KR20200130324A - Cd83-결합 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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에이치 리 모피트 캔서 센터 앤드 리서어치 인스티튜트 아이엔씨
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Abstract

공여자 세포를 받고 있는 대상체에서 이식편대숙주병(GVHD)을 예방하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 특히, 입양 세포 전달에서 사용되어, 동종반응성 공여자 세포를 억제할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드가 개시된다. 또한, 이들 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포가 개시된다. 따라서, 또한, 개시된 CAR을 발현하도록 조작된 개시된 면역 이펙터 세포의 입양 전달을 포함하는 이식 공여자 세포를 받고 있는 대상체에서 동종반응성 공여자 세포를 억제하는 방법이 개시된다.

Description

CD83-결합 키메라 항원 수용체
관련 출원에 관한 상호-참조
본 출원은 2018년 2월 23일자 출원된 미국 가출원 제62/634,435호 및 2018년 5월 30일자 출원된 출원 제62/677,783호의 이익을 주장하며, 이들은 그들 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 2019년 2월 21일자 생성된 파일명이 "320803-2200 Sequence Listing_ST25"인 ASCII.txt 파일로서 전자 형태로 제출된 서열 목록을 포함한다. 서열 목록의 내용은 그 전체가 본원에 포함된다.
동종이계 조혈 세포 이식(HCT)은 혈액학적 악성종양에 대한 유효한 치료법이지만, 그것은 급성 이식편대숙주병(GVHD)에 의해 제한된다. GVHD는, 공여자 T 세포가 숙주 세포 상의 유전적으로 정의된 단백질에 반응하는 경우에 발생하며, HCT와 관련된 높은 사망률에 대한 주요 원인이다. 수지상 세포(DC)는 GVHD를 야기하는 동종이계 T 세포 자극에서 주요한 역할을 수행한다. 공여자 DC는 이식 후에 동종항원의 간접적인 제시를 담당하는 일차 항원 제시 세포이며, 이러한 과정은 거의 이식 직후에 시작된다. GVHD를 제어하기 위한 현행의 면역억제 조치는 T 세포를 표적화하지만, 환자에서 이식-후 면역성을 손상시킨다.
동종반응성 세포, 예컨대 공여자 T 세포를 억제하기 위하여 입양 세포 전달에서 사용될 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드가 개시된다. 개시된 CAR 폴리펩타이드는 CD83-발현 세포에 결합할 수 있는 항-CD83 결합 작용제를 엑토도메인 내에 함유한다. 또한, 개시된 CAR 폴리펩타이드를 발현하도록 유전학적으로 변형된 면역 이펙터 세포가 개시된다.
항-CD83 결합 작용제는 일부 구현예에서, CD83에 특이적으로 결합하는 항체 단편이다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 CD83에 특이적으로 결합하는 항체의 Fab 또는 단일-쇄 가변 단편(scFv)일 수 있다. 항-CD83 결합 작용제는 일부 구현예에서, CD83에 특이적으로 결합하는 압타머이다. 예를 들어, 항-CD83 결합 작용제는 CD83에 결합하는 그의 능력에 기초하여 무작위 서열 풀(pool)로부터 선택되는 펩타이드 압타머일 수 있다. 항-CD83 결합 작용제는 또한, CD83의 천연 리간드 또는 CD83에 결합할 수 있는 그의 변이체 및/또는 단편일 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 갖는 가변 중쇄(VH) 도메인, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 갖는 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, VH 도메인의 CDR1 서열은 아미노산 서열 GFSITTGGYWWT(SEQ ID NO:1), SDGIS(SEQ ID NO:7) 또는 SNAMI(SEQ ID NO:13)를 포함하며; VH 도메인의 CDR2 서열은 아미노산 서열 GYIFSSGNTNYNPSIKS(SEQ ID NO:2), IISSGGNTYYASWAKG(SEQ ID NO:8) 또는 AMDSNSRTYYATWAKG(SEQ ID NO:14)를 포함하며; VH 도메인의 CDR3 서열은 아미노산 서열 CARAYGKLGFDY(SEQ ID NO:3), VVGGTYSI(SEQ ID NO:9) 또는 GDGGSSDYTEM(SEQ ID NO:15)을 포함하며; VL의 CDR1 서열은 아미노산 서열 TLSSQHSTYTIG(SEQ ID NO:4), QSSQSVYNNDFLS(SEQ ID NO:10) 또는 QSSQSVYGNNELS(SEQ ID NO:16)를 포함하며; VL 도메인의 CDR2 서열은 아미노산 서열 VNSDGSHSKGD(SEQ ID NO:5), YASTLAS(SEQ ID NO:11) 또는 QASSLAS(SEQ ID NO:17)를 포함하며; VL 도메인의 CDR3 서열은 아미노산 서열 GSSDSSGYV(SEQ ID NO:6), TGTYGNSAWYEDA(SEQ ID NO:12) 또는 LGEYSISADNH(SEQ ID NO:18)를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, VH 도메인의 CDR1 서열은 아미노산 서열 GFSITTGGYWWT(SEQ ID NO:1)를 포함하며, VH 도메인의 CDR2 서열은 아미노산 서열 GYIFSSGNTNYNPSIKS(SEQ ID NO:2)를 포함하며, VH 도메인의 CDR3 서열은 아미노산 서열 CARAYGKLGFDY(SEQ ID NO:3)를 포함하며, VL의 CDR1 서열은 아미노산 서열 TLSSQHSTYTIG(SEQ ID NO:4)를 포함하며, VL 도메인의 CDR2 서열은 아미노산 서열 VNSDGSHSKGD(SEQ ID NO:5)를 포함하며, VL 도메인의 CDR3 서열은 아미노산 서열 GSSDSSGYV(SEQ ID NO:6)를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, VH 도메인의 CDR1 서열은 아미노산 서열 SDGIS(SEQ ID NO:7)를 포함하며, VH 도메인의 CDR2 서열은 아미노산 서열 IISSGGNTYYASWAKG(SEQ ID NO:8)를 포함하며, VH 도메인의 CDR3 서열은 아미노산 서열 VVGGTYSI(SEQ ID NO:9)를 포함하며, VL의 CDR1 서열은 아미노산 서열 QSSQS VYNNDFLS(SEQ ID NO:10)를 포함하며, VL 도메인의 CDR2 서열은 아미노산 서열 YASTLAS(SEQ ID NO:11)를 포함하며, VL 도메인의 CDR3 서열은 아미노산 서열 TGTYGNSAWYEDA(SEQ ID NO:12)를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, VH 도메인의 CDR1 서열은 아미노산 서열 SNAMI(SEQ ID NO:13)를 포함하며, VH 도메인의 CDR2 서열은 아미노산 서열 AMDSNSRTYYATWAKG(SEQ ID NO:14)를 포함하며, VH 도메인의 CDR3 서열은 아미노산 서열 GDGGSSDYTEM(SEQ ID NO:15)을 포함하며, VL의 CDR1 서열은 아미노산 서열 QSSQSVYGNNELS(SEQ ID NO:16)를 포함하며, VL 도메인의 CDR2 서열은 아미노산 서열 QASSLAS(SEQ ID NO:17)를 포함하며, VL 도메인의 CDR3 서열은 아미노산 서열 LGEYSISADNH(SEQ ID NO:18)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 아미노산 서열: QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITTGGYWWTWIRQFPGQKLEWMGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:19, VH-GBM00)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: QPVLTQSPSASASLGNSVKITCTLSSQHSTYTIGWYQQHPDKAPKYVMYVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAHRYLSISNIQPEDEADYFCGSSDSSGYVFGSGTQLTVL(SEQ ID NO:20, VL-GBM00)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 아미노산 서열: METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNNAINWVRQAPGKGLEWIGYIWSGGLTYYANWAEGRFTISKTSTTVDLKMTSPTIEDTATYFCARGINNSALWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:21, 20D04)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MDMRAPTQLLGLLLLWLPGARCADVVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASESISNYLSWYQQKPGQPPKLLIYRTSTLASGVSSRFKGSGSGTEYTLTISGVQCDDVATYYCQCTSGGKFISDGAAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(SEQ ID NO:22, 20D04)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 아미노산 서열: METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFTISDYDLSWVRQAPGEGLKYIGFIAIDGNPYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITAPTTEDTATYFCARGAGDLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:23, 11G05)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MDTREPTQLLGLLLLWLPGARCADVVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQSSKNVYNNNWLSWFQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCAGDYSSSSDNGFGGGTEVVVKGDPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(SEQ ID NO:24, 11G05)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 아미노산 서열: METGLRWLLLVAVLKGVHCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSRSSYDMSWVRQAPGKGLEWVGVISTAYNSHYASWAKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGGSWLDLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:25, 14C12)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MDXRAPTQLLGLLLLWLPGARCALVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQSSQSVYDNDELSWYQQKPGQPPKLLIYALASKLASGVPSRFKGSGSGTQFALTISGVQCDDAATYYCQATHYSSDWYLTFGGGTEVVVKGFPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGTENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(SEQ ID NO:26, 14C12)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 아미노산 서열: METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYDMTWVRQAPGKGLEWIGIIYASGTTYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKVTSPTIGDTATYFCAREGAGVSMTLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:27, 020B08)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MDMRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISTYLDWYQQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCQQGYTHSNVDNVFGGGTEVVVKGDPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(SEQ ID NO:28, 020B08)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 아미노산 서열: METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVSPGTPLTLTCTASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLEYIGIISSSGSTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLEVTSLTTEDTATYFCSREHAGYSGDTGHLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVGIGPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:29, 006G05)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MDMRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVAIKCQASQSVSSYLAWYQQKPGQPPKPLIYEASMLAAGVSSRFKGSGSGTDFTLTISDLECDDAATYYCQQGYSISDIDNAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(SEQ ID NO:30, 006G05)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 아미노산 서열: METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSDGISWVRQAPGKGLEWIGIISSGGNTYYASWAKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARVVGGTYSIWGQGTLVTVSSASTKGPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:31, 96G08)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTASPVSAPVGGTVTINCQSSQSVYNNDFLSWYQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCTGTYGNSAWYEDAFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSAELATGTATIVCVANKYFPDGTVTWKVDGITQSSGINNSRTPQNSADCTYNLSSTLTLSSDEYNSHDEYTCQVAQDSGSPVVQSFSRKSC(SEQ ID NO:32, 96G08)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 아미노산 서열: METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSNAMIWVRQAPREGLEWIGAMDSNSRTYYATWAKGRFTISRTSSITVDLKITSPTTEDTATYFCARGDGGSSDYTEMWGPGTLVTVSSASTKGPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:33, 95F04)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQAVVTQTTSPVSAPVGGTVTINCQSSQSVYGNNELSWYQQKPGQPPKLLIYQASSLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGEYSISADNHFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSAELATGTATIVCVANKYFPDGTVTWKVDGITQSSGINNSRTPQNSADCTYNLSSTLTLSSDEYNSHDEYTCQVAQDSGSPVVQSFSRKSC(SEQ ID NO:34, 95F04)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 아미노산 서열: QVQLVQSGGAVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAAVSYDGSNKYYADFVKGRFTISRDNPKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCARRGGLDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCAAA(SEQ ID NO:35)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: LTQPPPASGTPGQQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYYGNDQRPSGVPDRFSASKSGTSASLAISGLQSEDEAHYYCAAWDGSLNGGVIFGGGTKVTLG(SEQ ID NO:36)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: VTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGTNPVNWYQQLPGTAPKLLIYTTDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSGLYVFGTGTKVTVLG(SEQ ID NO:37)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MTHTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLYWYLQRPGQSPQPLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVQAEDVGVYYCMQSLQLWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:38)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLIHSDGNTYLDWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDIGVYYCMQATHWPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:39)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVDSAGNTFLHWFHQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:40)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: LTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLVDSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:41)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNMYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQATQPTWTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:42)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSATYYCQQTYQGTKLEIKR(SEQ ID NO:43)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MTQSPSSLSASVGHPVTITCRASQSLISYLNWYHQKPGKAPKLLIYAASILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPENFASYYCQHTDSFPRTFGHGTKVEIKR(SEQ ID NO:44)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: LTQPPSASGTPGQGVTISCRGSTSNIGNNVVNWYQHVPGSAPKLLIWSNIQRPSGIPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDQAVYYCAVWDDGLAGWVFGGGTTVTVLS(SEQ ID NO:45)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: MTQAPVVSVALEQTVRITCQGDSLAIYYDFWYQHKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPHRFSGSSSNTDSLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWVFGGGTNLTVLG(SEQ ID NO:46)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 아미노산 서열: LTQSPLSLPVTLGQPASISCKSNQSLVHSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDVGVYYCMQGTQWPRTFGGQGTKLDIKR(SEQ ID NO:47)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 인간화되며, 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:48, VH-GBM01)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 인간화되며, 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQHPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSLVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:49, VH-GBM02)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 인간화되며, 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50, VH-GBM03)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 인간화되며, 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:51, VH-GBM04)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 인간화되며, 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:52, VH-GBM05)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VH 도메인은 인간화되며, 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:53, VH-GBM06)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 인간화되며, 아미노산 서열: QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHSTYTIGWHQQQPEKGPRYLMKVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:54, VL-GBM01)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv VL 도메인은 인간화되며, 아미노산 서열: LPVLTQPPSASALLGASIKLTCTLSSQHSTYTIGWYQQRPGRSPQYIMKVNSDGSHSKGDGIPDRFMGSSSGADRYLTFSNLQSDDEAEYHCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:55, VL-GBM02)을 포함한다.
중쇄 및 경쇄는 바람직하게는 링커에 의해 분리된다. scFv 항체에 적합한 링커는 해당 분야에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QPVLTQSPSASASLGNSVKITCTLSSQHSTYTIGWYQQHPDKAPKYVMYVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAHRYLSISNIQPEDEADYFCGSSDSSGYVFGSGTQLTVLRAAASSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSPSASASLGNSVKITCTLSSQHSTYTIGWYQQHPDKAPKYVMYVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAHRYLSISNIQPEDEADYFCGSSDSSGYVFGSGTQLTVLRAAA(SEQ ID NO:57)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITTGGYWWTWIRQFPGQKLEWMGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITTGGYWWTWIRQFPGQKLEWMGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTV(SEQ ID NO:58)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHSTYTIGWHQQQPEKGPRYLMKVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:59)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQHPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSLVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHSTYTIGWHQQQPEKGPRYLMKVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:60을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHSTYTIGWHQQQPEKGPRYLMKVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:61)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHSTYTIGWHQQQPEKGPRYLMKVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:62)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHSTYTIGWHQQQPEKGPRYLMKVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:63)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSQHSTYTIGWHQQQPEKGPRYLMKVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:64)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLPVLTQPPSASALLGASIKLTCTLSSQHSTYTIGWYQQRPGRSPQYIMKVNSDGSHSKGDGIPDRFMGSSSGADRYLTFSNLQSDDEAEYHCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:65)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQHPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSLVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLPVLTQPPSASALLGASIKLTCTLSSQHSTYTIGWYQQRPGRSPQYIMKVNSDGSHSKGDGIPDRFMGSSSGADRYLTFSNLQSDDEAEYHCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:66)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLPVLTQPPSASALLGASIKLTCTLSSQHSTYTIGWYQQRPGRSPQYIMKVNSDGSHSKGDGIPDRFMGSSSGADRYLTFSNLQSDDEAEYHCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:67)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLPVLTQPPSASALLGASIKLTCTLSSQHSTYTIGWYQQRPGRSPQYIMKVNSDGSHSKGDGIPDRFMGSSSGADRYLTFSNLQSDDEAEYHCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:68)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLPVLTQPPSASALLGASIKLTCTLSSQHSTYTIGWYQQRPGRSPQYIMKVNSDGSHSKGDGIPDRFMGSSSGADRYLTFSNLQSDDEAEYHCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:69)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSITTGGYWWTWIRQPPGKGLEWIGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLPVLTQPPSASALLGASIKLTCTLSSQHSTYTIGWYQQRPGRSPQYIMKVNSDGSHSKGDGIPDRFMGSSSGADRYLTFSNLQSDDEAEYHCGSSDSSGYVFGSGTKVTVL(SEQ ID NO:70)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD83 scFv는 아미노산 서열: QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITTGGYWWTWIRQFPGQKLEWMGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSPSASASLGNSVKITCTLSSQHSTYTIGWYQQHPDKAPKYVMYVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAHRYLSISNIQPEDEADYFCGSSDSSGYVFGSGTQLTVL(SEQ ID NO:71)을 포함한다.
다른 CAR과 같이, 개시된 폴리펩타이드도 또한 막횡단 도메인 및 면역 이펙터 세포를 활성화시킬 수 있는 엔도도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어, 엔도도메인은 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 신호전달 영역을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타(CD3ζ) 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 그의 조합의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 공동자극 신호전달 영역은 하나 이상의 세포내 신호전달 및/또는 공동자극 분자의 1, 2, 3 또는 4개의 세포질 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 공동-자극 신호전달 영역은 신호전달을 향상시키는 CD28 및/또는 4-1BB의 세포질 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이를 함유한다.
일부 구현예에서, CAR 폴리펩타이드는 불완전한 엔도도메인을 함유한다. 예를 들어, CAR 폴리펩타이드는 세포내 신호전달 도메인을 단독으로 또는 공동-자극 도메인을 단독으로 함유하지만, 둘 모두를 함유하지는 않는다. 이들 구현예에서, CAR 폴리펩타이드, 및 소실 도메인을 함유하는 제2 CAR 폴리펩타이드(또는 내인성 T-세포 수용체) 둘 모두가 그들의 각각의 항원에 결합하지 않는 한, 면역 이펙터 세포는 활성화되지 않는다. 따라서, 일부 구현예에서, CAR 폴리펩타이드는 CD3 제타(CD3ζ) 신호전달 도메인을 함유하지만, 공동자극 신호전달 영역(CSR)을 함유하지 않는다. 다른 구현예에서, CAR 폴리펩타이드는 CD28, 4-1BB 또는 그의 조합의 세포질 도메인을 함유하지만, CD3 제타(CD3ζ) 신호전달 도메인(SD)을 함유하지 않는다.
또한, 개시된 CAR 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산 서열, 이들 단리된 핵산을 포함하는 벡터, 및 이들 벡터를 함유하는 세포가 개시된다. 예를 들어, 세포는 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, B 세포, 선천 림프계 세포(ILC), 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 림포카인 활성화된 살해(LAK) 세포 및 조절 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 이펙터 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인이 CD83에 결합하는 경우, 세포는 동종반응성 공여자 세포, 예컨대 T 세포를 억제한다.
또한, 개시된 CD83-특이적 CAR로 유전학적으로 변형된, 유효량의 면역 이펙터 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 GVHD의 예방 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 대상체는 조직 이식을 받고 있다. 일부 구현예에서, 조직 이식은 골수 이식을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직 이식은 얼굴 이식, 복벽 이식, 사지 이식, 상지 이식, 혈관분포(vascularized) 복합 동종이식편 또는 전체 조직 이식편을 포함하나 이들에 한정되지 않는 고형 기관 이식을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 자가면역 질환, 패혈증, 류마티스 질환, 당뇨병 및/또는 천식을 갖는다. 또한, 개시된 CD83-특이적 CAR로 유전학적으로 변형된, 유효량의 면역 이펙터 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 자가면역의 치료 방법이 개시된다. 또한, 개시된 CD83-특이적 CAR로 유전학적으로 변형된, 유효량의 면역 이펙터 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 고형 기관 동종이식편 및 기성품(off-the-shelf) CAR-T 세포에 대한 거부를 예방하는 방법이 개시된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 첨부 도면 및 이하 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 본원에 개시된 일 구현예에 따른 인간 CD83 CAR 구축물의 개략도이다. 항-CD83 단일 쇄 가변 단편은 CD8 힌지 및 막횡단 도메인, 및 41BB 공동-자극 도메인 및 CD3ζ 활성화 도메인으로 이어진다. CAR은 3' 말단에서 형광 리포터로 태깅된다. CAR 리포터 유전자는 SFG 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝된다.
도 2a 내지 도 2e는 인간 CD83 CAR T 세포의 특징화를 보여준다. 도 2a는 모의 형질도입된(eGFP 음성) 또는 CD83 CAR(eGFP 양성) T 세포에서의, 생성 후 eGFP 리포터를 발현하는 T 세포의 양(평균 ± SEM)을 보여주는 막대 그래프이다. 도 2b는 모의 형질도입된 또는 CD83 CAR T 세포에서의, CD4 또는 CD8 발현의 상대적인 양(평균 ± SEM)을 보여주는 막대 그래프이다, 시닥(Sidak) 검정. 도 2c는 CD83+ DC를 사용한 자극 후의 모의 형질도입된 또는 CD83 CAR T 세포에 의해 방출되는 IFNγ의 양을 보여준다. 도 2d는 실시간 세포 분석 시스템에서 측정된, CD83+ DC와 공동-배양된 CD83 CAR T 세포 또는 모의 형질도입된 T 세포의 세포독성을 보여준다. 데이터는 2벌 웰에 대한 시간에 따른 평균 정규화된 세포 지수로서 제시된다. 정규화된 세포 지수는 T 세포의 첨가 1일 후인 정규화된 시점에서 세포 지수로 나눈 주어진 시점에서의 세포 지수로서 계산된다. 2개 중 1개의 대표적인 실험이 나타나 있다, 던넷(Dunnett) 검정. 도 2e는 14일 기간에 걸쳐 주마다 계산된, CD83+ DC에 의해 자극된 CD83 CAR T 세포 또는 모의 형질도입된 T 세포에 대한 T 세포의 절대 개수를 보여준다. 2개 중 1개의 대표적인 실험이 나타나 있다, 시닥 검정. **P=0.001-0.01, ***P=0.0001-0.001 및 ****P<0.0001.
도 3은 인간 CD83 키메라 항원 수용체 T 세포가 동종반응성을 감소시키는 것을 보여준다. 인간 T 세포를 동종이계, 사이토카인 성숙, 단핵구-유래 수지상 세포(moDC)와 함께 1:30의 DC:T 세포 비(즉, 100,000개의 T 세포 대 3333개의 moDC)로 배양하였다. CD83 CAR T(배양된 T 세포에 대하여 자가)를 moDC에 특정 비로 첨가하였다(3:1 내지 1:10, 여기서, 첨가되는 가장 적은 CAR T의 양은 333개 세포였다). T 세포 증식을 제+5일에 Ki-67 발현에 의해 측정하였다. CAR T를 그들의 GFP의 발현에 의해 배제하였다(gated out). 대조군은 단독의 T 세포(즉, 증식 부재), 모의 형질도입된 T 세포 및 CD19 CAR T 세포를 포함하였다. 이들 모의 형질도입된 T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하지 않았지만, 형질도입된 CD83 세포와 동일한 방식으로 처리하였다. CD19 CAR T 세포는 41BB 공동-자극 도메인을 사용하였으며, 이러한 시스템에서 비관련 항원을 표적화하였다. 2개 중 1개의 대표적인 실험이 나타나 있다.
도 4a 내지 도 4d는 CD83이 조절 T 세포(Treg)에 비하여 인간 활성화된 종래의 CD4+ T 세포(Tcon) 상에서 차등적으로 발현되는 것을 보여준다. 인간 T 세포를 동종이계 moDC(DC:T 세포 비 1:30) 또는 CD3/CD28 비드(비드:T 세포 비 1:30)에 의해 자극하였다. 활성화된 Tcon(CD4+, CD127+, CD25+) 또는 Treg(CD4+, CD127-, CD25+, Foxp3+) 상의 CD83 발현을 기준선, 자극 후 제4시간, 제8시간, 제24시간 및 제48시간에 측정하였다. 도 4a 및 도 4b는 자극 후 다양한 시점에 Tcon(도 4a) 및 Treg(도 4b)에서의 CD83 발현을 보여주는 대표적인 등고선이다. 3개 중 1개의 대표적인 실험이 나타나 있다. 도 4c 및 도 4d는 동종이계 DC(도 4c) 또는 CD3/CD28 비드(도 4d) 자극 후의 CD83+ Tconv 또는 Treg의 양(평균 ± SEM)을 보여주는 막대 그래프이다. n=5개의 독립적인 실험, 시닥 검정. *P<0.05, **P=0.001-0.01, ***P=0.0001-0.001 및 ****P<0.0001.
도 5a 및 도 5b는 인간 CD83 CAR T 세포가 이종 GVHD를 예방하는 것을 보여준다. NSG 마우스에 25x106개의 인간 PBMC를 제공하였으며, 저용량(1x106개) 또는 고용량(10x106개)의 CD83 CAR 또는 모의 형질도입된 T 세포를 접종하였다. CAR은 PBMC 공여자에 대하여 자가였다. 추가의 마우스의 대조군에는 PBMC를 단독으로 제공하였다. 도 5a 및 도 5b는 생존(도 5a) 및 (b) GVHD 임상 점수(도 5b)를 보여준다. 임상 점수는 활동, 털 및 피부 상태, 체중 감소 및 자세의 합산 평가를 포함한다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 풀링된 데이터, 실험군마다 최대 9마리의 마우스. 로그-순위 검정. **P=0.001-0.01.
도 6a 내지 도 6d는 CD83 CAR T 세포가 인간 T 세포에 의한 GVHD 표적-기관 손상을 유의미하게 감소시키는 것을 보여준다. NSG 마우스에 25x106개의 인간 PBMC + 1x106개의 CD83 CAR 또는 모의 형질도입된 T 세포를 이식하였다. 대조군은 PBMC를 제공하지 않은 마우스(음성 대조군) 및 변형된 T 세포 없이 PBMC를 제공한 마우스(이차 양성 대조군)로 이루어진다. 수여자 마우스를 제+21일에 인도적으로 안락사시키고, 조직 GVHD 중증도를 숙련된, 맹검 병리학자가 평가하였다. 이종 GVHD 병리학 점수(도 6a, 도 6c) 및 대표적인 H&E 이미지(도 6b, 도 6d)가 수여자 폐(도 6a, 도 6b) 및 간(도 6c, 도 6d)에 대하여 나타나 있다. 2개의 독립적인 실험으로부터의 풀링된 데이터, 실험군마다 최대 6마리의 마우스. 던넷 검정. **P=.001-.01 및 ***P=0.0001-0.001.
도 7은 인간 CD83 CAR T 세포가 생체 내에서 공여자 세포 확장의 확장을 감소시키는 것을 보여준다. NSG 마우스에 25x106개의 인간 PBMC + 1x106개의 CD83 CAR 또는 모의 형질도입된 T 세포를 이식하였다. 대조군은 PBMC를 제공하지 않은 마우스(음성 대조군) 및 변형된 T 세포 없이 PBMC를 제공한 마우스(이차 양성 대조군)로 이루어진다. 수여자 마우스를 제+21일에 인도적으로 안락사시키고, 그들의 비장을 총체적인 평가 및 유세포분석 연구를 위하여 제거하였다. 대표적인 이미지는 PBMC 및 CD83 CAR T 세포를 제공한 마우스가 감소된 비장 크기를 나타낸 것을 보여주며, 이는 생체 내에서의 공여자 T 세포 확장의 억제를 뒷받침한다. 2개 중 1개의 대표적인 실험, 실험군마다 최대 6마리의 마우스.
도 8a 내지 도 8e는 인간 CD83 CAR T 세포가 생체 내에서 순환하는 성숙 CD83+ DC를 유의미하게 감소시키는 것을 보여준다. NSG 마우스에 25x106개의 인간 PBMC + 1x106개의 CD83 CAR 또는 모의 형질도입된 T 세포를 제공하였다. 도 8a는 제+21일에 마우스 비장 내의 인간 CD83+, CD1c+ DC의 빈도를 보여주는 대표적인 등고선을 포함한다. 도 8b＼는 제+21일에 마우스 비장 내의 인간 CD83+, CD1c+ DC의 절대 개수(평균 ± SEM)를 보여주는 막대 그래프이다, 던넷 검정. 도 8c는 제+21일에 수여자 비장 내의 MHC 분류 II+, CD1c+ DC의 백분율을 보여주는 대표적인 등고선을 포함한다. 도 8d는 이들 세포의 절대 개수(평균 ± SEM)를 도시한 막대 그래프이다, 던넷 검정. 도 8e는 모의 형질도입된 T 세포를 제공한 마우스에 비하여, 제+21일에 접종된 마우스에서의 eGFP+ CD83 CAR T 세포의 양을 보여주는 대표적인 등고선이다. 2개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터, 실험군마다 최대 6마리의 마우스. **P=.001-.01.
도 9a 내지 도 9i는 인간 CD83 CAR T 세포가 병원성 Th1 세포를 유의미하게 감소시키고, Treg:Tconv 비를 증가시키는 것을 보여준다. 기재된 바와 같이 NSG 마우스에 25x106개의 인간 PBMC + 1x106개의 CD83 CAR 또는 모의 형질도입된 T 세포를 제공하였다. 제+21일에, 마우스를 인도적으로 안락사시키고, 공여자, 인간 T 세포의 양을 계수하고, 특징화시켰다. 도 9a는 수여자 비장에서의 인간 CD4+ T 세포의 빈도를 보여주는 대표적인 등고선을 포함한다. 도 9b 및 도 9c는 제+21일에 마우스 비장 내의 CD4+(도 9b) 및 CD8+(도 9c) T 세포의 절대 개수(평균 ± SEM)를 보여주는 막대 그래프이다, 던넷 검정. 도 9d는 제+21일에 마우스 비장 내의 CD4+, CD127-, CD25+, Foxp3+ Treg의 백분율을 도시한 등고선을 포함한다. 도 9e 및 도 9f는 수여자 마우스에서 제+21일에 Treg(도 9e) 및 Treg:CD4+, CD25+ 동종반응성 Tconv(도 9f)의 양(평균 ± SEM)을 보여주는 막대 그래프이다, 던넷 검정. 도 9g는 제+21일에 마우스 비장 내의 CD4+, IFNγ+ Th1 세포 및 CD4+, IL-4+ Th2 세포의 빈도를 도시한 등고선을 포함한다. 도 9h 및 도 9i는 수여자 비장 내의 Th1(도 9h) 및 Th2(도 9i) 세포의 절대 개수(평균 ± SEM)를 보여주는 막대 그래프이다, 던넷 검정. 2개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터, 실험군마다 최대 6마리의 마우스. *P<0.05, **P=0.001-0.01.
도 10: 인간 CD83 CAR T 세포는 CTL-매개의 항-종양 면역을 허용한다. 기재된 바와 같이 NSG 마우스에 25x106개의 인간 PBMC + 1x106개의 CD83 CAR 또는 모의 형질도입된 T 세포를 제공하였다. a) 제+21일에, 공여자, 인간 CD8+ T 세포의 양을 계수하였다, 던넷 검정. 2개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 데이터, 실험군마다 최대 6마리의 마우스. b) NSG 마우스에 30x106개의 인간 PBMC + 1x106개의 CD83 CAR 또는 모의 형질도입된 T 세포를 이식하였다. 조사된 K562 세포(107개)의 접종물을 제0일 및 제+7일에 제공하였다. 마우스를 제+12일에 인도적으로 안락사시키고, 인간 CD8 T 세포를 수여자 비장으로부터 정제하였다. 정제된 인간 CD8 T 세포를 신선한 K562 세포와 10:1의 E/T 비로 공동배양하고, 표적 세포 사멸을 xCELLigence RTCA 시스템을 사용하여 모니터링하였다, 던넷 검정. 2개 중 1개의 대표적인 실험이 나타나 있다. *P<.05, ***P=.0001-.001 및 ****P<.0001.
도 11a 및 도 11b는 동종이계 수지상 세포(도 11a) 또는 CD3/CD28 비드(도 11b)의 자극 후의 인간 CD8+ T 세포에서의 CD83 발현을 보여준다.
항원-제시 세포 상의 CD83을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본원에 개시된다. 또한, 이들 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포가 개시된다. 이들 CAR을 발현하는 CAR T 세포는 동종반응성 공여자 세포, 예컨대 T 세포를 억제할 수 있다. 따라서, 개시된 CD83-특이적 CAR을 발현하도록 조작된 개시된 면역 이펙터 세포의 입양 전달을 포함하는 대상체에서의 GVHD의 예방 방법도 또한 개시된다.
CD83-특이적 키메라 항원 수용체(CAR)
CAR은 일반적으로 림프구 활성화에 관여하는 막횡단 신호전달 모티프와 함께 모노클로널 항체(mAb)의 단일-쇄 가변 단편(scFv)으로부터의 항원 인식 도메인을 포함한다(문헌[Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45]). 동종반응성 공여자 세포를 억제하기 위하여 면역 이펙터 세포에서 발현될 수 있는 CD83-특이적 키메라 항원 수용체(CAR)가 본원에 개시된다.
개시된 CAR은 일반적으로 3개의 도메인: 엑토도메인, 막횡단 도메인 및 엔도도메인으로 구성된다. 엑토도메인은 CD83-결합 영역을 포함하고, 항원 인식을 담당한다. 또한 CAR이 글리코실화되고 면역 이펙터 세포의 세포막에 고정될 수 있도록 CAR은 신호 펩타이드(SP)를 선택적으로 함유한다. 막횡단 도메인(TD)은 그의 명칭이 시사하는 바와 같이, 엑토도메인을 엔도도메인에 연결하고 세포에 의해 발현될 때 세포막 내에 존재한다. 엔도도메인은 항원 인식 후에 활성화 신호를 면역 이펙터 세포에 전달하는 CAR의 비지니스 엔드(business end)이다. 예를 들어, 엔도도메인은 세포내 신호전달 도메인(ISD) 및 선택적으로 공동-자극 신호전달 영역(CSR)을 함유할 수 있다.
"신호전달 도메인(SD)"은 일반적으로 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM)가 인산화될 때 신호전달 캐스케이드를 활성화시키는 면역수용체 ITAM를 함유한다. 용어 "공동-자극 신호전달 영역(CSR)"은 T-세포 수용체에 의한 T-세포 활성화를 향상시킬 수 있는 공동자극 단백질 수용체, 예컨대 CD28, 41BB 및 ICOS로부터의 세포내 신호전달 도메인을 지칭한다.
일부 구현예에서, 엔도도메인은 SD 또는 CSR을 함유하지만, 둘 모두를 함유하지는 않는다. 이들 구현예에서, 개시된 CAR을 함유하는 면역 이펙터 세포는 소실 도메인을 함유하는 또 다른 CAR(또는 T-세포 수용체)도 또한 그의 각각의 항원에 결합하는 경우에만 활성화된다.
일부 구현예에서, 개시된 CAR은 하기 식에 의해 정의된다:
SP-CD83-HG-TM-CSR-SD; 또는
SP-CD83-HG-TM-SD-CSR;
상기 식에서,
"SP"는 선택적인 신호 펩타이드를 나타내고,
"CD83"은 CD83-결합 영역을 나타내고,
"HG"는 선택적인 힌지 도메인을 나타내고,
"TM"은 막횡단 도메인을 나타내고,
"CSR"은 하나 이상의 공동-자극 신호전달 영역을 나타내고,
"SD"는 신호전달 도메인을 나타내고,
"-"는 펩타이드 결합 또는 링커를 나타낸다.
추가의 CAR 구축물은 예를 들어 문헌[Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81]에 기재되어 있으며, 이는 이들 CAR 모델의 교시를 위해 그의 전문이 참고로 포함된다.
예를 들어, CAR은 TRUCK, 유니버셜(Universal) CAR, 자가-유도(Self-driving) CAR, 아머드(Armored) CAR, 자가-파괴 CAR, 조건적 CAR, 마킹된(Marked) CAR, TenCAR, 듀얼(Dual) CAR 또는 sCAR일 수 있다.
면역억제에 대하여 내성이도록 조작된 CAR T 세포(아머드 CAR)는 면역 체크포인트 스위치 수용체와 함께, 다양한 면역 체크포인트 분자(예를 들어, 세포독성 T 림프구-연관된 항원 4(CTLA4) 또는 예정된 세포사 단백질 1(PD1))를 더 이상 발현하지 않도록 유전학적으로 변형될 수 있거나, 면역 체크포인트 신호전달을 차단하는 모노클로널 항체와 함께 투여될 수 있다.
자가-파괴 CAR은 CAR을 인코딩하기 위해 전기천공법에 의해 전달되는 RNA를 사용하여 설계될 수 있다. 대안적으로, T 세포의 유도 가능한 세포자멸사는 유전자-변형된 림프구에서 티미딘 키나제로의 강시클로비르(ganciclovir) 결합 또는 소분자 이량체화제에 의한 인간 카스파제 9의 보다 최근에 기재된 활성화 시스템에 기초하여 달성될 수 있다.
조건적 CAR T 세포는 디폴트로 비반응성이거나, 회로를 완성하기 위해 소분자가 첨가될 때까지 스위치 오프('off')되어, 신호 1 및 신호 2 둘 모두의 전체 전달을 가능하게 함으로써, CAR T 세포를 활성화시킨다. 대안적으로, T 세포는 표적 항원에 지향된 후속 투여되는 이차 항체에 대한 친화성을 갖는 어댑터-특이적 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다.
탠덤 CAR(TanCAR) T 세포는 세포내 공동-자극 도메인(들) 및 CD3ζ 도메인에 융합된 상이한 친화성을 갖는 2개의 연결된 단일-쇄 가변 단편(scFv)으로 구성된 단일의 CAR을 발현한다. TanCAR T 세포 활성화는 표적 세포가 둘 모두의 표적을 공동-발현하는 경우에만 달성된다.
이중 CAR T 세포는 상이한 리간드 결합 표적을 갖는 2개의 개별 CAR을 발현하고; 하나의 CAR은 CD3ζ 도메인을 단독으로 포함하고, 다른 CAR은 공동-자극 도메인(들)을 단독으로 포함한다. 이중 CAR T 세포 활성화는 둘 모두의 표적의 공동-발현을 필요로 한다.
안전성 CAR(sCAR)은 세포내 저해 도메인에 융합된 세포외 scFv로 구성된다. 표준 CAR을 공동-발현하는 sCAR T 세포는 표준 CAR 표적을 보유하지만 sCAR 표적이 결여된 표적 세포와 마주치는 때에만 활성화된다.
개시된 CAR의 항원 인식 도메인은 통상 scFv이다. 그러나 많은 대안이 존재한다. 고유 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 단일 쇄로부터의 항원 인식 도메인은 단순한 엑토도메인(예를 들어, HIV 감염된 세포를 인식하기 위한 CD4 엑토도메인) 및 더 많은 외래의 인식 성분, 예컨대 연결된 사이토카인(사이토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식을 야기함)을 갖는 것으로 기재되어 있다. 사실상, 주어진 표적과 높은 친화성으로 결합하는 거의 모든 것이 항원 인식 영역으로서 사용될 수 있다.
엔도도메인은 항원 인식 후에 신호를 면역 이펙터 세포에 전달하여 면역 이펙터 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나를 활성화시키는 CAR의 비지니스 엔드이다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 엔도도메인은 T 세포 수용체(TCR) 및 선택적인 공동-수용체의 "세포내 신호전달 도메인"을 포함할 수 있다. 통상적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 정도까지, 그러한 절단된 부분은 그것이 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다.
자극 방식으로 작용하는 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM)로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 세포질 신호전달 서열을 포함하는 ITAM의 예는 CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, CD32(Fc 감마 RIIa), DAP10, DAP12, CD79a, CD79b, FcγRIγ, FCγRIIIγ, FcεRIβ(FCERIB), 및 FcεRIγ(FCERIG)로부터 유래된 것들을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타(CD3ζ)(TCR 제타, GenBank 수탁 번호 BAG36664.1)로부터 유래된다. T-세포 수용체 T3 제타 쇄 또는 CD247(분화 클러스터 247)로도 알려진 T-세포 표면 당단백질 CD3 제타(CD3ζ) 쇄는 인간에서 CD247 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다.
제1 세대 CAR는 전형적으로 내인성 TCR로부터의 신호의 일차 전달자인 CD3ζ 쇄로부터의 세포내 도메인을 가졌다. 제2 세대 CAR는 다양한 공동자극 단백질 수용체(예를 들어, CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인을 CAR의 엔도도메인에 부가하여, 추가의 신호를 T 세포에 제공한다. 보다 최근에, 제3 세대 CAR는 효능을 추가로 증대시키기 위하여 다수의 신호전달 도메인을 조합한다. 이들 CAR이 이식된 T 세포는 공동자극 수용체/리간드 상호작용과 독립적인 개선된 확장, 활성화, 지속성 및 종양-제거 효율이 입증되었다(문헌[Imai C, et al. Leukemia 2004 18:676-84]; 문헌[Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002 20:70-5]).
예를 들어, CAR의 엔도도메인은 단독으로 또는 본 발명의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합되어, CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 쇄 부분 및 공동자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 그들의 리간드이다. 이러한 분자의 예에는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD123, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, BTNL3, 및 NKG2D와 특이적으로 결합하는 리간드가 포함된다. 따라서, CAR은 공동-자극 신호전달 요소로서 주로 CD28과 함께 예시되지만, 다른 공동자극 요소가 단독으로 또는 다른 공동-자극 신호전달 요소와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 힌지 서열을 포함한다. 힌지 서열은 항체 유연성을 촉진하는 짧은 아미노산 서열이다(예를 들어, 문헌[Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)] 참조). 힌지 서열은 항원 인식 모이어티(예를 들어, 항-CD83 scFv)와 막횡단 도메인 사이에 위치될 수 있다. 힌지 서열은 임의의 적합한 분자로부터 유래되거나 수득된 임의의 적합한 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 힌지 서열은 CD8a 분자 또는 CD28 분자로부터 유래된다.
막횡단 도메인은 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 막횡단 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8(예를 들어, CD8 알파, CD8 베타), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CD11a, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR 및 PAG/Cbp로부터 유래될 수 있다(즉, 적어도 그의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다). 대안적으로, 막횡단 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 그것은 주로 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 것이다. 일부 경우에, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항이 합성 막횡단 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 2 내지 10개의 아미노산 길이와 같은 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커는 CAR의 막횡단 도메인과 내질 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 하나 초과의 막횡단 도메인을 가지며, 이는 동일한 막횡단 도메인의 반복일 수 있거나, 상이한 막횡단 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 WO2015/039523호에 기재된 바와 같이, 다중-쇄 CAR이며, 이는 이 교시를 위해 참조로 포함된다. 다중-쇄 CAR은 상이한 막횡단 폴리펩타이드에서 개별 세포외 리간드 결합 및 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 신호전달 도메인은 막근접 위치에서 조립되도록 설계될 수 있으며, 이는 최적의 신호 전달을 부여하는 천연 수용체에 더 가까운 유연한 구조를 형성한다. 예를 들어, 다중-쇄 CAR은 FCERI 쇄가 자발적으로 함께 이량체화되어 CAR을 형성하도록 FCERI 알파 쇄의 일부 및 FCERI 베타 쇄의 일부를 포함할 수 있다.
하기 표 1, 2 및 3은 개시된 CAR에 존재할 수 있는 CD83-결합 영역, 공동-자극 신호전달 영역 및 세포내 신호전달 도메인의 일부 예시적인 조합을 제공한다.
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일부 구현예에서, 항-CD83 결합 작용제는 단일 쇄 가변 단편(scFv) 항체이다. 항-CD83 scFv의 친화성/특이성은 대부분 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)에서 상보성 결정 영역(CDR) 내의 특정 서열에 의해 유도된다. 각각의 VH 및 VL 서열은 3개의 CDR(CDR1, CDR2, CDR3)을 가질 것이다.
일부 구현예에서, 항-CD83 결합 작용제는 천연 항체, 예컨대 모노클로널 항체로부터 유래된다. 일부 경우에, 항체는 인간이다. 일부 경우에, 항체는 인간에게 투여될 때 그것이 덜 면역원성이 되도록 변경을 겪는다. 예를 들어, 변경은 가장 가까운 인간 생식계열 서열에 상응하는 프레임워크 아미노산의 키메라화, 인간화, CDR-그라프팅, 탈면역화 및 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기법을 포함한다.
또한, CD83 및 적어도 하나의 추가의 항원을 표적화하는 이중-특이적 CAR이 개시된다. 또한, 상이한 항원에 결합하는 또 다른 CAR과 연계하여서만 작용하도록 설계된 CAR이 개시된다. 예를 들어, 이들 구현예에서, 개시된 CAR의 엔도도메인은 신호전달 도메인(SD)을 단독으로 또는 공동-자극 신호전달 영역(CSR)을 단독으로 함유하지만, 둘 모두를 함유하지는 않는다. 제2 CAR(또는 내인성 T-세포)은 그것이 활성화된다면 소실 신호를 제공한다. 예를 들어, 개시된 CAR이 SD를 함유하지만 CSR을 함유하지 않는다면, 이 CAR을 함유하는 면역 이펙터 세포는 CSR을 함유하는 또 다른 CAR(또는 T-세포)이 그의 각각의 항원에 결합하는 때에만 활성화된다. 마찬가지로, 개시된 CAR이 CSR을 함유하지만 SD를 함유하지 않는다면, 이러한 CAR을 함유하는 면역 이펙터 세포는 SD를 함유하는 또 다른 CAR(또는 T-세포)이 그의 각각의 항원에 결합하는 경우에만 활성화된다.
핵산 및 벡터
또한 개시된 면역 이펙터 세포에서 CD83-특이적 CAR의 발현을 가능하게 하는 개시된 CD83-특이적 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 벡터가 개시된다.
개시된 CAR 및 그의 영역을 인코딩하는 핵산 서열은 당해 분야에서 알려진 재조합 방법을 사용하여, 예컨대, 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기법을 사용하여 이를 포함하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝되는 것보다는 합성에 의해 생성될 수 있다.
CAR을 인코딩하는 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 구축물을 발현 벡터 내로 혼입함으로써 달성된다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
개시된 핵산은 수많은 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 비제한적으로 포함하는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열분석 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)] 및 기타 바이러스 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 비제한적으로 포함한다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 원점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 벡터는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터이다.
포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 수많은 바이러스 기반의 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고, 해당 분야에 알려진 기법을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서 재조합 바이러스를 단리하여, 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달할 수 있다.
적합한 프로모터의 일 예는 즉시 초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 그에 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 구성성 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 연장 성장 인자-1a(EF-1a)이다. 그러나, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, MND(골수증식성 육종 바이러스) 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡슈타인-바 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 비제한적으로, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 비제한적으로 포함하는 다른 구성성 프로모터 서열도 또한 사용될 수 있다. 프로모터는 대안적으로 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 비제한적으로 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함한다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 수많은 프로모터가 시작 부위의 다운스트림에 기능성 요소를 함유하는 것이 최근에 밝혀졌지만, 이들은 전형적으로 시작 부위의 업스트림 30 내지 110 bp 영역에 위치한다. 프로모터 요소들 사이의 간격은 종종 유연하여, 요소들이 서로에 대해 반전되거나 이동될 때 프로모터 기능이 보존되게 한다.
CAR 폴리펩타이드 또는 그의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 트랜스펙션시키거나 감염시키고자 한 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하기 위해 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 선택 가능한 마커는 DNA의 개별 조각 상에 운반되어 공동-트랜스펙션 절차에 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열이 측접될 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 예를 들어 항생제-내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 트랜스펙션된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수여자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않으며, 그의 발현이 일부 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어, 효소적 활성에 의해 나타나는 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수여자 세포 내로 도입된 이후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있고, 공지된 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 발현 수준을 나타내는 최소 5' 측접 영역을 갖는 구축물은 프로모터로 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있고, 프로모터-유도된 전사를 조절하는 능력에 대하여 작용제를 평가하는데 사용될 수 있다.
유전자를 세포 내로 도입 및 발현시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당해 분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생성하는 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]을 참조한다.
관심 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세구체, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀(micelle), 혼합된 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포좀(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 또 다른 양태에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포좀의 수성 내측에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오타이드 둘 모두와 회합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀 내에 포획되거나, 리포좀과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중의 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유되거나 복합체화되거나, 또는 지질과 달리 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관된 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조에, 미셀로서 또는 "붕괴된"구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 용액 중에 단순히 산재되어, 아마도 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집물을 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데히드와 같은 장쇄 지방족 탄화수소 및 그들의 유도체를 함유하는 화합물 부류를 포함한다. 사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma)로부터 수득할 수 있으며; 디세틸 포스페이트("DCP")는 케이 앤드 케이 래보러터리즈(K & K Laboratories)(미국 뉴욕주 플레인뷰 소재)로부터 수득할 수 있으며; 콜레스테롤("Choi")은 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 수득할 수 있으며; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인코포레이티드(Avanti Polar Lipids, Inc)(미국 알라바마주 버밍엄 소재)로부터 수득할 수 있다.
면역 이펙터 세포
개시된 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(본원에서 "CAR-T 세포"로도 지칭됨)가 또한 개시된다. 이들 세포는 바람직하게는 치료될 대상체로부터 수득된다(즉, 자가이다). 그러나, 일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포주 또는 공여자 이펙터 세포(동종이계)가 사용된다. 면역 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. 면역 이펙터 세포는 숙련자에게 공지된 임의의 수의 기법, 예컨대 Ficoll™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집한 혈액으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출법에 의해 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 용리에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. 면역 이펙터 세포의 특이적 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 예를 들어, 원하는 면역 이펙터 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 항체-컨쥬게이트된 비드와 인큐베이션함으로써, 양성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 지향된 항체의 조합을 사용하여 단리될 수 있다. 대안적으로, 면역 이펙터 세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 지향된 항체의 조합을 사용하여 음성 선택에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 감염성 질환 및 외래 물질에 대하여 신체를 방어하는데 관여하는 임의의 백혈구를 포함한다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 림프구, 단핵구, 대식구, 수지상 세포, 비만 세포, 호중구, 호염기구, 호산구 또는 그들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 T 림프구를 포함할 수 있다.
T 세포 또는 T 림프구는 세포 표면 상의 T-세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 다른 림프구, 예컨대 B 세포 및 자연 살해 세포(NK 세포)와 구별될 수 있다. 그들은 흉선에서 성숙하기 때문에 T 세포라고 불린다(그러나 일부는 편도선에서도 성숙함). 각각 별개의 기능을 갖는 T 세포의 몇몇의 하위세트가 존재한다.
T 헬퍼 세포(TH 세포)는 원형질 세포 및 기억 B 세포로의 B 세포의 성숙, 및 세포독성 T 세포 및 대식구의 활성화를 포함하는 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 보조한다. 이들 세포는 그들이 그들의 표면 상에 CD4 당단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로도 알려져있다. 헬퍼 T 세포는 그들이 항원-제시 세포(APC)의 표면 상에서 발현되는 MHC 부류 II 분자에 의해 펩타이드 항원이 제시될 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 그들은 빠르게 분열하여 활동적인 면역 반응을 조절하거나 돕는 사이토카인이라고 불리는 작은 단백질을 분비한다. 이들 세포는 상이한 사이토카인을 분비하여 상이한 유형의 면역 반응을 촉진하는, TH1, TH2, TH3, TH17, TH9 또는 TFH를 포함하는 몇몇의 하위유형 중 하나로 분화될 수 있다.
세포독성 T 세포(Tc 세포 또는 CTL)는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에도 연루된다. 이들 세포는 그들이 그들의 표면에서 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로도 알려져 있다. 이들 세포는 모든 유핵 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 부류 I 분자와 회합된 항원에 결합함으로써 그들의 표적을 인식한다. IL-10, 아데노신 및 조절 T 세포에 의해 분비되는 다른 분자를 통해, CD8+ 세포는 무력(anergic) 상태로 불활성화되어, 자가면역 질환을 예방할 수 있다.
기억 T 세포는 감염이 해결된 후에 장기간 지속되는 항원-특이적 T 세포의 하위세트이다. 그들은 그들의 동족 항원으로의 재-노출 시에 다수의 이펙터 T 세포로 빠르게 확장하여, 이에 따라, 면역계에 과거 감염에 대한 "기억"을 제공한다. 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있다. 기억 T 세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO를 발현한다.
이전에 억제자 T 세포로 알려진 조절 T 세포(Treg 세포)는 면역학적 관용을 유지하는데 중요하다. 그들의 주요 역할은 면역 반응의 종료를 위해 T 세포-매개된 면역을 중단시키고, 흉선에서 음성 선택 과정을 벗어나는 자동-반응성 T 세포를 억제하는 것이다. CD4+ Treg 세포의 2가지 주요 부류, 즉 자연 발생 Treg 세포 및 적응 Treg 세포가 설명되었다.
자연 살해 T(NKT) 세포(자연 살해(NK) 세포와 혼동하지 않을 것)는 적응 면역계를 선천 면역계와 연결시킨다. 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시된 펩타이드 항원을 인식하는 종래의 T 세포와 달리, NKT 세포는 CD1d라 불리는 분자에 의해 제시된 당지질 항원을 인식한다.
일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ 세포의 혼합물을 포함한다. 다른 구현예에서, T 세포는 세포 표면 발현에 기초하여 하나 이상의 하위세트에 대해 농축된다. 예를 들어, 일부 경우에, T는 세포독성 CD8+ T 림프구이다. 일부 구현예에서, T 세포는 γδ T 세포를 포함하고, 이는 α 쇄 및 β 쇄 대신에 하나의 γ 쇄 및 하나의 δ 쇄을 갖는 별개의 T-세포 수용체(TCR)를 보유한다.
자연-살해(NK) 세포는 바이러스 감염 및 형질전환된 세포를 사멸시킬 수 있고 선천 면역계의 중요한 세포 하위세트를 구성할 수 있는 CD56+CD3- 큰 과립 림프구이다(문헌[Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676]). 세포독성 CD8+ T 림프구와 달리, NK 세포는 사전 감작에 대한 요건 없이 종양 세포에 대해 세포독성을 개시하고, 또한 MHC-I-음성 세포를 박멸할 수 있다(문헌[Narni-Mancinelli E, et al. Int Immunol 2011 23:427-431]). NK 세포는 그들이 사이토카인 폭풍(문헌[Morgan RA, et al. Mol Ther 2010 18:843-851]), 종양 용해 증후군(문헌[Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365:725-733]) 및 온-타겟, 오프-종양 효과의 잠재적으로 치명적인 합병증을 피할 수 있기 때문에 더 안전한 이펙터 세포이다.
치료 방법
개시된 CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포는 동종반응성 공여자 세포, 예컨대 T-세포를 억제하고, GVHD를 예방한다. 따라서, 개시된 CAR은 GVHD의 위험이 있는 임의의 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 골수 이식을 받으며, 개시된 CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 공여자 T-세포 또는 수지상 세포의 동종반응성을 억제한다.
개시된 CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2, IL-15, 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합하여 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 ER 스트레스 차단(IRE-1/XBP-1 경로를 표적화하기 위한 화합물(예를 들어, B-I09))과 병용하여 투여된다. 일부 구현예에서, 개시된 CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 JAK2 저해제, STAT3 저해제, 오로라(Aurora) 키나제 저해제, mTOR 저해제 또는 그들의 임의의 조합과 병용하여 투여된다.
간략하게, 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여, 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 포도당, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 개시된 방법에 사용하기 위한 조성물은 일부 구현예에서, 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 약제학적 조성물은 MM을 치료하기에 적절한 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태 및 환자 질환의 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
"치료량"이 표기될 때, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 이식 정도 및 상태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 이러한 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여, 104 내지 109개 세포/㎏(체중), 예컨대 105 내지 106개 세포/㎏(체중)의 투여량으로 투여될 수 있다고 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량으로 다수 회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에 일반적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조). 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법은 질환의 징후에 대하여 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의약 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 다음, 이어서 다시 채혈하고(또는 성분채집술을 수행하고), 개시된 방법에 따라 이로부터 T 세포를 활성화시키고, 이들 활성화 및 확장된 T 세포를 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 과정은 몇 주마다 다수회 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, T 세포는 10 cc 내지 400 cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 구현예에서, T 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc 또는 100 cc의 채혈로부터 활성화된다. 이 다수의 채혈/다중 재주입 프로토콜을 사용하면, T 세포의 특정 집단을 선택하는 역할을 할 수 있다.
개시된 조성물의 투여는 주사, 수혈 또는 이식을 비롯한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 피하, 피내, 절내, 골수내, 근육내, 정맥내(iv) 주사 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 조성물은 또한 이식 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
특정 구현예에서, 개시된 CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 탈리도미드, 덱사메타손, 보르테조밉 및 레날리도미드를 비제한적으로 포함하는 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께(예를 들어, 그 이전에, 그와 동시에 또는 그 이후에) 환자에게 투여된다. 추가의 구현예에서, CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506, 항체 또는 다른 면역제거제(immunoablative agent), 예컨대 CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및 조사와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 골수 이식, 화학요법제, 예컨대 플루다라빈을 사용하는 T 세포 제거 요법, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드 또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 CAMPATH와 함께(예를 들어, 그 이전에, 그와 동시에 또는 그 이후에) 환자에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 세포 조성물은 CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어 리툭산(Rituxan)과 같은 B-세포 제거 요법 후에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 대상체는 고용량 화학요법에 의한 표준 치료 후 말초 혈액 줄기 세포 이식을 겪을 수 있다. 특정 구현예에서, 이식 후, 대상체는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가의 구현예에서, 확장된 세포는 수술 이전 또는 이후에 투여된다.
"생 치료제"의 형태로서 CAR-T 세포에 대한 하나의 주요 관심사는 생체 내에서의 그들의 조작성 및 그들의 잠재적인 면역-자극 부작용이다. CAR-T 요법을 보다 잘 제어하고 원치 않는 부작용을 방지하기 위해, 오프-스위치, 안전성 메커니즘 및 조건부 제어 메커니즘을 포함한 다양한 특징이 설계되었다. 예를 들어, 자가-파괴 및 마킹된/태깅된 CAR-T 세포는 둘 모두 CAR-발현 T-세포의 제거를 촉진하는 "오프-스위치"를 갖도록 조작된다. 자가-파괴 CAR-T는 CAR을 함유하지만, 외인성 분자의 투여시 유도 가능한 세포자멸사-유도 자살 유전자 또는 "제거 유전자"를 발현하도록 조작된다. HSV-TK(단순 포진 바이러스 티미딘 키나제), Fas, iCasp9(유도성 카스파제 9), CD20, MYC 태그 및 절단된 EGFR(내피 성장 인자 수용체)을 포함하여 다양한 자살 유전자가 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, HSK는 전구약물 간시클로비르(GCV)를 GCV-트리포스페이트로 전환시킬 것이며, 이는 복제 DNA 내에 자체 혼입되어 궁극적으로 세포사를 야기한다. iCasp9는 소분자 AP1903에 결합하여 카스파제 9 이량체화 및 세포자멸사를 야기하는 FK506-결합 단백질의 성분을 함유하는 키메라 단백질이다. 그러나, 마킹된/태깅된 CAR-T 세포는 CAR을 보유하지만 선택 마커를 발현하도록 조작된 것이다. 이 선택 마커에 대한 mAb의 투여는 CAR-T 세포의 제거를 촉진할 것이다. 절단된 EGFR은 항-EGFR mAb에 의한 이러한 하나의 표적화 가능한 항원이며, 세툭시맙의 투여는 CAR-T 세포의 제거를 촉진하도록 작용한다. 이러한 특징을 갖도록 생성된 CAR은 '전환 가능한 CAR'에 대하여 sCAR 및 '조절 가능한 CAR'에 대하여 RCAR로도 지칭된다. "저해성 CAR"(iCAR)로도 알려진 "안전성 CAR"은 2개의 항원 결합 도메인을 발현하도록 조작된다. 이들 세포외 도메인 중 하나는 제1 항원에 대하여 지향되고, 세포내 공동자극 및 자극 도메인에 결합된다. 그러나, 제2 세포외 항원 결합 도메인은 정상 조직에 특이적이고, CTLA4, PD1 또는 CD45와 같은 세포내 체크포인트 도메인에 결합된다. 다중 세포내 저해 도메인을 iCAR에 혼입하는 것도 가능하다. 이들 저해 도메인을 제공할 수 있는 일부 저해성 분자는 B7-H1, B7-1, CD160, PIH, 2B4, CEACAM(CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, TIGIT, BTLA, LAIR1, 및 TGFβ-R을 포함한다. 정상 조직의 존재 하에, 이 제2 항원 결합 도메인의 자극은 CAR을 저해하도록 작용할 것이다. 이 이중 항원 특이성으로 인해, iCAR은 또한 이중특이적 CAR-T 세포의 형태라는 점에 유의해야 한다. 안전성 CAR-T 조작은 조직에 대한 CAR-T 세포의 특이성을 향상시키고, 특정 정상 조직이 매우 낮은 수준의 항원을 발현하여 표준 CAR(문헌[Morgan 2010])로 표적외 효과를 야기할 상황에서 유리하다. 조건적 CAR-T 세포는 개별 세포내 공동자극인자 및 세포내 공동자극 도메인에 연결된 세포외 항원 결합 도메인을 발현한다. 공동자극 및 자극 도메인 서열은 외인성 분자의 투여시 수득된 단백질이 세포내에서 합쳐져서 CAR 회로를 완성하는 방식으로 조작된다. 이러한 방식으로, CAR-T 활성화가 조절될 수 있으며, 아마도 심지어 특정 환자에 대해 '미세조정'되거나 개인화될 수도 있다. 이중 CAR 설계와 유사하게, 자극 및 공동자극 도메인은 조건적 CAR에서 불활성일 때 물리적으로 분리되며; 이러한 이유로 이들은 또한 "분할 CAR"로도 지칭된다.
전형적으로, CAR-T 세포는 α-β T 세포를 사용하여 생성되지만, γ-δ T 세포도 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포를 생성하는데 사용되는 기재된 CAR 구축물, 도메인 및 조작된 특징은 NK(자연 살해) 세포, B 세포, 비만 세포, 골수-유래된 식세포 및 NKT 세포를 포함하는 다른 유형의 CAR-발현 면역 세포의 생성에 유사하게 사용될 수 있다. 대안적으로, CAR-발현 세포는 T-세포 및 NK 세포 둘 모두의 특성을 갖도록 생성될 수 있다. 추가의 구현예에서, CAR로 형질도입된 것은 자가 또는 동종이계일 수 있다.
레트로바이러스 형질도입(γ-레트로바이러스 포함), 렌티바이러스 형질도입, 트랜스포존/전위효소(슬리핑 뷰티 및 PiggyBac 시스템) 및 메신저 RNA 전달-매개된 유전자 발현을 포함하는, CAR 발현을 위한 몇개의 상이한 방법이 사용될 수 있다. CAR-T 세포 조작 가능성과 관련하여 유전자 편집(유전자 삽입 또는 유전자 결실/파괴)이 점점 더 중요해지고 있다. CRISPR-Cas9, ZFN(아연 핑거 뉴클레아제) 및 TALEN(이펙터 뉴클레아제와 같은 전사 활성화제) 시스템은 CAR-T 세포가 생성될 수 있는 3가지 잠재적 방법이다.
정의
용어 "아미노산 서열"은 아미노산 잔기를 나타내는 약어, 문자, 문자들 또는 단어의 목록을 지칭한다. 본원에 사용된 아미노산 약어는 아미노산에 대한 통상적인 하나의 문자 코드이며, 다음과 같이 표현된다: A, 알라닌; B, 아스파라긴 또는 아스파르트산; C, 시스테인; D 아스파르트산; E, 글루타메이트, 글루탐산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H 히스티딘; I 이소류신; K, 라이신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; Y, 티로신; Z, 글루타민 또는 글루탐산.
용어 "항체"는 면역글로불린, 특이적 결합 능력을 유지하는 그의 유도체, 및 면역글로불린 결합 도메인과 상동성이거나 또는 크게 상동성인 결합 도메인을 갖는 단백질을 지칭한다. 이들 단백질은 천연 공급원으로부터 유래되거나, 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 항체는 모노클로널 또는 폴리클로널일 수 있다. 항체는 임의의 인간 부류: IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 비롯한 임의의 종으로부터의 임의의 면역글로불린 부류의 구성원일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용되는 항체는 IgG 부류의 유도체이다. 온전한 면역글로불린 분자에 더하여, 용어 "항체"에는 또한 이러한 면역글로불린 분자의 단편 또는 중합체, 및 표적 항원에 선택적으로 결합하는 면역글로불린 분자의 인간 또는 인간화된 버전이 포함된다.
용어 "항체 단편"은 전장보다 더 적은 항체의 임의의 유도체를 지칭한다. 예시적인 구현예에서, 항체 단편은 전장 항체의 특이적인 결합 능력의 적어도 유의미한 부분을 보유한다. 항체 단편의 예에는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv 디아바디, Fc 및 Fd 단편이 포함된다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있거나, 항체 단편은 부분 항체 서열을 인코딩하는 유전자로부터 재조합에 의해 생성될 수 있거나, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 단일 쇄 항체 단편일 수 있다. 대안적으로, 단편은 예를 들어, 이황화 결합에 의해 함께 연결되는 다중의 쇄을 포함할 수 있다. 단편은 또한 선택적으로 다중분자 복합체일 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함할 것이며, 더욱 전형적으로 적어도 약 200개의 아미노산을 포함할 것이다.
용어 "항원 결합 부위"는 항원 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 영역을 지칭한다.
용어 "압타머"는 특정 표적 분자에 결합하는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자를 지칭한다. 이들 분자는 일반적으로 무작위 서열 풀로부터 선택된다. 선택된 압타머는 독특한 3차 구조를 조정하고 높은 친화성 및 특이성으로 표적 분자를 인식할 수 있다. "핵산 압타머"는 그의 입체구조를 통해 표적 분자에 결합함으로써 이러한 분자의 기능을 저해 또는 억제하는 DNA 또는 RNA 올리고핵산이다. 핵산 압타머는 DNA, RNA 또는 그들의 조합으로 구성될 수 있다. "펩타이드 압타머"는 일정한 스캐폴드 단백질 내에 삽입된 가변 펩타이드 서열을 갖는 조합 단백질 분자이다. 펩타이드 압타머의 확인은 전형적으로 엄격한 효모 디하이브리드 조건 하에서 수행되며, 이는 선택된 펩타이드 압타머가 세포내 상황에서 안정적으로 발현되고 정확하게 폴딩될 가능성을 향상시킨다.
용어 "담체"는 화합물 또는 조성물과 조합될 때 그의 의도된 용도 또는 목적을 위해 화합물, 또는 조성물의 제조, 저장, 투여, 전달, 유효성, 선택성 또는 임의의 다른 특징을 보조하거나 촉진하는 화합물, 조성물, 물질 또는 구조를 의미한다. 예를 들어, 담체는 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 유해한 부작용을 최소화하도록 선택될 수 있다.
용어 "키메라 분자"는 그들의 고유 상태에서 개별적으로 존재하는 둘 이상의 분자를 연결함으로써 생성된 단일 분자를 지칭한다. 단일의 키메라 분자는 그의 모든 구성성분 분자의 원하는 기능을 갖는다. 키메라 분자의 하나의 유형은 융합 단백질이다.
용어 "조작된 항체"는 적어도 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인으로부터 유래된 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편을 포함하는 재조합 분자를 지칭하며, Ig 부류(예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 IgY) 중 임의의 것으로부터의 항체의 가변 및/또는 불변 도메인의 전체 또는 부분을 선택적으로 포함할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체가 우선적으로 그리고 특이적으로 결합하는 항원의 영역을 지칭한다. 모노클로널 항체는 분자적으로 정의될 수 있는 분자의 단일의 특이적 에피토프에 우선적으로 결합한다. 본 발명에서, 다중의 에피토프는 다중특이적 항체에 의해 인식될 수 있다.
용어 "융합 단백질"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노 말단과 또 다른 폴리펩타이드의 카복실 말단 사이에 형성된 펩타이드 결합을 통해 2개 이상의 폴리펩타이드를 결합시킴으로써 형성된 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 단백질은 구성성분 폴리펩타이드의 화학적 커플링에 의해 형성될 수 있거나, 융합 단백질은 단일의 인접 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로부터 단일의 폴리펩타이드로서 발현될 수 있다. 단일 쇄 융합 단백질은 단일의 인접 폴리펩타이드 백본을 갖는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 프레임 내에서 2개의 유전자를 단일의 핵산으로 연결한 다음, 융합 단백질이 생성되는 조건 하에서 적절한 숙주 세포에서 핵산을 발현시키기 위한 분자 생물학의 통상적인 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
용어 "Fab 단편"은 H-쇄-간 이황화 결합에 대하여 N-말단의 힌지 영역에서 절단하고, 하나의 항체 분자로부터 2개의 Fab 단편을 생성하는 효소 파파인을 사용한 항체의 절단에 의해 생성되는 항원-결합 부위를 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
용어 "F(ab')2 단편"은 H-쇄-간 이황화 결합에 대하여 C-말단의 힌지 영역에서 절단하는 효소 펩신을 사용한 항체 분자의 절단에 의해 생성되는 2개의 항원-결합 부위를 함유하는 항체의 단편을 지칭한다.
용어 "Fc 단편"은 항체의 중쇄의 불변 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
용어 "Fv 단편"은 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
"유전자 구축물"은 폴리펩타이드에 대한 "코딩 서열"을 포함하거나, 또는 다르게 생물학적 활성 RNA(예를 들어, 안티센스, 디코이(decoy), 리보자임 등)로 전사 가능하고, 세포, 예를 들어, 특정 구현예에서, 포유동물 세포 내로 트랜스펙션될 수 있고, 구축물로 트랜스펙션된 세포에서 코딩 서열의 발현을 야기할 수 있는 핵산, 예컨대 벡터, 플라스미드, 바이러스 게놈 등을 지칭한다. 유전자 구축물은 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소, 및 인트론 서열, 폴리아데닐화 부위, 복제 원점, 마커 유전자 등을 포함할 수 있다.
용어 "동일성"은 2개의 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 동일성을 지칭한다. 동일성은 비교를 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 유사성 또는 동일성의 정도는 핵산 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일하거나 일치하는 뉴클레오타이드의 수의 함수이다. GCG 서열 분석 패키지(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 위스콘신 대학(University of Wisconsin))의 일부로서 이용 가능한 FASTA 또는 BLAST를 포함하는 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램이 2개의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어 디폴트 설정으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 특정 폴리펩타이드에 대해 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖고 바람직하게는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 달리 나타내지 않는 한, 유사성 점수는 BLOSUM62의 사용에 기초할 것이다. BLASTP를 사용하는 경우 유사성 백분율은 BLASTP 양성 점수에 기초하며, 서열 동일성 백분율은 BLASTP 동일성 점수에 기초한다. BLASTP "동일성"은 높은 점수의 서열 쌍에서 동일한 총 잔기의 수 및 분율을 보여주며; BLASTP "양성"은 정렬 점수가 양의 값을 가지며 서로 유사한 잔기의 수 및 분율을 보여준다. 본원에 개시된 아미노산 서열에 대하여 이들 정도의 동일성 또는 유사성, 또는 임의의 중간 정도의 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열이 본 발명에 의해 고려되고 포함된다. 유사한 폴리펩타이드의 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드를 사용하여 추론되고, 통상적인 수단에 의해, 특히 유전자 코드를 사용하여 그의 아미노산 서열을 역번역함으로써 수득될 수 있다.
용어 "링커"는 해당 분야에 인식되어 있으며, 2개의 화합물, 예컨대 2개의 폴리펩타이드를 연결하는 분자 또는 분자의 군을 지칭한다. 링커는 단일의 연결 분자로 구성될 수 있거나, 연결 분자, 및 연결 분자와 화합물을 소정의 거리로 분리하기 위해 의도된 스페이서 분자를 포함할 수 있다.
용어 "다가 항체"는 1개 초과의 항원 인식 부위를 포함하는 항체 또는 조작된 항체를 지칭한다. 예를 들어, "2가" 항체는 2개의 항원 인식 부위를 갖는 한편, "4가" 항체는 4개의 항원 인식 부위를 갖는다. 용어 "단일특이적", "이중특이적", "삼중특이적", "사중특이적" 등은 다가 항체에 존재하는 (항원 인식 부위의 수가 아니라) 상이한 항원 인식 부위 특이성의 수를 지칭한다. 예를 들어, "단일특이적 항체"의 항원 인식 부위는 모두 동일한 에피토프에 결합한다. "이중특이적" 항체는 제1 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항원 인식 부위 및 제1 에피토프와 상이한 제2 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항원 인식 부위를 갖는다. "다가의 단일특이적" 항체는 모두 동일한 에피토프에 결합하는 다수의 항원 인식 부위를 갖는다. "다가의 이중특이적" 항체는 다수의 항원 인식 부위를 가지며, 이 중 일부는 제1 에피토프에 결합하며, 이 중 일부는 제1 에피토프와 상이한 제2 에피토프에 결합한다.
용어 "핵산"은 하나의 뉴클레오타이드의 3' 위치에서 또 다른 뉴클레오타이드의 5' 말단에 포스페이트 기에 의해 연결된 단일 뉴클레오타이드 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 천연 또는 합성 분자를 지칭한다. 핵산은 길이에 의해 제한되지 않으므로, 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산과 또 다른 핵산 서열의 기능적 관계를 의미한다. 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 정지 부위 및 다른 신호 서열은 다른 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 예이다. 예를 들어, 전사 조절 요소로의 DNA의 작동 가능한 연결은 이러한 DNA의 전사가 DNA를 특이적으로 인식하고, 이에 결합하고, 이를 전사하는 RNA 중합효소에 의해 프로모터로부터 개시되도록 하는 DNA와 프로모터 사이의 물리적 및 기능적 관계를 지칭한다.
용어 "펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 하나의 아미노산의 카복실기에 의해 또 다른 아미노산의 알파 아미노기에 연결된 둘 이상의 아미노산을 포함하는 천연 또는 합성 분자를 지칭하도록 상호교환 가능하게 사용된다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서 합리적인 유익/위험 비에 상응하여 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭한다.
특정 폴리펩타이드에 관하여 사용되는 경우, 용어 "폴리펩타이드 단편" 또는 "단편"은 아미노산 잔기가 참조 폴리펩타이드 그 자체에 비하여 결실되지만, 나머지 아미노산 서열이 통상 참조 폴리펩타이드의 서열과 동일한 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 결실은 참조 폴리펩타이드의 아미노-말단 또는 카복시-말단, 또는 대안적으로 둘 모두에 존재할 수 있다. 단편은 전형적으로 적어도 약 5, 6, 8 또는 10개 아미노산 길이, 적어도 약 14개 아미노산 길이, 적어도 약 20, 30, 40 또는 50개 아미노산 길이, 적어도 약 75개 아미노산 길이 또는 적어도 약 100, 150, 200, 300, 500개 또는 그 이상의 아미노산 길이이다. 단편은 참조 폴리펩타이드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 보유할 수 있다. 다양한 구현예에서, 단편은 참조 폴리펩타이드의 효소 활성 및/또는 상호작용 부위를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단편은 면역원성 특성을 가질 수 있다.
용어 "단백질 도메인"은 단백질의 일부, 단백질의 부분 또는 구조적 온전성을 나타내는 전체 단백질을 지칭하며; 이 결정은 단백질의 일부, 단백질의 부분 또는 전체 단백질의 아미노산 조성에 기초할 수 있다.
용어 "단일 쇄 가변 단편 또는 scFv"는 중쇄 도메인과 경쇄 도메인이 연결된 Fv 단편을 지칭한다. 하나 이상의 scFv 단편은 다른 항체 단편(예컨대 중쇄 또는 경쇄의 불변 도메인)에 연결되어, 하나 이상의 항원 인식 부위를 갖는 항체 구축물을 형성할 수 있다.
본원에 사용되는 "스페이서"는 융합 단백질을 포함하는 단백질을 연결시키는 펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, 스페이서는 단백질을 연결시키거나 그들 사이의 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 유지하는 것 이외의 특정한 생물학적 활성을 갖지 않는다. 그러나, 스페이서의 구성성분 아미노산은 분자의 폴딩, 순전하 또는 소수성과 같은 분자의 일부 특성에 영향을 주도록 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하는"은 폴리펩타이드(항체 포함) 또는 수용체를 지칭할 때, 이종의 단백질 집단 및 다른 생물물질에서 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 수용체의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건(예를 들어, 항체의 경우 면역검정 조건) 하에서, 특정 리간드 또는 항체는 시료에 존재하는 다른 단백질, 또는 리간드 또는 항체가 유기체에서 접촉할 수 있는 다른 단백질에 상당한 양으로 결합하지 않는 경우, 그의 특정 "표적"에 "특이적으로 결합"한다(예를 들어, 항체는 내피 항원에 특이적으로 결합한다). 일반적으로, 제2 분자와 "특이적으로 결합하는" 제1 분자는 제2 분자와 약 105 M-1(예를 들어, 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 및 1012 M-1　또는 그 이상) 초과의 친화성 상수(Ka)를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 전달하는"은 특정 표적 분자 또는 마커를 보유하는 세포 또는 조직과, 분자가 우선적으로 회합하며, 표적 분자가 결여된 세포 또는 조직과는 우선적으로 회합하지 않는 것을 지칭한다. 물론 그것은 분자와 비-표적 세포 또는 조직 사이에서 어느 정도의 비-특이적 상호작용이 발생할 수 있음이 인식된다. 그럼에도 불구하고, 특이적 전달은 표적 분자의 특이적 인식을 통해 매개되는 것으로 구별될 수 있다. 전형적으로 특이적 전달은 전달된 분자와 표적 분자가 결여된 세포 사이보다 전달된 분자와 표적 분자를 보유하는 세포 사이에서 훨씬 더 강력한 회합을 초래한다.
용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적인 임의의 개체를 지칭한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어 포유동물일 수 있다. 따라서, 상기 대상체는 인간 또는 수의과 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예를 들어 의사의 치료 하의 대상체를 지칭한다.
용어 "치료적으로 유효한"은 사용된 조성물의 양이 질환 또는 장애의 하나 이상의 원인 또는 증후를 개선시키기에 충분한 양인 것을 지칭한다. 이러한 개선은 감소 또는 변경만을 필요로 하며, 제거를 반드시 필요로 하지는 않는다.
용어 "형질전환" 및 "트랜스펙션"은 상기 세포의 염색체 DNA로의 핵산의 도입을 포함하는, 수여자 세포로의 핵산, 예를 들어 발현 벡터의 도입을 의미한다.
용어 "치료"는 질환, 병리학적 증상 또는 장애를 치료하거나, 개선하거나, 안정화하거나 또는 예방하고자 하는 환자의 의료 관리를 지칭한다. 이 용어는 적극 치료, 즉, 질환, 병리학적적 증상 또는 장애의 개선을 향해 특별히 지시된 치료를 포함하며, 또한, 원인 치료, 즉, 연관된 질환, 병리학적 증상 또는 장애의 원인의 제거를 향해 지시된 치료도 포함한다. 또한, 이 용어는 완화 치료, 즉, 질환, 병리학적 증상 또는 장애의 치료보다는 증후의 완화를 위해 고안된 치료; 예방적 치료, 즉 연관된 질환, 병리학적 증상 또는 장애의 발생을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 저해하도록 지시된 치료; 및 보조 치료, 즉 연관된 질환, 병리학적 증상 또는 장애의 개선을 향해 지시된 또 다른 특정 요법을 보충하기 위해 사용되는 치료를 포함한다.
용어 "변이체"는 보존적 아미노산 치환, 비-보존적 아미노산 치환(즉, 축퇴성 변이체), 아미노산을 인코딩하는 각각의 코돈(즉, DNA 및 RNA)의 워블(wobble) 위치 내의 치환, 펩타이드의 C-말단에 부가된 아미노산을 갖는 아미노산 또는 펩타이드 서열 또는 참조 서열에 대하여 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 지칭한다.
용어 "벡터"는 벡터 서열이 연결된 또 다른 핵산을 세포 내로 수송할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "발현 벡터"는 (예를 들어, 전사 조절 요소에 연결된) 세포에 의한 발현에 적합한 형태로 유전자 구축물을 함유하는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 염색체)를 포함한다.
본 발명의 수많은 구현예가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 목적과 범주를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 다른 구현예는 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
실시예
실시예 1: 신규한 인간 CD83 키메라 항원 수용체 T 세포는 공여자 항-종양 면역을 유지하면서 GVHD를 예방한다
도입
동종-HCT는 고위험 혈액학적 악성종양 및 골수 부전 증후군에 대한 치료 의도로 수행되는 수술이다. 전세계적으로, 연간 30,000명의 환자가 동종-HCT를 받으며, 34 내지 89%는 표준 약리학적 면역 억제에도 불구하고, 급성 GVHD가 발생할 것이다(문헌[Cutler C., et al., Blood 2014 124:1372-1377]; 문헌[Pidala J., et al., Haematologica 2012 97:1882-1889]). GVHD를 예방하기 위한 현행의 관행은 메토트렉세이트(methotrexate), 시롤리무스(sirolimus) 또는 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)과 병용하여 광범위 억제성 칼시뉴린-저해제를 사용하는 것이다. 알려져 있는 유리한 GVL의 표적외 손상 및 제한된 관용 유도에도 불구하고(문헌[Zeiser R., et al., Blood 2006 108:390-399]), 칼시뉴린-저해제는 GVHD 예방 및 치료에 30년 넘게 포함된 바 있다(문헌[Powles R.L., et al., Lancet 1978 2:1327-1331]; 문헌[Storb R., et al., Blood 1986 68:119-125]; 문헌[Storb R., et al., N Engl J Med 1986 314:729-735]). 공여자 및 이식편 공급원 선택(문헌[Pidala J., et al., Blood 2014 124:2596-2606]; 문헌[Anasetti C., et al., N Engl J Med 2012 367:1487-1496]), 수여자 동반질환 평가(문헌[Sorror M.L., et al., Blood 2004 104:961-968]; 문헌[Thakar M., et al., Blood. 2019 133(7):754-762]) 및 조건화 요법의 진전이 동종-HCT 결과를 개선시켰지만(문헌[Solh M.M., et al., Biol Blood Marrow Transplant. 2018 Sep 19]; 문헌[Scott B.L., et al., J Clin Oncol 2017 35:1154-1161]), 칼시뉴린-저해제가 오늘날 GVHD 예방의 일반적인 면역 억제 백본을 유지하는 것은 놀라운 것이다(문헌[Cutler C., et al., Blood 2014 124:1372-1377]).
칼시뉴린 저해제 외에도, GVHD 예방에서 세포-기반의 면역 억제가 더 많이 연구되고 있다. 부분적으로, 세포-기반의 전략, 예컨대 Treg는 강력하고 잠재적으로 항원-특이적인 동종반응성 T 세포의 저해를 제공한다(문헌[Veerapathran A., et al. Blood 2011 118:5671-5680]; 문헌[Veerapathran A., et al., Blood 2013 122:2251-2261]). GVHD 예방에 Treg를 포함시킨 이전의 임상 시험에 의해, 세포-매개의 면역 억제가 GVL의 손상 없이 공여자 T 세포에 대하여 안전하고 효율적인 조절을 제공하는 것이 입증되었다(문헌[Brunstein C.G. et al., Blood 2011 117:1061-1070]; 문헌[Brunstein C.G., et al., Blood 2016 127:1044-1051]; 문헌[Kellner J.N., et al., Oncotarget 2018 9:35611-35622]). 예비임상 및 임상 증거는 또한, GVHD를 감소시키고, GVL을 보존하기 위한 자연 살해(NK) 세포, 불변 NKT 세포, 골수 유래 억제자 세포 및 2형 선천성 림프계 세포를 포함하는 신규한 세포 생성물의 적용 가능성(translational potential)을 뒷받침한다(문헌[Ruggeri L., et al., Science 2002 295:2097-2100]; 문헌[Olson J.A., et al., Blood 2010 115:4293-4301]; 문헌[Asai O., et al., J Clin Invest 1998 101:1835-1842]; 문헌[Du J., et al., Blood. 2017 129(23):3121-3125]; 문헌[Highfill S.L., et al., Blood 2010 116:5738-5747]; 문헌[Bruce D.W., et al., J Clin Invest 2017 127:1813-1825]). Treg 및 NK 세포가 임상 환경에서 광범위하게 연구되어 왔지만, 현재, 이들 세포 생성물은 대부분 연구 대상으로 남아 있다. 더욱 최근에, CAR T 세포는 불응성 급성 림프모구성 백혈병 및 미만성 거대 B 세포 림프종에서 독보적인 활성을 보였다(문헌[Neelapu S.S., et al., N Engl J Med 2017 377:2531-2544]; 문헌[Schuster S.J., et al., N Engl J Med 2019 380:45-56]; 문헌[Maude S.L., et al., N Engl J Med 2018 378:439-448]). 따라서, 이들 고위험 혈액학적 악성종양에서 CD19 CAR T 세포에 FDA 승인이 부여되었다. 이들 CAR T 세포가 실제로 세포용해성이고, 결코 면역 억제성이 아니지만, 그들은 GVHD 발병의 매개체의 표적화에서 CAR T 세포의 가능한 역할을 강조한다. 더욱이, CAR T 세포는 그들이 공여자-유래 생성물로서 동종-HCT 이후 투여될 때 GVHD를 유도하는 능력이 감소된다는 점에서 독특하다(문헌[Ghosh A., et al., Nat Med 2017 23:242-249]).
CD83은 염증성 수지상 세포 및 동종반응성 공여자 T 세포를 제거하기 위한 임상적으로 관련된 표적을 나타낸다. CD83은 면역글로불린 상과의 단백질 구성원이며, 활성화된 인간 수지상 세포의 표면 상에 발현된다(문헌[Ju X., et al., J Immunol 2016 197:4613-4625]). 또한, CD83은 동종이계-항원에 의한 자극 후에 인간 T 세포 상에서 발현되며, GVHD 환자에서 순환하는 T 세포 상에 존재한다(문헌[Ju X., et al., J Immunol 2016 197:4613-4625]). 모노클로널 항체를 사용한 CD83의 표적화는 마우스에서 병원성 바이러스에 대한 T 세포 반응 또는 GVL을 손상시키지 않고, 이종 GVHD를 감소시킨다(문헌[Wilson J., et al., J Exp Med 2009 206:387-398]). 그러나, 항체에 의한 면역 억제 효과는 일시적이며, NK-세포 매개된 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 의존성이다(문헌[Wilson J., et al., J Exp Med 2009 206:387-398]; 문헌[Seldon T.A., et al., Leukemia 2016 30:692-700]).
CD83의 항체-표적화의 한계를 극복하기 위하여, CD83 CAR T 세포를 설계하였다. 본 실시예에는 인간 CD83 CAR T 세포의 생성 및 GVHD 예방에서의 예비임상 효능이 설명된다. CD83 CAR T 세포는 모노클로널 항체와 달리, 그의 표적을 사멸시키기 위하여 ADCC를 필요로 하지 않는다. 더욱이, CD83 CAR T 세포는 심지어 세포의 단일의 주입 후에도 인간 T 세포 매개된 이종 GVHD 모델에서 지속적인 GVHD 예방을 제공한다. 부분적으로, 개시된 CAR은 Treg에 비하여 활성화된 Tconv 상의 CD83의 차등적인 발현을 이용한다. 따라서, CD83 CAR T 세포는 병원성 Th1 세포를 제거하며, 생체 내에서 Treg 대 Tconv의 비를 유의미하게 증가시킨다. 더욱이, CD83 CAR T 세포는 공여자 T 세포에 의한 강력한 항-종양 면역을 허용한다. CD83 CAR T 세포는 GVHD 예방에 대한 새로운 세포-기반의 접근법을 나타내며, 광범위하게 작용하는 칼시뉴린-저해제의 필요 없이, 지속적이고 선택적인 면역 억제를 제공한다.
재료 및 방법
연구 설계. 이것은 GVHD 예방을 위한 새로운 인간 CD83 CAR T 세포의 설계, 생성 및 효능의 예비임상 연구이다. 연구의 첫 부분은 CAR 구축물, 및 CD83+ 표적에 반응하는 표현형, 사이토카인 생성, 온-표적 사멸 및 증식에 관한 CD83 CAR T 세포의 시험관내 활성을 설명한다. 다음으로, 표준 alloMLR을 사용하여 시험관 내에서 CD83 CAR T 세포의 면역 억제 효과가 입증된다. 추가적으로, CD83 발현은 Treg 세포에 비하여 Tconv 상의 CD83의 차등적인 발현을 보여주는 인간 T 세포에서의 척도였다. GVHD 예방에서의 CD83 CAR의 예비임상 효능이 인간 T 세포 매개된 이종 GVHD 모델(문헌[Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2018 115:1582-1587]; 문헌[Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372)]; 문헌[Betts B.C., et al., Front Immunol. 2018 9:2887])에서 입증된다. 이는 CD83+ 수지상 세포 및 Tconv의 생체내 표적 사멸의 완전한 평가를 포함한다. 또한, 생체 내에서의 다양한 T 세포 하위세트 상의 CD83 CAR T 세포의 영향이 나타나 있다. 마지막으로, 확립된 이종 모델을 사용하여 CD83 CAR T 세포가 공여자 항-종양 면역을 남겨두어, 생체 내에서 인간, 종양-특이적 CD8 CTL을 생성한 것이 나타났으며(문헌[Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2018 115:1582-1587]; 문헌[Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372)]; 문헌[Betts B.C., et al., Front Immunol. 2018 9:2887]), CTL에 의한 사멸을 xCELLigence RTCA(리얼-타임 세포 분석) 시스템을 사용하여 시험관 내에서 시험하였다(문헌[Li G., et al., JCI Insight. 2018 3(18)]).
CD83 CAR T 세포 구축물 및 생성. [제공 요함]
모노클로널 항체 및 유세포분석. 형광색소-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 모노클로널 항체는 항-CD3, CD4, CD25, CD83, CD127, MHCII, Foxp3, Ki-67, IFNγ, IL-17A 및 IL-4를 포함한다(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 새너제이 소재; 이바이오사이언스(eBioscience), 미국 캘리포니아주 새너제이 소재; 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 미국 매사추세츠주 보스톤 소재). 생존/사멸(LIVE/DEAD) 픽서블(Fixable) 옐로우(Yellow) 또는 아쿠아(Aqua) 데드(Dead) 셀 스테인(Cell Stain)(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)을 사용하여, 생존력을 결정하였다. 생존 사건을 BD FACSCanto II 유세포분석기에서 획득하였다(FlowJo 소프트웨어, 버전 7.6.4; 트리스타(TreeStar), 미국 오리건주 애슐랜드 소재).
사이토카인 면역검정. CD83 CAR 및 모의 형질도입된 T 세포(1x106개)를 CD83+ moDC(1x105개)와 24시간 동안 공동배양하였다. 상청액을 수집하고, Ella 장치(ProteinSimple)에서 심플(Simple) 플렉스(Plex) 검정 키트(알앤디 시스템즈(R&D Systems))를 사용하여 분석하였다. 제조업체의 지침을 따랐다(47).
인간 CD83 CAR T 세포 시험관내 증식. 정규화된 개수(1 또는 2x106개)의 인간 CD83 CAR T 세포를 비-조직-배양-처리된 6-웰 플레이트에서 웰당 2x105개의 CD83+ moDC와 3벌로 공동배양하였다. 세포를 60 IU/㎖의 IL-2가 보충된 인간 T 세포 완전 배지에서 성장시키고, 2 내지 3일마다 또는 배지가 황색으로 변할 때마다 나누었다. 각 웰 내의 세포 생존력 및 총 세포 개수를 트립판 블루(trypan blue) 염색을 사용하여 세포 계수기(바이오-라드(Bio-Rad)) 상에서 매일 또는 2 내지 4일마다 측정하였다.
시험관내 alloMLR. 인간 단핵구-유래 수지상 세포(moDC)는 기재된 바와 같이 사이토카인-생성하고, 분화하고, 성숙하였다(문헌[Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372)]). 백혈구 농축물(원블러드(OneBlood) 또는 메모리얼 블러드 센터(Memorial Blood Center))로부터 정제된 T 세포(105개)를 10% 열-불활성화, 풀링된 인간 혈청이 보충된 100 ㎕의 완전 RPMI에서 동종이계 moDC(T 세포:DC 비 30:1)와 함께 배양하였다. CD83 CAR, CD19 CAR 또는 모의 형질도입된 T 세포(T 세포 공여자에 대하여 자가)를 다양한 CAR 대 DC 비로 alloMLR에 첨가하였다. T 세포 증식을 5일 후에 Ki-67 발현에 의해 측정하였다.
CD83 발현 시간 경과. 정제된 인간 T 세포를 동종이계 moDC(T 세포:DC 비 30:1) 또는 CD3/CD28 비드(T 세포:비드 비 30:1) 중 어느 하나로 자극하였다. T 세포를 제4시간, 제8시간, 제24시간 및 제48시간의 배양 시에, 96-웰 플레이트 내의 3벌 웰로부터 수집하였다. T 세포를 CD3, CD4, CD127, CD25 및 CD83에 대하여 염색한 다음, 고정하였다. CD83 발현을 활성화된 Tconv(CD3+, CD4+, CD127+, CD25+)(38), Treg(CD3+, CD4+, CD127-, CD25+)(38) 및 CD8 T 세포(CD3+, CD4-)에서 평가하였다.
이종 GVHD 모델. NOD scid 감마(NSG) 마우스(수컷 또는 암컷, 6 내지 24주령)를 모핏(Moffitt)/USF 동물 사육장에서 유지되는 IACUC-승인된 콜로니 내에서 길렀다. 수여자 마우스에게 25x106개의 신선한 인간 PBMC(원블러드)를 이식 제0일에 1회 제공하였다. 표기된 바와 같이, 마우스에는 단독의 PBMC, PBMC + CD83 CAR T 세포(저용량: 1x106개 또는 고용량: 10x106개) 또는 PBMC + 모의 형질도입된 T 세포(10x106개)를 제공하였다. 각각의 독립적인 실험을 상이한 인간 PBMC 공여자를 사용하여 수행하였으며, CAR T 세포 및 모의 형질도입된 T 세포는 PBMC 공여자로부터 유래하였다. 마우스를 GVHD 임상 점수 및 예비빈사(premoribund) 상태에 대하여 모니터링하였다. 표기된 경우, 단기간 실험을 제+21일에 인도적인 안락사를 통해 완료하여 GVHD 표적 기관 병리학(문헌[Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2018 115:1582-1587]; 문헌[Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372)]; 문헌[Betts B.C., et al., Front Immunol. 2018 9:2887]), 조직-내재 림프구, 및 쥣과 비장 내의 인간 DC 및 T 세포 하위세트의 함량을 평가하였다. 이들 마우스에는 CD83 CAR(1x106개) 또는 모의 형질도입된 T 세포(1x106개)와 함께 또는 이것 없이, PBMC(25x106개)를 이식하였다. 모든 척추동물 연구를 AICUC-승인된 프로토콜 하에 수행하였다.
인간 항-종양 CTL의 생체내 생성. NSG 마우스에는 CD83 CAR T 세포(1x106개) 또는 모의 형질도입된 T 세포(1x106개)와 함께 또는 이것 없이, 인간 PBMC(25x106개)를 이식하였다. 추가로, 수여자 마우스에는 제0일 및 제+7일에 조사된 K562 세포(107개/마우스)의 접종물을 제공하였다(문헌[Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2018 115:1582-1587]; 문헌[Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372)]; 문헌[Betts B.C., et al., Front Immunol. 2018 9:2887]). 마우스를 제+12일에 인도적으로 안락사시키고, 비장을 수집하고, 인간 CD8+ T 세포를 자성 비드 분리에 의해 단리하였다. 정제된 인간 CD8 T 세포를 신선한 K562 세포와 10:1의 E/T 비로 공동배양하고, 표적 세포 사멸을 xCELLigence RTCA 시스템(문헌[Li G., et al., JCI Insight. 2018 3(18)])을 사용하여 모니터링하였다.
통계적 분석. 데이터는 평균값±SEM으로 보고되어 있다. 다중-비교를 위한 보정과 함께 던넷 또는 시닥의 후속-검정을 포함하여, 그룹 비교를 위하여 ANOVA를 사용하였다. 생존 곡선의 비교를 위하여, 로그-순위 검정을 사용하였다. 통계적 분석을 프리즘(Prism) 소프트웨어 버전 5.04(그래프패드(GraphPad))를 사용하여 행하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05에 의해 정의되었다(양측).
결과
인간 CD83 CAR 구축물의 개요. CD83 CAR T 세포를 항-인간 CD83 항체, C312의 단일 쇄 가변 단편에 기초하여 설계하였다(문헌[Wilson J., et al., J Exp Med 2009 206:387-398]). CD83 CAR T 세포 구축물은 41BB 공동-자극 도메인 및 CD3ζ 활성화 도메인을 사용한다. CAR T 세포의 추적을 용이하게 하기 위하여, 구축물은 eGFP 태그를 함유하며, 이는 정상의 비-CAR T 세포 중에서 CAR T 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. CD83-표적화된 CAR T 세포를 레트로바이러스에 의해 형질도입하고, 정확하게 공개된 바와 같이 생성하였다(도 1)(문헌[Li G., et al. Methods Mol Biol 2017 1514:111-118]).
인간 CD83 CAR T 세포의 특징화. CD83 CAR 구축물은 고도의 형질도입 효율을 나타내었으며, 60% 초과의 T 세포가 생성 후 eGFP를 발현하였다(도 2a). CD4 발현이 둘 모두의 그룹에서 유사하였지만, 모의 형질도입된 T 세포에 비하여 CD83 CAR T 세포에서 CD8 발현의 유의미한 감소가 관찰되었다(도 2b). 그러나, CD83 CAR T 세포는 사이토카인-성숙, CD83+ 인간 moDC와 함께 배양되는 경우 강력한 IFNγ 생성을 나타내었다(도 2c). 또한, CD83 CAR T 세포는 모의 형질도입된 T 세포에 비하여 CD83+ moDC의 강력한 사멸 및 그에 대한 증식을 나타내었다(도 2d, 도 2e). 이들 실험에서 표적 moDC는 T 세포에 대하여 동종이계였으며, 이에 따라, 모의 형질도입된 T 세포에 의한 기준선 용해 및 증식은 기준선 동종반응성을 나타낸다(도 2d, 도 2e).
인간 CD83 CAR T 세포는 동종반응성을 감소시킨다. 인간 CD83 CAR T가 시험관 내에서 동종반응성을 감소시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 동종이계 혼합 림프구 반응(alloMLR)에서 그들의 억제 기능을 조사하였다. CD83 및 모의 형질도입된 CAR T 세포를 건강한 공여자, 인간 T 세포로부터 생성하였다. CD19 CAR T 세포는 B 세포를 표적화하며, 이에 따라, alloMLR에서 비관련 세포 유형을 또한 추가의 대조군으로서 시험하였다. CD19 및 CD83 CAR T 세포는 그들 둘 모두가 41BB를 통해 공동자극을 받는다는 점에서 유사하였다. CAR T 세포를 자가, 비형질도입된 T 세포(1x105개) 및 동종이계, 사이토카인-성숙, CD83+ moDC(3.33x103개)로 이루어진 제5일 alloMLR에 첨가하였다. CAR T 세포:moDC 비는 3:1 내지 1:10 범위였다. CD83 CAR T는 3:1 내지 1:3 표적 비에서 동종반응성 증식을 강력하게 감소시켰다(도 3, 상측 패널). 모의 형질도입 및 CD19 CAR T 세포는 동종반응성 T 세포에 대하여 억제 효과를 갖지 않았다(도 3, 가운데 및 하측 패널). 더욱이, CD19 CAR T 세포 대조군은 CD83 CAR T 세포에 의한 동종반응성 T 세포의 억제가 동족살해(fratricide)와 관련되지 않았음을 보여준다(도 3, 상측 및 하측 패널).
CD83은 Treg에 비하여 활성화된 인간 Tcon 상에서 차등적으로 발현된다. CD83은 인간 수지상 세포 성숙의 확립된 마커이며, 또한, 활성화된 인간 B 세포 상에서 발현된다. CD83 리포터 마우스 시스템을 사용하여, CD83의 쥣과 B 세포 발현이 주로 후기 프레-B 세포에 제한되어 있는 것이 이전에 밝혀졌다(문헌[Lechmann M., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2008 105:11887-11892]). 더욱이, CD83은 또한, 리포터 마우스 유래의 T 세포 상에서 발견되었다(문헌[Lechmann M., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2008 105:11887-11892]). CD83이 자극 후에 인간 T 세포 상에서 발현되며, 동종-HCT 이후에 순환하는 T 세포 상에서 검출 가능한 것이 알려져 있다(문헌[Ju X., et al., J Immunol 2016 197:4613-4625]). 그러나, T conv에 비한 Treg 상의 정확한 CD83의 발현은 불분명하다. 본원에 개시된 바와 같이, CD83의 인간 T 세포 발현은 동종이계 수지상 세포 또는 CD3/CD28 비드를 포함한 자극과 함께 발생한다(도 3a 내지 도 3d). 중요한 것은, CD83이 DC-동종활성화(alloactivation)에 반응하여 면역 억제성 CD4+ Treg에 비하여 인간 CD4+ Tconv 상에서 차등적으로 발현된다는 것이다(도 3c). CD83의 CD4+ Tconv 발현은 DC-동종자극 제4시간 내지 제8시간에 정점에 달하며, 제48시간까지 기준선 수준으로 감소하며, Treg 상에서 최소의 양이 관찰된다(도 3c). CD83의 발현은 초생리학적(supraphysiologic) CD3/CD28 비드 자극에서 더욱 풍부하며, 이는 또한 활성화 제48시간까지 Treg 상에서의 CD83 발현의 후기의 증가를 야기한다(도 3d). 보고에 의하면, CD83이 쥣과 CD8+ T 세포 상에서 발현되지만(문헌[Ju X., et al., J Immunol 2016 197:4613-4625]), 유의미한 양의 CD83이 시험관 내에서 DC-동종자극 또는 CD3/CD28 비드 활성화 후에 인간 CD8+ T 세포 상에서 검출되지 않았다(도 11a, 도 11b).
인간 CD83 CAR T 세포는 이종 GVHD를 예방한다. 이종 GVHD 모델을 사용하여 생체 내에서 인간 CD83 CAR T 세포의 효능을 평가하였다. 널리 확립된 NSG 마우스 모델을 사용하였으며, 여기서, 수여자에는 모두 제0일에 25x106개의 인간 PBMC에 더하여, 1 내지 10x106개의 자가 CD83 또는 모의 형질도입된 CAR T 세포를 접종하였다. 이식된 마우스를 제+100일까지 이종 GVHD의 임상 징후에 대하여 매일 모니터링하였다. CD83 및 모의 형질도입된 CAR T 세포는 NSG 마우스에서 안전하였으며, 단독의 PBMC에 비하여 조기의 GVHD 또는 독성의 어떠한 증거도 없었다(도 5a, 도 5b). CD83 CAR T 세포는 단독의 PBMC 또는 모의 형질도입된 CAR T 세포에 비하여, 이식 후에 이종 GVHD 생존을 유의미하게 개선시켰다(도 5a). 또한, 이종 GVHD 임상적 중증도는 CD83 CAR T 세포에 의해 감소되었다(도 5b). 현저하게, CD83 CAR T 세포의 둘 모두의 용량 코호트에서 마우스는 90% 또는 그보다 더 나은 3개월 생존을 보였다(도 5a). 개별 실험에서, 이식된 NSG 마우스에게 단독으로 또는 모의 형질도입된 T 세포(1x106개) 또는 CD83 CAR T 세포(1x106개)와 함께 PBMC를 제공하였으며, 제+21일에 인도적으로 안락사시켜, 표적 기관 GVHD 중증도를 평가하였다. GVHD 점수를 맹검법을 숙련한 병리학자가 결정하였다. CD83 CAR T 세포는 단독의 PBMC 또는 모의 형질도입된 T 세포에 비하여 수여자 폐(도 6a, 도 6b) 및 간(도 6c, 도 6d)에서 인간 T 세포에 의한 표적 기관 조직 손상을 본질적으로 없앴다.
인간 CD83 CAR T 세포는 생체 내에서 순환하는 성숙, CD83 + DC를 유의미하게 감소시킨다. 성숙, CD83+ 수지상 세포는 동종반응성 공여자 T 세포의 감작에 연루된다. 이와 같이, 본 발명자들은 이식된 마우스에서 인간 CD1c+ DC의 면역 회복에 대한 CD83 CAR T 세포의 영향을 측정하였다. 인간 PBMC에 더하여 CD83 CAR 또는 모의 형질도입된 T 세포를 이식한 NSG 마우스를 제+21일에 안락사시켰다. 수여자 비장의 수집 시에, 이러한 처리군에서 훨씬 더 작은 비장에 의해 나타나는 바와 같이, CD83 CAR T 세포가 생체 내에서 공여자 세포의 확장을 감소시키는 것이 명백하였다(도 7). CD83 CAR T 세포는 수여자 마우스에서 인간 CD1c+, CD83+ DC의 양을 유의미하게 감소시켰다(도 8a, 도 8b). MHC 부류 II를 발현하는 CD1c+ DC의 비율이 실험군 간에 유사하였지만, CD83 CAR T 세포를 이식한 마우스는 완전히 유의미하게 더 적은 DC를 나타내었다(도 8c, 도 8d). eGFP 태그를 사용하여, 주입된 인간 CD83 CAR T 세포가 제+21일에 쥣과 비장에서 검출 가능하였음을 확인하였다(도 8e).
인간 CD83 CAR T 세포는 병원성 Th1 세포를 유의미하게 감소시키며 Treg:Tconv 비를 증가시킨다. 제+21일에, CD83 CAR T 세포로 처리한 마우스의 비장에서 인간 CD4+의 총량의 유의미한 감소가 있었다(도 9a, 도 9b). 시험관 내에서 DC-동종자극 후에 CD83+, CD4+ Tconv의 유의미한 양이 존재하였기 때문에, 단독의 PBMC 또는 모의 형질도입된 T 세포로 처리된 마우스에서 제+21일에 CD83+ Tconv가 증가하였음을 확인하였다(도 9c). 더욱이, CD83+ Tconv의 양이 생체 내에서 CD83 CAR T 세포의 수여자에서 유의미하게 감소되었다(도 9c). 개별 실험에서, NSG 마우스에게 인간 T 세포를 단독으로 또는 T 세포에 더하여 수지상 세포를 이식하였다. 수지상 세포의 결여가 GVHD 발병을 약간 지연시켰지만, GVHD 생존 중간값은 둘 모두의 그룹에서 유사하였다. 따라서, CD83 CAR T가 주로 GVHD에 연루되는 동종반응성 Tconv를 제거함으로서 수여자를 GVHD로부터 보호한다고 추정되었다(도 9c). 쥣과 비장 내의 인간 Treg의 빈도는 제+21일에 모든 실험군에서 유사하였다(도 9d). 총 CD4+ T 세포의 감소와 유사하게, Treg의 절대 개수는 CD83 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 유의미하게 감소하였다(도 9d, 도 9e). 그러나, Treg 대 동종반응성 Tconv의 비는 CD83 CAR T 세포를 제공한 마우스에서 유의미하게 증가하였다(도 9f). Th1 세포는 GVHD 발병에 기여한다. 중요한 것은, CD83 CAR T 세포로 처리된 마우스가 인간 Th1 세포의 극심한 감소를 나타내었다는 것이다(도 9g, 도 9h). 또한, 비장-내재, 인간 Th2 세포의 양은 또한 CD83 CAR T 세포를 주사한 마우스에서 유의미하게 감소하였다(도 9g, 도 9i). 역으로, CD83 CAR T 세포는 단독의 PBMC 또는 모의 형질도입된 CAR에 비하여, 쥣과 비장에서 인간 Th17 세포의 양을 억제하지 않았다.
인간 CD83 CAR T 세포는 CD8+ 세포독성 T 림프구의 항-종양 활성(CTL)을 유지시킨다. CD4+ T 세포와 같이, 제+21일에 인간 CD8+ T 세포의 총량은 또한 PBMC 및 모의 형질도입된 T 세포를 주사한 마우스에 비하여 PBMC 및 CD83 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 유의미하게 감소하였다(도 10a). CD83 CAR T 세포가 공여자 항-종양 면역에 어떻게 영향을 미치는지를 시험하기 위하여, PBMC에 이어서 모의 형질도입된 T 세포 또는 CD83 CAR T 세포를 마우스에 주사함으로써, K562에 특이적인 인간 CD8 CTL을 생체 내에서 생성하였다. 또한, 마우스에는 제0일 및 제+10일에 조사된 K562의 접종물을 제공하였다. 대조군에는 PBMC를 단독으로 제공하였다. 마우스를 제+12일에 인도적으로 안락사시키고, CD8+ T 세포를 수여자 비장으로부터 정제하였다. 신선한 K562 세포에 대한 특이적인 종양 용해를 xCELLigence 플랫폼을 사용하여 시험관 내에서 평가하였다. 인간 PBMC 및 조사된 K562 세포를 주사한 모든 마우스는 PBMC를 단독으로 이식한 대조군 마우스에 비하여, 그들의 비장으로부터 정제된 CD8 CTL에 의한 온전한 사멸을 나타내었다(도 10b). 흥미로운 점은, 인간 CD83 CAR T 세포로 처리된 세포가 PBMC로 단독으로 또는 모의 T 세포로 처리된 마우스에 비하여, 뛰어난 CD8 CTL-매개된 항-종양 활성을 나타내었다는 점이다(도 10b).
논의
GVHD를 예방하기 위한 세포 면역요법으로서 CAR T 세포를 이용하는 것은 약리학적 면역 억제 또는 공여자 Treg의 입양 전달과 별개의 혁신적인 전략이다. CD83을 발현하는 세포의 표적화는 염증성, 성숙 DC 및 동종반응성 CD4+ T 세포의 이식 수여자를 효율적으로 고갈시킨다. 공여자 수지상 세포-고갈이 개별 이종 실험에서 GVHD를 감소시키지 않기 때문에, 기계적으로, 동종반응성 Tconv의 생체 내 제거는 이들 CAR T 세포의 효능을 유도할 수 있다. 더욱이, CD83 CAR T 세포는 인간 세포용해 CD8+ T 세포의 항-종양 활성을 손상시키지 않는다. CD8 T 세포가 CD83 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 감소되었지만, 이들 마우스로부터의 CTL은 향상된 종양 사멸을 나타내었다. CD83 CAR T 세포에 의한 동종반응성 T 이펙터의 생체 내 고갈은 또한, Treg:활성화된 Tconv 비의 유의미한 증가를 매개한다.
CD83 CAR T 세포는 생체 내에서 병원성 인간 Th1 및 Th2 세포를 유의미하게 감소시킨다. STAT4 및 STAT6 낙아웃 공여자 T 세포를 사용한 실험에 의해, Th1 및 Th2 세포가 마우스에서 독립적으로 치명적인 GVHD를 매개하는 것이 나타났다(문헌[Nikolic B., et al. J Clin Invest 2000 105:1289-1298]). 또한, 생체 내에서 Th1 및 Th2 세포의 조합은 쥣과 GVHD를 협동적으로 악화시켰다(문헌[Nikolic B., et al. J Clin Invest 2000 105:1289-1298]). 부분적으로, Th1 및 Th2 세포는 각각 장 및 폐에 대하여 조직-특이적 손상을 야기한다(문헌[Yi T., et al., Blood 2009 114:3101-3112]). 공여자 Th1 반응을 표적화하기 위한 신규한 전략이 현재 존재하며, 대부분 p40 사이토카인 중화 또는 관련 다운스트림 수용체 신호 전달의 저해에 의해 유도된다(문헌[Pidala J., et al., Haematologica 2018 103:531-539]; 문헌[Fu J., et al., J Immunol 2016 196:3168-3179]; 문헌[Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2018 115:1582-1587]; 문헌[Betts B.C., et al., Sci Transl Med. 2017 9(372)]; 문헌[Betts B.C., et al., Front Immunol. 2018 9:2887]). 그러나, 공여자 Th1 및 Th2 세포에 의한 병원성 반응을 동시에 표적화하는 접근법은 거의 없다. 역으로, JAK2, 즉, Th1 및 Th2 분화를 위한 관련 신호전달 분자의 맥락에서; 그의 중화 또는 저해는 Th1 세포의 억제를 제공하는 한편, Th2 세포를 유의미하게 증가시킨다(문헌[Betts B.C., et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2018 115:1582-1587]). 따라서, 인간 CD83 CAR T 세포는 alloHCT 이후에 공여자 Th1/Th2 반응을 동시에 억제하기 위한 신규한 세포 생성물을 나타낸다.
개시된 데이터는 인간 CD83 CAR T 세포가 활성화된 Tconv 및 GVHD 사망으로부터의 지속적인 보호를 제공한다는 것을 뒷받침한다. CD83이 인간 Treg 상에서 유의미하게 발현되지 않지만, 인간 CD83 CAR T 세포로 처리된 마우스는 감소된 양의 Treg를 나타내었다. 이것은 iTreg 분화를 위한 CD4+ T 세포 전구체의 제한된 이용 가능성 또는 순환하는 공여자 T 세포의 전반적인 감소에 의한 감소된 IL-2 농도 때문일 수 있다. 설치류에서, CD83은 생체 내에서 Treg 안정성에 참여하고, CD83-결핍 Treg를 보유한 마우스는 자가면역 증후군에 걸리기 쉽다(문헌[Doebbeler M., et al. JCI Insight. 2018 3(11)]). 그러나, 이종이식 실험에서, 인간 Treg 대 활성화된 Tconv의 비는 대조군에 비하여 CD83 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 유의미하게 증가하였다. Treg 대 Tconv의 비의 증가는 임상적으로 적절한 면역 지표이며, 심지어 Treg-지향된 GVHD 요법, 예컨대 저용량 IL-2에 대한 반응과 상호관련된다(문헌[Koreth J., et al., Blood 2016 128:130-137]). 더욱이, 인간 CD83 CAR T 세포는 잘 용인되었으며, 생체 내에서 면역-매개된 기관 손상을 없앴다. 따라서, CD83의 역할은 쥣과와 인간 Treg에서 상이할 수 있다.
흥미로운 점은, CD83 CAR T 세포의 수여자가 대조군에 비하여 그들의 비장 내에 유사한 양의 인간 Th17 세포를 가졌다는 점이다. GVHD 발병에서의 Th17 세포의 역할은 Th1 세포에 비하여 덜 분명하다. 마우스에서, 동종이계 Th17 세포는 치명적인 GVHD를 유도할 수 있다. Th17 세포에 대한 중요한 전사 인자인 공여자 T 세포 RORγt의 결핍은 GVHD를 증가시키고, 이를 제거하지 않는다(문헌[Yu Y., et al., Blood 2011 118:5011-5020]). 그러나, IL-17A는 또한 부분적으로 T 세포 활성화를 조절하는 세마포린 6d 및 4b의 감소로 인하여, 점막-연관 불변 T(MAIT) 세포에 의해 생성되는 경우 GVHD에서 보호적일 수 있다(문헌[Varelias A., et al., J Clin Invest 2018 128:1919-1936]). 더욱이, IL-17은 또한 염증성 대장염의 쥣과 모델에서 Th1 반응을 억제하는 것으로 나타났다(문헌[O'Connor, Jr. W. et al., Nat Immunol 2009 10:603-609]). 따라서, CD83 CAR T 세포에 의한 인간 Th17 세포의 보존은 GVHD 사망률의 전반적인 감소에 기여할 수 있다.
CD83은 독특한 면역 조절 분자이다. 마우스에서, 용해성 CD83은 인돌아민 2,3-디옥시게나제- 및 TGFβ-메커니즘을 통해 Treg 반응을 향상시킴으로써 면역 억제 효과를 매개한다(문헌[Bock F., et al., J Immunol 2013 191:1965-1975]). 인간 CD83의 세포외 도메인은 또한 시험관 내에서 동종반응성 T 세포 증식을 손상시키는 것으로 나타났다(문헌[Lechmann M., et al., J Exp Med 2001 194:1813-1821]). 역으로, 모노클로널 항체, 3C12C를 사용한 CD83의 직접적인 중화는 생체 내에서 인간 T 세포에 의해 매개되는 이종 GVHD를 유의미하게 감소시킨다(문헌[Wilson J., et al., J Exp Med 2009 206:387-398]). CD83 항체는 또한 공여자, 인간 CD8+ T 세포에 의한 Treg 및 항바이러스 반응을 보존한다(문헌[Seldon T.A., et al., Leukemia 2016 30:692-700]). 이것은 용해성 CD83이 면역 억제 특성을 가질 수 있지만, CD83의 세포 표면 발현의 표적화가 주요 이펙터 및 Treg 기능을 유지하면서 GVHD를 예방할 수 있는 것을 뒷받침한다. 개시된 CD83 CAR T 세포는 모노클로널 항체, 3C12C와는 별개이다. 2가지 접근법 간의 가장 큰 기능적 차이는 CD83 CAR T 세포가 NK-세포 매개된 항체-의존성 세포성 세포독성의 필요 없이 그의 표적을 사멸시킨다는 점이다(문헌[Seldon T.A., et al., Leukemia 2016 30:692-700]). 이것은 동종반응성 T 세포 및 성숙 DC의 신속하고 효율적인 제거가 GVHD를 예방하기 위하여 필요한 경우에 유리하다. 더욱이, CD83 CAR T 세포에 의한 보호 효과는 이식 후 3개월에 90% 초과의 생존을 제공한 반면, CD83 모노클로널 항체를 사용한 공개된 데이터는 보호 효과를 대략 50% 생존을 갖는 제30일로 제한한다.
결론적으로, CD83 CAR T 세포는 GVHD를 예방하기 위해 설계된 처음의 예정된 세포용해 이펙터 세포를 나타낸다. CD83 CAR T 세포는 GVHD 예방에서 적용 가능하지만, 고형 기관 및 혈관분포 복합 동종이식편 거부의 예방에서 이점을 갖는 것으로도 예상된다. CD83 CAR T 세포는 조혈 세포 및 고형 기관 공여자 선택에서 HLA 불일치의 장벽을 극복하고, 필요한 환자에게 치유적인 이식 수술의 적용을 크게 확장시킬 수 있다. 중요한 것은, CD83 CAR T 세포가 광범위 억제성, 비선택적 칼시뉴린-저해제 또는 글루코코르티코이드의 필요 없이 동종반응성 T 세포를 제거하는 플랫폼을 제공한다는 점이다. 따라서, CD83 CAR T 세포는 동종-HCT 이후에 이식-관련 사망률을 감소시키고 결과를 개선시킬 가능성이 높다.
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SEQUENCE LISTING <110> H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, Inc. <120> CD83-BINDING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> 320803-2200 <150> US 62/634,435 <151> 2018-02-23 <150> US 62/677,783 <151> 2018-05-30 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gly Phe Ser Ile Thr Thr Gly Gly Tyr Trp Trp Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Gly Tyr Ile Phe Ser Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Ile Lys 1 5 10 15 Ser <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Lys Leu Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Val Asn Ser Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp 1 5 10 <210> 6 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Gly Tyr Trp Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Gln Lys Leu Glu 35 40 45 Trp Met Gly Tyr Ile Phe Ser Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Ile Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Gly Asp Thr Ala Arg Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Lys Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ala Ser Ala Ser Leu Gly Asn Ser Val Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser 145 150 155 160 Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Tyr Gln Gln His Pro Asp 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Tyr Val Met Tyr Val Asn Ser Asp Gly Ser His Ser 180 185 190 Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala 195 200 205 His Arg Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp 210 215 220 Tyr Phe Cys Gly Ser Ser Asp Ser Ser Gly Tyr Val Phe Gly Ser Gly 225 230 235 240 Thr Gln Leu Thr Val Leu 245

Claims (18)

  1. CD83 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 세포내 신호전달 도메인 및 공동-자극 신호전달 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD83 항원 결합 도메인이 CD83에 특이적으로 결합하는 항체의 단일-쇄 가변 단편(scFv)인 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항-CD83 scFv가 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 갖는 가변 중쇄(VH) 도메인 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 갖는 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하며, 상기 VH 도메인의 CDR1 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:13을 포함하며; 상기 VH 도메인의 CDR2 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:14를 포함하며; 상기 VH 도메인의 CDR3 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9 또는 SEQ ID NO:15를 포함하며; 상기 VL의 CDR1 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:16을 포함하며; 상기 VL 도메인의 CDR2 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:17을 포함하며; 상기 VL 도메인의 CDR3 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:18을 포함하는 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항-CD83 scFv VH 도메인이 아미노산 서열 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52 또는 SEQ ID NO:53을 포함하는 폴리펩타이드.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 항-CD83 scFv VL 도메인이 아미노산 서열 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:54 또는 SEQ ID NO:55를 포함하는 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD83 scFv가 아미노산 서열 SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70 또는 SEQ ID NO:71을 포함하는 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공동자극 신호전달 영역이 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극 분자의 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR 폴리펩타이드가 하기 화학식에 의해 정의되는 폴리펩타이드:
    SP-CD83-HG-TM-CSR-ISD; 또는
    SP-CD83-HG-TM-ISD-CSR.
    (상기 식에서,
    "SP"는 신호 펩타이드를 나타내고,
    "CD83"은 CD83-결합 영역을 나타내고,
    "HG"는 선택적인 힌지 도메인을 나타내고,
    "TM"은 막횡단 도메인을 나타내고,
    "CSR"은 공동-자극 신호전달 영역을 나타내고,
    "ISD"는 세포내 신호전달 도메인을 나타내고,
    "-"는 2가 링커를 나타낸다)
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 CD3 제타(CD3ζ) 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산 서열.
  11. 제10항의 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  12. 제11항의 벡터를 포함하는 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포가 αβT 세포, γδT 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, B 세포, 선천 림프계 세포(ILC), 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 림포카인 활성화된 살해(LAK) 세포, 조절 T 세포 또는 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 상기 CAR의 항원 결합 도메인이 CD83에 결합하는 경우 동종반응성(alloreactive) 공여자 세포를 억제하는 세포.
  15. 이식 공여자 세포를 받고 있는 대상체에서의 동종반응성 공여자 세포의 억제 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩타이드를 발현하도록 유전학적으로 변형된, 유효량의 면역 이펙터 세포를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 동종반응성 공여자 세포를 억제하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포가 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL) 및 조절 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 공여자 세포가 동종반응성 T-세포, 수지상 세포 또는 그들의 조합을 포함하는 골수 세포인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 체크포인트 저해제가 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체 또는 그들의 조합을 포함하는 방법.
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