BR112020003601B1 - Anticorpo, polinucleotídeo, vetor, células hospedeiras, método para fabricar um anticorpo, composição farmacêutica, combinação farmacêutica e usos de um anticorpo, de uma combinação farmacêutica e de uma composição farmacêutica - Google Patents

Anticorpo, polinucleotídeo, vetor, células hospedeiras, método para fabricar um anticorpo, composição farmacêutica, combinação farmacêutica e usos de um anticorpo, de uma combinação farmacêutica e de uma composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

a presente divulgação fornece anticorpos que se ligam ao cd137 humano ou a fragmentos de ligação ao antígeno destes, ácido nucleico que codifica os mesmos, composições terapêuticas destes e seu uso para potencializar a função das células t para regular positivamente as respostas imunes mediadas por células e para o tratamento de células t disfuncionais distúrbios, como imunidade a tumores, e para o tratamento de câncer.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[01] Este pedido reivindica o benefício prioritário do Pedido de Patente Internacional N° PCT/CN2017/098332, depositado em 21 de agosto de 2017, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[02] O conteúdo da seguinte submissão em arquivo de texto ASCII é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade: um formulário legível por computador (CRF) da Listagem de Sequência (nome do arquivo: 695402000341seqlist.txt, data de gravação: 20 de agosto de 2018, tamanho: 542 KB).
CAMPO DA INVENÇÃO
[03] A presente invenção refere-se aos anticorpos que se ligam ao CD137 humano ou aos seus fragmentos de ligação ao antígeno, ao ácido nucleico que o codifica, a suas composições terapêuticas e ao seu uso antitumoral.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[04] O CD137 (também chamado receptor CD137, 4-1BB, TNFRSF9, etc.) é uma proteína transmembranar da Superfamília de Receptor de Fator de Necrose Tumoral (TNFRS). A compreensão atual do CD137 indica que sua expressão geralmente depende da ativação e está presente em um amplo subconjunto de células imunes, incluindo células NK e NKT ativadas, células T reguladoras, células dendríticas (DC), mastócitos estimulados, células mieloides diferenciadoras, monócitos, neutrófilos e eosinófilos (Wang, 2009, Immunological Reviews 229: 192-215). A expressão de CD137 também foi demonstrada em vasculatura de tumor (Broll, 2001, Amer. J. Clin. Pathol. 115 (4):543-549; Seaman, 2007, Cancer Cell 11: 539-554) e em sítios de endotélio inflamado ou aterosclerótico (Drenkard, 2007 FASEB J. 21: 456-463; Olofsson, 2008, Circulation 117: 1292-1301). O ligante que estimula o CD137, isto é, o Ligante de CD137 (CD137L), é expresso em células que apresentam antígeno ativado (APCs), células progenitoras mieloides e células-tronco hematopoiéticas.
[05] O CD137 humano é uma proteína de 255 aminoácidos (N° de acesso do GenBank NM_001561; NP_001552; SEQ ID NO.: 1). A proteína compreende uma sequência de sinal (resíduos de aminoácidos 1-17), seguida por um domínio extracelular (169 aminoácidos), uma região transmembranar (27 aminoácidos) e um domínio intracelular (42 aminoácidos) (Cheuk ATC et al. 2004 Cancer Gene Therapy 11: 215-226). O receptor é expresso na superfície celular nas formas monômeras e dímeras e provavelmente trimeriza com o ligante de CD137 para sinalizar.
[06] Vários estudos de células T murinas e humanas indicam que o CD137 promove proliferação celular aumentada, sobrevivência e produção de citocinas (Croft, 2009, Nat Rev Immunol 9:271-285). Estudos indicaram que alguns mAbs agonistas de CD137 aumentam a expressão de moléculas coestimulatórias e aumentam acentuadamente as respostas de linfócitos T citolíticos, resultando em eficácia antitumoral em vários modelos. Os mAbs agonistas de CD137 demonstraram eficácia em contextos profiláticos e terapêuticos. Além disso, os modelos de tumor de monoterapia e de terapia de combinação de CD137 estabeleceram respostas de memória de células T protetoras antitumorais duráveis (Lynch, 2008, Immunol Rev. 22: 277-286). Também se demonstrou que os agonistas de CD137 inibem reações autoimunes em uma variedade de modelos de autoimunidade reconhecidos na técnica (Vinay, 2006, J Mol Med 84: 726-736). Esta dupla atividade do CD137 oferece o potencial de fornecer atividade antitumoral, ao mesmo tempo em que reduz os efeitos colaterais autoimunes que podem ser associados às abordagens de imunoterapia que quebram a tolerância imunológica.
[07] Há uma necessidade não atendida há muito tempo de anticorpos que se ligam ao CD137 humano, aumentam uma resposta mediada por CD137 e, portanto, fornecem uma terapêutica potencial para o tratamento de várias doenças e condições, incluindo câncer e doenças autoimunes. Além disso, existe uma necessidade de anticorpo anti-CD137 que possua reatividade cruzada entre diferentes espécies, como animais humanos e experimentais (camundongo, macaco, cão etc.) para permitir estudos com modelos animais e fornecer candidatos terapêuticos ao mesmo tempo.
SUMÁRIO
[08] É um objetivo da invenção fornecer uma molécula de ligação isolada que se ligue ao CD137 humano, como um anticorpo ou um fragmento de ligação deste, ou seu derivado. É outro objetivo da invenção fornecer uma composição compreendendo uma molécula de ligação que se liga a CD137. Também é um objetivo da presente invenção fornecer métodos para o tratamento de uma doença e/ou condição associada ou mediada pela sinalização de CD137 usando uma ou mais moléculas de ligação da invenção. Estes e outros objetos da invenção são descritos mais detalhadamente neste documento.
[09] Por conseguinte, em um aspecto, é fornecido neste documento um ou mais anticorpos (por exemplo, anticorpos isolados) ou um ou mais fragmentos de ligação a antígenos, que se ligam a um domínio extracelular do CD137 humano e que compreendem um ou mais (por exemplo, um ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais ou todas as 10) das seguintes características funcionais: (a) liga um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 34-108 da SEQ ID NO: 1; (b) não se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 109-112, 125, 126, 135-138, 150 e 151 da SEQ ID NO: 1; (c) liga-se ao CD137 humano com um KD de 100 nM ou menos; (d) possui atividade agonista em CD137 humano; (e) não se liga ao receptor humano OX40, CD40, GITR e/ou CD27 em concentrações de até 1000 nM; (f) possui reatividade cruzada com macaco, camundongo, rato e/ou cão CD137; (g) não induz efeito ADCC; (h) é capaz de inibir o crescimento de células tumorais; (i) tem efeito terapêutico em um câncer; e/ou (j) bloqueia a ligação entre CD137 e CD137L.
[10] Por conseguinte, em um aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo (por exemplo, um anticorpo isolado) ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a um domínio extracelular do CD137 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma HVR- H1, uma HVR-H2 e uma HVR-H3, em que a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (I): X1TFX2X3YX4IHWV (SEQ ID NO: 2), em que X1 é F ou Y, X2 é S ou T, X3 é G, N, ou S, e X4 é A, G ou W; Fórmula (II): YSIX1SGX2X3WX4WI (SEQ ID NO: 3), em que X1 é S ou T, X2 é H ou Y, X3 é H ou Y e X4 é A, D, G, N, S ou T; e Fórmula (III): FSLSTX1GVX2VX3WI (SEQ ID NO: 4), em que X1 é G ou S, X2 é A ou G e X3 é A, G, S ou T; em que a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (IV): LALIDW X1X2DKX3YSX4SLKSRL (SEQ ID NO: 5), em que X1 é A, D ou Y, X2 é D ou G, X3 é R, S ou Y e X4 é P ou T; Fórmula (V): IGX1IYHSGX2TYYX3PSLKSRV (SEQ ID NO: 6), em que X1 é D ou E, X2 é N ou S e X3 é N ou S; e Fórmula (VI): VSX1ISGX2GX3X4TYYADSVKGRF (SEQ ID NO: 7), em que X1 é A, G, S, V ou Y, X2 é A, D, S ou Y, X3 é D, G ou S, e X4 é S ou T; e em que a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (VII): ARX1GX2X3X4VX5GDWFX6Y (SEQ ID NO: 8), em que X1 é E ou G, X2 é E ou S, X3 é D ou T, X4 é A, T, ou V, X5 é A, I, L, T ou V, e X6 é A, D ou G.
[11] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo (por exemplo, um anticorpo isolado) ou um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um domínio extracelular do CD137 humano compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a cadeia pesada a região variável compreende uma HVR- H1, uma HVR-H2 e uma HVR-H3, em que a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (XII): X1TFSX2YWIHWV (SEQ ID NO: 853), em que X1 é F ou Y, e X2 é N ou S; Fórmula (XIII): YSIX1SGX2X3WX4WI (SEQ ID NO: 854), em que X1 é S ou T, X2 é H ou Y, X3 é H ou Y e X4 é A, D, G, N ou S; e Fórmula (XIV): FSLSTX1GVX2VX3WI (SEQ ID NO: 855), em que X1 é G ou S, X2 é A ou G e X3 é A, G ou S; em que a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (IV): LALIDWX1X2DKX3YSX4SLKSRL (SEQ ID NO: 5), em que X1 é A, D ou Y, X2 é D ou G, X3 é R, S ou Y e X4 é P ou T; e Fórmula (XV): VSX1ISGX2GX3X4TYYADSVKGRF (SEQ ID NO: 856), em que X1 é G, S, V ou Y, X2 é A, D, S ou Y, X3 é D, G ou S e X4 é S ou T; e em que a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (VII): ARX1GX2X3X4VX5GDWFX6Y (SEQ ID NO: 8), em que X1 é E ou G, X2 é E ou S, X3 é D ou T, X4 é A, T, ou V, X5 é A, I, L, T ou V, e X6 é A, D ou G.
[12] Em um aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo (por exemplo, um anticorpo isolado) ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a um domínio extracelular do CD137 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que a HVR -L1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (VIII): X1ASQX2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 9), em que X1 é Q ou R, X2 é D, G ou S, X3 é I ou V, X4 é G ou R, S ou T, X5 é P, R, S ou T, X6 é A, D, F, S, V ou Y, X7 é L ou V e X8 é A, G ou N; em que a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (IX): X1ASX2X3X4X5GX6 (SEQ ID NO: 10), em que X1 é A ou D, X2 é N, S ou T, X3 é L ou R, X4 é A, E ou Q, X5 é S ou T e X6 é I ou V; e em que a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (X): YCQQX1YX2X3X4T (SEQ ID NO: 11), em que X1 é A, G, S ou Y, X2 é Q, S ou Y, X3 é I, L, T ou Y, e X4 é I, S, V ou W; e Fórmula (XI): YCX1QX2X3X4X5PX6T (SEQ ID NO: 12), em que X1 é E ou Q, X2 é P, S ou Y, X3 é D, L, S, T ou Y, X4 é D, E, H, S ou T, X5 é D, LT ou W e X6 é L, P, R ou V.
[13] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo (por exemplo, um anticorpo isolado) ou um fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um domínio extracelular do CD137 humano compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a cadeia leve região variável compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (XVI): X1ASQX2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 857), em que X1 é Q ou R, X2 é D, G ou S, X3 é I ou V, X4 é G, R, S ou T, X5 é P, R, S ou T, X6 é A, F, S, V ou Y, X7 é L ou V e X8 é A ou G; em que a HVR- L2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (XVII): X1ASX2X3X4X5GX6 (SEQ ID NO: 858), em que X1 é A ou D, X2 é N ou S, X3 é L ou R, X4 é A, E, ou Q, X5 é S ou T e X6 é I ou V; e em que a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (XVIII): YCQQX1YX2X3WT (SEQ ID NO: 859), em que X1 é A ou G, X2 é S ou Y e X3 é I, L ou T.
[14] Em um aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo (por exemplo, um anticorpo isolado) ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a um domínio extracelular do CD137 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de: VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, VH32, VH33, VH34, VH35, VH36, VH37, VH38, VH39, VH40, VH41, VH42, VH43, VH44, VH45, VH46, VH47, VH48, VH49, VH50, VH51, VH52, VH53, VH54, VH55, VH56, VH57, VH58, VH59, ou VH60; e/ou a região variável da cadeia leve compreende HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 de: VL1, VL2, VH3, VL4, VH5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, VL34, VL35, VL36, VL37, VL38, VL39, VL40, VL41, VL42, VL43, VL44, VL45, VL46, VL47, VL48, VL49, VL50, VL51, VL52, VL53, VL54, VL55, VL56, VL57, VL58, VL59, ou VL60 (como mostrado na Tabela 1c). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve compreendem HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR -L1, HVR-L2 e HVR-L3 de: VH1 e VL1, VH2 e VL2, VH3 e VL3, VH4 e VL4, VH5 e VL5, VH6 e VL6, VH7 e VL7, VH8 e VL8, VH9 e VL9, VH10 e VL10, VH11 e VL11, VH12 e VL12, VH13 e VL13, VH14 e VL14, VH15 e VL15, VH16 e VL16,VH17 e VL17, VH18 e VL18, VH19 e VL19, VH20 e VL20, VH21 e VL21, VH22 e VL22, VH23 e VL23, VH24 e VL24, VH25 e VL25, VH26 e VL26, VH27 e VL27, VH28 e VL28, VH29 e VL29, VH30 e VL30, VH31 e VL31, VH32 e VL32, VH33 e VL33, VH34 e VL34, VH35 e VL35, VH36 e VL36, VH37 e VL37, VH38 e VL38, VH39 e VL39, VH40 e VL40, VH41 e VL41, VH42 e VL42, VH43 e VL43, VH44 e VL44, VH45 e VL45, VH46 e VL46, VH47 e VL47, VH48 e VL48, VH49 e VL49, VH50 e VL50, VH51 e VL51, VH52 e VL52, VH53 e VL53, VH54 e VL54, VH55 e VL55, VH56 e VL56, VH57 e VL57, VH58 e VL58, VH59 e VL59, ou VH60 e VL60 (como mostrado na Tabela 1c).
[15] Em um aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo (por exemplo, um anticorpo isolado) ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a um domínio extracelular do CD137 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende a região variável da cadeia pesada de: VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, VH32, VH33, VH34, VH35, VH36, VH37, VH38, VH39, VH40, VH41, VH42, VH43, VH44, VH45, VH46, VH47, VH48, VH49, VH50, VH51, VH52, VH53, VH54, VH55, VH56, VH57, VH58, VH59, ou VH60; e/ou a região variável da cadeia leve compreende a região variável da cadeia leve de: VL1, VL2, VH3, VL4, VH5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, VL34, VL35, VL36, VL37, VL38, VL39, VL40, VL41, VL42, VL43, VL44, VL45, VL46, VL47, VL48, VL49, VL50, VL51, VL52, VL53, VL54, VL55, VL56, VL57, VL58, VL59, ou VL60 (como mostrado na Tabela 1c). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve compreendem a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve de: VH1 e VL1, VH2 e VL2, VH3 e VL3, VH4 e VL4, VH5 e VL5, VH6 e VL6, VH7 e VL7, VH8 e VL8, VH9 e VL9, VH10 e VL10, VH11 e VL11, VH12 e VL12, VH13 e VL13, VH14 e VL14, VH15 e VL15, VH16 e VL16,VH17 e VL17, VH18 e VL18, VH19 e VL19, VH20 e VL20, VH21 e VL21, VH22 e VL22, VH23 e VL23, VH24 e VL24, VH25 e VL25, VH26 e VL26, VH27 e VL27, VH28 e VL28, VH29 e VL29, VH30 e VL30, VH31 e VL31, VH32 e VL32, VH33 e VL33, VH34 e VL34, VH35 e VL35, VH36 e VL36, VH37 e VL37, VH38 e VL38, VH39 e VL39, VH40 e VL40, VH41 e VL41, VH42 e VL42, VH43 e VL43, VH44 e VL44, VH45 e VL45, VH46 e VL46, VH47 e VL47, VH48 e VL48, VH49 e VL49, VH50 e VL50, VH51 e VL51, VH52 e VL52, VH53 e VL53, VH54 e VL54, VH55 e VL55, VH56 e VL56, VH57 e VL57, VH58 e VL58, VH59 e VL59, ou VH60 e VL60 (como mostrado na Tabela 1c).
[16] Em um aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo (por exemplo, um anticorpo isolado) ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a um domínio extracelular do CD137 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antígeno se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 34108 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 34-93 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste nos resíduos de aminoácidos 34-36, 53-55 e 92-93 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos 34-36, um ou mais resíduos de aminoácidos 53-55 e um ou mais resíduos de aminoácidos 92-93 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno não se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste nos resíduos de aminoácidos 109-112, 125, 126, 135-138, 150 e 151 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno não se liga aos resíduos de aminoácidos 109-112, 125, 126, 135-138, 150 e 151 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno possui reatividade cruzada com um polipeptídeo CD137 de pelo menos uma espécie não humana selecionada dentre macaco cinomolgo, camundongo, rato e/ou cão. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a CD137 de macaco cinomolgo.
[17] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 711, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 735 e uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 759; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 783, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 807 e uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 831. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e/ou a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve e em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 617, e/ou a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 618.
[18] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 712, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 736 e uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 760; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 784, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 808 e uma HVR-L3 compreendendo a amino sequência ácida da SEQ ID NO: 832. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 e/ou a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 619, e/ou a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 620.
[19] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 731, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 755 e uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 779; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 803, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 827 e uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 851. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 e/ou a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 657 e/ou a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 658.
[20] Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo (por exemplo, um anticorpo isolado) que se liga a um domínio extracelular do CD137 humano, compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma HVR-H1, uma HVR-H2 e uma HVR-H3, em que a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada a partir do grupo que consiste em: Fórmula (I), Fórmula (II) e Fórmula (III); a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (IV), Fórmula (V) e Fórmula (VI); e a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (VII); e/ou a região variável da cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (VIII); a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (IX); e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (X) e Fórmula (XI). Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo (por exemplo, um anticorpo isolado) que se liga a um domínio extracelular do CD137 humano, compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma HVR- H1, uma HVR-H2 e uma HVR-H3, em que a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (XIII) e Fórmula (XVI); a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (IV) e Fórmula (XV); e a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (VII); e/ou a região variável da cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (XVI); a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (XVII); e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (XVIII).
[21] Em algumas modalidades, a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 253-312, a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 313-372, a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 373-432, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 433-492, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 493-552 e/ou a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 553-612. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, e 131 e/ou a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, e 132.
[22] Em algumas modalidades, a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste na Fórmula (XII), Fórmula (XIII) e Fórmula (XIV); a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (IV) ou a Fórmula (XV); e a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (VII); e/ou em que a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (XVI); a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (XVII); e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (XVIII). Em algumas modalidades, a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:709-732, a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:733-756, a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:757-780, a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:781-804, a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 805-828, e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS:829-852. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 15, 17, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 53, 61, 63, 65, 67, 71, 73, 75, 79, 83, 85 e 87, e/ou a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 16, 18, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 62, 64, 66, 68, 72, 74, 76, 80, 84, 86 e 88. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 613, 615, 617, 619, 621, 623, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 651, 653, 655, 657 e 659 e/ou a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, e 660.
[23] Em algumas modalidades, a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 711 ou 731, a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 735 ou 755, a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 759 ou 779, a HVR- L1 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 783 ou 803, a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos ou SEQ ID NO: 807 ou 827 e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 831 ou 851. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 ou 71, e a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 ou 72. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 617 ou 657, e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 618 ou 658.
[24] Em algumas modalidades, a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 712, a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 736, a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 760, a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 784, a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos ou SEQ ID NO: 808, e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 832. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 e a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 619, e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 620.
[25] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno liga o CD137 humano a um KD de 100 nM ou menos (por exemplo, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno liga o CD137 humano a um KD de 50 nM ou menos (por exemplo, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície).
[26] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno possui reatividade cruzada com um polipeptídeo CD137 de pelo menos uma espécie não humana selecionada dentre macaco cinomolgo (por exemplo, GenBank Gene ID 102127961), camundongo (por exemplo, GenBank Gene ID 21942), rato (por exemplo, GenBank Gene ID 500590) e/ou cão (por exemplo, GenBank Gene ID 608274). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a CD137 de macaco cinomolgo.
[27] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, uma atividade do CD137 humano (por exemplo, quando expresso em uma célula como uma célula humana) é reduzida quando entra em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.
[28] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno tem uma concentração do fármaco que induz metade do efeito máximo (IC50) de cerca de 100 nM ou menos para bloquear a ligação do CD137 humano ao CD137L humano in vitro. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno bloqueia completamente a ligação do CD137 humano ao CD137L humano in vitro quando o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é fornecido a uma concentração de cerca de 1 µM ou superior. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, uma atividade do CD137 humano (por exemplo, quando expresso em uma célula como uma célula humana) aumenta quando entra em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o contato do CD137 (por exemplo, expresso em uma célula humana) com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno resulta em aumento da transcrição dependente de NF-KB. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno bloqueia um ou mais aspectos da sinalização de CD137 estimulados por CD137L, por exemplo, transcrição estimulada por CD137L dependente de NF-kB, em uma célula que expressa CD137.
[29] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo compreende uma região Fc de IgG2 humana. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo compreende uma região Fc de IgG4 humana. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG4 humana compreende uma mutação S241P, em que a numeração é de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno não induz efeitos ADCC.
[30] Em outro aspecto, são aqui fornecidas regiões variáveis da cadeia pesada de anticorpo codificadas por um polinucleotídeo que compreende uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, e 251 e/ou regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo codificadas por um polinucleotídeo que compreende uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, e 252. Em algumas modalidades, fornecidas neste documento são cadeias pesadas de anticorpo codificadas por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 661, 663, 665, 667, 669, 671, 673, 675, 677, 679, 681, 683, 685, 687, 689, 691, 693, 695, 697, 699, 701, 703, 705, e 707 e/ou cadeias leves de anticorpo codificadas por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, e 708.
[31] Em algumas modalidades, as HVRs estão de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência GFSLSTSGVGVG (SEQ ID NO: 866), uma HVR-H2 compreendendo a sequência LIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 867) e uma HVR-H3 compreendendo a sequência GGSDTVLGDWFAY (SEQ ID NO: 868); e/ou um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência RASQSVSPYLA (SEQ ID NO: 869), uma HVR-L2 compreendendo a sequência DASSLES (SEQ ID NO: 870) e uma HVR-L3 compreendendo a sequência QQGYSLWT (SEQ ID NO: 871).
[32] Em algumas modalidades, as HVRs estão de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência GYSITSGHYWA (SEQ ID NO: 872), uma HVR-H2 compreendendo a sequência SISGYGSTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 873) e uma HVR-H3 compreendendo a sequência GGSDAVLGDWFAY (SEQ ID NO: 874); e/ou um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência RASQGIGSFLA (SEQ ID NO: 875), uma HVR-L2 compreendendo a sequência DASNLET (SEQ ID NO: 876) e uma HVR-L3 compreendendo a sequência QQGYYLWT (SEQ ID NO: 877).
[33] Em algumas modalidades, as HVRs estão de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência GFSLSTGGVGVG (SEQ ID NO: 878), uma HVR-H2 compreendendo a sequência LIDWADDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 879) e uma HVR-H3 compreendendo a sequência GGSDTVIGDWFAY (SEQ ID NO: 880); e/ou um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência RASQSIGSYLA (SEQ ID NO: 881), uma HVR-L2 compreendendo a sequência DASNLET (SEQ ID NO: 882) e uma HVR-L3 compreendendo a sequência QQGYYLWT (SEQ ID NO: 883).
[34] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo multimérico (por exemplo, um anticorpo biespecífico). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgM, por exemplo, compreende uma região Fc de IgM (por exemplo, uma região Fc de IgM humana).
[35] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos neste documento. Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs: 133-252.
[36] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um vetor compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos descritos acima. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão.
[37] Em outro aspecto, é fornecida uma célula hospedeira neste documento (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula de mamífero (como uma célula CHO ou uma célula 293T), etc.) compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos ou vetores descritos neste documento. Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método para fabricar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo a cultura da célula hospedeira em condições adequadas para a produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a recuperação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno produzido pela célula hospedeira.
[38] Em outro aspecto, é fornecida neste documento uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos neste documento (ou quaisquer derivados destes) e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[39] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de crescimento celular anormal (por exemplo, um câncer) em um sujeito em necessidade deste, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e/ou composições farmacêuticas descritos neste documento. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento métodos para reduzir a metástase de células tumorais em um sujeito, compreendendo a administração ao referido sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e/ou composições farmacêuticas descritos neste documento. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um (por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos 10, etc.) agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado do grupo que consiste em terapia genética viral, inibidores do ponto de verificação imune, terapias alvo, terapias de radiação e quimioterapias. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado do grupo que consiste em pomalyst, revlimid, lenalidomida, pomalidomida, talidomida, um derivado alquilador de DNA contendo platina, cisplatina, 5- fluorouracil, ciclofosfamida, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CD20, um anticorpo anti-CD40, um anticorpo anti-DR5, um anticorpo anti-CD1d, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-SLAMF7, um anticorpo anti-receptor KIR, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti-HER2, um anticorpo anti-ErbB-2, um anticorpo anti-EGFR, cetuximabe, rituximabe, trastuzumabe, pembrolizumabe, radioterapia, radiação de dose única, radiação fracionada, radiação focal, radiação de órgão inteiro, IL- 12, IFNa, GM-CSF, um receptor de antígeno quimérico, células T adotivamente transferidas, uma vacina anticâncer e um vírus oncolítico. Também é fornecido neste documento o uso de qualquer uma das composições farmacêuticas, anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos neste documento (ou quaisquer derivados destes) para o tratamento de crescimento celular anormal (por exemplo, um câncer) e/ou a redução de metástase de células tumorais em um sujeito em necessidade. Também é fornecido neste documento o uso de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos neste documento (ou quaisquer derivados destes) para a fabricação de um medicamento para o tratamento de crescimento celular anormal (por exemplo, um câncer) e/ou a redução de metástase de células tumorais em um indivíduo em necessidade.
[40] Deve-se entender que uma, algumas, ou todas as propriedades das várias modalidades descritas neste documento podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção. Esses e outros aspectos da presente invenção se tornarão evidentes para alguém versado na técnica. Essas e outras modalidades da presente invenção são descritas adicionalmente na descrição detalhada a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[41] A FIG. 1A mostra a definição de região hipervariável (HVR) em comparação com a definição de CDR de Kabat para um exemplo de região variável de cadeia pesada (VH) (SEQ ID NO: 13) e um exemplo de região variável de cadeia leve (VL) (SEQ ID NO: 14).
[42] A FiG. 1B mostra a seleção de hits de Fab que possuem reatividade cruzada com o CD137 de camundongo.
[43] A FiG. 2 mostra ensaios de ligação de ELISA a CD137 de humano, macaco e camundongo de exemplos de anticorpos. Cada painel é para um anticorpo diferente, conforme indicado na parte superior do painel.
[44] A FiG. 3A mostra ensaios de ligação baseada em FACS a CD137 de humano, macaco, camundongo e rato de anticorpos exemplares. Cada painel é para um antígeno diferente, conforme indicado na parte superior do painel.
[45] A FiG. 3B mostra uma comparação de reatividade cruzada de espécies entre anticorpos exemplares e anticorpos de referência.
[46] A FiG. 4A mostra anticorpos exemplares que se ligam a células T de humano e de macaco ativadas, mas não a células T humanas não expostas.
[47] A FiG. 4B mostra a ligação de AG10131 a células T ativadas de humano, macaco, camundongo e rato.
[48] A FiG. 5 mostra a especificidade de ligação de anticorpos exemplares a CD137, mas a outros membros da família TNFR.
[49] AS FiGs. 6A e FiG. 6B mostram que anticorpos exemplares bloqueiam a ligação de CD137 a seu ligante cognato CD137L por ELISA (FIG. 6A) e por ensaio de citometria de fluxo (FIG. 6B).
[50] A FIG. 7A mostra resultados de mapeamento de epítopo por citometria de fluxo.
[51] A FIG. 7B mostra um alinhamento múltiplo de sequências de uma porção de CD137 de humano (SEQ ID NO: 1), macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 860) e camundongo (SEQ ID NO: 861), com sequências/regiões de interesses (anotadas) de CD137 que foram identificadas a partir dos experimentos de mapeamento de epítopos.
[52] A FIG. 8 mostra a atividade agonista de exemplos de anticorpos no ensaio de repórter de NFKB.
[53] A FIG. 9 mostra a atividade agonista de exemplos de anticorpos na proliferação de células T CD8+ (painel superior) e secreção de INF-Y (painel inferior).
[54] A FIG. 10 mostra a eficácia antitumoral de exemplos de anticorpos, bem como a infiltração de células T CD4+e células T CD8+em tumores no modelo de câncer de fígado de camundongo H22.
[55] A FIG. 11 mostra a eficácia antitumoral de exemplos de anticorpos no modelo de câncer de cólon de camundongo CT26.
[56] A FIG. 12 mostra a eficácia antitumoral de exemplos de anticorpos no modelo de câncer de mama de camundongo EMT6.
[57] A FIGS. 13 mostra camundongos CT26 tratados com anticorpos exemplares mantidos livres de tumor após reexposição com as mesmas células tumorais.
[58] A FIG. 14 mostra a morte de células tumorais com esplenócitos de camundongos reexpostos que rejeitam tumores.
[59] A FIG. 15 mostra que AG10131 não apresenta efeitos ADCC.
[60] A FIG. 16 mostra exemplos de anticorpos exibindo pouca agregação em alta concentração.
[61] A FIG. 17 mostra estabilidade de exemplos de anticorpos sob condições de estresse aceleradas.
[62] A FIG. 18 mostra termoestabilidade.
[63] A FIG. 19 mostra que AG10131 não possui toxicidade hematológica em camundongos normais até 100 mg/kg duas vezes por semana (BIW) x 2.
[64] A FIG. 20 mostra que AG10131 não possui anormalidade histológica hepática em camundongos normais até 100 mg/kg duas vezes por semana (BIW) x 2.
[65] A FIG. 21 mostra que AG10131 não possui toxicidade hematológica em macacos cinomolgo a 10 mg/kg/semana x 4.
[66] A FIG. 22 mostra que AG10131 não possui toxicidade hepática em macacos a 10 mg/kg/semana x 4.
[67] A FIG. 23 mostra os perfis farmacocinéticos de AG10131 em macacos.
[68] A FIG. 24 mostra os perfis farmacocinéticos de AG10131 em ratos.
[69] A FIG. 25 mostra os perfis farmacocinéticos de vários anticorpos em camundongos.
[70] A FIG. 26 mostra uma estrutura cristalina do complexo CD137-CD137L humano com os domínios ricos em cisteína (CRDs) de CD137 indicados.
[71] A FIG. 27 mostra o mapeamento de epítopos do anticorpo anti-CD137 indicado que se liga aos CRDs de CD137 humanos indicados por citometria de fluxo.
[72] A FIG. 28 mostra que o anticorpo anti-CD137 AG10131 bloqueia a sinalização de CD137 estimulada por CD137L. Os resultados são de um ensaio de repórter de NFKBluciferase celular, no qual células 293T que expressam de forma estável um repórter de NFKBluciferase foram transfectadas com uma construção de DNA que expressa CD137 humano e co-cultivadas com as células de linfoma de células B humanas Daudi (linha superior) ou Raji (linha inferior) nas proporções indicadas, depois incubadas com diluições em série (como indicado) do controle de isotipo (coluna da esquerda) ou anticorpos anti- CD137 bloqueadores de ligantes (coluna da direita) durante a noite, seguidos pela medição da atividade da luciferase.
[73] A FIG. 29 mostra a ativação da sinalização de NFKBmediada por CD137 humano pelos anticorpos anti-CD137 AG10131 AC1121 ou AC1097 na presença ou ausência de anticorpo de reticulação. O EC50 (nM) para cada anticorpo contra a ativação da sinalização de NFkB (na presença ou na ausência de reticulação) é indicado.
[74] A FIG. 30 mostra AG10131 e seu anticorpo de controle de isotipo IgG4 humano não tem a capacidade de se ligar ao componente C1q do complemento humano na faixa de concentração testada, enquanto um anticorpo de controle de isotipo IgG1 humano é capaz de se ligar a C1q.
[75] A FIG. 31 mostra o aprimoramento de linfócitos T que se infiltram em tumores por tratamento com AG10131 em vários modelos de tumores. Superior esquerdo: imagens de coloração IHC representativas de células T CD4+ (painéis superiores) e CD8+ (painéis inferiores) em tumores H22 após o tratamento. Superior direito: imagens de coloração IHC representativas de células T CD4+ (painéis superiores) e CD8+ (painéis inferiores) em tumores EMT6 após o tratamento. Centro inferior: imagens de coloração IHC representativas de células T CD4+ (painéis superiores) e CD8+ (painéis inferiores) em tumores CT26 após o tratamento. As células T CD4+ ou CD8+ foram coradas de preto no fundo do contracorante nuclear por Hematoxilina. As células T CD4+ e CD8+ são indicadas por setas pretas.
[76] A FIG. 32 quantifica o número de linfócitos T que se infiltram em tumores a partir dos experimentos mostrados na FIG. 31. A % de células T CD4+(linha superior) e CD8+(linha inferior) em tumores das amostras de tumor H22, EMT6 e CT26 foram comparadas entre o veículo e os grupos tratados com AG10131. **, p < 0,01; ***, p < 0,001.
[77] A FIG. 33 mostra os efeitos antitumorais do AG10131 e do anticorpo anti-PD-1, isoladamente e em combinação, no modelo singênico de câncer de cólon CT26 de camundongo estabelecido. Painel superior: gráfico com crescimento tumoral médio para cada grupo de tratamento. Painéis inferiores: gráficos de linhas com crescimento individual do tumor para cada grupo.
DESCRIÇÃO DETALHADA A. DEFINIÇÕES
[78] A menos que definido de outra forma neste documento, todos os termos técnicos e científicos utilizados em conexão com a presente invenção têm os significados como comumente entendidos por aqueles de competência comum na técnica. Além disso, a menos que seja exigido o contrário pelo contexto, os termos no singular devem incluir as pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de, manipulação de anticorpos, imunoterapia, células e cultura de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química das proteínas e ácidos nucleicos descritas neste documento são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica.
[79] Tal como utilizado neste documento, cada um dos termos seguintes tem o significado a ele associado nesta seção.
[80] Os artigos "um" e "uma" são referem-se a um ou mais de um (por exemplo, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.
[81] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como a análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de forma semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato e O- fosfosserina. O termo "análogos de aminoácidos"refere-se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica de um aminoácido que ocorre naturalmente, mas o grupo carboxi C-terminal, o grupo amino N-terminal ou o grupo funcional da cadeia lateral foi quimicamente modificado para outro grupo funcional. O termo "miméticos de aminoácido"refere-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de forma semelhante a um aminoácido de ocorrência natural.
[82] O termo "anticorpo"é usado neste documento no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais completos), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos (por exemplo, um fragmento variável de cadeia única ou scFv) desde que exibam a atividade biológica desejada.
[83] O termo "anticorpo"é um termo reconhecido na técnica e pode se referir a uma proteína de ligação ao antígeno (isto é, imunoglobulina) tendo uma estrutura de cadeia de quatro polipeptídeos básica que consiste em duas cadeias pesadas (H) idênticas e duas cadeias leves (L) idênticas. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H estão ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfeto, dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia pesada possui, no N-terminal, uma região variável (abreviada neste documento como VH) seguida por uma região constante. A região constante da cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve possui, no N-terminal, uma região variável (abreviada neste documento como VI) seguida por uma região constante em sua outra extremidade. A região constante de cadeia leve é composta de um domínio, CL. O VL está alinhado com o VH e CL o está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). O emparelhamento de um VH e de um VL em conjunto forma um único sítio de ligação ao antígeno. Um anticorpo IgM consiste em 5 das unidades heterotetrâmeras básicas, juntamente com um polipeptídeo adicional chamado cadeia J e, portanto, contém 10 sítios de ligação ao antígeno, enquanto os anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar conjuntos polivalentes que compreendem 2-5 das unidades básicas de 4 cadeias junto com a cadeia J.
[84] As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões hipervariáveis (HVR) com base nas análises estrutural e de sequência. As HVRs são intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões framework (FW). Para comparação, a definição de CDR de Kabat por Yvonne Chen, et al. (Selection and Analysis of an Optimized Anti-VEGF Antibody: Crystal Structure of an Affinity-matured Fab in Complex with Antigen, J. Mol. Biol. (1999) 293, 865-881) está listado abaixo (ver também FIG. 1a). Cada VH e VL é composto por três HVRs e quatro FWs, dispostos do amino-terminal para o carboxi-terminal na seguinte ordem: FW1, HVR1, FW2, HVR2, FW3, HVR3, FW4. Ao longo da presente invenção, as três HVRs da cadeia pesada são referidas como HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3. Da mesma forma, as três HVRs da cadeia leve são referidas como HVR-L1, HVR- L2 e HVR-L3.
[85] As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imunitário (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema do complemento clássico. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 10 aminoácidos ou mais. Ver, em geral, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2aed. Raven Press, N.Y. (1989)).
[86] A cadeia L a partir de quaisquer espécies de vertebrados pode ser atribuída a um dos dois tipos claramente distintos, chamado kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), os anticorpos podem ser atribuídos a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com cadeias pesadas designadas a (alfa), d (delta), e (epsilon), Y (gama) e µ (mu), respectivamente. A classe de anticorpo IgG pode ser ainda classificada em quatro subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 pelas cadeias pesadas gama Y1-Y4, respectivamente.
[87] O termo "derivado de anticorpo" ou "derivado" de um anticorpo refere-se a uma molécula que é capaz de se ligar ao mesmo antígeno (por exemplo, CD137) ao qual o anticorpo se liga e compreende uma sequência de aminoácidos do anticorpo ligada a uma entidade molecular adicional. A sequência de aminoácidos do anticorpo que está contida no derivado de anticorpo pode ser uma cadeia pesada de comprimento integral, uma cadeia leve de comprimento integral, qualquer porção ou porções de uma cadeia pesada de comprimento integral, qualquer porção ou porções de cadeia leve de comprimento integral do anticorpo, qualquer outro fragmento(s) de um anticorpo ou o anticorpo completo. A entidade molecular adicional pode ser uma molécula química ou biológica. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem grupos químicos, aminoácidos, peptídeos, proteínas (como enzimas, anticorpos) e compostos químicos. A entidade molecular adicional pode ter qualquer utilidade, tal como para uso como agente de detecção, rótulo, marcador, agente farmacêutico ou terapêutico. A sequência de aminoácidos de um anticorpo pode ser unida ou ligada à entidade molecular adicional por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma. O termo "derivado de anticorpo"também abrange anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e moléculas que são derivadas de modificações das sequências de aminoácidos de um anticorpo de CD137, como substituições, adições e inserções de aminoácidos de conservação.
[88] O termo "fragmento de ligação ao antígeno"ou "porção de ligação ao antígeno"de um anticorpo refere-se a uma ou mais porções de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar ao antígeno ao qual o anticorpo se liga (por exemplo, CD137). Exemplos de "fragmento de ligação ao antígeno"de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI ; (ii) um fragmento F(ab‘)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1 ; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)), que consiste em um domínio VH ; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR).
[89] O termo "molécula de ligação" abrange (1) anticorpo, (2) fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo e (3) derivado de um anticorpo, cada um como definido neste documento.
[90] O termo "ligando CD137", "liga CD137", "ligando a CD137" ou "liga a CD137" refere-se à ligação de uma molécula de ligação, conforme definido neste documento, ao CD137 humano em um ensaio in vitro, como um Ensaio Biacore como descrito no Exemplo 4, com uma afinidade (KD) igual ou inferior a 100 nM.
[91] Os termos "CD137" e "receptor CD137" são utilizados de forma intercambiável no presente pedido e incluem o receptor CD137 humano, bem como variantes, isoformas e homólogos das espécies. Por conseguinte, uma molécula de ligação, como definida e descrita neste documento, também pode se ligar a CD137 de espécies diferentes da humana. Em outros casos, uma molécula de ligação pode ser completamente específica para o CD137 humano e pode não exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada.
[92] O termo "anticorpo de CD137" refere-se a um anticorpo, como definido neste documento, capaz de se ligar ao receptor CD137 humano.
[93] O termo "anticorpo quimérico"refere-se a um anticorpo que compreende sequências de aminoácidos derivadas de diferentes espécies animais, como aquelas que possuem uma região variável derivada de um anticorpo humano e uma região constante de imunoglobulina murina.
[94] O termo "competir pela ligação"refere-se à interação de dois anticorpos em sua ligação a um alvo de ligação. Um primeiro anticorpo compete pela ligação com um segundo anticorpo se a ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato for diminuída de forma detectável na presença do segundo anticorpo em comparação com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, em que a ligação do segundo anticorpo ao seu epítopo também é diminuída de forma detectável na presença do primeiro anticorpo, pode, mas não precisa ser o caso. Ou seja, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epítopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo ao respectivo epítopo. No entanto, onde cada anticorpo inibe de forma detectável a ligação do outro anticorpo com seu epítopo cognato, seja na mesma, maior ou menor extensão, diz-se que os anticorpos "competem de forma cruzada" entre si pela ligação de seus respectivos epítopos(s).
[95] O termo "epítopo"refere-se a uma parte de um antígeno à qual um anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) se liga. Os epítopos podem ser formados tanto por aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por um enovelamento secundário e/ou terciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente mantidos em exposição a solventes desnaturantes enquanto que os epítopos formados por enovelamento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo pode incluir vários números de aminoácidos em uma conformação espacial única. Os métodos para determinar a conformação espacial dos epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x, ressonância magnética nuclear bidimensional, troca de deutério e hidrogênio em combinação com espectrometria de massa ou mutagênese sítio-dirigida ou todos os métodos usados em combinação com modelagem computacional de antígeno e sua estrutura complexa com seu anticorpo de ligação e suas variantes. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Uma vez determinado o epítopo desejado de um antígeno, os anticorpos para esse epítopo podem ser gerados, por exemplo, usando as técnicas descritas neste documento. A geração e caracterização de anticorpos também podem elucidar informações sobre epítopos desejáveis. A partir dessas informações, é possível triar anticorpos competitivamente para a ligação com o mesmo epítopo. Uma abordagem para alcançar este objetivo é a realização de estudos de competição cruzada para encontrar anticorpos que se ligam competitivamente uns com os outros, isto é, os anticorpos competem para ligação com o antígeno. Um processo de alto rendimento de transferência para “armazenar” anticorpos com base em sua competição cruzada é descrito na Publicação PCT No. WO 03/48731.
[96] O termo "linhagem germinativa" refere-se às sequências nucleotídicas dos genes de anticorpos e segmentos gênicos à medida que são transmitidas dos precursores para os descendentes através das células germinativas. A sequência da linhagem germinativa é diferenciada das sequências nucleotídicas que codificam anticorpos nas células B maduras que foram alteradas por eventos de recombinação e hipermutação durante a maturação das células B.
[97] O termo "sítios de glicosilação"refere-se a resíduos de aminoácidos que são reconhecidos por uma célula eucariótica como locais para a ligação de resíduos de açúcar. Os aminoácidos aos quais o carboidrato, como o oligossacarídeo, se liga são tipicamente resíduos de asparagina (ligação N), serina (ligação O) e treonina (ligação O). O sítio específico de ligação é tipicamente sinalizado por uma sequência de aminoácidos, referida neste documento como uma "sequência do sítio de glicosilação". A sequência do sítio de glicosilação para a glicosilação ligada a N é: -Asn-X-Ser- ou -Asn-X-Thr-, em que X pode ser qualquer um dos aminoácidos convencionais, exceto prolina. Os termos "ligado a N" e "ligado a O" se referem ao grupo químico que serve como sítio de ligação entre a molécula de açúcar e o resíduo de aminoácido. Os açúcares ligados a N são ligados através de um grupo amino; os açúcares ligados a O são ligados através de um grupo hidroxila. O termo "ocupação de glicano" refere-se à existência de uma fração de carboidrato ligada a um sítio de glicosilação (ou seja, o sítio de glicano está ocupado). Onde existem pelo menos dois sítios de glicosilação potenciais em um polipeptídeo, nenhum (ocupação de sítio de glicano 0), um (ocupação de sítio de glicano 1) ou ambos (ocupação de sítio de glicano 2) podem ser ocupados por uma fração de carboidrato.
[98] O termo "célula hospedeira" refere-se a um sistema celular que pode ser modificado para gerar proteínas, fragmentos de proteínas ou peptídeos de interesse. Células hospedeiras incluem, sem limitação, células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamíferos derivadas de roedores (ratos, camundongos, porquinhos-da-índia ou hamsters) como CHO, BHK, NSO, SP2/0, YB2/0; ou tecidos humanos ou células de hibridoma, células de levedura e células de inseto e células compreendidas dentro de um animal transgênico ou tecido cultivado. O termo abrange não apenas a célula em questão, mas também a descendência dessa célula. Uma vez que determinadas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou a influências ambientais, essa progênie, na verdade, pode não ser idêntica à célula principal, mas ainda está incluída dentro do escopo do termo "célula hospedeira."
[99] O termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo no qual todas as sequências de aminoácidos das cadeias leves e cadeias pesadas são provenientes dos genes de imunoglobulina humana. Um anticorpo humano pode conter cadeias de carboidratos murinas se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Os anticorpos humanos podem ser preparados de várias maneiras conhecidas na técnica.
[100] O termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico que contém resíduos de aminoácidos derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado pode conter algumas ou todas as CDRs ou HVRs de um animal não humano ou anticorpo sintético, enquanto as regiões framework e constantes do anticorpo contêm resíduos de aminoácidos derivados de sequências de anticorpos humanos.
[101] O termo "anticorpo ilustrativo" refere-se a qualquer um dos anticorpos descritos na invenção e designados como aqueles listados nas Tabelas 1a e 1b. Esses anticorpos podem estar em qualquer classe (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM). Assim, cada anticorpo identificado acima abrange anticorpos em todas as cinco classes que possuem as mesmas sequências de aminoácidos para as regiões VL e VH. Além disso, os anticorpos na classe IgG podem estar em qualquer subclasse (por exemplo, IgG1 IgG2, IgG3 e IgG4). Assim, cada anticorpo identificado acima na subclasse IgG engloba anticorpos em todas as quatro subclasses que possuem as mesmas sequências de aminoácidos para as regiões VLe VH. As sequências de aminoácidos das regiões constantes da cadeia pesada de anticorpos humanos nas cinco classes, bem como nas quatro subclasses de IgG, são conhecidas na técnica. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve de comprimento integral para a subclasse IgG4 de cada um dos anticorpos ilustrativos mostrados na Tabela 1b é fornecida na invenção.
[102] O termo "anticorpo isolado" ou "molécula de ligação isolada" refere-se a um anticorpo ou molécula de ligação, conforme definido neste documento, que: (1) não está associado a componentes naturalmente associados que o acompanham em seu estado nativo; (2) está livre de outras proteínas da mesma espécie; (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente; ou (4) não ocorre na natureza. Exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo de CD137 que foi purificado por afinidade usando CD137, um anticorpo de CD137 que foi gerado por hibridomas ou outra linha celular in vitro e um anticorpo de CD137 derivado de um animal transgênico.
[103] O termo "ácido nucleico isolado" refere-se a uma molécula de ácido nucleico de origem genômica, cDNA ou sintética, ou uma combinação destas, que é separada de outras moléculas de ácido nucleico presentes na fonte natural do ácido nucleico. Por exemplo, com relação ao DNA genômico, o termo "isolado" inclui moléculas de ácido nucleico que são separadas do cromossomo ao qual o DNA genômico está naturalmente associado. De preferência, um ácido nucleico "isolado"está livre de sequências que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico de interesse.
[104] O termo "ka" refere-se à constante da taxa de associação de uma interação anticorpo-antigênio em particular, enquanto o termo "kd" refere-se à constante da taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antigênio em particular.
[105] O termo "KD" refere-se à constante de dissociação de equilíbrio de uma determinada interação anticorpo-antígeno. É obtido a partir da razão de kd para ka (isto é, kd/ka) e é expresso como uma concentração molar (M). KD é usado como uma medida para a afinidade da ligação de um anticorpo ao seu parceiro de ligação. Quanto menor o KD, mais forte a ligação do anticorpo ou maior a afinidade entre o anticorpo e o antígeno. Por exemplo, um anticorpo com uma constante de dissociação nanomolar (nM) se liga mais firmemente a um antígeno específico do que um anticorpo com uma constante de dissociação micromolar (µM). Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinar o KD de um anticorpo é usando a ressonância plasmônica de superfície, geralmente usando um sistema de biossensor, como um sistema Biacore®. Um procedimento de ensaio usando o sistema BIACORE™ (ensaio BIAcore) é descrito na seção Exemplos desta invenção.
[106] O termo "mamífero"refere-se a qualquer espécie animal da classe Mammalia. Exemplos de mamíferos incluem: humanos; animais de laboratório como ratos, camundongos, símios e porquinhos da índia; animais domésticos como gatos, cães, coelhos, gado, ovelhas, cabras, cavalos e porcos; e animais selvagens em cativeiro, como leões, tigres, elefantes e similares.
[107] O termo "impedir" ou "impedindo", com referência a uma determinada condição de doença em um mamífero, refere-se à prevenção ou atraso do início da doença ou à manifestação de seus sintomas clínicos ou subclínicos.
[108] Como usado neste documento, "identidade de sequência"entre duas sequências polipeptídicas indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos entre as sequências. A identidade da sequência de aminoácidos dos polipeptídeos pode ser determinada convencionalmente usando programas de computador conhecidos como Bestfit, FASTA ou BLAST (ver, por exemplo, Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132 185-219 (2000); Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucelic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). Ao usar o Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência específica é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, os parâmetros são definidos de forma que a porcentagem de identidade é calculada ao longo do comprimento integral da sequência de aminoácidos de referência e que as lacunas na homologia de até 5% do número total de resíduos de aminoácidos na sequência de referência sejam permitidas. Esse método mencionado acima para determinar a porcentagem de identidade entre polipeptídeos é aplicável a todas as proteínas, fragmentos ou seus variantes descritos neste documento.
[109] O termo "liga-se especificamente" ou "liga-se especificamente a", em referência à interação de uma molécula de ligação, conforme definido neste documento (por exemplo, um anticorpo) com seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno), refere-se à capacidade da molécula de ligação para distinguir entre um antígeno de interesse de uma espécie animal e o ortólogo do antígeno de uma espécie animal diferente sob um determinado conjunto de condições. Diz-se que uma molécula de ligação a CD137 se liga especificamente a CD137 humano se se liga a CD137 humano em uma EC50 que está abaixo de 50% da EC50 na qual se liga a CD137 de rato ou camundongo, conforme determinado em um ensaio in vitro. A especificidade de ligação de um anticorpo pode ser determinada usando métodos conhecidos na técnica. Exemplos de tais métodos incluem FACS usando células primárias estimuladas por PHA, Western blots, testes ELISA, RIA, ECL, IRMA e exames de peptídeos.
[110] O termo "liga-se seletivamente" ou "liga-se seletivamente a", em referência à interação de uma molécula de ligação, conforme definido neste documento (por exemplo, um anticorpo) com seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno), refere-se à capacidade da molécula de ligação para distinguir entre um antígeno de interesse de uma espécie animal (tal como CD137 humano) e um antígeno diferente da mesma espécie animal (tal como CD40 humano) sob um determinado conjunto de condições. Diz-se que uma molécula de ligação a CD137 se liga seletivamente ao CD137 humano se se ligar ao CD137 humano em uma EC50 que esteja abaixo de 10 por cento da EC50 na qual se liga ao CD40 humano ou CD134 humano, conforme determinado em um ensaio in vitro.
[111] O termo "tratar", "tratando" ou "tratamento", com referência a uma determinada condição de doença em um mamífero, refere-se a causar um efeito desejável ou benéfico no mamífero que possui a condição de doença. O efeito desejável ou benéfico pode incluir frequência ou gravidade reduzida de um ou mais sintomas da doença (isto é, crescimento de tumor e/ou metástase, ou outro efeito mediado pelos números e/ou atividade das células imunológicas e similares), ou interrupção ou inibição de desenvolvimento adicional da doença, condição ou distúrbio. No contexto do tratamento de câncer em um mamífero, o efeito desejável ou benéfico inclui inibição de crescimento ou disseminação adicional de células cancerígenas, morte de células cancerígenas, inibição da recorrência do câncer, redução da dor associada ao câncer ou sobrevida aprimorada do mamífero. O efeito pode ser subjetivo ou objetivo. Por exemplo, se o mamífero é humano, o ser humano pode observar melhora no vigor ou na vitalidade ou diminuição da dor como sintomas subjetivos de melhora ou resposta à terapia. Como alternativa, o médico pode notar uma diminuição no tamanho ou na carga tumoral com base em exames físicos, parâmetros laboratoriais, marcadores tumorais ou achados radiográficos. Alguns sinais laboratoriais que o médico pode observar em resposta ao tratamento incluem a normalização dos testes, como contagem de glóbulos brancos, contagem de glóbulos vermelhos, contagem de plaquetas, taxa de sedimentação de eritrócitos e vários níveis de enzimas. Além disso, o clínico pode observar uma diminuição em um marcador de tumor detectável. Como alternativa, outros testes podem ser usados para avaliar a melhoria objetiva, como sonogramas, testes de ressonância magnética nuclear e testes de emissões de pósitrons.
[112] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar uma molécula de ácido nucleico estranha. A molécula de ácido nucleico estranha está ligada à molécula de ácido nucleico de vetor por uma técnica recombinante, como ligação ou recombinação. Isso permite que a molécula estranha de ácido nucleico seja multiplicada, selecionada, manipulada ou expressa em uma célula ou organismo hospedeiro. Um vetor pode ser um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, cromossomo, vírus ou vírion. Um tipo de vetores pode ser integrado ao genoma de uma célula hospedeira após sua introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma hospedeiro (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais). Outro tipo de vetor é capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual é introduzido (por exemplo, vetores bacterianos com origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomais). Outro tipo específico de vetor capaz de direcionar a expressão de ácidos nucleicos estranhos expressáveis aos quais eles estão operacionalmente ligados é geralmente chamado de "vetores de expressão."Os vetores de expressão geralmente têm sequências de controle que acionam a expressão dos ácidos nucleicos estranhos expressáveis. Os vetores mais simples, conhecidos como "vetores de transcrição", só podem ser transcritos, mas não traduzidos: eles podem ser replicados em uma célula alvo, mas não expressos. O termo "vetor" abrange todos os tipos de vetores, independentemente de sua função. Os vetores capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos expressáveis aos quais estão operacionalmente ligados são comumente referidos como "vetores de expressão."
[113] Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e tal como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação, a menos que indicado de outra forma. Tais referências incluem, por exemplo, Sambrook e Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002), e Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, conforme comumente se realiza na técnica ou conforme descrito neste documento. As nomenclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos e técnicas de, química analítica, química orgânica sintética, e químicas farmacêutica e medicinal descritos neste documento são aqueles bem- conhecidos e comumente usados na técnica. Técnicas padrão são utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, e distribuição e tratamento de pacientes.
[114] Como usado neste documento, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviaturas seguem o uso convencional. Ver Immunology—A Synthesis (2aEdição, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).
B. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO QUE SE LIGAM A CD137 HUMANO
[115] A presente invenção fornece moléculas de ligação isoladas que se ligam a CD137 humano, incluindo anticorpos de CD137, fragmentos de ligação ao antígeno dos anticorpos de CD137 e derivados dos anticorpos de CD137. Em algumas modalidades, as moléculas de ligação são qualquer um dos anticorpos descritos neste documento, incluindo anticorpos descritos com referência à ligação de epítopo e anticorpos descritos com referência a sequências de aminoácidos específicas de HVRs, regiões variáveis (VL, VH) e cadeias leves e pesadas de IgG (por exemplo, IgG4). Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a moléculas de ligação que se ligam ao CD137 humano e têm pelo menos uma (por exemplo, pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, oito ou todas as nove) das seguintes propriedades funcionais: (a) se ligam ao CD137 humano com um KD de 500 nM ou menos; (b) têm atividade agonista no CD137 humano; (c) não se ligam ao receptor humano OX40, CD40, GITR e/ou CD27 em concentrações de até 1000 nM; (d) têm reatividade cruzada com CD137 de macaco, camundongo, rato ou cão; (e) não induzem efeitos ADCC; (f) são capazes de inibir o crescimento de células tumorais; (g) ter efeito terapêutico em um câncer; (h) bloqueiam a ligação entre CD137 e CD137L; e (i) bloqueiam a sinalização de CD137 estimulada por CD137L (por exemplo, transcrição dependente de NF-kB estimulada por CD137L) em uma célula que expressa CD137. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento também podem bloquear, por exemplo, bloquear completamente, a ligação entre CD137 e seu ligante CD137L. Também são fornecidos neste documento um ou mais anticorpos anti-CD137 ou fragmentos de ligação ao antígeno que competem de forma cruzada pela ligação ao CD137 humano com um ou mais dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, como descrito neste documento.
[116] Em algumas modalidades, os anticorpos ou os seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 34-108 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno se ligam a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 34-93 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno se ligam a um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste nos resíduos de aminoácidos 34-36, 53-55 e 92-93 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno se ligam a um ou mais resíduos de aminoácidos 34-36, um ou mais resíduos de aminoácidos 53-55 e um ou mais resíduos de aminoácidos 92-93 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno não se ligam a um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste nos resíduos de aminoácidos 109-112, 125, 126, 135-138, 150 e 151 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno não se ligam aos resíduos de aminoácidos 109-112, 125, 126, 135-138, 150 e 151 da SEQ ID NO: 1. Os métodos para medir a capacidade de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de se ligar a um antígeno alvo podem ser realizados usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, por ressonância plasmônica de superfície, um ELISA, calorimetria de titulação isotérmica, um ensaio de ligação de filtro, um EMSA etc. Em algumas modalidades, a capacidade do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de se ligar a um antígeno alvo é medida por ressonância plasmônica de superfície (Ver, por exemplo, o Exemplo 1 abaixo).
[117] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno se ligam ao CD137 humano com um KD de cerca de 500 nM ou menos (por exemplo, cerca de 500 nM ou menos, cerca de 400 nM ou menos, cerca de 300 nM ou menos, cerca de 200 nM ou menos, cerca de 150 nM ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 90 nM ou menos, cerca de 80 nM ou menos, cerca de 75 nM ou menos, cerca de 70 nM ou menos, cerca de 60 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos, cerca de 40 nM ou menos, cerca de 30 nM ou menos, cerca de 25 nM ou menos, cerca de 20 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos, cerca de 1 nM ou menos, cerca de 0,1 nM ou menos, etc.) Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno se ligam ao CD137 humano com um KD de cerca de 100 nM ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno se ligam ao CD137 humano com um KD de cerca de 50 nM ou menos. Os métodos para medir o KD de um anticorpo ou fragmento podem ser realizados usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, por ressonância plasmônica de superfície, um ELISA, calorimetria de titulação isotérmica, um ensaio de ligação de filtro, um EMSA, etc. Em algumas modalidades, o KD é medido por ressonância plasmônica de superfície (Veja, por exemplo, o Exemplo 1 abaixo).
[118] Os anticorpos anti-CD137 precisam ser reticulados para se tornarem agonísticos. Por exemplo, a reticulação é alcançada in vivoatravés de receptores Fc gama, enquanto tipicamente anticorpos anti-Fc policlonais são usados em experimentos baseados em células in vitro. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos neste documento têm atividade agonista no CD137 humano. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno induzem uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, etc.) atividades do CD137 humano quando uma célula (por exemplo, uma célula humana) expressando o CD137 humano entra em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Várias atividades do CD137 são conhecidas na técnica e podem incluir, sem limitação, indução de transcrição dependente de NF-KB, indução de proliferação de células T, prolongamento da sobrevivência de células T, coestimulação de células T ativadas, indução de secreção de citocinas (como IL- 2) e indução de ativação de monócitos. Em algumas modalidades, a uma ou mais atividades do CD137 não é a ligação do CD137 com seu ligante. Os métodos para medir a atividade do CD137 (por exemplo, a indução da transcrição dependente de NF-kB e/ou a proliferação de células T, etc.) são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, através dos métodos descritos nos Exemplos 8 e 9 abaixo. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aumentam a transcrição dependente de NF- KB em células (por exemplo, células humanas) que expressam CD137 humano. Em algumas modalidades, a transcrição dependente de NF-KB é aumentada em cerca de 10% ou mais, cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou cerca de 99% ou mais em células (por exemplo, células humanas) que expressam CD137 em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em relação a uma célula correspondente sem contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, uma célula correspondente sem contato com um anticorpo ou em contato com um anticorpo de controle de isotipo). Em algumas modalidades, a transcrição dependente de NF-kB é aumentada em cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou mais em células (por exemplo, células humanas) que expressam CD137 em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em relação a uma célula correspondente sem contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, uma célula correspondente sem contato com um anticorpo ou em contato com um anticorpo de controle de isotipo).
[119] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno possuem reatividade cruzada com CD137 de macaco (por exemplo, macaco cinomolgo), camundongo, rato e/ou cão. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno possuem reatividade cruzada com CD137 de macaco. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno possuem reatividade cruzada com CD137 de camundongo. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno possuem reatividade cruzada com CD137 de rato. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno possuem reatividade cruzada com CD137 de cão. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno possuem reatividade cruzada com CD137 de macaco e camundongo; CD137 de macaco e rato; CD137 de macaco e cão; CD137 de camundongo e rato; CD137 de camundongo e cão; CD137 de rato e cão; CD137 de macaco, camundongo e rato; CD137 de macaco, camundongo e cão; CD137 de macaco, rato e cão; CD137 de camundongo, rato e cão; ou CD137 de macaco, camundongo, rato e cão. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno possuem reatividade cruzada a cerca de 100 nM (por exemplo, a cerca de 1 nM, a cerca de 10 nM, a cerca de 25 nM, a cerca de 50 nM, a cerca de 75 nM, a cerca de 100 nM). Os métodos para medir a reatividade cruzada de anticorpos são conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, ressonância plasmônica de superfície, um ELISA, calorimetria de titulação isotérmica, um ensaio de ligação de filtro, um EMSA, etc. Em algumas modalidades, a reatividade cruzada é medida por ELISA (Ver, por exemplo, o Exemplo 2 abaixo).
[120] Em algumas modalidades, os anticorpos não induzem efeitos ADCC. Os métodos para medir os efeitos ADCC (por exemplo, métodos in vivo) são conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, através dos métodos descritos no Exemplo 11 abaixo. Em algumas modalidades, os anticorpos não induzem efeitos ADCC por mais de cerca de 10% (não induzem ADCC por mais de cerca de 10%, mais de cerca de 5%, mais de cerca de 1%, mais de cerca de 0,1% e mais de cerca de 0,01%) em relação a um controle.
[121] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno são capazes de inibir o crescimento/proliferação de células tumorais. Em algumas modalidades, o crescimento/proliferação de células tumorais é inibido em pelo menos cerca de 5% (por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 99%) quando em contato com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno em relação a células tumorais correspondentes sem contato com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno são capazes de reduzir o volume do tumor em um sujeito quando os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno são administrados ao sujeito. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno são capazes de reduzir o volume do tumor em um sujeito em pelo menos cerca de 5% (por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 99%) em relação ao volume tumoral inicial no sujeito (por exemplo, antes da administração dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno). Os métodos para monitorar o crescimento/proliferação de células tumorais, volume tumoral e/ou inibição tumoral são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, através dos métodos descritos no Exemplo 10 abaixo.
[122] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno têm efeito terapêutico em um câncer. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno reduzem um ou mais sinais ou sintomas de um câncer. Em algumas modalidades, um sujeito que sofre de um câncer entra em remissão parcial ou completa quando os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno são administrados neste.
[123] Em outro aspecto, a invenção fornece anticorpos isolados que competem ou competem de forma cruzada pela ligação a CD137 humano com qualquer um dos anticorpos ilustrativos da invenção, como AG10058, AG10059 e/ou AG10131. Em uma modalidade específica, a invenção fornece anticorpos isolados que competem ou competem de forma cruzada pela ligação ao mesmo epítopo no CD137 humano com qualquer um dos anticorpos ilustrativos da invenção. A capacidade de um anticorpo de competir ou competir de forma cruzada pela ligação com outro anticorpo pode ser determinada usando ensaios de ligação padrão conhecidos na técnica, como análise BIAcore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo. Por exemplo, pode-se permitir que um anticorpo ilustrativo da invenção se ligue ao CD137 humano sob condições de saturação e, em seguida, meça a capacidade do anticorpo de teste de se ligar ao CD137. Se o anticorpo de teste é capaz de se ligar ao CD137 ao mesmo tempo que o anticorpo ilustrativo, então o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do anticorpo ilustrativo. No entanto, se o anticorpo do teste não for capaz de se ligar ao CD137 ao mesmo tempo, então o anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo, um epítopo sobreposto ou um epítopo que está próximo ao epítopo ligado ao anticorpo ilustrativo. Este experimento pode ser realizado usando vários métodos, como ELISA, RIA, FACS ou ressonância plasmônica de superfície.
[124] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno bloqueiam a ligação entre CD137 e seu ligante (por exemplo, CD137 humano e CD137L humano). Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno bloqueiam a ligação entre CD137 e seu ligante in vitro. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno tem uma concentração do fármaco que induz metade do efeito máximo (IC50) de cerca de 500 nM ou menos (por exemplo, cerca de 500 nM ou menos, cerca de 400 nM ou menos, cerca de 300 nM ou menos, cerca de 200 nM ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos, cerca de 25 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos, cerca de 1nM ou menos, etc.) para bloquear a ligação do CD137 ao seu ligante. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno tem uma concentração do fármaco que induz metade do efeito máximo (IC50) de cerca de 100 nM ou menos para bloquear a ligação do CD137 ao seu ligante. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno bloqueia completamente a ligação do CD137 humano ao seu ligante quando fornecido a uma concentração de cerca de 100 nM ou superior (por exemplo, cerca de 100 nM ou superior, cerca de 500 nM ou superior, cerca de 1 µM ou superior, cerca de 10 µM ou superior, etc.). Como usado neste documento, o termo "bloqueio completo" ou "bloqueia completamente" refere-se à capacidade do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de reduzir a ligação entre uma primeira proteína e uma segunda proteína em pelo menos cerca de 80% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% etc.). Métodos para medir a capacidade de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de bloquear a ligação de uma primeira proteína (por exemplo, um CD137) e uma segunda proteína (por exemplo, um CD137L) são conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, por meio de análise BIAcore, ensaios ELISA e citometria de fluxo (Ver, por exemplo, o Exemplo 6 abaixo).
B-1. ANTICORPOS CD137
[125] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que se liga ao CD137 humano em um epítopo dentro dos resíduos de aminoácidos 34-108 ou 34-93 da SEQ ID NO.: 1. O anticorpo, em algumas modalidades, liga CD137 humano com um KD de 50 nM ou menos, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície. Em certas modalidades, o anticorpo pode possuir reatividade cruzada com pelo menos uma espécie não humana selecionada da lista que consiste em macaco cinomolgo, camundongo, rato e cão.
[126] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, a) em que a região variável da cadeia pesada compreende uma HVR-H1, uma HVR-H2 e uma HVR-H3, em que a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (I): X1TFX2X3YX4IHWV (SEQ ID NO: 2), em que X1 é F ou Y, X2 é S ou T, X3 é G, N ou S e X4 é A, G ou W; Fórmula (II): YSIX1SGX2X3WX4WI (SEQ ID NO: 3), em que X1 é S ou T, X2 é H ou Y, X3 é H ou Y e X4 é A, D, G, N, S ou T; e Fórmula (III): FSLSTX1GVX2VX3WI (SEQ ID NO: 4), em que X1 é G ou S, X2 é A ou G e X3 é A, G, S ou T; em que a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (IV): LALIDWX1X2DKX3YSX4SLKSRL (SEQ ID NO: 5), em que X1 é A, D ou Y, X2 é D ou G, X3 é R, S ou Y e X4 é P ou T; Fórmula (V): IGX1IYHSGX2TYYX3PSLKSRV (SEQ ID NO: 6), em que X1 é D ou E, X2 é N ou S e X3 é N ou S; e Fórmula (VI): VSX1ISGX2GX3X4TYYADSVKGRF (SEQ ID NO: 7), em que X1 é A, G, S, V ou Y, X2 é A, D, S ou Y, X3 é D, G ou S, e X4 é S ou T; e em que a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (VII): ARX1GX2X3X4VX5GDWFX6Y (SEQ ID NO: 8), em que X1 é E ou G, X2 é E ou S, X3 é D ou T, X4 é A, T ou V, X5 é A, I, L, T ou V e X6 é A, D ou G; e/ou b) em que a região variável da cadeia leve compreende uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3, em que a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (VIII): X1ASQX2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 9), em que X1 é Q ou R, X2 é D, G ou S, X3 é I ou V, X4 é G, R, S ou T, X5 é P, R, S ou T, X6 é A, D, F, S, V ou Y, X7 é L ou V e X8 é A, G ou N; em que a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a Fórmula (IX): X1ASX2X3X4X5GX6 (SEQ ID NO: 10), em que X1 é A ou D, X2 é N, S ou T, X3 é L ou R, X4 é A, E ou Q, X5 é S ou T e X6 é I ou V; e em que a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: Fórmula (X): YCQQX1YX2X3X4T (SEQ ID NO: 11), em que X1 é A, G, S ou Y, X2 é Q, S ou Y, X3 é I, L, T ou Y, e X4 é I, S, V ou W; e Fórmula (XI): YCX1QX2X3X4X5PX6T (SEQ ID NO: 12), em que X1 é E ou Q, X2 é P, S ou Y, X3 é D, L, S, T ou Y, X4 é D, E, H, S ou T, X5 é D, LT ou W e X6 é L, P, R ou V.
[127] Em algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma HVR-H1 com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 253-312, uma HVR-H2 com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 313372, uma HVR-H3 com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 373-432, uma HVR-L1 com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 433-492, uma HVR-L2 com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 493-552 e/ou uma HVR-L3 tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 553-612.
[128] Em certas modalidades, o anticorpo pode compreender uma VL e/ou VH com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 13-132, que podem preferencialmente ser codificadas pela sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 133252, respectivamente.
[129] Em algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma HVR-H1 com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 709-732, uma HVR-H2 com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 733756, uma HVR-H3 com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 757-780, uma HVR-L1 com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 781-804, uma HVR-L2 com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 805-828 e/ou uma HVR-L3 com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 829-852.
[130] Em certas modalidades, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve e/ou cadeia pesada (por exemplo, aquelas de IgG como IgG4) tendo as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 613-660, que podem ser preferencialmente codificadas pela sequência de DNA selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 661-708, respectivamente.
[131] Em algumas modalidades, as HVRs estão de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência GFSLSTSGVGVG (SEQ ID NO: 866), uma HVR-H2 compreendendo a sequência LIDWDDDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 867) e uma HVR-H3 compreendendo a sequência GGSDTVLGDWFAY (SEQ ID NO: 868); e/ou um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência RASQSVSPYLA (SEQ ID NO: 869), uma HVR-L2 compreendendo a sequência DASSLES (SEQ ID NO: 870) e uma HVR-L3 compreendendo a sequência QQGYSLWT (SEQ ID NO: 871).
[132] Em algumas modalidades, as HVRs estão de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência GYSITSGHYWA (SEQ ID NO: 872), uma HVR-H2 compreendendo a sequência SISGYGSTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 873) e uma HVR-H3 compreendendo a sequência GGSDAVLGDWFAY (SEQ ID NO: 874); e/ou um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência RASQGIGSFLA (SEQ ID NO: 875), uma HVR-L2 compreendendo a sequência DASNLET (SEQ ID NO: 876) e uma HVR-L3 compreendendo a sequência QQGYYLWT (SEQ ID NO: 877).
[133] Em algumas modalidades, as HVRs estão de acordo com Kabat. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma HVR-H1 compreendendo a sequência GFSLSTGGVGVG (SEQ ID NO: 878), uma HVR-H2 compreendendo a sequência LIDWADDKYYSPSLKS (SEQ ID NO: 879) e uma HVR-H3 compreendendo a sequência GGSDTVIGDWFAY (SEQ ID NO: 880); e/ou um domínio variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma HVR-L1 compreendendo a sequência RASQSIGSYLA (SEQ ID NO: 881), uma HVR-L2 compreendendo a sequência DASNLET (SEQ ID NO: 882) e uma HVR-L3 compreendendo a sequência QQGYYLWT (SEQ ID NO: 883).
[134] Os anticorpos CD137 descritos neste documento podem estar em qualquer classe, como IgG, IgM, IgE, IgA ou IgD. É preferido que os anticorpos CD137 estejam na classe IgG, como as subclasses IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Um anticorpo de CD137 pode ser convertido de uma classe ou subclasse para outra classe ou subclasse usando métodos conhecidos na técnica. Um método exemplar para produzir um anticorpo em uma classe ou subclasse desejada compreende as etapas de isolar um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo de CD137 e um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo de CD137, isolar a sequência que codifica a região VH, ligar a sequência VH a uma sequência que codifica uma região constante da cadeia pesada da classe ou subclasse desejada, expressar o gene da cadeia leve e a construção da cadeia pesada em uma célula e coletar o anticorpo de CD137.
[135] Além disso, os anticorpos fornecidos pela presente invenção podem ser monoclonais ou policlonais, mas preferencialmente monoclonais.
[136] Exemplos de anticorpos isolados específicos fornecidos pela presente invenção incluem aqueles listados nas Tabelas 1a e 1b. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada, cadeia pesada de comprimento integral para as subclasses IgG2 e IgG4, região variável da cadeia leve e cadeia leve de comprimento integral desses anticorpos também são fornecidas abaixo.
[137] Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por técnicas conhecidas na técnica, incluindo a metodologia convencional de anticorpos monoclonais, por exemplo, a técnica de hibridação de células somáticas padrão (Ver, por exemplo, Kohler e Milstein, Nature 256:495 (1975), transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou tecnologias de anticorpos recombinantes, conforme descrito em detalhes neste documento abaixo.
[138] A produção de hibridoma é um procedimento muito bem estabelecido. O sistema animal comum para a preparação de hibridomas é o sistema murino. Os protocolos de imunização e as técnicas para o isolamento de esplenócitos imunizados para a fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murinas) e procedimentos de fusão também são conhecidos. Um método bem conhecido que pode ser usado para produzir anticorpos CD137 humanos fornecidos pela presente invenção envolve o uso de um sistema animal XenoMouse™. Os camundongos XenoMouse™ são linhagens de camundongos manipuladas que compreendem grandes fragmentos de loci de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina humana e são deficientes na produção de anticorpos de camundongos. Ver, por exemplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) e WO2003/040170. O animal é imunizado com um antígeno CD137. O antígeno CD137 é um CD137 isolado e/ou purificado, preferencialmente CD137. Pode ser um fragmento de CD137, como o domínio extracelular de CD137, particularmente um fragmento de domínio extracelular de CD137 compreendendo os resíduos de aminoácido 34108 ou 34-93 da SEQ ID NO: 1. A imunização de animais pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nova York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para imunizar animais não humanos, como camundongos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, gado e cavalos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra, e Pat. U.S. N° 5.994.619. O antígeno CD137 pode ser administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Exemplos de adjuvantes incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídeos muramil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Após a imunização de um animal com um antígeno CD137, as linhagens celulares imortalizadas produtoras de anticorpos são preparadas a partir de células isoladas do animal imunizado. Após a imunização, o animal é sacrificado e os linfonodos e/ou células B esplênicas são imortalizados. Métodos de imortalização de células incluem, mas sem limitação, transferi-las com oncogenes, infectá-las com o vírus oncogênico, cultivá-las em condições que selecionam células imortalizadas, expô-las a compostos carcinogênicos ou mutantes, fundi-las com uma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma, e inativar um gene supressor de tumor. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Se for utilizada a fusão com células de mieloma, as células de mieloma preferencialmente não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linhagem celular não secretora). As células imortalizadas são pesquisadas usando CD137, uma porção deste ou uma célula que expressa CD137. As células produtoras de anticorpos CD137, por exemplo, hibridomas, são selecionadas, clonadas e triadas quanto a características desejáveis, incluindo crescimento robusto, alta produção de anticorpos e características de anticorpos desejáveis, como discutido mais adiante. Os hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singênicos, em animais que não possuem um sistema imunológico, por exemplo, camundongos nudes ou em cultura de células in vitro. Os métodos de seleção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
[139] Os anticorpos da invenção também podem ser preparados usando métodos de exibição de fagos ou exibição de leveduras. Tais métodos de exibição para isolar anticorpos humanos são estabelecidos na técnica, como Achim Knappik, et al., "Fully Synthetic Human Combinatorial Antibody Libraries (HuCAL) Based on Modular Consensus Frameworks and CDRs Randomized with Trinucleotides." J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86; e Michael J. Feldhaus, et al., "Flow-cytometric isolation of human antibodies from a non-immune Saccharomyces cerevisiae surface display library" Nat Biotechnol (2003) 21:163170.
B-2. FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
[140] Em alguns outros aspectos, a presente invenção fornece fragmentos de ligação ao antígeno de qualquer um dos anticorpos CD137 fornecidos pela presente invenção.
[141] O fragmento de ligação ao antígeno pode compreender quaisquer sequências do anticorpo. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos de: (1) uma cadeia leve de um anticorpo de CD137; (2) uma cadeia pesada de um anticorpo de CD137; (3) uma região variável da cadeia leve de um anticorpo de CD137; (4) uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo de CD137; (5) uma ou mais HVRs (dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs) de um anticorpo de CD137; ou (6) três HVRs da cadeia leve e três HVRs da cadeia pesada de um anticorpo de CD137.
[142] Em algumas modalidades particulares, a invenção fornece um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo selecionado dentre os listados nas Tabelas 1a e 1b.
[143] Em algumas outras modalidades particulares, os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo de CD137 incluem: (i) um fragmento Fab, que é um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, que é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; (vi) uma CDR isolada e (vii) anticorpo de cadeia única (scFv), que é um polipeptídeo compreendendo uma região VL de um anticorpo ligado a uma região VH de um anticorpo. Bird et al., (1988) Science 242:423-426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
[144] Em algumas modalidades particulares, o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento Fab selecionado dentre os listados na Tabela 1a.
B-3. ANTICORPOS DERIVADOS
[145] Em alguns aspectos adicionais, a presente invenção fornece derivados de qualquer um dos anticorpos CD137 fornecidos pela presente invenção.
[146] Em um aspecto, o derivado de anticorpo é derivado de modificações das sequências de aminoácidos de um anticorpo ilustrativo ("anticorpo parental") da invenção enquanto conserva a estrutura molecular geral da sequência de aminoácidos do anticorpo parental. As sequências de aminoácidos de qualquer região das cadeias de anticorpos parentais podem ser modificadas, como regiões framework, regiões HVR ou regiões constantes. Tipos de modificações incluem substituições, inserções, deleções ou combinações destas, de um ou mais aminoácidos do anticorpo parental.
[147] Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região VL ou VH que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico a uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13-132. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região de sequência de aminoácidos HVR-H1 que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 253312. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região de sequência de aminoácidos HVR-H2 que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 313372. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região de sequência de aminoácidos HVR-H3 que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 373432. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos HVR-L1 para todos os hits de Fab mostrados na Tabela 1a, que podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 433-492. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos HVR-L2 para todos os hits de Fab mostrados na Tabela 1a, que podem ser encontrados nas SEQ ID NOs: 493-552.
[148] Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos HVR-L3 para todos os hits de Fab mostrados na Tabela 1a, que podem ser encontrados nas SEQ ID NOs: 553-612. Em algumas modalidades particulares, o derivado compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições conservativas ou não conservativas e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 adições e/ou deleções a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13-132 e 253-612.
[149] Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma cadeia leve ou cadeia pesada que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 613-660.
[150] Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região de sequência de aminoácidos HVR-H1 que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 709-732. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região de sequência de aminoácidos HVR-H2 que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 733-756. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região de sequência de aminoácidos HVR-H3 que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 757-780. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região de sequência de aminoácidos HVR-L1 que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 781-804. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região de sequência de aminoácidos HVR-L2 que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 805-828. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região de sequência de aminoácidos HVR-L3 que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 829-852. Em algumas modalidades particulares, o derivado compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições conservativas ou não conservativas e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 adições e/ou deleções a uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 613-660 e 709-852.
[151] As substituições de aminoácidos abrangem substituições conservativas e substituições não conservativas. O termo "substituição conservativa de aminoácido"significa a substituição de um aminoácido por outro aminoácido, onde os dois aminoácidos têm semelhança em certas propriedades físico-químicas, como polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, tipicamente podem ser feitas substituições dentro de cada um dos seguintes grupos: (a) aminoácidos não polares (hidrofóbicos), como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; (b) aminoácidos polares neutros, tais como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; (c) aminoácidos carregados positivamente (básicos), como arginina, lisina e histidina; e (d) aminoácidos carregados negativamente (ácidos), tais como ácido aspártico e ácido glutâmico.
[152] As modificações podem ser feitas em qualquer posição das sequências de aminoácidos do anticorpo, incluindo as HVRs, regiões framework ou regiões constantes. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um derivado de anticorpo que contém as sequências de VH e VL HVR de um anticorpo ilustrativo desta invenção, mas contém sequências estruturais diferentes daquelas do anticorpo ilustrativo. Tais sequências de framework podem ser obtidas de bancos de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos de linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA da linhagem germinativa para genes da região variável da cadeia pesada e leve humana podem ser encontradas no banco de dados Genbank ou no banco de dados de sequência germinativa humana "VBase" (Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH No. 91-3242 (1991); Tomlinson, IM, et al., J. Mol. Biol. 227:776-798 (1992); e Cox, JPL et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836 (1994)). As sequências de framework que podem ser usadas na construção de um derivado de anticorpo incluem aquelas que são estruturalmente semelhantes às sequências de framework usadas por anticorpos ilustrativos da invenção, por exemplo, semelhantes às sequências de framework de VH 3-23 e/ou às sequências de framework de VLÀ3 ou À1-13 usadas por anticorpos ilustrativos da invenção. Por exemplo, as sequências de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 e as sequências HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 de um anticorpo ilustrativo podem ser enxertadas em regiões de framework que têm a sequência idêntica à encontrada no gene da imunoglobulina da linhagem germinativa da qual a sequência de framework deriva ou as sequências de HVR podem ser enxertadas em regiões de framework que contêm uma ou mais mutações em comparação com as sequências da linhagem germinativa.
[153] Em uma modalidade particular, o derivado de anticorpo é um anticorpo quimérico que compreende uma sequência de aminoácidos de um anticorpo ilustrativo da invenção. Em um exemplo, uma ou mais HVRs de um ou mais anticorpos humanos ilustrativos são combinados com HVRs de um anticorpo de um animal não humano, como camundongo ou rato. Em outro exemplo, todas as HVRs do anticorpo quimérico são derivadas de um ou mais anticorpos ilustrativos. Em algumas modalidades particulares, o anticorpo quimérico compreende uma, duas ou três HVRs da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve de um anticorpo ilustrativo. Os anticorpos quiméricos podem ser gerados usando métodos convencionais conhecidos na técnica.
[154] Outro tipo de modificação é a mutação de resíduos de aminoácidos nas regiões HVR da cadeia VH e/ou VL. A mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito na ligação do anticorpo ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo conhecidos na técnica. Normalmente, são introduzidas substituições conservativas. As mutações podem ser adições e/ou deleções de aminoácidos. Além disso, normalmente não mais que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região HVR são alterados. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos nas HVRs da cadeia pesada e/ou nas HVRs da cadeia leve. Em outra modalidade, a substituição de aminoácidos é para alterar uma ou mais cisteínas em um anticorpo para outro resíduo, como, sem limitação, alanina ou serina. A cisteína pode ser uma cisteína canônica ou não canônica. Em uma modalidade, o derivado de anticorpo possui 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácidos nas regiões HVR da cadeia pesada em relação às sequências de aminoácidos de um anticorpo ilustrativo.
[155] Também podem ser feitas modificações nos resíduos de framework nas regiões VH e/ou regiões VL. Tipicamente, essas variantes de frameworksão feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Uma abordagem é "voltar a mutar" um ou mais resíduos de framework para a sequência da linhagem germinativa correspondente. Um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de framework que diferem da sequência da linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando as sequências de framework do anticorpo com as sequências da linhagem germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para retornar as sequências de framework estrutural à sua configuração da linhagem germinativa, as mutações somáticas podem ser "mutadas de volta" para a sequência da linhagem germinativa por, por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese mediada por PCR.
[156] Além disso, modificações também podem ser feitas na região Fc de um anticorpo ilustrativo, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, como meia-vida sérica, fixação do complemento, ligação ao receptor Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Em um exemplo, a região de dobradiça de CH1 é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita na Pat. U.S. N° 5.677.425. O número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo. Em outro caso, a região de dobradiça Fc de um anticorpo sofre mutação para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo.
[157] Além disso, um anticorpo da invenção pode ser modificado para alterar seu potencial sítio ou padrão de glicosilação, de acordo com a experimentação de rotina conhecida na técnica. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um derivado de um anticorpo de CD137 da invenção que contém pelo menos uma mutação em uma região variável de uma cadeia leve ou cadeia pesada que altera o padrão de glicosilação na região variável. Tal derivado de anticorpo pode ter uma afinidade aumentada e/ou uma especificidade modificada para a ligação a um antígeno. As mutações podem adicionar um novo sítio de glicosilação na região V, alterar a localização de um ou mais sítios de glicosilação da região V ou remover um sítio de glicosilação pré-existente na região V. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um derivado de um anticorpo de CD137 com um sítio de glicosilação ligado a N potencial em asparagina na região variável da cadeia pesada, em que o sítio de glicosilação ligado a N potencial em uma região variável da cadeia pesada é removido. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um derivado de um anticorpo de CD137 com um sítio de glicosilação ligado a N potencial em asparagina na região variável da cadeia pesada, em que o sítio de glicosilação ligado a N potencial em ambas as regiões variáveis da cadeia pesada é removido. O método para alterar o padrão de glicosilação de um anticorpo é conhecido na técnica, tais como os descritos na Pat. U.S. 6.933.368, cuja invenção é incorporada neste documento por referência.
[158] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um derivado de anticorpo que compreende um anticorpo de CD137 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como descrito neste documento, ligado a uma entidade molecular adicional. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem agentes farmacêuticos, peptídeos ou proteínas, agente ou marcadores de detecção e anticorpos.
[159] Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende um anticorpo da invenção ligado a um agente farmacêutico. Exemplos de agentes farmacêuticos incluem agentes citotóxicos ou outros agentes terapêuticos de câncer e isótopos radioativos. Exemplos específicos de agentes citotóxicos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidróxi antracina diona, mitoxantrona, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes. Agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, dacarbazina 5- fluorouracil), agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tiotepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina- platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados com anticorpos para uso diagnóstico ou terapeuticamente incluem, mas não estão limitados a iodo131, índio111, ítrio90e lutécio177. Os métodos para ligar um anticorpo a um agente farmacêutico são conhecidos na técnica, como o uso de várias tecnologias de ligação. Exemplos de tipos de ligantes incluem hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos e ligantes contendo peptídeos. Para uma discussão mais aprofundada dos ligantes e métodos para ligar agentes terapêuticos a anticorpos, ver também Saito et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199215 (2003); Trail et al., Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337 (2003); Payne, Cancer Cell 3:207-212 (2003); Allen, Nat. Rev. Cancer 2:750-763 (2002); Pastan, I. e Kreitman, Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091 (2002); Senter, PD e Springer, CJ (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
[160] Em uma modalidade particular, o derivado de anticorpo é um multímero de anticorpo de CD137, que é uma forma multimérica de um anticorpo de CD137, como dímeros de anticorpo, trímeros ou multímeros de anticorpos monoméricos de ordem superior. Monômeros individuais dentro de um multímero de anticorpos podem ser idênticos ou diferentes. Além disso, os anticorpos individuais dentro de um multímero podem ter as mesmas ou diferentes especificidades de ligação. A multimerização de anticorpos pode ser realizada através da agregação natural de anticorpos. Por exemplo, alguma porcentagem de preparações de anticorpos purificados (por exemplo, moléculas de IgG4 purificadas) forma espontaneamente agregados de proteínas contendo homodímeros de anticorpos e outros multímeros de anticorpos de ordem superior. Alternativamente, os homodímeros de anticorpos podem ser formados através de técnicas de ligação química conhecidas na técnica, como através do uso de agentes de reticulação. Reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos reativamente distintos separados por um espaçador apropriado (como éster de m-maleimidobenzoil-N- hidroxissuccinimida, 4-(maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidil e N-succinimidil S-acetiltio-acetato) ou homobifuncional (como suberato de disuccinimidil). Tais ligantes estão disponíveis comercialmente em, por exemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Os anticorpos também podem ser produzidos para multimerizar através de técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica.
[161] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo multimérico (por exemplo, um anticorpo biespecífico). Em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgM, por exemplo, compreende uma região Fc de IgM (por exemplo, uma região Fc de IgM humana).
[162] Exemplos de outros derivados de anticorpos fornecidos pela presente invenção incluem anticorpos de cadeia única, diacorpos, anticorpos de domínio, nanocorpos e unicorpos. Um "anticorpo de cadeia única"(scFv) consiste em uma única cadeia polipeptídica compreendendo um domínio VL ligado a um domínio VH em que o domínio VLe o domínio VHestão emparelhados para formar uma molécula monovalente. O anticorpo de cadeia única pode ser preparado de acordo com o método conhecido na técnica (ver, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Um "diabody" consiste em duas cadeias, cada cadeia compreendendo uma região variável da cadeia pesada conectada a uma região variável da cadeia leve na mesma cadeia polipeptídica ligada por um ligante peptídico curto, em que as duas regiões da mesma cadeia não se emparelham, mas com domínios complementares na outra cadeia para formar uma molécula biespecífica. Os métodos de preparação de diabodies são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 64446448 e Poljak RJ et al., (1994) Structure 2: 1121-1123). Anticorpos de domínio (dAbs) são pequenas unidades funcionais de ligação de anticorpos, correspondentes às regiões variáveis das cadeias pesada ou leve de anticorpos. Os anticorpos de domínio são bem expressos nos sistemas celulares bacterianos, de leveduras e de mamíferos. Detalhes adicionais de anticorpos de domínio e métodos de produção dos mesmos são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Pat. N°s 6.291.158; 6.582.915; 6.593.081; 6.172.197; 6.696.245; Patentes europeias 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 e WO03/002609). Os nanobodies são derivados das cadeias pesadas de um anticorpo. Um nanobody normalmente compreende um único domínio variável e dois domínios constantes (CH2 e CH3) e mantém a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo original. Os nanobodies podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Pat. US 6.765.087, Pat. US 6.838.254, WO 06/079372). Os anticorpos consistem em uma cadeia leve e uma cadeia pesada de um anticorpo IgG4. Os anticorpos podem ser produzidos pela remoção da região de dobradiça dos anticorpos IgG4. Detalhes adicionais de anticorpos e métodos para prepará-los podem ser encontrados no documento WO2007/059782.
C. ÁCIDOS NUCLÉICOS, VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E MÉTODOS RECOMBINANTES DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS CD137
[163] Outro aspecto da invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de uma molécula de ligação fornecida pela presente invenção. A sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos pode ser qualquer porção de um anticorpo, como um HVR, uma sequência compreendendo um, dois ou três HVRs, uma região variável de uma cadeia pesada, região variável de uma cadeia leve ou pode ser uma cadeia pesada de comprimento total ou leve. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA, e pode ou não conter sequências intrônicas. Tipicamente, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.
[164] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em: (1) sequência de aminoácidos de um HVR-H3 ou HVR- L3 de um anticorpo ilustrativo; (2) uma região variável de uma cadeia pesada ou região variável de uma cadeia leve de um anticorpo ilustrativo; ou (3) uma cadeia pesada completa ou uma cadeia leve completa de um anticorpo ilustrativo.
[165] Em outras modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13-132, 253-612, 613-660 e 709-852.
[166] Em ainda outras modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 133-252 e 661-708.
[167] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos usando quaisquer técnicas de biologia molecular adequadas. Para anticorpos expressos por hibridomas, os cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos por técnicas de amplificação por PCR ou clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibição de fagos), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado da biblioteca.
[168] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia leve completa ao ligar operacionalmente o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências dos genes da região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5aEdição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242) e os fragmentos de DNA que englobam estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas mais preferencialmente é uma região constante de IgG4 ou IgG2 sem efeito ADCC. A sequência da região constante de IgG4 pode ser qualquer um dos vários alelos ou alotipos conhecidos por ocorrer entre indivíduos diferentes. Estes alotipos representam a substituição natural de aminoácidos nas regiões constantes de IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser operacionalmente ligado a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante CH1 de cadeia pesada.
[169] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento completo (bem como em um gene de cadeia leve Fab) ligando operacionalmente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências dos genes da região constante de cadeia leve humana são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5aEdição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242) e os fragmentos de DNA que englobam estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.
[170] Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH e VL são operacionalmente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4- Ser)3, tal como as sequências VHe VL podem ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VLe VH unidas pelo ligante flexível (ver, por exemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); e McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)).
[171] A presente invenção fornece adicionalmente um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico fornecida pela presente invenção. A molécula de ácido nucleico pode codificar uma porção de uma cadeia leve ou cadeia pesada (como uma CDR ou uma HVR), um polipeptídeo de cadeia leve ou pesada completa que compreende uma porção ou a totalidade de uma cadeia pesada ou leve, ou uma sequência de aminoácidos de um derivado de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão útil para a expressão de uma molécula de ligação, como um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste. Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento vetores, em que um primeiro vetor compreende uma sequência polinucleotídica que codifica uma região variável da cadeia pesada, conforme descrito neste documento, e um segundo vetor compreende uma sequência polinucleotídica que codifica uma região variável de cadeia leve, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, um único vetor compreende polinucleotídeos que codificam uma região variável de cadeia pesada, conforme descrito neste documento e uma região variável de cadeia leve, conforme descrito neste documento.
[172] Para expressar uma molécula de ligação da invenção, DNAs que codificam cadeias leves e pesadas completas ou parciais são inseridos em vetores de expressão, de modo que as moléculas de DNA sejam operacionalmente ligadas a sequências de controle de transcrição e de tradução. Neste contexto, o termo "operacionalmente ligado" significa que um gene de anticorpo é ligado a um vetor, de modo que as sequências de controle de transcrição e tradução dentro do vetor cumprem a função pretendida de regular a transcrição e tradução da molécula de DNA. As sequências de expressão de vetor e de expressão de controle são escolhidas de modo a serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em um vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão por quaisquer métodos adequados (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento e vetor do gene do anticorpo ou ligação de DNA baseada em recombinação homóloga). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos descritos neste documento podem ser usadas para criar genes de anticorpos completos de qualquer isótipo e subclasse de anticorpo, inserindo-os em vetores de expressão que já codificam regiões constantes de cadeia pesada e regiões constantes de cadeia leve do isótipo e subclasse desejados de modo que o segmento de VH é operacionalmente ligado aos segmentos de CH dentro do vetor e o segmento de VLé operacionalmente ligado ao segmento de CL dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpos de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpos pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo sinal seja ligado in-frame ao terminal amino do gene da cadeia de anticorpos. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína não imunoglobulina).
[173] Além dos genes da cadeia de anticorpos, os vetores de expressão da invenção tipicamente possuem sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpos em uma célula hospedeira. O termo "sequência reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia de anticorpos. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990)). Entende-se que, para os versados na técnica, a concepção do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira que será transformada, o nível de expressão da proteína desejado etc. Os exemplos de sequências reguladoras da expressão de células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteínas em células de mamíferos, como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), vírus Simian 40 (SV40), adenovírus (por exemplo, principal promotor tardio de adenovírus (AdMLP) e polioma. Alternativamente, podem ser usadas sequências reguladoras não virais, tais como o promotor de ubiquitina ou promotor de ß-globina. Ainda adicionalmente, os elementos reguladores compostos por sequências de diferentes fontes, como o sistema promotor SR, que contém sequências do promotor inicial SV40 e a repetição terminal longa do vírus da leucemia de células T humanas tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472).
[174] Além dos genes da cadeia de anticorpos e sequências reguladoras, os vetores de expressão podem conter sequências adicionais, como sequências que regulam a replicação do vetor nas células hospedeiras (por exemplo, origens da replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção das células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, Patente U.S. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas de Axel et al.). Por exemplo, normalmente o gene marcador selecionável confere resistência a drogas, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira, na qual o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis incluem o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras de dhfr com seleção/amplificação do metotrexato) e o gene neo (para a seleção de G418).
[175] Para a expressão das cadeias leve e pesada, os vetores de expressão que codificam as cadeias pesada e leve são transfectados para uma célula hospedeira por quaisquer técnicas adequadas. As várias formas do termo "transfecção"destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas e, tipicamente, em células hospedeiras de mamíferos, é mais típica.
[176] A presente invenção fornece adicionalmente uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico fornecida pela presente invenção. A célula hospedeira pode ser praticamente qualquer célula para a qual os vetores de expressão estão disponíveis. Pode ser, por exemplo, uma célula hospedeira eucariótica superior, como uma célula de mamífero, uma célula hospedeira eucariótica inferior, como uma célula de levedura, e pode ser uma célula procariótica, como uma célula bacteriana. A introdução do construto de ácido nucleico recombinante na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção com fosfato de cálcio, DEAE, transfecção mediada por dextrano, eletroporação ou infecção por fago.
[177] Os hospedeiros procarióticos adequados para transformação incluem E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus.
[178] As células hospedeiras de mamíferos para expressar uma molécula de ligação da invenção incluem, por exemplo, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980), usado com um marcador de seleção DHFR, por exemplo, conforme descrito em Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-621 (1982), células de mieloma NS0, células COS e células Sp2. Em particular, para uso com mieloma NS0 ou células CHO, outro sistema de expressão é o sistema de expressão gênica GS (glutamina sintetase) descrito nos documentos WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando vetores de expressão que codificam genes de anticorpo são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando quaisquer métodos adequados de purificação de proteínas.
D. COMPOSIÇÕES
[179] Em outros aspectos, a presente invenção fornece uma composição contendo uma molécula de ligação fornecida pela invenção. Em um aspecto, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições podem ser preparadas por métodos convencionais conhecidos na técnica.
[180] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma composição compreendendo um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, fornecido pela presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o referido anticorpo compreende um domínio variável compreendendo a sequência de aminoácidos HVR descrita neste documento, e em que a referida composição compreende não mais do que cerca de 11%, 10%, 8%, 5%, 3% ou 2% do referido anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno, que é glicosilada na asparagina da referida sequência de aminoácidos em comparação com o total quantidade de anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, presente na referida composição. Em outra modalidade, a composição compreende pelo menos cerca de 2% do referido anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno, que é glicosilada na asparagina da referida sequência de aminoácidos em comparação com a quantidade total de anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, presente em referida composição.
[181] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável"refere-se a qualquer substância inativa que é adequada para uso em uma formulação para a transmissão de uma molécula de ligação. Um veículo pode ser um antiaderente, aglutinante, revestimento, desintegrante, agente de enchimento ou diluente, conservante (como agente antioxidante, antibacteriano ou antifúngico), adoçante, agente de retardo de absorção, agente umectante, agente emulsificante, tampão e semelhantes. Os exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem água, etanol, poliois (como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e semelhantes) dextrose, óleos vegetais (como azeite), solução salina, tampão, solução salina tamponada e agentes isotônicos, como açúcares, poliálcoois, sorbitol e cloreto de sódio.
[182] As composições podem estar em qualquer forma adequada, como formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas. Os exemplos de formas de dosagem líquidas incluem solução (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), microemulsão, lipossomo, dispersão ou suspensão. Os exemplos de formas de dosagem sólidas incluem comprimido, pílula, cápsula, microcápsula e pó. Uma forma particular da composição adequada para fornecer uma molécula de ligação é um líquido estéril, como uma solução, suspensão ou dispersão, para injeção ou infusão. As soluções estéreis podem ser preparadas incorporando o anticorpo na quantidade necessária em um veículo apropriado, seguido de microfiltração de esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o anticorpo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e outros veículos. No caso de pós estéreis para a preparação de líquido estéril, os métodos de preparação incluem secagem a vácuo e liofilização (liofilização) para produzir um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução filtrada anteriormente esterilizada. As várias formas de dosagem das composições podem ser preparadas por técnicas convencionais conhecidas na técnica.
[183] A quantidade relativa de uma molécula de ligação incluída na composição variará dependendo de vários fatores, como a molécula de ligação específica e os veículos usados, forma de dosagem e liberação desejada e características farmacodinâmicas. A quantidade de uma molécula de ligação em uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade que produz um efeito terapêutico, mas também pode ser uma quantidade menor. Geralmente, esta quantidade varia dentre cerca de 0,01 por cento a cerca de 99 por cento, dentre cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, ou dentre cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento em relação ao peso total da forma de dosagem.
[184] Além da molécula de ligação, um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser incluídos na composição. Os exemplos de agentes terapêuticos adicionais são descritos abaixo. A quantidade adequada do agente terapêutico adicional a ser incluído na composição pode ser facilmente selecionada por um versado na técnica e variará dependendo de vários fatores, como o agente e os veículos em particular usados, forma de dosagem e liberação desejada e características farmacodinâmicas. A quantidade do agente terapêutico adicional incluído em uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade do agente que produz um efeito terapêutico, mas também pode ser uma quantidade menor. E. USO DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[185] As moléculas de ligação e composições farmacêuticas fornecidas pela presente invenção são úteis para fins terapêuticos, diagnósticos ou outros, como modular uma resposta imune, tratar o câncer, potencializar a eficácia de outra terapia contra o câncer, aumentar a eficácia da vacina ou tratar doenças autoimunes. Portanto, em outros aspectos, a presente invenção fornece métodos de uso das moléculas de ligação ou composições farmacêuticas. Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de um distúrbio em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero que necessita de tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação fornecida pela invenção. A molécula de ligação pode ser um agonista ou antagonista de CD137. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um agonista de CD137. Em algumas modalidades, o mamífero é um humano.
[186] Em algumas modalidades, o distúrbio é um câncer. Uma variedade de cânceres em que CD137 está implicado, seja maligno ou benigno e primário ou secundário, pode ser tratado ou prevenido com um método fornecido pela invenção. Os exemplos de tais cânceres incluem cânceres de pulmão, como carcinoma broncogênico (por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequenas, carcinoma de células grandes e adenocarcinoma), carcinoma de células alveolares, adenoma brônquico, hamartoma condromatoso (não canceroso) e sarcoma (canceroso); câncer de coração como mixoma, fibromas e rabdomiomas; cânceres ósseos tais como osteocondromas, condromas, condroblastomas, fibromas condromixoides, osteomas osteoides, tumores de células gigantes, condrosarcoma, mieloma múltiplo, osteossarcoma, fibrossarcomas, histiocitomas fibrosos malignos, tumor de Ewing (sarcoma de Ewing) e sarroma de células do retículo; câncer no cérebro, como gliomas (por exemplo, glioblastoma multiforme), astrocitomas anaplásicos, astrocitomas, oligodendrogliomas, meduloblastomas, cordoma, schwannomas, ependimomas, meningiomas, adenoma hipofisário, pinealoma, osteomas, hemangioblastomas, craniofarioma, angiomas; cânceres no sistema digestivo, tais como leiomioma, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, adenocarcinomas de estômago, lipomas intestinais, neurofibromas intestinais, fibromas intestinais, pólipos no intestino grosso e cânceres colorretais; cânceres de fígado, tais como adenomas hepatocelulares, hemangioma, carcinoma hepatocelular, carcinoma fibrolamelar, colangiocarcinoma, hepatoblastoma e angiossarcoma; cânceres nos rins tais como adenocarcinoma renal, carcinoma de células renais, hipernefroma e carcinoma de células transicionais da pelve renal; cânceres de bexiga; cânceres hematológicos, como leucemia linfocítica aguda (linfoblástica), leucemia mieloide aguda (mielocítica, mieloide, mieloblástica, mielomonocítica), leucemia linfocítica crônica (por exemplo, síndrome de Sezary e leucemia de células ciliadas), leucemia mielocítica crônica (mieloide, mieloide, granulocítica) linfoma, linfoma não-Hodgkin, linfoma de células B, micose fungoide e distúrbios mieloproliferativos (incluindo distúrbios mieloproliferativos como policitemia vera, mielofibrose, trombocitemia e leucemia mielocítica crônica); cânceres da pele, tais como carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular, melanoma, sarcoma de Kaposi e doença de Paget; cânceres da cabeça e pescoço; cânceres relacionados aos olhos, tais como retinoblastoma e melanocarcinoma intraoccular; cânceres do sistema reprodutor masculino, tais como hiperplasia prostática benigna, câncer de próstata e cânceres testiculares (por exemplo, seminoma, teratoma, carcinoma embrionário e coriocarcinoma); câncer de mama; canceres do sistema reprodutor feminino, tais como câncer do útero (carcinoma endometrial), câncer do colo do útero (carcinoma do colo do útero), câncer dos ovários (carcinoma do ovário), carcinoma vulvar, carcinoma vaginal, câncer da trompa de Falópio e mola hidatiforme; câncer de tireoide (incluindo câncer papilar, folicular, anaplásico ou medular); feocromocitomas (glândula adrenal); crescimentos não cancerosos das glândulas paratireoides; cânceres pancreáticos; e cânceres hematológicos tais como leucemias, mielomas, linfomas não-Hodgkin e linfomas de Hodgkin.
[187] Em algumas outras modalidades, o distúrbio é uma doença autoimune. Os exemplos de doenças autoimunes que podem ser tratadas com as moléculas de ligação incluem encefalomielite autoimune, lúpus eritematoso e artrite reumatoide. A molécula de ligação também pode ser usada para tratar inflamação (como asma alérgica) e doença crônica do enxerto contra o hospedeiro.
[188] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para melhorar uma resposta imune em um mamífero, que compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação fornecida pela invenção. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um anticorpo de CD137 ou fragmento de ligação ao antígeno deste e o mamífero é um humano. Em uma outra modalidade, a molécula de ligação é um anticorpo agonista de CD137 ou um fragmento de ligação a antígeno deste. O termo "potencializar a resposta imune" ou suas variações gramaticais significa estimular, evocar, aumentar, aprimorar ou aumentar qualquer resposta do sistema imune de um mamífero. A resposta imune pode ser uma resposta celular (ou seja, mediada por células, como mediada por linfócitos T citotóxicos) ou uma resposta humoral (ou seja, resposta mediada por anticorpos) e pode ser uma resposta imune primária ou secundária. Os exemplos de aumento da resposta imune incluem aumento da atividade das células T auxiliares de CD4+ e geração de células T citolíticas. O aprimoramento da resposta imune pode ser avaliado usando uma série de medições in vitro ou in vivo conhecidas pelos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a, ensaios de linfócitos T citotóxicos, liberação de citocinas (por exemplo, produção de IL-2), regressão de tumores, sobrevivência de animais portadores de tumor, produção de anticorpos, proliferação de células imunes, expressão de marcadores de superfície celular e citotoxicidade. Tipicamente, os métodos da invenção aprimoram a resposta imune por um mamífero quando comparados com a resposta imune por um mamífero não tratado ou um mamífero não tratado usando os métodos reivindicados. Em uma modalidade, a molécula de ligação é usada para aprimorar a resposta imune de um ser humano a um patógeno microbiano (como um vírus). Em outra modalidade, a molécula de ligação é usada para aumentar a resposta imune de um humano a uma vacina. A molécula de ligação pode ser um agonista ou antagonista de CD137. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um agonista de CD137. Em uma modalidade, o método aprimora uma resposta imune celular, particularmente uma resposta de células T citotóxicas. Em outra modalidade, a resposta imune celular é uma resposta de células T auxiliares. Em ainda outra modalidade, a resposta imune é uma produção de citocinas, particularmente a produção de IL- 2. A molécula de ligação pode ser usada para melhorar a resposta imune de um ser humano a um patógeno microbiano (como um vírus) ou a uma vacina. A molécula de ligação pode ser um agonista ou antagonista de CD137. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um agonista de CD137.
[189] Na prática dos métodos terapêuticos, as moléculas de ligação podem ser administradas sozinhas como monoterapia, ou administradas em combinação com um ou mais agentes ou terapias terapêuticas adicionais. Portanto, em outro aspecto, a presente invenção fornece uma terapia de combinação, que compreende uma molécula de ligação em combinação com uma ou mais terapias ou agentes terapêuticos adicionais para administração separada, sequencial ou simultânea. O termo "terapia adicional" refere-se a uma terapia que não emprega uma molécula de ligação fornecida pela invenção como um agente terapêutico. O termo "agente terapêutico adicional" refere-se a qualquer agente terapêutico que não seja uma molécula de ligação fornecida pela invenção. Em um aspecto particular, a presente invenção fornece uma terapia de combinação para o tratamento de câncer em um mamífero, que compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação fornecida pela invenção em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em uma modalidade adicional, o mamífero é um ser humano.
[190] Uma grande variedade de agentes terapêuticos do câncer pode ser usada em combinação com uma molécula de ligação fornecida pela presente invenção. Um versado na técnica reconhecerá a presença e o desenvolvimento de outras terapias contra o câncer que podem ser usadas em combinação com os métodos e moléculas de ligação da presente invenção e não serão restritas às formas de terapia estabelecidas neste documento. Os exemplos de categorias de agentes terapêuticos adicionais que podem ser usados na terapia combinada para o tratamento de câncer incluem (1) agentes quimioterapêuticos, (2) agentes imunoterapêuticos e (3) agentes terapêuticos hormonais.
[191] O termo "agente quimioterapêutico"refere-se a uma substância química ou biológica que pode causar a morte de células cancerígenas ou interferir no crescimento, divisão, reparo e/ou função das células de câncer. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem aqueles que são descritos em WO 2006/129163 e US 20060153808, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos em particular incluem: (1) agentes de alquilação, tal como clorambucil (LEUKERAN), ciclofosfamida (CYTOXAN), ifosfamida (IFEX), cloridrato de mecloretamina (MUSTARGEN), tiotepa (THIOPLEX), estreptozotocina (ZANOSAR), carmustina (BICNU, GLIADEL WAFER), lomustina (CEENU) e dacarbazina (DTIC-DOME); (2) alcaloides ou alcaloides de planta vinca, incluindo antibióticos citotóxicos, tal como doxorrubicina (ADRIAMYCIN), epirrubicina (ELLENCE, PHARMORUBICIN), daunorrubicina (CERUBIDINE, DAUNOXOME), nemorrubicina, idarrubicina (IDAMYCIN PFS, ZAVEDOS), mitoxantrona (DHAD, NOVANTRONE), dactinomicina (actinomicina D, COSMEGEN), plicamicina (MITHRACIN), mitomicina (MUTAMYCIN) e bleomicina (BLENOXANE), tartrato de vinorelbina (NAVELBINE)), vinblastina (VELBAN), vincristina (ONCOVIN) e vindesina (ELDISINE); (3) antimetabólitos, tal como capecitabina (XELODA), citarabina (CYTOSAR-U), fludarabina (FLUDARA), gencitabina (GEMZAR), hidroxiureia (HYDRA), metotrexato (FOLEX, MEXATE, TREXALL), nelarabina (ARRANON), trimetrexato (NEUTREXIN) e pemetrexedo (ALIMTA); (4) antagonistas de pirimidina, tal como 5-fluorouracil (5-FU); capecitabina (XELODA), raltitrexedo (TOMUDEX), tegafur- uracil (UFTORAL) e gencitabina (GEMZAR); (5) taxanos, tal como docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel (TAXOL); (6) drogas de platina, tal como cisplatina (PLATINOL) e carboplatina (PARAPLATIN) e oxaliplatina (ELOXATIN); (7) inibidores de topoisomerase, tal como irinotecano (CAMPTOSAR), topotecano (HYCAMTIN), etoposídeo (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR) e teniposídeo (VUMON); (8) epipodofilotoxinas (derivados de podofilotoxina), tal como etoposídeo (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR); (9) derivados de ácido fólico, tal como leucovorina (WELLCOVORIN); (10) nitrosoureias, tal como carmustina (BiCNU), lomustina (CeeNU); (11) inibidores do receptor de tirosina quinase, incluindo receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento tipo insulina (IGFR), receptor do fator de crescimento de hepatócitos (HGFR) e receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), tal como gefitinibe (IRESSA), erlotinibe (TARCEVA), bortezomibe (VELCADE), mesilato de imatinibe (GLEEVEC), genefitinibe, lapatinibe, sorafenibe, talidomida, sunitinibe (SUTENT), axitinibe, rituximabe (RITUXAN, MABTHERA), trastuzumabe (HERCEPTIN), cetuximabe (ERBITUX), bevacizumabe (AVASTIN) e ranibizumabe (LUCENTIS), lym-1 (ONCOLYM), anticorpos para o receptor do fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF-1R) que são descritos em WO2002/053596); (12) inibidores de angiogênese, tal como bevacizumabe (AVASTIN), suramina (GERMANIN), angiostatina, SU5416, talidomida e inibidores de metaloproteinase de matriz (tal como batimastate e marimastate) e aqueles que são descritos na WO2002055106; e (13) inibidores de proteassoma, tal como bortezomibe (VELCADE).
[192] O termo "agentes imunoterapêuticos"refere-se a uma substância química ou biológica que pode aprimorar a resposta imune de um mamífero. Os exemplos de agentes imunoterapêuticos incluem: bacillus Calmette-Guerin (BCG); citocinas, tal como interferons; vacinas, tal como imunoterapia personalizada MyVax, Onyvax-P, Oncófago, GRNVAC1, Favld, Provenge, GVAX, Lovaxin C, BiovaxID, GMXX e NeuVax; e anticorpos, tal comoalemtuzumabe (CAMPATH), bevacizumabe (AVASTIN), cetuximabe (ERBITUX), gemtuzunab ozogamicina (MYLOTARG), ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN), panitumumab (VECTIBIX), rituximab (RITUXAN, MABTHERA), trastuzumab (HERCEPTIN), tositumomab (BEXXAR), ipilimumab (YERVOY) tremelimumab, CAT-3888, anticorpos agonistas para o receptor de OX40 (tal como aqueles descritos em WO2009/079335), anticorpos agonistas para o receptor de CD40 (tal como aqueles descritos em WO2003/040170 e agonistas de TLR-9 (tal como aqueles descritos em WO2003/015711, WO2004/016805 e WO2009/022215).
[193] O termo "agente terapêutico hormonal" refere-se a uma substância química ou biológica que inibe ou elimina a produção de um hormônio, inibe ou neutraliza o efeito de um hormônio no crescimento e/ou sobrevida de células cancerígenas. Os exemplos de tais agentes adequados para os métodos descritos neste documento incluem aqueles que são descritos em US20070117809. Os exemplos de agentes terapêuticos hormonais específicos incluem tamoxifeno (NOLVADEX), toremifeno (Fareston), fulvestrant (FASLODEX), anastrozol (ARIMIDEX), exemestano (AROMASIN), letrozol (FEMARA), acetato de megestrol (MEGACE), goserelina (ZOLADEX) e leu (LUPRON). As moléculas de ligação desta invenção também podem ser usadas em combinação com terapias hormonais não medicamentosas, tais como (1) métodos cirúrgicos que removem todo ou parte dos órgãos ou glândulas que participam da produção do hormônio, como os ovários, os testículos, glândula adrenal e hipófise e (2) tratamento com radiação, no qual os órgãos ou glândulas do paciente são submetidos a radiação em uma quantidade suficiente para inibir ou eliminar a produção do hormônio alvo.
[194] A terapia combinada para o tratamento do câncer também abrange a combinação de uma molécula de ligação com a cirurgia para remover um tumor. A molécula de ligação pode ser administrada ao mamífero antes, durante ou após a cirurgia.
[195] A terapia de combinação para o tratamento de câncer também abrange a combinação de uma molécula de ligação com terapia de radiação, como radioterapia ionizante (eletromagnética) (por exemplo, raios X ou raios gama) e radioterapia por feixe de partículas (por exemplo, radiação de energia linear alta). A fonte de radiação pode ser externa ou interna ao mamífero. A molécula de ligação pode ser administrada ao mamífero antes, durante ou após a terapia de radiação.
[196] As moléculas e composições de ligação fornecidas pela presente invenção podem ser administradas por qualquer via entérica adequada ou via de administração parentérica. O termo "via enteral" de administração refere-se à administração por qualquer parte do trato gastrointestinal. Os exemplos de vias entéricas incluem via oral, mucosa, bucal e retal ou via intragástrica. "Via parenteral" de administração refere-se a uma via de administração diferente da via enteral. Os exemplos de vias de administração parentérica incluem administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral, intravesical, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, transtraceal, intra-articular, subcapsular, subaracnóidea, intraespinal, epidural e intrasternal, subcutânea ou subcutânea. Os anticorpos e composições da invenção podem ser administrados usando qualquer método adequado, como por ingestão oral, tubo nasogástrico, tubo de gastrostomia, injeção, infusão, bomba de infusão implantável e bomba osmótica. A via e o método de administração adequados podem variar dependendo de vários fatores, como o anticorpo específico em uso, a taxa de absorção desejada, a formulação específica ou a forma de dosagem utilizada, o tipo ou a gravidade do distúrbio em tratamento, o local de ação específico e condições do paciente e podem ser facilmente selecionados por um especialista na técnica
[197] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma molécula de ligação refere-se a uma quantidade que é eficaz para uma finalidade terapêutica pretendida. Por exemplo, no contexto de aprimoramento de uma resposta imune, uma "quantidade terapeuticamente eficaz"é qualquer quantidade que seja eficaz para estimular, evocar, aumentar, aprimorar ou ampliar qualquer resposta do sistema imune de um mamífero. No contexto de tratamento de uma doença, uma "quantidade terapeuticamente eficaz"é qualquer quantidade que seja suficiente para causar qualquer efeito desejável ou benéfico no mamífero que está sendo tratado. Especificamente, no tratamento do câncer, exemplos de efeitos desejáveis ou benéficos incluem inibição de crescimento ou disseminação adicional de células cancerígenas, morte de células cancerígenas, inibição da recorrência do câncer, redução da dor associada ao câncer ou sobrevida aprimorada do mamífero. A quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de CD137 geralmente varia dentre cerca de 0,001 a cerca de 500 mg/kg, e mais comumente dentre cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg, do peso corporal do mamífero. Por exemplo, a quantidade pode ser dentre cerca de 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg ou 100 mg/kg do peso corporal do mamífero. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de CD137 está no intervalo de cerca de 0,01-30 mg/kg do peso corporal do mamífero. Em algumas outras modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de CD137 está no intervalo de cerca de 0,05-15 mg/kg do peso corporal do mamífero. O nível de dosagem preciso a ser administrado pode ser prontamente determinado por um versado na técnica e dependerá de vários fatores, como o tipo e a gravidade do distúrbio a ser tratado, a molécula de ligação específica empregada, a via da administração, o tempo de administração, a duração do tratamento, a terapia adicional específica empregada, a idade, sexo, peso, condição, estado geral de saúde e antecedentes médicos anteriores do paciente a ser tratado e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.
[198] Uma molécula ou composição de ligação é geralmente administrada em várias ocasiões. Os intervalos entre doses únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Um regime de tratamento exemplificativo envolve a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada três meses ou uma vez a cada três a seis meses. Os regimes de dosagem típicos para um anticorpo de CD137 incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal por administração intravenosa, usando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanas por seis dosagens e depois a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal, uma vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.
[199] A invenção será compreendida mais amplamente pela referência aos exemplos a seguir. Os exemplos não devem, no entanto, ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção. Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos, e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas para pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações em anexo. O conteúdo de todas as figuras e todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo desta invenção é expressamente incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 GERAÇÃO DE FABS PRIMÁRIOS QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE AO CD137 HUMANO
[200] As bibliotecas proprietárias de fagomídeos (ver o Pedido Internacional PCT intitulado “Dynamic Human Antibody Light Chain Libraries”, depositado simultaneamente sob o Registro do Procurador N° 69540-2000140, incorporado neste documento por referência na sua totalidade; Ver também Pedido Internacional PCT intitulado “Dynamic Human Heavy Chain Antibody Libraries”, depositado simultaneamente neste documento sob o Registro do Procurador N° 69540-2000240, incorporado neste documento por referência na sua totalidade) foram empregadas para investigar antígenos CD137. Foram realizadas três ou quatro rodadas de panning. Após a rodada final de panning, foi realizado o ELISA sobrenadante de colônia única para identificar os hits primários que reconhecem especificamente o CD137 humano. Os hits primários foram definidos como aqueles cujos sinais ELISA eram pelo menos duas vezes os do fundo. Eles foram sequenciados, os clones únicos foram expressos e purificados para medição de afinidade por ForteBio e Biacore. A lista foi reduzida para 124 no Fab com resultados positivos para ELISA e sequências únicas. Seguindo os critérios do sinal de resposta KD R>0,1, R2>0,9 e afinidade KD < 100 nM, a lista foi adicionalmente reduzida para 60 hits (Tabela 1a). 24 deles foram então convertidos em IgG (Tabela 1b) para caracterização biofísica e funcional detalhada.
[201] Os Fabs correspondentes aos hits únicos foram expressos em E. coli e purificados. Suas afinidades contra o CD137 humano foram medidas pelos sistemas ForteBio Octet RED96. Resumidamente, os sensores AHC (Imersão de Captura Fc de anti-IgG humana e Read Biosensors) foram usados para capturar a proteína de fusão CD137-hisFc (Sino Biological N° Cat 10041- H03H) e imersos em poços contendo Fabs purificados que foram diluídos para 5-10 µg/ml com tampão cinético (HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM, surfactante P20 a 0,005% v/v, pH 7,4). Os dados de ForteBio adquiridos foram processados com o software Data Acquisition 7.1 e os dados cinéticos foram ajustados a um modelo de ligação Langmuir 1:1. Os parâmetros de afinidade e cinéticos (com o fundo subtraído) estão listados na Tabela 1a. A afinidade de suas IgGs correspondentes ao CD137 humano foi medida por Biacore e mostrada na Tabela 1b. TABELA 1A.A AFINIDADE DE FABS SELECIONADOS CONTRA CD137 HUMANO E SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS CORRESPONDENTES (NA SEQ ID NO.)
[202] As sequências de DNA correspondentes que codificam as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 13-132 podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 133-252, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-H1 para todos os hits de Fab mostradas na Tabela 1a podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 253-312, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-H2 para todos os hits de Fab mostradas na Tabela 1a podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 313-372, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-H3 para todos os hits de Fab mostradas na Tabela 1a podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 373-432, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-L1 para todos os hits de Fab mostradas na Tabela 1a podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 433-492, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-L2 para todos os hits de Fab mostradas na Tabela 1a podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 493-552, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-L3 para todos os hits de Fab mostradas na Tabela 1a podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 553-612, respectivamente (Ver também Tabela 1c). TABELA 1 B AFINIDADE DE FABS E AS IGGS CORRESPONDENTES CONTRACD137
[203] As sequências de DNA correspondentes que codificam as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 613-660 podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 661-708, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-H1 para todas as sequências de IgG mostradas na Tabela 1b podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 709-732, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-H2 para todas as sequências de IgG mostradas na Tabela 1b podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 733-756, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-H3 para todas as sequências de IgG mostradas na Tabela 1b podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 757-780, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-L1 para todas as sequências de IgG mostradas na Tabela 1b podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 781-804, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-L2 para todas as sequências de IgG mostradas na Tabela 1b podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 805-828, respectivamente. As sequências de aminoácidos HVR-L3 para todas as sequências de IgG mostradas na Tabela 1b podem ser encontradas nas SEQ ID NOs: 829-852, respectivamente. TABELA 1C: SEQUÊNCIAS CDR DE FABS
EXEMPLO 2 SELEÇÃO DOS HITS DE FAB QUE SÃO REATIVOS CRUZADOS COM O CD137 DE CAMUNDONGO
[204] A reatividade cruzada de espécies de hits de Fab foi determinada usando ELISA. Resumidamente, 200 µL de 5 µg/mL de IgG anti- humano (específico de Fab) (Sigma # I5260) foram revestidos em microplaca Maxisorp (Thermo Scientific 446469) a 4°C durante a noite. Após o bloqueio, 100 µL de Fab 5310 (5 µg/mL), 5351 (2,8 µg/mL) e 5365 (5 µg/mL) foram adicionados e incubados durante 1 hora. Após lavagem por três vezes, diluições em série de antígenos CD137 humanos ou de camundongo fundidos com fragmentos FC humanos foram adicionados e incubados por 1 hora. Após a lavagem, o FC anti- humano de cabra marcado com HRP foi diluído 1:2000 com PBS e adicionado a cada poço durante 1 hora de incubação. As placas foram lavadas três vezes e incubadas com substrato TMB por 20 min à temperatura ambiente. A absorbância a 450 nm foi medida após a reação ter sido interrompida. O resultado é apresentado na Figura 1b, painel inferior, mostrando que o Fab 5310 e o 5365 se ligam ao CD137 humano e de camundongo, enquanto o Fab 5351 se liga ao CD137 humano, mas não ao CD137 de camundongo.
EXEMPLO 3 CONVERSÃO E EXPRESSÃO DE IGG:AG10058, AG10059 EAG10131
[205] As cadeias pesadas e as cadeias leves dos Fabs 5310, 5351 e 5365 foram clonadas no vetor de expressão de mamíferos pCDNA 3.3 (Thermo Fisher Scientific) separadamente em isótipo IgG4 com mutação S241P. As cadeias pesada e leve de dois anticorpos de referência também foram clonadas em pCDNA3.3 no isótipo IgG4 e IgG2, respectivamente.
[206] A região variável da cadeia pesada usada no anticorpo de referência AC1097 compreendeu a sequência EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKI YPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFD YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 862) e a região variável da cadeia pesada no anticorpo de referência AC1097 compreendeu a sequência SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKN RPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKL TVL (SEQ ID NO: 863). A região variável de cadeia pesada usada no anticorpo de referência AC1121 compreendeu a sequência QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEIN HGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNY DWYFDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 864) e a região variável da cadeia leve no anticorpo de referência AC1121 compreendeu a sequência EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASN RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKV EIK (SEQ ID NO: 865). As IgGs usadas neste documento são mostradas na Tabela 2. TABELA 2: LISTA DE IGGS
[207] PARES DE PLASMÍDEOS FORAM TRANSFECTADOS TRANSITORIAMENTE paracélulas HEK293F, seguindo as instruções do fabricante. Os sobrenadantes foram coletados, limpos por centrifugação e filtração, e as IgGs foram purificadas com cromatografia de afinidade com proteína A padrão (MabSelect SuRe, GE Healthcare). As proteínas foram eluídas e neutralizadas e trocadas de tampão para tampão PB (fosfato de sódio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0). As concentrações de proteína foram determinadas por espectrofotometria de UV e a pureza de IgG foi analisada sob condições de desnaturação, redução e não redução por SDS-PAGE ou SEC-HPLC.
EXEMPLO 4 AFINIDADE DE LIGAÇÃO ACD137 DE HUMANOS, MACACOS E CAMUNDONGOS
[208] A afinidade de ligação de IgGs a CD137 de humanos, macacos e camundongos foi medida por BIAcore, ELISA e citometria de fluxo. Os resultados foram resumidos na Tabela 3. TABELA 3. AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ACD137 DE HUMANOS, MACACOS E CAMUNDONGOS NC: não reativo
4A. MEDIÇÃO DA AFINIDADE E CINÉTICA DE LIGAÇÃO POR SPR
[209] A afinidade de ligação e a cinética dos anticorpos contra a proteína CD137 de humanos, macacos e camundongos foram examinadas por análise de ressonância plasmônica de superfície (SPR) usando um instrumento Biacore™ T200 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) de acordo com as diretrizes do fabricante. O anticorpo IgG anti-humano (Fc) do Kit de captura de anticorpos humanos (GE BR-1008-39) foi imobilizado em chips CM5 acoplando seus grupos amina em superfícies carboxiladas de chips sensores, de acordo com as instruções do kit de acoplamento de amina (GE Biacore # BR-1000-50). O anticorpo IgG Anti-Humano (Fc) imobilizado foi utilizado para capturar AG10058, AG10059, AG10131, AC1121 e AC1097. Finalmente, seis concentrações (3,13, 6,25, 12,5, 25, 50, 100) (nM) (diluídas em tampão de corrida) de CD137-His6 (Sino Biological # 10041-H08H) foram injetadas a uma vazão de 30 µI/min durante 300 segundos e o tempo de dissociação foi de 300 segundos. O tampão de corrida em foi 1 x HBS-EP (HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM, Surfactante P20 a 0,005% v/v, pH 7,4 a 25°C). Os controles correspondentes foram conduzidos em cada caso usando uma célula de fluxo em branco sem proteína imobilizada para subtração "de fundo". As curvas de associação e dissociação foram ajustadas a um modelo de ligação Langmuir 1:1 usando o Biacore T200 Evaluation Software (Biacore AB, Uppsala, Suécia) de acordo com as diretrizes do fabricante. Conforme mostrado na Tabela 3, todos os anticorpos se ligam ao CD137 humano. AG10058 e AG10059 mostram maior afinidade que os dois anticorpos de referência. Exceto pelo mAb de referência AC1121, todos os anticorpos se ligam ao CD137 de macaco. Apenas AG10058 e AG10131 se ligam ao CD137 de camundongo e rato. O AG10058 tem uma afinidade mais alta (15,2 nM) do que o AG10131 (64,5 nM).
4B. MEDIÇÃO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO AO CD137 SOLÚVEL USANDO O ENSAIO ELISA
[210] Uma diluição em série de CD137 humano, macaco ou camundongo fundido com o fragmento de FC humano foi preparada e usada para revestir a placa ELISA a 37°C durante 1 hora. Após o bloqueio, 100 µL de IgGs (5 µg/mL) foram adicionados e incubados a 37°C durante 1 hora. As placas foram lavadas por três vezes e depois incubadas com proteína L conjugada com HRP (diluição 1: 2000) a 37°C durante 1 hora. As placas foram lavadas novamente por três vezes e incubadas com substrato TMB durante 20 minutos à temperatura ambiente. A absorbância a 450 nm foi medida após a reação ter sido interrompida. Os dados foram analisados pelo Graphpad Prism 6 com ajuste não linear. Conforme mostrado na Figura 2, todos os anticorpos se ligam ao CD137 humano (proteína de fusão FC) com afinidade sub nM semelhante. Exceto o mAb de referência AC1121, todos os anticorpos se ligam ao CD137 de macaco com afinidade sub nM semelhante. Consistente com os resultados do Biacore, apenas AG10058 e AG10131 se ligam ao CD137 do camundongo. O AG10058 tem uma afinidade mais alta (0,3 nM) que o AG10131 (23,9 nM).
4C. MEDIÇÃO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO ACD137 SUPEREXPRESSA NA SUPERFÍCIE CELULAR POR CITOMETRIA DE FLUXO
[211] A afinidade dos anticorpos também foi avaliada contra CD137 de humanos, macacos e camundongos que são expressos transitoriamente na superfície das células HEK293F. Resumidamente, as células HEK293F foram transfectadas com um plasmídeo que expressa CD137 humano, de macaco ou de camundongo completo a partir de um vetor IRES bicistrônico, usando EGFP para identificar as células transfectadas. Após 48 horas, as células transfectadas foram coletadas e depois lavadas uma vez com tampão FACS frio (PBS suplementado com BSA a 1%). As células foram então incubadas com várias IgGs (cada uma a 100 nM) durante 1 hora em gelo, lavadas duas vezes com tampão FACS pré-resfriado e incubadas com anticorpos FC anti-humanos de camundongo conjugado Alexa Fluor® 647 durante 30 min em gelo. As células foram lavadas uma vez antes da análise por citometria de fluxo (Beckman® CytoFlex). Conforme mostrado na Figura 3a, todos os anticorpos se ligam ao CD137 humano expresso na superfície celular com baixa afinidade nM. AG10058, AG10059 e AG10131 são ligeiramente melhores que os dois anticorpos de referência. Exceto o mAb de referência AC1121, todos os anticorpos se ligam ao CD137 de macaco com baixa afinidade nM, AG10058, AG10059 e AG10131 são ligeiramente melhores que o anticorpo de referência AC1097. Consistente com os resultados do Biacore e ELISA, apenas AG10058 e AG10131 se ligam ao CD137 de camundongo. O AG10058 tem uma afinidade maior que o AG10131 contra o CD137 de camundongo. Além disso, AG10058 e AG10131 (cada um a 100 nM) também se ligam a CD137 de camundongos e caninos superexpressos na superfície celular HEK293F (Figura 3b).
4D. LIGAÇÃO DE IGGS A CÉLULAST HUMANAS, DE MACACO, DE CAMUNDONGO E DE RATO ATIVADAS.
[212] A reatividade cruzada entre espécies dos anticorpos exemplares foi ainda confirmada usando células PBMC ou T estimuladas por PMA e Ionomicina de humanos, macacos, camundongos e ratos. PBMC de humanos e macacos cinomolgo foram isolados por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll. Resumidamente, o sangue total fresco de doadores saudáveis ou macacos cinomolgo foi diluído com igual volume de PBS e cuidadosamente carregado no topo do Histopaque 1077 (14 ml em tubo de centrífuga de 50 ml). Centrifugar a 1.200 x g durante 30 minutos em temperatura ambiente com o freio desligado. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente a camada superior com uma pipeta até 0,5 cm da interface opaca contendo células mononucleares. Descartar a camada superior. Transferir cuidadosamente a interface opaca (cerca de 3-5 ml) com uma pipeta para um tubo de centrífuga cônico limpo de 50 ml. Lavar as células com 20 ml de PBS, colete as células por centrifugação a 400 x g por 5 minutos e ressuspender as células em 20 ml de PBS. Contar as células com hemocitômetro e colete as células novamente por centrifugação a 400 x g por 5 minutos. Os esplenócitos de camundongo ou rato foram isolados passando baços através de um filtro de células de 45 µm ligado a um tubo cônico de 50 mL para obter uma suspensão de célula e lavar as células através do filtro com PBS. Centrifugar a 1600 rpm durante 5 minutos e descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em 2 ml de solução de lise de glóbulos vermelhos durante 2 minutos. Adicionar mais de 10 vezes o volume de PBS e coletar as células a 1600 rpm de centrifugação durante 5 minutos. Descartar o sobrenadante e ressuspender os esplenócitos em RPMI1640/10% de FBS. As células Pan-T foram enriquecidas a partir de PBMC (humano/macaco) ou esplenócitos (camundongo/rato) por seleção negativa com esferas magnéticas em kits comerciais (Stemcell Technologies) específicos para humanos, macacos, camundongos e ratos, respectivamente. A ativação de PBMC humano/macaco ou esplenócitos de camundongo/rato foi realizada incubando células com 50ng/ml de PMA + 1 µM de ionomicina a 37°C, 5% de CO2 durante a noite.
[213] As células ativadas (~2x105células/tubo) foram lavadas em tampão de coloração pré-resfriado (PBS suplementado com 2% de FBS) e incubadas com 100 nM de anticorpos testados durante 1 hora em gelo. As células foram então lavadas duas vezes usando 1 mL de tampão de coloração e ressuspensas em 100 mL de tampão de coloração contendo anticorpo FC anti- humano de rato conjugado Alexa Fluor® 647 e anticorpos marcadores de células T específicos da espécie. Os anticorpos marcadores de células T foram usados como se segue: CD3, CD4 ou CD8. As células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração após incubação no escuro durante 30 minutos. Finalmente, as células foram ressuspensas em 300 µL de tampão de coloração e analisadas por Beckman CytoFlex. A análise dos dados foi realizada no software Flowjo 10. Conforme mostrado na Figura 4a, todos os anticorpos testados se ligam às células T humanas e de macaco ativadas, mas não às células T humanas ingênuas. A capacidade de ligação de AG10131 a células T ativadas de camundongo e rato foi adicionalmente avaliada (Figura 4b). AG10131 liga-se a células T ativadas de camundongo e rato.
[214] Em resumo, os anticorpos AG10058 e AG10131 mostram maior afinidade com CD137 humano e macaco. Eles exibem ampla reatividade cruzada entre espécies, incluindo humanos, macaco cinomolgo, camundongo, rato e cachorro para AG10131, mas humanos, macaco cinomolgo, camundongo e cachorro para AG10058, permitindo uma avaliação rápida da eficácia in vivo em modelos singênicos de camundongos.
EXEMPLO 5 SELETIVIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS PARA CD137
[215] A seletividade de anticorpos para CD137 foi avaliada usando análise por citometria de fluxo de sua capacidade de ligação a membros da superfamília TNFR. Os receptores TNFRSF, incluindo CD137, OX40, CD40, GITR e CD27, foram superexpressos transitoriamente na superfície das células HEK293F. As células transfectadas foram lavadas em tampão de coloração pré- resfriado (PBS suplementado com 2% de FBS), depois incubadas com 100 nM de anticorpos durante 1 hora em gelo. As células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração e os anticorpos FC anti-humanos de camundongo conjugado Alexa Fluor® 647 foram adicionados e incubados durante 30 minutos em gelo. As amostras foram lavadas uma vez com tampão de coloração antes da análise por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 5, AG10058, AG10059 e AG10131 se ligam especificamente ao CD137, não a quaisquer outros membros da família testados ou células-mãe transfectadas com vetores vazios.
EXEMPLO 6 COMPETIÇÃO DE LIGANTES USANDO ELISA E CITOMETRIA DE FLUXO
[216] Os anticorpos foram testados quanto à sua capacidade de bloquear a ligação do CD137 ao ligante cognato de CD137L deste, tanto pelo teste ELISA quanto pela citometria de fluxo. Conforme mostrado nas Figuras 6a e 6b, todos os anticorpos testados bloqueiam a ligação de CD137 e CD137L.
6A. COMPETIÇÃO DE LIGANTES POR ELISA
[217] O CD137 humano recombinante (fundido com o Fc humano e o marcador His) foi diluído para 1 µg/mL em PBS e revestido na placa Maxisorp a 4°C durante a noite. As placas foram bloqueadas com PBS suplementado com 3% de leite sem gordura a 37°C durante 1 hora. Após a lavagem, um volume total de 100 µL de mistura de 50 µL de CD137L biotinilado (4 µg/mL) e várias concentrações de anticorpos de teste (oito diluições seriadas 1:2 variando de 500 µg/mL a 2 µg/mL) foram adicionados a cada bem e incubado a 37°C durante 1 hora. As placas foram lavadas três vezes e 100 µL de neutravidina conjugada com HRP (1:1000) foram adicionados a cada poço e incubados a 37°C durante 1 hora. As placas foram lavadas como descrito anteriormente e 50 µL de solução de substrato TMB foram adicionadas e incubadas em temperatura ambiente durante 20 minutos antes que a reação fosse interrompida por 50 µL de H2SO4. Conforme mostrado na Figura 6a, todos os anticorpos de teste AG10058, AG10059 e AG10131 bloqueiam a ligação de CD137 a CD137L. AG10131 mostra a capacidade de bloqueio mais forte ou completa, no intervalo de cerca de uM, seguida pela AG10058 para bloqueio significativo em >uM; e AG10059 para bloqueio eficaz na faixa de uM. Esses dados sugerem que, nas condições testadas e com os reagentes utilizados, os anticorpos reativos cruzados AG10131 e AG10058 de espécies amplas são inibidores altamente eficazes da interação entre CD137 e seu ligante de CD137L, enquanto AG10059 mostra apenas um bloqueio moderadamente eficaz da interação entre CD137 e o seu ligante CD137L. Deve-se notar que o anticorpo de referência AC1097, que reage de maneira cruzada com o CD137 humano e de macaco, enquanto o AC1121, que reage apenas com o CD137 humano, mostra quase nenhum bloqueio.
6B. LIGAÇÃO POR COMPETIÇÃO DE LIGANTES POR CITOMETRIA DE FLUXO
[218] O plasmídeo que codifica CD137 humano completo foi transitoriamente expresso em células HEK293F. As células foram lavadas com tampão de coloração (PBS suplementado com BSA a 1%) e ressuspensas em tampão de coloração contendo 100 nM de anticorpos de teste. Após incubação em gelo durante 30 minutos, CD137L biotinilado 33 nM foram adicionados a cada poço e incubados durante mais 1 hora em gelo. As células foram lavadas com tampão de coloração duas vezes, e 50 mL de tampão de coloração contendo estreptavidina conjugada com Alexa fluor 647 foram adicionados e incubados em gelo durante 30 minutos. As células foram lavadas uma vez e analisadas por citometria de fluxo CytoFlex. Conforme mostrado na Figura 6b, todos os três anticorpos testados podem bloquear a ligação entre CD137 e CD137L de uma maneira dependente da concentração. AG10131 mostra a maior capacidade de bloqueio, seguido por AG10058 com bloqueio significativo; e AG10059 com bloqueio menos eficaz. Estes dados sugerem que as largas espécies de anticorpos reativos cruzados AG10131 e AG10058 são altamente eficazes no bloqueio da interação entre CD137 e ligante de CD137L deste, enquanto AG10059 mostra bloqueio parcial da interação entre CD137 e ligante de CD137L deste. Por outro lado, o anticorpo de referência AC1097, que reage de maneira cruzada com CD137 humano e de macaco, mostra apenas bloqueio parcial, enquanto o anticorpo de referência AC1121, que reage apenas com CD137 humano, não mostra bloqueio.
EXEMPLO 7 MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS
[219] Para determinar as regiões de ligação dos anticorpos testados ao nível do resíduo de aminoácido, uma série de mutações (Tabela 5) foi feita no domínio extracelular do CD137 humano. Estes plasmídeos de mutação CD137 foram utilizados para transfectar células HEK293F. A ligação de anticorpos aos mutantes de CD137 humanos foi avaliada por análise por citometria de fluxo, como descrito anteriormente no Exemplo 5 e mostrado na Figura 7A. Os resultados estão resumidos na Tabela 5, juntamente com a reatividade cruzada desses anticorpos com CD137 humano, macaco, camundongo e rato em uma diferenciação interessante, indicando os epítopos finos dos hits derivados das bibliotecas Adagene. O AG10131 liga-se a todas as 4 espécies, enquanto o AG10058 liga todos os 3 CD137, mas não o CD137 de rato. AG10058, AG10059 e AG10131 perderam a capacidade de ligação às mutações GFT34AAA, FSS53AAA e FH92AA, indicando que seus epítopos de ligação estão dentro dessas regiões, por exemplo, resíduos de aminoácidos 34-93 ou 34-108 da SEQ ID NO.: 1 (Ver também figura 7B). AG10058 e AG10131 podem ligar o mesmo epítopo ou altamente semelhante, enquanto AG10059 pode ligar diferentes epítopos de AG10058 e AG10131.
[220] Os construtos mutantes pretendiam diferenciar os epítopos por AG10058, AG10059 e AG10131 dos anticorpos de referência por AC1121 e AC1097. É claro que todos os três anticorpos AG10058, AG10059 e AG10131 têm como alvo epítopos muito diferentes de AC1121 e AC1097. AG10058, AG10059 e AG10131 diferem de AC1121 nas regiões definidas pelos mutantes Hu_FH92AA e Hu_FSS53AAA e possivelmente Hu_GTF34AAA, enquanto AG10058, AG10059 e AG10131 diferem de AC1097 nas regiões definidas pela maioria dos mutantes usados, exceto Hu_FH92AA e suas espécies com reação cruzada, mas diferente em outras espécies, reatividade cruzada, como CD137 de camundongo, rato e cachorro. Em algumas modalidades, AG10058, AG10059 e AG10131 ou outros anticorpos descritos neste documento não se ligam a um epítopo localizado dentro dos resíduos de aminoácidos 115-156 da SEQ ID NO.: 1. Também mostrado na FIG. 7A e Tabela 5 é que a ligação do ligante de CD137 humano ao CD137 humano versus selvagem mutante combina bem com o padrão de ligação dos anticorpos testados, consistindo na observação de que esses anticorpos bloqueiam a ligação do ligante de CD137 ao receptor deste. TABELA 5 MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS
EXEMPLO 8 ATIVIDADE AGONISTA DE ANTICORPOS NO ENSAIO DO REPÓRTER DE NFKB LUCIFERASE
[221] A atividade agonista dos anticorpos foi avaliada usando o ensaio do repórter de NFKB. As células 293T foram transfectadas com plasmídeo que expressa CD137 humano, macaco ou camundongo juntamente com plasmídeos repórter de NFkB luciferase. Após 4 h, 50 µL de células foram colocadas em cada poço de ensaio de uma placa de 96 poços com densidade de 0,4 x 106/mL. Um volume total de 50 µL de mistura de anticorpos contendo anticorpos de teste e uma razão de 3:1 de anticorpo de reticulação (Fab' de FC de IgG anti-humana de cabra) foi adicionado e incubado durante 18 h. Após a remoção do meio, 50 µL de tampão de lise passiva (Promega E1980) foram adicionados e incubados a 37°C durante 30 minutos. 20 µL de lisado foram transferidos para uma placa branca e os substratos da luciferase foram adicionados. O sinal de luminescência do vagalume e da Renina foi medido e sua relação foi usada para análise dos dados pelo software GraphPad Prism 6.0. Conforme mostrado na Figura 8, em comparação com o anticorpo de controle do isótipo, todos os anticorpos de teste ativam a expressão do gene repórter de NFkB quando o CD137 humano e de macaco é expresso. Quando CD137 de camundongo é expresso, AG10058 e AG10131, mas não AG10059, ativam a expressão do gene repórter de NFkB. Isto é consistente com a observação anterior de que AG10058 e AG10131 se ligam ao CD137 de camundongo, enquanto AG10059 não.
EXEMPLO 9 ATIVIDADE AGONISTA DE ANTICORPOS NO ENSAIO DE ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T
[222] A atividade agonista dos anticorpos foi ainda confirmada no ensaio de ativação das células T. As placas de cultura celular de 96 poços foram revestidas com 50 µL do anticorpo anti-CD3 (2 µg/mL) isoladamente ou juntamente com 50 µL dos anticorpos em teste (60 µg/mL, 20 µg/mL, 6 µg/mL, 2 µg/mL e 0 µg/mL) em 1xPBS a 4°C durante a noite. As células T CD8+ foram isoladas usando protocolos de acordo com as instruções do fabricante. As células foram preparadas na densidade de 1 x107células/mL em meios de RPMI1640 suplementados com 10% de FBS. Plaquearam-se células de 200 µL para cada poço de ensaio e incubaram-se durante 4 dias em uma incubadora a 37°C, CO2 a 5%. As células foram verificadas diariamente sob microscópio quanto à proliferação. Após 96 horas de incubação, 100 µL de sobrenadante foram transferidos para uma nova placa de 96 poços para detecção de IFN-Y. A proliferação de células T foi testada usando o kit Cell Titer Glow (Promega). Conforme mostrado na Figura 9, em comparação com o anticorpo de controle do isótipo, todos os anticorpos testados induziram a proliferação de células T CD8+ e a secreção de IFN-y de maneira dependente da dose.
ExEMPLO 10 ATIVIDADE ANTITUMOR EM MODELOS SINGÊNICOS DE CAMUNDONGOS
[223] A reatividade cruzada da espécie com o CD137 de camundongo permite rápida avaliação funcional in vivo. O AG10058 e o AG10131 foram testados em vários modelos singênicos de camundongo. Camundongos BALB/c (n = 8 por grupo) foram transplantados por via subcutânea com 2x106células cancerígenas do fígado H22 (Xiao et al., Soluble PD-1 facilitates 4-1BBL-triggered antitumor immunity against murine H22 hepatocarcinoma in vivo. Clin Cancer Res. 2007; 13(6):1823-30.), 5x105células cancerígenas do cólon CT26 ou 5x105células cancerígenas da mama EMT6. Quando os tumores foram estabelecidos (> 50 mm3), o tratamento começou com o anticorpo de controle de isótipo, AG10058 ou AG10131 por injeção intraperitoneal, duas vezes por semana, durante até três semanas. O crescimento do tumor foi monitorado duas vezes por semana e relatado como o volume do tumor médio ± s.e.m ao longo do tempo. Conforme mostrado nas Figuras 10-13, em comparação com o anticorpo de controle de isótipo, o AG10058 e o AG10131 exibiram uma potente atividade antitumor in vivo nesses diferentes modelos de tumor singênico de camundongo.
10A. ANTICORPOS AGONISTAS DECD137 EXIBEM EFICÁCIA ANTITUMOR NO MODELO DE CÂNCER DE FÍGADO DE CAMUNDONGO H22
[224] Primeiro, o AG10058 ou AG10131 foi administrado duas vezes por semana durante 3 semanas na dosagem de 50 mg/kg. Ambas as moléculas mostraram quase 100% de TGI (inibição do crescimento do tumor) (Figura 10, painel a). A coloração imuno-histoquímica dos marcadores CD4 e CD8 mostrou que a AG10131 aumentou significativamente a infiltração de células T CD4+ e CD8+ no tumor H22 (Xiao et al., PD-1 solúvel facilita a imunidade antitumor desencadeada por 4-1BBL contra o hepatocarcinoma H22 murino in vivo. Clin Cancer Res. 2007; 13 (6): 1823-30.) Microambiente (Figura 10, painel b). Titulações de doses adicionais de até 3 mg/kg ainda mostraram ~ 100% de TGI, sugerindo que ambas as moléculas têm atividade antitumor potente (Figura 10, painéis c e d). Titulação de dose adicional de AG10131 até 1 e 0,1 mg/kg mostrou TGI superior a 50% a 0,1 mg/kg e 1 mg/kg (Figura 10, painel e).
10B. ANTICORPOS AGONISTAS DE CD137 EXIBEM EFICÁCIA ANTITUMOR NO MODELO DE CÂNCER DE FÍGADO DE CAMUNDONGO CT26
[225] Conforme mostrado na Figura 10, o AG10058 e o AG10131 mostraram quase 100% de TGI (inibição do crescimento do tumor) na dose de 50 mg/kg (Figura 11, painel a) no modelo de câncer de cólon de camundongo CT26 (Martinez-Forero et al., T cell costimulation with anti-CD137 monoclonal antibodies is mediated by K63-polyubiquitin-dependent signals from endosomes. J Immunol. 2013; 190 (12): 6694-706). Titulação de dose adicional de AG10131 (Figura 11, painel b) mostrou quase 100% de TGI em doses de 5 mg/kg e 1 mg/kg. Na dosagem de 0,1 mg/kg, foi alcançado aproximadamente 40% de TGI, indicando uma atividade antitumor dependente da dose.
10C. MODELO DE CÂNCER DE MAMA EMT6
[226] A atividade antitumor é adicionalmente avaliada no modelo singênico de câncer de mama EMT6 de camundongo (Shi e Siemann, efeitos antitumorais aumentados da terapia de radiação pelo tratamento com anticorpo 4-1BB (BMS-469492). Anticancer Res. 2006; 26: 3445-53) (Figura 12). Tanto o AG10058 como o AG10131 exibiram quase ~ 100% de inibição do crescimento do tumor.
10D. CAMUNDONGOS COM RESPOSTA COMPLETA AO TRATAMENTO COM ANTICORPO AGONISTA CD137 MANTÊM O TUMOR LIVRE APÓS SEREM NOVAMENTE DESAFIADOS COM NOVAS CÉLULAS TUMORAIS
[227] Após tratamento com AG10058 ou AG10131 durante 3 semanas no modelo de tumor CT26, os camundongos com regressão completa do tumor foram mantidos sem tratamento durante mais um mês. Os camundongos que mantiveram a resposta completa foram novamente reexpostos no Dia 62 por via subcutânea com 5x105células tumorais CT26 no flanco oposto e monitorado para crescimento do tumor. O grupo de controle de reexposição foi estabelecido ao mesmo tempo com camundongos não expostos com o mesmo número de células tumorais CT26. Conforme mostrado nas Figuras 13, o tratamento com AG10131 (a 1 e 5 mg/kg, ver Figura 13, painel superior e inferior, respectivamente) exibiu atividade antitumor potente no modelo de tumor CT26, 5/8 no AG10131 (grupo 1 mg/kg), 6/8 no AG10131 (grupo 5 mg/kg) mostrando resposta completa ao longo de 60 dias antes de ser novamente desafiado com células tumorais CT26 novamente. Além disso, esses camundongos permaneceram livres de tumor após reexposição com as mesmas células tumorais, sugerindo que foi desenvolvida memória antitumor específica nesses camundongos.
[228] Para provar esta hipótese, os esplenócitos foram coletados desses camundongos re-expostos e rejeitados pelo tumor e cocultivados com as células tumorais CT26 presas à mitomicina C in vitro durante 7 dias para amplificar as células T de memória específica do tumor. Estes esplenócitos foram então recuperados e misturados com células tumorais CT26 vivas marcadas com fluorescência em razões de E/T diferentes durante 4 h e a morte de células tumorais foi detectada pela coloração viva/morta e análise de FACS. Conforme mostrado na Figura 14, foi observada uma morte de células tumorais significativamente aumentada com esplenócitos de camundongos reexpostos com rejeição de tumor com tratamento prévio de AG10058 e AG10131.
EXEMPLO 11 AG10131-IGG4 NÃO INDUZ EFEITO ADCC
[229] As células T CD8+humanas foram isoladas do sangue periférico de um doador saudável com o kit de enriquecimento de células T CD8+ Human EasySep (StemCell Technologies) e depois estimuladas com PMA (50ng/ml) + Ionomicina (1uM) durante 18 horas in vitro. Essas células T CD8+ ativadas foram então marcadas com Calcein-AM e serviram como células alvo. As células NK de diferentes doadores saudáveis foram isoladas com o kit de isolamento NK humano (StemCell Technologies) e serviram como células efetoras. Para o ensaio de citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC), células efetoras (NK) e alvo (T CD8+ativada) foram misturadas na razão de 5:1 em uma placa de 96 poços na ausência e presença de anticorpos diluídos em série durante 4 horas em condição de cultura. O sobrenadante de cada poço foi então coletado e o sinal de fluorescência foi detectado pelo leitor de placas SpectraMax i3x (Ex. 488 nm, a 520 nm). Um isótipo hIgG4 mAb foi usado como controle negativo, enquanto o OKT3 humanizado (um anti-CD3 hIgG1 da Novoproteína) foi usado como controle positivo. A % de lise foi então calculada usando a seguinte fórmula: % de Lise = [(Liberação Experimental) - Ave (Alvo + NK)]/ [Ave (Alvo Max) - Ave (apenas Alvo)] x 100% (FIG. 15).
EXEMPLO12 PERFIL DE DESENVOLVIMENTO DE ANTICORPOS
[230] Para avaliação da capacidade de desenvolvimento, os AG10058, AG10059, AG10131 e AC1097 purificados foram trocados em tampão PB (PB 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0). Todas os experimentos, incluindo filtração, concentração, testes de estresse acelerado, foram realizadas em tampão PB. Para todas as análises SEC-HPLC, foram usadas as colunas TSKgel (Tosoh Bioscience G3000SWxl).
12A. SOLUBILIDADE
[231] Todos os três anticorpos podem ser concentrados acima de 100 mg/ml em tampão PB sem precipitação óbvia (Tabela 6). Os anticorpos foram então ajustados para 20 mg/ml em tampão PB. As amostras (10 µg cada) foram então analisadas através de SEC-HPLC para detecção de agregado de alto peso molecular (HMW). Conforme mostrado nos cromatogramas (Figura 16), não foi observado aumento do agregado de HMW em alta concentração (20 mg/ml) para todos os anticorpos de teste. TABELA 6 SOLUBILIDADE DOS ANTICORPOS
12B. ESTABILIDADE DE ANTICORPOS EM CONDIÇÕES DE ESTRESSE ACELERADO
[232] As estabilidades de anticorpos também foram examinadas sob condições de estresse acelerado, resultado resumido na Tabela 7. Todos os anticorpos permanecem estáveis após seis ciclos de congelamento (-80°C) e degelo (temperatura ambiente) (Figura 17). Após sete dias a 50°C, houve pouca alteração no agregado HMW ou nos fragmentos LMW (Figura 17). Em experimentos de longo prazo (40°C por até 28 dias), todos os anticorpos permanecem estáveis e não houve aumento significativo do agregado de HMW ou dos fragmentos de LMW (Figura 17).
[233] Tabela 7 Alterações do HMW em condições aceleradas
[234] Além disso, a termoestabilidade, medida pela calorimetria diferencial de varredura (DSC), mostra que o AG10131 e o AG10058 são estáveis até pelo menos cerca de 59°C. O ponto médio da transição, Tm (a temperatura característica na qual ocorre a transição de desdobramento para quase todos os domínios de proteínas) é mostrado na Figura 18 e na Tabela 8 abaixo. TABELA 8 TERMOESTABILIDADE PELO DSC
[235] ALÉM DISSO, A MAIOR CONCENTRAÇÃO POSSÍVEL DE AG10131 E AG10058 após a centrifugação foi superior a 180 mg/mL e superior a 220 mg/mL, respectivamente.
EXEMPLO 13 PERFIL DE SEGURANÇA EM ESPÉCIES RELEVANTES: CAMUNDONGO E MACACO CINOMOLGO 13A. ESTUDOS REPETIDOS DE TOXICIDADE DE DOSE DEAG10131 EM CAMUNDONGOS C57BL/6 NORMAIS.
[236] A toxicidade de dose repetida de AG10131 foi conduzida em camundongos C57BL/6 normais. O veículo (10 mL/kg), AG10131 (100 mg/kg), foi administrado i.p. no Dia 1, Dia 4, Dia 8 e Dia 11. Cinco camundongos fêmeas (7-8 semanas de idade) foram incluídos em cada grupo. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto a comportamentos e sintomas anormais e medidos diariamente quanto à ingestão de alimentos e peso corporal. No dia 14, os animais foram sacrificados para exame post mortem e outras análises. O sangue foi coletado de cada animal, com 2 amostras de sangue por grupo usado para hematologia (hemácias, plaquetas, leucócitos, diferencial de leucócitos) e as outras 3 amostras de sangue no grupo para bioquímica sanguínea (AL, AST, ALB, GLB, A/G, TBIL, ALP, GGT e LDH). Os seguintes órgãos de cada camundongo foram coletados e preservados no FFPE: coração, pulmão, timo, fígado, baço e rins. Os blocos de FFPE para tecidos hepáticos foram preparados, seccionados e corados com H&E para análise histopatológica.
[237] Durante o período de vida de todo o estudo, não houve comportamento anormal observado ou morte animal não programada. Comparado ao tratamento com veículo, o AG10131 não afetou a ingestão de alimentos e o peso corporal. O exame post mortem também não mostrou lesões óbvias em camundongos dos grupos de tratamento com ambos AG10131. A análise hematológica não mostrou alterações significativas, de acordo com os parâmetros bioquímicos do sangue testados em camundongos tratados com AG10131 (Figura 19). Não foram encontradas anormalidades óbvias nas seções histopatológicas do fígado de todos esses camundongos (Figura 20). Em geral, o AG10131 foi bem tolerado neste estudo e nenhuma toxicidade significativa foi observada em camundongos.
13B. ESTUDOS DE DOSAGEM REPETIDA DEAG10131 EM MACACOS CINOMOLGOS
[238] Foi realizado um estudo de dosagem repetida de AG10131 em macacos cinomolgos normais. O controle do isótipo de IgG4 humana (10 mg/kg), AG10131 (0,5 e 10 mg/kg) foi administrado iv (1 mL/kg) no Dia 0, Dia 7, Dia 14 e Dia 22. Um macho e uma fêmea macacos cinomolgo (3 a 5 anos) foram incluídos em cada grupo. Os animais foram monitorados diariamente quanto a comportamentos anormais e sinais clínicos e medidos diariamente quanto à ingestão de alimentos. O peso corporal foi medido no Dia (-15), Dia (-5) pré-dose e no Dia 6, Dia 13, Dia 18 e Dia 26 pós-dose. Os parâmetros hematológicos e de química do sangue foram medidos no Dia (-12), Dia (-5) pré-dose e Dia 7, Dia 14, Dia 19 e Dia 27 (grupo de 10 mg/kg apenas), a análise da urina foi conduzida no Dia (-12), Dia (-5) pré-dose e Dia 6, Dia 13, Dia 18 pós-dose. Os animais dos grupos de 10 mg/kg foram sacrificados para exame post mortem e outras análises no Dia 27. Os principais órgãos foram dissecados e pesados. Os blocos de tecido hepático de FFPE foram preparados, seccionados e corados com H&E para análise histopatológica.
[239] Durante o período de vida de todo o estudo, não houve comportamento anormal observado ou morte animal não programada em todos os grupos. Comparado ao tratamento com veículo, o tratamento de AG10131 a 10 mg/kg não afetou a ingestão de alimentos e o peso corporal. Não foram observados sinais clínicos, incluindo reações no local da injeção. Os exames post mortem não mostraram lesões óbvias e anormalidades de peso em todos os órgãos examinados em macacos cinomolgos tratados com AG10131 a 10 mg/kg. Os parâmetros de hematologia, química do sangue e urina também estão dentro dos limites normais em todos os grupos de tratamento (Figura 21). A análise histopatológica do fígado não mostrou nenhuma anormalidade óbvia, incluindo infiltração de linfócitos após dosagem repetida de AG10131 a 10 mg/kg (Figura 22). No geral, o AG10131 foi bem tolerado em doses semanais de até 10 mg/kg em macacos cinomolgos e nenhuma toxicidade óbvia foi detectada.
EXEMPLO 14 FARMACOCINÉTICA DEAG10131 EM MACACOS CINOMOLGOS 14A. FARMACOCINÉTICA DEAG10131 EM MACACOS CINOMOLGOS
[240] Foi conduzido um estudo farmacocinético de AG10131 em macacos cinomolgos não expostos. Três níveis de dose de AG10131 (10 mg/kg, 30 mg/kg e 100 mg/kg) foram administrados em bolus intravenoso em três grupos de macacos. Cada grupo contém 3 machos e 3 fêmeas. As amostras séricas foram coletadas pré-dose, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 240, 336, 408, 504, 672 e 840 horas pós-dosagem. As concentrações séricas de AG10131 foram determinadas por ELISA.
[241] A AG10131 foi rapidamente eliminada no dia 14 (336 horas) em 12 dos 16 animais, ou seja, todos os animais dos grupos de dose baixa e média e 2 de 6 animais do grupo de alta dose. No dia 21, mais 2 animais do grupo de doses altas mostraram uma rápida depuração. As concentrações séricas nesses 14 animais são baixas ou abaixo do limite da quantificação. Isso é consistente com a observação da geração de anticorpos antidrogas nesses animais. Os dados dos dois animais com farmacocinética potencialmente não afetada do grupo de altas doses foram ajustados para prever os parâmetros farmacocinéticos (Figura 23). A meia-vida de AG10131 varia de 7,3 a 8,8 dias.
14B. FARMACOCINÉTICA DEAG10131 EM RATOS
[242] Um estudo farmacocinético de AG10131 foi realizado em ratos SD não expostos. Três níveis de dose de AG10131 (10 mg/kg, 30 mg/kg e 100 mg/kg) foram administrados em bolus intravenoso em três grupos de animais. Cada grupo contém 15 machos e 15 fêmeas. As amostras séricas foram coletadas a partir de 3 animais a cada ponto temporal, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 240, 336, 408, 504, 672 e 840 horas pós- dosagem. As concentrações séricas de AG10131 foram determinadas por ELISA e os dados foram analisados por Phoenix Professional V6.3.
[243] Resultados: Os parâmetros PK das doses baixa, média e alta são semelhantes (Figura 24). A taxa de depuração do AG10131 é de cerca de 0,004 ml/kg/min. A meia-vida do AG10131 varia dentre 11,5 a 14,6 dias.
14C. FARMACOCINÉTICA DE AG10131 EM CAMUNDONGOS
[244] Foi realizado um estudo farmacocinético de AG10131 em camundongos BALB/c com cerca de 8 semanas de idade. 3 camundongos BALB/c fêmeas por grupo de dosagem foram injetados por via intravenosa dos anticorpos de teste, incluindo AG10131 a 1 mg/kg através da veia da cauda. Amostras de sangue (~ 100 ul por amostra) foram coletadas às 1h, 8, 48, 168 e 336 horas após a dosagem. O sangue de controle em branco foi coletado de 3 camundongos fêmeas não expostos sem administração de anticorpos. As concentrações séricas de cada anticorpo de teste, incluindo AG10131, foram determinadas por ELISA, no qual o anticorpo IgG anti-humano (específico para Fc) foi usado para captura e o anticorpo IgG anti-humano marcado com HRP (específico para Fab) para detecção.
[245] Todos os anticorpos de teste, incluindo o controle de isótipo (AG10154), dois anticorpos de referência (AC1020 e AC1021) e três anticorpos Adagene (AG10131, AG10058 e AG10059) exibem farmacocinética comparável em camundongos (Figura 25).
EXEMPLO 15 MAPEAMENTO DE EPÍTOPO ADICIONAL
[246] Para determinar o epítopo de ligação dos anticorpos mostrados neste documento por Adagene e outros anticorpos de referência, adotamos uma abordagem sistemática para dissecar os epítopos por três níveis de resolução: domínio, motivo e resíduos. Foi usado o domínio extracelular de CD137 contendo 4 motivos de CRD e CD137 de 4 espécies diferentes, como CD137 de humano, macaco, camundongo e rato (Tabela 9). Uma série de motivos de CD137 CRD humanos (domínio rico em cisteína) e construtos destes contendo uma, duas e três unidades de motivos de CRD humanos (Tabela 9) foram exibidos. Um número baixo de cópias, vetor baseado em CEN/ARS, foi usado para expressar os CD137 humanas CRDs sob o controle do promotor induzível GAL1-10 na levedura S. cerevisiae (Boder e Wittrup (1997) Nat Biotechnol 15(6): 553-7). A ligação de anticorpos a CRDs de CD137 humanos foi avaliada por análise de citometria de fluxo e outras tecnologias, conforme descrito anteriormente no Exemplo 5 e mostrado na FIG. 27.
[247] Os resultados estão resumidos na Tabela 9, esses anticorpos só se ligam seletivamente ao alvo de CD137, mas nenhum dos alvos não CD137 listados na tabela; no entanto, sua reatividade cruzada específica da espécie por esses anticorpos com CD137 de espécies humanas, macacos, camundongos e ratos é impressionante, destacando a fina cobertura do epítopo por diversos hits triados dentro de Bibliotecas de Precisão Dinâmica da Adagene. Por exemplo, AG10131 se liga ao CD137 humano, de macaco, camundongo, rato e cachorro (não mostrado); AG10058 liga CD137 humano, de macaco, camundongo, mas não CD137 de rato; enquanto AG10059 liga CD137 humano e macaco. Em contraste, o anticorpo de referência AC1121 de camundongo transgênico se liga apenas ao CD137 humano; enquanto outro anticorpo de referência da biblioteca de fagos de morfose se liga ao CD137 humano e de macaco. Para comparação, deve-se notar que o ligante humano CD137L interage apenas com o receptor de CD137 humano, não o CD137 de camundongo, e o CD137L de camundongo interage apenas com o CD137 de camundongo e não com o CD137 humano (ver a tabela 9). TABELA 9
[248] PARA DISSECAR ADICIONALMENTE OS MOTIVOS DE LIGAÇÃO DESSES anticorpos ao alvo CD137 humano, como resumido na Tabela 9, os sítios de ligação diferenciados por Adagene, outros anticorpos de referência, em comparação com a ligação do ligante de CD137 aos motivos de CRD de CD137 dissecados e combinação destes são bem separados. E observados que: os anticorpos AG10058, AG10059 e AG10131 e o ligante de CD137 humano não se liga à CRD única ou a duas unidades de CRD (CRD2-CRD3) de CD137 humano. Os anticorpos AG10058, AG10059 e AG10131, semelhantes ao ligante de CD137 humano, podem se ligar a três unidades de CRD (CRD1-CRD2-CRD3) de CD137 humano. Embora o anticorpo de referência AC1121 também possa se ligar a três unidades de CRD (CRD1-CRD2-CRD3) de CD137 humano, entretanto, são as duas unidades de CRD específicas (CRD1-CRD2) de CD137 humano. Em comparação, as três unidades de CRD (CRD1-CRD2-CRD3) de CD137 humano são necessárias para a ligação pelos anticorpos AG10058, AG10059, AG10131 e o ligante de CD137 humano. O anticorpo de referência AC1097 pode ligar duas unidades de CRD (CRD3-CRD4), incluindo três unidades de CRD (CRD2-CRD3-CRD4) de CD137 humano. Elas indicam que os anticorpos AG10058, AG10059, AG10131 da Adagene se ligam aos epítopos cobertos por três unidades de CRD (CRD1-CRD2-CRD3) de CD137 humano, semelhante a um ligante de CD137 humano, mas eles são muito diferentes do anticorpo AC1121 de referência que se liga a duas unidades de CRD (CRD1 - CRD2) de CD137 humano e do anticorpo AC1097 de referência que se liga a duas unidades de CRD (CRD3-CRD4) de CD137 humano. Em conclusão, o epítopo de ligação de CD137 pelos anticorpos da Adagene é diferente do epítopo pelos dois anticorpos de referência (AC1121 com CRD1-CRD2; e AC1097 com CRD3-CRD4), conforme mostrado pela distinção em termos das CRDs específicas usadas e seu número de unidades de CRD necessárias (ver Tabela 9B) por epítopos de CD137 altamente semelhantes, se não sobrepostos, pelo ligante de CD137L humano; o epítopo entre CD137- CD137L é confirmado pelo complexo de estrutura cristalina relatado recentemente, conforme é mostrado na FIG. 26 (Gilbreth, R.N., Oganesyan, V.Y., Amdouni, H., Novarra, S., Grinberg, L., Barnes, A., Baca, M. (2018) J. Biol. Chem. 293: 9880-9891). TABELA 9B.
[249] PARA DETERMINAR O EPÍTOPO DE LIGAÇÃO DA ADAGENE E OS anticorpos de referência no nível do resíduo de aminoácidos, uma série de mutações (Tabela 5) foi feita no domínio extracelular de CD137 humano. Estes plasmídeos de mutação CD137 foram utilizados para transfectar células HEK293F. A ligação de anticorpos aos mutantes de CD137 humanos foi avaliada por análise por citometria de fluxo, como descrito anteriormente no Exemplo 5 e mostrado na Figura 7A. Os resultados estão resumidos na Tabela 5, juntamente com a reatividade cruzada desses anticorpos com CD137 humano, macaco, camundongo e rato em uma diferenciação interessante, indicando os epítopos finos dos hits derivados das bibliotecas Adagene. O AG10131 se liga ao CD137 humano, de macaco, de camundongo e de rato, enquanto o AG10058 se liga ao CD137 humano, de macaco e de camundongo, mas não ao CD137 de rato. O epítopo de ligação de CD137 por AG10058, AG10059 e AG10131 foi mapeado nas unidades CRD1-CRD2-CRD3 de CD137, eles perderam sua capacidade de ligação às mutações GFT34AAA, FSS53AAA e FH92AA, indicando que seus epítopos de ligação estão dentro dessas regiões, por exemplo, resíduos de aminoácidos 34-93 ou 34-108 da SEQ ID NO.: 1 (ver também, figura 7B). AG10058 e AG10131 podem ligar o mesmo epítopo ou altamente semelhante, enquanto AG10059 pode ligar diferentes epítopos de AG10058 e AG10131. Os mutantes isolados como T35A, F36A, F53A, R66A, F72A, N83A e F92A mostram que a perda de ligação pelos anticorpos AG10058, AG10059 e AG10131 da Adagene com CD137 humano, juntamente com a ligação por CD137L, exceto R66A, que ainda mantém a ligação de CD137 pelo seu ligante. Os mutantes únicos, P32A e P49A, no entanto, que a ligação entre CDL137L e CD137 é perdida, mas seu impacto na interação entre anticorpo e CD137 é variado. O F125A mostra que o AC1097 não se liga mais ao CD137, mas sem efeitos na ligação de outros anticorpos, incluindo o CD137L humano. Em conclusão, o padrão geral de ligação por mutantes através de CD137 transmite uma mensagem clara de que os anticorpos da Adagene e anticorpos de referência respectivos são diferenciados em termos de seus sítios de ligação. Os construtos mutantes pretendiam diferenciar os epítopos por AG10058, AG10059 e AG10131 dos anticorpos de referência por AC1121 e AC1097. Os três anticorpos AG10058, AG10059 e AG10131 têm como alvo epítopos muito diferentes de AC1121 e AC1097. AG10058, AG10059 e AG10131 diferem de AC1121 nas regiões definidas pelos mutantes Hu_FH92AA e Hu_FSS53AAA e possivelmente Hu_GTF34AAA, enquanto AG10058, AG10059 e AG10131 diferem de AC1097 nas regiões definidas pela maioria dos mutantes usados, exceto Hu_FH92AA e suas espécies com reação cruzada, mas diferente em outras espécies, reatividade cruzada, como CD137 de rato, camundongo e cachorro. Em algumas modalidades, AG10058, AG10059 e AG10131 ou outros anticorpos descritos neste documento não se ligam a um epítopo localizado dentro dos resíduos de aminoácidos 115-156 da SEQ ID NO.: 1. Também mostrado na FIG. 7A e Tabela 5 é que a ligação do ligante de CD137 humano ao CD137 humano versus selvagem mutante combina bem com o padrão de ligação dos anticorpos testados, consistindo na observação de que esses anticorpos bloqueiam a ligação do ligante de CD137 ao receptor deste.
EXEMPLO 16 A SINALIZAÇÃO DE CD137L NATIVA É BLOQUEADA PELO AG10131
[250] Um ensaio de ligação in vitro por ELISA demonstrou que o AG10131 pode bloquear o CD137 recombinante e sua interação com o ligante. Para validar de modo funcional adicionalmente essa atividade de bloqueio de ligante de AG10131, foi realizado um ensaio repórter celular de luciferase de NFKB. Resumidamente, as células 293T que expressam de forma estável um repórter de luciferase de NFKB foram transfectadas com um construto de DNA que expressa CD137 humano, e as células foram cocultivadas com as células de linfoma de células B humanas Daudi ou Raji em diferentes razões. A mistura celular foi incubada com diluições em série de controle de isótipo ou anticorpos anti-CD137 bloqueadores de ligantes durante a noite, e a atividade da luciferase foi medida usando o kit de ensaio Promega luciferase de acordo com as instruções do fabricante. As unidades de luciferase relativa (RLUs) foram calculadas versus os níveis de luciferase expressos em células 293T na ausência de tratamento com anticorpos.
[251] Conforme mostrado na FIG. 28, as células Daudi (linha superior) e Raji (linha inferior) expressaram o ligante de CD137 funcional para ativar o repórter de luciferase NFKB em células 293T. Em comparação com o anticorpo de controle de isótipo (coluna da esquerda), a adição de AG10131 ao sistema de cocultura (coluna da direita) inibiu significativamente a sinalização de NFkB estimulada por ambos os tipos de células, sugerindo que o anticorpo AG10131 pode bloquear de modo funcional a sinalização de CD137 estimulada pelo ligante de CD137 expresso em células de linfoma Daudi e Raji B.
EXEMPLO 17 RETICULAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD137 EM UM ENSAIO REPÓRTER DE NFKB
[252] Usar o ensaio funcional de repórter celular de NFkB, foram testados três anticorposanti-CD137 (AG10131, AC1121 e AC1097). Conforme mostrado na FIG. 29, quando reticulados, todos os três anticorpos anti-CD137 foram capazes de estimular a sinalização do receptor de CD137 humano de uma maneira dependente da dose em níveis comparáveis. As EC50s da resposta de ativação de sinalização de NFkB induzida por anticorpo estavam em um intervalo semelhante para todos os três anticorpos anti-CD137. No entanto, o AC1121 exibiu uma propriedade exclusiva diferente de AG10131 e AC1097. O AC1121 foi capaz de ativar significativamente a sinalização do receptor de CD137 humano na ausência de reticulação, enquanto o AG10131 e o AC1097 foram incapazes de fazê-lo. Verificou-se que a EC50 de AC1121 com ou sem reticulação na estimulação da sinalização do receptor de CD137 estava em níveis semelhantes.
EXEMPLO 18 AG10131 NÃO INDUZCDC
[253] A atividade de CDC de AG10131foi determinada pela ligação direta de AG10131 ao componente purificado C1q do complemento humano com ELISA. Conforme mostrado na FIG. 30, AG10131 e seu anticorpo de controle de isótipo IgG4 humano não tem a capacidade de se ligar ao componente C1q do complemento humano na faixa de concentração testada, enquanto um anticorpo de controle de isótipo de IgG1 humano é capaz de se ligar a C1q. Este resultado sugere que também é improvável que AG10131 induza citotoxicidade dependente do complemento, consistente com sua framework de isótipo IgG4.
EXEMPLO 19 O ANTICORPO ANTI-CD137 AG10131 POTENCIALIZA OS LINFÓCITOS T QUE SE INFILTRAM NO TUMOR
[254] Os estudos de eficácia antitumor in vivo nos modelos de câncer de fígado singeneico H22 de camundongo, câncer de mama EMT6 e câncer de cólon CT26 mostrados no Exemplo 10 demonstraram que o tratamento com AG10131 inibe fortemente o crescimento do tumor. O AG10131 é um anticorpo agonista que ativa as células T e, portanto, espera-se que o tratamento com AG10131 estimule células T infiltradas no tumor no microambiente do tumor, mediando assim um efeito antitumor in vivo. Para avaliar o efeito do tratamento com AG10131 nos linfócitos de infiltração no tumor, os tumores do estudo de eficácia antitumor in vivo de AG10131 nos modelos de câncer de camundongo H22, EMT6 e CT26 foram coletados no final dos estudos.
[255] A FIG. 31 mostra imagens representativas da coloração IHC de células T CD4+ e CD8+ de camundongos em tumores H22 (canto superior esquerdo), tumores EMT6 (canto superior direito) e tumores CT26 (centro inferior). Conforme mostrado na FIG. 32, poucos linfócitos T (células T CD4+ ou CD8+) estavam presentes nos tumores H22, EMT6 e CT26 tratados com controle de veículo, enquanto o tratamento com AG10131 estimulou significativamente a infiltração de células T CD4+ e CD8+ (indicadas por setas pretas na FIG. 31) nos tumores. Esses dados são consistentes com a função do AG10131 como um agonista imune, estimulando a proliferação, ativação e infiltração de células T no microambiente do tumor para mediar um efeito antitumor.
EXEMPLO 20 EFICÁCIA ANTITUMOR APRIMORADA COMBINANDO O ANTICORPO ANTI-CD1 37 AG10131 E O ANTICORPO ANTI-PD1 NO MODELO DE CÂNCER DE CÓLON CT26
[256] O efeito de combinar o anticorpo anti-CD137 AG10131 com um anticorpo anti-PD1 foi testado em seguida no modelo de câncer de cólon CT26. Cada camundongo BALB/c fêmea foi inoculado subcutaneamente na região do flanco inferior direito com células tumorais CT26 (3x105) para o desenvolvimento do tumor. Quando o volume médio do tumor atingiu 98 mm3, 10 camundongos foram atribuídos para cada grupo experimental. Esses grupos receberam veículo (PBS), AG10131 em 5 ou 10 mg/kg, anti-PD-1 em 10 mg/kg ou uma combinação de 5 ou 10 mg/kg de AG10131 e 10 mg/kg de mAb anti-PD- 1 por injeção ip duas vezes por semana durante 3 semanas. Os volumes tumorais foram medidos e cada camundongo foi sacrificado quando seu tumor atingiu o volume final de 2000 mm3, ou no dia final (dia 42), o que ocorrer primeiro.
[257] Conforme mostrado na FIG. 33, tanto o AG10131 (5 mg/kg ou 20 mg/kg) quanto o anti-PD1 (10 mg/kg) atrasaram a progressão do tumor, embora o AG10131 tenha atrasado a progressão do tumor por mais alguns dias e, em casos raros, resultou em encolhimento do tumor. No entanto, quase todos os camundongos tratados com AG10131 ou anti-PD1 eventualmente morreram de progressão do tumor. É importante ressaltar que, quando o AG10131 (5 mg/kg ou 20 mg/kg) foi administrado em combinação com anti-PD1 (10 mg/kg), a maioria dos camundongos foi essencialmente curada do tumor, com apenas 2 (em 10) ou 1 (em 10) escapou da supressão do tumor nas combinações de AG10131 (5 mg/kg) com anti-PD1 (10 mg/kg) ou AG10131 (20 mg/kg) com anti- PD1 (10 mg/kg), respectivamente. Estes resultados demonstraram o forte efeito sinérgico de AG10131 e anti-PD1, sugerindo que a combinação de AG10131 com anti-PD1 poderia ser eficaz em tumores de resistência anti-PD1.

Claims (20)

1. ANTICORPO isolado, que se liga a um domínio extracelular de CD137 humano, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que: (i) a região variável de cadeia pesada compreende uma HVR- H1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 731, uma HVR-H2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 755, e uma HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 779; (ii) a região variável de cadeia leve compreende uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 803, uma HVR- L2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 827, e uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 851.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser reativo cruzado com um polipeptídeo CD137 de pelo menos uma espécie não humana selecionada dentre o grupo que consiste em macaco cinomolgo, camundongo, rato e cachorro; opcionalmente em que o anticorpo se liga ao CD137 de macaco cinomolgo.
3. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela região variável de cadeia pesada compreender uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, e a região variável de cadeia leve compreender uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72.
4. ANTICORPO ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, e em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 657, e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 658.
5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se ligar ao CD137 humano com um kD de 100 nM ou menos, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície, opcionalmente em que o anticorpo se liga a CD137 humano com um kD de 50 nM ou menos.
6. ANTICORPO ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por: (i) uma atividade do CD137 humano expressa em uma célula humana ser diminuída quando contatada com o anticorpo; (ii) o anticorpo ter uma meia concentração inibitória máxima (IC50) de 100 nM ou menos para bloquear a ligação de CD137 humano a CD137L humano in vitro; (iii) o anticorpo bloquear completamente a ligação do CD137 humano ao CD137L humano in vitro quando o anticorpo é fornecido a uma concentração de 1 µM ou superior; (iv) o anticorpo bloquear um ou mais aspectos de sinalização de CD137 estimulada por CD137L em uma célula que expressa CD137; (v) uma atividade do CD137 humano expressa em uma célula humana ser aumentada quando contatada com o anticorpo; e /ou (vi) o contato de uma célula humana que expressa CD137 com o anticorpo resultar em aumento da transcrição dependente de NF-KB.
7. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo anticorpo compreender: (i) uma região Fc de IgG2 humana; ou (ii) uma região Fc de IgG4 humana, opcionalmente em que a região Fc de IgG4 humana compreende uma mutação S241P, em que a numeração é de acordo com Kabat.
8. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por codificar o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 191 e 192.
10. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 9, opcionalmente em que o vetor é um vetor de expressão.
11. CÉLULA HOSPEDEIRA procariótica, caracterizada por compreender o vetor, conforme na reivindicação 10.
12. CÉLULA HOSPEDEIRA de levedura, caracterizada por compreender o vetor, conforme na reivindicação 10.
13. MÉTODO PARA FABRICAR UM ANTICORPO, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira que compreende o vetor, conforme definido na reivindicação 10, em condições adequadas para a produção do anticorpo, opcionalmente em que o método compreende adicionalmente a recuperação do anticorpo produzido pela célula.
14. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar câncer em um sujeito em necessidade deste.
16. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo medicamento ser para uso em combinação com pelo menos um agente terapêutico adicional, em que: (i) o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em terapia genética viral, inibidores do ponto de verificação imune, terapias alvo, terapias de radiação e quimioterapias; e/ou (ii) o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em pomalyst, revlimid, lenalidomida, pomalidomida, talidomida, um derivado alquilador de DNA contendo platina, cisplatina, 5- fluorouracil, ciclofosfamida, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CD20, um anticorpo anti-CD40, um anticorpo anti-DR5, um anticorpo anti-CD1d, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-SLAMF7, um anticorpo anti-receptor KIR, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti-HER2, um anticorpo anti-ErbB-2, um anticorpo anti-EGFR, cetuximabe, rituximabe, trastuzumabe, pembrolizumabe, radioterapia, radiação de dose única, radiação fracionada, radiação focal, radiação de órgão inteiro, IL- 12, IFNa, GM-CSF, um receptor de antígeno quimérico, células T adotivamente transferidas, uma vacina anticâncer e um vírus oncolítico.
17. COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um agente terapêutico adicional.
18. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e de um agente terapêutico adicional, caracterizado por ser para fabricar uma combinação farmacêutica para tratar câncer.
19. USO DE UMA COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, compreendendo um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um agente terapêutico adicional, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar câncer.
20. USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida na reivindicação 14, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar câncer.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20200757A1 (es) 2017-07-11 2020-07-27 Compass Therapeutics Llc Anticuerpos agonistas que se unen a cd137 humano y sus usos
WO2019032628A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 The Regents Of The University Of California GENERATING PLATFORM FOR SAFE CELLULAR THERAPEUTIC AGENTS
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
SG11202008261WA (en) 2018-03-08 2020-09-29 Rubius Therapeutics Inc Therapeutic cell systems and methods for treating cancer and infectious diseases
EP3894422A4 (en) * 2018-11-27 2022-08-24 Khona Scientific Holdings, Inc. BI-DIRECTIONAL MULTIENZYME SCAFFOLDS FOR CANNABINOID BIOSYNTHESIS
CA3137373A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Heidelberg Pharma Research Gmbh Amatoxin antibody-drug conjugates and uses thereof
CA3139968A1 (en) * 2019-06-05 2020-12-10 Peter Peizhi Luo Anti-cd137l antibodies and methods of using same
CN114269788A (zh) * 2019-11-13 2022-04-01 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 一种能够与人4-1bb结合的分子及其应用
CN112898426A (zh) * 2019-11-19 2021-06-04 非同（成都）生物科技有限公司 人源化4-1bb单克隆抗体及其药物组合物
TW202144395A (zh) * 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
EP4149547A1 (en) * 2020-05-13 2023-03-22 Adagene AG Compositions and methods for treating cancer
WO2021226883A1 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer submission of sequence listing on ascii text file
EP4168048A1 (en) * 2020-06-23 2023-04-26 Adagene Pte. Ltd. Combination therapy comprising anti-cd137 antibodies
WO2022036495A1 (en) 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
WO2022218264A1 (en) * 2021-04-11 2022-10-20 Adagene Inc. Combination therapies for treating cancer
WO2023061421A1 (en) * 2021-10-12 2023-04-20 Concept To Medicine Biotech Co., Ltd. Single-domain 4-1bb antibodies
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
AU665221B2 (en) 1991-12-02 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
US7138500B1 (en) 1993-05-07 2006-11-21 Immunex Corporation Antibodies to human 4-1BB
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
ATE226641T1 (de) * 1995-04-08 2002-11-15 Lg Chemical Ltd Humaner 4-1bb spezifischer humaner antikörper und diesen produzierende zellinie
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
AU6703198A (en) 1997-03-21 1998-10-20 Brigham And Women's Hospital Immunotherapeutic ctla-4 binding peptides
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
KR20000034847A (ko) * 1998-11-17 2000-06-26 성재갑 인간 4-1비비 분자에 대한 인간화 항체 및 이를 포함하는 약학조성물
ES2340745T3 (es) 1998-12-23 2010-06-08 Pfizer Inc. Anticuerpos monoclonales humanos contra ctla-4.
US20030118588A1 (en) 1999-05-22 2003-06-26 Linda Diehl Induction of anti-tumor CTL immunity through in vivo triggering of 4-1BB and/or CD40
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
WO2001025454A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP4200627B2 (ja) 2000-03-01 2008-12-24 味の素株式会社 変異型チロシンリプレッサー遺伝子とその利用
HUP0302525A2 (hu) 2001-01-05 2003-10-28 Abgenix, Inc. Az inzulinszerű növekedési faktor I receptor elleni ellenanyagok
BR0116575A (pt) 2001-01-09 2004-01-06 Merck Patent Gmbh Terapia combinada que usa inibidores de tirosina cinase receptora e inibidores de angiogênese
WO2004003019A2 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Domantis Limited Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
US8834900B2 (en) 2001-08-17 2014-09-16 University Of Iowa Research Foundation Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
ATE395413T1 (de) 2001-12-03 2008-05-15 Amgen Fremont Inc Antikörperkategorisierung auf der grundlage von bindungseigenschaften
CA2477947A1 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Dyax Corp. Modular recombinatorial display libraries
PL375144A1 (en) 2002-07-30 2005-11-28 Bristol-Myers Squibb Company Humanized antibodies against human 4-1bb
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
EP2330130B1 (en) 2002-10-17 2014-08-27 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
EP1572744B1 (en) 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
JP2006523090A (ja) 2002-12-27 2006-10-12 ドマンティス リミテッド リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体
EP1627062A1 (en) 2003-05-14 2006-02-22 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
PL1639011T3 (pl) 2003-06-30 2009-05-29 Domantis Ltd Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb)
US7288638B2 (en) * 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
AR046094A1 (es) * 2003-10-10 2005-11-23 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos completamente humanos contra 4-1bb humano
RS55723B1 (sr) 2003-11-05 2017-07-31 Roche Glycart Ag Molekuli koji se vezuju za antigen sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
WO2005103081A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
US20070253961A1 (en) 2004-06-09 2007-11-01 Ulsan Industrial Education Foundation Pharmaceutical Composition Comprising the Anti-4-1Bb Antibody for Treating or Preventing Rheumatoid Arthritis
US20080152655A1 (en) 2004-09-08 2008-06-26 The Ohio State University Research Foundation Combination Therapy With Anti-Ctla4 and Anti-4-1BB Antibodies
US20060153808A1 (en) 2004-11-17 2006-07-13 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Cancer immunotherapy incorporating p53
DE102004063494A1 (de) 2004-12-23 2006-07-13 Tegenero Ag Antikörper
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
EP2399935A3 (en) 2005-02-15 2012-02-22 GTC Biotherapeutics, Inc. An anti-CD137 antibody as an agent in the treatment of cancer and glycosylation variants thereof
CA2970873C (en) 2005-05-09 2022-05-17 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
EP1896030A1 (en) 2005-06-03 2008-03-12 Pfizer Products Incorporated Combinations of erbb2 inhibitors with other therapeutic agents in the treatment of cancer
CN101291954B (zh) 2005-08-26 2013-03-27 罗氏格黎卡特股份公司 具有改变的细胞信号传导活性的修饰的抗原结合分子
CN1294146C (zh) 2005-10-17 2007-01-10 山东大学 与t细胞表面共刺激分子cd137结合的多肽及其应用
CA2628747C (en) 2005-11-22 2014-01-21 Incyte Corporation Combinations of hormone therapy agents and metalloprotease inhibitors for the treatment of cancer
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
KR20080107050A (ko) 2007-06-05 2008-12-10 울산대학교 산학협력단 항-ｃｄ１３７ 단일클론 항체를 포함하는 만성이식편대숙주 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
DK2178916T3 (en) 2007-07-31 2015-01-12 Regeneron Pharma Human antibodies to human cd20 and method thereof for use
EP2190440A1 (en) 2007-08-13 2010-06-02 Pfizer Inc. Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
AU2013202755B2 (en) 2007-08-22 2016-05-12 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
ES2336873B1 (es) 2007-11-07 2011-01-24 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Composicion farmaceutica para el tratamiento de cancer.
PT2594590E (pt) 2007-12-14 2015-01-14 Bristol Myers Squibb Co Moléculas de ligação ao recetor humano ox40
WO2010014784A2 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-ctla4 antibody with diverse therapeutic regimens for the synergistic treatment of proliferative diseases
EP2385955B1 (en) 2009-01-12 2020-08-12 CytomX Therapeutics, Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
WO2010132389A2 (en) 2009-05-14 2010-11-18 University Of Maryland, Baltimore Methods for treating cancers and diseases associated with 4-1bb (cd137) expression
US9193791B2 (en) 2010-08-03 2015-11-24 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects
SG10201506906VA (en) 2010-09-09 2015-10-29 Pfizer 4-1bb binding molecules
PT2637694T (pt) 2010-11-12 2021-05-05 Nektar Therapeutics Conjugados de uma fração de il-2 e um polímero
CN104661677A (zh) 2012-06-22 2015-05-27 西托姆克斯治疗公司 抗Jagged 1/Jagged 2交叉反应抗体、可活化的抗Jagged抗体及其使用方法
WO2014139130A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Adagene Inc. An integrated system for library construction, affinity binder screening and expression thereof
CN104250302B (zh) 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
AU2014324884B2 (en) 2013-09-25 2020-03-26 Cytomx Therapeutics, Inc Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
BR112016013741A2 (pt) 2013-12-17 2017-10-03 Genentech Inc Usos de antagonistas de ligação de eixo de pd-1 e um anticorpo de anti-cd20, e kit compreendendo os mesmos
US20170000850A1 (en) 2013-12-20 2017-01-05 National University Of Singapore Differentiation therapy with cd137 ligand agonists
WO2015125159A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Nektar Therapeutics (India) Pvt. Ltd. Il-2rbeta-selective agonists in combination with an anti-ctla-4 antibody or an an anti-pd-1 antibody
TWI726842B (zh) 2014-04-07 2021-05-11 日商中外製藥股份有限公司 免疫活化抗原結合分子
BR112017001579A2 (pt) 2014-07-25 2017-11-21 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd3, anticorpos anti-cd3 ativáveis, anticorpos anti-cd3 multiespecíficos, anticorpos anti-cd3 ativáveis multiespecíficos e métodos de uso dos mesmos
CN105296433B (zh) 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
WO2016115275A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 City Of Hope Ctla4-binding protein peptide-linker masks
WO2016130986A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind ctla4
JP2018508509A (ja) * 2015-02-22 2018-03-29 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｃｄ１３７に結合する抗体医薬
CA2978942A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-pdl1 antibodies, activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
WO2016179335A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-itga3 antibodies, activatable anti-itga3 antibodies, and methods of use thereof
EA201792414A1 (ru) 2015-05-04 2018-06-29 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Антитела против cd166, активируемые антитела против cd166 и способы их применения
MX2017014699A (es) * 2015-05-21 2018-04-11 Alligator Bioscience Ab Polipeptidos novedosos.
CN108431018A (zh) 2015-06-12 2018-08-21 王天欣 药物应用中蛋白质修饰的方法
EP3322732A2 (en) 2015-07-13 2018-05-23 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
DK3354661T3 (da) * 2015-09-22 2020-07-06 Dingfu Biotarget Co Ltd Fuldstændigt humant antistof mod human CD137 og anvendelse deraf
GB201519481D0 (en) 2015-11-04 2015-12-16 Cancer Rec Tech Ltd Immunomodulatory antibodies
CN108430499B (zh) 2015-12-15 2022-07-19 肿瘤免疫股份有限公司 嵌合和人源化抗人类ctla4单克隆抗体和其用途
JP2019503349A (ja) 2015-12-17 2019-02-07 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子およびその使用
US20190016812A1 (en) 2015-12-22 2019-01-17 Abbvie Stemcentrx Llc Novel anti-tnfsf9 antibodies and methods of use
EP3417293A1 (en) 2016-02-18 2018-12-26 Institut Gustave Roussy Methods and kits for predicting the sensitivity of a subject to immunotherapy
CN109414498A (zh) 2016-03-03 2019-03-01 Cue生物制药公司 T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法
SG10201603721TA (en) 2016-05-10 2017-12-28 Agency Science Tech & Res Anti-CTLA-4 Antibodies
EP3464362B1 (en) 2016-05-27 2020-12-09 AbbVie Biotherapeutics Inc. Anti-4-1bb antibodies and their uses
US11091557B2 (en) * 2016-07-14 2021-08-17 Genmab A/S Methods of producing multispecific antibodies against CD40 and CD137
CN107840887B (zh) 2016-09-21 2022-03-25 基石药业（苏州）有限公司 一种新的pd-1单克隆抗体
GB201619648D0 (en) 2016-11-21 2017-01-04 Alligator Bioscience Ab Novel antibodies and uses thereof
RU2725811C1 (ru) 2017-01-06 2020-07-06 Ютайлекс Ко., Лтд. Антитела против 4-1bb человека и их применение
EP3609921A2 (en) 2017-04-13 2020-02-19 Agenus Inc. Anti-cd137 antibodies and methods of use thereof
KR20180119135A (ko) 2017-04-24 2018-11-01 주식회사 제넥신 4-1bbl 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질
MX2019012953A (es) 2017-05-02 2020-02-12 Alligator Bioscience Ab Anticuerpo biespecifico contra ox40 y ctla-4.
US11643463B2 (en) 2017-05-19 2023-05-09 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Monoclonal antibodies to cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4)
PE20200757A1 (es) 2017-07-11 2020-07-27 Compass Therapeutics Llc Anticuerpos agonistas que se unen a cd137 humano y sus usos
GB201712032D0 (en) 2017-07-26 2017-09-06 Bioinvent Int Ab Antibodies and uses thereof
US11585014B2 (en) 2017-08-21 2023-02-21 Adagene Inc. Dynamic human antibody light chain libraries
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
AU2017428737B2 (en) 2017-08-21 2024-02-15 Adagene Inc. Dynamic human heavy chain antibody libraries
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
WO2019104716A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Adagene Inc. Methods for using cd137 ligand as biomarker for treatment with anti-cd137 antibody
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
CA3139968A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Peter Peizhi Luo Anti-cd137l antibodies and methods of using same
EP4149547A1 (en) 2020-05-13 2023-03-22 Adagene AG Compositions and methods for treating cancer

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