TW202140027A - 包含ａｘｌ／ｍｅｒ及ｐｄ—１／ｐｄ／ｌ１抑制劑之組合療法 - Google Patents

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霍利 Ｋ 扣博利斯
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Abstract

本揭示案係關於藉由投與為AXL/MER激酶抑制劑之化合物與結合至PD-1之抗體或其抗體片段之組合來治療癌症之方法。

Description

包含AXL/MER及PD-1/PD-L1抑制劑之組合療法
本揭示案係關於藉由投與為AXL/MER激酶抑制劑之化合物與結合至PD-1之抗體或其抗體片段之組合來治療癌症之方法。
受體酪胺酸激酶(RTK)係將信號自細胞外環境傳輸至細胞質及核以調控細胞事件(例如存活、生長、增殖、分化、黏附及遷移)之細胞表面蛋白。
TAM子家族係由三種RTK組成，包括Tyro3、AXL及Mer (Graham等人，2014, Nature Reviews Cancer14 , 769-785； Linger等人，2008, Advances in Cancer Research100 , 35-83)。TAM激酶之特徵在於由兩個免疫球蛋白樣結構域及兩個纖連蛋白III型結構域組成之細胞外配位體結合結構域。對於TAM激酶已鑑別出兩種配位體，生長停滯特異性蛋白6 (GAS6)及蛋白S (PROS1)。GAS6可結合至且活化所有三種TAM激酶，而PROS1係Mer及Tyro3之配位體(Graham等人，2014, Nature Reviews Cancer14 , 769-785)。
AXL (亦稱為UFO、ARK、JTK11及TYRO7)最初鑑別為來自患有慢性骨髓性白血病之患者之DNA之轉型基因(O'Bryan等人，1991, Mol Cell Biol11 , 5016-5031； Graham等人，2014, Nature Reviews Cancer14 , 769-785； Linger等人，2008, Advances in Cancer Research100 , 35-83)。GAS6結合至AXL且誘導AXL酪胺酸激酶之後續自動磷酸化及活化。AXL活化若干下游信號傳導路徑，包括PI3K-Akt、Raf-MAPK、PLC-PKC (Feneyrolles等人，2014, Molecular Cancer Therapeutics13 , 2141-2148； Linger等人，2008, Advances in Cancer Research100 , 35-83)。
MER (亦稱為MERTK、EYK、RYK、RP38、NYK及TYRO12)最初鑑別為來自類淋巴母細胞表現文庫之磷酸蛋白(Graham等人，1995, Oncogene10 , 2349-2359； Graham等人，2014, Nature Reviews Cancer14 , 769-785； Linger等人，2008, Advances in Cancer Research100 , 35-83)。GAS6及PROS1皆可結合至Mer且誘導Mer激酶之磷酸化及活化(Lew等人，2014)。與AXL一樣，MER活化亦傳遞下游信號傳導路徑，包括PI3K-Akt及Raf-MAPK (Linger等人，2008, Advances in Cancer Research100 , 35-83)。
TYRO3 (亦稱為DTK、SKY、RSE、BRT、TIF、ETK2)最初係經由基於PCR之選殖研究來鑑別(Lai等人，Neuron6 , 691-70, 1991； Graham等人，2014, Nature Reviews Cancer14 , 769-785；Linger等人，2008, Advances in Cancer Research100 , 35-83)。兩種配位體GAS6及PROS1可結合至且活化TYRO3。儘管TYRO3活化下游之信號傳導路徑在TAM RTK中研究最少，但似乎PI3K-Akt及Raf-MAPK路徑皆有所涉及(Linger等人，2008, Advances in Cancer Research100 , 35-83)。發現AXL、MER及TYRO3在癌細胞中過表現。
仍需要使用AXL/MER激酶調節劑與結合至PD-1之抗體或其抗體片段之組合之新的癌症治療方案。本揭示案係針對此需求及其他需求。
本申請案尤其 提供治療患者之癌症之方法，其包括向該患者投與： (i)   化合物1，其具有以下結構：
Figure 02_image001
化合物1； 或其醫藥學上可接受之鹽；及 (ii)  結合至人類PD-1之抗體或其抗原結合片段，其中抗體包含(ii-1)可變重鏈(VH)結構域，其包含VH互補決定區(CDR)1、VH CDR2及VH CDR3；及(ii-2)可變輕鏈(VL)結構域，其包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；其中： (a)  VH CDR1包含胺基酸序列SYWMN (SEQ ID NO:6 )； (b)  VH CDR2包含胺基酸序列VIHPSDSETWLDQKFKD (SEQ ID NO:7 )； (c)  VH CDR3包含胺基酸序列EHYGTSPFAY (SEQ ID NO:8 )； (d)  VL CDR1包含胺基酸序列RASESVDNYGMSFMNW (SEQ ID NO:9 )； (e)  VL CDR2包含胺基酸序列AASNQGS (SEQ ID NO:10 )；且 (f)   VL CDR3包含胺基酸序列QQSKEVPYT (SEQ ID NO:11 )。
本申請案進一步提供治療患者之癌症之方法，其包括向患者投與化合物1或其醫藥學上可接受之鹽及瑞替法尼(retifanlimab)。
本申請案亦提供化合物1或其醫藥學上可接受之鹽及本文所述之抗體或抗原結合片段之用途，其用於製備用來治療癌症之藥物。
本申請案進一步提供化合物1或其醫藥學上可接受之鹽及本文所述之抗體或抗原結合片段，其用於本文所述之任一方法中。
本申請案尤其 提供治療患者之癌症之方法，其包括向該患者投與： (i)   化合物1，其具有以下結構：
Figure 02_image001
化合物1； 或其醫藥學上可接受之鹽；及 (ii)  結合至人類PD-1之抗體(例如瑞替法尼)或其抗原結合片段。
活體外 研究表明用單劑化合物1處理及單劑瑞替法尼處理誘導促發炎細胞介素，然而，化合物1與PD-1抗體瑞替法尼之組合產生大得多的細胞介素誘導(實例G)。
人類PD-1蛋白(Genbank登錄號NP_005009)之胺基酸序列係：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO:1 )。
瑞替法尼係結合至人類PD-1之人類化IgG4單株抗體(參見 US 2019/0127467，其全文皆以引用方式併入本文中)。下文闡述成熟瑞替法尼重鏈及輕鏈之胺基酸序列。
可變重鏈(VH)結構域及可變輕鏈(VL)結構域之互補決定區(CDR) 1、2及3係以成熟VL及VH序列之N至C末端之順序顯示且加有下劃線並加粗。由下文所列出之成熟重鏈(SEQ ID NO:2 )及成熟輕鏈(SEQ ID NO:3 )組成之抗體稱為瑞替法尼。成熟 瑞替法尼 重鏈 (HC) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT SYWMN WVRQAPGQGLEWIG VIHPSDSETWLDQKFKD RVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR EHYGTSPFAY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:2 )成熟 瑞替法尼 輕鏈 (LC) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASESVDNYGMSFMNW FQQKPGQPPKLLIH AASNQGS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFC QQSKEVPYT FGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:3 )
瑞替法尼之可變重鏈(VH)結構域具有以下胺基酸序列： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT SYWMN WVRQAPGQGLEWIG VIHPSDSETWLDQKFKD RVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR EHYGTSPFAY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:4 )
瑞替法尼之可變輕鏈(VL)結構域具有以下胺基酸序列： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASESVDNYGMSFMNW FQQKPGQPPKLLIH AASNQGS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFC QQSKEVPYT FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:5 )
下文列出瑞替法尼之VH CDR之胺基酸序列： VH CDR1：SYWMN (SEQ ID NO:6 )； VH CDR2：VIHPSDSETWLDQKFKD (SEQ ID NO:7 )； VH CDR3：EHYGTSPFAY (SEQ ID NO:8 )
下文列出瑞替法尼之VL CDR之胺基酸序列： VL CDR1： RASESVDNYGMSFMNW (SEQ ID NO:9 )； VL CDR2： AASNQGS (SEQ ID NO:10 )；及 VL CDR3： QQSKEVPYT (SEQ ID NO:11 )。
因此，本揭示案提供治療患者之癌症之方法，其包括向該患者投與： (i)   化合物1，其具有以下結構：
Figure 02_image001
化合物1； 或其醫藥學上可接受之鹽；及 (ii)  結合至人類PD-1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含(ii-1)可變重鏈(VH)結構域，其包含VH互補決定區(CDR)1、VH CDR2及VH CDR3；及(ii-2)可變輕鏈(VL)結構域，其包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；其中： (a)  VH CDR1包含胺基酸序列SYWMN (SEQ ID NO:6 )； (b)  VH CDR2包含胺基酸序列VIHPSDSETWLDQKFKD (SEQ ID NO:7 )； (c)  VH CDR3包含胺基酸序列EHYGTSPFAY (SEQ ID NO:8 )； (d)  VL CDR1包含胺基酸序列RASESVDNYGMSFMNW (SEQ ID NO:9 )； (e)  VL CDR2包含胺基酸序列AASNQGS (SEQ ID NO:10 )；且 (f)   VL CDR3包含胺基酸序列QQSKEVPYT (SEQ ID NO:11 )。
在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO:4 中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，VL結構域包含SEQ ID NO:5 中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO:4 中所示之胺基酸序列且VL結構域包含SEQ ID NO:5 中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體包含變異體Fc區，其包含： (A)     一或多個降低變異體Fc區對FcγR之親和力之胺基酸修飾，其中一或多個降低變異體Fc區對FcγR之親和力之修飾包含L234A；L235A；或L234A及L235A之取代，且其中編號方式係如Kabat中之EU索引之編號方式；及/或 (b)     一或多個增強變異體Fc區之血清半衰期之胺基酸修飾，其中一或多個增強變異體Fc區之血清半衰期之修飾包含M252Y；M252Y及S254T；M252Y及T256E；M252Y、S254T及T256E；或K288D及H435K之取代，且其中編號方式係如Kabat中之EU索引之編號方式。
在一些實施例中，抗體包含Fc區，其中Fc區具有IgG4同型。在一些實施例中，抗體包含IgG4同型之Fc區及包含穩定突變之IgG4鉸鏈結構域。在一些實施例中，抗體包含IgG4同型之Fc區及包含S228P取代之IgG4鉸鏈結構域( 參見例如 ，SEQ ID NO:12 ：ESKYGPPCPPCP (Lu等人(2008) 「The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of IgG4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation」, J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969)以減少股交換之發生。因此，在一些實施例中，(a)抗體包含Fc區及鉸鏈結構域；(b) Fc區及鉸鏈結構域屬於IgG4類型；且(c)鉸鏈結構域包含穩定突變。
在一些實施例中，抗體包含重鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO:2 中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，VL結構域包含SEQ ID NO:5 中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體包含輕鏈，其中輕鏈包含SEQ ID NO:3 中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO:4 中所示之胺基酸序列且VL結構域包含SEQ ID NO:5 中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈，且其中重鏈包含SEQ ID NO:2 中所示之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO:3 中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體包含屬於IgG1類型之Fc區。
在一些實施例中，抗體包含屬於IgG1類型之Fc區，其包含變異體CH2-CH3結構域(包含L234A/L235A (AA)取代)，但缺少C末端離胺酸殘基。在一些實施例中，抗體包含屬於IgG1類型之Fc區，其中成熟重鏈及輕鏈序列係SEQ ID NO:13 及SEQ ID NO:3 。成熟重鏈 (HC) QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG (SEQ ID NO:13 )
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段係人類化抗體。
在一些實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽及瑞替法尼係同時或依序投與患者。在一些實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽及瑞替法尼係同時投與患者。在一些實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽及瑞替法尼係依序投與患者。
化合物1及其醫藥學上可接受之鹽可藉由多種方法投與個體，例如有需要之個體，例如人類個體。對於許多應用，投與途徑係口服。在一些實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係作為醫藥組合物來投與。
化合物1之調配物(例如固體口服劑量形式)闡述於美國專利公開案第2020/0000812 A1號中，該美國專利公開案之全文皆以引用方式併入。在一些實施例中，化合物1係以包含以下之固體口服劑量形式調配： (a)化合物1或其醫藥學上可接受之鹽(例如化合物1馬來酸鹽)、溶劑合物或水合物； (b)有機酸；及 (c)表面活性劑。
術語「有機酸」係指具有酸性性質之有機化合物。在一些實施例中，有機酸係各自經一或多個酸性基團(例如1個、2個或3個羧酸、醇或磺酸基團)取代之C1-6 烷基、C2-6 烯基或5-6員雜環烷基，其中5-6員雜環烷基視情況經C1-6 烷基取代，該C1-6 烷基視情況經一或多個酸性基團(例如1個、2個、3個或4個羧酸、醇或磺酸基團)取代。有機酸可為經一或多個酸性基團(例如1個、2個、3個或4個羧酸、醇或磺酸基團)取代之C1-6 烷基或C2-6 烯基。在一些實施例中，有機酸係經1個、2個或3個羧酸基團取代且經0個、1個或2個醇基團取代之C1-6 烷基或C2-6 烯基。在一些實施例中，有機酸係經一或多個酸性基團(例如1個、2個或3個羧酸、醇或磺酸基團)取代且視情況經C1-6 烷基取代之5-6員雜環烷基，其中C1-6 烷基視情況經一或多個酸性基團(例如1個、2個或3個羧酸、醇或磺酸基團)取代。例示性有機酸包括(但不限於)檸檬酸、抗壞血酸、富馬酸、蘋果酸、山梨酸、酒石酸及其水合物或溶劑合物。調配物中之有機酸可為約1 wt%至約50 wt%。調配物中之有機酸可為約5 wt%至約40 wt%。調配物中之有機酸可為約5 wt%至約30 wt%。調配物中之有機酸可為約5 wt%至約20 wt%。調配物中之有機酸可為約10 wt%至約20 wt%。舉例而言，調配物中之有機酸可為約1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、40重量%、45重量%或50重量%。在一些實施例中，調配物中之有機酸為約10 wt%。在一些實施例中，調配物中之有機酸為約20 wt%。
在一些實施例中，有機酸係檸檬酸。在一些實施例中，檸檬酸係檸檬酸單水合物。調配物中之檸檬酸可為約1 wt%至約50 wt%。調配物中之檸檬酸可為約5 wt%至約40 wt%。調配物中之檸檬酸可為約5 wt%至約30 wt%。調配物中之檸檬酸可為約5 wt%至約20 wt%。調配物中之檸檬酸可為約10 wt%至約20 wt%。舉例而言，調配物中之檸檬酸可為約1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、40重量%、45重量%或50重量%。在一些實施例中，調配物中之檸檬酸為約10 wt%。在一些實施例中，調配物中之檸檬酸為約20 wt%。
表面活性劑可有助於增加化合物1或其醫藥學上可接受之鹽(例如化合物1馬來酸鹽)、溶劑合物或水合物之生物利用度。術語「表面活性劑」係指降低兩種液體之間或液體與固體之間之表面張力的化合物。在一些實施例中，表面活性劑亦可具有其他功能，例如崩解劑、潤濕劑、乳化劑、發泡劑及分散劑。例示性表面活性劑包括(但不限於)泊洛沙姆(poloxamer)。泊洛沙姆之實例係泊洛沙姆407、泊洛沙姆338、泊洛沙姆237及泊洛沙姆188。在一個實施例中，泊洛沙姆係泊洛沙姆188。在一個實施例中，泊洛沙姆係泊洛沙姆407。泊洛沙姆係聚乙烯-丙二醇共聚物(已知商標名係Supronic、Pluronic或Tetronic)，其具有可有助於藥物釋放之熱可逆性質及溶膠-凝膠轉變性質。舉例而言，泊洛沙姆在小於室溫下展現溶膠狀態且在體溫(37.2℃)下轉化成凝膠狀態，此可改變藥物釋放特徵(D. Ramya Devi等人，J. Pharm. Sci. & Res.第5卷(8), 2013, 159 - 165；Y. Mao等人，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 35 (2004) 1127-1142)。
抗PD-1抗體或其抗原結合片段可藉由多種方法投與個體，例如有需要之個體，例如人類個體。對於許多應用，投與途徑係以下中之一者：靜脈內注射或輸注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜內(IP)或肌內注射。亦可使用關節內遞送。亦可使用其他非經腸投與模式。該等模式之實例包括：動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、真皮內、經氣管、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內以及硬膜外及胸骨內注射。在一些情形下，投與可為口服。
抗PD-1抗體或其抗原結合片段可藉由多種方法投與個體，例如有需要之個體，例如人類個體。對於許多應用，投與途徑係以下中之一者：靜脈內注射或輸注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜內(IP)或肌內注射。亦可使用關節內遞送。亦可使用其他非經腸投與模式。該等模式之實例包括：動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、真皮內、經氣管、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內以及硬膜外及胸骨內注射。在一些情形下，投與可為口服。
抗體或其抗原結合片段之投與途徑及/或模式亦可針對個別情形進行調整，例如藉由監測個體，例如使用斷層攝影成像，例如以使腫瘤可視化。
抗體或其抗原結合片段可以固定劑量或以mg/kg劑量來投與。亦可選擇劑量以減少或避免針對抗PD-1抗體之抗體之產生。劑量方案經調整以提供期望反應，例如治療反應或組合治療效應。通常，可使用多個劑量之抗PD-1抗體(及視情況第二劑)以為個體提供生物利用量之劑。舉例而言，可投與介於以下範圍內之劑量：0.1-100 mg/kg、0.5-100 mg/kg、1 mg/kg -100 mg/kg、0.5-20 mg/kg、0.1-10 mg/kg或1-10 mg/kg。亦可使用其他劑量。在特定實施例中，向需要用抗PD-1抗體治療之個體投與有效劑量之抗體：1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg或40 mg/kg。
組合物可包含約1 mg/mL至100 mg/ml或約10 mg/mL至100 mg/ml或約50至250 mg/mL或約100至150 mg/ml或約100至250 mg/ml之抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
如本文所用之劑量單位形式或「固定劑量」或「穩定劑量」係指適於作為單位劑量供欲治療個體使用之物理離散單位；每一單位含有經計算以與所需醫藥載劑一起及視情況與另一劑一起產生期望治療效應之預定量之活性化合物。可給予單一或多個劑量。另選地或另外，抗體可經由連續輸注來投與。例示性固定劑量包括375 mg、500 mg及750 mg。
抗PD-1抗體或其抗原結合片段劑量可在例如足以涵蓋至少2個劑量、3個劑量、5個劑量、10個劑量或更多個劑量之一段時間(治療期)內，以週期性間隔(例如每天一次或兩次、或每週約1至4次、或較佳每週、每兩週(biweekly、every two weeks)、每三週、每月)投與例如約1至12週，較佳2至8週，更佳約3至7週，且甚至更佳約4週、5週或6週。可能影響有效治療個體所需之劑量及時間之因素包括例如疾病或病症之嚴重程度、調配物、遞送途徑、先前治療、個體之一般健康狀況及/或年齡及所存在之其他疾病。另外，用治療有效量之化合物治療個體可包括單一治療或較佳可包括一系列治療。
例示性給藥方案包括以375 mg之固定劑量每3週一次投與抗PD-1抗體或其抗原結合片段。另一例示性給藥方案包括以500 mg之固定劑量每4週一次投與抗PD-1抗體或其抗原結合片段。另一例示性給藥方案包括以750 mg之固定劑量每4週一次投與抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，術語「約」係指加或減值之10%。熟習此項技術者應獲知，本文所呈現之值可因實驗之條件(例如數據收集或儀器之變化)而變化。化合物 1
化合物1 (N -(4-(4-胺基-7-(1-異丁酰基六氫吡啶-4-基)吡咯并[1,2-f ][1,2,4]三嗪-5-基)苯基)-1-異丙基-2,4-二側氧基-3-(吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-甲酰胺)具有以下結構：
Figure 02_image001
。
化合物1可如美國專利第9,981,975號及美國公開案第2019/112313號中所述來合成，該等專利之全文皆以引用方式併入本文中。
本揭示案亦包括本文所述化合物1之醫藥學上可接受之鹽。
化合物1之結晶鹽形式闡述於美國公開案第2019/112313號中，該美國公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，化合物1及其鹽係實質上分離的。「實質上分離」意指化合物至少部分或實質上與形成或偵測到其之環境分離。部分分離可包括例如化合物1富集之組合物。實質上分離可包括含有至少約50重量%、至少約60重量%、至少約70重量%、至少約80重量%、至少約90重量%、至少約95重量%、至少約97重量%或至少約99重量%之化合物1或其鹽之組合物。分離化合物及其鹽之方法為此項技術中之常規方法。
化合物1可以多種固體形式存在。如本文所用之「固體形式」欲指特徵在於一或多種性質之固體，該一或多種性質係例如熔點、溶解度、穩定性、結晶度、吸濕性、水含量、TGA特徵、DSC特徵、DVS特徵、XRPD特徵等。例如，固體形式可為非晶形、結晶或其混合物。
不同結晶固體形式通常具有不同的晶格(例如晶胞)，且通常因此具有不同的物理性質。在一些情況下，不同的結晶固體形式具有不同的水或溶劑含量。不同晶格可藉由固態表徵方法、例如藉由X射線粉末繞射(XRPD)來鑑別。其他表徵方法(例如差示掃描量熱(DSC)、熱重分析(TGA)、動態蒸汽吸附(DVS)及諸如此類)進一步有助於鑑別固體形式以及有助於測定穩定性及溶劑/水含量。
反射(峰)之XRPD圖案通常視為特定結晶形式之指紋。已熟知，XRPD峰之相對強度可廣泛地變化，此尤其端視樣品製備技術、晶體尺寸分佈、所用各種濾波器、樣品安裝程序及所用具體儀器而定。在一些情況下，可觀察到新的峰或現有峰可能會消失，此端視儀器之類型或設置而定。如本文所用之術語「峰」係指具有最大峰高度/強度之至少約4%的相對高度/強度之反射。另外，儀器變化及其他因素可能影響2θ值。因此，峰分配(例如本文所報告之彼等峰分配)可變化加或減約0.2° (2θ)，且如本文XRPD上下文中所用之術語「實質上」意欲涵蓋上文所提及之變化。
以相同之方式，與DSC、TGA或其他熱實驗結合之溫度讀數可端視儀器、具體設置、樣品製劑等變化約±3℃。
因此，在一些實施例中，本申請案提供N-(4-(4-胺基-7-(1-異丁酰基六氫吡啶-4-基)吡咯并[1,2-f][1,2,4]三嗪-5-基)苯基)-1-異丙基-2,4-二側氧基-3-(吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-甲酰胺馬來酸鹽(在本文中亦稱為化合物1之馬來酸鹽、化合物1馬來酸鹽或其任一變化形式)。
在一些實施例中，鹽係1:1化學計量比之N-(4-(4-胺基-7-(1-異丁酰基六氫吡啶-4-基)吡咯并[1,2-f][1,2,4]三嗪-5-基)苯基)-1-異丙基-2,4-二側氧基-3-(吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-甲酰胺:馬來酸。
在一些實施例中，本文所提供化合物1之馬來酸鹽係結晶。如本文所用之「結晶」或「結晶形式」欲指結晶物質之某一晶格構形。同一物質之不同結晶形式通常具有不同晶格(例如晶胞)，此歸因於各結晶形式所特有之不同物理性質。在一些情況下，不同晶格構形具有不同的水或溶劑含量。
化合物1之化合物之馬來酸鹽可以各種結晶形式製備，包括例如形式I、形式II、形式III、形式IV或形式V，如美國公開案第2019/112313號中所述，該美國公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
化合物 1 馬來酸鹽，形式 I ： 本文提供化合物1之結晶形式，稱為形式I，其闡述於下文實例5中。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽具有至少一個XRPD峰，以2θ表示，其選自約4.3°、約8.4°、約12.6°、約13.2°及約18.5°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽具有至少兩個XRPD峰，以2θ表示，其選自約4.3°、約8.4°、約12.6°、約13.2°及約18.5°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽具有至少三個XRPD峰，以2θ表示，其選自約4.3°、約8.4°、約12.6°、約13.2°及約18.5°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽具有至少四個XRPD峰，以2θ表示，其選自約4.3°、約8.4°、約12.6°、約13.2°及約18.5°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽包含以下XRPD峰，以2θ表示：約4.3°、約8.4°、約12.6°、約13.2°及約18.5°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽包含以下XRPD峰，以2θ表示：約4.3°、約8.4°及約13.2°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽具有DSC溫度記錄圖，其具有在約211℃處之吸熱峰。
化合物 1 馬來酸鹽，形式 II ： 本文提供化合物1之結晶形式，稱為形式II，其闡述於下文實例6及實例7中。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式II具有至少一個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.8°、約7.8°、約23.5°及約26.0°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式II具有至少兩個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.8°、約7.8°、約23.5°及約26.0°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式II具有至少三個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.8°、約7.8°、約23.5°及約26.0°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式II包含以下XRPD峰，以2θ表示：約3.8°、約7.8°、約23.5°及約26.0°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式II包含以下XRPD峰，以2θ表示：約3.8°、約7.8°及約23.5°。
化合物 1 馬來酸鹽，形式 III ： 本文提供化合物1之結晶形式，稱為形式III，其闡述於下文實例6及實例8中。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式III具有至少一個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.8°、約7.7°、約12.1°、約18.9°及約20.6°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式III具有至少兩個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.8°、約7.7°、約12.1°、約18.9°及約20.6°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式III具有至少三個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.8°、約7.7°、約12.1°、約18.9°及約20.6°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式III具有至少四個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.8°、約7.7°、約12.1°、約18.9°及約20.6°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式III包含以下XRPD峰，以2θ表示：3.8°、約7.7°、約12.1°、約18.9°及約20.6°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式III包含以下XRPD峰，以2θ表示：約3.8°、約7.7°、約12.1°及約18.9°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式III具有DSC溫度記錄圖，其具有在約165.4℃及約195.4℃處之吸熱峰。在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式III具有DSC溫度記錄圖，其具有在約165.4℃處之吸熱峰。在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式III具有DSC溫度記錄圖，其具有在約195.4℃處之吸熱峰。
化合物 1 馬來酸鹽，形式 IV ： 本文提供化合物1之結晶形式，稱為形式IV，其闡述於下文實例6及實例9中。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式IV具有至少一個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.9°、約4.6°、約7.8°、約9.1°及約22.8°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式IV具有至少兩個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.9°、約4.6°、約7.8°、約9.1°及約22.8°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式IV具有至少三個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.9°、約4.6°、約7.8°、約9.1°及約22.8°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式IV具有至少四個XRPD峰，以2θ表示，其選自約3.9°、約4.6°、約7.8°、約9.1°及約22.8°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式IV包含以下XRPD峰，以2θ表示：約3.9°、約4.6°、約7.8°°、約9.1°及約22.8°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式IV包含以下XRPD峰，以2θ表示：約3.9°、約4.6°、約7.8°°及約9.1°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式IV具有DSC溫度記錄圖，其具有在約152.1℃及202.6℃處之吸熱峰。在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式IV具有DSC溫度記錄圖，其具有在約152.1℃處之吸熱峰。在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式IV具有DSC溫度記錄圖，其具有在約202.6℃處之吸熱峰。
化合物 1 馬來酸鹽，形式 V ： 本文提供化合物1之結晶形式，稱為形式V，其闡述於下文實例6及實例10中。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式V具有至少一個XRPD峰，以2θ表示，其選自約4.1°、約8.3°、約8.8°、約18.0°及約27.3°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式V具有至少兩個XRPD峰，以2θ表示，其選自約4.1°、約8.3°、約8.8°、約18.0°及約27.3°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式V具有至少三個XRPD峰，以2θ表示，其選自約4.1°、約8.3°、約8.8°、約18.0°及約27.3°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式V具有至少四個XRPD峰，以2θ表示，其選自約4.1°、約8.3°、約8.8°、約18.0°及約27.3°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式V包含以下XRPD峰，以2θ表示：約4.1°、約8.3°、約8.8°、約18.0°及約27.3°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式V包含以下XRPD峰，以2θ表示：約4.1°、約8.3°、約8.8°及約27.3°。
在一些實施例中，化合物1之馬來酸鹽之形式V具有DSC溫度記錄圖，其具有在約200.1℃處之吸熱峰。抗體及抗體醫藥組合物之製備
在某些實施例中，結合至人類PD-1之抗體包括人類重鏈及輕鏈恆定區。在某些實施例中，重鏈恆定區包含CH1結構域及鉸鏈區。在一些實施例中，重鏈恆定區包含CH3結構域。若重鏈恆定區包括取代，則該等取代會改變抗體之性質(例如增加或減小以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基數、效應細胞功能或補體功能)。在某些實施例中，抗體係IgG抗體。在特定實施例中，抗體係選自由IgG1、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。
抗體(例如瑞替法尼)可例如藉由製備及表現編碼所列舉胺基酸序列之合成基因或藉由突變人類生殖系基因以提供編碼所列舉胺基酸序列之基因來製得。另外，此抗體及結合至人類PD-1之其他抗體可例如使用以下方法中之一或多者來獲得。
人類化抗體可藉由用來自人類Fv可變區之等效序列替代不直接參與抗原結合之Fv可變區序列來產生。用於產生人類化抗體之一般方法提供於Morrison, S. L.,Science, 229:1202-1207 (1985)、Oi等人，BioTechniques, 4:214 (1986)及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；及US 6,407,213中。彼等方法包括分離、操縱及表現編碼重鏈或輕鏈中至少一者之免疫球蛋白Fv可變區之全部或一部分之核酸序列。該核酸之來源為熟習此項技術者所熟知且例如可自產生如上文所述針對預定靶之抗體之雜交瘤、自生殖系免疫球蛋白基因或自合成構築物獲得。然後可將編碼人類化抗體之重組DNA選殖至適當表現載體中。
例如，人類生殖系序列闡述於Tomlinson, I.A.等人，J. Mol. Biol ., 227:776-798 (1992)；Cook, G. P.等人，Immunol. Today, 16: 237-242 (1995)；Chothia, D.等人，J. Mol. Bio . 227:799-817 (1992)；及Tomlinson等人，EMBO J., 14:4628-4638 (1995)中。V BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之綜合目錄(由Tomlinson, I.A.等人 ，MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK編譯)。該等序列可用作例如框架區及CDR之人類序列之來源。亦可使用例如如美國專利第6,300,064號中所述之一致人類框架區。
亦可使用用於人類化抗體之其他方法。舉例而言，其他方法可解釋抗體之三維結構、三維靠近結合決定子之框架位置及免疫原性肽序列。參見例如WO 90/07861；美國專利第5,693,762號；第5,693,761號；第5,585,089號；第5,530,101號；及第6,407,213號；Tempest等人(1991)Biotechnology 9:266-271。另一方法稱為「人工程化」且闡述於例如U.S. 2005-008625中。
抗體可包括人類Fc區，例如野生型Fc區或包括一或多個變化之Fc區。在一個實施例中，恆定區經改變(例如經突變)以改變抗體之性質(例如增加或減小以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基數、效應細胞功能或補體功能)。舉例而言，人類IgG1恆定區可在一或多個殘基(例如殘基234及237 (基於Kabat編號方式)中之一或多者)處發生突變。抗體可在重鏈之CH2區中具有降低或改變效應功能(例如Fc受體結合及補體活化)之突變。舉例而言，抗體可具有突變，例如美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中所述之彼等突變。抗體亦可具有穩定免疫球蛋白之兩條重鏈之間之二硫鍵的突變，例如如此項技術中所揭示之IgG4鉸鏈區之突變(例如Angal等人(1993)Mol. Immunol. 30:105-08)。亦參見例如U.S. 2005-0037000。
結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體可呈結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體之全長抗體形式或低分子量形式(例如生物活性抗體片段或微小抗體)，例如Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv、Fd、dAb、scFv及sc(Fv)2。本揭示案涵蓋之其他抗體包括含有單一可變鏈(例如VH或VL)或其生物活性片段之單結構域抗體(sdAb)。參見例如Moller等人，J. Biol. Chem ., 285(49): 38348-38361 (2010)；Harmsen等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. , 77(1):13-22 (2007)；U.S. 2005/0079574及Davies等人(1996)Protein Eng ., 9(6):531-7。與完整抗體一樣，sdAb能夠選擇性結合至特異性抗原。具有僅12-15 kDa之分子量，sdAb遠小於常見抗體且甚至小於Fab片段及單鏈可變片段。
本文提供組合物，其包含結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段及其一或多種酸性變異體之混合物，例如，其中酸性變異體之量小於約80%、70%、60%、60%、50%、40%、30%、30%、20%、10%、5%或1%。亦提供組合物，其包含含有至少一個去醯胺位點之結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段，其中組合物之pH為約5.0至約6.5，使得例如至少約90%之抗體並非去醯胺的(即小於約10%之抗體係去醯胺的)。在某些實施例中，小於約5%、3%、2%或1%之抗體係去醯胺的。pH可為5.0至6.0，例如5.5或6.0。在某些實施例中，組合物之pH係5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
「酸性變異體」係相關多肽之變異體，其比該相關多肽酸性更強(例如如藉由陽離子交換層析所測定)。酸性變異體之實例係去醯胺變異體。
多肽分子之「去醯胺」變異體係其中原始多肽之一或多個天冬醯胺殘基已轉化成天冬胺酸、即中性醯胺側鏈已轉化成具有整體酸性特徵之殘基的多肽。
如本文用於包含結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段之組合物之術語「混合物」意指存在結合至人類PD-1或人類PD-L1之期望抗體或其抗原結合片段及其一或多種酸性變異體。酸性變異體可主要包含結合至人類PD-1或人類PD-L1之去醯胺抗體及少量其他酸性變異體。
在某些實施例中，經突變以消除去醯胺之抗體之結合親和力(KD )、締合速率(KD 締合)及/或解離速率(KD 解離)類似於野生型抗體之結合親和力、締合速率及/或解離速率，例如具有小於約5倍、2倍、1倍(100%)、50%、30%、20%、10%、5%、3%、2%或1%之差別。抗體片段
抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Facb及Fv)可藉由完整抗體之蛋白水解消化來製備。舉例而言，抗體片段可藉由用酶(例如木瓜酶、胃蛋白酶或纖維蛋白溶酶)處理完整抗體來獲得。完整抗體之木瓜酶消化產生F(ab)2或Fab片段；完整抗體之胃蛋白酶消化產生F(ab’)2或Fab’；且完整抗體之纖維蛋白溶酶消化產生Facb片段。
另選地，抗體片段可重組產生。舉例而言，可構築編碼相關抗體片段之核酸，將其引入表現載體中，且在適宜宿主細胞中表現。參見例如Co, M.S.等人，J. Immunol. , 152:2968-2976 (1994)；Better, M.及Horwitz, A.H.,Methods in Enzymology , 178:476-496 (1989)；Plueckthun, A.及Skerra, A.,Methods in Enzymology , 178:476-496 (1989)；Lamoyi, E.,Methods in Enzymology , 121:652-663 (1989)；Rousseaux, J.等人，Methods in Enzymology , (1989) 121:663-669 (1989)；及Bird, R.E.等人，TIBTECH , 9:132-137 (1991))。抗體片段可在大腸桿菌 (E. coli) 中表現且自其分泌，因此允許容易地產生大量該等片段。抗體片段可自抗體噬菌體文庫分離。另選地，Fab'-SH片段可直接自大腸桿菌回收且化學偶合以形成F(ab)2片段(Carter等人，Bio/Technology , 10:163-167 (1992))。根據另一方法，F(ab')2片段可直接自重組宿主細胞培養物分離。包含補救受體結合抗原決定基殘基之具有延長的活體內半衰期之Fab及F(ab') 2片段闡述於美國專利第5,869,046號中。微小抗體
結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體之微小抗體包括雙價抗體、單鏈(scFv)及單鏈(Fv)2 (sc(Fv)2)。
「雙價抗體」係藉由基因融合構築之二價微小抗體(參見例如Holliger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A ., 90:6444-6448 (1993)；EP 404,097；WO 93/11161)。雙價抗體係由兩條多肽鏈構成之二聚體。雙價抗體之每一多肽鏈之VL及VH結構域藉由連接體結合。構成連接體之胺基酸殘基之數量可介於2至12個殘基之間(例如3-10個殘基或5個或約5個殘基)。雙價抗體中多肽之連接體通常因太短而使VL及VH無法彼此結合。因此，在同一多肽鏈中編碼之VL及VH無法形成單鏈可變區片段，而是與不同單鏈可變區片段形成二聚體。因此，雙價抗體具有兩個抗原結合位點。
scFv係藉由用連接體連接VH及VL獲得之單鏈多肽抗體(參見例如Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 85:5879-5883 (1988)；及Plickthun, 「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」，第113卷，Resenburg及Moore編輯，Springer Verlag, New York，第269-315頁，(1994))。欲連接之VH及VL之順序不受特定限制，且其可以任一順序排列。排列之實例包括：[VH]連接體[VL]；或[VL]連接體[VH]。scFv中之H鏈V區及L鏈V區可衍生自本文所述之結合至人類PD-1或人類PD-L1之任何抗體或其抗原結合片段。
sc(Fv)2係其中兩個VH及兩個VL藉由連接體連接以形成單鏈之微小抗體(Hudson等人，J. Immunol. Methods , (1999) 231: 177-189 (1999))。sc(Fv)2可例如藉由用連接體連結scFv來製備。本揭示案之sc(Fv)2包括較佳其中自單鏈多肽之N末端開始，兩個VH及兩個VL以下列順序排列之抗體：VH、VL、VH及VL ([VH]連接體[VL]連接體[VH]連接體[VL])；然而，兩個VH及兩個VL之順序並不限於上述排列，且其可以任一順序排列。雙特異性抗體
雙特異性抗體係對至少兩種不同的抗原決定基具有結合特異性之抗體。例示性雙特異性抗體可結合至PD-1蛋白之兩種不同的抗原決定基。其他此類抗體可組合PD-1結合位點與另一蛋白質之結合位點。雙特異性抗體可製備為全長抗體或其低分子量形式(例如F(ab')2 雙特異性抗體、sc(Fv)2雙特異性抗體、雙價抗體雙特異性抗體)。
全長雙特異性抗體之傳統產生係基於兩條免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等人，Nature , 305:537-539 (1983))。在不同方法中，具有期望結合特異性之抗體可變結構域融合至免疫球蛋白恆定結構域序列。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入單獨表現載體中，且共轉染至適宜宿主細胞中。此提供調整三種多肽片段之比例之較大靈活性。然而，在至少兩條多肽鏈之等比率表現產生高產量時，可將兩條或所有三條多肽鏈之編碼序列插入單一表現載體中。
根據美國專利第5,731,168號中所述之另一方法，抗體分子對之間之界面可經工程化以使自重組細胞培養物回收之異二聚體之百分比最大化。較佳界面包含CH3 結構域之至少一部分。在此方法中，第一抗體分子界面之一或多條小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替代。藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替代大胺基酸側鏈在第二抗體分子之界面上產生大小與大側鏈相同或相似之補償性「空腔」。此提供增加異二聚體相對於其他不期望末端產物(例如同二聚體)之產率的機制。
雙特異性抗體包括交聯或「異源結合物」抗體。舉例而言，異源結合物中之一種抗體可偶合至抗生物素蛋白，另一抗體可偶合至生物素。異源結合物抗體可使用任何方便的交聯方法來製得。
「雙價抗體」技術提供製造雙特異性抗體片段之替代機制。該等片段包含藉由連接體連結至VL之VH，該連接體因太短而不允許在同一鏈上之兩個結構域之間配對。因此，一個片段之VH及VL結構域被迫與另一片段之互補VL及VH結構域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。多價抗體
表現抗體所結合之抗原之細胞對多價抗體之內化(及/或分解代謝)可快於二價抗體。本文所述之抗體可為具有三個或更多個抗原結合位點之多價抗體(例如四價抗體)，其可容易地藉由編碼抗體多肽鏈之核酸之重組表現來產生。多價抗體可包含二聚化結構域及三個或更多個抗原結合位點。例示性二聚化結構域包含Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。多價抗體可包含三個至約八個(例如四個)抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體視情況包含至少一條多肽鏈(例如至少兩條多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或更多個可變結構域。例如，多肽鏈可包含VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc，其中VD1係第一可變結構域，VD2係第二可變結構域，Fc係Fc區之多肽鏈，X1及X2代表胺基酸或肽間隔體，且n係0或1。結合抗體
本文所揭示之抗體可為結合至多種分子之結合抗體，該等分子包括大分子物質，例如聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、經PEG修飾之聚乙烯亞胺(PEI) (PEI-PEG)、聚麩胺酸(PGA) (N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺(HPMA)共聚物)、透明質酸、放射性材料(例如90 Y、131 I)螢光物質、發光物質、半抗原、酶、金屬螯合物、藥物及毒素(例如卡奇黴素(calcheamicin)、假單胞菌外毒素 (Pseudomonas exotoxin) A、蓖麻毒素(例如去糖基化蓖麻毒素A鏈))。
在一個實施例中，為改良結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體之細胞毒性作用及因此其治療有效性，使抗體與高毒性物質結合，包括放射性同位素及細胞毒性劑。該等結合物可將毒性負載選擇性遞送至靶位點(即表現抗體所識別抗原之細胞)，同時避開抗體不識別之細胞。為使毒性最小化，通常基於具有短血清半衰期之分子來對結合物進行工程化(因此，使用鼠類序列以及IgG3或IgG4同型)。
在某些實施例中，結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段經將其在循環中(例如在血液、血清或其他組織中)之穩定及/或滯留改良例如至少1.5倍、2倍、5倍、10倍或50倍之部分修飾。舉例而言，結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段可與聚合物(例如實質上非抗原性聚合物，例如聚環氧烷或聚氧化乙烯)締合(例如結合)。適宜聚合物將實質上根據重量而變化。可使用數量平均分子量介於約200至約35,000道爾頓(或約1,000至約15,000及2,000至約12,500)範圍內之聚合物。舉例而言，結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段可結合至水溶性聚合物，例如親水性聚乙烯基聚合物，例如聚乙烯基醇或聚乙烯基吡咯啶酮。此類聚合物之實例包括聚環氧烷均聚物，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，條件係維持嵌段共聚物之水溶解度。其他有用聚合物包括聚氧化烯，例如聚氧乙烯、聚氧丙烯以及聚氧乙烯及聚氧丙烯之嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆(carbomer)；及具分枝或不具分枝之多糖。
上述結合抗體可藉由對本文所述之抗體或其較低分子量形式實施化學修飾來製備。修飾抗體之方法為此項技術中所熟知(例如US 5057313及US 5156840)。產生抗體之方法
抗體可在細菌或真核細胞中產生。一些抗體(例如Fab)可在細菌細胞(例如大腸桿菌 細胞)中產生。抗體亦可在真核細胞(例如轉型細胞株(例如 CHO、293E、COS))中產生。另外，抗體(例如scFv)可在酵母細胞(例如畢赤酵母 (Pichia) (參見例如Powers等人，J Immunol Methods . 251:123-35 (2001))、漢遜酵母 (Hanseula) 或酵母菌屬 (Saccharomyces) )中表現。為產生相關抗體，構築編碼抗體之多核苷酸，將其引入表現載體中，且然後在適宜宿主細胞中表現。使用標準分子生物學技術製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉型體，培養宿主細胞並回收抗體。
若欲在細菌細胞(例如大腸桿菌 )中表現抗體，則表現載體應具有允許載體在細菌細胞中擴增之特徵。另外，當使用大腸桿菌 (例如JM109、DH5α、HB101或XL1-Blue)作為宿主時，載體必須具有啟動子，例如lacZ啟動子(Ward等人，341:544-546 (1989)、araB啟動子(Better等人，Science , 240:1041-1043 (1988))或可允許在大腸桿菌 中有效表現之T7啟動子。此類載體之實例包括例如M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1 (Pharmacia)、「QIA表現系統」 (QIAGEN)、pEGFP及pET (當使用此表現載體時，宿主較佳係表現T7 RNA聚合酶之BL21)。表現載體可含有用於抗體分泌之信號序列。為在大腸桿菌 之周質中產生，可使用pelB 信號序列(Lei等人，J. Bacteriol ., 169:4379 (1987))作為用於抗體分泌之信號序列。對於細菌表現，可使用氯化鈣方法或電穿孔方法將表現載體引入細菌細胞中。
若欲在動物細胞(例如CHO、COS及NIH3T3細胞)中表現抗體，則表現載體包括在該等細胞中表現所需之啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等人， Nature , 277:108 (1979))、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等人 ，Nucleic Acids Res. , 18:5322 (1990))或CMV啟動子。除編碼免疫球蛋白或其結構域之核酸序列外，重組表現載體可攜帶其他序列，例如調控載體在宿主細胞中之複製之序列(例如複製起點)及可選擇標記基因。可選擇標記基因促進其中已引入載體之宿主細胞之選擇(促進例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。舉例而言，可選擇標記基因通常賦予其中已引入載體之宿主細胞對藥物(例如G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲喋呤(methotrexate))之抗性。具有可選擇標記物之載體之實例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV及pOP13。
在一個實施例中，抗體係在哺乳動物細胞中產生。用於表現抗體之例示性哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞) (包括dhfr - CHO細胞，闡述於Urlaub及Chasin (1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中，與例如如Kaufman及Sharp (1982)Mol. Biol. 159:601-621中所述之DHFR可選擇標記物一起使用)、人類胚腎293細胞(例如293、293E、293T)、COS細胞、NIH3T3細胞、淋巴球性細胞株(例如NS0骨髓瘤細胞及SP2細胞)以及來自基因轉殖動物(例如基因轉殖哺乳動物)之細胞。舉例而言，細胞係乳腺上皮細胞。
在用於抗體表現之例示性系統中，藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體之抗體重鏈及抗體輕鏈之重組表現載體引入dhfr - CHO細胞中。在重組表現載體內，抗體重鏈及輕鏈基因各自可操作連接至增強子/啟動子調控元件(例如衍生自SV40、CMV、腺病毒及諸如此類，例如CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調控元件)以驅動基因之高轉錄水準。重組表現載體亦攜帶DHFR 基因，其允許選擇已使用胺甲喋呤選擇/擴增經載體轉染之CHO細胞。培養所選轉型體宿主細胞以允許表現抗體重鏈及輕鏈且自培養基回收抗體。
抗體亦可藉由基因轉殖動物來產生。舉例而言，美國專利第5,849,992號闡述在基因轉殖哺乳動物之乳腺中表現抗體之方法。構築包括乳汁特異性啟動子及編碼相關抗體之核酸及分泌信號序列之轉殖基因。由此類基因轉殖哺乳動物之雌性產生之乳汁包括其中分泌之相關抗體。抗體可自乳汁純化，或對於一些應用直接使用。亦提供包含一或多種本文所述核酸之動物。
本揭示案之抗體可自宿主細胞之內部或外部(例如培養基)分離且純化為實質上純且均質之抗體。常用於抗體純化之分離及純化方法可用於分離及純化抗體，且並不限於任何特定方法。可藉由適當地選擇及組合例如管柱層析、過濾、超濾、鹽析、溶劑沈澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沈澱、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電聚焦、透析及重結晶來分離及純化抗體。層析包括例如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析及吸附層析(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Daniel R. Marshak等人編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。層析可使用液相層析(例如HPLC及FPLC)來實施。用於親和層析之管柱包括蛋白質A管柱及蛋白質G管柱。使用蛋白質A管柱之管柱之實例包括Hyper D、POROS及Sepharose FF (GE Healthcare Biosciences)。本揭示案亦包括使用該等純化方法高度純化之抗體。具有經改變糖基化之抗體
不同糖型可顯著影響治療劑之性質，包括藥物動力學、藥效動力學、受體相互作用及組織特異性靶向(Graddis等人，2002,Curr Pharm Biotechnol. 3: 285-297)。具體而言，對於抗體，除抗體之效應功能(例如與誘導CDC之補體複合物C1之結合及與負責調節ADCC路徑之FcγR受體之結合)外，寡糖結構可影響與蛋白酶抗性相關之性質、由FcRn受體介導之抗體血清半衰期、吞噬作用及抗體反饋(Nose及Wigzell, 1983；Leatherbarrow及Dwek, 1983；Leatherbarrow等人，1985；Walker等人，1989；Carter等人，1992,PNAS , 89: 4285-4289)。
因此，調節抗體效應功能之另一方法包括改變抗體恆定區之糖基化。經改變之糖基化包括例如減少或增加糖基化殘基數、改變糖基化殘基之模式或位置以及改變糖結構。在人類IgG上發現之寡糖影響其效應功能之程度(Raju, T.S.BioProcess International 2003年4月. 44-53)；人類IgG寡糖之微觀不均一性可影響生物功能，例如CDC及ADCC、與各種Fc受體之結合及與Clq蛋白之結合(Wright A.及Morrison SL. TIBTECH 1997, 15 26-32；Shields等人，J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604；Shields等人，J Biol Chem. 2002; 277(30):26733-40；Shinkawa等人，J Biol Chem . 2003 278(5):3466-73；Umana等人，Nat Biotechnol . 1999年2月; 17(2): 176-80)。舉例而言，IgG結合C1q及活化補體級聯之能力可端視位於兩個CH2結構域之間之碳水化合物部分(其通常錨定於Asn297處)之存在、不存在或修飾而定(Ward及Ghetie,Therapeutic Immunology 2:77-94 (1995)。
含Fc之多肽(例如抗體，例如IgG抗體)中之糖基化位點可藉由標準技術來鑑別。糖基化位點之鑑別可為實驗性的或基於序列分析或建模數據。已闡述一致基元，亦即由各種糖基轉移酶識別之胺基酸序列。舉例而言，N連接之糖基化基元之一致基元通常為NXT或NXS，其中X可為除脯胺酸外之任何胺基酸。亦已闡述用於定位潛在糖基化基元之若干算法。因此，為鑑別抗體或含Fc片段內之潛在糖基化位點，例如藉由使用公共資料庫(例如由生物序列分析中心(Center for Biological Sequence Analysis)提供之網站)來檢查抗體之序列(參見用於預測N連接糖基化位點之NetNGlyc服務及用於預測O連接糖基化位點之NetOGlyc服務)。
活體內 研究已確認無糖基抗體之效應功能降低。舉例而言，無糖基抗CD8抗體無法清除小鼠中帶有CD8之細胞(Isaacs, 1992J. Immunol. 148: 3062)且無糖基抗CD3抗體不會誘導小鼠或人類中之細胞介素釋放症候群(Boyd, 1995見上文 ；Friend, 1999Transplantation 68:1632)。PD-1抗體之無糖基化形式亦具有降低的效應功能。
重要的是，儘管去除CH2結構域中之聚糖似乎對效應功能具有顯著效應，但抗體之其他功能及物理性質保持不變。特定而言，已顯示去除聚糖對血清半衰期及抗原結合具有極小至無效應(Nose, 1983見上文 ；Tao, 1989見上文 ；Dorai, 1991見上文 ；Hand, 1992見上文 ；Hobbs, 1992Mol. Immunol. 29:949)。
本揭示案之結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體可經修飾或改變以引發增加或減小的效應功能(與第二PD-1特異性抗體相比)。用於改變抗體之糖基化位點之方法闡述於例如US 6,350,861及US 5,714,350、WO 05/18572及WO 05/03175中；該等方法可用於產生具有改變的、減少的或無糖基化之本揭示案抗體。使用方法
本文所述之方法涉及癌症之治療。實例癌症包括膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、子宮內膜癌、胃癌、頭頸癌(例如喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌及口癌)、腎癌、肝癌(例如肝細胞癌、膽道細胞癌)、肺癌(例如腺癌、小細胞肺癌及非小細胞肺癌、小細胞及非小細胞癌、支氣管癌、支氣管腺瘤、胸膜肺母細胞瘤)、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、食管癌、膽囊癌、胰臟癌(例如外分泌胰臟癌)、胃癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、皮膚癌(例如鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、默克細胞皮膚癌)及腦癌(例如星形細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤、神經外胚層腫瘤、松果體瘤)。
可用本揭示案之治療方法治療之其他癌症包括骨癌、眼內癌、婦科癌症、內分泌系統癌症、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、垂體癌、三陰性乳癌(TNBC)及環境誘發之癌症，包括由石棉誘發之彼等癌症。
其他實例癌症包括血液惡性病，例如白血病或淋巴瘤、多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性淋巴瘤、成人T細胞白血病、B細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、霍奇金氏(Hodgkin’s)或非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓增生性贅瘤(例如真性多血症、原發性血小板過多症及原發性骨髓纖維化)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglubulinemia)、毛細胞淋巴瘤、慢性骨髓性淋巴瘤、急性淋巴母細胞性淋巴瘤、AIDS相關之淋巴瘤及伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)。
可用本揭示案之治療方法治療之其他癌症包括眼腫瘤、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、淋巴肉瘤及骨肉瘤。
本揭示案之方法亦可用於治療轉移性癌症，尤其表現PD-L1之轉移性癌症。
在一些實施例中，可使用本揭示案之方法治療之疾病及適應症包括(但不限於)血液癌、頭頸癌、肉瘤、肺癌、胃腸癌、泌尿生殖道癌、肝癌、骨癌、神經系統癌、婦科癌症及皮膚癌。
例示性血液癌包括淋巴瘤及白血病，例如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性前骨髓細胞性白血病(APL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣帶淋巴瘤(MZL)、非霍奇金氏淋巴瘤(包括復發性或難治性NHL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、霍奇金氏淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤、骨髓增生性疾病(例如原發性骨髓纖維化(PMF)、真性多血症(PV)、原發性血小板增多症(ET))、骨髓發育不良症候群(MDS)、T細胞急性淋巴母細胞性淋巴瘤(T-ALL)、多發性骨髓瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、毛細胞淋巴瘤、慢性骨髓性淋巴瘤及伯基特氏淋巴瘤。
例示性肉瘤包括軟骨肉瘤、尤恩氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤、黏液瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、纖維瘤、脂肪瘤、錯構瘤及畸胎瘤。
例示性肺癌包括非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、支氣管癌(鱗狀細胞腺癌、未分化小細胞腺癌、未分化大細胞腺癌)、肺泡(細支氣管)癌、支氣管腺瘤、軟骨瘤型錯構瘤及間皮瘤。
例示性胃腸癌包括食管癌(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃癌(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰臟癌(導管腺癌、胰島素瘤、胰升糖素瘤、胃泌素瘤、類癌瘤、胰腺瘤)、小腸癌(腺癌、淋巴瘤、類癌瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)、大腸癌(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤)、結腸直腸癌及膽管癌。
例示性泌尿生殖道癌包括腎癌(腺癌、威爾姆氏腫瘤(Wilm's tumor) [腎母細胞瘤]、腎細胞癌)、膀胱及尿道癌(鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌、尿路上皮癌)、前列腺癌(腺癌、肉瘤)及睪丸癌(精細胞瘤、畸胎瘤、胚癌、畸形癌、絨毛膜癌、肉瘤、間質細胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣腫瘤、脂肪瘤)。
例示性肝癌包括肝腫瘤(肝細胞癌)、膽道癌、肝母細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞腺瘤及血管瘤。
例示性骨癌包括例如成骨肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤恩氏肉瘤、惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞瘤脊索瘤、骨軟骨瘤(骨軟骨性外生骨疣)、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨樣骨瘤及巨細胞瘤。
例示性神經系統癌包括頭骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃色瘤、畸形性骨炎)、腦膜癌(腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經膠瘤病)、腦癌(星形細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、胚細胞瘤(松果體瘤)、神經膠母細胞瘤、多形性神經膠母細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜母細胞瘤、先天瘤)及脊髓癌(神經纖維瘤、腦膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)以及神經母細胞瘤、萊-杜二氏病(Lhermitte-Duclos disease)、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤及脊軸腫瘤。
例示性婦科癌症包括子宮癌(子宮內膜癌)、子宮頸癌(宮頸癌、腫瘤前宮頸發育不良)、卵巢癌(卵巢癌瘤(漿液囊腺癌、黏液囊腺癌、未分類癌瘤)、粒膜細胞瘤、支持-間質細胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、無性胚胎瘤、惡性畸胎瘤)、陰戶癌(鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤)、陰道癌(透明細胞癌、鱗狀細胞癌、葡萄形肉瘤(胚胎橫紋肌肉瘤)及輸卵管癌(癌瘤)。
例示性皮膚癌包括黑色素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤、默克細胞皮膚癌、胎塊發育不良性痣、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤及瘢痕瘤。
例示性頭頸癌包括神經膠母細胞瘤、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、淋巴肉瘤、骨肉瘤、鱗狀細胞癌、腺癌、口腔癌、喉癌、鼻咽癌、鼻癌及鼻旁癌、甲狀腺癌及副甲狀腺癌。
在一些實施例中，本揭示案提供治療有需要之患者之肝細胞癌之方法。在一些實施例中，本揭示案提供治療有需要之患者之橫紋肌肉瘤、食管癌、乳癌或頭頸癌之方法。
在一些實施例中，本揭示案提供治療癌症之方法，其中癌症係選自肝細胞癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、肛門癌、默克細胞癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、膽囊癌、胰臟癌、甲狀腺癌、皮膚癌、白血病、多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性淋巴瘤、成人T細胞白血病、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、霍奇金氏或非霍奇金氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、毛細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤及橫紋肌肉瘤。
在一些實施例中，本揭示案提供治療癌症之方法，其中癌症係選自肝細胞癌、乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、前列腺癌、胰臟癌、睪丸癌、甲狀腺癌、鱗狀細胞癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、子宮癌及橫紋肌肉瘤。
在一些實施例中，本揭示案提供治療癌症之方法，其中癌症係選自肉瘤、頭頸癌、黑色素瘤及非小細胞肺癌。在一些實施例中，癌症係肉瘤。在一些實施例中，癌症係頭頸癌。在一些實施例中，癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，癌症係非小細胞肺癌。
本文所述之方法涉及癌症(例如實體腫瘤)之治療。
在一些實施例中，實體腫瘤係選自皮膚癌、肺癌、淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、輸尿管、尿道及臍尿管癌、胃癌、子宮頸癌、肝癌、乳癌、腎癌、鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、肛門癌及高度微衛星不穩定性(MSI-H)腫瘤、錯配修復缺陷(dMMR)及/或DNA聚合酶ε核酸外切酶結構域突變陽性疾病。
在一些實施例中，實體腫瘤係選自膽道癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、霍奇金氏淋巴瘤、尿路上皮癌胃癌、肝細胞癌、默克細胞癌、三陰性乳癌、腎細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌及結腸直腸癌。
在一些實施例中，實體腫瘤係選自肉瘤、頭頸癌、黑色素瘤及非小細胞肺癌。在一些實施例中，實體腫瘤係肉瘤。在一些實施例中，實體腫瘤係頭頸癌。在一些實施例中，實體腫瘤係黑色素瘤。在一些實施例中，實體腫瘤係非小細胞肺癌。
如本文所用之術語「細胞」欲指活體外 、離體 或活體內 細胞。在一些實施例中，離體 細胞可為自生物體(例如哺乳動物)切除之組織樣品之一部分。在一些實施例中，活體外 細胞可為細胞培養物中之細胞。在一些實施例中，活體內 細胞係生活在生物體(例如哺乳動物)中之細胞。
如本文所用之術語「接觸」係指將活體外 系統或活體內 系統中之所指示部分放在一起。舉例而言，使TAM激酶與化合物1「接觸」包括向個體或患者(例如人類)投與化合物1以及例如將化合物1引入含有含TAM激酶之細胞或經純化製劑之樣品。
如本文所用之術語「個體(subject)」、「個體(individual)」或「患者」可互換使用且係指任何動物，包括哺乳動物，較佳小鼠、大鼠、其他嚙齒類動物、兔、狗、貓、豬、牛、綿羊、馬或靈長類動物，且最佳人類。
如本文所用之術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指1)抑制疾病；例如，抑制正在經歷或展示疾病、疾患或病症之病狀或症狀之個體之疾病、疾患或病症(即 ，阻止病狀及/或症狀之進一步發展)，或2)改善疾病；例如，改善正在經歷或展示疾病、疾患或病症之病狀或症狀之個體之疾病、疾患或病症(即 ，逆轉病狀及/或症狀)。
如本文所用之術語「預防(preventing)」或「預防(prevention)」係指預防可能易患疾病、疾患或病症但尚未經歷或展示疾病之病狀或症狀之個體之疾病、疾患或病症。組合療法 I. 癌症療法
癌細胞之生長及存活可受多個信號傳導路徑之功能障礙影響。因此，組合不同酶/蛋白/受體抑制劑以治療此類疾患係有用的，該等酶/蛋白/受體抑制劑在其調節活性之靶中展現不同偏好。靶向一個以上之信號傳導路徑(或參與給定信號傳導路徑之一種以上之生物分子)可降低在細胞群體中產生藥物抗性之可能性及/或降低治療之毒性。
一或多種其他醫藥劑(例如化學治療劑、抗發炎劑、類固醇、免疫抑制劑、腫瘤免疫劑、代謝酶抑制劑、趨化介素受體抑制劑及磷酸酶抑制劑)以及靶向療法(例如Bcr-Abl、Flt-3、EGFR、HER2、JAK、c-MET、VEGFR、PDGFR、c-Kit、IGF-1R、RAF、FAK、CDK2及CDK4/6激酶抑制劑，例如WO 2006/056399中所述之彼等激酶抑制劑)可與本揭示案之治療方法及方案組合使用來治療癌症及實體腫瘤。其他劑(例如治療性抗體)可與本揭示案之治療方法及方案組合使用來治療癌症及實體腫瘤。一或多種其他醫藥劑可同時或依序投與患者。
如本文所揭示之治療方法可與一或多種其他酶/蛋白/受體抑制劑療法組合使用來治療疾病，例如癌症及本文所述之其他疾病或病症。舉例而言，本揭示案之治療方法及方案可與一或多種以下激酶抑制劑組合來治療癌症：Akt1、Akt2、Akt3、BCL2、CDK2、CDK4/6、TGF-βR、PKA、PKG、PKC、CaM-激酶、磷酸化酶激酶、MEKK、ERK、MAPK、mTOR、EGFR、HER2、HER3、HER4、INS-R、IDH2、IGF-1R、IR-R、PDGFαR、PDGFβR、PI3K (α、β、γ、δ及多種或選擇性)、CSF1R、KIT、FLK-II、KDR/FLK-1、FLK-4、flt-1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Met、PARP、Ron、Sea、TRKA、TRKB、TRKC、TAM激酶(Axl、Mer、Tyro3)、FLT3、VEGFR/Flt2、Flt4、EphA1、EphA2、EphA3、EphB2、EphB4、Tie2、Src、Fyn、Lck、Fgr、Btk、Fak、SYK、FRK、JAK、ABL、ALK及B-Raf。可與本揭示案之治療方法及方案組合治療癌症之抑制劑之非限制性實例包括FGFR抑制劑(FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4，例如培米加替尼(pemigatinib，INCY54828)、INCB62079)、EGFR抑制劑(亦稱為ErB-1或HER-1；例如厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、奧西替尼(orsimertinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、奈昔木單抗(necitumumab)或帕尼單抗(panitumumab))、VEGFR抑制劑或路徑阻斷劑(例如貝伐珠單抗(bevacizumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉菲尼(sorafenib)、阿西替尼(axitinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、普納替尼(ponatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、凡德他尼、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、來瓦替尼(lenvatinib)、ziv-阿柏西普(aflibercept))、PARP抑制劑(例如奧拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕尼(rucaparib)、維利帕尼(veliparib)或尼拉帕尼(niraparib))、 JAK抑制劑(JAK1及/或JAK2，例如魯索替尼(ruxolitinib)、巴瑞克替尼(baricitinib)、衣康替尼(itacitinib，INCB39110)、LSD1抑制劑(例如INCB59872及INCB60003)、TDO抑制劑、PI3K-δ抑制劑(例如INCB50465及INCB50797)、PI3K-γ抑制劑(例如PI3K-γ選擇性抑制劑)、Pim抑制劑(例如INCB53914)、CSF1R抑制劑、TAM受體酪胺酸激酶(Tyro-3、Axl及Mer)、腺苷受體拮抗劑(例如A2a/A2b受體拮抗劑)、HPK1抑制劑、趨化介素受體抑制劑(例如CCR2或CCR5抑制劑)、SHP1/2磷酸酶抑制劑、組蛋白去乙醯酶抑制劑(HDAC) (例如HDAC8抑制劑)、血管生成抑制劑、介白素受體抑制劑、溴及額外末端家族成員抑制劑(例如溴結構域抑制劑或BET抑制劑，例如INCB54329及INCB57643)、 c-MET抑制劑(例如 卡馬替尼(capmatinib))、抗CD19抗體(例如 他法替他單抗(tafasitamab))、ALK2抑制劑(例如 INCB00928)；或其組合。
在一些實施例中，本文所述之治療方法係與投與PI3Kδ抑制劑組合。在一些實施例中，本文所述之治療方法係與投與JAK抑制劑組合。在一些實施例中，本文所述之治療方法係與投與JAK1或JAK2抑制劑(例如巴瑞克替尼或魯索替尼)組合。在一些實施例中，本文所述之治療方法係與投與JAK1抑制劑組合。在一些實施例中，本文所述之治療方法係與投與JAK1抑制劑組合，該JAK1抑制劑對JAK2具有選擇性。
可在組合療法中投與之實例抗體包括(但不限於)曲妥珠單抗(trastuzumab) (例如 抗HER2)、蘭尼單抗(ranibizumab) (例如 抗VEGF-A)、貝伐珠單抗(AVASTINTM ，例如 抗VEGF)、帕尼單抗(例如 抗EGFR)、西妥昔單抗(例如 抗EGFR)、瑞圖宣(rituxan) (例如 抗CD20)及針對c-MET之抗體。
以下劑中之一或多者可與本揭示案之治療方法組合投與患者且呈現為非限制性清單：細胞生長抑制劑、順鉑、多柔比星(doxorubicin)、泰索帝(taxotere)、汰癌勝(taxol)、依託泊苷(etoposide)、伊立替康(irinotecan)、肯托斯塔(camptostar)、托泊替康(topotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、埃博黴素(epothilone)、他莫昔芬(tamoxifen)、5-氟尿嘧啶、胺甲喋呤、替莫唑胺(temozolomide)、環磷醯胺、SCH 66336、R115777、L778,123、BMS 214662、IRESSATM (吉非替尼)、TARCEVATM (厄洛替尼)、針對EGFR之抗體、內含子、ara-C、阿霉素(adriamycin)、癌得星(cytoxan)、吉西他濱(gemcitabine)、尿嘧啶氮芥、甲川氯(chlormethine)、異環磷醯胺、美法崙(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、哌血生(pipobroman)、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷醯胺、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、鏈脲黴素(streptozocin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、氟尿苷(floxuridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、甲醯四氫葉酸(leucovirin)、ELOXATIN™ (奧沙利鉑)、噴司他丁(pentostatine)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、多柔比星、泛艾黴素(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、光輝黴素(mithramycin)、去氧助間型黴素(deoxycoformycin)、絲裂黴素(mitomycin)-C、L-天冬醯胺酶、替尼泊苷(teniposide) 17.α.-炔雌醇、乙烯雌酚、睪固酮(testosterone)、普賴松(Prednisone)、氟甲睪固酮、丙酸屈他雄酮(Dromostanolone propionate)、睪內酯(testolactone)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)、甲基睪固酮、普賴蘇濃、安西諾隆(triamcinolone)、氯烯雌醚(chlorotrianisene)、羥基助孕酮、胺魯米特(aminoglutethimide)、雌氮芥(estramustine)、乙酸甲羥孕酮、柳培林(leuprolide)、氟他胺(flutamide)、托瑞米芬(toremifene)、戈捨瑞林(goserelin)、卡鉑、羥基脲、安丫啶(amsacrine)、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、左旋咪唑(levamisole)、諾維本(navelbene)、阿那曲唑(anastrazole)、來曲唑(letrazole)、卡培他濱(capecitabine)、雷洛昔芬(reloxafine)、屈洛昔芬(droloxafine)、六甲蜜胺、癌思停、HERCEPTINTM (曲妥珠單抗)、BEXXARTM (托西莫單抗(tositumomab))、VELCADETM (硼替佐米(bortezomib))、ZEVALINTM (替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan))、 TRISENOXTM (三氧化砷)、XELODATM (卡培他濱)、長春瑞濱(vinorelbine)、卟吩姆(porfimer)、ERBITUXTM (西妥昔單抗)、塞替派(thiotepa)、六甲蜜胺(altretamine)、美法崙、曲妥珠單抗、來曲唑、氟維司群(fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、異環磷酰胺、利妥昔單抗(rituximab)、C225 (西妥昔單抗)、坎帕斯(Campath) (阿倫珠單抗(alemtuzumab))、氯法拉濱(clofarabine)、克拉屈濱(cladribine)、艾弗迪隆(aphidicolon)、瑞圖宣、舒尼替尼、達沙替尼(dasatinib)、替扎他濱(tezacitabine)、Sml1、氟達拉濱(fludarabine)、噴司他丁、曲安呯(triapine)、地多西(didox)、曲美多(trimidox)、艾米多西(amidox)、3-AP及MDL-101,731。
本揭示案之治療方法及方案可進一步與其他治療癌症之方法(例如藉由化學療法、輻射療法、腫瘤靶向療法、輔助療法、免疫療法或手術)組合使用。免疫療法之實例包括細胞介素治療(例如干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)、CRS-207免疫療法、癌症疫苗、單株抗體、雙特異性或多特異性抗體、抗體藥物結合物、過繼性T細胞轉移、鐸受體促效劑、RIG-I促效劑、溶瘤病毒療法及免疫調節小分子，包括雷利竇邁(thalidomide)或JAK1/2抑制劑、PI3Kδ抑制劑及諸如此類。化合物可與一或多種抗癌藥物(例如化學治療劑)組合投與。化學治療劑之實例包括以下中之任一者：阿巴瑞克(abarelix)、阿地介白素(aldesleukin)、阿倫珠單抗、阿曲諾英(alitretinoin)、別嘌呤醇、六甲蜜胺、阿那曲唑(anastrozole)、三氧化砷、天冬醯胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、貝伐珠單抗、貝沙羅汀(bexarotene)、巴瑞克替尼、博來黴素、硼替佐米、白消安靜脈內、口服白消安、卡普睪酮(calusterone)、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、西妥昔單抗、氮芥苯丁酸、順鉑、克拉屈濱、氯法拉濱、環磷醯胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、達肝素鈉(dalteparin sodium)、達沙替尼、道諾黴素、地西他濱(decitabine)、地尼介白素(denileukin)、地尼介白素2 (denileukin diftitox)、右雷佐生(dexrazoxane)、多西他賽、多柔比星、丙酸屈他雄酮、依庫株單抗(eculizumab)、愛帕司他(epacadostat)、泛艾黴素、厄洛替尼、雌氮芥、磷酸依託泊苷、依託泊苷、依西美坦、乙酸芬太尼(fentanyl citrate)、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、氟維司群、吉非替尼、吉西他濱、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、乙酸戈捨瑞林、乙酸組胺瑞林(histrelin acetate)、替伊莫單抗、伊達比星、異環磷醯胺、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、干擾素α2a、伊立替康、二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)、雷利竇邁、來曲唑、甲醯四氫葉酸、乙酸柳培林、左旋咪唑、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、乙酸甲地孕酮、美法崙、巰基嘌呤、胺甲喋呤、甲氧沙林(methoxsalen)、絲裂黴素C、米托坦、米托蒽醌、苯丙酸諾龍(nandrolone phenpropionate)、奈拉濱(nelarabine)、諾莫單抗(nofetumomab)、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、帕米磷酸鹽(pamidronate)、帕尼單抗、培門冬酶(pegaspargase)、培非格司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞二鈉(pemetrexed disodium)、噴司他丁、哌血生、普卡黴素(plicamycin)、丙卡巴肼、奎那克林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、利妥昔單抗、魯索替尼、索拉菲尼、鏈脲黴素、舒尼替尼、舒尼替尼馬來酸鹽、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睪內酯、雷利竇邁、硫鳥嘌呤、塞替派、托泊替康、托瑞米芬、托西莫單抗、曲妥珠單抗、維A酸(tretinoin)、尿嘧啶氮芥、戊柔比星(valrubicin)、長春鹼、長春新鹼、長春瑞濱、伏立諾他(vorinostat)及唑來膦酸鹽(zoledronate)。
化學治療劑之其他實例包括蛋白酶體抑制劑(例如 硼替佐米)、雷利竇邁、雷利米得(revlimid)及DNA損傷劑，例如美法崙、多柔比星、環磷醯胺、長春新鹼、依託泊苷、卡莫司汀及諸如此類。
實例類固醇包括皮質類固醇，例如地塞米松(dexamethasone)或普賴松。
實例Bcr-Abl抑制劑包括甲磺酸伊馬替尼(GLEEVAC™)、尼羅替尼(nilotinib)、達沙替尼、伯舒替尼(bosutinib)及普納替尼以及醫藥學上可接受之鹽。適宜Bcr-Abl抑制劑之其他實例包括美國專利第5,521,184號、WO 04/005281及美國專利第60/578,491號中所揭示之屬及種之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
適宜Flt-3抑制劑之實例包括米哚妥林(midostaurin)、來他替尼(lestaurtinib)、利尼伐尼(linifanib)、舒尼替尼、馬來酸舒尼替尼、索拉菲尼、奎紮替尼(quizartinib)、克萊拉尼(crenolanib)、帕利替尼(pacritinib)、坦度替尼(tandutinib)、PLX3397及ASP2215以及其醫藥學上可接受之鹽。適宜Flt-3抑制劑之其他實例包括如WO 03/037347、WO 03/099771及WO 04/046120中所揭示之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
適宜RAF抑制劑之實例包括達拉菲尼(dabrafenib)、索拉菲尼及威羅菲尼(vemurafenib)以及其醫藥學上可接受之鹽。適宜RAF抑制劑之其他實例包括如WO 00/09495及WO 05/028444中所揭示之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
適宜FAK抑制劑之實例包括VS-4718、VS-5095、VS-6062、VS-6063、BI853520及GSK2256098以及其醫藥學上可接受之鹽。適宜FAK抑制劑之其他實例包括如WO 04/080980、WO 04/056786、WO 03/024967、WO 01/064655、WO 00/053595及WO 01/014402中所揭示之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
適宜CDK4/6抑制劑之實例包括帕博西尼(palbociclib)、瑞博西利(ribociclib)、曲拉西利(trilaciclib)、來羅西利(lerociclib)及阿貝西利(abemaciclib)以及其醫藥學上可接受之鹽。適宜CDK4/6抑制劑之其他實例包括如WO 09/085185、WO 12/129344、WO 11/101409、WO 03/062236、WO 10/075074及WO 12/061156中所揭示之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，本揭示案之化合物可與一或多種其他激酶抑制劑(包括伊馬替尼)組合使用，尤其用來治療對伊馬替尼或其他激酶抑制劑有抗性之患者。
在一些實施例中，本揭示案之治療方法可與化學治療劑組合使用來治療癌症，且與單獨化學治療劑之反應相比可改良治療反應，而不加重其毒性效應。在一些實施例中，本揭示案之治療方法可與本文所提供之化學治療劑組合使用。舉例而言，用於治療多發性骨髓瘤之其他醫藥劑可包括(但不限於)美法崙、美法崙加普賴松[MP]、多柔比星、地塞米松及萬珂(Velcade) (硼替佐米)。用於治療多發性骨髓瘤之其他額外劑包括Bcr-Abl、Flt-3、RAF及FAK激酶抑制劑。在一些實施例中，該劑係烷基化劑、蛋白酶體抑制劑、皮質類固醇或免疫調節劑。烷基化劑之實例包括環磷醯胺(CY)、美法侖(MEL)及苯達莫司汀(bendamustine)。在一些實施例中，蛋白酶體抑制劑係卡非佐米(carfilzomib)。在一些實施例中，皮質類固醇係地塞米松(DEX)。在一些實施例中，免疫調節劑係雷利竇邁(LEN)或泊馬度胺(pomalidomide，POM)。加和或協同效應係組合本揭示案之治療方法與另一劑之期望結果。
該等劑可以單一或連續劑量形式與本治療方法之化合物1及/或結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段組合，或該等劑可作為單獨劑量形式同時或依序投與。
在一些實施例中，皮質類固醇(例如地塞米松)係與本揭示案之治療方法組合投與患者，其中地塞米松係以與連續方式相反之間歇性方式投與。
本文所述之治療方法可與另一免疫原性劑(例如癌性細胞、經純化腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽及碳水化合物分子)、細胞及經編碼免疫刺激細胞介素之基因轉染之細胞)組合。可用腫瘤疫苗之非限制性實例包括黑色素瘤抗原之肽，例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MARTI及/或酪胺酸酶之肽或經轉染以表現細胞介素GM-CSF之腫瘤細胞。
本文所述之治療方法可與疫苗接種方案組合使用來治療癌症。在一些實施例中，腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF。在一些實施例中，腫瘤疫苗包括來自參與人類癌症之病毒(例如人類乳頭瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡波西氏皰疹肉瘤病毒(KHSV))之蛋白質。在一些實施例中，本揭示案之治療方法及方案可與腫瘤特異性抗原(例如自腫瘤組織自身分離之熱休克蛋白)組合使用。在一些實施例中，本文所述之治療方法可與樹突細胞免疫組合來活化強效抗腫瘤反應。
本揭示案之治療方法及方案可與使表現Fe α或Fe γ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性大環肽組合使用。本揭示案之治療方法及方案亦可與活化宿主免疫反應性之大環肽組合。
在一些其他實施例中，本揭示案之治療方法係與在骨髓移植或幹細胞移植之前、期間及/或之後向患者投與其他治療劑組合。本揭示案之治療方法及方案可與骨髓移植組合使用來治療多種造血來源之腫瘤。
如上文實施例中之任一者所論述，當向患者投與一種以上之醫藥劑時，其可同時、單獨、依序或組合投與(例如 對於兩種以上之劑)。
安全且有效地投與大多數該等化學治療劑之方法為熟習此項技術者已知。另外，其投與闡述於標準文獻中。舉例而言，許多化學治療劑之投與闡述於「Physicians' Desk Reference」 (PDR，例如1996版，Medical Economics Company, Montvale, NJ)中，該文獻之揭示內容以引用方式併入本文中如同全文闡釋一般。 II. 免疫檢查點療法
本揭示案之化合物(化合物1或其醫藥學上可接受之鹽)可與一或多種免疫檢查點抑制劑組合使用來治療疾病，例如癌症或感染。例示性免疫檢查點抑制劑包括針對免疫檢查點分子(例如CBL-B、CD20、CD28、CD40、CD70、CD122、CD96、CD73、CD47、CDK2、GITR、CSF1R、JAK、PI3K δ、PI3K γ、TAM、精胺酸酶、HPK1、CD137 (亦稱為4-1BB)、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、TLR (TLR7/8)、TIGIT、CD112R、VISTA、PD-1、PD-L1及PD-L2)之抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點分子係選自CD27、CD28、CD40、ICOS、OX40、GITR及CD137之刺激性檢查點分子。在一些實施例中，免疫檢查點分子係選自A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM3、TIGIT及VISTA之抑制性檢查點分子。在一些實施例中，本文提供之化合物可與一或多種選自以下之劑組合使用：KIR抑制劑、TIGIT抑制劑、LAIR1抑制劑、CD160抑制劑、2B4抑制劑及TGFR β抑制劑。
在一些實施例中，本文提供之化合物可與免疫檢查點分子(例如，OX40、CD27、GITR及CD137 (亦稱為4-1BB))之一或多種促效劑組合使用。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係抗PD1抗體、抗PD-L1抗體或抗CTLA-4抗體。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係PD-1或PD-L1之抑制劑，例如抗PD-1或抗PD-L1單株抗體。在一些實施例中，抗PD-1或抗PD-L1抗體係尼沃魯單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗(avelumab)、西米普利單抗(cemiplimab)、阿替珠單抗、阿維魯單抗、替雷利珠單抗(tislelizumab)、司帕珠單抗(spartalizumab，PDR001)、西妥利單抗(cetrelimab，JNJ-63723283)、特瑞普利單抗(toripalimab，JS001)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab，SHR-1210)、信迪利單抗(sintilimab，IBI308)、AB122 (GLS-010)、AMP-224、AMP-514/MEDI-0680、BMS936559、JTX-4014、BGB-108、SHR-1210、MEDI4736、FAZ053、BCD-100、KN035、CS1001、BAT1306、LZM009、AK105、HLX10、SHR-1316、CBT-502 (TQB2450)、A167 (KL-A167)、STI-A101 (ZKAB001)、CK-301、BGB-A333、MSB-2311、HLX20、TSR-042或LY3300054。在一些實施例中，PD-1或PD-L1之抑制劑係以下專利中所揭示之一者：美國專利第7,488,802號、第7,943,743號、第8,008,449號、第8,168,757號、第8,217,149號或第10,308,644號；美國公開案第2017/0145025號、第2017/0174671號、第2017/0174679號、第2017/0320875號、第2017/0342060號、第2017/0362253號、第2018/0016260號、第2018/0057486號、第2018/0177784號、第2018/0177870號、第2018/0179179號、第2018/0179201號、第2018/0179202號、第2018/0273519號、第2019/0040082號、第2019/0062345號、第2019/0071439號、第2019/0127467號、第2019/0144439號、第2019/0202824號、第2019/0225601號、第2019/0300524號或第2019/0345170號；或PCT公開案第WO 03042402號、第WO 2008156712號、第WO 2010089411號、第WO 2010036959號、第WO 2011066342號、第WO 2011159877號、第WO 2011082400號或第WO 2011161699號，該等專利之全文各自以引用方式併入本文中。在一些實施例中，PD-L1之抑制劑係INCB086550。
在一些實施例中，抗體係抗PD-1抗體，例如抗PD-1單株抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體係尼沃魯單抗、派姆單抗、西米普利單抗、斯巴達珠單抗、卡瑞利珠單抗、西妥利單抗、特瑞普利單抗、信迪利單抗、AB122、AMP-224、JTX-4014、BGB-108、BCD-100、BAT1306、LZM009、AK105、HLX10或TSR-042。在一些實施例中，抗PD-1抗體係尼沃魯單抗、派姆單抗、西米普利單抗、斯巴達珠單抗、卡瑞利珠單抗、西妥利單抗、特瑞普利單抗或信迪利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體係派姆單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體係尼沃魯單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體係西米普利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體係斯巴達珠單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體係卡瑞利珠單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體係西妥利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體係特瑞普利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體係信迪利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體係AB122。在一些實施例中，抗PD-1抗體係AMP-224。在一些實施例中，抗PD-1抗體係JTX-4014。在一些實施例中，抗PD-1抗體係BGB-108。在一些實施例中，抗PD-1抗體係BCD-100。在一些實施例中，抗PD-1抗體係BAT1306。在一些實施例中，抗PD-1抗體係LZM009。在一些實施例中，抗PD-1抗體係AK105。在一些實施例中，抗PD-1抗體係HLX10。在一些實施例中，抗PD-1抗體係TSR-042。在一些實施例中，抗PD-1單株抗體係尼沃魯單抗或派姆單抗。在一些實施例中，抗PD1抗體係SHR-1210。其他抗癌劑包括抗體治療劑，例如4-1BB (例如 烏瑞魯單抗(urelumab)、烏托米單抗(utomilumab))。在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係PD-L1之抑制劑，例如抗PD-L1單株抗體。在一些實施例中，抗PD-L1單株抗體係阿替珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、替雷利珠單抗、BMS-935559、MEDI4736、阿替珠單抗(MPDL3280A；亦稱為RG7446)、阿維魯單抗(MSB0010718C)、FAZ053、KN035、CS1001、SHR-1316、CBT-502、A167、STI-A101、CK-301、BGB-A333、MSB-2311、HLX20或LY3300054。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係阿替珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗或替雷利珠單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係阿替珠單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係阿維魯單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係德瓦魯單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係替雷利珠單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係BMS-935559。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係MEDI4736。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係FAZ053。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係KN035。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係CS1001。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係SHR-1316。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係CBT-502。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係A167。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係STI-A101。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係CK-301。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係BGB-A333。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係MSB-2311。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係HLX20。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係LY3300054。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係結合至PD-L1之小分子，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係結合至且內化PD-L1之小分子，或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係選自US 2018/0179201、US 2018/0179197、US 2018/0179179、US 2018/0179202、US 2018/0177784、US 2018/0177870、美國專利第16/369,654號(於2019年3月29日提出申請)及美國專利第62/688,164號中之彼等化合物之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，該等專利各自之全文皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係KIR、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β之抑制劑。
在一些實施例中，抑制劑係MCLA-145。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係CTLA-4之抑制劑，例如抗CTLA-4抗體。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體係伊匹單抗(ipilimumab)、曲美目單抗(tremelimumab)、AGEN1884或CP-675,206。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係LAG3之抑制劑，例如抗LAG3抗體。在一些實施例中，抗LAG3抗體係BMS-986016、LAG525、INCAGN2385或依氟拉莫德(eftilagimod) α (IMP321)。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係CD73之抑制劑。在一些實施例中，CD73之抑制劑係奧來單抗(oleclumab)。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係TIGIT之抑制劑。在一些實施例中，TIGIT之抑制劑係OMP-31M32。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係VISTA之抑制劑。在一些實施例中，VISTA之抑制劑係JNJ-61610588或CA-170。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係B7-H3之抑制劑。在一些實施例中，B7-H3之抑制劑係恩妥珠單抗(enoblituzumab)、MGD009或8H9。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係KIR之抑制劑。在一些實施例中，KIR之抑制劑係利利單抗(lirilumab)或IPH4102。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係A2aR之抑制劑。在一些實施例中，A2aR之抑制劑係CPI-444。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係TGF-β之抑制劑。在一些實施例中，TGF-β之抑制劑係曲貝德生(trabedersen)、加魯替尼(galusertinib)或M7824。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係PI3K-γ之抑制劑。在一些實施例中，PI3K-γ之抑制劑係IPI-549。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係CD47之抑制劑。在一些實施例中，CD47之抑制劑係Hu5F9-G4或TTI-621。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係CD73之抑制劑。在一些實施例中，CD73之抑制劑係MEDI9447。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係CD70之抑制劑。在一些實施例中，CD70之抑制劑係庫薩土珠單抗(cusatuzumab)或BMS-936561。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係TIM3之抑制劑，例如抗TIM3抗體。在一些實施例中，抗TIM3抗體係INCAGN2390、MBG453或TSR-022。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係CD20之抑制劑，例如抗CD20抗體。在一些實施例中，抗CD20抗體係奧妥珠單抗(obinutuzumab)或利妥昔單抗。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑係OX40、CD27、CD28、GITR、ICOS、CD40、TLR7/8及CD137 (亦稱為4-1BB)之促效劑。
在一些實施例中，CD137之促效劑係烏瑞魯單抗。在一些實施例中，CD137之促效劑係烏托米單抗。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑係GITR之抑制劑。在一些實施例中，GITR之促效劑係TRX518、MK-4166、INCAGN1876、MK-1248、AMG228、BMS-986156、GWN323、MEDI1873或MEDI6469。在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑係OX40之促效劑，例如OX40促效劑抗體或OX40L融合蛋白。在一些實施例中，抗OX40抗體係INCAGN01949、MEDI0562 (他瓦利單抗(tavolimab))、MOXR-0916、PF-04518600、GSK3174998、BMS-986178或9B12。在一些實施例中，OX40L融合蛋白係MEDI6383。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑係CD40之促效劑。在一些實施例中，CD40之促效劑係CP-870893、ADC-1013、CDX-1140、SEA-CD40、RO7009789、JNJ-64457107、APX-005M或Chi Lob 7/4。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑係ICOS之促效劑。在一些實施例中，ICOS之促效劑係GSK-3359609、JTX-2011或MEDI-570。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑係CD28之促效劑。在一些實施例中，CD28之促效劑係特雷珠單抗(theralizumab)。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑係CD27之促效劑。在一些實施例中，CD27之促效劑係瓦利魯單抗(varlilumab)。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑係TLR7/8之促效劑。在一些實施例中，TLR7/8之促效劑係MEDI9197。
本揭示案之化合物可與雙特異性抗體組合使用。在一些實施例中，雙特異性抗體之結構域之一靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、GITR、OX40、TIM3、LAG3、CD137、ICOS、CD3或TGFβ受體。在一些實施例中，雙特異性抗體結合至PD-1及PD-L1。在一些實施例中，結合至PD-1及PD-L1之雙特異性抗體係MCLA-136。在一些實施例中，雙特異性抗體結合至PD-L1及CTLA-4。在一些實施例中，結合至PD-L1及CTLA-4之雙特異性抗體係AK104。
在一些實施例中，本揭示案之化合物可與一或多種代謝酶抑制劑組合使用。在一些實施例中，代謝酶抑制劑係IDO1、TDO或精胺酸酶之抑制劑。IDO1抑制劑之實例包括愛帕司他、NLG919、BMS-986205、PF-06840003、IOM2983、RG-70099及LY338196。精胺酸酶抑制劑之抑制劑包括INCB1158。
如通篇所提供，其他化合物、抑制劑、劑等可以單一或連續劑量形式與本化合物組合，或其可作為單獨劑量形式同時或依序投與。醫藥組合物
在一些實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽可調配為醫藥組合物之一部分。在一些實施例中，結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體可調配為醫藥組合物之一部分。包含本文所述之化合物及結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物可調配為醫藥組合物以投與個體，例如來治療本文所述之病症。通常，醫藥組合物包括醫藥學上可接受之載劑。如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲及延遲吸收劑及生理學上相容之類似載劑。組合物可包括醫藥學上可接受之鹽，例如酸加成鹽或鹼加成鹽(參見例如Berge, S.M.等人 . (1977)J. Pharm. Sci . 66:1-19)。
醫藥調配物係充分建立之技術，且進一步闡述於例如Gennaro (編輯),Remington: The Science and Practice of Pharmacy ，第20版，Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems ，第7版，Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727)；及Kibbe (編輯),Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association ，第3版. (2000) (ISBN: 091733096X)中。
醫藥組合物可呈多種形式。該等形式包括例如液體、半固體及固體劑量形式，例如液體溶液(例如可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及栓劑。較佳形式可端視預期投與模式及治療應用而定。通常，本文所述劑之組合物係呈可注射或可輸注溶液之形式。
組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於以高濃度穩定儲存之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將所需量之本文所述之劑與上文所列舉之一種成分或成分之組合(視需要)一起納入適當溶劑中、然後無菌過濾來製備。通常，分散液係藉由將本文所述之劑納入含有鹼性分散介質及來自上文所列舉成分之所需其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉劑之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥，產生本文所述之劑加來自其先前無菌過濾溶液之任何其他期望成分的粉末。可例如藉由使用包衣(例如卵磷脂)、在分散液之情形下藉由維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持溶液之適當流動性。可注射組合物之延長吸收可藉由將延遲吸收之劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)納入組合物中來達成。
在某些實施例中，結合至人類PD-1或人類PD-L1之抗體或其抗原結合片段可使用將保護化合物免於快速釋放之載劑來製備，例如受控釋放調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。許多製備此類調配物之方法已獲得專利或通常已知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems , J.R. Robinson編輯，Marcel Dekker, Inc., New York (1978)。
在一些實施例中，化合物調配為進一步包含至少一種賦形劑之醫藥組合物之一部分。
在一些實施例中，在製造本文所提供之組合物中，將化合物與賦形劑混合，用賦形劑稀釋或以例如膠囊、藥囊、紙或其他容器之形式封閉於此一載劑內。當賦形劑用作稀釋劑時，其可為固體、半固體或液體材料，用作活性成分之媒劑、載劑或介質。因此，組合物可呈以下形式：錠劑、丸劑、粉劑、菱形錠劑、藥囊、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣溶膠(呈固體形式或於液體介質中)、含有例如至多10重量%活性化合物之軟膏劑、軟及硬明膠膠囊、栓劑、無菌可注射溶液及無菌封裝粉劑。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物係呈錠劑形式。
在製備調配物中，可將化合物研磨以在與其他成分合併之前提供適當粒徑。在一些實施例中，可將化合物研磨成小於200目之粒徑。在一些實施例中，可藉由研磨來調整粒徑以提供調配物中實質上均勻之分佈，例如約40目。
適宜賦形劑之一些實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、纖維素、水、糖漿及甲基纖維素。調配物可另外包括：潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂及礦物油；潤濕劑；乳化及懸浮劑；防腐劑，例如羥基苯甲酸甲酯及羥基苯甲酸丙酯；甜味劑；及矯味劑。本文所提供之組合物可經調配以在藉由採用此項技術中已知之程序投與患者後提供活性成分之快速、持續或延遲釋放。
組合物可以單位劑量形式調配。術語「單位劑量形式」係指適宜作為人類個體及其他哺乳動物之單位劑量之物理離散單位，各單位含有經計算以產生期望治療效應(例如期望PK概況)之預定量之化合物以及適宜醫藥賦形劑。
在某些實施例中，為製備固體組合物(例如錠劑)，將化合物與醫藥賦形劑混合以形成含有化合物之均質混合物之固體預調配組合物。當提及該等預調配組合物為均質時，化合物通常均勻分散於整個組合物中，以使得組合物可容易地細分成同樣有效之單位劑量形式，例如錠劑、丸劑及膠囊。此固體預調配然後細分成單位劑量形式。
本揭示案之錠劑或丸劑可經包衣或以其他方式化合以提供提供延長作用優點之劑量形式。舉例而言，錠劑或丸劑可包含內部劑量組分及外部劑量組分，後者呈在前者上之包膜形式。兩種組分可由腸溶層分開，該腸溶層用於抵抗胃中之崩解且允許內部組分完整地進入十二指腸中或延遲釋放。可將多種材料用於此類腸溶層或包衣，此類材料包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇及乙酸纖維素之材料之混合物。
其中可納入本文所述之組合物以經口投與之液體形式包括水溶液，適宜地矯味糖漿、水性或油性懸浮液及矯味乳液以及可食用油(例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)以及酏劑及類似醫藥媒劑。
在一些實施例中，本文所述之組合物係藉由習用滅菌技術來滅菌，或可無菌過濾。水溶液可封裝以原樣使用，或凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌水性載劑組合。化合物製劑之pH通常將介於3與11之間，更佳介於5至9之間且最佳介於7至8之間。應理解，使用前述賦形劑、載劑或穩定劑中之某一者將形成醫藥鹽。
在一些實施例中，化合物1係經口投與。在一些實施例中，化合物1係以口服膠囊來投與。
在一些實施例中，化合物1係每天一次投與。
在一些實施例中，化合物1係以約5 mg至約150 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約5 mg至約120 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約5 mg至約100 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約5 mg至約80 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約5 mg至約60 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約5 mg至約40 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約5 mg至約20 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約5 mg至約10 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約10 mg至約150 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約10 mg至約120 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約10 mg至約100 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約10 mg至約80 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約10 mg至約60 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約10 mg至約40 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約10 mg至約20 mg之日劑量投與。在一些實施例中，化合物1係以約5 mg、約10 mg、約15 mg、約20 mg、約30 mg、約45 mg、約60 mg、約90 mg或約120 mg之日劑量投與。
在一些實施例中，化合物1係以連續給藥方案每天一次投與。在一些實施例中，化合物1係以28天給藥方案投與。
在一些實施例中，瑞替法尼係靜脈內投與。
在一些實施例中，瑞替法尼係每月一次投與。在一些實施例中，瑞替法尼係每四週一次投與。
在一些實施例中，瑞替法尼係以約250 mg至約1000 mg之劑量投與。在一些實施例中，瑞替法尼係以約400 mg至約600 mg之劑量投與。在一些實施例中，瑞替法尼係以約500 mg之劑量投與。 經標記化合物
本揭示案之另一態樣係關於經標記化合物1 (經放射性標記、經螢光標記、經同位素標記等)，其不僅將可用於成像技術，且亦可用於活體外 及活體內 分析。
本揭示案進一步包括經同位素標記之化合物1。「經同位素」或「經放射性標記」之化合物係化合物1，其中一或多個原子經原子質量或質量數不同於通常在自然界中發現(即天然)之原子質量或質量數之原子替代或取代。可納入本揭示案化合物中之適宜放射性核種包括(但不限於)2 H (亦寫為氘之D)、3 H (亦寫為氚之T)、11 C、13 C、14 C、13 N、15 N、15 O、17 O、18 O、18 F、35 S、36 Cl、82 Br、75 Br、76 Br、77 Br、1 23 I、124 I、125 I及131 I。舉例而言，本揭示案化合物中之一或多個氫原子可經氘原子替代，可視情況經氘原子取代。
化合物1之一或多個構成原子可經天然或非天然豐度之原子之同位素替代或取代。在一些實施例中，化合物1包括至少一個氘原子。舉例而言，本文所呈現化合物中之一或多個氫原子可經氘替代或取代。在一些實施例中，化合物包括兩個或更多個氘原子。在一些實施例中，化合物包括1-2個、1-3個、1-4個、1-5個或1-6個氘原子。在一些實施例中，化合物中之所有氫原子可經氘原子替代或取代。
將同位素納入有機化合物中之合成方法為此項技術中已知(Deuterium Labeling in Organic Chemistry，Alan F. Thomas (New York, N.Y., Appleton-Century-Crofts, 1971；The Renaissance of H/D Exchange，Jens Atzrodt、Volker Derdau、Thorsten Fey及Jochen Zimmermann, Angew. Chem. Int. 2007版, 7744-7765；The Organic Chemistry of Isotopic Labelling，James R. Hanson, Royal Society of Chemistry, 2011)。同位素標記之化合物可用於各種研究，例如NMR光譜、代謝實驗及/或分析。
用較重同位素(例如氘)取代可提供源自更大代謝穩定性之某些治療優點，例如延長的活體內 半衰期或降低之劑量要求，且因此在一些情況下可能較佳(參見例如 ，A. Kerekes等人，J. Med. Chem. 2011, 54, 201-210；R. Xu等人，J. Label Compd. Radiopharm. 2015, 58, 308-312)。具體而言，在一或多個代謝位點處取代可提供一或多個治療優點。
應理解，「經放射性標記」或「經標記化合物」係已納入至少一個放射性核種之化合物。在一些實施例中，放射性核種係選自由3 H及14 C組成之群。在一些實施例中，放射性核種係選自由11 C、18 F、75 Br、76 Br及77 Br組成之群。套組
本揭示案亦包括可用於例如治療本文所提及癌症之醫藥套組，其包括一或多個含有本文所述之醫藥組合物之容器。此類套組可進一步包括(若需要)各種習用醫藥套組組分中之一或多者，例如含有一或多種醫藥學上可接受之載劑之容器、其他容器等，如熟習此項技術者將容易地明了。指示欲投與組分之量、投與指南及/或混合組分之指南之呈插頁或呈標記形式之說明書亦可包括在套組中。實例
將藉助具體實例更詳細地闡述本發明。提供以下實例用於說明目的，且並不欲以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將容易地認識到可經改變或修改以產生基本上相同之結果之多個非關鍵參數。一般方法
將H1299細胞(RRID: CVCL_0060)維持於含有10%胎牛血清(FBS; GE Healthcare; #SH30071.03)之RPMI-1640 (RPMI, ThermoFisher Scientific, Carlsbad, CA; #11875-093)培養基中且自美國模式培養物保存中心(American Type Culture Collection) (ATCC; #CRL-5803)獲得。自德國微生物及細胞培養物保存中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (DSMZ; Braunschweig, Germany; #ACC 300)獲得BAF3細胞且使其生長於補充有10% FBS加4 ng/mL介白素(IL)-3之RPMI中。自ATCC (#CRL-1424)獲得G361細胞(RRID: CVCL_1220)且將其維持於含有10% FBS之RPMI培養基中。在過去3年內，所有人類細胞株已使用短串聯重複剖析認證。使用無黴漿菌之細胞實施所有實驗。瑞替法尼係由Incyte提供且係抗人類程式化細胞死亡(PD)-1抗體。自兩個健康供體之正常白血球分離(Biological Specialties, Colmar, PA)獲得人類外周血單核細胞(PBMC)。實例 A. 生物化學分析
藉由TR-FRET分析使用AXL、MER及TYRO3之激酶結構域之重組磷酸化形式來研究化合物1抑制TAM家族成員之酶活性之生物化學效能。
藉由時間解析螢光能量轉移(TR-FRET)分析量測磷酸-AXL (pAXL)、cMER及Tyro3激酶活性。在激酶分析之前，藉由將重組AXL蛋白(ThermoFisher Scientific; #PV4275)在含有50 mM Tris (pH 7.5)、0.2 mg/mL AXL、5 mM ATP、20 mM MgCl2 及2 mM二硫蘇糖醇(DTT)之緩衝液中在室溫下培育1小時來實施AXL之自動磷酸化。激酶分析緩衝液含有50 mM HEPES (pH 7.5)、10 mM MgCl2 、1 mM EGTA、0.01% NP-40及2 mM DTT。在分析緩衝液中製備0.69 nM磷酸-AXL或0.088 nM cMER (Carna Biosciences, Kobe, Japan; #08-108)或0.137 nM TYRO3 (Life Technologies, PR7480A)之酶溶液。將肽受質生物素-EQEDEPEGDYFEWLE-醯胺(Quality Controlled Biochemicals, Hopkinton, MA)溶解於二甲基亞砜(DMSO)中之1-mM原液在含有2000 µM ATP之分析緩衝液中稀釋至1 µM。將化合物1 (15 nL)溶解於DMSO中且自化合物板轉移至低體積白色384孔分析板(Perkin Elmer ProxiPlate, Waltham, MA)。將酶溶液(6 µL；或用於酶空白之分析緩衝液)添加至每板中之適當孔中且培育30分鐘。然後，添加6 μL/孔受質溶液以起始反應。保護板免於光照且在室溫下(21℃)培育60分鐘(cMER及TYRO3)或90分鐘(AXL)。藉由添加含有50 mM Tris-HCl (pH 7.8)、150 mM NaCl、0.05%牛血清白蛋白(BSA)、45 mM EDTA、180 nM SA-APC (Perkin Elmer; CR130-100)及3 nM Eu-W1024抗磷酸酪胺酸PY20 (Perkin Elmer; AD0067)之6-μL偵測溶液來終止反應。將板在室溫下培育30分鐘，且在PheraStar FS讀板儀(BMG Labtech, Ortenberg, Germany)上量測均質時間解析螢光(HTRF)信號。計算每一濃度之抑制%，且根據使用GraphPad Prism軟體(San Diego, CA)之曲線擬合產生半最大抑制濃度(IC50 )值。
藉由量測快速且大量稀釋cMER-抑制劑複合物後cMER酶活性之恢復來確定化合物可逆性。在含有50 mM HEPES (pH 7.5)、10 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.01% NP-40及2 mM DTT之激酶分析緩衝液中稀釋cMER、ATP及生物素標記之肽受質。在含有50 mM Tris-HCl (pH 7.8)、150 mM NaCl、0.05% BSA及45 mM EDTA之偵測緩衝液中製備偵測試劑(240 nM SA-APC [Perkin Elmer; CR130-100]及4 nM Eu-W1024抗磷酸酪胺酸PY20 [Perkin Elmer; AD0067])。為鑑別化合物之抑制模式，在不同ATP濃度(25 μM、100 μM、300 μM及1000 μM之最終反應濃度)下量測IC50 值。將化合物1與ATP及酶(66 pM cMER)於8-µL分析緩衝液中一起培育延長的時間(2小時)。在該等條件下，達到化合物、ATP及酶之間之平衡，然後藉由添加4 μL 1.5-μM生物素標記之肽起始反應。培育1小時後，藉由含有60 mM EDTA、240 nM SA-APC (Perkin Elmer; CR130-100)及4 nM Eu-W1024抗磷酸酪胺酸PY20 (Perkin Elmer; #AD0067)之4-µL偵測試劑終止反應。在培育30分鐘後藉由PheraStar讀板儀以HTRF模式讀取分析板。將劑量-反應曲線擬合且將IC50 值繪製為ATP濃度之函數。化合物1之抑制常數(Ki )係藉由將數據擬合至競爭性抑制之等式(IC50 = Ki (1+ [ATP]/Km))來計算。
多個批次之化合物1對AXL、MER及TYRO3之平均IC50 值分別係0.61 ± 0.31 nM (n = 18)、3.17 ± 1.97 nM (n = 25)及101 ± 27 nM (n = 25)，此展示對TYRO3之約30倍選擇性。亦在包括179種激酶之綜合激酶研究中在200 nM下評估化合物1。與c-Met相比，化合物1對AXL及MER之選擇性為約60倍且不會抑制任何其他激酶。該等結果展示，化合物1係AXL及MER激酶之強效及高選擇性抑制劑。使用MER激酶分析評估針對ATP濃度之抑制模式。如圖1中所顯示，化合物1對MER激酶之IC50 值隨著ATP濃度線性增加，此表明ATP競爭性抑制模式。實例 B. 細胞增殖分析
為評估TAM受體家族內之細胞效能及選擇性，產生具有穩定AXL、MER或TYRO3表現之小鼠BAF3細胞株。
將與二聚化序列及HA標籤融合之AXL、MER或TYRO3之細胞質結構域選殖至具有嘌呤黴素抗性標記物之pMSCV (鼠類幹細胞病毒)載體中以藉由電穿孔至BAF3細胞中個別地產生三種構築物。選擇並表徵具有IL-3-非依賴性及嘌呤黴素抗性之單純系。為評估對BAF3細胞增殖之效應，在384孔板中在化合物1存在或不存在下在稀釋於含有2% FBS之RPMI-1640中之不同濃度(自10 µM最高濃度使用三倍稀釋係數之10個濃度點)下，將1000個細胞/孔之BAF3、BAF3-AXL、BAF3 MER或BAF3-TYRO3細胞處理48小時。藉由ATP分析(CellTiter-Glo Assay, Promega, Madison, WI)根據製造商之程序量測細胞活力。將數據轉化成相對於DMSO對照之抑制%，且使用GraphPad Prism軟體擬合IC50 曲線。
用化合物1處理穩定BAF3轉染子會強效地抑制表現AXL或MER激酶之BAF3細胞之增殖，且50%生長抑制(GI50 )值所需之濃度分別為16 ± 11 nM及14 ± 4.9 nM，但較弱地抑制表現TYRO3之BAF3細胞之生長(IC50 = 498 ± 161 nM)，且對親代BAF3細胞無活性(IC50 ＞4000 nM)。該等細胞數據與生物化學數據一致且確認化合物1係AXL及MER之強效抑制劑並且對TYRO3具有＞30倍選擇性。實例 C. H1299 細胞中之 pAXL 抑制分析
在表現高水準內源AXL之腫瘤細胞株中評估化合物1調節AXL活性之能力。已顯示非小細胞肺癌細胞株H1299展現顯著增加的AXL蛋白表現。
將H1299細胞平鋪(30,000個細胞/孔)於96孔組織培養板(Costar, Corning Incorporated, Corning, NY)中且在37℃及5% CO2 下培育過夜。添加適當濃度之化合物1且將其在37℃及5% CO2 下培育1小時。將1 µg/mL之rhGAS6 (R&D Systems, Minneapolis, MN; #885-GSB)添加至每孔中，且將板在37℃及5% CO2 下培育15分鐘。收穫細胞且將其在冰上於含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑(ThermoFisher Scientific; #78446)之110 µL冰冷溶解緩衝液(Cell Signaling Technology, Danvers, MA; #9803)中溶解1小時並儲存在-80℃下用於ELISA。藉由將Greiner lumitrac高結合板與8 µg/mL之抗AXL抗體(R&D Systems; MAB154)在室溫下一起培育過夜來製備ELISA板。將板用含有0.1% BSA之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌且封閉。將細胞溶解物加載至ELISA板上且在室溫下培育2小時。將板洗滌，且與LANCE Eu-W1024抗磷酸酪胺酸抗體(Perkin Elmer; #AD0067)在室溫下在DELFIA分析緩衝液(Perkin Elmer; #4002-0010)中一起培育2小時，洗滌，並添加DELFIA增強溶液(Perkin Elmer; #4001-0010)。將板在室溫下輕輕振蕩15分鐘且在PheraStar (BMG Labtech)上讀取。將數據轉化成相對於DMSO對照之抑制%，且化合物1 IC50 測定係藉由使用GraphPad Prism擬合抑制%對 抑制劑濃度對數之曲線來實施。
用化合物1處理H1299細胞會強效地抑制pAXL，且IC50 值為1.8 ± 0.63 nM (N = 19)，如圖2中所顯示。實例 D. G361 細胞中之磷酸 -MER 抑制分析
在表現高水準MER激酶之黑色素瘤細胞株G361細胞中評估化合物1阻斷MER自動磷酸化之效能。
在使用前使新解凍之G361細胞恢復三代，且僅將解凍後20代以內之細胞用於分析中。將細胞保持在非鋪滿條件下且用於對數期生長。將2 mL 1 × 106 個細胞/mL (2 × 106 個細胞/孔)之G361細胞添加至6孔組織培養板(Corning Incorporated; #3961)中並保持2天。在分析時，將1 mL培養基添加至每孔中。為測定化合物1之活性，使用5 mM化合物1於DMSO中之原液來製造DMSO工作原液之三倍連續稀釋物，將其進一步稀釋於培養基中，且將100 μL經稀釋化合物添加至每孔中，最終濃度介於0.2 nM至1 μM範圍內。對於不存在化合物1之對照孔，添加100 μL之0.22% DMSO以維持每種樣品中最終0.02%之DMSO濃度。將細胞及化合物之混合物在37℃下在補充有5% CO2 之加濕培育器中培育1小時，然後將10 μL於PBS中之55.5 μg/mL MER活化抗體(R&D Systems; #MAB8912；最終濃度等於500 ng/mL)添加至每孔中，未經刺激之樣品除外，且在37℃下在補充有5% CO2 之加濕培育器中培育30分鐘。培育後，用2 mL冷PBS將每孔洗滌兩次。將含有1 mM PMSF、Halt磷酸酶抑制劑(1:100稀釋物；ThermoFisher Scientific; #78426)及蛋白酶抑制劑(1:50稀釋物；Cal Biochem® #535140; MilliporeSigma, Burlington, MA)之溶解緩衝液(120 μL; Cell Signaling Technology; #9803)添加至每種樣品中且在冰上培育30分鐘。將細胞提取物轉移至96孔V底板，在4℃下在3000 rpm下離心10分鐘且將提取物儲存在80℃下直至藉由ELISA分析磷酸-MER (pMer; R&D Systems; #DYC2579)。使用Molecular Devices SpectraMax Plus微量讀板儀(Molecular Devices, San Jose, CA)在450 nm下量測板之光學密度，在540 nm下進行波長校正。使用四參數算法曲線擬合軟體(SOFTmax PRO應用，Molecular Devices)針對 濃度對標準品之吸光度繪圖以產生標準曲線。藉由自標準曲線外推測定未知樣品之pMER濃度。藉由GraphPad Prism 7.0使用具有可變斜率之非線性回歸S形劑量-反應曲線來計算IC50 值。
如圖3中所顯示，在G361黑色素瘤細胞中，化合物1可有效地阻斷由MAB8912誘導之MER磷酸化，且IC50 值為8.3 ± 3.1 nM (N = 2)。實例 E. 原代巨噬細胞中 MER 激酶活性之抑制
評估在巨噬細胞中化合物1調節MER激酶活性之能力。
使用Ficoll-Paque密度梯度離心分離人類外周血單核細胞(PBMC)且使用1× RBC溶解緩衝液(Cell Signaling Technology)將任何剩餘紅血球(RBC)在室溫下溶解5分鐘。用PBS洗滌PBMC，然後使用CD14微珠陽性選擇分離遵循製造商之方案按照說明(AutoMacs Pro, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)富集單核球。首先將CD14+ 細胞以1.5 × 106 /孔接種於6孔板中之補充有100 ng/mL巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF; R&D Systems; #216-MC)之RPMI-1640 + 10%熱不活化FBS及10% AB人類血清(Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO)、100 U/mL青黴素(penicillin) + 100 μg/mL鏈黴素(streptomycin) (Corning)中，並在37℃、5% CO2 下培養10天。每3天將新鮮M-CSF添加至培養基中直至巨噬細胞附著。在用於分析之製備中，去除培養基且用不含人類血清之新鮮培養基再飼餵細胞。在100% DMSO中以1000×製備化合物1原液且首先稀釋67倍至培養基中，且然後在添加至巨噬細胞中時再稀釋15倍。用化合物1將巨噬細胞在37℃、5% CO2 下處理2小時。將5 μg/mL抗MER抗體MAB8912 (R&D Systems)添加至巨噬細胞中再保持30分鐘，此時用冷PBS洗滌細胞。自孔小心地抽出所有PBS且將乾板在-20℃下冷凍。
將巨噬細胞在冰上解凍，然後在4℃下用250 μL/孔之1×溶解緩衝液(Cell Signaling Technology; #9803)及Halt蛋白酶及磷酸酶抑制劑(ThermoFisher Scientific)溶解1小時。在冰上刮取溶解之細胞且轉移至Eppendorf瓶。將溶解物在4℃下在12,700 rpm下離心15分鐘。稱取PDX腫瘤且用補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合劑(Roche, Basel, Switzerland; #11836170001)之溶解緩衝液均質化。將腫瘤在冰上溶解30分鐘，然後在13,000 rpm下離心10分鐘。使用BCA蛋白質分析套組(Pierce, ThermoFisher Scientific; #23225)對蛋白質溶解物進行定量。將溶解物與6Í Laemmli SDS樣品緩衝液(Alfa Aesar, Haverhill, MA)一起轉移至新管且將樣品在95℃下加熱6分鐘。使用Novex™ 8%-16% Tris-甘胺酸微小凝膠或4%-12% Tris-甘胺酸Novex WedgeGels (Invitrogen, Carlsbad, CA)將約50 μg蛋白質樣品加載至每孔。使用iBlot (ThermoFisher Scientific)乾燥印跡系統將蛋白質轉移至硝基纖維素膜。使用0.5%脫脂乳粉在洗滌緩衝液(100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.1% Tween 20)中在室溫下將膜封閉1小時。用於pMER之一級抗體係來自PhosphoSolutions (Aurora, CO; #p186-749)。自Cell Signaling Technology獲得其餘抗體：MER (#4319)、pAXL (#5724)、AXL (#4566)、GAS6 (#67202)、pAKT (#4060)、AKT (#9272)及β-肌動蛋白(#4970)。在0.5%乳/洗滌緩衝液中分別以1:500及1:1000添加一級抗體且在4℃下搖動過夜。將膜在洗滌緩衝液中洗滌三次，然後與二級抗體(抗兔IgG1-HRP；Cell Signaling Technology)以1:2500在室溫下在0.5%乳/洗滌緩衝液中一起培育2小時。將膜再洗滌，然後用SuperSignal West Dura延長持續時間之化學發光受質(ThermoFisher Scientific)偵測條帶並使用Fluorochem M數位成像儀(Protein Simple, San Jose, CA)可視化。
化合物1能夠以濃度依賴性方式抑制原代巨噬細胞中之pMER且IC50 為1.6 ± 0.4 nM (N = 2)，如圖4中所顯示。該等資料表明，化合物1可抑制腫瘤及原代人類免疫細胞中之MER激酶活性。實例 F. T 細胞增殖分析之巨噬細胞抑制
為檢查化合物1之功能活性，評估對巨噬細胞介導之T細胞增殖抑制之效應。
藉由Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Chicago, IL; #17-1440-02)上之密度梯度離心、然後用抗CD14微珠(Miltenyi Biotec; #130-050-201)純化自健康供體之外周血分離人類PBMC。將經分離之CD14+ 單核球/巨噬細胞與100 ng/mL M-CSF (R&D Systems; #216-MC)及50 ng/mL TGFβ1 (R&D Systems; #240-B)在37℃下一起培育6天；將100 μL/孔之CD14+ 巨噬細胞以0.5 × 106 個細胞/mL接種於96孔圓底培養板(Costar; #3799)中且用化合物1在37℃下處理過夜。CD4+ CD25− 效應T (Teff )細胞係使用Dynabeads調控CD4+ CD25+ T細胞套組(Life Technologies; #11363D)分離，且用羧基螢光黃琥珀醯亞胺基酯(CFSE)使用CellTrace CFSE細胞增殖套組(ThermoFisher Scientific; #C34554)標記Teff 細胞。將新鮮的CFSE標記之Teff 細胞與Dynabeads人類T活化劑CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific; #11132D)以5:1之比率混合，然後將100 μL/孔之T細胞/珠粒混合物以1 × 106 個細胞/mL添加至化合物1處理之CD14+ 巨噬細胞中且繼續在37℃下培養5天。藉由流式細胞儀(BD LSRFortessa X-20, BD Biosciences, San Jose, CA)分析Teff 細胞，且在Luminex分析(Millipore; #HCYTOMAG-60K_38plex)中測試無細胞上清液以量測不同細胞介素及趨化介素之濃度。
圖5A展示化合物1部分地逆轉巨噬細胞介導之T細胞增殖抑制。此與IFN-γ產生之增加相關，如圖5B中所顯示。實例 G. PBMC 細胞共培養分析
評估化合物1與檢查點阻斷協作以進一步加強抗腫瘤反應之能力。將H1299肺癌細胞與經化合物1、抗人類程式化細胞死亡(PD)-1抗體瑞替法尼或組合處理之經刺激人類PBMC共培養，且在兩個不同實驗中評價促發炎細胞介素之產生(圖6)。實施第三實驗，其確認該等結果(未顯示)。
將H1299細胞與人類PBMC各自以4或16 × 104 個細胞/mL在含有10% FBS、100U/mL青黴素-鏈黴素(ThermoFisher Scientific; #15140-122)及1Í β-巰基乙醇(ThermoFisher Scientific; #21985-023)之RPMI中共培養。將化合物1或瑞替法尼以單劑或組合添加至細胞中。分別以1 μg/mL、0.5 μg/mL或100 ng/mL之最終濃度添加抗CD3 (BD Biosciences #555336)、抗CD28 (BD Biosciences #555725)或SEA (Toxin Technology, Sarasota, FL; #AT101red)，以刺激細胞生長。將培養物培育在37℃下在5% CO2 培育器中培育4天。收集上清液，使用多重分析系統(定制人類ProcartaPlex Luminex套組，ThermoFisher Scientific; #PPX-15-MXRWE6P)進行細胞介素分析。
單獨化合物1誘導IFN-γ、腫瘤壞死因子-ɑ、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子且適度誘導IL-12 p70 (圖6B-6D)。儘管瑞替法尼亦在供體亞組中誘導該等細胞介素，但化合物1及瑞替法尼之組合展示與個別劑相比細胞介素產生之顯著增加(圖6)，包括IL-2 (圖6A)。該等資料展示，化合物1與檢查點阻斷之組合可誘導活體外 促發炎細胞介素產生。實例 H. 活體內 功效研究
為測試化合物1之活體內潛在免疫調節活性， 在同基因腫瘤模型中實施抗腫瘤功效研究。
患者源性異種移植物(PDX)模型係常用的動物腫瘤模型，使用其評估抗癌藥物之抗腫瘤功效(Jin K、Teng L、Shen Y、He K、Xu Z、Li G. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review, Clin Transl Oncol (2010) 12:473-80. doi: 10.1007/s12094-010-0540-6)。PDX模型係藉由將新鮮癌組織自患者直接植入免疫受損小鼠中來產生。該等模型與基於細胞之異種移植物模型之不同之處在於，PDX模型從未在活體外傳代，而基於細胞之異種移植物係由生長於組織培養物中之植入細胞來產生。已顯示，PDX模型保留了原發性患者腫瘤之遺傳組成及組織形態，使其成為臨床前藥物發現之頗具價值之工具(Izumchenko E、Paz K、Ciznadija D、Sloma I、Katz A、Vasquez-Dunddel D等人，Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Ann Oncol (2017) 28:2595-605. doi: 10.1093/annonc/mdx416)。PDX模型已用於評估抗癌藥物在癌症適應症之腫瘤模型中之反應(Gao H、Korn JM、Ferretti S、Monahan JE、Wang Y、Singh M等人，High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.Nat Med (2015) 21:1318-25. doi: 10.1038/nm.3954)。該等研究已證實可用於鑑別對治療有反應之模型以及沒有反應之模型，該等模型可出現在同一癌症適應症之腫瘤中。
自日本研究生物資源細胞庫保存中心(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)獲得MBT-2細胞且將其維持於補充有10% FBS之DMEM中。自NCI獲得MC38細胞。自ATCC獲得4T1細胞且將其維持於補充有10% FBS之RPMI培養基中。對於MBT-2實驗，將5 × 105 個MBT-2細胞皮下接種至6至8週齡C3H小鼠或無胸腺裸小鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)之右後側腹中。對於MC38研究，將MC38腫瘤之漿(活體內第6代)接種至12週齡雌性C57BL/6小鼠之右後側腹中。對於4T1研究，將7.5 × 105 個4T1細胞皮下接種至6至8週齡雌性BALB/c小鼠或無胸腺裸小鼠(Charles River Laboratories)之右後側腹中。根據腫瘤體積將小鼠隨機化，且n = 10-12隻/組。自研究開始至結束每天兩次(BID)連續經口投用化合物1。在MC38研究中，以15 mg/kg每週兩次腹膜內投用抗程式化死亡配位體1 (PD-L1) (BE0101, Bio X Cell, West Lebanon, NH)。亦在治療開始時起始，向媒劑組及化合物1組每週兩次投與大鼠IgG2b對照抗體(BE0090, Bio X Cell)。在4T1研究中，在研究開始時以15 mg/kg腹膜內投用單劑量之抗PD-L1。在組合研究中，向媒劑對照組及接受抗PD-L1之小鼠BID連續投用媒劑直至研究結束。BID經口投用媒劑及化合物1。在實驗進程期間監測小鼠之腫瘤生長及明顯耐受性。在Champions Oncology (Hackensack, NJ)實施PDX腫瘤模型。將PDX腫瘤植入6至8週齡之雌性無胸腺裸小鼠中。當腫瘤體積為約150-250 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機化且以10 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg BID藉由口服管飼向其投與化合物1。使用式(L × W2 )/2計算腫瘤體積，其中L及W分別係指長度及寬度尺寸。使用式(1 − (VT /VC )) × 100計算腫瘤生長抑制(TGI)，其中VT 係最後一天治療時治療組之腫瘤體積，且VC 係最後一天治療時對照組之腫瘤體積。使用二因子方差分析(ANOVA)及Dunnett多重比較測試來確定治療組之間之統計差異(GraphPad Prism)。將動物圈養於由國際實驗動物護理評價及認證協會(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International)完全認證之障壁設施中。根據關於實驗室動物之人類護理及使用(Human Care and Use of Laboratory Animals)之美國公共服務政策(US Public Service Policy)以及因塞特動物護理及使用委員會指南(Incyte Animal Care and Use Committee Guidelines)實施所有程序。
在研究結束時，在最後一次劑量之化合物1後4小時收集腫瘤且置於冰上。將腫瘤樣品切割成2-mm片且轉移至Miltenyi C管(Miltenyi Biotec; #130-096-334)。根據製造商之方案(Miltenyi Biotec; #130-096-730)實施腫瘤解離。用冷PBS沖洗濾液且樣品發生沉澱。將紅血球溶解於Pharm Lyse (BD Biosciences; #555899)中。用PBS洗滌細胞且在室溫下於含有活/死染色劑(LifeTech Scientific, Shenzhen, China; #L34966)之PBS中重懸浮15分鐘。然後在PBS中洗滌細胞且重懸浮於染色劑緩衝液(BD; #554657)中並在4℃下將以下抗體添加至樣品中且保持30分鐘：CD3 (BD; #553062)、CD45 (BD; #564279)、CD8 (BD; #560182)、CD4 (BD; #552775)、CD11b (BD; #557657)、F4/80 (eBiosciences, San Diego, CA; #12-4801-82)、II類MHC (BD; #562564)及CD206 (BioLegend; #141708)。用固定/透化緩衝液(eBioscience 00-5523-00)洗滌、固定且透化細胞。將細胞重懸浮於透化緩衝液(eBioscience; 00-8333)中。在室溫下將Ki-67抗體(BioLegend, San Diego, CA; #652413)添加至樣品中並保持1小時。然後洗滌細胞且重懸浮於染色劑緩衝液(BD; #554657)中用於獲取。M1巨噬細胞在CD45+ 、CD11b+ F4/80+ 群體內鑑別為II類MHCHi /CD206Lo 且M2巨噬細胞鑑別為II類MHCLo /CD206Hi 。在BD Fortessa上獲取資料且用FlowJo軟體分析。使用多重蛋白質偵測套組根據製造商之方案(MesoScale Diagnostics, Rockville, MD)對腫瘤內干擾素(IFN)-γ之水準進行定量。藉由單因子ANOVA及Dunnett多重比較測試(GraphPad Prism)來確定統計差異。
化合物1在MBT-2及4T1腫瘤模型中誘導劑量依賴性功效(圖7A及圖7B)。在帶有相同腫瘤之免疫缺陷小鼠中無活性，此證實至少在該等模型中，抗腫瘤活性依賴於功能性免疫系統(圖7C)。在4T1模型中，化合物1治療以劑量依賴性方式增加M1樣巨噬細胞對M2樣巨噬細胞之比率(圖7D)。基於使用原代人類PBMC觀察到之增強的活體外 活性，活體內 測試化合物1與檢查點阻斷之組合。在MC38模型中，化合物1及抗PD-L1皆具有單劑抗腫瘤活性，但組合之活性顯著較高(圖8A)。兩種單劑治療誘導CD4+ 及CD8+ 腫瘤浸潤淋巴球之增殖，且組合之程度較高(圖8B及圖8C)。與單劑治療相比，組合治療亦會增加腫瘤中之IFN-γ水準(圖8D)。該等資料證實，化合物1誘導巨噬細胞極化，增加功能性CD4+ 及CD8+ T細胞活性且與檢查點阻斷組合增強活體內 抗腫瘤活性。實例 I. 肉瘤 PDX 模型
如實例H中針對PDX模型所述評估肉瘤PDX模型中化合物1之活性。向帶有(a) CTG-2041、(b) CTG-1302或(c) CTG-1339腫瘤之無胸腺裸小鼠每天兩次經口投用10 mg/kg、30 mg/kg及100 mg/kg之化合物1。將經化合物1或媒劑處理之小鼠之CTG-2041或CTG-1339腫瘤溶解且針對pAXL、AXL、pMER、MER、GAS6、pAKT、AKT及β-肌動蛋白藉由西方墨點進行處理。分析3隻小鼠/組。自不同凝膠獲得西方墨點資料。使用CTG-2041腫瘤之實驗代表血管肉瘤模型。使用CTG-1302腫瘤之實驗代表平滑肌肉瘤模型。使用CTG-1339腫瘤之實驗代表骨肉瘤模型。
在CTG-2041中觀察到強抗腫瘤反應，且在10 mg/kg、30 mg/kg及100 mg/kg BID化合物1投用下具有等效活性並展示95% TGI (圖9A)。亦在CTG-1302中觀察到穩健的抗腫瘤反應(圖9B)。相反，CTG-1339對化合物1治療有抗性(圖9C)。為理解負責與非反應者模型相比在反應者中觀察到之差異之潛在機制，評估在CTG-2401及CTG-1339腫瘤中化合物1對AXL及MER活化以及下游信號傳導之影響(圖9D)。儘管化合物1在兩種模型中抑制pAXL及pMER，但CTG-2041表現顯著較高之總AXL及MER水準，尤其pAXL及pMER (圖9D)。pAKT僅在CTG-2041中受抑制，此與化合物1之抗腫瘤功效相關聯。化合物1治療亦增加兩種腫瘤模型中之總MER水準以及CTG-2041中之GAS6水準。
在帶有(a) CTG-2426腫瘤(黏液纖維肉瘤)及(b) CTG-1861腫瘤(胃腸基質瘤)之無胸腺裸小鼠中進一步實施實驗。該等實驗之結果顯示於下表中。
模型 亞型 TGI (%)
CTG-2426 黏液纖維肉瘤 42
CTG-1861 胃腸基質瘤 74
實例 J. 人類化小鼠模型
將動物圈養於由國際實驗動物護理評價及認證協會完全認證之障壁設施中。根據關於實驗室動物之人類護理及使用之美國公共服務政策以及因塞特動物護理及使用委員會指南實施所有程序。將5百萬個H1299細胞(ATCC)皮下植入20至24週齡雌性人類CD34+ 復原之NSG小鼠(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)之右後側腹中。細胞接種包括磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之1:1體積比之基質膠(#354248; Corning, NY)。當腫瘤體積平均為約150 mm3 時，根據腫瘤體積及供體(2-5個供體/組)將小鼠隨機化成10組且用媒劑加人類IgG1同型對照抗體、化合物1、瑞替法尼或組合治療。將化合物1溶解於0.5%甲基纖維素中之50mM檸檬酸鹽緩衝液中且以30 mg/kg BID經口投用。將瑞替法尼稀釋於PBS中且以5 mg/kg每5天腹膜內投用。使用式(1-(VT /VC ))*100計算腫瘤生長抑制(TGI)，其中VT 係最後一天治療時治療組之腫瘤體積，且VC 係最後一天治療時對照組之腫瘤體積。使用二因子方差分析實施統計分析。實例 K. 1 期研究
此實例闡述1期、開放標記研究，其意欲評估單劑化合物1 (部分1)及化合物1與瑞替法尼之組合(部分2)之安全性及耐受性、藥物動力學、藥效動力學及初步功效。
部分1及部分2皆包括劑量發現及劑量擴展。部分1A及部分1B招募患有所選實體腫瘤之參與者；部分1C招募患有AML之參與者。部分2A及部分2B僅招募患有所選實體腫瘤之參與者。研究治療持續直至符合疾病進展、不可接受之毒性、死亡、同意退出或任何其他治療退出準則為止。 部分1：單劑化合物1
該研究起始於部分1A。首先，起始劑量水準隊列中之3名參與者接受單劑量之化合物1，然後進行定時PK評價以確認開始連續投與前約1週之暴露。基於此PK評價時之暴露根據下文所列出之基於暴露之給藥指南確定每個參與者之連續投與之劑量水準： ● 若單劑量PK分析之AUC0-24h 介於＞ 1000 nM·h但＜ 2000 nM·h之間且C24h 係≥ 15 nM，則以每天一次(QD) 10 mg之單劑化合物1劑量開始連續給藥。 ● 若單劑量PK分析之AUC0-24h 係＞ 2000 nM·h且C24h 係＞ 15 nM，則以5 mg QD開始連續給藥。 ● 若單劑量PK分析之AUC0-24h 係＜ 1000 nM·h或C24h ＜ 15 nM，則以15 mg QD開始連續給藥。 ● 若單劑量PK分析之AUC0-24h 係＞ 15,000 nM·h或C24h ＞ 50 nM，則由醫學監測員評估參與者之暴露水準以確定是否可安全地治療參與者或參與者是否將中斷研究治療。
劑量遞增始於最初3名參與者中投與之最低劑量。舉例而言，若最初3名參與者中之1者接受5 mg QD，則指定起始劑量水準隊列將為5 mg QD且使用3 + 3 + 3研究設計評價其安全性及耐受性。基於此情景，將參與者招募於5 mg隊列中直至存在足夠參與者及資料表明5 mg劑量係可耐受的。類似地，若最初3名參與者中之最低劑量係10 mg QD或15 mg QD，則10 mg QD或15 mg QD分別將為指定起始劑量水準，且參與者將招募於最低劑量水準隊列中直至表明該劑量水準隊列係可耐受的。在單劑量PK分析中開始於高於化合物1之指定起始劑量之劑量之最初3名參與者中之任一者保持他或她的基於暴露之劑量且包括在相應劑量水準隊列分析中。
在第1週期第1天時最初3名參與者之水準低於目標暴露(AUC0-24h 1000 nM·h或C24h係≤ 15 nM)之情形下，下一劑量水準增加可大於50%但不超過100%。單劑量PK分析係在劑量增加大於50%之任一劑量水準隊列中在最初3名參與者中實施，且可在其他參與者中或在任何其他劑量水準隊列中根據發起人之判斷實施。下文列出化合物1之劑量發現方案。
劑量水準 化合物 1 之劑量 投與頻率
劑量水準1 5 mg QD，28天週期
起始劑量/劑量水準1 10 mg QD，28天週期
劑量水準2 15 mg QD，28天週期
劑量水準3 20 mg QD，28天週期
劑量水準4 30 mg QD，28天週期
劑量水準5 45 mg QD，28天週期
劑量水準6 60 mg QD，28天週期
劑量水準7 90 mg QD，28天週期
劑量水準8 120 mg QD，28天週期
在部分1A中選擇建議擴展劑量(「RDE」)後，開始部分1B。
部分1B包括各自約12名參與者之4個獨立的腫瘤特異性(黑色素瘤、NSCLC、SCCHN及軟組織肉瘤)劑量擴展隊列以進一步表徵化合物1之RDE之安全性、耐受性、功效及藥效學效應。部分1B中之所有參與者需要成對腫瘤生檢(預治療及然後在第2週期第1天與第3週期第1天之間)。一旦可自化合物1及瑞替法尼之部分2A組合遞增獲得安全性資料且已確定組合之劑量係安全且耐受的，部分1B劑量擴展隊列中正在進行之參與者在完成最初治療時生檢及腫瘤成像並得到發起人批準後亦可立即接受瑞替法尼。要求開始組合療法之部分1B參與者重複第1週期及第2週期安全性及PK評價且必須同意在開始組合治療後4至8週進行重複生檢。化合物1之劑量不超過所測試劑量且經確定與瑞替法尼之組合在部分2A中為安全且耐受的。
研究之部分1C亦可開始於在部分1A中鑑別RDE後，且平行於部分1B實施。招募至此擴展隊列中之起始係由發起人決定。研究之此部分將患有復發性及/或難治性AML之參與者招募至1個獨立擴展隊列中且評估化合物1之RDE在此群體中之安全性、耐受性及初步功效。部分1C使用具有停止規則之Simon 2階段設計以在未觀察到反應時在階段1結束時提前終止。在階段1中，招募10名參與者；若未觀察到客觀反應，則將不進一步招募以使在無臨床活性證據之情況下治療之參與者之數量最小化。若觀察到至少1次客觀反應，則可將至多19名額外參與者招募至該隊列中，在部分1C中招募最多29名。 部分2：化合物1與瑞替法尼之組合
部分2包含部分2A及部分2B。部分2A係劑量發現階段，其係使用3 + 3 + 3設計來實施以評價化合物1與瑞替法尼之組合在患有所選晚期實體腫瘤之參與者中之安全性及耐受性。
一旦劑量水準在部分1A中確定為安全且可耐受便立即開始部分2A，並可與部分1A平行招募但在比當前確立之耐受劑量低1個劑量水準下。
下文列出化合物1與瑞替法尼之組合之劑量發現方案：
劑量水準 化合物 1 之劑量 化合物 1 投與 瑞替法尼之劑量 瑞替法尼投與
劑量水準1/起始劑量 在開始組合時，比部分1A中確立之最高安全/可耐受劑量低1個劑量水準。 QD，28天週期 500 mg IV每四週一次
劑量水準≥ 2 選擇為可耐受之下一劑量水準不超過部分1A MTD及/或RDE。 QD，28天週期 500 mg IV每四週一次
部分2B係劑量擴展以進一步評估在部分2A中確定之化合物1與瑞替法尼之組合之RDE下之安全性、耐受性、功效及藥效學效應。將招募各自約12名參與者之四個獨立的腫瘤特異性(黑色素瘤、NSCLC、SCCHN及軟組織肉瘤)擴展隊列。要求部分2B中之所有參與者進行成對腫瘤生檢(預治療及然後在第2週期第1天與第3週期第1天之間)。 研究治療
在每一28天週期中以口服膠囊QD投與化合物1。在每一28天週期之第1天經由IV投與瑞替法尼。研究藥物使用單劑或組合方案繼續直至疾病進展、需要藥物中斷之不良事件或參與者或醫師決定。參與者若獲得益處長達1年則繼續治療；屆時，研究者及發起人將討論繼續治療在臨床上是否係適當的。
參與者應在每天早晨大致相同之時間服用化合物1。可基於出現之PK觀察結果調整投與時間表。 納入準則
參與者僅在符合所有以下準則時才有資格納入研究中：
首先，所有參與者必須為至少18歲。
部分 1A 、部分 1B 、部分 2A 及部分 2B ： 無標準療法可用、或儘管有標準療法但已進展、或不耐受標準療法之實體贅瘤之組織學或細胞學證據，該標準療法可包括化學療法、靶向療法、生物療法及免疫療法，納入下文所概述之隊列特異性要求： ● 視為不適於手術或其他治愈性治療或程序之根據RECIST v1.1可量測之病灶，且至少1個靶病灶可用於評估。若病灶中已展示進展，則位於先前輻射之區域或經受其他局部區域療法之區域中之腫瘤病灶視為可量測。
僅部分 1A 及部分 2A ：晚期或轉移性胃腺癌或GEJ腺癌、HCC、黑色素瘤、NSCLC、RCC、軟組織肉瘤、SCCHN (再發性或轉移性)、TNBC或尿路上皮癌。經醫學監測員批準可允許其他腫瘤組織學，包括MSI-H腫瘤。
僅部分 1B 及部分 2B ： 隊列1：晚期或轉移性黑色素瘤 - 必須已接受可用標準護理，包括(但不限於) 1種含有PD-1/L1之先前方案(呈單劑或組合形式)，接受至少2個劑量之抗PD-1/L1劑，且在治療期間或之後經歷PD。 - 已知BRAF狀況(V600e及V600k)。 - 排除眼黑色素瘤。 隊列2：晚期或轉移性NSCLC - 必須已接受可用標準護理治療，包括(但不限於) 1種含有PD-1/L1之先前方案(呈單劑或組合形式)，接受至少2個劑量之抗PD-1/L1劑，且在治療期間或之後經歷PD。 - 允許招募先前已經適當靶向劑治療之患有具有已知驅動突變(EGFR、ALK、ROS1、BRAF)之腫瘤之參與者。 - 已知PD-L1表現狀況及/或TPS 隊列3：再發性或轉移性SCCHN - 必須已接受可用標準護理，包括(但不限於) 1種含有PD-1/L1之先前方案(呈單劑或組合形式)，接受至少2個劑量之抗PD-1/L1劑，且在治療期間或之後經歷PD。 - 已知PD-L1表現狀況及/或TPS - 排除鼻咽癌、甲狀腺癌、唾液腺癌或非鱗狀組織學癌。 隊列4：晚期或轉移性軟組織肉瘤 - 必須已接受可用標準護理 - 合格的亞型包括平滑肌肉瘤、較差分化/去分化之脂肪肉瘤、高級多形性未分化肉瘤/MFH、黏液纖維肉瘤、惡性外周神經鞘瘤、上皮樣肉瘤、透明細胞肉瘤、滑液肉瘤、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤及血管肉瘤；經醫學監測員批準可招募其他組織學。 - 必須尚未接受先前抗PD-1/L1靶向治療。
部分 1C ： 排除如藉由WHO準則定義之復發性及/或原發性難治性AML；急性前骨髓細胞性白血病(M3)、療法相關之AML及轉型MDS。 排除準則
若符合以下準則中之任一者，則參與者自研究排除在外： 1.    參與者接受CYP3A4之強效抑制劑或誘導劑。 a.    對於先前用強效CYP3A4抑制劑之治療，需要在第一劑量之化合物1之前經歷≥ 5個半衰期之清除期才能招募至研究中。 b.    對於用CYP3A4誘導劑治療任一參與者，需要在第一劑量之化合物1之前經歷≥ 14天之清除期才能招募至研究中。 2.    患有黃斑變性、增生性糖尿病視網膜病變或伴有黃斑水腫之糖尿病視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、葡萄膜炎、中心性漿液性視網膜病變、白血病性視網膜病變、遺傳性視網膜變性、遺傳性視網膜變性之已知家族史之參與者，以及具有瞳孔擴張導致閉角型青光眼風險之參與者無資格。具有在眼科篩查檢查期間鑑別之可能干擾眼部監測之其他臨床上顯著之異常之參與者無資格。若在眼科篩查檢查期間鑑別出異常，則研究者應聯繫醫學監測員討論是否有資格。 3.    臨床上顯著之心臟病，包括LVEF ＜ 40%，不穩定型心絞痛，第1週期第1天起6個月內之急性心肌梗塞，紐約心臟病協會III級或IV級充血性心臟衰竭，以及需要治療之心律失常。 4.    研究者認為在臨床上有意義之ECG史或存在。不包括＞ 480毫秒之篩選QTcF間隔。在單個QTc ＞ 480毫秒之情況下，若3次ECG之平均QTc ＜ 480毫秒，則參與者可入選。對於心室內傳導延遲(QRS間隔＞ 120毫秒)之參與者，經發起人批準，可使用JTc間隔替代QTc。若使用JTc替代QTc，則JTc必須≤ 340毫秒。排除左束支傳導阻滯之參與者。 5.    未經治療之腦或CNS轉移或已進展之腦或CNS轉移(例如新的或擴大的腦轉移或可歸因於腦或CNS轉移之新的神經系統症狀之證據)。先前接受過治療且臨床表現穩定的腦或CNS轉移並停用所有皮質類固醇≥ 2週之參與者有資格。 6.    患有與先前療法無關或由先前免疫檢查點抑制劑療法引起之活動性或非活動性自體免疫疾病或症候群(例如類風濕性關節炎、中度或重度銀屑病、多發性硬化、發炎性腸病)且在過去2年中需要全身性治療之參與者，或正在接受自體免疫疾病或發炎性疾病之全身性療法(即，使用疾病改良劑、皮質類固醇或免疫抑制藥物)之參與者。 7.    對先前免疫療法具有3級或3級以上之免疫相關AE或任何眼部毒性之參與者。允許以下3級或3級以上之AE： a.    使用局部療法消退之3級皮疹。 b.    不需要中斷治療之無症狀脂肪酶升高。 c.    根據上述第6條排除準則，允許出現自體免疫疾患。 8.    不在方案定義之範圍內之實驗室值。若在治療開始前＞ 7天實施以下篩選化學和血液學測試，則必須在第1週期第1天研究藥物投與前重複測試並確認有資格。具有如下篩選實驗室值之參與者無資格：
實驗室參數 部分 1A/1B 及部分 2 ( 實體腫瘤 ) 部分 1C (AML)
血小板 ＜ 100 × 109/L ＜ 50 × 109/L
b.血紅素 ＜ 9 g/dL或＜ 5.6 mmol/L N/A
c.絕對嗜中性球計數(「ANC」) ＜ 1.5 × 109/L ＜ 0.5 × 109/L
實驗室參數 所有參與者
d.天冬胺酸胺基轉移酶(「AST」)及丙胺酸胺基轉移酶(「ALT」) ≥ 2.5 ×正常上限(「ULN」) (在患有肝轉移之參與者中，AST及/或ALT ≥ 5 × ULN)
e.鹼性磷酸酶 對於在篩選放射影像學檢查時患有1)骨轉移及2)無肝實質轉移之參與者，≥ 2.5 × ULN或鹼性磷酸酶≥ 5 × ULN
f.總膽紅素 ≥ 1.2 × ULN，除非結合之膽紅素≤ ULN (若總膽紅素超過ULN，則僅需要測試結合之膽紅素)。若無制度性ULN，則直接膽紅素必須＜ 40%之總膽紅素
g.血清肌酸酐 對於肌酸酐水準＞ 1.5 ×制度性ULN之參與者，＞ 1.5 ×制度性ULN或肌酸酐清除率＜ 50 mL/min
h. INR或PT ＞ 1.5 × ULN
i. aPTT ＞ 1.5 × ULN
9.    排除接受任何維生素K拮抗劑之參與者，該等維生素K拮抗劑包括(但不限於)醋硝香豆素(acenocoumarol)、氟茚二酮(fluindione)、苯丙香豆素(phenprocoumon)及華法林(warfarin)。 10.  在第一次投與研究藥物之前之以下間隔內用抗癌藥物或研究藥物治療： a.    對於化學療法、靶向小分子療法或放射療法，至少14天。參與者不得因治療而患有放射性肺炎。經發起人批準，對非CNS疾病之姑息性放射允許1週清除期。 b.    對於用於抗癌療法之先前單株抗體，至少28天。對於具有長半衰期(例如＞ 5天)之其他劑，第5個半衰期之前之招募需要醫學監測員批準。 11.  在開始研究治療前，尚未自先前療法(包括先前免疫療法)之毒性效應及/或先前手術干預之併發症恢復至≤1級或基線；允許出現預期不會消退之穩定慢性毒性，例如外周神經毒性、脫髮及疲勞。 12.  在第一劑量之研究治療之前的7天內未使用全身性皮質類固醇。 13.  在第一劑量之研究治療之3個月內接受活疫苗 14.  需要全身性療法之活動性感染。需要對全身性抗生素進行28天清除。禁止在研究時及篩選期間使用益生菌。 15.  HBV或HCV感染或再活化風險之證據。必須無法偵測到B型肝炎病毒DNA及HCV RNA。參與者對HBV DNA、HCV RNA、B型肝炎表面抗原或抗B型肝炎核心抗體不可呈陽性。 16.  已知HIV (HIV 1/2抗體)史。 17.  已知對研究藥物或調配物組分之任何組分有超敏反應或嚴重反應。 18.  自篩選訪視開始至研究治療之最後一次劑量後的180天，在研究之計劃持續時間內懷孕或哺乳或預期受孕或生育子女。 19.  研究者認為會干擾充分參與研究之任何疾患，包括研究治療之投與及參加必需的研究訪視；對參與者構成重大風險；或干擾研究資料之解釋。 20.  參與者(或父母、監護人或法定授權代表)無法理解ICF或不願簽署ICF。 21.  患有已知吞咽困難、短腸症候群、胃輕癱或限制經口投與之藥物之攝入或胃腸道吸收之其他疾患的參與者。 22.  僅部分1C：在第一劑量之化合物1之60天內經受HSCT之參與者，或篩選時接受HSCT後免疫抑制療法之參與者，或患有臨床上顯著之GVHD之參與者。(允許對正在進行之皮膚GVHD使用局部類固醇。) 23.  僅部分1C：具有表明活動性CNS白血病或已知CNS白血病之臨床症狀之參與者。僅當篩選期間臨床懷疑CNS與白血病有關時，才需要評估腦脊液。 24.  間質性肺病、間質性肺病病史或活動性非感染性肺炎之證據。 25.  器官移植史，包括同種異體幹細胞移植(隊列1C除外)。 26.  建議永久中斷療法之先前檢查點抑制劑療法期間之免疫相關毒性(根據產品標記或共識指南)，或需要強化或延長免疫抑制以進行管控之任何免疫相關毒性(使用替代激素進行良好控制之內分泌病變除外)。 27.  眼皮膚白化病之診斷。
除了本文所述之修改外，熟習此項技術者根據前面之描述將明了本發明之各種修改。此類修改亦欲落在所附申請專利範圍之範圍內。本申請案中所引用之每一參考文獻(包括所有專利、專利申請案及出版物)之全文皆以引用方式併入本文中。
圖1係MER激酶對ATP濃度之化合物1之IC50 值之圖。 圖2係在H1299細胞中化合物1對磷酸-AXL (pAXL)之抑制%之圖。 圖3係在G361黑色素瘤細胞中化合物1對磷酸-MER (pMER)之抑制%之圖。 圖4係活體外 自人類外周血單核細胞(PBMC)分化之原代巨噬細胞中pMER及總MER之西方墨點(Western blot)，該等人類外周血單核細胞用化合物1預處理2小時，然後用MER特異性促效劑抗體MAB8912刺激。 圖5A係活體外 自經化合物1預處理之人類外周血單核細胞(PBMC)分化之原代巨噬細胞中T細胞增殖之圖。 圖5B係活體外 自經化合物1預處理之人類PBMC分化之原代巨噬細胞中IFN-γ產生之圖。 圖6A係顯示在PBMC中化合物1及/或瑞替法尼對介白素(IL)-2之活體外 誘導之熱圖。 圖6B係顯示在PBMC中化合物1及/或瑞替法尼對干擾素(IFN)-γ之活體外 誘導之熱圖。 圖6C係顯示在PBMC中化合物1及/或瑞替法尼對腫瘤壞死因子(TNF)-α之活體外誘導之熱圖。 圖6D係顯示在PBMC中化合物1及/或瑞替法尼對顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之活體外誘導之熱圖。 圖6E係顯示在PBMC中化合物1及/或瑞替法尼對IL-12 p70之活體外誘導之熱圖。 圖7A係用化合物1處理後MBT-2腫瘤體積之圖，其展示化合物1在C3H小鼠之MBT-2腫瘤模型中之腫瘤生長抑制功效。 圖7B係用化合物1處理後4T1腫瘤體積之圖，其展示化合物1在BALB/c小鼠之4T1腫瘤模型中之腫瘤生長抑制功效。 圖7C係用化合物1處理後4T1腫瘤體積之圖，其展示化合物1在無胸腺裸小鼠之4T1腫瘤模型中之腫瘤生長抑制功效。 圖7D係經化合物1處理之帶有4T1腫瘤之小鼠之M1/M2樣巨噬細胞比率的圖。 圖8A係經口投用化合物1、抗程式化死亡配位體1 (PD-L1)或組合之C57BL/6小鼠之MC38腫瘤體積之圖。 圖8B係用化合物1、抗PD-L1或組合處理後帶有MC38腫瘤之小鼠中CD4+ Ki67+ 細胞之百分比之圖。 圖8C係用化合物1、抗PD-L1或組合處理後帶有MC38腫瘤之小鼠中CD8+ Ki67+ 細胞之百分比之圖。 圖8D係用化合物1、抗PD-L1或組合處理後帶有MC38腫瘤之小鼠之腫瘤提取物中干擾素(IFN)-γ之濃度的圖。 圖9A係用化合物1處理後無胸腺裸小鼠中CTG-2041腫瘤之腫瘤體積之圖。 圖9B係用化合物1處理後無胸腺裸小鼠中CTG-1302腫瘤之腫瘤體積之圖。 圖9C係用化合物1處理後無胸腺裸小鼠中CTG-1339腫瘤之腫瘤體積之圖。 圖9D顯示經化合物1或媒劑處理之小鼠之CTG-2041或CTG-1339腫瘤之pAXL、AXL、pMER、MER、GAS6、pAKT、AKT及β-肌動蛋白的西方墨點。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Figure 110107831-A0101-11-0001-1

Claims (21)

  1. 一種治療患者之癌症之方法，其包括向該患者投與： (i)      化合物1，其具有以下結構：
    Figure 03_image001
    化合物1； 或其醫藥學上可接受之鹽；及 (ii)     結合至人類PD-1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含(ii-1)可變重鏈(VH)結構域，其包含VH互補決定區(CDR)1、VH CDR2及VH CDR3；及(ii-2)可變輕鏈(VL)結構域，其包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；其中： (a)     該VH CDR1包含胺基酸序列SYWMN (SEQ ID NO:6 )； (b)     該VH CDR2包含胺基酸序列VIHPSDSETWLDQKFKD (SEQ ID NO:7 )； (c)     該VH CDR3包含胺基酸序列EHYGTSPFAY (SEQ ID NO:8 )； (d)     該VL CDR1包含胺基酸序列RASESVDNYGMSFMNW (SEQ ID NO:9 )； (e)     該VL CDR2包含胺基酸序列AASNQGS (SEQ ID NO:10 )；且 (f)     該VL CDR3包含胺基酸序列QQSKEVPYT (SEQ ID NO:11 )。
  2. 如請求項1之方法，其中化合物1及該抗體係同時投與。
  3. 如請求項1之方法，其中化合物1及該抗體係依序投與。
  4. 如請求項1之方法，其中化合物1係經口投與。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段係經由靜脈內投與來投與。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段係每3週一次以375 mg之劑量來投與。
  7. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段係每4週一次以500 mg之劑量來投與。
  8. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該抗體或抗原結合片段係每4週一次以750 mg之劑量來投與。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該VH結構域包含SEQ ID NO:4 中所示之胺基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該VL結構域包含SEQ ID NO:5 中所示之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該VH結構域包含SEQ ID NO:4 中所示之胺基酸序列且該VL結構域包含SEQ ID NO:5 中所示之胺基酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中： (a)     該抗體包含Fc區及鉸鏈結構域； (b)     該Fc區及該鉸鏈結構域屬於IgG4類型；且 (c)     該鉸鏈結構域包含穩定突變。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該抗體包含重鏈且其中該重鏈包含SEQ ID NO:2 中所示之胺基酸序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該抗體包含輕鏈且其中該輕鏈包含SEQ ID NO:3 中所示之胺基酸序列。
  15. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，且其中該重鏈包含SEQ ID NO:2 中所示之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO:3 中所示之胺基酸序列。
  16. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該抗體包含屬於IgG1類型之Fc區。
  17. 如請求項1至12及16中任一項之方法，其中該抗體包含重鏈且其中該重鏈包含SEQ ID NO:13 中所示之胺基酸序列。
  18. 如請求項1至12及16中任一項之方法，其中該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO:13 中所示之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO:3 中所示之胺基酸序列。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該抗體係人類化抗體。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該癌症係選自肝細胞癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、肛門癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、膽囊癌、胰臟癌、甲狀腺癌、皮膚癌、白血病、多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性淋巴瘤、成人T細胞白血病、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、霍奇金氏(Hodgkin’s)或非霍奇金氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglubulinemia)、毛細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkett's lymphoma)、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤及橫紋肌肉瘤。
  21. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該癌症係選自肉瘤、頭頸癌、黑色素瘤及非小細胞肺癌。
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