TWI840364B - 抗-sirpa抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明大體上關於包括特異性結合SIRPA多肽(例如：哺乳動物SIRPA或人類SIRPA)之抗體(例如：單株抗體、抗體片段，等等)的組合物，及此類組合物在預防、降低風險或治療有此需要之個體上的用途。

Description

抗-SIRPA　抗體及其使用方法
本發明係關於抗-SIRPA抗體及此類抗體之治療用途。
吞噬細胞，諸如巨噬細胞(MΦ)及樹突狀細胞(DC)，藉由調節細胞活化狀態、增殖及/或效應功能之複雜細胞表面受體陣列來區分健康細胞與異常細胞。諸多此等受體識別不同的配體，該等配體標記不合需要之細胞以便移除(所謂的「吃我(eat-me)」信號)，或者保護正常細胞免受破壞(所謂的「不吃我(don't-eat-me)」信號)。近年來，SIRPα-CD47軸已成為在從癌細胞存活至造血細胞移植之成功植入範圍內的各種臨床配置中藉由巨噬細胞進行計劃性細胞移除的關鍵決定因素。影響此途徑之治療劑可滿足改善在諸多類型之人類癌症中具有特定相關性的疾病的相關醫學需求。
信號調節蛋白-α(signal regulatory protein-α，SIRPα)屬於跨膜受體之SIRP家族，其主要在骨髓細胞譜系(包括MΦ、DC、顆粒球等)內表現且其特徵在於含有2個近膜IgC域及一遠端IgV域之細胞外區域。SIRPα係此家族中獨一無二的，含有細胞內細胞質免疫受體酪胺酸基抑制基元(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)。在受體交聯後，酪胺酸磷酸化的ITIM位點募集並活化SHP磷酸酶以負調節細 胞功能，諸如吞噬作用或發炎性細胞介素釋放。CD47充當SIRPα之主要配體，且其在包括內皮細胞/上皮細胞、白血球及紅血球在內的大多數細胞類型中之廣泛表現表明其介導「不吃我」信號，以保護健康細胞免受吞噬細胞依賴性清除。為了支持此觀點，若干研究表明，將來自CD47基因剔除小鼠之紅血球或白血球授受性轉移至野生型接受者中導致缺乏CD47之細胞的快速清除。反之，接受人類造血細胞之多株免疫功能不全小鼠的位置遺傳分析將NOD小鼠中之Sirpα對偶基因鑑定為異種移植模型中成功植入的因果因素。後續研究表明，僅在NOD小鼠中表現之SIRPα的對偶基因變異體保留了結合在人類造血幹細胞上表現之人類CD47的能力，且因此抑制了巨噬細胞依賴性移植排斥反應。
SIRPα及CD47之經調節表現建立了用以調節吞噬細胞活性的體內恆定控制機制。例如，凋亡細胞下調CD47之表現以促進常駐巨噬細胞之吞噬，同時活細胞保持不受傷害。同樣地，諸如LPS之發炎刺激物降低巨噬細胞及樹突狀細胞(DC)中之SIRPα表現，以增強其在炎症期間的活化。然而，如癌症中所見，SIRPα及CD47表現之失調導致免疫相關疾病。幾種腫瘤相對於非癌細胞顯著增加CD47之表現，以便避開通常消除惡性細胞的免疫監視機制。臨床前研究揭示，諸如B16F10黑色素瘤之同基因腫瘤模型中CD47之基因減弱足以抑制免疫勝任小鼠中之腫瘤生長。在移植至免疫功能不全小鼠中之CD47減弱之人類癌細胞株的情況下觀察到類似的結果。或者，破壞SIRPα-CD47相互作用之生物製劑，諸如抗-CD47抗體，亦增強小鼠模型中之腫瘤清除。與標準單一療法相比，當與諸如曲妥珠單抗(trastuzumab)或利妥昔單抗(rituximab)之商業抗腫瘤抗原抗體組合時，抗-CD47抗體促進抗腫瘤反應之協同增加。然而，鑒於 CD47之普遍表現，抗-CD47抗體由於脫靶效應而冒著嚴重的毒性負擔風險，限制了其治療功效。然而，此等研究確定了SIRPα-CD47途徑在調節骨髓細胞方面的關鍵作用，在癌症免疫療法中具有潛在的應用。
抗-SIRPA抗體先前已在例如以下的國際專利申請公開案中有所描述：第WO2018/057669號、第WO 2018/026600號、第WO 2017/178653號、第WO2017/068164號、第WO2016/063233號、第WO2016/205042號、第WO2015/138600號、第WO2013/0956352號、第WO2009/091547號、第WO2009/131453號及第WO2009/046541號。
因此，需要治療性抗-SIRPA抗體來治療與不當的SIRPA活性有關的疾病、病症及病狀。
本文所引用之所有參考文獻，包括專利申請案及公開案，皆以全文引用之方式併入本文中。
本發明大體上關於包括特異性結合人類SIRPA之抗體的組合物，該等抗體例如單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、抗體片段等，及此類組合物之使用方法。
本發明之某些態樣至少部分地基於具有改善及/或增強的功能特徵(例如，相對於具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體)之抗-SIRPA抗體的鑑定，包括例如改善及/或增強的降低細胞上之SIRPA之細胞表面含量的能力，及/或具有改善及/或增強的結合動力學，及/或具有改善及/或增強的KD，及/或具有改善及/或增強的EC50值。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體所具有的對人類SIRPA之KD比具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體對人類SIRPA具有小於6nM、小於5nM、小於4nM、小於3nM、小於2nM、小於1nM、小於0.9nM、小於0.8nM、小於0.7nM、小於0.6nm或小於0.5nM之KD。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體活體外降低SIRPA之細胞表面表現量，其EC50比具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體低至少約20%、至少約30%、至少約40%或至少約50%。有利地，本發明之抗-SIRPA抗體以在約0.4nM至約0.5nM範圍內之半數最大有效濃度(EC50)活體外降低SIRPA之細胞含量。有利地，本發明之抗-SIRPA抗體對人類SIRPA具有在約0.6nM至0.7nM範圍內之解離常數(KD)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體結合人類SIRPA v1。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體結合人類SIRPA v2。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體結合人類SIRPB(SIRPβ)v3。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體不結合人類SIRPB v1。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體不結合鼠類SIRPA。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體不結合人類 SIRPγ。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體結合食蟹獼猴SIRPA。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體不結合食蟹獼猴SIRPB1。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體結合狨猴SIRPA。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體結合人類SIRPA、人類SIRPA v1、人類SIRPA v2、食蟹獼猴SIRPA、狨猴SIRPA及人類SIRPβ3。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含：HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18及19之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列；HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18及19之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：33、34及35之胺基酸序列至少90%或至少95%或至少99%相同的胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43及44之胺基酸序列至少90%或至少95%或至少99%相同的胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含一、二、三或四個構架區，其選自包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VH FR1、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VH FR2、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的VH FR3及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的VH FR4。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中輕鏈可變區包含一、二、三或四個構架區， 其選自包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的VL FR1、包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的VL FR2、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VL FR3及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL FR4。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含一、二、三或四個構架區，其選自包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VH FR1、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VH FR2、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的VH FR3及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的VH FR4；且其中輕鏈可變區包含一、二、三或四個構架區，其選自包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的VL FR1、包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的VL FR2、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VL FR3及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL FR4。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：33、34及35之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43及44之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：33、34及 35之胺基酸序列，且其中輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43及44之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含抗體3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24或3F9-25之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3(如表8中所示)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中輕鏈可變區包含抗體3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24或3F9-25之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3(如表7中所示)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含抗體3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24或3F9-25之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3(如表8中所示)；且其中輕鏈可變區包含抗體3F9-1、 3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24或3F9-25之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3(如表7中所示)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中該抗體包含抗體3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24或3F9-25之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3(如表7及8中所示)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含一、二、三或四個選自VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4之構架區，其中：VH FR1包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列；VH FR2包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；VH FR3包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列；且VH FR4包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區包含一、二、三或四個選擇VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4之構架區，其中VL FR1包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列；VL FR2包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列；VL FR3包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列；且VL FR4包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50 之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種經分離抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體為單株 抗體。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體為人類化抗體。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體為Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv或scFv片段。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體為多價抗體。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體屬於IgG類、IgM類或IgA類。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體屬於IgG類且呈IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體與抑制性Fc受體結合。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，抑制性Fc受體為抑制性Fc-γ受體IIB(FcγRIIB)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體降低FcγRIIB之細胞含量。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體具有人類或小鼠IgG1同型且包含在Fc區中在選自由以下組成之群的胺基酸殘基處的一或多個胺基酸取代：N297A、D265A、D270A、L234A、L235A、G237A、P238D、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、L234V、L234F、L235E、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D及其任何組合，其中殘基之編號係根據EU編號，或包含在Fc區中在對應於甘胺酸236之位置處的胺基酸缺失。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體包含在Fc區中在選自由以下組成之群的殘基位置處的一或多個胺基酸取代：C127S、L234A、L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S、E345R、E430G、S440Y及其任何組合，其中胺基酸殘基之編號係根據EU編號。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體降低SIRPA之細胞表面含量，降低SIRPA之細胞內含量，降低SIRPA之總細胞含量或其任何組合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體誘導SIRPA降解，誘導SIRPA裂解，誘導SIRPA內化，誘導SIRPA脫 落，誘導SIRPA表現之下調或其任何組合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體外降低SIRPA之細胞表面含量。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體內降低SIRPA之細胞表面含量。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體下調SIRPA在人類單核球中之表現。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體下調SIRPA在人類巨噬細胞中之表現。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體將SIRPA在人類巨噬細胞中之表現下調約70-95%。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體對人類SIRPA具有小於6nM、小於5nM、小於4nM、小於3nM、小於2nM或小於1nM之親和力(KD)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體對人類SIRPA具有約0.1nM至2nM之親和力(KD)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體對人類SIRPA具有親和力，其KD比包含含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體對人類SIRPA之親和力低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體外降低SIRPA v1之細胞表面含量，其中半數最大有效濃度(EC50)為約0.05nM至2nM或約0.4Nm至約0.5nM，如藉由流動式細胞測量術所量測。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體外降低SIRPA之細胞表面含量，其中對人類SIRPA v1之半數最大有效濃度(EC50)為約0.05至0.20nM，對人類SIRPA v2之半數最大有效濃度為約0.05至0.10nM，及/或對食蟹獼猴SIRPA之半數最大有效濃度為約0.05至1nM，如藉由流動式細胞測量術所量測。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體與SEQ ID NO：1之人類SIRPA v1之D3域結合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體與SEQ ID NO：1之人類SIRPA v1之胺基酸殘基R282、Q284及G337結合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例 中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體增加巨噬細胞中之腫瘤細胞吞噬作用，增加M1巨噬細胞中之腫瘤細胞吞噬作用，增加M2巨噬細胞中之腫瘤細胞吞噬作用，下調巨噬細胞中之CD14表現及/或其任何組合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體增強T細胞增殖。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體阻斷SIRPA與界面活性劑蛋白D(SP-D)之相互作用或結合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體不阻斷SIRPA與CD47之相互作用或結合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體下調CD32A/B之細胞表面表現。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體下調CD14之細胞表面表現。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體增強T細胞增殖而不阻斷SIRPγ及CD47之相互作用。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例 中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體刺激單核球中之ROS產生及/或增加單核球中之IL-8表現。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體活體內抑制腫瘤生長。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體減少周邊血液中CD14+骨髓細胞之數目及/或增加腫瘤中CD14+骨髓細胞之數目。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體結合人類SIRPA，但不實質上阻斷CD47與SIRPA之結合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體識別第一抗原及第二抗原，其中第一抗原為SIRPA且第二抗原為：(a)促進跨血腦障壁轉運之抗原；(b)選自運鐵蛋白受體(TR)、胰島素受體(HIR)、類胰島素生長因子受體(IGFR)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1及2(LPR-1及2)及白喉毒素受體的促進跨血腦障壁轉運之抗原；(c)選自致病肽或致病蛋白、致病核酸之致病原，其中該等致病核酸為反義GGCCCC(G2C4)重複序列擴增RNA，該等致病蛋白係選自類澱粉β、寡聚類澱粉β、類澱粉β斑塊、類澱粉前驅蛋白質或其片段、滔蛋白(Tau)、IAPP、α-突觸核蛋白、TDP-43、FUS蛋白、C9orf72(染色體9開 放閱讀框架72)、c9RAN蛋白、普里昂蛋白(prion protein)、PrPSc、亨廷頓蛋白(huntingtin)、降血鈣素、超氧化歧化酶、運動失調質(ataxin)、運動失調質1、運動失調質2、運動失調質3、運動失調質7、運動失調質8、運動失調質10、路易體(Lewy body)、心房利尿鈉因子、胰島類澱粉多肽、胰島素、脂蛋白元AI、血清類澱粉A、medin、泌乳素、運甲狀腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、膠溶素、角膜上皮蛋白、胱抑素、免疫球蛋白輕鏈AL、S-IBM蛋白、重複序列相關的非ATG(RAN)轉譯產物、二肽重複(DPR)肽、甘胺酸-丙胺酸(GA)重複肽、甘胺酸-脯胺酸(GP)重複肽、甘胺酸-精胺酸(GR)重複肽、脯胺酸-丙胺酸(PA)重複肽、泛蛋白及脯胺酸-精胺酸(PR)重複肽；及(d)在免疫細胞上表現之配體及/或蛋白質，其中該等配體及/或蛋白質選自PD1/PDL1、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、LIGHT、BTLA、CD30、TIGIT、VISTA、KIR、GAL9、TIM1、TIM3、TIM4、A2AR、LAG3、DR-5、CD2、CD5、CD39、CD73及磷脂醯絲胺酸；及在一或多個腫瘤細胞上表現之蛋白質、脂質、多醣或糖脂。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體與促進跨血腦障壁轉運之肽結合。在一些實施例中，該肽係選自CRM197、蛋白質轉導域、TAT、Syn-B、穿膜肽(penetratin)、聚精胺酸肽、angiopep肽及ANG1005。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例 中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體為調理素化抗體(opsonizing antibody)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體為結合抗體。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體與可偵測標記物、毒素或治療劑結合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體與選自以下之毒素結合：蓖麻毒素、蓖麻毒素A鏈、小紅莓(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、類美登素(maytansinoid)、紫杉醇(taxol)、溴化乙錠(ethidium bromide)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、二羥基炭疽菌素二酮、放線菌素(actinomycin)、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE)A、PE40、相思子毒素(abrin)、相思子毒素A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α帚麴菌素(sarcin)、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(retstrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、麻瘋樹逆境蛋白(curicin)、巴豆毒素(crotin)、卡奇黴素(calicheamicin)、肥皂草(Saponaria officinalis)抑制劑、糖皮質激素、奧瑞他汀(auristatin)、金黴素(auromycin)、釔、鉍、康普瑞汀(combrestatin)、倍癌黴素(duocarmycins)、尾海兔素(dolastatin)、cc1065及順鉑(cisplatin)。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗-SIRPA抗體與一或多種特異性結合選自以下之致病蛋白的抗體組合使用：類澱粉β、寡聚類澱粉β、類澱粉β斑塊、類澱粉前驅蛋白質或其片段、滔蛋白、IAPP、α-突觸核蛋白、TDP-43、FUS蛋白、C9orf72(染色體9開放閱讀框架72)、普里昂蛋白、PrPSc、亨廷頓蛋白、降血鈣素、超氧化歧化酶、運動失調質、運動失調質1、運動失調質2、運動失調質3、運動失調質7、運動失調質8、運動失調質10、路易體、心房利尿鈉因子、胰島類澱粉多肽、胰島素、脂蛋白元AI、血清類澱粉A、medin、泌乳素、運甲狀腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、膠溶素、角膜上皮蛋白、胱抑素、免疫球蛋白輕鏈AL、S-IBM蛋白、重複序列相關的非ATG(RAN)轉譯產物、二肽重複(DPR)肽、甘胺酸-丙胺酸(GA)重複肽、甘胺酸-脯胺酸(GP)重複肽、甘胺酸-精胺酸(GR)重複肽、脯胺酸-丙胺酸(PA)重複肽、泛蛋白及脯胺酸-精胺酸(PR)重複肽及其任何組合；或與一或多種結合選自由以下組成之群的免疫調節蛋白的抗體組合使用：PD1/PDL1、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、LIGHT、BTLA、CD30、TIGIT、VISTA、KIR、GAL9、TIM1、TIM3、TIM4、A2AR、LAG3、DR-5、CD2、CD5、CD39、CD73、TREM1、TREM2、CD33、Siglec-5、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-11、磷脂醯絲胺酸、致病核酸、反義GGCCCC(G2C4)重複序列擴增RNA及其任何組合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種預防、降低風險或治療癌症之方法，其中該方法包含 向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體，從而治療癌症。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種預防、降低風險或治療具有疾病、病症或損傷之個體的方法，其中該疾病、病症或損傷為癌症，該方法包含向該個體投與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體，從而預防、降低風險或治療該個體。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其中該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體，其中該癌症係選自肉瘤、膀胱癌、腦癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、腎盂癌、白血病、肺癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌及纖維肉瘤、多形性神經膠母細胞瘤；腎透明細胞癌；腎上腺皮質癌；膀胱尿道上皮癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、肺腺癌；胰臟腺癌、腎細胞癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、惰性B細胞淋巴瘤、侵襲性B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性骨髓白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、慢性骨髓白血病(chronic myeloid leukemia，CML)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓增生性贅瘤、乳房侵襲性癌、子宮頸鱗狀細胞癌、子宮頸內腺癌、膽管癌、結腸腺癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腎難染細胞、腎乳頭狀細胞癌、較低級別神經膠質瘤、肝細胞癌、肺鱗狀細胞癌、間皮瘤、卵巢漿液性囊腺癌、胰臟腺癌、嗜鉻細胞瘤及副神經節瘤、前列腺腺癌、直腸腺癌、皮膚黑色素瘤、胃腺癌、睪丸生殖細胞腫瘤、甲狀腺癌、胸腺瘤、子宮體子宮 內膜癌、子宮癌肉瘤及葡萄膜黑色素瘤。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其中該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體，該方法進一步包含投與抑制PD1、PDL1、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、CTLA4、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HVEM、LIGHT、BTLA、CD30、TIGIT、VISTA、KIR、GAL9、TIM1、TIM3、TIM4、A2AR、LAG3、DR-5、CD2、CD5、CD39或CD73之治療劑。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，治療劑為抑制PD1、PDL1、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、CTLA4、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HVEM、LIGHT、BTLA、CD30、TIGIT、VISTA、KIR、GAL9、TIM1、TIM3、TIM4、A2AR、LAG3、DR-5、CD2、CD5、CD39或CD73之抗體。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其中該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體，該方法包含向該個體投與至少一種與抑制性檢查點分子特異性結合之抗體及/或一或多種標準或研究用抗癌療法。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，至少一種與抑制性檢查點分子特異性結合之抗體係與抗-SIRPA抗體組合投與。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，該至少一種與抑制性檢查點分子特異性結合之抗體係選自抗-PD-L1抗體、抗-CTLA4抗體、抗-PD-L2抗體、抗-PD-1抗體、抗-B7-H3抗體、抗-B7-H4抗體及抗-HVEM抗體、抗-B-及T-淋巴細胞弱化因子(BTLA)抗體、抗殺 手細胞抑制性受體(KIR)抗體、抗-GAL9抗體、抗-TIM-1抗體、抗-TIM3抗體、抗-TIM-4抗體、抗-A2AR抗體、抗-CD39抗體、抗-CD73抗體、抗-LAG-3抗體、抗磷脂醯絲胺酸抗體、抗-CD27抗體、抗-CD30抗體、抗-TNFα抗體、抗-CD33抗體、抗-Siglec-5抗體、抗-Siglec-7抗體、抗-Siglec-9抗體、抗-Siglec-11抗體、拮抗性抗-TREM1抗體、拮抗性抗-TREM2抗體、抗-TIGIT抗體、抗-VISTA抗體、抗-CD2抗體、抗-CD5抗體及其任何組合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，該一或多種標準或研究用抗癌療法係選自放射線療法、細胞毒性化學療法、靶向療法、伊馬替尼(imatinib)療法、曲妥珠單抗療法、依那西普(etanercept)療法、過繼性細胞轉移(adoptive cell transfer，ACT)療法、嵌合抗原受體T細胞轉移(CAR-T)療法、疫苗療法及細胞介素療法。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其中該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體，其中該方法進一步包含向該個體投與至少一種與抑制性細胞介素特異性結合之抗體。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，該至少一種與抑制性細胞介素特異性結合之抗體係與抗-SIRPA抗體組合投與。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，該至少一種與抑制性細胞介素特異性結合之抗體係選自抗-CCL2抗體、抗-CSF-1抗體、抗-IL-2抗體及其任何組合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其中該方法包含向有需要之個體投 與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體，其中該方法進一步包含向該個體投與至少一種與刺激性檢查點蛋白特異性結合之促效性抗體。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，該至少一種與刺激性檢查點蛋白特異性結合之促效性抗體係與抗-SIRPA抗體組合投與。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，該至少一種與刺激性檢查點蛋白特異性結合之促效性抗體係選自促效劑抗-CD40抗體、促效劑抗-OX40抗體、促效劑抗-ICOS抗體、促效劑抗-CD28抗體、促效性抗-TREM1抗體、促效性抗-TREM2抗體、促效劑抗-CD137/4-1BB抗體、促效劑抗-CD27抗體、促效劑抗糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白GITR抗體、促效劑抗-CD30抗體、促效劑抗-BTLA抗體、促效劑抗-HVEM抗體、促效劑抗-CD2抗體、促效劑抗-CD5抗體及其任何組合。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其中該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體，該方法其進一步包含向該個體投與至少一種刺激性細胞介素。在一些實施例中，該至少一種刺激性細胞介素係選自IFN-α4、IFN-β、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、IL-20家族成員、LIF、IFN-γ、OSM、CNTF、GM-CSF、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、CXCL10、IL-33、MCP-1、MIP-1-β及其任何組合。
在一些實施例中，本發明提供一種經分離核酸，其包含編碼本發明之抗-SIRPA抗體之核酸序列。在一些實施例中，本發明提供一種包含經分離核酸之載體，該經分離核酸包含編碼本發明之抗-SIRPA抗體之核酸序列。在一些實施例中，本發明提供一種經分離宿主細胞，其包 含載體，該載體包含經分離核酸，該經分離核酸包含編碼本發明之抗-SIRPA抗體之核酸序列。
在一些實施例中，本發明提供製造與人類SIRPA結合之抗體之方法，其中該方法包含培養包含載體之宿主細胞以使得該抗體產生，該載體包含經分離核酸，該經分離核酸包含編碼本發明之抗-SIRPA抗體之核酸序列。本發明進一步提供回收由細胞產生之抗體。
在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之抗-SIRPA抗體及醫藥學上可接受之載劑。
圖1顯示人類SIRPA變異體1及來自各種物種之SIRPA蛋白質之細胞外域的胺基酸序列比對。所記錄之一致性百分比展現細胞外區域內之高同源性。寄存編號為P78324(人類SIRPA變異體1)、XP015313153(食蟹獼猴)、JAB51896(狨猴)、G1U0I5(兔)及XP005634938(犬)。圖1按出現之次序分別揭示SEQ ID NO 59-63。
圖2A列舉抗-SIRPA抗體3F9之重鏈可變域之潛在人類化序列。人類化序列係基於IGHV3-23*01接受體構架及IGHJ4*01連接區。圖2A按出現之次序分別揭示SEQ ID NO 64-65、2、64及3-4。圖2B列舉抗-SIRPA抗體3F9之輕鏈可變域之潛在人類化序列。圖2B按出現之次序分別揭示SEQ ID NO 66-67、5、66及68-70。
圖3闡述資料，其顯示初代人類巨噬細胞上鼠類及人類化抗-SIRPA 3F9抗體之抗體介導的SIRPA下調。
圖4A闡述資料，其顯示抗體介導之受體下調視N-連接型Fc聚糖而定。圖4B闡述資料，其顯示抗體介導之腫瘤細胞吞噬作用之增強 視N-連接型Fc聚糖而定。
圖5A闡述資料，其顯示人類化抗-SIRPA 3F9 IgG4抗體變異體未能誘導腫瘤細胞吞噬作用。圖5B闡述資料，其顯示人類化抗-SIRPA 3F9 IgG4抗體變異體未能下調巨噬細胞上之CD14表現。
圖6A顯示抗-SIRPA抗體3F9 mIgG1處理可下調初代人類巨噬細胞上之CD32A/B表現。圖6B顯示，抗-SIRPA抗體3F9處理可下調初代人類巨噬細胞上之CD32A及CD32B表現。
圖7A闡述資料，其顯示CD32A/B阻斷可抑制初代人類巨噬細胞上抗-SIRPA抗體3F9介導之SIRPA下調。圖7B闡述資料，其顯示CD32A/B阻斷可抑制抗-SIRPA抗體3F9介導之腫瘤細胞吞噬作用之增強。
圖8A至圖8B闡述資料，其顯示CD32A異型影響抗-SIRPA抗體3F9介導之SIRPA下調。圖8A顯示供體507及508為CD32A-R/H131異型接合的；圖8B顯示供體516及517供體CD32A-H/H131同型接合。
圖9A至圖9B闡述資料，其顯示抗體介導之受體下調可導致SIRPA降解。在圖9A中，將5μg、10μg及20μg全細胞溶菌液加載至SDS-PAGE上且用抗-SIRPA細胞質域(a-SIRPAct)進行免疫墨點法。在圖9B中，將20μg全細胞溶菌液加載至SDS-PAGE上且用a-SIRPAct及抗-SHP2探測。
圖10A至圖10B闡述資料，其比較抗-SIRPA抗體3F9-22之不同Fc變異體的吞噬活性之增強。在圖10A中，用野生型人類IgG1骨架上或具有S267E/L328F Fc突變之人類IgG1上之抗-SIRPA 3F9-22抗體或同型對照抗體處理初代人類巨噬細胞。在圖10B中，用具有S267E/L328F或 A330S/P331S Fc突變之人類IgG1骨架上之抗-SIRPA 3F9-22抗體或同型對照抗體處理初代人類巨噬細胞。
圖11A至圖11B闡述資料，其比較抗-SIRPA 3F9-22抗體之不同Fc變異體相對於抗-CD47在M1(圖11B)及M2(圖11A)巨噬細胞上之吞噬活性。
圖12A及圖12B闡述資料，其顯示經抗-SIRPA抗體3F9-22處理之巨噬細胞可活體外降低實體腫瘤細胞活力。
圖13A闡述資料，其比較在雙向MLR分析中抗-SIRPA抗體3F9-22之不同Fc變異體的T細胞增殖增強。圖13B闡述資料，其比較在雙向MLR分析中抗-SIRPA抗體3F9-22及抗-SIRPA抗體3F9-14之不同Fc變異體相對於抗-CD47 IgG4之T細胞增殖增強。
圖14A闡述資料，其比較在單向MLR分析中抗-SIRPA抗體3F9-22之不同Fc變異體相對於抗-CD47 IgG4之T細胞增殖增強。圖14B顯示單向MLR分析之代表性FACS圖。
圖15A及圖15B闡述資料，其比較抗-SIRPA抗體3F9-22之不同Fc變異體藉由LPS預致敏巨噬細胞達成之TNF釋放增強。
圖16闡述資料，其顯示人類SIRPA模型中抗-SIRPA抗體之「關鍵」殘基的鑑定及觀測。
圖17A至圖17C闡述資料，其顯示同基因型小鼠結腸癌模型中抗-SIRPA抗體3F9-22與抗-PD-L1抗體之組合對腫瘤生長抑制之影響。圖17A闡述FACS直方圖，其顯示小鼠CD47(上圖)及人類CD47(下圖)在野生型及工程化MC38細胞株中之表現。圖17B闡述資料，其顯示皮下植入有經工程化而缺乏小鼠CD47表現且過度表現人類CD47之MC38細胞 (MC38-mCD47KO/huCD47+)的huSIRPA/huCD47 BAC基因轉殖小鼠的平均腫瘤生長曲線。圖17C闡述圖17B之各處理組中之各個別動物之意大利麵條圖(spaghetti plot)。
圖18A至圖18B闡述資料，其顯示經遞增劑量之本發明之抗-SIRPA抗體處理的負載腫瘤BAC基因轉殖小鼠之骨髓細胞中之SIRPA之抗體介導之下調的動力學。圖18A闡述資料，其顯示腫瘤浸潤性骨髓細胞上之SIRPA表現隨時間推移的相對變化。圖18B闡述資料，其顯示脾骨髓細胞上之SIRPA表現隨時間推移的相對變化。
圖19A顯示負載A375腫瘤之人類化NOG-EXL小鼠中SIRPA研究之抗-SIRPA抗體介導之下調的處理條件。圖19B闡述資料，其顯示與本發明之抗-SIRPA抗體處理有關的SIRPA在人類腫瘤巨噬細胞上之表現量，呈MFI值(左圖)或標準化值(右圖)形式。
圖20A至圖20B顯示M1巨噬細胞標記物HLA-DR/MHC第2類(圖20A)及CD86(圖20B)在經本發明之抗-SIRPA抗體處理後自負載A375腫瘤之人類化NOG-EXL小鼠分離之人類腫瘤巨噬細胞上的表現量。圖20A及圖20B闡述資料，其分別顯示HLA-DR/MHC第2類及CD86之表現，呈MFI值(左圖)或標準化值(右圖)形式。
圖21A至圖21B顯示自負載A375腫瘤之人類化NOG-EXL小鼠分離之脾單核球(圖21A)及周邊血液單核球(圖21B)中之與本發明之抗-SIRPA抗體之投與有關的人類SIRPA下調。圖21A及圖21B闡述資料，其顯示人類SIRPA之表現，呈MFI值(左圖)或標準化值(右圖)形式。
圖22闡述資料，其顯示初代人類巨噬細胞上抗-SIRPA 3F9-22抗體之不同Fc變異體之抗體介導的SIRPA下調。
圖23闡述資料，其比較抗-SIRPA抗體3F9-22之不同Fc變異體相比於抗-CD47阻斷抗體之吞噬活性的增強。
圖24闡述資料，其顯示投與對照IgG抗體、抗-SIRPA抗體3F9-22 PS、抗-SIRPA抗體3F9-22 IgG4、抗-SIRPA抗體3F9-IgG2及抗-SIRPA抗體3F9-22 NSLF之食蟹獼猴中之紅血球及血小板計數。
應理解，可組合本文所描述之各種實施例的一種、一些或所有特性以形成本發明之其他實施例。本發明之此等及其他態樣對熟習此項技術者變得顯而易知。本發明之此等及其他實施例藉由下文之實施方式進一步描述。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年5月25日提交之美國臨時申請案第62/676,813號之優先權，其出於任何目的以全文引用之方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式電子提交且以全文引用之方式併入本文中。該ASCII複本創建於2019年5月14日，命名為40004-PCT_SL.txt且大小為99,798個位元組。
本發明係關於抗-SIRPA抗體(例如，單株抗體)；此類抗體之製造及使用方法；包含此類抗體之醫藥組合物；編碼此類抗體之核酸；及包含編碼此類抗體之核酸的宿主細胞。
本文所述或所提及之技術及程序通常很好理解且一般使用習知方法由熟習此項技術者採用，諸如以下文獻中所述之廣泛使用之方法：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版 (2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編，(2003))；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)：PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor編(1995)),Harlow及Lane編(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney編(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)編，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell編，1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos編，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.編，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd及C.Dean編，Oxford University Press,2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra編， Harwood Academic Publishers,1995)；及Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人編，J.B.Lippincott Company,1993)。
I.定義
除非另外指明，否則術語「SIRPα」或「SIRPα多肽」或「SIRPA」或「SIRPA多肽」在本文中可互換使用，在本文中係指來自任何脊椎動物來源的任何天然SIRPA，脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如，人類及食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。在一些實施例中，該術語涵蓋野生型序列及天然產生之變異序列，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一些實施例中，該術語涵蓋「全長」未加工SIRPA以及藉由在細胞中加工產生之任何形式之SIRPA。在一些實施例中，SIRPA為人類SIRPA。在一些實施例中，例示性SIRPA之胺基酸序列為Uniprot寄存編號P78324，截至2018年4月25日。在一些實施例中，例示性人類SIRPA v1之胺基酸序列為SEQ ID NO：1。在一些實施例中，例示性人類SIRPA v2之胺基酸序列為GenBank CAA71403。
術語「抗-SIRPA抗體」、「與SIRPA結合之抗體」及「特異性結合SIRPA之抗體」係指能夠以足夠使得抗體適用作靶向SIRPA時之診斷劑及/或治療劑的親和力結合SIRPA之抗體。在一個實施例中，抗-SIRPA抗體與不相關的非SIRPA多肽之結合程度小於抗體與SIRPA之結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，與SIRPA結合之抗體具有<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)之解離常數(KD)。在某些實施例中，抗-SIRPA 抗體與來自不同物種之SIRPA中之保守的SIRPA之抗原決定基結合。
關於抗體與目標分子之結合，術語「特異性結合」或「特異性地結合」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽目標上之抗原決定基意謂可量測地與非特異性相互相用不同的結合。特異性結合可例如藉由測定分子之結合對比對照分子之結合來量測。例如，特異性結合可以藉由與類似於目標之對照分子的競爭來確定，例如過量的未標記目標。在此情況下，若經標記之目標與探針之結合受到過量的未標記目標之競爭性抑制，則指示特異性結合。如本文所用之術語「特異性結合」或「與特異性地結合」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽目標上之抗原決定基可以例如由這樣的分子來展現，該分子對目標具有約為10-4M或更低、10-5M或更低、10-6M或更低、10-7M或更低、10-8M或更低、10-9M或更低、10-10M或更低、10-11M或更低、10-12M或更低中之任一者的KD，或在10-4M至10-6M或10-6M至10-10M或10-7M至10-9M之範圍內的KD。如熟習此項技術者將瞭解，親和力與KD值成反比。藉由低KD值量測對抗原之高親和力。在一個實施例中，術語「特異性結合」係指這樣的結合，其中分子與特定多肽或特定多肽上之抗原決定基結合而不與任何其他多肽或多肽抗原決定基實質上結合。
在本文中，術語「免疫球蛋白」(Ig)可與「抗體」互換使用。術語「抗體」在本文中以最廣泛含義使用且特別涵蓋單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，包括由至少兩種完整抗體形成之抗體，及抗體片段，只要其展現所要生物活性即可。
「天然抗體」通常為約150,000道爾頓(Dalton)之雜四聚體糖蛋白，由兩條相同輕(「L」)鏈及兩條相同重(「H」)鏈構成。各輕鏈藉 由一個共價二硫鍵與重鏈連接，而在不同免疫球蛋白同型之重鏈中，二硫鍵之數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔之鏈內二硫橋鍵。各重鏈在一端具有可變域(VH)，其後為多個恆定域。各輕鏈在一端具有可變域(VL)且在其另一端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。
關於不同類別抗體之結構及特性，參見例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr及Tristram G.Parslow(編),Appleton & Lange,Norwalk,CT,1994，第71頁及第6章。
來自任何脊椎動物物種之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而歸為兩種明顯不同類型中之一種，這兩種明顯不同類型稱為卡帕(「κ」)及拉姆達(「λ」)。視免疫球蛋白之重鏈(CH)之恆定域之胺基酸序列而定，其可歸為不同類別或同型。存在五種類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，分別具有命名為阿爾法(「α」)、德耳塔(「δ」)、伊普西隆(「ε」)、伽馬(「γ」)及謬(「μ」)之重鏈。基於CH序列及功能之相對較小差異，將γ及α類別進一步分成子類(同型)，例如人類表現以下子類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。不同類別之免疫球蛋白的次單元結構及三維組態係熟知的且大體描述於例如Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology，第4版(W.B.Saunders Co.,2000)中。
抗體，諸如本發明之抗-SIRPA抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體之重鏈或輕鏈之胺基端域。重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「VH」及「VL」。此等域一般為抗體之最可變部分(相對於相同種類之其 他抗體)且含有抗原結合位點。
術語「可變」係指以下事實：在抗體，諸如本發明之抗-SIRPA抗體中，可變域之某些區段在序列上廣泛不同。可變域介導抗原結合且限定特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性並非均勻分佈於可變域之整個跨度內。相反，其集中在輕鏈可變域及重鏈可變域中的三個稱為高變區(HVR)之區段中。可變域之較高度保守部分稱為構架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FR區，該等FR區主要採用β片構形，由三個HVR連接，其形成連接β片結構之環且在一些情況下形成β片結構之一部分。各鏈中之HVR藉由FR區緊密地結合在一起，且與其他鏈之HVR一起，有助於形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第五版，National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，諸如抗體依賴性細胞毒性中抗體的參與。
如本文所用之術語「單株抗體」係指獲自實質上均質抗體群體的抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可少量存在之可能天然產生之突變及/或轉譯後修飾(例如，異構化、醯胺化等)之外係相同的，諸如本發明之單株抗-SIRPA抗體。單株抗體具有高度特異性，係針對單一抗原位點。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)的不同抗體之多株抗體製劑相反，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除了其特異性之外，單株抗體之有利之處在於其係藉由融合瘤培養合成的，未被其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特徵為獲自實質上均質抗體群體，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。例如，待根據本發明使用之單株抗體可以藉由多種技術製得，該等技術包括例如融合瘤方法、重組 DNA方法及用於在具有部分或所有的編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因的動物中產生人類抗體或類似人類抗體的技術。例如，待根據本發明使用之單株抗體可以藉由多種技術製得，該等技術包括例如噬菌體呈現技術(參見例如Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 101(34)：12467-472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))、融合瘤方法(例如，Kohler及Milstein.,Nature,256：495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma,14(3)：253-260(1995)；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)、酵母呈現技術(參見例如WO2009/036379A2；WO2010105256；WO2012009568；及Xu等人，Protein Eng.Des.Sel.,26(10)：663-70(2013))、及用於在具有部分或所有的編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因的動物中產生人類抗體或類似人類抗體的技術(參見例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；及第5,661,016號；Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)； Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison,Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14：826(1996)；及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
術語「全長抗體」、「完整抗體」或「完全抗體」可互換使用，係指呈其實質上完整形式的抗體，諸如本發明之抗-SIRPA抗體，與抗體片段相反。具體而言，完全抗體包括具有包括Fc區之重鏈及輕鏈的抗體。恆定域可為天然序列恆定域(例如，人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。在一些情況下，完整抗體可以具有一或多種效應功能。
「抗體片段」係指不同於完整抗體，包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的部分的分子。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線抗體(參見美國專利5641870，實例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；由抗體片段形成之單鏈抗體分子及多特異性抗體。
木瓜蛋白酶消化抗體，諸如本發明之抗-SIRPA抗體，產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，及剩餘的「Fc」片段，其名稱反映容易結晶之能力。Fab片段由整條輕鏈連同重鏈之可變區域(VH)及一條重鏈之第一恆定域(CH1)一起組成。各Fab片段就抗原結合而言係單價的，亦即，其具有單一抗原結合位點。胃蛋白酶處理抗體產生單個大F(ab')2片段，該片段大致對應於經二硫鍵連接的具有不同抗原結合活性之兩個Fab片段且仍能夠交聯抗原。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，Fab'片段在CH1域之羧基端具有若干額外殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH係恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基時 Fab'在本文中之名稱。F(ab')2抗體片段最初以中間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對形式產生。抗體片段之其他化學偶合亦為已知的。
Fc片段包含藉由二硫化物結合在一起的兩條重鏈之羧基端部分。抗體之效應功能由Fc區中之序列決定，該區域亦由在某些類型之細胞上所發現之Fc受體(FcR)識別。
抗體，諸如本發明之抗-SIRPA抗體之「功能片段」包含完整抗體之一部分，一般包括完整抗體之抗原結合區或可變區或抗體中保留或已修改FcR結合能力之Fc區。抗體片段之實例包括由抗體片段形成之線抗體、單鏈抗體分子及多特異性抗體。
術語「雙功能抗體」係指藉由在VH與VL域之間用短連接子(約5-10個殘基)構築sFv片段(參見上一段)製備的小抗體片段，使得達成可變域之鏈間而非鏈內配對，從而產生二價片段，亦即，具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙功能抗體係兩個「互換(crossover)」sFv片段之雜二聚體，其中兩個抗體之VH及VL域存在於不同的多肽鏈上。
如本文所用之「嵌合抗體」係指一種抗體(免疫球蛋白)，諸如本發明之嵌合抗-SIRPA抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之對應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之對應序列相同或同源，以及此類抗體之片段，只要其展現所要生物活性即可。本文中感興趣的嵌合抗體包括PRIMATIZED®抗體，其中抗體之抗原結合區衍生自藉由例如用感興趣的抗原使獼猴免疫而產生之抗體。如本文所用之「人類化抗體」係作為「嵌合抗體」之子集使用。
非人類(例如，鼠類)抗體之「人類化」形式，諸如本發明 之抗-SIRPA抗體之人類化形式，為包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上所有，其中所有或實質上所有HVR(例如CDR)均與非人類抗體之HVR對應，且所有或實質上所有FR均與人類抗體之FR對應。人類化抗體視情況可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。
「人類抗體」為具有與由人類產生之抗體，諸如本發明之抗-SIRPA抗體之胺基酸序列對應的胺基酸序列的抗體，及/或使用如本文中所揭示之用於製造人類抗體之技術中之任一者製得的抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可以使用此項技術中已知之各種技術產生，包括噬菌體呈現庫及酵母呈現庫。人類抗體可以藉由向基因轉殖動物投與抗原來製備，該基因轉殖動物已經修飾以響應於抗原攻擊而產生此類抗體，但其內源性基因座已停用，例如經免疫之異種小鼠(xenomice)，以及經由人類B細胞融合瘤技術產生。人類抗體可以使用此項技術中已知之各種技術產生，該等技術包括噬菌體呈現庫。Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581(1991)。Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1)：86-95(1991)中所述之方法亦可用於製備人類單株抗體。亦參見van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)。人類抗體可以藉由向基因轉殖動物投與抗原來製備，該基因轉殖動物已經修飾以響應於抗原攻擊而產生此類抗體，但其內源性基因座已停用，例如經 免疫之異種小鼠(關於XENOMOUSETM技術，參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號)。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體，亦參見例如Li等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)。或者，人類抗體亦可以藉由採用如例如WO2009/036379A2；WO2010105256；WO2012009568；及Xu等人，Protein Eng.Des.Sel.,26(10)：663-70(2013)中所揭示之酵母庫及方法來製備。
術語「高變區」、「HVR」或「HV」當在本文中使用時係指抗體可變域之區域，諸如本發明之抗-SIRPA抗體之區域，該等區域在序列上係高變的及/或形成結構界定環。通常，抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3及L3呈現六個HVR之大部分多樣性，且咸信尤其是H3在賦予抗體精細特異性方面起到獨特作用。僅由重鏈組成的天然產生之駱駝抗體在無輕鏈存在下亦具有功能且穩定。
已使用多種HVR描述且該等描述涵蓋於本文中。在一些實施例中，HVR可為基於序列變異性之Kabat互補決定區(CDR)且為最常用的(Kabat等人，同前文獻)。在一些實施例中，HVR可為Chothia CDR。Chothia改為提及結構環之位置(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。在一些實施例中，HVR可為AbM HVR。AbM HVR表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用。在一些實施例中，HVR可為「接觸(contact)」HVR。「接觸」HVR係基於可用複合晶體結構之分析。來自此等HVR中之每一者的殘基標註如下。
Figure 108117983-A0305-02-0041-1
HVR可包含如下「擴展HVR」：VL中之24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)及89-97或89-96(L3)及VH中之26-35(H1)、50-65或49-65(較佳實施例)(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。關於此等擴展HVR定義中之每一者，可變域殘基根據Kabat等人之同前文獻編號。
「構架」或「FR」殘基為除如本文所定義之HVR殘基外的彼等可變域殘基。
短語「如EU或Kabat中之可變域殘基編號」或[0076]「如EU或Kabat中之胺基酸位置編號」及其變體係指EU或Kabat等人之同前文獻中用於抗體編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或HVR之縮短或插入的較少或額外胺基酸。例如，重鏈可變域可在H2之殘基52之後包括單一胺基酸插入物(根據Kabat之殘基52a)且在重鏈FR殘基82之後包括插入之殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。對於給定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之EU或Kabat編號。
通常在提及[0077]可變域中之殘基(大約為輕鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時使用EU或Kabat編號系統(例如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。通常在提及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時使用「EU或Kabat編號系統」或「EU索引」(例如，Kabat等人之同前文獻中所報導之EU索引)。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。除非本文中另外陳述，否則提及抗體可變域中之殘基編號時意謂根據Kabat編號系統之殘基編號。除非本文中另外陳述，否則提及抗體恆定域中之殘基編號時意謂根據EU或Kabat編號系統之殘基編號(例如，參見美國專利公開案第2010-280227號)。
如本文所用之「接受體人類構架」為包含衍生自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之VL或VH構架之胺基酸序列的構架。「衍生自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可以包含與其相同的胺基酸序列，或其可以包含預先存在的胺基酸序列變化。在一些實施例中，預先存在的胺基酸變化之數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少。當在VH中存在預先存在的胺基酸變化時，較佳的彼等變化出現在位置71H、73H及78H中之僅三個、兩個或一個位置處；例如，在彼等位置處之胺基酸殘基可為71A、73T及/或78A。在一個實施例中，VL接受體人類構架在序列上與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列相同。
「人類共同構架」為表示一系列人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。通常，此系列人類免疫球蛋白VL或VH序列係來自可變域序列之亞群。通常，序列之亞群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中之 亞群。實例包括對於VL，亞群可為如Kabat等人之同前文獻中之亞群κ I、κ II、κ III或κ IV。另外，對於VH，亞群可為如Kabat等人之同前文獻中之亞群I、亞群II或亞群III。
在例如本發明之抗-SIRPA抗體之指定位置處的「胺基酸修飾」係指指定殘基之取代或缺失，或鄰接指定殘基的至少一個胺基酸殘基之插入。「鄰接」指定殘基之插入意謂其一個至兩個殘基內之插入。插入可在指定殘基之N端或C端。本文中之較佳胺基酸修飾為取代。
「親和力成熟的」抗體，諸如本發明之親和力成熟的抗-SIRPA抗體，為在其一或多個HVR中具有一或多種改變的抗體，所述改變促使抗體對抗原之親和力相比於不具有彼等改變之親本抗體而言改善。在一個實施例中，親和力成熟的抗體對目標抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳親和力。親和力成熟的抗體藉由此項技術中已知的程序產生。例如，Marks等人Bio/Technology 10：779-783(1992)描述藉由VH及VL域改組之親和力成熟。HVR及/或構架殘基之隨機突變誘發由例如以下描述：Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
「Fv」為包含完整的抗原識別及結合位點的最小抗體片段。此片段由緊密非共價締合之一個重鏈可變區域與一個輕鏈可變區域之二聚體組成。由這兩個域之摺疊產生六個高變環(H鏈及L鏈各3個環)，其提供用於抗原結合之胺基酸殘基且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含特異性針對抗原之三個HVR的半個Fv)仍具有識別及 結合抗原之能力，儘管其親和力低於整個結合位點。
「單鏈Fv」亦簡稱為「sFv」或「scFv」，為包含連接成單一多肽鏈之VH及VL抗體域的抗體片段。較佳地，sFv多肽進一步包含在VH與VL域之間的多肽連接子，其使得sFv能夠形成用於抗原結合之所要結構。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(例如天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區)的彼等生物活性，且隨抗體同型而變化。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括天然序列Fc區及變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自處於位置Cys226之胺基酸殘基或自Pro230至其羧基端之延伸。可移除Fc區之C端離胺酸(殘基447，根據EU編號系統)，例如在抗體之製造或純化期間，或藉由以重組方式工程化編碼抗體之重鏈的核酸。因此，完整抗體之組合物可包含所有K447殘基均被移除之抗體群體、沒有K447殘基被移除之抗體群體及具有含有及不含K447殘基之抗體之混合物的抗體群體。適合用於本發明抗體中之天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
「天然序列Fc區」包含與自然界中所發現之Fc區之胺基酸序列相同的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然產生之變異體。
「變異Fc區」包含因至少一個胺基酸修飾，較佳一或多個胺基酸取代而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列的胺基酸序列。較佳地，變異Fc區相比於天然序列Fc區或相比於親本多肽之Fc區具有至少一個胺 基酸取代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中約一個至約十個胺基酸取代，且較佳約一個至約五個胺基酸取代。變異Fc區在本文中較佳與天然序列Fc區及/或與親本多肽Fc區具有至少約80%同源性，且最佳與其具有至少約90%同源性，更佳與其具有至少約95%同源性。
「Fc受體」或「FcR」描述與抗體Fc區結合之受體。較佳的FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳的FcR為結合IgG抗體之受體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式，FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有主要在其細胞質域方面不同的類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基活化基元(「ITAM」)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基抑制基元(「ITIM」)。本文術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括將來鑑定之FcR。FcR亦可以增加抗體之血清半衰期。
可例如在表現人類FcRn之基因轉殖小鼠或經轉染人類細胞株中或在投與具有變異Fc區之多肽的靈長類動物中分析人類FcRn高親和力結合多肽與人類FcRn的活體內結合及血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述與FcR之結合改善或減弱之抗體變異體。亦參見例如Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
如本文所用之關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」係指在比對序列且必要時引入空隙以達成最大序列一致性百分比之後，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分，候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基相同的胺基酸殘基之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可以在此項技術 之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的此項技術中已知的任何演算法。
術語「競爭」當在競爭相同抗原決定基之抗體(例如，中和抗體)的情況下使用時意謂如藉由分析所確定的抗體之間的競爭，其中待測試抗體阻止或抑制(例如，降低)參考分子(例如，配體或參考抗體)與共同抗原(例如，SIRPA或其片段)之特異性結合。可使用許多類型之競爭性結合分析來確定抗體是否與另一抗體競爭，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見例如Stahli等人，1983,Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Kirkland等人，1986,J.Immunol.137：3614-3619)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見例如Harlow及Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125標記之固相直接標記RIA(參見例如Morel等人，1988,Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Cheung等人，1990,Virology 176：546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，此類分析涉及使用與具有未經標記之測試抗體及經標記之參考抗體中之任一者的固體表面或細胞結合之經純化抗原。競爭性抑制係藉由在測試抗體存在下測定與固體表面或細胞結合之標記的量來量測。通常，測試抗體過量存在。藉由競爭分析(競爭抗體)鑑定之抗體包括與參考抗體結合至同一抗原決定基的抗體及結合至足夠靠近參考抗體所結合之抗原決定基之相鄰抗原 決定基以產生位阻的抗體。關於測定競爭性結合之方法的額外細節提供於本文中。通常，當競爭性抗體過量存在時，其將使參考抗體與共同抗原之特異性結合抑制(例如，降低)至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97.5%及/或接近100%。
如本文所用，SIRPA多肽與第二多肽之間的「相互作用」涵蓋(但不限於)蛋白質-蛋白質相互作用、物理相互作用、化學相互作用、結合、共價結合及離子結合。如本文所用，當抗體破壞、降低或完全消除兩個多肽之間的相互作用時，抗體「抑制」兩個多肽之間的「相互作用」。當本發明之抗體與兩個多肽中之一者結合時，其「抑制」兩個多肽之間的「相互作用」。在一些實施例中，可以將相互作用抑制至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97.5%及/或接近100%中之任一者。
術語「抗原決定基」包括任何能夠被抗體結合的決定子。抗原決定基為抗原之由靶向該抗原之抗體結合的區域，且當抗原為多肽時，包括直接接觸抗體之特定胺基酸。抗原決定基最常存在於多肽上，但在一些情況下可存在於其他類型之分子，諸如核酸上。抗原決定基決定子可包括分子之化學活性表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。通常，特異性針對特定目標抗原之抗體將優先識別多肽及/或大分子之複雜混合物中之目標抗原上之抗原決定基。
「促效劑」抗體或「活化」抗體為在抗體結合抗原之後誘導(例如，增加)抗原之一或多種活性或功能之抗體。
「拮抗劑」抗體或「阻斷」抗體或「抑制性」抗體為在抗 體結合抗原之後降低、抑制及/或消除(例如，減少)與一或多種配體之抗原結合的抗體，及/或在抗體結合抗原之後降低、抑制及/或消除(例如，減少)抗原之一或多種活性或功能的抗體。在一些實施例中，拮抗劑抗體或阻斷抗體或抑制性抗體實質上或完全抑制與一或多種配體之抗原結合及/或抗原之一或多種活性或功能。
「經分離」抗體，諸如本發明之經分離抗-SIRPA抗體，為已自其產生環境之組分鑑定、分離及/或回收(例如，天然地或重組地)的抗體。較佳地，經分離抗體與所有其他來自其產生環境之污染物組分無關。來自其產生環境之污染物組分，諸如由經重組轉染細胞產生之組分，為通常會干擾抗體之研究、診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，抗體將經純化：(1)達到超過95重量%之抗體，如藉由例如Lowry方法所測定，且在一些實施例中，達到超過99重量%；(2)達到藉由使用自旋杯式定序儀足以獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染料，達到均質性。經分離抗體包括在重組T細胞內之原位抗體，因為抗體之天然環境之至少一種組分將不存在。然而，通常，經分離多肽或抗體將藉由至少一個純化步驟來製備。
編碼抗體，諸如本發明之抗-SIRPA抗體之「經分離」核酸分子為自其產生環境中通常與其相關的至少一種污染物核酸分子鑑定及分離的核酸分子。較佳地，經分離核酸與所有與產生環境有關之組分無關。本文中編碼多肽及抗體之經分離核酸分子所呈形式不同於其在自然界中所發現的形式或環境。因此，經分離核酸分子與本文中天然存在於細胞中之 編碼多肽及抗體之核酸不同。
如本文所用之術語「載體」意欲指能夠轉運其所連接之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指環狀雙股DNA，其中可連接有額外的DNA區段。另一類型之載體為噬菌體載體。另一類型之載體為病毒載體，其中可將額外DNA區段連接至病毒基因組中。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中時整合至宿主細胞之基因組中，且從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠導引與其可操作地連接的基因之表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」或簡言之「表現載體」。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質體形式。在本說明書中，由於質體為最常用之載體形式，因此「質體」與「載體」可互換使用。
如在本文中可互換地使用的「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何受質。
「宿主細胞」包括可為或已成為用於併入聚核苷酸插入物之載體之接受者的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單個宿主細胞之後代，且後代可能因為自然、偶然或故意突變而不一定與原始母細胞完全相同(在形態或基因組DNA互補序列方面)。宿主細胞包括經本發明之聚核苷酸活體內轉染之細胞。
如本文所用之「載劑」包括醫藥學上可接受之載劑、賦形 劑或穩定劑，其在所使用之劑量及濃度下對曝露於其之細胞或哺乳動物無毒。通常生理學上可接受之載劑為水性pH緩衝溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)及PLURONICSTM。
如本文所用之術語「預防」包括提供關於個體中特定疾病、病症或病狀之發生或復發的預防。個體可能容易患上、易患特定疾病、病症或病狀，或有患上此類疾病、病症或病狀的風險，但尚未被診斷患有該疾病、病症或病狀。
如本文所用，「有」患上特定疾病、病症或病狀的「風險」的個體可具有或不具有可偵測之疾病或疾病症狀，且在本文所述之治療方法之前可能已經顯示或尚未顯示可偵測之疾病或疾病症狀。「有風險」表示個體具有一種或多種風險因素，其為與如此項技術中已知的特定疾病、病症或病狀的患上相關的可量測參數。具有此等風險因素中之一或多者的個體比沒有此等風險因素中之一或多者的個體具有更高的患上特定疾病、病症或病狀之機率。
如本文所用之術語「治療」係指旨在改變所治療之個體在臨床病理學過程中的自然過程的臨床干預。所要治療作用包括減小特定疾病、病症或病狀之發展速率，改善或減輕其病理狀態，及緩解或改善其預 後。例如，若與特定疾病、病症或病狀相關之一或多種症狀得以減輕或消除，則個體被成功「治療」。
「有效量」係指在所需劑量及時間段下，可有效達成所要治療或預防結果之量。有效量可以一或多次投藥提供。本文中之有效量可以根據諸如以下因素而變化：個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及治療在個體中引發所要反應的能力。有效量亦為治療有益作用超過治療之任何毒性或有害作用的量。對於預防用途，有益或所要結果包括諸如以下之結果：消除或降低疾病之風險，減輕疾病之嚴重程度，或延緩疾病發作，疾病包括疾病之生物化學、組織學及/或行為症狀、其併發症及在疾病發展期間所呈現之中間病理學表型。對於治療用途，有益或所要結果包括以下臨床結果：諸如減少由疾病引起之一或多種症狀，提高患病者之生活品質，降低治療疾病所需之其他藥物的劑量，增強另一藥物之作用(諸如經由靶向)，延緩疾病進展及/或延長存活時間。藥物、化合物或醫藥組合物之有效量為足以直接或間接地完成預防性或治療性治療的量。如在臨床背景下所瞭解的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量可以或可以不連同另一藥物、化合物或醫藥組合物一起達成。因此，可考慮在投與一或多種治療劑之情形下的「有效量」，且若聯合一或多種其他藥劑可達成或達成了所要結果，則單一藥劑可視為以有效量給予。
用於治療、預防或降低風險之目的之「個體」係指任何歸類為哺乳動物之動物，包括人類、家畜與農畜及動物園動物、運動動物或寵物，諸如犬、馬、兔、牛、豬、倉鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、貓及類似動物。在一些實施例中，個體為人類。
如本文所用，「聯合」另一化合物或組合物投與包括同時投 與及/或在不同時間投與。聯合投與亦涵蓋作為共同調配物投與或作為分開的組合物投與，包括以不同給藥頻率或時間間隔，及使用相同投與途徑或不同投與途徑。在一些實施例中，聯合投與為作為相同治療方案之一部分投與。
如本文所用之術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之相應值的常見誤差範圍。本文中提及「約」某一值或參數時包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。
除非上下文另外明確規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個提及物。例如，提及「抗體」係提及一種至多種抗體，諸如莫耳量，且包括熟習此項技術者已知之其等效物，等等。
應理解，本文所述之本發明之態樣及實施例包括「包含」態樣及實施例，「由」態樣及實施例「組成」，及「主要由」態樣及實施例「組成」。
抗-SIRPA抗體 抗-SIRPA抗體結合區
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體可以結合構形抗原決定基。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體可以結合不連續SIRPA抗原決定基。在一些實施例中，不連續SIRPA抗原決定基包含兩個或更多個肽、三個或更多個肽、四個或更多個肽、五個或更多個肽、六個或更多個肽、七個或更多個肽、八個或更多個肽、九個或更多個肽、或10個或更多個肽。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體可以結合包含一或多種肽之SIRPA抗原決定基。如本文中所揭示，SIRPA抗原決定基可 以包含一或多種肽，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、或20個或更多個胺基酸殘基，或與SEQ ID NO：1之胺基酸序列對應之哺乳動物SIRPA蛋白質上的五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、或20個或更多個胺基酸殘基。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA之抗原決定基結合，該抗原決定基與以下抗-SIRPA抗體所結合之SIRPA抗原決定基相同或重疊：包含含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、或包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有 SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體結合以下抗-SIRPA抗體所結合之基本上相同的SIRPA抗原決定基：包含含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、或包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體競爭性地抑制以下抗-SIRPA抗體之結合：包含含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：6之胺基酸序 列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、或包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與以下抗-SIRPA抗體競爭與SIRPA結合：包含含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：6之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體、或包含含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體競爭性地抑制至少一種選自表4、5、7、8及10中所列之抗體中之任一者的抗體的結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體競爭性地抑制至少一種選自以下之抗體之結合：m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9- 8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合。在一些實施例中，當本發明之抗-SIRPA抗體使一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體與SIRPA之結合與在不存在該抗-SIRPA抗體的情況下與SIRPA之結合相比降低約50%至100%範圍內之量時，該抗-SIRPA抗體與一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體競爭與SIRPA結合。在一些實施例中，當本發明之抗-SIRPA抗體使一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體與SIRPA之結合與在不存在該抗-SIRPA抗體的情況下與SIRPA之結合相比降 低至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%時，該抗-SIRPA抗體與一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體競爭與SIRPA結合。在一些實施例中，使一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體與SIRPA之結合降低100%的本發明之抗-SIRPA抗體指示，該抗-SIRPA抗體基本上完全阻斷一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體與SIRPA之結合。在一些實施例中，該抗-SIRPA抗體及一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、 3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體係以對應於以下的量存在：10：1比率、9：1比率、8：1比率、7：1比率、6：1比率、5：1比率、4：1比率、3：1比率、2：1比率、1：1比率、0.75：1比率、0.5：1比率、0.25：1比率、0.1：1比率、0.075：1比率、0.050：1比率、0.025：1比率、0.01：1比率、0.0075：1比率、0.0050：1比率、0.0025：1比率、0.001：1比率、0.00075：1比率、0.00050：1比率、0.00025：1比率、0.0001：1比率、1：10比率、1：9比率、1：8比率、1：7比率、1：6比率、1：5比率、1：4比率、1：3比率、1：2比率、1：0.75比率、1：0.5比率、1：0.25比率、1：0.1比率、1：0.075比率、1：0.050比率、1：0.025比率、1：0.01比率、1：0.0075比率、1：0.0050比率、1：0.0025比率、1：0.001比率、1：0.00075比率、1：0.00050比率、1：0.00025比率或1：0.0001比率之抗-SIRPA抗體：一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體。在一些實施例中，與一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、 3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體之量相比，該抗-SIRPA抗體以在約1.5倍至100倍或大於100倍範圍內之量過量存在。在一些實施例中，與一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體之量相比，該抗-SIRPA抗體以過量約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或100倍之量存在。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA之抗原決定基結合，該抗原決定基與由至少一種選自表4、5、7、8及10中所列之抗體中之任一者的抗體所結合之SIRPA抗原決定基相同或重疊。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA之抗原決定基結合，該抗原決定基與由至少一種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25之抗體所結合的SIRPA抗原決定基相同或重疊。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體結合由至少一種 選自表4、5、7、8及10中所列之抗體中之任一者的抗體所結合之基本上相同的SIRPA抗原決定基。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體結合由至少一種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25之抗體所結合的基本上相同的SIRPA抗原決定基。用於定位抗體所結合之抗原決定基之詳細例示性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體競爭與SIRPA結合。
此項技術中已知的任何適合的競爭分析或SIRPA結合分析，諸如BIAcore分析、ELISA分析或流動式細胞測量術，皆可用於確定抗-SIRPA抗體是否與一或多種選自m3F9、h3F9 H1/L1(14.70.1)、h3F9 H1/L2(14.70.2)、h3F9 H1/L3、h3F9 H2/L1(14.70.4)、h3F9 H2/L2、h3F9 H2/L3、3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、 3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24、3F9-25及其任何組合之抗體競爭與SIRPA結合。在例示性競爭分析中，在包含與SIRPA(例如，人類或非人類靈長類動物)結合之第一經標記抗體及第二未標記抗體的溶液中培育細胞表面上經固定之SIRPA或表現SIRPA之細胞，以測試該第二未標記抗體與第一抗體競爭與SIRPA結合之能力。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育經固定之SIRPA或表現SIRPA之細胞。在允許第一抗體與SIRPA結合之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與經固定之SIRPA或表現SIRPA之細胞有關的標記之量。若測試樣品中與經固定之SIRPA或表現SIRPA之細胞有關之標記之量相對於對照樣品中大幅減少，則指示第二抗體與第一抗體競爭與SIRPA結合。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
在一些實施例中，本文提供抗-SIRPA抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，該等HVR選自(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18及19之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗-SIRPA抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，該等HVR選自：(a)HVR- H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含 SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9 之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序 列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；及 (a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗-SIRPA抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列，該等VH HVR序列選自(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗-SIRPA抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列，該等VL HVR序列選自(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18及19之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗-SIRPA抗體，其包含(a)VH域，該VH域包含至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列，該等VH HVR序列選自(i)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列的HVR-H3；及(b)VL域，該VL域包含至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列，該等VL HVR序列選自(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18 及19之胺基酸序列的HVR-L3。
在一些實施例中，本文提供抗-SIRPA抗體，其包含(a)VH域，該VH域包含(i)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列的HVR-H3；及(b)VL域，該VL域包含(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18及19之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，抗-SIRPA抗體包含與選自SEQ ID NO：33、34及35之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與選自SEQ ID NO：33、34及35之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-SIRPA抗體保留與SIRPA結合之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-SIRPA抗體包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸 序列；及(c)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供一種抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43及44之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與選自SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43及44之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-SIRPA抗體保留與SIRPA結合之能力。在一些實施例中，SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44中總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44中總共1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-SIRPA抗體包含SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18及19之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含如在以上所提供之實施例中之任一者中的VH及如在以上所提供之實施例中之任一者中的VL。在一些實施例中，本文提供抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含如在以上所提供之實施例中之任一者中的VH及如在以上所提供之實施例中之任一者中的VL。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：33、34或35及SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43或44中對應的VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在一些實施例中，本文提供抗-SIRPA抗體，其包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，其中VH及VL選自由以下組成之群：包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的 VH及包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的VL；包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的VL；及包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的VL。
本文進一步提供競爭性地抑制包含以下之抗-SIRPA抗體之結合及/或與包含以下之抗-SIRPA抗體競爭結合的抗-SIRPA抗體：(a)VH域，該VH域包含(i)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列的HVR-H3；及(b)VL域，該VL域包含(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18 及19之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：33、34或35及SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43或44中對應的VH及VL序列。
本文提供與人類SIRPA之抗原決定基結合的抗-SIRPA抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗-SIRPA抗體所結合之抗原決定基相同或重疊：(a)VH域，該VH域包含(i)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列的HVR-H3；及(b)VL域，該VL域包含(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18及19之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：33、34或35及SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43及44中對應的VH及VL序列。在一些實施例中，人類SIRPA之抗原決定基為與由抗-SIRPA抗體所結合者相同的抗原決定基。
在一些實施例中，根據以上實施例中之任一者之抗-SIRPA抗體為單株抗體，包括人類化抗體及/或人類抗體。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文中所定義之其他抗體類別或同型。
在一些實施例中，根據以上實施例中之任一者之抗-SIRPA抗體可單獨地或組合地併入如本文所述之任何特徵。
本文提供抗-SIRPA抗體。所提供抗體適用於例如診斷或治療SIRPA介導之病症。
本發明部分關於展現一或多種改善及/或增強功能特徵(例如，相對於具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體)的抗-SIRPA抗體，包括例如能夠降低SIRPA之細胞含量的抗-SIRPA抗體、能夠降低SIRPA之細胞表面含量的抗-SIRPA抗體、能夠降解SIRPA之抗-SIRPA抗體、能夠降低CD32A/B之細胞含量的抗-SIRPA抗體、能夠增加或增強吞噬作用之抗-SIRPA抗體、能夠增加或增強巨噬細胞之腫瘤細胞吞噬作用的抗-SIRPA抗體、能夠增加或增強抗癌療法之抗腫瘤活性的抗-SIRPA抗體、能夠增加或增強T細胞增殖之抗-SIRPA抗體、能夠增加或增強自巨噬細胞之促炎性細胞介素釋放的抗-SIRPA抗體、及/或能夠以改善/增強的動力學結合人類SIRPA的抗-SIRPA抗體；此類抗-SIRPA抗體之製造及使用方法；含有此類抗-SIRPA抗體之醫藥組合物；編碼此類抗-SIRPA抗體之核酸；及含有編碼此類抗-SIRPA抗體之核酸的宿主細胞。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體可以具有一或多種至少部分歸因於抗體藉由誘導SIRPA之降解、下調、裂解、受體脫敏及/或溶酶體靶向而降低SIRPA之細胞表現(例如，細胞表面表現)之能力的活性。在一些實施例中，降低SIRPA之細胞含量的本發明之抗-SIRPA抗體為展現以下特徵中之一或多者的抗體：(1)抑制或降低一或多種SIRPA活性；(2)降低SIRPA表現細胞中之SIRPA表現(諸如在mRNA層面及/或在蛋白質層面)的能力；(3)與SIRPA蛋白質相互作用、結合或識別SIRPA蛋白質之能力；(4)與SIRPA蛋白質特異性地相互作用或結合之能力；及(5)治療、改善或預防本文所述或所涵蓋之疾病或病症之任何態樣的能力。
在一些實施例中，抗-SIRPA抗體展現以下特性中之一或多 者：a)對人類SIRPA所具有之解離常數(KD)低於具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體之解離常數；b)與人類細胞，諸如人類單核球及巨噬細胞結合；c)降低SIRPA之細胞表面含量(例如，活體外降低人類巨噬細胞上SIRPA之細胞表面含量，其半數最大有效濃度(EC50)低於具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體之半數最大有效濃度；d)對人類SIRPA的解離常數(KD)可在約0.6nM至約0.7nM範圍內；及/或e)降低SIRPA之細胞表面含量(例如，活體外降低人類巨噬細胞上SIRPA之細胞表面含量，其半數最大有效濃度(EC50)可在約0.4nM至約0.5nM範圍內)。如本文中所揭示之半數最大有效濃度(EC50)係指本發明之抗-SIRPA抗體將細胞上或細胞中之SIRPA之細胞含量降低至未經處理之細胞之一半時的濃度，或該抗體與細胞上之SIRPA達成半數最大結合度時之濃度。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體外降低SIRPA之細胞表面含量，其對人類SIRPA v1之半數最大有效濃度(EC50)為約0.40Nm至約0.5nM，如藉由流動式細胞測量術所量測。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體外降低SIRPA之細胞表面含量，其對人類SIRPA v1之半數最大有效濃度(EC50)為約5nM、約4nM、約3nM、約2nM、約1nM、約0.9nM、約0.8nM、約0.7nM、約0.6nM、約0.5nM、約0.4nM、約0.3nM、約0.2nM或約0.1nM，如藉由流動式細胞測量術所量測。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的 一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體外降低SIRPA之細胞表面含量，其對人類SIRPA v1之半數最大有效濃度(EC50)在以下範圍內：約5nM至1nM、約1nM至0.9nM、約1nM至0.8nM、約1nM至0.7nM、約1nM至0.6nM、約1nM至0.5nM、約1nM至0.4nM、約1nM至0.3nM、約1nM至0.2nM、約1nM至0.1nM、約0.9nM至0.8nM、約0.9nM至0.7nM、約0.9nM至0.6nM、約0.9nM至0.5nM、約0.9nM至0.4nM、約0.9nM至0.3nM、約0.9nM至0.2nM、約0.9nM至0.1nM、約0.8nM至0.6nM、約0.8nM至0.5nM、約0.8nM至0.4nM、約0.8nM至0.3nM、約0.8nM至0.2nM、約0.8nM至0.1nM、約0.7nM至0.5nM、約0.7nM至0.4nM、約0.7nM至0.3nM、約0.7nM至0.2nM、約0.7nM至0.1nM、約0.6nM至0.4nM、約0.6nM至0.3nM、約0.6nM至0.2nM、約0.6nM至0.1nM、約0.5nM至0.3nM、約0.5nM至0.2nM、約0.5nM至0.1nM、約0.4nM至0.2nM、約0.4nM至0.1nM或約0.3nM至0.1nM，如藉由流動式細胞測量術所量測。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體外降低SIRPA之細胞表面含量，其中對人類SIRPA v1之半數最大有效濃度(EC50)為約0.093nM，對人類SIRPA v2之半數最大有效濃度為約0.080nM，及/或對食蟹獼猴SIRPA之半數最大有效濃度為約0.879nM，如藉由流動式細胞測量術所量測。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體外降低SIRPA之細胞表面含量，其對人類SIRPA v1或對人類SIRPA v2之半數最大有效濃度(EC50)在以下範圍內：約2nM至0.05nM、約1nM至0.05nM、約0.9nM至0.05nM、約0.8nM至0.05nM、約0.7nM至0.05nM、約0.6nM至0.05nM、約0.5nM至0.05nM、約0.4nM至0.05nM、約0.3nM至0.05nM、約0.20nM至0.05nM、約0.15nM至0.05nM、約0.10nM至0.05nM、約0.09nM至0.05nM、約0.08nM至0.05nM、約0.07nM至0.05nM、約0.06nM至0.05nM、約0.20nM至0.06nM、約0.15nM至0.06nM、約0.10nM至0.06nM、約0.09nM至0.06nM、約0.08nM至約0.06nM、約0.07nM至0.06nM、約0.20nM至0.07nM、約0.15nM至0.07nM、約0.10nM至約0.07nM、約0.09nM至0.07nM、約0.08nM至0.7nM、約0.20nM至0.08nM、約0.15nM至0.08nM、約0.10nM至0.08nM、約0.09nM至0.08nM、約0.20nM至0.09nM、約0.15nM至0.09nM或約0.10nM至0.9nM，如藉由流動式細胞測量術所量測。
在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明提供一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該抗體活體外降低SIRPA之細胞表面含量，其中對人類SIRPA v1之半數最大有效濃度(EC50)為約0.107nM，對人類SIRPA v2之半數最大有效濃度為約0.082nM，及/或對食蟹獼猴SIRPA之半數最大有效濃度為約0.107nM，如藉由流動式細胞測量術所量測。
有利地，與對照抗-SIRPA抗體(例如，具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的對照抗-SIRPA抗體)相比，本發明之抗-SIRPA抗體更有效地(例如，以更低的EC50)降低SIRPA之細胞表面表現。此外，有利地，與對 照抗-SIRPA抗體(例如，具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的對照抗-SIRPA抗體)相比，本發明之抗-SIRPA抗體對SIRPA具有更高的親和力(例如，高出至多大約100倍的親和力)(例如，更低的KD值，如藉由表面電漿子共振所量測)。
本發明之某些態樣至少部分地基於展現一或多種改善的及/或增強的功能特徵(例如，相對於具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體)的抗-SIRPA抗體之鑑定，該等功能特徵包括改善的/增強的降低細胞上之SIRPA之細胞表面含量的能力，引起一或多種SIRPA活性之降低、中和、預防或控制，包括(但不限於)減少單核球、巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞及/或微神經膠質細胞之細胞生長；減少由樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、單核球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞、M2微神經膠質細胞、巨噬細胞、M1巨噬細胞、活化M1巨噬細胞及/或M2巨噬細胞誘導之T細胞增殖；降低嗜中性白血球、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、巨噬細胞、M1巨噬細胞、活化M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、單核球、破骨細胞、T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、顆粒球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞及/或M2微神經膠質細胞之存活率；減少嗜中性白血球、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、巨噬細胞、M1巨噬細胞、活化M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、單核球、破骨細胞、T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、顆粒球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞及/或M2微神經膠質細胞之增殖；抑制嗜中性白血球、樹突狀細 胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、巨噬細胞、M1巨噬細胞、活化M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、單核球、破骨細胞、T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、顆粒球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞及/或M2微神經膠質細胞之遷移；降低嗜中性白血球、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、巨噬細胞、M1巨噬細胞、活化M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、單核球、破骨細胞、T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、顆粒球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞及/或M2微神經膠質細胞之一或多種功能；減少單核球、巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞、嗜中性白血球及/或微神經膠質細胞之增殖；降低單核球、巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞、嗜中性白血球及/或微神經膠質細胞之整體功能性；抑制針對選自膀胱癌、腦癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓白血病、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌、纖維肉瘤及甲狀腺癌之不同類型之癌症的有益免疫反應；抑制針對選自癡呆、額顳葉型癡呆、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、血管性癡呆、混合型癡呆症、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、常壓性水腦症、肌肉萎縮性側索硬化、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、滔蛋白病變疾病(tauopathy disease)、那哈氏病(Nasu-Hakola disease)、中風、急性創傷、慢性創傷、原發性震顫、白塞氏病(Behcet's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、路易體癡呆、多發性系統萎縮症、夏-崔症候群(Shy-Drager syndrome)、進行性核上性麻痹、皮質基底核退化症、急性播散性腦脊髓炎、肉芽腫病症、類肉瘤病、衰老病、癲癇、脊髓損傷、創傷性腦損傷、年齡相關之黃斑部變性、青光眼、色素性視網膜炎、視網膜 變性及多發性硬化症之不同類型之神經病症的有益免疫反應；與腫瘤細胞上之SIRPA配體結合；與樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、單核球、微神經膠質細胞、T細胞、嗜中性白血球及/或巨噬細胞上之SIRPA配體結合；抑制微神經膠質細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、嗜中性白血球、T細胞、T輔助細胞或細胞毒性T細胞中之一或多者之腫瘤細胞殺傷；抑制微神經膠質細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、嗜中性白血球、T細胞、T輔助細胞或細胞毒性T細胞中之一或多者之抗腫瘤細胞增殖活性；抑制微神經膠質細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、嗜中性白血球、T細胞、T輔助細胞或細胞毒性T細胞中之一或多者之抗腫瘤細胞轉移活性；調節一或多種在微神經膠質細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、嗜中性白血球、T細胞、T輔助細胞或細胞毒性T細胞中之一或多者上表現之發炎性受體(諸如CD86)的表現；增強免疫抑制性樹突狀細胞、免疫抑制性巨噬細胞、骨髓衍生之抑制性細胞、腫瘤相關巨噬細胞、免疫抑制性嗜中性白血球及調節性T細胞中之一或多者至腫瘤中之浸潤；增加腫瘤、周邊血液或其他淋巴器官中之促腫瘤骨髓/顆粒球性免疫抑制細胞之數目；增強骨髓衍生之抑制性細胞之促腫瘤活性；降低具有腫瘤殺傷潛力之腫瘤特異性T淋巴細胞之活化；降低具有腫瘤殺傷潛力之腫瘤特異性T淋巴細胞之浸潤；增加腫瘤生長速率；增加腫瘤復發率；降低一或多種調節抗腫瘤T細胞反應之免疫療法的功效，視情況其中該一或多種免疫療法為靶向一或多種選自CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、LIGHT、BTLA、VISTA、KIR、GAL9、TIM1、TIM3、TIM4、 A2AR、LAG3、DR-5、CD39、CD70、TREM1、TREM2、Siglec-5、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-11、SirpA、CD447、CSF-1受體及其任何組合之蛋白質的免疫療法，或降低一種或化學治療劑及/或多種癌症疫苗之功效。
在一些實施例中，用如本文所述之抗-SIRPA抗體治療癌症可以：(i)增加腫瘤浸潤性CD3+ T細胞之數目；(ii)降低非致瘤CD14+骨髓細胞中之SIRPA之細胞含量，視情況其中非致瘤CD14+骨髓細胞為腫瘤浸潤性細胞或視情況其中非致瘤CD14+骨髓細胞存在於血液中；(iii)減少非致瘤CD14+骨髓細胞之數目，視情況其中非致瘤CD14+骨髓細胞為腫瘤浸潤性細胞或視情況其中非致瘤CD14+骨髓細胞存在於血液中；(iv)降低一或多個細胞中之PD-L1、PD-L2、B7-H7、B7-H3、CD200R、CD163及/或CD206含量，視情況其中該一或多個細胞為非致瘤骨髓衍生之抑制性細胞(MDSC)；(v)減小實體腫瘤之腫瘤生長速率；(vi)減小腫瘤體積；(vii)增加一或多種PD-1抑制劑之功效；(viii)增加一或多種檢查點抑制劑療法及/或免疫調節療法之功效，視情況其中該一或多種檢查點抑制劑療法及/或免疫調節療法靶向CTL4、腺苷途徑、PD-L1、PD-L2、OX40、TIM3、LAG3或其任何組合中之一或多者；(ix)增加一或多種化學治療劑之功效，視情況其中化學治療劑中之一或多者為吉西他濱(gemcitabine)、卡培他濱(capecitabine)、蒽環黴素(anthracycline)、小紅莓(Adriamycin®)、表柔比星(epirubicin)(Ellence®)、紫杉烷(taxane)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Taxol®)、多西他賽(docetaxel)(Taxotere®)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、環磷醯胺(Cytoxan®)、卡鉑(carboplatin)(Paraplatin®)及其任何組合；(x)增加T細胞在非致瘤骨髓衍生之抑制性細胞(MDSC)存 在下之增殖；(xi)抑制非致瘤骨髓衍生之抑制性細胞(MDSC)之分化、存活及/或一或多種功能；及(xii)當與化學或放射性毒素結合時殺傷實體腫瘤及相關血管中之表現CD33之免疫抑制性非致瘤骨髓細胞及/或非致瘤CD14表現細胞。
在一些實施例中，本發明之骨髓細胞包括(但不限於)CD45+CD14+骨髓細胞、CD14+骨髓細胞及骨髓衍生之抑制性細胞(MDSC)。在一些實施例中，本發明之骨髓細胞為非致瘤骨髓細胞。免疫抑制性細胞有時亦稱為骨髓衍生之抑制性細胞(MDSC)。在人類中，MDSC可以由以下標記物組合中之一者定義：(1)CD14+HLA-DR低/-；(2)CD14+IL4Rα+；(3)CD14+HLA-DR-IL4Rα+；(4)CD34+CD14+CD11b+CD33+；(5)CD11b+CD14+CD33+；(6)CD33+HLA-DR-；(7)Lin-HLA-DR-；(8)Lin-HLA-DR-CD33+；(9)Lin-HLA-DR-CD33+CD11b+；(10)Lin-CD33+CD11b+CD15+；(11)Lin-HLA-DR-CD33+CD11b+CD14-CD15+；(12)CD11b+CD14-CD33+；(13)CD11b+CD14-HLA-DR-CD33+CD15+；(14)CD33+HLA-DR-CD15+；(15)CD15+IL4Rα+；(16)CD11b+CD15+CD66b+；(17)CD15+FSC低SSC高；(18)CD15高CD33+；(19)CD11b+CD14-CD15+；(20)CD66b+SSC高；及(21)CD11b+CD15+(亦參見Solito S等人Annals of the NY Academy of Sciences,2014)。在小鼠中，MDSC可以由表面標記物CD45+、CD11b+、Gr1+及/或Il4Ra+之表現定義。額外例示性免疫抑制單核細胞譜系為CD45+、CD11b+、Gr1低；及CD45+、CD11c+。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體降低SIRPA之細 胞表面含量，降低SIRPA之細胞內含量，降低SIRPA之總細胞含量或其任何組合，僅在SIRPA天然配體或結合搭配物存在下。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體預防、降低或抑制SIRPA配體或結合搭配物之SIRPA介導之活性，包括例如SIRPA配體或結合搭配物CD47、界面活性劑蛋白A及/或界面活性劑蛋白D。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體選擇性與人類SIRPA結合，該人類SIRPA包括人類對偶基因變異體，本文中亦稱為「多形性」變異體，包括人類SIRPA v1及人類SIRPA v2，結合人類SIRPβ3，結合食蟹獼猴SIRPA及結合狨猴SIRPA。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體不結合小鼠/鼠類SIRPA，不與SIRPB v1(SIRPβ1)結合，不結合兔SIRPA，且不結合大鼠SIRPA。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體選擇性與人類SIRPA結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體選擇性與人類SIRPA及食蟹獼猴SIRPA結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA v1、人類SIRPA v2及食蟹獼猴SIRPA結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA v1、人類SIRPA v2及食蟹獼猴SIRPA結合，但不與鼠類SIRPA結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA v1、人類SIRPA v2及食蟹獼猴SIRPA結合，但不與SIRPβ1結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA v1、人類SIRPA v2及食蟹獼猴SIRPA結合，但不與鼠類SIRPA結合且不與人類SIRPβ1結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA v1、人類SIRPA v2、食蟹獼猴SIRPA及人類SIRPAβ3結合，但不結合鼠類SIRPA且不結合人類SIRPβ1。在以上實施例之任何組合 中，本發明之抗-SIRPA抗體不阻斷SIRPA及CD47之結合或相互作用。
本發明之某些態樣係關於下調，亦即降低SIRPA之細胞含量的抗-SIRPA抗體。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體降低SIRPA之細胞含量，而不抑制、阻斷或降低SIRPA與一或多種SIRPA配體(例如CD47)之間的相互作用(例如，結合)。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體可以具有一或多種至少部分地歸因於抗體藉由誘導SIRPA之降解、下調、裂解、受體脫敏及/或溶酶體靶向而降低SIRPA之細胞含量(例如，細胞表面表現)之能力的活性。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體下調細胞中之SIRPA表現。在一些實施例中，細胞中之SIRPA表現之下調為減少的SIRPA細胞表面表現。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體下調單核球(例如，人類單核球)中之SIRPA表現。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體下調巨噬細胞(例如，人類巨噬細胞)中之SIRPA表現。在一些實施例中，與不經本發明之抗-SIRPA抗體處理之巨噬細胞中之SIRPA細胞表面表現量相比，本發明之抗-SIRPA抗體將SIRPA之巨噬細胞細胞表面表現下調大於70%、大於75%、大於80%、大於85%或大於95%。在一些實施例中，與不經本發明之抗-SIRPA抗體處理之巨噬細胞中之SIRPA細胞表面表現量相比，本發明之抗-SIRPA抗體將SIRPA之巨噬細胞細胞表面表現下調約70-90%、約70-85%、約70-80%、約70-75%、約75-90%、約75-85%、約75-80%、約80-90%、約80-85%或約85-95%。在一些實施例中，巨噬細胞為人類巨噬細胞，包括(但不限於)人類M1巨噬細胞及人類M2巨噬細胞。
SIRPA之細胞含量可以指(但不限於)SIRPA之細胞表面含量、SIRPA之細胞內含量及SIRPA之總含量。在一些實施例中，SIRPA之細胞含量之降低包含SIRPA之細胞表面含量之降低。如本文所用，若抗-SIRPA抗體誘導SIRPA之細胞表面含量降低25%或更多，則其降低SIRPA之細胞表面含量，如藉由本文所述或此項技術中已知之任何活體外基於細胞之分析或適合的活體內模型所量測，例如使用流動式細胞測量術，諸如螢光活化細胞分選(FACS)來量測SIRPA之細胞表面含量。在一些實施例中，SIRPA之細胞含量之降低包含SIRPA之細胞內含量之降低。如本文所用，若抗-SIRPA抗體誘導SIRPA之細胞內含量降低25%或更多，則其降低Siglec-9之細胞內含量，如藉由本文所述或此項技術中已知之任何活體外基於細胞之分析或適合的活體內模型所量測，例如免疫染色、西方墨點分析(Western blot analysis)、共免疫沈澱及細胞血細胞計數法。在一些實施例中，SIRPA之細胞含量之降低包含SIRPA之總含量之降低。如本文所用，若抗-SIRPA抗體誘導SIRPA之總含量降低25%或更多，則其降低SIRPA之總含量，如藉由本文所述或此項技術中已知之任何活體外基於細胞之分析或適合的活體內模型所量測，例如免疫染色、西方墨點分析、共免疫沈澱及細胞血細胞計數法。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體誘導SIRPA降解、SIRPA裂解、SIRPA內化、SIRPA脫落、SIRPA表現下調或其任何組合。在一些實施例中，使用SIRPA細胞分析量測初代細胞(例如，樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、單核球、微神經膠質細胞及巨噬細胞)上或細胞株上SIRPA之細胞含量。
在一些實施例中，在將人類巨噬細胞在37℃下曝露於抗體4小時之後，下調性抗-SIRPA抗體具有200nM或更低，通常100nM或更低 的IC50(細胞表面上表現之SIRPA之50%下調)。在一些實施例中，在曝露於本發明抗體之至少24小時內，SIRPA保持下調。可使用任何技術，例如流動式細胞測量術分析細胞之SIRPA表面表現。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體將SIRPA之細胞含量與在不存在該抗-SIRPA抗體的情況下SIRPA之細胞含量相比降低至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多。
在可以與以上段落中概述之下調活性中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體抑制SIRPA之細胞表面叢集。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體下調SIRPA，但不阻斷、抑制或降低SIRPA配體(例如CD47)與SIRPA之結合。在本發明之上下文中，不阻斷CD47與SIRPA之結合的針對SIRPA之抗體係指當抗體 與CD47及表現SIRPA之細胞一起培育時不會引起與SIRPA結合之CD47顯著減少的抗體。在與SIRPA結合之CD47的情況下「顯著減少」係指與在存在不結合SIRPA之同型匹配對照抗體的情況下與SIRPA結合之CD47相比，結合減少30%或更低，通常至少25%、至少20%、至少15%或至少10%或更低。用於評定阻斷活性之說明性分析闡述於本文實例中。例如，將表現人類SIRPA之細胞，例如人類巨噬細胞，或經修飾以重組表現人類SIRPA之細胞，諸如CHO細胞，以105個細胞/孔種植於96孔盤中，洗滌，且在含有1.0μg/ml之單株抗體或同型對照的100μl緩衝液中培育以進行螢光活化細胞分選。隨後將細胞在可溶性人類CD47中在冰上洗滌及培育30分鐘。隨後分析細胞之表面結合的CD47。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體下調細胞中之CD32A/B表現(亦即，FcγRIIA/FcγRIIB)。在一些實施例中，細胞中之CD32A/B(亦即，FcγRIIA/FcγRIIB)表現之下調為降低的CD32A/B(亦即，FcγRIIA/FcγRIIB)細胞表面表現。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體下調巨噬細胞(例如，人類巨噬細胞)中之CD32A/B表現。在一些實施例中，本發明之抗-SIRP抗體下調巨噬細胞(例如，人類巨噬細胞)中之CD32A(亦即，FcγRIIA)表現。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體下調巨噬細胞(例如，人類巨噬細胞)中之CD32B(亦即，FcγRIIB)表現。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體將人類巨噬細胞中之CD32A(亦即，FcγRIIA)之細胞表面表現與不經本發明之抗-SIRPA抗體處理之人類巨噬細胞中之CD32A細胞表面表現量相比下調約75%、約80%或約85%。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體將人類巨噬細胞中之CD32A之細胞表面表現與不經本發明之抗-SIRPA抗體處理 之人類巨噬細胞中之CD32A細胞表面表現量相比下調約70-85%。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體將人類巨噬細胞中之CD32B(亦即，FcγRIIB)之細胞表面表現下調至不可偵測的程度。
在一個態樣中，本發明提供抗體，諸如經分離(例如，單株)抗體，其與本發明之SIRPA蛋白質內之區域，諸如抗原決定基相互作用或以其他方式與之結合。在一些實施例中，抗體以改善的/增強的動力學(例如，相對於具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體)與本發明之SIRPA蛋白質內的區域，諸如抗原決定基相互作用或以其他方式與之結合。在一些實施例中，抗體與諸如樹突狀細胞、骨髓細胞、單核球、巨噬細胞等人類細胞上之SIRPA蛋白質內之區域，諸如抗原決定基相互作用或以其他方式與之結合，其半數最大有效濃度(EC50)低於對照抗體(例如，相對於具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體)之半數最大有效濃度。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與SIRPA蛋白質結合且在與SIRPA蛋白質結合之後調節一或多種SIRPA活性，例如與細胞上之SIRPA表現有關的活性。本發明之SIRPA蛋白質包括(但不限於)哺乳動物SIRPA蛋白質、人類SIRPA蛋白質、小鼠SIRPA蛋白質、食蟹獼猴SIRPA蛋白質及大鼠SIRPA蛋白質。
在一些實施例中，本發明之抗體可以pH依賴性方式結合SIRPA。在一些實施例中，本發明之抗體可以在中性pH下與SIRPA結合且經內化而不與SIRPA蛋白質解離。或者，在酸性pH下，在本發明之抗體內化且隨後藉由內體/溶酶體途徑降解之後，該等抗體可以與SIRPA解 離。在某些實施例中，抗-SIRPA抗體在以下範圍內之pH下結合SIRPA：5.5至8.0、5.5至7.5、5.5至7.0、5.5至6.5、5.5至6.0、6.0至8.0、6.5至8.0、7.0至8.0、7.5至8.0、6.0至7.5、6.0至7.0、6.5至7.5。在某些實施例中，抗-SIRPA抗體在小於6.0、小於5.5、小於5.0、小於4.5、小於4.0、小於3.5、小於3.0、小於2.5或小於2.0之pH下與SIRPA解離。
SIRPA為單次通過I型膜蛋白(single-pass type I membrane protein)。在人類SIRPA之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)內，細胞外域位於胺基酸殘基31-373；跨膜域位於胺基酸殘基374-394；且細胞內域位於胺基酸殘基395-504。人類SIRPA包含單一V組及兩個C1組Ig超家族(IgSF)域，分別稱為D1域、D2域及D3域。D1域包含人類SIRPA之胺基酸殘基32-137；D2域包含人類SIRPA之胺基酸殘基148-247；且D3域包含人類SIRPA之胺基酸殘基254-348。如熟習此項技術者將瞭解，本發明域之開始及結束殘基可以視為了確定域所用之電腦模型化程式或所用方法而變化。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與SIRPA之D3域結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA之D3域結合，該域包含SEQ ID NO：1之人類SIRPA胺基酸序列之胺基酸殘基254-348。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA之D3域內之抗原決定基結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA之D3域內之抗原決定基結合，其中該抗原決定基包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：1之人類SIRPA胺基酸序列之胺基酸殘基254-348、胺基酸殘基254-274、胺基酸殘基264-279、胺基酸殘基274-289、胺基酸殘基273-331、胺基酸殘基281-315、胺基酸殘基281-337、胺基酸 殘基284-299、胺基酸殘基294-309、胺基酸殘基304-319、胺基酸殘基314-329、胺基酸殘基324-339及胺基酸殘基334-348。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA之D3域內之抗原決定基結合，其中該抗原決定基包括人類SIRPA v1胺基酸序列(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基R282、Q284及G337。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與人類SIRPA之D3域內之抗原決定基結合，其中該抗原決定基包括人類SIRPA v1胺基酸序列(SEQ ID NO：1)之胺基酸殘基Q281、R282、Q284、L285、W287、R295、E297、V302及W315。
在一些實施例中，抗體與SIRPA，例如人類SIRPA之D3域結合。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體與由具有如本文所述命名為m3F9之抗體之CDR的抗體所結合的相同的SIRPA抗原決定基或SIRPA抗原決定基之一部分結合。因此，在一些實施例中，本發明之抗體與由具有如本文所述之命名為m3F9之抗體之CDR的抗體所結合的相同的SIRPA抗原決定基或SIRPA抗原決定基之一部分結合。
本發明之某些態樣至少部分地基於展現一或多種改善的及/或增強的功能特徵(例如，相對於具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗-SIRPA抗體)之抗-SIRPA抗體的鑑定，該等功能特徵包括改善的/增強的降低細胞上之SIRPA之細胞表面含量的能力，引起一或多種SIRPA活性之降低、中和、預防或控制，包括(但不限於)減少單核球、巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞及/或微神經膠質細胞之細胞生長；減少由樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、單核球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞、M2微神經膠質細胞、巨噬細胞、M1巨噬細胞、活化 M1巨噬細胞及/或M2巨噬細胞誘導之T細胞增殖；降低嗜中性白血球、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、巨噬細胞、NK細胞、M1巨噬細胞、M1嗜中性白血球、M1 NK細胞、活化M1巨噬細胞、活化M1嗜中性白血球、活化M1 NK細胞、M2巨噬細胞、M2嗜中性白血球、M2 NK細胞、單核球、破骨細胞、T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、顆粒球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞及/或M2微神經膠質細胞之存活率；減少或降低嗜中性白血球、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、巨噬細胞、NK細胞、M1巨噬細胞、M1嗜中性白血球、M1 NK細胞、活化M1巨噬細胞、活化M1嗜中性白血球、活化M1 NK細胞、M2巨噬細胞、M2嗜中性白血球、M2 NK細胞、單核球、破骨細胞、T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、顆粒球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞及/或M2微神經膠質細胞之增殖；抑制嗜中性白血球、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、巨噬細胞、NK細胞、M1巨噬細胞、M1嗜中性白血球、M1 NK細胞、活化M1巨噬細胞、活化M1嗜中性白血球、活化M1 NK細胞、M2巨噬細胞、M2嗜中性白血球、M2 NK細胞、單核球、破骨細胞、T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、顆粒球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞及/或M2微神經膠質細胞之遷移；降低或抑制嗜中性白血球、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、巨噬細胞、NK細胞、M1巨噬細胞、M1嗜中性白血球、M1 NK細胞、活化M1巨噬細胞、活化M1嗜中性白血球、活化M1 NK細胞、M2巨噬細胞、M2嗜中性白血球、M2 NK細胞、單核球、破骨細胞、T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、顆粒球、微神經膠質細胞、M1微神經膠質細胞、活化M1微神經膠質細胞及/ 或M2微神經膠質細胞之一或多種功能；減少單核球、巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞、嗜中性白血球及/或微神經膠質細胞之增殖；降低單核球、巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞、嗜中性白血球及/或微神經膠質細胞之整體功能性；抑制針對選自膀胱癌、腦癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓白血病、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌、纖維肉瘤及甲狀腺癌之不同類型之癌症的有益免疫反應；抑制針對選自癡呆、額顳葉型癡呆、阿茲海默氏病、血管性癡呆、混合型癡呆症、庫賈氏病、常壓性水腦症、肌肉萎縮性側索硬化、亨廷頓氏病、滔蛋白病變疾病、那哈氏病、中風、急性創傷、慢性創傷、原發性震顫、白塞氏病、帕金森氏病、路易體癡呆、多發性系統萎縮症、夏-崔症候群、進行性核上性麻痹、皮質基底核退化症、急性播散性腦脊髓炎、肉芽腫病症、類肉瘤病、衰老病、癲癇、脊髓損傷、創傷性腦損傷、年齡相關之黃斑部變性、青光眼、色素性視網膜炎、視網膜變性及多發性硬化症之不同類型之神經病症的有益免疫反應；與腫瘤細胞上之SIRPA配體結合；與樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、單核球、微神經膠質細胞、T細胞、嗜中性白血球及/或巨噬細胞上之SIRPA配體結合；抑制微神經膠質細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、嗜中性白血球、T細胞、T輔助細胞或細胞毒性T細胞中之一或多者之腫瘤細胞殺傷；抑制微神經膠質細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、嗜中性白血球、T細胞、T輔助細胞或細胞毒性T細胞中之一或多者之抗腫瘤細胞增殖活性；抑制微神經膠質細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、嗜中性白血球、T細胞、T輔助細胞或細胞毒性T細胞中之一或多者之抗腫瘤細胞轉移活 性；調節一或多種在微神經膠質細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓衍生之樹突狀細胞、嗜中性白血球、T細胞、T輔助細胞或細胞毒性T細胞中之一或多者上表現之發炎性受體(諸如CD86)的表現；增強免疫抑制性樹突狀細胞、免疫抑制性巨噬細胞、骨髓衍生之抑制性細胞、腫瘤相關巨噬細胞、免疫抑制性嗜中性白血球及調節性T細胞中之一或多者至腫瘤中之浸潤；促進或拯救免疫抑制性樹突狀細胞、免疫抑制性巨噬細胞、免疫抑制性嗜中性白血球、免疫抑制性NK細胞、骨髓衍生之抑制性細胞、腫瘤相關巨噬細胞、腫瘤相關嗜中性白血球、腫瘤相關NK細胞及調節性T細胞中之一或多者之功能性；增加免疫抑制性樹突狀細胞、免疫抑制性巨噬細胞、免疫抑制性嗜中性白血球、免疫抑制性NK細胞、骨髓衍生之抑制性細胞、腫瘤相關巨噬細胞、腫瘤相關嗜中性白血球、腫瘤相關NK細胞、非致瘤CD45+CD14+骨髓細胞及調節性T細胞中之一或多者至腫瘤中之浸潤；增加腫瘤、周邊血液或其他淋巴器官中之促腫瘤骨髓/顆粒球性免疫抑制細胞之數目；增強骨髓衍生之抑制性細胞之促腫瘤活性；降低具有腫瘤殺傷潛力之腫瘤特異性T淋巴細胞之活化；增強非致瘤骨髓衍生之抑制性細胞及/或非致瘤CD45+CD14+骨髓細胞之存活；降低具有腫瘤殺傷潛力之腫瘤特異性T淋巴細胞之浸潤及/或活化；增加腫瘤生長速率；增加腫瘤復發率；降低一或多種調節抗腫瘤T細胞反應之免疫療法的功效，視情況其中該一或多種免疫療法為靶向一或多種選自CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、LIGHT、BTLA、VISTA、KIR、GAL9、TIM1、TIM3、TIM4、A2AR、LAG3、DR-5、CD39、CD70、TREM1、TREM2、Siglec-5、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-11、SIRPA、 CD447、CSF-1受體及其任何組合之蛋白質的免疫療法，或降低一種或化學治療劑及/或多種癌症疫苗之功效。
在可以與以上其他實施例中之任一者組合的一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體誘導、增強或增加一或多種活性，包括：(i)增加腫瘤浸潤性CD3+ T細胞之數目；(ii)降低非致瘤CD14+骨髓細胞中之SIRPA之細胞含量，視情況其中非致瘤CD14+骨髓細胞為腫瘤浸潤性細胞或視情況其中非致瘤CD14+骨髓細胞存在於血液中；(iii)減少非致瘤CD14+骨髓細胞之數目，視情況其中非致瘤CD14+骨髓細胞為腫瘤浸潤性細胞或視情況其中非致瘤CD14+骨髓細胞存在於血液中；(iv)降低一或多個細胞中之PD-L1、PD-L2、B7-H2、B7-H3、CD200R、CD163及/或CD206含量，視情況其中該一或多個細胞為非致瘤骨髓衍生之抑制性細胞(MDSC)；(v)減小實體腫瘤之腫瘤生長速率；(vi)減小腫瘤體積；(vii)增加一或多種PD-1抑制劑之功效；(viii)增加一或多種檢查點抑制劑療法及/或免疫調節療法之功效，視情況其中該一或多種檢查點抑制劑療法及/或免疫調節療法靶向CTL4、腺苷途徑、PD-L1、PD-L2、OX40、TIM3、LAG3或其任何組合中之一或多者；(ix)增加一或多種化學治療劑之功效，視情況其中化學治療劑中之一或多者為吉西他濱、卡培他濱、蒽環黴素、小紅莓(Adriamycin®)、表柔比星(Ellence®)、紫杉烷、太平洋紫杉醇(Taxol®)、多西他賽(Taxotere®)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、環磷醯胺(Cytoxan®)、卡鉑(Paraplatin®)及其任何組合；(x)增加T細胞在非致瘤骨髓衍生之抑制性細胞(MDSC)存在下之增殖；(xi)抑制非致瘤骨髓衍生之抑制性細胞(MDSC)之分化、存活及/或一或多種功能；及(xii)當與化學或放射性毒素結合時殺傷實體腫瘤及相關血管中之表現CD33之免疫抑制性 非致瘤骨髓細胞及/或非致瘤CD14表現細胞。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體降低調節性T細胞、腫瘤嵌入式免疫抑制性樹突狀細胞、腫瘤嵌入式免疫抑制性巨噬細胞、骨髓衍生之抑制性細胞、腫瘤相關巨噬細胞、急性骨髓白血病(AML)細胞、慢性淋巴球性白血病(CLL)細胞或慢性骨髓白血病(CML)之活性、功能性或存活。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體誘導或促進個體中之一或多種免疫細胞，例如一或多種選自樹突狀細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、NK細胞、微神經膠質細胞、T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞及其任何組合之免疫細胞的存活、成熟、功能性、遷移或增殖。
抗-SIRPA抗體結合親和力
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，抗體具有<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)之解離常數(Kd)。解離常數可以藉由任何分析技術測定，包括任何生物化學或生物物理技術，諸如ELISA、表面電漿子共振(SPR)、生物層干涉法(參見例如ForteBio之Octet系統)、等溫滴定熱量測定(ITC)、差示掃描熱量測定(DSC)、圓二色性(CD)、停流分析及比色或螢光蛋白解鏈分析。在一個實施例中，藉由經放射性標記之抗原結合分析(RIA)量測Kd。在一些實施例中，用Fab形式之感興趣的抗體及其抗原進行RIA，例如如Chen等人J.Mol.Biol.293：865-881(1999)中所述。在一些實施例中，使用BIACORE表面電漿子共振分析量測Kd，例如，在25℃下，採用經固定之抗原CM5晶片，以約10個反應單位(RU)，使用BIACORE-2000或 BIACORE-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)進行分析。在一些實施例中，使用單價抗體(例如，Fab)或全長抗體測定KD。在一些實施例中，使用呈單價形式之全長抗體測定KD。
抗體片段
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段以及下文描述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如WO 93/16185；及美國專利第5571894號及第5587458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5869046號。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的。參見例如EP404097；WO 1993/01161；Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)中。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(參見例如美國專利第6248516號)。
抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生，如本文所述。
嵌合及人類化抗體
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4816567號中。在一個實 例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。在某些實施例中，人類化抗體在人類中實質上無免疫原性。在某些實施例中，人類化抗體與來自衍生出人類化抗體之另一物種之抗體對目標具有實質上相同的親和力。參見例如美國專利第5530101號、第5693761號、第5693762號及第5585089號。在某些實施例中，鑑定可經修飾而不降低抗原結合域之天然親和力同時降低其免疫原性的抗體可變域之胺基酸。參見例如美國專利第5766886號及第5869619號。通常，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(或其部分)衍生自非人類抗體，且FR(或其部分)衍生自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如衍生出HVR殘基之抗體)之相應殘基取代，例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro等人Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如美國專利第5821337號、第7527791號、第6982321號及第7087409號中。可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合(best-fit)」法選擇之構架區(參見例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；衍生自具有輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter 等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及衍生自篩選FR庫之構架區(參見例如Baca等人J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
人類抗體
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體一般描述於van Dijk等人Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
人類抗體可藉由向已經修飾以響應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的基因轉殖動物投與免疫原來製備。可以利用人類Ig基因座之大片段工程化缺乏小鼠抗體產生的小鼠品系，預期此類小鼠將產生人類抗體而沒有小鼠抗體。大的人類Ig片段可保持大的可變基因多樣性以及適當調節抗體產生及表現。藉由利用小鼠機制進行抗體多樣化及選擇以及缺乏對人類蛋白質之免疫耐受性，此等小鼠品系中之再生人類抗體譜系可以產生針對任何感興趣的抗原(包括人類抗原)之高親和力完全人類抗體。使用融合瘤技術，可產生且選擇具有所要特異性之抗原特異性人類mAb。某些例示性方法描述於美國專利第5545807號、EP 546073及EP 546073中。此外，參見例如描述XENOMOUSETM技術之美國專利第6075181號及第6150584號；描述HUMAB®技術之美國專利第5770429號；描述K-M MOUSE®技術之美國專利第7041870號；及 描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。來自由此類動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合而進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製得。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株。(參見例如Kozbor J.Immunol.133：3001(1984)；及Boerner等人J.Immunol.147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生的人類抗體亦描述於Li等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1 03：3557-3562(2006)中。額外方法包括描述於例如美國專利第7189826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)中之方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術(Trioma technology))亦描述於Vollmers等人Histology and Histopathology 20(3)：927-937(2005)及Vollmers等人Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3)：185-91(2005)中。人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體呈現庫之Fv純系可變域序列產生。此類可變域序列隨後可與所要人類恆定域組合。下文描述用於自抗體庫選擇人類抗體之技術。
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，抗體為藉由活體外方法及/或篩選具有所要一或多種活性之抗體的組合庫分離的人類抗體。適合實例包括(但不限於)噬菌體呈現(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(前稱Proliferon)、Affimed)、核糖體呈現(CAT)、酵母呈現(Adimab)及類似方法。在某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系分別藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖且在噬菌體庫中隨機重組，隨後可針對抗原結合噬菌體對其 進行篩選，如Winter等人Ann.Rev.Immunol.12：433-455(1994)中所述。例如，此項技術中已知多種方法用於產生噬菌體呈現庫及針對具有所要結合特徵之抗體篩選此類庫。亦參見Sidhu等人J.Mol.Biol.338(2)：299-310,2004；Lee等人J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093,2004；Fellouse Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人J.Immunol.Methods 284(-2)：1 19-132(2004)。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫來源之庫提供針對免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖(例如自人類)原生譜系以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之單一抗體來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人EMBO J.12：725-734(1993)所述。最後，亦可以藉由選殖來自幹細胞之未重排V-基因區段，及使用包含用以編碼高度可變HVR3區及用以完成活體外重排之隨機序列的PCR引子，以合成方式製得原生庫，如Hoogenboom等人J.Mol.Biol.,227：381-388,1992所述。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括例如：美國專利第5750373號及美國專利公開案第2007/0292936號及第2009/0002360號。自人類抗體庫分離之抗體在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
包括Fc區之恆定區
在本文所提供之抗-SIRPA抗體中之任一者之一些實施例中，抗體包含Fc。在一些實施例中，Fc為人類IgG1、IgG2、IgG3及/或IgG4同型。在一些實施例中，抗體屬於IgG類、IgM類或IgA類。
在本文所提供之抗-SIRPA抗體中之任一者之某些實施例中，抗體具有IgG2同型。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體含有人類IgG2 恆定區。在一些實施例中，人類IgG2恆定區包括Fc區。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體誘導一或多種SIRPA活性或獨立於與Fc受體之結合。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體結合抑制性Fc受體。在某些實施例中，抑制性Fc受體為抑制性Fc-γ受體IIB(FcγIIB)。
在本文所提供之抗體中之任一者之某些實施例中，抗體具有IgG1同型。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體含有小鼠IgG1恆定區。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體含有人類IgG1恆定區。在一些實施例中，人類IgG1恆定區包括Fc區。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體結合抑制性Fc受體。在某些實施例中，抑制性Fc受體為抑制性Fc-γ受體IIB(FcγIIB)。
在本文所提供之抗-SIRPA抗體中之任一者之某些實施例中，抗體具有IgG4同型。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體含有人類IgG4恆定區。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包括Fc區。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體結合抑制性Fc受體。在某些實施例中，抑制性Fc受體為抑制性Fc-γ受體IIB(FcγIIB)。
在本文所提供之抗-SIRPA抗體中之任一者之某些實施例中，抗體具有混合IgG2/4同型。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體包括胺基酸序列，其包含人類IgG2之根據EU編號之胺基酸118至260及人類IgG4之根據EU編號之胺基酸261-447(WO 1997/11971；WO 2007/106585)。
在一些實施例中，與包含不含胺基酸取代之Fc區的相應抗體相比，Fc區增加叢集而不活化補體。在一些實施例中，抗體誘導該抗體所特異性結合之目標的一或多種活性。在一些實施例中，抗體與SIRPA結合。
亦可能需要修飾本發明之抗-SIRPA抗體以修飾效應功能及/或增加抗體之血清半衰期。例如，恆定區上之Fc受體結合位點可經修飾或突變以移除或降低對諸如FcγRI、FcγRII及/或FcγRIII之某些Fc受體的結合親和力，以降低抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。在一些實施例中，藉由移除抗體之Fc區(例如，在IgG之CH2域中)之N-糖基化而減弱效應功能。在一些實施例中，藉由修飾人類IgG之諸如233-236、297及/或327-331之區域而減弱效應功能，如WO 99/58572及Armour等人Molecular Immunology 40：585-593(2003)；Reddy等人J.Immunology 164：1925-1933(2000)中所述。在其他實施例中，亦可能需要修飾本發明之抗-SIRPA抗體以修飾效應功能，從而增加針對含ITIM之FcgRIIb(CD32b)之發現選擇性，以增加相鄰細胞上SIRPA抗體之叢集而不活化體液反應，包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性及抗體依賴性細胞吞噬作用。
為了增加抗體之血清半衰期，可以將救助受體結合抗原決定基併入抗體(尤其是抗體片段)中，如例如美國專利5739277中所述。如本文所用之術語「救助受體結合抗原決定基」係指負責增加IgG分子之活體內血清半衰期之IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區之抗原決定基。
多特異性抗體
多特異性抗體為對至少兩種不同的抗原決定基，包括同一種或另一多肽(例如，本發明之一或多種SIRPA多肽)上之抗原決定基具有結合特異性的抗體。在一些實施例中，多特異性抗體可為雙特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體可為三特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體可為四特異性抗體。此類抗體可以衍生自全長抗體或抗體片段 (例如，F(ab')2雙特異性抗體)。在一些實施例中，多特異性抗體包含與SIRPA上之第一位點結合的第一抗原結合區且包含與SIRPA上之第二位點結合的第二抗原結合區。在一些實施例中，多特異性抗體包含與SIRPA結合的第一抗原結合區及與第二多肽結合的第二抗原結合區。
本文提供多特異性抗體，其包含第一抗原結合區，其中第一抗原結合區包含本文所述之抗體之六個HVR，其與SIRPA結合；及第二抗原結合區，其與第二多肽結合。在一些實施例中，第一抗原結合區包含本文所述之抗體之VH或VL。
在多特異性抗體中之任一者之一些實施例中，第二多肽為促進跨血腦障壁轉運之抗原。此項技術中已知多種促進跨血腦障壁轉運之抗原及肽(參見例如Gabathuler R.Neurobiol.Dis.37：48-57(2010))。此類第二抗原及肽包括(但不限於)運鐵蛋白受體(TR)、胰島素受體(HIR)、類胰島素生長因子受體(IGFR)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1及2(LPR-1及2)、白喉毒素受體(包括CRM197(白喉毒素之無毒突變體))、TMEM 30(A)(翻轉酶(Flippase))、蛋白質轉導域(諸如TAT、Syn-B或穿膜肽)、聚精胺酸或通常帶正電荷的肽、Angiopep肽(諸如ANG1005)(參見例如Gabathuler,2010)、及其他在血腦障壁內皮細胞上富集的細胞表面蛋白(參見例如Daneman等人PLoS One 5(10)：e13741(2010))。
在多特異性抗體中之任一者之一些實施例中，第二多肽為致病蛋白，其選自類澱粉β、寡聚類澱粉β、類澱粉β斑塊、類澱粉前驅蛋白質或其片段、滔蛋白、IAPP、α-突觸核蛋白、TDP-43、FUS蛋白、C9orf72(染色體9開放閱讀框架72)、c9RAN蛋白、普里昂蛋白、PrPSc、亨廷頓蛋白、降血鈣素、超氧化歧化酶、運動失調質、運動失調質1、運 動失調質2、運動失調質3、運動失調質7、運動失調質8、運動失調質10、路易體、心房利尿鈉因子、胰島類澱粉多肽、胰島素、脂蛋白元AI、血清類澱粉A、medin、泌乳素、運甲狀腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、膠溶素、角膜上皮蛋白、胱抑素、免疫球蛋白輕鏈AL、S-IBM蛋白、重複序列相關的非ATG(RAN)轉譯產物、二肽重複(DPR)肽、甘胺酸-丙胺酸(GA)重複肽、甘胺酸-脯胺酸(GP)重複肽、甘胺酸-精胺酸(GR)重複肽、脯胺酸-丙胺酸(PA)重複肽、泛蛋白及脯胺酸-精胺酸(PR)重複肽；(d)在免疫細胞上表現之配體及/或蛋白質，其中該等配體及/或蛋白質選自CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3及磷脂醯絲胺酸；及/或(e)在一或多個腫瘤細胞上表現之蛋白質、脂質、多醣或糖脂；及其任何組合。
多價抗體可以識別SIRPA抗原以及(但不限於)額外抗原，諸如Aβ肽抗原、α-突觸核蛋白蛋白質抗原、滔蛋白抗原、TDP-43蛋白質抗原、普里昂蛋白抗原、亨廷頓蛋白蛋白質抗原、RAN轉譯產物抗原(包括由甘胺酸-丙胺酸(GA)、甘胺酸-脯胺酸(GP)、甘胺酸-精胺酸(GR)、脯胺酸-丙胺酸(PA)或脯胺酸-精胺酸(PR)構成之二肽重複序列(DPR肽))、胰島素受體、類胰島素生長因子受體或運鐵蛋白受體或任何其他促進跨血腦障壁之抗體轉移的抗原。在一些實施例中，第二多肽為運鐵蛋白。在一些實施例中，第二多肽為滔蛋白。在一些實施例中，第二多肽為Aβ。在一些實施例中，第二多肽為TREM2。在一些實施例中，第二多肽為α-突觸核蛋白。
多價抗體含有至少一條多肽鏈(及較佳兩條多肽鏈)，其中 多肽鏈包含兩個或更多個可變域。例如，多肽鏈可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區之一條多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。類似地，多肽鏈可以包含VH-CH1-可撓性連接子-VH-CH1-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。多價抗體在本文中較佳進一步包含至少兩個(且較佳四個)輕鏈可變域多肽。多價抗體在本文中可以例如包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情況進一步包含CL域。
用於製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello Nature 305：537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker等人EMBO J.10：3655(1991))，及「杵臼(knob-in-hole)」工程化(參見例如美國專利第5731168號)。亦參見WO 2013/026833(CrossMab)。多特異性抗體亦可藉由以下製得：用於製造抗體Fc-異源二聚分子之工程化靜電轉向效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體交聯(參見例如美國專利第4676980號)；使用白胺酸；使用用於製造雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Hollinger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(scFv)二聚體(參見例如Gruber等人J.Immunol.152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所述。
本文中亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之工程化抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576)。抗體在本文中亦包括包含與多個SIRPA結合之抗原結合位點的「雙效FAb(Dual Acting FAb)」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
抗體變異體
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，涵蓋抗體之胺基酸序列變異體。例如，可能需要改善抗體之結合親和力及/或其他生物特性。
取代、插入及缺失變異體
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成製備。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列內的殘基之缺失及/或插入及/或取代。表1：胺基酸取代
Figure 108117983-A0305-02-0105-290
對抗體生物特性之實質性修飾係藉由選擇取代來實現，該 等取代在其維持以下作用方面顯著不同：(a)取代區域中多肽骨架之結構，例如薄片或螺旋構形；(b)分子在目標位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈體積。基於常見側鏈特性將天然產生之殘基分為以下幾組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守取代可涉及以此等類別中之一者的成員交換另一類別之成員。此類經取代殘基可例如引入至人類抗體之與非人類抗體同源之區域中，或引入至分子之非同源區域中。
在對本文所述之多肽或抗體進行改變時，根據某些實施例，可以考慮胺基酸之親水指數。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特徵來分配親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
親水胺基酸指數在賦予蛋白質相互作用生物功能方面之重要性在此項技術中有所瞭解。Kyte等人J.Mol.Biol.,157：105-131(1982)。已知某些胺基酸可取代具有類似親水指數或評分之其他胺基酸且仍然保留類似生物活性。在基於親水指數進行改變時，在某些實施例中， 包括親水指數在±2內之胺基酸的取代。在某些實施例中，包括親水指數在±1內之胺基酸的取代，且在某些實施例中，包括親水指數在±0.5內之胺基酸的取代。
此項技術中亦瞭解，類似胺基酸之取代可基於親水性有效地進行，特別是當由此產生之生物學功能性蛋白質或肽意欲用於免疫學實施例中時，如在本發明之情況下。在某些實施例中，蛋白質之最大局部平均親水性，如由其相鄰胺基酸之親水性所決定，與其免疫原性及抗原性，亦即與蛋白質之生物特性相關。
已為此等胺基酸殘基分配以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0±1)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。在基於類似親水性值進行改變時，在某些實施例中，包括親水性值在±2內之胺基酸的取代，在某些實施例中，包括親水性值在±1內之胺基酸的取代，且在某些實施例中，包括親水性值在±0.5內之胺基酸的取代。亦可基於親水性自一級胺基酸序列鑑定抗原決定基。此等區域亦稱為「抗原決定基核心區」。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此類改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。例如，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。此類改變例如可在HVR中之抗原接觸殘基之外。在上文所提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過 一個、兩個或三個胺基酸取代。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如，對於ADEPT而言)或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合。
不參與維持抗體之適當構形之任何半胱胺酸殘基一般亦可經絲胺酸取代，以提高分子之氧化穩定性且防止異常交聯。反之，可向抗體添加半胱胺酸鍵以提高其穩定性(特別是在抗體為諸如Fv片段之抗體片段的情況下)。
糖基化變異體
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，改變抗體以增加或降低抗體糖基化之程度。向抗體中添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。
抗體之糖基化通常為N-連接型或O-連接型。N-連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸，其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸，為用於將碳水化合物部分酶促連接於天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，在多肽中此等三肽序列中之任一者的存在產生潛在糖基化位點。O連接型糖基化係指糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥胺基酸，最通常是絲胺酸或蘇胺酸的連接，但亦可使用5-羥脯胺酸或5-羥離胺酸。
宜藉由將胺基酸序列改變成使其含有上述三肽序列中之一 或多者來實現向抗體添加糖基化位點(對於N-連接型糖基化位點)。亦可藉由原始抗體之序列中一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基之添加或取代來進行改變(對於O-連接型糖基化位點)。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變連接於其上之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其通常藉由N鍵連接至Fc區之CH2域的根據Kabat編號之Asn297。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便產生具有某些改良特性之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有缺乏連接(直接或間接)於Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。參見例如美國專利公開案第2003/0157108號及第2004/0093621號。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體變異體相關之出版物之實例包括：US 2003/0157108；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Led 3 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US 2003/0157108)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)及Kanda等人Biotechnol.Bioeng.94(4)：680-688 (2006))。
經修飾之恆定區
在本文所提供之抗-SIRPA抗體中之任一者之一些實施例中，抗體Fc為抗體Fc同型及/或修飾。在一些實施例中，抗體Fc同型及/或修飾能夠與Fcγ受體結合。
例示性抗體Fc同型及修飾提供於下表2中。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體能夠結合Fcγ受體，具有下表2中所列之Fc同型。
Figure 108117983-A0305-02-0110-3
Figure 108117983-A0305-02-0111-4
除了表2中所述之同型之外，且不希望受到理論限制，可以認為，結合人類中之Fcg受體I、IIA、IIC、IIIA、IIIB及/或小鼠中之Fcg受體I、III及IV的具有人類IgG1或IgG3同型之抗體及其突變體(例如，Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology 2009,20：685-691)亦可用作短暫性促效劑抗體。
在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體屬於IgG類、IgM類或IgA類。在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些實施例中，抗體包含Fc區中在選自由以下組成之群 的殘基位置處的一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個或所有十三個)胺基酸取代：C127S、L234A、L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S、E345R、E430G、S440Y，以任何組合(殘基位置根據EU或Kabat編號)。在一些實施例中，Fc區包含在位置E430G處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置L243A、L235A及P331A處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置L243A、L235A、P331A處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置K322A及E430G處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置P331S及E430G處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置A330S、P331S及E430G處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置K322A、A330S及P331S處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置K322A、P331S及E430G處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置A330S、P331S及E430G處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置S267E及L328F處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置C127S處的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區包含在位置E345R、E430G及S440Y處的胺基酸取代。
在某些實施例中，結合Fcγ受體之抗體具有IgG2同型。在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體含有人類IgG2恆定區。在一些實施例中，人類IgG2恆定區包括Fc區。在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體結合抑制性Fc受體。在某些實施例中，抑制性Fc受體為抑制性Fc-γ受體IIB(FcγIIB)。在一些實施例中，Fc區含有一或多種修飾。例如，在一些實施 例中，Fc區含有一或多個胺基酸取代(例如，相對於相同同型之野生型Fc區)。在一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自V234A(Alegre等人，(1994)Transplantation 57：1537-1543.31；Xu等人，(2000)Cell Immunol,200：16-26)、G237A(Cole等人(1999)Transplantation,68：563-571)、H268Q、V309L、A330S、P331S(US 2007/0148167；Armour等人(1999)Eur J Immunol 29：2613-2624；Armour等人(2000)The Haematology Journal 1(增刊1)：27；Armour等人(2000)The Haematology Journal 1(增刊1)：27)、C232S及/或C233S(White等人(2015)Cancer Cell 27,138-148)、S267E、L328F(Chu等人，(2008)Mol Immunol,45：3926-3933)、M252Y、S254T及/或T256E，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例。
在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體具有IgG2同型，其具有含有C127S胺基酸取代之重鏈恆定域，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例(White等人，(2015)Cancer Cell 27,138-148；Lightle等人，(2010)PROTEIN SCIENCE 19：753-762；及WO2008079246)。
在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體具有IgG2同型，其具有含有C214S胺基酸取代之κ輕鏈恆定域，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例(White等人，(2015)Cancer Cell 27,138-148；Lightle等人，(2010)PROTEIN SCIENCE 19：753-762；及WO2008079246)。
在某些實施例中，結合Fcγ受體之抗體具有IgG1同型。在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體含有小鼠IgG1恆定區。在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體含有人類IgG1恆定區。在一些實施例中，人類IgG1恆定區包括Fc區。在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體結合抑制性 Fc受體。在某些實施例中，抑制性Fc受體為抑制性Fc-γ受體IIB(FcγIIB)。在一些實施例中，Fc區含有一或多種修飾。例如，在一些實施例中，Fc區含有一或多個胺基酸取代(例如，相對於相同同型之野生型Fc區)。在一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自N297A(Bolt S等人(1993)Eur J Immunol 23：403-411)、D265A(Shields等人(2001)R.J.Biol.Chem.276,6591-6604)、D270A、L234A、L235A(Hutchins等人(1995)Proc Natl Acad Sci USA,92：11980-11984；Alegre等人，(1994)Transplantation 57：1537-1543.31；Xu等人，(2000)Cell Immunol,200：16-26)、G237A(Alegre等人(1994)Transplantation 57：1537-1543.31；Xu等人(2000)Cell Immunol,200：16-26)、P238D、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、L234V、L234F、L235E(McEarchern等人，(2007)Blood,109：1185-1192)、P331S(Sazinsky等人，(2008)Proc Natl Acad Sci USA 2008,105：20167-20172)、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A及/或T394D，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例。
在一些實施例中，抗體包括IgG2同型重鏈恆定域1(CH1)及鉸鏈區(White等人，(2015)Cancer Cell 27,138-148)。在某些實施例中，IgG2同型CH1及鉸鏈區含有
Figure 108117983-A0305-02-0114-5
Figure 108117983-A0305-02-0114-6
之胺基酸序列(SEQ ID NO：58)。在一些實施例中，抗體Fc區含有S267E胺基酸取代、L328F胺基酸取代或二者，及/或 N297A或N297Q胺基酸取代，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例。
在某些實施例中，結合Fcγ受體之抗體具有IgG4同型。在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體含有人類IgG4恆定區。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包括Fc區。在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體結合抑制性Fc受體。在某些實施例中，抑制性Fc受體為抑制性Fc-γ受體IIB(FcγIIB)。在一些實施例中，Fc區含有一或多種修飾。例如，在一些實施例中，Fc區含有一或多個胺基酸取代(例如，相對於相同同型之野生型Fc區)。在一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自L235A、G237A、S228P、L236E(Reddy等人，(2000)J Immunol,164：1925-1933)、S267E、E318A、L328F、M252Y、S254T及/或T256E，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例。
在某些實施例中，結合Fcγ受體之抗體具有混合IgG2/4同型。在一些實施例中，結合Fcγ受體之抗體包括含有人類IgG2之根據EU或Kabat編號之胺基酸118至260及人類IgG4之根據EU或Kabat編號之胺基酸261-447的胺基酸序列(WO 1997/11971；WO 2007/106585)。
在某些實施例中，抗體含有小鼠IgG4恆定區(Bartholomaeus等人(2014).J.Immunol.192,2091-2098)。
在一些實施例中，Fc區進一步含有一或多個選自根據EU或Kabat編號之A330L、L234F、L235E及P331S及其任何組合的額外胺基酸取代。
在某些實施例中，抗體含有在Fc區中在選自C127S、L234A、L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、 P331S、E345R、E430G、S440Y及其任何組合之殘基位置處的一或多個胺基酸取代，其中殘基編號係根據EU或Kabat編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置E430G、L243A、L235A及P331S處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置E430G及P331S處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置E430G及K322A處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置E430G、A330S及P331S處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置E430G、K322A、A330S及P331S處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置E430G、K322A及A330S處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置E430G、K322A及P331S處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置S267E及L328F處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置C127S處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。在一些實施例中，Fc區含有在位置E345R、E430G及S440Y處的胺基酸取代，其中殘基位置之編號係根據EU編號。
在一些實施例中，結合SIRPA蛋白質之抗體可以包括降低SIRPA之細胞含量(例如，SIRPA之細胞表面含量)，抑制SIRPA及/或一或多個SIRPA配體之間的相互作用(例如，結合)，及抑制SIRPA蛋白質之一或多種活性的抗體。此類抗體藉由防止SIRPA與一或多個SIRPA配體之間的相互作用(例如，結合)或藉由防止在一或多個SIRPA配體存在下自 SIRPA之細胞外域信號轉導至細胞質中而抑制SIRPA蛋白質之一或多種活性。抗體亦可以藉由誘導SIRPA降解、SIRPA脫敏、SIRPA裂解、SIRPA內化、SIRPA脫落、SIRPA表現下調及/或SIRPA之溶酶體降解而降低SIRPA之細胞表面含量來抑制SIRPA蛋白質之一或多種活性。在一些實施例中，此類抗-SIRPA抗體可不短暫活化SIRPA。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體可以具有本發明之短暫性促效劑抗-SIRPA抗體之抗原決定基特異性，但具有不能夠結合Fcg受體且因此不能例如短暫叢集且活化SIRPA的Fc域。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體具有(但不限於)以下活性中之一或多者：降低SIRPA蛋白質與一或多種SIRPA配體之結合的能力，該等配體諸如含唾液酸之糖脂或含唾液酸之糖蛋白；降低細胞介素信號傳導(SOCS)蛋白質(例如，SOCS3蛋白質)之抑制因子與SIRPA蛋白質之結合的能力；增加SIRPA蛋白質之蛋白酶體降解的能力；降低SIRPA在循環的樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球、T細胞及/或微神經膠質細胞之表面上之功能性表現的能力；降低諸如LCK及FYN之Src家族酪胺酸激酶對Tyr-340及Tyr-358之磷酸化的能力；降低酪胺酸特異性蛋白質磷酸酶SHP1及SHP2之募集及與其結合的能力；降低PLC-g1之募集及與其結合的能力，PLC-g1充當動力蛋白-1之鳥嘌呤核苷酸交換因子；降低Crk1之募集及與其結合的能力；降低脾臟酪胺酸激酶Syk之募集及與其結合的能力；降低SH3-SH2-SH3生長因子受體結合蛋白2(Grb2)之募集及與其結合的能力；降低多種含SH2蛋白質之募集及與其結合的能力；增加細胞內鈣移動之能力；調節促炎性細胞介素IL-1β、IL-8及TNF-α之產生的能力；降低磷酸肌醇3-激酶之活化的能力；增加單核球、巨噬細胞、樹突 狀細胞、T細胞及/或微神經膠質細胞之生長的能力；增加單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞及/或微神經膠質細胞之存活的能力；增加多種細胞蛋白質上之酪胺酸磷酸化的能力；增加單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞及/或微神經膠質細胞之吞噬活性的能力；增加單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞及/或微神經膠質細胞之細胞增殖的能力；增加介導ITAM信號傳導之信號傳導分子之磷酸化的能力；增加模式識別受體之功能的能力；增加類鐸受體(Toll-like receptor)之功能的能力；增加損傷相關分子模式(DAMP)受體之功能的能力；調節C-C趨化介素受體7(CCR7)之表現的能力；及增加細胞及蛋白質碎片之清除的能力。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體具有顯示與一或多種Fcγ受體之結合降低的Fc區。此類Fc區及修飾之實例提供於下表3中。在一些實施例中，抗體具有下表3中所列之Fc同型。
在一些實施例中，與Fcγ受體之結合降低的本發明之抗-SIRPA抗體具有下表3中所列之Fc同型。
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在某些實施例中，抗-SIRPA抗體具有IgG1同型。在一些實施例中，抗體含有小鼠IgG1恆定區。在一些實施例中，抗體含有人類IgG1恆定區。在一些實施例中，人類IgG1恆定區包括Fc區。在一些實施例中，Fc區含有一或多種修飾。例如，在一些實施例中，Fc區含有一或多個胺基酸取代(例如，相對於相同同型之野生型Fc區)。
在一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自N297A、N297Q(Bolt S等人(1993)Eur J Immunol 23：403-411)、D265A、D270A、L234A、L235A(McEarchern等人，(2007)Blood,109：1185-1192)、C226S、C229S(McEarchern等人，(2007)Blood,109：1185-1192)、P238S(Davis等人，(2007)J Rheumatol,34：2204-2210)、E233P、L234V(McEarchern等人，(2007)Blood,109：1185-1192)、P238A、A327Q、A327G、P329A(Shields RL等人，(2001)J Biol Chem.276(9)：6591-604)、K322A、L234F、L235E(Hezareh等人，(2001)J Virol 75,12161-12168；Oganesyan等人，(2008).Acta Crystallographica 64,700-704)、P331S(Oganesyan等人，(2008)Acta Crystallographica 64,700-704)、T394D(Wilkinson等人(2013)MAbs 5(3)：406-417)、A330L、M252Y、S254T及/或T256E，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例。在某些實施例中，Fc區進一步包括在與根據EU或Kabat編號慣例之甘胺酸236對應的位置處的胺基酸缺失。
在一些實施例中，抗-SIRPA抗體具有IgG1同型，其中重鏈恆定區含有根據EU或Kabat編號慣例之C220S胺基酸取代。在一些實施例中，Fc區進一步含有一或多個選自根據EU或Kabat編號慣例之A330L、L234F、L235E及/或P331S之額外胺基酸取代。在某些實施例中，抗-SIRPA抗體具有IgG2同型。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體含有人類IgG2恆定區。在一些實施例中，人類IgG2恆定區包括Fc區。在一些實施例中，Fc區含有一或多種修飾。例如，在一些實施例中，Fc區含有一或多個胺基酸取代(例如，相對於相同同型之野生型Fc區)。在一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自P238S、V234A、G237A、H268A、 H268Q、H268E、V309L、N297A、N297Q、V309L、A330S、P331S、C232S、C233S、M252Y、S254T及/或T256E，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例(Vafa O.等人，(2014)Methods 65：114-126)。
在某些實施例中，抗-SIRPA抗體具有IgG4同型。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體含有人類IgG4恆定區。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包括Fc區。在一些實施例中，Fc區含有一或多種修飾。例如，在一些實施例中，Fc區含有一或多個胺基酸取代(例如，相對於相同同型之野生型Fc區)。在一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自E233P、F234V、L235A、G237A、E318A(Hutchins等人(1995)Proc Natl Acad Sci USA,92：11980-11984)、S228P、L234A/F234A、L236E、S241P、L248E(Reddy等人，(2000)J Immunol,164：1925-1933；Angal等人，(1993)Mol Immunol.30(1)：105-8；US 8614299 B2；Vafa O.等人，(2014)Methods 65：114-126)、T394D、M252Y、S254T、T256E、N297A及/或N297Q，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例。在一些實施例中，抗體具有IgG4同型，且包含在殘基位置228處的S228P胺基酸取代、在殘基位置234處的F234A胺基酸取代及在殘基位置235處的L235A胺基酸取代(殘基位置根據EU編號)。
在一些實施例中，Fc區進一步含有一或多個選自M252Y、S254T及/或T256E之額外胺基酸取代，其中胺基酸位置係根據EU或Kabat編號慣例。
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，經修飾抗體Fc為IgG1經修飾Fc。在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含一或多種修飾。例如，在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含一或多個胺基酸取代 (例如，相對於相同同型之野生型Fc區)。在一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自N297A(Bolt S等人(1993)Eur J Immunol 23：403-411)、D265A(Shields等人(2001)R.J.Biol.Chem.276,6591-6604)、L234A、L235A(Hutchins等人(1995)Proc Natl Acad Sci USA,92：11980-11984；Alegre等人，(1994)Transplantation 57：1537-1543.31；Xu等人，(2000)Cell Immunol,200：16-26)、G237A(Alegre等人(1994)Transplantation 57：1537-1543.31；Xu等人(2000)Cell Immunol,200：16-26)、C226S、C229S、E233P、L234V、L234F、L235E(McEarchern等人，(2007)Blood,109：1185-1192)、P331S(Sazinsky等人，(2008)Proc Natl Acad Sci USA 2008,105：20167-20172)、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T及/或T256E，其中胺基酸位置係根據EU編號慣例。
在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之N297A突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之D265A及N297A突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之D270A突變。在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含根據EU編號之L234A及L235A突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之L234A及G237A突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之L234A、L235A及G237A突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、L328E、E233、G237D、H268D、P271G及A330R突變中之一或多者(包括全部)。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之S267E/L328F突變中之一或多 者。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G及A330R突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、L328E、G237D、H268D、P271G及A330R突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、S267E、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G及A330R突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、S267E、L328E、G237D、H268D、P271G及A330R突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之C226S、C229S、E233P、L234V及L235A突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之L234F、L235E及P331S突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之S267E及L328F突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之S267E突變。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含將IgG1之恆定重鏈1(CH1)及鉸鏈區以含κ輕鏈之IgG2之CH1及鉸鏈區(根據EU編號，IgG2之胺基酸118-230)取代。
在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包括兩個或更多個胺基酸取代，與具有不包括兩個或更多個胺基酸取代之Fc區的相應抗體相比，該等胺基酸取代增加抗體叢集而不活化補體。因此，在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，IgG1經修飾Fc為包含Fc區之抗體，其中該抗體包含在位置E430G處的胺基酸取代及一或多個在Fc區中在選自以下之殘基位置處的胺基酸取代：L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S及其任何組合，根據EU編號。 在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含在根據EU編號之位置E430G、L243A、L235A及P331S處的胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含在根據EU編號之位置E430G及P331S處的胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含在根據EU編號之位置E430G及K322A處的胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含在根據EU編號之位置E430G、A330S及P331S處的胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含在根據EU編號之位置E430G、K322A、A330S及P331S處的胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含在根據EU編號之位置E430G、K322A及A330S處的胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1經修飾Fc包含在根據EU編號之位置E430G、K322A及P331S處的胺基酸取代。
在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，IgG1經修飾Fc在本文中可以進一步包含可以與根據EU編號慣例之A330L突變(Lazar等人Proc Natl Acad Sci USA,103：4005-4010(2006))、或L234F、L235E及/或P331S突變中之一或多者(Sazinsky等人Proc Natl Acad Sci USA,105：20167-20172(2008))組合，以消除補體活化。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，IgG1經修飾Fc可以進一步包含根據EU編號之A330L、A330S、L234F、L235E及/或P331S中之一或多者。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，IgG1經修飾Fc可以進一步包含一或多個突變以增強人類血清中之抗體半衰期(例如，根據EU編號慣例之M252Y、S254T及T256E突變中之一或多者(包括全部))。在IgG1經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，IgG1經修飾Fc可以進一步包含根據EU編號之E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、 E345Y、S440Y及/或S440W中之一或多者。
本發明之其他態樣係關於具有經修飾恆定區(亦即，Fc區)之抗體。依賴於與FcgR受體之結合而活化所靶向受體之抗體若經工程化以消除FcgR結合，則會失去其促效劑活性(參見例如Wilson等人Cancer Cell 19：101-113(2011)；Armour等人Immunology 40：585-593(2003)；及White等人Cancer Cell 27：138-148(2015))。因此，可以認為，當具有恰當的抗原決定基特異性的本發明之抗-SIRPA抗體具有來自人類IgG2同型之Fc域(CH1及鉸鏈區)或另一類型之能夠優先結合抑制性FcgRIIB r受體之Fc域或其變體時，該抗體可以活化目標抗原，具有最小的副作用。
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，經修飾抗體Fc為IgG2經修飾Fc。在一些實施例中，IgG2經修飾Fc包含一或多種修飾。例如，在一些實施例中，IgG2經修飾Fc包含一或多個胺基酸取代(例如，相對於相同同型之野生型Fc區)。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自根據EU編號慣例之V234A(Alegre等人Transplantation 57：1537-1543(1994)；Xu等人Cell Immunol,200：16-26(2000))；G237A(Cole等人Transplantation,68：563-571(1999))；H268Q、V309L、A330S、P331S(US 2007/0148167；Armour等人Eur J Immunol 29：2613-2624(1999)；Armour等人The Haematology Journal 1(增刊1)：27(2000)；Armour等人The Haematology Journal 1(增刊1)：27(2000))、C219S及/或C220S(White等人Cancer Cell 27,138-148(2015))；S267E、L328F(Chu等人Mol Immunol,45：3926-3933(2008))；及M252Y、S254T及/或T256E。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位 置V234A及G237A處的胺基酸取代。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置C219S或C220S處的胺基酸取代。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置A330S及P331S處的胺基酸取代。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置S267E及L328F處的胺基酸取代。
在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號慣例之C127S胺基酸取代(White等人，(2015)Cancer Cell 27,138-148；Lightle等人Protein Sci.19：753-762(2010)；及WO 2008/079246)。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，該抗體具有IgG2同型，其中κ輕鏈恆定域包含根據EU編號慣例之C214S胺基酸取代(White等人Cancer Cell 27：138-148(2015)；Lightle等人Protein Sci.19：753-762(2010)；及WO 2008/079246)。
在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號慣例之C220S胺基酸取代。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，抗體具有IgG2同型，其中κ輕鏈恆定域包含根據EU編號慣例之C214S胺基酸取代。
在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號慣例之C219S胺基酸取代。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，抗體具有IgG2同型，其中κ輕鏈恆定域包含根據EU編號慣例之C214S胺基酸取代。
在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包括IgG2同型重鏈恆定域1(CH1)及鉸鏈區(White等人Cancer Cell 27：138-148 (2015))。在IgG2經修飾Fc中之任一者之某些實施例中，IgG2同型CH1及鉸鏈區包含根據EU編號118-230之胺基酸序列。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，抗體Fc區包含根據EU編號慣例之S267E胺基酸取代、L328F胺基酸取代或二者，及/或N297A或N297Q胺基酸取代。
在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc進一步包含在根據EU編號之位置E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y及S440W處的一或多個胺基酸取代。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc可以進一步包含一或多個突變以增強人類血清中之抗體半衰期(例如，根據EU編號慣例之M252Y、S254T及T256E突變中之一或多者(包括全部))。在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc可以進一步包含A330S及P331S。
在IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc為IgG2/4混合Fc。在一些實施例中，IgG2/4混合Fc包含IgG2 aa 118至260及IgG4 aa 261至447。在任何IgG2經修飾Fc之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置H268Q、V309L、A330S及P331S處的一或多個胺基酸取代。
在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含一或多個選自根據EU編號之A330L、L234F、L235E或P331S及其任何組合的額外胺基酸取代。
在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之某些實施例中，Fc包含在選自根據EU編號之C127S、L234A、L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S、E345R、E430G、S440Y及其任何組合之殘基位置處的一或多個胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G、 L243A、L235A及P331S處的胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G及P331S處的胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G及K322A處的胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G、A330S及P331S處的胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G、K322A、A330S及P331S處的胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G、K322A及A330S處的胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G、K322A及P331S處的胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置S267E及L328F處的胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置C127S處的胺基酸取代。在IgG1及/或IgG2經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E345R、E430G及S440Y處的胺基酸取代。
在本文所提供之抗體中之任一者之一些實施例中，經修飾抗體Fc為IgG4經修飾Fc。在一些實施例中，IgG4經修飾Fc包含一或多種修飾。例如，在一些實施例中，IgG4經修飾Fc包含一或多個胺基酸取代(例如，相對於相同同型之野生型Fc區)。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自根據EU編號慣例之L235A、G237A、S229P、L236E(Reddy等人J Immunol 164：1925- 1933(2000))、S267E、E318A、L328F、M252Y、S254T及/或T256E。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc可以進一步包含根據EU編號慣例之L235A、G237A及E318A。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc可以進一步包含根據EU編號慣例之S228P及L235E。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，IgG4經修飾Fc可以進一步包含根據EU編號慣例之S267E及L328F。
在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，IgG4經修飾Fc包含可以與根據EU編號慣例之S228P突變(Angal等人Mol Immunol.30：105-108(1993))及/或與(Peters等人J Biol Chem.287(29)：24525-33(2012))中所述之一或多個突變組合以增強抗體穩定化。
在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，IgG4經修飾Fc可以進一步包含一或多個突變以增強人類血清中之抗體半衰期(例如，根據EU編號慣例之M252Y、S254T及T256E突變中之一或多者(包括全部))。
在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之L235E。在IgG4經修飾Fc中之任一者之某些實施例中，Fc包含在選自根據EU編號之C127S、F234A、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、E345R、E430G、S440Y及其任何組合之殘基位置處的一或多個胺基酸取代。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G、L243A、L235A及P331S處的胺基酸取代。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G及P331S處的胺基酸取代。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430G及K322A處的胺基酸取 代。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E430處的胺基酸取代。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc區包含在根據EU編號之位置E430G及K322A處的胺基酸取代。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置S267E及L328F處的胺基酸取代。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置C127S處的胺基酸取代。在IgG4經修飾Fc中之任一者之一些實施例中，Fc包含在根據EU編號之位置E345R、E430G及S440Y處的胺基酸取代。
其他抗體修飾
在抗體中之任一者之一些實施例中，抗體為衍生物。術語「衍生物」係指包括除胺基酸(或核酸)之插入、缺失或取代外之化學修飾的分子。在某些實施例中，衍生物包含共價修飾，包括(但不限於)與聚合物、脂質或其他有機或無機部分化學鍵結。在某些實施例中，經化學修飾之抗原結合蛋白可以具有比未經化學修飾之抗原結合蛋白更大的循環半衰期。在某些實施例中，經化學修飾之抗原結合蛋白可以具有針對所要細胞、組織及/或器官之改善的靶向能力。在一些實施例中，衍生的抗原結合蛋白經共價修飾以包括一或多個水溶性聚合物連接，包括(但不限於)聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。參見例如美國專利第4640835號、第4496689號、第4301144號、第4670417號、第4791192號及第4179337號。在某些實施例中，衍生的抗原結合蛋白包含一或多種聚合物，包括(但不限於)單甲氧基-聚乙二醇、聚葡萄糖、纖維素、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、聚 -(N-乙烯基吡咯啶酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)及聚乙烯醇、以及此類聚合物之混合物。
在某些實施例中，衍生物經聚乙二醇(PEG)次單元共價修飾。在某些實施例中，一或多個水溶性聚合物鍵結在衍生物之一或多個特定位置，例如胺基端。在某些實施例中，一或多個水溶性聚合物無規連接至衍生物之一或多個側鏈。在某些實施例中，使用PEG來改善抗原結合蛋白之治療能力。在某些實施例中，使用PEG來改善人類化抗體之治療能力。某些此類方法論述於例如美國專利第6133426號中，其出於任何目的以引用之方式併入本文中。
肽類似物常用於醫學行業作為非肽藥物，且性質類似於模板肽之性質。此等類型之非肽化合物稱為「肽模擬物(peptide mimetic)」或「肽模擬物(peptidomimetic)」。Fauchere,J.Adv.Drug Res.,15：29(1986)；及Evans等人J.Med.Chem.,30：1229(1987)，其出於任何目的以引用之方式併入本文中。此類化合物通常藉助於電腦化分子模型化來研發。在結構上類似於治療上適用之肽之肽模擬物可用於產生類似治療或預防作用。通常，肽模擬物在結構上類似於範例多肽(亦即，具有生物化學特性或藥理學活性之多肽)，諸如人類抗體，但具有一或多個視情況藉由此項技術中熟知之方法經選自以下之鍵置換的肽鍵：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(順式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。在某些實施例中，可使用以相同類型之D-胺基酸(例如，D-離胺酸而非L-離胺酸)系統性取代共同序列之一或多個胺基酸而產生更穩定的肽。另外，可藉由此項技術中已知之方法(Rizo及Gierasch Ann.Rev. Biochem.,61：387(1992)，出於任何目的以引用之方式併入本文中)；例如，藉由添加能夠形成使肽環化之分子內二硫橋鍵的內部半胱胺酸殘基，產生包含共同序列或實質上相同的共同序列變體的限制性肽。
藥物結合涉及生物活性細胞毒性(抗癌)酬載或藥物與特異性靶向某些腫瘤標記物(例如，理想地，僅在腫瘤細胞中或腫瘤細胞上發現的多肽)之抗體的偶合。抗體在體內一路追蹤此等蛋白質且將自身與癌細胞表面連接。抗體與目標蛋白質(抗原)之間的生物化學反應觸發腫瘤細胞中之信號，隨後腫瘤細胞吸收或內化抗體以及細胞毒素。在ADC內化之後，細胞毒性藥物釋放出來且殺死癌症。由於此靶向，理想地，藥物具有比其他化學治療劑更低的副作用且給出更寬的治療窗。結合抗體之技術為此項技術中已揭示的或已知的(參見例如Jane de Lartigue OncLive 2012年7月5日；ADC Review on antibody-drug conjugates；及Ducry等人Bioconjugate Chemistry 21(1)：5-13(2010))。
抗體構架
本文所述之抗-SIRPA抗體中之任一者進一步包括構架(FR)。在一些實施例中，構架為人類免疫球蛋白構架。例如，在一些實施例中，抗體(例如，抗-SIRPA抗體)包含如任何以上實施例中之HVR且進一步包含接受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。人類免疫球蛋白構架可為人類抗體之一部分，或可以藉由用人類構架區置換一或多個內源性構架而使非人類抗體人類化。可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」法選擇之構架區(參見例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；衍生自具有輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter等人Proc.Natl.Acad. Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及衍生自篩選FR庫之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含重鏈可變區，其包含一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個、三個或更多個或所有四個)選自VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4(如表9中所示)之構架區。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含含有VH FR1之重鏈可變區，其中VH FR1包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含含有VH FR2之重鏈可變區，其中VH FR2包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含含有VH FR3之重鏈可變區，其中VH FR3包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含含有VH FR4之重鏈可變區，其中VH FR4包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含重鏈可變區，其包含含有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VH FR1、含有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VH FR2、含有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的VH FR3及含有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的VH FR4。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含重鏈可變區，其包含抗-SIRPA抗體3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、 3F9-22、3F9-23、3F9-24或3F9-25之VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含輕鏈可變區，其包含一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個、三個或更多個或所有四個)選自VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4(如表9中所示)之構架區。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含含有VL FR1之輕鏈可變區，其中VL FR1包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含含有VL FR2之輕鏈可變區，其中VL FR2包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含含有VL FR3之輕鏈可變區，其中VL FR3包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含含有VL FR4之輕鏈可變區，其中VL FR4包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含輕鏈可變區，其包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的VL FR1、含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的VL FR2、含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VL FR3及含有SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL FR4。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含輕鏈可變區，其包含抗-SIRPA抗體3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24或3F9-25之VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含重鏈可變 區，其包含含有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VH FR1、含有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VH FR2、含有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的VH FR3及含有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的VH FR4；及輕鏈可變區，其包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的VL FR1、含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的VL FR2、含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VL FR3及含有SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL FR4。在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體包含重鏈可變區，其包含抗體3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24或3F9-25之VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4；及輕鏈可變區，其包含抗體3F9-1、3F9-2、3F9-3、3F9-4、3F9-5、3F9-6、3F9-7、3F9-8、3F9-9、3F9-10、3F9-11、3F9-12、3F9-13、3F9-14、3F9-15、3F9-16、3F9-17、3F9-18、3F9-19、3F9-20、3F9-21、3F9-22、3F9-23、3F9-24或3F9-25之VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4。
在一些實施例中，本發明提供一種抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列且輕鏈 包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗-SIRPA抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
核酸、載體及宿主細胞
本發明之抗-SIRPA抗體可以使用重組方法及組合物產生，例如如美國專利第4816567號中所述。在一些實施例中，提供具有編碼本發明之抗-SIRPA抗體中之任一者的核苷酸序列的經分離核酸。此類核酸可以編碼包含抗-SIRPA抗體之VL之胺基酸序列及/或包含其VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一些實施例中，提供一或多種包含此類核酸之載體(例如，表現載體)。在一些實施例中，亦提供包含此類核酸之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含(例如，已經以下轉導)：(1)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列的核酸的載體；或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列的核酸的第一載體及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列的核酸的第二載體。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。本發明之宿主細胞亦包括(但不限於)經分離細胞、活體外培養細胞及離體培養細胞。
提供本發明之抗-SIRPA抗體之製造方法。在一些實施例中，該方法包括在適合於表現該抗體之條件下培養包含編碼抗-SIRPA抗 體之核酸的本發明之宿主細胞。在一些實施例中，隨後自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
對於本發明之抗-SIRPA抗體之重組產生，將編碼抗-SIRPA抗體之核酸分離且插入一或多個載體中，以便在宿主細胞中進行進一步選殖及/或表現。此類核酸可以使用習知程序容易地分離及定序(例如，藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。
本文所述之包含編碼本發明之抗-SIRPA抗體或其細胞表面表現片段或多肽(包括抗體)中之任一者的核酸序列的適合載體包括(但不限於)選殖載體及表現載體。適合選殖載體可根據標準技術構築，或可選自大量在此項技術中可供使用之選殖載體。雖然所選擇之選殖載體可以根據意欲使用之宿主細胞而變化，但是適用的選殖載體通常具有自我複製能力，可具有針對特定限制性核酸內切酶之單一目標，及/或可攜帶可用於選擇包含載體之純系的標記物的基因。適合實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體(shuttle vector)，諸如pSA3及pAT28。此等及許多其他選殖載體可購自諸如BioRad、Strategene及Invitrogen之商業供應商。
適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括原核或真核細胞。例如，本發明之抗-SIRPA抗體可以在細菌中產生，特別是當不需要糖基化及Fc效應功能時。對於抗體片段及多肽在細菌中之表現，例如，美國專利第5648237號、第5789199號及第5840523號。在表現之後，抗體可以可溶性級分自細菌細胞糊狀物分離且可經進一步純化。
除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦為 適合抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已經「人類化」之真菌及酵母株，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態的抗體(例如，Gerngross Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)；及Li等人Nat.Biotech.24：210-215(2006))。
適合表現糖基化抗體之宿主細胞亦可衍生自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可以用作宿主(例如，美國專利第5959177號、第6040498號、第6420548號、第7125978號及第6417429號，描述用於在基因轉殖植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。例如，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉形之猴腎CV1株(COS-7)；人類胚腎株(293或293細胞，如例如在Graham等人J.Gen Virol.36：59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，如例如在Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如在Mather等人Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞 株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適合於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
醫藥組合物/調配物
本文中提供醫藥組合物及/或醫藥調配物，其包含本發明之抗-SIRPA抗體及醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之載劑較佳在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒。本文所述之抗體可以調配成呈固體、半固體、液體或氣體形式的製劑。此類調配物之實例包括(但不限於)錠劑、膠囊、散劑、顆粒劑、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體及氣霧劑。視所要調配物而定，醫藥學上可接受之載劑可以包括稀釋劑之醫藥學上可接受之無毒載劑，其為常用於調配用於動物或人類投與之醫藥組合物的媒劑。在某些實施例中，醫藥組合物可包含用於修飾、維持或保持組合物之例如pH、容積莫耳滲透濃度(osmolarity)、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透的調配物材料。
在某些實施例中，醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗菌劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；膨化劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣；雙醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸 如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯苄烷銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如普洛尼克(pluronics)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、曲拉通(triton)、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物，較佳氯化鈉或氯化鉀、甘露糖醇、山梨糖醇)；遞送媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。適合各種類型之投與的調配物之其他實例可見於Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Pharmaceutical Press第22版(2013)中。關於藥物遞送方法之簡要綜述，參見Langer,Science 249：1527-1533(1990)。
適合非經腸投與之調配物包括可包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者之血液等張之溶質的水性及非水性等張無菌注射溶液；及可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑之水性及非水性無菌懸浮液。
調配物可經最佳化以在腦或中樞神經系統中保持及穩定化。當將藥劑投與至顱區室中時，需要將藥劑保留在該區室中，且不擴散或以其他方式跨越血腦障壁。穩定化技術包括交聯、多聚化或與諸如聚乙二醇、聚丙烯醯胺、中性蛋白質載劑等基團連接以便達成分子量之增加。
用於增加保持力之其他策略包括將抗體，諸如本發明之抗- SIRPA抗體包埋在生物可降解的或生物可侵蝕性植入物中。治療活性劑之釋放速率由經由聚合物基質之轉運速率及植入物之生物降解速率來控制。植入物可為顆粒、片材、貼片、斑塊、纖維、微膠囊及類似物且可具有與所選擇之插入部位相容的任何大小或形狀。可採用的生物可降解的聚合物組合物可為有機酯或醚，其在降解時產生生理學上可接受的降解產物，包括單體。可以使用酸酐、醯胺、原酸酯或類似物本身或將其與其他單體組合使用。聚合物將為縮合聚合物。聚合物可為交聯的或非交聯的。特別令人感興趣的是羥基脂族羧酸之聚合物，可為均聚物或共聚物，及多醣。在感興趣的聚酯中包括D-乳酸、L-乳酸、外消旋乳酸、乙醇酸、聚己酸內酯及其組合之聚合物。感興趣的多醣為海藻酸鈣及功能化纖維素，特別是羧甲基纖維素酯，其特徵在於水不溶性、分子量約5kD至500kD等。在本發明之植入物中亦可採用生物可降解的水凝膠。水凝膠通常為共聚物材料，其特徵在於吸收液體之能力。
治療用途
如本文中所揭示，本發明之抗-SIRPA抗體可用於預防、降低風險或治療疾病及病症。
在本發明之一個態樣中，下調SIRPA之藥劑，例如抗-SIRPA抗體，係用作治療劑。投與此類試劑以治療、減輕及/或預防個體中與SIRPA表現、活性及/或信號傳導有關的疾病或病理。治療方案係藉由使用標準方法鑑定患有(或具有患上的風險)與SIRPA表現、活性及/或信號傳導有關的疾病或病症(例如癌症或其他贅生性病)之個體(例如人類患者)而進行。在一些實施例中，具有與SIRPA表現、活性及/或信號傳導有關之病理的細胞表現SIRPA配體，例如CD47。在一些實施例中，具有與 SIRPA表現、活性及/或信號傳導有關之病理的細胞表現SIRPA。
如下文進一步詳述，下調SIRPA之藥劑，例如抗-SIRPA抗體，可與用於治療與SIRPA表現、活性或信號傳導有關之疾病或病理的額外治療劑組合使用。術語「組合」及「聯合」在本發明中可互換使用。與抗-SIRPA抗體組合投與之額外治療劑可在下調SIRPA之藥劑，例如抗-SIRPA抗體之前、在此之後或與此同時投與。
在本發明之一個態樣中，向人類個體投與抗-SIRPA抗體製劑，其例如包含降低SIRPA在細胞表面上之表現，但不實質上阻斷配體(例如CD47)與SIRPA之結合的抗-SIRPA抗體。該抗體之投與可以消除或抑制或干擾SIRPA之由配體結合(例如CD47結合)介導之表現、活性及/或信號傳導功能。
在一個實施例中，與SIRPA表現有關之疾病或病症為癌症。在一些實施例中，向具有表現SIRPA之癌症，諸如骨髓細胞之血液學增生性病症的患者投與抗-SIRPA抗體。在典型實施例中，向具有表現CD47之癌症的患者投與抗-SIRPA抗體。
在某些實施例中，待藉由本發明方法預防或治療之癌症包括(但不限於)鱗狀細胞癌(例如，上皮鱗狀細胞癌)、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、肺鱗狀癌、非鱗狀NSCLC、神經膠質瘤、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌(gastric cancer/stomach cancer)，包括胃腸癌及胃腸基質癌、腎癌(例如，透明細胞癌)、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌(例如，腎細胞癌(RCC))、前列腺癌(例如，激素難治性前列腺腺癌)、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、神經膠母細胞瘤(多形性神經膠母細胞瘤)、子宮頸癌、胃 癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌及頭頸癌(或癌瘤)、胃癌、生殖細胞腫瘤、小兒肉瘤、鼻腔鼻竇自然殺手、黑色素瘤(例如，轉移性惡性黑色素瘤，諸如皮膚或眼球內惡性黑色素瘤)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門區癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體腫瘤、輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、骨髓發育不良症候群、結腸直腸贅瘤、實體腫瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤；環境誘發之癌症，包括由石棉誘發之癌症；病毒相關癌症(例如，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)相關腫瘤)；及衍生自兩個主要血球譜系中之任一者的血液科惡性疾病，這兩個主要血球譜系亦即骨髓細胞株(其產生顆粒球、紅血球、血小板、巨噬細胞及肥大細胞)或淋巴細胞株(其產生B、T、NK及漿細胞)，該等疾病諸如所有類型之白血病、淋巴瘤及骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴球性及/或骨髓性白血病，諸如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化的AML(M0)、骨髓母細胞白血病(M1)、骨髓母細胞白血病(M2；細胞成熟)、前髓細胞性白血病(M3或M3變異體[M3V])、骨髓單核細胞性白血病(M4或伴隨嗜伊紅血球增多症之M4變異體[M4E])、單核細胞性白血病(M5)、紅白血病(M6)、巨核母細胞白血病(M7)、分離顆粒球性肉瘤及綠色瘤；淋巴瘤，諸如霍奇金氏淋巴瘤(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、惰性淋巴瘤、大B細胞彌漫性淋巴瘤、B細胞血液科惡性疾病(例如B細胞淋巴瘤)、T細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、單核細胞樣 B細胞淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤、多形性(例如，Ki 1+)大細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤/白血病、套細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、腸T細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、前驅T淋巴母細胞淋巴瘤、T淋巴母細胞；及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、周邊T細胞淋巴瘤、淋巴母細胞淋巴瘤、移植後淋巴增生性病症、真組織細胞性淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴母細胞淋巴瘤(LBL)、淋巴譜系之造血腫瘤、急性淋巴母細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)(包括原發性難治性DLBCL患者、利妥昔單抗(Rituximab)難治性、利妥昔單抗/CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及強的松(prednisone))難治性、復發性或難治性(R/R)DLBCL及/或CAR-T不合格的DLBCL患者)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、濾泡性淋巴瘤、彌漫性組織細胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前驅B淋巴母細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTLC)(亦稱為蕈樣黴菌病或塞紮萊症候群(Sezary syndrome))及伴隨瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)之淋巴漿細胞淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，諸如IgG骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、和緩性骨髓瘤(亦稱為惰性骨髓瘤)、孤立性漿細胞瘤及多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞淋巴瘤；骨髓譜系之造血腫瘤、間葉細胞源性腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；精原細胞瘤、畸胎上皮癌、中樞及周邊神經腫瘤，包括星形細胞瘤、神經鞘瘤(schwannomas)；間葉細胞源性腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡性癌症及畸胎上皮癌、淋巴譜系之造血腫瘤，例如T細胞及B細胞腫瘤，包括(但不限於) T細胞病症，諸如T前淋巴球性白血病(T-PLL)，包括小細胞及腦狀細胞類型之病症；較佳T細胞類型之大顆粒淋巴細胞白血病(LGL)；a/d T-NHL七葉性淋巴瘤；周邊/胸腺後T細胞淋巴瘤(多形性及免疫母細胞亞型)；血管中心性(鼻)T細胞淋巴瘤；頭部或頸部之癌症、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌；急性骨髓淋巴瘤，以及該等癌症之任何組合。本發明之抗-SIRPA抗體亦可用於治療轉移癌。
在一些實施例中，癌症係選自肉瘤、膀胱癌、腦癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、腎盂癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌及纖維肉瘤。在一些實施例中，乳癌為三陰性乳癌。在一些實施例中，癌症可為早期癌症或晚期癌症。在一些實施例中，腦癌可為原發性腫瘤。在一些實施例中，癌症可為在以上類型之癌症中之任一者所衍生的第二位點處的轉移性腫瘤。
在一些實施例中，癌症係選自多形性神經膠母細胞瘤；腎透明細胞癌；腎上腺皮質癌；膀胱尿道上皮癌；彌漫性大B細胞淋巴瘤；肺腺癌；胰臟腺癌、腎細胞癌、非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓白血病(CML)、多發性骨髓瘤、乳房侵襲性癌、子宮頸鱗狀細胞癌、子宮頸內腺癌、膽管癌、結腸腺癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腎難染細胞、腎乳頭狀細胞癌、較低級別神經膠質瘤、肝細胞癌、肺鱗狀細胞癌、間皮瘤、卵巢漿液性囊腺癌、胰臟腺癌、嗜鉻細胞瘤及副神經節瘤、前列腺腺癌、直腸腺癌、皮膚黑色素瘤、胃腺癌、睪丸生殖細胞腫瘤、甲狀腺癌、胸腺瘤、子宮體子宮內膜癌、子宮癌肉瘤及葡萄膜黑色素瘤。
在一些實施例中，本發明提供為患有癌症之個體預防、降低風險或治療的方法，其中該個體難以用檢查點抑制劑療法治療，該等方法係藉由向個體投與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體。
在一些實施例中，本發明提供為患有癌症之個體預防、降低風險或治療的方法，該等方法係藉由向個體投與治療有效量之本發明之抗-SIRPA抗體。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體可聯合充當檢查點抑制劑之治療劑投與。在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與至少一種與抑制性免疫檢查點分子特異性結合之抗體及/或另一標準或研究用抗癌療法。在一些實施例中，抑制性檢查點分子係選自PD1、PDL1、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、CTLA4、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HVEM、LIGHT、BTLA、CD30、TIGIT、VISTA、KIR、GAL9、TIM1、TIM3、TIM4、A2AR、LAG3、DR-5、CD2、CD5、CD39及CD73。在典型實施例中，治療劑為針對選自以下之檢查點抑制劑之抗體：D1、PDL1、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、CTLA4、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HVEM、LIGHT、BTLA、CD30、TIGIT、VISTA、KIR、GAL9、TIM1、TIM3、TIM4、A2AR、LAG3、DR-5、CD2、CD5、CD39或CD73。在一些實施例中，該至少一種與抑制性檢查點分子特異性結合之抗體係與本發明之抗-SIRPA抗體組合投與。在一些實施例中，針對檢查點抑制劑之抗體之組合係聯合本發明之抗-SIRPA抗體投與。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體可聯合至少一種與刺激性檢查點蛋白特異性結合之促效性抗體投與，該至少一種促效性抗 體例如促效劑抗-CD40抗體、促效劑抗-OX40抗體、促效劑抗-ICOS抗體、促效劑抗-CD28抗體、促效性抗-TREM1抗體、促效性抗-TREM2抗體、促效劑抗-CD137/4-1BB抗體、促效劑抗-CD27抗體、促效劑抗糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白GITR抗體、促效劑抗-CD30抗體、促效劑抗-BTLA抗體、促效劑抗-HVEM抗體、促效劑抗-CD2抗體、促效劑抗-CD5抗體及其任何組合。
在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與至少一種與抑制性免疫檢查點分子特異性結合之抗體及/或另一標準或研究用抗癌療法。在一些實施例中，該至少一種與抑制性檢查點分子特異性結合之抗體係與本發明之抗-SIRPA抗體組合投與。在一些實施例中，該至少一種與抑制性檢查點分子特異性結合之抗體係選自抗-PD-L1抗體、抗-CTLA4抗體、抗-PD-L2抗體、抗-PD-1抗體、抗-B7-H3抗體、抗-B7-H4抗體及抗-HVEM抗體、抗-B-及T-淋巴細胞弱化因子(BTLA)抗體、抗殺手細胞抑制性受體(KIR)抗體、抗-GAL9抗體、抗-TIM3抗體、抗-A2AR抗體、抗-LAG-3抗體、抗磷脂醯絲胺酸抗體、抗-CD27抗體及其任何組合。在一些實施例中，標準或研究用抗癌療法為一或多種選自放射線療法、細胞毒性化學療法、靶向療法、伊馬替尼(Gleevec®)、曲妥珠單抗(Herceptin®)、過繼性細胞轉移(ACT)、嵌合抗原受體T細胞轉移(CAR-T)、疫苗療法及細胞介素療法之療法。在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與至少一種與抑制性細胞介素特異性結合之抗體。在一些實施例中，該至少一種與抑制性細胞介素特異性結合之抗體係與本發明之抗-SIRPA抗體組合投與。在一些實施例中，該至少一種與抑制性細胞介素特異性結合之抗體係選自抗-CCL2抗體、抗-CSF-1抗體、抗-IL-2抗體及其 任何組合。
在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與至少一種與刺激性免疫檢查點蛋白特異性結合之促效性抗體。在一些實施例中，該至少一種與刺激性檢查點蛋白特異性結合之促效性抗體係與本發明之抗-SIRPA抗體組合投與。在一些實施例中，該至少一種與刺激性檢查點蛋白特異性結合之促效性抗體係選自促效劑抗-CD40抗體、促效劑抗-OX40抗體、促效劑抗-ICOS抗體、促效劑抗-CD28抗體、促效劑抗-CD137/4-1BB抗體、促效劑抗-CD27抗體、促效劑抗糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白GITR抗體及其任何組合。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體係與放射線療法及/或化學治療劑組合投與。化學治療劑包括例如下組：抗代謝物/抗癌劑，諸如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他濱、吉西他濱及阿糖胞苷)及嘌呤類似物、葉酸鹽拮抗劑及相關抑制劑(甲胺喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他汀(pentostatin)及2-氯去氧腺苷(克拉屈濱(cladribine)))；抗增殖/抗有絲分裂劑，包括天然產物，諸如長春花屬生物鹼(長春鹼、長春新鹼及長春瑞濱(vinorelbine))、微管破裂劑，諸如紫杉烷(太平洋紫杉醇、多西他賽)、長春新鹼、長春鹼、諾考達唑(nocodazole)、埃博黴素(epothilones)、艾日布林(eribulin)及溫諾平(navelbine)；表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxin)(依託泊苷、替尼泊苷(teniposide))；DNA損傷劑(放線菌素、安吖啶(amsacrine)、蒽環黴素、博來黴素(bleomycin)、白消安(busulfan)、喜樹鹼(camptothecin)、卡鉑、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、順鉑、環磷醯胺、Cytoxan、放線菌素d、道諾黴素、小紅莓、表柔比星、六甲基三聚氰胺 奧沙利鉑(hexamethylmelamineoxaliplatin)、異環磷醯胺(iphosphamide)、美法侖(melphalan)、甲基二(氯乙基)胺(merchlorehtamine)、絲裂黴素、米托蒽醌(mitoxantrone)、亞硝基脲(nitrosourea)、普卡黴素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇、紫杉德(taxotere)、替莫唑胺(temozolamide)、替尼泊苷、三伸乙基硫代磷醯胺及依託泊苷(VP16))；DNA甲基轉移酶抑制劑(氮雜胞苷)；抗生素，諸如放線菌素d(放線菌素D)、道諾黴素、小紅莓(阿德力黴素(adriamycin))、伊達比星(idarubicin)、蒽環黴素、米托蒽醌、博來黴素、普卡黴素(光神黴素(mithramycin))及絲裂黴素；酶(L-天冬醯胺酶，其全身性代謝L-天冬醯胺並剝奪不具有合成其自身天冬醯胺之能力的細胞)；抗血小板劑；抗增殖/抗有絲分裂烷基化劑，諸如氮芥(甲基二(氯乙基)胺、環磷醯胺及類似物、美法侖、氯芥苯丁酸)、乙烯亞胺及甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺及噻替派(thiotepa))、烷基磺酸鹽(白消安)、亞硝基脲(卡莫司汀(carmustine)(BCNU)及類似物、鏈佐黴素(streptozocin))、三氮烯(達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC))；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物，諸如葉酸類似物(甲胺喋呤)；鉑配位錯合物(順鉑、卡鉑)、丙卡巴肼、羥基脲、米托坦(mitotane)、胺魯米特(aminoglutethimide)；激素、激素類似物(雌激素、他莫昔芬(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、比卡魯胺(bicalutamide)、尼魯米特(nilutamide))及芳香酶抑制劑(來曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole))；抗凝血劑(肝素、合成肝素鹽及凝血酶之其他抑制劑)；纖維蛋白溶解劑(諸如組織纖維蛋白溶酶原活化因子、鏈球菌激酶及尿激酶)、阿司匹靈(aspirin)、雙嘧達莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔單抗(abciximab)；抗 遷移劑；抗分泌劑(布瑞汀(breveldin))；免疫抑制劑(環孢靈(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil))；抗血管生成化合物(TNP470、金雀異黃酮(genistein)、泊馬度胺(pomalidomide))及生長因子抑制劑(血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑，諸如ziv-阿柏西普(aflibercept)；纖維母細胞生長因子(FGF)抑制劑)；細胞凋亡蛋白質(IAP)拮抗劑之抑制劑(比林納潘特(birinapant))；組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑(伏立諾他(vorinostat)、羅米地辛(romidepsin)、西達本胺(chidamide)、帕比司他(panobinostat)、莫塞諾他(mocetinostat)、阿貝司他(abexinostat)、貝林諾他(belinostat)、恩替諾特(entinostat)、雷米諾他(resminostat)、吉韋諾他(givinostat)、奎西諾他(quisinostat)、SB939)；蛋白酶體抑制劑(依薩佐米(ixazomib))；血管收縮素受體阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體(曲妥珠單抗、帕尼單抗(panitumumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、阿達木單抗(adalimumab)、戈利木單抗(golimumab)、英利昔單抗(infliximab)、利妥昔單抗、奧克珠單抗(ocrelizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿昔單抗、阿利珠單抗(atlizumab)、達利珠單抗(daclizumab)、地諾單抗(denosumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、羅維珠單抗(rovelizumab)、魯利單抗(ruplizumab)、優特克單抗(ustekinumab)、維西珠單抗(visilizumab)、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、布倫妥昔單抗維多汀(brentuximb vedotin))；嵌合抗原受體；細胞週期抑 制劑(夫拉平度(flavopiridol)、羅斯維汀(roscovitine)、苔蘚蟲素(bryostatin)-1)及分化誘導劑(維甲酸(tretinoin))；mTOR抑制劑、拓樸異構酶(topoisomerase)抑制劑(小紅莓(阿黴素)、安吖啶、喜樹鹼、道諾黴素、放線菌素d、艾尼西德(eniposide)、表柔比星、依託泊苷、伊達比星、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)及米托蒽醌、拓朴替康(topotecan)、伊立替康)、皮質類固醇(皮質酮、地塞米松(dexamethasone)、氫皮質酮(hydrocortisone)、甲潑尼龍(methylpednisolone)、強的松及潑尼龍(prenisolone))；PARP抑制劑(尼拉帕尼(niraparib)、奧拉帕尼(olaparib))；局部黏著斑激酶(FAK)抑制劑(迪法替尼(defactinib)(VS-6063)、VS-4718、VS-6062、GSK2256098)；生長因子信號轉導激酶抑制劑(西地尼布(cediranib)、高倫替布(galunisertib)、羅西替尼(rociletinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、EGF816、AZD4547)；c-Met抑制劑(卡普尼布(capmatinib)、INC280)；ALK抑制劑(色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib))；粒線體功能障礙誘導劑、毒素，諸如霍亂毒素(Cholera toxin)、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、百日咳博德氏桿菌(Bordetella pertussis)腺苷酸環化酶毒素或白喉毒素，及凋亡蛋白酶活化劑；及染色質破裂劑。在一些實施例中，化學治療劑為B-Raf抑制劑、MEK抑制劑、VEGF抑制劑、VEGFR抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、抗有絲分裂劑或其任何組合。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體係與過繼性細胞轉移(ACT)療法、嵌合抗原受體T細胞轉移(CAR-T)療法、疫苗療法及/或細胞介素療法組合投與。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體係與至少一種與 抑制性細胞介素特異性結合之抗體組合投與，例如抑制性細胞介素，諸如抗-CCL2抗體、抗-CSF-1抗體或抗-IL-2抗體。
在一些實施例中，本發明之抗-SIRPA抗體係與至少一種刺激性細胞介素組合投與。在可以與本文中之實施例中之任一者組合的一些實施例中，該至少一種刺激性細胞介素係選自IFN-α4、IFN-β、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、IL-20家族成員、LIF、IFN-γ、OSM、CNTF、GM-CSF、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、CXCL10、IL-33、MCP-1、MIP-1-β及其任何組合。
在一些實施例中，下調SIRPA之藥劑，例如抗-SIRPA抗體，係向患有神經病症之患者投與，或係為了降低風險、緩慢發作或預防神經病症而投與。在一些實施例中，神經病症為癡呆，包括癡呆、額顳葉型癡呆、阿茲海默氏病、血管性癡呆、輕度認知障礙、帕金森氏病、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、亨廷頓氏病、滔蛋白病變疾病(Taupathy disease)或多發性硬化症。
在一些實施例中，下調SIRPA之藥劑，例如抗-SIRPA抗體，係向患有帕金森氏病、肌肉萎縮性側索硬化、亨廷頓氏病、滔蛋白病變疾病或多發性硬化症之患者投與。在一些實施例中，該藥劑係向患有以下疾病之患者投與：庫賈氏病、常壓性水腦症、那哈氏病、中風、感染、創傷性腦損傷、進行性核上性麻痹、拳擊手型癡呆(dementia pugilistica)(慢性創傷性腦病)、與17號染色體相關之帕金森氏症、利波氏病(Lytico-Bodig disease)(關島型帕金森氏症-癡呆症候群(Parkinson-dementia complex of Guam))、纏結為主型癡呆(tangle-predominant dementia)、神經節膠質細胞瘤及神經節瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性全腦炎、鉛毒 腦病、結節性硬化症、哈雷狛登-斯巴茲病(Hallervorden-Spatz disease)、脂褐質沈積症、匹克病(Pick's disease)、皮質基底核退化症、嗜銀性顆粒病(Argyrophilic grain disease，AGD)、額顳葉退化症、路易體癡呆、多發性系統萎縮症、夏-崔症候群、進行性核上性麻痹或皮質基底核退化症。
癡呆
癡呆為非特異性症候群(亦即，一組體徵及症狀)，其表現為先前未受損傷的人的整體認知能力的嚴重喪失，超出正常衰老所預期的。由於獨特的整體腦損傷，癡呆可為靜態的。或者，癡呆可為進行性的，由於體內的損傷或疾病而導致長期惡化。雖然癡呆在老年人群中更為常見，但其亦可發生在65歲之前。受癡呆影響的認知區域包括(但不限於)記憶力、注意廣度、語言及問題解決。通常，在個體被診斷患有癡呆之前，症狀必須存在至少六個月。
癡呆之例示性形式包括(但不限於)額顳葉型癡呆、阿茲海默氏病、血管性癡呆、語意型癡呆及路易體癡呆。
在一些實施例中，投與本發明之抗-SIRPA抗體可以預防、降低風險及/或治療癡呆。在一些實施例中，抗-SIRPA抗體可以調節患有癡呆之個體中的一或多種SIRPA活性。
額顳葉型癡呆
額顳葉型癡呆(FTD)為由腦額葉之進行性惡化引起的病狀。隨時間推移，退化可推進至顳葉。流行率僅次於阿茲海默氏病(AD)，FTD佔早老性癡呆病例的20%。FTD之臨床特徵包括記憶缺失、行為異常、人格改變及語言障礙(Cruts,M.& Van Broeckhoven,C.,Trends Genet.24：186-194(2008)；Neary,D.等人，Neurology 51：1546-1554(1998)；Ratnavalli,E.,Brayne,C.,Dawson,K.& Hodges,J.R.,Neurology 58：1615-1621(2002))。
大部分FTD病例以體染色體顯性方式遺傳，但即使在一個家族中，症狀亦可以覆蓋從伴有行為障礙之FTD至原發性進行性失語症至皮質基底核退化症的範圍。與大多數神經退化性疾病一樣，FTD之特徵在於患病腦中特定蛋白質聚集體的病理性存在。從歷史上看，FTD之首次描述認識到在神經原纖維纏結或匹克體(Pick body)中存在過磷酸化滔蛋白之神經元內累積。藉由鑑定若干家族中編碼滔蛋白之基因中之突變而支持微管相關蛋白滔蛋白之因果作用(Hutton,M.等人，Nature 393：702-705(1998)。然而，大多數FTD腦未顯示過磷酸化滔蛋白之累積，但展現出對泛蛋白(Ub)及TAR DNA結合蛋白(TDP43)之免疫反應性(Neumann,M.等人，Arch.Neurol.64：1388-1394(2007))。大多數具有Ub包涵體(FTD-U)之FTD病例顯示在顆粒蛋白前體(Progranulin)基因中攜帶突變。
在一些實施例中，投與本發明之抗-SIRPA抗體可以預防、降低風險及/或治療FTD。在一些實施例中，投與抗-SIRPA抗體可以調節患有FTD之個體中的一或多種SIRPA活性。
阿茲海默氏病
阿茲海默氏病(AD)為最常見的癡呆形式。該疾病沒有治癒方法，其隨著疾病的進展而惡化，且最終導致死亡。AD最常在年齡超過65歲之人中被診斷出。然而，較不普遍的早發型阿茲海默氏可以更早發生。阿茲海默氏病之常見症狀包括行為症狀，諸如難以記住最近發生的事件；認知症狀、混淆、煩躁及攻擊性、情緒波動、語言障礙及長期記憶喪 失。隨著疾病的進展，身體功能喪失，最終導致死亡。阿茲海默氏病在變得完全明顯之前需要一段未知且可變的時間來發展，且其可以在未確診的情況下進展多年。
在一些實施例中，投與本發明之抗-SIRPA抗體可以預防、降低風險及/或治療阿茲海默氏病。在一些實施例中，投與抗-SIRPA抗體可以調節患有阿茲海默氏病之個體中的一或多種SIRPA活性。
帕金森氏病
帕金森氏病可稱為特發性或原發性帕金森氏症、運動過弱型強直症候群(hypokinetic rigid syndrome，HRS)或震顫麻痺，為影響運動系統控制之神經退化性腦部病症。腦中產多巴胺細胞之進行性死亡引起帕金森氏症的主要症狀。帕金森氏病最常在年齡超過50歲之人中被診斷出。帕金森氏病在大多數人中為特發性的(沒有已知病因)。然而，遺傳因素亦在該疾病中發揮作用。
帕金森氏病之症狀包括(但不限於)手、手臂、腿、頜部及面部之震顫、四肢及軀幹肌肉僵硬、移動緩慢(動作遲緩)、姿勢不穩、行走困難、神經精神問題、說話或行為改變、抑鬱、焦慮、疼痛、精神病、癡呆、幻覺及睡眠問題。
在一些實施例中，投與本發明之抗-SIRPA抗體可以預防、降低風險及/或治療帕金森氏病。在一些實施例中，投與抗-SIRPA抗體可以調節患有帕金森氏病之個體中的一或多種SIRPA活性。
肌肉萎縮性側索硬化(ALS)
如本文所用，肌肉萎縮性側索硬化(ALS)或運動神經元疾病或路格里克氏病(Lou Gehrig's disease)可互換使用且係指具有不同病因的 使人衰弱的疾病，其特徵在於快速進行性無力、肌肉萎縮及束化、肌肉痙攣、說話困難(發音困難)、吞咽困難(difficulty swallowing)(吞咽困難(dysphagia))及呼吸困難(difficulty breathing)(呼吸困難(dyspnea))。
已證明，顆粒蛋白前體在ALS中起作用(Schymick,JC等人，(2007)J[0343]Neurol Neurosurg Psychiatry.；78：754-6)且又免受由導致ALS之蛋白質(諸如TDP-43)引起的損傷(Laird,AS等人，(2010).PLoS ONE 5：e13368)。亦證實，NGF前體誘導p75介導之脊髓損傷後寡樹突細胞及皮質脊髓神經元之死亡(Beatty等人，Neuron(2002),36，第375-386頁；Giehl等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA(2004),101，第6226-30頁)。
在一些實施例中，投與本發明之抗-SIRPA抗體可以預防、降低風險及/或治療ALS。在一些實施例中，投與抗-SIRPA抗體可以調節患有肌肉萎縮性側索硬化之個體中的一或多種SIRPA活性。
亨廷頓氏病
亨廷頓氏病(HD)為由亨廷頓基因(HTT)中之體染色體顯性突變引起的遺傳性神經退化性疾病。在亨廷頓基因內細胞介素-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)三聯體重複序列之擴增導致產生由該基因編碼之亨廷頓蛋白(Htt)之突變形式。此突變亨廷頓蛋白(mHtt)有毒且促使神經元死亡。亨廷頓氏病之症狀最常在35歲與44歲之間出現，儘管其亦可在任何年齡出現。
亨廷頓氏病之症狀包括(但不限於)運動控制問題、急動、隨機運動(舞蹈病)、異常眼球運動、平衡受損、癲癇、咀嚼困難、吞咽困難、認知問題、說話改變、記憶缺失、思考困難、失眠、疲勞、癡呆、人格改變、抑鬱、焦慮及強迫行為。
在一些實施例中，投與本發明之抗-SIRPA抗體可以預防、降低風險及/或治療亨廷頓氏病(HD)。在一些實施例中，投與抗-SIRPA抗體可以調節患有亨廷頓氏病之個體中的一或多種SIRPA活性。
滔蛋白病變疾病
滔蛋白病變疾病或滔蛋白病變為由微管相關蛋白滔蛋白在腦內之聚集引起的一類神經退化性疾病。阿茲海默氏病(AD)為最熟知的滔蛋白病變疾病且涉及滔蛋白在神經元內以不溶性神經原纖維纏結(NFT)形式之累積。其他滔蛋白病變疾病及病症包括進行性核上性麻痹、拳擊手型癡呆(慢性創傷性腦病)、額顳葉型癡呆及與17號染色體相關之帕金森氏症、利波氏病(關島型帕金森氏症-癡呆症候群)、纏結為主型癡呆、神經節膠質細胞瘤及神經節瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性全腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、哈雷狛登-斯巴茲病、脂褐質沈積症、匹克病、皮質基底核退化症、嗜銀性顆粒病(AGD)、亨廷頓氏病及額顳葉退化症。
在一些實施例中，投與本發明之抗-SIRPA抗體可以預防、降低風險及/或治療滔蛋白病變疾病。在一些實施例中，投與抗-SIRPA抗體可以調節患有滔蛋白病變疾病之個體中的一或多種SIRPA活性。
多發性硬化症
多發性硬化症(MS)亦可稱為播散性硬化症或播散性腦脊髓炎。MS為發炎性疾病，其中腦及脊髓之軸突周圍的脂肪髓鞘受損，導致脫髓鞘及瘢痕形成以及廣泛的體徵及症狀。MS影響腦及脊髓中之神經細胞有效地相互通信的能力。神經細胞藉由向稱為軸突之長纖維發送稱為動作電位之電信號進行通信，該等長纖維包含在稱為髓鞘之絕緣物質中。在MS中，身體自身的免疫系統攻擊並損害髓鞘。當髓鞘丟失時，軸突不再 能夠有效地傳導信號。MS發病通常發生在青少年中，且在女性中更常見。
MS之症狀包括(但不限於)感覺的變化，諸如喪失敏感性或麻刺感；刺痛或麻木，諸如感覺遲鈍及感覺異常；肌肉無力；陣攣；肌肉痙攣；移動困難；協調及平衡方面的困難，諸如共濟失調；說話問題，諸如發音困難，或吞咽問題，諸如吞咽困難；視覺問題，諸如眼球震顫、包括光幻視在內的視神經炎及複視；疲勞；急性或慢性疼痛；及膀胱及腸道困難；不同程度的認知障礙；抑鬱或情緒不穩定的情緒症狀；烏托夫現象(Uhthoff's phenomenon)，其為由於曝露於高於平時的環境溫度而導致現有症狀惡化；及拉密特氏徵象(Lhermitte's sign)，其為在彎曲頸部時從背部向下蔓延的觸電樣感覺。
在一些實施例中，投與本發明之抗-SIRPA抗體可以預防、降低風險及/或治療多發性硬化症。在一些實施例中，投與抗-SIRPA抗體可以調節患有多發性硬化症之個體中的一或多種SIRPA活性。
在一些實施例中，個體(subject/individual)為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、羊、貓、犬及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在一些實施例中，個體(subject/individual)為人類。
本文所提供之抗體(及任何額外治療劑)可以藉由任何適合方法投與，包括非經腸、肺內、鼻內、病灶內投與、腦脊髓內、顱內、脊柱內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑。非經腸輸注包括肌肉內、作為大丸劑或藉由在一段時間內連續輸注而靜脈內投與、動脈內、關節內、腹膜內或皮下投與。在一些實施例中，該投與為靜脈內投與。在一些 實施例中，該投與為皮下投與。給藥可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分地視投藥是短期還是長期而定。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或在不同時間點的多次投藥、大丸劑投藥及脈衝式輸注。
本文所提供之抗體將以符合良好醫學規範的方式調配、給予及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送部位、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。抗體不需要但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所討論之病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體的量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。此等藥劑一般以相同劑量且以如本文所描述之投與途徑使用，或以本文所描述之劑量之約1%至99%使用，或以任何劑量且藉由憑經驗/臨床上確定為適當之任何途徑使用。
為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視以下而定：待治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重度及病程、抗體是出於預防還是治療目的而投與的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷。適當地向患者一次性投與或歷經一系列治療投與抗體。
視疾病之類型及嚴重程度而定，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗體可為向患者投與之初始候選劑量，不論是例如藉由一或多次分開投與還是藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一個典型的日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更大的範圍內。對於歷經數日或更長時間之重複投藥，視病狀而定，治療通常將持續至發生疾 病症狀之所要抑制為止。抗體之一個例示性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如以使得患者接受約二至約二十或例如約六個劑量的抗體)。在某些實施例中，給藥頻率為每天三次、每天兩次、每天一次、每隔一天一次、每週一次、每兩週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次或每月一次、每兩個月一次、每三個月一次或更久。可投與初始較高起始劑量，接著可投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析來監測。
診斷用途
在抗體中之任一者之一些實施例中，本文所提供之抗-SIRPA抗體中之任一者適用於偵測樣品或個體中SIRPA之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。本文提供出於診斷目的使用本發明抗體之方法，諸如偵測個體或衍生自個體之組織樣品中之SIRPA。在一些實施例中，個體為人類。
偵測方法可涉及抗原結合抗體之定量。生物樣品中之抗體偵測可以用此項技術中已知之任何方法進行，包括免疫螢光顯微術、免疫細胞化學、免疫組織化學、ELISA、FACS分析、免疫沈澱或微型正電子發射斷層攝影術。在某些實施例中，抗體例如經18F放射性標記，且隨後使用微型正電子發射斷層攝影術分析偵測。亦可藉由非侵襲性技術定量患者中之抗體結合，諸如正電子發射斷層攝影術(PET)、X射線電腦斷層攝影術、單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)、電腦斷層攝影術(CT)及電腦 軸向斷層攝影術(CAT)。
製品
本文提供包含本文所述之抗-SIRPA抗體的製品(例如，套組)。製品可以包括一或多個包含本文所述之抗體的容器。容器可為任何適合包裝，包括(但不限於)小瓶、瓶子、廣口瓶、軟包裝(例如密封聚酯薄膜(Mylar)或塑膠袋)及類似包裝。容器可為單位劑量、散裝包裝(例如，多劑量包裝)或次單位劑量。
在一些實施例中，套組可進一步包括第二藥劑。在一些實施例中，第二藥劑為醫藥學上可接受之緩衝劑或稀釋劑，包括(但不限於)諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。在一些實施例中，第二藥劑為如上所述之醫藥活性藥劑。
在製品中之任一者之一些實施例中，製品進一步包括根據本發明方法之使用說明書。說明書一般包括關於用於預期治療之劑量、給藥時程及投與途徑之資訊。在一些實施例中，此等說明書包含對根據本發明之任何方法投與本發明之經分離抗-SIRPA抗體(例如，本文所述之抗-SIRPA抗體)以預防、降低風險或治療具有選自以下之疾病、病症或損傷的個體的描述：癡呆、額顳葉型癡呆、阿茲海默氏病、血管性癡呆、混合型癡呆症、庫賈氏病、常壓性水腦症、肌肉萎縮性側索硬化、亨廷頓氏病、滔蛋白病變疾病、那哈氏病、中風、急性創傷、慢性創傷、狼瘡、急性及慢性結腸炎、類風濕性關節炎、創傷癒合、克羅恩氏病(Crohn's disease)、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、肥胖、瘧疾、原發性震顫、中樞神經系統狼瘡、白塞氏病、帕金森氏病、路易體癡呆、多發性系統萎縮 症、夏-崔症候群、進行性核上性麻痹、皮質基底核退化症、急性播散性腦脊髓炎、肉芽腫病症、類肉瘤病、衰老病、癲癇、脊髓損傷、創傷性腦損傷、年齡相關之黃斑部變性、青光眼、色素性視網膜炎、視網膜變性、呼吸道感染、敗血症、眼睛感染、全身感染、狼瘡、關節炎、多發性硬化症、低骨密度、骨質疏鬆症、成骨、骨性骨質硬化病、骨佩吉特氏病(Paget's disease)，及癌症，包括膀胱癌、腦癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌、纖維肉瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓白血病(CML)、多發性骨髓瘤、真性多紅血球症、原發性血小板增多症、原發性或特發性骨髓纖維化、原發性或特發性骨髓硬化、骨髓衍生腫瘤、表現SIRPA之腫瘤、甲狀腺癌、感染、CNS疱疹、寄生蟲感染、錐蟲感染、Cruzi感染、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染、黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani)感染、B群鏈球菌感染、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)感染、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningiditis)感染、第I型HIV及流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)。在一些實施例中，說明書包括抗-SIRPA抗體及第二藥劑(例如，第二醫藥活性劑)之使用說明書。
參考以下實例將更充分地理解本發明。然而，該等實例不應視為限制本發明之範疇。本發明通篇所有引用在此明確地以引用的方式併入。
實例
以下實例僅以說明而非作為限制之方式提供。熟習此項技 術者將容易想到可經改變或修改以產生基本類似之結果的多種參數。
實例1：產生抗-SIRPA抗體
人類SIRPA蛋白質之胺基酸序列如下文SEQ ID NO：1所示。人類SIRPA含有位於SEQ ID NO：1之胺基殘基1-30處之信號肽。人類SIRPA含有位於SEQ ID NO：1之胺基殘基32-137處之細胞外類免疫球蛋白可變型(IgV)域；位於SEQ ID NO：1之胺基殘基148-247及254-348處之額外細胞外類免疫球蛋白恆定型(IgC)域序列；位於SEQ ID NO：1之胺基殘基374-394處之跨膜域；及位於SEQ ID NO：1之胺基殘基395-504處之細胞內域。
人類SIRPA v1胺基酸序列(SEQ ID NO：1)：
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SIRPA-CD47複合物之晶體結構分析將配體結合位點解析為連接SIRPA之IgV域中之β片股的可變環。CD47結合界面由SIRPA之胺 基酸殘基S59-P65、L96-F104及K123-D130組成。
已鑑定SIRPA在人類中之多種多形現象。因為序列中之大多數變異超出了CD47配體結合位點，所以所檢查的大多數SIRPA變異體似乎以相似的親和力結合CD47。SIRP家族之另一成員SIRPB1與SIRPA共用高序列同源性，但不能結合CD47。單一A57M取代足以重排S59-P65配體結合界面，防止SIRPB1與CD47結合。此外，SIRPA-CD47相互作用為高度物種特異性的。人類SIRPA不能結合小鼠或大鼠或牛CD47(在所測試物種中)且人類CD47僅識別由NOD小鼠品系表現之小鼠SIRPA之單一對偶基因變異體。
來自多個物種之SIRPA序列之蛋白質BLAST分析顯示與人類SIRPA之顯著程度的一致性(圖1)。SIRP家族內之高序列同源性在產生SIRPA特異性抗體同時仍保持與非人類SIRPA抗原之交叉反應性方面提出了重大挑戰。
實例2：表徵人類化抗-SIRPA抗體
本文中所論述之小鼠SIRPA抗體m3F9含有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區。
下表4及5列舉鼠類抗-SIRPA抗體m3F9之融合瘤衍生之重鏈可變區及輕鏈可變區胺基酸序列，以及相應的人類化序列(稱為「h3F9」)。抗-SIRPA抗體3F9重鏈可變域之第一人類化抗體序列(h3F9-H1)為不改變人類構架序列之「CDR-交換」。
隨後的人類化重鏈可變區序列(h3F9-H2)在某些CDR接合點處具有改變的構架殘基。(參見圖2A。)圖2A列舉抗-SIRPA抗體3F9之重 鏈可變域之潛在人類化序列。人類化序列係基於IGHV3-23*01接受體構架及IGHJ4*01連接區。
抗-SIRPA抗體3F9輕鏈可變域之第一人類化序列(h3F9-L1)為不改變人類構架序列之輕鏈可變域之「CDR-交換」。隨後的人類化輕鏈可變區序列改變某些構架胺基酸殘基(h3F9-L2及h3F9-L3)。(參見圖2B。)圖2B列舉抗-SIRPA抗體3F9之輕鏈可變域之潛在人類化序列。
人類化序列係基於IGKV3-11*01接受體構架及IGKJ2*01連接區。CDR序列以粗體表示。CDR定義為來自網站www.bioinf.org.uk/abs/之AbM。「b」表示內埋側鏈；「p」表示部分內埋；「i」表示在VH與VL域之間的界面處的側鏈。人類與鼠類生殖系之間的序列差異由星號(*)表示。構架中之潛在額外突變標註在序列下方。CDR序列中之潛在改變標註在各CDR序列下方。此等改變可以防止天冬醯胺(N)脫醯胺。將抗-SIRPA抗體3F9之所有六種不同的人類化版本(基於重鏈及輕鏈可變區之以下組合：h3F9-H1/L1；h3F9-H1/L2；h3F9-H1/L3；h3F9-H2/L1；h3F9-H2/L2；及h3F9-H2/L3)移植至人類IgG4骨架上，在CHO-K1細胞中重組產生，且如下所述進一步表徵。
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Figure 108117983-A0305-02-0166-10
如下進行抗-SIRPA抗體之親和力量測。在Pall ForteBio Octet RED96儀器上收集生物層干涉法(BLI)資料。使用9.0版ForteBio資料分析軟體進行資料分析。使用標準動力學緩衝劑(PBS，0.1% BSA，0.02% Tween-20，pH 7.2)進行分析及用於製備試劑。在緩衝劑中進行感測器平衡之後，將人類化3F9抗-SIRPA抗體中之每一者(2.5μg/mL，300秒加載時間)捕捉在抗人類IgG Fc捕捉、浸漬及讀數生物感測器(Pall ForteBio,Menlo Park,CA)上。隨後使不同濃度(0-200nM)之組胺酸標記之人類SIRPA(Sino Biological,Beijing,China)與所捕捉的抗-SIRPA表面結合(300秒締合時間，600秒解離時間)。所得BLI信號作為與來自參考(2.5μg/mL IgG+0nM SIRPA)感測器之響應的差異而獲得。零配體對照(0μg/mL IgG+200nM SIRPA)顯示SIRPA與感測器尖端表面無可量測之非特異性結合。親本m3F9抗體之親和力量測使用類似方法進行，但改用被捕捉在抗小鼠IgG Fc生物感測器上之抗體。使用1：1相互作用模型進行多濃度動力學分析以提取各抗體之締合及解離速率常數(分別為ka及kd)。由比率kd/ka計算結合親和力常數(KD)。
經固定之抗小鼠IgG Fc或抗人類IgG Fc抗體分別在生物感 測器上捕捉鼠類抗-SIRPA抗體3F9及人類化抗-SIRPA抗體3F9。使遞增濃度之組胺酸標記之huSIRPA同功異型物1(10-500nM)流經所捕捉的抗-SIRPA抗體3F9以記錄跡線。自所得感測器圖譜分析最佳擬合跡線以計算締合速率、解離速率及親和力值。所測試的三種人類化抗-SIRPA抗體3F9變異體為mAb 14.70.1(SEQ ID NO：3之重鏈可變序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變序列)、mAb 14.70.2(SEQ ID NO：3之重鏈可變序列及SEQ ID NO：7之輕鏈可變序列)及mAb 14.70.4(SEQ ID NO：4之重鏈可變序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變序列)。人類化抗-SIRPA 3F9抗體之所量測的結合動力學以所提取的ka、kd及KD值概述於下表6中。在所產生的六種h3F9變異體中，3種抗-SIRPA抗體(mAb 14.70.1：H1/L1；mAb 14.70.2：H1/L2；mAb 14.70.4：H2/L1)對可溶性SIRPA抗原展現與親本m3F9抗-SIRPA抗體(SEQ ID NO：2之重鏈可變序列及SEQ ID NO：5之輕鏈可變序列)類似的親和力。
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除了結合可溶性抗原之外，亦進行基於細胞之親和力量測以確定h3F9抗-SIRPA抗體相對於m3F9抗-SIRPA抗體對膜結合SIRPA v1抗原之表觀親和力。藉由向過度表現人類SIRPA之BWZ細胞添加遞增濃度之抗-SIRPA 3F9抗體而給相對親和力賦予EC50值。藉由用抗小鼠IgG Fc APC或抗人類IgG PE二級抗體對細胞染色來偵測受體結合抗體。將單株抗體之連續稀釋液添加至105個過度表現huSIRPA之BWZ細胞(BWZ-huSIRPA)中且使其在4℃下達成結合平衡。在添加經螢光標記之二級抗體 及簡單的洗滌步驟之後，經由FACS分析記錄隨所滴定之抗體濃度而變的平均螢光強度(MFI)值。使用非線性回歸分析用Graphpad Prism 6軟體擬合曲線。採用h3F9抗-SIRPA抗體mAb 14.70.1、mAb 14.70.2及mAb 14.70.4之基於細胞之滴定實驗分別得到1.065nM、0.9682nM及1.607nM之EC50值。人類化3F9抗-SIRPA抗體得到比m3F9抗-SIRPA抗體(EC50=2.1nM)低的EC50值，相對於鼠類3F9抗-SIRPA抗體所測定之結合親和力，顯示出人類化抗體之改善的結合親和力。
亦進行基於競爭之分析以計算抗-SIRPA抗體之IC50值，其中向BWZ-huSIRPA v1細胞添加遞增濃度之人類化及鼠類3F9抗-SIRPA抗體以置換經螢光團標記之參考抗體。IC50值提供相對親和力之另一比較。在基於競爭之分析中，向表現huSIRPA之細胞添加遞增濃度之抗-SIRPA 3F9抗體以置換經螢光團標記之參考抗體。IC50值確定如下：m3F9=11.54nM；mAb 14.70.1=3.303nM；mAb 14.70.2=2.185nM；mAb 14.70.4=4.606nM。此等結果證實，相對於與SIRPA結合之參考m3F9抗-SIRPA抗體，本發明之人類化抗-SIRPA抗體為更有效的競爭者。
在初代人類巨噬細胞(huMac)上評估h3F9抗-SIRPA抗體降低SIRPA之細胞表面表現的能力。自健康供體之周邊血液分離人類單核球且藉由用人類M-CSF補充生長培養基使其在活體外分化成巨噬細胞。在分化後，收集huMac且將其接種至具有遞增濃度之同型對照或可溶性抗-SIRPA抗體之96孔組織培養盤上且在37℃下培育隔夜。使用屬於與抗-SIRPA抗體3F9不同的抗原決定基組(epitope bin)的DyLight650結合之抗人類SIRPA抗體(純系SA56)，藉由流動式細胞測量術分析細胞之SIRPA表 面表現。如圖3中所示，h3F9抗-SIRPA抗體變異體(mAb 14.70.1(70.1)、mAb 14.70.2(70.2)及mAb 14.70.4(70.4))以劑量依賴性方式下調巨噬細胞中之SIRPA受體表現量。然而，親本m3F9抗-SIRPA抗體展現比人類化抗體更大的最大受體下調，儘管上文所論述之抗原結合特性類似。此等結果表明，除受體參與以外的抗-SIRPA抗體特性決定了抗-SIRPA抗體3F9在巨噬細胞上之功能活性。
實例3：抗-SIRPA抗體之功能活性需要Fcγ受體(FcγR)
人類與鼠類3F9抗-SIRPA抗體之間的主要差異為使Fcγ受體(FcγR)參與之能力。將人類化抗-SIRPA抗體移植至已知具有不良FcγR結合特性之人類IgG4 Fc骨架上。融合瘤m3F9抗-SIRPA抗體儘管為鼠類IgG1抗體，但仍保留對某些人類FcγR之結合活性。為了驗證FcγR調節抗-SIRPA抗體之功能活性，用EndoS處理m3F9抗-SIRPA抗體以酶促移除Asn297上之Fc聚糖，一種介導IgG-FcγR相互作用之關鍵決定子。將來自2個健康供體之初代人類巨噬細胞用遞增濃度之糖基化或去糖基化m3F9抗-SIRPA抗體處理隔夜。隨後將細胞用與不同抗原決定基組結合之DyLight650結合之抗-SIRPA參考抗體(SA56-DyL650)染色且隨後藉由FACS分析來分析其SIRPA表面表現。
如圖4A中所示，m3F9抗-SIRPA抗體之兩種糖型均顯著下調SIRPA之細胞表面表現。然而，在兩種供體中，與抗體之糖基化形式所觀測到之最大活性相比，去糖基化m3F9抗-SIRPA抗體變異體展現降低的最大活性。詳言之，糖基化m3F9抗-SIRPA抗體在供體(Dnr)413及供體414中分別使SIRPA表現下調多達90%及85%；而去糖基化m3F9抗-SIRPA抗體在相同的供體巨噬細胞中分別僅達成70%及75% SIRPA受體下調。此 發現表明，抗-SIRPA抗體，特別是抗體m3F9，需要FcγR參與來增強SIRPA細胞表面表現之下調。圖4A中之結果呈現為藉由將經抗-SIRPA抗體處理之樣品的MFI值除以經同型對照處理之樣品的MFI值得到的參考抗體結合百分比。
除了如上文所揭示之抗體介導之受體下調之外，評估FcγR在3F9抗-SIRPA抗體介導增強腫瘤細胞吞噬作用方面之作用。基於pHrodo螢光開發腫瘤細胞吞噬作用分析。將初代人類巨噬細胞用同型對照抗體(MOPC)或指定抗-SIRPA 3F9抗體變異體處理隔夜。將經pHrodo染料標記之Raji細胞添加至巨噬細胞中且在37℃下培育2小時。紅色抗生物素蛋白(Invitrogen)為與pHrodo紅色染料，一種獲取酸性環境中之螢光的螢光標記物結合之抗生蛋白鏈菌素分子，諸如吞噬體。對於目標腫瘤細胞標記，將500nM紅色抗生物素蛋白與15nM生物素標記之小扁豆凝集素(Lens Culinaris Agglutinin，LCA；Vector Labs)混合。隨後將紅色抗生物素蛋白-LCA複合物以1：1體積比與400,000個Raji細胞在無血清RPMI培養基中在冰上混合。LCA之糖結合特性將紅色抗生物素蛋白與腫瘤細胞表面上之碳水化合物結構連接。在簡單的洗滌步驟之後，將紅色抗生物素蛋白-LCA標記之Raji細胞與單核球衍生之人類巨噬細胞在無血清RPMI培養基中混合且在37℃下培育2小時。隨後收集巨噬細胞且在冰上在含有FcγR阻斷抗體之FACS緩衝劑中用抗-CD14 APC染色。藉由計數CD14/pHrodo雙陽性巨噬細胞之百分比而量測吞噬活性。作為對照，將未標記Raji細胞與巨噬細胞混合以確定背景螢光含量。圖4B中之結果呈現為pHrodo/CD14雙陽性巨噬細胞群體之百分比的增加倍數。
如圖4B中所示，經糖基化m3F9抗-SIRPA抗體處理隔夜之 巨噬細胞展示腫瘤細胞吞噬作用相對於使用經同型對照抗體處理之巨噬細胞所觀測到之腫瘤細胞吞噬作用增加約2倍。經去糖基化m3F9抗-SIRPA抗體處理之巨噬細胞展示腫瘤細胞吞噬作用相對於經同型對照處理之巨噬細胞增加約1.5倍。腫瘤細胞吞噬作用的此約1.5倍增加表示活性相對於用糖基化m3F9抗-SIRPA抗體所觀測到之活性存在約50%的統計顯著降低。此外，經h3F9 IgG4(mAb 14.70.1或mAb 14.70.2)處理之巨噬細胞不展現任何增強腫瘤細胞吞噬作用高於基線程度的能力。
先前的研究確定了在用3F9抗-SIRPA抗體刺激巨噬細胞後增加的吞噬活性與CD14下調之間的相關性。為了確定此相關性是否亦至少部分地視FcγR而定，將初代人類巨噬細胞用糖基化m3F9或h3F9 IgG4抗-SIRPA抗體變異體(mAb 14.70.1、mAb 14.70.2及mAb 14.70.4)處理隔夜且分析腫瘤細胞吞噬作用及CD14表現。如圖5A中所示，僅經m3F9抗-SIRPA抗體處理之巨噬細胞顯示Raji細胞之吞噬作用相對於在經同型對照抗體處理之巨噬細胞下觀測到之吞噬作用增強。結果呈現為pHrodo/CD14雙陽性巨噬細胞群體之百分比的增加倍數。人類化抗-SIRPA IgG4抗體未能增強Raji細胞之吞噬作用。同樣，僅m3F9抗-SIRPA抗體刺激下調巨噬細胞上之CD14表現，而h3F9 IgG4抗-SIRPA抗體變異體不改變CD14表現(圖5B)。除了支持CD14表現量與巨噬細胞中之吞噬活性之間的相關性之外，此等結果亦證實3F9抗-SIRPA抗體之功能活性至少部分地依賴於FcγR。
實例4：抗-SIRPA抗體之CD32下調
除了感興趣的目標抗原之外，骨髓譜系之細胞亦表現多個能夠與治療性抗體之Fc域結合之Fc受體。Fcγ受體(FcγR)構成介導Fc依賴 性效應功能之經最佳表徵且最有效的受體類別。FcγR由ITAM相關活化受體(CD64/FcγRI、CD32A/FcγRIIA及CD16A/FcγRIIIA)及攜帶ITIM之抑制性受體(CD32B/FcγRIIB)組成，且活化受體/抑制性受體在相同細胞上之共表現建立細胞活化之臨限值。一般而言，由免疫複合體連接活化FcγR可引發若干信號傳導級聯，其引起細胞活化且隨後誘導效應功能。此等活性在骨髓細胞類型之間變化，但可以包括抗體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞吞噬作用及若干促炎性細胞介素及趨化介素之上調等。相反，由免疫複合體連接抑制性受體FcγRIIB可抵消活化FcγR之免疫刺激信號，支持維持組織穩態。例如，若干研究確定，在免疫複合體介導之炎症的鼠類模型中，基因剔除FcγRIIB促使促炎性巨噬細胞活性增強。因為FcγRIIB為唯一具有抑制活性之FcγR，所以其在藉由骨髓細胞調節FcγR介導之炎症中起重要作用。在腫瘤微環境之情況下，FcγRIIB表現量可以確定腫瘤相關巨噬細胞之極化狀態及活體內巨噬細胞效應功能之調節。
為了確定哪種FcγR促成3F9抗-SIRPA抗體之活體外活性，將獲自兩個健康供體之單核球衍生之巨噬細胞用同型對照抗體或抗-SIRPA抗體m3F9處理隔夜，且隨後評定FcγRIIIA(CD16)、FcγRI(CD64)及FcγRIIA/B(CD32A/B)之表面表現量。如圖6A中所示，相對於經同型對照抗體處理之巨噬細胞中所觀測到之表面表現而言，m3F9抗-SIRPA抗體處理實質上降低CD32A/B之表面表現。因為用於量測FcγRII之表面含量的偵測抗體(純系FUN-2；Biolegend)不區分活化受體FcγRIIA與抑制性受體FcγRIIB，所以用受體特異性抗體重複此分析。如先前所描述，將獲自兩個健康供體之單核球衍生之巨噬細胞用同型對照抗體或3F9抗-SIRPA抗體之指定變異體處理隔夜。圖6B顯示，相對於在經同型對照抗體處理 之細胞中觀測到之FcγRIIA，抗-SIRPA抗體m3F9將巨噬細胞中之FcγRIIA顯著下調約70-85%。此效應視Fc域而定，因為h3F9 IgG4變異體(mAb 14.70.2)及鼠類抗體之去糖基化形式均消除FcγRIIA下調。
當評定FcγRIIB之表面表現時，相對於在經同型對照抗體處理之巨噬細胞中觀測到之表現，抗-SIRPA抗體m3F9處理將抑制性受體之表現降低至幾乎不可偵測的程度(圖6B)。相反，在經抗-SIRPA抗體3F9處理之巨噬細胞上，相對於經同型對照處理之細胞，FcγRI/CD64或FcγRIIIA/CD16A明顯無顯著下調，指示抗-SIRPA 3F9抗體處理不改變初代人類巨噬細胞上之CD16及CD64表現(資料未示出)。
為了確認抗-SIRPA抗體m3F9之功能活性需要CD32A/B，進行選擇性FcγR阻斷實驗以評定個別FcγR對抗體介導之SIRPA下調及腫瘤細胞吞噬作用之作用。在阻斷實驗中，將來自兩個健康供體之初代人類巨噬細胞與抗-CD16或抗-CD32A/B阻斷抗體一起在冰上預培育15分鐘。隨後，將細胞與同型對照(MOPC21)或m3F9抗-SIRPA抗體一起培育隔夜。用DyLight650結合之抗-SIRPA參考抗體(SA56-DyL650)偵測SIRPA表現。結果呈現為藉由將經抗-SIRPA抗體處理之樣品的MFI值除以經同型對照處理之樣品的MFI值得到的參考抗體結合百分比。如圖7A中所示，相對於在不經FcγR阻斷抗體處理之巨噬細胞中觀測到之SIRPA下調，在抗-SIRPA抗體m3F9處理之後，CD16阻斷不破壞SIRPA下調。相反，在與抗-CD32A/B阻斷抗體一起預培育之巨噬細胞中，m3F9介導之SIRPA下調顯著減弱。
為了確定CD32A/B阻斷是否亦阻礙吞噬作用，將初代人類巨噬細胞與抗-CD32A/B阻斷抗體一起預培育且用同型對照抗體或抗- SIRPA抗體m3F9處理隔夜。將經pHrodo染料標記之Raji細胞與巨噬細胞混合且在37℃下培育2小時。結果呈現為pHrodo/CD14雙陽性巨噬細胞群體之百分比的增加倍數。如圖7B中所示，來自兩個供體之經m3F9處理之巨噬細胞使Raji細胞之吞噬作用相對於在經同型對照抗體處理之巨噬細胞中觀測到之吞噬作用增強約2倍。然而，CD32A/B阻斷部分或完全地阻斷m3F9介導之腫瘤細胞吞噬作用之增強。綜合而言，此等結果確定，CD32A/B參與在功能上為抗-SIRPA抗體m3F9之活性所需。
實例5：h3F9抗-SIRPA抗體之親和力成熟
進行人類化h3F9抗-SIRPA抗體之親和力成熟。簡言之，重鏈或輕鏈中之某些胺基酸殘基經選擇性突變誘發且藉由額外幾輪篩選選擇結合改善的突變體。此方法同時改善特異性、物種交叉反應性及可開發性概況，允許精確調整所要作用機制、生物分析中之效力及臨床前模型化中所涉及的特性。表徵包括Forte Bio及MSD親和力量測、細胞結合及若干可開發性分析。在第一輪親和力成熟之後，具有改善的親和力之抗體亦展現改善的多特異性反應性(PSR)，其用於測定抗體之非特異性結合。因此，進行第二輪親和力成熟以在不升高PSR之情況下改善親和力。
抗體重鏈及輕鏈可變域序列
使用標準技術，測定本文所述之親和力成熟抗體之輕鏈可變域及重鏈可變域之胺基酸序列。抗體之輕鏈HVR序列如表7至表8中所示。抗體之輕鏈HVR序列如表7中所示。抗體之重鏈HVR序列如表8中所示。抗體之輕鏈及重鏈構架(FR)序列如表9中所示。抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區序列如下表10中所示。
Figure 108117983-A0305-02-0175-12
Figure 108117983-A0305-02-0175-13
Figure 108117983-A0305-02-0175-14
Figure 108117983-A0305-02-0176-15
Figure 108117983-A0305-02-0177-16
實例6：表徵親和力成熟抗-SIRPA抗體
本文所揭示之親和力成熟抗-SIRPA抗體之初始表徵包含使用生物層干涉法(BLI)在Pall ForteBio Octet RED96儀器上獲取抗原親和力量測。經固定之抗小鼠IgG Fc或抗人類IgG Fc抗體分別將鼠類抗-SIRPA 3F9抗體及人類化抗-SIRPA 3F9抗體捕捉在生物感測器上。用流經所捕捉抗體3F9之25nM huSIRPA或50nM huSIRPB1進行單循環動力學以記錄跡線。使用9.0版ForteBio資料分析軟體進行資料分析。使用標準動力學緩衝劑(PBS，0.1% BSA，0.02% Tween-20，pH 7.2)進行分析及用於製備試劑。在緩衝劑中進行感測器平衡之後，將抗-SIRPA抗體h3F9(2μg/mL，300秒加載時間)或抗-SIRPA抗體h3F9之親和力成熟變異體捕捉在抗人類IgG Fc捕捉、浸漬及讀數生物感測器(Pall ForteBio,Menlo Park,CA)上。隨後使50nM經組胺酸標記之人類SIRPA v1或人類SIRPB1(Novoprotein,Summit,NJ,USA)與所捕捉之抗-SIRPA抗體塗佈表面結合(200秒締合時間，900秒解離時間)。所得BLI信號作為與來自參考(2μg/mL 3F9+0nM SIRPA)感測器之響應的差異而獲得。零配體對照(0μg/mL 3F9+200nM SIRPA)顯示SIRPA與感測器尖端表面無可量測之非特異性結合。使用1：1相互作用模型進行單曲線動力學分析以提取各抗體之締合及解離速率常數(分別為ka及kd)。由比率kd/ka計算親和力常數(KD)。獲得與可溶性huSIRPA及huSIRPB1結合之25種抗-SIRPA後代抗體及一種親本抗體的感測器圖譜，且使用最佳擬合跡線計算締合速率、解離速率及親和力值。衍生自由此等實驗獲得之感測器圖譜之曲線擬合分析的親和力量測結果(ka、kd及KD)概述於表11中。所有親和力成熟 抗-SIRPA抗體皆沒有與huSIRPB1之任何可量測的交叉反應性(資料未示出)，且六種親和力成熟抗-SIRPA抗體(3F9-18、3F9-12、3F9-23、3F9-14、3F9-22及3F9-20)展現對可溶性huSIRPA之親和力相對於親本抗-SIRPA抗體h3F9所觀測到之親和力增加約10倍。
Figure 108117983-A0305-02-0178-17
亦進行基於細胞之親和力量測以確定親和力成熟3F9抗-SIRPA抗體與細胞表面表現之抗原的表觀親和力。將抗-SIRPA單株抗體中之每一者之連續稀釋液添加至105個BWZ-huSIRPA細胞且使其在4℃下達成結合平衡。在添加經螢光標記之二級抗體及簡單的洗滌步驟之後，經 由FACS分析記錄隨所滴定之抗體濃度而變的MFI值。藉由向過度表現人類SIRPA之BWZ細胞添加遞增濃度之3F9抗體變異體而給相對親和力賦予EC50值(列於下文)。藉由用抗人類IgG PE二級抗體對細胞染色來偵測受體結合抗體。使用非線性回歸分析用Graphpad Prism 6軟體擬合曲線。採用鼠類3F9及人類化親和力成熟抗-SIRPA抗體之基於細胞之滴定實驗顯示人類化親和力成熟抗-SIRPA抗體之EC50值改善；兩種抗-SIRPA抗體顯示EC50值顯著改善(mAb 3F9-14=0.42nM且mAb 3F9-22=0.49nM)，相比於用抗-SIRPA 3F9 mIgG1抗體所觀測到之EC50值(0.72nM)而言。參見下表12。
Figure 108117983-A0305-02-0179-18
實例7：親和力成熟抗-SIRPA抗體與SIRPA抗原變異體之交叉反應性
人類SIRPA之CD47結合域為高度多形性的，其會妨礙能夠識別在人類群體中表現之所有SIRPA對偶基因變異體的CD47阻斷性抗-SIRPA抗體的發展。事實上，人類SIRPA之兩種最常見的對偶基因(v1及v2)在序列方面亦為最不同的，在IgV域中有13個殘基不同。因為CD47競爭研究確定，抗-SIRPA抗體m3F9結合不同於CD47配體結合位點之區域，所以進行結合分析以驗證人類SIRPA v1與v2之間的交叉反應性以及跨物種反應性，從而確定用於毒理學研究之相關動物模型。
在ELISA分析中，如所指示，在4℃下在PBS中用給定物種之His或Fc標記之SIRPA以1μg/mL塗佈96孔Immulon HBX培養盤隔夜。在PBS中之5%(w/v)牛血清白蛋白中阻斷培養盤1小時，之後將其用PBS/0.05% Tween 20(PBS/T)洗滌3次。將抗-SIRPA抗體以稀釋系列添加 至培養盤且在室溫下培育2小時，之後藉由用PBS/T洗滌移除未結合抗體。隨後向孔中添加辣根過氧化酶結合之抗小鼠IgG或抗人類κ輕鏈(Jackson Immunoresearch)且培育30分鐘。藉由用PBS/T洗滌移除未結合抗體，之後使用四甲基聯苯胺(TMB)偵測結合抗體。用2N H2SO4停止反應，之後在A450下讀取培養盤。
親本鼠類3F9抗-SIRPA抗體以類似EC50值(分別為0.695及0.789nM)結合人類SIRPA-Fc之v1及v2形式。在經His標記之人類抗原的情況下觀測到表觀親和力部分降低，表明與Fc標記之SIRPA的更大的親合結合。另外，親本鼠類3F9抗-SIRPA抗體展現與Fc及His標記之食蟹獼猴SIRPA的弱交叉反應性(EC50=1.09nM)。未觀測到與大鼠SIRPA之可偵測結合。
在如上所述之親本抗體的親和力成熟之後，針對同一組SIRPA抗原篩選兩種後代抗-SIRPA抗體mAb 3F9-14及mAb 3F9-22以評定交叉反應性。如同抗-SIRPA抗體m3F9一樣，人類化及親和力成熟抗-SIRPA抗體均保留針對人類SIRPA v1及v2之結合活性，但EC50值顯著較低，證實了在以上所述之生物感測器量測及細胞結合分析中所觀測到之親和力增加。儘管對人類SIRPA v1及v2之親和力增加，但是抗-SIRPA抗體3F9-14展現與食蟹獼猴SIRPA之弱交叉反應性；結合曲線得到EC50值(EC50=0.879nM)，類似於在抗-SIRPA抗體m3F9之情況下所觀測到之EC50值。相反，抗-SIRPA抗體3F9-22證實對食蟹獼猴SIRPA之結合活性與人類SIRPA之兩種變異體等效(EC50=0.107nM)。3F9-14及3F9-22抗體均不與大鼠SIRPA結合(資料未示出)。自結合曲線計算之EC50列於下文且確定所有抗-SIRPA抗體皆結合人類SIRPA之兩種對偶基因變異體。僅 抗-SIRPA抗體hu3F9-22結合食蟹獼猴SIRPA，其親和力類似於與人類SIRPA之結合。下表13顯示抗-SIRPA抗體與各種SIRPA蛋白質之EC50值(nM)。
Figure 108117983-A0305-02-0181-19
進行類似ELISA實驗以確定抗-SIRPA抗體9C2(關於抗-SIRPA抗體9C2胺基酸序列，參見下文)及3F9針對一組不同SIRPA及SIRPB蛋白質的EC50值。下表14顯示此等抗-SIRPA抗體與各種SIRP蛋白質之EC50值(nM)。
Figure 108117983-A0305-02-0181-20
寄存編號：CAA71403.1(SIRPA v2)；O00241.5(SIRPB1 iso.1)；Q5TFQ8.1(SIRPB1 iso.3)；NP_001271679.1(食蟹獼猴SIRPA)；XP_005568598(食蟹獼猴SIRPB1)；n.b.=無結合
鑒於來自多個物種之SIRPA蛋白質之間的高序列類似性，如圖1中所示，亦篩選抗-SIRPA抗體後代純系針對來自各種哺乳動物物種之額外SIRPA抗原的交叉反應性。將Fc標記之狨猴SIRPA(寄存編號JAB51896)或犬SIRPA(寄存編號XP005634938)或兔SIRPA(寄存編號G1U0I5)塗佈至培養盤上且與遞增濃度之抗-SIRPA抗體hu3F9-14及hu3F9-22一起培育。抗-SIRPA mAb 3F9-14及mAb 3F9-22均識別狨猴及 犬SIRPA，儘管親和力低於在人類SIRPA之情況下所觀測到之親和力。例如，3F9-14結合狨猴及犬SIRPA之EC50值分別為1.2nM及0.64nM。同樣，3F9-22結合狨猴及犬SIRPA之EC50值分別為4.3nM及0.83nM。抗-SIRPA抗體純系3F9-14及3F9-22均不結合兔SIRPA。
實例8：親和力成熟抗-SIRPA抗體下調SIRPA及CD32A/B
先前實驗確定，抗-SIRPA抗體m3F9藉由降低SIRPA表面表現而非競爭性地拮抗CD47與SIRPA之結合，其促使刺激巨噬細胞吞噬腫瘤細胞之能力與CD47阻斷性抗-SIRPA抗體相比增加。針對對鼠類抗體之類似功能特性的保持性，分析親和力成熟抗-SIRPA抗體。
因為抗-SIRPA抗體m3F9(在小鼠IgG1骨架上)以Fc依賴性方式下調SIRPA及CD32A/B，所以產生嵌合抗體，其中親本抗-SIRPA抗體m3F9之Fab序列與野生型人類IgG1之Fc域(3F9 huIgG1)或在重鏈中攜帶S267E/L328F突變之人類IgG1 Fc(3F9-SELF)融合。相對於野生型人類IgG1 Fc，Fc SELF突變使與人類FcγR2B/CD32B之結合增強>100倍。自健康供體之周邊血液分離人類單核球且藉由用人類M-CSF使其在活體外分化成巨噬細胞。在分化後，收集huMac且將其接種至具有遞增濃度之同型對照或可溶性抗-SIRPA抗體之96孔組織培養盤上且在37℃下培育隔夜。使用DyLight650結合之抗人類SIRPA抗體(純系SA56)及FITC標記之抗-CD32A/B(FUN-2)，藉由流動式細胞測量術分析細胞之SIRPA及C32A/B表面表現。與先前觀測結果一致，抗-SIRPA抗體3F9 mIgG1展現SIRPA及CD32A/B之穩固的劑量依賴性下調。然而，嵌合抗-SIRPA 3F9 huIgG1抗體顯示受體下調效力相比於鼠類抗體減弱(資料未示出)。此等結果提供進一步證據，抗體之Fc域在活性中起重要作用。將SELF突變工程 化至嵌合3F9之Fc域上(3F9-SELF)可恢復將SIRPA及CD32A/B下調至與抗-SIRPA抗體3F9 mIgG1所觀測到之類似含量的能力。此結果證實CD32A/B充當巨噬細胞上之m3F9活性之重要輔受體。
早期實驗揭示，移植至人類IgG4骨架上之抗-SIRPA抗體3F9之人類化變異體損失功能活性。在人類IgG1骨架上產生親和力成熟抗-SIRPA抗體3F9變異體且評估其下調SIRPA及CD32A/B之能力，與親本抗-SIRPA抗體m3F9及嵌合抗-SIRPA抗體3F9 huIgG1相比較。用抗-SIRPA DyLight650(純系SA56)及抗-CD32A/B FITC(純系FUN2)偵測SIRPA及CD32A/B表現。親和力成熟抗體3F9-14、3F9-18、3F9-20及3F9-22將SIRPA下調至與親本抗-SIRPA m3F9抗體所觀測到之類似含量(資料未示出)。然而，相同的親和力成熟抗-SIRPA抗體僅最低限度地改善CD32A/B下調，相比於嵌合抗-SIRPA 3F9 huIgG1抗體所觀測到之下調而言。此等結果指示，增強抗體與抗原之親和力可補償對目標受體(亦即SIRPA)下調之Fc依賴性，但不補償與FcγR之Fc介導之相互作用。
為了確定Fc工程化是否進一步增強親和力成熟抗-SIRPA抗體之SIRPA下調，將SELF點突變引入抗-SIRPA 3F9-22 huIgG1抗體之Fc域中。將來自4個健康供體之初代人類巨噬細胞用遞增濃度之攜帶野生型人類IgG1 Fc或人類IgG1 S267E/L328F Fc(SELF)的人類化抗-SIRPA 3F9-22抗體處理隔夜。用抗-SIRPA DyLight650(純系SA56)偵測SIRPA表現。藉由qPCR針對CD32A-R/H131多形現象對血液供體進行基因分型。圖8A及圖8B展示此等實驗之典型結果，比較兩種Fc變異體之活性。在CD32A-H131對偶基因同型接合(藉由qPCR驗證供體516及517)的個體之間，抗-SIRPA 3F9-22抗體之兩種Fc變異體均將SIRPA下調至與在人類 巨噬細胞上觀測到之含量類似的含量(圖8B)。此結果指示，增強與FcγR2B之結合無法增強抗體介導之SIRPA下調。
在CD32A-H131及-R131對偶基因均異型接合的個體中，抗-SIRPA 3F9-22 hIgG1 Fc變異體顯示比用SELF Fc變異體所觀測到之下調更大的最大SIRPA下調(圖8A)。SELF Fc可以限制此功能，而非增強SIRPA下調。值得注意的是，SELF突變增強對CD32B以及CD32A-R131對偶基因之Fc親和力。鑒於人類巨噬細胞之CD32A表現量大於CD32B之表現量，來自表現CD32A-R131之個體的巨噬細胞可以多價螯合遠離SIRPA或CD32B之抗-SIRPA抗體3F9-22以限制最大下調活性。
下表15提供人類巨噬細胞株U937上抗體介導之SIRPA及CD32下調結果的彙總。在此等研究中，比較本發明之抗-SIRPA抗體與先前所述之抗-SIRPA抗體KWAR23(揭示於國際專利申請公開案第WO2015/138600號中)。如表15中所示，本發明之抗-SIRPA抗體下調或降低U937細胞中SIRPA之細胞表面表現，且最大下調百分比介於68%與76%之間。藉由比較，抗-SIRPA抗體KWAR23僅能夠將SIRPA之細胞表面表現下調9%。
表15亦顯示，本發明之抗-SIRPA抗體可有效下調或降低CD32在U937細胞中之細胞表面表現。如表中所示，本發明之抗-SIRPA抗體以介於49%與73%之間的最大下調百分比下調或降低此等細胞中之CD32細胞表面表現。
Figure 108117983-A0305-02-0184-21
Figure 108117983-A0305-02-0185-22
實例9：親和力成熟抗-SIRPA抗體在巨噬細胞中降解SIRPA
藉由FACS量測抗體介導之受體下調證實，抗-SIRPA抗體之目標參與降低細胞表面表現。為了確定內化受體是否降解及隨後是否再循環至細胞表面，藉由西方墨點法(western blotting)如下分析人類巨噬細胞之總SIRPA蛋白質含量。將單核球衍生之初代人類巨噬細胞用5μg/ml之同型對照或抗-SIRPA 3F9-22 A330S/P331S(ASPS)Fc變異體處理隔夜。收集細胞，將其用冷PBS洗滌，且用補充有HALT蛋白酶/磷酸酶抑制劑之RIPA緩衝劑在冰上溶解15分鐘。使溶解細胞離心以沈澱細胞膜部分且收集涵蓋總細胞溶菌液之上清液部分。如圖9A中所示，將來自經同型對照抗體或抗-SIRPA抗體3F9-22處理之巨噬細胞的遞增量之細胞溶菌液部分加載至SDS-PAGE上且用抗原特異性抗體對SIRPA蛋白質進行免疫墨點法。在圖9A中，將5μg、10μg及20μg全細胞溶菌液加載至SDS-PAGE上且用抗-SIRPA細胞質域(a-SIRPAct)進行免疫墨點法。在經同型對照處理之巨噬細胞中偵測到隨SIRPA之預測分子量遷移的條帶，但未在經抗-SIRPA 3F9-22抗體處理之巨噬細胞中觀測到該條帶。在類似實驗中，將來自經同型對照處理或經抗體3F9-22 ASPS處理之巨噬細胞的細胞溶菌液加載至SDS-PAGE上且對SIRPA及SHP-2進行免疫墨點法，SHP-2為可以與SIRPA及其他ITIM受體締合的酪胺酸磷酸酶。在圖9B中，將20μg全細胞溶菌液加載至SDS-PAGE上且用a-SIRPAct及抗-SHP2探測。墨點法表明，藉由mAb 3F9-22處理，SIRPA蛋白質含量降低。如圖9B中所示，抗-SIRPA抗體3F9-22刺激可導致SIRPA而非SHP2之降解。
實例10：親和力成熟抗-SIRPA抗體刺激巨噬細胞中之腫瘤細胞吞噬作用
先前實驗證實，親和力成熟抗-SIRPA抗體保留下調SIRPA及CD32A/B之能力，導致SIRPA在人類巨噬細胞中降解。分析本發明之親和力成熟抗體誘導腫瘤細胞吞噬作用之能力。將初代人類巨噬細胞用同型對照或3F9-22人類IgG1或3F9-22 SELF處理隔夜以評定對抗體功能之Fc依賴性作用。將經pHrodo標記之Raji細胞與巨噬細胞混合且在37℃下培育2小時。藉由計數CD14/pHrodo雙陽性巨噬細胞之百分比而量測吞噬活性。結果呈現為pHrodo/CD14雙陽性巨噬細胞群體之百分比的增加倍數。另外，顯示吞噬作用後之CD14表現量。如圖10A中所示，抗-SIRPA抗體3F9-22之兩種Fc變異體均增強Raji細胞吞噬作用，相對於經同型對照處理之巨噬細胞而言。儘管抗體3F9-22 SELF似乎誘導比抗體3F9-22 huIgG1更大的吞噬作用，但此差異未達到統計顯著性。另外，兩種抗-SIRPA 3F9-22 Fc變異體均將CD14表現下調至類似程度，其指示吞噬活性及巨噬細胞活化狀態之類似誘導。
拮抗SIRPA-CD47信號傳導軸之標誌為調理素化腫瘤細胞之抗體依賴性吞噬作用之增強。在圖10B中，評定經抗-SIRPA抗體3F9-22處理之巨噬細胞上在添加或不添加調理素化抗-CD20 huIgG1之情況下Raji細胞之吞噬作用。在經同型對照處理之巨噬細胞中，含抗-CD20 huIgG1之調理素化Raji細胞使腫瘤細胞之吞噬作用相比於非調理素化Raji細胞增強約50%。結果呈現為pHrodo/CD14雙陽性巨噬細胞群體之百分比。如先前所示，經抗-SIRPA抗體3F9-22 SELF或3F9-22 ASPS刺激之巨噬細胞將非調理素化Raji細胞之吞噬作用相對於經同型對照處理之巨噬細胞增強約30-40%。類似地，經抗-SIRPA抗體3F9-22處理之巨噬細胞將吞 噬作用相對於與抗-CD20調理素化Raji細胞混合的經對照處理之巨噬細胞增強約30%。向經抗-SIRPA抗體3F9-22處理之巨噬細胞添加抗-CD20調理素化Raji細胞顯示對吞噬作用之累加效應相對於用與非調理素化Raji細胞混合之經對照處理之巨噬細胞觀測到的累加效應增加約2倍。儘管抗體3F9-22之兩種Fc變異體均誘導腫瘤細胞吞噬作用，但SELF Fc變異體展現比ASPS Fc變異體統計顯著更大的吞噬活性。此等結果證實，本發明之親和力成熟抗-SIRPA抗體藉由拮抗SIRPA-CD47途徑增強巨噬細胞中之腫瘤細胞吞噬作用。
下表16提供關於在人類初代巨噬細胞中抗體介導之SIRPA及CD32下調測定的IC50值之彙總。另外，表16顯示人類初代巨噬細胞中與本發明之各種抗-SIRPA抗體有關的吞噬作用的增加倍數。在此等研究中，比較本發明之抗-SIRPA抗體與先前所述之抗-SIRPA抗體HEFLB(揭示於國際專利申請公開案第WO2017/178653號中)。如表16中所示，本發明之抗-SIRPA親和力成熟抗體具有較低的IC50值，相比於用抗-SIRPA 3F9 huIgG1抗體觀測到之IC50值而言。另外，抗-SIRPA抗體3F9-14、3F9-18、3F9-20及3F9-22顯示比抗-SIRPA抗體HEFLB低的IC50值。類似地，相比於抗-SIRPA抗體HEFLB，本發明之抗-SIRPA抗體顯示較佳的吞噬作用活性。
Figure 108117983-A0305-02-0187-23
n.d.=未測定，*相對於基線活性之增加倍數
實例11：親和力成熟抗-SIRPA抗體刺激M1及M2巨噬細胞中之腫瘤細胞吞噬作用
巨噬細胞響應於微環境線索而經歷深刻的表型轉化，獲得不同的促炎(M1)或抗炎(M2)表型。評估本發明之抗-SIRPA抗體在體內恆定(類M2)巨噬細胞及發炎性(類M1)巨噬細胞中誘導腫瘤細胞吞噬作用的能力。使用經Ficoll之密度梯度離心，自健康志願者之血液分離單核球。藉由在GM-CSF(800U/ml；Peprotech)或M-CSF(25ng/ml；Peprotech)存在下培養單核球6天，產生類M1及類M2巨噬細胞。將極化巨噬細胞用同型對照抗體或抗-SIRPA抗體3F9-22 Fc變異體處理隔夜。將經螢光標記之Raji細胞在存在或不存在調理素化抗-CD20 huIgG1之情況下與巨噬細胞在37℃下混合2小時。或者，將Raji細胞用單獨的抗-CD47 IgG4(純系hu5F9)或用抗-CD47及抗-CD20 huIgG1調理素化且添加至未經處理之巨噬細胞。藉由計數CD14/pHrodo雙陽性巨噬細胞之百分比而量測吞噬活性。
如圖11A中所示，經抗體3F9-22處理之類M2巨噬細胞之兩種Fc變異體相對於經對照處理之巨噬細胞均增強腫瘤細胞吞噬作用。與先前的觀測結果一致，相比於抗體3F9-22 huIgG1，SELF Fc變異抗體顯示非調理素化及調理素化Raji細胞之吞噬作用在統計學上顯著更大的增加。此外，經抗-SIRPA抗體3F9-22 SELF處理之類M2巨噬細胞將非調理素化及調理素化Raji細胞之吞噬作用增強至與經抗-CD47 IgG4處理之Raji細胞類似的程度。
自在GM-CSF存在下培養之單核球分化的類M1巨噬細胞具 有不同於MCSF衍生之類M2巨噬細胞的特性。例如，GM-CSF衍生之類M1巨噬細胞降低CD14、CD32A/B及SIRPA之表現。另外，類M1巨噬細胞似乎以比衍生自相同健康供體之類M2巨噬細胞(圖11B)更高的速率吞噬非調理素化Raji細胞。在用抗-SIRPA抗體3F9-22 Fc變異體刺激後，相對於經對照處理之巨噬細胞，類M1巨噬細胞將非調理素化Raji細胞之吞噬作用增加約50%。用抗-CD20 huIgG1調理素化Raji細胞不顯示經抗體3F9-22處理之類M1巨噬細胞的吞噬作用的累加效應，其與用類M2巨噬細胞獲得之觀測結果形成對比。類似地，在存在或不存在抗-CD20 huIgG1之情況下經抗-CD47 IgG4調理素化的Raji細胞當添加至類M1巨噬細胞中時亦不增加吞噬作用超過基線程度(圖11B)。因為GM-CSF衍生之巨噬細胞下調FcgR表現，所以此等細胞可具有較低的介導抗體依賴性吞噬作用的潛力。此等結果亦表明，抗-SIRPA抗體3F9-22藉由拮抗SIRPA以誘導M1及M2巨噬細胞中之吞噬作用而起作用，而抗-CD47抗體主要充當調理素化劑，其需要類M2巨噬細胞上之FcgR之參與以誘導吞噬作用。
實例12：組合療法增強親和力成熟抗-SIRPA抗體之抗腫瘤活性
稱為腫瘤起始細胞(tumor-initiating cell，TIC)或癌症幹細胞(cancer stem cell，CSC)的癌細胞小子集形成自我維持癌細胞之儲庫，其具有自我更新及維持腫瘤體積的能力。有證據表明，人類實體腫瘤細胞及CSC上調CD47表現以避開免疫監視機制，允許腫瘤細胞增殖及轉移。腫瘤球培養模型，其中癌細胞作為三維球狀細胞叢生長，被廣泛用於分析CSC之自我更新能力及更好地模擬活體內細胞生長條件。腫瘤球形成係基於在補充有生長因子，諸如表皮生長因子及鹼性纖維母細胞生長因子之無血清培養基中將癌細胞培養至超低附著培養盤上。將腫瘤球與初代人類巨 噬細胞共培養允許關於腫瘤細胞活力評定作為單一藥劑或與其他抗腫瘤療法組合的抗-SIRPA抗體。
MDA-MB-231細胞株為先前顯示形成腫瘤球的經充分表徵的人類三陰性乳癌細胞株。為了在共培養分析中量測腫瘤細胞活力，採用用於螢光素酶及GFP之組成性表現之慢病毒轉導MDA-MB-231細胞(MB231-Luc)。關於腫瘤球形成，將10,000個MB231-Luc細胞/孔接種至96孔盤上補充有肝素及氫皮質酮的StemXVivo無血清腫瘤球培養基(R&D Systems)中。腫瘤球培養基亦補充有MCSF以支持巨噬細胞活力。將MB231-Luc單獨或在50,000個巨噬細胞/孔存在下培養2-3天。藉由用添加至各孔之OneGlo試劑(Promega)量測螢光素酶活性且將樣品在室溫下在培養盤震盪器上培育3分鐘，定量腫瘤細胞活力。使用GEN5TM 2.04軟體，用BioTek SynergyTM微量培養盤讀取器偵測發光信號。
將組成性表現螢光素酶之MDA-MB-231乳癌細胞單獨地或在人類巨噬細胞存在下在補充有MCSF之無血清腫瘤球培養基中培養。將細胞在37℃下在存在或不存在抗-SIRPA抗體3F9-22之情況下用抗-EGFR(2μg/mL)、抗-PDL1(2μg/mL)或太平洋紫杉醇(0.5μM)處理2天。作為比較，用抗-CD47 IgG4處理單獨的或在巨噬細胞存在下的腫瘤細胞。藉由用OneGlo受質試劑量測螢光素酶活性而定量腫瘤細胞活力。如圖12A中所示，基於發光值，MB231-Luc細胞在含或不含巨噬細胞之培養物中增殖。抗-SIRPA抗體3F9-22僅在MB231-Luc細胞在巨噬細胞存在下形成腫瘤球時抑制腫瘤細胞活力。此結果證實，巨噬細胞在針對腫瘤活力最佳化之培養條件下保留腫瘤破壞潛力。在類似條件下，抗-CD47 IgG4不顯著抑制MB231-Luc活力。
在此腫瘤球活力分析中驗證抗-SIRPA抗體3F9-22之單一藥劑功效之後，進行額外研究以展現組合治療之效果。因為腫瘤細胞活力依賴於培養基中所存在之EGF，所以當MB231-Luc細胞單獨培養時，添加抗-EGFR阻斷抗體顯示出對腫瘤生長之顯著抑制。在未經處理之巨噬細胞存在下，抗-EGFR抗體之抗腫瘤活性未增強。然而，經抗-SIRPA抗體3F9-22處理之巨噬細胞將抗-EGFR抗體之抗腫瘤活性增強至統計顯著程度。在類似培養條件下，抗-PDL1抗體藉由誘導強烈的腫瘤細胞凋亡而顯示出意想不到的表型，無論巨噬細胞是否存在。當曝露於500nM太平洋紫杉醇時，MB231-Luc細胞活力亦降低，太平洋紫杉醇為常用於治療多種癌症的微管穩定化學治療劑。將太平洋紫杉醇與經抗-SIRPA抗體3F9-22處理之巨噬細胞組合亦顯示腫瘤細胞活力統計顯著減小。此等結果證實，本發明之抗-SIRPA抗體增強藉由除腫瘤細胞調理素化以外的各種作用機制起作用的抗腫瘤療法之活性。
將組成性表現螢光素酶之MDA-MB-231乳癌細胞單獨地或在人類巨噬細胞存在下在補充有MCSF或MCSF+IL-4+IL-10之無血清腫瘤球培養基中培養。如有指示，將細胞用抗-SIRPA抗體3F9-22或抗-CD47 IgG4在37℃下處理3天。藉由量測在添加含有螢光素酶受質之OneGlo試劑後的發光值，定量腫瘤細胞活力。偶爾，與MB231-Luc細胞共培養的來自健康志願者之單核球衍生之巨噬細胞在無處理之情況下抑制腫瘤細胞活力(圖12B)。為了確保與MB231-Luc細胞共培養之巨噬細胞採用更像腫瘤的免疫抑制表型，給腫瘤球培養基補充IL-4及IL-10。如圖12B中所示，單獨培養之MB231-Luc細胞在補充有MCSF或MCSF加IL-4及IL-10之培養基中同樣良好地增殖。然而，在僅補充有MCSF之培養基 中，來自供體570之巨噬細胞將腫瘤細胞活力降低至統計顯著程度。此抑制藉由添加IL-4及IL-10反轉，證明不同培養策略極化巨噬細胞以調節腫瘤細胞生長。重要的是，在兩種生長條件下，抗-SIRPA抗體3F9-22處理巨噬細胞均顯著降低腫瘤細胞活力。
實例13：親和力成熟抗-SIRPA抗體增強T細胞增殖
T細胞與抗原呈現細胞(antigen presenting cell，APC)形成免疫突觸以起始T細胞活化及增殖。T細胞上之CD47表現可藉由經由SIRPA向APC傳遞抑制信號來抵抗活化。然而，T細胞亦表現SIRPG，SIRP家族之能夠結合在APC上表現之CD47的另一成員。SIRPG(T細胞)-CD47(APC)相互作用已證明可穩定免疫突觸及促進T細胞活化及增殖。儘管抗-CD47抗體阻斷經由SIRPA遞送之抑制信號，但是抗-CD47抗體亦阻斷來自SIRPG結合之刺激效應，且因此，可以證明在產生有效的抗腫瘤T細胞反應方面係有害的。因此，拮抗性抗-SIRPA抗體藉由抑制SIRPA信號傳導而不破壞免疫突觸中之關鍵相互作用來避開此潛在缺點。為了測試此假設，在單向及雙向MLR分析中評估抗-SIRPA抗體。
MLR分析之原理為：衍生自一個供體之APC，通常為DC，將MHC分子上之肽呈遞給自另一供體分離的T細胞。一小部分T細胞將表現能夠識別MHC：肽複合物之TCR且在協同刺激後增殖。在此單向MLR中，來自一個供體之細胞參與抗原呈現且來自另一供體之細胞藉由增殖作出反應。在雙向MLR中，兩種供體均為反應貢獻APC及T細胞；因此，兩個分開的T細胞群體藉由增殖作出反應。
抗-SIRPA抗體對T細胞增殖之影響最初在雙向MLR分析中評定。將PBMC自健康供體分離且在遞增濃度之3F9-22 Fc變異體或同型 對照存在下共培養3天。藉由定量代謝活性細胞之存在作為細胞數量之指示而估計T細胞增殖。用CellTiter Glo試劑(Promega)定量代謝活性，該試劑產生與所存在之ATP之量成比例的發光信號。如圖13A中所示，經抗-SIRPA抗體3F9-22處理之PBMC顯示發光相對於經同型處理之PBMC增加約1.5倍，其表明T細胞增殖增加。相比於先前所述之吞噬作用分析，抗體3F9-22 huIgG1 Fc變異體傾向於比SELF Fc變異體更有效地刺激T細胞增殖。
為了確定抗-SIRPA抗體3F9-22所觀測到之增加的發光是否特異性針對抗-SIRPA抗體，用抗-CD47抗體重複雙向MLR分析。自兩個健康供體分離PBMC且將100,000個來自各供體之細胞與遞增濃度之測試抗體或同型對照抗體混合在一起。在共培養3天後，用CellTiter Glo試劑量測細胞增殖。如圖13B中所示，抗-SIRPA抗體3F9-14及3F9-22 huIgG1及ASPS Fc變異體將發光信號相對於經同型對照抗體處理之PBMC所觀測到之發光信號增加約70%。在相同條件下，SELF Fc上之抗-SIRPA抗體(3F9-14 SELF及3F9-22 SELF)未能相對於對照增加發光信號，建立對抗體功能之另一Fc依賴性作用。相比於抗體3F9-22 huIgG1，抗-CD47處理顯示發光存在約10%的邊際增加。綜合而言，來自雙向MLR實驗之結果表明，用抗-SIRPA抗體3F9-22 huIgG1拮抗SIRPA可促進T細胞增殖。
因為雙向MLR中之定量代謝活性為T細胞增殖之間接量度，所以進行更傳統的單向MLR分析以確認抗-SIRPA抗體3F9-22 huIgG1所觀測到之刺激效應。初代人類樹突狀細胞(DC)係衍生自健康供體之單核球且與經CFSE染料標記之同種異體T細胞以1：5比率共培養。將樹突狀細胞用抗-SIRPA抗體3F9-22 Fc變異體或抗-CD47(hu5F9)或同型 對照抗體處理且在37℃下培育5天。藉由用抗CD3 APC對T細胞染色且對CFSE低群體進行閘控(gating)來量測T細胞增殖。圖14A顯示，相對於經同型或抗-CD47處理之DC，經抗體3F9-22 huIgG1或ASPS處理之來自不同供體之DC將T細胞增殖增加約50%。此T細胞增殖增加與雙向MLR中經抗體3F9-22 huIgG1處理之PBMC所觀測到之發光增加成比例。圖14B顯示圖14A中所呈現之資料的代表性FACS圖。來自單向及雙向MLR之結果從而表明，用抗-SIRPA抗體3F9-22 huIgG1拮抗SIRPA而不阻斷SIRPG-CD47相互作用可促進T細胞增殖。
實例14：親和力成熟抗-SIRPA抗體增強促炎性細胞介素釋放
為了進一步區分抗-SIRPA抗體3F9-22 Fc變異體之活性，將來自兩個健康志願者之初代人類巨噬細胞用丟失劑量LPS與抗-SIRPA抗體3F9-22或同型對照抗體組合刺激隔夜。在圖15A中，將來自2個健康供體之初代人類巨噬細胞在37℃下用0.5ng/mL LPS與抗-SIRPA抗體3F9-22 Fc變異體或同型對照抗體組合刺激隔夜。將上清液部分收集且藉由ELISA分析TNFα含量。在圖15B中，將初代人類巨噬細胞在37℃下用0.5ng/mL LPS與遞增濃度之抗-SIRPA抗體3F9-22 Fc變異體或同型對照抗體組合刺激隔夜。將上清液部分收集且藉由ELISA分析TNFα釋放。如圖15A及圖15B中所示，相對於經同型對照抗體或抗體3F9-22 SELF協同刺激之細胞，經抗體3F9-22 ASPS協同刺激之巨噬細胞展現TNFα分泌顯著增加。抗體3F9-22 SELF Fc變異體顯示極小協同刺激活性。滴定抗-SIRPA抗體顯示類似模式，其中抗體3F9-22 huIgG1及ASPS變異體藉由LPS預致敏巨噬細胞以劑量依賴性方式明顯增加TNFα釋放，而抗體3F9-22 SELF顯示TNFα反應減弱且具有高變異性。此等結果證實，非CD47阻斷抗-SIRPA 抗體以Fc依賴性方式拮抗SIRPA以自ITIM信號傳導釋放抑制。
實例15：抗-SIRPA抗體結合位點之抗原決定基定位
使用藉由人類SIRPA cDNA序列之槍型突變誘發產生之丙胺酸掃描庫進行抗-SIRPA抗體之抗原決定基定位。對編碼C端V5抗原決定基標籤之SIRPA表現構築體進行高產量丙胺酸掃描突變誘發(概述於Davidson及Doranz,2014 Immunology 143,13-20中)以產生全面突變庫。使代表SIRPA細胞外域之殘基中之每一者(SEQ ID NO：1之胺基酸31-374)突變，大多數突變為丙胺酸，而丙胺酸密碼子突變為絲胺酸。
將排列在384孔微量培養盤中的SIRPA突變體庫純系單獨地轉染至HEK-293T細胞中且使其表現22小時。消化抗體以產生Fab，之後將細胞與在10%正常山羊血清(normal goat serum，NGS)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中稀釋之Fab一起培育。在庫篩選之前，使用針對表現野生型SIRPA之細胞的獨立免疫螢光滴定曲線確定初級Fab濃度以確保信號在線性偵測範圍內。使用10% NGS中之7.5μg/ml AlexaFluor488結合之二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Westgrove,PA)偵測Fab。將細胞用PBS洗滌兩次且再懸浮於含0.1% BSA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)之Cellstripper(Cellgro,Manassas,VA)中。在一些情況下，使用較為嚴格的條件，包括增加的pH、增加的溫度及增加的解離時間。使用Intellicyt高產量流式細胞儀(HTFC，Intellicyt,Albuquerque,NM)偵測平均細胞螢光。藉由減去來自經模擬物轉染之對照的信號且相對於來自經野生型SIRPA轉染之對照的信號標準化，相對於野生型SIRPA蛋白質反應性計算針對各突變純系之Fab反應性。
若庫純系內之突變殘基不支持測試Fab之反應性，但支持市 售參考抗體MAB4546(R&D Systems)或額外抗-SIRPA Fab之反應性，則將其鑑定為對Fab結合抗原決定基係「關鍵」的。此反向篩選(counter-screen)策略有助於排除局部摺疊異常或具有表現缺陷之SIRPA突變體。
國際專利申請案第PCT/US2017/65366號中描述抗-SIRPA抗體9C2。
mAb 9C2：重鏈可變域序列
EFQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYSLTGYNMNWVKQSRGKSLEWIGNINPHYGSSTYNQNFKDKATLTVDKSSSAAYMQFNSLTSEDSAVYYCAREGYDGVFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：45)
mAb 9C2：輕鏈可變域序列
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYVTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：46)
下表17描繪被鑑定為在篩選中關鍵的所有殘基之平均結合反應性及範圍。初級關鍵殘基定義為突變對於測試抗體結合為陰性(與WT之結合<30%)，但對於對照抗體為陽性(>80% WT)的殘基。圖16描繪SIRPA之晶體結構模型(PDB ID 2WNG；Hatherley等人，2009,J Biol Chem,284：26613-9)，以陰影球形式突出對於結合抗-SIRPA抗體3F9及9C2而言關鍵的殘基。
如表18中所指示，抗-SIRPA抗體3F9之結合中所涉及的關鍵SIRPA殘基包括以上所示之人類SIRPA v1序列之胺基酸殘基R282、Q284及G337。抗體9C2(如國際專利申請案第PCT/US2017/65366號中所揭示)之結合中所涉及的關鍵SIRPA殘基包括以上所揭示之人類SIRPA v1序列之胺基酸殘基Q281、R282、Q284、L285、W287、R295、E297、V302及W315。此等殘基位於SIRPA之近膜Ig域內，該近膜Ig域在SIRPA科學文獻中稱為D3域，此等殘基與人類SIRPA v1序列之胺基酸254-348對應。多份已公開報導表明，人類SIRPA之D3域與膠原凝集素(collectin)家 族中之模式識別分子結合，該等模式識別分子亦即界面活性劑蛋白D及A(分別為Sp-D及Sp-A)。
Figure 108117983-A0305-02-0197-24
Figure 108117983-A0305-02-0197-25
實例16：在同基因型腫瘤模型中抗-SIRPα抗體增強檢查點抑制劑之抗腫瘤活性
靶向SIRPA-CD47途徑之治療性抗體可依靠異種移植腫瘤模型進行概念驗證研究，其中免疫缺陷型NOD或NOG小鼠維持植入的人類癌細胞之生長。因為由NOD小鼠表現之鼠類SIRPA之對偶基因變異體結合人類CD47，所以此相互作用允許將人類細胞植入鼠類宿主。然而，此等小鼠亦可誇大該途徑之作用，因為NOD SIRPA以比人類SIRPA更大的親和力結合人類CD47。此外，免疫缺陷型小鼠品系中之PrkdcSCID及IL2RγNull突變消除T細胞、B細胞及NK細胞，從而使得骨髓細胞及先天免疫系統成為可供用於抑制腫瘤生長之僅有的效應細胞。腫瘤異種移植模型不允許詢問靶向先天免疫細胞之療法以引發或增強適應性抗腫瘤免疫反 應。因此，為了在免疫勝任型動物宿主之情況下評估本發明之人類抗-SIRPA抗體，將人類SIRPA及人類CD47之基因引入C57BL6/J小鼠品系中。
簡言之，使用UCSC基因組瀏覽器及來自NCBI之CloneDB鑑定人造細菌染色體(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)，其攜帶編碼人類SIRPA或編碼人類CD47之核酸，且具有側接序列以包括相關人類基因調節元件。鑑定一種BAC純系(BACRP11-636L228)，預測其含有用於人類SIRPA基因之編碼序列。鑑定另一BAC純系(BACRP11-671F8)，預測其含有用於人類CD47基因之編碼序列。隨後藉由使用標準原核注射(pronuclear injection)技術將經純化之BAC DNA注射至小鼠C57BL6/J合子中，產生攜帶感興趣的BAC純系之小鼠。合子返回至雌性小鼠，且針對所要轉殖基因之存在，對所得鼠類幼仔進行基因分型。隨後將含有轉殖基因之創始動物(founder animal)培育成非基因轉殖動物，且藉由PCR使用標準技術且另外藉由來自動物之周邊血液細胞的FACS染色，針對轉殖基因之表現篩選後代。使攜帶感興趣的各個別基因之BAC基因轉殖小鼠異種交配以便產生表現人類SIRPA及人類CD47之「人類化」小鼠。
除了如上所述工程化小鼠以表現人類SIRPA及人類CD47之外，亦工程化同基因型腫瘤細胞株以用人類CD47替換小鼠CD47。簡言之，利用CRISPR-Cas9技術將Cas9/導引RNA(gRNA)複合物引入MC38目標細胞中。Cas9/gRNA介導被靶向區域(小鼠CD47之外顯子2)處之插入或缺失形成，引起框移及/或過早停止，從而基因剔除內源性小鼠CD47基因之表現。在轉染gRNA及Cas9之後，藉由定序篩選單細胞衍生之純系且擴 增含有所要突變之同型接合純系。如圖17A(上圖)中所示，經抗小鼠CD47抗體染色之親本MC38細胞及小鼠CD47基因剔除細胞株(MC38-mCD47KO)之FACS分析證實此等工程化細胞中缺失小鼠CD47表現。隨後，用含有人類CD47基因插入之慢病毒轉導MC38-mCD47KO細胞。以嘌呤黴素(puromycin)選擇且擴增MC38-mCD47KO-huCD47+細胞。圖17A(下圖)顯示FACS直方圖，驗證人類CD47在所選細胞群體中之表現。
採用植入有MC38-mCD47KO-huCD47+細胞與T細胞檢查點抑制劑之組合的huSIRPA/huCD47 BACtg小鼠，使用小鼠結腸癌模型活體內評估本發明之抗-SIRPA抗體之抗腫瘤作用。在此等小鼠之右側腹皮下注射500,000個MC38細胞。當在細胞移植後大約十天將小鼠隨機分組時或當腫瘤達成80mm3之平均體積時，開始抗體療法。小鼠每週接受兩次10mg/kg抗-SIRPA抗體3F9 mIgG1或抗-SIRPA抗體3F9 mIgG2A之腹膜內(IP)注射，持續3週，與5mg/kg次最佳劑量之抗小鼠PDL1抗體(純系10F.9G2，Bioxcell)組合。當腫瘤達到約2000mm3之體積時，將小鼠處死。
圖17B顯示皮下植入有經工程化而缺乏小鼠CD47表現且過度表現人類CD47之MC38細胞(MC38-mCD47KO/huCD47+)的huSIRPa/huCD47 BAC基因轉殖小鼠的平均腫瘤生長曲線。將小鼠用同型對照抗體、抗小鼠PDL1抗體、抗-SIRPA抗體3F9 mIgG1加抗小鼠PDL1抗體或抗-SIRPA抗體3F9 mIgG2A加抗小鼠PDL1抗體處理，如所指示。當腫瘤平均值為80mm3時，開始處理。如圖17B中所示，相對於經同型對照抗體處理之動物，抗-PDL1抗體處理將腫瘤生長抑制20%，其不達成統計顯著性。然而，抗-PDL1抗體與抗-SIRPA抗體3F9 mIgG1或抗-SIRPA 抗體3F9 mIgG2A之組合療法在此等動物中進一步分別將腫瘤生長抑制40%及47%。圖17C顯示處理組內各動物之腫瘤體積的意大利麵條圖。除了少許不良反應者以外，在組合療法處理組中之大多數動物中腫瘤體積不超過1000mm3，而同型對照組或抗-PDL1抗體單一療法組中之若干動物中之腫瘤達到2000mm3限制。
此等結果證實，本發明之抗-SIRPA 3F9抗體在編碼人類SIRPA-CD47途徑之免疫勝任型動物模式中可有效增強檢查點抑制劑之抗腫瘤活性。此等結果指示，本發明之抗-SIRPA抗體適用於增強檢查點抑制劑之抗腫瘤活性。因此，本發明之抗-SIRPA抗體當與檢查點抑制劑療法組合使用時可有效治療癌症。
實例17：抗-SIRPα抗體下調小鼠同基因型腫瘤中之腫瘤浸潤性骨髓細胞上的SIRPA表現
先前實例證實本發明之抗-SIRPA抗體在人類SIRPA/CD47 BAC基因轉殖小鼠中之抗腫瘤活性。為了驗證抗腫瘤活性與腫瘤巨噬細胞上由抗體介導之SIRPA下調相關，在藥物投與後表徵腫瘤骨髓細胞。
在人類SIRPA/huCD47 BAC基因轉殖小鼠之右側腹皮下植入500,000個MC38-mCD47KO/huCD47+細胞。在投與抗體之前，小鼠中之腫瘤生長至約400mm3之平均體積。小鼠以3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg間隔三天接受兩次抗-SIRPA抗體3F9-22 mIgG2A之IP注射。對照小鼠以10mg/kg接受2次mIgG2A同型之IP注射。在投與第二劑量抗體之後1天、4天及8天，自小鼠收集腫瘤組織及脾臟。藉由用70μm細胞過濾器進行機械解離，將脾臟處理成單細胞懸浮液。隨後用PBS洗滌細胞且用ACK溶解緩衝液溶解紅血球。隨後，將細胞再懸浮於由PBS/2% FBS組成之 FACS緩衝液中且經製備用於染色。類似地，藉由用gentleMACSTM解離劑(Miltenyi Biotec)進行酶促及機械解離，將腫瘤組織處理成單細胞懸浮液。將組織勻漿經由70μm細胞過濾器過濾且再懸浮於由PBS/2% FBS組成之FACS緩衝液中用於染色。根據下圖對細胞染色：
Figure 108117983-A0305-02-0201-26
圖18A顯示在腫瘤浸潤性骨髓細胞(單核球及巨噬細胞)上SIRPA之表現隨時間推移之相對變化。腫瘤相關巨噬細胞定義為CD45+ CD11b+ F4/80+ Ly6C- Ly6G-細胞，而腫瘤浸潤性單核球定義為CD45+ CD11b+ F4/80- Ly6C+ Ly6G-細胞。相比於投與同型對照抗體之動物，投與抗-SIRPA抗體之動物在抗體投與後1天顯示腫瘤單核球及腫瘤巨噬細胞上之細胞表面SIRPA表現幾乎降低80%。在4天或8天後，在分別投與3mg/kg或10mg/kg抗-SIRPA抗體3F9-22 mIgG2A之小鼠中，SIRPA表現返回至基線水準。在投與30mg/kg抗-SIRPA抗體3F9-22 mIgG2A之小鼠中，SIRPA表現量穩定在低於基線約50%。
亦對脾區室進行免疫分析以確定是否可以確定與腫瘤微環境的任何相關性。相對於在腫瘤單核球中觀測到之情況，脾單核球似乎對抗體介導之受體下調更具抗性(圖18B)。脾單核球定義為CD45+ CD11b+ F4/80- Ly6C+ Ly6G-細胞。脾紅髓巨噬細胞定義為CD45+ CD11b- F4/80+ Ly6C-細胞。脾單核球在抗體投與後一天顯示約40%之最大SIRPA 下調且在稍後的時間點快速恢復受體表現。另一方面，脾紅髓巨噬細胞遵循與腫瘤巨噬細胞所觀測到的類似的SIRPA受體表現模式。
綜合而言，此等結果證實，本發明之抗-SIRPA抗體可有效降低(下調)巨噬細胞，特別是腫瘤相關巨噬細胞上之SIRPA含量，且巨噬細胞上SIRPA含量之減小或下調與本發明之抗-SIRPA抗體之抗腫瘤活性相關。
實例18：在人類免疫系統(HIS)小鼠中抗-SIRPA抗體下調腫瘤浸潤性骨髓細胞上之SIRPA表現
因為抗-SIRPA抗體之Fc域起受體下調及抗體功能的作用，所以採用經人類免疫系統復原之小鼠以比較不同Fc變異體與本發明之抗-SIRPA抗體之活性。HIS小鼠模型需要在用亞致死輻射預處理後將獲自臍帶血之CD34+人類造血幹細胞(hHSC)植入免疫缺陷小鼠(亦即NOG品系)中。HSC在周邊血液、骨髓、胸腺及脾臟(以及其他組織)中穩定地發展大量的細胞譜系，尤其是淋巴細胞群體。經工程化以表現人類GM-CSF及人類IL-3之NOG小鼠(NOG-EXL；Taconic)與其他小鼠品系相比提供支持更大的骨髓細胞分化的額外優點。HIS小鼠提供在植入有人類癌細胞株之小鼠中活體內研究人類腫瘤-免疫系統相互作用的機會。另外，HIS小鼠有助於評估治療性抗體候選物在活體內環境中的作用機制。
在小鼠之側腹區域以3×106個細胞/小鼠之細胞密度採用50%基質膠(目錄354234；Corning)皮下接種A375人類黑色素瘤細胞。腫瘤生長至400mm3之平均體積，隨後小鼠以10mg/kg間隔三天接受2次3F9-22 huIgG1 P331S(PS)、3F9-22 huIgG1 N325S/L328F(NSLF)或huIgG1同型對照之IP注射。在第二次注射抗體之後1天，收集血液、脾臟 及腫瘤組織。藉由用70μm細胞過濾器進行機械解離，將脾臟處理成單細胞懸浮液。用PBS洗滌細胞且用ACK溶解緩衝液溶解紅血球。隨後，將細胞再懸浮於由PBS/2% FBS組成之FACS緩衝液中且經製備用於染色。類似地，藉由用gentleMACSTM解離劑(Miltenyi Biotec)進行酶促及機械解離，將腫瘤組織處理成單細胞懸浮液。將組織勻漿經由70μm細胞過濾器過濾且再懸浮於由PBS/2% FBS組成之FACS緩衝液中用於染色。用ACK溶解緩衝液處理周邊血液細胞以溶解RBC且將其再懸浮於由PBS/2% FBS組成之FACS緩衝液中。根據下圖對細胞染色：
Figure 108117983-A0305-02-0203-27
對NOG-EXL小鼠植入來自兩個不同供體(供體A及B)之人類臍帶血衍生之CD34+造血幹細胞(HSC)。對所有小鼠皮下植入300萬個A375細胞，一種人類黑色素瘤細胞株。在抗體投與之前，腫瘤生長至約400mm3之平均體積。小鼠以10mg/kg間隔三天接受兩次抗-SIRPA抗體之IP注射。對照小鼠以10mg/kg接受2次huIgG1同型之IP注射。在投與第二劑量之抗體之後1天，自小鼠收集腫瘤組織。
圖19顯示在此等研究中在攜帶A375腫瘤之人類化NOG-EXL小鼠中抗體介導之SIRPA下調之研究設計及結果。圖19A顯示，對8 隻小鼠植入來自供體A之CD34+HSC且對29隻小鼠植入來自供體B之CD34+HSC。簡言之，自Taconic,NY獲得植入有來自2個不同供體之CD34+HSC的40隻小鼠。在植入後10週，在裝運之前，藉由流動式細胞測量術針對人類白血球復原對小鼠進行品質檢查。大多數小鼠(36/40)在周邊血液中含有>50% huCD45+細胞。
NOG-EXL小鼠中之腫瘤相關巨噬細胞定義為CD45+ CD11b+ CD14+ CD16+ CD3- CD19-細胞。圖19B顯示SIRPA在人類腫瘤巨噬細胞上之表現量，描繪為MFI值(左圖)或標準化值(右圖)。相比於同型對照組，抗-SIRPA抗體處理引起來自兩個供體之人類腫瘤巨噬細胞中SIRPA顯著下調。各供體之標準化MFI值揭示SIRPA表現減少約70%，其近似在活體外單核球衍生之巨噬細胞中及在BAC基因轉殖小鼠中之腫瘤巨噬細胞中觀測到之下調程度。在此等實驗中，在抗-SIRPA 3F9-22 PS Fc變異體與抗-SIRPA抗體之NSLF Fc變異體之間未觀測到顯著的活性差異。
除了SIRPA表現之外，亦分析來自此等實驗之腫瘤巨噬細胞以檢查M1標記物之表現。腫瘤巨噬細胞定義為huCD45+ huCD11b+ CD14+ huCD16+細胞。如圖20A中所示，本發明之抗-SIRPA抗體上調HLA-DR之表現。各供體之標準化MFI值顯示，抗-SIRPA抗體3F9-22 PS Fc變異體將兩個供體中之HLA-DR表現相對於在同型對照抗體處理之情況下觀測到之表現增加約3倍。相比之下，抗-SIRPA抗體3F9-22 NSLF Fc變異體將HLA-DR表現相對於在同型對照抗體處理之情況下觀測到之表現增加約1.5-2倍。藉由抗-SIRPA抗體3F9-22 NSLF Fc變異體，只有在供體B巨噬細胞上量測到之增加達到統計顯著性。類似地，本發明之抗-SIRPA 抗體僅增加在來自供體B之腫瘤巨噬細胞上之CD86表現(圖20B)。儘管PS及NSLF Fc變異體均使CD86表現相對於同型對照抗體組增加約40%，但是關於增加的CD86表現，僅PS Fc變異體達成統計顯著性。此等結果證實，抗-SIRPA抗體3F9-22之PS及NSLF Fc變異體均在人類腫瘤巨噬細胞上下調SIRPA及增加M1標記物；然而，在此等實驗中，PS變異體似乎在某種程度上比NSLF變異體更有效。
為了比較本發明之抗-SIRPA抗體在腫瘤及周邊免疫區室中之活性，亦評定周邊血液單核球及脾單核球中抗體介導之SIRPA下調。人類單核球群體定義為CD45+ CD11b+ CD14+ CD16- CD3- CD19-細胞。小鼠以10mg/kg間隔三天接受兩次抗-SIRPA抗體之IP注射。對照小鼠以10mg/kg接受2次huIgG1對照抗體之IP注射。在投與第二劑量之抗體之後1天，自小鼠收集脾臟及血液。如圖21A中所示，相比於抗-SIRPA抗體3F9-22 PS Fc變異體在脾單核球中所觀測到之SIRPA下調，抗-SIRPA抗體3F9-22 NSLF Fc變異體展現較佳的SIRPA下調。然而，在周邊血液單核球中，兩種Fc變異體展現類似的活性(圖21B)。本發明之抗-SIRPA抗體在衍生自供體B之單核球中比在衍生自供體A之單核球中顯示更大的受體下調，其可能與SIRPA在供體B中之單核球上比在供體A中之單核球上的基線表現更高有關。
綜合而言，此等結果證實，本發明之抗-SIRPA抗體可有效下調周邊血液單核球以及脾單核球中之SIRPA含量。
實例19：針對選擇性FcR參與工程化之抗-SIRPA抗體保留抗體介導之受體下調活性
為了進一步評估FcR在本發明之抗-SIRPA抗體之活性方面 的作用，用具有不同的FcR結合概況之不同的Fc域表現抗-SIRPA抗體3F9-22之可變域。使用生物層干涉法(BLI)在Pall ForteBio Octet RED96儀器上獲得抗-SIRPA抗體Fc變異體之FcR親和力量測。經固定之抗人類Fab-CH1抗體將人類化抗-SIRPA抗體3F9-22 Fc變異體捕捉在生物感測器上(10μg/mL，300秒加載時間)。用流經所捕捉之抗體的100nM可溶性人類FcR進行單循環動力學以記錄跡線(300秒締合時間，300秒解離時間)。使用9.0版ForteBio資料分析軟體進行資料分析。使用標準動力學緩衝劑(PBS，0.1% BSA，0.02% Tween-20，pH 7.2)進行分析及用於製備試劑。
衍生自由此等實驗獲得之感測器圖譜之曲線擬合分析的相對親和力量測結果概述於下表19中。Fc變異體展現所預測的FcR結合模式。例如，LALAPS Fc突變消除與除了高親和力受體FcgR1之外的所有FcR之結合。N325S/L328F(NSLF)Fc突變特異性地消除與人類FcgR3A之結合。類似地，IgG2及IgG4同型無法結合FcgR3A且僅IgG4保留與FcgR1之結合。
Figure 108117983-A0305-02-0206-28
隨後評定抗-SIRPA抗體3F9-22 Fc變異體下調人類單核球衍生之巨噬細胞中之SIRPA表現或含量的能力。如先前所描述，自健康供體之周邊血液分離人類單核球且藉由用人類M-CSF補充生長培養基使其在活體外分化成巨噬細胞。在分化後，收集人類巨噬細胞且將其接種至具 有遞增濃度之對照抗體或可溶性抗-SIRPA抗體之96孔組織培養盤上且在37℃下培育隔夜。使用屬於與抗-SIRPA抗體3F9-22不同的抗原決定基組的DyLight650結合之抗人類SIRPA抗體，藉由流動式細胞測量術分析細胞之SIRPA細胞表面表現。
如圖22中所示及表20中所概述，抗-SIRPA抗體3F9-22之大多數Fc變異體以類似的IC50值最大限度地下調巨噬細胞上之SIRPA細胞表面含量。然而，抗-SIRPA抗體3F9-22 LALAPS僅部分下調SIRPA細胞表面含量，證實在增強抗-SIRPA抗體之此活性方面涉及FcR參與。另外，因為不結合FcgR3A之Fc變異體顯示與結合所有FcR之抗-SIRPA抗體3F9-22 PS類似的受體下調，表明FcgR3A參與對於抗體介導之受體內化係非必需的。
Figure 108117983-A0305-02-0207-29
實例20：針對選擇性FcR參與工程化之抗-SIRPA抗體增強巨噬細胞對腫瘤細胞之吞噬作用
除了如上文所揭示之抗體介導之受體下調之外，採用抗-SIRPA抗體3F9-22之不同Fc變異體評估FcR在抗-SIRPA抗體介導增強腫瘤細胞吞噬作用方面的作用。另外，平行評定靶向此途徑之其他抗體的吞噬活性。
將初代人類巨噬細胞用對照抗體或指定測試抗體處理隔夜。將腫瘤細胞用CFSE染料標記且添加至巨噬細胞中，在37℃下隔夜。 第二天，將巨噬細胞收集且在冰上用抗-CD14 APC在含有FcR阻斷抗體之FACS緩衝液中染色。藉由計數CD14/CFSE雙陽性巨噬細胞之百分比而量測吞噬活性。
此等實驗之結果顯示於圖23中且呈現為CD14/CFSE雙陽性巨噬細胞群體之百分比的增加倍數。如圖23中所示及下表21中所概述，抗-SIRPA抗體3F9-22 PS及抗-SIRPA抗體3F9-22 NSLF變異體均顯著地增強A375黑色素瘤細胞之吞噬作用，相對於在經對照抗體處理之巨噬細胞中觀測到之吞噬作用而言。所觀測到之吞噬作用增強似乎與在此等研究中測試之抗-CD47抗體(aCD47)相當，其主要藉由針對ADCP調理素化表現CD47之腫瘤細胞起作用。相比之下，兩種不同的CD47阻斷抗-SIRPA抗體KWAR23(參見WO2015/138600)及18D5(參見WO2017/178653)未能顯示腫瘤細胞吞噬作用之任何增強。此等結果證實，抗-SIRPA抗體3F9-22之PS及NSLF Fc變異體均保留在不存在調理素化抗腫瘤抗原抗體的情況下增強腫瘤細胞吞噬作用之特性。因為本發明之抗-SIRPA抗體關於SIRPA/CD47相互作用係非阻斷的，所以此等結果亦顯示，相比於非阻斷抗-SIRPA抗體KWAR23及18D5所觀測到之腫瘤細胞吞噬作用，本發明之非阻斷抗-SIRPA抗體可有效增加或增強腫瘤細胞吞噬作用。
Figure 108117983-A0305-02-0208-30
實例21：抗-SIRPA抗體3F9-22變異體不誘導紅血球及血小板計數改變
已有報導指出，投與至非人類靈長類動物之抗-CD47抗體5F9造成貧血(Liu等人，2015,PLOS ONE,DOI：10.1371/journal.pone.0137345)且投與至人類之抗-SIRPAFc TTI-621造成血小板劑量依賴性降低(Ansell等人，2016,Blood 128：1812)。為了檢查本發明之抗-SIRPA抗體是否對活體內紅血球計數或血小板計數造成任何影響，進行以下研究。將雌性食蟹獼猴分為五組且投與對照抗體、抗-SIRPA抗體3F9-22 PS、抗-SIRPA抗體3F9-22 IgG4、抗-SIRPA抗體3F9-22 IgG2或抗-SIRPA抗體3F9-22 NSLF，如下表22中所指示。藉由靜脈內輸注經由隱靜脈向動物投與抗體。
Figure 108117983-A0305-02-0209-31
在給藥前階段期間且隨後在抗體投與後大約72、168、240、408、576、672及744小時，經由股靜脈自動物收集血液一次用於紅血球(RBC)計數及血小板計數。
如圖24中所示，在此等實驗之過程中，抗-SIRPA抗體3F9-22 PS、3F9-22 IgG4、3F9-22 IgG2及3F9-22 NSLF中之任一者皆不改變紅血球及血小板計數。
本發明之某些額外抗-SIRPA抗體序列如下所示。加底線的 胺基酸指示以下抗-SIRPA抗體之胺基酸序列中之某些差異。
3F9-22-IgG1 WT重鏈(SEQ ID NO：47)
Figure 108117983-A0305-02-0210-32
3F9-22 huIgG1 PS重鏈(SEQ ID NO：48)
Figure 108117983-A0305-02-0210-33
3F9-22 SELF重鏈(SEQ ID NO：49)
Figure 108117983-A0305-02-0210-34
3F9-22 hIgG1 NSLF重鏈(SEQ ID NO：53)
Figure 108117983-A0305-02-0210-35
3F9-22 hIgG1 LALAPS重鏈(SEQ ID NO：54)
Figure 108117983-A0305-02-0211-36
3F9-22 huIgG1輕鏈(SEQ ID NO：50)
Figure 108117983-A0305-02-0211-37
3F9-14 huIgG1 WT重鏈(SEQ ID NO：51)
Figure 108117983-A0305-02-0211-38
3F9-14 PS重鏈(SEQ ID NO：57)
Figure 108117983-A0305-02-0211-39
3F9-14 SELF重鏈(SEQ ID NO：52)
Figure 108117983-A0305-02-0211-291
3F9-14 NSLF重鏈(SEQ ID NO：55)
Figure 108117983-A0305-02-0212-41
3F9-14 LALAPS重鏈(SEQ ID NO：56)
Figure 108117983-A0305-02-0212-42
3F9-14 huIgG1輕鏈(SEQ ID NO：50)
Figure 108117983-A0305-02-0212-43
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<223> /注意=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 29
Figure 108117983-A0305-02-0224-232
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 30
Figure 108117983-A0305-02-0224-234
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 31
Figure 108117983-A0305-02-0224-237
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 32
Figure 108117983-A0305-02-0225-286
<210> 33
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 33
Figure 108117983-A0305-02-0225-238
<210> 34
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 34
Figure 108117983-A0305-02-0226-131
<210> 35
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 35
Figure 108117983-A0305-02-0226-239
Figure 108117983-A0305-02-0227-240
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 36
Figure 108117983-A0305-02-0227-241
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 37
Figure 108117983-A0305-02-0227-243
Figure 108117983-A0305-02-0228-244
<210> 38
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 38
Figure 108117983-A0305-02-0228-138
<210> 39
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 39
Figure 108117983-A0305-02-0229-245
<210> 40
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 40
Figure 108117983-A0305-02-0229-246
<210> 41
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 41
Figure 108117983-A0305-02-0230-247
<210> 42
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 42
Figure 108117983-A0305-02-0230-248
Figure 108117983-A0305-02-0231-249
<210> 43
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 43
Figure 108117983-A0305-02-0231-250
<210> 44
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 44
Figure 108117983-A0305-02-0231-251
Figure 108117983-A0305-02-0232-146
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108117983-A0305-02-0232-287
<210> 46
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 46
Figure 108117983-A0305-02-0233-253
<210> 47
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 47
Figure 108117983-A0305-02-0233-254
Figure 108117983-A0305-02-0234-255
Figure 108117983-A0305-02-0235-152
<210> 48
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 48
Figure 108117983-A0305-02-0235-256
Figure 108117983-A0305-02-0236-154
Figure 108117983-A0305-02-0237-155
<210> 49
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 49
Figure 108117983-A0305-02-0237-156
Figure 108117983-A0305-02-0238-157
Figure 108117983-A0305-02-0239-257
<210> 50
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 50
Figure 108117983-A0305-02-0239-258
Figure 108117983-A0305-02-0240-259
<210> 51
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 51
Figure 108117983-A0305-02-0240-260
Figure 108117983-A0305-02-0241-162
Figure 108117983-A0305-02-0242-292
<210> 52
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 52
Figure 108117983-A0305-02-0242-261
Figure 108117983-A0305-02-0243-165
Figure 108117983-A0305-02-0244-262
<210> 53
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 53
Figure 108117983-A0305-02-0244-263
Figure 108117983-A0305-02-0245-264
<210> 54
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 54
Figure 108117983-A0305-02-0246-265
Figure 108117983-A0305-02-0247-170
<210> 55
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 55
Figure 108117983-A0305-02-0248-266
Figure 108117983-A0305-02-0249-172
<210> 56
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 56
Figure 108117983-A0305-02-0249-267
Figure 108117983-A0305-02-0250-174
Figure 108117983-A0305-02-0251-175
<210> 57
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 57
Figure 108117983-A0305-02-0251-268
Figure 108117983-A0305-02-0252-178
Figure 108117983-A0305-02-0253-179
<210> 58
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 58
Figure 108117983-A0305-02-0253-269
Figure 108117983-A0305-02-0254-288
<210> 59
<211> 343
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Figure 108117983-A0305-02-0254-270
Figure 108117983-A0305-02-0255-183
<210> 60
<211> 342
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 60
Figure 108117983-A0305-02-0255-271
Figure 108117983-A0305-02-0256-185
<210> 61
<211> 343
<212> PRT
<213> 狨
<400> 61
Figure 108117983-A0305-02-0257-272
Figure 108117983-A0305-02-0258-273
<210> 62
<211> 342
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 62
Figure 108117983-A0305-02-0258-188
Figure 108117983-A0305-02-0259-189
<210> 63
<211> 343
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 63
Figure 108117983-A0305-02-0259-274
Figure 108117983-A0305-02-0260-275
Figure 108117983-A0305-02-0261-276
<210> 64
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 64
Figure 108117983-A0305-02-0261-277
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 65
Figure 108117983-A0305-02-0261-278
<210> 66
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 66
Figure 108117983-A0305-02-0262-289
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=人工序列之描述：合成肽」
<400> 67
Figure 108117983-A0305-02-0262-279
<210> 68
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 68
Figure 108117983-A0305-02-0262-280
Figure 108117983-A0305-02-0263-281
<210> 69
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 69
Figure 108117983-A0305-02-0263-282
<210> 70
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=人工序列之描述：合成多肽」
<400> 70
Figure 108117983-A0305-02-0264-283

Claims (62)

  1. 一種與人類SIRPA特異性結合之經分離抗體，其中該經分離抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：22、23及24之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含選自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17、18及19之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之經分離抗體，其中該重鏈可變區包含一、二、三或四個構架區，其選自包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VH FR1、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VH FR2、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的VH FR3及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的VH FR4；及/或其中該輕鏈可變區包含一、二、三或四個構架區，其選自包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的VL FR1、包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的VL FR2、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VL FR3及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL FR4。
  3. 如請求項1或2之經分離抗體，其中該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：33、34及35之胺基酸序列至少90%或至少95%或至少99%相同的胺基酸序列。
  4. 如請求項1或2之經分離抗體，其中該輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43及44之胺基酸序列至少90%或至少95%或至少99%相同的胺基酸序列。
  5. 一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該經分離抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；HVR-H2，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：24之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含選自SEQ ID NO：16之胺基酸序列。
  6. 如請求項5之經分離抗體，其中該重鏈可變區包含一、二、三或四個選自以下之構架區：包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VH FR1；包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VH FR2；包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的VH FR3；及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的VH FR4；及/或其中該輕鏈可變區包含一、二、三或四個選自以下之構架區：包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的VL FR1；包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的VL FR2；包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VL FR3；及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL FR4。
  7. 如請求項5或6之經分離抗體，其中該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：35之胺基酸序列至少90%或至少95%或至少99%相同的胺基酸序列。
  8. 如請求項5或6之經分離抗體，其中該輕鏈可變區包含與選自SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%或至少95%或至少99%相同的胺基酸序列。
  9. 一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該經分離抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：33、34及35之胺基酸序列，且其中該輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：36、37、38、39、40、41、42、43及44之胺基酸序列。
  10. 一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該經分離抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，且其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列。
  11. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體為單株抗體。
  12. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體為人類化抗體。
  13. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體為Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv或scFv片段。
  14. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該經分離 抗體為多價抗體。
  15. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體屬於IgG類、IgM類或IgA類。
  16. 如請求項15之經分離抗體，其中該經分離抗體屬於該IgG類且呈IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
  17. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體與抑制性Fc受體結合。
  18. 如請求項17之抗體，其中該抑制性Fc受體為抑制性Fc-γ受體IIB(FcgRIIB)。
  19. 如請求項18之經分離抗體，其中該經分離抗體降低FcgRIIB之細胞含量。
  20. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體具有人類IgG1同型且在Fc區中包含選自由以下組成之群之胺基酸殘基處的一或多個胺基酸取代：N297A、D265A、D270A、L234A、L235A、G237A、P238D、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、L234V、L234F、L235E、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、 P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、N325S、L328F、T394D及其任何組合，其中該等殘基之編號係根據EU編號，或在該Fc區中包含對應於甘胺酸236之位置處的胺基酸缺失。
  21. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體包含選自由以下組成之群之殘基位置處的一或多個胺基酸取代：C127S、L234A、L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、N325S、L328F、A330S、P331S、E345R、E430G、S440Y及其任何組合，其中該等胺基酸殘基之編號係根據EU或Kabat編號。
  22. 如請求項21之經分離抗體，其中該經分離抗體包含N325S及L328F取代。
  23. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其為全長抗體，且其中該重鏈包含C端離胺酸殘基。
  24. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該重鏈不含C端離胺酸殘基。
  25. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該重鏈包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列。
  26. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該重鏈包 含除了SEQ ID NO：53之C端離胺酸殘基以外之SEQ ID NO：53的胺基酸序列。
  27. 如請求項1、2、5、6、9或10中任一項之經分離抗體，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
  28. 一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該經分離抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
  29. 一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該經分離抗體包含重鏈，該重鏈包含除了SEQ ID NO：53之C端離胺酸殘基以外之SEQ ID NO：53的胺基酸序列，且其中該經分離抗體包含輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
  30. 一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該經分離抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：53之胺基酸序列組成且該輕鏈由SEQ ID NO：50之胺基酸序列組成。
  31. 一種與人類SIRPA結合之經分離抗體，其中該經分離抗體包含重鏈，該重鏈由除了SEQ ID NO：53之C端離胺酸殘基以外之SEQ ID NO：53的胺基酸序列組成，且其中該經分離抗體包含輕鏈，該輕鏈由SEQ ID NO：50之胺基酸序列組成。
  32. 一種結合人類SIRPA之經分離抗體，其中該經分離抗體包含重鏈及輕鏈，其中a)該重鏈包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列；b)該重鏈包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列；c)該重鏈包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列；d)該重鏈包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列；e)該重鏈包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列；f)該重鏈包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列；g)該重鏈包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列；h)該重鏈包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列；或i)該重鏈包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
  33. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體， 其中該經分離抗體降低SIRPA之細胞表面含量，降低SIRPA之細胞內含量，降低SIRPA之總細胞含量或其任何組合。
  34. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體誘導SIRPA降解，誘導SIRPA裂解，誘導SIRPA內化，誘導SIRPA脫落，下調SIRPA表現或其任何組合。
  35. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體於活體外及/或活體內降低SIRPA之細胞表面含量。
  36. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體在人類單核球及/或人類巨噬細胞中下調SIRPA之表現。
  37. 如請求項36之經分離抗體，其中該經分離抗體在人類巨噬細胞中將SIRPA之表現下調70-95%。
  38. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體對人類SIRPA v1具有小於6nM之親和力(KD)。
  39. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體對人類SIRPA v1具有0.1nM至2nM之親和力(KD)。
  40. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體於活體外降低SIRPA之細胞表面含量，其中對人類SIRPA v1之半數最大有效濃度(EC50)為0.05至0.20nM，對人類SIRPA v2之半數最大有效濃度為0.05至0.10nM，及/或對食蟹獼猴SIRPA之半數最大有效濃度為0.05至1nM，係藉由流動式細胞測量術所量測。
  41. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體結合人類SIRPA、人類SIRPA v1、人類SIRPA v2、食蟹獼猴SIRPA、狨猴SIRPA及人類SIRPβ3。
  42. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體與SEQ ID NO：1之人類SIRPA v1之D3域結合。
  43. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體與SEQ ID NO：1之人類SIRPA v1之胺基酸殘基R282、Q284及G337結合。
  44. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體在M1巨噬細胞中增加腫瘤細胞吞噬作用，在M2巨噬細胞中增加腫瘤細胞吞噬作用，在巨噬細胞中下調CD14表現及/或其任何組合。
  45. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體， 其中該經分離抗體增強T細胞增殖。
  46. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體增強T細胞增殖而不阻斷SIRPA與CD47之相互作用。
  47. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體在單核球中刺激ROS產生及/或在單核球中增加IL-8表現。
  48. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體於活體內抑制腫瘤生長。
  49. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32中任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體在周邊血液中減少CD14+骨髓細胞之數目及/或在腫瘤中增加CD14+骨髓細胞之數目。
  50. 如請求項1、2、5、6、9、10、或28至32任一項之經分離抗體，其中該經分離抗體結合人類SIRPA，但不實質上阻斷CD47與SIRPA之結合。
  51. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至50中任一項之經分離抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  52. 一種經分離核酸，其包含編碼如請求項1至50中任一項之經分離抗體的核酸序列。
  53. 一種載體，其包含如請求項52之核酸。
  54. 一種經分離宿主細胞，其包含如請求項52之核酸或如請求項53之載體。
  55. 一種經分離宿主細胞，其表現如請求項1至50中任一項之經分離抗體。
  56. 一種組合物之用途，其係用於製備治療個體之癌症之藥物，其中該組合物包含治療有效量之如請求項1至50中任一項之經分離抗體。
  57. 如請求項56之用途，其中該癌症係選自肉瘤、膀胱癌、腦癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、腎盂癌、白血病、肺癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌及纖維肉瘤、多形性神經膠母細胞瘤；腎透明細胞癌；腎上腺皮質癌；膀胱尿道上皮癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、肺腺癌；胰臟腺癌、腎細胞癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、惰性B細胞淋巴瘤、侵襲性B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓白血病(CML)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓增生性贅瘤、乳房侵襲性癌、子宮 頸鱗狀細胞癌、子宮頸內腺癌、膽管癌、結腸腺癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腎難染細胞、腎乳頭狀細胞癌、較低級別神經膠質瘤、肝細胞癌、肺鱗狀細胞癌、間皮瘤、卵巢漿液性囊腺癌、胰臟腺癌、嗜鉻細胞瘤及副神經節瘤、前列腺腺癌、直腸腺癌、皮膚黑色素瘤、胃腺癌、睪丸生殖細胞腫瘤、甲狀腺癌、胸腺瘤、子宮體子宮內膜癌、子宮癌肉瘤及葡萄膜黑色素瘤。
  58. 如請求項56或57之用途，其中該用途進一步包含向該個體投與治療劑，該治療劑抑制或促效PD1、PDL1、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、CTLA4、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HVEM、LIGHT、BTLA、CD30、TIGIT、VISTA、KIR、GAL9、TIM1、TIM3、TIM4、A2AR、LAG3、DR-5、CD2、CD5、CD39或CD73。
  59. 如請求項56之用途，其中該用途進一步包含向該個體投與至少一種與抑制性檢查點分子特異性結合之抗體。
  60. 如請求項59之用途，其中該至少一種與抑制性檢查點分子特異性結合之抗體係選自抗-PD-L1抗體、抗-CTLA4抗體、抗-PD-L2抗體、抗-PD-1抗體、抗-B7-H3抗體、抗-B7-H4抗體及抗-HVEM抗體、抗-B-及T-淋巴細胞弱化因子(BTLA)抗體、抗殺手細胞抑制性受體(KIR)抗體、抗-GAL9抗體、抗-TIM-1抗體、抗-TIM3抗體、抗-TIM-4抗體、抗-A2AR抗體、抗-CD39抗體、抗-CD73抗體、抗-LAG-3抗體、抗磷脂醯絲胺酸抗 體、抗-CD27抗體、抗-CD30抗體、抗-TNFα抗體、抗-CD33抗體、抗-Siglec-5抗體、抗-Siglec-7抗體、抗-Siglec-9抗體、抗-Siglec-11抗體、拮抗性抗-TREM1抗體、拮抗性抗-TREM2抗體、抗-TIGIT抗體、抗-VISTA抗體、抗-CD2抗體、抗-CD5抗體及其任何組合。
  61. 如請求項56或57之用途，其中該用途進一步包含向該個體投與一或多種標準或研究用抗癌療法。
  62. 如請求項61之用途，其中該一或多種標準或研究用抗癌療法係選自放射線療法、細胞毒性化學療法、靶向療法、伊馬替尼(imatinib)療法、曲妥珠單抗(trastuzumab)療法、依那西普(etanercept)療法、過繼性細胞轉移(ACT)療法、嵌合抗原受體T細胞轉移(CAR-T)療法、疫苗療法及細胞介素療法。
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