JP4224586B2 - マクロファージ活性化剤並びにその製造方法及びスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
(1)シグナルレギュレートリープロテインβ(SIRP β)の細胞外領域を認識する抗
体を含むマクロファージ活性化剤。
(2) 前記抗体がモノクローナル抗体である、(1)のマクロファージ活性化剤。
(3) SIRP βの細胞外領域を認識する抗体を取得する工程、および該抗体を薬学的に許容されうる担体と配合する工程を含む、マクロファージ活性化剤の製造方法。
(4) SIRP βの細胞外領域に結合する物質を取得する工程、および該物質をマクロファージ細胞に添加して該物質のマクロファージ活性化能を測定する工程を含む、マクロファージ活性化剤のスクリーニング方法。
Regulatory Protein β:SIRP β)の細胞外領域を認識する抗体を含むマクロファージ活性化剤である。SIRP βとしては、哺乳動物のSIRP βが好ましく、マウスまたはヒトのSIRP βがより好ましく、ヒトのSIRP βが特に好ましい。ヒトのSIRP βとしては配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましく、マウスのSIRP βとしては配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましい。細胞外領域は、ヒトのSIRP βの細胞外領域として配列番号4の1〜369番目のアミノ酸配列を有する領域が、マウスのSIRP
βの細胞外領域として配列番号2の1〜362番目のアミノ酸配列を有する領域が挙げられる。本発明のマクロファージ活性化剤に含まれる抗体は、これらのSIRP βの細胞外領域を認識する抗体であるが、マクロファージを活性化できる抗体である限り、エピトープが上記細胞外領域のどの部分にあってもよい。
に使用するためのSIRPβの細胞外領域タンパク質は、細胞外領域の一部であってもよい。抗体がSIRPβの細胞外領域を認識するかどうかは、ウエスタンブロットやELISAなどによって確認することができる。また、マクロファージを活性化できるかどうかは、該抗体で処理したマクロファージの、細胞の形態やオプソニン化赤血球に対する貪食作用などを観察又は測定し、その結果を非処理マクロファージと比較することによって調べることができる。
なお、本発明において、モノクローナル抗体とは、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、F(ab’)2化抗体、F(ab’)化抗体、短鎖抗体(scFv)、ダイアボディ(Diabodies)およびミニボディ(Minibodies)を含むものとする。本発明の医薬組成物がヒトに使用するものである場合は、マウスミエローマ細胞によって得られた抗体を、キメラ化又はヒト化することが好ましい。具体的には、遺伝子組み換えによって抗体の定常領域をヒト由来のものとするキメラ抗体作成技術や、超可変領域以外をヒト由来とするヒト化抗体作成技術などを用いて、モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化することが好ましい。
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、投与方法、あるいは該医薬組成物 に含有される抗体の割合などにより異なるが、1回の投与において1kg体重あたり、1μg〜100mgが好ましく、1kg体重あたり、50μg〜50mgがより好ましい。投与回数は特に制限されず、1日あたり1回〜数回投与することができる。
λZapII胸腺cDNAライブラリー(Stratagene社)を鋳型に、配列番号5及び6の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたPCRによって、C57BL/6マウスのSIRPβをコードするcDNAを増幅した。PCR産物をpGEM-Tベクター(Invitrogen社)にサブクローニングし、ABI PRISM310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社)を用いて塩基配列の確認を行った。その結果、配列番号1に示す塩基配列であった。
pEFneoFc76ベクター(EMBO J., 2003, vol. 22, p2634-2644)をEcoRIとNcoIで消化して抗体のFc領域をコードするDNAフラグメントを切り出した。このフラグメントをpTracer-CMV(Invitrogen社)に挿入してpTracer-Fcを得た。
上記で増幅したC57BL/6マウスのSIRPβ全長cDNA(配列番号1)を鋳型に、配列番号7及び8の塩基配列を有するプライマーを用いたPCRによってマウスSIRPβの細胞外領域(配列番号2の1−362番目のアミノ酸からなる領域)をコードするDNAを増幅した。得られたPCR産物をBamHI及びXbaIで消化し、上記pTracer-Fcに挿入した。これによってマウスSIRPβの細胞外領域とFcの融合タンパク質を発現するためのベクターpTracer-CMV-SIRPβ-Fcを得た。
SIRPβ-Fc融合タンパク質を2匹のWistarラットの後ろ足のうらに1週間おきに注入した。その後、リンパ節からリンパ球を単離し、J Biol Chem. 1996, vol. 271, p27652-27658に記載の方法によりP3U1ミエローマ細胞と融合させた。ハイブリドーマクローンの中か
ら、ELISA法により、SIRPβ-Fcに反応し、SHPS-1-Fcに反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。なお、SHPS-1-Fcは、SHPS-1(Blood, 2001, Vol. 97, No. 9, p. 2741-2749参照)とFcの融合タンパク質である。得られた7種類のSIRPβ-Fc抗体産生ハイブリドーマの中から、クローン80及び84を以下の実験に用いた。クローン80及び84の無血清培養上清から、プロテインA−Sepharose 4FF(Amersham Pharmacia Biotech社)を用いたカラムクロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。これらをそれぞれ、mAb80、mAb84と名づけた。Rat Mono AB ID/SP kit(Zymed社)を用いてこれらのアイソタイプを決定したところ、mAb80はIgG2a、mAb84はIgGκであることがわかった。以下、mAb80、mAb84を単に抗SIRPβ抗体と呼ぶことがある。
チオグリコール酸で顕在化したマウスプライマリー腹腔マクロファージ(PEM)は、J Biol Chem, 2002, 277, 39833-39839に記載の方法に従って単離、培養した。具体的には、C57BL/6マウスに3mlの3%チオグリコール酸培地(ニッスイ社)を腹腔内注入した3日後、腹腔を0.2%BSAを含む氷冷PBSでフラッシュした。滲出細胞を4℃、400xg、5分間で遠心分離して単離し、氷冷RPMI−1640で洗浄し、10%ウシ胎児血清を含むRPMI−1640で再懸濁した。37℃で24時間インキュベーションした後、好中球、B細胞及びT細胞を含む非付着細胞を洗浄して除いた。得られたチオグリコール酸で顕在化したマウス腹腔マクロファージ(PEM)を24ウェル培養プレートに分注し、3〜4日培養した。貪食アッセイの直前に、プレートを氷上に置き、mAb80、mAb84、またはこれらに対応するアイソタイプのコントロールIgGを20μg/mlの濃度で加えた。氷上で15分間、インキュベートした後、細胞を氷冷したPBSで2回洗浄し、2次抗体の存在下(図1A、2nd Abs(+)、図1C及びD)または非存在下(図1A、2nd Abs(−))、グルタルアルデヒドで固定化したIgGオプソニン化ヒツジ赤血球(Ig-sRBC;Inter-Cell Technologies社)(5×107/ウェル)を含む無血清RPMI-1640を加えた。なお、2次抗体としては、ラットIgGに対するヤギポリクローナル抗体(20μg/ml;Jackson Immuno Research社)を用いた。図1C及びDでは、非オプソニン化ヒツジ赤血球、C3biオプソニン化ヒツジ赤血球を用いた実験も行った。
一方、図1BではマウスマクロファージのセルラインであるRAW264.7を用いた。RAW264.7は10%ウシ胎児血清を含むRPMI−1640を用いて培養した。培養は37℃、5%CO2の加湿条件下で行った。PEMと同様にして、mAb80、mAb84、またはコントロールIgGを20μg/mlの濃度で加えた。次いで、2次抗体の存在下(図1B、2nd Abs(+))または非存在下(図1B、2nd Abs(−))、グルタルアルデヒドで安定化したIgGオプソニン化ヒツジ赤血球を含む無血清RPMI-1640を加えた。
なお、IgGまたはC3biでオプソニン化した赤血球はJ Exp. Med., 2001, vol. 193, p855-862に記載の方法に従って調製した。
O3, 0.1mM EDTA)で常温で5分間インキュベートした。貪食インデックスを決定するために、ランダムに選択した視野の100以上の細胞を検討し、貪食された赤血球を有する細胞のパーセンテージを算出した。
結果を図1に示す。図1Aより、抗SIRPβ抗体であるmAb80、mAb84を加えて2次抗体でクロスリンク(架橋)したPEMでは、コントロールのラットIgGを加えて2次抗体でクロスリンクしたPEMに比べて、マクロファージによる貪食が約2倍に増加した。2次抗体非添加ではほとんど効果が見られなかったことから、抗SIRPβ抗体によるマクロファージの活性化には、2次抗体でクロスリンクするなどして抗体濃度を高めることが必要であることがわかった。図1Bより、mAb80、mAb84は培養マクロファージ細胞株に対しても活性化できることがわかった。図1Cより、mAb80、mAb84によって活性化されたPEMは非オプソニン化赤血球を貪食することもできるが、オプソニン化赤血球のほうがより多く貪食することができることがわかった。図1Dより、mAb80、mAb84によって活性化されたPEMは、捕体C3biによってオプソニン化された赤血球を貪食することもできることがわかった。
抗SIRPβ抗体がマクロファージを活性化するメカニズムを探るために以下の実験を行った。
抗SIRPβ抗体またはコントロールIgG、及び2次抗体で処理したPEMを37℃で10分間インキュベートした。ポジティブコントロールとしては、M-CSF(10ng/ml)を加えて37℃で5分間インキュベートした。ネガティブコントロールとしては非処理のPEMを用いた。次に、各細胞を溶解し、抗MAPK抗体(αMAPK)、抗活性型(リン酸化)MAPK抗体(αpMAPK)、抗MEK抗体(αMEK)、抗活性型MEK抗体(αpMEK)を用いたイムノブロット解析を行った(図2A)。mAb80、mAb84によってMAPK及びMEKのリン酸化が亢進しており、抗SIRPβ抗体添加によりMAPK及びMEKが活性化することがわかった。
細胞骨格の再構築による細胞接着や細胞遊走には、MAPKによるミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)の活性化が関与していることが知られている(J Cell Biol., 1997,vol. 137, p481-492)。このことから、SIRPβ抗体によるマクロファージ活性化経路においても、MAPKによるミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)の活性化が関与しているかどうかについて調べた。
まず、MLCKの阻害剤であるML-7(J Biol Chem., 1987, vol. 262, p7796-7801)の存在下(10μM)、非存在下でPEMを37℃で30分間インキュベートした。次に、抗SIRPβ抗体またはコントロールIgG、及び2次抗体で処理した後、IgGでオプソニン化した赤血球を加えて37℃、5分間インキュベートし、細胞を固定化して貪食インデックスを測定した(図3A)。また、MLCKによって活性化されるミオシンのATPase活性の阻害剤(BDM;50mM)を用いて同様の実験を行った(図3B)。これら阻害剤添加によりマクロファージの活性化が
見られなくなったことから、抗SIRPβ抗体によるマクロファージの貪食作用の活性化にMLCK→Myosin経路が関与していることが示唆された。
ラットIgG、mAb80又はmAb84で処理したPEMを4%パラホルムアルデヒド及び0.1%グルタルアルデヒドを含むPBS中、常温で20〜30分間、固定化した。次に、0.1%TritonX100及び5%ヤギ血清を含むPBS(ブロッキング液)で、常温、60分間処理し、膜透過性にした。ブロッキング液に希釈した一次抗体(活性型MAPK抗体)を加えて常温1時間または4℃一晩インキュベートした後、細胞をPBSで洗浄し、ブロッキング液に希釈したAlexa488結合二次抗体(Molecular Probe社)を加えて、常温で1時間インキュベートした。F-アクチンの可視化のためには、細胞を前記2次抗体とともに、Rhodamine結合ファロイジン(phalloidin;Molecular Probe社)を加えてインキュベートした。細胞をPBSで洗浄した後に、封入した。共焦点レーザー顕微鏡(LSM5 PASCAL Zeiss社)を用いて蛍光像を得た(図4)。その結果、mAb80又はmAb84の添加によりMAPKの核への移行が見られ、マクロファージは糸状突起(filopodia)や膜状仮足(lamellipodia)を有する長く伸びた形態を示した。このような形態変化は、PI3キナーゼの阻害剤であるwortmanin添加では見られたが、及びMEK阻害剤(PD98059)またはMLCK阻害剤(ML-7)添加では見られなかった。
SIRPβはDAP12と複合体を形成し、DAP12をリン酸化して、DAP12とチロシンキナーゼSykの結合を誘導することが報告されている(J Immunol., 2000, vol. 164, p9-12)。そこで、抗SIRPβ抗体によるマクロファージ活性化経路において、DAP12、Sykが関与しているかどうかについて調べた。
まず、mAb84またはラットIgG(コントロール)、及び2次抗体で処理したPEMの溶解物について抗SIRPβポリクローナル抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降物について抗DAP12抗体を用いてイムノブロットを行った(図5A)。これにより、SIRPβとDAP12が相互作用していることが確認できた。
また、mAb84またはラットIgG、及び2次抗体で処理したPEMの溶解物について抗DAP12ポリクローナル抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降物について抗リン酸化チロシン抗体を用いてイムノブロットを行った(図5B上)。同様に、mAb84またはラットIgG、及び2次抗体で処理したPEMの溶解物について抗Sykポリクローナル抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降物について抗DAP12抗体を用いてイムノブロットを行った(図5B下)。これにより、mAb84添加によりDAP12のリン酸化の亢進、及びDAP12とSykの相互作用の亢進が見られた。
また、抗Sykポリクローナル抗体を用いて得た免疫沈降物について抗リン酸化チロシン抗体を用いてイムノブロットを行った(図5C)。これにより、mAb80、mAb84添加によりSykのリン酸化の亢進が見られた。
また、Piceatannol非存在、存在下で抗SIRPβ抗体またはコントロールIgG、及び2次抗体で処理したPEMを抗Syk抗体で免疫沈降することにより得られた沈降物を、抗リン酸化チロシン抗体(αPY)を用いたイムノブロットによって解析した(図5E)。さらに、Piceatannol非存在、存在下で抗SIRPβ抗体またはコントロールIgG、及び2次抗体で処理したPEMを、抗MAPK抗体(αMAPK)、抗活性型MAPK抗体(αpMAPK)を用いたイムノブロットによって解析した(図5F)。その結果、Piceatannol非存在下ではmAb80、mAb84によるSykおよびMAPKの活性化が確認されたが、Piceatannol存在下ではmAb80、mAb84によるSykおよび
MAPKの活性化が見られなかった。これらの結果から、抗SIRPβ抗体によるマクロファージの活性化には、SIRPβ→DAP12→Syk→MAPKという経路が予想された。
SykはSLP-76をリン酸化することが知られている(Immunity, 1998, vol. 9, p607-616)。したがって、抗SIRPβ抗体によって活性化されたSykがアダプタータンパク質であるSLP-76をリン酸化するかどうかを調べるために以下の実験を行った。
Piceatannol非存在、存在下で抗SIRPβ抗体またはコントロールIgG、及び2次抗体で処理したPEMをSLP-76抗体で免疫沈降することにより得られた沈降物を、抗リン酸化チロシン抗体(αPY)を用いたイムノブロットによって解析した(図6A,B)。その結果、mAb80、mAb84によってSLP-76の活性化が見られたが、Piceatannol存在下ではSLP-76の活性化が見られなかった。
すなわち、まず、リガンドによるSIRPβの細胞外ドメインへの刺激によってSIRPβに結合したDAP12がリン酸化されて、リン酸化部位にSykが結合する。SykがSLP-76をリン酸化し、さらにその下流のMEKが活性化され、MAPKを活性化する。活性化されたMAPKによりMLCKが活性化され、Myosinがリン酸化される。これにより細胞骨格が変化し、マクロファージの活性化が起こるというメカニズムが推定された。
Claims (4)
- シグナルレギュレートリープロテインβ(SIRP β)の細胞外領域を認識する抗体を含むマクロファージ活性化剤。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載のマクロファージ活性化剤。
- SIRP βの細胞外領域を認識する抗体を取得する工程、および該抗体を薬学的に許容されうる担体と配合する工程を含む、マクロファージ活性化剤の製造方法。
- SIRP βの細胞外領域に結合する物質を取得する工程、および該物質をマクロファージ細胞に添加して該物質のマクロファージ活性化能を測定する工程を含む、マクロファージ活性化剤のスクリーニング方法。
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