CN115279766A - 包含a2a/a2b和pd-1/pd-l1抑制剂的组合疗法 - Google Patents

包含a2a/a2b和pd-1/pd-l1抑制剂的组合疗法 Download PDF

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Abstract

本申请提供使用A2A和/或A2B抑制剂和PD‑1和/或PD‑L1抑制剂的组合治疗癌症的方法。

Description

包含A2A/A2B和PD-1/PD-L1抑制剂的组合疗法
技术领域
本文公开包含A2A/A2B抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂的组合疗法，以及使用所述组合疗法治疗病症(例如癌症)的方法。
背景技术
一些癌症患者具有较差的长期预后和/或对此项技术中常用的一种或多种类型的治疗有抗性。因此，在这个难以治疗的患者群体中仍然需要具有增加的功效和改善的安全性概况的有效癌症疗法。
发明内容
本申请尤其提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂。
根据说明书和权利要求书，将明了本发明的其它特征、目的和优点。
附图说明
图1A-1C显示在与原代T细胞共培养的CHO-PD-L1中，化合物9与(1A)派姆单抗(pembrolizumab)、(1B)抗体X和(1C)化合物Y的协同效应(参见实施例1)。
图2A-2D显示在用CD3抗体刺激的PBMC中，化合物9或化合物3A与阿替利珠单抗(atezolizumab)的协同效应。
图3A-3C显示在临床前CT26和B16-F10肿瘤模型中化合物9和抗PD1(针对鼠类PD-1的克隆29F.1A12)的抗肿瘤效应。(3A)10mg/kg BID化合物9在CT26同基因模型中作为单剂和与抗PD1抗体的组合的功效研究。(3B)10mg/kg BID化合物9在CT-26NSG异种移植物模型中的功效研究。(3C)10mg/kg BID化合物9在B16同基因模型中作为单剂和与抗PD-L1抗体的组合的功效研究。
具体实施方式
本申请提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂。
A2A/A2B抑制剂
腺苷是可通过许多免疫细胞类型调节免疫反应的细胞外信号传导分子。Drury和
Figure BDA0003804213750000021
首次将腺苷识别为冠状血管紧张性的生理调控剂(Sachdeva,S.和Gupta,M.Saudi Pharmaceutical Journal,2013,21,245-253)，然而，直到1970年Sattin和Rall才表明腺苷经由占据细胞表面上的特定受体来调控细胞功能(Sattin,A.和Rall,T.W.,1970.Mol.Pharmacol.6,13-23；Hasko′,G.等人，2007,Pharmacol.Ther.113,264-275)。
腺苷在多种其它生理功能中起重要作用。它在连接到三个磷酸基团时参与核酸的合成；它形成细胞能量系统的整体组分ATP。腺苷可通过细胞外ATP的酶分解产生，或者还可通过穿过受损质膜从受损神经元和神经胶质细胞释放(Tautenhahn,M.等人，Neuropharmacology,2012,62,1756-1766)。在外周神经系统和在中枢神经系统中，腺苷通过作用于定位于细胞膜上的特定受体产生多种药理学效应(Matsumoto,T.等人，Pharmacol.Res.,2012,65,81-90)。已描述细胞外腺苷产生的替代途径。这些途径包括通过CD38、CD203a和CD73的协同作用从烟酰胺二核苷酸(NAD)而不是ATP产生腺苷。腺苷的CD73非依赖性产生还可通过其它磷酸酯(例如碱性磷酸酶或前列腺特异性磷酸酶)来进行。
人类腺苷受体存在四种已知亚型，包括A1、A2A(ADORA2A)、A2B(ADORA2B)和A3受体。A1和A2A是高亲和力受体，而A2B和A3是低亲和力受体。腺苷和其激动剂可经由这些受体中的一者或多者起作用，并且可调节腺苷酸环化酶的活性，所述酶负责增加环状AMP(cAMP)。不同受体对这种酶具有差异刺激和抑制效应。细胞内cAMP浓度增加可抑制免疫细胞和炎症细胞的活性(Livingston,M.等人，Inflamm.Res.,2004,53,171-178)。
A2A腺苷受体可在外周神经系统和CNS中进行信号传导，其中激动剂用作抗炎症药物并且拮抗剂用于神经退化性疾病(Carlsson,J.等人，J.Med.Chem.,2010,53,3748-3755)。在大多数细胞类型中，A2A亚型抑制细胞内钙水平，而A2B加强细胞内钙水平。A2A受体通常似乎抑制免疫细胞的炎症反应(Borrmann,T.等人，J.Med.Chem.,2009,52(13),3994-4006)。
A2B受体在胃肠道、膀胱、肺中以及在肥大细胞上高表达(Antonioli,L.等人，Nature Reviews Cancer,2013,13,842-857)。A2B受体尽管在结构上与A2A受体密切相关并且能够活化腺苷酸环化酶，但其功能不同。假设这种亚型可利用除腺苷酸环化酶外的信号转导系统(Livingston,M.等人，Inflamm.Res.,2004,53,171-178)。在所有腺苷受体中，A2B腺苷受体被视为低亲和力受体，认为它在生理条件下保持沉默并且因细胞外腺苷水平增加而被活化(Ryzhov,S.等人，Neoplasia,2008,10,987-995)。A2B腺苷受体的活化可分别通过活化Gs和Gq蛋白刺激腺苷酸环化酶和磷脂酶C。还已描述与促分裂原活化的蛋白激酶偶合(Borrmann,T.等人，J.Med.Chem.,2009,52(13),3994-4006)。
在免疫系统中，腺苷信号传导的参与可为保护组织免于过度免疫反应的关键调控机制。腺苷可通过许多免疫细胞类型负调节免疫反应，所述免疫细胞类型包括T细胞、自然杀手细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞和骨髓源性抑制细胞(Allard,B.等人，CurrentOpinion in Pharmacology,2016,29,7-16)。
在肿瘤中，这种途径被肿瘤微环境劫持并且破坏免疫系统的抗肿瘤能力，从而促进癌症进展。在肿瘤微环境中，腺苷主要通过两种外核苷酸酶CD39和CD73从细胞外ATP产生。多种细胞类型可通过表达CD39和CD73产生腺苷。肿瘤细胞、T效应细胞、T调控细胞、肿瘤相关巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、内皮细胞、癌症相关纤维母细胞(CAF)和间充质基质/干细胞(mesenchymal stromal/stem cell，MSC)就是这种情况。另外，肿瘤微环境常见的疾患低氧和炎症诱导CD39和CD73的表达，从而使腺苷产生增加。因此，实体肿瘤中的腺苷水平高于正常生理条件。
A2A主要在淋巴源性细胞(包括T效应细胞、T调控细胞和自然杀手(NK)细胞)上表达。阻断A2A受体可防止使T细胞暂时失活的下游免疫抑制信号。A2B受体主要在单核细胞源性细胞(包括树突细胞、肿瘤相关巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSC)和间充质基质/干细胞(MSC))上表达。阻断临床前模型中的A2B受体可抑制肿瘤生长，阻断转移，并且增加肿瘤抗原的呈递。
就ADORA2A/ADORA2B(A2A/A2B)阻断的安全性概况来说，A2A和A2B受体剔除(KO)小鼠都为活的，这表明无生长异常并且为可孕的(Allard,B.等人，Current Opinion inPharmacology,2016,29,7-16)。A2A KO小鼠展示，仅在用脂多糖(LPS)激发后促炎症细胞因子的水平增加并且无基线炎症的证据(Antonioli,L.等人，Nature Reviews Cancer,2013,13,842-857)。A2B KO小鼠展现正常的血小板、红细胞和白细胞计数，但基线炎症(例如TNF-α和IL-6)增加(Antonioli,L.等人，Nature Reviews Cancer,2013,13,842-857)。在LPS处理后检测到TNF-α和IL-6的产生进一步增加。A2B KO小鼠还展现增加的调介炎症以及白细胞粘附/滚动的血管粘附分子；增强的肥大细胞活化；增加的IgE介导的过敏反应的敏感性以及低氧下增加的血管渗漏和嗜中性粒细胞流入(Antonioli,L.等人，Nature ReviewsCancer,2013,13,842-857)。
腺苷途径是保护组织免于过度免疫反应的关键免疫抑制途径(Antonioli,L.等人，Nature Review Cancer.2013,13,842-857；Inflamm.Res.2004,53:171-178；Allard等人，Current Opinion in Pharmacology 2016,29:7)。腺苷的免疫抑制活性通过两种G蛋白偶联受体(GPCR)(称为A2A和A2B)来调介；发现两种受体在许多免疫细胞类型(包括T细胞、自然杀手细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞和骨髓源性抑制细胞)上表达(SaudiPharmaceutical Journal.2013,21:245；Frontiers in Immunology.2019,10:925；J ClinInvest.2017,127(3):929；Neoplasia.2008,10:987；Neoplasia.2013,15:1400)。作为在肿瘤微环境中观察到高水平的腺苷产生的结果，已报道免疫系统的抗肿瘤能力受到抑制，从而引起癌症进展。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂是选自表1的化合物或其药学上可接受的盐。
表1.
Figure BDA0003804213750000051
Figure BDA0003804213750000061
Figure BDA0003804213750000071
Figure BDA0003804213750000081
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂是式(I)化合物：
Figure BDA0003804213750000091
或其药学上可接受的盐，其中
Cy1是苯基，其经1或2个独立地选自卤基和CN的取代基取代；
Cy2是5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基，其中Cy2的5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个各自独立地选自以下的基团取代：C1-3烷基、C1-3烷氧基、NH2、NH(C1-3烷基)和N(C1-3烷基)2；
R2选自苯基-C1-3烷基-、C3-7环烷基-C1-3烷基-、(5-7元杂芳基)-C1-3烷基-、(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基-和ORa2，其中R2的苯基-C1-3烷基-、C3-7环烷基-C1-3烷基-、(5-7元杂芳基)-C1-3烷基-和(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基-各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的RC取代基取代；
Ra2是(5-7元杂芳基)-C1-3烷基-，其任选地经1或2个经独立选择的RC取代基取代；
每个RC独立地选自卤基、C1-6烷基、C6芳基、5-7元杂芳基、(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基-、ORa4和NRc4Rd4；并且
每个Ra4、Rc4和Rd4独立地选自H和C1-6烷基。
在式(I)化合物的一些实施方案中，Cy2是嘧啶基。
在式(I)化合物的一些实施方案中，R2选自吡啶-2-基甲基、(2,6-二氟苯基)(羟基)甲基、(5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基、(3-甲基吡啶-2-基)甲氧基和(5-(1H-吡唑-1-基)-1H-四唑-1-基)甲基。
在一些实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物1，表1)。
在一些实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物2，表1)。
在一些实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物3A，表1)。
在一些实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物3B，表1)。
在一些实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((3-甲基吡啶-2-基)甲氧基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物4，表1)。
在一些实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐是3-(2-((5-(1H-吡唑-1-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物21A，表1)。
在一些实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐是3-(2-((5-(1H-吡唑-1-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物21B，表1)。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂选自：
3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(5-氨基-2-((3-甲基吡啶-2-基)甲氧基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
3-(2-((5-(1H-吡唑-1-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
式(I)化合物的合成和表征可参见WO2019/168847和US62/891,685，二者的全文都以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂是式(II)化合物：
Figure BDA0003804213750000111
或其药学上可接受的盐，其中
R2选自H和CN；
Cy1是苯基，其经1或2个独立地选自卤基和CN的取代基取代；
L是C1-3亚烷基，其中所述亚烷基任选地经1个、2个或3个经独立选择的R8D取代基取代；
Cy4选自苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基，其中苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基各自任选地经1个、2个或3个独立地选自R8D和R8的取代基取代；
每个R8独立地选自卤基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基、(5-6元杂芳基)-C1-3烷基和(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基，其中R8的C1-6烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基、(5-6元杂芳基)-C1-3烷基和(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R8A取代基取代；
每个R8A独立地选自卤基、C1-6烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、CN、ORa81和NRc81Rd81，其中R8A的C1-3烷基、5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R8B取代基取代；
每个Ra81、Rc81和Rd81独立地选自H、C1-6烷基和4-7元杂环烷基，其中Ra81、Rc81和Rd81的C1-6烷基和4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R8B取代基取代；
每个R8B独立地选自卤基和C1-3烷基；并且
每个R8D独立地选自OH、CN、卤基、C1-6烷基和C1-6卤代烷基。
在一些实施方案中，式(II)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-(羟基(苯基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物5，表1)。
在一些实施方案中，式(II)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物6，表1)。
在一些实施方案中，式(II)化合物或其药学上可接受的盐是5-氨基-7-(3-氰基-2-氟苯基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-8-甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物7，表1)。
在一些实施方案中，式(II)化合物或其药学上可接受的盐是3-(5-氨基-2-((2-氟-6-(((1-甲基-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基)甲基)苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物8，表1)。
式(II)化合物的合成和表征可参见WO2019/222677，其全文都以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂是式(III)化合物：
Figure BDA0003804213750000131
或其药学上可接受的盐，其中
Cy1是苯基，其经1或2个独立地选自卤基和CN的取代基取代；
R2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中R2的5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R2A取代基取代；
每个R2A独立地选自D、卤基、C1-6烷基和C1-6卤代烷基；
R4选自苯基-C1-3烷基-、C3-7环烷基-C1-3烷基-、(5-6元杂芳基)-C1-3烷基-和(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基，其中R4的苯基-C1-3烷基-、C3-7环烷基-C1-3烷基-、(5-6元杂芳基)-C1-3烷基-和(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基-各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R4A取代基取代；
每个R4A独立地选自卤基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、ORa41和NRc41Rd41；并且
每个Ra41、Rc41和Rd41独立地选自H和C1-6烷基。
在一些实施方案中，式(III)化合物或其药学上可接受的盐是3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物9，表1)。
在一些实施方案中，式(III)化合物或其药学上可接受的盐是3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物10，表1)。
在一些实施方案中，式(III)化合物或其药学上可接受的盐是3-(8-氨基-2-(氨基(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物11，表1)。
在一些实施方案中，式(III)化合物或其药学上可接受的盐是3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(2,6-二甲基吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物12，表1)。
式(III)化合物的合成和表征可参见PCT/US2019/040496，其全文都以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂是式(IV)化合物：
Figure BDA0003804213750000151
或其药学上可接受的盐，其中
Cy1是苯基，其经1或2个独立地选自卤基和CN的取代基取代；
Cy2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中Cy2的5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R6取代基取代；
每个R6独立地选自卤基、C1-6烷基和C1-6卤代烷基；
R2是苯基-C1-3烷基-或(5-6元杂芳基)-C1-3烷基-，其中R2的苯基-C1-3烷基-和(5-6元杂芳基)-C1-3烷基-各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R2A取代基取代；并且
每个R2A独立地选自卤基、C1-6烷基和C1-6卤代烷基。
在一些实施方案中，式(IV)化合物或其药学上可接受的盐是3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物13，表1)。
在一些实施方案中，式(IV)化合物或其药学上可接受的盐是3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物14，表1)。
在一些实施方案中，式(IV)化合物或其药学上可接受的盐是3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(吡啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物15，表1)。
在一些实施方案中，式(IV)化合物或其药学上可接受的盐是3-(4-氨基-7-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐(参见化合物16，表1)。
式(IV)化合物的合成和表征可参见US 62/798,180，其全文都以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂是式(V)化合物：
Figure BDA0003804213750000161
或其药学上可接受的盐，其中
R2选自H、D、卤基、C1-6烷基和C1-6卤代烷基；
R3选自H和C1-6烷基；
R4选自H和C1-6烷基；
R5选自H、卤基、CN、C1-6烷基；
R6选自苯基、C3-7环烷基、5-7元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中R6的所述苯基、所述C3-7环烷基、所述5-7元杂芳基和所述4-7元杂环烷基任选地经1个、2个或3个经独立选择的RA取代基取代；
每个RA独立地选自(5-10元杂芳基)-C1-3烷基-和(4-10元杂环烷基)-C1-3烷基-，其中RA的(5-10元杂芳基)-C1-3烷基-和(4-10元杂环烷基)-C1-3烷基-各自任选地经1或2个经独立选择的RB取代基取代；
每个RB独立地选自卤基、C1-6烷基和C(O)Rb26；
Rb26独立地选自H和C1-3烷基，其中Rb26的C1-3烷基任选地经1或2个经独立选择的RC取代基取代；
每个RC独立地选自卤基、C1-6烷基、CN、ORa36和NRc36Rd36；并且
每个Ra36、Rc36和Rd36独立地选自H和C1-6烷基。
在一些实施方案中，式(V)化合物或其药学上可接受的盐是7-(1-((5-氯吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮或其药学上可接受的盐(参见化合物17，表1)。
在一些实施方案中，式(V)化合物或其药学上可接受的盐是3-甲基-7-(1-((5-甲基吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮或其药学上可接受的盐(参见化合物18，表1)。
在一些实施方案中，式(V)化合物或其药学上可接受的盐是3-甲基-9-戊基-7-(1-(噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基甲基)-1H-吡唑-4-基)-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮或其药学上可接受的盐(参见化合物19，表1)。
在一些实施方案中，式(V)化合物或其药学上可接受的盐是7-(1-((2-(2-(二甲基氨基)乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮或其药学上可接受的盐(参见化合物20，表1)。
式(V)化合物的合成和表征可参见US-2019-0337957，其全文都以引用方式并入本文中。
PD-1/PD-L1抑制剂
免疫系统在控制和消灭疾病(例如癌症)方面起重要作用。然而，癌细胞通常产生逃避或抑制免疫系统的策略以有利于其生长。一种这种机制是改变在免疫细胞上表达的共刺激和共抑制分子的表达(Postow等人，J.Clinical Oncology 2015,1-9)。阻断抑制性免疫检查点(例如PD-1)的信号传导已证明为有希望且有效的治疗方式。
程序化死亡-1(“PD-1”，还称为“CD279”)是广泛负调控免疫反应的T细胞调控剂的扩展CD28/CTLA-4家族的约31kD的I型膜蛋白成员(Ishida,Y.等人(1992)EMBO J.11:3887-3895；美国专利公布第2007/0202100号；第2008/0311117号；以及第2009/00110667号；美国专利第6,808,710号；第7,101,550号；第7,488,802号；第7,635,757号；以及第7,722,868号；PCT公布第WO 01/14557号)。
PD-1在活化T细胞、B细胞和单核细胞上表达(Agata,Y.等人(1996)Int.Immunol.8(5):765-772；Yamazaki,T.等人(2002)J.Immunol.169:5538-5545)，并且在自然杀手(NK)T细胞中以低水平表达(Nishimura,H.等人(2000)J.Exp.Med.191:891-898；Martin-Orozco,N.等人(2007)Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)。
PD-1的细胞外区域由与CTLA-4中的等效结构域具有23％一致性的单免疫球蛋白(Ig)V结构域组成(Martin-Orozco,N.等人(2007)Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)。细胞外IgV结构域之后为跨膜区和细胞内尾。细胞内尾含有位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基元和基于免疫受体酪氨酸的转换基元中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负调控TCR信号(Ishida,Y.等人(1992)EMBO J.11:3887-3895；Blank,C.等人(2006)Immunol.Immunother.56(5):739-745)。
PD-1通过与B7-H1和B7-DC结合来调介其对免疫系统的抑制(Flies,D.B.等人(2007)J.Immunother.30(3):251-260；美国专利第6,803,192号；第7,794,710号；美国专利申请公布第2005/0059051号；第2009/0055944号；第2009/0274666号；第2009/0313687号；PCT公布第WO 01/39722号；第WO 02/086083号)。
人类PD-1蛋白的氨基酸序列(Genbank登录号NP_005009)是：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ ID NO:1)。
PD-1具有两个配体，即PD-L1和PD-L2(Parry等人，Mol Cell Biol 2005,9543-9553；Latchman等人，Nat Immunol 2001,2,261-268)，并且它们的表达模式有所不同。PD-L1蛋白回应于脂多糖和GM-CSF处理在巨噬细胞和树突细胞上调，并且在T细胞受体和B细胞受体信号传导后在T细胞和B细胞上调。PD-L1还在几乎所有的肿瘤细胞上高表达，并且表达在IFN-γ处理后进一步增加(Iwai等人，PNAS2002,99(19):12293-7；Blank等人，CancerRes 2004,64(3):1140-5)。实际上，肿瘤PD-L1表达状况已显示为多个肿瘤类型中的预后(Wang等人，Eur J Surg Oncol 2015；Huang等人，Oncol Rep 2015；Sabatier等人，Oncotarget 2015,6(7):5449-5464)。相比之下，PD-L2表达更受限并且主要由树突细胞表达(Nakae等人，J Immunol 2006,177:566-73)。PD-1与其T细胞上的配体PD-L1和PD-L2连结递送抑制IL-2和IFN-γ产生以及T细胞受体活化后诱导的细胞增殖的信号(Carter等人，Eur J Immunol 2002,32(3):634-43；Freeman等人，J Exp Med 2000,192(7):1027-34)。机制涉及募集SHP-2或SHP-1磷酸酶以抑制T细胞受体信号传导，例如Syk和Lck磷酸化(Sharpe等人，Nat Immunol 2007,8,239-245)。PD-1信号传导轴的活化还减弱PKC-θ活化环磷酸化，它是活化NF-κB和AP1途径以及细胞因子产生(例如IL-2、IFN-γ和TNF)所必需(Sharpe等人，Nat Immunol 2007,8,239-245；Carter等人，Eur J Immunol 2002,32(3):634-43；Freeman等人，J Exp Med 2000,192(7):1027-34)。
来自临床前动物研究的若干条证据指示，PD-1和其配体负调控免疫反应。已显示PD-1缺陷性小鼠罹患狼疮样肾小球肾炎和扩张型心肌病(Nishimura等人，Immunity 1999,11:141-151；Nishimura等人，Science 2001,291:319-322)。使用慢性感染的LCMV模型已显示，PD-1/PD-L1相互作用抑制病毒特异性CD8 T细胞的效应功能的活化、扩大和获取(Barber等人，Nature 2006,439,682-7)。总之，这些数据支持阻断PD-1介导的抑制性信号传导级联以加强或“拯救”T细胞反应的治疗方法的开发。因此，需要新的阻断PD-1/PD-L1蛋白/蛋白相互作用，由此治疗受试者癌症的方法。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂是选自以下的化合物：尼沃鲁单抗(nivolumab，
Figure BDA0003804213750000201
BMS-936558、MDX1106或MK-34775)、派姆单抗(
Figure BDA0003804213750000202
MK-3475、SCH-900475、拉波里单抗(lambrolizumab)，CAS登记号1374853-91-4)、阿替利珠单抗(
Figure BDA0003804213750000203
CAS登记号1380723-44-3)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab，
Figure BDA0003804213750000204
)、西米普利单抗(cemiplimab)、AMP-224、AMP-514/MEDI-0680、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、BGB-A317、BMS936559、德瓦鲁单抗、JTX-4014、SHR-1210、匹利珠单抗(pidilizumab，CT-011)、REGN2810、BGB-108、BGB-A317、SHR-1210(HR-301210、SHR1210或SHR-1210)、BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736、MSB0010718C、MDX1105-01以及以下专利中所述的一种或多种PD-1/PD-L1阻断剂：美国专利第7,488,802号、第7,943,743号、第8,008,449号、第8,168,757号、第8,217,149号或公布第WO 03042402号、第WO 2008/156712号、第WO 2010/089411号、第WO 2010/036959号、第WO2011/066342号、第WO 2011/159877号、第WO 2011/082400号、第WO 2011/161699号、第WO2017/070089号、第WO 2017/087777号、第WO 2017/106634号、第WO 2017/112730号、第WO2017/192961号、第WO 2017/205464号、第WO 2017/222976号、第WO 2018/013789号、第WO2018/04478号、第WO 2018/119236号、第WO 2018/119266号、第WO 2018/119221号、第WO2018/119286号、第WO 2018/119263号、第WO 2018/119224号、第WO 2019/191707号和第WO2019/217821号，以及其任何组合。前述专利、申请和公布中每一者的公开内容的全文都以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂选自如WO 2018/119266中所公开的化合物，例如
(S)-1-((7-氯-2-(2'-氯-3'-(5-(((2-羟基乙基)氨基)甲基)甲吡啶酰胺基)-2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)哌啶-2-甲酸或其药学上可接受的盐；
(S)-1-((7-氯-2-(3'-(7-氯-5-(((S)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)苯并[d]噁唑-2-基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐；
(S)-1-((2-(2'-氯-3'-(1,5-二甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-2-甲基联苯-3-基)-7-氰基苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(2,2'-二甲基-3'-(4,5,6,7-四氢噻唑并[5,4-c]吡啶-2-基)联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(5-(2-(二甲基氨基)乙酰基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐；以及
1-((7-氰基-2-(3'-(5-(2-(二甲基氨基)乙酰基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)哌啶-4-甲酸或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂是(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐。
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐在本文中还称为化合物Y。化合物Y的合成和表征公开于WO 2018/119266中，其全文都以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂选自：
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸氢溴酸盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸草酸盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸盐酸盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸L-酒石酸盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸丙二酸盐；以及
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸磷酸盐。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂选自WO 2018/119224中所公开的化合物，例如
(S)-1-((2-(2'-氯-3'-(1,5-二甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-2-甲基联苯-3-基)-7-氰基苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐；
(R)-1-((2-(2'-氯-3'-(6-异丙基-4,5,6,7-四氢-2H-吡唑并[3,4-c]吡啶-2-基)-2-甲基联苯-3-基)-7-氰基苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐；
(S)-N-(2-氯-3'-(5-(2-羟基丙基)-1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-2'-甲基联苯-3-基)-5-异丙基-1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺或其药学上可接受的盐；
顺式-4-((2-((2,2'-二氯-3'-(1-甲基-5-(四氢-2H-吡喃-4-基)-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-[1,1'-联苯]-3-基)氨甲酰基)-1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)甲基)环己烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐；
反式-4-(2-(2-((2,2'-二氯-3'-(5-(2-羟基乙基)-1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-[1,1'-联苯]-3-基)氨甲酰基)-1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)环己烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐；
反式-4-(2-(2-((2-氯-2'-甲基-3'-(1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-[1,1'-联苯]-3-基)氨甲酰基)-1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)环己烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐；以及
顺式-4-((2-(2-氯-3'-(5-(2-(乙基(甲基)氨基)乙酰基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2'-甲基联苯-3-基氨甲酰基)-1-甲基-6,7-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5(4H)-基)甲基)环己烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂选自WO 2019/191707中所公开的化合物，例如
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(7-((3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-2-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)哌啶-4-甲酸或其药学上可接受的盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(7-(((S)-1-羟基丙-2-基氨基)甲基)-2-甲基吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(2-(二氟甲基)-7-((3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)哌啶-4-甲酸或其药学上可接受的盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(2-(二氟甲基)-7-((3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)-N,N-二甲基哌啶-4-甲酰胺或其药学上可接受的盐；
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(2-环丙基-7-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐；以及
(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂选自WO 2019/217821中所公开的化合物，例如
4-(2-(2-((2,2'-二氯-3'-(1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-[1,1'-联苯]-3-基)氨甲酰基)-1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)二环[2.2.1]庚烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐；
4-(2-(2-((3'-(5-((1H-吡唑-3-基)甲基)-1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-2,2'-二氯-[1,1'-联苯]-3-基)氨甲酰基)-1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)二环[2.2.1]庚烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐；
(R)-4-(2-(2-((2,2'-二氯-3'-(5-(2-羟基丙基)-1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-[1,1'-联苯]-3-基)氨甲酰基)-1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)二环[2.2.1]庚烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐；
4,4'-(((((2,2'-二氯-[1,1'-联苯]-3,3'-二基)双(氮烷二基))双(羰基))双(1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2,5-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(二环[2.2.1]庚烷-1-甲酸)或其药学上可接受的盐；
4-(2-(2-((2-氯-2'-甲基-3'-(1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-[1,1'-联苯]-3-基)氨甲酰基)-1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)二环[2.2.1]庚烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐；
4-(2-(2-((2,2'-二甲基-3'-(1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-[1,1'-联苯]-3-基)氨甲酰基)-1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)二环[2.2.1]庚烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐；以及
4-(2-(2-((3'-(5-(反式-4-羧基-4-甲基环己基)-1-甲基-4,5,6,7-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲酰胺基)-2,2'-二氯-[1,1'-联苯]-3-基)氨甲酰基)-1-甲基-1,4,6,7-四氢-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)二环[2.2.1]庚烷-1-甲酸或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂是派姆单抗。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂是尼沃鲁单抗。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂是阿替利珠单抗。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂是抗体X。如本文所用的抗体X是结合到人类PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。参见WO2017019846中的hPD-1mAb 7(1.2)，其全文都以引用方式并入本文中。下文显示成熟抗体X重链和轻链的氨基酸序列。可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域的互补决定区(CDR)1、2和3以成熟VL和VH序列的N末端到C末端的顺序显示，加下划线并且加粗。由下文所列成熟重链(SEQ ID NO:2)和成熟轻链(SEQ ID NO:3)组成的抗体称为抗体X。
成熟抗体X重链(HC)
Figure BDA0003804213750000261
Figure BDA0003804213750000271
成熟抗体X轻链(LC)
Figure BDA0003804213750000272
抗体X的可变重链(VH)结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0003804213750000273
抗体X的可变轻链(VL)结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0003804213750000274
下文列出抗体X的VH CDR的氨基酸序列：
VH CDR1：SYWMN(SEQ ID NO:6)；
VH CDR2：VIHPSDSETWLDQKFKD(SEQ ID NO:7)；
VH CDR3：EHYGTSPFAY(SEQ ID NO:8)
下文列出抗体X的VL CDR的氨基酸序列：
VL CDR1：RASESVDNYGMSFMNW(SEQ ID NO:9)；
VL CDR2：AASNQGS(SEQ ID NO:10)；以及
VL CDR3：QQSKEVPYT(SEQ ID NO:11)。
如本文所用的“QD”意指每天一次施用于受试者的剂量。“QOD”意指每隔一天一次施用于受试者的剂量。“QW”意指每周一次施用于受试者的剂量。“Q2W”意指每隔一周一次施用于受试者的剂量。“Q3W”意指每三周一次施用于受试者的剂量。“Q4W”意指每四周一次施用于受试者的剂量。
如本文所用的“约”在提及可测量值(例如量、剂量、时间长度等)时打算涵盖±10％的变化。在某些实施方案中，“约”可包括与指定值相差±5％、±1％或±0.1％的变化及其之间的任何变化，这是因为此类变化适于实施所公开的方法。
在一些实施方案中，本文所公开的化合物是化合物的(S)-对映异构体或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，化合物是化合物的(R)-对映异构体或其药学上可接受的盐。
应进一步了解，为清楚起见描述于单独实施方案的上下文中的本发明的某些特征还可组合提供于单个实施方案中。相反，为简洁起见描述于单个实施方案的上下文中的本发明的各个特征还可单独或以任何合适的子组合来提供。
术语“n元”(其中n是整数)通常描述成环原子的数量为n的部分中成环原子的数量。举例来说，哌啶基是6元杂环烷基环的实例，吡唑基是5元杂芳基环的实例，吡啶基是6元杂芳基环的实例，并且1,2,3,4-四氢-萘是10元环烷基的实例。
如本文所用的词组“任选地经取代”意指未经取代或经取代。取代基经独立选择，并且取代可处于任一化学可及位置。如本文所用的术语“经取代”意指氢原子被移除并且经取代基替代。单个二价取代基(例如氧代)可替代两个氢原子。应理解，给定原子处的取代受化合价的限制。
如本文所用的词组“每个‘变量’独立地选自”意指与其中“在每次出现时‘变量’选自”大体上相同。
在整个定义中，术语“Cn-m”指示包括终点的范围，其中n和m是整数并且指示碳的数量。实例包括C1-3、C1-4、C1-6等。
如本文所用，单独使用或与其它术语组合使用的术语“Cn-m烷基”是指具有n到m个碳的饱和烃基，它可为直链或支链的。烷基部分的实例包括(但不限于)诸如以下的化学基团：甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基(n-Pr)、异丙基(iPr)、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；更高级同系物，例如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等。在一些实施方案中，烷基含有1到6个碳原子、1到4个碳原子、1到3个碳原子或1到2个碳原子。
如本文所用，单独使用或与其它术语组合使用的术语“Cn-m烷氧基”是指式-O-烷基的基团，其中烷基具有n到m个碳。实例烷氧基包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基和异丙氧基)、丁氧基(例如正丁氧基和叔丁氧基)等。
如本文所用，单独使用或与其它术语组合使用的术语“芳基”是指芳族烃基，它可为单环或多环(例如具有2个、3个或4个稠合环)。术语“Cn-m芳基”是指具有n到m个环碳原子的芳基。芳基包括例如苯基、萘基、蒽基、菲基、二氢茚基、茚基等。在一些实施方案中，芳基具有5到10个碳原子。在一些实施方案中，芳基是苯基或萘基。
在一些实施方案中，芳基是苯基(即C6芳基)。
如本文所用的“卤基”或“卤素”是指F、Cl、Br或I。在一些实施方案中，卤基是F、Cl或Br。在一些实施方案中，卤基是F或Cl。
在一些实施方案中，卤基是F。在一些实施方案中，卤基是Cl。
如本文所用，单独使用或与其它术语组合使用的术语“Cn-m卤代烷基”是指具有1个卤素原子到2s+1个卤素原子的烷基，所述卤素原子可相同或不同，其中“s”是烷基中的碳原子数，其中烷基具有n到m个碳原子。在一些实施方案中，卤代烷基仅经氟化。在一些实施方案中，烷基具有1到6个、1到4个或1到3个碳原子。实例卤代烷基包括CF3、C2F5、CHF2、CH2F、CCl3、CHCl2、C2Cl5等。
如本文所用的“环烷基”是指非芳族环状烃，包括环化烷基和烯基。环烷基可包括单环或多环(例如具有2个稠合环)基团、螺环和桥接环(例如桥接二环烷基)。环烷基的成环碳原子可任选地经氧代或硫基取代(例如C(O)或C(S))。环烷基的定义中还包括具有一个或多个与环烷基环稠合(即，具有共同的键)的芳香族环的部分，例如环戊烷、环己烷等的苯并或噻吩基衍生物。含有稠合芳族环的环烷基可通过任一成环原子(包括稠合芳族环的成环原子)连接。环烷基可具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个成环碳(即C3-10)。在一些实施方案中，环烷基是C3-10单环或二环环烷基。在一些实施方案中，环烷基是C3-7单环环烷基。在一些实施方案中，环烷基是C4-7单环环烷基。在一些实施方案中，环烷基是C4-10螺环或桥接环烷基(例如桥接二环烷基)。实例环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环己三烯基、降冰片基、降蒎基(norpinyl)、降蒈烷基、立方烷、金刚烷、二环[1.1.1]戊基、二环[2.1.1]己基、二环[2.2.1]庚基、二环[3.1.1]庚基、二环[2.2.2]辛基、螺[3.3]庚基等。在一些实施方案中，环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
如本文所用的“杂芳基”是指具有至少一个选自N、O、S和B的杂原子环成员的单环或多环(例如具有2个稠合环)芳族杂环。在一些实施方案中，杂芳基环具有1个、2个、3个或4个独立地选自N、O、S和B的杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基部分中的任何成环N可为N-氧化物。在一些实施方案中，杂芳基是具有1个、2个、3个或4个独立地选自N、O、S和B的杂原子环成员的5-10元单环或二环杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基是具有1个、2个、3个或4个独立地选自N、O和S的杂原子环成员的5-10元单环或二环杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基是具有1或2个独立地选自N、O、S和B的杂原子环成员的5-6单环杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基是具有1或2个独立地选自N、O和S的杂原子环成员的5-6单环杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基含有3到10个、4到10个、5到10个、5到7个、3到7个或5到6个成环原子。在一些实施方案中，杂芳基具有1到4个成环杂原子、1到3个成环杂原子、1到2个成环杂原子或1个成环杂原子。当杂芳基含有一个以上的杂原子环成员时，杂原子可相同或不同。实例杂芳基包括(但不限于)噻吩基(thienyl或thiophenyl)、呋喃基(furyl或furanyl)、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、1,2,3-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-三唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-三唑基、1,3,4-噻二唑基、1,3,4-噁二唑基和1,2-二氢-1,2-氮杂硼杂苯(azaborine)、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、唑基、三唑基、噻二唑基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异噁唑基、咪唑并[1,2-b]噻唑基、嘌呤基、三嗪基、噻吩并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、1,5-萘啶基、1H-吡唑并[4,3-b]吡啶基、三唑并[4,3-a]吡啶基、1H-吡咯并[3,2-b]吡啶基、1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、吲唑基等。
如本文所用的“杂环烷基”是指具有至少一个非芳族环(饱和或部分不饱和环)的单环或多环杂环，其中杂环烷基的一个或多个成环碳原子经选自N、O、S和B的杂原子替代，并且其中杂环烷基的成环碳原子和杂原子可任选地经一个或多个氧代或硫基取代(例如C(O)、S(O)、C(S)或S(O)2等)。当杂环烷基的成环碳原子或杂原子任选地经一个或多个氧代或硫基取代时，所述基团的O或S不包括在本文所指定成环原子的数量内(例如，1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基是6元杂环烷基，其中成环碳原子经氧代取代，并且其中6元杂环烷基进一步经甲基取代)。杂环烷基包括单环和多环(例如具有2个稠合环)系统。单环和多环3到10元、4到10元、5到10元、4到7元、5到7元或5到6元杂环烷基包括在杂环烷基中。杂环烷基还可包括螺环和桥接环(例如一个或多个成环碳原子经独立地选自N、O、S和B的杂原子替代的5到10元桥接二杂环烷基环)。杂环烷基可通过成环碳原子或成环杂原子连接。在一些实施方案中，杂环烷基含有0到3个双键。在一些实施方案中，杂环烷基含有0到2个双键。
具有稠合到非芳族杂环(即与非芳族杂环具有共用键)的一个或多个芳族环的部分也包括在杂环烷基的定义中，例如哌啶、吗啉、氮杂
Figure BDA0003804213750000321
等的苯并或噻吩基衍生物。含有稠合芳族环的杂环烷基可通过任一成环原子(包括稠合芳族环的成环原子)连接。
在一些实施方案中，杂环烷基含有3到10个成环原子、4到10个成环原子、3到7个成环原子或5到6个成环原子。在一些实施方案中，杂环烷基具有1到4个杂原子、1到3个杂原子、1到2个杂原子或1个杂原子。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1或2个独立地选自N、O、S和B的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环4-6元杂环烷基。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1个、2个、3个或4个独立地选自N、O、S和B的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环或二环5-10元杂环烷基。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1个、2个、3个或4个独立地选自N、O和S的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环或二环5到10元杂环烷基。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1个、2个、3个或4个独立地选自N、O和S的杂原子并且具有一个或多个氧化环成员的单环5到6元杂环烷基。
实例杂环烷基包括吡咯烷-2-酮(或2-氧代吡咯烷基)、1,3-异噁唑烷-2-酮、吡喃基、四氢吡喃、氧杂环丁基、氮杂环丁基、吗啉基、硫吗啉基、哌啶基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、吡咯烷基、异噁唑烷基、异噻唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、咪唑烷基、氮杂环庚基、1,2,3,4-四氢异喹啉、苯并氮杂环庚三烯、氮杂二环[3.1.0]己基、二氮杂二环[3.1.0]己基、氧代二环[2.1.1]己基、氮杂二环[2.2.1]庚基、二氮杂二环[2.2.1]庚基、氮杂二环[3.1.1]庚基、二氮杂二环[3.1.1]庚基、氮杂二环[3.2.1]辛基、二氮杂二环[3.2.1]辛基、氧代二环[2.2.2]辛基、氮杂二环[2.2.2]辛基、氮杂金刚烷基、二氮杂金刚烷基、氧代-金刚烷基、氮杂螺[3.3]庚基、二氮杂螺[3.3]庚基、氧代-氮杂螺[3.3]庚基、氮杂螺[3.4]辛基、二氮杂螺[3.4]辛基、氧代-氮杂螺[3.4]辛基、氮杂螺[2.5]辛基、二氮杂螺[2.5]辛基、氮杂螺[4.4]壬基、二氮杂螺[4.4]壬基、氧代-氮杂螺[4.4]壬基、氮杂螺[4.5]癸基、二氮杂螺[4.5]癸基、二氮杂螺[4.4]壬基、氧代-二氮杂螺[4.4]壬基、氧代-二氢哒嗪基、氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛基、氧代六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪基、3-氧代哌嗪基、氧代-吡咯烷基、氧代-吡啶基等。举例来说，杂环烷基包括以下基团(具有和不具有N-甲基取代)：
Figure BDA0003804213750000331
如本文所用的“Co-p环烷基-Cn-m烷基-”是指式环烷基-亚烷基-的基团，其中环烷基具有o到p个碳原子并且亚烷基连接基团具有n到m个碳原子。
如本文所用的“Co-p芳基-Cn-m烷基-”是指式芳基-亚烷基-的基团，其中芳基具有o到p个碳原子并且亚烷基连接基团具有n到m个碳原子。
如本文所用的“杂芳基-Cn-m烷基-”是指式杂芳基-亚烷基-的基团，其中亚烷基连接基团具有n到m个碳原子。
如本文所用的“杂环烷基-Cn-m烷基-”是指式杂环烷基-亚烷基-的基团，其中亚烷基连接基团具有n到m个碳原子。
在某些地方，定义或实施方案是指特定环(例如氮杂环丁烷环、吡啶环等)。除非另有指示，否则这些环可连接到任何环成员，条件是不超过原子的化合价。举例来说，氮杂环丁烷环可在环的任何位置连接，而吡啶-3-基环在3位连接。
如本文所用，术语“氧代”是指氧原子(即＝O)作为二价取代基，在连接到碳时形成羰基(例如C＝O或C(O))或连接到氮或硫杂原子时形成亚硝基、亚磺酰基或磺酰基。
如本文所用，术语“独立地选自”意指每次出现的变量或取代基在每次出现时独立地选自适用的列表。
本文所述的化合物可为不对称的(例如，具有一个或多个立体中心)。除非另有指示，否则欲指所有立体异构体(诸如对映异构体和非对映异构体)。本公开的含有不对称取代的碳原子的化合物可以光学活性或外消旋形式分离。如何从无光学活性的起始材料制备光学活性形式的方法已为业内已知，诸如通过外消旋混合物的拆分或通过立体选择性合成。烯烃的许多几何异构体、C＝N双键等也可存在于本文所述化合物中，并且所有此类稳定的异构体都涵盖在本发明中。描述本公开的化合物的顺式和反式几何异构体，并且它们可分离为异构体的混合物或分离为单独的异构形式。在一些实施方案中，化合物具有(R)-构型。在一些实施方案中，化合物具有(S)-构型。本文提供的式(例如式(I)、式(II)等)包括化合物的立体异构体。
化合物的外消旋混合物的拆分可通过此项技术中已知的多种方法中的任一者进行。实例方法包括使用手性拆分酸进行分级重结晶，手性拆分酸是一种光学活性的成盐有机酸。适用于分级重结晶方法的拆分剂是例如光学活性酸，例如D和L形式的酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸或各种光学活性樟脑磺酸(例如β-樟脑磺酸)。其它适用于分级结晶方法的拆分剂包括立体异构纯形式的α-甲基苄胺(例如，S和R形式，或非对映异构纯形式)、2-苯基甘氨醇、降麻黄碱、麻黄碱、N-甲基麻黄碱、环己基乙胺、1,2-二氨基环己烷等。
外消旋混合物的拆分还可通过在填装光学活性拆分剂(例如，二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱上洗脱来实施。适宜洗脱溶剂组成可由本领域技术人员确定。
本文提供的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式由单键与毗邻双键的交换以及伴随的质子迁移产生。互变异构形式包括质子转移互变异构体，其为具有相同经验式和总电荷的异构质子化状态。质子转移互变异构体的实例包括酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内酰胺-内酰亚胺对、烯胺-亚胺对，以及其中质子可占据杂环系统的两个或更多个位置的环形形式，例如1H-和3H-咪唑、1H-、2H-和4H-1,2,4-三唑、1H-和2H-异吲哚、2-羟基吡啶和2-吡啶酮以及1H-和2H-吡唑。互变异构形式可处于平衡或通过适当的取代而空间锁定成一种形式。
所有化合物和其药学上可接受的盐可与其它物质(例如水和溶剂)一起发现(例如水合物和溶剂合物)，或可分离出来。
在一些实施方案中，化合物的制备可涉及添加酸或碱，以影响例如期望反应的催化或盐形式(例如酸加成盐)的形成。
在一些实施方案中，本文提供的化合物或其盐大体上分离。“大体上分离”意指化合物至少部分或大体上与其形成或检测的环境分离。部分分离可包括例如富含本文提供的化合物的组合物。大体上分离可包括含有按重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的本文提供的化合物或其盐的组合物。分离化合物和其盐的方法是业内常规的。
如本文所用的术语“化合物”打算包括所描绘结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。除非另外指明，否则本文中通过名称或结构鉴定为一种特定互变异构形式的化合物打算包括其它互变异构形式。
词组“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
本申请还包括本文所述的化合物的药学上可接受的盐。如本文所用的“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将存在的酸或碱部分转化为其盐形式而经修饰。药学上可接受的盐的实例包括(但不限于)碱性残基(诸如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱性或有机盐等。本公开的药学上可接受的盐包括母体化合物的例如由无毒无机酸或有机酸形成的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的合适碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，非水性介质如醚、乙酸乙酯、醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇)或乙腈(ACN)是优选的。适宜盐的列表参见Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985，第1418页和Journal ofPharmaceutical Science,66,2(1977)，其各自的全文都以引用方式并入本文中。
本文所述的化合物(包括其盐)可使用已知的有机合成技术来制备，并且可根据多种可能合成途径中的任一者来合成。
制备本文所述化合物的反应可在可由熟习有机合成技术者容易选择的适宜溶剂中实施。适宜溶剂在实施反应的温度(例如可介于溶剂的冰点到溶剂的沸点范围内的温度)下可大体上不与起始材料(反应物)、中间体或产物反应。给定反应可在一种溶剂或一种以上溶剂的混合物中实施。根据具体反应步骤，可由本领域技术人员选择适用于具体反应步骤的溶剂。
本文所述化合物的制备可涉及多个化学基团的保护和脱保护。本领域技术人员可容易地确定保护和脱保护的需要和适宜保护基团的选择。保护基团的化学可参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley&Sons,Inc.,New York(1999)，其全文都以引用方式并入本文中。
反应可根据此项技术中已知的任一适宜方法来监测。举例来说，可通过波谱方法(例如核磁共振谱(例如1H或13C)、红外光谱、分光光度法(例如UV可见光)、质谱)或通过色谱方法(例如高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LCMS)或薄层色谱(TLC))来监测产物形成。化合物可由本领域技术人员通过多种方法来纯化，包括高效液相色谱(HPLC)(“Preparative LC-MS Purification:Improved Compound Specific MethodOptimization”Karl F.Blom等人，J.Combi.Chem.2004,6(6),874-883，其全文都以引用方式并入本文中)和正相二氧化硅色谱。
本文所述的化合物可调节多种GPCR(包括例如A2A/A2B)中的一者或多者的活性。术语“调节”意思是指增加或降低A2A/A2B家族的一个或多个成员的活性的能力。因此，本文所述的化合物可用于通过使A2A/A2B与本文所述化合物或组合物中的任一者或多者接触来调节A2A/A2B的方法中。在一些实施方案中，本发明的化合物可用作A2A和A2B中的一者或两者的抑制剂。在其它实施方案中，本文所述的化合物可用于通过施用调节量的本文所述化合物或其药学上可接受的盐来调节需要调节受体的个体中A2A/A2B的活性。在一些实施方案中，调节是抑制。
鉴于癌细胞生长和存活受多个信号传导途径影响，本发明可用于治疗特征在于药物抗性突变体的疾病状态。另外，在GPCR中展现不同偏好的不同GPCR抑制剂可以组合使用，所述不同GPCR抑制剂调节GPCR的活性。这种方法可证明通过靶向多个信号传导途径高度有效地治疗疾病状态，降低在细胞中产生药物抗性的可能性，并且降低疾病治疗的毒性。
本发明化合物结合和/或调节(例如抑制)的GPCR包括A2A/A2B家族的任一成员。
在一些实施方案中，使用一种以上的本文所述化合物来抑制一种GPCR(例如A2A)的活性。
在一些实施方案中，使用一种以上的本文所述化合物来抑制一种以上的GPCR，例如至少两种GPCR(例如A2A和A2B)。
在一些实施方案中，一种或多种化合物与另一GPCR拮抗剂组合使用来抑制一种GPCR(例如A2A或A2B)的活性。
本文所述的A2A/A2B抑制剂可具有选择性。“选择性”意指与至少一种其它GPCR相比，化合物分别以较大亲和力或效力结合或抑制GPCR。在一些实施方案中，本文所述的化合物是A2A或A2B的选择性抑制剂。在一些实施方案中，本文所述的化合物是A2A的选择性抑制剂(例如相对于A2B)。在一些实施方案中，本文所述的化合物是A2B的选择性抑制剂(例如相对于A2A)。在一些实施方案中，选择性可为至少约2倍、5倍、10倍、至少约20倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍。选择性可通过此项技术中的常规方法来测量。在一些实施方案中，选择性可以对每一GPCR的生物化学亲和力来测试。在一些实施方案中，本文所述化合物的选择性可通过与具体A2A/A2B GPCR活性相关的细胞分析来测定。
如本文所用的术语“接触”是指将所指示部分一起带入活体外系统或活体内系统中。举例来说，使A2A/A2B与本文所述化合物“接触”包括将本发明的化合物施用于具有A2A/A2B的个体或患者(例如人类)，以及例如将本文所述的化合物引入含有含A2A/A2B的细胞或经纯化制剂的样品中。
如本文所用的术语“个体”或“患者”可互换使用并且是指任何动物，包括哺乳动物，优选小鼠、大鼠、其它啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，最优选人类。
如本文所用的词组“治疗有效量”是指引发组织、系统、动物、个体或人类的研究者、兽医、医师或其它临床医师正寻求的生物或医学反应的活性化合物或医药剂的量。
如本文所用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指以下中的一者或多者：(1)预防疾病；例如，预防可能易患疾病、疾患或病症但尚未经历或展示疾病的病状或症状的个体的疾病、疾患或病症；(2)抑制疾病；例如，抑制正在经历或展示疾病、疾患或病症的病状或症状的个体的疾病、疾患或病症(即，阻止病状和/或症状的进一步发展)；以及(3)改善疾病；例如，改善正在经历或展示疾病、疾患或病症的病状或症状的个体的疾病、疾患或病症(即，逆转病状和/或症状)，例如降低疾病的严重程度。在一些实施方案中，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指抑制或改善疾病。
给药和施用
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约0.1mg到约1000mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约1mg到约500mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约5mg到约250mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约10mg到约100mg的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以选自以下的剂量施用于受试者：基于游离碱约0.5mg、约1mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约105mg、约110mg、约115mg、约120mg、约125mg、约130mg、约135mg、约140mg、约145mg、约150mg、约155mg、约160mg、约165mg、约170mg、约175mg、约180mg、约185mg、约190mg、约195mg、约200mg、约205mg、约210mg、约215mg、约220mg、约225mg、约230mg、约235mg、约240mg、约245mg、约250mg、约255mg、约260mg、约265mg、约270mg、约275mg、约280mg、约285mg、约290mg、约295mg、约300mg、约305mg、约310mg、约315mg、约320mg、约325mg、约330mg、约335mg、约340mg、约345mg、约350mg、约355mg、约360mg、约365mg、约370mg、约375mg、约380mg、约385mg、约390mg、约395mg、约400mg、约405mg、约410mg、约415mg、约420mg、约425mg、约430mg、约435mg、约440mg、约445mg、约450mg、约455mg、约460mg、约465mg、约470mg、约475mg、约480mg、约485mg、约490mg、约495mg、约500mg、约505mg、约510mg、约515mg、约520mg、约525mg、约530mg、约535mg、约540mg、约545mg、约550mg、约555mg、约560mg、约565mg、约570mg、约575mg、约580mg、约585mg、约590mg、约595mg、约600mg、约605mg、约610mg、约615mg、约620mg、约625mg、约630mg、约635mg、约640mg、约645mg、约650mg、约655mg、约660mg、约665mg、约670mg、约675mg、约680mg、约685mg、约690mg、约695mg、约700mg、约705mg、约710mg、约715mg、约720mg、约725mg、约730mg、约735mg、约740mg、约745mg、约750mg、约755mg、约760mg、约765mg、约770mg、约775mg、约780mg、约785mg、约790mg、约795mg、约800mg、约805mg、约810mg、约815mg、约820mg、约825mg、约830mg、约835mg、约840mg、约845mg、约850mg、约855mg、约860mg、约865mg、约870mg、约875mg、约880mg、约885mg、约890mg、约895mg、约900mg、约905mg、约910mg、约915mg、约920mg、约925mg、约930mg、约935mg、约940mg、约945mg、约950mg、约955mg、约960mg、约965mg、约970mg、约975mg、约980mg、约985mg、约990mg、约995mg和约1000mg。在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约0.1mg到约500mg范围内的剂量或其之间的任一剂量值施用于受试者。在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约1mg到约100mg范围内的剂量或其之间的任一剂量值施用于受试者。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以每天一次、每隔一天、每周一次或其之间的任何时间间隔施用于受试者。在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以每天一次施用于受试者。在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐每隔一天施用于受试者。在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂或其药学上可接受的盐以每周一次施用于受试者。
在一些实施方案中，每一剂量以单一的每天一次剂量施用。在一些实施方案中，每一剂量以单一的每天一次口服剂量施用。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约0.1mg到约1000mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约1mg到约500mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约5mg到约250mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约10mg到约100mg的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂或其药学上可接受的盐以选自以下的剂量施用于受试者：基于游离碱约0.5mg、约1mg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约105mg、约110mg、约115mg、约120mg、约125mg、约130mg、约135mg、约140mg、约145mg、约150mg、约155mg、约160mg、约165mg、约170mg、约175mg、约180mg、约185mg、约190mg、约195mg、约200mg、约205mg、约210mg、约215mg、约220mg、约225mg、约230mg、约235mg、约240mg、约245mg、约250mg、约255mg、约260mg、约265mg、约270mg、约275mg、约280mg、约285mg、约290mg、约295mg、约300mg、约305mg、约310mg、约315mg、约320mg、约325mg、约330mg、约335mg、约340mg、约345mg、约350mg、约355mg、约360mg、约365mg、约370mg、约375mg、约380mg、约385mg、约390mg、约395mg、约400mg、约405mg、约410mg、约415mg、约420mg、约425mg、约430mg、约435mg、约440mg、约445mg、约450mg、约455mg、约460mg、约465mg、约470mg、约475mg、约480mg、约485mg、约490mg、约495mg、约500mg、约505mg、约510mg、约515mg、约520mg、约525mg、约530mg、约535mg、约540mg、约545mg、约550mg、约555mg、约560mg、约565mg、约570mg、约575mg、约580mg、约585mg、约590mg、约595mg、约600mg、约605mg、约610mg、约615mg、约620mg、约625mg、约630mg、约635mg、约640mg、约645mg、约650mg、约655mg、约660mg、约665mg、约670mg、约675mg、约680mg、约685mg、约690mg、约695mg、约700mg、约705mg、约710mg、约715mg、约720mg、约725mg、约730mg、约735mg、约740mg、约745mg、约750mg、约755mg、约760mg、约765mg、约770mg、约775mg、约780mg、约785mg、约790mg、约795mg、约800mg、约805mg、约810mg、约815mg、约820mg、约825mg、约830mg、约835mg、约840mg、约845mg、约850mg、约855mg、约860mg、约865mg、约870mg、约875mg、约880mg、约885mg、约890mg、约895mg、约900mg、约905mg、约910mg、约915mg、约920mg、约925mg、约930mg、约935mg、约940mg、约945mg、约950mg、约955mg、约960mg、约965mg、约970mg、约975mg、约980mg、约985mg、约990mg、约995mg和约1000mg。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约0.1mg到约500mg范围内的剂量或其之间的任一剂量值施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂或其药学上可接受的盐以基于游离碱约1mg到约100mg范围内的剂量或其之间的任一剂量值施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以约1mg/kg到约10mg/kg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以约200mg到约1000mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以约200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约425mg、约450mg、约475mg、约500mg、约525mg、约550mg、约575mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875mg、约900mg、约925mg、约950mg、约975mg或约1000mg的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以每天一次、每隔一天、每周一次或其之间的任何时间间隔施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以每天一次施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂每隔一天施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以每周一次施用于受试者。
在一些实施方案中，每一剂量以单一的每天一次剂量施用。在一些实施方案中，每一剂量以单一的每天一次口服剂量施用。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂每两周、每三周或每四周施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂每月或每季度施用于受试者。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂通过静脉内施用来施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以1mg/kg Q2W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以3mg/kg Q2W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以3mg/kg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以10mg/kg Q2W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以10mg/kg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以200mg Q3W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以250mg Q3W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以375mg Q3W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以500mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂以750mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂是抗体X。在一些实施方案中，抗体X以约250mg到约850mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X以约375mg到约850mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X以约450mg到约850mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X以约500mg到约750mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X以约500mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X以约750mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X每四周施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X通过静脉内施用来施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以1mg/kg Q2W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以3mg/kg Q2W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以3mg/kg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以10mg/kg Q2W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以10mg/kg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以200mg Q3W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以250mg Q3W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以375mg Q3W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以500mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以750mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为抗体X。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂以基于游离碱约0.1mg到约500mg的剂量施用于受试者，其中A2A/A2B抑制剂以每天一次或每隔一天施用。
在一些实施方案中，抗体X以约100mg到约1000mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌(Merkel cell carcinoma)，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为抗体X；
其中A2A/A2B抑制剂以基于游离碱约0.1mg到约500mg的剂量施用于受试者，其中A2A/A2B抑制剂以每天一次或每隔一天施用；并且
抗体X以约100mg到约1000mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以约375mg Q4W的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X以约500mg Q4W的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X以约750mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为派姆单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为派姆单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为阿替利珠单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为阿替利珠单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐(化合物Y)。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐(化合物Y)。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为抗体X。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为抗体X。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂以基于游离碱约0.1mg到约500mg的剂量施用于受试者，其中A2A/A2B抑制剂以每天一次或每隔一天施用。
在一些实施方案中，抗体X以约100mg到约1000mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为抗体X；
其中A2A/A2B抑制剂以基于游离碱约0.1mg到约500mg的剂量施用于受试者，其中A2A/A2B抑制剂以每天一次或每隔一天施用；并且
抗体X以约100mg到约1000mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为抗体X；
其中A2A/A2B抑制剂以基于游离碱约0.1mg到约500mg的剂量施用于受试者，其中A2A/A2B抑制剂以每天一次或每隔一天施用；并且
抗体X以约100mg到约1000mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，抗体X以约375mg Q4W的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X以约500mg Q4W的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，抗体X以约750mg Q4W的剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为派姆单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为派姆单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为派姆单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为派姆单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为阿替利珠单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为阿替利珠单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为阿替利珠单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为阿替利珠单抗。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐(化合物Y)。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐(化合物Y)。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐(化合物Y)。
在一些实施方案中，本文提供治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐(化合物Y)。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂同时施用。
在一些实施方案中，A2A/A2B抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂依序施用。
当PD-1/PD-L1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段时，它可通过多种方法施用于受试者，例如有需要的受试者，例如人类受试者。本文所论述的方法和剂量适用于所有抗PD-1抗体或其抗原结合片段，包括抗体X。对于许多应用，施用途径为以下中的一种：静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜内(IP)或肌内注射。还可使用关节内递送。还可使用其它肠胃外施用模式。此类模式的实例包括：动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及硬膜外和胸骨内注射。在一些情况下，施用可为口服。
抗体或其抗原结合片段的施用途径和/或模式还可针对个别情况进行调整，例如通过例如使用断层摄影成像监测受试者，例如以使肿瘤可视化。
抗体或其抗原结合片段可以固定剂量或mg/kg剂量来施用。剂量还可经选择以减少或避免针对抗PD-1抗体的抗体产生。调整剂量方案以提供期望反应，例如治疗反应或组合治疗效应。通常，可使用抗PD-1抗体(和任选的第二剂)的剂量以向受试者提供生物利用量的剂。举例来说，可施用0.1-100mg/kg、0.5-100mg/kg、1mg/kg-100mg/kg、0.5-20mg/kg、0.1-10mg/kg或1-10mg/kg范围内的剂量。还可使用其它剂量。在特定实施方案中，向需要用抗PD-1抗体治疗的受试者施用剂量为1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、35mg/kg或40mg/kg的抗体。
组合物可包含约1mg/mL到100mg/ml或约10mg/mL到100mg/ml或约50到250mg/mL或约100到150mg/ml或约100到250mg/ml的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
如本文所用的剂量单位形式或“固定剂量”是指适于作为单位剂量用于待治疗受试者的物理离散单位；各单位含有经计算与所需药物载体一起并且任选地与另一剂一起产生期望治疗效应的预定量的活性化合物。可给予单一或多个剂量。替代地或另外，抗体可经由连续输注来施用。例示性固定剂量包括375mg、500mg和750mg。
抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量可在足以涵盖至少2个剂量、3个剂量、5个剂量、10个剂量或更多个剂量的时间段(治疗期)内例如以周期性间隔施用，例如每天一次或两次，或约每周1到4次，或优选每周、每两周(biweekly、every two weeks)、每三周、每月，例如持续约1到12周，优选2到8周，更优选约3到7周，甚至更优选持续约4周、5周或6周。可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间的因素包括例如疾病或病症的严重程度、制剂、递送途径、先前治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄和所存在的其它疾病。另外，用治疗有效量的化合物治疗受试者可包括单一治疗，或优选可包括一系列治疗。
药物组合物可包含“治疗有效量”的本文所述的剂。此类有效量可基于所施用剂的效应或在使用一种以上的剂时各剂的组合效应来确定。剂的治疗有效量还可根据诸如以下的因素而变化：受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物在个体中诱发期望反应(例如改善至少一种病症参数或改善病症的至少一种症状)的能力。治疗有效量也是其中组合物的治疗有益效应超过任何毒性或有害效应的量。
药物制剂
当作为药物使用时，本公开的化合物可以药物组合物的形式施用。这些组合物可以药学领域熟知的方式制备，并且可通过多种途径施用，所述途径取决于期望局部治疗还是全身治疗以及取决于待治疗的区域。施用可为局部施用(包括经皮施用、表皮施用、眼部施用和粘膜施用，包括鼻内递送、阴道递送和直肠递送)、肺部施用(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内或鼻内)、经口或肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、腹膜内施用、肌内施用或注射或输注；或颅内施用，例如鞘内施用或脑室内施用。肠胃外施用可呈单次浓注剂量的形式，或者可为例如通过连续灌注泵。用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可为必需的或合乎需要的。
本公开还包括药物组合物，其含有作为活性成分的本公开的化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体(赋形剂)的组合。在一些实施方案中，组合物适于局部施用。在制备本公开的组合物中，活性成分通常与赋形剂混合，用赋形剂稀释或包封在呈例如胶囊、小药囊、纸或其它容器形式的此类载体内。当赋形剂用作稀释剂时，其可为固体、半固体或液体材料，其用作活性成分的媒介物、载体或介质。因此，组合物可呈片剂、丸剂、粉剂、菱形片剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、含有例如高达10重量％的活性化合物的软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液和无菌包装的粉剂的形式。
在制备制剂时，在与其它成分混合之前，可将活性化合物研磨以提供适宜粒径。如果活性化合物大体上不可溶，那么可将其研磨到小于200目的粒径。如果活性化合物大体上是水溶性的，那么可通过研磨来调节粒径，以在制剂中提供大体上均匀的分布，例如约40目。
本公开的化合物可使用已知的研磨程序(例如湿磨)来研磨，以获得适合片剂形成和其它制剂类型的粒径。本公开的化合物的细分(纳米颗粒)制剂可通过业内已知的方法制备，例如参见国际申请第WO2002/000196号。
适宜赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂可另外包括：润滑剂，诸如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，诸如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；以及矫味剂。本公开的组合物可通过采用此项技术中已知的程序配制以在施用患者后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
组合物可以单位剂量形式配制。术语“单位剂量形式”是指适于作为单位剂量用于人类受试者和其它哺乳动物的物理离散单位，各单位含有经计算以与适宜医药赋形剂一起产生期望治疗效应的预定量的活性材料。
为制备固体组合物(例如片剂)，将主要活性成分与医药赋形剂混合以形成含有本公开化合物的均质混合物的固体预配制组合物。当将这些预配制组合物提及为均质时，活性成分通常均匀分散于整个组合物中，以使得组合物可容易地细分成同样有效的单位剂量形式，例如片剂、丸剂和胶囊。然后将这种固体预制剂细分成上述类型的单位剂量形式。
本公开的片剂或丸剂可经包衣或以其它方式复合以提供具有延长作用的优点的剂量形式。举例来说，片剂或丸剂可包含内部剂量组分和外部剂量组分，后者呈在前者上的包膜形式。两种组分可由肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解并且允许内部组分完整地进入十二指肠中或延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括多种聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、十六烷醇和乙酸纤维素的材料的混合物。
本公开的化合物和组合物可掺入其中用于口服或通过注射施用的液体形式包括水溶液、适当矫味的糖浆、水性或油悬浮液，以及具有食用油(诸如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)的矫味乳液，以及酏剂和类似的药物媒介物。
用于吸入或吹入的组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉剂。液体或固体组合物可含有如上文所述的适宜药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物通过口服或鼻呼吸途径施用以获得局部或全身效应。组合物可通过使用惰性气体来雾化。雾化溶液可直接从雾化装置呼吸，或可将雾化装置连接到面罩、帐篷或间歇正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可从以适当方式递送制剂的装置经口或经鼻施用。
局部制剂可含有一种或多种常规载体。在一些实施方案中，软膏可含有水和一种或多种疏水性载体，所述一种或多种疏水性载体选自例如液体石蜡、聚氧乙烯烷基醚、丙二醇、白凡士林等。乳霜的载体组合物可基于水与甘油和一种或多种其它组分(例如甘油单硬脂酸酯、PEG-甘油单硬脂酸酯和鲸蜡硬脂醇)的组合。凝胶可使用异丙醇和水适当地与其它组分(例如甘油、羟乙基纤维素等)组合来配制。在一些实施方案中，局部制剂含有至少约0.1重量％、至少约0.25重量％、至少约0.5重量％、至少约1重量％、至少约2重量％或至少约5重量％的本公开的化合物。局部制剂可适当地包装在例如100g的管中，所述管任选地与治疗所选适应症(例如牛皮癣或其它皮肤疾患)的说明书相关联。
施用给患者的化合物或组合物的量将根据所施用的物质、施用的目的(诸如预防或治疗)、患者的状态、施用方式等而变化。在治疗应用中，可以足以治愈或至少部分阻止疾病和其并发症的症状的量将组合物施用给已经患有疾病的患者。有效剂量将取决于所治疗的疾病状况以及主治临床医生的判断，这取决于诸如疾病的严重程度、患者的年龄、体重和一般状况等因素。
施用给患者的组合物可呈上述药物组合物的形式。这些组合物可通过常规灭菌技术灭菌，或者可经无菌过滤。水溶液可经包装以原样使用，或经冻干，冻干的制剂在施用前与无菌水性载体合并。化合物制剂的pH通常将介于3与11之间，更优选为5到9，最优选为7到8。应理解，使用某些上述赋形剂、载体或稳定剂会导致药物盐的形成。
本公开的化合物的治疗剂量可根据例如进行治疗的具体用途、化合物的施用方式、患者的健康和状况以及处方医师的判断而变化。药物组合物中本公开的化合物的比例或浓度可根据许多因素而变化，所述因素包括剂量、化学特征(例如疏水性)和施用途径。举例来说，本公开的化合物可以含有约0.1％到约10％w/v的化合物的水性生理缓冲溶液提供用于肠胃外施用。
本公开的组合物可进一步包含一种或多种其它医药剂，例如化学治疗剂、类固醇、抗炎症化合物或免疫抑制剂，其实例列于本文中。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体可与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，例如控制释放制剂，包括植入物和微囊封递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法已申请专利或通常已知。参见例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。
实体肿瘤和癌症
可使用本公开的治疗方法和方案治疗的癌症的实例包括(但不限于)骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌(carcinoma of theendometrium)、子宫内膜癌(endometrial cancer)、子宫颈癌、阴道癌、阴门癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或尿道癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括石棉诱发的癌症)和所述癌症的组合。本公开的方法还可用于治疗转移性癌症，尤其表达PD-L1的转移性癌症。
在一些实施方案中，可用本公开的方法治疗的癌症包括黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、鳞状细胞头颈癌、尿路上皮癌(例如膀胱)和具有高微卫星不稳定性(MSI高)的癌症。另外，本公开包括难治性或复发性恶性病，其生长可使用本公开的方法来抑制。
在一些实施方案中，可使用本公开的方法治疗的癌症包括(但不限于)实体肿瘤(例如前列腺癌、结肠癌、食管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、神经胶母细胞瘤、肉瘤、膀胱癌等)、血液癌(例如淋巴瘤、白血病(例如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、被套细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(包括再发性或难治性NHL和复发性滤泡性NHL)、霍奇金氏淋巴瘤或多发性骨髓瘤)和所述癌症的组合。
在一些实施方案中，可使用本公开的方法治疗的癌症包括(但不限于)胆道癌、胆管癌、三阴性乳腺癌、横纹肌肉瘤、小细胞肺癌、平滑肌肉瘤、肝细胞癌、尤因氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、脑癌、脑瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、基底细胞癌、软骨肉瘤、上皮样肉瘤、眼癌、输卵管癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、毛细胞白血病、肠癌、胰岛细胞癌、口腔癌、口癌、喉癌、喉头癌、唇癌、间皮瘤、颈癌、鼻腔癌、眼癌、眼黑色素瘤、盆腔癌、直肠癌、肾细胞癌、唾腺癌、窦癌、脊柱癌、舌癌、管状癌、尿道癌和输尿管癌。
在一些实施方案中，癌症选自肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、子宫内膜癌、膀胱癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、头颈癌、甲状腺癌、肾癌、胃癌和肉瘤。在一些实施方案中，癌症选自急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、被套细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、真性多血症、自发性血小板增多、慢性骨髓性白血病、骨髓纤维化、原发性骨髓纤维化、真性多血症/自发性血小板增多后骨髓纤维化、自发性血小板增多后骨髓纤维化和真性多血症后骨髓纤维化。在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤、子宫内膜癌、肺癌、肾细胞癌、尿路上皮癌、膀胱癌、乳腺癌和胰腺癌。
在一些实施方案中，癌症选自膀胱癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌或肺转移)、黑色素瘤(例如转移性黑色素瘤)、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、食管癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、肝癌、子宫癌、头颈癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、肛门癌、胆道癌、口腔癌、非黑色素瘤皮肤癌和默克细胞癌。
在一些实施方案中，前列腺癌是转移性去势抵抗性前列腺癌瘤(mCRPC)。
在一些实施方案中，结肠直肠癌是结肠直肠癌瘤(CRC)。
在一些实施方案中，癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、子宫内膜癌、膀胱癌、皮肤癌、子宫癌、肾癌、胃癌或肉瘤。在一些实施方案中，肉瘤是阿金氏肿瘤(Askin's tumor)、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、叶状囊性肉瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、胃肠基质瘤(GIST)、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤或未分化多形性肉瘤。
在一些实施方案中，癌症是间皮瘤或肾上腺癌。在一些实施方案中，疾病或病症是间皮瘤。在一些实施方案中，癌症是肾上腺癌。
MDSC(骨髓源性抑制细胞)是来自骨髓谱系的异质性免疫细胞群体(源自骨髓干细胞的细胞家族)。MDSC在诸如慢性感染和癌症等病理情况下会因造血功能改变而强烈扩增。MDSC与其它骨髓细胞类型不同，它们具有强免疫抑制活性而不是免疫刺激特性。与其它骨髓细胞相似，MDSC与其它免疫细胞类型(包括T细胞、树突细胞、巨噬细胞和自然杀手细胞)相互作用以调控其功能。在一些实施方案中，本文所述的化合物等可用于与具有高MDSC浸润的癌症组织(例如肿瘤)相关的方法中，包括具有高基底水平的巨噬细胞和/或MDSC浸润的实体肿瘤。在一些实施方案中，本文所述的组合疗法可用于与具有表达PD-1或PD-L1的肿瘤或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的癌症组织(例如肿瘤)相关的方法中。
在一些实施方案中，癌症是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌(例如结肠癌)、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肾细胞癌、肝癌或肝细胞癌。
在一些实施方案中，癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌。
在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤、子宫内膜癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌和结肠癌。
在一些实施方案中，癌症选自子宫内膜癌、肛门癌和胆道癌。
在一些实施方案中，癌症是在肿瘤微环境中展示高腺苷水平的肿瘤。这些肿瘤可通过基因表达特征来富集，或通过CD73和/或其它碱性磷酸酶(包括组织非特异性碱性磷酸酶(即TNAP和PAP))的高表达水平来富集。
在一些实施方案中，癌症是结肠癌。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是子宫内膜癌。在一些实施方案中，子宫内膜癌是子宫内膜样腺癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，肺癌选自非小细胞肺癌和小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症是肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症是尿路上皮癌。在一些实施方案中，癌症是膀胱癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，胰腺癌是胰腺导管腺癌。在一些实施方案中，癌症是肉瘤。在一些实施方案中，肉瘤选自阿金氏肿瘤、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、叶状囊性肉瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、胃肠基质瘤(GIST)、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和未分化多形性肉瘤。
经标记化合物和分析方法
本公开进一步包括经同位素标记的本公开化合物。“经同位素标记”或“经放射性标记”的化合物是其中一个或多个原子经原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现(即天然)的原子质量或质量数的原子替代或取代的本公开化合物。可纳入本公开化合物中的适宜放射性核素包括(但不限于)2H(也写为氘，D)、3H(也写为氚，T)、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和131I。举例来说，本公开化合物中的一个或多个氢原子可经氘原子替代(例如本文所述化合物的烷基的一个或多个氢原子可任选地经氘原子取代，例如用-CD3取代-CH3)。
本文所呈现化合物的一个或多个构成原子可经天然或非天然丰度的原子的同位素替代或取代。在一些实施方案中，化合物包含至少一个氘原子。在一些实施方案中，化合物包含两个或更多个氘原子。在一些实施方案中，化合物包含1-2、1-3、1-4、1-5或1-6个氘原子。在一些实施方案中，化合物中的所有氢原子可经氘原子替代或取代。
在一些实施方案中，连接到本文所述化合物的碳原子的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个氢原子任选地经氘原子替代。
将同位素纳入有机化合物中的合成方法为此项技术中已知(Deuterium Labelingin Organic Chemistry，Alan F.Thomas(New York,N.Y.,Appleton-Century-Crofts,1971；The Renaissance of H/D Exchange，Jens Atzrodt,Volker Derdau,Thorsten Fey和Jochen Zimmermann,Angew Chem.Int.2007版,7744-7765；The Organic Chemistry ofIsotopic Labelling，James R.Hanson,Royal Society of Chemistry,2011)。经同位素标记的化合物可用于各种研究中，例如NMR谱、代谢实验和/或分析。
用较重同位素(例如氘)取代可提供源自更大代谢稳定性的某些治疗优势，例如延长的活体内半衰期或减少的剂量需求，并且因此在一些情况下可能是优选的(参见例如A.Kerekes等人，J.Med.Chem.2011,54,201-210；R.Xu等人，J.LabelCompd.Radiopharm.2015,58,308-312)。具体来说，一个或多个代谢位点处的取代可提供一种或多种治疗优势。
纳入本发明的经放射性标记的化合物中的放射性核素将根据经放射性标记的化合物的具体应用而定。举例来说，对于活体外A2A/A2B标记和竞争分析，可使用纳入3H、14C、82Br、125I、131I或35S的化合物。对于放射性成像应用，可使用11C、18F、125I、123I、124I、131I、75Br、76Br或77Br。
应理解，“经放射性标记”或“经标记化合物”是已纳入至少一种放射性核素的化合物。在一些实施方案中，放射性核素选自由3H、14C、125I、35S和82Br组成的组。
本公开可进一步包括用于将放射性同位素纳入本公开的化合物中的合成方法。将放射性同位素纳入有机化合物中的合成方法为此项技术中所熟知，并且本领域技术人员将容易地意识到适用于本公开化合物的方法。
产生抗体的方法
抗体可在细菌或真核细胞中产生。一些抗体(例如Fab)可在细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)中产生。抗体还可在真核细胞(例如经转化细胞系(例如CHO、293E、COS))中产生。另外，抗体(例如scFv)可在酵母细胞(例如毕赤酵母(Pichia)(参见例如Powers等人，J Immunol Methods.251:123-35(2001))、汉逊酵母(Hanseula)或啤酒酵母(Saccharomyces))中表达。为产生所关注抗体，构建编码抗体的多核苷酸，将其引入表达载体中，然后在适宜宿主细胞中表达。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞并回收抗体。
如果要在细菌细胞(例如大肠杆菌)中表达抗体，那么表达载体应具有允许载体在细菌细胞中扩增的特征。另外，当使用大肠杆菌(例如JM109、DH5α、HB101或XL1-Blue)作为宿主时，载体必须具有可允许在大肠杆菌中有效表达的启动子，例如lacZ启动子(Ward等人，341:544-546(1989))、araB启动子(Better等人，Science,240:1041-1043(1988))或T7启动子。此类载体的实例包括例如M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIA表达系统”(QIAGEN)、pEGFP和pET(当使用这种表达载体时，宿主优选是表达T7 RNA聚合酶的BL21)。表达载体可含有用于抗体分泌的信号序列。为在大肠杆菌的周质中产生，可使用pelB信号序列(Lei等人，J.Bacteriol.,169:4379(1987))作为用于抗体分泌的信号序列。对于细菌表达，可使用氯化钙方法或电穿孔方法将表达载体引入细菌细胞中。
如果要在动物细胞(例如CHO、COS和NIH3T3细胞)中表达抗体，那么表达载体包括对于在这些细胞中表达所需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人，Nature,277:108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.,18:5322(1990))或CMV启动子。除编码免疫球蛋白或其结构域的核酸序列外，重组表达载体可携带其它序列，例如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因促进其中已引入载体的宿主细胞的选择(参见例如美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号)。举例来说，可选择标记基因通常赋予其中已引入载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤(methotrexate))的抗性。含有可选择标记物的载体的实例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
在一个实施方案中，抗体在哺乳动物细胞中产生。用于表达抗体的例示性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中所述的dhfr-CHO细胞，与DHFR可选择标记物一起使用，例如如Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所述)、人类胚肾293细胞(例如293、293E、293T)、COS细胞、NIH3T3细胞、淋巴细胞性细胞系(例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞)和来自转基因动物(例如转基因哺乳动物)的细胞。举例来说，细胞是乳房上皮细胞。
在用于抗体表达的例示性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗PD-1抗体(例如抗体X)的抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，将抗体重链和轻链基因各自可操作连接到增强子/启动子调控元件(例如衍生自SV40、CMV、腺病毒等，例如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，它允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经载体转染的CHO细胞。培养所选转化宿主细胞以允许表达抗体重链和轻链并从培养基回收抗体。
还可通过转基因动物产生抗体。举例来说，美国专利第5,849,992号描述在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建包括乳特异性启动子和编码所关注抗体的核酸以及分泌信号序列的转基因。由此类转基因哺乳动物的雌性产生的乳包括其中分泌的所关注抗体。抗体可从乳纯化，或对于一些应用直接使用。还提供包含一种或多种本文所述核酸的动物。
本公开的抗体可从宿主细胞的内部或外部(例如培养基)分离并且纯化为大体上纯且均质的抗体。常用于抗体纯化的分离和纯化方法可用于分离和纯化抗体，并且不限于任何特定方法。抗体可通过适当地选择和组合例如柱色谱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析和重结晶来分离和纯化。色谱包括例如亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤、反相色谱和吸附色谱(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory CourseManual.Daniel R.Marshak等人编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。色谱可使用液相色谱(例如HPLC和FPLC)来实施。用于亲和色谱的柱包括蛋白质A柱和蛋白质G柱。使用蛋白质A柱的柱的实例包括Hyper D、POROS和Sepharose FF(GE HealthcareBiosciences)。本公开还包括使用这些纯化方法高度纯化的抗体。
抗体(例如抗体X)可例如通过制备和表达编码所列举氨基酸序列的合成基因、或通过突变人类种系基因以提供编码所列举氨基酸序列的基因来制得。另外，这种抗体和其它抗PD-1抗体可例如使用以下方法中的一种或多种来获得。
人源化抗体可通过用人类Fv可变区的等效序列替代不直接参与抗原结合的Fv可变区序列来产生。用于产生人源化抗体的一般方法提供于Morrison,S.L.,Science,229:1202-1207(1985)；Oi等人，BioTechniques,4:214(1986)；以及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；以及US 6,407,213中。那些方法包括分离、操纵和表达编码重链或轻链中的至少一者的免疫球蛋白Fv可变区的全部或一部分的核酸序列。此类核酸的来源为本领域技术人员所熟知，并且例如可从如上文所述产生针对预定靶的抗体的杂交瘤、从种系免疫球蛋白基因或从合成构建体获得。然后可将编码人源化抗体的重组DNA克隆到适宜表达载体中。
例如，人类种系序列公开于Tomlinson,I.A.等人，J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)；Cook,G.P.等人，Immunol.Today,16:237-242(1995)；Chothia,D.等人，J.Mol.Bio.227:799-817(1992)；以及Tomlinson等人，EMBO J.,14:4628-4638(1995)中。VBASE目录提供人类免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson,I.A.等人，MRCCentre for Protein Engineering,Cambridge,UK编译)。这些序列可用作例如框架区和CDR的人类序列的来源。还可使用一致人类框架区，例如如美国专利第6,300,064号中所述。
还可使用用于人源化抗体的其它方法。举例来说，其它方法可解释抗体的三维结构、三维靠近结合决定簇的框架位置和免疫原性肽序列。参见例如WO 90/07861；美国专利第5,693,762号；第5,693,761号；第5,585,089号；第5,530,101号；以及第6,407,213号；Tempest等人(1991)Biotechnology 9:266-271。另一种方法称为“人工程化(humaneering)”并且描述于例如U.S.2005-008625中。
抗体可包括人类Fc区，例如野生型Fc区或包括一个或多个变化的Fc区。在一个实施方案中，恒定区经改变(例如经突变)以改进抗体的性质(例如增加或降低以下中的一者或多者：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能或补体功能)。举例来说，人类IgG1恒定区可在一个或多个残基(例如残基234和237中的一者或多者(基于Kabat编号))处突变。抗体可在重链的CH2区中具有降低或改变效应功能(例如Fc受体结合和补体活化)的突变。举例来说，抗体可具有突变，例如美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中所述的那些突变。抗体还可具有稳定免疫球蛋白的两条重链之间的二硫键的突变，例如IgG4的铰链区的突变，如此项技术中所公开(例如Angal等人(1993)Mol.Immunol.30:105-08)。还参见例如U.S.2005-0037000。
抗PD-1抗体可呈全长抗体的形式，或呈抗PD-1抗体的低分子量形式的形式(例如生物活性抗体片段或微小抗体)，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、dAb、scFv和sc(Fv)2。本公开所涵盖的其它抗PD-1抗体包括含有单一可变链(例如VH或VL)的单结构域抗体(sdAb)或其生物活性片段。参见例如Moller等人，J.Biol.Chem.,285(49):38348-38361(2010)；Harmsen等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(1):13-22(2007)；U.S.2005/0079574和Davies等人(1996)Protein Eng.,9(6):531-7。与完整抗体一样，sdAb能够选择性结合到特定抗原。sdAb的分子量仅为12-15kDa，远小于普通抗体，甚至小于Fab片段和单链可变片段。
本文提供包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段和其一种或多种酸性变体的混合物的组合物，例如，其中酸性变体的量小于约80％、70％、60％、60％、50％、40％、30％、30％、20％、10％、5％或1％。还提供包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含至少一个脱酰胺位点，其中组合物的pH为约5.0到约6.5，使得例如至少约90％的抗PD-1抗体不脱酰胺(即小于约10％的抗体脱酰胺)。在某些实施方案中，小于约5％、3％、2％或1％的抗体脱酰胺。pH可为5.0到6.0，例如5.5或6.0。在某些实施方案中，组合物的pH是5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
“酸性变体”是所关注多肽的变体，其酸性大于(例如如通过阳离子交换色谱所测定)所关注多肽。酸性变体的实例是脱酰胺变体。
多肽分子的“脱酰胺”变体是其中原始多肽的一个或多个天冬酰胺残基已转化成天冬氨酸，即中性酰胺侧链已转化成具有总体酸性特征的残基的多肽。
如本文提及包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段的组合物所用的术语“混合物”意指存在期望抗PD-1抗体或其抗原结合片段和其一种或多种酸性变体二者。酸性变体可主要包含脱酰胺的抗PD-1抗体以及少量其它酸性变体。
在某些实施方案中，经突变以消除脱酰胺的抗体的结合亲和力(KD)、缔合速率(KD缔合)和/或解离速率(KD解离)类似于野生型抗体的结合亲和力、缔合速率和/或解离速率，例如差别小于约5倍、2倍、1倍(100％)、50％、30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％。
抗体片段
抗体片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Facb和Fv)可通过完整抗体的蛋白水解消化来制备。举例来说，抗体片段可通过用酶(例如木瓜酶、胃蛋白酶或纤溶酶)处理完整抗体来获得。完整抗体的木瓜酶消化产生F(ab)2或Fab片段；完整抗体的胃蛋白酶消化产生F(ab’)2或Fab’；并且完整抗体的纤溶酶消化产生Facb片段。
替代地，抗体片段可以重组方式产生。举例来说，可构建编码所关注抗体片段的核酸，将其引入表达载体中，并且在适宜宿主细胞中表达。参见例如Co,M.S.等人，J.Immunol.,152:2968-2976(1994)；Better,M.和Horwitz,A.H.,Methods in Enzymology,178:476-496(1989)；Plueckthun,A.和Skerra,A.,Methods in Enzymology,178:476-496(1989)；Lamoyi,E.,Methods in Enzymology,121:652-663(1989)；Rousseaux,J.等人，Methods in Enzymology,(1989)121:663-669(1989)；以及Bird,R.E.等人，TIBTECH,9:132-137(1991)。抗体片段可在大肠杆菌中表达和从其分泌，因此可容易地产生大量这些片段。抗体片段可从抗体噬菌体文库分离。替代地，Fab'-SH片段可直接从大肠杆菌回收并化学偶合以形成F(ab)2片段(Carter等人，Bio/Technology,10:163-167(1992))。根据另一方法，F(ab')2片段可直接从重组宿主细胞培养物分离。包含补救受体结合表位残基的具有延长的活体内半衰期的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利第5,869,046号中。
微小抗体
抗PD-1抗体的微小抗体包括双价抗体、单链(scFv)和单链(Fv)2(sc(Fv)2)。
“双价抗体”是通过基因融合构建的二价微小抗体(参见例如Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6444-6448(1993)；EP 404,097；WO 93/11161)。双价抗体是由两条多肽链构成的二聚体。双价抗体的每条多肽链的VL和VH结构域通过连接体结合。构成连接体的氨基酸残基的数量可介于2到12个残基之间(例如3-10个残基或5个或约5个残基)。双价抗体中多肽的连接体通常太短以致于VL和VH无法彼此结合。因此，在同一多肽链中编码的VL和VH无法形成单链可变区片段，而是与不同的单链可变区片段形成二聚体。因此，双价抗体具有两个抗原结合位点。
scFv是通过用连接体连接VH和VL获得的单链多肽抗体(参见例如Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)；以及Plickthun,“The Pharmacologyof onoclonal Antibodies”，第113卷，Resenburg和Moore编辑，Springer Verlag,NewYork，第269-315页，(1994))。VH和VL连接的顺序不受具体限制，并且它们可以任一顺序排列。排列的实例包括：[VH]连接体[VL]；或[VL]连接体[VH]。scFv中的H链V区和L链V区可衍生自本文所述的任何抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
sc(Fv)2是其中两个VH和两个VL通过连接体连接形成单链的微小抗体(Hudson等人，J.Immunol.Methods,(1999)231:177-189(1999))。sc(Fv)2可例如通过用连接体联结scFv来制备。本发明的sc(Fv)2包括优选其中两个VH和两个VL以下列顺序排列的抗体：从单链多肽的N末端开始，VH、VL、VH和VL([VH]连接体[VL]连接体[VH]连接体[VL])；然而，两个VH和两个VL的顺序并不限于上述排列，并且它们可以任一顺序排列。
双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两个不同的表位具有结合特异性的抗体。例示性双特异性抗体可结合到PD-1蛋白的两个不同的表位。其它此类抗体可组合PD-1结合位点与另一蛋白质的结合位点。双特异性抗体可制备为全长抗体或其低分子量形式(例如F(ab')2双特异性抗体、sc(Fv)2双特异性抗体、双价抗体双特异性抗体)。
传统全长双特异性抗体的产生是基于两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同特异性(Millstein等人，Nature,305:537-539(1983))。在不同方法中，使具有期望结合特异性的抗体可变结构域融合到免疫球蛋白恒定结构域序列。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独表达载体中，并共转染到适宜宿主细胞中。这提供调整三种多肽片段的比例的较大灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等比率表达产生高产量时，可将两条或所有三条多肽链的编码序列插入单个表达载体中。
根据美国专利第5,731,168号中所述的另一种方法，一对抗体分子之间的界面可经工程化以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选界面包含CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，来自第一抗体分子的界面的一条或多条小氨基酸侧链经较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替代。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替代较大氨基酸侧链在第二抗体分子的界面上产生大小与较大侧链相同或相似的补偿性“空腔”。这提供相对于其它不期望最终产物(例如同二聚体)增加异二聚体产率的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源结合物”抗体。举例来说，异源结合物中的一种抗体可偶合到抗生物素蛋白，另一种偶合到生物素。异源结合物抗体可使用任何方便的交联方法来制得。
“双价抗体”技术提供制造双特异性抗体片段的替代性机制。片段包含通过连接体联结到VL的VH，所述连接体因太短以致于无法在同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。
多价抗体
表达抗体所结合的抗原的细胞对多价抗体的内化(和/或分解代谢)可快于二价抗体。本文所述的抗体可为具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)，它们可容易地通过重组表达编码抗体多肽链的核酸来产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。例示性二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由其组成)。多价抗体可包含三个到约八个(例如四个)抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体任选地包含至少一条多肽链(例如至少两条多肽链)，其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的多肽链，X1和X2表示氨基酸或肽间隔体，并且n是0或1。
结合抗体
本文所公开的抗体可为结合抗体，它们结合到各种分子，包括大分子物质，例如聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、经PEG修饰的聚乙烯亚胺(PEI)(PEI-PEG)、聚谷氨酸(PGA)(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物)、透明质酸、放射性材料(例如90Y、131I)、荧光物质、发光物质、半抗原、酶、金属螯合物、药物和毒素(例如刺孢霉素(calcheamicin)、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A、蓖麻毒素(例如去糖基化蓖麻毒素A链))。
在一个实施方案中，为改善抗PD-1抗体的细胞毒性作用并且因此改善其治疗有效性，使抗体与高毒性物质(包括放射性同位素和细胞毒性剂)结合。这些结合物可将毒性负载选择性递送到靶位点(即表达抗体所识别的抗原的细胞)，同时保留抗体未识别的细胞。为使毒性最小化，通常基于具有短血清半衰期的分子来工程化结合物(因此，使用鼠类序列以及IgG3或IgG4同型)。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段用将其在循环中(例如在血液、血清或其它组织中)的稳定和/或滞留改善例如至少1.5倍、2倍、5倍、10倍或50倍的部分修饰。举例来说，抗PD-1抗体或其抗原结合片段可与聚合物(例如大体上非抗原性聚合物，例如聚环氧烷或聚环氧乙烷)缔合(例如结合)。适宜聚合物按重量计变化很大。可使用数量平均分子量介于约200到约35,000道尔顿(或约1,000到约15,000和2,000到约12,500)范围内的聚合物。举例来说，抗PD-1抗体或其抗原结合片段可结合到水溶性聚合物，例如亲水性聚乙烯基聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。此类聚合物的实例包括聚环氧烷均聚物，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是维持嵌段共聚物的水溶性。其它有用的聚合物包括聚氧化烯，例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆(carbomer)；以及分支或不分支多糖。
上述结合抗体可通过对本文所述的抗体或其较低分子量形式实施化学修饰来制备。用于修饰抗体的方法为此项技术中所熟知(例如US 5057313和US 5156840)。
药盒
本公开还包括可用于例如治疗或预防本文所述的A2A/A2B相关的疾病或病症的医药药盒，其包括一个或多个含有药物组合物的容器，所述药物组合物包含治疗有效量的本公开化合物。此类药盒可进一步包括(如果需要)多种常规医药药盒组分中的一种或多种，例如含有一种或多种药学上可接受的载体的容器、其它容器等，如本领域技术人员将容易地明了。呈插页或呈标记形式的指示待施用组分的量、施用指南和/或混合各组分的指南的说明书也可包括在药盒中。
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例用于说明性目的，并不打算以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地意识到多种非关键参数，其可经改变或改进而产生基本上相同的结果。应了解，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征还可组合提供于单一实施方案中。相反，为简洁起见在单一实施方案的上下文中描述的本发明的多个特征还可单独或以任一适宜子组合提供。
除本文所述的那些修改外，本领域技术人员根据前述描述将明了本发明的多种修改。此类修改也打算属于所附权利要求书的范围内。本公开中所引用的每篇参考文献(包括所有专利、专利申请和公布)的全文都以引用方式并入本文中。
实施例
实施例1：活体外CHO-PD-L1共培养分析
在活体外CHO-PD-L1共培养分析中，在CHO-PD-L1细胞存在下用PD-1抗体处理T细胞，并使用腺苷模拟试剂5′-N-乙基甲酰胺腺苷(NECA)来活化腺苷信号传导。在这些条件下，化合物9可利用抗PD1试剂恢复T细胞功能。
在2μM NECA处理下，在这个系统中测试的抗PD1试剂包括：(A)派姆单抗，(B)抗体X，和(C)化合物Y，如图1中所显示。
方案：
在第0天，将10,000个CHO PDL1+细胞平铺于板96组织培养平底板中的100ul不含抗生素的CHO培养基中。在第1天，将T细胞解冻并以1×106个细胞/ml重悬浮于T细胞培养基中。从CHO PDL1+细胞板去除培养基并添加130ul T细胞培养基。将198ul的T细胞培养基以2ul或1:100稀释度添加到化合物板上，然后重悬浮。将来自化合物板的20ul化合物以1:1000的最终化合物稀释度添加到CHO细胞板上。将50ul T细胞(50,000个细胞)添加到含有CHO细胞的板上以制造总共200ul的体积，并在37℃下培育72hr。培养3天后，收集上清液，使用用于hIFNg和hIL2的ProCartaplex 2plex试剂盒(Life Technologies目录号PPX-02)进行hIFNg和hIL2细胞因子分析运行(制造商的方案)。在Flex Map 3D Luminex多路复用平台上使用ProCartaplex试剂盒运行细胞因子分析。
实施例2：活体外混合谱系反应分析
在另一活体外分析，即混合谱系反应分析(MLR)中，通过CD3抗体刺激健康供体的PBMC，并在10μM腺苷模拟试剂NECA下用阿替利珠单抗、化合物9或化合物3A处理(图2A-2D)。
方案：
在第0天，将来自健康供体的10,000个PBMC与来自另一健康供体的10,000个γ辐照的PBMC共培养。将细胞平铺于96孔组织培养圆底板中的200ul补充有10％FBS的RPMI-1640培养基中，并经或不经10μM NECA、5ng/ml CD3抗体(克隆OKT3)和所指示浓度的化合物/抗体处理。将细胞在37℃下培育4天。通过HTRF试剂盒(Cisbio,62HIFNGPEH)测量每孔上清液中的IFN-γ，并在第4天在Pherastar FS读板仪(BMG Labtech)上检测荧光信号。
化合物9在与抗PD-L1抗体(即阿替利珠单抗)组合时能够显著增加IFNγ产生(图2A-2B)。化合物3A在与抗PD-L1抗体(即阿替利珠单抗)组合时也能够显著增加IFNγ产生(图2C-2D)。
实施例3：小鼠协同模型中的活体内功效研究
在两种不同模型中评估化合物9对肿瘤生长的抑制。已展示，CT-26鼠类结肠癌在肿瘤微环境中具有高腺苷水平并且反映经选择用于临床研究的高腺苷肿瘤(Mosely等人，Cancer Immunol Res；5(1)2017年1月，第29-41页)。作为单剂，在10mg/kg BID下，化合物9以相对于媒介物对照52％的肿瘤生长抑制(TGI)显著减缓肿瘤生长，并且另外显示与抗PD-1抗体组合的加和作用(77％TGI相对于媒介物)(图3A)。相比之下，当将相同方案应用于以NSG小鼠为宿主的模型时未观察到单剂功效，所述NSG小鼠缺少T和NK细胞，认为化合物9通过所述T和NK细胞发挥其大部分治疗作用(图3B)。
在免疫寒冷(immunologically cold)模型B16黑色素瘤模型中进一步评估化合物9破坏免疫检查点抗性的能力。化合物9和抗PD-L1都具有中等但不显著的单剂活性，但在组合时协同产生54％的肿瘤生长抑制(图3C)。这些数据表明，化合物9可改变高腺苷肿瘤中的微环境并且与其它肿瘤免疫剂协作以驱动有效的抗肿瘤反应。
实施例A：A2A/A2B抑制剂的活性
I.A2A
Figure BDA0003804213750000791
HTRF分析
在黑色小体积384孔聚苯乙烯板(Greiner 784076-25)中以10μL的最终体积实施分析。首先将测试化合物在DMSO中连续稀释，并将100nl添加到板孔，之后添加其它反应组分。DMSO的最终浓度为1％。将
Figure BDA0003804213750000792
腺苷A2A标记的细胞(CisBio C1TT1A2A)以1:5稀释到Tag-lite缓冲液(CisBio LABMED)中，并以1200g旋转5min。将沉淀物以10.4X初始细胞悬液体积的体积重悬浮于Tag-lite缓冲液中，并添加腺苷A2A受体红色拮抗剂荧光配体(CisBio L0058RED)，其最终浓度为12.5nM。将10ul细胞和配体混合物添加到分析孔中，并在室温下培育45分钟，然后在配有HTRF 337/620/665光学模块的PHERAstar FS读板仪(BMGLabtech)上读取。计算荧光配体的结合百分比；其中100nM的A2A拮抗剂对照ZM 241385(Tocris 1036)置换配体100％，并且1％DMSO具有0％置换。将结合％对抑制剂浓度对数的数据拟合到单位点竞争性结合模型(GraphPad Prism 7.02版)，其中配体常数＝12.5nM并且配体Kd＝1.85nM。经由这种方法获得的Ki数据显示于表2中。
II.腺苷A2B受体环状AMP GS分析
将稳定转染的表达人类腺苷A2B受体的HEK-293细胞(Perkin Elmer)维持在含有10％FBS和100μg/ml遗传霉素(Geneticin)的MEM培养基(Life Technologies)中。在分析前18到24小时，从培养物中去除遗传霉素。将使用FRET(荧光共振能量转移)技术的cisbiocAMP-GS动态试剂盒用于测量细胞中的cAMP累积。将适当浓度的本公开的化合物与白色96孔半区板(Perkin Elmer)中的10000个细胞/孔混合，并在RT下轻轻振荡30min。将12nM的激动剂NECA(R&DTechnologies)添加到每个孔，并在RT下轻轻振荡60min。将检测试剂d2标记的cAMP(受体)和抗cAMP穴状化合物(供体)添加到每个孔，并在RT下轻轻振荡60min。在Pherastar(BMG Labtech)上读取板，计算荧光比665/620，并通过使用GraphPad Prism拟合对照％对化合物浓度对数的曲线实施EC50确定。经由这种方法获得的EC50数据显示于表2中。
表2.下文提供A2A_Ki数据(实施例A(I))和A2B_cAMP_EC50数据(实施例A(II))。
Figure BDA0003804213750000801
Figure BDA0003804213750000811
Figure BDA0003804213750000817
指示A2A_Ki或A2B_cAMP_EC50≤10nM，
Figure BDA0003804213750000812
指示A2A_Ki或A2B_cAMP_EC50>10nM但≤100nM，
Figure BDA0003804213750000813
指示A2A_Ki或A2B_cAMP_EC50>100nM但≤1μM，
Figure BDA0003804213750000814
指示A2A_Ki或A2B_cAMP_EC50大于1μM。
实施例A1：3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物1)的合成
Figure BDA0003804213750000815
步骤1：3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000816
将4,6-二氯嘧啶-2-胺(2.5g,15.2mmol)、(3-氰基苯基)硼酸(2.02g,13.7mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(1.06g,0.92mmol)和碳酸钠(3.23g,30.5mmol)于1,4-二噁烷(60mL)和水(5mL)中的混合物用氮气脱气，然后将所得混合物在60℃下加热并搅拌两天。冷却到室温(r.t.)后，将混合物浓缩，用水稀释，并用DCM(30mL×3)萃取。经MgSO4干燥合并的有机层，过滤，并浓缩。通过硅胶柱上的快速色谱，用二氯甲烷中的8％EtOAc洗脱来纯化所得残余物，以提供期望产物。针对C11H8ClN4(M+H)+的LCMS计算值：231.0。实验值：231.0。
步骤2：2-(吡啶-2-基)乙酰肼
Figure BDA0003804213750000821
在r.t.下，将肼(4.15mL,132mmol)添加到2-(吡啶-2-基)乙酸甲酯(10g,66.2mmol)的乙醇(66mL)溶液。将混合物在85℃下加热并搅拌4h，然后冷却到r.t.。在静置时形成白色固体，经由过滤收集所述白色固体并且不经进一步纯化即用于下一步骤中。针对C7H10N3O(M+H)+的LCMS计算值：152.1。实验值：152.0。
步骤3：3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000822
在r.t.下，将2-(吡啶-2-基)乙酰肼(2.62g,17.34mmol)添加到3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈(4.00g,17.34mmol)的乙醇(35mL)溶液。在回流下加热并搅拌2h后，将反应混合物冷却到r.t.，并浓缩。将所得残余物溶解于N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺(20mL)中并在120℃下搅拌7h。然后将混合物冷却到r.t.，倾倒到冰上，并在r.t.下搅拌1h。通过过滤收集所得固体，并溶解于20mL 1N HCl溶液中。将所得混合物在r.t.下搅拌1h，过滤，并通过添加饱和NaHCO3溶液中和水层。通过过滤收集所得沉淀，并干燥以获得棕色固体状期望产物。针对C18H14N7(M+H)+的LCMS计算值：328.1；实验值：328.1。
步骤4：3-(5-氨基-8-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000831
向3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(2g,6.11mmol)于DMF(12mL)中的混合物中在-30℃下逐份添加NBS(1.09g,6.11mmol)。将反应混合物缓慢升温到0℃，产生均质溶液。在0℃下搅拌1h后，用饱和NaHCO3溶液稀释反应混合物并通过过滤收集所得固体。然后通过硅胶柱上的快速色谱，用DCM中的0到10％MeOH洗脱来纯化固体，以提供期望产物。针对C18H13BrN7(M+H)+的LCMS计算值：406.0；实验值：406.0。
步骤5：3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
将Pd(Ph3P)4(284mg,0.246mmol)添加到4-(三丁基锡烷基)嘧啶(1090mg,2.95mmol)、3-(5-氨基-8-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(1000mg,2.46mmol)和氯化铜(I)(244mg,2.46mmol)于1,4-二噁烷(12mL)中的混合物。用N2吹扫反应混合物并在80℃下搅拌7h。将所得混合物冷却到r.t.，浓缩，用DCM(50mL)稀释并用饱和NH4OH溶液洗涤。经Na2SO4干燥有机层，浓缩，并通过制备型LC-MS(pH 2，乙腈/含TFA的水)纯化，以提供呈TFA盐形式的产物。针对C22H16N9(M+H)+的LCMS计算值：406.2；实验值：406.2。1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.95(s,1H),8.83(d,J＝5.3Hz,1H),8.59(d,J＝5.1Hz,1H),7.96(m,1H),7.88(d,J＝5.1Hz,1H),7.82(d,J＝7.6Hz,1H),7.76(s,1H),7.60-7.53(m,2H),7.53-7.48(m,1H),7.48-7.42(m,1H),4.49(s,2H)。
实施例A2：3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物2)的合成
Figure BDA0003804213750000841
步骤1：2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯
Figure BDA0003804213750000842
在0℃下，将浓硫酸(1.42mL,27mmol)添加到2,6-二氟苦杏仁酸(5g,27mmol)的甲醇(45mL)溶液。将混合物在r.t.下搅拌4h，然后浓缩。向所得浆液中添加饱和NaHCO3溶液(30mL)。用DCM(3×20mL)萃取所得混合物。用水洗涤合并的有机层，经Mg2SO4干燥，过滤，并浓缩，以提供粗产物，其未经进一步纯化即用于下一步骤中。针对C11H12F2NO3(M+H+MeCN)+的LC-MS计算值：m/z＝244.1；实验值：244.2。
步骤2：3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
这种化合物使用与针对实施例A1所述相似的程序、在步骤2中用2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯替代2-(吡啶-2-基)乙酸甲酯来制备。通过手性SFC使用PhenomenexLux Cellulose-1柱(21.2×250mm,5μm粒径)，用等梯度流动相CO2中的25％MeOH以80mL/分钟的流量洗脱来分离两种对映异构体。分离峰1，并通过制备型LCMS(pH＝2，MeCN/含TFA的水)进一步纯化以获得呈TFA盐形式的期望产物。针对C23H15F2N8O(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝457.1；实验值：457.1。1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.94(d,J＝1.3Hz,1H),8.81(d,J＝5.2Hz,1H),7.85(dd,J＝5.3,1.4Hz,1H),7.81(dt,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.76(t,J＝1.7Hz,1H),7.55(dt,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.49(t,J＝7.8Hz,1H),7.44(tt,J＝8.4,6.4Hz,1H),7.09(t,J＝8.3Hz,2H),6.27(s,1H)。
实施例A3：3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物3A)和3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物3B)的合成
Figure BDA0003804213750000851
步骤1：3-(5-氨基-2-(羟基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000852
在r.t.下，将2-羟基乙酰肼(2.34g,26.01mmol)添加到3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈(4.00g,17.34mmol)的乙醇(35mL)溶液(实施例A1，步骤1)。在回流下加热并搅拌2h后，将反应混合物冷却到r.t.，并浓缩。将所得残余物溶解于N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺(20mL)中并在120℃下搅拌7h。然后将混合物冷却到r.t.，倾倒到冰上，并在r.t.下搅拌1h。通过过滤收集所得固体，并溶解于20mL 1N HCl溶液中。将所得混合物在r.t.下搅拌1h，过滤，并通过添加饱和NaHCO3溶液中和水层。通过过滤收集所得沉淀，并干燥以获得棕色固体状期望产物。针对C13H11N6O(M+H)+的LCMS计算值：267.1；实验值：267.1。
步骤2：3-(5-氨基-8-溴-2-(羟基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000861
向3-(5-氨基-2-(羟基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(1.0g,3.76mmol)于DMF(12mL)中的混合物中在-30℃下逐份添加NBS(0.67g,3.76mmol)。将反应混合物缓慢升温到0℃，产生均质溶液。在0℃下搅拌1h后，用饱和NaHCO3溶液稀释反应混合物，通过过滤收集期望产物并干燥。针对C13H10BrN6O(M+H)+的LCMS计算值：345.0；实验值：345.0。
步骤3：3-(5-氨基-2-(羟基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000862
将四(三苯基膦)钯(0)(0.067g,0.058mmol)添加到4-(三丁基锡烷基)嘧啶(0.321g,0.869mmol)、3-(5-氨基-8-溴-2-(羟基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(0.20g,0.579mmol)、CsF(0.176g,1.159mmol)和碘化铜(I)(0.022g,0.116mmol)于1,4-二噁烷(5.0mL)中的混合物。用N2吹扫反应混合物并在80℃下搅拌7h。将所得混合物冷却到r.t.，浓缩并通过快速柱色谱，用DCM中的0％到10％甲醇洗脱来纯化，以提供产物。针对C17H13N8O(M+H)+的LC-MS计算值：345.1；实验值：345.1。
步骤4：3-(5-氨基-2-(氯甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000871
在r.t.下，向3-(5-氨基-2-(羟基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(0.1g,0.290mmol)于乙腈(10ml)中的混合物中添加亚硫酰氯(0.212ml,2.90mmol)。将反应混合物在r.t.下搅拌5h，浓缩，并通过快速色谱，用DCM中的0％到5％甲醇洗脱来纯化，以提供产物。针对C17H12ClN8(M+H)+的LC-MS计算值：363.1；实验值：363.1。
步骤5：3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物3A)和3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物3B)的混合物
将3-(5-氨基-2-(氯甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(10mg,0.028mmol)、2-(1H-四唑-5-基)吡啶(8.1mg,0.055mmol)和Cs2CO3(20.7mg,0.064mmol)于DMF(1mL)中的混合物在100℃下搅拌10min。然后将反应混合物冷却到r.t.，用甲醇(4mL)稀释，并通过制备型LC-MS(pH 2，乙腈/含TFA的水)纯化，以提供呈TFA盐形式的产物。针对C23H16N13(M+H)+的LCMS计算值：474.2；实验值：474.2。
化合物3A：1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.99(d,J＝1.4Hz,1H),8.85(d,J＝5.3Hz,1H),8.80-8.71(m,1H),8.71-8.39(b,2H),8.18(d,J＝7.7,1.1Hz,1H),8.04(t,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.85(m,2H),7.80-7.76(m,1H),7.62-7.55(m,2H),7.53(t,J＝7.8Hz,1H),6.39(s,2H)。
实施例A4：3-(5-氨基-2-((3-甲基吡啶-2-基)甲氧基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物4)的合成
Figure BDA0003804213750000881
步骤1：6-氯-N2,N2-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2,4-二胺
Figure BDA0003804213750000882
向2,6-二氯嘧啶-4-胺(5.0g,31mmol)于2-丙醇(31mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(6.4ml,37mmol)和双(4-甲氧基苄基)胺(7.9g,31mmol)。将所得溶液在100℃下搅拌16h，冷却到r.t.，用水(100mL)稀释，并用EtOAc(100mL)萃取。用水和盐水洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥，并浓缩以产生粗产物，其未经进一步纯化即用于下一步骤中。针对C20H22ClN4O2(M+H)+的LC-MS计算值：385.1；实验值：385.1。
步骤2：7-氯-N5,N5-双(4-甲氧基苄基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-2,5-二胺
Figure BDA0003804213750000883
在r.t.下，将异硫氰酸乙氧羰酯(3.1mL,26mmol)添加到6-氯-N2,N2-双(4-甲氧基苄基)嘧啶-2,4-二胺(1.0g,2.6mmol)的1,4-二噁烷(5.0mL)溶液中。然后将反应混合物在90℃下搅拌过夜，冷却到r.t.，并浓缩。将所得物质溶解于甲醇(12mL)和乙醇(12mL)中，并添加N,N-二异丙基乙胺(0.91mL,5.2mmol)，然后添加羟胺盐酸盐(0.54g,7.8mmol)。将反应混合物在45℃下搅拌2h，冷却到r.t.，并浓缩。将所得物质溶解于EtOAc中，用水洗涤，经无水硫酸钠干燥，并浓缩。然后通过硅胶色谱，用己烷中的0％到50％EtOAc洗脱来纯化粗物质，以提供产物。针对C21H22ClN6O2(M+H)+的LC-MS计算值：425.1；实验值：425.2。
步骤3：3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000891
将氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)(330mg,0.42mmol)添加到(3-氰基苯基)硼酸(460mg,3.2mmol)、7-氯-N5,N5-双(4-甲氧基苄基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-2,5-二胺(890mg,2.1mmol)和碳酸钠(890mg,8.4mmol)于1,4-二噁烷(8.8mL)和水(1.8mL)中的混合物中。用N2吹扫混合物并在95℃下搅拌过夜。然后将反应混合物冷却到r.t.，浓缩，并通过硅胶色谱，用DCM中的0％到50％EtOAc洗脱来纯化，以提供期望产物。针对C28H26N7O2(M+H)+的LC-MS计算值：492.2；实验值：492.2。
步骤4：3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-8-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000901
在0℃下，向3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(330mg,0.66mmol)于DMF(1.4mL)中的溶液中缓慢添加NBS(120mg,0.66mmol)。然后将反应混合物在r.t.下搅拌30min，然后添加水(10mL)。通过过滤收集所得固体，并干燥以获得期望产物。针对C28H25BrN7O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝570.1；实验值：570.2。
步骤5：3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000902
将3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-8-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(350mg,0.61mmol)、4-(三丁基锡烷基)嘧啶(210μL,0.67mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(70mg,0.060mmol)、碘化铜(I)(23mg,0.12mmol)和氟化铯(180mg,1.2mmol)于二噁烷(4.7mL)中的混合物在微波反应器中在140℃下加热并搅拌30min。然后将反应混合物冷却到r.t.，经由硅藻土塞过滤(用DCM洗涤)，并浓缩。通过硅胶柱色谱，用0-20％MeOH/DCM洗脱来纯化所得材料以获得期望产物。针对C32H28N9O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝570.2；实验值：570.3。
步骤6：3-(5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000911
在氮气下在50℃下，向溴化铜(II)(91mg,0.407mmol)和亚硝酸叔丁酯(0.054ml,0.407mmol)于乙腈(3mL)中的混合物中逐滴添加乙腈(3mL)中的3-(2-氨基-5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(100mg,0.203mmol)。将混合物在50℃下搅拌2小时。冷却到室温后，添加1N NH4OH水溶液(20mL)并用CH2Cl2(20mL)将混合物萃取三次。经硫酸钠干燥合并的有机层，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱，用50％-100％乙酸乙酯/己烷洗脱来纯化粗材料以获得期望产物。针对C32H26BrN8O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝633.1；实验值：633.2。
步骤7：3-(5-氨基-2-((3-甲基吡啶-2-基)甲氧基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
将氢化钠(60％于矿物油中，3.8mg,0.095mmol)、3-(5-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(20mg,0.032mmol)和(3-甲基吡啶-2-基)甲醇(9.1μL,0.095mmol)于1,4-二噁烷(1mL)中的悬浮液在110℃下在氮气下加热并搅拌过夜。然后将反应混合物冷却到rt，浓缩，并添加TFA(1.0mL)。然后将所得混合物在110℃下搅拌30min，冷却到rt，用乙腈稀释，过滤并通过制备型LC-MS(pH 2，乙腈/含TFA的水)纯化以获得呈TFA盐形式的期望产物。针对C23H18N9O(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝436.2；实验值：436.2。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.97(d,J＝1.4Hz,1H),8.88(d,J＝5.2Hz,1H),8.58-8.52(m,1H),7.97(d,J＝7.8Hz,1H),7.88(dd,J＝5.4,1.4Hz,1H),7.85(dt,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.78(t,J＝1.8Hz,1H),7.60-7.54(m,2H),7.53(t,J＝7.8Hz,1H),5.69(s,2H),2.48(s,3H)。
实施例A5：3-(5-氨基-2-(羟基(苯基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物5)的合成
Figure BDA0003804213750000921
步骤1：3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750000922
将4,6-二氯嘧啶-2-胺(2.5g,15.24mmol)、(3-氰基苯基)硼酸(2.016g,13.72mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(1.057g,0.915mmol)和碳酸钠(3.23g,30.5mmol)于1,4-二噁烷(60mL)和水(5mL)中的混合物用氮气脱气，然后将所得混合物在60℃下加热两天。冷却到室温(RT)后，将混合物浓缩，然后用水稀释，并用二氯甲烷(DCM,3×30mL)萃取。经MgSO4干燥合并的有机层，过滤，并浓缩。通过含有二氯甲烷中的8％乙酸乙酯(EtOAc)的硅胶柱上的快速色谱纯化残余物，以提供期望产物。针对C11H8ClN4(M+H)+的LCMS计算值：231.0。实验值：231.0。
步骤2：3-(5-氨基-2-(羟基(苯基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈
将3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈(100mg,0.434mmol)和2-羟基-2-苯基乙酰肼(108mg,0.650mmol)于乙醇(2ml)中的溶液在95℃下加热并搅拌3h。冷却到RT后，将反应将混合物浓缩到干燥，溶解于N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺(1mL)中并在120℃下搅拌7h。将所得混合物冷却到RT，倾倒到冰上，并搅拌1h。用DCM将所得悬浮液萃取三次。经MgSO4干燥合并的有机层，过滤，并浓缩。将残余物溶解于甲醇(MeOH)中并通过制备型LC-MS(pH 2，乙腈/含TFA的水)纯化，以提供呈TFA盐形式的产物。针对C19H15N6O(M+H)+的LCMS计算值：343.1；实验值：343.1。
实施例A6：3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(化合物6)的合成
Figure BDA0003804213750000931
步骤1：3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)-2-氟苯甲腈
Figure BDA0003804213750000932
在20min内向冷却到0℃的3-溴-2-氟苯甲腈(18.3g,91mmol)于THF(60mL)中的溶液中添加THF(1.3M)中的i-PrMgCl LiCl络合物(70.4mL,91mmol)。将混合物在0℃下搅拌50min，然后在0℃下添加2-MeTHF(1.9M)中的氯化锌(48.1mL,91mmol)。将反应在r.t.下搅拌25min，此时一次性添加4,6-二氯嘧啶-2-胺(10g,61.0mmol)。将溶液搅拌10min。将四(三苯基膦)钯(1.41g,1.22mmol)添加到混合物，并将反应物在r.t.下搅拌16h。完成后，将2,4,6-三巯基三嗪硅胶(2g)添加到反应溶液。将混合物搅拌1h并过滤。用乙酸乙酯洗涤固体直到期望产物完全洗脱(如通过LCMS所检测)。用饱和氯化铵溶液和水洗涤滤液。浓缩有机物以提供粗产物。将水添加到粗材料，通过过滤收集所得沉淀并在氮气流下干燥。粗材料未经额外纯化即后续使用。针对C11H7ClFN4(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝249.0；实验值：249.0。
步骤2：2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯
Figure BDA0003804213750000941
在0℃下，将浓硫酸(1.4mL,27mmol)添加到2,6-二氟苦杏仁酸(5.0g,27mmol)的甲醇(45mL)溶液。将混合物在r.t.下搅拌4h，然后浓缩。向所得浆液中添加饱和NaHCO3溶液。用DCM萃取所得混合物。用水洗涤合并的有机层，经MgSO4干燥，过滤，并浓缩，以提供粗产物，其未经进一步纯化即用于下一步骤中。针对C11H12F2NO3(M+H+MeCN)+的LC-MS计算值：m/z＝244.1；实验值：244.2。
步骤3：2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酰肼
Figure BDA0003804213750000942
在RT下，将肼(3.0mL,96mmol)添加到2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯(10.8g,53mmol)的乙醇(90mL)溶液。将反应混合物在100℃下搅拌2h，冷却到RT，浓缩，并且未经进一步纯化即用于下一步骤中。针对C8H9F2N2O2(M+H)+的LC-MS计算值：203.1；实验值：203.2。
步骤4：3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
标题化合物使用与针对实施例A5步骤2所述相似的程序、用3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)-2-氟苯甲腈替代3-(2-氨基-6-氯嘧啶-4-基)苯甲腈，并用2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酰肼替代2-羟基-2-苯基乙酰肼来制备。通过手性SFC使用Phenomenex(R,R)-Whelk-O1柱(21.2×250mm,5μm粒径)，用等梯度流动相CO2中的15％MeOH以85mL/分钟的流量洗脱来分离两种对映异构体。峰1和峰2的滞留时间分别为3.8min和5.3min。浓缩后，通过制备型LCMS(pH＝2，MeCN/含TFA的水)纯化峰2以获得呈TFA盐形式的期望产物。针对C19H12F3N6O(M+H)+的LC-MS计算值：397.1；实验值：397.1。
实施例A7：5-氨基-7-(3-氰基-2-氟苯基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-8-甲腈(化合物7)的合成
Figure BDA0003804213750000951
步骤1：3-(5-氨基-8-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
Figure BDA0003804213750000952
这种化合物使用与针对实施例A1步骤4所述相似的程序、用3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(来自实施例A6)替代3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈来制备。针对C19H11BrF3N6O(M+H)+的LCMS计算值：475.0；实验值：475.0。
步骤2：5-氨基-7-(3-氰基-2-氟苯基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-8-甲腈
将3-(5-氨基-8-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(0.12g,0.25mmol)、ZnCN2(0.060g,0.51mmol)和tBuXPhos Pd G3(0.020g,0.025mmol)于1,4-二噁烷(0.63mL)和水(0.63mL)中的混合物用N2吹扫并在100℃下搅拌1h。冷却到r.t.后，用饱和NaHCO3稀释反应物并用EtOAc(3×)萃取有机物。经MgSO4干燥合并的有机物并浓缩。通过手性HPLC使用Phenomenex Lux Celluose-4柱(21.2×250mm,5μm粒径)，用等梯度流动相己烷中的60％EtOH以20mL/分钟的流量洗脱来分离两种对映异构体。峰1和峰2的滞留时间分别为4.9min和7.2min。浓缩后，通过制备型LC-MS(pH 2，乙腈/含TFA的水)纯化峰1，以获得呈TFA盐形式的期望产物。针对C20H11F3N7O(M+H)+的LC-MS计算值：422.1；实验值：422.1。
实施例A8：3-(5-氨基-2-((2-氟-6-(((1-甲基-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基)甲基)苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(化合物8)的合成
Figure BDA0003804213750000961
步骤1：2-(2-氟-6-乙烯基苯基)乙酸甲酯
Figure BDA0003804213750000962
将2-(2-溴-6-氟苯基)乙酸甲酯(6.0g,24mmol)、磷酸三钾(15.5g,73mmol)、乙酸钯(II)(0.55g,2.4mmol)和SPhos(1.0g,2.4mmol)的混合物添加到500mL压力容器。然后，添加二噁烷(150mL)和水(15mL)中的4,4,5,5-四甲基-2-乙烯基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(6.4ml,36mmol)，用N2吹扫反应混合物，并在80℃下搅拌16h。然后将反应混合物冷却到RT，浓缩，并用EtOAc(×3)萃取。经MgSO4干燥合并的有机层，浓缩，并通过柱色谱(DCM中的0到50％EtOAc)纯化。针对C11H12FO2(M+H)+的LC-MS计算值：195.1；实验值：195.1。
步骤2：2-(2-氟-6-乙烯基苯基)-2-羟基乙酸甲酯
Figure BDA0003804213750000971
将2-(2-氟-6-乙烯基苯基)乙酸甲酯(2.5g,12.9mmol)溶解于THF(130mL)中并冷却到-78℃。逐滴添加THF(1.0M)中的LDA(16.7mL,16.7mmol)，并将所得溶液在-78℃下搅拌30min。然后，在THF(0.5M)中逐滴添加9,9-二甲基四氢-4H-4a,7-桥亚甲基苯并[c][1,2]氧氮丙啶并(oxazireno)[2,3-b]异噻唑3,3-二氧化物(4.7g,20.6mmol)。在-78℃下30min后，将反应混合物升温到0℃并搅拌1h。用饱和NH4Cl淬灭反应。用DCM(3×)萃取水层。经无水Na2SO4干燥合并的有机物，过滤，并在减压下浓缩。通过柱色谱，用己烷中的0到50％乙酸乙酯洗脱来纯化粗产物，以提供期望产物。针对C11H11FO3Na(M+Na)+的LCMS计算值：233.1；实验值：233.1。
步骤3：2-(2-氟-6-乙烯基苯基)-2-羟基乙酰肼
Figure BDA0003804213750000972
这种化合物使用与针对实施例A6步骤3所述相似的程序、用2-(2-氟-6-乙烯基苯基)-2-羟基乙酸甲酯替代2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酸甲酯来制备。针对C10H12FN2O2(M+H)+的LCMS计算值：211.1；实验值：211.1。
步骤4：3-(5-氨基-2-((2-氟-6-乙烯基苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
Figure BDA0003804213750000973
这种化合物使用与针对实施例A6步骤4所述相似的程序、用2-(2-氟-6-乙烯基苯基)-2-羟基乙酰肼替代2-(2,6-二氟苯基)-2-羟基乙酰肼来制备。针对C21H15F2N6O(M+H)+的LCMS计算值：405.1；实验值：405.1。
步骤5：3-(5-氨基-2-((2-氟-6-甲酰基苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
Figure BDA0003804213750000981
将水中的四氧化锇(4％w/w,0.36mL,0.12mmol)添加到3-(5-氨基-2-((2-氟-6-乙烯基苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(930mg,2.30mmol)的THF(18mL)和水(4.6mL)溶液。将反应混合物在RT下搅拌5min，然后添加过碘酸钠(2.5g,11.5mmol)。搅拌1h后，用饱和NaHCO3水溶液(5％w/w,20mL)中的偏二亚硫酸钠稀释混合物并用EtOAc(×3)萃取。经MgSO4干燥合并的有机层并在减压下浓缩。通过柱色谱，用己烷中的0到100％乙酸乙酯洗脱来纯化粗材料，以提供期望产物。针对C20H13F2N6O2(M+H)+的LCMS计算值：407.1；实验值：407.1。
步骤6：3-(5-氨基-2-((2-氟-6-(((1-甲基-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基)甲基)苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈
将3-氨基-1-甲基吡咯烷-2-酮(63mg,0.55mmol)和3-(5-氨基-2-((2-氟-6-甲酰基苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈(150mg,0.37mmol)于1,2-二氯乙烷(1.9mL)中的溶液在40℃下搅拌2h。然后添加三乙酰氧基硼氢化钠(160mg,0.74mmol)并将反应混合物在室温下搅拌16h。用饱和NaHCO3稀释反应物并用EtOAc(3×)萃取有机物。经MgSO4干燥合并的有机物并浓缩。通过手性HPLC使用Phenomenex LuxCelluose-4柱(21.2×250mm,5μm粒径)，用等梯度流动相己烷中的45％EtOH以20mL/分钟的流量洗脱来分离非对映异构体。峰1和峰2的滞留时间分别为14.9min和17.5min。浓缩后，通过手性HPLC使用Phenomenex Lux Celluose-1柱(21.2×250mm,5μm粒径)，用等梯度流动相己烷中的30％EtOH以20mL/分钟的流量洗脱进一步分离峰2。峰1和峰2的滞留时间分别为11.0min和15.5min。浓缩后，通过制备型LC-MS(pH＝2，MeCN/含TFA的水)纯化峰1，以获得呈TFA盐形式的期望产物。针对C25H23F2N8O2(M+H)+的LC-MS计算值：505.2；实验值：505.2。
实施例A9：3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(化合物9)的合成
Figure BDA0003804213750000991
步骤1：3-溴-1-(2-(3-氰基苯基)-2-氧代乙基)-1H-1,2,4-三唑-5-甲酸甲酯
Figure BDA0003804213750000992
向3-溴-1H-1,2,4-三唑-5-甲酸甲酯(5.0g,24.3mmol)、3-(2-溴乙酰基)苯甲腈(5.44g,24.3mmol)于DMF(100mL)中的溶液中添加碳酸钾(3.35g,24.3mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌2h。然后用水和DCM稀释反应混合物。分离有机层，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。经由快速色谱纯化所得残余物以获得白色固体状期望产物(5.2g,61％)。针对C13H10BrN4O3(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝349.0；实验值：349.0。
步骤2：3-(2-溴-8-氧代-7,8-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001001
将3-溴-1-(2-(3-氰基苯基)-2-氧代乙基)-1H-1,2,4-三唑-5-甲酸甲酯(10.5g,30.1mmol)溶解于乙酸(100mL)中，并添加乙酸铵(23.18g,301mmol)。将混合物在110℃下搅拌12h。冷却到室温后，用水稀释反应混合物。经由过滤收集所得沉淀，用水洗涤，并在真空下干燥，以提供产物(8.4g,88％)。针对C12H7BrN5O(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝316.0；实验值：316.0。
步骤3：3-(2-溴-8-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001002
将3-(2-溴-8-氧代-7,8-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(8.4g,26.6mmol)和POCl3(49.5mL,531mmol)的混合物在110℃下搅拌过夜。冷却到室温后，将反应混合物缓慢添加到含有冰和碳酸氢钠的烧瓶中。收集所得沉淀，用水洗涤，并干燥，以提供产物(8.8g,99％)。针对C12H6BrClN5(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝333.9；实验值：334.0。
步骤4.3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001011
将3-(2-溴-8-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(8.99g,26.9mmol)、双(4-甲氧基苄基)胺(10.37g,40.3mmol)和DIPEA(9.4mL,53.7mmol)于DMF(134mL)中的混合物在85℃下搅拌过夜。将反应混合物冷却到室温，并用水稀释。经由过滤收集所得沉淀，并干燥，以提供产物(14.1g,94％)。针对C28H24BrN6O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝555.1；实验值：555.1。
步骤5：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001012
在-78℃下，向2-甲基吡啶(0.050g,0.540mmol)于THF(0.5mL)中的溶液中添加2.5M正丁基锂(0.216mL,0.540mmol)。将所得溶液在相同温度下搅拌1h，然后添加2-甲基四氢呋喃中的1.9M氯化锌(0.284mL,0.540mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌10min。
将装填有3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(0.15g,0.270mmol)、乙酸钯(1.1mg,4.7μmol)和2'-(二环己基膦基)-N,N,N',N'-四甲基联苯-2,6-二胺(4.1mg,9.5μmol)的微波瓶在高真空下抽空并用氮气回填。然后将THF(2.0mL)和甲苯(0.5mL)添加到反应瓶。将混合物冷却到0℃，并经由注射器缓慢添加从先前步骤制备的锌试剂。然后将反应混合物在60℃下搅拌过夜，冷却到室温，并在乙酸乙酯与饱和NH4Cl溶液之间分配。分离各层并用乙酸乙酯萃取水层。用水和盐水洗涤合并的有机层，经MgSO4干燥，并浓缩。经由快速色谱纯化所得残余物以提供产物(0.11g,71％)。针对C34H30N7O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝568.2；实验值：568.3。
步骤6.3-(8-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001021
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(110mg,0.194mmol)和TFA(746μL,9.69mmol)的混合物在80℃下搅拌30min，冷却到室温，并浓缩。经由制备型LCMS(pH 2)纯化所得残余物以获得白色固体状产物(TFA盐)(57mg,90％)。针对C18H14N7(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝328.1；实验值：328.1。
步骤7.3-(8-氨基-5-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001022
向3-(8-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(TFA盐)(35mg,0.079mmol)于DMF(0.5mL)/DCM(0.5mL)中的溶液中添加NBS(14.1mg,0.079mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌1h，并浓缩以提供粗产物，其未经进一步纯化即用于下一步骤中。针对C18H13BrN7(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝406.0；实验值：406.0。
步骤8.3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
将6-氯-2-甲基哒嗪-3(2H)-酮(30mg,0.21mmol)、双(频哪醇)二硼(53mg,0.21mmol)、氯(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)(15.7mg,0.02mmol)(XPhos Pd G2)和乙酸钾(61.7mg,0.63mmol)于1,4-二噁烷(1mL)中的混合物在100℃下搅拌1h。然后将3-(8-氨基-5-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(10mg,0.025mmol)、碳酸铯(37.6mg,0.116mmol)和水(0.2mL)添加到反应混合物。将所得混合物在90℃下加热1h。将混合物浓缩并通过制备型LCMS(pH 2，乙腈/含TFA的水)纯化，以提供呈TFA盐形式的期望产物。针对C23H18N9O(M+H)+的LCMS计算值：436.2；实验值：436.2。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.66-8.62(d,J＝5.1Hz,1H),8.09-8.02(d,J＝1.8Hz,1H),7.88-7.85(t,J＝1.8Hz,1H),7.85-7.81(m,3H),7.78-7.72(d,J＝9.6Hz,1H),7.66-7.51(m,4H),7.10-7.06(d,J＝9.6Hz,1H),4.59-4.48(s,2H),3.53-3.43(s,3H)。
实施例A10：3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(化合物10)的合成
Figure BDA0003804213750001031
步骤1：3-溴-1-(2-(3-氰基苯基)-2-氧代乙基)-1H-1,2,4-三唑-5-甲酸甲酯
Figure BDA0003804213750001041
向3-溴-1H-1,2,4-三唑-5-甲酸甲酯(5.0g,24.3mmol)、3-(2-溴乙酰基)苯甲腈(5.44g,24.3mmol)于DMF(100mL)中的溶液中添加碳酸钾(3.35g,24.3mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌2h。然后用水和DCM稀释反应混合物。分离有机层，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。经由快速色谱纯化所得残余物以获得白色固体状期望产物(5.2g,61％)。针对C13H10BrN4O3(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝349.0；实验值：349.0。
步骤2：3-(2-溴-8-氧代-7,8-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001042
将3-溴-1-(2-(3-氰基苯基)-2-氧代乙基)-1H-1,2,4-三唑-5-甲酸甲酯(10.5g,30.1mmol)溶解于乙酸(100mL)中，并添加乙酸铵(23.18g,301mmol)。将混合物在110℃下搅拌12h。冷却到室温后，用水稀释反应混合物。经由过滤收集所得沉淀，用水洗涤，并在真空下干燥以提供产物(8.4g,88％)。针对C12H7BrN5O(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝316.0；实验值：316.0。
步骤3：3-(2-溴-8-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001051
将3-(2-溴-8-氧代-7,8-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(8.4g,26.6mmol)和POCl3(49.5mL,531mmol)的混合物在110℃下搅拌过夜。冷却到室温后，将反应混合物缓慢添加到含有冰和碳酸氢钠的烧瓶中。经由过滤收集所得沉淀，用水洗涤，并干燥以提供产物(8.8g,99％)。针对C12H6BrClN5(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝336.0；实验值：336.0。
步骤4：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001052
将3-(2-溴-8-氯-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(8.99g,26.9mmol)、双(4-甲氧基苄基)胺(10.37g,40.3mmol)和DIPEA(9.4mL,53.7mmol)于DMF(134mL)中的混合物在65℃下搅拌过夜。将反应混合物冷却到室温，并用水稀释。经由过滤收集所得沉淀，并干燥以提供产物(14.1g,94％)。针对C28H24BrN6O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝555.1；实验值：555.1。
步骤5：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001061
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(10.0g,18.0mmol)、4,4,5,5-四甲基-2-乙烯基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(3.88g,25.2mmol)、磷酸三钾(9.55g,45.0mmol)和氯(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)(567mg,0.72mmol)于1,4-二噁烷(200mL)和水(50mL)中的混合物在85℃下搅拌2hr。将反应混合物冷却到室温，并去除大部分1,4-二噁烷。经由过滤收集所得沉淀，用水洗涤并干燥以提供粗产物(9.1g)，其直接用于下一步骤中。针对C30H27N6O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝503.2；实验值：503.1。
步骤6.3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001062
在0℃下，向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(717mg,1.43mmol)于10mL二氯甲烷中的溶液中添加1-溴吡咯烷-2,5-二酮(254mg,1.43mmol)。将所得混合物搅拌4hr，并直接通过硅胶柱纯化以提供期望产物(780mg,94％)。针对C30H26BrN6O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝581.1；实验值：581.2。
步骤7：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-(嘧啶-4-基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001071
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(260mg,0.45mmol)、4-(三丁基锡烷基)嘧啶(215mg,0.58mmol)、氯化锂(28.4mg,0.67mmol)、氯化铜(I)(67mg,0.67mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(52mg,0.045mmol)于THF(5mL)中的混合物在90℃下搅拌45min。用水淬灭反应混合物并用二氯甲烷萃取。浓缩合并的有机层，并通过硅胶柱纯化以提供期望产物(176mg,67％)。针对C34H29N8O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝581.2；实验值：581.1。
步骤8：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-甲酰基-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001072
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-(嘧啶-4-基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(176mg,0.3mmol)、氧化锇(VIII)(3mg于0.3mL水中，0.015mmol)和过碘酸钠(292mg,1.36mmol)于THF/水(1:1,6mL)中的混合物在65℃下搅拌1h。将反应混合物冷却到室温，并用二氯甲烷萃取。浓缩合并的有机层，并通过硅胶柱纯化以提供期望产物(130mg,74％)。针对C33H27N8O3(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝583.2；实验值：583.2。
步骤9：3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
格氏试剂(Grignard reagent)的制备：在-10℃下，向1,3-二氟-2-碘苯(142mg,0.6mmol)于四氢呋喃(1mL)中的溶液中添加异丙基氯化镁溶液(296μl,2M)。将所得混合物搅拌1h，并且直接用于下一步骤中。
在-10℃下，向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-甲酰基-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(120mg,0.2mmol)于THF(2mL)中的溶液中添加从先前步骤刚制备的格氏试剂。将反应混合物搅拌30min，用氯化铵溶液(4mL)淬灭，并用二氯甲烷萃取。在真空下浓缩合并的有机层。将所得材料溶解于TFA(5mL)中，并在80℃下搅拌20min。然后将反应混合物冷却到室温，浓缩，并通过添加NaHCO3水溶液碱化。
通过硅胶柱直接纯化粗材料以提供呈外消旋混合物形式的期望产物(60mg,64％)。然后用手性HPLC使用手性柱(Phenomenex Lux 5um Cellulose-4,21.2x250 mm)和己烷中的75％EtOH(20mL/min)溶剂系统分离产物。
分离峰2，并经由制备型LC/MS(pH＝2，乙腈/含TFA的水)进一步纯化以获得呈TFA盐形式的期望产物。针对C23H15F2N8O(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝457.1；实验值：457.0。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.14(d,J＝1.3Hz,1H),8.95(d,J＝5.2Hz,1H),7.90(dd,J＝5.2,1.4Hz,1H),7.88(s,1H),7.78(dt,J＝7.6,1.4Hz,1H),7.74(t,J＝1.4Hz,1H),7.54(dt,J＝7.9,1.3Hz,1H),7.51-7.40(m,2H),7.09(t,J＝8.4Hz,2H),6.27(s,1H)。
实施例A11：3-(8-氨基-2-(氨基(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(化合物11)的合成
Figure BDA0003804213750001091
步骤1：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001092
向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(实施例A10步骤5；241mg,0.48mmol)于DCM(5mL)中的溶液中添加NBS(84.6mg,0.48mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌1h，并浓缩以提供粗产物，其未经进一步纯化即用于下一步骤中。针对C30H26BrN6O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝581.1；实验值：581.1。
步骤2：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-甲酰基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001101
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-乙烯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(174mg,0.3mmol)、氧化锇(VIII)(3mg于0.3mL水中，0.015mmol)和过碘酸钠(292mg,1.36mmol)于THF/水(1:1,6mL)中的混合物在65℃下搅拌1h。将反应混合物冷却到室温，并用二氯甲烷萃取。浓缩合并的有机层，并通过硅胶柱纯化以提供期望产物。针对C29H24N6O3Br(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝583.1；实验值：583.1。
步骤3：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001102
格氏试剂的制备：在-10℃下，向1,3-二氟-2-碘苯(142mg,0.6mmol)于四氢呋喃(1mL)中的溶液中添加异丙基氯化镁溶液(296μl,2M)。将所得混合物搅拌1h，并且直接用于下一步骤中。
在-10℃下，向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-甲酰基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(120mg,0.2mmol)于THF(2mL)中的溶液中添加从先前步骤刚制备的格氏试剂。将反应混合物搅拌30min，用氯化铵溶液(4mL)淬灭，并用二氯甲烷萃取。在真空下浓缩合并的有机层并通过硅胶柱纯化，以提供呈外消旋混合物形式的期望产物。针对C35H28N6O3BrF2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝697.1；实验值：697.1。
步骤4：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001111
将3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(382mg,0.55mmol)、4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)噁唑(137mg,0.65mmol)、二环己基(2',4',6'-三异丙基联苯-2-基)膦-(2'-氨基联苯-2-基)(氯)钯(1:1)(17mg,21.6μmol)和Cs2CO3(356mg,1.09mmol)于1,4-二噁烷(2mL)和水(200μl)中的混合物用N2吹扫并在95℃下加热7h。将混合物浓缩并经由快速色谱纯化以提供无色油状期望产物。针对C39H32N7O4F2(M+H)+的LCMS计算值：700.2；实验值：700.2。
步骤5：3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-(氯(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001112
在rt下，向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(201mg,0.29mmol)于2mL二氯甲烷中的溶液中添加亚硫酰氯(105μl,1.435mmol)。将所得混合物搅拌4h，浓缩，并且未经任何进一步纯化即用于下一步骤中。针对C39H31N7O3ClF2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝718.2；实验值：718.2。
步骤6：3-(8-氨基-2-(氨基(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈
向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-2-(氯(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(40mg,0.084mmol)于1mL DMSO中的溶液中添加氨溶液(1mL)。将混合物利用微波条件在100℃下加热10h，然后用水稀释并用EtOAc萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层，经MgSO4干燥，并浓缩。将所得残余物溶解于TFA(1mL)中，并在80℃下搅拌20min。然后将反应混合物冷却到室温，浓缩，并通过添加NaHCO3水溶液碱化。通过硅胶柱直接纯化粗材料，以提供呈外消旋混合物形式的期望产物。然后用手性HPLC使用手性柱(AM-1)和己烷中的45％EtOH(20mL/min)溶剂系统分离产物。分离峰1，并经由制备型LC/MS(pH＝2，乙腈/含TFA的水)进一步纯化以获得呈TFA盐形式的期望产物。针对C23H17F2N8O(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝459.1；实验值：459.0。
实施例A12：3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(2,6-二甲基吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(化合物12)的合成
Figure BDA0003804213750001121
向3-(8-(双(4-甲氧基苄基)氨基)-5-溴-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈(实施例A11步骤3；0.518g,0.638mmol)、2,6-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡啶(0.346g,1.48mmol)和二环己基(2',4',6'-三异丙基联苯-2-基)膦-(2'-氨基联苯-2-基)(氯)钯(1:1)(0.058g,0.074mmol)于二噁烷(3.0mL)和水(0.60mL)中的溶液中添加磷酸三钾(0.472g,2.23mmol)。将反应混合物在90℃下搅拌1h。然后用水和DCM稀释反应混合物。分离各层，用DCM萃取水层，并经MgSO4干燥合并的有机流份，过滤并浓缩。将粗材料溶解于TFA(5mL)中，加热到80℃并保持20分钟。然后将反应混合物冷却到室温，浓缩，并通过添加NaHCO3水溶液碱化。通过硅胶柱直接纯化粗材料，以提供呈外消旋混合物形式的期望产物(257mg,72％)。
然后用手性HPLC使用手性柱(Phenomenex Lux 5um Cellulose-2,21.1×250mm)和己烷中的35％EtOH(20mL/min)溶剂系统分离产物。分离峰2，并使用制备型LC/MS(pH＝2，乙腈/含TFA的水)进一步纯化以获得呈TFA盐形式的期望产物。针对C26H20F2N7O(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝484.2；实验值：484.2。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.92(s,2H),7.85(s,1H),7.83(d,J＝7.6Hz,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.53-7.40(m,4H),7.10(t,J＝8.4Hz,2H),6.27(s,1H),2.51(s,6H)。
实施例A13：3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(化合物13)的合成
Figure BDA0003804213750001131
步骤1.4,6-二氯-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶
Figure BDA0003804213750001132
在0℃下，将NaNO2(3.88g,56.2mmol)于水(3mL)中的溶液添加到2,6-二氯吡啶-3,4-二胺(10g,56mmol)于37％盐酸(5mL)中的溶液。将溶液搅拌30min。添加水(20mL)并将白色沉淀过滤，用水洗涤，并干燥以获得期望产物。针对C5H3Cl2N4的LC-MS计算值：189.0(M+H)+；实验值：189.0(M+H)+。
步骤2.6-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺
Figure BDA0003804213750001141
将4,6-二氯-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶(600mg,3.17mmol)、(2,4-二甲氧基苯基)甲胺(0.53mL,3.49mmol)和三乙胺(0.53mL,3.81mmol)于1,4-二噁烷(10mL)中的混合物在110℃下搅拌3天。在硅胶柱上直接纯化提供期望产物(875mg,86％)。针对C14H15ClN5O2的LC-MS计算值：320.1(M+H)+；实验值：320.3(M+H)+。
步骤3.6-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺
Figure BDA0003804213750001142
在0℃下，向6-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺(875mg,2.74mmol)、吡啶-2-基甲醇(0.317mL,3.28mmol)和三苯基膦(1436mg,5.47mmol)于DCM(20mL)中的混合物中添加偶氮二甲酸二异丙酯(0.647mL,3.28mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌1h。在硅胶柱上直接纯化提供期望产物(375mg,33.4％产率)。针对C20H20ClN6O2的LC-MS计算值：411.1(M+H)+；实验值：411.2(M+H)+。
步骤4.3-(4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001151
向6-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺(375mg,0.913mmol)和(3-氰基苯基)硼酸(268mg,1.825mmol)于1,4-二噁烷(10mL)和水(1.00mL)中的混合物中添加碳酸铯(595mg,1.825mmol)。用N2吹扫所得混合物，然后添加氯(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)(71.8mg,0.091mmol)。将反应混合物在微波照射下在120℃下搅拌90min。用20mL乙酸乙酯和20mL水淬灭反应。分离有机相并用乙酸乙酯将水溶液萃取两次。经Na2SO4干燥合并的萃取物，过滤并在减压下蒸发。在硅胶柱上纯化残余物以提供期望产物(300mg,68.9％)。针对C27H24N7O2的LC-MS计算值：478.2(M+H)+；实验值：478.3(M+H)+。
步骤5.3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001161
将3-(4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(300.3mg,0.629mmol)于TFA(5mL)中的溶液在100℃下搅拌30min。在减压下蒸发TFA，然后添加20mL饱和NaHCO3水溶液和20mL乙酸乙酯。分离有机相并用乙酸乙酯将水溶液萃取两次。经Na2SO4干燥合并的萃取物，过滤并在减压下蒸发。在硅胶柱上纯化残余物以提供期望产物(175mg,85％)。针对C18H14N7的LC-MS计算值：328.1(M+H)+；实验值：328.2(M+H)+。
步骤6.3-(4-氨基-7-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001162
将3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(175mg,0.535mmol)和1-溴吡咯烷-2,5-二酮(100mg,0.561mmol)于THF(10mL)中的混合物在0℃下搅拌30min，然后用饱和NaHCO3水溶液淬灭。分离有机相，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下蒸发。在硅胶柱上纯化所得残余物以提供期望产物(135mg,62.2％)。针对C18H13BrN7的LC-MS计算值：406.0(M+H)+和408.0(M+H)+；实验值：406.1(M+H)+和408.2(M+H)+。
步骤7.3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001171
将3-(4-氨基-7-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(182mg,0.448mmol)、4-(三丁基锡烷基)嘧啶(496mg,1.344mmol)和氯化铜(I)(53.2mg,0.538mmol)、氯化锂(22.79mg,0.538mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(51.8mg,0.045mmol)于THF(1ml)中的混合物首先用N2吹扫，然后在90℃下加热并搅拌2h。用甲醇稀释反应物并用制备型LCMS(pH＝2)纯化以获得期望产物。针对C22H16N9的LC-MS计算值：406.2(M+H)+；实验值：406.2(M+H)+。
实施例A14：3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(化合物14)的合成
Figure BDA0003804213750001172
步骤1.6-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺
Figure BDA0003804213750001173
在0℃下，向6-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺(实施例A13步骤2；1000mg,3.13mmol)、(3-氟吡啶-2-基)甲醇(477mg,3.75mmol)和三苯基膦(1641mg,6.25mmol)于DCM(1.7mL)中的混合物中添加偶氮二甲酸二异丙酯(739μl,3.75mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1h。在硅胶柱上直接纯化提供期望产物(433mg,32％)。针对C20H19ClFN6O2的LC-MS计算值：429.1(M+H)+；实验值：429.3(M+H)+。
步骤2.3-(4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001181
将碳酸铯(658mg,2.019mmol)添加到6-氯-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-4-胺(433mg,1.010mmol)和(3-氰基苯基)硼酸(297mg,2.019mmol)于1,4-二噁烷(10.0mL)和水(1.0mL)中的混合物。向所得混合物充N2 2min并添加(SP-4-4)-[2'-氨基[1,1'-联苯]-2-基]氯[二环己基[2',4',6'-三(1-甲基乙基)[1,1'-联苯]-2-基]膦]钯(79mg,0.101mmol)。将反应混合物在微波照射下在120℃下搅拌1.5h。用20mL乙酸乙酯和20mL水淬灭反应。分离有机相并用乙酸乙酯将水溶液萃取两次。经Na2SO4干燥合并的萃取物，过滤并在减压下蒸发。在硅胶柱上纯化残余物以提供期望产物(357mg,71％)。针对C27H23FN7O2的LC-MS计算值：496.2(M+H)+；实验值：496.3(M+H)+。
步骤3.3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001191
将3-(4-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(357.3mg,0.721mmol)于TFA(5mL)中的溶液在100℃下搅拌1h。在减压下蒸发TFA，然后添加20mL饱和NaHCO3水溶液和20mL乙酸乙酯。分离有机相并用乙酸乙酯将水溶液萃取两次。经Na2SO4干燥合并的萃取物，过滤并在减压下蒸发。在硅胶柱上纯化残余物以提供期望产物(213mg,61％)。针对C18H13FN7的LC-MS m/z计算值：346.1(M+H)+；实验值：346.3(M+H)+。
步骤4.3-(4-氨基-7-溴-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001192
将3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(213mg,0.617mmol)和1-溴吡咯烷-2,5-二酮(220mg,1.234mmol)于THF(5mL)中的混合物在0℃下搅拌1h。在硅胶上直接纯化提供期望产物(175mg,67％)。针对C18H12BrFN7的LC-MS计算值：424.0(M+H)+和426.0(M+H)+；实验值：424.3(M+H)+和426.3(M+H)+。
步骤5.3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈
Figure BDA0003804213750001201
将3-(4-氨基-7-溴-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(220mg,0.519mmol)、4-(三丁基锡烷基)嘧啶(383mg,1.037mmol)和氯化铜(I)(61.6mg,0.622mmol)、氯化锂(26.4mg,0.622mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(59.9mg,0.052mmol)于THF(1ml)中的混合物首先用N2吹扫，然后在90℃下加热并搅拌2h。用甲醇稀释反应物并用制备型LCMS(pH＝2)纯化以获得期望产物。针对C22H15FN9的LC-MS计算值：424.1(M+H)+；实验值：424.3(M+H)+。1H NMR(500MHz,DMSO-
Figure BDA0003804213750001203
)ppm 8.98(s,1H),8.77(d,J＝5.02Hz,1H),8.38(dd,J1＝4.60Hz,J2＝1.32Hz,1H),7.90-8.30(bs,2H),7.76-7.89(m,3H),7.66(dd,J1＝5.25Hz,J2＝1.25Hz,1H),7.45-7.58(m,3H),6.25(s,2H)。
实施例A15：3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(吡啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(化合物15)的合成
Figure BDA0003804213750001202
将碳酸铯(46.1mg,0.141mmol)添加到3-(4-氨基-7-溴-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈(30mg,0.071mmol)和吡啶-4-基硼酸(17.38mg,0.141mmol)于1,4-二噁烷(2mL)和水(0.2mL)中的混合物。向所得混合物充N22min并添加氯(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)(5.56mg,7.07μmol)。将反应混合物在微波照射下在120℃下搅拌1.5h。用甲醇稀释反应混合物。在制备型HPLC上直接纯化提供期望产物。针对C23H16FN8的LC-MS计算值：423.1(M+H)+；实验值：423.3(M+H)+。
实施例A16：3-(4-氨基-7-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈(化合物16)的合成
Figure BDA0003804213750001211
步骤1.3-(4-氨基-7-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈
Figure BDA0003804213750001212
这种化合物通过遵循与实施例A13步骤1到步骤6相似的程序、在步骤4中用(3-氰基-2-氟苯基)硼酸替代(3-氰基苯基)硼酸来制备。针对C18H12BrFN7的LC-MS计算值：424.0(M+H)+和426.0(M+H)+；实验值：424.3(M+H)+和426.3(M+H)+。
步骤2.3-(4-氨基-7-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈
Figure BDA0003804213750001213
这种化合物通过遵循与实施例A15中相似的程序、用(1-甲基-1H-吡唑-5-基)硼酸替代吡啶-4-基硼酸并且用3-(4-氨基-7-溴-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈替代3-(4-氨基-7-溴-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈来制备。针对C22H17FN9的LC-MS计算值：426.2(M+H)+；实验值：426.3(M+H)+。
实施例A17：7-(1-((5-氯吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(化合物17)的合成
Figure BDA0003804213750001221
步骤1：3-(戊基氨基)-1H-吡咯-2-甲酸乙酯
Figure BDA0003804213750001222
在室温下，将3-氨基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(5g,32.4mmol)、戊醛(3.79ml,35.7mmol)和氰基硼氢化钠(2.038g,32.4mmol)在甲醇(64.9ml)中混合过夜。在减压下浓缩反应混合物。通过快速色谱(己烷中的0到100％EtOAc)纯化粗残余物以获得期望产物(4.4g,61％)。针对C12H21N2O2(M+H)的LCMS计算值：225.2。实验值：225.1。
步骤2：3-(3-(乙氧基羰基)-1-戊基硫脲基)-1H-吡咯-2-甲酸乙酯
Figure BDA0003804213750001231
向瓶中装填3-(戊基氨基)-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(4.4g,19.62mmol)、二氯甲烷(39.2ml)和异硫氰酸乙氧羰酯(2.78ml,23.54mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。用水(40ml)淬灭反应混合物，并分离各层。用二氯甲烷(3×40mL)萃取水层并经MgSO4干燥合并的有机流份，过滤，并浓缩。粗材料未经进一步纯化即用于下一步骤中(7.3g，定量)。针对C16H26N3O4S(M+H)的LCMS计算值：356.2。实验值：356.1。
步骤3：1-戊基-2-硫酮-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮
Figure BDA0003804213750001232
向微波瓶中装填3-(3-(乙氧基羰基)-1-戊基硫脲基)-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(7.31g,20.57mmol)和乙醇钠(21％w/w,8.45ml,22.62mmol)溶液。盖上瓶盖并在微波反应器中在120℃下加热10分钟。通过添加1M HCl溶液使反应混合物达到中性pH，过滤并干燥固体产物(3.1g,64％)。针对C11H16N3OS(M+H)的LCMS计算值：238.1。实验值：238.1。
步骤4：2-亚肼基-1-戊基-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮
Figure BDA0003804213750001241
向瓶中装填1-戊基-2-硫酮-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮(3.13g,13.19mmol)和肼水合物(20mL)。将反应混合物在100℃下搅拌过夜。过滤所形成的固体并用水洗涤以获得期望产物(2.2g,70％)。针对C11H18N5O(M+H)的LCMS计算值：236.1。实验值：236.1。
步骤5：3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
Figure BDA0003804213750001242
向瓶中装填(E)-2-亚肼基-1-戊基-2,3-二氢-1H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4(5H)-酮(4.8g,20.40mmol)、一滴三氟乙酸和原乙酸三乙酯(20mL)。将反应混合物加热到110℃并保持3小时。将悬浮液过滤，用己烷洗涤，并干燥(4.0g,76％)。针对C13H18N5O(M+H)的LCMS计算值：260.1。实验值：260.2。
步骤6：3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
Figure BDA0003804213750001243
向瓶中装填3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(来自步骤1)(4g,15.43mmol)、二氯甲烷(40mL)、二甲基氨基吡啶(0.188g,1.543mmol)、三乙胺(3.23ml,23.14mmol)和苯磺酰氯(2.187ml,16.97mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。用水淬灭反应混合物，并分离各层。用二氯甲烷(3×40mL)萃取水层并经MgSO4干燥合并的有机流份，过滤，并浓缩。粗材料未经进一步纯化即用于下一步骤中(6.1g，定量)。针对C19H22N5O3S(M+H)的LCMS计算值：400.1。实验值：400.1。
步骤7：7-溴-3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
Figure BDA0003804213750001251
向瓶中装填3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(1g,2.503mmol)、无水THF(30mL)，并将混合物冷却到-78℃。逐滴添加二异丙基氨基锂溶液(1M于己烷/THF中，3.13ml,3.13mmol)。将反应混合物在-78℃下维持1.5小时。将1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷(1.223g,3.75mmol)于无水THF(3ml)中的溶液逐滴添加到反应混合物，并将反应混合物在-78℃下再维持1.5小时。用饱和NH4Cl水溶液(30mL)淬灭反应混合物并用二氯甲烷(30mL)稀释。分离各层并用DCM(3×30mL)萃取水层。经MgSO4干燥合并的有机流份，过滤，并浓缩。通过自动快速色谱(DCM中的0到100％EtOAc)纯化粗残余物以获得期望产物(0.84g,70％)。针对C19H21BrN5O3S(M+H)的LCMS计算值：478.1。实验值：478.1。
步骤8：3-氯-5-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)甲基)吡啶
Figure BDA0003804213750001261
向瓶中装填4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(0.5g,2.58mmol)、3-(溴甲基)-5-氯吡啶氢溴酸盐(0.741g,2.58mmol)、碳酸铯(2.52g,7.73mmol)和DMF(6.44ml)。将反应混合物在60℃下搅拌1小时。用水(10ml)淬灭反应混合物并用二氯甲烷(10ml)稀释。分离各层，并用二氯甲烷(3×10mL)萃取水层。经MgSO4干燥合并的二氯甲烷萃取物，过滤，并浓缩。通过自动快速色谱(DCM中的0到100％EtOAc)纯化提供产物(0.548g,67％)。针对C15H20BClN3O2(M+H)的LCMS计算值：320.1、322.1。实验值：320.1、322.1。
步骤9：7-(1-((5-氯吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
向瓶中装填7-溴-3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(0.01g,0.021mmol)、3-氯-5-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)甲基)吡啶(0.013g,0.042mmol)、氯(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)(5.00mg,0.006mmol)和磷酸三钾(0.016g,0.074mmol)。添加1,4-二噁烷(0.35ml)和水(0.07ml)并向反应混合物充氮气5分钟，然后在90℃下搅拌2小时。将反应混合物冷却到室温并添加氢氧化钠(10mg)。将反应混合物在40℃下搅拌60分钟。将反应混合物冷却到室温并用DMF(5ml)稀释。通过制备型HPLC(pH 2，乙腈/含TFA的水)纯化提供呈TFA盐形式的产物(2mg,21％)。针对C22H24ClN8O(M+H)的LCMS计算值：451.2、453.2。实验值：451.2、453.2。
实施例A18：3-甲基-7-(1-((5-甲基吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(化合物18)的合成
Figure BDA0003804213750001271
这种化合物使用与实施例A17中所述相似的程序、在步骤8中使用3-(溴甲基)-5-甲基吡啶替代3-(溴甲基)-5-氯吡啶氢溴酸盐来制备。针对C23H27N8O(M+H)的LCMS计算值：431.2。实验值：431.3。
实施例A19：3-甲基-9-戊基-7-(1-(噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基甲基)-1H-吡唑-4-基)-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(化合物19)的合成
Figure BDA0003804213750001272
这种化合物使用与实施例A17中所述相似的程序、在步骤8中使用6-(溴甲基)噻吩并[3,2-b]吡啶替代3-(溴甲基)-5-氯吡啶氢溴酸盐来制备。针对C24H25N8OS(M+H)的LCMS计算值：473.2。实验值：473.3。
实施例A20：7-(1-((2-(2-(二甲基氨基)乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(化合物20)
Figure BDA0003804213750001281
步骤1：6-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
Figure BDA0003804213750001282
向烧瓶中装填4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(.5g,2.58mmol)、6-(羟基甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(0.339g,1.288mmol)、三苯基膦(0.743g,2.83mmol)和THF(12ml)。将溶液冷却到0℃并逐滴添加DIAD(0.601ml,3.09mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。用乙酸乙酯稀释混合物并用水洗涤，干燥并浓缩。通过柱色谱，用己烷/EtOAc(最大60％EtOAc)洗脱来纯化产物以提供产物。针对C24H35BN3O4(M+H)+的LCMS计算值：m/z＝440.3；实验值：440.3。
步骤2：7-溴-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
Figure BDA0003804213750001283
将TBAF(1.0M于THF中)(2.0ml,2.0mmol)添加到7-溴-3-甲基-9-戊基-6-(苯基磺酰基)-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(0.360g,0.753mmol)于THF(4.0ml)中的溶液，然后将反应物在50℃下搅拌1h。去除溶剂并通过柱色谱，用CH2Cl2/MeOH(最大10％MeOH)洗脱来纯化产物。针对C13H17BrN5O(M+H)+的LCMS计算值：m/z＝338.1；实验值：338.1。
步骤3：6-((4-(3-甲基-5-氧代-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-7-基)-1H-吡唑-1-基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
Figure BDA0003804213750001291
将7-溴-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(来自实施例A20，步骤2)(0.040g,0.118mmol)、6-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(0.062g,0.142mmol)、二氯[1,1'-双(二环己基膦基)二茂铁]钯(II)二氯甲烷加合物(Pd-127)(8.94mg,0.012mmol)和氟化铯(0.090g,0.591mmol)于t-BuOH(1.5ml)/水(0.6ml)中的混合物抽真空并补充N2 3次。然后将反应物在105℃下搅拌2h，冷却到rt，用乙酸乙酯稀释，用水洗涤，干燥并浓缩。通过柱，用CH2Cl2/MeOH(最大10％MeOH)洗脱来纯化产物。针对C31H39N8O3(M+H)+的LCMS计算值：m/z＝571.3；实验值：571.5。
步骤4：3-甲基-9-戊基-7-(1-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
Figure BDA0003804213750001301
将TFA(0.5ml,6.49mmol)添加到6-((4-(3-甲基-5-氧代-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-7-基)-1H-吡唑-1-基)甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯(50.0mg,0.088mmol)于CH2Cl2(0.5ml)中的溶液，然后将反应物在室温下搅拌30min。然后去除溶剂以提供呈TFA盐形式的粗产物。针对C26H31N8O(M+H)+的LCMS计算值：m/z＝471.3；实验值：471.2。
步骤5：7-(1-((2-(2-(二甲基氨基)乙酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-甲基-9-戊基-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮
在室温下，将二甲基甘氨酰氯(3.10mg,0.026mmol)添加到3-甲基-9-戊基-7-(1-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-6,9-二氢-5H-吡咯并[3,2-d][1,2,4]三唑并[4,3-a]嘧啶-5-酮(6.0mg,0.013mmol)和三乙胺(8.89μl,0.064mmol)于CH2Cl2(0.8ml)中的溶液并搅拌30min。去除溶剂，用乙腈/水稀释混合物并通过制备型HPLC(pH 2，乙腈/含TFA的水)纯化以提供呈其TFA盐形式的期望化合物。针对C30H38N9O2(M+H)+的LC-MS计算值：m/z＝556.3；实验值：556.3。
实施例A21.3-(2-((5-(1H-吡唑-1-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物21A)和3-(2-((5-(1H-吡唑-1-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈(化合物21B)
Figure BDA0003804213750001311
标题化合物的混合物使用与针对实施例A3所述相似的程序、用5-(1H-吡唑-1-基)-1H-四唑替代2-(1H-四唑-5-基)吡啶来制备。通过制备型LC-MS(pH 2，乙腈/含TFA的水)来纯化化合物21A，以提供呈TFA盐形式的产物。针对C21H15N14(M+H)+的LCMS计算值：463.2；实验值：463.2。
除本文所述的那些修改外，本领域技术人员根据前述描述将明了本发明的多种修改。此类修改也打算属于所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的每篇参考文献(包括所有专利、专利申请和公布)的全文都以引用方式并入本文中。

Claims (26)

1.一种治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂是式(I)化合物：
Figure FDA0003804213740000011
或其药学上可接受的盐，其中
Cy1是苯基，其经1或2个独立地选自卤基和CN的取代基取代；
Cy2是5-6元杂芳基或4-7元杂环烷基，其中Cy2的所述5-6元杂芳基或所述4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个各自独立地选自以下的基团取代：C1-3烷基、C1-3烷氧基、NH2、NH(C1-3烷基)和N(C1-3烷基)2；
R2选自苯基-C1-3烷基-、C3-7环烷基-C1-3烷基-、(5-7元杂芳基)-C1-3烷基-、(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基-和ORa2，其中R2的所述苯基-C1-3烷基-、所述C3-7环烷基-C1-3烷基-、所述(5-7元杂芳基)-C1-3烷基-和所述(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基-各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的RC取代基取代；
Ra2是(5-7元杂芳基)-C1-3烷基-，其任选地经1或2个经独立选择的RC取代基取代；
每个RC独立地选自卤基、C1-6烷基、C6芳基、5-7元杂芳基、(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基-、ORa4和NRc4Rd4；并且
每个Ra4、Rc4和Rd4独立地选自H和C1-6烷基。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂选自：
3-(5-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-1H-四唑-1-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(5-氨基-2-((3-甲基吡啶-2-基)甲氧基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
3-(2-((5-(1H-吡唑-1-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-5-氨基-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂是式(II)化合物：
Figure FDA0003804213740000031
或其药学上可接受的盐，其中
R2选自H和CN；
Cy1是苯基，其经1或2个独立地选自卤基和CN的取代基取代；
L是C1-3亚烷基，其中所述亚烷基任选地经1个、2个或3个经独立选择的R8D取代基取代；
Cy4选自苯基、环己基、吡啶基、吡咯烷酮基和咪唑基，其中所述苯基、所述环己基、所述吡啶基、所述吡咯烷酮基和所述咪唑基各自任选地经1个、2个或3个独立地选自R8D和R8的取代基取代；
每个R8独立地选自卤基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、苯基、C3-7环烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、苯基-C1-3烷基、C3-7环烷基-C1-3烷基、(5-6元杂芳基)-C1-3烷基和(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基，其中R8的所述C1-6烷基、所述C2-4烯基、所述C2-4炔基、所述苯基、所述C3-7环烷基、所述5-6元杂芳基、所述4-7元杂环烷基、所述苯基-C1-3烷基、所述C3-7环烷基-C1-3烷基、所述(5-6元杂芳基)-C1-3烷基和所述(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R8A取代基取代；
每个R8A独立地选自卤基、C1-6烷基、5-6元杂芳基、4-7元杂环烷基、CN、ORa81和NRc81Rd81，其中R8A的所述C1-3烷基、所述5-6元杂芳基和所述4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R8B取代基取代；
每个Ra81、Rc81和Rd81独立地选自H、C1-6烷基和4-7元杂环烷基，其中Ra81、Rc81和Rd81的所述C1-6烷基和所述4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R8B取代基取代；
每个R8B独立地选自卤基和C1-3烷基；并且
每个R8D独立地选自OH、CN、卤基、C1-6烷基和C1-6卤代烷基。
5.如权利要求1或4所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂选自：
3-(5-氨基-2-(羟基(苯基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(5-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐；
5-氨基-7-(3-氰基-2-氟苯基)-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-8-甲腈或其药学上可接受的盐；以及
3-(5-氨基-2-((2-氟-6-(((1-甲基-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基)甲基)苯基)(羟基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂是式(III)化合物：
Figure FDA0003804213740000041
或其药学上可接受的盐，其中
Cy1是苯基，其经1或2个独立地选自卤基和CN的取代基取代；
R2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中R2的所述5-6元杂芳基和所述4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R2A取代基取代；
每个R2A独立地选自D、卤基、C1-6烷基和C1-6卤代烷基；
R4选自苯基-C1-3烷基-、C3-7环烷基-C1-3烷基-、(5-6元杂芳基)-C1-3烷基-和(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基，其中R4的所述苯基-C1-3烷基-、所述C3-7环烷基-C1-3烷基-、所述(5-6元杂芳基)-C1-3烷基-和所述(4-7元杂环烷基)-C1-3烷基-各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R4A取代基取代；
每个R4A独立地选自卤基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、ORa41和NRc41Rd41；并且
每个Ra41、Rc41和Rd41独立地选自H和C1-6烷基。
7.如权利要求1或6所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂选自：
3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈；
3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(8-氨基-2-(氨基(2,6-二氟苯基)甲基)-5-(4-甲基噁唑-5-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
3-(8-氨基-2-((2,6-二氟苯基)(羟基)甲基)-5-(2,6-二甲基吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂是式(IV)化合物：
Figure FDA0003804213740000061
或其药学上可接受的盐，其中
Cy1是苯基，其经1或2个独立地选自卤基和CN的取代基取代；
Cy2选自5-6元杂芳基和4-7元杂环烷基，其中Cy2的所述5-6元杂芳基和所述4-7元杂环烷基各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R6取代基取代；
每个R6独立地选自卤基、C1-6烷基和C1-6卤代烷基；
R2是苯基-C1-3烷基-或(5-6元杂芳基)-C1-3烷基-，其中R2的所述苯基-C1-3烷基-和所述(5-6元杂芳基)-C1-3烷基-各自任选地经1个、2个或3个经独立选择的R2A取代基取代；并且
每个R2A独立地选自卤基、C1-6烷基和C1-6卤代烷基。
或其药学上可接受的盐。
9.如权利要求1或8所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂选自：
3-(4-氨基-2-(吡啶-2-基甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(嘧啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；
3-(4-氨基-2-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-7-(吡啶-4-基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
3-(4-氨基-7-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-2H-[1,2,3]三唑并[4,5-c]吡啶-6-基)-2-氟苯甲腈或其药学上可接受的盐。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂是3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂是3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1抑制剂是(R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲基)-1,7-萘啶-8-基氨基)-2,2'-二甲基联苯-3-基)苯并[d]噁唑-5-基)甲基)吡咯烷-3-甲酸或其药学上可接受的盐。
13.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1抑制剂是派姆单抗。
14.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1抑制剂是阿替利珠单抗。
15.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1抑制剂是抗体X，其中抗体X是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)结构域，所述可变重链结构域包含VH互补决定区(CDR)1、VH CDR2和VH CDR3，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列SYWMN(SEQ ID NO:6)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列VIHPSDSETWLDQKFKD(SEQ ID NO:7)；并且
所述VH CDR3包含氨基酸序列EHYGTSPFAY(SEQ ID NO:8)；并且
其中所述抗体包含可变轻链(VL)结构域，所述可变轻链结构域包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：
所述VL CDR1包含氨基酸序列RASESVDNYGMSFMNW(SEQ ID NO:9)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AASNQGS(SEQ ID NO:10)；并且
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQSKEVPYT(SEQ ID NO:11)。
16.如权利要求15所述的方法，其中抗体X是人源化抗体。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂以基于游离碱约0.1mg至约1000mg的剂量施用于所述受试者。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述A2A/A2B抑制剂以每天一次、每隔一天或每周一次施用于所述受试者。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中同时施用所述A2A/A2B抑制剂和所述PD-1/PD-L1抑制剂。
20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中依序施用所述A2A/A2B抑制剂和所述PD-1/PD-L1抑制剂。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌。
22.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、子宫内膜癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌和结肠癌。
23.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。
24.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
25.一种治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向所述受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(8-氨基-5-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-基)-2-(吡啶-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为抗体X；
其中所述A2A/A2B抑制剂以基于游离碱约0.1mg至约500mg的剂量施用于所述受试者，其中所述A2A/A2B抑制剂以每天一次或每隔一天施用；并且
所述抗体X以约100mg至约1000mg Q4W的剂量施用于所述受试者；
其中抗体X是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)结构域，所述可变重链结构域包含VH互补决定区(CDR)1、VH CDR2和VH CDR3，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列SYWMN(SEQ ID NO:6)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列VIHPSDSETWLDQKFKD(SEQ ID NO:7)；并且
所述VH CDR3包含氨基酸序列EHYGTSPFAY(SEQ ID NO:8)；并且
其中所述抗体包含可变轻链(VL)结构域，所述可变轻链结构域包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：
所述VL CDR1包含氨基酸序列RASESVDNYGMSFMNW(SEQ ID NO:9)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AASNQGS(SEQ ID NO:10)；并且
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQSKEVPYT(SEQ ID NO:11)。
26.一种治疗受试者癌症的方法，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、口腔癌、头颈癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌和默克细胞癌，所述方法包括向所述受试者施用：
(i)A2A/A2B抑制剂，其为3-(5-氨基-2-((5-(吡啶-2-基)-2H-四唑-2-基)甲基)-8-(嘧啶-4-基)-[1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-7-基)苯甲腈或其药学上可接受的盐；以及
(ii)PD-1/PD-L1抑制剂，其为抗体X；
其中所述A2A/A2B抑制剂以基于游离碱约0.1mg至约500mg的剂量施用于所述受试者，其中所述A2A/A2B抑制剂以每天一次或每隔一天施用；并且
所述抗体X以约100mg至约1000mg Q4W的剂量施用于所述受试者；
其中抗体X是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)结构域，所述可变重链结构域包含VH互补决定区(CDR)1、VH CDR2和VH CDR3，其中：
所述VH CDR1包含氨基酸序列SYWMN(SEQ ID NO:6)；
所述VH CDR2包含氨基酸序列VIHPSDSETWLDQKFKD(SEQ ID NO:7)；并且
所述VH CDR3包含氨基酸序列EHYGTSPFAY(SEQ ID NO:8)；并且
其中所述抗体包含可变轻链(VL)结构域，所述可变轻链结构域包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：
所述VL CDR1包含氨基酸序列RASESVDNYGMSFMNW(SEQ ID NO:9)；
所述VL CDR2包含氨基酸序列AASNQGS(SEQ ID NO:10)；并且
所述VL CDR3包含氨基酸序列QQSKEVPYT(SEQ ID NO:11)。
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