す、ダネット検定。図２Ｅは、１４日間にわたり毎週計算した、ＣＤ８３＋ＤＣで刺激したＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞又はモック形質導入Ｔ細胞に対するＴ細胞の絶対数を示す。２つのうち１つの代表的実験を示す、シダック検定。＊＊Ｐ＝０．００１－０．０１、＊＊＊Ｐ＝０．０００１－０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図３は、ヒトＣＤ８３キメラ抗原受容体Ｔ細胞がアロ反応性を低下させることを示す。同種のサイトカイン成熟単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）とともにヒトＴ細胞を１：３０のＤＣ：Ｔ細胞比（即ち１００，０００個のＴ細胞及び３３３３個のｍｏＤＣ）で培養した。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ（培養Ｔ細胞に対して自己）をｍｏＤＣに対して特異的な比で添加した（３：１～１：１０、添加したＣＡＲ Ｔの最低量は細胞３３３個であった）。第＋５日にＫｉ‐６７発現によってＴ細胞増殖を測定した。ＧＦＰのそれらの発現によって、ＣＡＲ Ｔをゲートアウトした。対照には、Ｔ細胞のみ（即ち増殖なし）、モック形質導入Ｔ細胞及びＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞が含まれた。これらのモック形質導入Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現しなかったが、形質導入ＣＤ８３細胞と同一方式で処置した。ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、４１ＢＢ同時刺激ドメインを使用し、この系において無関係である抗原を標的とした。２つの代表的な実験のうち１つを示す。 図４Ａ～４Ｄは、ＣＤ８３が、制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と比較して、ヒト活性化通常型ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）上で異なって発現されることを示す。同種ｍｏＤＣ（ＤＣ：Ｔ細胞比１：３０）又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ビーズ：Ｔ細胞比１：３０）によってヒトＴ細胞を刺激した。活性化Ｔｃｏｎ（ＣＤ４＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ２５＋）又はＴｒｅｇ（ＣＤ４＋、ＣＤ１２７－、ＣＤ２５＋、Ｆｏｘｐ３＋）上でのＣＤ８３発現をベースライン、刺激後４時間、８時間、２４時間及び４８時間で測定した。図４Ａ及び４Ｂは、刺激後様々な時点でのＴｃｏｎ（図４Ａ）及びＴｒｅｇ（図４Ｂ）の間でのＣＤ８３発現を示す代表的なコンタープロットである。３回のうち１回の代表的実験を示す。図４Ｃ及び４Ｄは、同種ＤＣ（図４Ｃ）又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（図４Ｄ）刺激後のＣＤ８３＋Ｔｃｏｎｖ又はＴｒｅｇ（平均±ＳＥＭ）の量を示す棒グラフである。ｎ＝５回の独立実験、シダック検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＝０．００１－０．０１、＊＊＊Ｐ＝０．０００１－０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図５Ａ及び５Ｂは、ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞が異種間ＧＶＨＤを防ぐことを示す。ＮＳＧマウスに２５ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣを与え、低用量（１ｘ１０６）又は高用量（１０ｘ１０６）ＣＤ８３ ＣＡＲ又はモック形質導入Ｔ細胞を接種した。ＣＡＲはＰＢＭＣドナーにとって自己であった。マウスのさらなる対照群にはＰＢＭＣのみを与えた。図５Ａ及び５Ｂは生存率（図５Ａ）及び（Ｂ）ＧＶＨＤ臨床スコア（図５Ｂ）を示す。臨床スコアは、活動性、毛衣及び皮膚状態、体重減少及び姿勢の統合評価を組み込む。１実験アームあたり最大９匹のマウスで３回の独立実験からのデータをプールした。ログランク検定。＊＊Ｐ＝０．００１－０．０１。 図６Ａ～６Ｄは、ヒトＴ細胞によりＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞がＧＶＨＤ標的臓器障害を顕著に軽減することを示す。ＮＳＧマウスに２５ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣ＋１ｘ１０６個のＣＤ８３ ＣＡＲ又はモック形質導入Ｔ細胞を移植した。対照群は、ＰＢＭＣを与えなかったマウス（陰性対照）及び改変Ｔ細胞なしでＰＢＭＣを与えたマウス（二次陽性対照）から構成された。レシピエントマウスを第＋２１日に人道的に安楽死させ、専門の病理学者が盲検で組織ＧＶＨＤ重症度を評価した。レシピエント肺（図６Ａ、６Ｂ）及び肝臓（図６Ｃ、６Ｄ）に対する、異種間ＧＶＨＤパススコア（図６Ａ、６Ｃ）及び代表的Ｈ＆Ｅ画像（図６Ｂ、６Ｄ）を示す。実験アームあたり最大６匹のマウスで２回の独立実験からデータをプールした。ダネット検定。＊＊Ｐ＝．００１－．０１及び＊＊＊Ｐ＝０．０００１－０．００１。 図７は、ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞がインビボでのドナー細胞増殖の増殖を減少させることを示す。ＮＳＧマウスに２５ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣ＋１ｘ１０６個のＣＤ８３ ＣＡＲ又はモック形質導入Ｔ細胞を移植した。対照群は、ＰＢＭＣを与えなかったマウス（陰性対照）及び改変Ｔ細胞なしでＰＢＭＣを与えたマウス（二次陽性対照）から構成された。レシピエントマウスを第＋２１日に人道的に安楽死させ、肉眼での評価及びフローサイトメトリー試験のためにそれらの脾臓を摘出した。代表的な画像から、ＰＢＭＣ及びＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞が与えられたマウスの脾臓サイズが小さくなったことが示され、これにより、インビボでのドナーＴ細胞増殖の抑制が裏付けられる。２回のうち１回の代表的実験、実験アームあたり最大６匹のマウス。 図８Ａ～８Ｅは、ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞がインビボで循環成熟ＣＤ８３＋ＤＣを顕著に減少させることを示す。ＮＳＧマウスに２５ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣ＋１ｘ１０６個のＣＤ８３ ＣＡＲ又はモック形質導入Ｔ細胞を与えた。図８Ａは、第＋２１日のマウス脾臓におけるヒトＣＤ８３＋、ＣＤ１ｃ＋ＤＣの頻度を示す代表的なコンタープロットを含有する。図８Ｂ＼は、＋２１日のマウス脾臓におけるヒトＣＤ８３＋、ＣＤ１ｃ＋ＤＣの絶対数（平均±ＳＥＭ）を示す棒グラフである。ダネット検定。図８Ｃは、第＋２１日でのレシピエント脾臓におけるＭＨＣクラスＩＩ＋、ＣＤ１ｃ＋ＤＣのパーセンテージを示す代表的コンタープロットを含有する。図８Ｄは、これらの細胞の絶対数（平均±ＳＥＭ）を示す棒グラフである、ダネット検定。図８Ｅは、モック形質導入Ｔ細胞を与えたマウスと比較した、第＋２１日での接種マウスにおけるｅＧＦＰ＋ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の量を示す代表的なコンタープロットである。実験アームあたり最大６匹のマウスで、２回の独立実験からのデータをプールした。＊＊Ｐ＝．００１－．０１。 図９Ａ～９Ｉは、ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞が病原性Ｔｈ１細胞を顕著に減少させ、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ比を上昇させることを示す。記載のようにＮＳＧマウスに２５ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣ＋１ｘ１０６個のＣＤ８３ ＣＡＲ又はモック形質導入Ｔ細胞を与えた。第＋２１日に、マウスを人道的に安楽死させ、ドナー、ヒトＴ細胞の量を数え上げ、特徴を調べた。図９Ａは、レシピエント脾臓中のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す代表的なコンタープロットを含有する。図９Ｂ及び９Ｃは、第＋２１日のマウス脾臓におけるＣＤ４＋（図９Ｂ）及びＣＤ８＋（図９Ｃ）Ｔ細胞の絶対数（平均±ＳＥＭ）を示す棒グラフである。ダネット検定。図９Ｄは、第＋２１日のマウス脾臓におけるＣＤ４＋、ＣＤ１２７－、ＣＤ２５＋、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージを示すコンタープロットを含有する。図９Ｅ及び９Ｆは、レシピエントマウスにおける、第＋２１日のＴｒｅｇｓ（図９Ｅ）及びＴｒｅｇ：ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋アロ反応性Ｔｃｏｎｖ（図９Ｆ）の量（平均±ＳＥＭ）を示す棒グラフである。ダネット検定。図９Ｇは、第＋２１日のマウス脾臓におけるＣＤ４＋、ＩＦＮγ＋Ｔｈ１細胞及びＣＤ４＋、ＩＬ－４＋Ｔｈ２細胞の頻度を示すコンタープロットを含有する。図９Ｈ及び９Ｉは、レシピエント脾臓におけるＴｈ１（図９Ｈ）及びＴｈ２（図９Ｉ）細胞の絶対数（平均±ＳＥＭ）を示す棒グラフである。ダネット検定。実験アームあたり最大６匹のマウスで、２回の独立実験からのデータをプールした。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＝０．００１－０．０１。 ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＴＬ介在性抗腫瘍免疫を可能にする。ＮＳＧマウスに、記載のように２５ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣ＋１ｘ１０６個のＣＤ８３ ＣＡＲ又はモック形質導入Ｔ細胞を与えた。Ａ）第＋２１日に、ドナー、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の量を数え上げた、ダネット検定。実験アームあたり最大６匹のマウスで、２回の独立実験からのデータをプールした。Ｂ）ＮＳＧマウスに３０ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣ＋１ｘ１０６個のＣＤ８３ ＣＡＲ又はモック形質導入Ｔ細胞を移植した。第０及び＋７日に照射済みＫ５６２細胞（１０７）の接種物を与えた。第＋１２日にマウスを人道的に安楽死させ、レシピエント脾臓からヒトＣＤ８ Ｔ細胞を精製した。１０：１のＥ／Ｔ比で精製ヒトＣＤ８ Ｔ細胞を新鮮Ｋ５６２細胞と一緒に同時培養し、xCELLigence RTCA系を使用して標的細胞の死滅を監視した。ダネット検定。２回のうち１回の代表的実験を示す。＊Ｐ＜．０５、＊＊＊Ｐ＝．０００１－．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜．０００１。 １１Ａ及び１１Ｂは、同種樹状細胞（図１１Ａ）又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（図１１Ｂ）の刺激後の、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞間でのＣＤ８３発現を示す。
詳細な説明
抗原提示細胞においてＣＤ８３を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書中で開示される。これらのＣＡＲを発現するように改変されるＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞も開示される。これらのＣＡＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞などのアロ反応性ドナー細胞を抑止し得る。従って、開示されるＣＤ８３特異的なＣＡＲを発現するように改変された開示される免疫エフェクター細胞の養子移植を含む、対象においてＧＶＨＤを予防するための方法も開示される。
ＣＤ８３特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
ＣＡＲは一般に、リンパ球活性化に関与する膜貫通シグナル伝達モチーフがあるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からの抗原認識ドメインを組み込む（Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45）。アロ反応性ドナー細胞を抑止するための免疫エフェクター細胞において発現され得るＣＤ８３特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を本明細書中で開示する。
開示されるＣＡＲは一般に３個のドメイン：外部ドメイン、膜貫通ドメイン及び内部ドメインから構成される。外部ドメインは、ＣＤ８３結合領域を含み、抗原認識に関与する。これは、任意選択によりシグナルペプチド（ＳＰ）も含有し、ＣＡＲがグリコシル化され、免疫エフェクター細胞の細胞膜においてアンカーされ得るようになる。膜貫通ドメイン（ＴＤ）は、その名が示すように、外部ドメインを内部ドメインに連結し、細胞により発現されるとき細胞膜内に存在する。内部ドメインは、抗原認識後、免疫エフェクター細胞に活性化シグナルを伝達するＣＡＲの決定的部分である。例えば内部ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）及び任意選択により同時刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）を含有し得る。
「シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）」は一般に、リン酸化されるとシグナル伝達カスケードを活性化する免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。「同時刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）」という用語は、Ｔ細胞受容体によりＴ細胞活性化を促進可能である、ＣＤ２８、４１ＢＢ及びＩＣＯＳなどの同時刺激タンパク質受容体からの細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
いくつかの実施形態では、内部ドメインはＳＤ又はＣＳＲを含有するが、両方を含有することはない。これらの実施形態では、開示されるＣＡＲを含有する免疫エフェクター細胞は、欠損ドメインを含有する別のＣＡＲ（又はＴ細胞受容体）もその個々の抗原に結合する場合にのみ活性化される。
いくつかの実施形態では、開示されるＣＡＲは、次の式により定義される：
ＳＰ－ＣＤ８３－ＨＧ－ＴＭ－ＣＳＲ－ＳＤ；又は
ＳＰ－ＣＤ８３－ＨＧ－ＴＭ－ＳＤ－ＣＳＲ；
式中、「ＳＰ」は任意選択のシグナルペプチドを表し、
式中、「ＣＤ８３」はＣＤ８３結合領域を表し、
式中、「ＨＧ」は任意選択のヒンジドメインを表し、
式中、「ＴＭ」は膜貫通ドメインを表し、
式中、「ＣＳＲ」は１つ以上の同時刺激シグナル伝達領域を表し、
式中、「ＳＤ」はシグナル伝達ドメインを表し、
式中、「－」はペプチド結合又はリンカーを表す。
さらなるＣＡＲコンストラクトは、例えば、これらのＣＡＲモデルの教示に対してその全体において参照により組み込まれるFresnak AD, et al. Engineered T cells:the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81に記載されている。
例えば、ＣＡＲは、ＴＲＵＣＫ、ユニバーサルＣＡＲ（Universal CAR）、セルフドライビングＣＡＲ（Self-driving CAR）、アーマードＣＡＲ（Armored CAR）、セルフデストラクトＣＡＲ（Self-destruct CAR）、コンディショナルＣＡＲ（Conditional CAR）、マークトＣＡＲ（Marked CAR）、ＴｅｎＣＡＲ、デュアルＣＡＲ（Dual CAR）又はｓＣＡＲであり得る。
免疫抑制に抵抗性を示すように改変されたＣＡＲ Ｔ細胞（アーマードＣＡＲ（Armored CAR））は、免疫チェックポイントスイッチ受容体により様々な免疫チェックポイント分子（例えば細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）又はプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１））をもはや発現しないように遺伝子改変され得るか、又は免疫チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体とともに投与され得る。
セルフデストラクトＣＡＲ（Self-destruct CAR）は、ＣＡＲをコードするためにエレクトロポレーションによって送達されるＲＮＡを使用して設計され得る。或いは、Ｔ細胞の誘導性アポトーシスは、遺伝子改変リンパ球におけるチミジンキナーゼへのガンシクロビル結合に基づき、又は低分子二量体化剤によるヒトカスパーゼ９の活性化のより近年に記載された系により、達成され得る。
コンディショナルＣＡＲ（Conditional CAR）Ｔ細胞は、初期設定で無応答性であるか、又はシグナル１及びシグナル２の両方の完全形質導入を可能にし、それによりＣＡＲ Ｔ細胞を活性化するサーキットを完成させるための低分子の添加まで、スイッチ「オフ」になっている。或いはＴ細胞は、その後に投与される、標的抗原に向けられる二次抗体に対して親和性があるアダプター特異的受容体を発現するように改変され得る。
タンデムＣＡＲ（tandem CAR）（ＴａｎＣＡＲ）Ｔ細胞は、細胞内同時刺激ドメイン及びＣＤ３ζドメインと融合される異なる親和性を有する２つの連結される１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる単一ＣＡＲを発現する。ＴａｎＣＡＲ Ｔ細胞活性化は、標的細胞が両標的を同時発現するときのみ達成される。
デュアルＣＡＲ（Dual CAR）Ｔ細胞は、異なるリガンド結合標的とともに２つの個別ＣＡＲを発現し；一方のＣＡＲはＣＤ３ζドメインのみを含み、他方のＣＡＲは同時刺激ドメインのみを含む。デュアルＣＡＲ（Dual CAR）Ｔ細胞活性化は、両標的の同時発現を必要とする。
セイフティーＣＡＲ（safety Car）（ｓＣＡＲ）は、細胞内阻害ドメインと融合される細胞外ｓｃＦｖからなる。標準ＣＡＲを同時発現するｓＣＡＲ Ｔ細胞は、標準的ＣＡＲ標的を保持するがｓＣＡＲ標的を欠く標的細胞に遭遇する場合のみ活性化されるようになる。
開示されるＣＡＲの抗原認識ドメインは通常ｓｃＦｖである。しかし、多くの代替物がある。単純な外部ドメイン（例えばＨＩＶ感染細胞を認識するためのＣＤ４外部ドメイン）及び（サイトカイン受容体を有する細胞の認識につながる）連結されるサイトカインなどのより新型の認識コンポーネントを有するものとして、ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ１本鎖からの抗原認識ドメインが記載されている。実際に、高い親和性がある、ある種の標的に結合するほぼ全てのものを抗原認識領域として使用し得る。
内部ドメインは、抗原認識後にシグナルを免疫エフェクター細胞に伝達するＣＡＲの決定的部分であり、免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つを活性化する。Ｔ細胞のエフェクター機能は例えば、サイトカイン分泌を含む細胞溶解性活性又はヘルパー活性であり得る。従って、内部ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び任意選択の共受容体の「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含み得る。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得る一方で、多くの例において、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用される範囲で、このような短縮部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。
刺激方式で作用するＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３２（ＦｃガンマＲＩＩａ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩγ、ＦｃγＲＩＩＩγ、ＦｃεＲＩβ（ＦＣＥＲＩＢ）及びＦｃεＲＩγ（ＦＣＥＲＩＧ）由来のものが挙げられる。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）（ＴＣＲゼータ、GenBank accno.ＢＡＧ３６６６４．１）由来である。Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖又はＣＤ２４７（表面抗原分類２４７）としても知られるＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖は、ヒトにおいてＣＤ２４７遺伝子によりコードされるタンパク質である。
第一世代ＣＡＲは一般的に、内在性ＴＣＲからのシグナルの一次伝達物質である、ＣＤ３ζ鎖からの細胞内ドメインを有した。第二世代ＣＡＲは、さらなるシグナルをＴ細胞に提供するためにＣＡＲの内部ドメインに様々な同時刺激タンパク質受容体（例えばＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）からの細胞内シグナル伝達ドメインを付加する。より近年の第三世代ＣＡＲは、効力をさらに強化するために複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせる。これらのＣＡＲとともに移植されたＴ細胞は、同時刺激受容体／リガンド相互作用と独立して、増殖、活性化、持続性及び腫瘍根絶効果の向上を示した（Imai C, et al. Leukemia 2004 18:676-84; Maher J,et al. Nat Biotechnol 2002 20:70-5）。
例えば、ＣＡＲの内部ドメインは、それだけで、又は本発明のＣＡＲの観点で有用な何らかの他の所望の細胞質ドメインと合わせて、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分及び同時刺激シグナル伝達領域を含み得る。同時刺激シグナル伝達領域は、同時刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。同時刺激分子は、抗原へのリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体又はそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３並びに、ＣＤ１２３、ＣＤ８、ＣＤ４、ｂ２ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭｙＤ８８、ＢＴＮＬ３及びＮＫＧ２Ｄに特異的に結合するリガンドが挙げられる。従って、主に同時刺激シグナル伝達エレメントとしてのＣＤ２８とともにＣＡＲが例証される一方で、他の同時刺激エレメントを、単独で、又は他の同時刺激シグナル伝達エレメントと組み合わせて使用し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲはヒンジ配列を含む。ヒンジ配列は、抗体の柔軟性を促進するアミノ酸の短い配列である（例えばWoof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2):89-99(2004)参照）。ヒンジ配列は、抗原認識部分（例えば抗ＣＤ８３ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジ配列は、何らかの適切な分子由来であるか又はそれから得られる何らかの適切な配列であり得る。いくつかの実施形態では、例えばヒンジ配列はＣＤ８ａ分子又はＣＤ２８分子由来である。
膜貫通ドメインは、天然又は合成起源の何れか由来であり得る。供給源が天然である場合、ドメインは、何らかの膜結合又は膜貫通タンパク質由来であり得る。例えば、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Tactile)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ及びＰＡＧ／Ｃｂｐの、アルファ、ベータ又はゼータ鎖由来であり得る（即ち少なくともその膜貫通領域を含み得る）。或いは、膜貫通ドメインは合成され得、この場合、これは主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。一部の例では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンの三つ組が合成膜貫通ドメインの各末端で見られ得る。２～１０アミノ酸長などの短いオリゴ又はポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと内質ドメインとの間で結合を形成し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、一つより多い膜貫通ドメインを有し、これらは同じ膜貫通ドメインの反復であり得るか又は異なる膜貫通ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、この教示に対して参照により組み込まれる国際公開第２０１５／０３９５２３号に記載のように複数鎖ＣＡＲである。複数鎖ＣＡＲは、異なる膜貫通ポリペプチドにおける個別の細胞外リガンド結合及びシグナル伝達ドメインを含み得る。シグナル伝達ドメインは、膜近傍位置で集合するように設計され得、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体により近い柔軟な構造物を形成する。例えば、複数鎖ＣＡＲは、ＦＣＥＲＩ鎖がＣＡＲを形成するために一緒に自然に二量体化するようにＦＣＥＲＩアルファ鎖の一部及びＦＣＥＲＩベータ鎖の一部を含み得る。
以下の表１、２及び３は、開示されるＣＡＲで起こり得るＣＤ８３結合領域、同時刺激シグナル伝達領域及び細胞内シグナル伝達ドメインのいくつかの例の組み合わせを提供する。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３結合物質は１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体である。抗ＣＤ８３ｓｃＦｖの親和性／特異性は、重（ＶＨ）及び軽（ＶＬ）鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ）内の特異的配列により大部分決定される。各ＶＨ及びＶＬ配列は、３個のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ８３結合物質はモノクローナル抗体などの天然抗体由来である。一部の例では、抗体はヒトである。一部の例では、抗体は、ヒトに投与されたときにその免疫原性を弱くするために改変がなされている。例えば改変は、最も近いヒト生殖系列配列に対応するための、キメラ化、ヒト化、ＣＤＲ移植、免疫原性低減（deimmunization）及びフレームワークアミノ酸の突然変異からなる群から選択される１つ以上の技術を含む。
ＣＤ８３及び少なくとも１つのさらなる抗原を標的とする二特異性ＣＡＲも開示される。異なる抗原と結合する別のＣＡＲと組み合わせてのみ働くように設計されるＣＡＲも開示する。例えば、これらの実施形態では、開示されるＣＡＲの内部ドメインは、シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）又は同時刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）のみを含有し得るが、両方を含有することはない。第２のＣＡＲ（又は内在性Ｔ細胞）は、活性化される場合、欠損シグナルを提供する。例えば開示されるＣＡＲがＳＤを含有するがＣＳＲを含有しない場合、このＣＡＲを含有する免疫エフェクター細胞は、ＣＳＲを含有する別のＣＡＲ（又はＴ細胞）がその個々の抗原と結合する場合のみ活性化される。同様に、開示されるＣＡＲがＣＳＲを含有するがＳＤを含有しない場合、このＣＡＲを含有する免疫エフェクター細胞は、ＳＤを含有する別のＣＡＲ（又はＴ細胞）がその個々の抗原に結合する場合のみ活性化される。
核酸及びベクター
開示される免疫エフェクター細胞におけるＣＤ８３特異的なＣＡＲの発現を可能にする開示されるＣＤ８３特異的なＣＡＲをコードするポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドベクターも開示する。
開示されるＣＡＲをコードする核酸配列及びその領域は、例えば、標準的な技術を使用して、その遺伝子を発現する細胞からライブラリをスクリーニングすることによる、その遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を導き出すことによる、又はその遺伝子を含有する細胞及び組織から直接単離することによるなど、当技術分野で公知の組み換え方法を使用して得られ得る。或いは、関心のある遺伝子をクローニングではなく合成により作製し得る。
ＣＡＲをコードする核酸の発現は一般に、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸をプロモーターに操作可能に連結し、発現ベクターにコンストラクトを組み込むことにより達成される。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列及びプロモーターを含有する。
開示される核酸を多くのタイプのベクターにクローニングし得る。例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むが限定されないベクターに核酸をクローニングし得る。特に関心があるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター及びシーケンシングベクターが挙げられる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えばSambrook et al. (2001,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)において、及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが挙げられるが限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的である複製起点、プロモーター配列、都合の良い制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択可能マーカーを含有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドベクターはレンチウイルス又はレトロウイルスベクターである。
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスに基づく系が開発されている。例えばレトロウイルスは、遺伝子送達系のための都合の良いプラットフォームを提供する。選択される遺伝子をベクターに挿入し、当技術分野で公知である技術を使用してレトロウイルス粒子中でパッケージ化し得る。次に組み換えウイルスを単離し、インビボ又はエクスビボの何れかで対象の細胞に送達し得る。
適切なプロモーターの一例は前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結される何らかのポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を推進可能な強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（Elongation Growth Factor-1α）（ＥＦ－１α）である。しかし、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルス）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチニンキナーゼプロモーターなどであるが限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが限定されない他の構成的プロモーター配列も使用し得る。プロモーターは或いは誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが限定されない。
さらなるプロモーターエレメント、例えばエンハンサー、は、転写開始頻度を調節する。一般的には、これらは開始部位の領域３０～１１０ｂｐ上流に位置するが、多くのプロモーターは最近、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間のスペーシングは、しばしば柔軟であり、エレメントが反転されるか又は互いに対して動く場合、プロモーター機能が保持されるようになっている。
ＣＡＲポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞に導入されるべき発現ベクターは、ウイルスベクターを通じて遺伝子移入されるか又は感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択をし易くするために、選択可能マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子の何れか又はその両方も含有し得る。他の態様では、選択可能マーカーは、ＤＮＡの個別の断片で行い、同時遺伝子移入手順で使用され得る。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子の両方とも、宿主細胞での発現を可能にするために適切な制御配列と隣接させ得る。有用な選択可能マーカーとしては、例えば抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
遺伝子移入された可能性がある細胞を同定するために、及び調節配列の機能性を評価するために、レポーター遺伝子を使用する。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織に存在しないか又はそれにより発現されない、及び例えば酵素活性など、いくつかの容易に検出可能な性質により発現が顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、適切な時にレポーター遺伝子の発現をアッセイする。適切なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が挙げられ得る。適切な発現系は周知であり、既知の技術を使用して調製し得るか、又は市販品を入手し得る。一般に、レポーター遺伝子の最大レベルの発現を示す最小５’隣接領域があるコンストラクトがプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子と連結され、プロモーター推進転写を調整する能力について物質を評価するために使用され得る。
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当技術分野で公知である。発現ベクターの文脈において、当技術分野での何らかの方法によって、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫細胞にベクターを容易に導入し得る。例えば、物理学的、化学的又は生物学的手段によって発現ベクターを宿主細胞に遺伝子移入し得る。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は当技術分野で周知である。例えばSambrook et al.(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)参照。
関心のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法にはＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター及び特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法となっている。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ及び水中油エマルションを含む脂質に基づく系、ミセル、混合ミセル及びリポソームが挙げられる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとしての使用のための代表的なコロイド系はリポソームである（例えば人工膜小胞）。
非ウイルス送達系が利用される場合、代表的な送達ビヒクルはリポソームである。別の態様において、核酸を脂質と会合させ得る。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性である内部に封入され得るか、リポソームの脂質二重層内で分散され得るか、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに連結され得るか、リポソーム中に封入され得るか、リポソームと複合体化させ得るか、脂質を含有する溶液中で分散され得るか、脂質と混合され得るか、脂質と組み合わせられ得るか、脂質中の懸濁液として含有され得るか、ミセルとともに含有され得るか若しくはミセル複合体化させ得るか、又はそうでなければ脂質と会合させられ得る。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター会合組成物は溶液中で何らかの特定の構造に限定されない。例えばそれらは、ミセルとして、又は「崩壊した」構造を伴い、二層構造中に存在し得る。これらはまた単純に、おそらくサイズ又は形状が均一ではない凝集体を形成して、溶液中に分散され得る。脂質は、天然又は合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば脂質は、細胞質中に自然に生じる脂肪滴並びに長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどを含有する化合物のクラスを含む。使用に適切な脂質は市販の供給源から入手し得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はSigma, St.Louis, Mo. から入手し得；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はK & K Laboratories（Plainview, N.Y.）から入手し得；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はCalbiochem-Behringから入手し得；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質はAvanti Polar lipids, Inc，（Birmingham, Ala.）から入手し得る。
免疫エフェクター細胞
開示されるＣＡＲを発現するように改変される免疫エフェクター細胞（本明細書中で「ＣＡＲ－Ｔ細胞」とも呼ばれる）も開示される。これらの細胞は好ましくは処置しようとする対象から入手される（即ち自己）。しかし、いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞株又はドナーエフェクター細胞（同種）を使用する。免疫エフェクター細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む多くの供給源から得られ得る。免疫エフェクター細胞は、Ficoll（商標）分離など、当業者にとって公知の技術の何らかの多くの技術を使用して対象から回収される血液から得られ得る。例えば、個体の循環血からの細胞はアフェレーシスにより得られ得る。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、赤血球細胞を溶解させ、単球を枯渇させることにより、例えばPERCOLL（商標）勾配を通じた遠心分離によって、又は向流遠心溶出法によって、末梢血液リンパ球から単離される。免疫エフェクター細胞の特異的な亜集団は、陽性又は陰性選択技術によりさらに単離され得る。例えば、免疫エフェクター細胞は、陽性選択細胞に特有である表面マーカーに対する抗体の組み合わせを使用して、例えば所望の免疫エフェクター細胞の陽性選択に十分な時間にわたり抗体複合ビーズと温置することにより、単離され得る。或いは、陰性選択細胞に特有である表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて陰性選択によって免疫エフェクター細胞集団の濃縮を完遂し得る。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、感染性疾患及び外来物質から身体を防御することに関与する何らかの白血球を含む。例えば免疫エフェクター細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球又はそれらの何らかの組み合わせを含み得る。例えば免疫エフェクター細胞はＴリンパ球を含み得る。
Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、他のリンパ球、例えばＢ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）から区別され得る。これらは、胸腺で成熟するのでＴ細胞と呼ばれる（しかし一部は扁桃腺でも成熟する）。それぞれが別個の機能を有するＴ細胞のいくつかのサブセットがある。
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞及びメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟及び細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む免疫学的過程において他の白血球細胞を支援する。これらの細胞は、それらがその表面上でＣＤ４糖タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、それらが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチド抗原を提示されるとき活性化されるようになる。活性化されると、これらは急速に分裂し、能動的な免疫応答を調節するか又は助けるサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９又はＴＦＨを含むいくつかのサブタイプのうち１つに分化し得、免疫応答の異なるタイプを促進するために異なるサイトカインを分泌する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞又はＣＴＬ）は、ウイルス感染した細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞は、その表面でＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子と会合する抗原への結合によりそれらの標的を認識する。制御Ｔ細胞により分泌されるＩＬ－１０、アデノシン及び他の分子を通じて、アネルギー性の状態へとＣＤ８＋細胞が不活性化され得、これにより自己免疫疾患が阻止される。
記憶Ｔ細胞は、感染が回復した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。これらは、それらの同族抗原への再曝露時に、多数のエフェクターＴ細胞に素早く広がり、従って過去の感染に対する「記憶」を伴う免疫系を提供する。記憶細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋の何れかであり得る。記憶Ｔ細胞は一般的に、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
抑制Ｔ細胞としても以前は知られていた制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は免疫寛容の維持に重要である。それらの主要な役割は、免疫反応終了に向けてＴ細胞介在性免疫を遮断すること及び胸腺において陰性選択の過程を逃れた自己反応Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの大きなクラス－天然Ｔｒｅｇ細胞及び適応Ｔｒｅｇ細胞が記載されている。
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と混同しないこと）は、適応免疫系と自然免疫系とを橋渡しする。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する通常型のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞の混合物を含む。他の実施形態では、細胞表面発現に基づき１つ以上のサブセットに対してＴ細胞が濃縮される。例えば一部の例では、Ｔを含むは（T comprise are）細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はγδＴ細胞を含み、これは、α及びβ鎖の代わりに１本のγ鎖及び１本のδ鎖を有する別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つ。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ウイルス感染し、形質転換した細胞を死滅させ、自然免疫系の重要な細胞サブセットを構成し得るＣＤ５６＋ＣＤ３ー大顆粒リンパ球である（Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676）。細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は、以前の感作を必要とせずに腫瘍細胞に対する細胞傷害性を立ち上げ、ＭＨＣ－Ｉ陰性細胞も根絶し得る（Narni-Mancinelli E, et al. Int Immunol 2011 23:427-431）。ＮＫ細胞は、サイトカインストームの致死的となり得る合併症（Morgan RA, et al. Mol Ther 2010 18:843-851）、腫瘍崩壊症候群（Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365:725-733）及びオンターゲット、オフ腫瘍（off-tumor）効果を回避し得るので、より安全なエフェクター細胞である。
治療法
開示されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞など、アロ反応性ドナー細胞を抑制し、ＧＶＨＤを防ぐ。従って、ＧＶＨＤに対するリスクを有するあらゆる対象に開示されるＣＡＲを投与し得る。いくつかの実施形態では、対象は骨髄移植を受け、開示されるＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、ドナーＴ細胞又は樹状細胞のアロ反応性を抑制する。
開示されるＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、単独で、又は希釈剤と、及び／又はＩＬ－２、ＩＬ－１５若しくは他のサイトカイン又は細胞集団などの他の構成成分と組み合わせた医薬組成物としての何れかで投与され得る。
いくつかの実施形態では、開示されるＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、ＥＲストレス遮断と組み合わせて投与される（ＩＲＥ－１／ＸＢＰ－１経路（例えばＢ－Ｉ０９を標的とするための化合物）。いくつかの実施形態では、開示されるＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、ＪＡＫ２阻害剤、ＳＴＡＴ３阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤又は何らかのそれらの組み合わせと組み合わせて投与される。
簡潔に述べると、医薬組成物は、１つ以上の薬学的又は生理学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書中に記載のような標的細胞集団を含み得る。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；及び保存剤を含み得る。開示される方法での使用のための組成物は、いくつかの実施形態では、静脈内投与用に処方される。医薬組成物は、ＭＭの処置に適切なあらゆる方式で投与され得る。適切な投与量は臨床治験により決定され得るものの、投与の量及び頻度は、患者の状態及び患者の疾患の重症度のような因子により決定される。
「治療量」が指示される場合、投与しようとする本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、移植の及ぶ範囲及び患者（対象）の状態における個々の相違を考慮して医師により決定され得る。本明細書中に記載のＴ細胞を含む医薬組成物が細胞１０４～１０９個／ｋｇ体重、例えば細胞１０５～１０６個／ｋｇ体重（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の投与量で投与され得ると一般的に言われ得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般的に知られる点滴技術を使用することにより投与され得る（例えばRosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676,1988参照）。特定の患者に対する最適投与量及び処置計画は、疾患の徴候について患者を監視し、適切に処置を調整することによって、医療分野の当業者により容易に決定され得る。
ある一定の実施形態では、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、次に、続いて血液を再び採取し（又はアフェレーシスを行う）、開示される方法に従いそこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化し、増殖させたＴ細胞を患者に再点滴することが所望され得る。この過程を数週間ごとに複数回行い得る。ある一定の実施形態では、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化し得る。ある一定の実施形態では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ又は１００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化する。この複数回の採血／複数回の再点滴プロトコールを使用することは、Ｔ細胞のある一定の集団を選択するのに役立ち得る。
開示される組成物の投与は、注射、輸血又は移植によるものを含め、何らかの都合のよい方式で行われ得る。本明細書中に記載の組成物は、患者に、皮下、皮内、節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、又は腹腔内に投与され得る。いくつかの実施形態では、開示される組成物は、皮内又は皮下注射により患者に投与される。いくつかの実施形態では、開示される組成物はｉ．ｖ．注射により投与される。本組成物はまた移植部位に直接注射され得る。
ある一定の実施形態では、サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブ及びレナリドミドを含むが限定されないいくつもの適切な治療モダリティと組み合わせて（例えばその前、同時に又はその後）、開示されるＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞を患者に投与する。さらなる実施形態では、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩及びＦＫ５０６など、抗体又は他の免疫削摩剤、例えばＣＡＭ ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体若しくは他の抗体療法剤、サイトキシン（cytoxin）、フルダリビン（fludaribine）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン及び放射線照射と組み合わせてＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞を使用し得る。いくつかの実施形態では、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドの何れかを使用するＴ細胞除去療法、又はＯＫＴ３若しくはカムパス（ＣＡＭＰＡＴＨ）などの抗体と組み合わせて（例えば前、同時又は後）、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞を患者に投与する。別の実施形態では、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサン、などのＢ細胞除去療法後、本発明の細胞組成物を投与する。例えば、いくつかの実施形態では、対象は高用量化学療法とそれに続く末梢血液幹細胞移植での標準治療を受け得る。ある一定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖させた免疫細胞の点滴を受ける。さらなる実施形態では、手術の前又は後に増殖させた細胞を投与する。
「生物治療薬（living therapeutic）」の形態としてのＣＡＲ－Ｔ細胞に伴う大きな関心事は、インビボでのそれらの操作性及びそれらの免疫刺激性の副作用の可能性である。ＣＡＲ－Ｔ療法をより良好に制御し、不要な副作用を防ぐために、オフスイッチ、安全性機序及び条件付き制御機序を含め、様々な特性が改変されている。セルフデストラクト（self-destruct）及びマークト／タグド（marked/tagged）ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方は例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のクリアランスを促進する「オフスイッチ」を有するように改変される。セルフデストラクトＣＡＲ（self-destruct CAR）－Ｔは、ＣＡＲを含有するが、外因性分子の投与時に、アポトーシス促進性自殺遺伝子又は「排除遺伝子」誘導性を発現するようにも改変されている。ＨＳＶ－ＴＫ（ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ）、Ｆａｓ、ｉＣａｓｐ９（誘導性カスパーゼ９）、ＣＤ２０、ＭＹＣ ＴＡＧ及び短縮型ＥＧＦＲ（内皮増殖因子受容体）を含め、この目的のために様々な自殺遺伝子を使用し得る。ＨＳＫは、例えば、プロドラッグガンシクロビル（ＧＣＶ）を、それ自身複製ＤＮＡに組み込むＧＣＶ－三リン酸に変換し、最終的には細胞死につながる。ｉＣａｓｐ９は、低分子ＡＰ１９０３に結合するＦＫ５０６－結合タンパク質の構成要素を含有するキメラタンパク質であり、カスパーゼ９二量体化及びアポトーシスにつながる。しかしマークト／タグドＣＡＲ（marked/tagged CAR）－Ｔ細胞は、ＣＡＲを保持するが、選択マーカーを発現するようにも改変されているものである。この選択マーカーに対するｍＡｂの投与は、ＣＡＲ－Ｔ細胞のクリアランスを促進する。短縮型ＥＧＦＲは、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂによるこのような標的設定可能な抗原の１つであり、セツキシマブの投与は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の排除を促進するように働く。これらの特性を有するように作製されたＣＡＲは、「スイッチ可能ＣＡＲ（switchable CAR）」についてはｓＣＡＲ、「調節可能ＣＡＲ（regulatable CAR）」についてはＲＣＡＲとも呼ばれる。「阻害ＣＡＲ（inhibitory CAR）」（ｉＣＡＲ）としても知られる「セイフティーＣＡＲ（safety CAR）」は、２個の抗原結合ドメインを発現するように改変される。これらの細胞外ドメインのうち１つは、第１の抗原に対するものであり、細胞内同時刺激及び刺激ドメインに結合する。しかし第２の細胞外抗原結合ドメインは、正常な組織に特異的であり、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１又はＣＤ４５などの細胞内チェックポイントドメインに結合する。複数の細胞内阻害ドメインのｉＣＡＲへの組み込みも可能である。これらの阻害ドメインを提供し得るいくつかの阻害分子としては、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＣＤ１６０、ＰＩＨ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１．ＣＥＡＣＡＭ－３、及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１及びＴＧＦβ－Ｒが挙げられる。正常組織の存在下で、この第２の抗原結合ドメインの刺激は、ＣＡＲを阻害するために働く。注目すべきは、この二重抗原特異性により、ｉＣＡＲが二特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞の形態でもあるということである。セイフティーＣＡＲ（safety CAR）－Ｔ改変は、組織に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性を促進し、ある種の正常組織が、標準ＣＡＲでのオフターゲット効果につながる非常に低レベルの抗原を発現し得る状況において有利である（Morgan 2010）。コンディショナルＣＡＲ（conditional CAR）－Ｔ細胞は、細胞内同時刺激ドメイン及び個別の細胞内同時刺激物質に連結される細胞外抗原結合ドメインを発現する。外因性分子の投与時に、得られたタンパク質が細胞内に一緒に来て、ＣＡＲ回路を完成するように、同時刺激及び刺激ドメイン配列を改変する。このように、ＣＡＲ－Ｔ活性化が調整され得、おそらく「微調整」も行われ得るか、又は特定の患者に対して個別化され得る。デュアルＣＡＲ（dual CAR）設計と同様に、コンディショナルＣＡＲ（conditional CAR）において不活性である場合、刺激及び同時刺激ドメインが物理的に分離され；この理由のために、これらは「スプリットＣＡＲ（split CAR）」とも呼ばれる。
一般的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞はα－βＴ細胞を使用して作製されるが、γ－δＴ細胞も使用し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するために使用する、記載のＣＡＲコンストラクト、ドメイン及び改変された特性は、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、骨髄由来食細胞及びＮＫＴ細胞を含むＣＡＲ発現免疫細胞の他のタイプの作製において同様に使用し得る。或いはＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方の特性を有するように作製され得る。さらなる実施形態では、ＣＡＲでの形質導入は自己又は同種間であり得る。
レトロウイルス形質導入（γ－レトロウイルスを含む）、レンチウイルス形質導入、トランスポゾン／トランスポサーゼ（Sleeping Beauty及びPiggyBac系）及びメッセンジャーＲＮＡ転移介在遺伝子発現を含め、ＣＡＲ発現のためのいくつかの異なる方法を使用し得る。遺伝子編集（遺伝子挿入又は遺伝子欠失／破壊）は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の改変に対する可能性に関して同様に重要性が増してきている。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）及びＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）系は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が作製され得る３つの可能性のある方法である。
定義
「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸残基を表す略語、文字、字又は言葉の一覧を指す。本明細書中で使用される「アミノ酸略語」は、アミノ酸に対する従来の１文字コードであり、次のように表される：Ａ、アラニン；Ｂ、アスパラギン又はアスパラギン酸；Ｃ、システイン；Ｄ アスパラギン酸；Ｅ、グルタメート、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ ヒスチジン；Ｉ イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン；Ｚ、グルタミン又はグルタミン酸。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン、特異的な結合能を維持するその誘導体及び免疫グロブリン結合ドメインと相同又は殆ど相同である結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は、天然供給源由来であり得るか、又は部分的若しくは完全に合成により作製され得る。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトクラスの何れか：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含め、何らかの種由来の何らかの免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る。代表的な実施形態では、本明細書中に記載の方法及び組成物とともに使用される抗体は、ＩｇＧクラスの誘導体である。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、これらの免疫グロブリン分子の断片又はポリマー、及び標的抗原に選択的に結合する免疫グロブリン分子のヒト若しくはヒト化バージョンも含まれる。
「抗体断片」という用語は、全長未満の抗体の何らかの誘導体を指す。代表的な実施形態では、抗体断片は、全長抗体の特異的な結合能の少なくともかなりの部分を保持する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、Ｆｃ及びＦｄ断片が挙げられるが限定されない。抗体断片は、あらゆる手段により作製し得る。例えばインタクトな抗体の断片化により抗体断片を酵素的又は化学的に作製し得るか、部分的抗体配列をコードする遺伝子からこれを組み換えにより作製し得るか、又はこれを全体的に若しくは部分的に合成により作製し得る。抗体断片は、任意選択により１本鎖抗体断片であり得る。或いは、断片は、例えばジスルフィド結合により一緒に連結される複数の鎖を含み得る。断片は、任意選択により複数分子の複合体でもあり得る。機能的抗体断片は一般的に、少なくとも約５０個のアミノ酸、より一般的には少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。
「抗原結合部位」という用語は、抗原上のエピトープに特異的に結合する抗体の領域を指す。
「アプタマー」という用語は、特異的な標的分子に結合するオリゴ核酸又はペプチド分子を指す。これらの分子は一般にランダム配列プールから選択される。選択されるアプタマーは、特有の三次構造に適応し、高い親和性及び特異性で標的分子を認識可能である。「核酸アプタマー」は、その構造を介して標的分子に結合し、それによりこのような分子の機能を阻害又は抑制するＤＮＡ又はＲＮＡオリゴ核酸である。核酸アプタマーはＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組み合わせにより構成され得る。「ペプチドアプタマー」は、定常足場タンパク質内に可変ペプチド配列が挿入されたコンビナトリアルタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの同定は一般的に、ストリンジェントな酵母ジハイブリッド条件下で行われ、これにより、選択されるペプチドアプタマーが安定して発現され、細胞内の状況において正しく折り畳まれる可能性が高まる。
「担体」という用語は、化合物又は組成物と組み合わせる場合に、その意図する使用若しくは目的に対する、調製、保管、投与、送達、有効性、選択性又は化合物若しくは組成物の何らかの他の特性を助けるか又は促進する、化合物、組成物、物質又は構造を意味する。例えば、活性成分の何らかの分解を最小化するために、及び対象における何らかの有害な副作用を最小化するために、担体を選択し得る。
「キメラ分子」という用語は、それらのネイティブ状態で個別に存在する２つ以上の分子を連結することにより作製される単一分子を指す。単一のキメラ分子は、その構成分子の全ての所望の機能性を有する。キメラ分子の一タイプは融合タンパク質である。
「改変抗体」という用語は、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメイン由来の抗原結合部位を含む少なくとも１つの抗体断片を含む組み換え分子を指し、Ｉｇクラスの何れか（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＹ）からの抗体の可変及び／又は定常ドメインの全体又は一部を任意選択により含み得る。
「エピトープ」という用語は、抗体が優先的に及び特異的に結合する抗原の領域を指す。モノクローナル抗体は、分子的に定義され得る分子の単一の特異的なエピトープに優先的に結合する。本発明では、複数のエピトープが多特異性抗体により認識され得る。
「融合タンパク質」という用語は、１つのポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間で形成されるペプチド結合を通じた２つ以上のポリペプチドの連結により形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成的ペプチドの化学的カップリングにより形成され得るか、又はこれは、単一近接融合タンパク質をコードする核酸配列から単一ポリペプチドとして発現され得る。１本鎖融合タンパク質は、単一近接ポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。２つの遺伝子をインフレームで連結して単一の核酸にするために分子生物学における通常技術を使用し、次いで融合タンパク質が作製される条件下で適切な宿主細胞中で核酸を発現させて、融合タンパク質を調製し得る。
「Ｆａｂ断片」という用語は、Ｈ鎖間ジスルフィド結合に対してヒンジ領域Ｎ末端で切断し、１つの抗体分子から２個のＦａｂ断片を生成させる酵素パパインでの抗体の切断により生じる抗原結合部位を含む抗体の断片を指す。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、Ｈ鎖間ジスルフィド結合に対してヒンジ領域Ｃ末端で切断する酵素ペプシンでの抗体分子の切断により生じる２個の抗原結合部位を含有する抗体の断片を指す。
「Ｆｃ断片」という用語は、その重鎖の定常ドメインを含む抗体の断片を指す。
「Ｆｖ断片」という用語は、その重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む抗体の断片を指す。
「遺伝子コンストラクト」は、核酸、例えばポリペプチドに対する「コード配列」を含むか、又はそうでなければ生物学的に活性であるＲＮＡ（例えアンチセンス、デコイ、リボザイムなど）に転写可能である、ベクター、プラスミド、ウイルスゲノムなどを指し、細胞に、例えばある一定の実施形態では哺乳動物細胞に、遺伝子移入され得、このコンストラクトを遺伝子移入された細胞においてコード配列の発現を引き起こし得る。遺伝子コンストラクトは、コード配列、並びにイントロン配列、ポリアデニル化部位、複製起点、マーカー遺伝子などに操作可能に連結される１つ以上の制御エレメントを含み得る。
「同一性」という用語は、２つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的でアラインされ得る各配列において位置を比較することにより決定され得る。比較される配列中のある位置が同じ塩基により占有される場合、それらの分子はその位置で同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の度合いは、それらの核酸配列により共有される位置において同一であるか又は一致するヌクレオチドの数の関数である。ＧＣＧ配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として利用可能であり、例えば初期設定で使用され得るＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴを含め、２つの配列間の同一性を計算するために、様々なアライメントアルゴリズム及び／又はプログラムを使用し得る。例えば、本明細書中に記載の特異的なポリペプチドと少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一性を有する、及び好ましくは実質的に同じ機能を示すポリペプチド並びにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。別段の指示がない限り、類似性スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰを使用する場合、パーセント類似性はＢＬＡＳＴＰ positivesスコアに基づき、パーセント配列同一性はＢＬＡＳＴＰ identitiesスコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「Identities」は、同一である高いスコアを示す配列対における総残基の数及び割合を示し；ＢＬＡＳＴＰ「Positives」は、アライメントスコアが正の値を有し、互いに同様である残基の数及び割合を示す。これらの同一性又は類似性の度合い又は本明細書中で開示されるアミノ酸配列に対する類似性の同一性（identity of similarity）の何らかの中間的な度合いを有するアミノ酸配列が企図され、この開示により包含される。同様のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを使用して推定され、従来の手段により、特に遺伝コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することにより、得られ得る。
「リンカー」という用語は、当技術分野で認められており、２つのポリペプチドなどの２つの化合物を連結する分子又は分子群を指す。リンカーは、単一の連結分子から構成され得るか、又は具体的な距離により連結分子及び化合物を分離することが意図される、連結分子及びスペーサー分子を含み得る。
「多価抗体」という用語は、複数の抗原認識部位を含む抗体又は改変抗体を指す。例えば、「二価」抗体は２個の抗原認識部位を有し、一方で「四価」抗体は４個の抗原認識部位を有する。「一特異性」、「二特異性」、「三特異性」、「四特異性」などという用語は、（抗原認識部位の数とは対照的に）多価抗体に存在する異なる抗原認識部位特異性の数を指す。例えば、「一特異性」抗体の抗原認識部位は全て、同じエピトープに結合する。「二特異性」抗体は、第１のエピトープに結合する少なくとも１個の抗原認識部位及び第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合する少なくとも１個の抗原認識部位を有する。「多価一特異性」抗体は、全て同じエピトープに結合する複数の抗原認識部位を有する。「多価二特異性」抗体は、複数の抗原認識部位を有し、そのうち一部は第１のエピトープに結合し、そのうち一部は第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合する。
「核酸」という用語は、単一のヌクレオチド又は１個のヌクレオチドの３’末端で別のヌクレオチドの５’末端にリン酸基により連結される２個以上のヌクレオチドを含む天然若しくは合成分子を指す。核酸は長さにより制限されず、従って核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。
「操作可能に連結される」という用語は、別の核酸配列との核酸の機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳停止部位及び他のシグナル配列は、他の配列に操作可能に連結される核酸配列の例である。例えば、転写制御エレメントに対するＤＮＡの操作可能な結合とは、このようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し、それに結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的及び機能的関係を指す。
「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、あるアミノ酸のカルボキシル基により別のアミノ酸のアルファアミノ基に連結される２つ以上のアミノ酸を含む天然又は合成分子を指すために、交換可能に使用される。
「薬学的に許容可能な」という用語は、合理的な利益／リスク比と釣り合い、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答又は他の問題若しくは合併症なく、健全な医学的判断の範囲内で、人間及び動物の組織との接触での使用に適切である、これらの化合物、材料、組成物及び／又は剤型を指す。
「ポリペプチド断片」又は「断片」という用語は、特定のポリペプチドに関して使用される場合、参照ポリペプチドそれ自身と比較したとき、アミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が通常参照ポリペプチドと同一である、ポリペプチドを指す。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端若しくはカルボキシ末端又は或いは両方で起こり得る。断片は一般的に、少なくとも約５、６、８又は１０アミノ酸長、少なくとも約１４アミノ酸長、少なくとも約２０、３０、４０又は５０アミノ酸長、少なくとも約７５アミノ酸長又は少なくとも約１００、１５０、２００、３００、５００以上のアミノ酸長である。断片は、参照ポリペプチドの生物学的活性のうち１つ以上を保持し得る。様々な実施形態では、断片は、参照ポリペプチドの酵素活性及び／又は相互作用部位を含み得る。別の実施形態では、断片は免疫原性特性を有し得る。
「タンパク質ドメイン」という用語は、タンパク質の一部分、タンパク質のいくつかの部分又は構造完全性を示すタンパク質全体を指し；この決定は、タンパク質の一部分、タンパク質のいくつかの部分又はタンパク質全体のアミノ酸組成に基づき得る。
「１本鎖可変断片又はｓｃＦｖ」という用語は、重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインが連結されるＦｖ断片指す。１つ以上の抗原認識部位を有する抗体コンストラクトを形成させるために１つ以上のｓｃＦｖ断片が他の抗体断片（重鎖又は軽鎖の定常ドメインなど）に連結され得る。
「スペーサー」は、本明細書中で使用される場合、融合タンパク質を含むタンパク質を連結するペプチドを指す。一般にスペーサーは、タンパク質を連結するか又はそれらの間のいくつかの最小距離又は他の空間的関係を保存する以外に、特異的な生物学的活性はない。しかし、スペーサーの構成アミノ酸は、分子の折り畳み、正味電荷又は疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を与えるために選択され得る。
「特異的に結合」という用語は、本明細書中で使用される場合、ポリペプチド（抗体を含む）又は受容体に言及するとき、タンパク質及び他の生物製剤の不均一集団においてタンパク質又はポリペプチド又は受容体の存在の決定要因である結合反応を指す。従って、指定のリガンド又は抗体が、試料中に存在する他のタンパク質に又はそのリガンド若しくは抗体が生物中で接触し得る他のタンパク質に僅かな量しか結合しない場合、指定される条件（例えば抗体の場合の免疫アッセイ条件）下で、この指定のリガンド又は抗体は、その特定の「標的」に「特異的に結合」する（例えば抗体は内皮抗原に特異的に結合する）。一般に、第２の分子に「特異的に結合」する第１の分子は、その第２の分子と、約１０５Ｍー１（例えば１０６Ｍー１、１０７Ｍー１、１０８Ｍー１、１０９Ｍー１、１０１０Ｍー１、１０１１Ｍー１及び１０１２Ｍー１以上）よりも大きい親和性定数（Ｋａ）を有する。
「特異的に送達する」という用語は、本明細書中で使用される場合、ある分子と特定の標的分子又はマーカーを保有する細胞又は組織との優先的な会合を指し、その標的分子を欠く細胞又は組織を指さない。当然ではあるが、分子と非標的細胞又は組織との間の非特異的な相互作用が、ある一定の度合いで起こり得ることが認識される。それにもかかわらず、特異的な送達は、標的分子の特異的な認識を通じて媒介されるものとして区別され得る。一般的に、特異的な送達の結果、送達分子と標的分子を保有する細胞との間で、送達分子と標的分子を欠く細胞との間よりもはるかに強い会合が起こる。
「対象」という用語は、投与又は処置の標的である何らかの個体を指す。対象は脊椎動物、例えば哺乳動物であり得る。従って対象はヒト又は獣医学の患者であり得る。「患者」という用語は、臨床家、例えば医師の処置下の対象を指す。
「治療的有効」という用語は、疾患又は障害の１つ以上の原因又は症状を改善するために十分な量である組成物の使用量を指す。このような改善は、軽減又は変化のみを必要とし、必ずしも排除を必要としない。
「形質転換」、「遺伝子移入」という用語は、レシピエント細胞の染色体ＤＮＡへの核酸の導入を含む、レシピエント細胞への、核酸、例えば発現ベクターの導入を意味する。
「処置」という用語は、疾患、病的状態又は障害を、治癒させる、改善する、安定化させる、又は予防する目的での患者の医学的管理を指す。この用語は、能動的治療、即ち具体的には、疾患、病的状態又は障害の改善に対する処置を含み、また原因療法、即ち付随する疾患、病的状態又は障害の原因の除去に対する処置も含む。さらにこの用語は、対症治療、即ち疾患、病的状態又は障害の治癒ではなく症状の軽減のために計画される処置；予防的処置、即ち付随する疾患、病的状態又は障害の進行を最小限に抑える、又は部分的若しくは完全に阻害することを目的とする処置；及び支持療法、即ち付随する疾患、病的状態又は障害の改善を目的とする、追加の別の具体的治療に対して使用される処置を含む。
「変異体」という用語は、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換（即ち縮重変異体（degenerate variant））、アミノ酸、ペプチドのＣ末端に付加されるアミノ酸又は参照配列に対して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有するペプチドをコードする各コドン（即ちＤＮＡ及びＲＮＡ）のゆらぎ部位内での置換を有するアミノ酸又はペプチド配列を指す。
「ベクター」という用語は、ベクター配列が連結されている別の核酸を細胞に輸送可能な核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語は、細胞による発現に適切な形態で遺伝子コンストラクトを含有する何らかのベクター、（例えばプラスミド、コスミド又はファージ染色体）を含む（例えば転写制御エレメントに連結される）。
多くの本発明の実施形態を記載してきた。それでもなお、本発明の精神及び範囲からの逸脱なく様々な改変をなし得ることが理解されよう。従って、他の実施形態は次の特許請求の範囲内である。
実施例
実施例１：新規ヒトＣＤ８３キメラ抗原受容体Ｔ細胞は、ドナー抗腫瘍免疫を維持しながらＧＶＨＤを防ぐ
導入
同種ＨＣＴは、高リスク血液悪性腫瘍及び骨髄不全症候群に対して治癒目的で行われる手順である。世界中で年間３０，０００名の患者が同種ＨＣＴを受け、標準的な薬理学免疫抑制にもかかわらず、３４～８９％が急性ＧＶＨＤを発症する（Cutler C., et al., Blood 2014 124:1372-1377; Pidala J., et al., Haematologica 2012 97:1882-1889）。現行の方式は、ＧＶＨＤを防ぐために、メトトレキサート、シロリムス又はミコフェノール酸モフェチルと組み合わせて、広く抑制的なカルシニューリン阻害剤を使用するというものである。有益なＧＶＬの既知のオフターゲット障害及び限定的な寛容性誘導にもかかわらず（Zeiser R., et al., Blood 2006 108:390-399）、カルシニューリン阻害剤は、３０年超にわたりＧＶＨＤ予防及び処置に含まれてきた（Powles R.L., et al., Lancet 1978 2:1327-1331;Storb R., et al., Blood 1986 68:119-125; Storb R., et al., N Engl J Med 1986 314:729-735）。ドナー及び移植片供給源選択における進歩（Pidala J., et al., Blood 2014 124:2596-2606; Anasetti C., et al., N Engl J Med 2012 367:1487-1496）、レシピエント併存疾患評価（Sorror M.L., et al., Blood 2004 104:961-968; Thakar M., et al., Blood.2019 133(7):754-762）及び移植前処置が同種ＨＣＴの転帰を向上させた一方で（Solh M.M., et al., Biol Blood Marrow Transplant. 2018 Sep 19; Scott B.L., et al., J Clin Oncol 2017 35:1154-1161）、カルシニューリン阻害剤が、今日、広く認められるＧＶＨＤ予防の免疫抑制基盤であり続けていることは特筆すべきことである（Cutler C., et al., Blood 2014 124:1372-1377）。
カルシニューリン阻害剤を超えて、細胞に基づく免疫抑制がＧＶＨＤ予防において益々研究されている。一部で、Ｔｒｅｇなどの細胞に基づくストラテジーにより、アロ反応性Ｔ細胞の、強力であり、抗原特異的である可能性がある阻害がもたらされる（Veerapathran A., et al. Blood 2011 118:5671-5680; Veerapathran A., et al., Blood 2013 122:2251-2261）。ＧＶＨＤ予防においてＴｒｅｇを組み込む過去の臨床試験により、細胞介在性免疫抑制が、ＧＶＬを損なうことなく、ドナーＴ細胞に対して安全で有効な制御をもたらすことが証明されている（Brunstein C.G. et al., Blood 2011 117:1061-1070;Brunstein C.G., et al., Blood 2016 127:1044-1051;Kellner J.N., et al., Oncotarget 2018 9:35611-35622）。前臨床及び臨床エビデンスによっても、ＧＶＨＤを軽減し、ＧＶＬを保存するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞及び２型自然リンパ系細胞を含む、新規細胞生成物の橋渡し的な可能性が裏付けられている（Ruggeri L., et al., Science 2002 295:2097-2100; Olson J.A., et al., Blood 2010 115:4293-4301;Asai O., et al., J Clin Invest 1998 101:1835-1842;Du J., et al., Blood.2017 129(23):3121-3125;Highfill S.L., et al., Blood 2010 116:5738-5747;Bruce D.W., et al., J Clin Invest 2017 127:1813-1825）。最近、臨床設定においてＴｒｅｇ及びＮＫ細胞が広く研究されてきたにもかかわらず、これらの細胞生成物は、依然として殆ど試験中である。近年、ＣＡＲ Ｔ細胞は、治療抵抗性急性リンパ芽球性白血病及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において、比類のない活性を明らかにした（Neelapu S.S., et al., N Engl J Med 2017 377:2531-2544; Schuster S.J., et al., N Engl J Med 2019 380:45-56;Maude S.L., et al., N Engl J Med 2018 378:439-448）。従って、これらの高リスク血液悪性腫瘍におけるＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞に対してＦＤＡ適応（FDA indications）が認められた。これらのＣＡＲ Ｔ細胞が実際に細胞溶解性であり、決して免疫抑制的ではない一方で、これらは、ＧＶＨＤ病態形成の標的メディエーターにおけるＣＡＲ Ｔ細胞に対する潜在的な役割を強調する。さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ドナー由来生成物として同種ＨＣＴ後に投与される場合、ＧＶＨＤ誘発の可能性を低下させる点でユニークである（Ghosh A., et al., Nat Med 2017 23:242-249）。
ＣＤ８３は、炎症性樹状細胞並びにアロ反応性ドナーＴ細胞を排除するための臨床的に意義のある標的に相当する。ＣＤ８３は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質メンバーであり、活性化ヒト樹状細胞の表面上で発現される（Ju X., et al., J Immunol 2016 197:4613-4625）。ＣＤ８３は、アロ抗原による刺激後にヒトＴ細胞上でも発現され、ＧＶＨＤ患者の循環Ｔ細胞上に存在する（Ju X., et al., J Immunol 2016 197:4613-4625）。モノクローナル抗体でＣＤ８３を標的とすることにより、ＧＶＬ又は病原性ウイルスに対するＴ細胞応答を損なうことなく、マウスにおいて異種間ＧＶＨＤが軽減される（Wilson J., et al., J Exp Med 2009 206:387-398）。しかし、抗体による免疫抑制効果は一時的であり、ＮＫ細胞が介在する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に依存する（Wilson J., et al., J Exp Med 2009 206:387-398;Seldon T.A., et al., Leukemia 2016 30:692-700）。
ＣＤ８３の抗体標的化の限界を克服するために、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞を設計した。この実施例は、ＧＶＨＤ予防におけるヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の産生及び前臨床での有効性を記載する。モノクローナル抗体とは異なり、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、その標的を死滅させるためにＡＤＣＣを必要としない。さらに、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、１回の細胞注入後でさえも、ヒトＴ細胞介在性の異種間ＧＶＨＤモデルにおいて持続的にＧＶＨＤを予防する。一部、開示されるＣＡＲは、活性化Ｔｃｏｎｖ対ＴｒｅｇにおいてＣＤ８３の差次的発現を利用する。従って、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、病原性Ｔｈ１細胞を排除し、インビボでＴｒｅｇとＴｃｏｎｖとの比を顕著に上昇させる。さらに、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ドナーＴ細胞により強力な抗腫瘍免疫を可能にする。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＶＨＤ予防に対する新しい細胞に基づくアプローチに相当し、広く作用するカルシニューリン阻害剤を必要とせずに、耐久性があり選択的な免疫抑制をもたらす。
材料及び方法
試験計画。これは、ＧＶＨＤ予防のための新しいヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の、計画、作製及び有効性の前臨床試験である。この試験の第１の部分は、ＣＡＲコンストラクト並びに、表現型、サイトカイン産生、オンターゲットの死滅及びＣＤ８３＋標的に応答した増殖に関して、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ活性を記載する。次に、標準的なアロＭＬＲを使用した、インビトロでのＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の免疫抑制効果を明らかにする。さらに、ＣＤ８３発現は、Ｔｃｏｎｖ 対Ｔｒｅｇ細胞上でのＣＤ８３の異なる発現を示すヒトＴ細胞間での基準であった。ヒトＴ細胞が介在する異種間ＧＶＨＤモデル（Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci USA 2018 115:1582-1587; Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372); Betts B.C., et al., Front Immunol.2018 9:2887）において、ＧＶＨＤ予防におけるＣＤ８３ ＣＡＲの前臨床での有効性が実証される。これには、ＣＤ８３＋樹状細胞及びＴｃｏｎｖのインビボ標的死滅の徹底的な評価が含まれる。インビボでの様々なＴ細胞サブセットにおけるＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の効果も示される。最後に、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで、ヒト、腫瘍特異的ＣＤ８ ＣＴＬを生成させるために確立された異種間モデルを使用して、ドナー抗腫瘍免疫を温存することが示されており（Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci USA 2018 115:1582-1587; Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372); Betts B.C., et al., Front Immunol. 2018 9:2887）、xCELLigence RTCA（リアルタイム細胞分析）系を使用してＣＴＬによる死滅をインビトロで試験した（Li G., et al., JCI Insight. 2018 3(18)）。
ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞コンストラクト及び産生。［提供してください］
モノクローナル抗体及びフローサイトメトリー。蛍光色素結合マウス抗ヒトモノクローナル抗体には、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ１２７、ＭＨＣＩＩ、Ｆｏｘｐ３、Ｋｉ－６７、ＩＦＮγ、ＩＬ－１７Ａ及びＩＬ－４が含まれた（BD Biosciences, San Jose, CA. USA;eBioscience San Jose, CA. USA; Cell Signaling Technology, Boston, MA.USA）。生存能を判定するために、LIVE/DEAD Fixable Yellow or Aqua Dead Cell Stain（Life Technologies, Grand Island, NY）を使用した。BD FACSCanto IIフローサイトメーター上で生存事象を捕捉した（FlowJoソフトウェア，ver.7.6.4;TreeStar, Ashland, OR, USA）。
サイトカイン免疫アッセイ。ＣＤ８３ ＣＡＲ及びモック形質導入Ｔ細胞（１ｘ１０６個）をＣＤ８３＋ｍｏＤＣ（１ｘ１０５個）とともに２４時間にわたり同時培養した。上清を回収し、Ｅｌｌａ装置（ProteinSimple）上でSimple Plex Assay Kit（R&D Systems）を使用して分析した。製造者の説明書に従った（４７）。
ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ増殖。ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の正規化数（１又は２ｘ１０６個）を、三つ組みで非組織培養処理済み６ウェルプレートにおいてウェルあたり２ｘ１０５個のＣＤ８３＋ｍｏＤＣとともに同時培養した。６０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を補給したヒトＴ細胞完全培地中で細胞を増殖させ、２～３日ごとに又は培地が黄色になるたびに分割した。トリパンブルー染色により、細胞カウンター（Bio-Rad）上で各ウェル中の細胞生存能及び総細胞数を毎日又は２～４日ごとに測定した（第０日としてＴ単離）。
インビトロのアロＭＬＲ。記載のように、ヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）をサイトカインにより生成させ、分化させ、成熟させた（Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372)）。１０％熱不活性化したプールヒト血清を補給した１００μＬの完全ＲＰＭＩ中で、白血球濃縮物から精製した精製Ｔ細胞（１０５個）（OneBlood又はMemorial Blood Center）を同種ｍｏＤＣ（Ｔ細胞：ＤＣ比３０：１）とともに培養した。ＣＤ８３ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ又はモック形質導入Ｔ細胞（Ｔ細胞ドナーにとって自己）をＣＡＲ対ＤＣ比の範囲でアロＭＬＲに添加した。５日後、Ｋｉ－６７発現によりＴ細胞増殖を測定した。
ＣＤ８３発現の経時変化。同種ｍｏＤＣ（Ｔ細胞：ＤＣ比３０：１）又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔ細胞：ビーズ比３０：１）の何れかで精製ヒトＴ細胞を刺激した。培養４、８、２４及び４８時間の時点で９６ウェルプレート中の三つ組ウェルからＴ細胞を回収した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１２７、ＣＤ２５及びＣＤ８３に対してＴ細胞を染色し、次いで固定した。活性化Ｔｃｏｎｖ（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ２５＋）（３８）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１２７－、ＣＤ２５＋）（３８）及びＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４－）においてＣＤ８３発現を評価した。
異種間ＧＶＨＤモデル。Moffitt/USF vivariumで維持されたＩＡＣＵＣ承認コロニー内でＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウス（雄又は雌、６～２４週齢）を飼育した。移植第０日にレシピエントマウスに２５ｘ１０６個の新鮮ヒトＰＢＭＣ（OneBlood）を１回与えた。指定のように、マウスにＰＢＭＣ単独、ＰＢＭＣ＋ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞（低用量：１ｘ１０６個又は高用量：１０ｘ１０６個）又はＰＢＭＣ＋モック形質導入Ｔ細胞（１０ｘ１０６個）の何れかを与えた。異なるヒトＰＢＭＣドナーで各独立実験を行い、ＣＡＲ Ｔ細胞及びモック形質導入Ｔ細胞はＰＢＭＣドナー由来であった。ＧＶＨＤ臨床スコア及び前瀕死状態についてマウスを監視した。指定される場合には、ＧＶＨＤ標的臓器の病態（Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci USA 2018 115:1582-1587; Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372); Betts B.C., et al., Front Immunol. 2018 9:2887）、組織常在リンパ球及びマウス脾臓内のヒトＤＣ及びＴ細胞サブセットの内容を評価するために、人道的な安楽死を介して短期実験を第＋２１日に完了した。これらのマウスにＣＤ８３ ＣＡＲ（１ｘ１０６個）又はモック形質導入Ｔ細胞（１ｘ１０６個）とともに、又はそれらなしで、ＰＢＭＣ（２５ｘ１０６個）を移植した。全ての脊椎動物実験はＡＩＣＵＣ承認プロトコール下で行った。
ヒト抗腫瘍ＣＴＬのインビボ作製。ＮＳＧマウスに、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞（１ｘ１０６個）又はモック形質導入Ｔ細胞（１ｘ１０６個）とともに、又はこれらなしでヒトＰＢＭＣ（２５ｘ１０６個）を移植した。さらに、第０日及び＋７日にレシピエントマウスに照射済みＫ５６２細胞（１０７個／マウス）の接種を行った（Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci USA 2018 115:1582-1587; Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372); Betts B.C., et al., Front Immunol. 2018 9:2887）。第＋１２日にマウスを人道的に安楽死させ、脾臓を摘出し、磁気ビーズ分離によりヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。精製ヒトＣＤ８ Ｔ細胞を１０：１のＥ／Ｔ比で新鮮Ｋ５６２細胞とともに同時培養し、xCELLigence RTCA系を使用して、標的細胞の死滅を監視した（Li G., et al., JCI Insight. 2018 3(18)）。
統計学的分析。平均値±ＳＥＭとしてデータを報告する。多重比較のために補正を行い、ダネット又はシダック事後検定を含め、群比較のためにＡＮＯＶＡを使用した。生存曲線の比較の場合、ログランク検定を使用した。Prismソフトウェアバージョン5.04（GraphPad）を使用して統計学的分析を行った。Ｐ＜０．０５（両側）により統計学的有意性を定めた。
結果
ヒトＣＤ８３ ＣＡＲコンストラクトの模式図。抗ヒトＣＤ８３抗体、Ｃ３１２の１本鎖可変断片に基づき、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞を設計した（Wilson J., et al., J Exp Med 2009 206:387-398）。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞コンストラクトは４１ＢＢ同時刺激ドメイン及びＣＤ３ζ活性化ドメインを使用する。ＣＡＲ Ｔ細胞の追跡を容易にするために、コンストラクトは、正常な非ＣＡＲ Ｔ細胞の間でＣＡＲ Ｔ細胞を同定するために使用され得るｅＧＦＰタグを含有する。ＣＤ８３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞にレトロウイルスを用いて形質導入し、公開されるものと全く同じように作製した（図１）（Li G., et al. Methods Mol Biol 2017 1514:111-118）。
ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の特徴評価。ＣＤ８３ ＣＡＲコンストラクトは、高い形質導入効率を示し、Ｔ細胞の６０％超が産生後にｅＧＦＰを発現した（図２Ａ）。両群の間でＣＤ４発現が同様であった一方で、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の間でＣＤ８発現の有意な低下が観察された（図２Ｂ）。しかし、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、サイトカイン成熟ＣＤ８３＋ヒトｍｏＤＣと培養した場合、強固なＩＦＮγ産生を示した（図２Ｃ）。さらに、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＤ８３＋ｍｏＤＣの強力な殺傷効果及び、ＣＤ８３＋ｍｏＤＣと対照して増殖を示した（図２Ｄ、２Ｅ）。これらの実験における標的ｍｏＤＣは、Ｔ細胞と同種であり、従ってモック形質導入Ｔ細胞によるベースライン溶解及び増殖は、ベースラインアロ反応性に相当する（図２Ｄ、２Ｅ）。
ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞はアロ反応性を低下させる。ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔがインビトロでアロ反応性を低下させ得るか否かを試験するために、同種混合白血球反応（アロＭＬＲ）におけるそれらの抑制機能を調べた。健康なドナー、ヒトＴ細胞から、ＣＤ８３及びモック形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞はＢ細胞を標的とし、従ってアロＭＬＲにおける不適切な細胞タイプもさらなる対照として試験した。ＣＤ１９及びＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、４１ＢＢを介してそれら両方が同時刺激を受けるという点で同様であった。自己、非形質導入Ｔ細胞（１ｘ１０５個）及び同種サイトカイン成熟ＣＤ８３＋ｍｏＤＣ（３．３３ｘ１０３個）からなる５日アロＭＬＲにＣＡＲ Ｔ細胞を添加した。ＣＡＲ Ｔ細胞：ｍｏＤＣ比は３：１～１：１０の範囲であった。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔは、３：１～１：３の標的比でアロ反応性増殖を強力に低下させた（図３、上パネル）。モック形質導入及びＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、アロ反応性Ｔ細胞に対して抑制効果がなかった（図３、中及び下パネル）。さらに、ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞対照群は、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞によるアロ反応性Ｔ細胞の抑制がフラトリサイドに関連しなかったことを示す（図３、上及び下パネル）。
ＣＤ８３は、Ｔｒｅｇと比較して、活性化ヒトＴｃｏｎにおいて異なって発現される。ＣＤ８３は、ヒト樹状細胞成熟の確立されたマーカーであり、活性化ヒトＢ細胞上でも発現される。ＣＤ８３レポーターマウス系を使用して、ＣＤ８３のマウスＢ細胞発現が主に後期プレＢ細胞に限定されることが以前示された（Lechmann M., et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008 105:11887-11892）。さらに、ＣＤ８３はレポーターマウス由来のＴ細胞でも見られた（Lechmann M., et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008 105:11887-11892）。刺激後にヒトＴ細胞上でＣＤ８３が発現され、同種ＨＣＴ後に循環Ｔ細胞上で検出可能であることが知られている（Ju X., et al., J Immunol 2016 197:4613-4625）。しかし、Ｔｒｅｇ対ＴｃｏｎｖにおけるＣＤ８３の正確な発現は不明であった。本明細書中で開示されるように、ＣＤ８３のヒトＴ細胞発現は、同種樹状細胞又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを含め、刺激で起こる（図３Ａ～３Ｄ）。重要なこととして、ＣＤ８３は、ＤＣ－アロ活性化に応答する免疫抑制ＣＤ４＋と比較して、ヒトＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ上で異なって発現される（図３Ｃ）。ＣＤ８３のＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ発現はＤＣ－アロ刺激の４～８時間でピークになり、４８時間までにベースラインに低下し、Ｔｒｅｇ上で最小量で観察される（図３Ｃ）。ＣＤ８３の発現は、超生理的ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激によってより大量になり、活性化から４８時間までにＴｒｅｇ上でのＣＤ８３発現の遅れた増加も生じる（図３Ｄ）。報告によればマウスＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されるにもかかわらず（Ju X., et al., J Immunol 2016 197:4613-4625）、ＤＣ－アロ刺激又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化後、インビトロにおいてヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上で顕著な量のＣＤ８３は検出されなかった（図１１Ａ、１１Ｂ）。
ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は異種間ＧＶＨＤを防ぐ。インビボでのヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を評価するために、異種間ＧＶＨＤモデルを使用した。よく確立されたＮＳＧマウスモデルを使用し、２５ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣ＋１～１０ｘ１０６個の自己ＣＤ８３又はモック形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞の何れかを全て第０日にレシピエントに接種した。異種間ＧＶＨＤの臨床徴候について、移植を受けたマウスを第＋１００日まで毎日監視した。ＮＳＧマウスにおいてＣＤ８３及びモック形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞は安全であり、ＰＢＭＣ単独と比較して早期ＧＶＨＤ又は毒性の証拠は全くなかった（図５Ａ、５Ｂ）。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ単独又はモック形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、移植後、異種間ＧＶＨＤ生存を顕著に改善した（図５Ａ）。さらに、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞により異種間ＧＶＨＤ臨床重症度を低下させた（図５Ｂ）。注目すべきことに、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の両用量コホートのマウスは、９０％以上の３か月生存を実証した（図５Ａ）。個別の実験において、移植を受けたＮＳＧマウスにＰＢＭＣを単独で、又はモック形質導入Ｔ細胞（１ｘ１０６個）若しくはＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞（１ｘ１０６個）とともに与え、標的臓器ＧＶＨＤ重症度を評価するために第＋２１日に人道的に安楽死させた。盲検で病理学の専門家がＧＶＨＤスコアを判定した。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、基本的に、ＰＢＭＣ単独又はモック形質導入Ｔ細胞と比較して、レシピエント肺（図６Ａ、６Ｂ）及び肝臓（図６Ｃ、６Ｄ）においてヒトＴ細胞による標的臓器組織損傷を排除した。
ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで循環成熟、ＣＤ８３＋ＤＣを顕著に減少させる。成熟、ＣＤ８３＋樹状細胞は、アロ反応性ドナーＴ細胞の感作に関わる。そのようなものとして、発明者らは、移植を受けたマウスにおいて、ヒトＣＤ１ｃ＋ＤＣの免疫回復に対するＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の効果を究明した。ヒトＰＢＭＣ＋ＣＤ８３ ＣＡＲ又はモック形質導入Ｔ細胞を移植したＮＳＧマウスを第＋２１日に安楽死させた。レシピエント脾臓の摘出時に、この処置群で脾臓がはるかにより小さかったことにより示されるように、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞がインビボでドナー細胞の増殖を減少させたことが明らかであった（図７）。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、レシピエントマウスにおいてヒトＣＤ１ｃ＋、ＣＤ８３＋ＤＣの量を顕著に減少させた（図８Ａ、８Ｂ）。ＭＨＣクラスＩＩを発現するＣＤ１ｃ＋ＤＣの割合が実験群間で同様であった一方で、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞を移植したマウスは、全体で有意により少ないＤＣを示した（図８Ｃ、８Ｄ）。ｅＧＦＰタグを使用して、第＋２１日にマウス脾臓で注入したヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞が検出可能であったことが確認された（図８Ｅ）。
ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、病原性Ｔｈ１細胞を顕著に減少させ、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ比を上昇させる。第＋２１日に、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスの脾臓においてヒトＣＤ４＋の総量の有意な減少があった（図９Ａ、９Ｂ）。インビトロでのＤＣ－アロ刺激後にＣＤ８３＋、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖの相当量があったので、ＰＢＭＣ単独で、又はモック形質導入Ｔ細胞で処置したマウス間で、第＋２１日にＣＤ８３＋Ｔｃｏｎｖが増加したことが確認された（図９Ｃ）。さらに、インビボにおいてＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞のレシピエントでＣＤ８３＋Ｔｃｏｎｖの量が有意に減少した（図９Ｃ）。個別の実験において、ＮＳＧマウスにヒトＴ細胞単独又はＴ細胞＋樹状細胞を移植した。樹状細胞の欠損によりＧＶＨＤ発症が僅かに遅くなった一方で、中央値ＧＶＨＤ生存は両群間で同様であった。従って、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔは、主に、ＧＶＨＤに関連するアロ反応性Ｔｃｏｎｖを排除することによってレシピエントのＧＶＨＤを防ぐと推測された（図９Ｃ）。マウス脾臓でのヒトＴｒｅｇの頻度は、第＋２１日に全実験群間で同様であった（図９Ｄ）。総ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少と同様に、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスにおいて、Ｔｒｅｇの絶対数が有意に減少した（図９Ｄ、９Ｅ）。しかし、Ｔｒｅｇとアロ反応性Ｔｃｏｎｖとの比は、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞が投与されたマウスにおいて有意に上昇した（図９Ｆ）。Ｔｈ１細胞はＧＶＨＤ病態形成に寄与する。重要なこととして、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、ヒトＴｈ１細胞の大幅な減少を示した（図９Ｇ、９Ｈ）。さらに、脾臓常在ヒトＴｈ２細胞の量もＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞を注射したマウスにおいて顕著に減少した（図９Ｇ、９Ｉ）。逆に、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ単独又はモック形質導入ＣＡＲと比較して、マウス脾臓においてヒトＴｈ１７細胞の量を抑制しなかった。
ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の抗腫瘍活性を温存する。ＣＤ４＋Ｔ細胞のように、ＰＢＭＣ及びモック形質導入Ｔ細胞を注射したマウスと比較して、ＰＢＭＣ及びＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスにおいて、第＋２１日でのヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の総量も有意に減少した（図１０Ａ）。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞がどのようにドナー抗腫瘍免疫に影響を及ぼすかを試験するために、マウスにＰＢＭＣを、続いてモック形質導入Ｔ細胞又はＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞を注射することによって、Ｋ５６２に特異的なヒトＣＤ８ ＣＴＬをインビボで作製した。マウスは、第０及び＋１０日に照射済みＫ５６２の接種も受けた。対照にはＰＢＭＣを単独で与えた。第＋１２日にマウスを人道的に安楽死させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞をレシピエント脾臓から精製した。xCELLigenceプラットフォームを使用して、新鮮Ｋ５６２細胞に対する特異的な腫瘍溶解をインビトロで評価した。ＰＢＭＣを単独で移植した対照マウスと比較して、ヒトＰＢＭＣ及び照射済みＫ５６２細胞を注射した全マウスが、それらの脾臓から精製したＣＤ８ ＣＴＬによる完全な死滅を示した（図１０Ｂ）。興味深いことに、ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、ＰＢＭＣ単独又はモックＴ細胞で処置したマウスと比較して、優れたＣＤ８ ＣＴＬ介在性抗腫瘍活性を示した（図１０Ｂ）。
考察
ＧＶＨＤを防ぐための細胞性免疫療法としてのＣＡＲ Ｔ細胞の使用は、ドナーＴｒｅｇの薬理学的な免疫抑制又は養子移植とは異なる、画期的なストラテジーである。ＣＤ８３を発現する標的指向細胞は、移植レシピエントから炎症、成熟ＤＣ並びにアロ反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞を効果的に枯渇させる。機構的に、ドナー樹状細胞枯渇は個別の異種間実験においてＧＶＨＤを軽減しないので、アロ反応性Ｔｃｏｎｖのインビボ排除はこれらのＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を推進し得る。さらに、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ヒト細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性を損なわない。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスにおいてＣＤ８ Ｔ細胞が減少したにもかかわらず、これらのマウスからのＣＴＬは腫瘍殺傷の促進を示した。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞によるアロ反応性Ｔエフェクターのインビボ枯渇は、Ｔｒｅｇ：活性化Ｔｃｏｎｖ比の有意な上昇も仲介する。
ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、病原性のヒトＴｈ１及びＴｈ２細胞をインビボで顕著に減少させる。ＳＴＡＴ４及びＳＴＡＴ６ノックアウトドナーＴ細胞を使用した実験から、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞が独立にマウスにおいて致死的ＧＶＨＤを仲介することが示されている（Nikolic B., et al. J Clin Invest 2000 105:1289-1298）。さらに、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞の組み合わせはインビボで協同的にマウスＧＶＨＤを悪化させる（Nikolic B., et al. J Clin Invest 2000 105:1289-1298）。一部において、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞は、それぞれ腸及び肺に組織特異的な損傷を引き起こす（Yi T., et al., Blood 2009 114:3101-3112）。現在、ドナーＴｈ１応答を標的とするための新規ストラテジーが存在し、これは適切な下流受容体シグナル形質導入のｐ４０サイトカイン中和又は阻害により主に推進される（Pidala J., et al., Haematologica 2018 103:531-539; Fu J., et al., J Immunol 2016 196:3168-3179; Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci USA 2018 115:1582-1587; Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372); Betts B.C., et al., Front Immunol. 2018 9:2887）。しかし、ドナーＴｈ１及びＴｈ２細胞による発症応答を同時に標的とするアプローチは僅かしかない。逆に、Ｔｈ１及びＴｈ２分化に対する関連するシグナル伝達分子であるＪＡＫ２の観点で；その中和又は阻害は、Ｔｈ２細胞を顕著に上昇させる一方で、Ｔｈ１細胞の抑制をもたらす（Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci USA 2018 115:1582-1587）。従って、ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、同種ＨＣＴ後にドナーＴｈ１／Ｔｈ２応答を同時に抑制するための新規細胞製品に相当する。
開示されるデータから、ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞が、活性化Ｔｃｏｎｖ及びＧＶＨＤ死亡を持続的に防ぐことが裏付けられる。ＣＤ８３がヒトＴｒｅｇ上で顕著に発現されないにもかかわらず、ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、Ｔｒｅｇ量の減少を示した。これは、ｉＴｒｅｇ分化に対するＣＤ４＋Ｔ細胞前駆体の利用が限られていること又は循環ドナーＴ細胞の全体的な減少によりＩＬ－２濃度が低下していることによるものであり得る。げっ歯類において、ＣＤ８３は、インビボでＴｒｅｇ安定性に寄与し、ＣＤ８３－欠損Ｔｒｅｇを有するマウスは自己免疫症候群に罹患し易い（Doebbeler M., et al. JCI Insight. 2018 3(11)）。しかし、異種移植実験において、ヒトＴｒｅｇと活性化Ｔｃｏｎｖとの比は、対照と比較して、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスにおいて有意に上昇していた。ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖとの比の上昇は、臨床的に意義がある免疫指標であり、低用量ＩＬ－２などのＴｒｅｇ指向性ＧＶＨＤ療法に対する応答とさえも相関する（Koreth J., et al., Blood 2016 128:130-137）。さらに，ヒトＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は良好な耐容性を示し、インビボで免疫介在性臓器障害を排除した。従ってＣＤ８３の役割はマウス及びヒトＴｒｅｇ間で異なり得る。
興味深いことに、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞のレシピエントは、対照と比較して、その脾臓中で同様の量のヒトＴｈ１７細胞を有した。ＧＶＨＤ病態形成におけるＴｈ１７細胞の役割は、Ｔｈ１細胞と比較してあまり明らかになっていない。マウスにおいて、同種Ｔｈ１７細胞は、致死性ＧＶＨＤを誘導し得る。Ｔｈ１７細胞に対する決定的な転写因子であるドナーＴ細胞ＲＯＲγｔの欠損は増大するが、ＧＶＨＤを排除しない（Yu Y., et al., Blood 2011 118:5011-5020）。しかし、一部にはＴ細胞活性化を調節するセマフォリン６ｄ及び４ｂの減少により、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞により産生される場合、ＩＬ－１７ＡはＧＶＨＤにおいて防御的でもあり得る（Varelias A., et al., J Clin Invest 2018 128:1919-1936）。さらに、ＩＬ－１７は、炎症性大腸炎のマウスモデルにおいてＴｈ１応答を抑制することも示されている（O’Connor, Jr.W. et al., Nat Immunol 2009 10:603-609）。従ってＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞によるヒトＴｈ１７細胞の保存は、ＧＶＨＤ死亡率の全体的低下に関与し得る。
ＣＤ８３は類のない免疫調節分子である。マウスにおいて、可溶性ＣＤ８３は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－及びＴＧＦβ－機序を通じてＴｒｅｇ応答を促進することによって免疫抑制効果に介在する（Bock F., et al., J Immunol 2013 191:1965-1975）。ヒトＣＤ８３の細胞外ドメインはインビトロでアロ反応性Ｔ細胞増殖を弱めることも示された（Lechmann M., et al., J Exp Med 2001 194:1813-1821）。逆に、モノクローナル抗体、３Ｃ１２ＣによるＣＤ８３の直接的中和により、インビボでヒトＴ細胞が介在する異種間ＧＶＨＤが顕著に軽減される（Wilson J., et al., J Exp Med 2009 206:387-398）。ＣＤ８３抗体も、ドナー、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞によりＴｒｅｇ及び抗ウイルス応答を保った（Seldon T.A., et al., Leukemia 2016 30:692-700）。これは、可溶性ＣＤ８３が免疫抑制特性を有し得る一方で、ＣＤ８３の細胞表面発現を標的とすることにより、極めて重要なエフェクター及びＴｒｅｇ機能を保持しながらＧＶＨＤを防ぎ得ることを示唆する。開示されるＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、モノクローナル抗体、３Ｃ１２Ｃとは別である。２つのアプローチ間の最大の機能の違いは、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞がＮＫ細胞介在性の抗体依存性細胞傷害活性を必要とせずにその標的を死滅させることである（Seldon T.A., et al., Leukemia 2016 30:692-700）。これは、アロ反応性Ｔ細胞及び成熟ＤＣの迅速で効率的な排除がＧＶＨＤを防ぐために必要とされる場合に長所となる。さらに、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞による防御効果が、移植から３か月後に９０％を超える生存率をもたらしたが、一方でＣＤ８３モノクローナル抗体での公開データでは、防御効果がおよそ５０％の生存率で３０日までに限定される。
結論として、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＶＨＤを防ぐために設計される第１のプログラム化細胞溶解性エフェクター細胞に相当する。固体臓器及び血管柄付複合組織同種移植拒絶を防ぐことにおけるメリットを有することも予想されるにもかかわらず、ＧＶＨＤ予防におけるＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞の橋渡し能。ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、血液細胞及び固体臓器ドナー選択においてＨＬＡ格差の障壁を克服し得、必要とする患者への治療的移植手順の適用を大きく拡大する。重要なこととして、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、広く抑制性であり非選択的なカルシニューリン阻害剤又はグルココルチコイドを必要とせずにアロ反応性Ｔ細胞を排除するためのプラットフォームを提供する。従って、ＣＤ８３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、移植関連の死亡率を低下させ、同種ＨＣＴ後の転帰を改善する可能性が高くなる。
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、開示される発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で引用される刊行物及びそれらが引用される資料は参照により具体的に組み込まれる。
当業者は、本明細書中に記載の発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識するか、又は通常のものを超えない実験を使用して確認可能である。このような同等物は、次の特許請求の範囲により包含されるものとする。

Claims (17)

  1. ＣＤ８３抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、同時刺激シグナル伝達領域と、を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、
    前記ＣＤ８３抗原結合ドメインが、ＣＤ８３に特異的に結合する抗体の１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（抗ＣＤ８３ｓｃＦｖ）であり、
    前記抗ＣＤ８３ｓｃＦｖが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインと、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと、を含み、前記ＶＨドメインのＣＤＲ１配列が、配列番号１のアミノ酸配列を含み；前記ＶＨドメインのＣＤＲ２配列が、配列番号２のアミノ酸配列を含み；前記ＶＨドメインのＣＤＲ３配列が、配列番号３のアミノ酸配列を含み；前記ＶＬのＣＤＲ１配列が、配列番号４のアミノ酸配列を含み；前記ＶＬドメインのＣＤＲ２配列が、配列番号５のアミノ酸配列を含み；前記ＶＬドメインのＣＤＲ３配列が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  2. 前記抗ＣＤ８３ｓｃＦｖのＶＨドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記抗ＣＤ８３ｓｃＦｖのＶＬドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. 前記抗ＣＤ８３ｓｃＦｖが、配列番号７１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 前記同時刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及び何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択される同時刺激分子の細胞質ドメインを含む、請求項１～４の何れか１項に記載のポリペプチド。
  6. 前記ＣＡＲポリペプチドが、式：
    ＳＰ－ＣＤ８３－ＨＧ－ＴＭ－ＣＳＲ－ＩＳＤ；又は
    ＳＰ－ＣＤ８３－ＨＧ－ＴＭ－ＩＳＤ－ＣＳＲ
    により定義され、
    式中、「ＳＰ」がシグナルペプチドを表し、
    式中、「ＣＤ８３」がＣＤ８３結合領域を表し、
    式中、「ＨＧ」が任意選択のヒンジドメインを表し、
    式中、「ＴＭ」が膜貫通ドメインを表し、
    式中、「ＣＳＲ」が同時刺激シグナル伝達領域を表し、
    式中、「ＩＳＤ」が細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
    式中、「－」が二価リンカーを表す、
    請求項１～５の何れか１項に記載のポリペプチド。
  7. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～６の何れか１項に記載のポリペプチド。
  8. 配列番号７１のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ８３ｓｃＦｖ、ＣＤ８の膜貫通ドメイン、４－１ＢＢの同時刺激シグナル伝達領域、及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  9. 請求項１～８の何れか１項に記載の組み換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
  10. 請求項９に記載の単離核酸を含む、ベクター。
  11. 請求項１０に記載のベクターを含む、細胞。
  12. αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、及び制御Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞。
  13. 前記ＣＡＲの抗原結合ドメインがＣＤ８３に結合するとき、アロ反応性ドナー細胞を抑制する、請求項１２に記載の細胞。
  14. 移植ドナー細胞を受けた対象においてアロ反応性ドナー細胞を抑制するための医薬組成物であって、請求項１～８の何れか１項に記載のＣＡＲポリペプチドを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む、医薬組成物。
  15. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御Ｔ細胞又はそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記移植ドナー細胞が、アロ反応性Ｔ細胞、樹状細胞又はそれらの組み合わせを含む骨髄細胞である、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記医薬組成物がチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され、前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体又はそれらの組み合わせを含む、請求項１４～１６の何れか１項に記載の医薬組成物。
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