BR112020026819A2

BR112020026819A2 - anticorpos isolados, ácido nucleico, vetor, células hospedeiras, método de produção de um anticorpo, composição farmacêutica, métodos para tratar o câncer e para tratar uma doença e usos de um anticorpo

Info

Publication number: BR112020026819A2
Application number: BR112020026819-4A
Authority: BR
Inventors: Andrew Pincetic; Patricia Culp; Arnon Rosenthal
Original assignee: Alector Llc
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2021-04-20
Also published as: EA202190138A1; WO2020006374A3; CA3099176A1; US20210277113A1; CN112384532A; AU2019293589A1; MX2020013324A; WO2020006374A2; KR20210025614A; JP2021529520A; IL279648A; MA53015A; SG11202010990TA; EP3814377A2

Abstract

ANTICORPOS ISOLADOS, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULASHOSPEDEIRAS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOSPARA TRATAR O CÂNCEREPARA TRATAR UMA DOENÇAE USOSDE UM ANTICORPO”. A presente divulgação é, de modo geral, direcionada a composições que incluem anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos, etc., que ligam-se especificamente a um polipeptídeo SIRPß1, por exemplo, uma SIRPß1 humana, e ao uso dessas composições na prevenção, redução do risco ou tratamento de um indivíduo com tal necessidade.

Description

“ANTICORPOS ISOLADOS, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULAS HOSPEDEIRAS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA TRATAR O CÂNCER E PARA TRATAR UMA DOENÇA E USOS DE UM ANTICORPO” REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório dos EUA nº US 62/691.913, depositado em 29 de junho de 2018, o qual é integralmente incorporado ao presente pela referência para qualquer finalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente divulgação refere-se a anticorpos anti-SIRPβ1 e usos terapêuticos de tais anticorpos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A proteína reguladora de sinal beta (SIRPβ) pertence à família de receptores transmembranares SIRP, que são expressos na linhagem de células mieloides (incluindo monócitos, macrófagos, granulócitos, e células dendríticas) e em células neuronais. A família de proteínas SIRP é caracterizada por uma região extracelular contendo 2 domínios IgC proximais à membrana e um domínio IgV distal. Diferentemente dos receptores SIRPα, as proteínas SIRPβ contêm domínios citoplasmáticos curtos que carecem de motivos de sequência citoplasmática capazes de recrutar a proteína tirosina fosfatase SHP-2 e SHP-1. A isoforma 1 da SIRPβ (SIRPβ1) associa-se à proteína adaptadora DAP12, que contém um único motivo de imunorreceptor ativador baseado em tirosina (ITAM) citoplasmático. Consulte, por exemplo, Dietrich et al. 2000, J Immunol 164: 9-12; Liu et al. 2005 J Biol Chem 280: 36132-36140. A SIRPβ demonstrou ser um modulador microglial da fagocitose na doença de Alzheimer. Consulte, por exemplo, Gaikwad et al. 2009 Am J Pathol 175: 2528-2539.

[004] Consequentemente, existe uma necessidade por anticorpos anti-SIRPβ1 terapêuticos para tratar doenças, distúrbios e condições associadas a atividade indesejada de SIRPβ1.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga à SIRPβ1 humana, em que o anticorpo tem pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco propriedades selecionadas a partir de: a) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPα humana; b) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPγ humana; c) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à isoforma 3 da SIRPβ1 humana; d) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPβ1 de camundongo; e) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 de macacos cinomolgos; f) agoniza a atividade de SIRPβ1 in vitro e/ou in vivo em monócitos positivos para CD14; g) induz ou aumenta a explosão respiratória (respiratory burst) em células imunes, tais como neutrófilos e/ou monócitos de maneira in vitro e/ou in vivo; h) induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vitro e/ou in vivo; i) induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas in vitro e/ou in vivo; j) induz a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais in vitro e/ou in vivo; k) aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo; l) aumenta a expressão de TREM2 em macrófagos in vitro e/ou in vivo; m) aumenta a viabilidade de macrófagos in vitro e/ou in vivo, sozinho e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti-TREM2; e n) aumenta a viabilidade de células dendríticas in vitro e/ou in vivo.

[006] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPα humana ou isoforma 3 da SIRPβ1 humana. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPα, SIRPγ ou isoforma 3 da SIRPβ1 humana. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo tem pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três propriedades selecionadas a partir de: a) agoniza a atividade de SIRPβ1 in vitro e/ou in vivo em monócitos positivos para CD14; b) induz ou aumenta a explosão respiratória em células imunes, tais como neutrófilos e/ou monócitos de maneira in vitro e/ou in vivo; c) induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vitro e/ou in vivo; d) induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas in vitro e/ou in vivo; e) induz a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais in vitro e/ou in vivo; o) aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo;

p) aumenta a expressão de TREM2 em macrófagos in vitro e/ou in vivo; q) aumenta a viabilidade de macrófagos in vitro e/ou in vivo, sozinho e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti-TREM2; e f) aumenta a viabilidade de células dendríticas in vitro e/ou in vivo.

[007] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga à SIRPβ1 humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (a) HVR- H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 mostrada na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (b) HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H2 mostrada na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H3 mostrada na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (d) HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L1 mostrada na Tabela 3 e/ou Tabela 8; (e) HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L2 mostrada na Tabela 3 e/ou Tabela 8; e (f) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L3 mostrada na Tabela 3 e/ou Tabela 8. Em alguns exemplos de realização, a região variável de cadeia pesada compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais (frameworks) selecionadas a partir de VH FR1, VH FR2, VH FR3 e VH FR4 mostradas na Tabela 6. Em alguns exemplos de realização, a região variável de cadeia leve compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais (frameworks) selecionadas a partir de VL FR1, VL FR2, VL FR3 e VL FR4 mostradas na Tabela 5.

[008] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende a HVR-H1, HVR-H2, HVR-H2, HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7,

SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18,

SB-19, SB-20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB-

29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39,

SB-40, SB-41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB-

50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-

11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-

40-21 (mostrados nas Tabelas 3, 4, 8 e 9). Em alguns exemplos de realização,

o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283,

285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315,

317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347,

349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373,

374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 ou 382. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 268, 270, 272, 274, 276,

279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309,

311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341,

343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369,

371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 ou 382. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos

90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 267, 269, 271, 273, 275, 277,

278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340,

342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364 ou 370. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 267, 269, 271, 273, 275, 277, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364 ou 370. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia pesada, e uma região variável de cadeia leve pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB- 20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB-29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB- 41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB-50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21 Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB- 20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB-29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB- 41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB-50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

[009] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende a HVR-H1, HVR-H2, HVR-H2, HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7,

SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-

1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15,

SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21 (mostrado nas Tabelas 3,

4, 8 e 9). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%,

pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5,

SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3,

SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14,

SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-

4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2,

SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13,

SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9,

SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7,

SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-

40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9,

SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-

40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia pesada, e uma região variável de cadeia leve 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia leve, de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB- 40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21.

[010] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende HVR-H1, HVR-H2, HVR-H2, HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB- 2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40- 18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21 (mostrado nas Tabelas 8 e 9). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2- 9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40- 19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2- 9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-

19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8- 15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB- 40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia pesada, e uma região variável de cadeia leve 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia leve, de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8- 15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB- 1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8- 13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21.

[011] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 228, ou 229; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, 239, 239, 240, ou 241; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, 367, 368, ou 369. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, 367, 368, ou 369. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267.

[012] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81, 99, 230, 231, ou 232; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, 242, 243, 244, ou 245; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126 ou 253; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, 372, 373, 374, ou 375. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 269 ou 370. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, 372, 373, 374, ou 375. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 269 ou 370. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, 372, ou 373 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 370; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 374 ou 375 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 269.

[013] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, 233 ou 234; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, 246, 247 ou 248; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 ou 254; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376, 377 ou 378. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 280. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376, 377 ou 378. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 280.

[014] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, 235, 236 ou 237; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, 249, 250, 251 ou 252; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 379, 380, 381 ou 382. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 344. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 379, 380, 381 ou 382. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 344.

[015] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 229; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 239; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 367. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 367. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267.

[016] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 231; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 372. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 370. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 372. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 270.

[017] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 280. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 280.

[018] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é da classe IgG, da classe IgM ou da classe IgA. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é da classe IgG e tem um isotipo IgG1, IgG2 ou IgG4. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo tem um isotipo IgG1. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende uma substituição E430G e uma substituição P331S de acordo com a numeração EU.

[019] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é um fragmento Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 ou scFv.

[020] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo tem uma afinidade (KD) para a isoforma 1 da SIRPβ1 humana de 0,1 nM a 50 nM ou 0,5 nM a 10 nM ou 0,5 nM a 5 nM. Em alguns exemplos de realização, a afinidade é medida usando um sistema ForteBio Octet®.

[021] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo reconhece um primeiro e um segundo antígeno, em que o primeiro antígeno é SIRPβ1 e o segundo antígeno é: (a) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica; (b) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica selecionado a partir do grupo que consiste no receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteínas relacionadas ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 1 e 2 (LPR -1 e 2), e receptor da toxina da difteria; (c) um agente causador de doenças selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeos ou proteínas causadores de doenças, ácidos nucleicos causadores de doenças, em que os ácidos nucleicos causadores de doenças são RNA de expansão de repetição de GGCCCC (G2C4) antissenso, proteínas causadoras de doenças são selecionadas a partir do grupo que consiste em beta amiloide, beta amiloide oligomérico, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos dos mesmos, Tau, IAPP, alfa- sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (fase de leitura aberta 72 no cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína príon, PrPSc, Huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide de ilhotas, insulina, apolipoproteína A1, amiloide sérica A, medina, prolactina, transtiretina, lisozima, beta 2 microglobulina, gelsolina,

queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG (RAN) associados à repetição, peptídeos de repetição de diPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina- arginina (GR), peptídeos de repetição prolina-alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR); (d) um ligante e/ou proteína expresso(s) em células imunes, em que o ligante e/ou proteína é(são) selecionado(s) a partir do grupo que consiste em CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA- 4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, BTLA, KIR, GAL9, TIM3, A2AR, LAG-3 e fosfatidilserina; e (e) uma proteína, lipídio, polissacarídeo ou glicolipídio expresso em uma ou mais células tumorais.

[022] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga à SIRPβ1 humana, em que o anticorpo compete com um ou mais anticorpos fornecidos na presente invenção para a ligação à isoforma 1 da SIRPβ1 humana. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga à SIRPβ1 humana, em que o anticorpo liga-se essencialmente ao mesmo epítopo da isoforma 1 da SIRPβ1 ou sobreposto a um ou mais anticorpos fornecidos na presente invenção.

[023] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um ácido nucleico isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-SIRPβ1 fornecido na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um vetor compreendendo o ácido nucleico.

Em alguns exemplos de realização, é fornecida uma célula hospedeira isolada compreendendo o vetor. Em alguns exemplos de realização, é fornecida uma célula hospedeira isolada que expressa um anticorpo anti-SIRPβ1 proporcionado na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, são fornecidos métodos de produção de um anticorpo que se liga à SIRPβ1 humana, compreendendo o cultivo de uma célula hospedeira que expressa um anticorpo anti-SIRPβ1 fornecido na presente invenção de modo que o anticorpo seja produzido. Em alguns exemplos de realização, o método compreende a recuperação do anticorpo produzido pela célula.

[024] Em alguns exemplos de realização, uma composição farmacêutica é fornecida, compreendendo um anticorpo anti-SIRPβ1 fornecido na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[025] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um método de tratamento do câncer, compreendendo a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPβ1 fornecido na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, o câncer é selecionado a partir de sarcoma, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de pélvis renal, leucemia, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, melanoma, linfoma, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário e fibrossarcoma, glioblastoma multiforme; carcinoma renal de células claras; carcinoma adrenocortical; carcinoma urotelial da bexiga, linfoma difuso de grandes células B, adenocarcinoma de pulmão; adenocarcinoma pancreático, câncer de células renais, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma indolente de células B, linfoma de células B agressivo, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múltiplo, síndromes mielodisplásicas, neoplasias mieloproliferativas, carcinoma invasivo de mama, carcinoma de células escamosas cervicais, adenocarcinoma endocervical, colangiocarcinoma, adenocarcinoma de cólon, linfoma difuso de grandes células B, carcinoma de cabeça e pescoço, carcinoma renal cromofóbico,

carcinoma renal de células papilares, glioma de grau inferior, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas pulmonares, mesotelioma, cistadenocarcinoma seroso ovariano, adenocarcinoma pancreático, feocromocitoma e paraganglioma, adenocarcinoma da próstata, adenocarcinoma retal, melanoma cutâneo, adenocarcinoma de estômago, tumores de células germinais testiculares, carcinoma da tiroide, timoma, carcinoma endometrial do corpo uterino, carcinossarcoma uterino, e melanoma uveal.

[026] Em alguns exemplos de realização, o método de tratamento compreender ainda a administração de um agente terapêutico que inibe ou agoniza PD1, PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, CTLA4, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39 ou CD73. Em alguns exemplos de realização, o método de tratamento compreende ainda a administração ao indivíduo de, pelo menos, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de ponto de verificação, e/ou uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais.

[027] Em alguns exemplos de realização, o método de tratamento compreende ainda a administração de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória em combinação com o anticorpo anti-SIRPA. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória é selecionado a partir de um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e anticorpo anti-HVEM, anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo antirreceptor tipo imunoglobulina Killer (KIR) inibidor, um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM-1, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-TIM-4, um anticorpo anti-

A2AR, um anticorpo anti-CD39, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti- LAG-3, um anticorpo anti-fosfatidilserina, um anticorpo anti-CD27, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-TNFα, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti- Siglec- 5, um anticorpo anti-Siglec-7, um anticorpo anti-Siglec-9, um anticorpo anti-Siglec-11, um anticorpo anti-TREM1 antagonista, um anticorpo anti- TREM2 antagonista, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-VISTA, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, e qualquer combinação dos mesmos.

[028] Em alguns exemplos de realização, o método de tratamento compreende a administração de uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais selecionadas a partir de radioterapia, quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, terapia com imatinibe, terapia com trastuzumabe, terapia com etanercept, transferência de células adotivas (ACT), terapia de transferência de receptor de antígeno quimérico de células T (CAR- T), terapia com vacina e terapia com citocinas.

[029] Em alguns exemplos de realização, o método de tratamento inclui ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é selecionado a partir de um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2, e qualquer combinação dos mesmos.

[030] Em alguns exemplos de realização, o método de tratamento compreende ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação imune estimuladora. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora é selecionado a partir de um anticorpo agonista anti-CD40, um anticorpo agonista anti-OX40, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonista anti-TREM1, um anticorpo agonista anti-TREM2, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista anti-CD27, um anticorpo agonista anti-GITR proteína relacionada ao TNFR induzida por glicocorticoide, um anticorpo agonista anti-CD30, um anticorpo agonista anti-BTLA, um anticorpo agonista anti-HVEM, um anticorpo agonista anti-CD2, um anticorpo agonista anti-CD5 e qualquer combinação dos mesmos.

[031] Em alguns exemplos de realização, um método de tratamento compreende ainda administrar ao indivíduo pelo menos uma citocina estimuladora. Em alguns exemplos de realização, a pelo menos uma citocina estimuladora é selecionada a partir de IFN-α4, IFN-β, IL-1β, TNF-α, IL- 6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL- 11, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1-beta e qualquer combinação das mesmas.

[032] Em alguns exemplos de realização, é fornecido o uso de um anticorpo anti-SIRPβ1 fornecido aqui para a preparação de um medicamento. Em alguns exemplos de realização, o medicamento é para o tratamento do câncer. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 fornecido aqui é fornecido para o tratamento do câncer.

[033] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um método de tratamento de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo, compreendendo a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPβ1 fornecido na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, a doença neurodegenerativa ou distúrbio é selecionado a partir de demência, demência frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva, doença de Alzheimer, demência vascular, doença de Nasu-Hakola, déficit cognitivo, perda de memória, convulsões,

distrofia retinal, esclerose lateral amiotrófica, cérebro traumático lesão, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, encefalomielite disseminada aguda, degeneração retinal, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, esclerose múltipla.

[034] Em alguns exemplos de realização, é fornecido o uso de um anticorpo anti-SIRPβ1 fornecido na presente invenção para a preparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio neurodegenerativo.

Em alguns exemplos de realização, a doença neurodegenerativa ou distúrbio é selecionado a partir de demência, demência frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva, doença de Alzheimer, demência vascular, doença de Nasu-Hakola, déficit cognitivo, perda de memória, convulsões, distrofia retinal, esclerose lateral amiotrófica, cérebro traumático lesão, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, encefalomielite disseminada aguda, degeneração retinal, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, esclerose múltipla. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 fornecido na presente invenção para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo. Em alguns exemplos de realização, a doença neurodegenerativa ou distúrbio é selecionado a partir de demência, demência frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva, doença de Alzheimer, demência vascular, doença de Nasu-Hakola, déficit cognitivo, perda de memória, convulsões, distrofia retinal, esclerose lateral amiotrófica, cérebro traumático lesão, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, encefalomielite disseminada aguda, degeneração retinal, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, esclerose múltipla.

[035] Deve ser compreendido que uma ou algumas ou todas as propriedades dos diversos exemplos de realização aqui descritos podem ser combinadas para formar outros exemplos de realização da presente invenção.

Estes e outros aspectos da presente invenção serão evidentes para os técnicos hábeis no assunto. Estes e outros exemplos de realização da invenção são adicionalmente descritos pela descrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[036] A FIG. 1A mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos da isoforma 1 da SIRPβ1 (SEQ ID NO: 1; No. de acesso Uniprot O00241) e isoforma 3 da SIRP β1 (SEQ ID NO: 384; No. de acesso Uniprot Q5TFQ8). A FIG. 1B mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos da isoforma 1 da SIRPβ1 (SEQ ID NO: 1) com SIRPα (SEQ ID NO: 385; No. de acesso Uniprot P78324), que mostra alta homologia dentro dos domínios extracelulares.

[037] A FIG. 2 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos da isoforma 1 da SIRPβ1 humana (SEQ ID NO: 1) e SIRPβ1 de camundongo (SEQ ID NO: 3 86; No. de Acesso Uniprot Q8BFX8).

[038] As FIGs. 3A-3B mostram a indução da expressão de luciferase dependente de SIRPβ1 humana em um ensaio repórter baseado em células. As células foram estimuladas com anticorpos anti-SIRPβ1 ligados à placa (3A) ou anti-SIRPα (SA-9C2) (3B) ou controle isotípico de IgG1 humana.

Os resultados são expressos como a quantidade em vezes sobre o nível de fundo. O nível de fundo é definido como 1 no eixo y.

[039] A FIG. 4A mostra o padrão de expressão de dois receptores associados a DAP12, SIRPβ1 e TREM1, em monócitos humanos.

Os histogramas sombreados representam a fluorescência de fundo de células coradas com isotipo. Os histogramas delineados em preto representam o nível de expressão do receptor com células coradas de anticorpos específicos para o alvo. A FIG. 4B mostra a expressão de SIRPβ1 em macrófagos polarizados M1 e M2 de 2 doadores saudáveis. Os histogramas sombreados representam a fluorescência de fundo de células coradas com isotipo. Os histogramas delineados em preto representam o nível de expressão de SIRPβ1 em macrófagos M2, enquanto os histogramas em linha tracejada representam o nível de expressão de SIRPβ1 em macrófagos M1. A FIG. 4C mostra a expressão de SIRPβ1 e TREM1 em células dendríticas derivadas de monócitos humanos (DCs) com ou sem estimulação com LPS. Os histogramas sombreados representam a fluorescência de fundo de células coradas com isotipo. Os histogramas delineados em preto representam o nível de expressão do receptor com células coradas de anticorpos específicos para o alvo.

[040] A FIG. 5A exibe perfis do padrão de expressão de RNA da isoforma 1 da SIRPβ1 em vários tecidos de doadores humanos. A FIG. 5B exibe perfis do padrão de expressão de RNA da isoforma 3 da SIRPβ1 em vários tecidos de doadores humanos. O pico de expressão da isoforma 3 da SIRPβ1 ocorre no cérebro com expressão limitada em tecidos periféricos.

[041] A FIG. 6A mostra a explosão respiratória mediada por SIRPβ1 de neutrófilos humanos primários obtidos de dois doadores diferentes.

A FIG. 6B mostra a explosão respiratória mediada por SIRPβ1 (painel superior) ou liberação de IL-8 (painel inferior) de monócitos humanos primários. A FIG.

6C mostra a liberação de citocinas TNF-α mediada por SIRPβ1 a partir de macrófagos humanos primários ou células dendríticas (DCs).

[042] A FIG. 7 mostra a atividade antitumoral de neutrófilos humanos primários estimulados com anticorpos anti-SIRPβ1 ligados à placa.

Os valores de luminescência são apresentados em uma escala relativa com o sinal de Raji-Luc cocultivado com neutrófilos na ausência de anticorpo opsonizante definido como 1 no eixo y.

[043] A FIG. 8 mostra a indução da expressão de luciferase dependente de SIRPβ1 humana em um ensaio repórter baseado em células por anticorpos maturados por afinidade. Os resultados apresentados são valores brutos de luminescência. O nível de fundo é definido como 10.000 no eixo y.

[044] A FIG. 9 mostra a liberação de citocinas TNF-α mediada por SIRPβ1 a partir de células dendríticas (DCs) humanas primárias.

[045] As FIGs. 10A-10B exibem a reatividade cruzada de anticorpos anti-SIRPβ1 para múltiplos antígenos SIRPβ1. SIRPβ1-Fc humana da isoforma 1 (O00241) ou isoforma 3 (Q5TFQ8) ou SIRPβ1-Fc de cinomolgo (XM005568541) (XM005568541) foram revestidas em placas e incubadas com concentrações crescentes de formas parentais e maturadas por afinidade de anticorpos SB-1 anti-SIRPβ1-1-2, SB-2, SB-2-7, SB-8, SB-8-13, SB-40 e SB- 40-21. Todos os anticorpos anti-SIRPβ1 se ligaram apenas ao antígeno da isoforma 1 da SIRPβ1-Fc humana.

[046] A FIG. 11A mostra o aumento da expressão de TREM2 em macrófagos humanos derivados de monócitos a partir de três doadores saudáveis diferentes por anticorpos anti-SIRPβ1 de comprimento total ligados à placa, SB-1-3, SB-2-8, SB-8-13, o SB -8-15 e SB-40-20. A expressão basal de TREM2 foi determinada a partir de células incubadas em anticorpo de controle isotípico IgG1 humana. A proteína TREM2 foi detectada com um anticorpo anti- TREM2 (clone ADI-22) conjugado com fluoróforo DyLight650. FIG. 11B mostra a viabilidade de macrófagos humanos derivados de monócitos cultivados em anticorpos anti-SIRPβ1 de comprimento total ligados à placa SB-1-3, SB-2-8, SB-8-13, SB-8-15 e SB- 40-20. As células viáveis foram quantificadas medindo os valores de luminescência após a adição do substrato Cell Titer Glo. As células cultivadas no controle isotípico de IgG1 humana ou na ausência de anticorpo ligado à placa (Sem Ab) estabeleceram a viabilidade basal das células.

[047] A FIG. 12 mostra a viabilidade de macrófagos derivados de monócitos de dois doadores saudáveis diferentes cultivados em concentrações crescentes de anticorpos anti-SIRPβ1 de comprimento total ligados à placa SB-

1-3 e SB-2-8 ou controle isotípico IgG1 humana. As células viáveis foram quantificadas medindo os valores de luminescência após a adição do substrato Cell Titer Glo.

[048] A FIG. 13 mostra que os anticorpos anti-SIRPβ1 aumentam a atividade agonística do anticorpo anti-TREM2 em um ensaio de viabilidade de macrófagos. Os macrófagos derivados de monócitos foram cultivados com SB- 1-3, SB-2-8 ou controle isotípico huIgG1 ligados a placa, na presença ou ausência de anticorpo anti-TREM2 solúvel. As células viáveis foram quantificadas medindo os valores de luminescência após a adição do substrato Cell Titer Glo.

[049] A FIG. 14A mostra a viabilidade de macrófagos derivados da medula óssea obtidos a partir de camundongos transgênicos BAC com SIRPβ1 humana cultivados em anticorpos anti-SIRPβ1 de comprimento total SB-1-3, SB-2-8 e SB-8-13 ligados à placa ou controle isotípico IgG1 humana. A FIG. 14B mostra a viabilidade de células dendríticas obtidas da medula óssea a partir de camundongos transgênicos BAC com SIRPβ1 humana cultivados em anticorpos anti-SIRPβ1 de comprimento total SB-1-3, SB-2-8 e SB-8-13 ligados à placa ou controle isotípico IgG1 humana. As células viáveis foram quantificadas medindo os valores de luminescência após a adição do substrato Cell Titer Glo. As células cultivadas no controle isotípico de IgG1 humana ou na ausência de anticorpo ligado à placa (Sem Ab) estabeleceram a viabilidade basal das células.

[050] As FIGs. 15A-15C mostram reatividade cruzada de anticorpos anti-SIRPβ1 para diferentes receptores da família SIRP. A FIG. 15A e FIG. 15B mostram curvas de titulação de vários anticorpos antirreceptor de SIRP que ligam-se às células BW5147.G.1.4 que superexpressam SIRPβ1 humana recombinante ou SIRPα humana recombinante, respectivamente. A FIG. 15C mostra curvas de titulação de anticorpos que se ligam às células

Jurkat, uma linhagem de células T humanas imortalizadas que expressa endogenamente SIRPγ. Os anticorpos de controle positivo eram anti-SIRPα/β clone 18D5, anti-SIRPα/β/γ clone KWAR23 e anti-SIRPγ clone LSB2.20.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[051] A presente divulgação refere-se a anticorpos anti-SIRPβ1 (por exemplo, anticorpos monoclonais); métodos de produção e uso de tais anticorpos; composições farmacêuticas compreendendo tais anticorpos; ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos; e células hospedeiras compreendendo ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos.

[052] As técnicas e procedimentos descritos ou mencionados no presente são de modo geral bem compreendidos e comumente empregados utilizando a metodologia convencional pelos técnicos hábeis no assunto, tal como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas com àquelas descritas em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd & C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000).

[053] Todas as referências citadas na presente divulgação, incluindo patentes e publicações, são integralmente incorporadas ao presente pela referência.

I. DEFINIÇÕES

[054] Os termos “Proteína reguladora de sinal β1”, “SIRPβ1” e “polipeptídeo SIRPβ1” são usados de maneira indistinta no presente documento e referem-se a qualquer proteína SIRPβ1 nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos e cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo quando indicado de outra forma. Em alguns exemplos de realização, o termo abrange sequências tipo selvagem e sequências variantes de ocorrência natural, por exemplo, variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas. Em alguns exemplos de realização, o termo engloba termo SIRPβ1 “completa” ou “de comprimento total” não processadas, bem como qualquer forma de SIRPβ1 que resulta do processamento na célula. Em alguns exemplos de realização, SIRPβ1 é SIRPβ1humana. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácidos de uma isoforma 1 da SIRPβ1 exemplar é a da sequência com o Nº de Acesso Uniprot O00241, de 28 de fevereiro de 2018. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácidos de uma SIRPβ1 humana exemplar é a da SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácidos de uma isoforma 3 da SIRPβ1 exemplar é a da sequência com o Nº de Acesso Uniprot Q5TFQ8, 31 de janeiro de 2018. Em alguns exemplos de realização, a sequência de aminoácidos de uma isoforma 3 da SIRPβ1 humana exemplar é a da SEQ ID NO: 384. A menos que especificamente indicado de outra forma, “SIRPβ1”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se à isoforma 1 da SIRPβ1.

[055] As expressões “anticorpo anti-SIRPβ1” e “um anticorpo que se liga à SIRPβ1” e “anticorpo que se liga especificamente à SIRPβ1” referem- se a um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente à SIRPβ1 com afinidade suficiente para que o anticorpo se torne útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico direcionado contra SIRPβ1. Em uma realização, a extensão de ligação de um anticorpo anti-SIRPβ1 a um polipeptídeo não SIRPβ1 não relacionado, é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo à SIRPβ1 mensurada, por exemplo, por um teste de radioimunoensaio (RIA). Em certos exemplos de realização, um anticorpo que se liga à SIRPβ1 tem uma constante de dissociação (KD) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em certas realizações, um anticorpo anti-SIRPβ1 se liga a um epítopo de SIRPβ1 que é conservado entre os polipeptídeo de SIRPβ1 de diferentes espécies.

[056] Com relação à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, o termo “ligação específica” ou “se liga especificamente à” ou é “específico para” um polipeptídeo específico ou um epítopo em um polipeptídeo alvo específico significa que a ligação é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, pela determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada pela competição com uma molécula controle que é semelhante ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado à sonda é competitivamente inibida pelo excesso de alvo não marcado. O termo “ligação específica” ou “liga-se especificamente a” ou é “específico para” um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo alvo particular, tal como utilizado na presente invenção, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com um K D para o alvo de cerca de 10-4 M ou menos, 10-5 M ou menos, 10-6 M ou menos, 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos, 10-12 M ou menos ou um KD no intervalo de 10-4 M a 10-6 M ou 10-6 M a 10-10 M ou 10-7 M a 10-9 M. Como será reconhecido pelo versado na técnica, os valores de afinidade e KD estão inversamente relacionados. Uma alta afinidade para um antígeno é medida por um baixo valor de K D. Em uma realização, o termo “ligação específica” indica a ligação quando uma molécula liga-se a um polipeptídeo específico ou epítopo de um polipeptídeo específico, substancialmente sem qualquer ligação a outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.

[057] O termo “imunoglobulina” (Ig) é utilizado indistintamente com “anticorpo” no presente documento. O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente os anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) incluindo aqueles formado por pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos desde que estes exibam a atividade biológica desejada.

[058] “Anticorpos nativos” são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves (“L”) idênticas e duas cadeias pesadas (“H”) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto a quantidade de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes de dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (V H), seguido por um número de domínios constante. Cada cadeia leve contém um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácido específicos formam uma relação entre os domínios variáveis da cadeia leve e cadeia pesada.

[059] Para a estrutura e as propriedades das diferentes classes de anticorpo, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª edição, Daniel. P. Stites, Abba I. Terr e Tristam G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 Capítulo 6.

[060] A cadeia leve de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um dos dois tipos claramente distintos, denominados kappa (“κ”) e lambda (“λ”), baseados nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser classificadas em classes ou isotipos diferentes. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com cadeias pesadas designadas alfa (“α”), delta (“δ”), épsilon (“ε”), gama (“γ”) e mu (“μ”), respectivamente. As classes γ e α são divididas ainda em subclasses (isotipos) com base em diferenças relativamente pequenas na função e sequência de CH, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As estruturas das subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e descritas geralmente em, por exemplo, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4a ed. (WB Saunders, Co., 2000).

[061] A “região variável” ou “ domínio variável” de um anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição, refere-se aos domínios amino-terminais de cadeia pesada ou leve do anticorpo. Os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser referidos como “VH” e “VL”, respectivamente. Esses domínios geralmente são as partes mais variáveis do anticorpo (em relação a outros anticorpos da mesma classe) e contêm os sítios de ligação a antígenos.

[062] O termo “variável” refere-se ao fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos, como os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente divulgação. O domínio variável medeia a ligação ao antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular para o seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente em toda a extensão dos domínios variáveis.

Em vez disso, está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis (HVRs), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como nos domínios variáveis de cadeia pesada. As porções mais bem conservadas de domínios variáveis são denominadas de regiões estruturais ou regiões de arcabouço (frameworks) (FR). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem 4 regiões FR cada, adotando em grande parte uma configuração de folha beta, conectadas por três HVRs, que formam alças (loops) que se conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha beta. As HVRs de cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas regiões FR e, com as HVRs da outra cadeia, contribuindo para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Quinta Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação do anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.

[063] A expressão “anticorpo monoclonal”, usada no presente documento, refere-se a um anticorpo como um anticorpo anti-SIRPβ1 monoclonal da presente descrição, obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural e/ou alterações pós-traducionais (por exemplo, isomerizações, amidações, etc.) que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos de modo que eles podem ser sintetizados por cultura de hibridomas, não contaminada por outras imunoglobulinas. O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma, métodos de DNA recombinante e tecnologias para produzir anticorpos humanos ou semelhantes aos de humanos em animais que possuem partes ou todos os loci ou genes de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina humana.

[064] Os termos “anticorpo completo”, “anticorpo intacto” ou “anticorpo inteiro” são usados indistintamente para se referir a um anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição, em sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de anticorpo.

Especificamente, os anticorpos inteiros incluem aqueles com cadeias pesadas e leves, incluindo uma região Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes da sequência nativa humana) ou a sequência de aminoácidos variante desta. Em alguns casos, o anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.

[065] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno para o qual o anticorpo intacto se liga.

Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’) 2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; (vide a Patente US 5.641.870, Exemplo 2; Zapata, et al, Protein Ens.. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[066] A digestão de anticorpos por papaína, como os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente descrição, produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos “Fab” e um fragmento “Fc” residual,

uma designação que reflete a capacidade de cristalizar rapidamente. O fragmento Fab consiste de uma cadeia leve inteira juntamente com o domínio da região variável da cadeia pesada (VH) e o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente com relação a ligação ao antígeno ou seja, ele tem um único sítio de ligação ao antígeno. O tratamento de um anticorpo com pepsina gera um fragmento F(ab’) 2 que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por pontes de dissulfeto possuindo a atividade de ligação ao antígeno diferente, e ainda é capaz de reticular o antígeno. Os fragmentos Fab’ se diferem dos fragmentos Fab por possuírem alguns resíduos adicionais na extremidade carbóxi-terminal do domínio CH1, incluindo uma ou mais cisteínas a partir da região de dobradiça do anticorpo. Fab’-SH é a designação da presente invenção para o Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes sustenta(m) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab’)2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab’ que possuem dobradiças de cisteínas entre si. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

[067] O fragmento Fc compreende as porções carboxi-terminal de ambas as cadeias pesadas unidas por ligações (pontes) de dissulfeto. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas pelas sequências na região de Fc, regiões as quais também são reconhecidas pelos receptores Fc (FcR) encontrados em determinados tipos celulares.

[068] “Fragmentos funcionais” de anticorpos, como anticorpos anti-SIRPβ1 da presente descrição, compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente incluindo a ligação ao antígeno ou região variável do anticorpo intacto ou a região F de um anticorpo que retém ou modificou a capacidade de ligação ao FcR. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (ou simples); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[069] O termo “diacorpos” (diabodies) refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos preparados pela construção de fragmentos sfv (vide parágrafo anterior), com ligantes curtos (cerca de resíduos 5-10) entre os domínios VH e VL, de modo que é obtido o pareamento intercadeia, mas não o pareamento intracadeia dos domínios variáveis, resultando em um fragmento bivalente ou seja, fragmento com dois sítios de ligação ao antígeno. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv ‘cruzados’ (sFv crossover) em que os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas.

[070] Como utilizado neste documento, “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo (imunoglobulina), como um anticorpo quimérico anti- SIRPβ1 da presente descrição, no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos específica, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é (são) idêntico(s) ou homólogo(s) às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Os anticorpos quiméricos de interesse neste documento incluem anticorpos PRIMATIZED® nos quais a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido, por exemplo, pela imunização de macacos Macaca com um antígeno de interesse. Como usado no presente documento, “anticorpo humanizado”; é usado como um subconjunto de “anticorpos quiméricos”.

[071] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos), como formas humanizadas de anticorpos anti-SIRPβ1 da presente descrição, são anticorpos quiméricos que compreendem resíduos de aminoácidos de HVRs não humanos e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àquelas de um anticorpo não humano, e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, se refere a um anticorpo que foi submetido à humanização.

[072] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos correspondente à de um anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição, produzido por um humano e/ou que foi produzido usando qualquer uma das técnicas para produzir anticorpos humanos divulgadas neste documento. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo bibliotecas de exibição por fagos e tecnologias de plataforma baseada em leveduras. Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta a um desafio antigênico, mas cujos locos endógenos foram desativados, por exemplo, camundongos transgênicos imunizados e gerados por tecnologia de hibridoma de célula B humana.

[073] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, quando utilizado neste documento, refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo, como o de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação, que são hipervariáveis na sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas.

Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade dentre as seis HVRs e acredita-se que a H3 em particular, desempenha um papel único na conferência da especificidade fina aos anticorpos. Anticorpos de camelídeos de ocorrência natural e que consistem em uma cadeia pesada somente são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve.

[074] Diversos delineamentos da HVR são utilizados e englobados no presente documento. Em alguns exemplos de realização, as HVRs podem ser regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de Kabat com base na variabilidade da sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., supra). Em alguns exemplos de realização, as HVRs podem ser CDRs de Chothia. Chothia por sua vez refere-se a localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Em alguns exemplos de realização, as HVRs podem ser CDRs de Chothia. As HVRs do AbM representam um acordo entre as CDRs de Kabat e as alças (loops) estruturais de Chothia, e são utilizados pelo programa “Oxford Molecular AbM antibody modeling software”. Em alguns exemplos de realização, as HVRs podem ser HVRs de “contato”. O “contato” das HVRs é baseado em uma análise das estruturas de complexo cristalino disponíveis. Os resíduos de cada uma destas HVRs são descritas a seguir.

Alça Kabat AbM Chothia Contato L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeração de Kabat)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

[075] As HVRs podem compreender “HVRs estendidas” como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2,) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL, e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (a modalidade preferida) (H2) e 93- 102, 94-102 ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al., supra para cada uma dessas definições de HVRs estendidas.

[076] Resíduos da “região estrutural” ou “região de arcabouço” ou “FR” (do inglês framework region) são aqueles resíduos do domínio variável que não são resíduos da HVR conforme definido no presente.

[077] A expressão “região estrutural humana aceptora” conforme usada na presente invenção é uma região estrutural (framework) contendo a sequência de aminoácidos de uma região estrutural V L ou VH derivada de uma região estrutural da imunoglobulina humana ou a partir de uma região estrutural de consenso humano. Uma região estrutural humana aceptora “derivada de” uma região estrutural de uma imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido desta ou pode compreender uma alteração na sequência de aminoácidos pré- existente. Em alguns exemplos de realização, o número de alterações de aminoácidos pré-existentes são de 10 ou menos, nove ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Quando as alterações de aminoácidos pré-existentes estão presentes em um VH, essas alterações ocorrem preferencialmente em apenas três, dois ou uma das posições 71H, 73H e 78h, por exemplo, os resíduos de aminoácidos nessas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Em um exemplo de realização, a região estrutural humana aceptora V L é idêntica em sua sequência com a sequência da região estrutural da imunoglobulina humana V L ou sequência da região estrutural de consenso humano.

[078] Uma “região estrutural de consenso humano” é uma região estrutural que representa os mais comumente resíduos de aminoácidos que ocorrem em uma seleção de sequências da região estrutural V H ou VL da imunoglobulina humana. De modo geral, a seleção das sequências VH ou VL da imunoglobulina humana ocorre a partir de um subgrupo de sequências de domínios variáveis. Em geral, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Exemplos incluem para o VL, o subgrupo pode ser o subgrupo kappa (capa) I, kappa II, kappa III ou kappa IV, como em Kabat et al., supra. Além disso, para VH, o subgrupo pode ser o subgrupo I, subgrupo II ou subgrupo III, como em Kabat et al., supra.

[079] Uma “alteração de aminoácidos” na posição especificada, por exemplo, de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição, refere-se à substituição ou deleção do resíduo especificado ou a inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido adjacente ao resíduo especificado. A inserção “adjacente” a um resíduo especificado significa a inserção em um a dois dos resíduos dos mesmos. A inserção pode ser N-terminal ou C-terminal ao resíduo especificado. A alteração de aminoácido preferida neste documento é uma substituição.

[080] Um anticorpo “maturado por afinidade” ou “amadurecido por afinidade”“, tal como um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição, é um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais de suas HVRs, que resultam em melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com um anticorpo de origem que não possua esta(s)

alteração(ões). Em um exemplo de realização os anticorpos maturados por afinidades preferidos irão possuir afinidades nanomolares ou ainda picomolares ao antígeno alvo. Anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos no estado da técnica. Marks, et al., Biotechnology 10:779-783 (1992) descrevem, por exemplo, a maturação por afinidade por embaralhamento (shuffling) dos domínio VH e VL. A mutagênese aleatória da HVR e/ou resíduos da região estrutural é descrita em, por exemplo, Barbas, et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994); Shier et al., Gene 169:147- 155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J.

Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[081] “Fv” é o menor fragmento de anticorpo, que compreende um sítio completo de reconhecimento e de ligação de antígenos. Este fragmento consiste em um dímero de uma região variável de cadeia pesada e uma de cadeia leve em estreita associação não covalente. A partir do enovelamento destes dois domínios, surgem 6 alças (loops) hipervariáveis (3 alças da cadeia H e 3 alças da cadeia L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação ao antígeno e conferem especificidade de ligação ao anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três HVRs específicos para um antígeno), possui a capacidade de reconhecer e ligar ao antígeno, embora em menor afinidade do que o site de ligação inteiro.

[082] “Fv de cadeia única”, também abreviado como “sFv” ou “scFv” são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios V H e VL de anticorpo conectados em uma única cadeia de polipeptídica.

Preferencialmente, o polipeptídeo sFv compreende ainda um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL, permitindo que o sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno.

[083] Um anticorpo com “funções efetoras” refere-se as atividades biológicas atribuídas a região Fc (uma sequência nativa da região Fc ou uma sequência de aminoácido variante da região Fc) de um anticorpo, e variam de acordo com o isotipo do anticorpo.

[084] O termo “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo a sequência nativa de regiões Fc e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir de um resíduo de aminoácidos na posição Cys226 ou a partir da Pro230, até a região carboxi-terminal desta. A lisina C-terminal (resíduo 477 de acordo com sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo ou pela construção de um ácido nucleico recombinante que codifica uma cadeia pesada do anticorpo.

Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos podem incluir populações de anticorpos com todos resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem a remoção dos resíduos K447, e populações de anticorpos com uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. As regiões Fc de sequência nativa adequadas para uso nos anticorpos da presente descrição incluem a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.

[085] Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Região Fc humana de sequência nativa inclui uma região Fc de IgG1 humano de sequência nativa (alótipos não A e A); região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa, região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como as variantes de ocorrência natural destas.

[086] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que difere da região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, de preferência, uma ou mais substituição(ões) de aminoácido(s). Preferivelmente, a região Fc variante possui pelo menos uma substituição de aminoácido quando comparada a uma região Fc de sequência nativa ou a uma região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente cerca de 1 a cerca de 5 substituições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante da presente invenção irá possuir preferencialmente cerca de pelo menos 80% de homologia com uma sequência da região Fc nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com esta.

[087] Os termos “receptor de Fc” ou “FcR” descrevem um receptor que se liga a uma região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR de sequência nativa humana. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcγRI, FcγRII e FcγRIII, incluindo variantes alélicas e formas oriundas de splicing alternativo destes receptores, os receptores FcγRII incluem FcγRIIA (um “receptor ativador”) e FcγRIIB (um “receptor inibidor”), que possuem sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcRIIA possui um motivo de ativação com base em imunorreceptor tirosina (“ITAM”), no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcγRIIB possuí um motivo de inibição com base em imunorreceptor tirosina (“ITIM”) no seu domínio citoplasmático.

Outros FCRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro são abrangidos pelo termo “FcR” na presente invenção. Os FcRs também podem aumentar a meia-vida sérica dos anticorpos.

[088] Conforme usado neste documento, “porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” e “homologia” com relação a uma sequência de peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo referem-se à porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência específica de peptídeo ou polipeptídeo, após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas (gaps), se necessário, para atingir a identidade percentual máxima da sequência e sem considerar quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, tais como o uso de softwares de computador disponíveis ao público, tal como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign® (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas.

[089] O termo “competir” quando usado no contexto de anticorpos (por exemplo, anticorpos neutralizantes) que competem pelo mesmo epítopo significa a competição entre o anticorpo, conforme determinado por um ensaio em que o anticorpo sendo testado previne ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação específica de uma molécula de referência (por exemplo, um ligante ou um anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, SIRPβ1 ou um fragmento deste). Diversos tipos de ensaios de ligação competitiva podem ser usados para determinar se o anticorpo compete com outro, por exemplo: radioimunoensaio (RIA) direto ou indireto em fase sólida, ensaio imunoenzimático direto ou indireto (EIA), (vide, por exemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology. 2:242-253); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (vide, por exemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619)

ensaio de marcação direto em fase sólida, ensaio sanduíche marcado em fase sólida (vide, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA com marcação direta em fase sólida utilizando o marcador 125I (vide, por exemplo, Morel et al., 1988, Molec.

Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (vide, por exemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); e RIA com marcação direta (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células contendo qualquer um destes, um anticorpo de teste não marcado e um anticorpo de referência marcado. A inibição competitiva é mediada pela determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença do anticorpo teste. Normalmente, o anticorpo de teste está presente em excesso. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos competidores) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento estérico. Detalhes adicionais relativos a métodos para determinar a ligação competitiva são fornecidos nos exemplos apresentados na presente invenção. Normalmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, ele irá inibir (por exemplo, reduzir) a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5% e/ou perto de 100%.

[090] Como utilizado neste documento, uma “interação” entre uma polipeptídeo SIRPβ1 e um segundo polipeptídeo abrange, sem limitação, interação proteína-proteína, interação física, interação química, ligação, ligação covalente e ligação iônica. Como utilizado neste documento, um anticorpo “inibe a interação” entre dois polipeptídeos quando o anticorpo interrompe, reduz ou elimina completamente uma interação entre os dois polipeptídeos. Um anticorpo da presente descrição ou fragmento do mesmo, “inibe a interação” entre dois polipeptídeos quando o anticorpo ou fragmento do mesmo se liga a um dos dois polipeptídeos. Em alguns exemplos de realização, a interação pode ser inibida por pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5% e/ou perto de 100%.

[091] O termo “epítopo” inclui qualquer determinante capaz de ser ligado por um anticorpo. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo que tem como alvo esse antígeno e, quando o antígeno é um polipeptídeo, inclui aminoácidos específicos que contatam diretamente o anticorpo. Na maioria das vezes, os epítopos residem em polipeptídeos, mas, em alguns casos, podem residir em outros tipos de moléculas, como ácidos nucleicos. Os determinantes epitópicos podem incluir agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativos, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou sulfonila e podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Geralmente, os anticorpos específicos para um determinado antígeno alvo reconhecerão preferencialmente um epítopo no antígeno alvo em uma mistura complexa de polipeptídeos e/ou macromoléculas.

[092] Um anticorpo “agonista” ou um anticorpo “ativador” (ou ainda ‘de ativação’) é um anticorpo que induz (por exemplo, aumenta) uma ou mais atividades ou funções do antígeno após o anticorpo se ligar ao antígeno.

[093] Um anticorpo “antagonista” ou anticorpo “bloqueador” ou anticorpo “inibidor” (inibitório) é um anticorpo que reduz, inibe e/ou elimina (por exemplo, diminui) a ligação ao antígeno de um ou mais ligantes após o anticorpo se ligar ao antígeno, e/ou que inibe e/ou abole (por exemplo, diminui) uma ou mais atividades ou funções do antígeno após o anticorpo se ligar ao antígeno. Em alguns exemplos de realização, anticorpos antagonistas ou anticorpos bloqueadores ou anticorpos inibidores inibem substancialmente ou completamente a ligação do antígeno a um ou mais ligantes e/ou uma ou mais atividades ou funções do antígeno.

[094] Um anticorpo “isolado”, como um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição, é aquele que foi identificado, separado e/ou recuperado de um componente de seu meio de produção (por exemplo, naturalmente ou de forma recombinante). De preferência, o polipeptídeo isolado está livre de associação a todos os outros componentes contaminantes do seu meio de produção. Os componentes contaminantes do seu meio de produção, como os resultantes de células transfectadas recombinantes, são materiais que tipicamente interferem nas utilizações diagnósticas, terapêuticas ou de pesquisa para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em exemplos de realização preferenciais, o polipeptídeo será purificado (1) até mais de 95% em peso do anticorpo, tal como determinado, por exemplo, pelo método de Lowry, e, em alguns exemplos de realização, até mais de 99% em peso; (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N- terminal através da utilização de, por exemplo, um sequenciador de copo giratório ou (3) até a homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células T recombinantes, desde que, pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, contudo, um polipeptídeo ou anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[095] Uma molécula de ácido nucleico “isolada” que codifica um anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição, é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada no meio em que foi produzida. De preferência, o ácido nucleico isolado está livre de associação a todos os componentes associados ao meio de produção. As moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os polipeptídeos e anticorpos deste documento estão em uma forma diferente da forma ou configuração na qual são encontradas na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas são, portanto, distinguidas do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos e anticorpos deste documento existentes naturalmente nas células.

[096] O termo “vetor”, da forma utilizada na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a um DNA de fita dupla circular ao qual, segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor fago. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genoma viral. Determinados vetores são capazes de realizar replicação autônoma na célula hospedeira a qual foram introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, sendo, desta forma, replicado junto com o genoma hospedeiro. Adicionalmente, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são denominados na presente invenção como “vetores de expressão recombinantes” ou simplesmente, “vetores de expressão”. Em geral, os vetores de expressão para uso em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente presentes na forma de plasmídeos. De acordo com o presente relatório descritivo, os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser utilizados de forma alternada, sendo que o termo “plasmídeo” é a forma de vetor mais comumente utilizada.

[097] “Polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, utilizada na apresente invenção de forma alternada, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser deoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou análogos destes ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero pela DNA ou RNA polimerase ou por uma reação sintética.

[098] Uma “célula hospedeira” inclui uma célula de cultura ou uma célula individual que pode ser ou ter sido um receptor para vetor(es) para a incorporação de inserções de polinucleotídeos. As células hospedeiras incluem a descendência de uma única célula hospedeira e a descendência pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento do DNA genômico) à célula de origem devido a uma mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo(s) da presente invenção.

[099] “Veículos” conforme utilizado no presente incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes e/ou estabilizantes, que são atóxicos para as células ou para os mamíferos que são expostos nas mesmas dosagens e concentrações utilizadas.

[100] Conforme usado neste documento, o termo “prevenção”; inclui o fornecimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença, distúrbio ou condição específica em um indivíduo. Um indivíduo pode estar predisposto a, suscetível a, uma doença, distúrbio ou condição específica ou correr o risco de desenvolver tal doença, distúrbio ou condição, mas ainda não foi diagnosticado com a doença, distúrbio ou condição.

[101] Conforme usado neste documento, um indivíduo “em risco” de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição específica pode ou não ter uma doença ou sintomas da doença detectáveis, e pode ou não ter exibido uma doença ou sintomas detectáveis antes dos métodos de tratamento descritos neste documento. “Em risco” denota que um indivíduo tem um ou mais fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que se correlacionam com o desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição específica, como é conhecido na técnica. Um indivíduo com um ou mais desses fatores de risco tem maior probabilidade de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição específica do que um indivíduo sem um ou mais desses fatores de risco.

[102] Como utilizado neste documento, o termo “tratamento” refere-se à intervenção clínica projetada para modificar o curso natural do indivíduo sendo tratado durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuir a taxa de progressão, melhorar ou diminuir o estado patológico e remissão ou prognóstico aprimorado de uma doença, distúrbio ou condição específica. Um indivíduo é “tratado” com sucesso, por exemplo, se um ou mais sintomas associados a uma doença, distúrbio ou condição específica são mitigados ou eliminados.

[103] Uma “quantidade eficaz” refere-se a, pelo menos, uma quantidade eficaz nas dosagens e períodos de tempo necessários para alcançar o resultado profilático ou terapêutico desejado. Uma quantidade eficaz pode ser fornecida em uma ou mais administrações. Uma quantidade eficaz no presente documento pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do tratamento de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade eficaz também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do tratamento são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Para uso profilático, resultados benéficos ou desejados incluem resultados tais como a eliminação ou redução do risco, diminuição da gravidade ou atraso do aparecimento da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos tais como a diminuição de um ou mais sintomas resultantes da doença, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuição da dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, potencialização do efeito de outro medicamento, tal como visando o retardo da progressão da doença, e/ou prolongando a sobrevida. Uma quantidade eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar o tratamento profilático ou terapêutico direta ou indiretamente. Como é compreendido no contexto clínico, uma quantidade eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma “quantidade eficaz” pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos e um único agente pode ser considerado como dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou for atingido.

[104] Um “indivíduo” para fins de tratamento, prevenção ou redução de risco refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda e zoológico, de esporte ou animais de estimação, como cães, cavalos, coelhos, gado, porcos, hamsters, gerbil, camundongos, furões, ratos, gatos e similares. Em alguns exemplos de realização, o indivíduo é humano.

[105] Conforme usado neste documento, a administração “em conjunto” com outro composto ou composição inclui administração simultânea e/ou administração em diferentes momentos. A administração em conjunto também abrange a administração como uma coformulação ou administração como composições separadas, incluindo em diferentes frequências ou intervalos de dosagem, e usando a mesma via de administração ou diferentes vias de administração. Em alguns exemplos de realização, a administração em conjunto é a administração como parte do mesmo regime de tratamento.

[106] O termo “cerca de” ou “aproximadamente”, como utilizado no presente documento, refere-se ao intervalo (faixa) de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pela pessoa versada neste campo técnico. Em referência a “cerca de” um valor ou parâmetro no presente documento inclui (e descreve) exemplos de realização que são dirigidos a esse valor ou parâmetro per se.

[107] Como utilizado no presente e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um” e “o, a” incluem a referência ao plural, a menos que o contexto indique claramente de outra maneira. Por exemplo, a referência a um “anticorpo” é uma referência a de um a muitos anticorpos, tais como quantidades molares, e inclui equivalentes dos mesmos conhecidos pelos versados na técnica, e assim por diante.

[108] Entende-se que aspectos e exemplos de realização da presente descrição descritos no presente documento incluem “compreendendo”, “consistindo” e “consistindo essencialmente de” aspectos e exemplos de realização.

I. ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1

[109] São fornecidos anticorpos anti-SIRPβ1. Os anticorpos fornecidos são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento dos distúrbios mediados por SIRPβ1.

[110] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação é um agonista da atividade de SIRPβ1. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à SIRPα humana. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à SIRPγ humana. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à isoforma 3 da SIRPβ1 humana. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti- SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à SIRPβ1 de camundongo e/ou SIRPβ1 de macacos cinomolgos. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação agoniza a atividade de SIRPβ1 em monócitos CD14-positivos. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação induz a explosão respiratória em células imunes, tais como neutrófilos, monócitos, e/ou macrófagos. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação induz fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação aumenta ou aumenta as propriedades antitumorais ou a atividade de neutrófilos.

[111] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação recruta células imunes. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação induz a fosforilação syk. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação induz a fosforilação de syk quando agrupado por células adjacentes que expressam receptores Fc gama.

[112] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo SIRPβ1 da presente divulgação regula negativamente a expressão de SIRPβ1 na superfície de uma célula. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo SIRPβ1 da presente divulgação não regula negativamente a expressão de SIRPβ1 na superfície de uma célula. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo SIRPβ1 da presente divulgação bloqueia a ligação de um ligante à SIRPβ1. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo SIRPβ1 da presente divulgação não bloqueia a ligação de um ligante à SIRPβ1.

[113] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que tem uma ou mais propriedades selecionadas a partir de: a) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPα humana; b) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPγ humana; c) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à isoforma 3 da SIRPβ1 humana; d) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPβ1 de camundongo; e) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPβ1 de macaco cinomolgo; f) agoniza a atividade de SIRPβ1 in vitro e/ou in vivo em monócitos positivos para CD14; g) induz ou aumenta a explosão respiratória em células imunes, tais como neutrófilos e/ou monócitos de maneira in vitro e/ou in vivo; h) induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vitro e/ou in vivo; i) induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas in vitro e/ou in vivo; j) induz ou aumenta a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais in vitro e/ou in vivo; k) induz ou aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo; l) regula positivamente a expressão de TREM2 em macrófagos in vitro e/ou in vivo; m) aumenta a viabilidade de macrófagos in vitro e/ou in vivo, sozinho e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti-TREM2; e n) aumenta a viabilidade de células dendríticas in vitro e/ou in vivo.

[114] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que possui as seguintes propriedades: a) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPα humana; b) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPγ humana; c) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à isoforma 3 da SIRPβ1 humana; d) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPβ1 de camundongo; e) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPβ1 de macaco cinomolgo; f) agoniza a atividade de SIRPβ1 in vitro e/ou in vivo em monócitos positivos para CD14; g) induz ou aumenta a explosão respiratória em células imunes, tais como neutrófilos e/ou monócitos de maneira in vitro e/ou in vivo; h) induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vitro e/ou in vivo; i) induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas in vitro e/ou in vivo; j) induz ou aumenta a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais in vitro e/ou in vivo; o) induz ou aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo; p) regula positivamente a expressão de TREM2 em macrófagos in vitro e/ou in vivo; q) aumenta a viabilidade de macrófagos in vitro e/ou in vivo, sozinho e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti-TREM2; e k) aumenta a viabilidade de células dendríticas in vitro e/ou in vivo.

A. ANTICORPOS EXEMPLARES E OUTROS EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DE ANTICORPO

[115] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (b) HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (d) HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8; (e) HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8; e (f) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8.

[116] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3, em que: (a) HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (b) HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H2 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H3 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (d) HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8; (e) HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L2 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8; e (f) HVR- L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L3 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8.

[117] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo seis HVRs de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB-20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB- 29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB-41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB- 50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2- 11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB- 40-21 (mostrado nas Tabelas 3, 4, 8, e 9).

[118] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo seis HVRs de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB- 1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21 (mostrado nas Tabelas 3, 4, 8, e 9).

[119] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo seis HVRs de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB- 2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40- 18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21 (mostrado nas Tabelas 8 e 9).

[120] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo seis HVRs de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-3, SB-2-8, e SB-8-13 (mostrado nas Tabelas 8 e 9).

[121] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 228; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 238; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

[122] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 229; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 239; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

[123] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 229; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 240; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

[124] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 229; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 241; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

[125] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 230; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 242; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[126] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 231; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[127] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 232; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 244; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[128] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 245; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[129] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 230; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 242; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 253; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[130] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

[131] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 234; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 247; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

[132] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 248; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

[133] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 254; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

[134] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 235; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 249; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69.

[135] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 236; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 250; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69.

[136] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 237; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 251; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69.

[137] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 236; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 252; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69.

[138] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (b) HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H2 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H3 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende a HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB-20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB- 29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB-41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB- 50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2- 11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB- 40-21 (mostrado nas Tabelas 4 e 9). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende a HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB- 1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21 (mostrado nas Tabelas 4 e 9). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende a HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10,

SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21 (exibida na Tabela 9). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende a HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-3, SB-2-8, e SB-8-13 (exibida na Tabela 9). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 229; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 239; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

125. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 231; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.

[139] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8; (b) HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L2 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8; (c) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L3 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 compreende HVR-L1, HVR–L2, e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB-

20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB-29, SB-30,

SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB-

41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB-50, SB-1-2,

SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13,

SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21

(mostrado nas Tabelas 3 e 8). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende HVR-L1, HVR–L2, e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7,

SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-

1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15,

SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21 (mostrado nas Tabelas 3 e 8). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende HVR-L1, HVR–L2, e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11,

SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-

21 (exibida na Tabela 8). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-

SIRPβ1 compreende HVR-L1, HVR–L2, e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-3, SB-2-8, e SB-8-13 (exibida na Tabela 8). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende (a)

HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (b)

HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (c)

HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende (a)

HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (b)

HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (c)

HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende (a)

HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (b)

HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

[140] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVRs selecionadas a partir de (i) HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9, (ii) HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVRs selecionadas a partir de (i) HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8, (ii) HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8, e (iii) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8.

[141] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9, (ii) HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9, e (iii) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8, (ii) HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8, e (iii) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8.

[142] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo um domínio VH compreendendo HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H2, e um domínio VL compreendendo HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3, em que HVR-H1, HVR-H2, HVR- H2, HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3 são as HVRs de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB-20, SB-21, SB- 22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB-29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB-41, SB-42, SB- 43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB-50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1- 4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8- 15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21 (mostrado nas Tabelas 3, 4, 8, e 9).

[143] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo um domínio VH compreendendo HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H2, e um domínio VL compreendendo HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3, em que HVR-H1, HVR-H2, HVR- H2, HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3 são as HVRs de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21 (mostrado nas Tabelas 3, 4, 8, e 9).

[144] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo um domínio VH compreendendo HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H2, e um domínio VL compreendendo HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3, em que HVR-H1, HVR-H2, HVR- H2, HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3 são as HVRs de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21 (mostrado nas Tabelas 8 e 9).

[145] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo um domínio VH compreendendo HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H2, e um domínio VL compreendendo HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3, em que HVR-H1, HVR-H2, HVR- H2, HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3 são as HVRs de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-3, SB-2-8, e SB-8-13 (mostrado nas Tabelas 8 e 9).

[146] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 229; (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 239; (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; e (b) um domínio VL que compreende (iv) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (v) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (vi) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

[147] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 231; (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243; (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; e (b) um domínio VL que compreende (iv) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (v) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (vi) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[148] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti-SIRPβ1 compreendendo (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233; (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246; (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131; e (b) um domínio VL que compreende (iv) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (v) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (vi) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

[149] Em outro aspecto, um anticorpo anti-SIRPβ1 compreende uma sequência do domínio variável de cadeia pesada (V H) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 ou

382. Em certos exemplos de realização, uma sequência VH possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363 ou 365 contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções com relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti- SIRPβ1 compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se à SIRPβ1. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido, e/ou deletado na SEQ ID NO: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309,

311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 ou 382. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 5 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 ou 382. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-SIRPβ1 compreende a sequência VH de SEQ ID NO: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 ou 382, incluindo modificações pós- traducionais de tais sequências. Em um exemplo de realização específico, a V H compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (b) HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 4 e/ou Tabela 9.

[150] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267, 269, 271, 273, 275, 277, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292,

294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324,

326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356,

358, 360, 362, 364 ou 370. Em certos exemplos de realização, uma sequência

VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%

ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267,

269, 271, 273, 275, 277, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298,

300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330,

332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362,

364 ou 370, contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras),

inserções ou deleções com relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-SIRPβ1 compreendendo tal sequência retém a capacidade de ligar-se à SIRPβ1. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 267, 269,

271, 273, 275, 277, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300,

302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332,

334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364 ou 370. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 5 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 267, 269, 271, 273, 275,

277, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306,

308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338,

340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364 ou 370. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-SIRPβ1 compreende a sequência VL de SEQ ID NO: 267, 269,

271, 273, 275, 277, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300,

302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364 ou 370, incluindo modificações pós-traducionais de tais sequências.

Em um exemplo de realização específico, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8; (b) HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8; e (c) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 exibida na Tabela 3 e/ou Tabela 8.

[151] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma V L como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em alguns exemplos de realização, são fornecidos na presente invenção anticorpos anti- SIRPβ1, em que tal anticorpo compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma VL como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma sequência VH selecionada a partir das SEQ ID NOs: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, e 382; e sequência VL selecionada a partir das SEQ ID NOs: 267, 269, 271, 273, 275, 277, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, e 370, incluindo modificações pós-traducionais dessas sequências. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e sequência VL de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB-20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-

26, SB-27, SB-28, SB-29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB-41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB- 47, SB-48, SB-49, SB-50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB- 2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40- 19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e sequência VL de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e sequência VL de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e sequência VL de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-3, SB-2-8, e SB-8-13. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende a sequência VH de SEQ ID NO: 367 e sequência VL de SEQ ID NO: 267. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende a sequência VH de SEQ ID NO: 372 e sequência VL de SEQ ID NO: 370. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende a sequência VH de SEQ ID NO: 376 e sequência VL de SEQ ID NO: 280.

[152] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 compete pela ligação com um anticorpo compreendendo uma sequência VH selecionada a partir das SEQ ID NOs: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, e 382, e uma sequência

VL selecionada a partir das SEQ ID NOs: 267, 269, 271, 273, 275, 277, 278,

280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310,

312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342,

344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, e 370. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compete pela ligação com um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-

7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-

18, SB-19, SB-20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28,

SB-29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-

39, SB-40, SB-41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49,

SB-50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-

2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e

SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compete pela ligação com um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2,

SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-

49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-

11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-

40-21. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compete pela ligação com um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4,

SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-

15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compete pela ligação com um anticorpo selecionado a partir de SB-1-3, SB-2-8, e SB-8-13. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compete pela ligação com um anticorpo compreendendo a sequência VH de SEQ ID NO: 367 e sequência

VL de SEQ ID NO: 267. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 compete pela ligação com um anticorpo compreendendo a sequência

VH de SEQ ID NO: 372 e sequência VL de SEQ ID NO: 370. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 compete pela ligação com um anticorpo compreendendo a sequência VH de SEQ ID NO: 376 e sequência VL de SEQ ID NO: 280.

[153] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se a um epítopo da SIRPβ1 humana, que é o mesmo ou que se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPβ1 compreendendo uma sequência VH selecionada a partir das SEQ ID NOs: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, e 382, e uma sequência VL selecionada a partir das SEQ ID NOs: 267, 269, 271, 273, 275, 277, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, e 370. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se a um epítopo da SIRPβ1 humana, que é o mesmo ou que se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPβ1 selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB- 20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB-29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB- 41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB-50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21.

[154] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se a um epítopo da SIRPβ1 humana, que é o mesmo ou que se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPβ1 selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-

1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8- 15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se a um epítopo da SIRPβ1 humana, que é o mesmo ou que se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPβ1 selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2- 11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-

21. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se a um epítopo da SIRPβ1 humana, que é o mesmo ou que se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPβ1 selecionado a partir de SB-1-3, SB-2-8, e SB-8-13. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo da SIRPβ1 humana, que é o mesmo ou que se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPβ1 compreendendo a sequência VH de SEQ ID NO: 367 e sequência VL de SEQ ID NO: 267. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo da SIRPβ1 humana, que é o mesmo ou que se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPβ1 compreendendo a sequência VH de SEQ ID NO: 372 e sequência VL de SEQ ID NO: 370. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo da SIRPβ1 humana, que é o mesmo ou que se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPβ1 compreendendo a sequência VH de SEQ ID NO: 376 e sequência VL de SEQ ID NO: 280. Em alguns exemplos de realização, o epítopo da SIRPβ1 humana é o mesmo epítopo ligado por um anticorpo anti-SIRPβ1.

[155] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 30 a 148 de SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 30 a 136 de SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 30 a 80 de SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 40 a 90 de SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 50 a 100 de SEQ ID NO: 1. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 60 a 110 de SEQ ID NO: 1._ Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga- se a um epítopo dentro dos aminoácidos 70 a 120 de SEQ ID NO: 1._ Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 80 a 130 de SEQ ID NO: 1._ Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1 liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 90 a 140 de SEQ ID NO: 1.

[156] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPβ1 de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima é um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo humanizado e/ou humano. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPβ1 é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab’, scFv, diacorpo (diabody) ou F(ab’)2. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPβ1 é um anticorpo substancialmente completo (de comprimento total), por exemplo, um anticorpo IgG1, anticorpo IgG2a ou outra classe de anticorpo ou isotipo conforme definido no presente pedido.

[157] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-SIRPβ1, de acordo com qualquer uma dos exemplos de realização acima, pode incorporar qualquer uma das características isoladamente ou em combinação, conforme descrito nas Seções 1-7 abaixo.

(1) AFINIDADE DE LIGAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-SIRPβ1

[158] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem uma constante de dissociação (KD) <1 μM, <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,1 nM, <0,01 nM ou <0,001 nM (por exemplo,10-8 M ou menos, por exemplo, de10-8 M a10-13 M, por exemplo, de10-9 M a10-13 M). As constantes de dissociação podem ser determinadas por qualquer técnica analítica, incluindo qualquer técnica bioquímica ou biofísica, tal como ELISA, ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria BioLayer (consultar, por exemplo, Octet System por ForteBio), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), calorimetria de varredura diferencial (DSC), dicroísmo circular (CD), análise de fluxo interrompido e análise colorimétrica ou análises de fusão com proteína fluorescente. Em um exemplo de realização, a KD é medida por um ensaio de ligação ao antígeno radiomarcado (RIA). Em alguns exemplos de realização, um RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno, por exemplo, conforme descrito em Chen et al. J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)). Em alguns exemplos de realização, o valor KD é medido usando um ensaio de ressonância plasmônica de superfície BIACORE, por exemplo, um ensaio usando um instrumento BIACORE-2000 ou um instrumento BIACORE-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25ºC com antígeno imobilizado chips CM5 em ~ 10 unidades de resposta (RU). Em alguns exemplos de realização, o KD é medido usando um sistema ForteBio Octet® Red384 (ForteBio, Menlo Park, CA), por exemplo, conforme discutido nos exemplos da presente invenção.

[159] Em alguns exemplos de realização, o KD é determinado usando um anticorpo monovalente (por exemplo, um Fab) ou um anticorpo de comprimento total (completo). Em alguns exemplos de realização, o valor de KD é determinado usando um anticorpo de comprimento total em uma forma monovalente.

(2) FRAGMENTOS DE ANTICORPOS

[160] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv e scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, consulte Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão dos fragmentos scFv, consulte, por exemplo, o documento WO 93/16185; e as

Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para uma discussão de fragmentos Fab e F(ab')2 compreendendo resíduos de epítopo de ligação do receptor de recuperação e tendo meia-vida in vivo aprimorada, vide a Patente US

5.869.046.

[161] Os diabodies (diacorpos) são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos.

Consulte, por exemplo, EP404097; WO 1993/01161; Hudson et al. Nat. Med.

9:129- 134 (2003). Os triabodies (triacorpos) e tetrabodies (tetracorpos) também estão descritos em Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinadas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (consulte, por exemplo, a Patente US 6248516).

[162] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, mas não se limitando à digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito neste documento.

(3) ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS

[163] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um anticorpo quimérico.

Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente US.

4.816.567. Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em ainda outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe trocada”, em que a classe ou subclasse foi alterada daquela do anticorpo de origem. Anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno destes.

[164] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade em seres humanos, enquanto mantém a especificidade e afinidade do anticorpo não humano precursor. Em certos exemplos de realização, um anticorpo humanizado é substancialmente não imunogênico em humanos. Em certos exemplos de realização, um anticorpo humanizado tem substancialmente a mesma afinidade para um alvo que um anticorpo de outra espécie da qual o anticorpo humanizado é derivado.

Consulte, por exemplo, as Patentes US 5.530.101, US 5.693.761; US

5.693.762; e US 5.585.089. Em certos exemplos de realização, os aminoácidos de um domínio variável de anticorpo que podem ser modificados sem diminuir a afinidade nativa do domínio de ligação ao antígeno enquanto reduzem sua imunogenicidade são identificados. Vide, por exemplo, as Patentes US

5.766.886 e US 5.869.619. De modo geral, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, nos quais as HVRs (ou porções destas), são derivadas de um anticorpo não humano e as FRs (ou porções destas) são derivadas das sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá adicionalmente pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em alguns exemplos de realização, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos da HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[165] Anticorpos humanizados e métodos de fazê-los são revistos, por exemplo, em Almagro et al. Front. Biosci. 13:161 9-1633 (2008), e são descritos ainda, por exemplo, nas Patentes US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 e US 7.087.409. As regiões estruturais (frameworks) humanas que podem ser usadas para a humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões estruturais selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (vide, por exemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); e Presta et al., J.

Immunol. 151:2623 (1993)); regiões estruturais (mutadas somaticamente) maduras humanas ou regiões estruturais da linhagem germinativa (vide, por exemplo, Almagro e Fransson Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al. J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al. J. Biol. Chem.

271:22611-22618 (1996)).

(4) ANTICORPOS HUMANOS

[166] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um anticorpo humano.

Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica. Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk et al. Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) e Lonberg Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

[167] Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. É possível manipular cepas de camundongo deficientes na produção de anticorpos de camundongos com grandes fragmentos dos loci de Ig humanas na expectativa de que tais camundongos produzam anticorpos humanos na ausência de anticorpos de camundongo. Grandes fragmentos de Ig humanas podem preservar uma grande diversidade de gene variável, bem como a regulação adequada de produção e de expressão de anticorpos. Através da exploração da maquinaria de camundongo para diversificação de anticorpo e seleção e a falta de tolerância imunológica a proteínas humanas, o repertório de anticorpo humano reproduzido nestas cepas de camundongo podem produzir anticorpos de afinidade elevada completamente humanos contra qualquer antígeno de interesse, incluindo antígenos humanos. Usando a tecnologia de hibridomas, mAbs humanos antígeno-específicos com a especificidade desejada podem ser prontamente produzidos e selecionados. Alguns métodos exemplificativos são descritos na Patente US 5.545.807, EP 546073 e EP 546073. Consulte também, por exemplo, as Patentes US 6.075.181 e US 6.150.584 descrevendo a tecnologia XENOMOUSE®; Patente US 5.770.429 descrevendo a tecnologia HUMAB®; a Patente US 7.041.870 descrevendo a tecnologia K-M MOUSE® e a Publicação do Pedido de Patente US 2007/0061900, descrevendo a tecnologia VELOCIMOUSE®. As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por tais animais podem ser modificadas ainda, por exemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.

[168] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos baseados em hibridoma. As linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas. (vide, por exemplo, Kozbor J. Immunol.

133:3001 (1984) e Boerner et al. J. Immunol. 147:86 (1991)). Os anticorpos humanos gerados através da tecnologia do hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1 03:3557-3562 (2006). Os métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente US 7.189.826 (descrevendo a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhagens de células de hibridoma). A tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers et al.

Histology and Histopathology 20(3) :927-937 (2005) e Vollmers et al. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91 (2005).

Os anticorpos humanos também podem ser gerados por meio do isolamento das sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fago derivadas de humanos. Tais sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas de seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.

[169] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é um anticorpo humano isolado por métodos in vitro e/ou triagem de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Exemplos adequados incluem, mas não estão limitados a exibição de fagos (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed) exibição de ribossomo (CAT), tecnologias de plataformas baseadas em leveduras (Adimab) e similares. Em certos métodos de exibição de fago, repertórios de genes de VH e VL são separadamente clonados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e aleatoriamente recombinados em bibliotecas de fagos, que podem então ser triadas por fagos de ligação ao antígeno, conforme descrito em Winter et al. Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994). Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida no estado arte para a produção de bibliotecas de exibição por fago e a seleção tais bibliotecas para anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Consulte também Sidhu et al. J. Mol. Biol. 338(2): 299-310, 2004; Lee et al. J. Mol. Biol. 340(5): 1073- 1093, 2004; Fellouse Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); e Lee et al. J. Immunol. Methods 284( - 2):1 19-132 (2004). O fago normalmente exibe fragmentos de anticorpos, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) quanto como fragmentos Fab. As bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno, sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório inicial (naive) pode ser clonado (por exemplo, a partir de humano) para fornecer uma única fonte de anticorpos humanos, para uma ampla faixa de antígenos não próprios (non-self) e também próprios (self), sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas iniciais (naïves) podem também ser produzidas sinteticamente por meio de clonagem de segmentos de gene V não rearranjados a partir de células tronco, e utilizando primers de PCR que compreendem sequências aleatórias para codificar as regiões HVR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381-388, 1992. As publicações de patentes descrevendo bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patente US 5.750.373, e Publicações de Patentes US 2007/0292936 e US 2009/0002360. Os anticorpos isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos neste documento.

(5) REGIÕES CONSTANTES INCLUINDO REGIÕES FC

[170] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos no presente, o anticorpo compreende um Fc. Em alguns exemplos de realização, o Fc é um isotipo de IgG1, IgG2, IgG3 e/ou IgG4 humana. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é da classe IgG, da classe IgM ou da classe IgA.

[171] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem um isotipo IgG2. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo contém uma região constante de IgG2 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante de IgG2 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo induz uma ou mais atividades de SIRPβ1 ou independentemente da ligação a um receptor Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se a um receptor Fc inibitório. Em certos exemplos de realização, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc-gama IIB inibitório (FcγIIB).

[172] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem um isotipo IgG1. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo contém uma região constante de IgG1 de camundongo. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo contém uma região constante de IgG1 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante da IgG1 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se a um receptor Fc inibitório. Em certos exemplos de realização, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc-gama IIB inibitório (FcγIIB).

[173] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem um isotipo IgG4. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo contém uma região constante de IgG4 humana. Em alguns exemplos de realização, a região constante de IgG4 humana inclui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se a um receptor Fc inibitório. Em certos exemplos de realização, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc-gama IIB inibitório (FcγIIB).

[174] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem um isotipo IgG2/4 híbrido. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo inclui uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 118 a 260 de acordo com a numeração EU da IgG2 humana e os aminoácidos 261-447 de acordo com a numeração EU da IgG4 humana (WO 1997/11971; WO 2007/106585).

[175] Em alguns exemplos de realização, a região Fc aprimora o agrupamento sem ativar o complemento em comparação com um anticorpo correspondente compreendendo uma região Fc que não compreende as substituições de aminoácidos. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo induz uma ou mais atividades de um alvo especificamente ligado pelo anticorpo. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo liga-se à SIRPβ1.

[176] Também pode ser desejável modificar um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente descrição para modificar a função efetora e/ou aprimorar a meia-vida sérica do anticorpo. Por exemplo, o sítio de ligação ao receptor Fc na região constante pode ser modificado ou mutado para remover ou reduzir a afinidade de ligação a certos receptores Fc, como FcγRI, FcγRII, e/ou FcγRIII para reduzir a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo.

Em alguns exemplos de realização, a função efetora é prejudicada pela remoção da N-glicosilação da região Fc (por exemplo, no domínio CH2 da IgG) do anticorpo. Em alguns exemplos de realização, a função efetora é prejudicada pela modificação de regiões como 233-236, 297 e/ou 327-331 da IgG humana, conforme descrito no documento WO 99/58572 e Armor et al.

Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al. J. Immunology 164:1925- 1933 (2000). Em outros exemplos de realização, também pode ser desejável modificar um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição para modificar a função efetora para melhorar a seletividade de busca contra o FcγRIIb contendo ITIM (CD32b) para aprimorar o agrupamento de anticorpos SIRPβ1 em células adjacentes sem ativar respostas humorais, incluindo citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos e fagocitose celular dependente de anticorpos.

[177] Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um epítopo de ligação tipo receptor de recuperação nos anticorpos (especialmente um fragmento de anticorpo), conforme descrito na Patente US

5.739.277, por exemplo. Da forma como utilizada no presente, a expressão “epítopo de ligação do receptor de recuperação” designa um epítopo da região

Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia vida da molécula de IgG in vivo no soro.

Outras Modificações Na Sequência De Aminoácidos (6) ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[178] Os multiespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes, incluindo aqueles no mesmo ou em outro polipeptídeo (por exemplo, um ou mais polipeptídeos SIRPβ1 da presente descrição). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo triespecífico. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo tetraespecífico. Tais anticorpos podem ser derivados de anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab’) 2). Em alguns exemplos de realização, o anticorpo multiespecífico compreende uma primeira região de ligação ao antígeno que se liga ao primeiro sítio na SIRPβ1 e compreende uma segunda região de ligação ao antígeno que se liga ao segundo sítio na SIRPβ1. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos multiespecíficos compreendem uma primeira região de ligação ao antígeno que se liga à SIRPβ1 e uma segunda região de ligação ao antígeno que se liga a um segundo polipeptídeo.

[179] São fornecidos neste documento anticorpos multiespecíficos que compreendem uma primeira região de ligação ao antígeno, em que a primeira região de ligação ao antígeno compreende as seis HVRs de um anticorpo descrito neste documento, que se liga à SIRPβ1 e uma segunda região de ligação ao antígeno que se liga a um segundo polipeptídeo. Em alguns exemplos de realização, a primeira região de ligação ao antígeno compreende a VH ou VL de um anticorpo descrito neste documento.

[180] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos multiespecíficos, o segundo polipeptídeo é um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo da presente invenção é conjugado a um peptídeo que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica.

Inúmeros antígenos são conhecidos na técnica que facilitam o transporte através da barreira hematoencefálica (vide, por exemplo, Gabathuler R.

Neurobiol. Dis. 37:48-57 (2010)). Esses segundos antígenos incluem, sem limitação, receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteínas 1 e 2 relacionadas ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LPR-1 e 2), receptor da toxina da difteria, incluindo CRM197 (um mutante não tóxico da toxina da difteria), TMEM 30(A) (Flippase), domínios de transdução de proteínas, tais como TAT, Syn-B ou penetratina, poliarginina ou peptídeos geralmente positivamente carregados, peptídeos Angiopep como ANG1005 (consulte, por exemplo, Gabathuler, 2010) e outras proteínas da superfície celular que são enriquecidas em células endoteliais da barreira hematoencefálica (consulte, por exemplo, Daneman et al. PLoS One 5(10):e13741 (2010)). Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é transferrina.

[181] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos multiespecíficos, o segundo polipeptídeo é uma proteína causadora de doenças selecionada a partir de beta amiloide, beta amiloide oligomérico, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos dos mesmos, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (fase de leitura aberta 72 no cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína príon, PrPSc, Huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase,

ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide de ilhotas, insulina, apolipoproteína A1, amiloide sérica A, medina, prolactina, transtiretina, lisozima, beta 2 microglobulina, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG (RAN) associados à repetição, peptídeos de repetição de diPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição prolina-alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR). Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é Tau. Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é Aβ. Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é TREM2. Em alguns exemplos de realização, o segundo polipeptídeo é α-sinucleína.

[182] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos multiespecíficos, o segundo polipeptídeo é um ligante e/ou proteína expressa em células imunes, em que o ligante e/ou proteína é selecionado a partir de CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA-4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, BTLA, KIR, GAL9, TIM3, A2AR, LAG-3 e fosfatidilserina.

[183] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos multiespecíficos, o segundo polipeptídeo é uma proteína, lipídeo, polissacarídeo ou glicolipídio expresso em uma ou mais células tumorais e qualquer combinação dos mesmos.

[184] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos multiespecíficos, o segundo polipeptídeo é um receptor do tipo imunoglobulina, como TREM2. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos multiespecíficos, o segundo polipeptídeo é um receptor do tipo imunoglobulina expresso em células da linhagem mieloide.

[185] O anticorpo multivalente contém pelo menos uma cadeia polipeptídica (e preferencialmente duas cadeias polipeptídicas), em que a cadeia polipeptídica compreende dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a cadeia ou cadeias polipeptídicas podem compreender VD1- (X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e n é 0 ou 1. Da mesma forma, a cadeia ou cadeias polipeptídicas podem compreender cadeia da região V H-CH1–ligante flexível–VH-CH1-Fc; ou cadeia da região V H- CH1-VH-CH1-Fc. O anticorpo multivalente na presente invenção, preferencialmente compreende ainda de pelo menos dois (e preferencialmente quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve.

O anticorpo multivalente da presente invenção pode, por exemplo, compreender entre cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve contemplados na presente invenção compreendem um domínio variável de cadeia leve e compreendem, opcionalmente, um domínio CL.

[186] As técnicas para produzir anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitadas a, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia pesada - cadeia leve de imunoglobulina com especificidades diferentes (consulte Milstein e Cuello Nature 305: 537 (1983), documento WO 93/08829 e Traunecker et al. EMBO J. 10: 3655 (1991)) e manipulação “knob-in-hole” (consulte, por exemplo, a Patente US

5.731.168). Vide também o documento WO 2013/026833 (CrossMab). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por efeitos de direção eletrostática de manipulação para a produção de moléculas Fc- heterodiméricas de anticorpos (WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos (consulte, por exemplo, Patente US 4.676.980); usando leucina; usando a tecnologia “diacorpo” (diabody) para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Hollinger et al. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993); e usando dímeros de cadeia única Fv (scFv) (consulte, por exemplo, Gruber et al. J. Immunol. 152: 5368 (1994)); e preparar anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, in Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

[187] Os anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação ao antígeno funcionais, incluindo “anticorpos octopus”, também são incluídos no presente documento (consulte, por exemplo, US 2006/0025576). O anticorpo no presente documento também inclui um “FAb de ação dupla” ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga a múltiplas SIRPβ1 (consulte, US 2008/0069820, por exemplo).

(7) VARIANTES DE ANTICORPOS

[188] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, são contempladas variantes de sequência de aminoácidos dos anticorpos. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo.

(I) VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E DELEÇÃO

[189] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, são fornecidas variantes de anticorpo com uma ou mais substituições de aminoácidos. As variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica o anticorpo ou pela síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo.

TABELA 1

SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

[190] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são obtidas por meio da seleção de substituições que diferem significativamente em seus efeitos sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: (1) Hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu (4) básico: His, Lys, Arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro; e (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[191] Por exemplo, as substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma das classes acima por um membro de outra classe. Esses resíduos substituídos podem ser introduzidos, por exemplo, em regiões do anticorpo que são homólogas com anticorpos não humanos ou nas regiões não homólogas da molécula.

[192] Ao fazer alterações no polipeptídeo ou anticorpo descrito neste documento, de acordo com certos exemplos de realização, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base nas suas características de hidrofobicidade e carga. São eles: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (−0,4); treonina (−0,7); serina (−0,8); triptofano (−0,9); tirosina (−1,3); prolina (−1,6); histidina (−3,2); glutamato (−3,5); glutamina (−3,5); aspartato (−3,5); asparagina (-3,5); lisina (−3,9); e arginina (−4,5).

[193] A importância do índice de aminoácido hidropático para conferir função biológica interativa numa proteína é compreendida na técnica.

Kyte et al. J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Sabe-se que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos com um índice ou pontuação hidropática semelhante e ainda manter uma atividade biológica semelhante. Ao fazer alterações com base no índice hidropático, em certos exemplos de realização, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2 está inclusa. Em certos exemplos de realização, aquelas que estão dentro de ± 1 são incluídas e, em certos exemplos de realização, aquelas dentro de ± 0,5 são incluídas.

[194] Também compreende-se a partir do estado da técnica que uma substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita de forma eficaz com base na hidrofilicidade, particularmente quando se pretende que a proteína ou peptídeo biologicamente funcional assim criado seja usado em exemplos de realização imunológicos, como no presente caso. Em determinados exemplos de realização, a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade e antigenicidade ou seja, com uma propriedade biológica da proteína.

[195] Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a esses resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0 ± 1); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (−0,5±1); alanina (−0,5); histidina (−0,5); cisteína (−1,0); metionina (−1,3); valina (−1,5); leucina (−1,8); isoleucina (−1,8); tirosina (−2,3); fenilalanina (−2,5) e triptofano (−3,4). Ao fazer alterações com base nos valores de hidrofilicidade semelhantes, em certos exemplos de realização, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 está inclusa, em certos exemplos de realização, aqueles que estão dentro de ± 1 estão inclusos, e em certos exemplos de realização, aqueles dentro de ± 0,5 estão inclusos. Também é possível identificar epítopos de sequências primárias de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Essas regiões também são referidas como “regiões de núcleo epitópico”.

[196] Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade dos anticorpos de se ligarem ao antígeno. Por exemplo, alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras conforme fornecidas neste documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas nas HVRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos que entram em contato com o antígeno nas HVRs. Em determinados exemplos de realização das sequências VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é inalterada ou contém não mais de uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[197] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carboxi-terminais que variam no comprimento de um resíduo até polipeptídeos compreendendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intrassequenciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N- terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo à uma enzima (por exemplo, ADEPT) ou um polipeptídeo que aumente a meia vida sérica do anticorpo.

[198] Qualquer resíduo da cisteína não envolvida na manutenção da conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e para impedir ligações cruzadas aberrantes. De forma inversa, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (em especial quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv).

(II) VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO

[199] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo é alterado para aprimorar ou reduzir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação em um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que um ou mais sítios de glicosilação é criado ou removido.

[200] A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou O- ligada. N-ligada refere-se à ligação da unidade de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeos asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da unidade de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desta forma, a presença de qualquer destas sequências de tripeptídeos no polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser utilizados.

[201] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é acompanhada, de forma conveniente, pela alteração da sequência de aminoácido de modo que esta sequência contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N- ligados). A alteração pode também ser feita através da adição de ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo ou polipeptídeo original (para sítios de glicosilação O-ligados).

[202] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, os carboidratos ligados a estes podem ser alterados. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado, biantenário que geralmente está ligado por uma ligação N a um Asn297 de acordo com a numeração Kabat do domínio C H2 da região Fc.. Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco/haste” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.

[203] Em um exemplo de realização, as variantes de anticorpos são fornecidas tendo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose anexada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Vide, por exemplo, as publicações dos pedidos de patente US 2003/0157108; US 2004/0093621.

Exemplos de publicações relacionadas a variantes de anticorpo “desfucosilado” ou “deficiente em fucose” incluem: US 2003/0157108; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Os exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos desfucosilados incluem células CHO Led 3 deficientes na fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch.

Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108) e linhas celulares nocautes, tais como para o gene alfa-1,6- fucosiltransferase, FUT8, células CHO nocautes (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) e Kanda et al. Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006)).

(III) REGIÕES CONSTANTES MODIFICADAS

[204] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo Fc é um anticorpo Fc isotípico e/ou com modificações. Em alguns exemplos de realização, o isotipo e/ou modificação de anticorpo Fc é capaz de se ligar ao receptor Fc gama.

[205] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos aqui, o Fc de anticorpo modificado é um Fc modificado de IgG1. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas a partir de N297A (Bolt S et al. (1993) Eur J Immunol 23:403-411), D265A (Shields et al. (2001) R. J. Biol.

Chem. 276, 6591–6604), L234A, L235A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92:11980-11984; Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-1543.

31; Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26), G237A (Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537-1543. 31; Xu et al. (2000) Cell Immunol, 200:16-26), C226S, C229S, E233P, L234V, L234F, L235E (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P331S (Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:20167-20172), S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T, e/ou T256E, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU.

[206] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende a mutação N297A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações D265A e N297A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações D270A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende mutações L234A e L235A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações L234A e G237A de acordo com a numeração EU.

Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações L234A e G237A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma ou mais (incluindo todas) mutações P238D, L328E, E233, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma ou mais mutações S267E/L328F de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma as mutações P238D, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma as mutações P238D, L328E, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma as mutações P238D, S267E, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende uma as mutações P238D, S267E, L328E, G237D, H268D, P271G e A330R de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações C226S, C229S, E233P, L234V, e L235A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações L234F, L235E, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende mutações S267E e L328F de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende a mutação S267E de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc compreende um substituto da cadeia constante pesada 1 (CH1) e região de dobradiça da IgG1 com CH1 e região de dobradiça da IgG2 (aminoácidos 118-230 de IgG2 de acordo com a numeração EU) com uma cadeia leve kappa (capa).

[207] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc inclui duas ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram o agrupamento de anticorpos sem ativar o complemento em comparação com um anticorpo correspondente com uma região Fc que não inclui as duas ou mais substituições de aminoácidos. Consequentemente, em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 é um anticorpo compreendendo uma região Fc, em que o anticorpo compreende uma substituição de aminoácidos na posição E430G e uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir de: L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S e qualquer combinação destes de acordo com a numeração EU.

Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, L243A, L235A e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e K322A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, A330S, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, A330S, e P331S de acordo com a numeração EU.

Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, e A330S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG1 compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, e P331S de acordo com a numeração EU.

[208] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 pode compreender ainda neste documento pode ser combinado com uma mutação A330L (Lazar et al. Proc Natl Acad Sci USA, 103:4005-4010 (2006)) ou uma ou mais mutações L234F, L235E e/ou P331S (Sazinsky et al. Proc Natl Acad Sci USA, 105:20167-20172

(2008)), de acordo com a convenção de numeração EU, para eliminar a ativação do complemento. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 pode ainda compreender um ou mais de A330L, A330S, L234F, L235E e/ou P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 pode compreender ainda uma ou mais mutações para potencializar a meia-vida do anticorpo no soro humano (por exemplo, uma ou mais (incluindo todas) mutações M252Y, S254T e T256E de acordo com a convenção de numeração EU). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1, o Fc modificado de IgG1 pode compreender ainda um ou mais de E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e/ou S440W, de acordo com a numeração EU.

[209] Outros aspectos da presente descrição referem-se a anticorpos com regiões constantes modificadas (ou seja, regiões Fc). Um anticorpo dependente da ligação ao receptor FcγR para ativar receptores alvo pode perder sua atividade agonista se for manipulado para eliminar a ligação ao FcγR (consulte, por exemplo, Wilson et al. Cancer Cell 19:101-113 (2011); Armour et al. Immunology 40:585-593 (2003); e White et al. Cancer Cell 27:138-148 (2015)). Como tal, é pensado que um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição com a especificidade correta do epítopo pode ativar o antígeno alvo, com efeitos adversos mínimos, quando o anticorpo tem um domínio Fc de um isotipo IgG2 humano (CH1 e região de dobradiça) ou outro tipo de domínio Fc que é capaz de ligar preferencialmente os receptores inibitórios de FcγRIIB r ou uma variação destes.

[210] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos aqui, o Fc de anticorpo modificado é um Fc modificado de IgG2. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG2 compreende uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG2 compreende contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, as uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas a partir de V234A (Alegre et al. Transplantation 57:1537-1543 (1994); Xu et al. Cell Immunol, 200:16-26 (2000)); G237A (Cole et al. Transplantation, 68:563-571 (1999)); H268Q, V309L, A330S, P331S (US 2007/0148167; Armour et al. Eur J Immunol 29: 2613-2624 (1999); Armour et al. The Haematology Journal 1(Suppl.1):27 (2000); Armour et al. The Haematology Journal 1(Suppl.1):27 (2000)), C219S, e/ou C220S (White et al.

Cancer Cell 27, 138-148 (2015)); S267E, L328F (Chu et al. Mol Immunol, 45:3926-3933 (2008)); e M252Y, S254T, e/ou T256E de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições V234A e G237A de acordo com a numeração EU.

Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições C219S ou C220S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições A330S e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições S267E e L328F de acordo com a numeração EU.

[211] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos C127S de acordo com a convenção de numeração EU (White et al., (2015) Cancer Cell 27, 138-148; Lightle et al. Protein Sci. 19:753-762 (2010); e WO

2008/079246). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o anticorpo tem um isotipo IgG2 com um domínio constante da cadeia leve Capa que compreende uma substituição de aminoácidos C214S de acordo com a convenção de numeração EU (White et al. Cancer Cell 27:138-148 (2015); Lightle et al. Protein Sci. 19:753-762 (2010); e WO 2008/079246).

[212] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos C220S de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fc modificados de IgG2, o anticorpo tem um isotipo IgG2 com um domínio constante da cadeia leve Capa que compreende uma substituição de aminoácidos C214S de acordo com a convenção de numeração EU.

[213] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos C219S de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG2, o anticorpo tem um isotipo IgG2 com um domínio constante da cadeia leve Capa que compreende uma substituição de aminoácidos C214S de acordo com a convenção de numeração EU.

[214] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG2, o Fc inclui um domínio constante 1 da cadeia pesada do isotipo IgG2 (CH1) e a região de dobradiça (White et al. Cancer Cell 27:138-148 (2015)). Em certos exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG2, o CH1 do isotipo IgG2 e a região de dobradiça compreendem a sequência de aminoácidos de 118-230 de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer dos Fcs modificados de IgG2, a região Fc do anticorpo compreende uma substituição de aminoácidos S267E, uma substituição de aminoácidos L328F ou ambos, e/ou uma substituição de aminoácidos N297A ou N297Q de acordo com a convenção de numeração EU.

[215] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG2, o Fc compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W, de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG2, o Fc pode compreender ainda uma ou mais mutações para potencializar a meia-vida do anticorpo no soro humano (por exemplo, uma ou mais (incluindo todas) mutações M252Y, S254T e T256E de acordo com a convenção de numeração EU ). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG2, o Fc pode ainda compreender A330S e P331S.

[216] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG2, o Fc é um Fc híbrido IgG2/4. Em alguns exemplos de realização, o Fc híbrido IgG2/4 compreende aa 118 a 260 de IgG2 e aa 261 a 447 de IgG4. Em alguns exemplos de realização de qualquer Fc modificado de IgG2, o Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições H268Q, V309L, A330S e P331S de acordo com a numeração EU.

[217] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais selecionadas a partir de A330L, L234F; L235E ou P331S de acordo com a numeração EU; e qualquer combinação destes.

[218] Em certos exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição de resíduo selecionada a partir de C127S, L234A, L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S, E345R, E430G, S440Y e qualquer combinação destes, de acordo com a numeração

EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, L243A, L235A e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e K322A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados por IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, A330S, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, A330S, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, e A330S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, K322A, e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições S267E e L328F de acordo com a numeração EU.

Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição C127S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG1 e/ou IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E345R, E430G e S440Y de acordo com a numeração EU.

[219] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos fornecidos aqui, o Fc de anticorpo modificado é um Fc modificado de IgG4. Em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG4 compreende uma ou mais modificações. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, o Fc modificado de IgG4 compreende contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, as uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas a partir de L235A, G237A, S229P, L236E (Reddy et al. J Immunol 164: 1925-1933(2000)), S267E, E318A, L328F, M252Y, S254T e/ou T256E de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc pode ainda compreender L235A, G237A e E318A de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc pode ainda compreender S228P e L235E de acordo com a convenção de numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc modificado de IgG4 pode ainda compreender S267E e L328F de acordo com a convenção de numeração EU.

[220] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc modificado de IgG4 compreende pode ser combinado com uma mutação S228P de acordo com a convenção de numeração EU (Angal et al. Mol Immunol. 30:105-108 (1993)) e/ou com uma ou mais mutações descritas em (Peters et al. J Biol Chem. 287(29):24525-33 (2012)) para potencializar a estabilização de anticorpos.

[221] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc modificado de IgG4 pode compreender ainda uma ou mais mutações para potencializar a meia- vida do anticorpo no soro humano (por exemplo, uma ou mais (incluindo todas) mutações M252Y, S254T e T256E de acordo com a convenção de numeração EU).

[222] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc compreende L235E de acordo com a numeração EU. Em certos exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição de resíduo selecionada a partir de C127S, F234A, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, E345R, E430G, S440Y e qualquer combinação destes, de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G, L243A, L235A e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e P331S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e K322A de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição E430 de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, a região Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E430G e K322S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG2, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições S267E e L328F de acordo com a numeração EU.

Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição C127S de acordo com a numeração EU. Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos Fcs modificados de IgG4, o Fc compreende uma substituição de aminoácidos nas posições E345R, E430G e S440Y de acordo com a numeração EU.

(8) OUTRAS MODIFICAÇÕES DO ANTICORPO

[223] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos, o anticorpo é um anticorpo derivado. O termo “derivado” refere-se a uma molécula que inclui uma modificação química diferente de uma inserção, deleção ou substituição de aminoácidos (ou ácidos nucleicos). Em certos exemplos de realização, os derivados compreendem modificações covalentes, incluindo, mas não se limitando a, uma ligação química com polímeros, lipídios ou outras porções orgânicas ou inorgânicas. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação ao antígeno quimicamente modificada pode ter uma meia-vida circulante maior do que uma proteína de ligação ao antígeno que não seja quimicamente modificada. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação ao antígeno quimicamente modificada pode ter capacidade de direcionamento melhorada para células, tecidos e/ou órgãos desejados. Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação ao antígeno é modificada covalentemente para incluir uma ou mais ligações de polímeros solúveis em água, incluindo, sem limitação, polietilenoglicol, polioxietilenoglicol ou polipropileno glicol. Consulte, por exemplo, as Patentes US 4640835, US 4496689, US 4301144, US 4670417, US 4791192 US e US

4179337. Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação ao antígeno derivada compreende um ou mais polímeros, incluindo, mas não se limitando a, monometóxi-polietileno glicol, dextrano, celulose, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, polivinil pirrolidona, poli-1, 3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), poli-(N-vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliois polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico, assim como misturas de tais polímeros.

[224] Em certos exemplos de realização, um derivado é modificado covalentemente com subunidades de polietileno glicol (PEG). Em certos exemplos de realização, um ou mais polímeros solúveis em água são ligados em uma ou mais posições específicas, por exemplo, no terminal amino, de um derivado. Em certos exemplos de realização, um ou mais polímeros solúveis em água são aleatoriamente ligados a uma ou mais cadeias laterais de um derivado. Em certos exemplos de realização, o PEG é usado para melhorar a capacidade terapêutica de uma proteína de ligação ao antígeno. Em certos exemplos de realização, o PEG é usado para melhorar a capacidade terapêutica de um anticorpo humanizado. Certos métodos são discutidos, por exemplo, na Patente US 6.133.426, que é incorporada no presente documento por referência para qualquer finalidade.

[225] Análogos de peptídeo geralmente são usados na indústria farmacêutica como fármacos não peptídicas com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Esses tipos de compostos não peptídicos são denominados “miméticos peptídicos” ou “peptidomiméticos”. Fauchere, J. Adv.

Drug Res., 15:29 (1986); e Evans et al. J. Med. Chem., 30:1229 (1987), os quais são incorporados neste documento por referência para qualquer finalidade. Tais compostos são frequentemente desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. Miméticos peptídicos que são estruturalmente semelhantes a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático semelhante.

Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipeptídeo de paradigma (ou seja, um polipeptídeo que possui uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica), tal como anticorpo humano, mas tem uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada a partir de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, - CH═CH-(cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) pode ser usada em certos exemplos de realização para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, os peptídeos restritos compreendendo uma sequência consenso ou uma variação de sequência consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992), incorporados neste documento por referência); por exemplo, pela adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.

[226] A conjugação de fármaco envolve o acoplamento de uma carga ou fármaco citotóxico (anticâncer) ativa e biológica a um anticorpo que direciona especificamente um determinado marcador tumoral (por exemplo, um polipeptídeo que, idealmente, é encontrada apenas nas células tumorais ou sobre as células tumorais). Os anticorpos rastreiam essas proteínas no corpo e ligam-se à superfície das células cancerígenas. A reação bioquímica entre o anticorpo e a proteína alvo (antígeno) dispara um sinal na célula tumoral, que absorve ou internaliza o anticorpo juntamente com a citotoxina. Após o ADC ser internalizado, o fármaco citotóxico é liberado e mata o câncer. Devido a esse direcionamento, o ideal é que o fármaco tenha efeitos colaterais menores e proporcione uma janela terapêutica mais ampla do que outros agentes quimioterápicos. As técnicas para conjugar anticorpos são divulgadas e conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Jane de Lartigue, Onc Live, 5 de Julho de 2012; ADC Review on antibody-drug conjugates; e Ducry et al. Bioconjugate Chemistry 21 (1):5-13 (2010).

II. ATIVIDADE DE ANTICORPO

[227] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à SIRPα humana. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à SIRPγ humana. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à isoforma 3 da SIRPβ1 humana. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à SIRPβ1 de camundongo. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à SIRPβ1 de macaco cinomolgo. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que se liga à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não se liga à isoforma 1 da SIRPβ1.

[228] Em alguns exemplos de realização, a ligação de um anticorpo anti-SIRPβ1 a um antígeno pode ser determinada usando um sistema ForteBio Octet® Red384 (ForteBio, Menlo Park, CA), por exemplo, conforme descrito no Exemplo 1. A ligação do anticorpo pode ser determinada usando, por exemplo, um fragmento Fab do anticorpo (para ligação monovalente) ou um anticorpo de comprimento total, tal como uma IgG (para ligação bivalente ou avidez). Um ensaio de ligação exemplar para anticorpos de comprimento total usando um sistema ForteBio Octet® Red384 é o seguinte. Os anticorpos são carregados em sensores AHQ. Os anticorpos carregados são então expostos ao antígeno, e a taxa de dissociação medida em tampão de ensaio em vários intervalos de tempo (tal como 3 minutos). Os dados cinéticos podem então ser ajustados usando um modelo de ligação no software de análise de dados fornecido com o sistema. Para medições de afinidade de fragmento Fab de anticorpo, em alguns exemplos de realização, um antígeno Fc pode ser carregado em sensores AHQ e, em seguida, exposto ao fragmento Fab do anticorpo. A velocidade de dissociação (off-rate) é medida como acima e os dados são analisados usando o software fornecido com o sistema.

[229] Em alguns exemplos de realização, é fornecido o anticorpo anti-SIRPβ1 que agoniza a atividade de SIRPβ1 em monócitos positivos para CD14 in vitro e/ou in vivo. Em alguns exemplos de realização, é fornecido o anticorpo anti-SIRPβ1 que agoniza in vitro a atividade de SIRPβ1 em monócitos positivos para CD14. Em alguns exemplos de realização, é fornecido o anticorpo anti-SIRPβ1 que agoniza in vivo a atividade de SIRPβ1 em monócitos positivos para CD14. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPβ1 agoniza a atividade SIRPβ1 em monócitos CD14-positivos in vitro em um ensaio no qual o anticorpo anti-SIRPβ1 é imobilizado em um suporte sólido, como uma placa de cultura ou ligado por um anticorpo secundário anti- IgG ou ligado pelo receptor Fc gama em uma célula acessória. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que agoniza in vivo a atividade de SIRPβ1 em monócitos CD14 positivos. Um exemplo não limitante de ensaio para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 agoniza a atividade SIRPβ1 em monócitos CD14-positivos in vitro é descrita nos Exemplos 3 e 4. Por exemplo, monócitos isolados são privados de energia por um período de tempo, como 4 horas, e então incubados com anticorpo anti- SIRPβ1, por exemplo, na presença de anticorpo anti-IgG. Após a incubação, as células são lisadas e a fosforilação de um ou mais dentre Syk, ERK, AKT, SIRPβ1 e/ou DAP12 é medida, por exemplo, usando um anticorpo antifosfotirosina e/ou antifosfoserina. Um aumento na fosforilação de um ou mais dentre Syk, ERK, AKT, SIRPβ1 e/ou DAP12 é indicativo de um aumento na atividade de SIRPβ1 (ou seja, agonista da atividade de SIRPβ1). Como outro exemplo, os monócitos podem ser incubados com anticorpo anti-SRPβ1 na presença de células acessórias que expressam receptores Fc gama, tais como células B. Após a incubação, as células são lisadas e a fosforilação de um ou mais dentre Syk, ERK, AKT, SIRPβ1 e/ou DAP12 é determinada como acima. Um aumento na fosforilação de um ou mais dentre Syk, ERK, AKT, SIRPβ1 e/ou DAP12 é indicativo de um aumento na atividade de SIRPβ1 (ou seja, que o anticorpo anti-SIRPβ1 é um agonista da atividade de SIRPβ1). Um ensaio exemplar não limitante para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 agoniza a atividade de SIRPβ1 em monócitos CD14-positivos in vivo compreende a administração do anticorpo anti-SIRPβ1 a um camundongo C57BL/6 BAC transgênico para SIRPβ1 humana, e isolamento de monócitos CD14–positivos, por exemplo, por FACS. Os monócitos são então lisados e a fosforilação de um ou mais dentre Syk, ERK, AKT, SIRPβ1 e/ou DAP12 é medida como descrito acima. Um aumento na fosforilação de um ou mais dentre Syk, ERK, AKT, SIRPβ1 e/ou DAP12 é indicativo de um aumento na atividade de SIRPβ1 (ou seja, agonista da atividade de SIRPβ1).

[230] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a explosão respiratória em células imunes, tais como neutrófilos e/ou monócitos de maneira in vitro e/ou in vivo; Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a explosão respiratória em células imunes, tais como neutrófilos e/ou monócitos de maneira in vitro; Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a explosão respiratória em células imunes, tais como neutrófilos e/ou monócitos de maneira in vivo; Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para determinar se um anticorpo induz ou aumenta a explosão respiratória em células imunes de anticorpo anti-SIRPβ1, tal como neutrófilos e/ou monócitos, são descritos no Exemplos 5 e 6. Por exemplo, os neutrófilos primários são colocados em contato com o anticorpo anti-SIRPβ1 e a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) é detectada usando um indicador de estresse oxidativo geral, como o corante fluorescente CM-H2DCFDA. Alternativamente, o ensaio pode ser realizado usando anticorpo anti-SIRPβ1 imobilizado em um suporte sólido, tal como uma placa de cultura ou ligado por um anticorpo anti-IgG secundário ou ligado por receptor Fc gama em uma célula acessória.

[231] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vitro e/ou in vivo. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vitro. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vivo.

Um ensaio in vitro exemplar não limitante do escopo da invenção para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos é descrito no Exemplo 5. Por exemplo, o monócito primário pode ser estimulado com um anticorpo anti-SIRPβ1 imobilizado em um suporte sólido, tal como uma placa de cultura ou ligado por um anticorpo anti-IgG secundário ou ligado por receptor Fc gama em uma célula acessória, por exemplo, durante a noite. O sobrenadante pode ser coletado para testar a liberação de IL-8. Um ensaio exemplar não limitante para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vivo compreende a administração do anticorpo anti-SIRPβ1 aos camundongos C57BL/6 transgênicos BAC para SIRPβ1 humana e a obtenção de uma ou mais amostras de sangue. A concentração sérica de IL-8 pode ser determinada usando um ensaio comercial, como o kit Duoset ELISA (R&D Systems).

[232] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas de maneira in vitro e/ou in vivo. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas de maneira in vitro. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas de maneira in vivo. Um ensaio in vitro exemplar não limitante do escopo da invenção para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a expressão de TNF-α é descrito no Exemplo 6. Por exemplo, os macrófagos derivados de monócitos ou células dendríticas podem ser estimulados com LPS na presença de anticorpo anti-SIRPβ1 imobilizado em um suporte sólido, tal como uma placa de cultura ou ligado por um anticorpo anti-IgG secundário ou ligado pelo receptor Fc gama em uma célula acessória, por exemplo, durante a noite. O sobrenadante pode ser coletado para testar a liberação de TNFα. Um ensaio exemplar não limitante para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas in vivo compreende a administração do anticorpo anti-SIRPβ1 a camundongos C57BL/6 BAC transgênicos para SIRPβ1 humanas juntamente com LPS (tal como 5 μg de LPS/camundongo). Os camundongos são então sacrificados, por exemplo, por asfixia com CO2 e o líquido peritoneal é recuperado e clarificado por centrifugação. A concentração sérica de TNFα pode ser determinada usando um ensaio comercial, como o kit Duoset ELISA (R&D Systems).

[233] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta in vitro e/ou in vivo a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta in vitro a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti- SIRPβ1 que induz ou aumenta in vivo a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que induz ou aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo. Um ensaio in vitro exemplar não limitante do escopo da invenção para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a fagocitose mediada por neutrófilo é descrito no Exemplo 7.

Por exemplo, os neutrófilos primários são colocados em contato com um anticorpo anti-SIRPβ1 imobilizado em um suporte sólido, tal como uma placa de cultura ou ligado por um anticorpo anti-IgG secundário ou ligado por receptor Fc gama em uma célula acessória. As células de câncer, como células de linfoma de células Raji B projetadas para expressarem luciferase, são cocultivadas com os neutrófilos e anticorpo anti-SIRPβ1 imobilizado na presença de anticorpo opsonizante, como anticorpo anti-CD20. As células Raji viáveis são quantificadas medindo a atividade da luciferase. Uma redução nas células Raji viáveis na presença de anticorpo anti-SIRPβ1 em comparação com um anticorpo de controle IgG indica que o anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a fagocitose mediada por neutrófilos. Um ensaio exemplar não limitante da invenção para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a eliminação de células tumorais mediadas por neutrófilos in vivo compreende a injeção intravenosa de células de melanoma B16F10 que expressam GFP em camundongos BAC transgênicos para SIRPβ1 humana.

Os camundongos são então tratados com o anticorpo anti-SIRPβ1 com um anticorpo anti-gp75 opsonizante. O sangue periférico é coletado, os glóbulos vermelhos são lisados e os glóbulos brancos ressuspensos em tampão FACS.

Os neutrófilos são corados com anticorpos anti-CD11b e anti-Ly6G e analisados por citometria de fluxo para a aquisição de sinal de fluorescência verde de células tumorais ingeridas. Um aumento no sinal de fluorescência verde nos neutrófilos em comparação com o mesmo experimento com um anticorpo de controle isotípico compatível indica que o anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a fagocitose mediada por neutrófilos.

[234] Outro ensaio exemplar não limitante para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo usa um modelo de metástase pulmonar, por exemplo, da seguinte forma. Camundongos C57BL/6 com deficiência do receptor Fc, que não têm expressão de ativação de FcγRs, são reinjetados por via intravenosa com células de melanoma B16F10. Neutrófilos um medula óssea isolados a partir de camundongos BAC transgênicos para SIRPβ1 humana são então injetados por via intravenosa com o anticorpo anti-SIRβ1 em combinação com um anticorpo anti-gp75 opsonizante. Depois de um período de tempo, os camundongos são sacrificados e os pulmões coletados e fixados.

O número de nódulos de tumores metastáticos com pigmentação escura é contado visualmente. Uma redução no número de nódulos tumorais metastáticos em comparação com o mesmo experimento com um anticorpo de controle isotípico compatível indica que o anticorpo anti-SIRPβ1 induz ou aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo.

[235] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que aumenta a expressão de TREM2 em macrófagos in vitro e/ou in vivo. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que aumenta a expressão de TREM2 em macrófagos in vitro. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti- SIRPβ1 que aumenta a expressão de TREM2 em macrófagos in vivo. Um ensaio in vitro exemplar não limitante para determinar se um anticorpo anti- SIRPβ1 aumenta a expressão de TREM2 em macrófagos é descrito no Exemplo 16. Por exemplo, macrófagos derivados de monócitos diferenciados em cultura com M-CSF são incubados com anticorpo anti- SIRPβ1 imobilizado em um suporte sólido, tal como uma placa de cultura ou ligado por um anticorpo anti-IgG secundário ou ligado pelo receptor Fc gama em uma célula acessória. A expressão de TREM2 nos macrófagos é analisada, por exemplo, por análise FACS. Um ensaio exemplar não limitante para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 aumenta a expressão de TREM2 em macrófagos in vivo é o seguinte. Camundongos C57BL/6 BAC transgênicos para SIRPβ1 humana foram desafiados com caldo de tioglicolato envelhecido estéril injetado no peritônio. Após o desafio, os camundongos são tratados com o anticorpo anti-SIRPβ1. Os camundongos são então sacrificados e os macrófagos peritoneais são novamente coletados após a eutanásia, por exemplo, enxaguando a cavidade peritoneal com PBS. Os macrófagos são definidos como células CD11b + Ly6C- F4/80+ e podem ser analisados por FACS para determinar os níveis de expressão de TREM2.

[236] Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que aumenta a viabilidade de macrófagos in vitro e/ou in vivo, sozinho e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti- TREM2. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti- SIRPβ1 que aumenta a viabilidade de macrófagos in vitro, sozinho e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti-TREM2. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que aumenta a viabilidade de macrófagos in vivo, sozinho e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti-TREM2. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que aumenta a viabilidade de células dendríticas in vitro e/ou in vivo. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que aumenta a viabilidade de células dendríticas in vitro. Em alguns exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-SIRPβ1 que aumenta a viabilidade de células dendríticas in vivo. Ensaios exemplares in vitro não limitantes do escopo da invenção para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 aumenta a viabilidade dos macrófagos in vitro, sozinho ou em combinação com um anticorpo anti- TREM2 agonista, são descritos nos Exemplos 17, 18 e 19. Por exemplo, macrófagos derivados de monócitos diferenciados em cultura com M-CSF são incubados com anticorpo anti-SIRPβ1 imobilizado em um suporte sólido,

tal como uma placa de cultura ou ligado por um anticorpo anti-IgG secundário ou ligado pelo receptor Fc gama em uma célula acessória e com e sem anticorpo anti-TREM2. A viabilidade celular é medida, por exemplo,

usando o kit Cell Titer Glo (Promega), um reagente que produz um sinal de luminescência em relação à concentração de ATP na amostra.

Um ensaio semelhante pode ser usado para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 aumenta a viabilidade de macrófagos derivados da medula óssea ou células dendríticas in vitro.

Para este ensaio, as células da medula óssea são cultivadas com M-CSF para diferenciar macrófagos ou com GM-CSF para diferenciar células dendríticas.

Os macrófagos ou células dendríticas são incubados com anticorpo anti-SIRPβ1 imobilizado em um suporte sólido,

como uma placa de cultura ou ligado por um anticorpo anti-IgG secundário ou ligado pelo receptor Fc gama em uma célula acessória, e com ou sem anticorpo anti-TREM2. Conforme definido acima, a viabilidade celular é medida, por exemplo, usando o kit Cell Titer Glo (Promega), um reagente que produz um sinal de luminescência em relação à concentração de ATP na amostra.

Um ensaio exemplar não limitante para determinar se um anticorpo anti-SIRPβ1 aumenta a viabilidade de macrófagos in vivo é o seguinte.

O tratamento prolongado com um anticorpo bloqueador para

CSF1R esgota os macrófagos F4/80 + residentes no tecido e peritoneal devido à revogação do sinal de sobrevivência mediado por M-CSF.

Para este ensaio, camundongos C57BL/6 BAC transgênicos SIRPβ1 são administrados com anticorpo anti-CSF1R, juntamente com o anticorpo anti-

SIRPβ1. Após o tratamento, os camundongos são sacrificados, por exemplo,

por CO2 asfixia, e sangue periférico é coletado por punção cardíaca.

Os macrófagos peritoneais são coletados por lavagem com PBS.

As populações de macrófagos são contadas por FACS por gating em células CD11b + Ly6C-

F4/80+ no sangue e peritônio.

III. ÁCIDOS NUCLEICOS, VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[237] Os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente descrição podem ser produzidos pelo uso de métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.816.567. Em alguns exemplos de realização, ácidos nucleicos isolados com uma sequência nucleotídica que codifica qualquer um dos anticorpos anti-SIRPβ1 da presente descrição são fornecidos. Tais ácidos nucleicos podem codificar uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL e/ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo anti- SIRPβ1 (por exemplo, as cadeias leve e/ou pesada do anticorpo). Em alguns exemplos de realização, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo esses ácidos nucleicos são fornecidos. Em alguns exemplos de realização, uma célula hospedeira compreendendo tal ácido nucleico é também fornecida. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transduzida com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster chinês (CHO) ou células linfoides (por exemplo, células Y0, NS0, Sp20). As células hospedeiras da presente descrição também incluem, sem limitação, células isoladas, células cultivadas in vitro e células cultivadas ex vivo.

[238] Métodos de produção de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição são fornecidos. Em alguns exemplos de realização, o método inclui cultivar uma célula hospedeira da presente descrição compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-SIRPβ1, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é subsequentemente recuperado da célula hospedeira (ou meio de cultura de células hospedeiras).

[239] Para produção recombinante de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição, um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-SIRPβ1 é isolado e inserido em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado por meio da utilização de procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas de oligonucleotídeos capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).

[240] Vetores adequados compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-SIRPβ1 da presente descrição ou fragmentos expressos de superfície celular ou polipeptídeos destes polipeptídeos (incluindo anticorpos) descritos neste documento incluem, sem limitação, vetores de clonagem e vetores de expressão. Os vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira que se pretende utilizar, os vetores de clonagem úteis geralmente têm a capacidade de se autorreplicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular, e/ou podem carrear genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones compreendendo o vetor. Os exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores de transferência, tais como PSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais tais como BioRad, Stratagene e Invitrogen.

[241] As células hospedeiras adequadas para a clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem as células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente descrição podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias (por exemplo, Patentes US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.

[242] Além de procariontes, microrganismos eucariontes tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou de expressão adequados para vetores que codificam anticorpo, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano (por exemplo, Gerngross Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); e Li et al. Nat. Biotech.

24:210-215 (2006)).

[243] As células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo glicosilado também podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas diversas cepas de baculovírus que podem ser utilizadas juntamente com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiras (por exemplo, as Patentes US

5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429, descrevendo a tecnologia PLANTIBODIES® para a produção de anticorpos em plantas transgênicas).

[244] Células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, as linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são: linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de células de rim embrionárias humana (células HEK 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em suspensão de cultura, como descrito, por exemplo, em Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK); células de Sertoli de camundongos (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); Células de rim de macaco verde africano (VERO- 76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais caninas (MDCK; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al. Annals NY Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 77:4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma tais como Y0, NS0 e Sp2/0.

Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpos consulte, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs. 255-268 (2003).

IV. COMPOSIÇÕES/FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[245] São fornecidas neste documento composições farmacêuticas e/ou formulações farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente descrição e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[246] Em alguns exemplos de realização, o veículo farmaceuticamente aceitável é preferencialmente não tóxico para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Os anticorpos descritos neste documento podem ser formulados em preparações nas formas sólida, semissólida, líquida ou gasosa. Exemplos de tais formulações incluem, sem limitação, comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, unguentos, soluções, supositórios, injeções, inalantes, géis, microesferas e aerossóis. Os veículos farmacêuticos aceitáveis podem incluir, dependendo da formulação desejada, veículos de diluentes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, que são veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração animal ou humana. Em certos exemplos de realização, a composição farmacêutica pode compreender materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou de liberação, adsorção ou penetração da composição.

[247] Em certos exemplos de realização, veículos farmaceuticamente adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogeno- sulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido etilenodiamino tetra- acético (EDTA)); agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas/preenchedores; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (tais como glicose, manose ou dextrina); proteínas (tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, flavorizantes e diluentes; emulsificantes; polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons formadores de sal (tais como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (por exemplo, glicerina, propileno glicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcares (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; surfactantes ou agentes umectantes (tais como pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos, tais como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potencializadores de estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol); agentes potencializadores de tonicidade (tais como haletos de metais alcalinos, preferencialmente cloreto de sódio ou de potássio, manitol sorbitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Outros exemplos de formulações adequadas para vários tipos de administração podem ser encontrados em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Pharmaceutical Press 22ª ed. (2013). Para uma breve revisão dos métodos para distribuição de fármaco, consulte, Langer, Science 249:1527- 1533 (1990).

[248] As formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéril isotônicas aquosas e não aquosas, que podem compreender antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores e conservantes.

[249] As formulações podem ser otimizadas para retenção e estabilização no cérebro ou sistema nervoso central. Quando o agente é administrado no compartimento craniano, é desejável que o agente seja retido no compartimento e não difundir ou atravessar a barreira hematoencefálica. As técnicas de estabilização incluem reticulação, multimerização ou ligação a grupos como polietilenoglicol, poliacrilamida, veículos neutros de proteínas etc., de modo a obter um aprimoramento no peso molecular.

[250] Outras estratégias para aprimorar a retenção incluem o aprisionamento do anticorpo, como um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição, em um implante biodegradável ou bioerodível. A taxa de liberação do agente terapeuticamente ativo é controlada pela taxa de transporte através da matriz polimérica e pela biodegradação do implante. Os implantes podem ser partículas, folhas, adesivos, placas, fibras, microcápsulas e similares e podem ter qualquer tamanho ou forma compatível com o sítio de inserção selecionado. As composições poliméricas biodegradáveis que podem ser empregadas podem ser ésteres ou éteres orgânicos que, quando degradados, resultam em produtos de degradação fisiologicamente aceitáveis, incluindo os monômeros. Anidridos, amidas, orto ésteres ou outros semelhantes, sozinhos ou em combinação com outros monômeros, podem ser usados. Os polímeros serão polímeros de condensação. Os polímeros podem ser reticulados ou não reticulados. De particular interesse são os polímeros de ácidos carboxílicos hidroxialifáticos quer homo- ou copolímeros e polissacarídeos. Entre os poliésteres de interesse estão incluídos polímeros de ácido D-lático, ácido L- lático, ácido lático racêmico, ácido glicólico, policaprolactona e combinações destes. Entre os polissacarídeos de interesse estão o alginato de cálcio e celuloses funcionalizadas, particularmente ésteres de carboximetilcelulose caracterizados por serem insolúveis em água, um peso molecular de cerca de 5 kD a 500 kD, etc. Os hidrogéis biodegradáveis também podem ser utilizados nos implantes da presente invenção. Os hidrogéis são tipicamente um material de copolímero, caracterizado pela capacidade de absorver um líquido.

V. USOS TERAPÊUTICOS

[251] Tal como divulgado na presente invenção, os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente descrição podem ser utilizados para prevenir, reduzir o risco ou tratar doenças ou distúrbios. Em diversos exemplos de realização, os anticorpos anti-SIRPβ1 fornecidos aqui têm uma ou mais atividades selecionadas a partir de: agonizar a atividade de SIRPβ1 em monócitos CD14 positivos in vitro e/ou in vivo; induzir a explosão respiratória em células imunes, como neutrófilos e/ou monócitos in vitro e/ou in vivo; induzir a expressão de IL-

8 em monócitos in vitro e/ou in vivo; induzir a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas in vitro e/ou in vivo; induzir a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais in vitro e/ou in vivo; aumentar a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo; regular positivamente a expressão de TREM2 em macrófagos in vitro e/ou in vivo; aumentar a viabilidade de macrófagos in vitro e/ou in vivo, sozinhos e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti-TREM2; e aumentar a viabilidade de células dendríticas in vitro e/ou in vivo.

[252] Em vários exemplos de realização, os anticorpos anti- SIRPβ1 fornecidos no presente documento podem ser usados para prevenir, reduzir o risco ou tratar demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica, Doença de Huntington, doenças taupáticas (taupatias), doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, lúpus, colite aguda e crônica, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, obesidade, malária, tremor essencial, sistema nervoso central lúpus, doença de Behçet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar basal cortical, encefalomielite disseminada aguda, doenças granulomatosas, Sarcoidose, doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, retinite pigmentosa, degeneração da retina, infecção do trato respiratório, sepse, infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget e/ou câncer. Em alguns desses exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPβ1 é um anticorpo agonista.

[253] Em alguns exemplos de realização, são fornecidos métodos para prevenir, reduzir o risco ou tratar um indivíduo com demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica, Doença de Huntington, doenças taupáticas (taupatias), doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, lúpus, colite aguda e crônica, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, obesidade, malária, tremor essencial, sistema nervoso central lúpus, doença de Behçet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar basal cortical, encefalomielite disseminada aguda, doenças granulomatosas, Sarcoidose, doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, retinite pigmentosa, degeneração da retina, infecção do trato respiratório, sepse, infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget e/ou câncer. Em alguns desses exemplos de realização, o anticorpo anti-SIRPβ1 é um agonista de (por exemplo, induz ou aumenta) a atividade de SIRPβ1.

[254] Conforme divulgado na presente invenção, podem também ser utilizados anticorpos anti-SIRPβ1 da presente divulgação para induzir e/ou promover a sobrevida de células imune inata. Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação fornece métodos de induzir ou promover a sobrevivência de células imunes inatas em um indivíduo com tal necessidade, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo agonista anti-SIRPβ1 da presente divulgação.

[255] Conforme divulgado na presente invenção, os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente divulgação podem ser usados para induzir e/ou promover a cicatrização de feridas, tais como após lesão. Em alguns exemplos de realização, a cicatrização pode ser a reparação da ferida do cólon após uma lesão. Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação fornece métodos de indução ou promoção da cicatrização em um indivíduo com tal necessidade, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo agonista anti-SIRPβ1 da presente divulgação.

[256] Em determinados exemplos de realização, o sujeito ou indivíduo é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos tal como macacos), e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em alguns exemplos de realização, o sujeito ou indivíduo é um ser humano.

[257] Um anticorpo fornecido neste documento (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo a via parenteral, intrapulmonar, intranasal, administração intralesional, intracerobrospinal, intracraniana, intraespinal, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, administração intra-arterial, intra- articular, intraperitoneal ou subcutânea. Em alguns exemplos de realização, a administração é administração intravenosa. Em alguns exemplos de realização, a administração é subcutânea. Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte se a administração é breve ou crônica. Os esquemas de dosagem, incluindo mas não se limitando a, administração simples ou múltiplas administrações ao longo de vários pontos de tempo, administração em bolus e infusão pulsada, são contemplados na presente invenção.

[258] Os anticorpos fornecidos neste documento seriam formulados, dosados e administrados de forma consistente com as boas práticas médicas. Fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente o local de entrega do agente, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar os distúrbios em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.

[259] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de anticorpo, da severidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, se houve e qual foi a terapia anterior, o histórico clínico do paciente, a reação ao anticorpo, e o critério do médico atendente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

[260] Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 µg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg – 20 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dose inicial candidata para a administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar em cerca de 1 µg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Em certos exemplos de realização, a frequência de dosagem é três vezes por dia, duas vezes por dia, uma vez por dia, uma vez a cada dois dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada nove semanas, uma vez a cada dez semanas ou uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses ou mais Pode ser administrada uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas.

Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.

DEMÊNCIA

[261] A demência é uma síndrome inespecífica (ou seja, um conjunto de sinais e sintomas) que se apresenta como uma séria perda da capacidade cognitiva global em uma pessoa anteriormente não prejudicada, além do que se pode esperar do envelhecimento normal. A demência pode ser estática como resultado de uma lesão cerebral global única. Alternativamente, a demência pode ser progressiva, resultando em declínio em longo prazo devido a danos ou doenças no corpo. Embora a demência seja muito mais comum na população geriátrica, também pode ocorrer antes dos 65 anos. As áreas cognitivas afetadas pela demência incluem, sem limitação, memória, atenção, linguagem e solução de problemas. Em geral, os sintomas devem estar presentes por pelo menos seis meses antes de um indivíduo ser diagnosticado com demência.

[262] Formas exemplificativas de demência incluem, sem limitação, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência semântica e demência com corpos de Lewy.

[263] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a demência. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 pode induzir uma ou mais atividades de SIRPβ1 em um indivíduo com demência.

DEMÊNCIA FRONTOTEMPORAL

[264] A demência frontotemporal (FTD) é uma condição resultante da deterioração progressiva do lobo frontal do cérebro. Com o tempo, a degeneração pode avançar para o lobo temporal. Perdendo apenas para a doença de Alzheimer (AD) na prevalência, a FTD responde por 20% dos casos de demência pré-senil. As características clínicas da FTD incluem déficits de memória, anormalidades comportamentais, alterações de personalidade e comprometimentos de linguagem (Cruts, M. & Van Broeckhoven, C., Trends Genet. 24:186-194 (2008); Neary, D., et al., Neurology 51:1546-1554 (1998); Ratnavalli, E., Brayne, C., Dawson, K. & Hodges, J. R., Neurology 58:1615-1621 (2002)).

[265] Uma porção substancial dos casos da FTD é herdada de maneira autossômica dominante, mas mesmo em uma família, os sintomas podem abranger um espectro, desde FTD com distúrbios comportamentais, até

Afasia Progressiva Primária, até Degeneração Ganglionar Corticobasal. A FTD, como a maioria das doenças neurodegenerativas, pode ser caracterizada pela presença patológica de agregados de proteína específicos no cérebro doente.

Historicamente, as primeiras descrições da FTD reconheceram a presença de acúmulos intraneuronais da proteína Tau hiperfosforilada em emaranhados neurofibrilares ou corpos de Pick. Uma função causal para a proteína Tau associada ao microtúbulo foi respaldada pela identificação de mutações no gene que codifica a proteína Tau em várias famílias (Hutton, M., et al., Nature 393:702-705 (1998). No entanto, a maioria dos cérebros com FTD não mostra acúmulo de Tau hiperfosforilada, mas exibe imunorreatividade à ubiquitina (Ub) e à proteína TAR de ligação ao DNA (TDP43) (Neumann, M., et al., Arch.

Neurol. 64:1388-1394 (2007)). Foi demonstrado que a maioria dos casos de FTD com inclusões de Ub (FTD-U) carrega mutações no gene da Progranulina.

[266] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a FTD. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 pode induzir uma ou mais atividades de SIRPβ1 em um indivíduo com FTD.

DOENÇA DE ALZHEIMER

[267] A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência. Não há cura para a doença, que piora à medida que progride e, eventualmente, leva à morte. Na maioria das vezes, a AD é diagnosticada em pessoas com mais de 65 anos. No entanto, o Alzheimer de início precoce menos prevalente pode ocorrer muito mais cedo.

[268] Os sintomas comuns da doença de Alzheimer incluem sintomas comportamentais, como dificuldade em lembrar eventos recentes; sintomas cognitivos, confusão, irritabilidade e agressão, alterações de humor, problemas de linguagem e perda de memória de longo prazo. À medida que a doença progride, as funções corporais são perdidas, levando à morte. A doença de Alzheimer se desenvolve por um período desconhecido e variável antes de se tornar totalmente aparente, e pode progredir sem diagnóstico por anos.

[269] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Alzheimer. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 pode induzir uma ou mais atividades de SIRPβ1 em um indivíduo com doença de Alzheimer.

DOENÇA DE NASU-HAKOLA

[270] A doença de Nasu-Hakola (NHD), que pode ser chamada de osteodisplasia lipomembranosa policística com leucoencefalopatia esclerosante (PLOSL), é uma leucodistrofia hereditária rara, caracterizada por demência pré-senil progressiva associada a fraturas ósseas recorrentes devido a lesões ósseas policísticas das extremidades inferiores e superiores. O curso da doença NHD é geralmente dividido em quatro estágios: latente, ósseo, neurológico inicial e neurológico avançado. Após um desenvolvimento normal durante a infância (estágio latente), a NHD começa a se manifestar durante a adolescência ou início da vida adulta (idade típica de início entre 20 e 30 anos) com dor nas mãos, pulsos, tornozelos e pés. Os pacientes começam então a sofrer fraturas ósseas recorrentes devido a lesões ósseas e osteroporóticas policísticas nos ossos dos membros (estágio ósseo). Durante a terceira ou quarta década de vida (estágio neurológico inicial), os pacientes apresentam alterações de personalidade pronunciadas (por exemplo, euforia, falta de concentração, perda de discernimento e inibições sociais), características de uma síndrome do lobo frontal. Os pacientes também costumam sofrer de distúrbios progressivos da memória. Convulsões epilépticas também são frequentemente observadas. Finalmente (estágio neurológico avançado), os pacientes progridem para uma demência profunda, são incapazes de falar e se mover e, geralmente, morrem aos 50 anos.

[271] Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Nasu-Hakola (NHD). Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 pode induzir uma ou mais atividades de SIRPβ1 em um indivíduo com NHD.

DOENÇA DE PARKINSON

[272] A doença de Parkinson, que pode ser chamada de parkinsonismo idiopático ou primário, síndrome rígida hipocinética (HRS) ou paralisia agitante, é um distúrbio cerebral neurodegenerativo que afeta o controle do sistema motor. A morte progressiva das células produtoras de dopamina no cérebro leva aos principais sintomas de Parkinson. Na maioria das vezes, a doença de Parkinson é diagnosticada em pessoas com mais de 50 anos. A doença de Parkinson é idiopática (sem causa conhecida) na maioria das pessoas. No entanto, fatores genéticos também desempenham um papel na doença.

[273] Os sintomas da doença de Parkinson incluem, sem limitação, tremores nas mãos, braços, pernas, mandíbula e face, rigidez muscular nos membros e tronco, lentidão de movimento (bradicinesia), instabilidade postural, dificuldade para caminhar, problemas neuropsiquiátricos, alterações na fala ou comportamento, depressão, ansiedade, dor, psicose, demência, alucinações e problemas de sono.

[274] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Parkinson. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 pode induzir uma ou mais atividades de SIRPβ1 em um indivíduo com doença de Parkinson.

ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA

[275] Conforme usado neste documento, esclerose lateral amiotrófica (ALS) ou doença do neurônio motor ou doença de Lou Gehrig são usadas de forma intercambiável e referem-se a uma doença debilitante com etiologia variada caracterizada por fraqueza rapidamente progressiva, atrofia e fasciculações musculares, espasticidade muscular, dificuldade na fala (disartria), dificuldade em engolir (disfagia) e dificuldade em respirar (dispneia).

[276] Foi demonstrado que a progranulina desempenha um papel na ALS (Schymick, JC et al., (2007) J Neurol Neurosurg Psychiatry.; 78: 754-6) e protege novamente os danos causados por proteínas que causam ALS como TDP-43 (Laird, AS et al., (2010). PLoS ONE 5: e13368). Também foi demonstrado que o pro-NGF induz a morte de oligodendrócitos e neurônios corticospinais mediada por p75 após lesão medular (Beatty et al., Neuron (2002), 36, págs. 375-386; Giehl et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (2004), 101, págs.

6226-30).

[277] Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a ALS. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 pode induzir uma ou mais atividades de SIRPβ1 em um indivíduo com ALS.

DOENÇA DE HUNTINGTON

[278] A doença de Huntington (HD) é uma doença neurodegenerativa hereditária causada por uma mutação autossômica dominante no gene da Huntingtina (HTT). A expansão de uma repetição de tripleto de citocina-adenina-guanina (CAG) no gene Huntingtina resulta na produção de uma forma mutante da proteína Huntingtina (Htt) codificada pelo gene. Essa proteína Huntingtina mutante (mHtt) é tóxica e contribui para a morte neuronal. Os sintomas da doença de Huntington costumam aparecer entre 35 e 44 anos, embora possam aparecer em qualquer idade.

[279] Os sintomas da doença de Huntington incluem, sem limitação, problemas de controle motor, movimentos aleatórios e espasmódicos (coreia), movimentos oculares anormais, equilíbrio comprometido, convulsões, dificuldade em mastigar, dificuldade em engolir, problemas cognitivos, fala alterada, déficits de memória, dificuldades de pensamento, insônia, fadiga, demência, alterações na personalidade, depressão, ansiedade e comportamento compulsivo.

[280] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Huntington (HD). Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 pode induzir uma ou mais atividades de SIRPβ1 em um indivíduo com HD.

TAUOPATIA

[281] As taupatias ou tauopatias, são uma classe de doença neurodegenerativa causada pela agregação da proteína tau associada ao microtúbulo no cérebro. A doença de Alzheimer (AD) é a taupatia mais conhecida e envolve um acúmulo de proteína tau dentro dos neurônios na forma de emaranhados neurofibrilares insolúveis (NFTs). Outras taupatias e distúrbios incluem paralisia supranuclear progressiva, demência pugilística (encefalopatia traumática crônica), demência frontotemporal e parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Lytico-Bodig (complexo parkinsonismo- demência de Guam), demência com predomínio de emaranhados, ganglioglioma e gangliocitoma, meningioangiomatose, panencefalite esclerosante subaguda, encefalopatia por chumbo, esclerose tuberosa, doença de Hallervorden-Spatz, lipofuscinose, doença de Pick, degeneração corticobasal, doença por grãos argirofílicos (AGD), doença de Huntington, demência frontotemporal e degeneração lobar frontotemporal.

[282] Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a taupatia. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 pode induzir uma ou mais atividades de SIRPβ1 em um indivíduo com taupatia.

ESCLEROSE MÚLTIPLA

[283] A esclerose múltipla (MS) também pode ser referida como esclerose disseminada ou encefalomielite disseminada. A MS é uma doença inflamatória na qual as bainhas de mielina ao redor dos axônios do cérebro e da medula espinhal são danificadas, levando à desmielinização e cicatrização, bem como a um amplo espectro de sinais e sintomas. A MS afeta a capacidade das células nervosas do cérebro e da medula espinhal de se comunicarem efetivamente. As células nervosas se comunicam enviando sinais elétricos chamados potenciais de ação por fibras longas chamadas axônios, que estão contidos em uma substância isolante chamada mielina. Na MS, o próprio sistema imunológico do corpo ataca e danifica a mielina. Quando a mielina é perdida, os axônios não podem mais conduzir sinais de maneira efetiva. O início da MS normalmente ocorre em jovens adultos e é mais comum em mulheres.

[284] Os sintomas da MS incluem, sem limitação, alterações na sensação, como perda de sensibilidade ou formigamento; ardência ou dormência, como hipoestesia e parestesia; fraqueza muscular; clônus; espasmos musculares; dificuldade em se mover; dificuldades com coordenação e equilíbrio, como ataxia; problemas na fala, como disartria ou na deglutição, como disfagia; problemas visuais, como nistagmo, neurite óptica incluindo fosfenos e diplopia; fadiga; dor aguda ou crônica; e dificuldades na bexiga e intestino; comprometimento cognitivo em vários graus; sintomas emocionais de depressão ou humor instável; fenômeno de Uhthoff, que é uma exacerbação dos sintomas existentes devido a uma exposição a temperaturas ambientes mais altas do que as normais; e sinal de Lhermitte, que é uma sensação elétrica que desce pelas costas ao dobrar o pescoço.

[285] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente descrição possa prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a esclerose múltipla. Em alguns exemplos de realização, a administração de um anticorpo anti-SIRPβ1 pode induzir uma ou mais atividades de SIRPβ1 em um indivíduo com esclerose múltipla.

CÂNCER

[286] Ainda, outros aspectos da presente divulgação fornecem métodos de prevenção, redução de risco ou tratamento de um indivíduo com câncer, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação.

Qualquer um dos anticorpos isolados da presente divulgação pode ser usado nestes métodos. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo isolado é um anticorpo agonista da presente divulgação.

[287] Sabe-se que o microambiente do tumor é conhecido por conter um infiltrado imunológico heterogêneo, que inclui linfócitos T, macrófagos e células da linhagem mieloide/granulocítica. Em particular, a presença de macrófagos M2 nos tumores está associada a um mau prognóstico. As terapias que reduzem o número dessas células no tumor, como agentes bloqueadores do CSF-1R, estão mostrando efeitos benéficos em modelos pré-clínicos e em estudos clínicos em estágio inicial. Um estudo pré- clínico seminal também demonstrou sinergias entre drogas que direcionam macrófagos associados a tumores (por exemplo, anticorpos bloqueadores CSF-1/CSF-1R) e anticorpos bloqueadores de ponto de verificação

(checkpoint) que visam células T, indicando que a manipulação de ambos os tipos de células mostra eficácia em modelos de tumores nos quais as terapias individuais são pouco eficazes (Zhu Y; Cancer Res. 15 de setembro de 2014; 74 (18):5057-69). Portanto, sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que a indução da sinalização de SIRPβ1 em macrófagos associados a tumores e/ou neutrófilos podem inibir a supressão da resposta imune no microambiente tumoral, resultando em uma resposta terapêutica imune antitumoral.

[288] Em determinados exemplos de realização, um câncer a ser prevenido ou tratado pelos métodos da presente divulgação inclui, sem limitação, carcinoma de células escamosas (por exemplo, carcinoma epitelial de células escamosas), câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células escamosas não pequenas (NSCLC), adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, NSCLC não escamoso, glioma, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrointestinal e câncer estromal gastrointestinal, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer de ovário, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de endométrio, câncer de rim (por exemplo, carcinoma de células renais (RCC)), câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), câncer de tireoide, neuroblastoma, câncer pancreático, glioblastoma (glioblastoma multiforme), câncer cervical, câncer de estômago, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma de cólon e câncer (ou carcinoma) de cabeça e pescoço, câncer gástrico, tumor de células germinativas, sarcoma pediátrico, linfoma de linfocitos T citolíticos (NK) de seios paranasais, melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático, como melanoma maligno cutâneo ou intraocular), câncer ósseo, câncer de pele, câncer uterino, câncer da região anal, câncer testicular, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma de colo uterino, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal,

sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (SNC), linfoma do SNC primário, síndromes mielodisplásicas,

neoplasias colorretais, tumores sólidos, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi,

câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T,

cânceres induzidos ambientalmente, incluindo aqueles induzidos por amianto,

cânceres relacionados a vírus (por exemplo, tumor relacionado ao vírus do papiloma humano (HPV)) e malignidades hematológicas derivadas de qualquer uma das duas principais linhagens de células sanguíneas ou seja, a linhagem celular mieloide (que produz granulócitos, eritrócitos, trombócitos, macrófagos e mastócitos) ou linhagem celular linfoide (que produz células B, T, NK e plasmáticas), como todos os tipos de leucemias, linfomas e mielomas, por exemplo, agudo, crônico, linfocítico e/ou leucemias mielógenas, como leucemia aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (CLL)

e leucemia mieloide crônica (CML), LMA indiferenciada (M0), leucemia mieloblástica (M1), leucemia mieloblástica (M2; com maturação celular),

leucemia promielocítica (M3 ou M3 variante [M3V]), leucemia mielomonocítica

(M4 ou variante M4 com eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5),

eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma e cloroma;

linfomas, como linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não-Hodgkin (NHL), linfoma indolente, linfoma difuso de grandes células B, malignidade hematológica de células B, por exemplo, linfomas de células B, linfomas de células T, linfoma linfoplasmocitoides, linfoma de células B monocitóides, tecido linfoide associado à mucosa (MALT), linfoma anaplásico (por exemplo, Ki1+) linfoma de células grandes, linfoma/leucemia de células T adultas, linfoma de células do manto, linfoma angioimunoblástico de células T, linfoma angiocêntrico, linfoma de células T intestinal, linfoma de células B mediastinais primário, linfoma linfoblástico T precursor, linfoma/leucemia linfoblástica T (T-Lbly/T-ALL),

linfoma de células T periférico, linfoma linfoblástico, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, linfoma histiocítico verdadeiro, linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma de efusão primária, linfoma linfoblástico (LBL), tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma imunoblástico de grandes células, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma cutâneo de células T (CTLC) (também chamado de micose fungoide ou síndrome de Sezary) e linfoma linfoplasmocitário (LPL) com macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas,

como mieloma IgG, mieloma de cadeia leve, mieloma não secretor, mieloma latente (também chamado de mieloma indolente), plasmocitoma solitário e mielomas múltiplos, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células pilosas; tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; seminoma,

teratocarcinoma, tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores,

incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma,

câncer folicular da tireoide e teratocarcinoma, tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, por exemplo, células T e tumores de células B, incluindo,

mas não se limitando a distúrbios de células T, como T- leucemia prolinfocítica

(T-PLL), incluindo do tipo de células pequenas e células cerebriformes; leucemia de linfócitos granulares grandes (LGL) de preferência do tipo de células T; linfoma heptassilábico a/d T-NHL; linfoma de células T periférico/pós-

tímico (subtipos pleomórfico e imunoblástico); linfoma angiocêntrico (nasal) de células T; câncer de cabeça ou pescoço, câncer renal, câncer retal, câncer da glândula tireoide; linfoma mieloide agudo, bem como quaisquer combinações dos referidos cânceres. Um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação também pode ser usado para tratar câncer metastático.

[289] Em alguns exemplos de realização, o câncer é selecionado de sarcoma, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de pélvis renal, leucemia, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, melanoma, linfoma, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário e fibrossarcoma. Em alguns exemplos de realização, o câncer é carcinoma da mama triplo-negativo. Em alguns exemplos de realização, o câncer pode ser um câncer em estágio inicial ou um câncer em estágio avançado. Em alguns exemplos de realização, o câncer pode ser um tumor primário. Em alguns exemplos de realização, o câncer pode ser um tumor metastático em um segundo local derivado de qualquer um dos tipos de câncer acima.

[290] Em alguns exemplos de realização, o câncer é selecionado de glioblastoma multiforme; carcinoma renal de células claras; carcinoma adrenocortical; carcinoma urotelial da bexiga; linfoma difuso de grandes células B; adenocarcinoma pulmonar; adenocarcinoma pancreático, câncer de células renais, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma indolente de células B, linfoma de células B agressivo, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múltiplo, síndromes mielodisplásicas, neoplasias mieloproliferativas, carcinoma invasivo da mama, carcinoma de células escamosas cervicais, adenocarcinoma endocervical, colangiocarcinoma, adenocarcinoma do cólon, linfoma difuso de grandes células B, carcinoma esofágico da cabeça, carcinoma esofágico do pescoço cromófobo do rim, carcinoma de células papilares renais, glioma de grau inferior, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas do pulmão, mesotelioma, cistadenocarcinoma seroso do ovário, adenocarcinoma pancreático, feocromocitoma e paraganglioma, adenocarcinoma de células escamosas do pulmão, mesotelioma, cistadenocarcinoma seroso do ovário, adenocarcinoma pancreático, feocromocitoma e paraganglioma, adenocarcinoma de células escamosas de próstata, adenocarcinoma cutâneo de adenocarcinoma de estômago, adenocarcinoma cutâneo, adenocarcinoma de estômago, carcinoma da tireoide, timoma, carcinoma edometrial do corpo uterino, carcinossarcoma uterino e melanoma uveal.

[291] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação fornece métodos de prevenção, redução de risco ou tratamento de um indivíduo com câncer, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação.

[292] Em alguns exemplos de realização, a presente divulgação fornece métodos de prevenção, redução de risco ou tratamento de um indivíduo com câncer, em que o indivíduo é refratário à terapia com inibidor do ponto de verificação, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação.

[293] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação pode ser administrado em conjunto com um agente terapêutico que atua como um inibidor de ponto de verificação imunológico. Em alguns exemplos de realização, o método inclui ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imune inibitória e/ou outra terapia anticâncer padrão ou investigacional. Em alguns exemplos de realização, a molécula de ponto de verificação inibitória é selecionada a partir de PD1, PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR,

CTLA4, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39 e CD73.

Em exemplos de realização típicos, o agente terapêutico é um anticorpo para um inibidor de ponto de verificação selecionado a partir de D1, PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, CTLA4, PD-L2, B7-H3, B7- H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39 ou CD73. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, uma combinação de anticorpos direcionados contra inibidores de ponto de verificação é administrada em conjunto com um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente invenção.

[294] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação pode ser administrado em conjunto com pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 agonista, um anticorpo anti-OX40 agonista, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonista anti-TREM1, um anticorpo agonista anti-TREM2, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista anti-CD27, um anticorpo anti- proteína GITR relacionada com TNFR induzida por glicocorticoide agonista, um anticorpo agonista anti- CD30, um anticorpo agonista anti-BTLA, um anticorpo agonista anti-HVEM, um anticorpo agonista anti-CD2, um anticorpo agonista anti-CD5 e qualquer combinação dos mesmos.

[295] Em alguns exemplos de realização, o método inclui ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação imune inibitória e/ou outra terapia anticâncer padrão ou investigacional. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória é selecionado a partir de um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e anticorpo anti-HVEM, um anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo antirreceptor tipo imunoglobulina Killer (KIR) inibidor, um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-A2AR, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti-fosfatidilserina, um anticorpo anti-CD27 e qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos de realização, a terapia anticâncer padrão ou experimental é uma ou mais terapias selecionadas de radioterapia, quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, imatinibe (Gleevec®), trastuzumabe (Herceptin®), transferência de células adotivas (ACT), transferência de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T), terapia com vacina e terapia com citocinas.. Em alguns exemplos de realização, o método inclui ainda administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora. Em alguns exemplos de realização, pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é administrado em combinação com o anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é selecionado a partir de um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2, e qualquer combinação dos mesmos.

[296] Em alguns exemplos de realização, o método inclui ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação imune estimuladora.

Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora é administrado em combinação com o anticorpo anti-SIRPβ1 da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, o pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora é selecionado a partir de um anticorpo agonista anti-CD40, um anticorpo agonista anti-OX40, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista antiproteína GITR relacionada ao TNFR induzida por glicocorticoide e qualquer combinação dos mesmos.

[297] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente invenção é administrado em combinação com radioterapia e/ou um agente quimioterápico. Os agentes quimioterápicos incluem, por exemplo, os seguintes grupos: antimetabolitos/agentes anticâncer, tais como análogos de pirimidina (5-fluorouracil, floxuridina, capecitabina, gencitabina e citarabina) e análogos de purina, antagonistas de folato e inibidores relacionados (metotrexato, pemetrexed, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos, incluindo produtos naturais, tais como alcaloides da vinca (vinblastina, vincristina e vinorelbina), desrreguladores de microtúbulos, tais como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas, eribulina e navelbina; epidipodofilotoxinas (etoposide, teniposide); agentes prejudiciais ao DNA (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, bussulfano, camptotecina, carboplatina, clorambucilo, cisplatina, ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, hexametilmelamineoxaliplatina, ifosfamida, melfalano, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosoureia, plicamicina,

procarbazina, taxol, taxotere, temozolamida, teniposide, trietilenotiofosforamida e etoposide (VP 16)); Inibidores de DNA metiltransferase (azacitidina);

antibióticos, como dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina,

doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona,

bleomicinas, plicamicina (mitramicina) e mitomicina; enzimas (L-asparaginase que metaboliza sistemicamente L-asparagina e priva células que não têm a capacidade de sintetizar sua própria asparagina); agentes antiplaquetários;

agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos, como mostardas de nitrogênio (mecloretamina, ciclofosfamida e análogos, melfalan, clorambucila),

etileniminas e metilmelaminas (hexametilmelamina e tiotepa), alquilsulfonatos

(busulfan), nitrosoureias (carmustina (BCNU), triazsazina (carmustina (BCNU),

triazsazina, estrepbiazina (DTIC)); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos, tais como análogos do ácido fólico

(metotrexato); complexos de coordenação de platina (cisplatina, carboplatina),

procarbazina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutetimida; hormônios, análogos de hormônios (estrogênio, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inibidores de aromatase (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sais de heparina sintética e outros inibidores da trombina); agentes fibrinolíticos (tais como ativador do plasminogênio tecidual, estreptoquinase e uroquinase),

aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes anti-

migratórios; agentes antissecretores (breveldina); imunossupressores

(ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina,

micofenolato de mofetil); compostos anti-angiogênicos (TNP470, genisteína,

pomalidomida) e inibidores do fator de crescimento (inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), tais como ziv-aflibercept; inibidores do fator de crescimento de fibroblastos (FGF)); inibidores de antagonistas da proteína de apoptose (IAP) (birinapant); inibidores da histona desacetilase

(HDAC) (vorinostat, romidepsina, xidamida, panobinostate, mocetinostate,

abexinostate, belinostate, entinostate, resminostate, givinostate, quisinostate,

SB939); inibidores de proteassoma (ixazomibe); bloqueador do receptor da angiotensina; doadores de óxido nítrico; oligonucleotídeos antissenso;

anticorpos (trastuzumabe, panitumumabe, pertuzumabe, cetuximabe,

adalimumabe, golimumabe, infliximabe, rituximabe, ocrelizumabe,

ofatumumabe, obinutuzumabe, alemtuzumabe, abciximabe, atlizumabebe,

daclizumabe, denosumabe, efalizumabe, elotuzumabe, rovelizumabe,

ruplizumabe, ustekinumabe, visilizumabe, gemtuzumabe ozogamicin,

brentuximb vedotin); receptores de antígenos quiméricos; inibidores do ciclo celular (flavopiridol, roscovitina, briostatina-1) e indutores de diferenciação

(tretinoína); Inibidores de mTOR, inibidores de topoisomerase (doxorrubicina

(adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorrubicina, dactinomicina,

enipósido, epirrubicina, etoposídeo, idarrubicina, irinotecano (CPT-11) e mitoxantrona, topotecolesterona, cortisteroxantrona, topotecolesterona,

cortisortisortona, metil-desidrisortisortona, cortisortisortisortona,

cortisortisortisortona, prednisona e prenisolona); Inibidores de PARP

(niraparibe, olaparibe); inibidores da quinase de adesão focal (FAK)

(defactinibe (VS-6063), VS-4718, VS-6062, GSK2256098); inibidores da quinase de transdução de sinal do fator de crescimento (cediranibe,

galunisertibe, rociletinibe, vandetanibe, afatinibe, EGF816, AZD4547);

inibidores de c-Met (capmatinib, INC280); Inibidores de ALK (ceritinibe,

crizotinibe); indutores de disfunção mitocondrial, toxinas tais como toxina da cólera, ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de adenilato ciclase de

Bordetella pertussis ou toxina da difteria e ativadores de caspase; e desrreguladores da cromatina.

Em alguns exemplos de realização, um agente quimioterápico é um inibidor de B-Raf, um inibidor de MEK, um inibidor de VEGF, um inibidor de VEGFR, um inibidor de tirosina quinase, um agente antimitótico ou qualquer combinação dos mesmos.

[298] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação é administrado em combinação com terapia de transferência de células adotivas (ACT), terapia de transferência de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T), terapia com vacina e terapia com citocinas.

[299] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação é administrado em combinação com pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora, por exemplo, uma citocina inibidora, como um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1 ou um anticorpo anti-IL-2.

[300] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti- SIRPβ1 da presente divulgação é administrado em combinação com pelo menos uma citocina estimuladora. Em alguns exemplos de realização que podem ser combinados com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, a pelo menos uma citocina estimuladora é selecionada a partir de IFN-α4, IFN-β, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1-beta e qualquer combinação das mesmas.

VI. USOS DIAGNÓSTICOS

[301] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos, qualquer um dos anticorpos anti-SIRPβ1 fornecidos neste documento é útil para detectar a presença de SIRPβ1 em uma amostra ou indivíduo. O termo “detecção”, conforme usado neste documento, abrange a detecção quantitativa ou qualitativa. São fornecidos métodos de uso dos anticorpos da presente divulgação para fins de diagnóstico, como a detecção de SIRPβ1 em um indivíduo ou em amostras de tecido derivadas de um indivíduo. Em alguns exemplos de realização, o indivíduo é um ser humano.

[302] O método de detecção pode envolver a quantificação do anticorpo ligado ao antígeno. A detecção de anticorpos em amostras biológicas pode ocorrer com qualquer método conhecido na técnica, incluindo microscopia de imunofluorescência, imunocitoquímica, imuno-histoquímica, ELISA, análise FACS, imunoprecipitação ou tomografia por emissão de micropósitrons. Em certos exemplos de realização, o anticorpo é radiomarcado, por exemplo, com 18F e, subsequentemente, detectado utilizando análise de tomografia por emissão de micropósitrons. A ligação de anticorpos também pode ser quantificada em um paciente por técnicas não invasivas, como tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada por raios X, tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada (CT) e tomografia axial computadorizada (CAT).

VII. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[303] São fornecidos neste documento artigos de fabricação/manufatura (por exemplo, kit) compreendendo um anticorpo anti- SIRPβ1 descrito neste documento. O artigo de fabricação pode incluir um ou mais recipientes compreendendo um anticorpo descrito neste documento.

Recipientes podem ser quaisquer embalagens adequadas incluindo, mas não está limitada às ampolas, garrafas, jarros, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos de plástico), e semelhantes. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens em lote (por exemplo, embalagens multidose) ou doses de subunidade.

[304] Em alguns exemplos de realização, os kits podem incluir ainda um segundo agente. Em alguns exemplos de realização, o segundo agente é um tampão ou agente diluente farmaceuticamente aceitável, incluindo, mas não limitado a, tal como água para injeção bacteriostática (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Em alguns exemplos de realização, o segundo agente é um agente farmaceuticamente ativo. Em alguns exemplos de realização, o segundo agente é um agente farmaceuticamente ativo descrito na presente invenção.

[305] Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos artigos de fabricação, o artigo de fabricação inclui ainda instruções para uso de acordo com os métodos desta descrição. Geralmente, as instruções incluem informações sobre dosagem, cronograma de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Em alguns exemplos de realização, essas instruções compreendem uma descrição da administração do anticorpo isolado da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-SIRPβ1 aqui descrito) para prevenir, reduzir o risco ou tratar um indivíduo com uma doença, distúrbio ou lesão selecionada dentre demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular ia, demência mista, doença de Creutzfeldt- Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doença taupatia, doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, lúpus, agudo e colite crônica, artrite reumatoide, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, obesidade, malária, tremor essencial, lúpus do sistema nervoso central, doença de Behçet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, Shy-Drager síndrome, paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar basal cortical, encefalomielite disseminada aguda, distúrbios granulomatosos, sarcoidose, doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, retinite pigmentosa, degeneração retinal, infecção do trato respiratório, sepse, infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget e câncer, de acordo com quaisquer métodos da presente divulgação. Em alguns exemplos de realização, as instruções incluem instruções para o uso do anticorpo anti-SIRPA e o segundo agente (por exemplo, o segundo agente farmaceuticamente ativo).

[306] A presente descrição será compreendida mais amplamente pela referência aos exemplos a seguir. Tais Exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente divulgação. Todas as citações ao longo da descrição são expressamente incorporadas a este documento por referência.

EXEMPLOS

[307] Os exemplos a seguir são fornecidos apenas com o objetivo de ilustrar e não como forma de limitação da presente invenção. Os versados na técnica reconhecerão prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente semelhantes.

EXEMPLO 1 PRODUÇÃO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS AGONISTAS ANTI- SIRPβ1

[308] A sequência de aminoácidos da proteína SIRPβ1 isoforma 1 humana (SIRPβ1) é apresentada abaixo na SEQ ID NO: 1. A SIRPβ1 humana contém um peptídeo sinal localizado nos resíduos de amino 1-29 da SEQ ID NO: 1; um domínio extracelular de tipo variável tipo imunoglobulina (IgV) localizado nos resíduos de amino 30-136 de SEQ ID NO: 1; dois domínios constantes do tipo imunoglobulina (IgC) localizados nos aminoácidos 147-246 e 253-347 da SEQ ID NO: 1; um domínio transmembranar localizado nos resíduos de amino 372-392 da SEQ ID NO: 1; e um domínio intracelular localizado nos resíduos de aminoácidos 393-398 da SEQ ID NO: 1.

[309] Sequência de aminoácidos da SIRPβ1 humana (SEQ ID NO: 1): 10 20 30 40 50

MPVPASWPHL PSPFLLMTLL LGRLTGVAGE DELQVIQPEK SVSVAAGESA 60 70 80 90 100

TLRCAMTSLI PVGPIMWFRG AGAGRELIYN QKEGHFPRVT TVSELTKRNN 110 120 130 140 150

LDFSISISNI TPADAGTYYC VKFRKGSPDD VEFKSGAGTE LSVRAKPSAP 160 170 180 190 200

VVSGPAVRAT PEHTVSFTCE SHGFSPRDIT LKWFKNGNEL SDFQTNVDPA 210 220 230 240 250

GDSVSYSIHS TARVVLTRGD VHSQVICEIA HITLQGDPLR GTANLSEAIR 260 270 280 290 300

VPPTLEVTQQ PMRAENQANV TCQVSNFYPR GLQLTWLENG NVSRTETAST 310 320 330 340 350

LIENKDGTYN WMSWLLVNTC AHRDDVVLTC QVEHDGQQAV SKSYALEISA 360 370 380 390 HQKEHGSDIT HEAALAPTAP LLVALLLGPK LLLVVGVSAI YICWKQKA.

[310] A sequência de aminoácidos da SIRPβ1 humana compreende um resíduo de lisina (aa380) dentro do domínio transmembranar que interage com um ácido aspártico em DAP12, uma proteína adaptadora chave que transduz a sinalização de SIRPβ1, bem como TREM1, TREM2, e outros membros da família IgV relacionados. Uma análise BLAST da SIRPβ1 humana identificou múltiplas isoformas possivelmente derivadas de splicing alternativo. Entre essas variantes de transcrição, a isoforma 3 da SIRPβ1 compartilha a maior identidade de sequência com a isoforma 1 da SIRPβ1 (FIG. 1A). A SIRPβ1 humana também está relacionada à SIRPα humana. Um alinhamento das sequências de aminoácidos da SIRPβ1 humana e SIRPα humana foi gerado por um BLAST de duas vias (Fig. 1B). A região extracelular de ambos os receptores compartilham 85% da identidade de sequência. Em contraste, o SIRPβ1 humana exibe homologia mais pobre com a SIRPβ1 de camundongo (FIG. 2), sugerindo que os loci do gene SIRP em ambas as espécies experimentam pressão de seleção divergente.

[311] Os anticorpos que se ligam ao domínio extracelular de SIRPβ1 humana, particularmente o domínio IgV extracelular (resíduos de aminoácidos 30-136 de SEQ ID NO: 1) podem ser gerados usando tecnologia de hibridoma de camundongo, tecnologia de exibição de fago e tecnologia de plataforma baseada em levedura. Os anticorpos são pesquisados quanto à sua capacidade de ligação às células que expressam SIRPβ1 e quanto à capacidade de ativar a sinalização de SIRPβ1, atividade e função de células e em um animal inteiro, in vivo, conforme descrito nos Exemplos 2- 20 a baixo.

Por exemplo, os anticorpos agonísticos anti-SIRPβ1 podem ser produzidos para atingir o domínio IgV (resíduos de aminoácidos 30-136). Por analogia à SIRPα, o domínio IgV de SIRPβ1 é previsto ligar-se a um ligante(s) desconhecido(s) e, através da multimerização do receptor, levar à ativação.

PRODUÇÃO DE DOMÍNIOS IGV DE SIRPΒ1 HUMANA A SIRPΑ HUMANA MARCADOS COM HIS (HIS-TAGGED) E CONJUGADOS COM FC

[312] Para a expressão em mamíferos de antígenos SIRPα humana e domínio IgV de SIRPβ1 humana (também referido como “domínio 1”) (SEQ ID NOs: 387 e 388, respectivamente), genes sintéticos baseados em cDNA foram clonados em vetores de expressão de mamífero, seguido por transfecção transitória e expressão em células HEK293/T. As construções incluíram um peptídeo sinal heterólogo e Fc de IgG1 humana C-terminal e/ou ou His-tag. Resumidamente, os vetores de expressão contendo o antígeno de interesse foram transfectados por complexação com um reagente de transfecção seguido por exposição a células HEK293/T por uma hora seguida por diluição do meio de cultura para uma densidade final de 4 milhões de células por mL. As células foram então cultivadas durante 7 dias com meio de alimentação fresco a cada 48 horas. Após 7 dias, o sobrenadante foi coletado após centrifugação e a purificação foi realizada usando Ni-sepharose e, em alguns casos, uma purificação em coluna SEC para atingir > 95% de teor de monômero não agregado. Os antígenos monoméricos SIRPα e SIRPβ1 foram preparados fragmentando um antígeno de fusão SIRPα/β1 Fc com a região de dobradiça modificada (Lynaugh et al., MAbs. outubro de 2013; 5 (5): 641-45) com a protease FabRICATOR (IdeS) (Genovis, Cat # A2-FR2-1000), seguido por purificação de afinidade de Proteína A para remover a proteína de fusão Fc não digerida e SEC para remover o monômero agregado.

TRIAGEM DE BIBLIOTECA PARA ANTICORPOS ANTI-SIRPΒ1

[313] Oito bibliotecas de leveduras sintéticas humanas naïves (pré-imune), cada uma com ~109 diversidades, foram concebidas, geradas e propagadas como descrito anteriormente (Consulte, por exemplo: Xu et al., 2013; documentos WO2009036379; WO2010105256; WO2012009568; Xu et al., Protein Eng Des Sel. outubro de 2013; 26 (10): 663-70). Dez seleções paralelas foram realizadas, usando as oito bibliotecas naïves para seleções de antígenos de fusão SIRPβ1- Fc e dois conjuntos das oito bibliotecas para seleções de monômero de SIRPβ1 humana. Para as duas primeiras rodadas de seleção, uma técnica de classificação com esferas magnéticas utilizando o sistema Miltenyi MACs foi realizada, essencialmente conforme descrito (Siegel et al., J Im munol Methods. março de 2004; 286 (l-2): 141-53). Resumidamente, células de levedura (~ 109 células/biblioteca, densidade total ~ 1010) foram incubadas com 3 mL de 10 nM de antígeno de fusão SIRPβ1-Fc biotinilado ou 100 nM de antígeno de monômero SIRPβ1 biotinilado por 15 min em temperatura ambiente em tampão de lavagem FACS de PBS com BSA a 0,1%.

Após a lavagem por uma vez com 50 mL de tampão de lavagem gelado, o sedimento celular foi ressuspenso em 40 mL de tampão de lavagem e 500 μL de microesferas com estreptavidina (Streptavidin MicroBeads) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha. Cat # 130-048-101) foram adicionados à levedura e incubados durante 15 min a 4ºC. Em seguida, as células de levedura foram sedimentadas, ressuspensas em 5 mL de tampão de lavagem e carregadas em uma coluna MACS LS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha. Cat. # 130-042-401). Depois de carregados os 5 mL, a coluna foi lavada 3 vezes com 3 mL de tampão de lavagem FACS. A coluna foi então removida do campo magnético e a levedura foi eluída com 5 mL de meio de crescimento e depois cultivada durante a noite. As seguintes quatro rodadas de classificação foram realizadas usando citometria de fluxo.

[314] Para a primeira rodada de seleção FACS, aproximadamente 1x108 leveduras foram sedimentadas, lavadas três vezes com tampão de lavagem e incubadas com 10 nM de antígeno de fusão SIRPβ1-Fc biotinilado ou 100 nM de antígeno de monômero SIRPβ1 biotinilado por 10 min em temperatura ambiente. A levedura foi então lavada duas vezes e corada com anticorpo de cabra anti-F(ab')2 kappa (capa) humano-FITC diluído 1:100 (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, Cat # 2062-02) e estreptavidina-Alexa Fluor 633 (Life Technologies, Grand Isla nd, NY, Cat # S21375) diluído 1:500 ou Extravidina-ficoeritina (Sigma- Aldrich, St Louis, Cat # E4011) diluído 1:50, reagentes secundários por 15 min a 4ºC. Depois de lavar duas vezes com tampão de lavagem gelado, os pellets de células foram ressuspensos em 0,4 mL de tampão de lavagem e transferidos para tubos de classificação com tampa de filtro. A classificação foi realizada usando um classificador FACS ARIA (BD Biosciences) e os gates de classificação foram determinados para selecionar apenas clones de ligação à SIRPβ1. Na rodada de seleção seguinte, aproximadamente 2 x 10 7 leveduras foram preparadas como descrito acima, mas a incubação foi com um reagente de reatividade poliespecífica para conduzir uma classificação negativa para diminuir os ligantes poliespecíficos (Xu et al., PEDS. outubro de 2013; 26 (1 0): 663 -70), e ligantes para controlar a proteína, monômero de SIRPα humana marcado com HIS. Na rodada seguinte utilizou-se a marcação com antígenos de fusão SIRPβ1-Fc humanos 10 nM e antígeno monômero SIRPβ1 humana 100 nM. Após a rodada final de classificação, as células de levedura foram semeadas e as colônias individuais foram coletadas para a caracterização. A rodada final utilizou marcação com antígeno monômero SIRPβ1 humana 100 nM e 10 nM.

[315] As cadeias pesadas a partir da segunda e quarta rodadas da triagem de seleção FACS foram usadas para preparar bibliotecas de diversificação de cadeia leve utilizadas para seleções adicionais. Para essas seleções, a primeira rodada de seleção utilizou esferas Miltenyi MACs e marcação com antígeno de fusão SIRPβ1-Fc humano a 10 nM. Quatro rodadas de classificação FACS foram feitas. A primeira rodada utilizou 100 nM de antígeno monômero SIRPβ1. A segunda rodada de FACS foi uma espécie negativa para diminuir a ligação aos reagentes ligantes, ligantes poliespecíficos e ligantes para controlar monômero His-tagged da proteína SIRPα humana. As duas últimas rodadas utilizaram titulação de monômero de SIRPβ1 humana (100 nM, 10 nM e 1 nM) para selecionar ligantes de maior afinidade, monômero de SIRPα humana a 100 nM e competição com anticorpo de controle AM4-5, que se liga ao domínio IgV da SIRPβ1, para avaliar a representação do concorrente na população enriquecida. (consulte a Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos US2014/0242095.) Após a rodada final de classificação, as células de levedura foram semeadas e as colônias individuais foram coletadas para a caracterização.

PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IGG E FAB

[316] Os clones de levedura foram cultivados até à saturação e, em seguida, induzidos durante 48 h a 30ºC com agitação. Após a indução, as células de levedura foram sedimentadas e os sobrenadantes foram coletados para purificação. As IgGs foram purificadas usando uma coluna de Proteína A e eluídas com ácido acético, pH 2,0. Os fragmentos Fab foram gerados por digestão com papaína e purificados sobre a matriz de afinidade CaptureSelect IgG-CH1.

[317] (LifeTechnologies, Cat # 1943200250). EXPERIMENTOS DE LIGAÇÃO OCTET®

[318] As afinidades dos anticorpos anti-SIRPβ1 foram determinadas medindo suas constantes de dissociação (KD) usando um sistema ForteBio Octet® Red384 (ForteBio, Menlo Park, CA), realizado geralmente como descrito anteriormente (Estep et al., MAbs. março-abril de 2013; 5 (2): 270-8).

Resumidamente, as medições de afinidade do Octet foram realizadas carregando IgGs em linha em sensores AHQ. Os sensores foram equilibrados off-line em tampão de ensaio por 30 min e depois monitorados on-line por 60 segundos para o estabelecimento do valor basal. Para a medição de ligação ávida, os sensores com IgGs carregados foram expostos a 100 nM de antígeno (fusão de domínio 1 da SIRPα humana (D1) – Fc ou fusão de domínio 1 da SIRPβ1 (D1) – Fc ) por 3 min, e então transferidos para tampão de ensaio por 3 min para medição da velocidade de dissociação. Foi determinada a avidez de ligação adicional pelo carregamento de monômero de SIRPβ1 biotinilado em sensores SA e expondo a 100 nM de IgG na solução. As medições de ligação monovalentes foram obtidas por carregamento de antígenos de fusão SIRPα humana ou SIRPβ1 humana com Fc no sensor AHQ, seguido por exposição a 100 nM anticorpo Fab anti-SIRPβ1. Medições monovalentes adicionais foram feitas por carregamento monômero SIRPα ou SIRPβ1 humana no sensor SA seguido por exposição a 100 nM de Fab em solução. Os dados cinéticos foram ajustados usando um modelo de ligação 1:1 no software de análise de dados fornecido pela ForteBio (ForteBio Data Analysis Software 7.0).

CLASSIFICAÇÃO DE EPÍTOPOS (EPITOPE BINNING)

[319] A classificação de epítopos dos anticorpos anti-SIRPβ1 foi realizada em um sistema ForteBio Octet® Red384 (ForteBio, Menlo Park, CA) usando um ensaio de classificação em formato sanduíche padrão. Um IgG antialvo de controle foi carregado em sensores AHQ e os sítios de ligação ao Fc desocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgG1 humano não relevante. Os sensores foram então expostos a 100 nM de antígeno alvo seguido por um segundo anticorpo antialvo. Os dados foram processados usando o programa ForteBio Data Analysis software 7.0. A ligação adicional pelo segundo anticorpo após a associação do antígeno indica um epítopo não ocupado (não competidor), enquanto nenhuma ligação indica o bloqueio do epítopo (competidor).

Este processo foi iterado para dois anticorpos de referência que se ligam ao domínio IgV de SIRPβ1: (i) AM4-5, que define o bin 1; e (ii) SB-17, que define o bin

2.

[320] O conjunto final de anticorpos anti-SIRPβ1 foi selecionado com base nas afinidades de ligação ao antígeno. Os anticorpos que eram positivos para a ligação a humana SIRPβ1 foram testados para reatividade cruzada com SIRPα humana. A categoria bin de cada um dos anticorpos está listada abaixo na Tabela

2. Na Tabela 2, “N.D.” refere-se a anticorpos para os quais a categoria Bin não foi determinada; “N.B.” refere-se a anticorpos para os quais não havia ligação ao antígeno indicado; “P.F.” refere-se a anticorpos para os quais a cinética de ligação ao antígeno mostra fraco ajuste para um modelo de ligação 1:1. Nenhuma ligação detectável para SIRPβ1 D1-Fc de camundongo, SIRPα D1-Fc humano ou SIRPα D1-Fc de camundongo foi observada para qualquer um dos anticorpos anti-SIRPβ1.

TABELA 2 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 Índice de clones Cód. Bin (SIRPβ1 Fab KD SIRPβ1 humana- IgG KD SIRPβ1 humana (SB#) humana) Fc (M) Monovalente D1-Fc (M) Avidez 1* 2 9,79E-08 9,66E-10 2* 2 2,66E-07 1,97E-09 3 2 P.F. P.F. 4 2 P.F. P.F. 5 2 P.F. P.F. 6 2 1,31E-07 1,30E-09 7 2 P.F. P.F. 8* 2 1,26E-07 2,72E-09

Índice de clones Cód.

Bin (SIRPβ1 Fab KD SIRPβ1 humana- IgG KD SIRPβ1 humana (SB#) humana) Fc (M) Monovalente D1-Fc (M) Avidez

9 2 P.F. 3,66E-09 10 2 P.F.

P.F. 11 2 6,78E-07 3,69E-09 12 1 N.B. 4,94E-09 13 1 P.F.

P.F. 14 2 P.F.

P.F. 15 2 4,07E-07 3,45E-09 16 2 N.B.

P.F. 17 2 2,46E-07 3,32E-09 18 2 P.F.

P.F. 19 2 N.B. 7,41E-09 20 2 P.F.

P.F. 21 1 N.B. 5,86E-09 22 2 N.B.

P.F. 23 2 P.F.

P.F. 24 1 N.B.

P.F. 25 2 N.B.

P.F. 26 2 N.B. 6,17E-09 27 2 P.F.

P.F. 28 2 P.F. 5,59E-09 29 2 N.B. 1,07E-08 30 2 N.B. 7,87E-09 31 2 P.F. 3,75E-09 32 1 N.B. 7,13E-09 33 2 N.B. 9,23E-09 34 1 N.B.

P.F. 35 2 N.B. 7,47E-09 36 2 N.B.

P.F. 37 2 N.B. 7,50E-09 38 2 N.B. 7,33E-09 39 1 N.B. 2,14E-08

Índice de clones Cód. Bin (SIRPβ1 Fab KD SIRPβ1 humana- IgG KD SIRPβ1 humana (SB#) humana) Fc (M) Monovalente D1-Fc (M) Avidez 40* 1,2 4,27E-07 9,64E-09 41 1,2 N.B. 1,03E-08 42 1 N.B. 1,23E-08 43 1 N.B. 1,23E-08 44 1,2 N.B. 1,89E-08 45 1 N.B. 1,39E-08 46 2 N.B. 2,00E-08 47 1,2 N.B. 1,44E-08 48 1,2 N.B. 2,77E-08 49 2 1,56E-07 4,39E-09 50 2 P.F. P.F.

SEQUÊNCIAS DE DOMÍNIO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA E LEVE DE ANTICORPO

[321] Usando técnicas padrão, foram determinadas as sequências de aminoácidos que codificam domínios variáveis da cadeia leve e os domínios variáveis da cadeia pesada dos anticorpos. As sequências dos anticorpos EU ou de Kabat são apresentadas nas Tabelas 3 - 6 a seguir. As sequências EU ou de Kabat da HVR de cadeia leve dos anticorpos são apresentadas na Tabela 3 . As sequências EU ou de Kabat da HVR de cadeia pesada dos anticorpos são apresentadas na Tabela 4 . As sequências EU ou de Kabat da região estrutural (Framework ou FR) de cadeia leve dos anticorpos são apresentadas na Tabela 5. As sequências EU ou de Kabat da região estrutural (Framework ou FR) de cadeia pesada dos anticorpos são apresentadas na Tabela 6. TABELA 3 SEQUÊNCIAS EU OU DE KABAT DA HVR DE CADEIA LEVE DE ANTICORPOS ANTI-

SIRPβ1 Ab ID HVR L1 SEQ ID HVR L2 SEQ ID HVR L3 SEQ ID

NO NO NO SB-1 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QLLGSSPRT 31 SB-2 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQSSSHPFT 32 SB-3 RASQSVSSYLA 2 DASNRAT 17 QQRLFHPPT 33 SB-4 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQYADAPIT 34 SB-5 RASQSVSSYLA 2 DASNRAT 17 QQRLFHPPT 33 SB-6 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQSGHLPIT 35 SB-7 KSSQSVLFSSNNKNYLA 3 WASTRES 18 QQHYIAPFT 36 SB-8 RASQSVSSSYLA 383 GASNRAT 19 QQVYSSPYT 37 SB-9 KSSQSVLFSSNNKNYLA 3 WASTRES 18 QQYHSVPPIT 38 SB-10 RSSQSLLHSNGYNYLD 4 LGSNRAS 20 MQAIESPLT 39 SB-11 RSSQSLLYSNGYNYLD 5 LGSNRAS 20 VQALQTPLT 40 SB-12 RASQSVSSNLA 6 SASTRAT 21 QQLDNLPYT 41 SB-13 RSSQSLLYSNGYNYLD 5 LGSNRAS 20 MQALRSPIT 42 SB-14 RASQSVSSYLA 2 DSSNRAT 22 QQFSYYPIT 43 SB-15 RASQSISSYLN 7 AASSLQS 23 QQAYSHPFT 44 SB-16 KSSQSVLFSSNNKNYLA 3 WASTRES 18 QQLFSTPFT 45 SB-17 KSSQSVLFSSNNKNYLA 3 WASTRES 18 QQYYDDPYT 46 SB-18 RSSQSLLHSNGYNYLD 4 LGSNRAS 20 LQALQTPIT 47 SB-19 RSSQSLLHSNGYNYLD 4 LGSNRAS 20 MQAIGVPPT 48 SB-20 KSSQSVLYSSNNKNYLA 8 WASTRES 18 QQYYLSPFT 49 SB-21 RSSQSLLHSNGYNYLD 4 LGSNRAS 20 MQTLRIPPT 50 SB-22 RASQGISSWLA 9 AASNLQS 24 QQGNSYPIT 51 SB-23 RASQSISSYLN 7 AASSLQS 23 QQAYPYPLT 52 SB-24 RASQSVSSNLA 6 GASTRAT 25 QQLNIHPWT 53 SB-25 RASQGISSWLA 9 AASSLQS 23 QQVNSFPWT 54 SB-26 RSSQSLLHSNGYNYLD 4 LGSNRAS 20 MQARGLPT 55 SB-27 KSSQSVLFSSNNKNYLA 3 WASTRES 18 QQAVSDPPT 56 SB-28 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQDGNFPLT 57 SB-29 RSSQSLLHSNGYNYLD 4 LGSNRAS 20 MQARGSPIT 58 SB-30 RASQSVSSSFLA 10 GASSRAT 16 QQFLSSPWT 59 SB-31 RASQGISSWLA 9 AASSLQS 23 QQAVSHPFT 60 SB-32 KSSQSVLYSSNNKNYLA 8 WASTRES 18 QQDFLTPIT 61 SB-33 QASQDISNYLN 11 DASNLET 26 QQFAFLPLT 62 SB-34 RASQSVSSNLA 6 GASTRAT 25 QQDNTFPYT 63 SB-35 RSSQSLLHSNGYNYLD 4 LGSNRAS 20 MQTLQVPLT 64 SB-36 RASQGISSWLA 9 AASSLQS 23 QQAFSHRT 65 SB-37 RASQSVSSYLA 2 DASNRAT 17 QQRHTYPLT 66 SB-38 RASQGISSWLA 9 AASSLQS 23 QQAVSYPIT 67 SB-39 RASQSISSYLN 7 GASSLQS 27 QQSYDFPLT 68 SB-40 RASQSVSSYLA 2 DSSNRAT 22 QQRDEHPPWT 69 SB-41 QASQDITNYLN 12 DASNLET 26 QQADNFPYT 70 SB-42 RASQSISSYLN 7 SASSLQS 28 QQGDSFPIT 71

Ab ID HVR L1 SEQ ID HVR L2 SEQ ID HVR L3 SEQ ID

NO NO NO SB-43 RASQSVSSYLA 2 DASKRAT 29 QQRFDFPIT 72 SB-44 RASQSIGSWLA 13 KASSLES 30 QEYGSYRT 73 SB-45 RASQSVSSSFLA 10 GASSRAT 16 QQVVSVPT 74 SB-46 RASQSVRSSYLA 14 GASSRAT 16 QQLYSSPYT 75 SB-47 QASQDISNYLN 11 DASNLET 26 QQADYFPIT 76 SB-48 RASQGIDSWLA 15 AASSLQS 23 QQASNFPIT 77 SB-49 QASQDITNYLN 12 DASNLET 26 QQYFHPPLT 78 SB-50 KSSQSVLFSSNNKNYLA 3 WASTRES 18 QQFLHTPRT 79 TABELA 4 SEQUÊNCIAS EU OU DE KABAT DA HVR DE CADEIA PESADA DE ANTICORPOS ANTI- SIRPβ1 Ab ID HVR H1 SEQ HVR H2 SEQ HVR H3 SEQ

ID ID ID

NO NO NO SB-1 SYAMS 80 TISGSGGSTYYADSVKG 101 DFTEVVGWLGMDV 125 SB-2 SYGMN 81 VIWYDGSNKYYADSVKG 102 DQTAAAAIWGMDV 126 SB-3 GYYMH 82 WINPSSGGTNYAQKFQG 103 EGIAATDAYFDL 127 SB-4 SYGIS 83 WISAYNGNTNYAQKLQG 104 SGTHFGTYSYSNWFDP 128 SB-5 GYYMH 82 WINPNSGGTNYAQKFQG 105 EGDEDWFDP 129 SB-6 SYAMS 80 TISGSGGSTYYADSVKG 101 DFTEVVGWLGMDV 125 SB-7 SYAIS 84 GIIPIFGTASYAQKFQG 106 ETRQDSAHYYGMDV 130 SB-8 SGYYWG 85 SIYHSGSTYYNPSLKS 107 GGAMTPAGMDV 131 SB-9 SYGIH 86 WISAYNGNTNYAQKLQG 104 DGLHYGDYIVYYGMDV 132 SB-10 SYAIS 84 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 GVPRGDLGMDV 133 SB-11 NYAIS 87 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 PVDSSSYSLGYYYGMDV 134 SB-12 GYYMH 82 WINPNSGGTSYAQKFQG 109 DTYAYSYGMDV 135 SB-13 SYYWS 88 SIYYSGSTNYNPSLKS 110 GDTSGGAYFDL 136 SB-14 SYAIS 84 GIIPIFGTASYAQKFQG 106 DRGGVGFDY 137 SB-15 SNSYYWG 89 SIYYSGSTYYNPSLKS 111 EVGAPPSYPFDI 138 SB-16 SYAIS 84 SIIPIFGTANYAQKFQG 112 ANYYDSSGYSGLDL 139 SB-17 SYGIS 83 WISAYNGNTNYAQKLQG 104 GPLLYGDYHVRYGMDV 140 SB-18 SYAIS 84 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 AKPRGDYGMDV 141 SB-19 SYAIS 84 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 DGGGGYAYEYFQH 142 SB-20 SYAIS 84 SIIPIFGTANYAQKFQG 112 DGREYGGHYYGMDV 143 SB-21 SNGIS 90 WISAYNGNTNYAQKLQG 104 VGNMDQEYFDL 144 SB-22 SNYMS 91 VIYSDGSTYYADSVKG 113 PTRYGYDRLGMDV 145 SB-23 SYAIS 84 GIAPIFGTANYAQKFQG 114 TTYRDYYMDV 146 SB-24 SGYYWA 92 SIYHSGSTYYNPSLKS 107 DRSRGYPVYGMDV 147 SB-25 SLAIS 93 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 SGGDYSGYDYASGMDV 148 SB-26 SYAIS 84 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 DGSAGRQEHGMDV 149 SB-27 SYAIS 84 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 QDLGSSHWHFDL 150 SB-28 SSSYYWG 94 SISYSGSTYYNPSLKS 115 DPRDYSSGSSGGGWGYFDL 151

Ab ID HVR H1 SEQ HVR H2 SEQ HVR H3 SEQ

ID ID ID

NO NO NO SB-29 SYAIS 84 SIIPIFGTANYAQKFQG 112 APYGSSSGYGYFDL 152 SB-30 SGGYYWS 95 YIYYSGSTVYNPSLKS 116 EGPGYPSYFDP 153 SB-31 SYYMH 96 IINPGGGSTSYAQKFQG 117 EGLYSSGWYIDV 154 SB-32 SYYWS 88 YIYSSGSTNYNPSLKS 118 GDSSSGGLDL 155 SB-33 SNYMS 91 VIYSGGSTYYADSVKG 119 GQYTGSLDV 156 SB-34 GYYMH 82 WINPNSGGTKYAQKFQG 120 DTYYTPYGMDV 157 SB-35 SYAIS 84 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 GRPQSESYLLDY 158 SB-36 SYYMH 96 IINPSGGSTSYAQKFQG 121 EGPEQLWYLDY 159 SB-37 NYAIS 87 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 SRWGASGYYYYMDV 160 SB-38 SYYMH 96 IINPSGGSTSYAQKFQG 121 ESGTDFGTISY 161 SB-39 SGYYWA 92 SIYHSGSTYYNPSLKS 107 GGSNYGDYGRFDY 162 SB-40 SYYMS 97 IINPSGGSTSYAQKFQG 121 DTGEYSYSPHGMDV 163 SB-41 SSSYYWG 94 SIYYSGSTYYNPSLKS 111 VGQYPIYGMDV 164 SB-42 SYGIS 83 WISAYNGNTNYAQKLQG 104 GPGHYYVAGMDV 165 SB-43 SGYYWA 92 SIYHSGSTYYNPSLKS 107 DAPGYPMLGMDV 166 SB-44 SNYMS 91 VIYSGGDTYYADSVKG 122 EGSSFWSGSAVSYYGMDV 167 SB-45 SGYYWA 92 SIYHSGSTYYNPSLKS 107 DLSRGYAVSGMDV 168 SB-46 SYAMS 80 AISGSGGSTYYADSVKG 123 ASPWELDV 169 SB-47 SSSYAWG 98 SIYYSGSTYYNPSLKS 111 DLGHYDYWSGSRDYYYGMDV 170 SB-48 SYGMH 99 VISYDGSNKYYADSVKG 124 DGTIAAAGWPPEYFQH 171 SB-49 SSDYYWG 100 SIYYSGSTYYNPSLKS 111 GPTGYKDKWRYYYGMDV 172 SB-50 SYAIS 84 GIIPIFGTANYAQKFQG 108 EGGGHASYHYYGMDV 173 TABELA 5 SEQUÊNCIAS EU OU DE KABAT DA FR DE CADEIA LEVE DE ANTICORPOS ANTI- SIRPβ1 Ab VL FR1 S VL FR2 S VL F3 S VL FR4 S

ID E E E E Q Q Q Q ID ID ID ID N N N N

O O O O SB- EIVMTQSPGTLSLS 17 WYQQKPGQ 18 GIPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 1 PGERATLSC 4 APRLLIY 6 RLEPEDFAVYYC 2 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPGTLSLSP 17 WYQQKPGQ 18 GIPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 2 GERATLSC 5 APRLLIY 6 RLEPEDFAVYYC 2 KVEIK 0 SB- EIVMTQSPATLSLS 17 WYQQKPGQ 18 GIPARFSGSGSGTDFTLTISS 19 FGGGT 20 3 PGERATLSC 6 APRLLIY 6 LEPEDFAVYYC 3 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPGTLSLSP 17 WYQQKPGQ 18 GIPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 4 GERATLSC 5 APRLLIY 6 RLEPEDFAVYYC 2 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPATLSLSP 17 WYQQKPGQ 18 GIPARFSGSGSGTDFTLTISS 19 FGGGT 20 5 GERATITC 7 APRLLIY 6 LEPEDFAVYYC 3 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPGTLSLSP 17 WYQQKPGQ 18 GIPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 6 GERATLSC 5 APRLLIY 6 RLEPEDFAVYYC 2 KVEIK 0

Ab VL FR1 S VL FR2 S VL F3 S VL FR4 S

ID E E E E Q Q Q Q ID ID ID ID N N N N

O O O O SB- DIVMTQSPDSLAVS 17 WYQQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 7 LGERATINC 8 PPKLLIY 7 SLQAEDVAVYYC 4 KVEIK 0 SB- EIVMTQSPGTLSLS 17 WYQQKPGQ 18 GIPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 8 PGERATLSC 4 APRLLIY 6 RLEPEDFAVYYC 2 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPDSLAVS 17 WYQQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 9 LGERATINC 8 PPKLLIY 7 SLQAEDVAVYYC 4 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPLSLPVT 17 WYLQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS 19 FGGGT 20 10 PGEPASISC 9 SPQLLIY 8 RVEAEDVGVYYC 5 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPLSLPVT 17 WYLQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS 19 FGGGT 20 11 PGEPASISC 9 SPQLLIY 8 RVEAEDVGVYYC 5 KVEIK 0 SB- EIVMTQSPATLSVS 18 WYQQKPGQ 18 GIPARFSGSGSGTEFTLTISS 19 FGGGT 20 12 PGERATLSC 0 APRLLIY 6 LQSEDFAVYYC 6 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPLSLPVT 17 WYLQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS 19 FGGGT 20 13 PGEPASISC 9 SPQVLIY 9 RVEAEDVGVYYC 5 KVEIK 0 SB- EIVMTQSPATLSLS 17 WYQQKPGQ 18 GIPARFSGSGSGTDFTLTISS 19 FGGGT 20 14 PGERATLSC 6 APRLLIY 6 LEPEDFAVYYC 3 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSLSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 15 VGDRVTITC 1 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPDSLAVS 17 WYQQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 16 LGERATINC 8 PPKLLIY 7 SLQAEDVAVYYC 4 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPDSLAVS 17 WYQQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 17 LGERATINC 8 PPKLLIY 7 SLQAEDVAVYYC 4 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPATLSLSP 18 WYLQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS 19 FGGGT 20 18 GERATLSC 2 SPQLLIY 8 RVEAEDVGVYYC 5 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPLSLPVT 17 WYLQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS 19 FGGGT 20 19 PGEPASISC 9 SPQLLIY 8 RVEAEDVGVYYC 5 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPDSLAVS 17 WYQQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 20 LGERATINC 8 PPKLLIY 7 SLQAEDVAVYYC 4 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPLSLPVT 17 WYLQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS 19 FGGGT 20 21 PGEPASISC 9 SPQLLIY 8 RVEAEDVGVYYC 5 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSVSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 22 VGDRVTITC 3 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSLSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 23 VGDRVTITC 1 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- EIVMTQSPATLSVS 18 WYQQKPGQ 18 GIPARFSGSGSGTEFTLTISS 19 FGGGT 20 24 PGERATLSC 0 APRLLIY 6 LQSEDFAVYYC 6 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSVSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 25 VGDRVTITC 3 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPLSLPVT 17 WYLQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS 19 FGGGT 20 26 PGEPASISC 9 SPQLLIY 8 RVEAEDVGVYYC 5 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPDSLAVS 17 WYQQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 27 LGERATINC 8 PPKLLIY 7 SLQAEDVAVYYC 4 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPGTLSLSP 17 WYQQKPGQ 18 GIPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 28 GERATLSC 5 APRLLIY 6 RLEPEDFAVYYC 2 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPLSLPVT 17 WYLQKPGQ 19 GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS 19 FGGGT 20

Ab VL FR1 S VL FR2 S VL F3 S VL FR4 S

ID E E E E Q Q Q Q ID ID ID ID N N N N

O O O O 29 PGEPASISC 9 SPQLLIF 1 RVEAEDVGVYYC 5 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPGTLSLSP 17 WYQQKPGQ 18 GIPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 30 GERATLSC 5 APRLLIY 6 RLEPEDFAVYYC 2 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSVSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 31 VGDRVTITC 3 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPDSLAVS 17 WYQQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 32 LGERATINC 8 PPKLLIY 7 SLQAEDVAVYYC 4 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSLSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTFTIS 19 FGGGT 20 33 VGDRVTITC 1 APKLLIY 0 SLQPEDIATYYC 8 KVEIK 0 SB- EIVMTQSPATLSVS 18 WYQQKPGQ 18 GIPARFSGSGSGTEFTLTISS 19 FGGGT 20 34 PGERATLSC 0 APRLLIY 6 LQSEDFAVYYC 6 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPLSLPVT 17 WYLQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS 19 FGGGT 20 35 PGEPASISC 9 SPQLLIY 8 RVEAEDVGVYYC 5 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSVSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 36 VGDRVTITC 3 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPATLSLSP 18 WYQQKPGQ 18 GIPARFSGSGSGTDFTLTISS 19 FGGGT 20 37 GERATLSC 2 APRLLIY 6 LEPEDFAVYYC 3 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSVSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 38 VGDRVTITC 3 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSLSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 39 VGDRVTITC 1 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPATLSLSP 18 WYQQKPGQ 18 GIPARFSGSGSGTDFTLTISS 19 FGGGT 20 40 GERATLSC 2 APRLLIY 6 LEPEDFAVYYC 3 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSLSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTFTIS 19 FGGGT 20 41 VGDRVTITC 1 APKLLIY 0 SLQPEDIATYYC 8 KVEIK 0 SB- EIVMTQSPATLSVS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 42 PGERATITC 4 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPATLSLSP 18 WYQQKPGQ 18 GIPARFSGSGSGTDFTLTISS 19 FGGGT 20 43 GERATLSC 2 APRLLIY 6 LEPEDFAVYYC 3 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSTLSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTEFTLTIS 19 FGGGT 20 44 VGDRVTITC 5 APKLLIY 0 SLQPDDFATYYC 9 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPGTLSLSP 17 WYQQKPGQ 18 GIPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 45 GERATLSC 5 APRLLIY 6 RLEPEDFAVYYC 2 KVEIK 0 SB- EIVLTQSPGTLSLSP 17 WYQQKPGQ 18 GIPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 46 GERATLSC 5 APRLLIY 6 RLEPEDFAVYYC 2 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSLSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTFTIS 19 FGGGT 20 47 VGDRVTITC 1 APKLLIY 0 SLQPEDIATYYC 8 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSVSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 48 VGDRVTITC 3 APKLLIY 0 SLQPEDFATYYC 7 KVEIK 0 SB- DIQMTQSPSSLSAS 18 WYQQKPGK 19 GVPSRFSGSGSGTDFTFTIS 19 FGGGT 20 49 VGDRVTITC 1 APKLLIY 0 SLQPEDIATYYC 8 KVEIK 0 SB- DIVMTQSPDSLAVS 17 WYQQKPGQ 18 GVPDRFSGSGSGTDFTLTIS 19 FGGGT 20 50 LGERATINC 8 PPKLLIY 7 SLQAEDVAVYYC 4 KVEIK 0 TABELA 6

SEQUÊNCIAS EU OU DE KABAT DA FR DE CADEIA PESADA DE ANTICORPOS ANTI- SIRPβ1 Ab ID VH FR1 S VH FR2 S VH F3 S VH FR4 S

E E E E Q Q Q Q ID ID ID ID N N N N

O O O O SB-1 EVQLLESGGGLVQPG 20 WVRQAPGK 21 RFTISRDNSKNTLYLQMN 21 WGQGT 22 GSLRLSCAASGFTFS 1 GLEWVS 0 SLRAEDTAVYYCAK 5 TVTVSS 2 SB-2 QVQLVESGGGVVQP 20 WVRQAPGK 21 RFTISRDNSKNTLYLQMN 21 WGQGT 22 GRSLRLSCAASGFTF 2 GLEWVA 1 SLRAEDTAVYYCAR 6 TVTVSS 2

S SB-3 QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTRDTSISTAYMELS 21 WGRGTL 22 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 RLRSDDTAVYYCAR 7 VTVSS 3

T SB-4 QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTTDTSTSTAYMEL 21 WGQGTL 22 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 RSLRSDDTAVYYCAR 8 VTVSS 4

T SB-5 QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTRDTSISTAYMELS 21 WGQGTL 22 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 RLRSDDTAVYYCAR 7 VTVSS 4

T SB-6 EVQLLESGGGLVQPG 20 WVRQAPGK 21 RFTISRDNSKNTLYLQMN 21 WGQGT 22 GSLRLSCAASGFTFS 1 GLEWVS 0 SLRAEDTAVYYCAK 5 TVTVSS 2 SB-7 QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGT 22 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 TVTVSS 2

S SB-8 QVQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGT 22 ETLSLTCAVSGYSIS 5 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 TVTVSS 2 SB-9 QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTTDTSTSTAYMEL 21 WGQGT 22 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 RSLRSDDTAVYYCAR 8 TVTVSS 2

T SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGT 22 10 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 TVTVSS 2

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGKGTT 22 11 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 VTVSS 5

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTRDTSISTAYMELS 21 WGQGT 22 12 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 RLRSDDTAVYYCAR 7 TVTVSS 2

T SB- QVQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGRGTL 22 13 ETLSLTCTVSGGSIS 6 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 VTVSS 3 SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGTL 22 14 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 VTVSS 4

S SB- QLQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGT 22 15 ETLSLTCTVSGGSIS 7 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 MVTVSS 6 SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGRGTL 22 16 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 VTVSS 3

S

Ab ID VH FR1 S VH FR2 S VH F3 S VH FR4 S

E E E E Q Q Q Q ID ID ID ID N N N N

O O O O SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTTDTSTSTAYMEL 21 WGQGT 22 17 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 RSLRSDDTAVYYCAR 8 TVTVSS 2

T SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGT 22 18 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 TVTVSS 2

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGTL 22 19 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 VTVSS 4

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGT 22 20 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 TVTVSS 2

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTTDTSTSTAYMEL 21 WGRGTL 22 21 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 RSLRSDDTAVYYCAR 8 VTVSS 3

T SB- EVQLVESGGGLVQP 20 WVRQAPGK 21 RFTISRDNSKNTLYLQMN 21 WGQGT 22 22 GGSLRLSCAASGFTV 8 GLEWVS 0 SLRAEDTAVYYCAR 6 TVTVSS 2

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGKGTT 22 23 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 VTVSS 5

S SB- QVQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGT 22 24 ETLSLTCAVSGYSIS 5 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 TVTVSS 2 SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGT 22 25 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 TVTVSS 2

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGT 22 26 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 TVTVSS 2

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGRGTL 22 27 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 VTVSS 3

S SB- QLQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGRGTL 22 28 ETLSLTCTVSGGSIS 7 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 VTVSS 3 SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGRGTL 22 29 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 VTVSS 3

S SB- QVQLQESGPGLVKPS 20 WIRQHPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGTL 22 30 QTLSLTCTVSGGSIS 9 GLEWIG 4 SVTAADTAVYYCAR 0 VTVSS 4 SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTRDTSTSTVYMEL 22 WGQGTL 22 31 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 SSLRSEDTAVYYCAR 1 VTVSS 4

T SB- QVQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGRGTL 22 32 ETLSLTCTVSGGSIS 6 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 VTVSS 3 SB- EVQLVESGGGLVQP 20 WVRQAPGK 21 RFTISRDNSKNTLYLQMN 21 WGQGT 22 33 GGSLRLSCAASGFTV 8 GLEWVS 0 SLRAEDTAVYYCAR 6 MVTVSS 6

S

Ab ID VH FR1 S VH FR2 S VH F3 S VH FR4 S

E E E E Q Q Q Q ID ID ID ID N N N N

O O O O SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTRDTSISTAYMELS 21 WGQGT 22 34 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 RLRSDDTAVYYCAR 7 TVTVSS 2

T SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGTL 22 35 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 VTVSS 4

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTRDTSTSTVYMEL 22 WGQGTL 22 36 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 SSLRSEDTAVYYCAR 1 VTVSS 4

T SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGT 22 37 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 MVTVSS 6

S SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTRDTSTSTVYMEL 22 WGQGTL 22 38 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 SSLRSEDTAVYYCAR 1 VTVSS 4

T SB- QVQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGTL 22 39 ETLSLTCAVSGYSIS 5 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 VTVSS 4 SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTRDTSTSTVYMEL 22 WGQGT 22 40 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 SSLRSEDTAVYYCAR 1 TVTVSS 2

T SB- QLQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGT 22 41 ETLSLTCTVSGGSIS 7 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 TVTVSS 2 SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTMTTDTSTSTAYMEL 21 WGQGT 22 42 GASVKVSCKASGYTF 3 QGLEWMG 2 RSLRSDDTAVYYCAR 8 TVTVSS 2

T SB- QVQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGT 22 43 ETLSLTCAVSGYSIS 5 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 TVSVSS 7 SB- EVQLVESGGGLVQP 20 WVRQAPGK 21 RFTISRDNSKNTLYLQMN 21 WGQGT 22 44 GGSLRLSCAASGFTV 8 GLEWVS 0 SLRAEDTAVYYCAR 6 TVTVSS 2

S SB- QVQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGT 22 45 ETLSLTCAVSGYSIS 5 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 TVTVSS 2 SB- EVQLLESGGGLVQPG 20 WVRQAPGK 21 RFTISRDNSKNTLYLQMN 21 WGQGT 22 46 GSLRLSCAASGFTFS 1 GLEWVS 0 SLRAEDTAVYYCAR 6 MVTVSS 6 SB- QLQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGT 22 47 ETLSLTCTVSGGSIS 7 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 TVTVSS 2 SB- QVQLVESGGGVVQP 20 WVRQAPGK 21 RFTISRDNSKNTLYLQMN 21 WGQGTL 22 48 GRSLRLSCAASGFTF 2 GLEWVA 1 SLRAEDTAVYYCAR 6 VTVSS 4

S SB- QLQLQESGPGLVKPS 20 WIRQPPGK 21 RVTISVDTSKNQFSLKLS 22 WGQGT 22 49 ETLSLTCTVSGGSIS 7 GLEWIG 3 SVTAADTAVYYCAR 0 TVTVSS 2 SB- QVQLVQSGAEVKKP 20 WVRQAPG 21 RVTITADESTSTAYMELS 21 WGQGT 22 50 GSSVKVSCKASGGTF 4 QGLEWMG 2 SLRSEDTAVYYCAR 9 TVTVSS 2

S CARACTERIZAÇÃO DA LIGAÇÃO DO ANTICORPO SIRPΒ1

[322] A caracterização inicial de anticorpos anti-SIRPβ1 envolveu a determinação de suas capacidades de ligar às linhagens de células que expressam SIRPβ1 humana ou de camundongo. As células foram coletadas, plaqueadas a 106/mL em uma placa de 96 poços, lavadas e incubadas em 100 μL de tampão FACS contendo 1 μg/mL de anticorpo anti-SIRPβ1 durante 0,5 hora em gelo. As células foram então lavadas duas vezes e incubadas em 100 μL de tampão FACS contendo 0,5 μg de anticorpo secundário/mL conjugado com PE durante 30 minutos em gelo. As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS frio e adquiridas em um BD FACS Canto. A análise de dados e o cálculo dos valores de intensidade média de fluorescência (MFI) ou % de células positivas foram realizadas com o software FlowJo (TreeStar) versão

10.0.7.

[323] A Tabela 7 mostra a média de valores da média de intensidade de fluorescência (IMF) de anticorpos SIRPβ1 que se ligam à linhagem de célula de ovário de hamster chinês (CHO) que expressa níveis baixos de SIRPβ1 humana recombinante. O controle isotípico da IgG1 humana estabeleceu o sinal de fluorescência de fundo definido como 1. Dos 50 clones de anticorpo anti-SIRPβ1 testados, 32 clones se ligaram a células com uma MFI ≥ 2 vezes sobre o fundo. Como um controle negativo, os anticorpos anti- SIRPβ1 também foram rastreados para ligação à superfície de células CHO que superexpressam SIRPβ1 recombinante de camundongo. Conforme esperado, nenhum dos anticorpos testados ligou-se à SIRPβ1 de camundongo.

Devido a alta similaridade de sequência entre os receptores da família SIRP, os anticorpos anti-SIRPβ1 também foram avaliados quanto à reatividade cruzada com SIRPα humana e de camundongo. Em ensaios de ligação de células, nenhum dos anticorpos anti-SIRPβ1 ligou-se às células que superexpressam SIRPα humana ou de camundongo.

TABELA 7

CARACTERIZAÇÃO DE LIGAÇÃO CELULAR DOS ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 VSF (Vezes sobre VSF da Ligação às VSF da Ligação às Índice de o fundo) da VSF da Ligação às Células SIRPβ de Células SIRPα de clones Ligação às Células SIRPα camundongo camundongo (SB#) Células SIRPβ Humana positivas positivas positivas Humana 1* 5,7 2,3 1,1 1,4 2* 8,7 3,0 1,3 1,1 3 2,5 1,8 1,3 1,3 4 1,7 2,0 1,2 0,9 5 1,6 2,0 1,3 1,5 6 4,3 1,2 1,2 1,0 7 3,7 2,0 1,5 1,0 8* 4,1 2,1 1,7 1,2 9 1,8 2,1 1,0 0,8 10 3,8 2,4 1,4 1,0 11 6,3 2,3 1,2 0,9 12 1,6 2,0 1,3 1,2 13 1,9 1,9 1,2 0,9 14 4,5 2,5 1,3 1,2 15 8,0 2,2 1,3 1,4 16 2,0 2,0 1,5 1,4 17 2,8 2,5 1,3 1,6 18 2,8 2,4 1,2 0,9 19 1,8 2,2 1,3 0,9 20 2,6 2,2 1,3 1,2 21 1,9 2,0 1,3 1,2 22 1,4 1,9 1,4 0,9 23 2,4 1,9 1,5 1,4 24 3,7 2,5 1,3 1,1 25 2,1 2,5 1,2 1,3 26 2,0 2,1 1,3 1,2 27 3,9 2,4 1,3 1,1 28 4,1 2,1 1,2 1,0 29 1,8 1,9 1,2 0,9 30 1,7 2,1 1,4 1,5 31 3,1 1,8 1,4 1,0

VSF (Vezes sobre VSF da Ligação às VSF da Ligação às Índice de o fundo) da VSF da Ligação às Células SIRPβ de Células SIRPα de clones Ligação às Células SIRPα camundongo camundongo (SB#) Células SIRPβ Humana positivas positivas positivas Humana 32 1,5 2,2 1,2 1,2 33 1,4 2,2 1,3 1,4 34 1,8 2,0 1,2 1,3 35 2,1 2,6 1,1 1,0 36 1,7 2,1 1,1 1,2 37 3,8 2,2 1,2 1,0 38 1,5 2,1 1,3 1,1 39 5,0 2,0 1,4 1,1 40* 7,0 2,5 1,1 1,2 41 1,7 2,2 1,3 1,7 42 3,3 2,7 1,2 1,2 43 2,8 2,3 1,1 1,6 44 2,8 2,9 1,5 1,2 45 8,5 2,5 1,4 1,2 46 5,3 2,1 1,3 1,4 47 1,6 2,1 1,3 1,7 48 1,7 2,1 1,1 2,4 49 3,4 2,7 1,2 1,7 50 2,8 2,5 1,2 1,7

[324] Além disso, os anticorpos anti-SIRPβ1 também foram rastreados quanto à especificidade do antígeno usando uma linhagem de células repórteres que expressam o gene da luciferase sob o controle de um promotor NFAT (fator nuclear de células T ativadas). A linhagem de células BW5147.G.1.4 (ATCC® TIB48®), derivada de linfócitos T de linfoma de camundongo, foi infectada com o vírus Cignal Lenti NFAT-luciferase (Qiagen), resultando em células repórteres BWZ/NFAT-luciferase. Em seguida, as células foram transduzidas com um lentivírus expressando quimera SIRPα- DAP12 humana, em que o motivo ITIM intracelular de SIRPα foi substituído pelo motivo ITAM intracelular de DAP12 ou com dois lentivírus expressando SIRPβ1 humana e DAP12 humano. Os anticorpos de teste, bem como o controle isotípico IgG1 humana, foram adsorvidos em uma placa de 96 poços a 10 μg/mL. Após a lavagem, 105 células repórteres NFAT-luciferase expressando a quimera huSIRPα/DAP12 (BWZ-huSIRPα) ou coexpressando huSIRPβ1 e DAP12 (BWZ-huSIRPβ1) foram semeadas em placas e incubadas durante a noite a 37ºC. A atividade da luciferase foi medida adicionando reagente OneGlo (Promega) a cada poço e incubando as amostras por 3 min em temperatura ambiente em um agitador de placas. O sinal de luminescência foi quantificado utilizando com um leitor de microplacas BioTek Synergy® Microplate Reader usando o software GEN5® 2.04. Como mostrado na FIG. 3A, 48 de 50 clones anti-SIRPβ1 induziram a expressão de luciferase > 5 vezes sobre o fundo em células repórter BWZ-huSIRPβ1. Em contraste, os anticorpos anti-SIRPβ1 falharam em induzir a expressão da luciferase quando as células repórter BWZ-huSIRPα foram adicionadas aos poços revestidos com anticorpo (FIG. 3B). Em resumo, apenas as células repórter que expressam SIRPβ1 humana induzem a expressão de luciferase na presença de anticorpos anti- SIRPβ1 imobilizados, conforme medido pelo sinal de luminescência. Estes resultados estabelecem que a maioria dos anticorpos anti-SIRPβ1 capazes de se ligar ao antígeno ligado à membrana demonstra especificidade em relação ao antígeno alvo sem reação cruzada com outros receptores SIRP.

EXEMPLO 2 PERFIL DE EXPRESSÃO DE SIRPβ1 EM CÉLULAS MIELOIDES

[325] A família SIRP compreende várias glicoproteínas transmembranas expressas principalmente dentro do compartimento de células mieloides. O padrão de expressão de SIRPβ1 foi verificado em células humanas primárias isoladas de doadores humanos saudáveis. Monócitos primários humanos foram isolados a partir de sangue periférico humano heparinizado obtido a partir de dois doadores saudáveis (Blood Centers of the

Pacific) usando um coquetel de Enriquecimento de Monócitos humanos RosetteSep (StemCell Technologies), de acordo com o protocolo do fabricante.

SIRPβ1 e TREM1 são preferencialmente expressos em monócitos CD14 high. Os monócitos foram semeados em meio RPMI (Invitrogen) contendo 10% de soro bovino fetal (Hyclone) e 50 ng/mL de M-CSF ou GM-CSF (Peprotech) para induzir a diferenciação de macrófagos tipo M2 ou M1, respectivamente. Após 5- 6 dias, os macrófagos foram coletados por raspagem das células fixadas ao plástico. Alternativamente, os monócitos foram semeados em meio RPMI contendo 10% de soro bovino fetal (Hyclone) e 20 ng/mL de IL-4 e GM-CSF (Peprotech) para induzir a diferenciação de células dendríticas imaturas. Após 6-7 dias, as células dendríticas foram coletadas por raspagem das células fixadas ao plástico.

[326] Como mostrado na FIG. 4A, a expressão de CD14 define um subconjunto de monócitos humanos primários. Monócitos clássicos e intermediários expressam altos níveis de CD14, enquanto monócitos não clássicos não apresentam expressão de CD14. Como TREM1, SIRPβ1 é abundantemente expressa em monócitos CD14+. Os monócitos isolados do sangue periférico como descrito acima foram cultivados durante 5 dias com M- CSF ou GM-CSF para gerar macrófagos M2 ou M1, respectivamente. A expressão de SIRPβ1 diminui após a diferenciação de monócitos primários em macrófagos com macrófagos tipo M1 expressando níveis mais elevados do receptor em relação a macrófagos tipo M2 (FIG. 4B). Da mesma forma, a expressão de SIRPβ1 diminui após a diferenciação de monócitos primários em células dendríticas imaturas. A maturação induzida por LPS de células dendríticas diminui ainda mais a expressão de SIRPβ1, em contraste com a expressão aumentada observada para TREM1 (FIG. 4C). Diferentemente de TREM1, o tratamento com LPS regula negativamente a expressão de SIRPβ1 nas DCs. O pico de expressão para SIRPβ1 ocorre no sangue, baço e pulmão.

A pesquisa do padrão de expressão de SIRPβ1 a partir de conjuntos de dados de RNA-seq de várias amostras de tecido coletadas de doadores saudáveis confirma que os níveis de transcrição de SIRPβ1 predominam no sangue, consistente com a alta expressão do receptor em monócitos e neutrófilos circulantes (FIG. 5A). Entretanto, os dados de RNA-seq revelam que o padrão de expressão de transcritos de uma isoforma 3 da SIRPβ diferem da isoforma 1 da SIRPβ; A isoforma 3 da SIRPβ1 é expressa principalmente no cérebro e não nos tecidos periféricos (FIG. 5B). (Os dados foram obtidos do banco de dados do consórcio Genotype-Tissue Expression (GTEx) Consortium).

EXEMPLO 3 ANTICORPOS SIRPβ1 INDUZEM FOSFORILAÇÃO DE SYK

[327] A tirosina quinase esplênica (Syk) é uma molécula de sinalização intracelular que funciona a jusante de SIRPβ1 por fosforilação de vários substratos, facilitando assim a formação de um complexo principal de sinalização para a ativação celular e processos inflamatórios.

A capacidade dos anticorpos agonistas SIRPβ1 em induzir a ativação de Syk é determinada por cultura de monócitos de camundongo e medição do estado de fosforilação da proteína Syk em extratos celulares. Nestes experimentos, um anticorpo secundário é usado para reticular anticorpos anti-SIRPβ1 nas células a fim de induzir a sinalização intracelular.

[328] Os monócitos derivados da medula (BMDM) de camundongos tipo selvagem (WT), de camundongos BAC transgênicos para SIRPβ1 humana e de camundongos que não possuem expressão do gene de cadeia gama comum do receptor Fc funcional (FcγR KO; REF: Takai T 1994. Cell 76 (3): 519-29) são mantidos em jejum por 4 horas em meio RPMI com 1% de soro e, em seguida, removidos das placas de cultura de tecidos com PBS-EDTA, lavados com PBS e contados. As células são revestidas com anticorpos SIRPβ1 de comprimento total ou com controle isotípico huIgG 1 por 15 minutos em gelo. Após lavagem com PBS frio, as células são incubadas a 37ºC durante o período de tempo indicado na presença de anticorpo de cabra anti-IgG humana. Após a estimulação, as células são lisadas com tampão de lise (1% v/v NP -40%, 50 Mm Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1,5 mM MgCl 2, 10% de glicerol, mais protease e inibidores de fosfatase) seguido por centrifugação a 16.000 g por 10 min a 4ºC para remover materiais insolúveis. Os lisados são então imunoprecipitados com anticorpo anti-Syk (N-19 para BMDM ou 4D10 para DCs humanas, Santa Cruz Biotechnology). As proteínas precipitadas são fracionadas por SDS-PAGE, transferidas para membranas de PVDF e sondadas com anticorpo antifosfotirosina (4G10, Millipore). Para confirmar que todos os substratos são adequadamente imunoprecipitados, os immunoblots são reexaminados com anticorpo anti-Syk (Abcam, para BMDM) ou anti-Syk (Novus Biological, para DCs humanas). A visualização é realizada com o sistema de quimioluminescência aprimorada (ECL) (GE Healthcare), conforme descrito (por exemplo, Peng et al., (2010) Sci Signal., 3 (122): ra38). Estes estudos fornecem suporte de que os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente invenção induzem a fosforilação de syk.

EXEMPLO 4 ANTICORPOS SIRPβ1 INDUZEM FOSFORILAÇÃO SYK QUANDO AGRUPADOS POR CÉLULAS ADJACENTES QUE EXPRESSAM RECEPTORES FC GAMA.

[329] A ativação da tirosina quinase esplênica (Syk) é facilitada pela reticulação de dois ou mais receptores SIRPβ1 com anticorpos, facilitando assim a formação de um complexo de sinalização que leva à ativação celular e processos inflamatórios. A reticulação in vivo é mediada por células adjacentes que expressam receptores Fc (FcR), como células B e outros leucócitos (White A.L., Cancer Immunol Immunother (2013) 62: 941–948; Wilson N.S., 2011,

Cancer Cell 19, 101 –113; Bartholomaeus P.J., Immunol 2014; 192: 2091- 2098). Nestes experimentos, as células acessórias que expressam os receptores Fc gama (isto é, células B) são usadas para reticular anticorpos anti-SIRPβ1 a fim de induzir a sinalização intracelular.

[330] A capacidade dos receptores Fc de induzir a ativação de Syk através do agrupamento de anticorpos é determinada cultivando monócitos de camundongo na presença de células que expressam receptores Fc e medindo o estado de fosforilação da proteína Syk em extratos celulares.

Monócitos derivados da medula óssea (BMDM) a partir de camundongos tipo selvagem (WT) e camundongos BAC transgênicos com SIRPβ1 humana são privados durante 4 horas em meio RPMI com 1% de soro e, em seguida, removidos das placas de cultura de tecido com PBS-EDTA, lavados com PBS, e contados. As células são revestidas com anticorpos SIRPβ1 de comprimento total ou com controle isotípico huIgG1 por 15 minutos em gelo. Após a lavagem com PBS frio, as células são incubadas por 5 minutos a 37ºC com células fixadas em glutaraldeído que expressam receptores Fc e que são previamente preparadas da seguinte forma. Resumidamente, as células que expressam o receptor Fc são células B isoladas a partir de baço de camundongos utilizando microesferas MACS (kit de isolamento de células B CD19 + Miltenyi Biotec), de acordo com o protocolo do fabricante ou alternativamente, a linhagem de células P815 que expressa em excesso FcR2b e FcR3. 2 x 10 6 células/mL são fixadas com glutaraldeído a 0,05% durante 1 minuto à temperatura ambiente, a reação é interrompida com 1 μM de glicina e as células são então lavadas exaustivamente com PBS. Após a estimulação, as células são lisadas com tampão de lise (1% v/v NP-40%, 50 Mm Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1,5 mM MgCl2, 10% de glicerol, mais protease e inibidores de fosfatase) seguido por centrifugação a 16.000 g por 10 min a 4ºC para remover materiais insolúveis. Os lisados são então imunoprecipitados com anticorpo anti-Syk (N-

19 para BMDM ou 4D10 para DCs humanas, Santa Cruz Biotechnology). As proteínas precipitadas são fracionadas por SDS-PAGE, transferidas para membranas de PVDF e sondadas com anticorpo antifosfotirosina (4G10, Millipore). Para confirmar que todos os substratos são adequadamente imunoprecipitados, os immunoblots são reexaminados com anticorpo anti-Syk (Abcam, para BMDM) ou anti-Syk (Novus Biological, para DCs humanas). A visualização é realizada com o sistema de quimioluminescência aprimorada (ECL) (GE Healthcare), conforme descrito (por exemplo, Peng et al., (2010) Sci Signal., 3 (122): ra38). Estes estudos fornecem suporte de que os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente invenção induzem a fosforilação de syk quando agrupados por células adjacentes que expressam receptores Fc gama.

EXEMPLO 5 ANTICORPOS SIRPβ1 INDUZEM EXPLOSÃO RESPIRATÓRIA EM CÉLULAS DO SISTEMA

IMUNOLÓGICO

[331] A função agonística dos anticorpos SIRPβ1 da presente divulgação foi avaliada em células imunes humanas inatas primárias (por exemplo, monócitos e neutrófilos).

[332] Anticorpos anti-SIRPβ1 e de controle isotípicos foram diluídos em meio RPMI isento de soro e misturados com 100.000 neutrófilos em placas de 96 poços a uma concentração de 10 μg/mL. Os neutrófilos primários foram isolados com o kit EasySep® Direct Human Neutrophil Isolation Kit (STEMCELL) de acordo com as instruções do fabricante a partir do sangue periférico obtido no mesmo dia. Para detectar a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), as células foram marcadas com 2 μM do corante fluorescente, CM-H2DCFDA. As células foram estimuladas com controle isotípico IgG1 humano de comprimento total solúvel ou os anticorpos anti- SIRPβ1 SB-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -11, -14, -15, -17, -27, -28, -31, -39, - 40, -41, -45, -46 e -49. Após 1 hora de estimulação mediada por anticorpos na presença de CM-H2DCFDA a 37ºC, as unidades de fluorescência relativas nas células foram medidas no comprimento de onda de excitação 495 nm e comprimento de onda de emissão 530 nm. O índice de fluorescência específico de células estimuladas foi obtido por subtração da fluorescência de fundo de células marcadas incubadas em meio sozinho e/ou com anticorpo de controle isotípico (huIgG1). As placas foram lidas com um leitor de microplacas BioTek Synergy® usando o software GEN5® 2.04.

[333] Na FIG. 6A, neutrófilos humanos primários de 2 doadores saudáveis foram estimulados com 10 μg/mL de anticorpos anti-SIRPβ1 solúveis de comprimento total ou controle isotípico IgG1 humana e marcador com 2 μM de CM-H2DCFDA por 1 hora a 37ºC para monitorar a produção de ROS mediada por SIRPβ1. Os anticorpos SIRPβ1 SB-1, -2, -3 e -5 mostraram- se altamente agonísticos em solução. Em contraste, os anticorpos SIRPβ1 SB- 15, -17, -27, -28, -31, -39, -40, -41, -45, -46 e -49 ativaram fracamente a explosão respiratória mediada por SIRPβ1 em solução.

[334] As células foram deixadas sem tratamento ou estimuladas com controle isotípico IgG1 humano de comprimento total solúvel ou os anticorpos anti-SIRPβ1 SB-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -11, -12, -13, -14, -15, - 17, -23, -26, -27, -28, -31, -33, -34, -35, -36, -37, -39, -40, -41, -45, -46, e -49.

Na FIG. 6B, os monócitos humanos primários foram estimulados com 20 μg/mL de anticorpos anti-SIRPβ1 solúveis de comprimento total ou controle isotípico IgG1 humana e marcador com 2 μM de CM-H2DCFDA por 1 hora a 37ºC para monitorar a produção de IL-8 e produção de ROS mediada por SIRPβ1. Os anticorpos SIRPβ1 SB-2, -3, -4, -5, -6, -7, -28 e -49 mostraram-se altamente agonísticos em solução. Em contraste, os anticorpos SIRPβ1 SB-14, -15, -17, - 27, -41, -45 e -46 ativaram fracamente a explosão respiratórios mediada por SIRPβ1 enquanto em solução. Além disso, os monócitos primários foram estimulados durante a noite a 37 º C com anticorpos anti-SIRPβ1 adsorvidos em placas de 96 poços a 10 μg/mL. A fração de sobrenadante foi subsequentemente coletada e testada quanto à libertação de IL-8. Os anticorpos SIRPβ1 SB-1, -2, -3, -7, -8, -9, -14, 28 e -49 mostraram-se altamente agonísticos como anticorpos ligados à placa. Em contraste, os anticorpos SIRPβ1 SB-4, -12, -23, -26, -33, -34, -35, -36 e -37 ativaram fracamente a liberação de citocina mediada por SIRPβ1.

EXEMPLO 6 SIRPβ1 AUMENTA A SECREÇÃO DE CITOCINAS INFLAMATÓRIAS A PARTIR DE MACRÓFAGOS.

[335] A literatura publicada descreve macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) ou macrófagos peritoneais primários que possuem respostas TLR alteradas quando deficientes em DAP12. Para determinar se os anticorpos SIRPβ1 da presente divulgação induzem mudanças na produção de citocinas inflamatórias, macrófagos derivados de monócitos humanos primários e células dendríticas são cultivados com anticorpos de teste ligados à placa em combinação com níveis não saturantes de estimuladores de TLR e o nível de citocinas é medido após 24h. Para gerar macrófagos e células dendríticas derivados de monócitos, monócitos primários humanos foram isolados a partir do sangue humano heparinizado (Blood Centers of the Pacific) usando o coquetel de enriquecimento de monócitos RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies), de acordo com o protocolo do fabricante. Os monócitos foram semeados em RPMI (Invitrogen) contendo 10% de Soro Bovino Fetal (Hyclone) e 50 ng/mL de M-CSF para induzir a diferenciação de macrófagos. Após 5-6 dias, os macrófagos foram coletados por raspagem das células fixadas ao plástico. Alternativamente, os monócitos foram semeados em meio RPMI contendo 10% de soro bovino fetal (Hyclone) e 20 ng/mL de IL-4 e GM-CSF (Peprotech) para induzir a diferenciação de células dendríticas imaturas. Após 6-7 dias, as células dendríticas foram coletadas por raspagem das células fixadas ao plástico. Os macrófagos ou células dendríticas são plaqueados em placas de 96 poços revestidas com o anticorpo indicado a uma densidade de 105 células/poço e incubadas durante 24 h a 37ºC. As células são coestimuladas com agonista de TLR4, LPS (Salmonella abortus equi).

[336] Conforme mostrados na FIG. 6C, as células dendríticas e macrófagos derivados de monócitos foram estimulados durante a noite a 37ºC com 0,5 ng/mL de LPS na presença de anticorpos anti-SIRPβ1 (SB-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -11, -12, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -28, -32, -40 e - 49) adsorvido em placas de 96 poços a 10 μg/mL. A fração sobrenadante foi subsequentemente coletada e testada quanto à libertação de TNFα. Como controle negativo, as DCs foram estimuladas com LPS na presença de anticorpo anti-SIRPα ligado à placa, SA-56-90, que suprime a liberação de TNFα. Em todos os experimentos de medição da explosão respiratória, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi monitorada por células de marcação com 2 μM do indicador fluorescente, CM-H2DCFDA. Os anticorpos SIRPβ1 SB-1, -2, -6, -8 e -49 mostraram-se altamente agonísticos como anticorpos ligados à placa. Em contraste, a maioria dos anticorpos SIRPβ1 restantes ativou fracamente a liberação de citocinas mediada por SIRPβ1. Da mesma forma, SB-1 e SB-40 ligados à placa, mas não SB-32, aumentaram a liberação de TNFα induzida por LPS a partir de células dendríticas derivadas de monócitos. Em contraste, a liberação de TNFα induzida por LPS foi diminuída em células dendríticas estimuladas com anticorpo anti- SIRPα ligado à placa, SA-90, confirmando que os anticorpos anti-SIRPβ1 agonísticos ativam as células, enquanto os anticorpos SIRPα agonísticos inibem a atividade celular. EXEMPLO 7 ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NEUTRÓFILOS ESTIMULADOS POR SIRPβ1

[337] Embora os neutrófilos sejam fagócitos eficientes para as células alvo opsonizadas com anticorpo ou complemento, no contexto do microambiente tumoral, os neutrófilos contribuem geralmente para a progressão, invasão e angiogênese do tumor. No entanto, publicações recentes sugerem que os neutrófilos associados ao tumor, como outras células mieloides, retêm o potencial de polarização em direção a um fenótipo antitumoral. Uma vez que os neutrófilos expressam níveis elevados de SIRPβ1, os anticorpos anti-SIRPβ1 foram avaliados quanto à capacidade de induzir a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vitro. Os neutrófilos primários foram isolados com o kit EasySep® Direct Human Neutrophil Isolation Kit (STEMCELL) de acordo com as instruções do fabricante a partir do sangue periférico de doadores saudáveis obtido no mesmo dia. Os neutrófilos humanos isolados foram então adicionadas em placas de 96 poços previamente revestidas com 10 μg/mL de anticorpos anti-SIRPβ1 ou controle isotípico.

Subsequentemente, células de linfoma de células B Raji projetadas para expressarem luciferase de maneira estável foram misturadas com neutrófilos em uma proporção de 1:1 com ou sem anticorpo opsonizante (anti-CD20 IgG1 humana). As células cocultivadas foram incubadas durante a noite a 37ºC, e as células Raji viáveis foram quantificadas pela mediação da atividade da luciferase após a adição do reagente OneGlo (Promega) e incubando as amostras à temperatura ambiente por 3 min em um agitador de placa. O sinal de luminescência foi detectado com um leitor de microplacas BioTek Synergy® Microplate Reader usando o software GEN5® 2.04.

[338] Tal como mostrado na FIG. 7, os neutrófilos humanos não conseguiram eliminar as células Raji quando cocultivados na presença de anticorpo de controle isotípico imobilizado. A adição de anti-CD20 huIgG1 não restaurou a depuração de células tumorais com neutrófilos não estimulados. Da mesma forma, os neutrófilos estimulados com anticorpos anti-SIRPβ1 imobilizados falharam em eliminar significativamente as células Raji. No entanto, os neutrófilos estimulados com SIRPβ1 limparam as células Raji opsonizadas com anti-CD20. Os anticorpos agonísticos anti-SIRPβ1 SB-1, SB- 2, SB-3 e SB-4 reduziram o sinal de luminescência de células Raji viáveis em ~ 50% em comparação com neutrófilos tratados com controle isotípico. Os anticorpos anti-SIRPβ1 SB-28 e SB-49 demonstraram atividade fraca contra células Raji opsonizadas. Estes resultados sugerem que os anticorpos anti- SIRPβ1 agonísticos aumentam as propriedades antitumorais dos neutrófilos.

EXEMPLO 8 MATURAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1

[339] Cinco anticorpos anti-SIRPβ1, SB-1, CGS-2, SB-8, e SB-40 (designados como anticorpos “parentais”), com vários atributos físicos e funcionais foram maturados por afinidade. Resumidamente, bibliotecas diversificadas de anticorpos foram criadas em levedura para cada um dos anticorpos parentais de partida. A diversidade foi criada utilizando técnicas de clonagem molecular padrão para combinar a cadeia pesada parental CDR-H3 e cadeia leve (LC) com diversidade genética pré-existente nas regiões CDR-H1 e CDR-H2 da cadeia pesada (HC) (denominada otimização “H1/H2”). Isso resultou em seis bibliotecas de aproximadamente 105 clones de tamanho; 1:755-768 para seleção de anticorpos com afinidade melhorada. As pressões de seleção utilizadas para a triagem de bibliotecas incluíram a titulação de antígeno de equilíbrio de SIRPα e SIRPβ1 humanas, cinética de competição de anticorpos Fab parentais, e o uso do reagente de seleção poliespecífica (tal como descrito, por exemplo, no documento WO 2014/179363; Xu et al., Protein Eng Des Sel, 26 (10) : 663-670). A citometria de fluxo FACS foi então empregada para visualizar e selecionar anticorpos, usando técnicas padrão (Consulte, por exemplo, Chao et al. Nature Protocols, 2006; 1: 755-768). A população desejada foi então transportada para rodadas de seleção adicionais.

Após 6 rodadas de enriquecimento, as células de levedura foram semeadas a fim de se obter isolados de anticorpo único, que foram então produzidos e caracterizados como descrito no Exemplo 1. Dezessete anticorpos com afinidade aprimorada a partir de quatro dos cinco anticorpos parentais iniciais foram assim obtidos.

PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IGG E FAB

[340] Os clones de levedura foram cultivados até à saturação e, em seguida, induzidos durante 48 h a 30ºC com agitação. Após a indução, as células de levedura foram sedimentadas e os sobrenadantes foram coletados para purificação.

[341] As imunoglobulinas foram purificadas usando uma coluna de Proteína A e eluídas com ácido acético, pH 2,0. Os fragmentos Fab foram gerados por digestão com papaína e purificados sobre a matriz de afinidade CaptureSelect IgG-CH1 (LifeTechnologies).

DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE

[342] As afinidades dos anticorpos anti-SIRPβ1 foram determinadas medindo os valores KD usando os instrumentos ForteBio Octeto® e Meso Scale Discovery (MSD). As medições de afinidade Octet® foram realizadas à temperatura ambiente, geralmente de modo geral conforme descrito anteriormente (Estep et al., MAbs. Mar-Abr de 2013; 5 (2): 270-8). Resumidamente, as medições de afinidade do Octet® foram realizadas carregando IgGs em linha em sensores AHQ. Os sensores foram equilibrados off-line em tampão de ensaio por 30 min e depois monitorados on-line por 60 segundos para o estabelecimento do valor basal. Para a medição de ligação ávida, os sensores com IgGs carregados foram expostos a 100 nM de antígeno (fusão de SIRPα e SIRPβ1 humana – Fc) por 3 min, e então transferidos para tampão de ensaio por 3 min para medição da velocidade de dissociação. Foi determinada a avidez de ligação adicional pelo carregamento de monômero de SIRPβ1 biotinilado em sensores SA e exposição a 100 nM de IgG na solução. As medições de ligação monovalentes foram obtidas por carregamento de antígenos da fusão SIRPβ1 humana com Fc no sensor AHQ, seguido por exposição a 100 nM anticorpo Fab anti-SIRPβ1. Medições monovalentes adicionais foram feitas por carregamento monômero de SIRPβ1 humana no sensor SA seguido por exposição a 100 nM de Fab em solução. Os dados cinéticos foram ajustados usando um modelo de ligação 1:1 no software de análise de dados fornecido pela ForteBio.

[343] As medições de KD por MSD-SET, titulações de equilíbrio de solução (SET) foram realizadas em PBS + 0,1% BSA livre de IgG (PBSF) com SIRPβ1 humana recombinante, mantidas constante a 100 pM e incubadas com diluições seriadas de 3 a 5 vezes de anticorpo iniciando com cerca de 50 nM. Os anticorpos (20 nM em PBS) foram revestidos em placas de ligação padrão MSD- ECL durante a noite a 4ºC ou à temperatura ambiente durante 30 min. As placas foram então bloqueadas com BSA a 1% por 30 min com agitação a 700 rpm, seguido por três lavagens com tampão de lavagem (PBSF + Tween 20 a 0,05%).

Amostras SET foram aplicadas e incubadas nas placas por 150s com agitação a 700 rpm seguida por uma lavagem. O antígeno capturado em uma placa foi detectado com 250 ng/mL de estreptavidina marcada com sulfotag em PBSF por incubação em placa por 3 min. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e depois lidas no instrumento MSD Sector Imager 2400 usando lx Read Buffer T com tensoativo. O percentual de antígeno livre foi representado graficamente como uma função do anticorpo titulado no Prisma e ajustado a uma equação quadrática para extrair o KD. Para melhorar o rendimento, robôs de manuseio de líquidos foram usados em todos os experimentos MSD-SET, incluindo a preparação de amostras SET.

[344] As medições da afinidade de ligação foram realizadas a 4ºC utilizando células repórteres BWZ que expressam SIRPα humana ou SIRPβ1 humana. Resumidamente, as células foram coletadas, lavadas em PBS e incubadas com concentração crescente de anticorpos anti-SIRPβ1 ou controle isotípico. Os anticorpos foram diluídos em tampão FACS (PBS + 2% SBF). Após a incubação em gelo por 30 min, as células foram lavadas duas vezes em tampão FACS e incubadas com anticorpo secundário conjugado com PE anti-humano (BD Biosciences) por 30 min em gelo. As células foram então lavadas duas vezes em 200 µL de tampão FACS e subsequentemente analisadas em um instrumento de triagem FACS Canto (BD). Os valores KD aparentes foram determinados por ajuste de curva não linear (OneSiteTotal modificado, Graph Pad Prism).

SELEÇÃO DE ANTICORPO ANTI-SIRPΒ1

[345] Os clones de anticorpo anti-SIRPβ1 maturado por finidade, que mostraram afinidade melhorada em comparação com os respectivos anticorpos parentais, foram caracterizados adicionalmente. Após a triagem inicial de todos os clones de anticorpos maturados por afinidade, os clones para cada anticorpo parental foram selecionados para análise adicional.

SEQUÊNCIAS DE DOMÍNIO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA E LEVE DE ANTICORPO

[346] Usando técnicas padrão, foram determinadas as sequências de aminoácidos que codificam domínios variáveis de cadeia leve e variáveis de cadeia pesada dos anticorpos. As sequências Kabat da HVR de cadeia leve dos anticorpos maturados por afinidade são apresentadas na Tabela 8. As sequências Kabat da HVR de cadeia pesada dos anticorpos maturados por afinidade são apresentadas na Tabela 9. As sequências Kabat da região estrutural (Framework ou FR) de cadeia pesada dos anticorpos são apresentadas na Tabela 10. As sequências de Kabat da região estrutural (Framework ou FR) de cadeia leve dos anticorpos são apresentadas na Tabela

11.

TABELA 8 SEQUÊNCIAS KABAT DA HVR DE CADEIA LEVE DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1

MATURADOS POR AFINIDADE

Ab ID HVR L1 SEQ HVR L2 SEQ HVR L3 SEQ ID

ID NO ID NO NO SB-1 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QLLGSSPRT 31 (p) SB-1-2 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QLLGSSPRT 31 SB-1-3 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QLLGSSPRT 31 SB-1-4 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QLLGSSPRT 31 SB-1-5 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QLLGSSPRT 31 SB-2 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQSSSHPFT 32 (p) SB-2-7 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQSSSHPFT 32 SB-2-8 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQSSSHPFT 32 SB-2-9 RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQSSSHPFT 32 SB-2- RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQSSSHPFT 32 10 SB-2- RASQSVSSSYLA 383 GASSRAT 16 QQSSSHPFT 32 11 SB-8 RASQSVSSSYLA 383 GASNRAT 19 QQVYSSPYT 37 (p) SB-8- RASQSVSSSYLA 383 GASNRAT 19 QQVYSSPYT 37 13 SB-8- RASQSVSSSYLA 383 GASNRAT 19 QQVYSSPYT 37 14 SB-8- RASQSVSSSYLA 383 GASNRAT 19 QQVYSSPYT 37 15 SB-8- RASQSVSSSYLA 383 GASNRAT 19 QQVYSSPYT 37 16 SB-40 RASQSVSSYLA 2 DSSNRAT 22 QQRDEHPP 69 (p) WT SB-40- RASQSVSSYLA 2 DSSNRAT 22 QQRDEHPP 69 18 WT SB-40- RASQSVSSYLA 2 DSSNRAT 22 QQRDEHPP 69 19 WT SB-40- RASQSVSSYLA 2 DSSNRAT 22 QQRDEHPP 69 20 WT

Ab ID HVR L1 SEQ HVR L2 SEQ HVR L3 SEQ ID

ID NO ID NO NO SB-40- RASQSVSSYLA 2 DSSNRAT 22 QQRDEHPP 69 21 WT (p) indica a sequência de anticorpo parental.

TABELA 9 SEQUÊNCIAS KABAT DA HVR DE CADEIA PESADA DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1

MATURADOS POR AFINIDADE Ab HVR H1 SE HVR H2 SEQ ID HVR H3 SEQ

ID Q ID NO ID

NO NO SB-1 SYAMS 80 TISGSGGSTYYADSV 101 DFTEVVGWLGMDV 125 (p) KG SB- SFGMN 228 AITASGGSTFYADSV 238 DFTEVVGWLGMDV 125 1-2 KG SB- AYGMN 229 AITSSGRSTYYADSV 239 DFTEVVGWLGMDV 125 1-3 KG SB- AYGMN 229 AIRASGGATYYADSV 240 DFTEVVGWLGMDV 125 1-4 KG SB- AYGMN 229 AISASGRSTFYADSV 241 DFTEVVGWLGMDV 125 1-5 KG SB-2 SYGMN 81 VIWYDGSNKYYADSV 102 DQTAAAAIWGMDV 126 (p) KG SB- RYGMH 230 AISGLAGPT- 242 DQTAAAAIWGMDV 126 2-7 YADSVKG SB- DYGMH 231 AISAFAGST- 243 DQTAAAAIWGMDV 126 2-8 YADSVKG SB- TYGMH 232 HIWYEGSNKVYADSV 244 DQTAAAAIWGMDV 126 2-9 KG SB- SYGMH 99 AISGLAGQT- 245 DQTAAAAIWGMDV 126 2-10 YADSVKG SB- RYGMH 230 AISGLAGPT- 242 DQTAAWGIWGMDV 253 2-11 YADSVKG SB-8 SGYYW 85 SIYHSGSTYYNPSLK 107 GGAMTPAGMDV 131

Ab HVR H1 SE HVR H2 SEQ ID HVR H3 SEQ

ID Q ID NO ID

NO NO (p) G S SB- AHYYW 233 SIFHSGHTYYNPSLK 246 GGAMTPAGMDV 131 8-13 G S SB- PHYYW 234 SIYHSGHTYYNPSLK 247 GGAMTPAGMDV 131 8-14 G S SB- AHYYW 233 SIYQSGHTYYNPSLK 248 GGAMTPAGMDV 131 8-15 G S SB- AHYYW 233 SIFHSGHTYYNPSLK 246 AGAMTPAGMDV 254 8-16 G S SB- SYYMS 97 IINPSGGSTSYAQKF 121 DTGEYSYSPHGMD 163 40 QG V (p) SB- SYYMA 235 WINPAVGATIYSQKF 249 DTGEYSYSPHGMD 163 40- QG V 18 SB- SYYMV 236 IINPSSGATNYAQKF 250 DTGEYSYSPHGMD 163 40- QG V 19 SB- SFYIS 237 IINPSSGHTNYAQKL 251 DTGEYSYSPHGMD 163 40- QG V 20 SB- SYYMV 236 IINPSSGDTNYAQKF 252 DTGEYSYSPHGMD 163 40- QG V 21 (p) indica a sequência de anticorpo parental.

TABELA 10 SEQUÊNCIAS KABAT DA FR DE CADEIA LEVE DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1

MATURADOS POR AFINIDADE SE

SEQ SEQ SEQ Ab Q VL FR1 ID VL FR2 ID VL F3 ID VL FR4

ID ID NO NO NO

NO SB- EIVMTQ 174 WYQQKPGQ 186 GIPDRFSGSG 192 FGGGTK 20

SE

SEQ SEQ SEQ Ab Q VL FR1 ID VL FR2 ID VL F3 ID VL FR4

ID ID NO NO NO

NO 1 SPGTL APRLLIY SGTDFTLTISR VEIK 0 (p) SLSPG LEPEDFAVYY

ERATL C SC EIVMTQ GIPDRFSGSG

SPGTL SB- WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 SLSPG 174 186 192 1-2 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0

ERATL C SC EIVMTQ GIPDRFSGSG

SPGTL SB- WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 SLSPG 174 186 192 1-3 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0

ERATL C SC EIVMTQ GIPDRFSGSG

SPGTL SB- WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 SLSPG 174 186 192 1-4 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0

ERATL C SC EIVMTQ GIPDRFSGSG

SPGTL SB- WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 SLSPG 174 186 192 1-5 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0

ERATL C SC EIVLTQ

GIPDRFSGSG SB- SPGTL WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 2 SLSPG 175 186 192 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 (p) ERATL

C SC

EVVLT GIPDRFSGSG SB- QSPGT WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 255 186 192 2-7 LSLSP APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0

GERAT C SE

SEQ SEQ SEQ Ab Q VL FR1 ID VL FR2 ID VL F3 ID VL FR4

ID ID NO NO NO NO LSC EVVLT GIPDRFSGSG

QSPGT SB- WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 LSLSP 255 186 192 2-8 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0

GERAT C LSC EVVLT GIPDRFSGSG

QSPGT SB- WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 LSLSP 255 186 192 2-9 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0

GERAT C LSC EIVLTQ

GIPDRFSGSG SB- SPGTL WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 2- SLSPG 175 186 192 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 10 ERATL

C SC EIVLTQ

GIPDRFSGSG SB- SPGTL WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 2- SLSPG 175 186 192 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 11 ERATL

C SC EIVMTQ

GIPDRFSGSG SB- SPGTL WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 8 SLSPG 174 186 192 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 (p) ERATL

C SC EIVMTQ

GIPDRFSGSG SB- SPGTL WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 8- SLSPG 174 186 192 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 13 ERATL

C

SC SB- EIVMTQ WYQQKPGQ GIPDRFSGSG FGGGTK 20 174 186 192 8- SPGTL APRLLIY SGTDFTLTISR VEIK 0

SE

SEQ SEQ SEQ Ab Q VL FR1 ID VL FR2 ID VL F3 ID VL FR4

ID ID NO NO NO

NO 14 SLSPG LEPEDFAVYY

ERATL C SC EIVMTQ

GIPDRFSGSG SB- SPGTL WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 8- SLSPG 174 186 192 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 15 ERATL

C SC EIVMTQ

GIPDRFSGSG SB- SPGTL WYQQKPGQ SGTDFTLTISR FGGGTK 20 8- SLSPG 174 186 192 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 16 ERATL

C SC EIVLTQ

GIPARFSGSG SB- SPATLS WYQQKPGQ SGTDFTLTISS FGGGTK 20 40 LSPGE 182 186 193 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 (p) RATLS

C C EIVLTQ

GIPARFSGSG SB- SPATLS WYQQKPGQ SGTDFTLTISS FGGGTK 20 40- LSPGE 182 186 193 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 18 RATLS

C C EIVLTQ

GIPARFSGSG SB- SPATLS WYQQKPGQ SGTDFTLTISS FGGGTK 20 40- LSPGE 182 186 193 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 19 RATLS

C C EIVLTQ

GIPARFSGSG SB- SPATLS WYQQKPGQ SGTDFTLTISS FGGGTK 20 40- LSPGE 182 186 193 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 20 RATLS

C C SE

SEQ SEQ SEQ Ab Q VL FR1 ID VL FR2 ID VL F3 ID VL FR4

ID ID NO NO NO NO EIVLTQ

GIPARFSGSG SB- SPATLS WYQQKPGQ SGTDFTLTISS FGGGTK 20 40- LSPGE 182 186 193 APRLLIY LEPEDFAVYY VEIK 0 21 RATLS

C

C (p) indica a sequência de anticorpo parental.

TABELA 11 SEQUÊNCIAS KABAT DA FR DE CADEIA PESADA DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1

MATURADOS POR AFINIDADE Ab VH FR1 SE VH FR2 SE VH F3 SEQ ID VH SEQ ID Q ID Q ID NO FR4 ID NO

NO NO SB-1 EVQLLE 201 WVRQAPGK 210 RFTISRDN 215 WGQG 222 (p) SGGGLV GLEWVS SKNTLYLQ TTVTV

QPGGSL MNSLRAE SS RLSCAA DTAVYYCA

SGFTFS K SB- QVQLVE 256 WVRQAPGK 210 RFTISRDN 215 WGQG 222 1-2 SGGGV GLEWVS SKNTLYLQ TTVTV

VQPGRS MNSLRAE SS LRLSCA DTAVYYCA ASGFTF K

G SB- EVQLVE 257 WVRQAPGK 210 RFTISRDN 215 WGQG 222 1-3 SGGGLV GLEWVS SKNTLYLQ TTVTV

KPGGSL MNSLRAE SS RLSCAA DTAVYYCA

SGFTFS K SB- QVQLVE 258 WVRQAPGK 210 RFTISRDN 215 WGQG 222 1-4 SGGGV GLEWVS SKNTLYLQ TTVTV

VQPGG MNSLRAE SS SLRLSC DTAVYYCA AASGFT K

Ab VH FR1 SE VH FR2 SE VH F3 SEQ ID VH SEQ ID Q ID Q ID NO FR4 ID NO

NO NO

FS SB- QVQLVE 202 WVRQAPGK 210 RFTISRDN 215 WGQG 222 1-5 SGGGV GLEWVS SKNTLYLQ TTVTV

VQPGRS MNSLRAE SS LRLSCA DTAVYYCA ASGFTF K

S SB-2 QVQLVE 202 WVRQAPGK 211 RFTISRDN 216 WGQG 222 (p) SGGGV GLEWVA SKNTLYLQ TTVTV

VQPGRS MNSLRAE SS LRLSCA DTAVYYCA ASGFTF R

S SB- EVQLLE 259 WVRQAPGK 210 RFTISRDN 216 WGQG 222 2-7 SGGGLV GLEWVS SKNTLYLQ TTVTV

QPGGSL MNSLRAE SS RLSCAA DTAVYYCA

SGFTFA R SB- QVQLVE 260 WVRQAPGK 210 RFTISRDN 216 WGQG 222 2-8 SGGGV GLEWVS SKNTLYLQ TTVTV

VQPGRS MNSLRAE SS LRLSCA DTAVYYCA ASGFTF R

L SB- QVQLVE 261 WVRQAPGK 211 RFTISRDN 216 WGQG 222 2-9 SGGGV GLEWVA SKNTLYLQ TTVTV

VQPGRS MNSLRAE SS LRLSCA DTAVYYCA ASGFTF R

K SB- EVQLLE 262 WVRQAPGK 210 RFTISRDN 216 WGQG 222 2-10 SGGGLV GLEWVS SKNTLYLQ TTVTV

QPGGSL MNSLRAE SS RLSCAA DTAVYYCA

Ab VH FR1 SE VH FR2 SE VH F3 SEQ ID VH SEQ ID Q ID Q ID NO FR4 ID NO

NO NO

SGFTFG R SB- QVQLVE 263 WVRQAPGK 210 RFTISRDN 216 WGQG 222 2-11 SGGGLV GLEWVS SKNTLYLQ TTVTV

QPGGSL MNSLRAE SS RLSCAA DTAVYYCA

SGFTFA R SB-8 QVQLQE 205 WIRQPPGKG 213 RVTISVDT 220 WGQG 222 (p) SGPGLV LEWIG SKNQFSLK TTVTV

KPSETL LSSVTAAD SS SLTCAV TAVYYCAR

SGYSIS SB- QVQLQE 205 WIRQPPGKG 213 RVTISVDT 220 WGQG 222 8-13 SGPGLV LEWIG SKNQFSLK TTVTV

KPSETL LSSVTAAD SS SLTCAV TAVYYCAR

SGYSIS SB- QVQLQE 205 WIRQPPGKG 213 RVTISVDT 220 WGQG 222 8-14 SGPGLV LEWIG SKNQFSLK TTVTV

KPSETL LSSVTAAD SS SLTCAV TAVYYCAR

SGYSIS SB- QVQLQE 205 WIRQPPGKG 213 RVTISVDT 220 WGQG 222 8-15 SGPGLV LEWIG SKNQFSLK TTVTV

KPSETL LSSVTAAD SS SLTCAV TAVYYCAR

SGYSIS SB- QVQLQE 205 WIRQPPGKG 213 RVTISVDT 220 WGQG 222 8-16 SGPGLV LEWIG SKNQFSLK TTVTV

KPSETL LSSVTAAD SS SLTCAV TAVYYCAR

SGYSIS SB- QVQLVQ 203 WVRQAPGQ 212 RVTMTRD 221 WGQG 222 40 SGAEVK GLEWMG TSTSTVYM TTVTV

Ab VH FR1 SE VH FR2 SE VH F3 SEQ ID VH SEQ ID Q ID Q ID NO FR4 ID NO

NO NO (p) KPGASV ELSSLRSE SS

KVSCKA DTAVYYCA

SGYTFT R SB- QVQLVQ 203 WVRQAPGQ 264 RVTITRDT 265 WGQG 222 40- SGAEVK RLEWMG SASTAYME TTVTV 18 KPGASV LSSLRSED SS

KVSCKA TAVYYCAR

SGYTFT SB- QVQLVQ 203 WVRQAPGQ 212 RVTMTTDT 218 WGQG 222 40- SGAEVK GLEWMG STSTAYME TTVTV 19 KPGASV LRSLRSDD SS

KVSCKA TAVYYCAR

SGYTFT SB- QVQLVQ 203 WVRQAPGQ 212 RVTMTTDT 266 WGQG 222 40- SGAEVK GLEWMG STSTAYME TTVTV 20 KPGASV LSSLRSED SS

KVSCKA TAVYYCAR

SGYTFT SB- QVQLVQ 203 WVRQAPGQ 212 RVTMTRD 217 WGQG 222 40- SGAEVK GLEWMG TSISTAYM TTVTV 21 KPGASV ELSRLRSD SS

KVSCKA DTAVYYCA

SGYTFT R (p) indica a sequência de anticorpo parental. CARACTERIZAÇÃO DA LIGAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-SIRPΒ1 MATURADO POR

AFINIDADE

[347] O conjunto final de anticorpos anti-SIRPβ1 maturados por afinidade foi selecionado com base nas afinidades de ligação ao antígeno. Os anticorpos que eram positivos para a ligação a humana SIRPβ1 foram testados para reatividade cruzada para SIRPα humana. As características bioquímicas de cada anticorpo estão listadas abaixo na Tabela 12. Na Tabela 12, “N. B.” refere-se a anticorpos nos quais não há ligação ao antígeno indicado; “P.F.”

refere-se a anticorpos para os quais a cinética de ligação ao antígeno mostra ajuste fraco em um modelo de ligação 1:1; “N. M.” refere-se a não mensurável.

TABELA 12 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 MATURADO POR

AFINIDADE MSD Fab KD Fab KD SIRPβ Avidez da IgG Avidez da IgG Índice de Método de SIRPβ hum. humana Fc (M) KD SIRPβ de KD SIRPα clones Otimização HIS (M) Monovalente camund. Fc (M) humana Fc (M) Monovalente SB-1 Parental 1,72E-07 N.B. N.B. N.M. SB-1-2 H1H2 3,78E-08 N.B. N.B. N.M. SB-1-3 H1H2 4,54E-08 N.B. N.B. N.M. SB-1-4 H1H2 4,33E-08 N.B. N.B. N.M. SB-1-5 H1H2 8,24E-08 N.B. N.B. N.M. SB-2 Parental 9,77E-07 N.B. N.B. N.M. SB-2-7 H1H2 6,21E-09 N.B. N.B. N.M. SB-2-8 H1H2 5,02E-09 N.B. N.B. N.M. SB-2-9 H1H2 1,92E-08 N.B. N.B. N.M. SB-2-10 H1H2 1,23E-08 N.B. N.B. N.M. SB-2-11 H3 4,40E-09 N.B. N.B. N.M. SB-8 Parental 1,51E-07 N.B. N.B. N.M. SB-8-13 H1H2 2,85E-09 N.B. N.B. 6,3E-11 SB-8-14 H1H2 3,25E-09 N.B. 1,83E-08 5,3E-11 SB-8-15 H1H2 3,73E-09 N.B. N.B. 4,8E-11 SB-8-16 H3 2,32E-09 N.B. N.B. 5,5E-11 SB-40 Parental 9,18E-07 N.B. N.B. N.M. SB-40-18 H1H2 1,81E-08 N.B. N.B. N.M. SB-40-19 H1H2 4,48E-08 N.B. N.B. N.M. SB-40-20 H1H2 9,41E-09 N.B. N.B. N.M. SB-40-21 H1H2 4,04E-08 N.B. N.B. N.M.

[348] A caracterização subsequente de anticorpos anti-SIRPβ1 maturados por afinidade envolveu a determinação de suas capacidades de ligar às linhagens de células que expressam SIRPβ1 humana ou de camundongo. As células foram coletadas, plaqueadas a 106/mL em uma placa de 96 poços, lavadas e incubadas em 100 μL de tampão FACS contendo 1 μg/mL de anticorpo anti-SIRPβ1 durante 0,5 hora em gelo. As células foram então lavadas duas vezes e incubadas em 100 μL de tampão FACS contendo 0 μg de anticorpo secundário/mL conjugado com PE durante 30 minutos em gelo.

As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS frio e adquiridas em um BD FACS Canto. A análise de dados e o cálculo dos valores de intensidade média de fluorescência (MFI) ou % de células positivas foram realizadas com o software FlowJo (TreeStar) versão 10.0.7.

[349] A Tabela 13 mostra a média de valores da média de intensidade de fluorescência (IMF) de anticorpos SIRPβ1 maturados por afinidade que se ligam à linhagem de célula de ovário de hamster chinês (CHO) que expressa níveis baixos de SIRPβ1 humana. O controle isotípico da IgG1 humana estabeleceu o sinal de fluorescência de fundo definido como 1.

Dos 22 clones de anticorpo anti-SIRPβ1 testados, 17 clones se ligaram a células com uma MFI ≥ 3 vezes sobre o fundo. Como um controle negativo, os anticorpos anti-SIRPβ1 também foram rastreados para ligação à superfície de células CHO que superexpressam SIRPβ1 de camundongo. Como esperado, nenhum dos anticorpos de teste mostrou ligação significativa à SIRPβ1 de camundongo, pois os clones foram originalmente selecionados para ligação ao antígeno humano. Devido a alta similaridade de sequência entre os receptores da família SIRP, os anticorpos anti-SIRPβ1 também foram avaliados quanto à reatividade cruzada com SIRPα humana. Em ensaios de ligação de células, nenhum dos anticorpos anti-SIRPβ1 ligou-se às células que superexpressam SIRPα humana.

TABELA 13 CARACTERIZAÇÃO DE LIGAÇÃO CELULAR DOS ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1

MATURADOS POR AFINIDADE

VSF (Vezes sobre o VSF da Ligação às VSF da Ligação às Índice de fundo) da Ligação às Células SIRPβ de Células SIRPα EC50 (nM) clones Células SIRPβ camundongo Humana positivas Humana positivas SB-1 2 1 1 0,072 SB-1-2 4 1 1 0,059 SB-1-3 4 0 2 0,062 SB-1-4 3 1 1 0,073 SB-1-5 3 1 2 0,038 SB-2 2 1 1 0,235 SB-2-7 5 1 1 0,132 SB-2-8 5 1 1 0,174 SB-2-9 4 1 2 0,469 SB-2-10 4 1 2 0,234 SB-2-11 6 0 2 0,220 SB-8 2 1 2 0,441 SB-8-13 7 1 2 0,253 SB-8-14 7 1 1 0,304 SB-8-15 7 1 1 0,737 SB-8-16 9 1 2 0,147 SB-40 2 1 1 0,707 SB-40-18 4 1 2 0,320 SB-40-19 3 1 2 0,713 SB-40-20 3 1 2 0,405 SB-40-21 5 1 2 0,715

[350] Embora os quatro anticorpos originais anti-SIRPβ1 parentais não tenham demonstrado a reatividade cruzada de SIRPα, a análise Octet® revelou que um dos anticorpos descendentes (SB-8-14) adquiriu uma ligação ávida à SIRPα apesar da aplicação de pressão de seleção negativa durante a triagem da biblioteca. Consulte a Tabela 12 abaixo. Para determinar se a avidez de ligação ativa a sinalização dependente de SIRPα, anticorpos anti-SIRPβ1 foram avaliados quanto à capacidade de induzir a expressão de genes em células repórter expressando SIRPα e SIRPβ1 humanas. Conforme descrito anteriormente, os anticorpos de teste ou dois anticorpos anti- SIRPα

(clones SA-90, SA-94) foram adsorvidos em placas de 96 poços a 10 μg/mL.

Após a lavagem, 105 células repórteres NFAT-luciferase - BWZ-hu SIRPα ou BWZ-hu SIRPβ1 - foram semeadas em poços e incubadas durante a noite a 37ºC. A atividade da luciferase foi quantificada através da adição de reagente OneGlo (Promega) a cada poço e as amostras foram incubando à temperatura ambiente por 3 min em um agitador de placas. O sinal de luminescência foi quantificado utilizando com um leitor de microplacas BioTek Synergy® Microplate Reader usando o software GEN5® 2.04. Como mostrado na FIG. 8, tanto os anticorpos anti-SIRPβ1 parentais quanto sua progênie melhorada por afinidade retiveram a capacidade de induzir a expressão de luciferase nas células repórteres BWZ-huSIRPβ1. Todos os clones de afinidade maturada, incluindo SB-8-14, falharam em induzir significativamente a expressão de luciferase quando as células repórteres BWZ-huSIRPα foram adicionadas aos poços revestidos com anticorpo (FIG. 8). Em contraste, ambos os clones de anticorpo anti-SIRPα induziram a expressão de luciferase em células repórteres BWZ-huSIRPα e não em células BWZ-huSIRPβ1 (FIG. 8). Estes resultados estabelecem que, apesar da avidez de ligação à SIRPα solúvel de um dos anticorpos parentais com afinidade maturada aqui divulgado, todos os anticorpos anti-SIRPβ1 testados falharam em engajar funcionalmente a SIRPα ligada à membrana. Em vez disso, os anticorpos anti-SIRPβ1 demonstram especificidade funcional para SIRPβ1 humana ligada à membrana.

EXEMPLO 9 ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 MATURADOS POR AFINIDADE AUMENTAM A SECREÇÃO DE CITOCINAS INFLAMATÓRIAS DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS.

[351] Para determinar se os anticorpos SIRPβ1 maturados por afinidade retêm a capacidade de induzir mudanças na produção de citocinas inflamatórias, macrófagos derivados de monócitos humanos primários e células dendríticas são cultivados com anticorpos de teste ligados à placa em combinação com níveis não saturantes de estimuladores de TLR e o nível de citocinas é medido após 24h. Para gerar células dendríticas derivadas de monócitos, monócitos primários humanos foram isolados a partir do sangue humano heparinizado (Blood Centers of the Pacific) usando o coquetel de enriquecimento de monócitos RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies), de acordo com o protocolo do fabricante.

Os monócitos foram semeados em meio RPMI (Invitrogen) contendo 10% de soro bovino fetal (Hyclone) e 20 ng/mL de IL-4 e GM-CSF (Peprotech) para induzir a diferenciação de células dendríticas imaturas. Após 6-7 dias, as células dendríticas foram coletadas por raspagem das células fixadas ao plástico. As células dendríticas são plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com o anticorpo indicado a uma densidade de 10 5 células/poço e incubadas durante 24 h a 37ºC. As células são coestimuladas com agonista de TLR4, LPS (Salmonella abortus equi).

[352] Na FIG. 9, células dendríticas derivadas de monócitos de 3 doadores saudáveis foram estimuladas durante a noite a 37ºC com 0,5 ng/mL de LPS na presença de anticorpos anti-SIRPβ1 maturados por afinidade indicados adsorvidos em placas de 96 poços a 2 μg/mL. A fração sobrenadante foi subsequentemente coletada e testada quanto à libertação de TNFα. Os anticorpos SIRPβ1 SB-1-3, SB-2-8 e SB8-13 mostraram-se altamente agonísticos como anticorpos ligados à placa. Em contraste, os anticorpos SIRPβ1 restantes, SB-2-8, SB-8-15 e SB-40-20, liberam citocinas mediadas por SIRPβ1 fracamente ativadas.

EXEMPLO 10 ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 SÃO ESPECÍFICOS PARA A ISOFORMA 1 DE SIRPβ1

HUMANA

[353] Entre as múltiplas isoformas SIRPβ1 catalogadas, a isoforma 1 é a versão completa do receptor, expressa principalmente na periferia. O antígeno recombinante baseado na sequência da isoforma 1 da SIRPβ1 foi utilizado para a seleção de anticorpos anti-SIRPβ1 a partir de bancos de bibliotecas de levedura. Para verificar se os anticorpos anti-SIRPβ1 selecionados reagiram de forma cruzada com outras isoformas de SIRPβ1 humana ou com SIRPβ1 de cinomolgo, foram usados antígenos recombinantes baseados na sequência da isoforma 3 da SIRPβ1 humana e sequência da isoforma 1 da SIRPβ1 de cinomolgo em células HEK293. As proteínas recombinantes Fc marcadas (Fc-tagged) purificadas foram adsorvidas em placas de 96 poços a 1 μg/mL durante a noite a 4ºC. As placas foram subsequentemente lavadas com PBS + 0,05% Tween-20 e bloqueadas com 1% BSA + PBS durante 2 h à temperatura ambiente. Os anticorpos diluídos em tampão de bloqueio a 1μg/mL foram adicionados aos poços, diluídos em série e autorizados a se ligar ao antígeno durante a noite a 4ºC. No dia seguinte, os anticorpos primários foram removidos e o anticorpo de cadeia leve kappa anti- humana conjugado com rábano peroxidase diluído a 1: 10000 em tampão de bloqueio foram adicionados aos poços e incubados durante 1 h à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS + Tween-20 a 0,05% e 100 μL de solução de substrato TMB foram adicionados aos poços para gerar um sinal colorimétrico proporcional à quantidade de anticorpo anti-SIRPβ1 ligado ao antígeno. Uma vez que a reação atingiu uma intensidade de cor apropriada, 100 μL de solução de parada foram adicionados para bloquear a enzima. As placas foram lidas com um leitor de microplacas BioTek Synergy® usando o software GEN5® 2.04.

[354] As FIG. 10A-10B mostram curvas de ligação de anticorpos anti-SIRPβ1 ligados a antígenos SIRPβ1 indicados baseados em dados de ELISA. Oito anticorpos anti-SIRPβ1 (quatro anticorpos parentais e quatro anticorpos maturados por afinidade correspondentes) foram selecionados para análise. Os valores de EC50 calculados a partir dessas curvas de ligação demonstraram que todos os oito anticorpos anti-SIRPβ1 reconheceram a isoforma 1 da SIRPβ1 humana com alta afinidade. Por exemplo, os valores de EC50 para SB-1 e SB-1-2 são 0,034 nM e 0,045 nM, respectivamente. Os valores de EC50 para SB-2 e SB-2-7 são 0,032 nM e 0,029 nM, respectivamente. Os valores de EC50 para SB-8 e SB-8-13 são 0,022 nM e 0,019 nM, respectivamente. Os valores de EC50 para SB-40 e SB-40-21 são 0,040 nM e 0,025 nM, respectivamente. No entanto, os anticorpos anti-SIRPβ1 testados não apresentaram reação cruzada com a isoforma 3 da SIRPβ1 humana ou com SIRPβ1 de cinomolgo. Estes resultados demonstram que a plataforma de rastreio e seleção produziram anticorpos altamente específicos para isoforma 1 da SIRPβ humana com nenhuma evidência de reatividade cruzada para SIRPα humana, isoforma 3 da SIRPβ1 humana, SIRPβ1 murina ou SIRPβ1 de cinomolgo.

EXEMPLO 11 ANÁLISE DO EFEITO DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 NO AUMENTO DO

RECRUTAMENTO DE CÉLULAS IMUNES IN VIVO

[355] A capacidade dos anticorpos anti-SIRPβ1 em modular o recrutamento de células inflamatórias (granulócitos neutrófilos, monócitos e macrófagos) na cavidade peritoneal (PEC) de camundongos BAC transgênicos para SIRPβ1 humana após administração intraperitoneal (IP) de qualquer anticorpo sozinho ou em combinação com LPS é avaliada da seguinte forma.

Resumidamente, os camundongos recebem primeiro uma injeção IP de 40 mg/kg de anticorpo anti-SIRPβ1 ou anticorpo de controle isotípico mIgG1 (clone MOPC-21, Bioxcell). Depois de 14 horas os camundongos recebem uma injeção IP de 4 mg/kg de LPS ou PBS como controle. 6 horas após a injeção de LPS ou PBS, as células são coletadas do PEC conforme descrito (Consulte, por exemplo, Gawish R et al., 2014 FASEB J) e analisadas por FACS. Para a análise FACS, as células PEC são incubadas com anti-CD11b-Pacific Blue,

anti-CD11c PeCy7, anti-MCH-II- APCCy7, anti-Gr1-FITC, anti-Ly6G-PE e um corante de viabilidade (Life Technologies, Cat # L34957) por 1 hora em gelo, depois são lavadas por duas vezes com tampão FACS frio. As amostras fixadas com 4% de PFA são então adquiridas. Os dados são adquiridos em um citômetro BD FACS CANTO II (Becton Dickinson) e analisados com o software FlowJo. Estes estudos fornecem suporte para que os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente divulgação aumentem o recrutamento de células imunes in vivo.

EXEMPLO 12 EXPRESSÃO DE SIRPβ1 NO MICROAMBIENTE TUMORAL

[356] Grupos de 3 camundongos transgênicos BAC para SIRPβ1 humana (fêmeas com 8 semanas de idade) são desafiados subcutaneamente com 1x106 células de carcinoma de cólon MC38 ou CT26 ou células de carcinoma da mama murinas EMT-6, suspensas em 100 μL de PBS. Os animais são anestesiados com isoflurano antes do implante. Quando os tumores atingem um tamanho de 700-1000 mm3, os tumores são explantados para analisar a expressão de SIRPβ1 no microambiente tumoral por FACS.

Como comparação, o baço de camundongos com tumor ou o baço de camundongos controle naïves também é analisado. Para a análise de expressão por FACS, o tumor e os baços são incubados em PBS contendo 1 mg/mL de colagenase e, em seguida, processados através de uma peneira de célula para se obter uma suspensão de célula única. As células são então incubadas com anticorpos anti-CD45-PerCp-Cy7, anti-CD11b-PerCP-Cy5.5, anti-CD3-PC, anti-Gr1-FITC, anti-NK1.1-PE, anti-SIRPβ1- APC e um corante de viabilidade (Life Technologies, Cat # L34957) por 30 min em gelo, em seguida, lavada duas vezes com tampão FACS frio. As amostras fixadas com 4% de PFA são então adquiridas. Os dados são adquiridos em um citômetro BD FACS CANTO II (Becton Dickinson) e analisados com o software FlowJo.

Estes estudos fornecem suporte para que as células mieloides ou células da linhagem mieloide expressem SIRPβ1 no ambiente tumoral.

EXEMPLO 13 ANÁLISE DO CRESCIMENTO TUMORAL EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS BAC - SIRPβ1 HUMANA

[357] Grupos de camundongos tipo selvagem (WT, n = 11) e transgênicos BAC para SIRPβ1 humana (SIRPβ1tg, n = 14) (irmãos de mesma ninhada, sexo e idade, 10 semanas de idade (+/- 2 semanas)) são desafiados subcutaneamente com 1x106 células tumorais de carcinoma de cólon MC38 suspensas em 100 μL de PBS. Os animais são então anestesiados com isoflurano antes do implante de tumor. Após o implante do tumor, os camundongos são administrados com várias concentrações de um anticorpo anti-SIRPβ1 da presente invenção. O crescimento do tumor é monitorado com um paquímetro a cada quinze dias começando no dia 5. O desfecho do experimento é um volume tumoral de 2,000 mm3 ou 60 dias. O efeito da administração de anticorpo anti-SIRPβ1 na redução do crescimento ou tamanho do tumor (expresso como volume, mm 3), em comparação com o observado em animais controle, é determinado. Estes estudos fornecem suporte de que os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente invenção reduzem o crescimento de tumor in vivo.

EXEMPLO 14 ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 INDUZEM A EXPRESSÃO DE CD83 E CD86 EM CÉLULAS DENDRÍTICAS (DC) HUMANAS

[358] Para avaliar a capacidade dos anticorpos anti-SIRPβ1 de modificar a expressão de CD83 e CD86, anticorpos tanto os ligados à placa quanto solúveis são incubados com células dendríticas (DCs) e a expressão de CD83, CD86, CCR7 e ERK fosforilado é mensurada. Os anticorpos são plaqueados durante a noite a 4ºC em placas de 12 poços a 2 ou 10 μL/mL em PBS. Os poços foram lavados 3 vezes com PBS no dia seguinte. Monócitos humanos primários isolados a partir do sangue periférico de doadores saudáveis são adicionados a poços revestidos de anticorpo em meio RPMI suplementado com 10% de SBF e 20 ng/mL de IL-4 e GM-CSF e incubados a 37ºC, 5% de CO2 por 5 dias. No dia 5, DCs humanos imaturos são coletados e analisados por FACS para CD86, CD83, CD1a e HLA-DR, em um BD FACS Canto. A análise de dados é realizada com software FlowJo (TreeStar) versão

10.0.7. Os níveis de CD83 e CD86 são avaliados para populações de células CD1a+/HLA-/DR+. Para a fosforilação de ERK intracelular, as células são fixadas com formaldeído a 1%, permeabilizadas com kit citofix/citoperm (BD) e a fosforilação de Erk intracelular é determinada por citometria de fluxo após a coloração com anticorpo PE-ERK (BD). Estes estudos suportam que anticorpos anti-SIRPβ1 da presente invenção aumentam a expressão de CD83, CD86 e CCR7 em células dendríticas humanas. Além disso, estes estudos fornecem suporte de que anticorpos anti- SIRPβ1 da presente invenção aumentam ou induzem a fosforilação de ERK em células dendríticas humanas.

EXEMPLO 15 TRIAGEM DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 E/OU ANTI-SIRPβ1 BIESPECÍFICO QUE INDUZEM A FOSFORILAÇÃO DE SIRPβ1, DAP12, SYK, ERK E AKT, QUE INDICAM A ATIVAÇÃO DA VIA PI3K

[359] Células mieloides humanas primárias ou linhagens de células mieloides murinas manipuladas para expressarem SIRPβ1 humana (J774, RAW 264.7, células BMM ou osteoclastos) são removidas a partir de placas de cultura de tecido com PBS-EDTA, lavadas com PBS, e contadas.

Células J774 (40 × 106) ou células RAW 264.7 (10 × 106 BMM ou osteoclastos) são incubadas com um anticorpo anti-SIRPβ1 e/ou um anticorpo biespecífico anti-SIRPβ1 (tal como um anticorpo biespecífico anti-SIRPβ1/TREM2) ou com um anticorpo de controle compatível com isotipo em uma concentração de 1 μg/106 células por 20 min em gelo ou sob outras condições. As células são lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) resfriado em gelo por 20 min, seguido de centrifugação a 16.000 g por 10 min a 4ºC para remover materiais insolúveis. O sobrenadante resultante é submetido a reações de imunoprecipitação com os anticorpos indicados (DAP12, ERK ou AKT) e proteína A ou proteína G agarose (Sigma). As contas são lavadas extensivamente com tampão RIPA e as proteínas são separadas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). As proteínas são então transferidas para membranas de nitrocelulose por Western blot, incubadas com os anticorpos apropriados (anticorpos que especificamente reconhecem a forma fosforilada de DAP12, ERK ou AKT), e visualizadas com o sistema de quimioluminescência aumentada (ECL) (Pierce), como descrito (por exemplo, Peng et al., (2010) Sci Signal., 3 (122): ra38). Estes estudos fornecem suporte de que os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente invenção induzem a fosforilação de SIRPβ1, DAP12, SYK, ERK e AKT. Além disso, esses estudos fornecem suporte de que os anticorpos anti-SIRPβ1 da presente invenção são eficazes na ativação da via PI3K.

EXEMPLO 16 ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 REGULAM POSITIVAMENTE A EXPRESSÃO DE TREM2

EM MACRÓFAGOS HUMANOS

[360] SIRPβ1 e TREM2 são receptores associados a DAP12 expressos em células mieloides. Para avaliar se SIRPβ1 modifica a expressão de TREM2, os macrófagos foram cultivados em anticorpos ligados à placa e analisados quanto aos níveis de TREM2 na superfície celular por citometria de fluxo.

[361] Os anticorpos (SB-1-3, SB-2-8, SB-8-13, SB-8-15, SB-40- 20, e controle huIgG1) foram adsorvidos em placas de 96 poços a 37ºC durante quatro horas a 2 μg/mL em PBS. Os poços foram lavados duas vezes com PBS. Macrófagos humanos derivados de monócitos, com diferenciação em cultura com M-CSF por 5-6 dias, foram coletados e semeados a uma densidade de 100.000 células por poço. Os macrófagos foram incubados durante a noite a 37ºC, 5% de CO2. A análise FACS da expressão de TREM2 foi realizada em um citômetro BD FACS Canto II e a análise de dados foi realizada com o software FlowJo (TreeStar).

[362] Como mostrado na FIG. 11A, os anticorpos anti-SIRPβ1, SB-2-8, SB-8-15 e SB-40-20, ligados à placa aumentaram a expressão de TREM2 em aproximadamente 2 vezes em relação aos macrófagos tratados com controle isotípico huIgG1 obtidos de 3 doadores saudáveis. Em 2 de 3 doadores saudáveis (624 e 626), no entanto, os anticorpos anti-SIRPβ1 SB-1-3 e SB-8-13 ligados à placa aumentaram apenas parcialmente a expressão de TREM2 em relação aos macrófagos tratados com controle isotípico huIgG1. Em macrófagos de um terceiro doador saudável (625), SB-1-3 e SB-8-13 ligados à placa aumentaram a expressão de TREM2 em aproximadamente 2 vezes em relação ao controle isotípico huIgG1. Com base nestes resultados, os anticorpos anti-SIRPβ1 SB-2-8, SB-8-15 e SB-40-20 funcionam como agonistas que induzem a expressão de TREM2 na superfície celular.

E XEMPLO 17 ANTICORPOS ANTI -SIRPβ1 AUMENTAM A V IABILIDADE DE MACRÓFAGOS

HUMANOS

[363] Evidencias na literatura sugerem que TREM2 promove a viabilidade de macrófagos/micróglia. Uma vez que SIRPβ1 associa-se à molécula adaptadora DAP12 e pode influenciar a expressão de TREM2, os anticorpos anti-SIRPβ1 foram avaliados quanto à capacidade de aumentar a viabilidade de macrófagos humanos.

[364] Os anticorpos (SB-1-3, SB-2-8, SB-8-13, SB-8-15, SB- 40-20, e controle huIgG 1) foram adsorvidos em placas de 96 poços a 37ºC durante quatro horas a 2 μg/mL em PBS. Os poços foram lavados duas vezes com PBS. Macrófagos humanos derivados de monócitos, com diferenciação em cultura com M-CSF por 5-6 dias, foram coletados e lavados para remover M-CSF residual. Os macrófagos foram ressuspensos em meio de crescimento RPMI suplementado com 10% de SBF e 1% de Penn/Strep a 500.000 células por mL. As células foram diluídas com igual volume de PBS e 100 μL contendo 25.000 células foram adicionados a cada poço. Os macrófagos foram incubados a 37ºC por 2 dias. A análise de viabilidade celular foi realizada usando o kit Cell Titer Glo (Promega), um reagente que produz um sinal de luminescência em relação à concentração de ATP na amostra. As placas foram lidas com um leitor de microplacas BioTek Synergy usando o software GEN5 2.04.

[365] Conforme mostrado na FIG. 11B, a luminescência basal foi estabelecida com macrófagos cultivados em controle isotípico huIgG 1 completo (de comprimento total) ligado à placa. Em comparação com macrófagos semeados na ausência de anticorpo (Sem Ab), não há alteração significativa na viabilidade dos macrófagos semeados com o controle isotípico. Entretanto, macrófagos cultivados com anticorpos anti- SIRPβ1 de comprimento total, SB-1-3, SB-8-13 e SB-8-15 ligados à placa, demonstraram um aumento significativo na viabilidade em relação às células tratadas com controle isotípico. Os anticorpos anti-SIRPβ1 de comprimento total ligados à placa SB-2-8 e SB-40-20 não conseguiram aumentar a viabilidade dos macrófagos em relação às células tratadas com controle isotípico.

[366] Dadas as diferenças de atividade inicialmente observadas entre os anticorpos anti-SIRPβ1, os ensaios subsequentes determinaram se a atividade dos anticorpos dependia da concentração de proteína adsorvida. Os anticorpos anti-SIRPβ1 SB-1-3 e SB-2-8 ou o controle isotípico IgG1hu foram revestidos em placas de 96 poços a 37ºC por 4 horas começando a 10 μg/mL em PBS e diluídos em série em 3 vezes. Conforme descrito anteriormente, os macrófagos foram diluídos com igual volume de PBS e 100 μL contendo 25.000 células foram adicionados a cada poço. Os macrófagos foram incubados a 37ºC por 2 dias. A análise da viabilidade foi realizada usando o kit Cell Titer Glo (Promega) e as placas foram lidas com um leitor Biotek Synergy Microplate Reader usando o software GEN5 2.04.

[367] Como mostrado na FIG. 12, o anticorpo anti-SIRPβ1 de comprimento total SB-1-3 ligado à placa aumentou a viabilidade dos macrófagos de uma maneira dose-dependente em relação às células tratadas com controle isotípico. Em contrapartida, o anticorpo anti-SIRPβ1 SB-2-8 de comprimento total ligado à placa não conseguiu aumentar a viabilidade dos macrófagos, mesmo em altas concentrações de proteína revestida. Assim, os anticorpos anti-SIRPβ1 SB-1-3, SB-8-13, e SB-8-15 exibiram atividade agonista neste ensaio.

EXEMPLO 18

EFEITO ADITIVO E SINÉRGICO DO TRATAMENTO COMBINADO DE MACRÓFAGOS COM ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 E ANTI-TREM2

[368] Anticorpos anti-TREM2 agonísticos mostraram aumentar a viabilidade de macrófagos quando adicionados às células em um formato solúvel. Os ensaios de viabilidade foram realizados para determinar se a coestimulação de macrófagos com anticorpos anti-SIRPβ1 aumenta ainda mais a atividade agonista do anticorpo anti-TREM2.

[369] Os anticorpos anti-SIRPβ1 SB-1-3 e SB-2-8 ou o controle isotípico IgG1hu foram revestidos em placas de 96 poços a 37ºC por 4 horas a 10 μg/mL em PBS. Conforme descrito anteriormente, os macrófagos foram diluídos com igual volume de PBS e 100 μL contendo 25.000 células foram adicionados a cada poço. Quando indicado, os macrófagos também foram tratados com 50 μg/mL de anticorpo anti-TREM2. Os macrófagos foram incubados a 37ºC por 2 dias. A análise da viabilidade foi realizada usando o kit Cell Titer Glo (Promega) e as placas foram lidas com um leitor Biotek Synergy Microplate Reader usando o software GEN5 2.04.

[370] Conforme mostrado na FIG. 13, a adição de anticorpo anti- TREM2 agonista às células cultivadas em controle isotípico IgG1 humana aumentou significativamente a viabilidade de macrófagos em relação às células cultivadas na ausência de anticorpo agonista anti-TREM2, estabelecendo a reprodutibilidade deste ensaio. Além disso, o cultivo de macrófagos com anticorpo anti-SIRPβ1 de comprimento total ligado à placa SB-1-3 aumentou significativamente a viabilidade celular em comparação com as células tratadas com o controle isotípico, enquanto que o anticorpo anti-SIRPβ1 SB-2-8 não exibiu essa atividade (Fig. 12). A coestimulação de macrófagos com o anticorpo anti-SIRPβ1 SB-1-3 ligado à placa e anticorpo agonista anti-TREM2 solúvel exibiu aditividade, aumentando ainda mais a viabilidade de macrófagos.

De modo interessante, a coestimulação de macrófagos com o anticorpo anti- SIRPβ1 SB-2-8 ligado à placa e anticorpo anti-TREM2 solúvel exibiu atividade sinérgica, aumentando a viabilidade dos macrófagos. Assim, os anticorpos anti- SIRPβ1 aumentam a atividade de anticorpos anti-TREM2 agonísticos.

EXEMPLO 19 ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 AUMENTAM A VIABILIDADE DE MACRÓFAGOS

DERIVADOS DA MEDULA ÓSSEA

[371] Foram gerados camundongos transgênicos BAC para SIRPβ1 humana que reproduz a expressão do antígeno humano em células mieloides de camundongo. As células da medula óssea murina a partir de camundongos transgênicos para SIRPβ1 humana foram obtidas por lavagem da tíbia e fêmures com PBS. As células da medula óssea foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 50 ng/mL de M-CSF para diferenciar macrófagos ou 10 ng/mL de GM-CSF para diferenciar células dendríticas. Os anticorpos anti-SIRPβ1 foram avaliados quanto à capacidade de aumentar a viabilidade das células mieloides murinas.

[372] Os anticorpos anti-SIRPβ1 SB-1-3, SB-2-8, e SB-8-13 ou o controle isotípico IgG1hu foram revestidos em placas de 96 poços a 37ºC por 4 horas a 10 μg/mL em PBS. Os macrófagos e células dendríticas foram diluídos com igual volume de PBS e 100 μL dessa solução contendo 25.000 células foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas a 37ºC por 2 dias.

A análise da viabilidade foi realizada usando o kit Cell Titer Glo (Promega) e as placas foram lidas com um leitor Biotek Synergy Microplate Reader usando o software GEN5 2.04. Como mostrado na FIG. 14A, de forma consistente com macrófagos humanos, a cultura de macrófagos derivados da medula óssea com anticorpos anti-SIRPβ1 de comprimento total ligados a placa (SB-1-3 e SB-8-13) aumentou a viabilidade dos macrófagos em relação às células tratadas com controle isotípico. Em contraste, o anticorpo anti-SIRPβ1 SB-2-8 não conseguiu aumentar a viabilidade dos macrófagos. Como mostrado na FIG. 14B, quando as células dendríticas (DC) foram cultivadas com anticorpos ligados à placa, todos os anticorpos anti-SIRPβ1 aumentaram a viabilidade das DCs em comparação com as células tratadas com controle isotípico. No entanto, apenas as DCs tratadas com anticorpo anti-SIRPβ1 SB-8-13 mostraram maior viabilidade em relação às células dendríticas não tratadas (Sem Ab). Assim, os anticorpos anti-SIRPβ1 mostram atividade agonística com células mieloides murinas que expressam SIRPβ1 humana.

EXEMPLO 20 REATIVIDADE CRUZADA DE ANTICORPOS ANTI-SIRPβ1 MATURADOS POR AFINIDADE

PARA RECEPTORES SIRP RELACIONADOS

[373] Uma característica das proteínas da família SIRP é sua extensa conservação na sequência de aminoácidos do domínio extracelular.

Por exemplo, a região extracelular da SIRPβ1 compartilha ~ 90% de identidade de sequência com a SIRPα e ~ 77% de identidade de sequência com SIRPγ.

Os anticorpos desenvolvidos contra um membro da família de proteínas SIRP frequentemente apresentam reação cruzada com vários membros da família de receptores SIRP.

[374] Apesar da homologia na sequência/estrutura, os receptores SIRP exibem diferentes propriedades funcionais e padrões de expressão. Por exemplo, a SIRPα contém um motivo ITIM citoplasmático para mediar a supressão imunológica após a ligação ao CD47. Em contraste, SIRPβ1, que carece de motivos de sinalização intracelular e não liga-se ao CD47, se associa com a proteína adaptadora DAP12 contendo ITAM para propagar sinais de ativação. SIRPγ, ao contrário de outros receptores SIRP que são expressos principalmente em células mieloides, é expresso em linfócitos e células NK e serve para estabilizar a adesão célula-célula durante a apresentação do antígeno às células T.

[375] Para determinar a especificidade ao antígeno de anticorpos anti-SIRPβ1 da presente divulgação, foram realizadas medições de afinidade baseadas em células para determinar as afinidades aparentes de anticorpos anti-SIRPβ1 maturados por afinidade ao antígeno expresso na superfície celular. Células BW5147.G.1.4, uma linhagem de células T de camundongo imortalizada, foram manipuladas para superexpressarem SIRPβ1 humana (BWZ-huSIRPβ1) ou SIRPα humana (BWZ-huSIRPα). Células Jurkat, uma linhagem de células T humanas imortalizadas, expressam endogenamente SIRPγ.

[376] Nestes experimentos, dois anticorpos anteriormente descritos foram utilizados como controles positivos: o anticorpo 18D5 (um anticorpo anti-SIRP que reage de forma cruzada com SIRPα e SIRPβ) e anticorpo KWAR23 (um anticorpo anti-SIRP que reage de forma cruzada com

SIRPα, SIRPβ, e SIRPγ). Esses anticorpos foram produzidos de forma recombinante em uma estrutura de IgG4 humana. Um anticorpo anti-SIRPγ disponível comercialmente (clone LSB2.20; Biolegend, San Diego) conjugado com fluoróforo ficoeritrina (PE) foi usado para verificar a expressão de SIRPγ em células Jurkat. As diluições seriadas de cada um dos anticorpos anti- SIRPβ1 monoclonais e anticorpos de controle foram adicionados a 105 células e foi permitido alcançar o equilíbrio de ligação a 4ºC. Após a adição do anticorpo secundário marcado com fluorescência e breves etapas de lavagem, os valores de MFI em função da concentração de anticorpo titulado foram registrados por análise FACS.

[377] Na Tabela 14, abaixo, os valores de EC50 atribuem a afinidade relativa pela adição de concentrações crescentes de diversos anticorpos às células que superexpressam SIRPβ1. Os anticorpos ligados ao receptor foram detectados pela coloração das células com anticorpo secundário anti-IgG humana PE (Southern Biotech). As curvas foram ajustadas usando análise de regressão não linear com software GraphPad Prism 6.

Como mostrado na Fig. 15A, os anticorpos anti-SIRPβ1 ligaram-se às células BWZ-huSIRPβ1 com perfis EC50 distintos. O anticorpo anti-SIRPβ1 SB1-3 mostrou a melhor afinidade aparente em relação aos outros anticorpos anti- SIRPβ1, bem como em comparação com o anticorpo de controle positivo, 18D5. Os anticorpos anti-SIRPβ1 não conseguiram se ligar às células que expressam SIRPα (Fig. 15B) ou SIRPγ (Fig. 15C), demonstrando que estes anticorpos são específicos para seus antígenos.

TABELA 14 VALORES DE EC50 DE ANTICORPOS QUE SE LIGAM ÀS CÉLULAS BWZ-SIRPβ1

HUMANA SB1-3 SB2-8 SB8-13 SB8-15 SB40-20 18D5 EC50 (nM) 0,02837 0,2025 0,1993 0,5962 8,704 0,4769

ALGUMAS SEQUÊNCIAS

[378] SB-1: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQLLGSSPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 267).

[379] SB-1: Região Variável de Cadeia Pesada:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS

TISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFTEVVGWLG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 268).

[380] SB-2: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSSHPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 269).

[381] SB-2: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMNWVRQAPGKGLEWVA

VIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQTAAAAIWG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 270).

[382] SB-3: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRLFHPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 271).

[383] SB-3: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMG

WINPSSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGIAATDAYF DLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 272).

[384] SB-4: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADAPITFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO: 273).

[385] SB-4: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMG

WISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSGTHFGTYSY SNWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 274).

[386] SB-5: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATITCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRLFHPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 275).

[387] SB-5: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMG

WINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGDEDWFDPW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 276).

[388] SB-6: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSGHLPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 277).

[389] SB-6: Região Variável de Cadeia Pesada:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS

[390] SB-7: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP

PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYIAPFTFGGGT KVEIK (SEQ ID NO: 278).

[391] SB-7: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTASYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARETRQDSAHYY

GMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 279).

[392] SB-8: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVYSSPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 280).

[393] SB-8: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWGWIRQPPGKGLEWI

GSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGAMTPAGMD VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 281).

[394] SB-9: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP

PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYHSVPPITFGGG TKVEIK (SEQ ID NO: 282).

[395] SB-9: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGIHWVRQAPGQGLEWMG

WISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDGLHYGDYIV YYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 283).

[396] SB-10: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSP

QLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQAIESPLTFGGGTK VEIK (SEQ ID NO: 284).

[397] SB-10: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVPRGDLGMD VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 285).

[398] SB-11: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSP QLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQALQTPLTFGGGTK

VEIK (SEQ ID NO: 286).

[399] SB-11: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPVDSSSYSLG YYYGMDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 287).

[400] SB-12: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIY

SASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQLDNLPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 288).

[401] SB-12: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMG

WINPNSGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTYAYSYGMD VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 289).

[402] SB-13: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSP

QVLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALRSPITFGGGTK VEIK (SEQ ID NO: 290).

[403] SB-13: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIG

SIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGDTSGGAYFDL WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 291).

[404] SB-14: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DSSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFSYYPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 292).

[405] SB-14: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTASYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDRGGVGFDYW

GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 293).

[406] SB-15: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY

AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSHPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 294).

[407] SB-15: Região Variável de Cadeia Pesada:

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSNSYYWGWIRQPPGKGLEW

IGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREVGAPPSYP FDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 295).

[408] SB-16: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP

PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLFSTPFTFGGGT KVEIK (SEQ ID NO: 296).

[409] SB-16: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

SIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARANYYDSSGYS GLDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 297).

[1000] SB-17: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP

PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYDDPYTFGGGT KVEIK (SEQ ID NO: 298).

[410] SB-17: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMG

WISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGPLLYGDYHV RYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 299).

[411] SB-18: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSP QLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQALQTPITFGGGTK

VEIK (SEQ ID NO: 300).

[412] SB-18: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAKPRGDYGMD VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 301).

[413] SB-19: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSP

QLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQAIGVPPTFGGGTK VEIK (SEQ ID NO: 302).

[414] SB-19: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGGGGYAYEY FQHWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 303).

[415] SB-20: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQP

PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYLSPFTFGGGT KVEIK (SEQ ID NO: 304).

[416] SB-20: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

SIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGREYGGHYY GMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 305).

[417] SB-21: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSP

QLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLRIPPTFGGGTK VEIK (SEQ ID NO: 306).

[418] SB-21: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNGISWVRQAPGQGLEWMG WISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVGNMDQEYFD

LWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 307).

[419] SB-22: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY

AASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNSYPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 308).

[420] SB-22: Região Variável de Cadeia Pesada:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVS

VIYSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPTRYGYDRLGM DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 309).

[421] SB-23: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY

AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYPYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 310).

[422] SB-23: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

GIAPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTTYRDYYMDV WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 311).

[423] SB-24: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIY

GASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQLNIHPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 312).

[424] SB-24: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWAWIRQPPGKGLEWI

GSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRSRGYPVYG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 313).

[425] SB-25: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVNSFPWTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO: 314).

[426] SB-25: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSLAISWVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGGDYSGYDY ASGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 315).

[427] SB-26: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSP

QLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARGLPTFGGGTKV EIK (SEQ ID NO: 316).

[428] SB-26: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGSAGRQEHG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 317).

[429] SB-27: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP

PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQAVSDPPTFGGGT KVEIK (SEQ ID NO: 318).

[430] SB-27: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQDLGSSHWHF DLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 319).

[431] SB-28: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDGNFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 320).

[432] SB-28: Região Variável de Cadeia Pesada:

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEW IGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDPRDYSSGS

SGGGWGYFDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 321).

[433] SB-29: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSP

QLLIFLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARGSPITFGGGTK VEIK (SEQ ID NO: 322).

[434] SB-29: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

SIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAPYGSSSGYG YFDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 323).

[435] SB-30: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFLSSPWTFGGGTKVENQ (SEQ ID NO: 324).

[436] SB-30: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEW

IGYIYYSGSTVYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGPGYPSYF DPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 325).

[437] SB-31: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY

AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAVSHPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 326).

[438] SB-31: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMG

IINPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGLYSSGWYI DVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 327).

[439] SB-32: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQP PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDFLTPITFGGGT

KVEIK (SEQ ID NO: 328).

[440] SB-32: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIG

YIYSSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGDSSSGGLDLW GRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 329).

[441] SB-33: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIY

DASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQFAFLPLTFGGGTKVENQ (SEQ ID NO: 330).

[442] SB-33: Região Variável de Cadeia Pesada:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVS

VIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGQYTGSLDVWG QGTMVTVSS (SEQ ID NO: 331).

[443] SB-34: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIY

GASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDNTFPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 332).

[444] SB-34: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMG

WINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTYYTPYGMD VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 333).

[445] SB-35: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSP

QLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLQVPLTFGGGTK VEIK (SEQ ID NO: 334).

[446] SB-35: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGRPQSESYLL

DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 335).

[447] SB-36: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY

AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAFSHRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 336).

[448] SB-36: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMG

IINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGPEQLWYLD YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 337).

[449] SB-37: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRHTYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 338).

[450] SB-37: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRWGASGYYY YMDVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 339).

[451] SB-38: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY

AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAVSYPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 340).

[452] SB-38: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMG

IINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARESGTDFGTIS YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 341).

[453] SB-39: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYDFPLTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO: 342).

[454] SB-39: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWAWIRQPPGKGLEWI

GSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGSNYGDYGR FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 343).

[455] SB-40: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DSSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRDEHPPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 344).

[456] SB-40: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMSWVRQAPGQGLEWMG

IINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGEYSYSPH GMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 345).

[457] SB-41: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIY

DASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNFPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 346).

[458] SB-41: Região Variável de Cadeia Pesada:

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEW

IGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVGQYPIYGM DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 347).

[459] SB-42: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPATLSVSPGERATITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY

SASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSFPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 348).

[460] SB-42: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMG WISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGPGHYYVAGM

DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 349).

[461] SB-43: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DASKRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRFDFPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 350).

[462] SB-43: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWAWIRQPPGKGLEWI

GSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDAPGYPMLGM DVWGQGTTVSVSS (SEQ ID NO: 351).

[463] SB-44: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIY

KASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQEYGSYRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 352).

[464] SB-44: Região Variável de Cadeia Pesada:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVS

VIYSGGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGSSFWSGSAV SYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 353).

[465] SB-45: Região Variável de Cadeia Leve:

VLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYG

ASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVVSVPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 354).

[466] SB-45: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWAWIRQPPGKGLEWI

GSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDLSRGYAVSG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 355).

[467] SB-46: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSSYLAWYQQKPGQAPRLLI YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQLYSSPYTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO: 356).

[468] SB-46: Região Variável de Cadeia Pesada:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS

AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASPWELDVWG QGTMVTVSS (SEQ ID NO: 357).

[469] SB-47: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIY

DASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADYFPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 358).

[470] SB-47: Região Variável de Cadeia Pesada:

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYAWGWIRQPPGKGLEW

IGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDLGHYDYWS GSRDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 359).

[471] SB-48: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIY

AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQASNFPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 360).

[472] SB-48: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA

VISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGTIAAAGWP PEYFQHWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 361).

[473] SB-49: Região Variável de Cadeia Leve:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIY

DASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYFHPPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 362).

[474] SB-49: Região Variável de Cadeia Pesada:

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSDYYWGWIRQPPGKGLEW IGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGPTGYKDKW

RYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 363).

[475] SB-50: Região Variável de Cadeia Leve:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQP

PKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFLHTPRTFGGGT KVEIK (SEQ ID NO: 364).

[476] SB-50: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGGHASYHY YGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 365).

[477] SB-1-2: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQLLGSSPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 267).

[478] SB-1-2: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFGSFGMNWVRQAPGKGLEWVS

AITASGGSTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFTEVVGWLG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 366).

[479] SB-1-3: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQLLGSSPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 267).

[480] SB-1-3: Região Variável de Cadeia Pesada:

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSAYGMNWVRQAPGKGLEWVS

AITSSGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFTEVVGWLG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 367).

[481] SB-1-4: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQLLGSSPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO: 267).

[482] SB-1-4: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYGMNWVRQAPGKGLEWVS

AIRASGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFTEVVGWLG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 368).

[483] SB-1-5: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQLLGSSPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 267).

[484] SB-1-5: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSAYGMNWVRQAPGKGLEWVS

AISASGRSTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFTEVVGWLG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 369).

[485] SB-2-7: Região Variável de Cadeia Leve:

EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSSHPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 370).

[486] SB-2-7: Região Variável de Cadeia Pesada:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYGMHWVRQAPGKGLEWVS

AISGLAGPTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQTAAAAIWGM DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 371).

[487] SB-2-8: Região Variável de Cadeia Leve:

EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSSHPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 370).

[488] SB-2-8: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFLDYGMHWVRQAPGKGLEWVS AISAFAGSTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQTAAAAIWGM

DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 372).

[489] SB-2-9: Região Variável de Cadeia Leve:

EVVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSSHPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 370).

[490] SB-2-9: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFKTYGMHWVRQAPGKGLEWVA

HIWYEGSNKVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQTAAAAIWG MDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 373).

[491] SB-2-10: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSSHPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 269).

[492] SB-2-10: Região Variável de Cadeia Pesada:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYGMHWVRQAPGKGLEWVS

AISGLAGQTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQTAAAAIWGM DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 374).

[493] SB-2-11: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSSHPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 269).

[494] SB-2-11: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARYGMHWVRQAPGKGLEWVS

AISGLAGPTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQTAAWGIWGM DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 375).

[495] SB-8-13: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI YGASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVYSSPYTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO: 280).

[496] SB-8-13: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISAHYYWGWIRQPPGKGLEWI

GSIFHSGHTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGAMTPAGMD VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 376).

[497] SB-8-14: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVYSSPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 280).

[498] SB-8-14: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISPHYYWGWIRQPPGKGLEWI

GSIYHSGHTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGAMTPAGMD VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 377).

[499] SB-8-15: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVYSSPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 280).

[500] SB-8-15: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISPHYYWGWIRQPPGKGLEWI

[501] SB-8-16: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVYSSPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 280).

[502] SB-8-16: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISAHYYWGWIRQPPGKGLEWI GSIFHSGHTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAGAMTPAGMD

VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 378).

[503] SB-40-18: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DSSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRDEHPPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 344).

[504] SB-40-18: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMAWVRQAPGQRLEWMG

WINPAVGATIYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGEYSYSPH GMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 379).

[505] SB-40-19: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DSSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRDEHPPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 344).

[506] SB-40-19: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMVWVRQAPGQGLEWMG

IINPSSGATNYAQKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDTGEYSYSPH GMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 380).

[507] SB-40-20: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DSSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRDEHPPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 344).

[508] SB-40-20: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSFYISWVRQAPGQGLEWMG

IINPSSGHTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGEYSYSPH GMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 381).

[509] SB-40-21: Região Variável de Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY DSSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRDEHPPWTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO: 344).

[510] SB-40-21: Região Variável de Cadeia Pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMVWVRQAPGQGLEWMG

IINPSSGDTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTGEYSYSPH GMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 382).

[511] SIRPα, domínio 1 (domínio IgV):

EELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIY

NQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAG TELSVRAKPS (SEQ ID NO: 387).

[512] SIRPβ1, domínio 1 (domínio IgV):

EDELQVIQPEKSVSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELI

YNQKEGHFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGA GTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 388).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO ISOLADO que se liga à SIRPβ1 humana, caracterizado por ter pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco propriedades selecionadas a partir de: a) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPα humana; b) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPγ humana; c) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à isoforma 3 da SIRPβ1 humana; d) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à SIRPβ1 de camundongo; e) liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não liga-se à isoforma 1 da SIRPβ1 de macacos cinomolgos; f) agoniza a atividade de SIRPβ1 in vitro e/ou in vivo em monócitos positivos para CD14; g) induz ou aumenta a explosão respiratória (respiratory burst) em células imunes, tais como neutrófilos e/ou monócitos de maneira in vitro e/ou in vivo; h) induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vitro e/ou in vivo; i) induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas in vitro e/ou in vivo; j) induz a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais in vitro e/ou in vivo; k) aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo; l) aumenta a expressão de TREM2 em macrófagos in vitro e/ou in vivo; m) aumenta a viabilidade de macrófagos in vitro e/ou in vivo, sozinho e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti-TREM2; e n) aumenta a viabilidade de células dendríticas in vitro e/ou in vivo.

2. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se ligar à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não à SIRPα humana ou isoforma 3 da SIRPβ1 humana; ou caracterizado por se ligar à isoforma 1 da SIRPβ1 humana, mas não à SIRPα humana, SIRPγ ou isoforma 3 da SIRPβ1 humana.

3. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ter pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três propriedades selecionadas a partir de: a) agoniza a atividade de SIRPβ1 in vitro e/ou in vivo em monócitos positivos para CD14; b) induz ou aumenta a explosão respiratória em células imunes, tais como neutrófilos e/ou monócitos de maneira in vitro e/ou in vivo; c) induz ou aumenta a expressão de IL-8 em monócitos in vitro e/ou in vivo; d) induz ou aumenta a expressão de TNFα em macrófagos e/ou células dendríticas in vitro e/ou in vivo; e) induz a fagocitose mediada por neutrófilos, por exemplo, de células tumorais in vitro e/ou in vivo; o) aumenta a depuração de células tumorais mediada por neutrófilos in vivo; p) aumenta a expressão de TREM2 em macrófagos in vitro e/ou in vivo; q) aumenta a viabilidade de macrófagos in vitro e/ou in vivo,

sozinho e/ou em combinação com um anticorpo agonista anti-TREM2; e f) aumenta a viabilidade de células dendríticas in vitro e/ou in vivo.

4. ANTICORPO ISOLADO que se liga à SIRPβ1 humana, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (a) HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 mostrada na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (b) HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H2 mostrada na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H3 mostrada na Tabela 4 e/ou Tabela 9; (d) HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L1 mostrada na Tabela 3 e/ou Tabela 8; (e) HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L2 mostrada na Tabela 3 e/ou Tabela 8; e (f) HVR- L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-L3 mostrada na Tabela 3 e/ou Tabela 8.

5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela região variável de cadeia pesada compreender uma, duas, três ou quatro regiões estruturais (frameworks) selecionadas a partir de VH FR1, VH FR2, VH FR3 e VH FR4 mostradas na Tabela 6.

6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pela região variável de cadeia leve compreender uma, duas, três ou quatro regiões estruturais (frameworks) selecionadas a partir de VL FR1, VL FR2, VL FR3 e VL FR4 mostradas na Tabela 5.

7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a HVR-H1, HVR-H2, HVR-H2, HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12,

SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB-20, SB-21, SB-22, SB- 23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB-29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB-41, SB-42, SB-43, SB- 44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB-50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1- 5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB- 8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21 (mostrados nas Tabelas 3, 4, 8 e 9).

8. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 ou 382.

9. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 268, 270, 272, 274, 276, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 ou 382.

10. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 267, 269, 271, 273, 275, 277,

278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364 ou 370.

11. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 267, 269, 271, 273, 275, 277, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364 ou 370.

12. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve que são pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idênticas à região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB- 20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB-29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB- 41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB-50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

13. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-10, SB-11, SB-12, SB-13, SB-14, SB-15, SB-16, SB-17, SB-18, SB-19, SB- 20, SB-21, SB-22, SB-23, SB-24, SB-25, SB-26, SB-27, SB-28, SB-29, SB-30, SB-31, SB-32, SB-33, SB-34, SB-35, SB-36, SB-37, SB-38, SB-39, SB-40, SB-

41, SB-42, SB-43, SB-44, SB-45, SB-46, SB-47, SB-48, SB-49, SB-50, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

14. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a HVR-H1, HVR-H2, HVR-H2, HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2- 10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB- 40-20 e SB-40-21 (mostrados nas Tabelas 3, 4, 8 e 9).

15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB- 1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

17. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 16, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB- 40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21.

18. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 17, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20, e SB-40-21.

19. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 18, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve que são pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idênticas à região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB- 40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

20. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 19, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1, SB-2, SB-3, SB-4, SB-5, SB-6, SB-7, SB-8, SB-9, SB-14, SB-28, SB-39, SB-40, SB-49, SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB- 40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

21. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a HVR-H1, HVR-H2,

HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3 de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40- 21 (mostrados nas Tabelas 8 e 9).

22. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

23. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB- 2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40- 18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

24. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 23, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2- 9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40- 19, SB-40-20 e SB-40-21.

25. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2-9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8- 15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40-19, SB-40-20 e SB-40-21.

26. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 25, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve que são pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idênticas à região variável da cadeia pesada e região variável da cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2- 9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40- 19, SB-40-20 e SB-40-21.

27. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 26, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SB-1-2, SB-1-3, SB-1-4, SB-1-5, SB-2-7, SB-2-8, SB-2- 9, SB-2-10, SB-2-11, SB-8-13, SB-8-14, SB-8-15, SB-8-16, SB-40-18, SB-40- 19, SB-40-20 e SB-40-21.

28. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 228 ou 229; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, 239, 239, 240 ou 241; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

29. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, 367, 368 ou 369.

30. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 28 ou 29,

caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267.

31. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 30, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 366, 367, 368 ou 369.

32. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 31, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

267.

33. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81, 99, 230, 231 ou 232; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, 242, 243, 244 ou 245; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126 ou 253; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

34. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, 372, 373, 374 ou

375.

35. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 269 ou 370.

36. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 35, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, 372, 373, 374 ou 375.

37. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 36, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 269 ou 370.

38. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 37, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 371, 372 ou 373, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 370; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 374 ou 375 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 269.

39. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, 233 ou 234; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, 246, 247 ou 248; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 ou 254; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

40. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376, 377 ou 378.

41. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 280.

42. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 39 a 41, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376, 377 ou 378.

43. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 39 a 42, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

280.

44. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, 235, 236 ou 237; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, 249, 250, 251 ou 252; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69.

45. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 379, 380, 381 ou 382.

46. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 44 ou 45,

caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 344.

47. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 44 a 46, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 379, 380, 381 ou 382.

48. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 44 a 47, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

344.

49. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 229; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 239; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

50. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 367.

51. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 267.

52. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 49 a 51, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 367.

53. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 49 a 52, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

267.

54. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 231; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 243; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

55. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 372.

56. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 370.

57. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 56, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 372.

58. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 57, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

270.

59. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por compreender a (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 246; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 383; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

60. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376.

61. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 280.

62. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 59 a 61, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 376.

63. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 59 a 62, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

280.

64. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 63, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal.

65. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 64, caracterizado pelo anticorpo ser da classe IgG, da classe IgM ou da classe IgA.

66. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo anticorpo ser da classe IgG e ter um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

67. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado por ter um isotipo IgG1.

68. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado por compreender uma substituição E430G e uma substituição P331S de acordo com a numeração EU.

69. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 68, caracterizado pelo anticorpo ser um fragmento de anticorpo.

70. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fragmento de anticorpo ser um fragmento Fab, Fab', Fab'- SH, F(ab')2 ou scFv.

71. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 70, caracterizado pelo anticorpo ter uma afinidade (K D) para a isoforma 1 da SIRPβ1 humana de 0,1 nM a 50 nM ou de 0,5 nM a 10 nM ou de 0,5 nM a 5 nM.

72. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pela afinidade ser medida usando um sistema ForteBio Octet®.

73. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 72, caracterizado pelo anticorpo reconhecer um primeiro e um segundo antígeno, em que o primeiro antígeno é SIRPβ1 e o segundo antígeno é:

(a) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica;

(b) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica selecionado a partir do grupo que consiste no receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteínas relacionadas ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 1 e 2 (LPR -1 e 2), e receptor da toxina da difteria;

(c) um agente causador de doenças selecionado a partir di grupo que consiste em proteínas ou peptídeos causadores de doenças ou ácidos nucleicos causadores de doenças, em que os ácidos nucleicos causadores de doenças são RNA de expansão de repetição de GGCCCC

(G2C4) antissenso, as proteínas causadoras de doenças são selecionadas a partir di grupo que consiste em beta amiloide, beta amiloide oligomérico, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos dos mesmos,

Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (fase de leitura aberta 72 no cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína príon, PrPSc,

Huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3,

ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial,

polipeptídeo amiloide de ilhotas, insulina, apolipoproteína A1, amiloide sérica A,

medina, prolactina, transtiretina, lisozima, beta 2 microglobulina, gelsolina,

queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM,

produtos de tradução não ATG (RAN) associados à repetição, peptídeos de repetição tipo diPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição glicina-alanina (GA),

peptídeos de repetição glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina- arginina (GR), peptídeos de repetição prolina-alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR);

(d) um ligante e/ou proteína expresso(s) em células imunes, em que o ligante e/ou proteína é(são) selecionado(s) a partir do grupo que consiste em CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA- 4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, BTLA, KIR, GAL9, TIM3, A2AR, LAG-3 e fosfatidilserina; e (e) uma proteína, lipídio, polissacarídeo ou glicolipídio expresso em uma ou mais células tumorais.

74. ANTICORPO ISOLADO que se liga à SIRPβ1 humana, caracterizado por competir com um ou mais anticorpos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 73, pela ligação à isoforma 1 da SIRPβ1 humana.

75. ANTICORPO ISOLADO que se liga à SIRPβ1 humana, caracterizado por ligar-se essencialmente o mesmo epítopo ou se sobrepor ao epítopo da isoforma 1 da SIRPβ1 como um ou mais anticorpos de qualquer uma das reivindicações de 1 a 74.

76. ÁCIDO NUCLEICO isolado, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo de qualquer uma das reivindicações anteriores.

77. VETOR, caracterizado por compreender o ácido nucleico da reivindicação 76.

78. CÉLULA HOSPEDEIRA isolada, caracterizada por compreender o vetor da reivindicação 77.

79. CÉLULA HOSPEDEIRA isolada, caracterizada por expressar o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a

75.

80. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO que se liga à SIRPβ1 humana, caracterizado por compreender o cultivo da célula de acordo com a reivindicação 78 ou 79, para que o anticorpo seja produzido.

81. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado por compreender adicionalmente a recuperação do anticorpo produzido pela célula.

82. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, compreendendo o anticorpo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 75, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

83. MÉTODO PARA TRATAR O CÂNCER, caracterizado por compreender a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 75.

84. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo câncer ser selecionado a partir de sarcoma, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de pélvis renal, leucemia, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, melanoma, linfoma, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário e fibrossarcoma, glioblastoma multiforme; carcinoma renal de células claras; carcinoma adrenocortical; carcinoma urotelial da bexiga, linfoma difuso de grandes células B, adenocarcinoma de pulmão; adenocarcinoma pancreático, câncer de células renais, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma indolente de células B, linfoma de células B agressivo, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múltiplo, síndromes mielodisplásicas, neoplasias mieloproliferativas, carcinoma invasivo de mama, carcinoma de células escamosas cervicais, adenocarcinoma endocervical, colangiocarcinoma, adenocarcinoma de cólon, linfoma difuso de grandes células B, carcinoma de cabeça e pescoço, carcinoma renal cromofóbico, carcinoma renal de células papilares, glioma de grau inferior, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas pulmonares, mesotelioma, cistadenocarcinoma seroso ovariano, adenocarcinoma pancreático, feocromocitoma e paraganglioma, adenocarcinoma da próstata, adenocarcinoma retal, melanoma cutâneo, adenocarcinoma de estômago, tumores de células germinais testiculares, carcinoma da tiroide, timoma, carcinoma endometrial do corpo uterino, carcinossarcoma uterino, e melanoma uveal.

85. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 83 ou 84, caracterizado por compreender ainda a administração de um agente terapêutico que inibe ou agoniza PD1, PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, CTLA4, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR- 5, CD2, CD5, CD39 ou CD73.

86. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 83 a 85, caracterizado por compreender ainda a administração ao indivíduo de, pelo menos, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de ponto de verificação, e/ou uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais.

87. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado por compreender ainda a administração de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória em combinação com o anticorpo anti-SIRPA.

88. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 86 ou 87, caracterizado pelo anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de ponto de verificação inibitória ser selecionado a partir de um anticorpo anti-PD- L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e anticorpo anti-HVEM, um anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo antirreceptor tipo imunoglobulina Killer (KIR) inibidor, um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM-1, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-TIM-4, um anticorpo anti- A2AR, um anticorpo anti-CD39, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti- LAG-3, um anticorpo anti-fosfatidilserina, um anticorpo anti-CD27, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-TNFα, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti- Siglec- 5, um anticorpo anti-Siglec-7, um anticorpo anti-Siglec-9, um anticorpo anti-Siglec-11, um anticorpo anti-TREM1 antagonista, um anticorpo anti- TREM2 antagonista, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-VISTA, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, e qualquer combinação dos mesmos.

89. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado por uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais serem selecionadas a partir de radioterapia, quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, terapia com imatinibe, terapia com trastuzumabe, terapia com etanercept, transferência de células adotivas (ACT), terapia de transferência de receptor de antígeno quimérico de células T (CAR-T), terapia com vacina e terapia com citocinas.

90. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 83 a 89, caracterizado por compreender ainda a administração ao indivíduo de, pelo menos, um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora.

91. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora ser selecionado a partir de um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2, e qualquer combinação dos mesmos.

92. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 83 a 91, caracterizado por compreender ainda a administração ao indivíduo de, pelo menos, um anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora.

93. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação estimuladora ser selecionado a partir de um anticorpo agonista anti-CD40, um anticorpo agonista anti-OX40, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonista anti-TREM1, um anticorpo agonista anti-TREM2, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista anti-CD27, um anticorpo agonista anti-GITR proteína relacionada ao TNFR induzida por glicocorticoide, um anticorpo agonista anti- CD30, um anticorpo agonista anti-BTLA, um anticorpo agonista anti-HVEM, um anticorpo agonista anti-CD2, um anticorpo agonista anti-CD5 e qualquer combinação dos mesmos.

94. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 83 a 93, caracterizado por compreender ainda a administração ao indivíduo pelo menos uma citocina estimuladora.

95. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pela citocina estimuladora ser selecionada a partir de IFN-α4, IFN-β, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1- beta e qualquer combinação das mesmas.

96. USO DE UM ANTICORPO de qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento.

97. USO de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para tratar o câncer.

98. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 75, caracterizado por ser para uso no tratamento do câncer.

99. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA ou distúrbio neurodegenerativo, caracterizado por compreender a administração a um indivíduo com tal necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 75.

100. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pela doença ou distúrbio neurodegenerativo ser selecionado a partir de demência, demência frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva, doença de Alzheimer, demência vascular, doença de Nasu-Hakola, déficit cognitivo, perda de memória, convulsões, distrofia retinal, esclerose lateral amiotrófica, cérebro traumático lesão, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, encefalomielite disseminada aguda, degeneração retinal, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, esclerose múltipla.

101. USO de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio neurodegenerativo.

102. USO, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pela doença ou distúrbio neurodegenerativo ser selecionado a partir de demência, demência frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva, doença de Alzheimer, demência vascular, doença de Nasu-Hakola, déficit cognitivo, perda de memória, convulsões, distrofia retinal, esclerose lateral amiotrófica, cérebro traumático lesão, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, encefalomielite disseminada aguda, degeneração retinal, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, esclerose múltipla.

103. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 75, caracterizado pelo por ser para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo.

104. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pela doença ou distúrbio neurodegenerativo ser selecionado a partir de demência, demência frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva, doença de Alzheimer, demência vascular, doença de Nasu- Hakola, déficit cognitivo, perda de memória, convulsões, distrofia retinal, esclerose lateral amiotrófica, cérebro traumático lesão, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, encefalomielite disseminada aguda, degeneração retinal, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, esclerose múltipla.