CN107176974B - ω-5-醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位及其应用 - Google Patents

ω-5-醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种ω‑5‑醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位，该表位的氨基酸序列为LAMAMNIASASRLLS。该T细胞表位肽能诱导特异性CD4+T细胞增殖，为变应原特异性免疫治疗提供了新的靶点。可以用于制备药物，用于小麦依赖运动诱发的严重过敏性反应(WDEIA)特异性免疫治疗，为WDEIA提供新的治疗手段。

Description

ω-5-醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位及其应用
技术领域
本发明涉及ω-5-醇溶蛋白特异性CD4+T细胞表位及其小麦依赖运动诱发的严重过敏性反应(WDEIA)特异性免疫治疗。
背景技术
食物依赖运动诱发严重过敏反应是致死性的严重过敏反应，在中国人群中，最常见的致敏食物为小麦。发病率呈逐年上升趋势。由于其症状严重，给患者的生活造成极大影响。ω-5醇溶蛋白是其发病的主要致敏蛋白。能被T细胞识别的肽段称为T细胞表位，不同的T细胞表位激活特异性T细胞的能力不同。HLA-DRB1基因的高度多态性在一定程度上影响抗原提呈细胞提呈抗原肽种类以及激活特异性CD4+T细胞的能力，这可能是不同个体对同一蛋白组分产生不同免疫应答的原因。目前在花生、桃、芹菜、牛奶、榛子、牛肉等中，已相继开展了CD4+T细胞免疫应答的研究，鉴定出了相关主要致敏蛋白的CD4+T细胞表位，并发现CD4+T细胞在疾病的发生发展过程中发挥着至关重要的作用。同时特异性CD4+T细胞表位的肽段已经用于特异性免疫治疗，与传统的皮下免疫治疗相比，更安全，有效。
但迄今为止，仍没有ω-5-醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位及其特异性细胞免疫应答的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种ω-5醇溶蛋白特异性CD4+T细胞表位的免疫原性肽，本发明的另一个目的在于提供所述免疫原性肽的用途。
本发明提供的一种ω-5-醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位的免疫原性肽，其肽序列为：LAMAMNIASASRLLS(SEQ ID No.1)。
进一步，本发明所述的免疫原性肽可以与其他免疫原性肽组成能够引起多特异性应答反应的多表位组合物，例如嵌合多肽。
进一步，本发明还提供编码所述免疫原性肽或所述嵌合多肽的DNA。这些DNA能插入到合适的载体中，在寄主细胞或者生物体重表达所述的免疫原性肽或所述的嵌合多肽。
进一步，本发明还提供包含所述免疫原性肽或所述嵌合多肽或编码所述肽的DNA的组合物。这些组合物还可进一步包含其他免疫原性肽或者编码所述其他免疫原性肽的DNA。
进一步，本发明提一种供抗原提呈细胞，其提呈所述的免疫原性肽或所述的嵌合多肽或转化了所述的DNA。例如，抗原提呈细胞为树突状细胞。通过抗原提呈细胞的提呈，可以与免疫细胞建立起高效免疫应答。
进一步，本发明提供所述的免疫原性肽、所述的嵌合多肽、编码所述肽的DNA以及包含所述肽或编码所述肽的DNA的组合在制备药物中的应用。尤其是，该药物用于小麦依赖运动诱发的过敏性休克特异性免疫治疗。或者该药物用于小麦依赖运动诱发的过敏性休克病人诊断。
本发明ω-5-醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位肽，能诱导特异性CD4+T细胞增殖，为变应原特异性免疫治疗提供了新的靶点。可以用于制备药物，用于小麦依赖运动诱发的过敏性休克(WDEIA)特异性免疫治疗，为WDEIA提供新的治疗手段。
附图说明
图1为表位肽ω-510-24经HPLC纯化的结果。
图2为合成多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30分别刺激WDEIA患者PBMC分泌IL-4/IL-5ELISPOT斑点图。
图3为合成多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30分别刺激WDEIA患者PBMC后第五天CD4+T细胞亚群的扩增比例结果图。
图4为WDEIA患者外周血PBMC分别经多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30刺激后CD4+T细胞的增殖动力学变化图。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。
实施例1ω-5-醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位的免疫原性肽的获得
利用生物信息学软件NetMHCⅡpan及NetMHCII在线预测ω-5醇溶蛋白T细胞表位。将氨基酸序列导入在线预测软件，输入HLA-DRB1基因型，系统通过计算HLA-DRB1不同位点，具体是HLA-DRB1*1501，*0901，*1202，*0701，*0301，*0803与肽段亲和力的高低预测潜在的T细胞表位。
预测出T细胞表位的氨基酸区域为1-35，67-86，148-167，334-351，365-384。具体详见下表1。
表1.ω-5醇溶蛋白多肽基本信息
Figure BDA0001314103080000031
其中，已知ω-5醇溶蛋白[Triticum aestivum，小麦]含有439个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。
合成如表1中的15条预测的T细胞表位氨基酸区域的多肽。所用试剂、仪器，具体步骤如下：
1.合成原料及相关试剂、仪器：
1.1合成原料：
树脂：取代度为1.03mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin(天津市南开合成科技有限公司)；氨基酸：Fmoc-Gln(Trt)-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Pro-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Phe-OH(成都诚诺，>99％)等。
1.2相关试剂：
合成试剂：DMF(原产地韩国)，DCM(原产地韩国)，MEOH(原产地日本)，DIEA(新德化工，99％)，HBTU(昊帆生物科技，99％)；脱保护试剂：哌啶(国药集团上海化学试剂公司，99％)；
检测试剂：苯酚试剂(自配)，吡啶试剂(自配)，茚三酮试剂(自配)；裂解试剂：95％切割液：TFA(J.T.Baker，99％)，TIS(上海达瑞精细化工，98％)，EDT(上海达瑞精细化工，98％)，无水乙醚(上海实验，实测99.7％)；氮气：(新联气体)
1.3仪器：
十二通道半自动多肽合成仪上海强耀生物科技有限公司自主设计并申请专利的半自动多肽合成仪，专利号为201020226529.2；SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.Sevial System，厂商：SHIMADZU)；LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO)；离心机(上海安亭科学仪器厂型号：TDL-40B)
2.多肽合成步骤如下：
合成顺序：从序列C端到N端，步骤如下：
a.称取n当量树脂放入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的DIEA，适量的二甲基甲酰胺(DMF)，DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，二异丙基乙胺(DIEA)、DMF、DCM，氮气鼓泡反应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、MEOH洗净；
b.往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量HBTU(1－羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，N2鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；
c.依步骤b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰；
d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/g的比例)的切割液(组成是95％三氟乙酸(TFA)，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂；e.得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物。
ω-5醇溶蛋白多肽合成和纯化：根据预测的结果，选取与HLA-DRB1分子结合率高的肽段进行合成(肽段结合率＝结合某肽段的HLA-DRB1分子数量/HLA-DRB1分子总数)。合成的多肽在高压液相色谱仪上进行纯化，纯化后的产品分别经反相色谱和质谱进行纯化分析和质量鉴定。其中，表位肽ω-510-24经HPLC纯化，纯度为96.37％，如图1所示。
实施例2小麦ω-5醇溶蛋白T细胞表位多肽对外周血单个核细胞增殖活性的影响
一、外周血单个核细胞分离和冻存
1.主要材料及试剂：
人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll)、PBS(医科院基础所)
2.仪器设备：
水平离心机(Thermo Fisher)
3.方法步骤
3.1抽取肝素抗凝静脉血4mL，加入4mL PBS溶液混匀；
3.2取淋巴细胞分离液置于离心管中，将4mL稀释血液距分离液面上约1cm，沿管壁轻轻叠加于3mL淋巴细胞分离液上，保持淋巴细胞分离液与血样品之间的界限清晰；
3.3置于水平离心机中，20℃，400g/min，离心35min。
3.4离心后，从离心管的底部到液面分成4层，依次为红细胞和粒细胞层、分离液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)
3.5用吸管直接吸出单个核细胞层，置于另一离心管中。
3.6加入6mL PBS溶液，充分混匀，每次100g/min，离心10min。离心后弃去上清液，用PBS清洗2次。
3.7沉淀的细胞用l mL含10％DMSO的胎牛血清配成单细胞悬液。
3.8程序性降温：用冻存液冻存后，先在4℃保存60分钟，然后-20℃保存30min，-80℃过夜，最后移入液氮保存。
二、外周血单个核细胞复苏
1.主要材料及试剂
人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll)、台盼蓝(北京雷根生物技术有限公司)、血细胞计数板、载玻片、PBS(医科院基础所)、完全培养基(RPMI 1640180ml；胎牛血清(FBS)20ml(2支)，FBS-20℃保存；谷氨酰胺，1支
(1ml)，-20℃保存；β-巯基乙醇，1000×200μl，1支，4℃保存；丙酮酸钠，(4ml)，1支，-20℃保存；HEPES，调节酸碱，1.5ml)
2.仪器设备
水浴锅、倒置显微镜(OPTEC公司)
3.方法步骤
3.1提前准备好37℃水浴锅，超净台里准备好15ml离心管，加入9ml培养基后管盖拧紧，水浴锅内37℃预热。
3.2将液氮中冻存管拿出，立即放入37℃水浴锅中不停地摇晃，注意水浴锅水面不要高于管盖口以免水渗入。
3.3约2min后，拿起看冻存管中固体全部化为液体，立马拿进超净台，加入到刚才预热的9ml里面，这样相当于稀释10倍，以免DMSO损伤细胞。
3.4置于水平离心机中，1000rpm/min，5min。离心后，弃上清，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞。原则就是：操作一定要快，避免污染，稀释。
3.5细胞浓度的调节：取10μl单细胞悬液加入40μl 0.4％台盼蓝中混匀，取10μl加入细胞计数板中进行活细胞计数，根据计数结果，用37℃调节细胞浓度至1×106个/ml，待用。
三、表位肽诱导CD4+T细胞系产生
本实验中，采用CCK-8法替代以往的MTT法进行淋巴细胞增殖试验。CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析，其基本原理为：该试剂中含有WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan dye)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖检测。此方法比起原有的MTT法具有操作简便、重复性好、灵敏度高等优点。
所用材料及试剂、设备、具体方法如下：
1.主要材料及试剂
RPMI1640培养基(医科院基础所)、胎牛血清(医科院基础所)、谷氨酰胺(医科院基础所)、β-巯基乙醇(医科院基础所)、HEPES(医科院基础所)、植物血凝素PHA(挧圣生物)、Cell Counting Kit-8试剂盒(日本同仁化学)、96孔培养板(Corning3599)、人工合成候选表位肽(上海强耀生物科技有限公司)2.仪器设备
CO2培养箱、酶标仪(Thermo Fisher)3.方法步骤
3.1将分离的外周血单个核细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞数为1×106/ml
3.2将上述细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100μl，每组设三个复孔。
将不同刺激剂按表位肽段(20μg/ml)、PHA(阳性对照，20μg/ml)和培养基(阴性对照)的顺序依次加入96孔板中，将96孔板周边的孔设为空白孔，加入无细胞悬液的RPMI-1640完全培养基，以预防误差。37℃，5％C02培养72h。
3.3检测淋巴细胞增殖情况：
向各孔中加入20μl的CCK-8溶液。37℃、5％CO2孵育5小时。测定450nm处的OD值。结果以三个复孔的平均值表示。通过OD450值大小来反应表位多肽对人PBMC增殖活性的影响。增殖水平以刺激指数(Stimulation Index，SI)表示：SI＝变应原刺激后OD450值/阴性对照OD450值。SI≥2被认为阳性结果。
通过多肽筛选的方法对小麦依赖运动诱发严重过敏反应中ω-5醇溶蛋白的主要T细胞表位进行初步鉴定，发现可能参与严重过敏反应发生的主要T细胞表位。采用间接法进行CD4+T细胞表位的筛选。选择外周血单个核细胞作为效应细胞，将合成的15条肽段(20μg/ml)作为刺激物，同时加入(聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA))PHA为阳性对照和不加任何刺激物的阴性对照，依次加入96孔板中，37℃，5％CO2培养。72h后检测淋巴细胞增殖情况：向各孔中加入20μl的CCK-8溶液。37℃、5％CO2孵育5小时。测定450nm处的OD值。结果以三个复孔的平均值表示。通过OD450值大小来反应表位多肽对人外周血单个核细胞(PBMC)增殖活性的影响。增殖水平以刺激指数(Stimulation Index，SI)表示：SI＝变应原刺激后OD450值/阴性对照OD450值。SI≥2被认为阳性结果。观察PBMC在候选表位肽氨基酸序激活下的增殖反应情况。通过比较WDEIA患者和正常对照PBMC增殖后的活化指数(SI)，分析不同肽段的变应原性。对ω-5醇溶蛋白的主要T细胞表位进行初步研究。WDEIA患者PBMC对15条肽段表现出不同的增殖能力：其中，5条表位肽(ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30)对WDEIA患者PBMC的活化程度最高，30例WDEIA患者28例(93.33％)对这5条肽段增殖指数为阳性；其中ω-510-24对WDEIA患者的活化率最高，为90％。余下各肽段的增殖阳性率为10％-20％。而健康对照组外周血PBMC在各肽段刺激下的活化率为0-20％。
实施例3 ELISPOT法筛选可刺激分泌IL-4和IL-5的多肽
斑点酶联免疫检测(Enzyme-linked Immunospot Assay，ELISPOT)是利用ELISA技术的基本原理从单细胞水平检测分泌细胞因子的细胞的一种免疫学检测技术，可从单细胞水平评价机体的细胞免疫功能。其技术原理为：用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以斑点酶联显色方式将其表现出来。
此技术操作在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底PVDF膜为基质，包被上特异性单克隆抗体，以捕获细胞分泌的细胞因子。然后在培养板孔内加入细胞培养基、待检测的细胞及抗原刺激物进行培养。在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就开始分泌各种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方膜上的单克隆抗体所捕获。洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，可以在膜的局部形成圆形斑点。每个斑点代表一个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞(Spots forming cells，SFCs)，通过ELISPOT斑点酶联分析系统对斑点进行分析即可计算出阳性细胞的频率。
所用的材料及试剂、仪器设备、具体步骤如下所示：
1.主要材料及试剂
IL-4ELISPOT试剂盒(BD)、IL-5ELISPOT试剂盒(BD)、96孔PVDF滤膜板(MAIP N45)(Millipore公司)、含10％胎牛血清的RPMI1640培养基。2.仪器设备
ELISPOT读数仪(ChamSpotTMII型酶联免疫斑点图像分析系统)
3.方法步骤
3.1复苏冻存的患者PBMC，用10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养20-24h。
3.1包被 将捕获性抗体(15μg/ml鼠抗人IL-4/IL-5mAb 50μl)预先包被96孔PVDF滤膜板，4℃孵育过夜。
3.2洗板 将板用PBS洗6遍
3.3封闭 用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基封闭，室温下封闭1h。(胎牛血清可以封闭所包被抗体的胎牛血清受体以降低非特异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA的不同之处。)
3.4调整细胞数 外周血单核细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基稀释至2×106～4×106个/孔。
3.5刺激和培养 将上述细胞悬液加入ELISPOT板孔中，每孔100μl，每组设三个复孔。依次加入表位肽(20μg/ml)、PHA(阳性对照)和培养基(阴性对照)的顺序依次加入96孔板中，37℃，5％C02培养24－48h。
3.6洗涤 用含体积比0.01％Tween-20的PBS洗6次，以弃去细胞
3.7孵育 加入50μl(1μg/ml)生物素化抗细胞因子的检测抗体，孵育3h。洗6次后，加入50μl ALP-链霉亲和素，室温孵育1－2h。
3.8显色 用PBS－Tween－20再洗5次，加入100μl BCIP/NBT显色液于室温下(25℃)避光显色1h，观察斑点形成。显色完毕后，用去离子水洗板3次终止反应，将板放置于室温避光阴凉处干燥后用ELISPOT读板仪测定斑点数，计算IL-4、IL-5斑点形成细胞数。每孔斑点数≥5，即可判为阳性。T细胞频率以分泌IL-4(或IL-5)的细胞数/106PBMC表示。为了进一步验证淋巴细胞增殖实验的结果，使用斑点酶联免疫分析技术(ELISPOT法)检测经多肽刺激的外周血单个核细胞分泌IL-4和IL-5的情况。此步骤是对候选表位肽进行初筛。Elispot板通过显色反应，在细胞分泌IL-4和IL-5的相应位置显现清晰可辨的斑点，通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数。ELISPOT结果中的每一个斑点代表一个分泌IL-4或IL-5的T细胞，称为斑点形成细胞(Spot forming cell,SFC)，最后结果以SFC/106PBMC表示，反映机体细胞免疫的水平。
应用经淋巴细胞增殖法初步筛选到的多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30刺激外周血单个核细胞，检测小麦ω-5醇溶蛋白T细胞表位多肽诱导相关HLA-DRB等位基因阳性个体CD4+T细胞分泌IL-4，IL-5等细胞因子的情况。结果如图2所示，其中，图2中为分别采用ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30诱导分泌的IL-4，IL-5结果图，结果说明表位肽ω-510-24诱导产生的分泌IL-4和IL-5的细胞数量都显著高于其他各表位肽(P＜0.05)，达到了389±62个/106PBMC和393±75个/106PBMC，进而鉴定出ω-5醇溶蛋白特异的T细胞表位为ω-510-24。
实施例4 CFSE标记技术检测表位肽诱导的特异性CD4+T细胞增殖
流式细胞法筛选可刺激T细胞反应的多肽，比较各候选表位肽特异性CD4+T细胞增殖率
为了进一步验证ELISPOT筛选法的结果，选取另外10例WDEIA患者，使用流式细胞法检测表位肽对CD4+T细胞刺激增殖的情况。由于CD3是T细胞的特有标记，因此以CD3设门，采用流式细胞术检测CD3+CD4+T细胞占PBMC百分比。ω-5醇溶蛋白主要T细胞表位刺激WDEIA患者外周血PBMC后，会显著诱导T细胞活化增殖、分化，CD3+CD4+T细胞百分比将显著升高。
所用的试剂盒仪器、具体实验步骤如下：
1.主要试剂和仪器
荧光抗体抗CD4；荧光抗体抗CD3；BD FACSCantoTM II流式细胞仪
2.方法步骤
2.1调整细胞数 用RPMI-1640完全培养基调整细胞数为1×107个/ml的细胞悬液。洗涤离心及后续操作过程中注意避光。
2.2 T细胞的激活、扩增；
2.2.1加入96(24)孔细胞培养板，100μl/孔(1ml)，同时加入稀释好的多肽，终浓度为20μg/mI。
2.2.2 37℃，5％C02培养细胞培养
2.3流式细胞术检测和分析T淋巴细胞亚群的增殖
2.3.1收集细胞 收集表位肽刺激培养第5天的细胞(每管加入100μl细胞悬液)
2.3.2用抗CD4-PE、抗CD3-Biotin作细胞表面分子染色加入FITC antimouseCD3、PE anti-mouse CD4荧光抗体各2μl，冰上避光孵育20min
2.3.3洗涤 离心洗涤细胞2次，去除残留的荧光抗体；
2.3.4上机检测 以0.5ml细胞染色缓冲液重悬细胞，转移至流式管中；在流式细胞仪上检测。
CFSE标记技术检测表位肽诱导的特异性CD4+T细胞增殖
CFSE(羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂)是一种活细胞染料，进入细胞后与胞内蛋白形成稳定的大分子荧光结合物。当细胞分裂时,荧光结合物平均分配到两个子细胞中,而荧光强度为亲代细胞的一半。用流式细胞术检测CFSE标记细胞的荧光强度,同时检测细胞表面标志分子(如：CD3/CD4)就可以分析淋巴细胞亚群的增殖动力学。
表位肽与患者T细胞亲和力高，就可以完全地激活T细胞，诱导T细胞增殖、分化。T细胞增殖分裂过程中，CFSE被平均分配至各代细胞中而使细胞的平均荧光强度减弱，通过Modfit软件分析获得每代细胞数目和增殖指数。所用设计和仪器、具体步骤如下：
1.主要试剂和仪器
CFSE(Molecular Probes公司)；BD FACS CantoTM II流式细胞仪
2.方法步骤
2.1 CFSE标记外周血单个核细胞(PBMC)
2.1.1 CFSE溶于二甲基亚砜(DMSO)配制成储存液(2mmol/L)分装后-20℃保存。
2.1.2调整细胞数 用RPMI-1640完全培养基调整细胞数为1×107个/ml的细胞悬液。每毫升细胞悬液加入0.5μl CFSE贮存液，终浓度为1μmol/L；
2.1.3孵育 置37℃孵育10min
2.1.4洗涤 加入10ml RPMI-1640完全培养基，1000r/min离心10min，洗涤细胞2次
2.1.5调整细胞数 用RPMI-1640完全培养基将染色后PBMC制成细胞悬液，调整细胞数为1×107个/ml。洗涤离心及后续操作过程中注意避光。
2.2 T细胞的激活、扩增；
2.2.1调整细胞数 用RPMI-1640完全培养基将染色后PBMC制成细胞悬液，调整细胞数为1×107个/mI
2.2.2加入96(24)孔细胞培养板，100μl/孔(1ml)，同时加入稀释好的多肽，终浓度为20μg/ml。
2.2.3 37℃，5％C02培养细胞培养
2.3流式细胞术检测和分析T淋巴细胞亚群的增殖
2.3.1收集细胞 用表位肽刺激培养5天收集细胞(每管加入100μl细胞悬液)
2.3.2上机检测 以0.5ml细胞染色缓冲液重悬细胞，转移至流式管中；在流式细胞仪上检测。
2.3.3用Cell Quest软件获取数据，然后用Modfit软件分析不同T细胞亚群的增殖动力模型。
应用流式细胞法验证可刺激T细胞反应的多肽，比较各候选表位肽特异性CD4+T细胞增殖率。外周血单个核细胞经表位肽激活后增殖5天，用荧光抗体染色后在流式细胞仪上测定获得数据，如图3所示，其中，图3中分别为多肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30测定的流式细胞结果图，结果表明ω-510-24刺激增殖的CD3+CD4+T细胞百分比均显著高于阴性对照组(P＜0.05)。而其他四种表位肽激增殖的CD3+CD4+T细胞与阴性对照组相比无显著差异(P>0.05)。说明表位肽ω-510-24诱导产生以CD3+CD4+T细胞增殖为主的Th型免疫应答，为ω-5醇溶蛋白的潜在表位，这一结果与先前ELISPOT的结果相符。再用Modfit软件中的增殖分析模块进行分析，得到CD4+T细胞的增殖动力模型，即可计算出增殖指数(Proliferation Index，PI，)。-
WDEIA患者外周血PBMC经ω-510-24刺激后CD4+T细胞的增殖动力学变化，如图4所示，其中，图4中分别为表位肽ω-54-18、ω-57-21、ω-510-24、ω-513-27、ω-516-30刺激的PBMC均发生了增殖反应，但ω-510-24刺激的PBMC则发生了显著的增殖，经ω-510-24刺激后CD4+T细胞子代增殖总百分比为99.34％，增殖指数为41.82。可见经ω-510-24刺激后WDEIA患者CD4+T细胞发生了特异性增殖。
本发明提供的ω-5醇溶蛋白HLA-DR限制性T细胞表位鉴定为变应原特异性免疫治疗提供了新的靶点。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> ω-5-醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位及其应用
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Leu Ala Met Ala Met Asn Ile Ala Ser Ala Ser Arg Leu Leu Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Lys Thr Phe Ile Ile Phe Val Leu Leu Ala Met Ala Met Asn
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Phe Ile Ile Phe Val Leu Leu Ala Met Ala Met Asn Ile Ala Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Phe Val Leu Leu Ala Met Ala Met Asn Ile Ala Ser Ala Ser Arg
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Ala Met Asn Ile Ala Ser Ala Ser Arg Leu Leu Ser Pro Arg Gly
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Ile Ala Ser Ala Ser Arg Leu Leu Ser Pro Arg Gly Lys Glu Leu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Ser Arg Leu Leu Ser Pro Arg Gly Lys Glu Leu His Thr Pro Gln
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Leu Gln Gln Gln Gln Ile Pro Gln
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Gln Gln Gln Phe Leu Gln Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln Gln Ile
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Phe Leu Gln Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
Pro Gln Gln Pro Gln Gln Phe Leu Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Pro Gln Gln Phe Leu Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Pro
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
Gln Phe Leu Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Pro Pro Gln
1 5 10 15
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Pro Gln Gln Gln Phe His Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Phe Pro
1 5 10 15
Gln
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
Gln Gln Gln Gln Leu Thr Gln Gln Gln Phe Pro Arg Pro Gln Gln Ser
1 5 10 15
Pro
<210> 16
<211> 439
<212> PRT
<213> ω-5醇溶蛋白的氨基酸序列
<400> 16
Met Lys Thr Phe Ile Ile Phe Val Leu Leu Ala Met Ala Met Asn Ile
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ser Arg Leu Leu Ser Pro Arg Gly Lys Glu Leu His Thr
20 25 30
Pro Gln Glu Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Pro Gln Gln
35 40 45
Phe Pro Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln His Gln Ile Pro Gln Gln Pro
50 55 60
Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Leu Gln Gln Gln Gln Ile Pro
65 70 75 80
Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln His Gln Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln
85 90 95
Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln His Gln Ser Pro Gln Gln
100 105 110
Gln Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Lys Leu Pro Gln Gln Glu
115 120 125
Phe Pro Gln Gln Gln Ile Ser Gln Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Gln
130 135 140
Gln Gln Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln Phe Leu Gln Gln Gln Gln Phe
145 150 155 160
Pro Gln Gln Gln Pro Pro Gln Gln His Gln Phe Pro Gln Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gln Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln Pro
180 185 190
Gln Gln Ile Pro Gln Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln Phe
195 200 205
Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro
210 215 220
Gln Gln Glu Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Ile Ala
225 230 235 240
Arg Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln Pro
245 250 255
Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Ser Pro Gln
260 265 270
Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Leu Pro
275 280 285
Gln Lys Gln Phe Pro Gln Pro Gln Gln Ile Pro Gln Gln Gln Gln Ile
290 295 300
Pro Gln Gln Pro Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln
305 310 315 320
Gln Phe Pro Gln Gln Gln Glu Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln
325 330 335
Gln Phe His Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln
340 345 350
Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln
355 360 365
Gln Leu Thr Gln Gln Gln Phe Pro Arg Pro Gln Gln Ser Pro Glu Gln
370 375 380
Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Phe
385 390 395 400
Pro Gln Gln Gln Phe Pro Ile Pro Tyr Pro Pro Gln Gln Ser Glu Glu
405 410 415
Pro Ser Pro Tyr Gln Gln Tyr Pro Gln Gln Gln Pro Ser Gly Ser Asp
420 425 430
Val Ile Ser Ile Ser Gly Leu
435

Claims (9)

1.一种ω-5-醇溶蛋白特异性CD4+T细胞的表位肽，其氨基酸序列为：LAMAMNIASASRLLS。
2.编码权利要求1所述表位肽的DNA。
3.包含权利要求1所述表位肽的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，其还包含其他表位肽。
5.一种抗原提呈细胞，其转化了权利要求2所述的DNA。
6.根据权利要求5所述的抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞为树突状细胞。
7.权利要求1所述的表位肽、权利要求2所述的DNA、权利要求3或4所述的药物组合物在制备诊治小麦ω-5-醇溶蛋白引起的过敏性疾病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，该药物用于小麦依赖运动诱发的严重过敏性反应特异性免疫治疗。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，该药物用于小麦依赖运动诱发的严重过敏性反应病人诊断。
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