TW202120925A

TW202120925A - 肽：mhc結合多肽的表徵方法

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Publication number: TW202120925A
Application number: TW109127505A
Authority: TW
Inventors: 海科舒斯特; 麥克胡特; 湯尼文史恩克; 賽巴斯汀邦克; 奧利佛史古兒; 林納斯巴克特; 馬丁霍夫曼; 金斯弗里切; 菲力士尤佛多本; 濟斯拉施馬克; 福洛里安薩羅彼亞塔
Original assignee: 德商英麥提克生物技術股份有限公司
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2020-08-13
Publication date: 2021-06-01
Also published as: WO2021028503A1; AU2020330717A1; EP4014043A1; CL2022000352A1; WO2021028503A8; CR20220065A; MX2022001869A; CN114375397A; CA3150546A1; US20210048442A1; BR112022002699A2; CO2022001531A2; JP2022547794A; IL289209A; KR20220044485A; PE20220564A1

Abstract

本發明涉及透過例如質譜法和被識別肽空間分析表徵肽：MHC結合多肽的方法，即為了鑒定在MHC提呈的情況下可以結合的肽以及不能結合的肽。

Description

肽：MHC結合多肽的表徵方法

本發明涉及表徵肽：MHC結合多肽的方法，例如，透過質譜法和被識別肽空間分析，即為了鑒定在被 MHC提呈的情況下可以被結合以及不能被結合的肽。

免疫治療已在腫瘤學領域發揮了重要作用，並已證明在治療不同類型腫瘤方面具有重要價值。免疫治療的範圍從嵌合抗原受體(CAR)、擴增性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)和T細胞受體(TCR)轉導效應細胞。不同研究成功地利用了TCR工程改造T細胞來增強患者對惡性腫瘤的適應性免疫反應，從而證明其具有強效抗腫瘤反應性。但是，基因修飾T細胞抗癌療效的大幅提高卻以增強毒性為代價。

當轉導T細胞群意外攻擊預期抗原以外的抗原或獨立於其特異性激活自身時，會發生脫靶毒性。

US 2018/0125889提示，可對γ-δT細胞進行改造以表達抑制性CAR，從而最小化脫靶細胞（例如，非腫瘤細胞，其中細胞表面靶標為腫瘤相關抗原，而非腫瘤特異性抗原）的激活。WO 2018/053374描述了一種可預測或研究T細胞、TCR或TCR樣分子的毒性和/或脫靶效應的T細胞表位篩選方法，該方法包括使改造靶細胞或改造靶細胞群與T細胞、TCR或TCR樣分子接觸，並進行測定以確定T細胞、TCR或TCR樣分子是否與改造靶細胞或改造靶細胞群結合和/或測量任何此類結合的強度。

Bijen等人(Bijen et al., 2018)發現不表達HA-2抗原的人成纖維細胞和角質形成細胞的7B5 T細胞克隆可識別脫靶。Bijen等人公開了一種組合肽庫掃描法，以鑒定被7B5 T細胞克隆識別的脫靶肽，即CDH13衍生肽。

仍然需要降低免疫治療的脫靶毒性。

MHC分子有兩類：MHC I或II，在大多數有核細胞上均可找到。MHC分子分別由一條α重鏈和β-2-微球蛋白（MHC-I類受體）或一條α和一條β鏈（MHC-II類受體）組成。其三維構形形成一個結合槽，從而允許與特定的肽發生非共價相互作用。

MHC I類受體提呈主要為內源性的蛋白、缺陷核糖體產物(DRIP)和較大肽蛋白裂解生成的肽。MHC II類受體主要發現於專業抗原提呈細胞(APC)上，並且主要提呈在內吞作用過程中被APC攝入並且隨後被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。

肽和MHC I類分子的複合體由負載適當T細胞受體(TCR)的CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞進行識別，而肽和MHC II類分子的複合體由負載適當TCR的CD4陽性輔助T細胞進行識別。在此識別過程中，已熟知TCR、肽和MHC按1:1:1的化學計算量而存在並形成複合體。

肽要觸發（引發）細胞免疫反應，必須與MHC分子結合。這一過程依賴於MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態性。MHC-I類-結合肽的長度通常為8-12個氨基酸，並且在其與MHC分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含至少兩個保守殘基（「錨定殘基」，AR）。這樣，每個MHC等位基因都有一個結合基序，可控制肽與結合溝槽特異性結合的能力。然而，如上所述，在MHC-I類依賴性免疫反應中，肽不僅必須能與腫瘤細胞表達的某些MHC-I類分子結合，而且它們還必須能被負載特異性T細胞受體(TCR)的T細胞識別。腫瘤特異性細胞毒性T 淋巴細胞所識別的抗原（即它們的表位）可以是源自所有蛋白類型的分子（肽），如酶、受體、轉錄因子等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達上調。

當前正在開發的許多癌症免疫治療依賴於將肽：MHC結合多肽以可溶多肽分子的方式給予或將表達此類多肽為膜結合分子的細胞（優選為T細胞）轉移給受試者。

儘管此類肽：MHC結合多肽的實際靶肽序列通常已經確定/定義，但可能仍存在未知數量的其他肽是這些分子可以與之結合的。這些所謂的「脫靶肽」由於存在潛在的嚴重副作用而對體內應用構成重大的安全性風險。造成這些副作用的原因通常是因為在癌症組織以外的健康組織上提呈這些脫靶肽，並且之前已經報告了相應的致命結果（例如，參見(Linette et al., 2013)）。

此外，還有一些案例報告指出：在給予用某些未經優化的T細胞受體轉導的T細胞(van den Berg et al., 2015)以及用靶向作用於Mage-A4和Mage-A10的受體轉導的T細胞（適應性免疫產品 ADP-A2M4和ADP-A2M10）後，出現問題和可能致命的嚴重不良事件。

因此，關於鑒定這些脫靶肽及其安全相關性的準確知識對於正確開發涉及肽：MHC結合多肽的癌症免疫治療來說具有最高相關性。

當前鑒定此類肽的策略包括在蛋白質序列數據庫中搜索與靶肽相似的肽。根據所應用的搜索參數，這些方法通常可產生大量潛在的上萬種肽，所有這些肽都需要用下游測定法進行測試，以瞭解它們與相應肽：MHC結合多肽結合的可能性。透過整合來自肽：MHC結合多肽的其他特徵（例如突變掃描數據）對這些搜索進行修改，可以潛在減少需要用下游測定法測試的肽數量，但仍然無法提供在生理環境下MHC分子是否提呈這些肽的有關資訊，因此，仍對體內應用造成相當大的安全性風險。

另外，所有這些方法都需要基於突變掃描數據作出如何評估與靶序列的相似性或肽序列的某些位置可耐受哪些氨基酸的某些假設。不滿足這些假設的肽，例如，因為它們與MHC分子或肽：MHC結合多肽的結合方式與靶肽序列的結合方式不同，因此，無法透過這些方法進行鑒定。這與長度與靶肽不同的肽特別相關（例如，來自十聚體靶肽的九聚體脫靶肽），這些肽可能顯示與靶序列無關的完全不同的氨基酸序列(Ekeruche-Makinde et al., 2013)。

鑒於上述情況，本領域需要有效的方法來鑒定TCR的靶表位，其目的是盡量接近體內情況。此外，這還需要鑒定與在分析中的TCR（或TCR樣分子）發生交叉反應的「脫靶」表位，以便可開發出不僅具有高度特異性而且不靶向作用於正常健康組織的治療藥劑。

因此，非常需要提出一種替代性而且更直接的方法，以避免對可能數百至數千可能的脫靶肽使用不準確的預測演算法和繁瑣測試，從而鑒定肽：MHC結合多肽所結合或識別的相關MHC結合肽。因此，本發明的目的是提出一種表徵肽：MHC結合多肽的方法，以便鑒定可被這些分子以全面且直接的方式結合的脫靶肽（即，MHC提呈的配體）。技術人員在研究本發明的以下說明時，本發明的其他目的和優勢將變得明瞭。

在本發明的第一方面，本發明的目的透過一種用於表徵包含至少一個定義的肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽）與肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）結合的方法來解決，其包括： a)提出包含至少一種肽：MHC複合體的待分析樣本， b)將所述樣本與所述多肽分子（「pMHC結合多肽」）接觸，並允許所述多肽分子的所述至少一個肽結合結構域與所述至少一種肽：MHC複合體結合， c)分離與所述至少一個肽結合結構域結合的所述至少一種肽：MHC複合體，和 d)鑒定按步驟c)中所分離的所述至少一種肽：MHC複合體的所述肽，從而鑒定所述多肽分子與所述至少一種肽：MHC複合體的所述肽的結合。

在一實施方案中，所述肽結合結構域的氨基酸序列是或衍生自T細胞受體(TCR)、T細胞受體樣多肽和/或抗體或其僅結合結構域。

本文所用的術語「包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子」與術語「pMHC結合多肽」可互換使用。

此類pMHC結合多肽為：例如，本文其他地方公開的抗體或其功能片段或衍生物，或T細胞受體（本文也稱為「TCR」），優選為本文其他地方公開的可溶性T細胞受體或其功能片段或衍生物。

結合多肽內的術語「定義肽結合結構域」系指，例如，抗體的重鏈和輕鏈可變結構域或TCR的α和β亞單位可變結構域。

結合多肽內的術語「定義肽結合結構域」也可指抗體或TCR的至少一個可變結構域的至少一個互補決定區（本文也稱為「CDR」）。本文所用的肽：MHC複合體中的術語「肽」與術語「靶肽」可互換使用。

術語「肽：MHC複合體」可縮寫為「pMHC複合體」，甚或「pMHC」。

如請求項方法中的一實施方案，所述多肽分子任選地附著於基質材料，和/或其中所述多肽分子進一步包含至少一個與基質材料結合或與之附著的附著位點。

重要的是提及，此實施方案僅涉及所述方法本身，其中表徵所述多肽分子的例如交叉反應性。本文其他地方所討論的多肽分子本身可為可溶性的。

根據一實施方案，表徵多肽分子與肽：MHC複合體的肽的結合包括鑒定多肽分子與肽：MHC複合體的所述肽結合。

在另一優選方面，本公開提出了用於鑒定脫靶肽：MHC複合體的脫靶肽的方法，所述脫靶肽：MHC複合體的脫靶肽能夠與定義的T細胞受體(TCR)和/或抗體肽結合結構域結合，該方法包括例如： a)提出樣本（例如，細胞裂解物），其包含脫靶肽：MHC複合體，其中所述樣本不一定包含定義所述肽結合結構域的肽結合特性的靶肽：MHC複合體， b)親和力純化所述樣本，包括將所述樣本與任選地偶聯或附著於基質材料的多肽接觸，其中所述多肽包含與所述靶肽：MHC複合體結合的至少一個肽結合結構域，並且其中所述多肽為與所述靶肽：MHC複合體的靶肽結合的T細胞受體(TCR)和/或抗體， c)分離與所述至少一個肽結合結構域結合的所述脫靶肽：MHC複合體，和 d)鑒定按步驟c)中所分離的所述至少一種脫靶肽：MHC複合體的所述脫靶肽。

在本發明背景下，所述樣本可選自任何包含至少一種待分析的肽：MHC複合體的合適天然或人工樣本（例如，細胞裂解物），或包含純化或富集的肽：MHC複合體的樣本。肽：MHC複合體的組成/性質以及分子的濃度/含量可以是已知的，也可以是未知的。樣本的一個實例為肽：MHC複合體的文庫，其中，結合肽的序列進行了定義和/或其長度和氨基酸序列相似。

在一實施方案中，包含所述至少一個肽結合結構域的多肽分子不包含另一種結合特異性，即，其對肽或肽：MHC複合體是單特異性的。

根據本發明方法的不同實施方案中，包含所述至少一個肽結合結構域的多肽分子選自雙特異性、三特異性、四特異性或多特異性分子。

本發明方法背景下術語「雙特異性」系指對兩種不同抗原具有至少兩種效價和結合特異性的多肽分子，因此包括兩個抗原結合位點。根據本發明所述，那些抗原結合位點之一為定義肽結合結構域。術語「效價」系指抗多肽分子的結合位點數量，例如，二價多肽涉及具有兩個結合位點的多肽。應注意的是，術語效價系指結合位點的數量，其中那些結合位點可以與相同或不同的靶標結合，即，二價多肽分子可以為單特異性（即，與一個靶標結合），也可以為雙特異性的（即，與兩個不同的靶標結合）。

在這種情況下，肽：MHC結合多肽是能夠將所述分子與特異性/定義的肽：MHC複合體相結合或介導它們結合的T細胞受體(TCR)、T細胞受體樣多肽和/或抗體或這些分子的片段，或衍生自T細胞受體(TCR)、T細胞受體樣多肽和/或抗體或這些分子的片段。

所述至少一個肽結合結構域可以為選自以下的分子，或衍生自選自以下的分子：抗體、同時多重相互作用T細胞銜接(SMITE)雙特異性抗體、雙特異性T細胞銜接抗體(BiTE)、scFV、雙抗體、雙重親和力重靶向抗體(DART)、串聯抗體(TandAb)、可溶性TCR、scTCR、突變TCR，例如包含S橋、截短TCR和雙特異性T細胞受體(TCR)-抗體融合分子。

在一實施例中，至少一個肽結合結構域可以為抗體或衍生自抗體。

在本發明背景下，「定義的」或「定義」肽：MHC結合多肽應指在MHC背景下與所選擇的（「被靶向」）MHC肽結合的多肽（由結合結構域構成或包含結合結構域）。在一優選實施方案中，與其他（已知）MHC肽相比時，肽：MHC結合多肽與所選 MHC肽的所述結合以最高的親和力和/或選擇性發生。

本發明背景下使用的實施例為實施例1、3、4和5中顯示對PRAME-004肽SLLQHLIGL(SEQ ID NO: 1)具有親和力的定義肽：MHC結合多肽，以及實施例2中顯示對具有序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO. 24)（在本文中也稱為MAGEA4/8肽）的MAGEA4/A8衍生肽的親和力增強的定義肽：MHC結合多肽，。

定義肽：MHC結合多肽的結合可包括在MHC背景下與靶肽結合或與靶肽和MHC多肽兩者都結合。

儘管近年來描述了篩選針對肽配體的TCR和TCR樣分子的一些方法，但是迄今為止，這些方法取得的成功有限。例如，Birnbaum等人開發了~2.1 x 108個抗原小基因的肽：MHC（「pMHC」）酵母展示文庫(Birnbaum et al, 2014)。使用Birnbaum的系統，與可溶TCR結合的細胞用磁珠進行純化，然後進行高通量測序。經過四輪選擇，鑒定出數百種與五個不同小鼠TCR交叉反應的肽。但是，未檢測出已知與TCR結合的原始表位。

本發明優選使用肽：MHC結合多肽，以便從有機分子的混合物中分離或富集特定的肽：MHC分子，所述有機分子如：肽和蛋白質（例如，由組織或細胞系產生的蛋白裂解物、重組產生的肽：MHC分子的文庫），然後例如進行質譜分析從而分析分離的肽：MHC分子並鑒定結合肽的序列。

與稱為「脫靶預測方法」的現有技術方法相比，本方法具有許多優點。

為了實際鑒定脫靶結合劑，在預測方法中，結合劑基序用於預測大量的肽，然後進行費力的體外測試。在本發明中，可以用樣本（如，細胞裂解物）直接鑒定。這不需要在體外測定中對預測肽進行繁瑣測試。此外，發現該方法具有高度靈敏性，因此甚至可以鑒定出被較弱交叉識別的肽。

在預測方法中，不可能鑒定出未知脫靶識別的來源。相反，本發明可以透過產生樣本（例如，裂解物）並在肽：MHC結合多肽的親和層析實驗中使用所述裂解物而實現。

在預測方法中，結合劑基序的產生由位置掃描數據推斷出，而在本發明中，由鑒定的脫靶推斷出，並進一步考慮了肽氨基酸序列不同位置處的多重取代，而無需事先進行體外測試。

另外，本發明方法不限於分析特定的HLA同種異型（例如，HLA-A*02:01），還可用於鑒定不同HLA同種異型提呈的脫靶。這些同種反應性很難用當前可用的標準方法來評估，且不適合作為預測方法。

最後，關於肽序列的長度變異和修飾，在預測測定中，無法預測長度變異或天然存在的肽修飾，而本測定法可直接鑒定所有長度變異和天然存在的肽修飾，例如，磷酸化和糖基化。

在一實施方案中，本方法可特異性和可靠地鑒定出肽：MHC結合多肽所結合的肽，包括富集或分離衍生自生物樣本或生物技術產生的肽：MHC分子混合物中被所述肽：MHC結合多肽識別的肽：MHC分子，以及透過例如質譜分析法鑒定出富集/分離的肽：MHC分子，以及隨後測試鑒定肽在體外被同一肽：MHC結合多肽結合的可能性。

優選的為根據本發明所述的方法，其中包含與肽：MHC複合體結合的所述至少一個肽結合結構域的所述多肽分子選自雙特異性、三特異性、四特異性或多特異性分子。

進一步優選的為根據本發明所述的方法，其中包含所述至少一個肽結合結構域的所述多肽分子是包含衍生自T細胞受體(TCR)的肽結合結構域的雙特異性分子。

另一方面，包含與靶肽：MHC複合體結合的所述至少一個肽結合結構域的多肽可以是包含衍生自T細胞受體(TCR)的結合結構域的雙特異性分子。

在其他方面，本文描述的方法可進一步包括選擇結合特性上不同的一組多肽。

有利情況是，獨立項所述的本發明方法不一定需要透過以下過程來確定結合基序：在靶肽的各位置處取代單個氨基酸，隨後用功能測定法測試對這些肽變體的識別，然後基於所述結合基序、利用人蛋白質組數據庫預測潛在的脫靶，隨後按如上所述用體外測定法測試這些（潛在的）大量肽。

在另一方面，與基於預測的方法相比，本文所述的方法著重於透過合適的HLA同種異型在生物樣本上提呈的相關肽優選地使鑒定出的脫靶肽數量減少至少2倍，優選為至少5倍，最優選為至少10倍，如上文所述並參見本文的比較例。

另一方面，所述至少一個結合結構域可能包含可檢測的標誌物或標記。

根據本發明的一實施方案所述，所述肽：MHC結合結構域的交叉反應性透過至少一項細胞毒性實驗進一步探索。這可透過例如負載相應肽的T2細胞完成，所述負載相應肽的T2細胞在存在指定濃度的PRAME-004特異性肽：MHC結合多肽的情況下與人CD8+ T細胞（50,000個細胞/孔）共孵育（參見圖4和本文其他地方的相應描述）。

本發明還可涉及一種套件，其包含用於實施該方法的材料，包括：a)諸如本文所述的基質材料等材料，以及b)包含與靶肽：MHC複合體結合的至少一個結合結構域的多肽。

本發明進一步涉及包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽」），其中其與肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）的結合用如請求項1至29中任一項中所述的方法進行表徵。

本文其他地方方法背景下所討論的此類多肽分子可以為抗體或T細胞受體或修飾形式。

本文其他地方方法背景下所討論的此類多肽分子可以為單特異性、雙特異性或多特異性。

本文其他地方方法背景下所討論的此類多肽分子可以為可溶的。

此類多肽分子對肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）或肽：MHC複合體的親和力KD可以為＜ 500 nM。

所述方法背景下討論的多肽分子的所有優選實施方案在此也適用，並且出於經濟原因將不再重複。

本發明進一步涉及一種製造表達靶特異性抗原識別構建體的細胞群的方法，包括提供宿主細胞、提供包含編碼第二多肽的編碼序列的靶特異性抗原識別構建體、將所述靶特異性抗原識別構建體引入所述宿主細胞、以及透過宿主細胞來表達所述靶特異性抗原識別構建體。另一方面，表達可包括將抗原識別構建體提呈至細胞表面上。

另一方面，靶特異性抗原識別構建體可以是包含與所述編碼序列可操作地連接的啟動子序列的表達構建體。再一方面，靶特異性抗原識別構建體可來源於哺乳動物，任選地來源於人。靶特異性抗原識別構建體可以進一步為修飾的TCR，其中所述修飾包括添加包含標記的功能結構域或包含膜錨定結構域的可選結構域。

另一方面，靶特異性抗原識別構建體可以為α/β TCR、γ/δ TCR或單鏈TCR(scTCR)。另一方面，靶特異性抗原識別構建體可透過逆轉錄病毒轉導被引入所述合適的宿主細胞。再一方面，本文所述的方法可進一步包括從宿主細胞分離和純化靶特異性抗原識別構建體，以及任選地在T細胞中重建靶特異性抗原識別構建體。

一方面，本發明涉及透過本發明的方法產生的細胞群，特別是T細胞群。

透過本發明方法產生的靶特異性抗原識別構建體和細胞（特別是T細胞）預期可在疾病治療中顯示改善特性，其中所述治療包括免疫治療。由於本方法模擬更接近/更類似於體內情況這一事實，因此遇到的脫靶效應和副作用將較少。這對醫學和臨床運用有好處；在對源自HLA-A*02:01轉基因小鼠免疫的改良型抗MAGE-A3 TCR進行測試的臨床試驗中，九名癌症患者中有兩人出現致命的靶向神經毒性，原因是識別出一種源自大腦中表達的同一基因家族的肽(Morgan et al., 2013)。

另一項試驗中，在骨髓瘤和黑色素瘤患者中測試親和力增強的抗MAGE-A3 TCR時，兩名患者因識別完全不同的肽引起脫靶毒性導致嚴重的心肌損傷而死亡(Linette et al., 2013; Raman et al., 2016)。這些臨床病例顯示，預測未經最佳胸腺選擇的TCR的確切特異性以及由此產生的影響是多麼的困難。制定策略以廣泛驗證TCR的確切特異性至關重要，尤其是因為TCR改造T細胞具有高度敏感性(Stone and Kranz, 2013; Jahn et al., 2016)。

另一方面，本發明涉及一種治療患有癌症患者的方法，包括向所述患者給予包含上述細胞群的組合物，其中所述癌症選自非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、腎細胞癌、腦癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌(HCC)、胰腺癌、攝護腺癌、白血病、乳腺癌、梅克爾細胞癌、黑色素瘤、卵巢癌(OC)、膀胱癌、子宮癌、膽囊和膽管癌、食道癌(OSCAR)、急性髓細胞性白血病、膽管細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、膠質母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、非霍奇金淋巴瘤和子宮內膜癌。

另一方面，宿主細胞可能獲得自患者。另一方面，宿主細胞可能獲得自健康供體。另一方面，宿主細胞可以為CD8+ T細胞。

另一方面，MHC分子可以為MHC I類分子。另一方面，MHC分子可以為HLA-A*02分子。

優選的為根據本發明的方法，其中所述多肽分子包含至少一個第二結合結構域，該第二結合結構域選自與已知誘導免疫細胞激活的細胞表面分子結合的結構域，或選自由免疫反應相關分子所組成的群，優選為與CD3或其一個鏈（例如：CD3γ、CD3δ和CD3ε鏈）、TCRγ/δCD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD18、CD22、CD25、CD28、CD32a、CD32b、CD33、CD41、CD41b、CD42a、CD42b、CD44、CD45RA、CD49、CD55、CD56、CD61、CD64、CD68、CD94、CD90、CD117、CD123、CD125、CD134、CD137、CD152、CD163、CD193、CD203c、CD235a、CD278、CD279、CD287、Nkp46、NKG2D、GITR、FcεRI、TCRα/β、TCRγ/δ和HLA-DR結合的第二結合結構域。

根據一實施方案，包含所述至少一個肽結合結構域的多肽分子為可溶性分子。本文其他地方所討論的此類可溶性多肽分子（例如抗體、T細胞受體或其衍生物）為優選治療方式。

根據一實施方案，所述多肽分子對肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）或肽：MHC複合體的親和力KD為＜ 100 nM。

KD為解離常數，即平衡常數，其度量靶標-結合劑複合體可逆分離（解離）的傾向。一種確定KD的方法為表面等離子體共振(SPR)。

優選情況為，多肽分子對肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）或肽：MHC複合體的親和力KD為＜ 100 nM、＜ 50 nM、＜ 20 nM、＜ 10 nM、＜ 5 nM、＜ 2 nM、＜ 1 nM、＜ 500 pM、＜ 400 pM、＜ 300 pM、＜ 200 pM、＜ 100 pM、＜ 50 pM、＜ 20 pM、＜ 10 pM或＜ 1 pM。最優選的範圍為10 nM至500 pM。

在根據本發明所述方法的另一方面，結合於或附著於所述基質材料的所述附著位點位於至少一個結合結構域、至少一個第二域或為單獨的附著基團，並且基本上不干擾所述分子的結合。

優選的是根據本發明所述的方法，其中在將所述肽：MHC結合多肽與固體基質偶聯之後，透過親和層析法或免疫沉澱法來分離肽：MHC分子。

優選的是根據本發明所述的方法，其中所述基質材料選自瓊脂糖凝膠(Sepharose^® )或瓊脂糖(agarose)。但是，結合也可發生於沒有固體基質的溶液中（作為批次），並且可以使用例如抗體、沉澱、過濾等適當分離複合體。

另一方面，所述方法可進一步包括使步驟b)和/或c)的所述樣本與一或多個其他結合結構域分子（例如，廣泛的特異性TCR和/或抗體）接觸。

此類廣泛的特異性結合結構域分子優選為對一個或多個MHC分子單獨具有結合特異性的結合結構域分子，無論該一個或多個MHC分子所結合的肽為何。此類結合分子在本文中稱為具有MHC泛特異性。

在本方法的一實施方案中， (i)使樣本的第一部分與pMHC結合多肽接觸，並且 (ii)使樣本的第二部分與另一種pMHC結合多肽或MHC泛特異性結合分子接觸其中進一步地，在分離出與pMHC結合多肽和另一種pMHC結合多肽或MHC泛特異性結合分子結合的肽：MHC複合體後，比較兩個部分中獲得的分離效率。

例如，這可透過合併以不同結合分子平行進行相應分離的質譜數據集來實現。如實施例2所示，每種鑒定的肽的定量數據可比較不同pMHC結合多肽之間或pMHC結合多肽與MHC泛特異性結合分子之間的肽分離效率。

這使之能夠透過計算肽：MHC結合多肽和廣泛特異性TCR或抗體的倍數變化/富集因子來校正所分析生物樣本中每種肽的天然豐度和任何非特異性結合。

在此方法的一實施方案中，在步驟b)或c)中，使用了大量超量的pMHC結合多肽和任選地MHC泛特異性結合分子。這樣，每種肽的回收不受可用結合位點數量的限制。

在此方法的另一實施方案中，如實施例3所示，基於分離效率的比較，確定了第一和第二部分中使用的結合劑（結合多肽或結合分子）與樣本中不同肽的結合親和力。

發明人驚訝地發現，MHC泛特異性結合分子（例如，抗體BB7.2和pMHC結合多肽）之間各個肽的回收率（＝接觸和分離）和pMHC結合多肽與這些肽（靶標和脫靶）的結合親和力相關，如透過生物層干涉測量法進行的比較實驗所示（在此情況下為Octet測量；參見圖12，後者表示為灰度著色；以及圖13）。

因此，優選情況為，分離可包括使肽：MHC複合體與針對MHC分子的泛特異性抗體接觸。另一方面，所述抗體可以是選自W6/32、B1.23.2、BB7.2、GAP-A3、Spv-L3、Tü39、L243或IVD-12中的至少一種。進一步優選的方法包括：將所述肽：MHC分子與針對肽：MHC分子的MHC組分的廣泛特異性（或多特異性或非特異性）肽：MHC結合多肽並行分離，從而使與某種MHC同種異型結合的所有肽都分離，不論結合肽的肽序列的性質如何（圖1）。如上所述，此類廣泛特異性肽：MHC結合多肽可以是（但不限於）抗體，例如，HLA-A*02泛特異性抗體BB7.2或泛HLA-A,B,C特異性抗體W6/32。表1列出了其他小鼠雜交瘤衍生抗體以及對人MHC分子的相關泛特異性。

表1：對所示HLA同種型具有特異性的常用小鼠雜交瘤衍生抗體的概述

克隆	特異性	參考
W6/32	HLA-A,B,C	(Barnstable et al., 1978)
B1.23.2	HLA-B,C	(Rebai et al., 1983)
BB7.2	HLA-A*02	(Parham and Brodsky, 1981)
GAP-A3	HLA-A*03	(Berger et al., 1982)
Spv-L3	HLA-DQ	(Spits et al., 1983)
Tü39	HLA-DR, DP, DQ	(Maeda and Hirata, 1984)
L243	HLA-DR	(Lampson and Levy, 1980)
IVD-12	HLA-DQ	(Kolstad et al., 1987)

合併並行執行的各分離的質譜數據集可得出每種鑒定出的肽的定量數據，從而可比較不同肽：MHC結合多肽之間或肽：MHC結合多肽與廣泛的特異性TCR或抗體之間的肽分離效率，如實施例2所示。這使之能夠透過計算肽：MHC結合多肽和廣泛特異性TCR或抗體的倍數變化/富集因子來校正所分析生物樣本中每種肽的天然豐度和任何非特異性結合。

進一步優選的方法包括肽的分離，該分離的方式包含從肽：MHC分子的混合物中分離和去除非特異性結合的肽的額外步驟，該肽：MHC分子的混合物與例如分離程序中所用的材料表面結合。此類步驟可以由另一種親和色譜柱構成，其包含固體基質（例如，Sepharose^® 、瓊脂糖），但不含肽：MHC結合多肽，並且在各自肽：MHC結合多肽分離步驟之前將肽：MHC分子混合物施加至其上（見圖1）。隨後對這些非特異性結合的肽進行提取（洗脫）和透過質譜鑒定法可以對其進行鑒定，並可以在進一步的分析中排除這些肽。

優選的為根據本發明所述的方法，其中，步驟d)中的所述鑒定包括選自質譜分析和肽測序的方法。

根據本發明所述方法的一實施方案，表徵多肽分子與肽：MHC複合體的肽的結合包括鑒定所述肽：MHC結合結構域的上位結合基序。

圖7、相應的描述以及實施例1中提供了有關如何完成此操作的詳細資訊。

根據本發明所述方法的一實施方案，表徵多肽分子與肽：MHC複合體的肽的結合包括 a)鑒定所述肽：MHC結合結構域的多肽分子的基於位置和/或上位的結合基序，和/或 b)使用由本申請鑒定的肽來鑒定肽：MHC結合結構域的多肽分子之脫靶肽。

根據本發明所述方法的一實施方案，表徵多肽分子與肽：MHC複合體的肽的結合包括探索和/或鑒定所述肽與其他肽：MHC結合結構域的交叉反應性。

本文所用的術語「上位結合基序」用於描述哪些氨基酸在肽序列的哪個位置被耐受，同時仍保持與肽：MHC結合多肽的結合。

本文所用的術語「基於位置的結合基序」用於描述結合肽的氨基酸序列中的哪些位置與肽：MHC結合多肽的相互作用有關。

本文所用的術語「脫靶肽序列」涉及能夠與給定肽：MHC結合多肽結合的肽序列，儘管其序列與最初設計或選擇的肽：MHC結合多肽的肽序列有偏離。因此，如果此類脫靶肽序列顯示於，例如，健康非癌性組織上，則存在肽：MHC結合多肽將表現出對健康組織的細胞毒性活性（「腫瘤外/脫靶」毒性）的風險。

圖7和圖12至15、相應的描述以及所提出的實施例中提供了有關如何完成此操作的詳細資訊。進一步優選的為根據本發明所述的方法，其中，所鑒定的肽序列用於推斷肽：MHC結合多肽結合特徵的相關資訊。此類資訊可用於例如產生肽：MHC結合多肽的結合基序。這些結合基序常用於描述結合肽的氨基酸序列中的哪些位置和與肽：MHC結合多肽的相互作用有關（「基於位置的結合基序」），另外在肽：MHC結合多肽仍保持結合的情況下，肽序列的哪些位置可耐受哪些氨基酸（「上位結合基序」）。對鑒定肽的氨基酸序列進行分析並且如果存在於肽序列的選定位置中，則促進產生這些結合基序。後者可以進一步用於例如，根據蛋白質序列數據庫，以結合基序中包含的資訊作為搜索標準對安全相關脫靶進行預測。

優選的為根據本發明所述的方法，其中，透過質譜法實現序列鑒定，方式為：在分離步驟之後，在所鑒定的序列匹配中以最高的靈敏度和高置信度，對包含的所有肽序列進行全面的定量鑒定。

在本發明背景下，可以優選應用下列的其中一種技術和方法： a)任何數量的不同質譜儀和質譜碎片化技術（例如，碰撞誘導解離(CID)、表面誘導解離(SID)、電子捕獲解離(ECD)、高能C-阱解離(HCD)、電子轉移解離(ETD)、負電子轉移解離(NETD)、電子脫離解離(EDD)、紅外多光子解離(IRMPD)、黑體紅外輻射解離(BIRD)、電子轉移/更高能量碰撞解離(ETHCD)、紫外光解離(UVPD)、電子轉移和碰撞誘導解離(ETCID)）或激活能量的特定用途或組合，以便達到更好的肽串聯MS(MS/MS)光譜序列覆蓋。 b)數據依賴採集(DDA)和數據獨立採集(DIA)模式的質譜實驗。這可進一步包括採用肽序列預定義列表的特定採集策略（靶向分析）或其他方法，例如所有理論性質譜圖(SWATH)分析的順序視窗採集法。 c)在質譜分析之前或直接偶聯進行質譜分析，透過例如 HPLC（例如，納米UHPLC以乙腈溶於水的梯度運行）對肽混合物進行預分離。 d)重複測量相同的肽混合物，以便進行更可靠的統計學評估。 e)使用不同的搜索引擎（例如，MASCOT、Sequest、Andromeda、Comet、XTandem、MS-GF+）或使用上述搜索引擎之一以及從頭序列鑒定演算法的軟體工具對MS/MS頻譜進行搜索。 f)進一步使用MS/MS頻譜預測的計算工具進行搜索，例如 pDeep(Zhou et al., 2017) g)針對不同的蛋白質序列數據庫（例如，UniProtKB、IPI）以及為了特定目的而生成的自定義序列數據庫（例如，從mRNA序列翻譯而來的蛋白質序列）對MS/MS頻譜進行搜索。 h)對有疑問的合成肽進行質譜測量，以透過比較肽特定特徵（例如，其MS/MS頻譜及其在HPLC柱上的保留時間）來確認其身份。 i)MS/MS頻譜搜索，涉及先前鑒定的MS/MS頻譜數據庫（例如，頻譜文庫或頻譜檔案）。透過比較新記錄的MS/MS頻譜與已鑒定肽序列的各MS/MS頻譜，此數據庫可用於肽鑒定過程。 j)i)中所述的任何數據庫，進一步存儲有關已鑒定肽的實驗或預測保留時間(RT)的資訊，從而有助於鑒定過程 j)例如，透過使用適當的演算法（例如，SuperHirn）提取和整合MS特徵從而對MS或MS/MS層級上的肽信號面積進行定量評估(Mueller et al., 2007)。

優選的為根據本發明所述的方法，其進一步包括鑒定所述肽(said peptide or peptides)在癌性和/或非癌性細胞或組織上提呈的步驟。

此類鑒定包括在癌性或非癌性組織中鑒定結合基序以及本文其他地方所公開的鑒定脫靶肽序列。

為此，可分析來自癌性和非癌性組織樣本的細胞上展示的肽：MHC複合體。

執行此操作的一種方法為分離整個肽：MHC複合體（「免疫肽組」），例如透過免疫親和力捕獲法。然後，可透過例如酸變性將所展示的肽與MHC解離。然後透過HPLC提取肽產物並將其分離為級分，之後使用LC-MS/MS鑒定這些級分中的肽序列。透過此類方法，可從廣泛的細胞類型（包括癌細胞和感染細胞以及組織中的細胞）中鑒定出數千種肽。

然後將由此獲得的肽序列輸入數據庫，注釋癌細胞和/或非癌細胞或組織上是否有相應肽。然後可對此類數據庫進行全部掃描，以瞭解對應於按本文其他地方所述鑒定的結合基序或上位基序的肽的提呈情況。

尤其在WO2005076009、WO2011128448和WO2016107740中公開了實現此目的的方法和方案，其內容透過引用併入本文，並且全部轉讓給本申請人。

因此，本發明的方法可還包括透過應用以下任何一種技術進行進一步研究從而評估鑒定的肽與引起脫靶毒性的相關性，所述技術包括但不限於： i)分析所述脫靶肽的源基因在不同正常或癌組織以及細胞系上的基因表達特徵； ii)分析所述脫靶在不同正常或癌組織以及細胞系上的肽提呈特徵；和 iii)分析所述脫靶在不同正常或癌組織以及細胞系上的每細胞肽拷貝數。

根據本發明方法的另一重要方面，所述方法進一步包括對所述鑒定和/或脫靶結合進行計算分析的步驟，特別是在進一步修飾本文所公開的所述肽：MHC結合多肽的製備中。各計畫均是本領域技術人員所熟知的。

根據本發明，如果透過該方法鑒定脫靶肽，則可以適當改變肽：MHC結合多肽，以減少與這些脫靶肽的結合。此類改變包括修飾肽：MHC結合多肽的氨基酸序列（特別是在幾輪成熟過程中），以改善肽：MHC結合多肽的特異性。因此，可顯著提高新產生分子的特異性，如圖2中透過減少對靶標陰性細胞系T98G的殺傷示例所示。肽：MHC結合多肽各自成熟的方法為技術人員已知，具體地包括肽：MHC結合多肽的變化，例如：TCR的六個互補決定區(CDR)。類似地，可相應地修飾抗體的CDR（參見，例如，Smith et al., 2014, Stewart-Jones et al., 2009；US 2014-0065111A1；WO 2017/174823A1；WO 2016/199141以及WO 2012/013913）。

因而優選的為根據本發明所述的方法，其中，肽：MHC混合物從其中衍生的所述生物樣本選自一種或幾種癌細胞系，其可單獨分析或在所述方法的分離步驟中合併分析。圖3 基於XPRESIDENT^® 數據圖示了合併幾種細胞系如何增加正常組織肽空間的覆蓋率，這可透過選擇用於生成樣本的幾種細胞系採用這種方法直接解決。技術人員可能還希望合併MHC表達強的幾種細胞系，或以某種方式修飾此類細胞系，例如：透過用目的基因進行轉染或病毒轉導或用某種物質或化合物（例如干擾素γ）進行處理，從而增加或修飾MHC表達，以此增加或修飾由MHC分子在此類細胞系中提呈的不同肽的數量。這些基因可以是但不限於特定的MHC I類或II類基因（例如，HLA-A*02、HLA-DRB3）、參與MHC肽加工和提呈的基因（例如，TAP1/2、LMP7）或能夠誘導或修飾細胞基因表達的轉錄因子（例如，AIRE）。

進一步優選的為根據本發明所述的方法，其中，肽：MHC混合物從其中衍生的所述生物樣本選自一種或幾種健康供體的原生正常組織樣本或血液以及來自癌症患者的腫瘤組織或感染組織。特別相關的是正常組織或衍生自這些組織或特定身體腔室的分離細胞，在這些組織上交叉識別肽時，具有發生致命不良事件的高風險。此類正常組織或從其分離的細胞可以是但不限於：腦組織、心臟組織、血液、肺組織、脊髓、神經組織或肝組織。

所有生物樣本可以是新鮮的也可以是處理的（如：冷凍或製備），只要它們仍然適用於根據本發明所述的方法即可。一方面，生物樣本可以包括組織、器官、細胞、蛋白質或細胞的膜提取物、血液或生物液體，諸如，從受試者身上獲得的血液、血清、粘液、尿液、腹水或腦液。

根據本發明方法的一實施方案，所述方法進一步包括向步驟a)中的所述樣本添加至少 • 一種具有已知序列的肽和/或 • 一種定義和/或預選肽：MHC複合體，其肽具有已知序列，優選為以預定的量添加（「加標」）。

根據一實施方案，所述肽的序列相對於包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽」）所結合的肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）的序列改變或突變。

根據一實施方案，創建了包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽」）所結合的肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）的一系列突變體，並添加至步驟a)的樣本。在其中，每個突變體在其整個長度上或其至少一個亞級分中之一個位置上的氨基酸殘基被取代成另一個氨基酸。

根據一實施方案，每個突變體在其整個長度上或其至少一個亞級分中之一個位置上的氨基酸殘基被取代成丙氨酸或甘氨酸，例如，如實施例5所示。

如上所述，可在本發明方法的步驟a)中將如此獲得的突變肽加標至樣本（例如pHLA文庫或細胞裂解液）。此方法可更好地表徵上位結合基序並鑒定潛在脫靶。

根據一實施方案，用於加標的合成肽衍生自天然肽（例如，基於質譜或基因組數據）並基於定義的標準（例如，與靶肽的化學相似性）選擇，如實施例4所示。

在一實施方案中，使用本文討論的方法，沒有必要將靶肽序列納入樣本來評估這些肽。此外，在所述實施方案中，無需計算相對於靶肽序列或其他肽序列的任何比值。突變肽的結合強度僅透過其在結合劑相較於BB7.2製劑中的回收來確定。

根據一實施方案，包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽」）所結合的肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）的錨定位置無改變/突變。

需要注意的是，在此背景下，所謂的「錨定殘基」（本文中縮寫為「AR」）介導肽與MHC中的肽結合槽結合。在HLA-A*02:01中，這些錨定殘基最常為P2的亮氨酸以及P9的亮氨酸或纈氨酸，在結合多肽與肽：MHC複合體之間的結合反應中僅起較小作用。

根據本發明所述方法的另一優選方面，肽：MHC分子的混合物可以透過生物技術生產而人工產生。後者可以實現，但不限於在原核（例如，大腸桿菌）系統中轉化和表達MHC分子。此類MHC分子可以被進一步修飾，以增加其溶解性（例如，透過替換或改變此類分子的跨膜部分）。此類分子的肽載入和重構可能會被實現，但不僅限於存在目標肽以及可促進所需分子重構的其他化學物質（谷胱甘肽、精氨酸等）的情況下，再折疊MHC組分的包涵體（例如，蛋白重鏈和β-2微球蛋白）。

技術人員可能希望將這些載入不同肽的人工產生肽：MHC分子中的幾種進行組合，以生成數十種至數百至數千至數萬或數十萬種不同的肽：MHC分子的文庫，其可根據提出的方法用肽：MHC結合多肽進行測試。技術人員可能還希望將人工產生的肽：MHC分子的這些混合物加標至來自生物來源的另一種肽：MHC分子混合物中。另一方面，技術人員可以用含有一個或幾個重的穩定同位素標記（例如，但不限於¹³ C、¹⁵ N或² H）的肽來重構這些人工產生的肽：MHC分子。然後可以將這些肽：MHC分子加標至另一種肽：MHC分子混合物（例如，來自生物樣本），以獲得含有重標記的目標肽的其他資訊，並使用所提出的方法提供有關分離肽效率的定量質譜數據。

在根據本發明方法的另一優選方面，所述方法與所述鑒定和/或脫靶結合的計算分析相結合。

此附加資訊可能由但不限於肽相似性和與MHC分子結合的肽得分的計算組成，如PMBEC、Blosum62、Pam250、NetMHC、NetMHCpan、SYFPEITHI。

兩個肽的術語「相似性」考慮了給定位置上兩個氨基酸的相關性（例如，參見下表1a）。類似氨基酸序列（例如，與靶肽序列相似的脫靶肽序列）可用BLAST演算法對兩個序列之間的相似性進行統計分析而從蛋白質數據庫中檢索（例如，參見(Karlin and Altschul, 1993)）。此類比對的優選設置為：詞長3、期望值(E)10、使用BLOSUM62或PMBEC評分矩陣(Kim et al., 2009)，優選為確定相似性時使用PMBEC評分矩陣。這些矩陣例如基於氨基酸之間的進化性或功能相似性來定量氨基酸相似性，其與根據理化參數的相似性有密切相關。對於給定靶肽序列中氨基酸的每次取代，可使用這些矩陣來計算得分（十進位值），從而表明靶肽序列中的氨基酸與脫靶肽序列中被取代氨基酸的相似性。可透過加總靶肽序列中單次取代的效果（得分）來考慮多次取代。根據定義，脫靶肽可實現的最大分數由未取代靶肽序列提供，而導致脫靶肽的任何取代都會在得分矩陣中罰分，最終導致脫靶肽的分數較低。但是，此最大分數取決於靶肽的長度和氨基酸序列（即，不同靶肽序列的最大分數將不同）。通常情況下，較長的氨基酸序列會導致較高的分數。但是，靶肽的分數取決於分配給其組成的氨基酸分數。為了能夠在不考慮不同靶肽序列最大分數差異的情況下計算和比較脫靶肽與靶肽的相似性，將脫靶肽與靶肽的相似性計算結果之各十進位值進行轉換為百分比分數，因此，靶肽序列的最大分數始終為100%。

表1a：氨基酸以及分別的保守和半保守取代。如果新的半胱氨酸仍以游離硫醇形式存在，則從A、F、H、I、L、M、P、V、W或Y變為C為半保守的。此外，本領域技術人員將理解，空間需求位置上的甘氨酸不應被取代。

氨基酸	保守取代	半保守取代
A	G; S; T N; V; C
C	A; V; L	M; I; F; G
D	E; N; Q	A; S; T; K; R; H
E	D; Q; N	A; S; T; K; R;
F	W; Y; L; M; H	I; V; A
G	A	S; N; T; D; E; N; Q
H	Y; F; K; R	L; M; A
I	V; L; M; A	F; Y; W; G
K	R; H	D; E; N; Q; S; T; A
L	M; I; V; A	F; Y; W; H; C
M	L; I; V; A	F; Y; W; C;
N	Q	D; E; S; T; A; G; K; R
P	V; I	L; A; M; W; Y; S; T; C; F
Q	N	D; E; A; S; T; L; M; K; R
R	K; H	N; Q; S; T; D; E; A
S	A; T; G; N	D; E; R; K
T	A; S; G; N; V D; E; R; K; I
V	A; L; I M; T; C; N
W	F; Y; H	L; M; I; V; C
Y	F; W; H	L; M; I; V; C

現將參考以下實施例對本發明作進一步闡述，但並不限於此。為了本發明之目的，所有參考文獻均以完整引用的形式併入本文。

實施例1：

在HLA-A*02背景下提呈的本實施例中使用的被靶向MHC肽衍生自在腫瘤中優先表達的黑色素瘤抗原(PRAME)，並顯示出序列SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)（本文也稱為PRAME-004）。

在這些實驗中使用的肽：MHC結合多肽的實例為修飾的T細胞受體分子，其已被改造為可溶的，並且顯示對PRAME-004肽的親和力增強，此外還包含CD3結合抗體部分。

PCT/EP2020/050936中公開了這些實驗中使用的肽：MHC結合多肽、其獲得方法及其技術特徵，其內容透過引用併入本文。

使用了人HLA-A*02高表達膠質母細胞瘤來源的細胞系T98G作為肽：MHC混合物的生物學來源。此細胞系之前已在細胞毒性實驗中使用所述針對PRAME-004的肽：MHC結合多肽進行了測試，並顯示了正向的殺傷力。

將五億個T98G細胞在含有CHAPS去污劑的緩衝液中進行裂解，並在超聲輔助下使其均質化。

使用化學偶聯方法以預定比將肽：MHC結合多肽偶聯至經BrCN激活後的固體Sepharose^® 基質。同樣，使用相同的策略並行偶聯激活了相同量的Sepharose^® ，但是未添加肽：MHC結合多肽。取而代之的是將0.1M氨基酸甘氨酸溶液添加至Sepharose^® 中，其取而代之的與化學上激活的基團偶聯。然後將包含肽：MHC分子混合物的T98G裂解物加到載入200 μl甘氨酸偶聯的Sepharose^® 基質或200 μl肽：MHC結合多肽偶聯的Sepharose^® 基質肽：MHC結合多肽的兩個親和色譜柱上。藉此，T98G衍生裂解物按如下方式施加：首先將其在甘氨酸偶聯的Sepharose^® （在本文中稱為甘氨酸柱）上運行，以便去除或消耗任何在分離與肽：MHC結合多肽結合的肽之前，會與色譜柱或Sepharose^® 基質非特異性地結合的肽（圖1）。用PBS和ddH₂ O洗滌親和柱後，使用三氟乙酸(TFA)從色譜柱上洗脫所結合的肽：MHC複合體。

在此步驟中，MHC結合肽也從MHC部分中釋放出來，並且可以使用分子量截斷值小於10 kDa的指定設備透過超濾使之從更高分子量的分子中分離。

然後，分離出的肽混合物最終使用nanoACQUITY UPLC系統(Waters)進行液相色譜-質譜聯用(LC-MS)技術分析，接著使用Orbitrap fusion^TM Tribrid^TM 質譜儀(Thermo Scientific)進行分析。

使用不同的碎片化技術（在本實施例中為CID和HCD碎片化）以及在兩個不同分析儀（在本實施例中為IonTrap和Orbitrap分析儀）中讀取MS/MS頻譜，以數據依賴採集模式(DDA)操作質譜儀。

使用修改版國際蛋白質索引(IPI v.378)和通用蛋白質資源(UniProt)序列數據庫，透過搜索引擎 SEQUEST搜索人蛋白質組的肽片段頻譜。從甘氨酸色譜柱中洗脫並鑒定的所有肽都排除，不進一步的分析，因為它們代表著非特異性結合肽。此外，根據內部數據庫和用於鑒定它們的演算法所得的已知污染物也不進行分析。

分離和加工後共鑒定出20種肽，如表2所示。作為參考，還顯示了靶肽PRAME-004，但其未在分離的肽中被鑒定出，並且預期無法鑒定出。

為了確認它們的相關性並分析與靶肽相比的結合力，所有肽都進行了生物層干涉測量。使用生物層干涉法（在這種情況下，使用製造商推薦的設置的Octet RED384系統）進行測量。簡言之，在30°C和1000 rpm轉速下以PBS、0.05%吐溫-20、0.1% BSA用作緩衝液來測量結合動力學。在分析連續稀釋的肽：MHC特異性結合劑之前，將肽：MHC複合體載入到生物感測器(HIS1K)上。表2最後一欄列出了與PRAME-004相比的平衡解離常數(KD)比。

在細胞毒性實驗中進一步測試了這些一系列肽。簡言之，在存在指定濃度的PRAME-004特異性肽：MHC結合多肽的情況下，將載入有10 nM相應肽的T2細胞（10,000個細胞/孔）與人CD8+ T細胞（50,000個細胞/孔）共孵育（圖4）。48小時後，利用CytoTox 96非放射性細胞毒性測定套件(PROMEGA)測量LDH釋放來定量細胞毒性。表2中還列出了受測肽的相應EC50值。此分析產生的主要脫靶為IFT17-003，與靶肽PRAME-004相比，其顯示出與肽：MHC結合多肽相似的KD值和EC50值。

XPRESIDENT^® 肽提呈和基因表達數據可用於透過將相關的脫靶與不太相關的脫靶（僅在其他腫瘤組織的背景下才會提呈/表達）區分開來，從而評估脫靶肽的潛在安全風險。在本實施例中，由於肽在不同正常組織上的普遍表達（圖5）和提呈（圖6），IFT17-003被視為高度相關的脫靶。因此，將本實施例的呈現數據與其他大規模肽提呈或表達數據相結合對於脫靶風險評估具有額外的價值。

為了提高肽：MHC結合多肽的特異性，已使用鑒定的肽作為選擇決定簇進行了另一輪成熟處理。因此，可大大提高新產生分子的特異性，如圖2中靶標陰性細胞系T98G的殺傷降低所示。殺傷測定基本上按上所述進行。人PBMC（100,000個細胞/孔）和所示濃度的肽：MHC結合多肽共孵育48小時後，對靶標陽性或陰性細胞（10,000個細胞/孔）的LDH釋放進行定量分析。用於肽分離的原始肽：MHC結合多肽分子顯示為實心方塊，而特異性提高的變體顯示為空心圓。對照肽：MHC結合多肽分子（帶星號的方形）和不含雙特異性分子的對照物（帶星號的圓圈）不會誘導對靶細胞的殺傷。

表2：鑒定的肽：MHC結合多肽特異性肽概述。最上面表示的是靶標PRAME-004。指出了使用肽載入T2細胞的細胞毒性實驗的EC50值，並使用HIS1K生物感測器透過生物層干涉法確定了結合親和力。

肽代碼	肽序列	EC50 [pM]	結合親和力倍數降低
PRAME-004	SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1)	1.2	1
IFT17-003	FMNPHLISV (SEQ ID NO: 2)	1.6	1
MCM5-006	MLAKHVITL (SEQ ID NO: 3)	16.1	3
IFIT1-001	VLLHHQIGL (SEQ ID NO: 4)	38.4	8
FADS2-001	LLLAHIIAL (SEQ ID NO: 5)	83.7	13
CTBP1-001	ALMYHTITL (SEQ ID NO: 6)	79.31	13
ITSN1-001	ILAMHLIDV (SEQ ID NO: 7)	1024	36
ATP1A1-001	FLPIHLLGL (SEQ ID NO: 8)	196	106
MCMB-002	YLILHLIST (SEQ ID NO: 9)	n.a.	127
EHD4-001	ALAKHLIKI (SEQ ID NO: 10)	n.a.	61
SF3B3-005	TLVYHVVGV (SEQ ID NO: 11)	n.a.	152
EHD-001	ALANHLIKV (SEQ ID NO: 12)	n.a.	159
FARSA-001	LTLGHLMGV (SEQ ID NO: 13)	n.a.	38
INTS7-002	ILGTHNITV (SEQ ID NO: 14)	n.a.	57
MLXI-001	KLTSHAITL (SEQ ID NO: 15)	n.a.	12
PPP4R1-003	HLMPHLLTL (SEQ ID NO: 16)	n.a.	16
RIF1-004	AIWEKLISL (SEQ ID NO: 17)	n.a.	156
SFXN3-001	SLTKHLPPL (SEQ ID NO: 18)	n.a.	60
TBCK-002	ALSPHNILL (SEQ ID NO: 19)	n.a.	142
TNRC6B-001	SLARHLMTL (SEQ ID NO: 20)	n.a.	4
ZFYVE16-002	ALCPHLKTL (SEQ ID NO: 21)	n.a.	33

結合基序的鑒定

所鑒定的肽可以進一步用於推斷肽：MHC結合多肽的結合基序，這提供了肽序列中哪些氨基酸與所述多肽的結合具有相關性的資訊。

此外，可以從相關位置內的氨基酸推導出結合基序的其他資訊。根據被鑒定的一組肽，氨基酸序列第1-9位置僅耐受一亞組的氨基酸（參見圖7和表3）。

表3：透過所提出方法鑒定的每個位置的耐受氨基酸概述。

位置	耐受的氨基酸殘基
1	A, S, F, I, L, H, K, M, T, V, Y
2	L, I, M, T
3	A, L, M, T, C, G, I, N, P, S, V, W
4	P, K, Y, A, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T
5	H, K
6	L, N, V, A, I, Q, T
7	I, L, M, K, P, V
8	T, G, S, K, A, D, L, P
9	L, V, I, T

與常規氨基酸掃描方法（氨基酸在各個位置被突變取代，隨後在體外測定中進行測試）相反，還可以闡明對整體結合力具有不同潛在相反作用的多重取代。例如，如果天然氨基酸序列第6位置的取代導致總體結合親和力降低，則可透過第8位的類似取代來挽救，這可能導致肽：MHC結合多肽與肽：MHC分子的結合親和力大大提高。

如此生成的結合基序用於搜索不同的蛋白質序列數據庫（例如，UniProt、IPI），從而發現反映並適應結合基序帶來的限制的其他脫靶肽（即，結合基序相關位置中耐受的已定義的一組氨基酸）。

比較例1

以下實驗顯示了本領域目前可用的方法如何不會鑒定出實施例1中鑒定的最相關脫靶肽，因此不能預測預期用於體內給藥的肽：MHC結合多肽的有害副作用。

使用位置掃描鑒定結合基序：

天然PRAME-004序列的變體（其中每個氨基酸隨後被氨基酸丙氨酸替換）使用生物層干涉法測試其與肽：MHC結合多肽結合的可能性。 A L L Q H L I G L (SEQ ID NO. 38) S A L Q H L I G L (SEQ ID NO. 39) S L A Q H L I G L (SEQ ID NO. 40) S L L A H L I G L (SEQ ID NO. 41) S L L Q A L I G L (SEQ ID NO. 42) S L L Q H A I G L (SEQ ID NO. 43) S L L Q H L A G L (SEQ ID NO. 44) S L L Q H L I A L (SEQ ID NO. 45) S L L Q H L I G A (SEQ ID NO. 46)

圖8顯示了這些實驗的結果。與野生型序列相比，丙氨酸取代的肽中有五個導致結合親和力降低50%或更多（或KD分別增加2倍或更多），因此視為是結合必不可少的。根據這些結果，結合基序會產生XXXXHLIGL(SEQ ID NO. 22)，其中X代表任何氨基酸。

在位置掃描方法的擴展變體中，PRAME-004序列在各位置上均被任何天然氨基酸以與前述相似的方式取代。未用於PRAME-004取代的唯一蛋白原性氨基酸為半胱氨酸，因為已知此氨基酸會迅速進行數種化學修飾，這可能導致測試過程中對肽識別產生錯誤的解讀。因此，總共研究了9*18 = 162種肽。

再次使用生物層干涉法測試每種肽的結合親和力（圖9）。與野生型序列相比，導致結合親和力降低50%或更多（或KD分別增加2倍或更多）的肽視為對肽結合不耐受或有害。這形成複合體結合基序，其中氨基酸序列第1-9位置可耐受或接受一組不同的氨基酸： X₁ X₂ X₃ X₄ HX₅ IX₆ X₇ 其中X₁ 選自ADEFGHIKLMNPQRSTVWY中的任何一個；X₂ 選自AFGILMQSTVY中的任何一個；X₃ 選自ADGIKLMNQSTVW中的任何一個；X₄ 選自AFGHIKLMNPQRSTVWY中的任何一個；X₅ 選自ILM中的任何一個；X₆ 選自GST中的任何一個；X₇ 選自EFHIKLMPQTVY中的任何一個。

基於Ala-Scan衍生結合基序的相似性搜索：

使用內部軟體工具搜索不同的蛋白質序列數據庫（IPI v.3.78，包含SNV的Ensembl版本77 GrCH38、NCBI非冗餘蛋白質數據庫）以查找包含已鑒定基序序列(X-X-X-X-X-H-L-I-G-L)(SEQ ID NO. 22)的人蛋白質，其中X可由任何氨基酸組成。鑒定出八種獨特的肽：靶本身PRAME-004以及源自不同人蛋白的七種肽：VEZT(Vezatin)、HTR2C（5-羥色胺受體2C）、HEPHL1（膜鐵轉運輔助蛋白樣蛋白 1）、COL28A1（膠原α-1(XXVIII)鏈）、SLC2A1（溶質載體家族2，促進葡萄糖轉運蛋白成員1）、SLC44A3（膽鹼轉運蛋白樣蛋白3）、PIEZO2（Piezo型機械敏感性離子通道組分2）。

這些肽的氨基酸序列如下所示。

蛋白質（Uniprot 登錄號）	序列
PRAME (P78395) (SEQ ID NO. 1)	S	L	L	Q	H	L	I	G	L
VEZT (Q9HBM0) (SEQ ID NO. 23)	H	P	S	Q	H	L	I	G	L
HTR2C (P28335) (SEQ ID NO. 32)	S	F	L	V	H	L	I	G	L
HEPHL1 (Q6MZM0) (SEQ ID NO. 33)	R	V	S	W	H	L	I	G	L
COL28A1 (Q2UY09) (SEQ ID NO. 34)	I	N	E	S	H	L	I	G	L
SLC2A1 (P11166) (SEQ ID NO. 35)	R	R	T	L	H	L	I	G	L
SLC44A3 (Q8N4M1) (SEQ ID NO. 36)	M	W	S	Y	H	L	I	G	L
PIEZO2 (Q9H5I5) (SEQ ID NO. 37)	F	T	A	G	H	L	I	G	L

592份正常組織樣本和710份腫瘤組織樣本（全部來自HLA-A*02型個體）的內部XPRESIDENT^® 免疫肽組數據表明，在HLA-A*02背景下，7種預測的脫靶肽均從未被鑒定出存在於任何被分析的樣本上。值得注意的是，VEZT和SLC2A1衍生肽之前已被XPRESIDENT^® 鑒定出存在於非A*02陽性個體的組織樣本上，這表明它們由不同的HLA同種型提呈（在VEZT衍生肽情況下，為HLA-B*07；在SLC2A1衍生肽情況下，則為HLA-B*27），因此在HLA-A*02限制性肽：MHC結合多肽的情況下不太可能產生脫靶風險。但是，位置掃描和預測方法無法鑒定任何相關的脫靶肽（可用本申請中描述的較優方法進行鑒定）。

基於上位結合基序的相似性搜索：

還用使用同一內部軟體工具來預測源自人蛋白質組的肽（滿足複合體結合基序標準）。由於半胱氨酸在取代過程中被排除，因此，此氨基酸被額外允許在氨基酸序列的每個位置，從而產生以下基序： X₈ X₉ X₁₀ X₁₁ X₁₂ X₁₃ X₁₄ X₁₅ X₁₆ 其中，X₈ 選自ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY中的任何一個；X₉ 選自ACFGILMQSTVY中的任何一個；X₁₀ 選自ACDGIKLMNQSTVW中的任何一個；X₁₁ 選自ACFGHIKLMNPQRSTVWY中的任何一個；X₁₂ 選自CH中的任何一個；X₁₃ 選自CILM中的任何一個；X₁₄ 選自CI中的任何一個；X₁₅ 選自CGST中的任何一個；X₁₆ 選自CEFHIKLMPQTVY中的任何一個。

該搜索生成滿足結合基序標準的888種不同肽的總列表。僅兩種肽（IFT17-003和ATP1A1-001）與透過本申請在本實施例1中所述的較優方法鑒定的相關脫靶列表重疊，而其餘的肽無法用基於預測的方法鑒定，即使隨後使用下游體外分析對所有888種肽進行了測試。

實施例2：

在HLA-A*02背景下提呈的本實施例中使用的被靶向MHC肽衍生自黑色素瘤相關抗原A4和A8(MAGEA4/A8)，並顯示出序列KVLEHVVRV(SEQ ID NO:24)（本文也稱為MAGEA4/8）。

肽：MHC結合多肽由修飾的T細胞受體分子組成，其已被改造為可溶的，並且顯示對MAGEA4/A8衍生肽的親和力增強，此外還包含CD3結合抗體部分。使用了人HLA-A*02高表達和MAGEA4/8陽性肺腺癌衍生的細胞系NCI-H1755作為肽：MHC混合物的生物學來源。將此細胞系的五億個細胞在含有CHAPS去污劑的緩衝液中進行裂解，並在超聲輔助下使其均質化。

肽：MHC結合多肽的偶聯以及親和層析按實施例1所述進行。在將含有肽：MHC分子混合物的NCI-H1755裂解物施加至甘氨酸偶聯的和肽：MHC結合劑偶聯的Sepharose^® 之前，將體積各分一半。後一半的體積在不同的甘氨酸偶聯Sepharose^® 基質上並行運行，然後在與HLA-A*02特異性抗體BB7.2偶聯的Sepharose^® 基質上運行。後者旨在分離此細胞系中由HLA-A*02提呈的全譜肽（也參見圖1）。

如實施例1中所述，從所有色譜柱中洗脫肽並進行質譜分析。再次將從甘氨酸柱中洗脫的肽以及已知的污染物排除，不進一步分析。此外，使用SuperHirn演算法在所有不同的運行中對所有肽前體信號進行定量(Mueller et al., 2007)。使用±3分鐘的固定保留時間窗和±5 ppm的質量精度提取和定量所有質譜實驗中的特徵。

計算了來自MAGEA4/8特異性肽：MHC結合多肽的單個肽前體信號的所得面積與來自BB7.2製劑的相同前體信號的面積之比。這些比反映了與HLA-A*02特異性抗體BB7.2相比，MAGEA4/8肽：MHC結合多肽的分離效率。由於MAGEA4/8特異性肽：MHC結合多肽對其靶標以及與HLA-A*02分子結合的潛在脫靶肽具有高親和力，因此，與BB7.2（對HLA-A*02的親和力較低為納摩爾範圍，很大程度上獨立於結合的肽種類）相比，這些肽的分離效率要高得多(Parham and Brodsky, 1981)。質譜數據分析鑒定出10種肽，包括靶肽MAGEA4/8（參見表4）。根據肽：MHC結合多肽和BB7.2的面積比對這些肽進行分級，可確定與BB7.2相比這些肽的分離效率，該分離效率與使用如實施例1所述的生物層干涉法分析的結合親和力相關。因此，可從質譜實驗的定量數據中直接推導出脫靶毒性的風險以及靶肽與脫靶肽之間潛在的治療窗。

在表4的列出示例中，與靶肽MAGEA4/8相比，MAGEA1的面積比較小（~11對比~10.6），轉化為非常小的結合親和力的降低--4.1。相比之下，對於肽HEAT5RA，與MAGEA4/8相比，面積比大幅降低約800倍，這也反映為與MAGEA4/8相比，結合親和力大幅降低為238。

對XPRESIDENT^® 中肽提呈和基因表達數據更深入分析後顯示，MAGEA1無相關脫靶風險，因為它僅存在於癌症組織中（圖10），並顯示出癌-睾丸樣的表達模式（圖11）。

表4：鑒定的肽：MHC結合多肽特異性肽概述。指出的是透過質譜法從MAGEA4/8結合多肽洗脫的肽與HLA-A*02特異性結合肽BB7.2之比。在頂行中，列出了靶肽MAGEA4/A8，其顯示了最高的信號面積比。PMBEC評分是肽與靶序列相似性的一種評估手段。結合親和力透過使用HIS1K生物感測器用生物層干涉法測定。

肽代碼	肽序列	信號面積比[MAGEA4/8 結合劑/BB7.2]	PMBEC	結合親和力倍數降低
MAGEA4/A8	KVLEHVVRV (SEQ ID NO. 24)	11	1.85568	1
MAGEA1	KVLEYVIKV (SEQ ID NO. 25)	10.615	1.42928	4.1
	KVLEFLAKV (SEQ ID NO. 26)	5.218	1.24828
	KIIDLLPKV (SEQ ID NO. 27)	4.009	0.94598
	KLQEFLQTL (SEQ ID NO. 28)	0.032	0.45866
HEAT5RA	KVLETLVTV (SEQ ID NO. 29)	0.014	1.06691	237.7
FAM115A	KLGSVPVTV (SEQ ID NO. 30)	0.006	0.50865	503.1
	KIADFGWSV (SEQ ID NO. 31)	0.002	0.53985

實施例3：

本實施例中使用的被靶向MHC肽與實施例1中描述的相同(PRAME-004, SEQ ID NO: 1)。同樣，肽：MHC結合多肽的實例為修飾的T細胞受體分子，其已被改造為可溶的，並且顯示對PRAME-004肽的親和力增強，此外還包含CD3結合抗體部分，但是，與實施例1相比為不同的變體，導致脫靶識別的改變。

使用了十種不同的細胞系作為肽：MHC混合物的生物學來源。選擇細胞系以使 HLA-A*02:01肽的量和多樣性達到最大。每個細胞系的五億個細胞在含有CHAPS去污劑的緩衝液中進行裂解，並進行勻漿和合併。對於個別分析，使用五億數量級細胞數的等分試樣。

如實施例2所述進行肽：MHC結合多肽和HLA-A*02特異性抗體BB7.2的偶聯和親和層析，但是為了增加裂解物和基質偶聯肽：MHC結合多肽的接觸時間，在反應管中孵育並搖晃16個小時。

分離和加工後共鑒定出79種肽。表5中顯示了十個最相關的脫靶，包括靶肽PRAME-004。79個肽中有32個顯示出低信號強度比[pMHC結合多肽/BB7.2]（低於0.005），因此預計與肽：MHC結合多肽的結合低或不結合。這些肽作為參考被納入進一步分析中。根據使用肽：MHC結合多肽純化後獲得的MS信號強度與使用HLA-A*02特異性抗體BB7.2純化後的MS信號強度相比，將所選肽顯示於圖12中。至對角線的距離表示信號強度的比值。對於靶標和強脫靶，預計幾乎定量的親和層析，導致信號強度的比值[pMHC結合多肽/BB7.2]大約為1（虛線）。圖表中顯示了十個最強結合脫靶的名稱，所有這些均按預期接近對角線。使用生物層干涉法作為參考，具有極低信號強度比值[pMHC結合多肽/BB7.2]的肽確實顯示出極大或不可量化的結合親和力倍數降低。

表5：基於使用HIS1K 生物感測器的生物層干涉法所確定的結合親和力倍數降低的前十最相關靶標概述。指出的是透過質譜法測得之從PRAME-004結合多肽洗脫的肽與從HLA-A*02特異性結合肽BB7.2洗脫的肽之比。對於標有星號的數值，由於從HLA-A*02特異性結合肽BB7.2洗脫的肽豐度低，因此無法計算比值，並假定為最大測量值。

肽代碼	肽序列	信號面積比[PRAME 結合劑/BB7.2]	結合親和力倍數降低
PRAME-004	SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1)	0.9	1.0
IFT17-003	FMNPHLISV (SEQ ID NO: 2)	0.8	1.0
MCM5-006	MLAKHVITL (SEQ ID NO: 3)	3.1	2.4
IFIT1-001	VLLHHQIGL (SEQ ID NO: 4)	3.1*	8.1
MLXI-001	KLTSHAITL (SEQ ID NO: 15)	3.1*	9.2
CTBP1-001	ALMYHTITL (SEQ ID NO: 6)	1.0	10.6
PPP4R1-003	HLMPHLLTL (SEQ ID NO: 16)	1.4	13.0
TUB-006	YMNNDLIGL (SEQ ID NO: 47)	2.0	13.1
FADS2-001	LLLAHIIAL (SEQ ID NO: 5)	0.3	13.6
CTBP2-001	AMMYHTITL (SEQ ID NO: 48)	1.4	15.8

為了確認它們的相關性並分析與靶肽相比的結合強度，按照實施例1中所述對所有肽進行了生物層干涉法測量。測定了與PRAME-004相比的平衡解離常數(KD)之比，且將其與透過本發明方法確定的信號強度的比值[pMHC結合多肽/BB7.2]相關。所確定的結合親和力倍數降低在圖12中用灰度表示。透過本發明方法確定的結合親和力倍數降低與信號強度比值[pMHC結合多肽/BB7.2]的相關性見圖13。如上所述，與肽：MHC結合多肽具有強結合力的肽可鑒定為具有高信號強度比值[pMHC結合多肽/BB7.2]，而非結合肽則顯示低於0.001的信號強度比值[pMHC結合多肽/BB7.2]。為了獲得該方法的最大靈敏度，過量使用了肽：MHC結合多肽和HLA-A*02特異性抗體BB7.2，導致在兩種情況下脫靶的幾乎定量提取以及信號面積最大比值[pMHC結合多肽/BB7.2]約為1。為了考慮這種飽和效應，進行了指數回歸（圖13）。

數據表明，結合親和力可使用應用本發明方法的單個實驗的信號強度比值來估算。

實施例4：

本實施例中使用的被靶向MHC肽與實施例1中描述的相同(PRAME-004, SEQ ID NO: 1)。同樣，肽：MHC結合多肽的實例為修飾的T細胞受體分子，其已被改造為可溶的，並且顯示對PRAME-004肽的親和力增強，此外還包含CD3結合抗體部分，但是，與實施例1和3相比為不同的變體。

為了證明本發明方法從合成肽文庫中鑒定潛在脫靶的能力，八種同位素標記的肽：MHC複合體的混合物被加標至源自腎細胞癌組織樣本的生物基質中。為了進行該實驗，如上所述裂解0.3 g組織，並加入2 pmol肽：MHC複合體。裂解物被分成相等部分，並使用肽：MHC結合多肽和HLA-A*02特異性抗體BB7.2進行親和層析。同位素標記的肽由靶標、五個已知交叉反應肽和作為陰性對照的兩個非結合肽組成（表6）。

圖14展示了PRAME結合多肽相對於HLA-A*02特異性抗體BB7.2的信號面積。如預期的一樣，靶標和已知脫靶顯示出高信號面積比值[pMHC結合多肽/BB7.2]，數量級大約為1，因此根據本發明方法將其歸類為高度相關。同樣，兩種陰性對照肽均顯示出極低的信號面積比值[pMHC結合多肽/BB7.2]，因此，根據本發明方法視為相關性較低。

表6：加標同位素標記肽：MHC複合體概述。同位素標記的氨基酸用星號表示。指出的是透過質譜法測得之從PRAME結合多肽洗脫的肽與從HLA-A*02特異性結合肽BB7.2洗脫的肽之比。最上面一行為靶肽PRAME-004，然後是五個已知脫靶肽和兩個非結合陰性對照肽。PMBEC評分是肽與靶序列相似性的一種評估手段。結合親和力透過使用HIS1K 生物感測器的生物層干涉法測定。

肽代碼	肽序列	信號面積比[PRAME 結合劑/BB7.2]	PMBEC
PRAME-004*	SLL*QHLIGL (SEQ ID NO. 1)	0.5422	1.60	靶標
IFIT1-001*	VL*LHHQIGL (SEQ ID NO. 4)	1.4524	1.08	脫靶
ATP-009*	HLLMHLI*GS (SEQ ID NO. 49)	2.3194	1.05	脫靶
FADS2-001*	L*LLAHIIAL (SEQ ID NO. 5)	0.5232	0.99	脫靶
MCM5-006*	ML*AKHVITL (SEQ ID NO. 3)	1.7379	0.76	脫靶
IFT17-003*	FMNPHL*ISV (SEQ ID NO. 2)	0.9949	0.75	脫靶
GAL-001*	SL*DPSSPQV (SEQ ID NO. 50)	0.0015	0.31	陰性對照
KLHL14-001*	VLDDSIYL*V (SEQ ID NO. 51)	0.0016	0.21	陰性對照

實施例5：

本實施例中使用的被靶向MHC肽與實施例4中描述的相同(PRAME-004, SEQ ID NO: 1)。同樣，肽：MHC結合多肽的實例為修飾的T細胞受體分子，其已被改造為可溶的，並且顯示對PRAME-004肽的親和力增強，此外還包含CD3結合抗體部分。

為了證明本發明方法檢索有關肽：MHC結合多肽的結合基序的資訊的另一種方式，靶肽的合成肽變體被用作加標文庫。在這種方法中，與肽：MHC結合多肽的識別相關的每個氨基酸位置都被丙氨酸單獨交換（「掃描」）(SEQ ID NO. 38至46)。在此實施例中，相關位置為不含對肽-MHC結合至關重要的第2和9位置之錨定氨基酸的所有位置（1至9）。合成肽被載入至重組生產和重折疊的HLA-A*02:01同種異型MHC分子上，並加標至衍生自腎細胞癌組織樣本的生物基質中。為了進行該實驗，如上所述裂解.1 g組織，並加入140 fmol肽：MHC複合體。裂解物被分成相等部分，並使用肽：MHC結合多肽和HLA-A*02特異性抗體BB7.2進行親和層析。肽定量使用靶向質譜測量法進行。

如前所述，計算靶向作用於PRAME的pMHC結合多肽與HLA-A*02特異性抗體BB7.2的信號強度比值作為結合親和力的估計值。所獲得的MS信號強度比值描繪於圖15。將比值標準化為最大值，以便與圖8中使用生物層干涉測量法的比較例更好地進行比較。與用於基於位置的結合基序確定的比較例一致（圖8），第1、3和4位置與pMHC複合體的結合無關。本發明方法似乎對識別弱結合突變體肽也具有較高的敏感性，例如，從第8位置中相對較高的比值可以看出，提示本發明方法的動態範圍不同。但是，各個肽的順序一致，第5位置為最強識別位置，接著是第7、6和8位置。根據數據，儘管 MS信號強度比值明顯降低，但第8位置不視為與結合相關。這也與確定的上位結合基序（圖7）一致，顯示在第8位置對甘氨酸和多種其他允許氨基酸的選擇性降低。與圖7的比較也顯示，第5位置是迄今最相關的結合位置，也充分反映在所提呈的基於位置的結合基序。

擴展加標文庫納入除丙氨酸以外的其他替代氨基酸也可增加單個實驗中獲得的有關結合基序的資訊。此外，數百至數千個天然肽的合成文庫可用作合成文庫。本發明方法的已證明方面的一個主要優點為：各自的結合親和力可並行確定。

縮寫詞

AR	錨定殘基
APC	抗原提呈細胞
BIRD	黑體紅外輻射解離
BiTE	雙特異性T細胞銜接子
CAR	嵌合抗原受體
CDR	互補決定區
CID	碰撞誘導解離
DART	雙重親和力重靶向抗體
DDA	數據依賴採集
DIA	數據獨立採集
DRIP	缺陷型核糖體顆粒
ECD	電子捕獲解離
EDD	電子脫離解離
ETCID	電子轉移和碰撞誘導解離
ETD	電子轉移解離
ETHCD	電子轉移/更高能量碰撞解離
HCD	更高能量碰撞解離
IRMPD	紅外多光子解離
IQR	四分位數範圍
KD	解離常數
NETD	負電子轉移解離
LDH	乳酸脫氫酶
PBMC	外周血單核細胞
SID	表面誘導解離
SMITE	同時多重相互作用T細胞銜接
TandAb	串聯抗體
TCR	T細胞受體
TFA	三氟乙酸
TIL	腫瘤浸潤淋巴細胞

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無

圖1：根據本發明的實驗方法的示意圖概述。例如，透過產生源自組織或細胞系的肽：MHC表達細胞的裂解物從而提供含有肽：MHC分子的樣本。或者，樣本可透過添加人工產生的肽：MHC分子的混合物來修飾或樣本可由人工產生的肽：MHC分子的混合物構成。從該樣本中分離特定的肽：MHC分子，方法為：例如透過使樣本與附著有肽：MHC結合多肽的基質接觸。不包含附著多肽的甘氨酸色譜柱可用於去除樣本中的非特異性分離的肽：MHC分子，該非特異性分離的肽：MHC分子與基質發生非特異性相互作用。質譜法可用於鑒定從樣本中分離的MHC結合的肽，從而對肽：MHC結合多肽識別的肽空間進行鑒定和測序。因此，無需預測工具即可闡明之前未知的脫靶風險。對這種方法進行改進時，可以均分相同的包含肽：MHC分子的樣本，並使用無論所結合的肽種類為何皆與這些分子結合的HLA廣泛特異性抗體或TCR並行進行第二次親和層析。在所示的實施例中，使用HLA-A*02泛特異性抗體BB7.2分離 HLA-A*02提呈的無論肽序列為何的所有肽（本文稱之為HLA-A*02免疫肽組）。兩次分離中的目標（例如，脫靶）肽的豐度可用於評估肽：MHC結合多肽相較於所使用的廣泛特異性抗體或TCR（本實施例中為BB7.2）對所述肽的結合親和力。

圖2：細胞毒性實驗，顯示PRAME-004肽：MHC結合多肽的兩個變體（黑色矩形：原始變體，白點：使用鑒定出的脫靶肽作為選擇決定簇對於針對PRAME-004的肽：MHC特異性結合劑再進行一輪成熟處理後特異性提高的變體）對靶標陽性(U2OS)和靶標陰性(T98G)細胞系的殺傷。當使用肽：MHC結合多肽的特異性提高的變體時，對靶標陰性細胞系T98G的殺傷大大降低，而對靶標陽性細胞系U2OS的殺傷僅受到輕微影響。

圖3：為了實現對HLA-A*02提呈的免疫肽組高度覆蓋，可組合幾種細胞系以生成樣本。根據60個細胞系的XPRESIDENT^® 免疫肽組數據，如果要考慮之前在正常組織上已檢測到至少10次肽鑒定的這些肽，表明這些細胞系中已有的10個細胞系組合可覆蓋60%以上的HLA-A*02免疫肽組。

圖4：使用來自實施例1的PRAME-004特異性肽：MHC結合多肽對分析中鑒定的所有肽進行細胞毒性分析。簡言之，在存在所示濃度的PRAME-004特異性肽：MHC結合多肽的情況下，將載入有10 nM相應肽的T2細胞與人CD8+ T細胞共同孵育。48小時後，透過測量LDH釋放來定量細胞毒性。

圖5：不同正常組織和腫瘤組織中IFT17-003的肽編碼源外顯子的表達特徵分析。腫瘤（黑點）和正常（灰點）樣本根據器官起源進行分組。盒鬚圖代表中位FPKM值、第25和第75百分位數（盒）+鬚，延伸到最低數據點仍在下四分位數的1.5四分位數範圍(IQR)內，最高數據點仍在上四分位數的1.5 IQR內。正常器官按字母順序排列。FPKM：每百萬映射讀數每千堿基片段。組織（從左到右）：正常樣本：脂肪（脂肪組織）；adrenal gl（腎上腺）；膽管；膀胱；血細胞；bloodvess（血管）；骨髓；腦；乳腺；esoph（食管）；眼；gall bl（膽囊）；頭頸；心臟；intest. la（大腸）；intest. sm（小腸）；腎；肝；肺；淋巴結；nerve periph（外周神經）；卵巢；胰腺；parathyr（甲狀旁腺）；perit（腹膜）；pituit（垂體）；胎盤；胸膜；攝護腺；skel. mus（骨骼肌）；皮膚；脊髓；脾；胃；睾丸；胸腺；甲狀腺；氣管；輸尿管；子宮。腫瘤樣本：AML（急性髓性白血病）；BRCA（乳腺癌）；CCC（膽管細胞癌）；CLL（慢性淋巴細胞性白血病）；CRC（結直腸癌）；GBC（膽囊癌）；GBM（膠質母細胞瘤）；GC（胃癌）；HCC（肝細胞癌）；HNSCC（頭頸部鱗狀細胞癌）；MEL（黑色素瘤）；NHL（非霍奇金淋巴瘤）；NSCLCadeno（非小細胞肺癌腺癌）；NSCLCother（NSCLC樣本，不能明確分配為NSCLCadeno或NSCLCsquam）；NSCLCsquam（鱗狀細胞非小細胞肺癌）；OC（卵巢癌）；OSCAR（食管癌）；PACA（胰腺癌）；PRCA（攝護腺癌）；RCC（腎細胞癌）；SCLC（小細胞肺癌）；UBC（膀胱癌）；UEC（子宮內膜癌）。

圖6：不同正常組織和腫瘤組織上IFT17-003肽提呈的分析。上面部分：根據技術重複測量值的中位MS信號強度繪製為點，檢測到該肽的單一HLA-A*02陽性正常組織為灰色點（左圖），腫瘤樣本為黑點（右圖）。盒顯示了標準化信號強度的中位值、第25和第75百分位數，而鬚延伸到最低數據點仍在下四分位數的1.5四分位數範圍(IQR)內，最高數據點仍在上四分位數的1.5 IQR內。正常器官按字母順序排列。下面部分：每個器官的相對肽檢測頻率顯示為脊柱圖。圖表下面的數字表示每個器官分析的總樣本數中檢測到肽的樣本數（正常樣本N = 592，腫瘤樣本N = 710）。如果在一個樣本上檢測到肽，但因技術原因無法量化，則該樣本納入此檢測頻率的表示法中，但圖表上面部分不顯示任何點。組織（從左到右）：正常樣本：脂肪（脂肪組織）；adrenal gl（腎上腺）；膽管；膀胱；血細胞；bloodvess（血管）；骨髓；腦；乳腺；esoph（食管）；眼；gall bl（膽囊）；頭頸；心臟；intest. la（大腸）；intest. sm（小腸）；腎；肝；肺；淋巴結；nerve cent（中樞神經）；nerve perith（外周神經）；卵巢；胰腺；parathyr（甲狀旁腺）；perit（腹膜）；pituit（垂體）；胎盤；胸膜；攝護腺；skel. mus（骨骼肌）；皮膚；脊髓；脾；胃；睾丸；胸腺；甲狀腺；氣管；輸尿管；子宮。腫瘤樣本：AML（急性髓性白血病）；BRCA（乳腺癌）；CCC（膽管細胞癌）；CLL（慢性淋巴細胞白血病）；CRC（結直腸癌）；GBC（膽囊癌）；GBM（膠質母細胞瘤）；GC（胃癌）；GEJC（胃食管交界癌）；HCC（肝細胞癌）；HNSCC（頭頸部鱗狀細胞癌）；MEL（黑色素瘤）；NHL（非霍奇金淋巴瘤）；NSCLC（非小細胞肺癌）；OC（卵巢癌）；OSCAR（食管癌）；PACA（胰腺癌）；PRCA（攝護腺癌）；RCC（腎細胞癌）；SCLC（小細胞肺癌）；UBC（膀胱癌）和UEC（子宮和子宮內膜癌）。

圖7：使用所述方法確定、並以序列徽標形式顯示的針對PRAME-004的肽：MHC結合多肽的上位結合基序。選定位置上單個氨基酸的大小反映了它們在已鑒定脫靶中的豐度。因此，此方法提供了針對PRAME-004的肽：MHC結合多肽的結合基序的精確資訊。

例如，在已鑒定脫靶內，肽序列第5位置的組氨酸(H)與賴氨酸(K)相比更為頻繁，這意味著在PRAME-004結合多肽的所述位置以組氨酸為優選。換句話說：與第5位置具有賴氨酸殘基的肽相比，在第5位置具有組氨酸殘基的肽被各PRAME-004結合多肽結合的親和力更高。第5位置除了組氨酸或賴氨酸以外的任何其他氨基酸將進一步降低各肽的親和力。

從中可以看出，各PRAME-004結合多肽所接受的結合基序在第1、3和4位置上相當靈活，而在第5-8位置上可確定對所選氨基酸殘基具有明顯偏好，層級如表1b所示：

表1b：各PRAME-004結合多肽對PRAME-004 第5、6、7和8位置氨基酸的偏好層級

位置	偏好/容忍度層級
5	H＞K
6	L＞N＞V＞A＞I＞Q＞T
7	I＞L＞M＞K＞P＞V
8	T＞G＞S＞K＞A＞D＞L＞P

需要注意的是，在此背景下，所謂的「錨定殘基」（本文中縮寫為「AR」）介導肽與MHC中的肽結合槽結合。在HLA-A*02:01中，這些錨定殘基最常為P2的亮氨酸以及P9的亮氨酸或纈氨酸，在結合多肽與肽：MHC複合體之間的結合相互作用中僅起較小作用。

在下文中，顯示了PRAME的全長序列（在腫瘤中優先表達的黑素瘤抗原，UniProt: P78395），PRAME-004靶肽序列(SLLQHLIGL, SEQ ID NO: 1)以粗體下劃線顯示：＞sp|P78395|PRAME_HUMAN Melanoma antigen preferentially expressed in tumors OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRAME PE=1 SV=1 MERRRLWGSIQSRYISMSVWTSPRRLVELAGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAA FDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKAVLDGLDVLLAQEVRPRRWKLQ VLDLRKNSHQDFWTVWSGNRASLYSFPEPEAAQPMTKKRKVDGLSTEAEQPFIPVEVLVD LFLKEGACDELFSYLIEKVKRKKNVLRLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLEV TCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFLSLQCLQA LYVDSLFFLRGRLDQLLRHVMNPLETLSITNCRLSEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSLSGVM LTDVSPEPLQALLERASATLQDLVFDECGITDDQLLALLPSLSHCSQLTTLSFYGNSISI SALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMV WLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPN

因此，根據上述數據，可以確定基於位置的結合基序以及上位結合基序，如下表1c和1d所示：

表1c：各PRAME-004結合多肽的基於位置的結合基序和上位結合基序。

位置	1	2	3	4	5	6	7	8	9
PRAME-004 的序列	S	L	L	Q	H	L	I	G	L
基於位置的結合基序	X	AR	X	X	H	L	I	G	AR
上位結合基序	無偏好	AR	無偏好	無偏好	H＞K	L＞N＞V＞A＞I＞Q＞T	I＞L＞M＞K＞P＞V	T＞G＞S＞K＞A＞D＞L＞P	AR

使用這些資訊，可透過僅打亂優選殘基而在無偏好殘基中占位元符的情況下，鑒定肽：MHC結合多肽的多肽分子之脫靶肽。然後將得到潛在脫靶肽序列的列表。

下一步，可在如本文其他地方所述存檔肽：MHC複合體中展示的肽的相應數據庫中進行搜索，以查找包含此類結合基序的肽。

表1d：透過本發明方法鑒定的肽具有如上確定的上位結合基序

肽代碼	SEQ ID NO		AR			上位結合基序	AR
PRAME-004	1	S	L	L	Q	H	L	I	G	L
IFT17-003	2	F	M	N	P	H	L	I	S	V
MCM5-006	3	M	L	A	K	H	V	I	T	L
IFIT1-001	4	V	L	L	H	H	Q	I	G	L
FADS2-001	5	L	L	L	A	H	I	I	A	L
CTBP1-001	6	A	L	M	Y	H	T	I	T	L
ITSN1-001	7	I	L	A	M	H	L	I	D	V
ATP1A1-001	8	F	L	P	I	H	L	L	G	L
MCMB-002	9	Y	L	I	L	H	L	I	S	T
EHD4-001	10	A	L	A	K	H	L	I	K	I
SF3B3-005	11	T	L	V	Y	H	V	V	G	V
EHD-001	12	A	L	A	N	H	L	I	K	V
FARSA-001	13	L	T	L	G	H	L	M	G	V
INTS7-002	14	I	L	G	T	H	N	I	T	V
MLXI-001	15	K	L	T	S	H	A	I	T	L
PPP4R1-003	16	H	L	M	P	H	L	L	T	L
RIF1-004	17	A	I	W	E	K	L	I	S	L
SFXN3-001	18	S	L	T	K	H	L	P	P	L
TBCK-002	19	A	L	S	P	H	N	I	L	L
TNRC6B-001	20	S	L	A	R	H	L	M	T	L
ZFYVE16-002	21	A	L	C	P	H	L	K	T	L

然後可合成這些肽，並測試與相應PRAME-004結合多肽的交叉反應性。

圖8：使用位置掃描鑒定針對PRAME-004的肽：MHC結合多肽的基於位置的結合基序，用丙氨酸替換肽序列除了錨定殘基以外第1-9位置的各氨基酸。對於每種肽，列出了靶肽PRAME-004與肽序列的丙氨酸取代變體的KD比。將KD比50%（虛線）的閾值用於確定結合劑識別的位置。透過生物膜層干涉法測定KD值。

相較於根據本發明的方法（其提供有關上位結合基序以及脫靶肽序列的詳細資訊，因而可探索和/或鑒定所述肽：MHC結合多肽的交叉反應性），僅用丙氨酸替換每個氨基酸只提供非常有限的資訊，即，僅鑒定為結合劑識別所需之給定氨基酸殘基的位置。

圖9：用所有蛋白原氨基酸（半胱氨酸除外）在每個位置進行氨基酸取代測定複合體結合基序。表示了靶肽PRAME-004與相應位置掃描變體的KD比，並進行灰度編碼（從白色到深灰色表示由低到高的值）。透過生物膜層干涉法測定KD值。

圖10：不同正常組織和腫瘤組織中MAGEA1的肽編碼源外顯子的表達特徵分析。有關圖的詳細說明，請參閱圖5的圖例。

圖11：不同正常組織和腫瘤組織上MAGEA1肽提呈的分析。有關圖的詳細說明，請參閱圖6的圖例。

圖12：透過本發明方法所鑒定的針對PRAME-004的肽：MHC結合多肽之潛在脫靶肽。描繪在使用針對PRAME-004的肽：MHC結合多肽進行親和層析之後獲得的MS信號強度相對於使用HLA-A*02特異性（「MHC泛特異性」）抗體BB7.2進行親和層析之後獲得的MS信號強度。同樣，可使用其他泛HLA特異性結合劑，例如，如表1所示。單個肽在BB7.2和結合劑之間的回收率與結合劑對這些肽（靶標和脫靶）的結合親和力相關。

信號強度的比值對應於至對角線（虛線）的距離，弱結合肽位於左上方，而強結合肽位於右下方。箭頭指示PRAME-004。所有結合劑的親和層析以使用大量過量的所有結合劑的方式進行。因此，每種肽的回收不受可用結合位點數量的限制。肽：MHC結合多肽和HLA-A*02特異性抗體BB7.2的幾乎定量沉澱導致最大值約為1，這表示結合劑強烈識別的肽出現於對角線附近。灰度表示透過使用HIS1K生物感測器的生物層干涉法測定的相對於靶標的結合親和力倍數降低，如本文其他地方所述。對於結合力低於生物層干涉法檢測極限的肽，結合親和力倍數降低設為1000/0.1%。

從中可以看出，兩種方法（(i)使用pMHC結合多肽和MHC泛特異性結合分子的平行結合實驗和(ii)生物層干涉法）對於脫靶肽親和力均提供相似的結果。由於在非常低信號強度下質譜測量的隨機性，無法對三種肽（例如 IFIT1-001）的MHC泛特異性抗體的MS信號強度進行定量，因此在圖中顯示為「不適用」。因此，無法計算這些脫靶的比值。但是，在進行親和層析之後的這些獨特鑒定的肽也透過生物層干涉測量法確認表明為高度相關脫靶。

然後可基於結合親和力倍數降低設定閾值，從而將與針對PRAME-004的肽：MHC結合多肽具有交叉反應性的肽和不再認為與之的交叉反應性太弱且因此不相關的肽區分開來。通常來說，鑒定的肽可分為強結合肽（結合親和力倍數降低≥ 0.1）、中結合肽（0.01 ≥結合親和力倍數降低＞ 0.1）和弱結合肽（0.001 ≥結合親和力倍數降低＞ 0.01）。

圖13：透過生物層干涉法確定的相對於靶標的結合親和力倍數降低與透過本發明方法確定的信號面積比值[pMHC結合多肽/BB7.2]的相關性。相關性分析（spearman秩相關性）得出rho值為0.84。使用函數 f(x)= a - exp(b*x-c)進行指數回歸。95%概率預測區間以虛線表示。三種肽僅在與肽：MHC結合多肽偶聯的基質上檢測到，因此無法計算出信號強度的比值。此值設置為最大檢測到的值。對於結合力低於檢測極限的肽，結合親和力倍數降低設為1000 來進行指數回歸。

圖14：用於鑒定相關脫靶的合成肽：MHC文庫的演示。描繪在使用針對PRAME-004的肽：MHC結合多肽進行親和層析之後獲得的MS信號強度相對於使用HLA-A*02特異性抗體BB7.2進行親和層析之後獲得的MS信號強度。信號強度的比值對應於至對角線（虛線）的距離，弱結合肽位於左上方，而強結合肽位於右下方。肽：MHC結合多肽和HLA-A*02特異性抗體BB7.2的幾乎定量沉澱導致最大值約為1。為了進行證明，對五個之前鑒定的脫靶、靶標和兩個非結合肽進行了同位素標記，載入到重組生產和重折疊的HLA-A*02:01同種異型 MHC 單體上，並用作合成加標物。

圖15：使用本發明方法和基於靶肽單個氨基酸的位置突變的合成肽文庫，測定針對PRAME-004的肽：MHC結合多肽之基於位置的結合基序。在這種情況下，除錨定殘基(AR)外，所有第1至9位置均被丙氨酸交換。合成肽被整合至pMHC複合體中，並添加至細胞裂解物基質中。描繪針對每個氨基酸交換位置如其他地方所述確定的結合親和力倍數降低。最大值標準化為1。誤差槓表示兩次技術重複的標準偏差。所獲得的基於位置的結合基序總體上與使用生物層干涉法在比較例中確定的基於位置的基序一致（圖8）。本發明方法似乎具有較高的靈敏度，也識別弱結合突變肽，這從第8位置的相對較高比值可以看出。儘管兩種方法之間的動態範圍不同，但單個弱結合肽的順序一致，第5位置是最強識別位置，其次是第7、6和8位置。這也與確定的上位結合基序（圖7）一致，所述上位結合基序顯示第5位置到目前為止具有最高選擇性，其次是第7、6和8位置。與位置掃描方法一致，圖7也顯示了第8位置對甘氨酸和多種所允許的氨基酸選擇性降低。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims

一種用於表徵包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽」）與肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）結合的方法，其包括 a)提出包含至少一種肽：MHC複合體的待分析樣本， b)使所述樣本與所述多肽分子（「pMHC結合多肽」）接觸，並允許所述多肽分子的所述至少一個肽結合結構域與所述至少一種肽：MHC複合體結合， c)分離與所述至少一個肽結合結構域結合的所述至少一種肽：MHC複合體，和 d)鑒定按步驟c)中所分離的所述至少一種肽：MHC複合體的所述肽，從而鑒定所述多肽分子與所述至少一種肽：MHC複合體的所述肽的結合。
如請求項1所述的方法，其中所述多肽分子任選地附著於基質材料，和/或其中所述多肽分子進一步包含至少一個與基質材料結合或與之附著的附著位點。
如請求項1或2所述的方法，其中表徵多肽分子與肽：MHC複合體的肽的結合包括鑒定多肽分子與肽：MHC複合體的所述肽結合。
如請求項1所述的方法，其中，所述樣本選自包含至少一種肽：MHC複合體的天然或人工樣本（例如，細胞裂解物），或包含純化或富集的肽：MHC複合體的樣本。
如請求項1所述的方法，其中包含所述至少一個肽結合結構域的所述多肽分子選自雙特異性、三特異性、四特異性或多特異性分子。
如請求項1所述的方法，其中包含所述至少一個肽結合結構域的所述多肽分子為選自以下的分子，或衍生自選自以下的分子：抗體、同時多重相互作用T細胞銜接(SMITE)雙特異性分子、雙特異性T細胞銜接分子(BiTE)、scFV、雙抗體、雙重親和力重靶向抗體(DART)、串聯抗體(TandAb)、可溶性TCR、scTCR、突變TCR（例如包含S橋）、截短TCR和雙特異性T細胞受體(TCR)-抗體融合分子。
如請求項1所述的方法，其中所述多肽分子包含至少一個第二結合結構域，該第二結合結構域選自與已知誘導免疫細胞激活的細胞表面分子以及免疫反應相關分子結合的結構域，優選為與CD3或其一個鏈（例如：CD3γ、CD3δ和CD3ε鏈）、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD18、CD22、CD25、CD28、CD32a、CD32b、CD33、CD41、CD41b、CD42a、CD42b、CD44、CD45RA、CD49、CD55、CD56、CD61、CD64、CD68、CD94、CD90、CD117、CD123、CD125、CD134、CD137、CD152、CD163、CD193、CD203c、CD235a、CD278、CD279、CD287、Nkp46、NKG2D、GITR、FcεRI、TCRα/β、TCRγ/δ和/或HLA-DR結合的第二結合結構域。
如請求項1所述的方法，其中包含所述至少一個肽結合結構域的所述多肽分子是包含衍生自T細胞受體(TCR)的肽結合結構域的雙特異性分子。
如請求項1所述的方法，其中包含所述至少一個肽結合結構域的所述多肽分子為可溶性分子。
如請求項2所述的方法，其中所述附著位點位於至少一個結合結構域、至少一個第二結構域或為單獨的附著基團，並且基本上不干擾所述分子的結合。
如請求項1所述的方法，其中，步驟d)中的所述鑒定包括選自質譜分析和肽測序的方法。
如請求項1所述的方法，其中，表徵多肽分子與肽：MHC複合體的肽的結合包括鑒定所述肽：MHC結合結構域的上位結合基序。
如請求項1所述的方法，其中，表徵多肽分子與肽：MHC複合體的肽的結合包括 a)鑒定所述肽：MHC結合結構域的多肽分子的基於位置和/或上位的結合基序，和/或 b)使用由本申請鑒定的肽來鑒定肽：MHC結合結構域的多肽分子之脫靶肽。
如請求項1所述的方法，其中，表徵多肽分子與肽：MHC複合體的肽的結合包括探索和/或鑒定所述肽與其他肽：MHC結合結構域的交叉反應性。
如請求項1所述的方法，其進一步包括鑒定所述肽基序(said peptide motif or peptide motifs)在癌性和/或非癌性細胞或組織上提呈的步驟。
如請求項1所述的方法，其中，所述方法進一步包括向步驟a)中的所述樣本添加至少 • 一種具有已知序列的肽和/或 • 一種定義的和/或預選定的肽：MHC複合體，其肽具有已知序列，優選為以預定的量添加（「加標」）。
如請求項16所述的方法，其中，所述肽的序列相對於包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽」）所結合的肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）的序列改變或突變。
如請求項16或17所述的方法，其中創建了包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽」）所結合的肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）的一系列突變體，並添加至步驟a)的樣本，每個突變體在其整個長度上或其至少一個亞級分中之一個位置上的氨基酸殘基被取代成另一個氨基酸。
如請求項18所述的方法，其中，每個突變體在其整個長度上或其至少一個亞級分中之一個位置上的氨基酸殘基被取代成丙氨酸或甘氨酸。
如請求項16所述的方法，其中，包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽」）所結合的肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）的錨定位置無改變/突變。
如請求項2所述的方法，其中所述基質材料選自Sepharose^® 或瓊脂糖(agarose)。
如請求項1所述的方法，其中所述方法進一步包括使步驟b)和/或c)的所述樣本與一個或更多其他結合結構域分子（例如，廣泛的特異性TCR和/或抗體）接觸。
如請求項22所述的方法，其中，至少一種廣泛的特異性結合結構域分子為對一個或多個MHC分子單獨具有結合特異性的MHC泛特異性結合分子，無論該一個或多個MHC分子所結合的肽為何。
如請求項21或22所述的方法，其中， (i)使樣本的第一部分與pMHC結合多肽接觸，並且 (ii)樣本的第二部分與另一種pMHC結合多肽或MHC泛特異性結合分子接觸其中進一步地，在分離出與pMHC結合多肽和另一種pMHC結合多肽或MHC泛特異性結合分子結合的肽：複合體後，比較兩個部分中獲得的分離效率。
如請求項1所述的方法，其中，在步驟b)或c)中，使用了大量超量的pMHC結合多肽和任選地MHC泛特異性結合分子。
如請求項24所述的方法，其中，基於分離效率的比較，確定了第一和第二部分中使用的結合劑（結合多肽或結合分子）與樣本中不同肽的結合親和力。
如請求項1所述的方法，其中所述方法中的至少一種分子包括可檢測的標誌物或標記。
如請求項1所述的方法，其進一步包括對所述鑒定和/或脫靶結合進行計算分析。
如請求項14所述的方法，其中，所述肽：MHC結合結構域的交叉反應性透過至少一項細胞毒性實驗進一步探索。
一種套件，其包含實施如請求項1至29任一項中所述的方法的材料，例如，a)基質材料，以及b)包含與至少一種肽：MHC複合體結合的所述至少一個肽結合結構域的多肽分子。
一種包含至少一個定義肽結合結構域的多肽分子（「pMHC結合多肽」），其中其與肽：MHC複合體的肽（「靶肽」）的結合用如請求項1至29中任一項中所述的方法進行表徵。