CN1294146C

CN1294146C - 与t细胞表面共刺激分子cd137结合的多肽及其应用

Info

Publication number: CN1294146C
Application number: CN 200510104308
Authority: CN
Inventors: 张利宁; 李娜; 王群
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2005-10-17
Publication date: 2007-01-10
Anticipated expiration: 2025-10-17
Also published as: CN1749270A

Abstract

本发明公开了一组与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽，它们具有SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；本发明还公开了所述的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽在制备治疗自身免疫病、肿瘤以及移植排斥反应的药物、制备激活或阻断CD137-CD137L通路的药物以及在研究或制备CD137-CD137L拮抗肽、类肽中的应用。

Description

与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种调节T淋巴细胞免疫功能的关键肽，具体地说，本发明涉及一组与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽及其应用。

背景技术

免疫应答过程中T细胞的活化需要双信号刺激。第一信号由T细胞上的抗原受体(TCR)与抗原递呈细胞(APC)表面的抗原肽-主要组织相容性复合物(MHC)的特异性结合提供；第二信号(又称为协同刺激信号)则来自T细胞与APC表面协同刺激分子之间的相互结合。增强T淋巴细胞活化所需要的协同刺激信号是增强抗肿瘤免疫的重要方法。阻断T细胞活化所需要的协同刺激信号是抑制T细胞活化、诱导T细胞处于失能状态的有效方法，也是治疗移植排斥反应及自身免疫病的有效手段。CD137是继CD28/B7之外新发现的另一重要的T细胞协同刺激分子，CD137与CD137配体在维持T细胞，尤其是CTL细胞的活化、增殖等方面具有重要的意义。

鉴于CD137-CD137L在免疫应答和免疫调节中所起的特殊作用，它们在肿瘤免疫、自身免疫病以及移植排斥中都具有重要的应用价值。刺激型抗-CD137单克隆抗体可通过活化T细胞介导的抗肿瘤免疫，消除小鼠体内的肿瘤。用抗CD137L的单抗阻断CD137-CD137L途径，可降低骨髓移植后移植物抗宿主反应(GVHD)造成的损伤，特别是可延长移植后小鼠的存活期。CD137配体基因敲除鼠可导致针对主要组织相容性抗原和次要组织相容性抗原的皮肤移植排斥反应延迟两周。目前阻断CD137-CD137L途径的方法主要两种，一是用特异性单克隆抗体封闭，如用抗CD137L的单抗阻断CD137-CD137L途径。但单抗多为鼠源性，用于人体治疗有许多副作用。因此，迫切需要研发出更为廉价、有效的阻断剂。但迄今为止，CD137与CD137L特异结合位点的关键序列还未明确。这就限制了对CD137、CD137L的功能及其作用机制的研究，阐明CD137与CD137L特异结合位点的关键序列对其功能和作用机制的深入研究有重要价值。

噬菌体随机肽库技术是近年来发展起来的一种高效、快捷的分析蛋白分子间相互作用的工具。噬菌体展示肽文库是将一段编码外源短肽的寡核苷酸整合到噬菌体基因中，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，从而构建成序列不同的特定长度的小肽集合。一般采用生物亲合选择系统淘选噬菌体肽库。随着此项技术的不断完善和发展，噬菌体肽库已被广泛应用于受体与配体特异结合位点、酶与底物作用位点、细胞因子与受体活性中心的作用、蛋白质抗原表位研究等研究领域，为探索受体与配基、酶与底物及抗原与抗体的相互作用奠定了基础。Marc等用噬菌体展示肽文库技术得到与HIV膜蛋白gp120结合的特定多肽，此多肽能抑制gp120与CD4受体之间的相互作用。

发明内容

针对CD137与CD137L特异结合位点的关键序列还未明确的不足，本发明要解决的问题是提供一组与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽及其应用，以促进对CD137、CD137L的功能及其作用机制的研究。

本发明涉及的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征

*长度：7氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.1

Arg Pro Thr Gln Gly Ala Phe

5

本发明涉及的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征

*长度：7氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.2

Arg Pro Thr Gln Val Ala Leu

5

本发明涉及的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽，它具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征

*长度：7氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.3

Arg Pro Thr Gln Val Ala Phe

5

本发明涉及的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽，它具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征

*长度：7氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.4

Ser Arg Ser Arg Val Arg Tyr

5

上述与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽的制备：是使用重组的CD137分子筛选肽文库，以重组人CD137分子作为亲和淘选的靶分子，从噬菌体随机七肽库中筛选得到。

本发明涉及的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽在制备治疗自身免疫病、肿瘤免疫以及移植排斥反应的药物中的应用。

与本发明所述的肽序列相关的激活或阻断CD137-CD137L通路的肽在肿瘤免疫、自身免疫病以及移植排斥反应临床治疗中具有重要的开发和应用价值，本发明制备的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽为制备其相关的药物奠定了基础。

本发明涉及的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽在制备激活或阻断CD137-CD137L通路的药物中的应用。

对上述肽序列所做的酶联免疫吸附实验(ELISA)显示，所述的肽序列与CD137都有较强的亲和性。

本发明涉及的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽在研究或制备CD137-CD137L拮抗肽、类肽中的应用。

对上述肽序列所做的功能实验显示四个肽均能在体外抑制抗CD137Ab刺激的淋巴细胞增殖反应，并且还显示其均能与细胞表面CD137结合从而阻断抗CD137Ab的作用。

本发明所获得的多肽序列对CD137-CD137L相关结合位点的研究建立基础。对与这些肽序列相关的激活或阻断CD137-CD137L通路的肽在肿瘤、自身免疫病以及移植排斥反应临床治疗中的应用、激活或阻断CD137-CD137L通路的药物开发以及CD137-CD137L拮抗肽、类肽的研究提供条件。

附图说明

图1.23个淘选的噬菌体克隆ELISA值

图2.噬菌体展示肽体外抑制抗CD137抗体诱导的T细胞增殖实验结果

具体实施方式

CD137是继CD28/B7之外新发现的另一重要的T细胞协同刺激分子，为肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族成员。CD137由255个氨基酸组成，为跨膜蛋白，1-17为信号肽，18-186为胞外区，187-213为跨膜区，214-255氨基酸为胞内区。CD137仅表达于活化的T细胞表面，而在静止T细胞上不表达，其配体(CD137L)主要表达在活化的APC表面，包括巨噬细胞、成熟B细胞和树突状细胞。

本发明以重组人CD137分子为靶，从噬菌体随机七肽库亲和筛选人CD137特异性结合序列，经五轮筛选，获得一组与CD137特异性结合的肽序列。

实施例1：从噬菌体随机七肽库筛选CD137结合肽

材料、试剂

随机七肽噬菌体展示文库(Ph.D.7^TM Phage Display Peptide Library Kit)购自美国New England Biolabs公司，其中噬菌体的滴度为2.0×10¹³pfu/ml，复杂度为2.8×10⁹转化子，宿主菌为E.coli ER2738。

重组人CD137购自R&D公司。

IPTG、Xgal购自Takara公司。

PEG8000购自Promega。

测序引物5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’由上海博亚公司合成。

包被液：0.1M pH 8.6的NaHCO3

封闭液：0.5％BSA-NaHCO3

洗脱液：0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/ml BSA

中和液：1M Tris-HCl(pH 9.1)

洗涤液：0.1％TBST、0.5％TBST

实验

1.1噬菌体随机七肽库淘选：

以100μg/ml的靶分子(CD137)溶液(溶于0.1M pH 8.6的NaHCO3)，包被96孔细胞培养板，每孔150μl，4℃轻微震荡，孵育过夜。每孔加满封阻液，4℃作用2-3hr。TBST洗涤6次，加入10μl噬菌体七肽原始文库和100μl TBS，室温温和摇动60min。用TBST洗板10次。用100μl 0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/ml BSA洗脱10min，洗脱液转入离心管中。然后再用15μl 1M Tris-HCl(pH 9.1)中和上述洗脱液。测定洗脱物的滴度，并扩增剩余洗脱物，测定扩增后的滴度用于第二轮淘选。在第二、三轮淘选中分别加入前一轮扩增产物2×10¹²PFU/ml，洗涤液改为0.5％TBST，其余淘选、扩增方法同前。第三轮洗脱，测定滴度，并在IPTG/Xgal平板上挑取5个噬菌斑进行鉴定并测序。

第四及第五轮淘选，包被的CD137浓度分别降为50μg/ml和20μg/ml，并分别挑取6、12个噬菌斑进行鉴定并测序。

根据每轮淘选前加入的噬菌体量与洗脱后的噬菌体量计算回收率，比较五轮淘选的噬菌体回收率，显示第一轮至第五轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高，有一定的富集效果(见表1)。

表1 CD137对噬菌体随机七肽库的淘选和富集

筛选轮次	投入	产出	产率(％)
筛选轮次	投入	产出	产率(％)	1234	2×10¹¹2×10¹¹2×10¹¹2×10¹⁰	5×10⁶1.2×10⁷2×10⁷1.5×10⁸	2.5×10^-56×10^-51×10^-47.5×10^-3

5

1×10¹⁰

1×10⁸

1×10^-2

注：产率＝产出/投入％

1.2阳性噬菌斑的扩增：

将ER2738过夜培养物按1∶100稀释接种于LB培养基，分1ml到培养管中。每个要鉴定的克隆一管，挑一蓝色噬菌斑到上述1ml培养管中，37℃摇床培养4.5-5hrs。培养物转入微量离心管中，离心30sec。上清转入新鲜管中，再离心。将80％的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体，用于测序模板的纯化和ELISA检测。

1.3测序模板纯化和DNA序列测定：

第三、四、五轮淘选后，分别随机挑选5、6、12个克隆扩增并测序。

将500μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管，加200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。离心10min，弃上清液。沉淀物重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温温育10min。离心，弃上清。用70％的乙醇洗沉淀。沉淀重悬于20μl TE中，此即为纯化的测序模板。

取10μl的模板溶液，以5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’为测序引物，委托上海博亚公司在ABI 377型DNA自动测序仪上进行自动测序，共测23个克隆。(见表2)

表2 23个噬菌体克隆的氨基酸序列

序列号	肽序列
序列号	肽序列	12345678910111213，201415，181617192122	HHFVNWSEQLVAIGSPSSACYSANVPVLDHAHVHYLHTRHSSRPTQGAFRPTQVALTATMSSSGHDRAQPQFGPALNRTSQHTLSRSRVRYKLPVIRSRPTQVAFTSASPASTHPLFSHPIISRATSPIPSPMSQTTNEL

23

HRRPSRS

实施例2：ELISA实验检测肽与CD137的亲和力

材料、试剂

辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗M13噬菌体单抗(HRP/anti-M13)为Pharmacia产品。

实验

2.1夹心ELISA检测淘选的噬菌体展示多肽对靶分子的结合

在扩增上述噬菌斑进行DNA测序时，将所剩余的含噬菌斑上清4℃保存。对每一个要鉴定的噬菌斑克隆，接种一管宿主菌ER2738于20ml LB培养基中，37℃培养至稍微浑浊。于每管ER2738培养液中加入5μl噬菌体上清，37℃培养4.5hrs。培养物转入离心管中，离心10min。上清移入新鲜离心管，再离心。取80％上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀过夜。离心，弃上清。沉淀重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管，PEG/NaCl再沉淀。冰上作用60min。离心，弃上清。沉淀重悬于50μlTBS中，测定噬菌体滴度。

用150μl 50μg/ml的CD137(溶于0.1M pH 8.6NaHCO3中)包被ELISA板，4℃过夜，同时设空白对照。以封阻液封闭1h，0.5％TBST洗板6次，按所测定的噬菌体滴度每孔加入1×10¹²个噬菌体，以空载体噬菌体克隆pComb3H为无关噬菌体阴性对照，37℃作用2h，0.5％TBST洗板6次，每孔加200μl 1∶5000稀释的HRP/抗-M13单抗，室温作用1hr。TBST洗板6次，加OPD底物显色5min，2M硫酸终止反应，490nm测定吸光值(见表3、4)。

结果显示大多数淘选到的噬菌体克隆所展示的多肽与CD137都有较高的结合力，空白对照OD值为0.01、阴性对照未显色，说明淘选过程有良好效果(见图1)。

表3淘选到的第一组高度相似序列和其与CD137的亲和力

克隆号	肽序列	OD值
克隆号	肽序列	OD值	781215，18	RPTQGAFRPTQVALRTSQHTLRPTQVAF	1.5593.1601.9832.106

表4 淘选到的第二组相似序列和其与CD137的亲和力

克隆号	肽序列	OD值
克隆号	肽序列	OD值	13，2023	SRSRVRYHRRPSRS	1.0752.637

在ELISA检测中，也有某些克隆显示高OD值(见表5)。

表5.ELISA检测与CD137高亲和力结合的噬菌体展示多肽序列

No. of clones	polypeptide sequence	OD value
No. of clones	polypeptide sequence	OD value	38101423	SPSSACYRPTQVALGHDRAQPKLPVIRSHRRPSRS	2.8193.1603.0583.0382.637

根据上述结果，我们选择有高度相似性、重复性且在ELISA实验中显示高亲和力的四个克隆，即7号、8号、15号和13号克隆，并对其生物学作用进行进一步的检测。这些克隆所展示的肽序列即为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，即Arg ProThr Gln Gly Ala Phe；Arg Pro Thr Gln Val Ala Leu；Arg Pro Thr Gln Val Ala Phe和Ser Arg Ser Arg Val Arg Tyr。

实施例3：噬菌体展示多肽体外抑制抗CD137抗体诱导的T细胞增殖

材料、试剂

PHA购自科睿生物技术公司

³H-TdR购自中国原子能科学研究院

抗CD137Ab购自R&D公司。

实验

对筛选到的含共有序列噬菌体克隆，分别取1×10¹²噬菌体，加入96孔板，紫外照射三小时以使噬菌体失去感染性和活力，但仍保持其所展示的多肽。体外检测每一噬菌体展示多肽对PHA和抗CD137Ab刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应影响。同时，以无关噬菌体VCSM13做对照。

常规分离人外周血淋巴细胞，调细胞浓度为1×10⁶/ml，按每孔200ul量加入96孔培养板。对每一噬菌体展示多肽分三组进行实验：PHA组；PHA+CD137Ab组；PHA+CD137Ab+噬菌体展示多肽组，并设细胞空白对照，每组三个复孔。每孔PHA终浓度为50ug/ml，抗CD137抗体终浓度为5ug/ml，置37℃，5％CO2培养箱中培养56h。每孔加1μCi³H-TdR，继续培养至72h。用多头细胞收集器将每孔培养物分别吸到49型玻璃纤维滤纸上，将滤纸置80℃烘干1h后，分别将每片滤纸放闪烁杯中，每杯加5mL闪烁液。在β-液体闪烁计数仪上测定每杯样品的cpm。

4个克隆的肽序列分别为RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF和SRSRVRY。PHA+CD137Ab组的cpm值虽高于PHA+CD137Ab+VCSM13组，但二者无统计学差异(P＞0.05)。

PHA+CD137Ab组与4个克隆的PHA+CD137Ab+噬菌体展示多肽组相比有显著性差异(P＜0.05)。4个PHA+CD137Ab+噬菌体展示多肽组各组间无显著性差异(P＞0.05)(见图2)。

淋巴细胞增殖抑制实验显示四个肽，肽序列即为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，均能在体外抑制抗CD137Ab刺激的淋巴细胞增殖反应，并且还显示其均能与细胞表面CD137结合从而阻断抗CD137Ab的作用。

序列表

SEQ ID NO.1

<110>山东大学

<120>与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽及其应用

<141>2005-10-13

<160>4

<210>1

<211>7

<212>PRT

<221>与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽

<222>(1)…(7)

<400>1

Arg Pro Thr Gln Gly Ala Phe

5

SEQ ID NO.2

<210>2

<211>7

<212>PRT

<221>与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽

<222>(1)…(7)

<400>2

Arg Pro Thr Gln Val Ala Leu

5

SEQ ID NO.3

<210>3

<211>7

<212>PRT

<221>与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽

<222>(1)…(7)

<400>3

Arg Pro Thr Gln Val Ala Phe

5

SEQ ID NO.4

<210>4

<211>7

<212>PRT

<221>与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽

<222>(1)…(7)

<400>4

Ser Arg Ser Arg Val Arg Tyr

5

Claims

1.一种与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征

*长度：7氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.1

Arg Pro Thr Gln Gly Ala Phe

5

2.一种与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征

*长度：7氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.2

Arg Pro Thr Gln Val Ala Leu

5

3.一种与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽，它具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征

*长度：7氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.3

Arg Pro Thr Gln Val Ala Phe

5

4.一种与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽，它具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；其所示信息为：

(a)序列特征

*长度：7氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.4

Ser Arg Ser Arg Val Arg Tyr

5

5.权利要求1、2、3或4所述的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽在制备治疗自身免疫病、肿瘤免疫以及移植排斥反应的药物中的应用。

6.权利要求1、2、3或4所述的与T细胞表面共刺激分子CD137结合的多肽在制备激活或阻断CD137-CD137L通路的药物中的应用。