KR20220044485A - 펩티드:mhc 결합 폴리펩티드의 특성화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 예를 들어, 질량 분석법 및 인식된 펩티드 공간의 분석에 의해, 즉 MHC에 의한 제시의 맥락에서 결합될 수 있는 펩티드 및 결합될 수 없는 펩티드를 확인하기 위한 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 특성화 방법에 관한 것이다.

Description

펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 특성화 방법

본 발명은, 예를 들어, 질량 분석법 및 인식된 펩티드 공간의 분석에 의해, 즉 MHC에 의한 제시(presentation)의 맥락에서 결합될 수 있는 펩티드 및 결합될 수 없는 펩티드를 확인하기 위한 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 특성화 방법에 관한 것이다.

면역요법은 종양학 분야에서 두드러진 역할을 하였으며 상이한 유형의 종양의 치료에 가치가 있는 것으로 판명되었다. 면역요법의 범위는 키메라 항원 수용체(CAR)로부터 종양-침윤 림프구(TIL) 및 T 세포 수용체(TCR)-형질도입 효과기 세포로 확장하여 다양하다. 다양한 연구들이 악성 종양에 대한 환자의 적응 면역 반응을 향상시키는데 TCR-조작된 T 세포를 성공적으로 사용하여 강력한 항종양 반응성을 입증한다. 그러나, 암에 대한 유전자 변형 T 세포의 효능은 독성이 증가하는 대신 크게 개선된다.

표적외(off-target) 독성은 형질도입된 T 세포 집단이 의도된 것 이외의 항원을 예기치 않게 공격하거나 이들의 특이성과는 무관하게 스스로를 활성화할 때 발생한다.

제US 2018/0125889호는 감마 델타 T-세포가 억제성 CAR을 발현하도록 조작될 수 있으며, 이것이 표적외 세포, 예를 들어 세포 표면 표적이 종양과 관련되지만 종양-특이성 항원이 아닌 비종양 세포에서 활성화를 최소화함을 나타낸다. 제WO 2018/053374호는 조작된 표적 세포, 또는 조작된 표적 세포의 집단을 T-세포, TCR 또는 TCR-유사 분자와 접촉시키고, T-세포, TCR 또는 TCR-유사 분자가 조작된 표적 세포, 또는 조작된 표적 세포의 집단에 결합하는지 여부를 결정하고/하거나 이러한 결합의 강도를 측정하기 위한 검정을 수행함을 포함하여, T-세포, TCR 또는 TCR-유사 분자의 독성 및/또는 표적외 효과를 예측하거나 연구하기 위한 T-세포 에피토프 스크리닝 방법을 기술한다.

Bijen 등(Bijen et at., 2018)은 HA-2 항원을 발현하지 않는 인간 섬유아세포 및 각질세포의 7B5 T-세포 클론에 의한 표적외 인식을 발견하였다. Bijen 등은 7B5 T-세포 클론에 의해 인식되는 표적외 펩티드(off-target peptide), 즉 CDH13-유래 펩티드를 확인하기 위한 조합 펩티드 라이브러리 스캐닝 접근법을 개시한다.

면역요법에서 표적외 독성을 감소시킬 필요가 남아 있다.

MHC 분자에는 두 가지 부류가 있다. 대부분의 유핵 세포에서 발견될 수 있는 MHC I 또는 II. MHC 분자는 각각 알파 중쇄 및 베타-2-마이크로글로불린(MHC 클래스 I 수용체) 또는 알파 및 베타 사슬(MHC 클래스 II 수용체)로 구성된다. 이들의 3차원 구조는 결합 홈을 생성하여 특정 펩티드와의 비공유 상호작용을 가능하게 한다.

MHC 클래스 I 수용체는 주로 내인성 단백질, 결함 리보솜 입자(DRIP) 및 보다 큰 펩티드의 단백질 가수분해 절단으로부터 야기되는 펩티드를 제시한다. MHC 클래스 II 수용체는 주로 전문 항원 제시 세포(APC)에서 발견될 수 있으며, 주로 세포내이입 과정 동안 APC에 의해 흡수되고 후속적으로 처리되는 외인성 또는 막관통 단백질의 펩티드를 제시한다.

펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합체(complex)는 적절한 T-세포 수용체(TCR)를 지닌 CD8-양성 세포독성 T-림프구에 의해 인식되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체는 적절한 TCR을 지닌 CD4-양성 헬퍼-T 세포에 의해 인식된다. 이러한 인식 과정 동안, TCR, 펩티드 및 MHC가 1:1:1의 화학량론적 양으로 존재하고 복합체를 형성한다는 것은 잘 알려져 있다.

펩티드가 세포 면역 반응을 촉발(유도)하기 위해서는, MHC-분자에 결합해야 한다. 이 과정은 MHC-분자의 대립유전자 및 펩티드의 아미노산의 서열의 특정 다형성에 의존한다. MHC-클래스-1-결합 펩티드는 통상적으로 8-12개 아미노산 길이이며 통상적으로 MHC-분자의 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 적어도 2개의 보존된 잔기("고정 잔기(anchoring residue)", AR)를 이들의 서열에 함유한다. 이러한 방식으로, 각 MHC 대립유전자는 결합 홈에 특이적으로 결합하는 펩티드의 능력을 제어하는 결합 모티프를 갖는다. 그럼에도 불구하고, 상기 언급한 바와 같이, MHC 클래스 I 의존성 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정 MHC 클래스 I 분자에 결합할 수 있어야 할 뿐만 아니라 특정 T-세포 수용체(TCR)를 보유하는 T-세포에 의해 인식되어야 한다. 종양 특이성 세포독성 T-림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 이들의 에피토프는 발현되는 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 부류로부터 유래된 분자(펩티드)일 수 있으며, 동일한 기원의 변경되지 않은 세포에 비해, 각 종양의 세포에서 상향조절된다.

현재 개발 중인 많은 암 면역요법은 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 가용성 폴리펩티드 분자 형태로 대상체에 투여하거나 세포, 우선적으로 T 세포를 전달하여 이러한 폴리펩티드를 막 결합 분자로 발현하는 것에 의존한다.

이러한 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 대한 실제 표적 펩티드(target peptide) 서열은 통상적으로 확립/정의되어 있지만, 이들 분자가 결합할 수 있는 추가 펩티드의 수는 알려져 있지 않을 수 있다. 이러한 소위 "표적외 펩티드"는 잠재적으로 심각한 부작용으로 인해 생체내 적용에 대한 상당한 안전상의 위험이 된다. 이러한 부작용의 원인은 통상적으로 암 조직 이외의 건강한 조직 상의 이러한 표적외 펩티드의 제시이며, 각각의 치명적인 결과가 이전에 보고된 바 있다(예를 들면, 참조; (Linette et al., 2013)).

또한 최적화되지 않은 특정 T-세포 수용체(van den Berg etal., 2015) 및 Mage-A4 및 Mage-A10을 표적화하는 수용체(Adaptimmune 제품 ADP-A2M4 및 ADP-A2M10)로 형질도입된 T 세포의 투여시 문제들 및 잠재적으로 치명적인 중대한 이상 반응에 대한 사례 보고가 있다.

결과적으로, 이들 표적외 펩티드의 정체 및 이들의 안전 관련성에 대한 정확한 지식은 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 포함하는 암 면역요법의 적절한 개발을 위해 가장 관련성이 높다.

이러한 펩티드를 확인하기 위한 현재 전략은 표적 펩티드와 유사성을 갖는 펩티드에 대한 단백질 서열 데이터베이스의 검색을 포함한다. 이러한 접근법은 통상적으로 적용된 검색 매개변수에 따라 다수의 잠재적으로 수만 개의 펩티드를 생성하며, 이들 모두는 각각의 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 의해 결합될 가능성에 대해 다운스트림 분석에서 시험되어야 한다. 돌연변이 스캐닝 데이터와 같은 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드로부터의 추가 특성을 통합하여 이러한 검색을 수정하면 잠재적으로 다운스트림 분석에서 시험되어야 하는 펩티드의 수를 줄일 수 있지만, 여전히 이러한 펩티드가 생리학적 환경에서 MHC 분자에 의해 제시되는지 여부에 대한 정보를 제공하지 않으며, 따라서 여전히 생체내 적용에 상당한 안전상의 위험을 제기한다.

또한, 이러한 모든 접근법은 표적 서열에 대한 유사성이 어떻게 평가되는지 또는 돌연변이 스캐닝 데이터를 기반으로 하는 펩티드 서열의 특정 위치에서 어떤 아미노산이 허용되는지에 대한 확실한 가정을 필요로 한다. 이러한 가정을 충족하지 않는 펩티드는, 예를 들면 MHC 분자 또는 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 대한 이들의 결합 방식이 표적 펩티드 서열의 결합 방식과는 다르기 때문에, 이러한 접근법에 의해 확인할 수 없다. 이것은 표적 서열과 관련이 없는 완전히 상이한 아미노산 서열을 나타낼 수 있는, 표적 펩티드와는 길이가 상이한 펩티드(예를 들어 10량체 표적 펩티드로부터의 9량체 표적외 펩티드)와 특히 관련이 있다(Ekeruche-Makinde et al., 2013).

상기를 고려하여, 생체내 상황에 최대한 근접하도록 하는 목적으로 TCR의 표적 에피토프를 확인하는 효율적인 방법이 당업계에 필요하다. 이것은 또한 고도로 특이적일 뿐만 아니라 정상적인 건강한 조직을 표적으로 하지 않는 치료제가 개발될 수 있도록 분석 중인 TCR(또는 TCR-유사 분자)과 교차-반응성인 "표적외" 에피토프의 확인을 필요로 한다.

따라서, 부정확한 예측 알고리즘의 사용과 잠재적으로 수백 내지 수천 개의 잠재적인 표적외 펩티드의 성가신 시험을 피함으로써 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 의해 결합되거나 인식되는 관련 MHC 결합 펩티드의 확인을 위한 대안적이고 보다 직접적인 방법을 제공하는 것이 매우 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적은 포괄적이고 직접적인 방식으로 이들 분자에 의해 결합될 수 있는 표적외 펩티드(즉, MHC 제시 리간드)를 확인하기 위해 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 특성화를 위한 이러한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 제공된 바와 같은 하기 설명을 연구할 때 숙련가에게 쉽게 명백해질 것이다.

본 발명의 제1 측면에서, 본 발명의 목적은

a) 분석할 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,

b) 상기 샘플을 상기 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")와 접촉시키고, 상기 폴리펩티드 분자의 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인(domain)이 상기 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체에 결합하도록 하는 단계,

c) 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인에 결합된 상기 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체를 단리하는 단계, 및

d) 단계 c)에서 단리된 바와 같은 상기 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체의 상기 펩티드를 확인함으로써, 상기 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체의 상기 펩티드에 대한 상기 폴리펩티드 분자의 결합을 확인하는 단계를 포함하여, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드")에 대한 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")의 결합을 특성화하는 방법에 의해 해결된다.

하나의 실시양태에서, 상기 펩티드 결합 도메인의 아미노산 서열은 T-세포 수용체(TCR), T-세포 수용체-유사 폴리펩티드, 및/또는 항체 또는 이들의 단순한 결합 도메인이거나, 그로부터 유래된다.

본원에 사용된 용어 "적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자"는 용어 "pMHC 결합 폴리펩티드"와 상호교환적으로 사용된다.

이러한 pMHC 결합 폴리펩티드는, 예를 들면, 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같은 항체, 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체, 또는 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같은 T-세포 수용체(본원에서 "TCR"이라고도 함), 바람직하게는 가용성 T-세포 수용체, 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체이다.

결합 폴리펩티드 내의 용어 "정의된 펩티드 결합 도메인"은, 예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 또는 TCR의 α- 및 β-서브유닛의 가변 도메인을 지칭한다.

결합 폴리펩티드 내의 용어 "정의된 펩티드 결합 도메인"은 또한 항체 또는 TCR의 적어도 하나의 가변 도메인의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(본원에서 "CDR"이라고도 함)을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 펩티드:MHC 복합체에서 용어 "펩티드"는 용어 "표적 펩티드"와 상호교환적으로 사용된다.

용어 "펩티드:MHC 복합체"는 "pMHC 복합체" 또는 심지어 "pMHC"로 축약될 수 있다.

하나의 실시양태에 따르면, 청구된 방법에서, 폴리펩티드 분자는 임의로 매트릭스 물질(matrix material)에 부착되고/되거나 상기 폴리펩티드 분자는 매트릭스 물질에 결합하거나 부착되는 적어도 하나의 부착 부위를 추가로 포함한다.

이러한 실시양태는 폴리펩티드 분자가 예를 들어 교차 반응성에 대해 특성화되는 방법 자체와만 관련된다는 것을 언급하는 것이 중요하다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 폴리펩티드 분자 자체는 가용성일 수 있다.

하나의 실시양태에 따르면, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 특성화하는 것은 펩티드:MHC 복합체의 상기 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 확인하는 것을 포함한다.

또 다른 바람직한 측면에서, 본 개시내용은, 예를 들면:

a) 표적외 펩티드:MHC 복합체를 포함하는 샘플, 예를 들어 세포 용해물을 제공하는 단계(여기서, 상기 샘플은 상기 펩티드 결합 도메인의 펩티드 결합 특성을 정의하는 표적 펩티드:MHC 복합체를 반드시 포함하지는 않는다),

b) 매트릭스 물질에 임의로 커플링되거나 부착된 폴리펩티드와 상기 샘플을 접촉시키는 것을 포함하여 상기 샘플을 친화성 정제하는 단계(여기서, 상기 폴리펩티드는 상기 표적 펩티드:MHC 복합체에 결합하는 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 상기 표적 펩티드:MHC 복합체의 표적 펩티드에 결합하는 T-세포 수용체(TCR) 및/또는 항체이다),

c) 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인에 결합된 상기 표적외 펩티드:MHC 복합체를 단리하는 단계; 및

d) 단계 c)에서 단리된 바와 같은 상기 적어도 하나의 표적외 펩티드:MHC 복합체의 상기 표적외 펩티드를 확인하는 단계를 포함하여, 정의된 T-세포 수용체(TCR) 및/또는 항체 펩티드 결합 도메인에 결합할 수 있는 표적외 펩티드:MHC 복합체의 표적외 펩티드를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 맥락에서, 상기 샘플은 세포 용해물과 같은 분석할 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체를 포함하는 임의의 적합한 천연 또는 인공 샘플, 또는 정제되거나 농축된(enriched) 펩티드:MHC 복합체(들)를 포함하는 샘플로부터 선택될 수 있다. 펩티드:MHC 복합체(들)의 조성/특성 뿐만 아니라 분자의 농도/양은 알려져 있거나 알려지지 않을 수 있다. 샘플의 한 예는 펩티드:MHC 복합체의 라이브러리이며, 여기서 결합된 바와 같은 펩티드의 서열은 이들의 길이 및 아미노산 서열이 정의되어 있고/있거나 유사하다.

하나의 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자는 추가 결합 특이성을 포함하지 않으며, 즉, 이것은 펩티드 또는 펩티드:MHC 복합체에 대해 단일특이성이다.

본 발명에 따른 방법의 상이한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자는 이중특이성(bispecific), 삼중특이성, 사중특이성 또는 다중특이성 분자로부터 선택된다.

본 발명의 방법의 맥락에서 용어 "이중특이성"은 적어도 2개의 원자가 및 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖고 따라서 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 본 발명에 따르면 이러한 항원 결합 부위 중 하나는 정의된 펩티드 결합 도메인이다. 용어 "원자가"는 폴리펩티드 분자의 결합 부위의 수를 지칭하며, 예를 들어 2가 폴리펩티드는 2개의 결합 부위를 갖는 폴리펩티드와 관련된다. 원자가라는 용어는 결합 부위의 수를 나타내며, 여기서 이러한 결합 부위는 동일하거나 상이한 표적에 결합할 수 있고, 즉, 2가 폴리펩티드 분자는 단일특이성, 즉 하나의 표적에 결합하거나, 이중특이성, 즉 두 개의 상이한 표적에 결합할 수 있음을 주지해야 한다.

이 경우에 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드는 T-세포 수용체(TCR), T-세포 수용체-유사 폴리펩티드, 및/또는 항체, 또는 특이적/정의된 펩티드:MHC 복합체에 결합할 수 있거나 특이적/정의된 펩티드:MHC 복합체에 대한 상기 분자의 결합을 매개할 수 있는 이들 분자의 단편이거나 이로부터 유래한다.

적어도 하나의 펩티드 결합 도메인은 항체, 동시 다중 상호작용 T-세포 관여(simultaneous multiple interaction T-cell engaging; SMITE) 이중특이성, 이중특이성 T-세포 관여항체(bispecific T-cell engager; BiTE), scFV, 디아바디(diabody), 이중-친화성 재표적 항체(dual-affinity re-targeting antibody; DART), 탠덤 항체(tandem antibody; TandAb), 가용성 TCR, scTCR, 돌연변이된 TCR, 예를 들면 S-브릿지(s-bridge)를 포함하는 돌연변이된 TCR, 절두된 TCR, 및 이중특이성 T-세포 수용체(TCR)-항체 융합 분자로부터 선택된 분자일 수 있거나 이들 분자로부터 유래된다.

하나의 예에서, 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인은 항체일 수 있거나 항체로부터 유래된다.

본 발명의 맥락에서, "정의된" 또는 "정의하는" 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드는 MHC의 맥락에서 선택된("표적화된") MHC 펩티드에 결합하는 폴리펩티드(결합 도메인을 구성하거나 포함함)를 의미할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 선택된 MHC 펩티드에 대한 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 상기 결합은 다른 (알려진) MHC 펩티드와 비교할 때 가장 높은 친화도 및/또는 선택도로 일어난다.

본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 예는 PRAME-004 펩티드 SLLQHLIGL(서열 번호 1)에 대한 친화성을 보이는 실시예 1, 3, 4 및 5의 정의된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 본원에서 MAGEA4/8 펩티드로도 지칭되는 서열 KVLEHVVRV(서열 번호 24)를 갖는 MAGEA4/A8 유래 펩티드에 대한 향상된 친화도를 보이는 실시예 2의 정의된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드이다.

정의된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 결합은 MHC의 맥락에서 표적화된 펩티드에 대한 결합 또는 표적화된 펩티드 및 MHC 폴리펩티드 둘 다에 대한 결합을 포함할 수 있다.

최근 몇 년 동안 펩티드 리간드에 대한 TCR 및 TCR-유사 분자를 스크리닝하는 몇 가지 방법이 기술되었지만, 현재까지 이러한 방법은 제한된 성공을 거두었다. 예를 들면, Birnbaum 등은 ~2.1 x 10⁸개 항원 꼬마유전자의 펩티드:MHC("pMHC") 효모 디스플레이 라이브러리를 개발하였다(Birnbaum et al., 2014). Birnbaum의 시스템을 사용하여, 가용성 TCR에 결합된 세포를 자기 비드로 정제한 다음 고속 대량 서열분석(sequencing)에 적용하였다. 4 라운드의 선택 후, 5개의 별개의 마우스 TCR과 교차 반응성인 수백 개의 펩티드가 확인되었다. 그러나, TCR이 결합하는 것으로 알려진 원래 에피토프는 검출되지 않았다.

본 발명은 바람직하게는 펩티드 및 단백질과 같은 유기 분자의 혼합물(예를 들어, 조직 또는 세포주로부터 생성된 단백질 용해물, 재조합적으로 생성된 펩티드:MHC 분자의 라이브러리)로부터 특정 펩티드:MHC 분자를 단리하거나 농축시키기 위해 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 사용하고, 예를 들어 단리된 펩티드:MHC 분자를 분석하고 결합된 펩티드의 서열을 확인하기 위해 후속 질량 분석을 사용한다.

본 발명의 방법은 "표적외 예측 접근법"으로 지정될 수 있는 최신 기술의 방법과 비교하여 많은 이점을 갖는다.

표적외 결합제의 실제 확인을 위해, 예측 접근법에서는 결합제 모티프를 사용하여 많은 펩티드 목록을 예측한 다음 힘든 시험관내 검사를 수행한다. 본 발명에서는, 세포 용해물과 같은 샘플로부터 직접 확인이 가능하다. 이것은 시험관내 검정에서 예측된 펩티드의 번거로운 검사를 필요로 하지 않는다. 또한, 이 방법은 매우 민감하여 약하게 교차-인식된 펩티드도 확인할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

예측 접근법에서는, 알려지지 않은 표적외 인식의 출처를 확인하는 것이 불가능하다. 대조적으로, 본 발명에서는 샘플, 예를 들어 용해물을 생성하고, 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 사용한 친화성 크로마토그래피 실험에서 상기 용해물을 사용함으로써 이것이 가능하다.

예측 접근법에서는, 결합제 모티프 생성이 위치 스캐닝 데이터로부터 추론되는 반면, 본 발명에서는 확인된 표적외로부터 추론되고, 추가로 사전 시험관내 검사 필요 없이 펩티드(들) 아미노산 서열의 상이한 위치에서 다중 치환을 고려한다.

또한, 제시된 방법은 특정 HLA 알로타입(예를 들어, HLA-A*02:01)의 분석으로 제한되지 않으며 상이한 HLA 알로타입에 의해 제시된 표적외를 확인하는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 알로반응성은 현재 사용 가능한 표준 접근법으로는 평가하기 어렵고 예측 방법을 사용할 수 없다.

마지막으로, 펩티드 서열의 길이 변이체 및 변형과 관련하여, 예측 검정에서는 길이 변이체 또는 자연 발생 펩티드 변형의 예측은 불가능하며, 본 발명의 검정은 예를 들면, 인산화 및 글리코실화와 같은 모든 길이 변이체 및 자연 발생 펩티드 변형을 직접 확인할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 생물학적 샘플 또는 생물공학적 생산으로부터 유래된 펩티드:MHC 분자의 혼합물로부터 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 의해 인식되는 펩티드:MHC 분자의 농축 또는 단리, 및 농축/단리된 펩티드:MHC 분자의, 예를 들어, 질량 분석법에 의한 확인, 및 시험관내 동일한 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 의해 결합될 가능성에 대한 확인된 펩티드의 후속 검사를 포함하여, 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 의해 결합된 펩티드를 특이적이고 신뢰할 수 있게 확인한다.

펩티드:MHC 복합체에 결합하는 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드 분자가 이중특이성, 삼중특이성, 사특이성 또는 다중특이성 분자로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.

상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드 분자가 T-세포 수용체(TCR)로부터 유래된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 분자인 본 발명에 따른 방법이 더욱 바람직하다.

또 다른 측면에서, 표적 펩티드:MHC 복합체에 결합하는 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 함유하는 폴리펩티드는 T-세포 수용체(TCR)로부터 유래된 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 분자일 수 있다.

다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 결합 특성이 상이한 폴리펩티드의 세트를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

유리하게는, 독립항에 기술된 바와 같이 제시된 방법은 표적 펩티드의 개별 위치에서 단일 아미노산의 치환에 의해 결합 모티프를 결정하고, 후속적으로 기능 분석에서 이러한 펩티드 변이체의 인식을 시험한 다음 인간 프로테옴 데이터베이스를 사용하여 상기 결합 모티프에 기반한 잠재적인 표적외를 예측하고 후속적으로 상기 설명된 바와 같이 시험관내 검정에서 이러한 (잠재적으로) 다수의 펩티드를 시험하는 것이 반드시 필요하지는 않다.

또 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 바람직하게는 상기 및 본원의 비교 실시예에 설명된 바와 같은 적절한 HLA 알로타입에 의해 생물학적 샘플에 제시되는 관련 펩티드에 초점을 맞춘 예측-기반 접근법과 비교하여 확인된 표적외 펩티드의 수를 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배, 가장 바람직하게는 적어도 10배 감소시킨다.

또 다른 측면에서, 적어도 하나의 결합 도메인은 검출 가능한 마커(marker) 또는 표지(label)를 함유할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 상기 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 교차-반응성(cross-reactivity)은 적어도 하나의 세포독성 실험에 의해 추가로 조사된다. 이것은 예를 들어 표시된 농도의 PRAME-004 특이 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 존재하에 인간 CD8+ T 세포(50,000개 세포/웰)와 공동-배양된 각각의 펩티드가 부하된 T2 세포에 의해 수행될 수 있다(도 4 및 본원의 다른 곳의 각각의 설명 참조).

본 발명은 또한 a) 본원에 기술된 매트릭스 물질과 같은 물질, 및 b) 표적 펩티드:MHC 복합체에 결합하는 적어도 하나의 결합 도메인을 함유하는 폴리펩티드를 포함하는 방법을 수행하기 위한 물질을 함유하는 키트(kit)에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 추가로 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")에 관한 것이며, 여기서 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드")에 대한 결합은 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따르는 방법으로 특성화되었다.

이러한 폴리펩티드 분자는 본원의 다른 곳의 방법의 맥락에서 논의된 바와 같이 항체 또는 T 세포 수용체, 또는 변형된 형식일 수 있다.

이러한 폴리펩티드 분자는 본원의 다른 곳의 방법의 맥락에서 논의된 바와 같이 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있다.

이러한 폴리펩티드 분자는 본원의 다른 곳의 방법의 맥락에서 논의된 바와 같이 가용성일 수 있다.

이러한 폴리펩티드 분자는 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드"), 또는 KD < 500nM의 펩티드:MHC 복합체에 대한 친화성을 가질 수 있다.

방법의 맥락에서 논의된 폴리펩티드 분자의 모든 바람직한 실시양태는 여기에도 적용되며 경제성을 위해 반복하지 않을 것이다.

본 발명은 또한 숙주 세포를 제공하는 단계, 제2 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 표적 특이성 항원 인식 작제물을 제공하는 단계, 상기 숙주 세포에 상기 표적 특이성 항원 인식 작제물을 도입하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 상기 표적 특이성 항원 인식 작제물을 발현시키는 단계를 포함하여, 표적 특이성 항원 인식 작제물을 발현하는 세포 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 발현시키는 단계는 세포 표면 상에 항원 인식 작제물을 제시하는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 표적 특이성 항원 인식 작제물은 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 함유하는 발현 작제물일 수 있다. 또 다른 측면에서, 표적 특이성 항원 인식 작제물은 포유동물 기원, 임의로 인간 기원일 수 있다. 표적 특이성 항원 인식 작제물은 추가로 변형된 TCR일 수 있으며, 여기서 상기 변형은 표지를 포함하는 기능적 도메인, 또는 막 고정 도메인을 포함하는 대안적 도메인의 추가를 포함한다.

또 다른 측면에서, 표적 특이성 항원 인식 작제물은 알파/베타 TCR, 감마/델타 TCR, 또는 단일 사슬 TCR(scTCR)일 수 있다. 또 다른 측면에서, 표적 특이성 항원 인식 작제물은 레트로바이러스 형질도입에 의해 상기 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 방법은 숙주 세포로부터 표적 특이성 항원 인식 작제물을 단리 및 정제하는 단계, 및 임의로, T-세포에서 표적 특이성 항원 인식 작제물을 재구성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 세포, 특히 T-세포, 집단에 관한 것이다.

표적 특이성 항원 인식 작제물, 및 본 방법에 의해 생산된 세포, 특히 T-세포는 질환에 대한 치료에서 개선된 특성을 보일 것으로 예상되며, 여기서 상기 치료는 면역요법을 포함한다. 본 발명의 방법이 생체내 방법과 더 가깝거나/더 유사한 상황을 닮아 있다는 사실 때문에, 표적외 효과 및 부작용에 덜 직면할 것이다. 이것은 의료 및 임상 용도에 이점이 있다: HLA-A^*02:01 유전자이식 마우스의 면역화로부터 유래된 변형된 항-MAGE-A3 TCR을 검사하는 임상 시험에서, 암 환자 9명 중 2명은 뇌에서 발현되는 동일한 유전자 계열로부터 유래된 펩티드의 인식으로 인해 치명적인 표적내(on-target) 신경학적 독성이 발생하였다(Morgan et al., 2013).

친화성-향상된 항-MAGE-A3 TCR을 골수종 및 흑색종 환자를 대상으로 시험하는 또 다른 시험에서, 2명의 환자는 심각한 심근 손상을 초래하는 완전히 다른 펩티드의 인식에 의해 유발된 표적외 독성으로 사망하였다(Linette etal., 2013; Raman et al., 2016). 이러한 임상 사례는 최적의 흉선 선택을 거치지 않은 TCR의 정확한 특이성 및 결과적인 효과를 예측하는 것이 얼마나 어려운지를 보여준다. 특히 TCR-조작된 T 세포는 매우 민감하기 때문에 TCR의 정확한 특이성을 광범위하게 검증하는 전략을 개발하는 것이 중요하다(Jahn etal., 2016; Stone and Kranz, 2013).

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기와 같은 세포 집단을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 암을 가진 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 암은 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)(NSCLC), 소세포 폐암(small cell lung cancer)(SCLC), 신세포암(renal cell cancer), 뇌암, 위암, 결장직장암, 간세포암(hepatocellular cancer)(HCC), 췌장암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma), 흑색종, 난소암(ovarian cancer)(OC), 방광암, 자궁암, 담낭 및 담관암, 식도암(OSCAR) 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 담관세포 암종(cholangiocellular carcinoma), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 교모세포종(glioblastoma), 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma), 비호지킨 림프종(non-hodgkin lymphoma) 및 자궁내막암(endometrial cancer)으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 숙주 세포는 환자로부터 수득될 수 있다. 또 다른 측면에서, 숙주 세포는 건강한 기증자로부터 수득될 수 있다. 또 다른 측면에서, 숙주 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다.

또 다른 측면에서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자일 수 있다. 또 다른 측면에서, MHC 분자는 HLA-A^*02 분자일 수 있다.

상기 폴리펩티드 분자가 면역 세포의 활성화를 유도하는 것으로 알려진 세포 표면 분자에 결합하는 도메인으로부터 선택되거나 면역 반응-관련 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 결합 도메인, 바람직하게는 CD3 또는 CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 사슬과 같은 이의 사슬 중 하나, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45RA, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD152, CD163, CD193, CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FcεRI, TCRα/β, TCRγ/δ, 및 HLA-DR에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.

하나의 실시양태에 따르면, 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자는 가용성 분자이다. 이러한 가용성 폴리펩티드 분자, 예를 들어, 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같은 항체, T 세포 수용체 또는 이로부터의 유도체가 바람직한 치료 양식이다.

하나의 실시양태에 따르면, 폴리펩티드 분자는 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드"), 또는 K_D < 100nM의 펩티드:MHC 복합체에 대한 친화성을 갖는다.

K_D는 해리 상수, 즉 가역적으로 분리(해리)하려는 표적-결합제 복합체의 경향을 측정하는 평형 상수이다. K_D를 결정하는 한 가지 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하는 것이다.

바람직하게는, 폴리펩티드 분자는 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드"), 또는 K_D < 100 nM; < 50 nM; < 20 nM; < 10 nM; < 5 nM; < 2 nM; < 1 nM; < 500 pM; < 400 pM; < 300 pM; < 200 pM; < 100 pM; < 50 pM; < 20 pM; < 10 pM; 또는 < 1 pM의 펩티드:MHC 복합체에 대한 친화성을 갖는다. 가장 바람직한 범위는 10 nM 내지 500 pM이다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 측면에서, 상기 매트릭스 물질에 결합하거나 부착되는 상기 부착 부위는 적어도 하나의 결합 도메인, 적어도 하나의 제2 도메인에 위치하거나 별도의 부착 그룹이며, 본질적으로 상기 분자의 결합을 방해하지 않는다.

펩티드:MHC 분자의 단리가 고체 매트릭스에 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 커플링한 후에 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전에 의해 수행되는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.

상기 매트릭스 물질이 Sepharose^®　또는 아가로스(agarose)로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 결합은 또한 고체 매트릭스가 없는 용액에서 (배치로서) 수행될 수 있으며, 복합체는 예를 들어, 항체, 침전, 여과 등을 사용하여 적절하게 단리될 수 있다.

또 다른 측면에서, 상기 방법은 단계 b) 및/또는 c)에서 상기 샘플을, 예를 들면, 광범위 특이성(broad specific) TCR 및/또는 항체와 같은 하나 이상의 다른 결합 도메인 분자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 광범위성 특이 결합 도메인 분자는 바람직하게는, 이에 결합된 펩티드와 관계없이, 하나 이상의 MHC 분자 단독에 대해 결합 특이성을 갖는 결합 도메인 분자이다. 이러한 결합 분자를 본원에서 MHC pan-특이성이라고 한다.

본 발명의 하나의 실시양태에서,

(i) 샘플의 제1 분획은 pMHC 결합 폴리펩티드와 접촉되고,

(ii) 샘플의 제2 분획은 다른 pMHC 결합 폴리펩티드 또는 MHC pan-특이성 결합 분자와 접촉되며,

여기서 추가로, pMHC 결합 폴리펩티드 및 다른 pMHC 결합 폴리펩티드 또는 MHC pan-특이성 결합 분자에 결합된 펩티드:MHC 복합체를 단리한 후, 두 분획에서 달성된 단리 효율을 비교한다.

이것은 예를 들면 상이한 결합 분자로 동시에 수행된 각 단리의 질량 분석 데이터 세트를 조합함으로써 달성될 수 있다. 각각의 확인된 펩티드에 대한 정량적 데이터는, 실시예 2에 예시된 바와 같이, 상이한 pMHC 결합 폴리펩티드 또는 pMHC 결합 폴리펩티드와 MHC pan-특이성 결합 분자 사이의 펩티드의 단리 효율(isolation efficiency)의 비교를 가능하게 한다.

이것은 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 광범위 특이성 TCR 또는 항체의 배수 변화/농축 계수(enrichment factor)의 계산에 의해 분석된 생물학적 샘플에서 각 펩티드의 자연 존재비(natural abundance) 및 임의의 비특이성 결합에 대한 보정을 가능하게 한다.

본 발명의 방법의 하나의 실시양태에서, 단계 b) 또는 c)에서, 과량의 pMHC 결합 폴리펩티드 및 임의로 MHC pan-특이성 결합 분자가 적용된다. 이러한 방식으로, 각 펩티드의 회수는 이용 가능한 결합 부위의 수에 의해 제한되지 않는다.

본 발명의 방법의 하나의 추가의 실시양태에서, 샘플의 상이한 펩티드에 대한 제1 및 제2 분획에 사용된 결합제(결합 폴리펩티드 또는 결합 분자)의 결합 친화도는, 예를 들어 실시예 3에 예시된 바와 같이, 단리 효율의 비교에 기반하여 결정된다.

본 발명자들은 놀랍게도, 생물층 간섭법(biolayer interferometry)을 통해 수행된 비교 실험에서 알 수 있는 바와 같이(이 경우 Octet 측정; 도 12(후자는 회색 톤으로 표시됨) 및 도 13 참조), MHC pan-특이성 결합 분자(예를 들어, 항체 BB7.2 및 pMHC 결합 폴리펩티드) 사이의 개별 펩티드의 회수(=접촉 및 단리) 비율이 이들 펩티드(표적 및 표적외)에 대한 pMHC 결합 폴리펩티드의 결합 친화도와 상관관계가 있음을 보여주었다.

바람직하게는, 따라서 단리는 펩티드:MHC 복합체를 MHC 분자에 대한 pan-특이성 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 항체는 W6/32, B1.23.2, BB7.2, GAP-A3, Spv-L3, T

39, L243, 또는 IVD-12로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 펩티드:MHC 분자의 MHC 성분에 대해 지시되며 따라서 결합된 펩티드의 펩티드 서열의 특성에 관계없이 특정 MHC 알로타입에 결합된 모든 펩티드의 단리를 가능하게 하는 광범위-특이성(또는 다중-특이성 또는 비특이성) 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드와 병행하여 상기 펩티드:MHC 분자의 단리를 포함하는 방법이 더욱 바람직하다(도 1). 언급된 바와 같이, 이러한 광범위-특이성 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드는 항체, 예를 들어 HLA-A^*02 pan-특이성 항체 BB7.2 또는 pan-HLA-A,B, C 특이성 항체 W6/32일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 인간 MHC 분자에 대한 추가적인 마우스 하이브리도마 유래 항체 및 관련 pan-특이성은 표 1에 열거되어 있다.

표 1: 표시된 HLA 알로타입에 특이적인 일반적으로 적용되는 마우스 하이브리도마 유래 항체의 개요

동시에 수행된 각각의 단리에 대한 질량 분석 데이터 세트를 조합하면 확인된 각 펩티드에 대한 정량적 데이터가 생성되어 실시예 2에 열거된 바와 같은 상이한 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 또는 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 광범위 특이성 TCR 또는 항체 간의 펩티드의 단리 효율을 비교할 수 있다. 이것은 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 광범위 특이성 TCR 또는 항체의 배수 변화/농축 계수의 계산에 의해 분석된 생물학적 샘플에서 각 펩티드의 자연 존재비 및 임의의 비특이성 결합에 대한 보정을 가능하게 한다.

예를 들면 단리 과정에 사용된 물질의 표면에 결합하는 펩티드:MHC 분자의 혼합물로부터 비특이적으로 결합된 펩티드의 단리 및 고갈을 위한 추가 단계를 포함하는 방식으로 펩티드의 단리를 포함하는 방법이 추가로 바람직하다. 이러한 단계는 고체 매트릭스(예를 들어, Sepharose^®, 아가로스)를 포함하지만 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드가 없고 펩티드:MHC 분자의 혼합물이 각각의 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드로 단리 단계 전에 적용되는 또 다른 친화성-크로마토그래피 컬럼에 의해 구성될 수 있다(도 1 참조). 이러한 비특이적으로 결합된 펩티드의 후속 추출(용출) 및 질량 분석에 의한 확인은 이들의 확인을 가능하게 하고 추가 분석으로부터 이들 펩티드를 제외할 수 있게 한다.

상기 단계 d)에서의 확인이 질량 분석 및 펩티드 서열분석(sequencing)으로부터 선택되는 방법을 포함하는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법의 하나의 실시양태에 따르면, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 특성화하는 것은 상기 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 상위 결합 모티프(superordinate binding motif)를 확인하는 것을 포함한다.

이것이 어떻게 달성되는지에 대한 세부사항은 도 7과 각각의 설명에, 및 실시예 예 1에 제공되어 있다.

본 발명에 따른 방법의 하나의 실시양태에 따르면, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 특성화하는 것은 다음을 포함한다:

a) 상기 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 폴리펩티드 분자의 위치-기반 및/또는 상위 결합 모티프를 확인하는 것, 및/또는

b) 제시된 출원에 의해 확인된 펩티드를 사용하여 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 폴리펩티드 분자의 표적외 펩티드를 확인하는 것.

이것이 어떻게 달성되는지에 대한 세부사항은 도 7과 각각의 설명에, 및 실시예 예 1에 제공되어 있다.

본 발명에 따른 방법의 하나의 실시양태에 따르면, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 특성화하는 것은 다른 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 상기 펩티드의 교차-반응성을 탐색 및/또는 확인하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "상위 결합 모티프"는 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 결합을 여전히 유지하면서 펩티드 서열의 어느 위치에서 어떤 아미노산이 허용되는지를 설명하는데 사용된다.

본원에 사용된 용어 "위치-기반 결합 모티프"는 결합된 펩티드의 아미노산 서열에서 어떤 위치가 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드와의 상호작용에 관련되는지를 설명하는데 사용된다.

본원에 사용된 용어 "표적외 펩티드 서열"은 주어진 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 결합할 수 있지만 이들의 서열이 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드가 원래 설계되거나 이를 위해 선택되는 펩티드의 서열에서 벗어나는 펩티드 서열과 관련된다. 따라서, 이러한 표적외 펩티드 서열이 예를 들어, 건강한 비암성 조직에 표시되는 경우 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드가 건강한 조직에 대해 세포독성 활성을 나타낼 위험이 있다("종양외/표적외" 독성).

이것이 어떻게 달성되는지에 대한 세부사항은 도 7과 도 12 - 15, 및 각각의 설명, 및 제시된 실시예에 제공되어 있다. 확인된 펩티드 서열을 사용하여 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 결합 특성에 대한 정보를 추론하는 본 발명에 따른 방법이 더욱 바람직하다. 이러한 정보는 예를 들면 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 결합 모티프를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 결합 모티프는 결합된 펩티드의 아미노산 서열에서 어떤 위치가 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드와의 상호작용과 관련이 있는지("위치-기반 결합 모티프"), 더욱이 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 결합을 여전히 유지하면서 펩티드 서열의 어느 위치에서 어떤 아미노산이 허용되는지("상위 결합 모티프")를 설명하는데 사용된다. 확인된 펩티드의 아미노산 서열 및 펩티드 서열의 선택된 위치에서의 존재의 분석은 이러한 결합 모티프의 생성을 용이하게 한다. 후자는 결합 모티프에 포함된 정보를 검색 기준으로 사용하여 예를 들면 단백질 서열 데이터베이스로부터 안전 관련 표적외 펩티드의 예측을 수행하는데 추가로 사용될 수 있다.

단리 단계 이후에 함유된 모든 펩티드 서열이 가장 높은 감도에서 확인된 서열 일치에 대한 높은 신뢰도로 포괄적이고 정량적으로 확인되도록 하는 방식으로 질량 분석법에 의해 서열 확인이 달성되는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.

본 발명의 맥락에서, 다음과 같은 열거된 기술 및 방법 중 하나가 바람직하게 적용될 수 있다:

a) 다수의 상이한 질량 분석기 및 질량 분석 단편화 기술의 특정 용도 또는 조합(예를 들어, 충돌-유도 해리(CID), 표면-유도 해리(SID), 전자-포획 해리(ECD), 고에너지 C-트랩 해리(HCD), 전자-이동 해리(ETD), 음전자-이동 해리(NETD), 전자-분리 해리(EDD), 적외선 다광자 해리(IRMPD), 흑체 적외선 복사 해리(BIRD), 전자 이동/고에너지 충돌 해리(ETHCD), 자외선 광해리(UVPD), 전자-이동 및 충돌-유도 해리(ETCID)) 또는 펩티드 탠덤 MS(MS/MS) 스펙트럼의 더 양호한 서열 커버리지를 허용하는 활성화 에너지.

b) 데이터-종속성(DDA) 및 데이터-독립성 획득 모드(DIA)에서의 질량 분석 실험. 이것은 펩티드 서열의 미리 정의된 목록을 사용하는 특정 획득 전략(표적 분석) 또는 모든 이론적인 질량 스펙트럼(SWATH) 분석의 순차 창 획득과 같은 기타 방법을 추가로 포함할 수 있다.

c) 예를 들어 질량 분석계 분석 전 또는 직접 결합된 HPLC(예를 들어 수중 아세토니트릴 구배를 사용하여 실행되는 나노-UHPLC)에 의한 펩티드 혼합물의 사전-분리.

d) 더 강력한 통계 평가를 가능하게 하기 위해 동일한 펩티드 혼합물의 중복 측정.

e) 상이한 검색 엔진(예를 들어, MASCOT, Sequest, Andromeda, Comet, XTandem, MS-GF+) 또는 이러한 검색 엔진 중 하나를 사용한 소프트웨어 도구 및 데 노보 서열 식별 알고리즘을 사용하는 MS/MS 스펙트럼의 검색.

f) 예를 들어 pDeep과 같은 MS/MS 스펙트럼 예측을 위한 컴퓨터 도구를 추가로 사용하는 검색(Zhou et at., 2017).

g) 상이한 단백질 서열 데이터베이스(예를 들어 UniProtKB, IPI) 및 특정 목적을 위해 생성된 맞춤형 서열 데이터베이스(예를 들어 mRNA 서열로부터 번역된 단백질 서열)에 대한 MS/MS 스펙트럼의 검색.

h) MS/MS 스펙트럼 및 예를 들면 HPLC 컬럼 상의 체류 시간과 같은 펩티드 특이적 특성을 비교함으로써 이들의 정체를 확인하기 위한 해당 펩티드의 합성 버전에 대한 질량 분석 측정.

i) 이전에 확인된 MS/MS 스펙트럼(예를 들어 스펙트럼 라이브러리 또는 스펙트럼 아카이브)의 데이터베이스를 포함하는 MS/MS 스펙트럼의 검색. 이러한 데이터베이스는 새로 기록된 MS/MS 스펙트럼을 이전에 확인된 펩티드 서열의 각 MS/MS 스펙트럼과 비교함으로써 펩티드 확인 프로세스에 사용될 수 있다.

j) 확인 프로세스를 돕기 위해 이전에 확인된 펩티드의 실험적 또는 예측된 체류 시간(RT)에 대한 정보를 추가로 저장하는 i)에 기술된 바와 같은 임의의 데이터베이스.

j) 예를 들면 적절한 알고리즘(예를 들어 SuperHirn)을 사용한 MS 기능의 추출 및 통합에 의한 MS 또는 MS/MS 수준에서의 펩티드 신호 영역의 정량적 평가(Mueller et al., 2007).

암성(cancerous) 및/또는 비-암성 세포 또는 조직에서 상기 펩티드 또는 펩티드들의 제시를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.

이러한 확인은 결합 모티프의 확인 뿐만 아니라 암성 또는 비암성 조직에서 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 확인된 표적외 펩티드 서열의 확인 둘 다를 포함한다.

이를 위해, 암성 및 비-암성 조직 샘플로부터의 세포에 표시된 펩티드:MHC 복합체를 분석할 수 있다.

이를 수행하는 한 가지 방법은, 예를 들어, 면역친화성 포획(immunoaffinity capture)에 의해 펩티드:MHC 복합체 전체("면역펩티드돔(immunopeptidome)")를 단리하는 것이다. 그후 표시된 펩티드는 예를 들어 산 변성에 의해 MHC로부터 해리될 수 있다. 그후 펩티드 카고를 추출하고 HPLC에 의해 분획으로 분리하며, LC-MS/MS를 사용하여 이 분획의 펩티드 서열을 확인한다. 이러한 방식으로, 암성 및 감염된 세포와 조직으로부터의 세포를 포함한 다양한 세포 유형으로부터 수천 개의 펩티드를 확인할 수 있다.

이렇게 수득된 펩티드 서열은 그후 각각의 펩티드가 암성 및/또는 비-암성 세포 또는 조직에서 발견되었는지 여부에 대한 주석과 함께 데이터베이스에 입력된다. 그후 이러한 데이터베이스는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 확인된 결합 모티프 또는 상위 모티프에 상응하는 펩티드의 제시에 대해 스캔될 수 있다.

이를 달성하기 위한 방법 및 프로토콜은 특히 제WO2005076009호, 제WO201 1128448호 및 제WO2016107740호에 개시되어 있으며, 이들의 내용은 본원에 참고로 포함되고, 이들 모두는 본 출원인에게 양도된다.

따라서, 본 발명의 방법은 하기 기술 중 임의의 것을 적용하지만 이에 제한되지 않는 추가 조사에 의해 표적외 독성을 야기하는 이들의 관련성에 대해 확인된 펩티드를 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다:

i) 상이한 정상 또는 암 조직 뿐만 아니라 세포주에 대한 상기 표적외 펩티드의 소스 유전자의 유전자 발현 프로파일의 분석;

ii) 상이한 정상 또는 암 조직 뿐만 아니라 세포주에 대한 상기 표적외 펩티드의 펩티드 제시 프로파일의 분석; 및

iii) 상이한 정상 또는 암 조직 뿐만 아니라 세포주에 대한 상기 표적외 펩티드의 세포당 펩티드 카피 수의 분석.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 중요한 측면에서, 상기 방법은 특히 본원에 개시된 바와 같은 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 추가 변형(들)에 대한 준비에서 상기 확인 및/또는 표적외 결합의 컴퓨터 분석(computational analysis) 단계를 추가로 포함한다. 각 프로그램은 숙련가에게 잘 알려져 있다.

본 발명에 따르면, 표적외 펩티드가 이 방법에 의해 확인된다면, 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드는 이러한 표적외 펩티드에 대한 결합을 감소시키기 위해 적절하게 변경될 수 있다. 이러한 변경은 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 특이성을 개선하기 위해 특히 성숙 단계에서 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시키는 것을 포함한다. 이에 의해 새로 생성된 분자의 특이성은 도 2에서 표적 음성 세포주 T98G의 감소된 사멸에 의해 예시적으로 나타난 바와 같이 크게 개선될 수 있다. 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 각각의 성숙 방법은 숙련가에게 알려져 있으며, 특히 TCR의 6개의 상보성 결정 영역(CDR)과 같은 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 변화를 포함한다. 유사하게, 항체의 CDR이 그에 따라 변형될 수 있다(Smith et al., 2014; Stewart-Jones et al., 2009); 제US 2014-0065111A1호; 제WO 2017/174823A1호; 제WO 2016/199141호; 및 제WO 2012/013913호).

따라서 펩티드:MHC 혼합물이 유래된 상기 생물학적 샘플이 개별적으로 분석되거나 상기 방법의 단리 단계에서 조합될 수 있는 하나 내지 여러 암 세포주로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다. 도 3은 XPRESIDENT^® 데이터를 기반으로 어떻게 여러 세포주의 조합이 정상 조직 펩티드 공간의 커버리지를 증가시키는지를 예시하며, 이것은 샘플 생성을 위해 여러 세포주를 선택함으로써 이 방법으로 직접 해결할 수 있다. 숙련가는 강한 MHC 발현을 갖는 여러 세포주를 조합하거나, 예를 들면 관심 유전자로 형질감염 또는 바이러스 형질도입하거나 이러한 세포주에서 MHC 분자에 의해 제시되는 상이한 펩티드의 수를 증가시키거나 변형시키는 방식으로 MHC 발현을 증가시키거나 변형시키는 물질 또는 화학적 화합물(예를 들어 인터페론 감마)로 처리하는 방식으로 이러한 세포주를 변형하기를 원할 수 있다. 이러한 유전자는 특정 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 유전자(예를 들어 HLA-A^*02, HLA-DRB3), MHC 펩티드 처리 및 제시에 관련된 유전자(예를 들어 TAP1/2, LMP7) 또는 세포의 유전자 발현을 유도하거나 변형할 수 있는 전사 인자(예를 들어 AIRE)일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

펩티드:MHC 혼합물이 유래된 상기 생물학적 샘플이 하나 내지 여러 개의 일차 정상 조직 샘플 또는 건강한 공여자의 혈액 뿐만 아니라 암 환자로부터의 종앙 조직 또는 감염된 조직으로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법이 더욱 바람직하다. 특히 관련이 있는 것은 정상 조직 또는 이들 조직으로부터 유래된 단리된 세포 또는 이들 조직 상의 펩티드의 교차-인식의 경우 치명적인 이상 반응의 위험이 높은 특정 신체 구획이다. 이러한 정상 조직 또는 이로부터 단리된 세포는 뇌 조직, 심장 조직, 혈액, 폐 조직, 척수, 신경 조직 또는 간 조직일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

모든 생물학적 샘플은 본 발명에 따른 방법에 여전히 적합한 한 신선하거나 가공(예를 들어 동결 또는 조제)될 수 있다. 하나의 측면에서, 생물학적 샘플은 조직, 기관, 세포, 단백질 또는 세포의 막 추출물, 혈액, 또는 생물학적 유체, 예를 들어 대상체로부터 수득된 혈액, 혈청, 점액, 뇨, 복수액 또는 뇌액을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 하나의 실시양태에 따르면, 상기 방법은 단계 a)에서 상기 샘플에 적어도 다음을 바람직하게는 미리 결정된 양으로 첨가하는 것("스파이킹(spiking)")을 추가로 포함한다:

· 공지된 서열을 갖는 하나의 펩티드 및/또는

· 이의 펩티드가 공지된 서열을 갖는 하나의 정의 및/또는 미리 선택된 펩티드:MHC 복합체.

하나의 실시양태에 따르면, 상기 펩티드의 서열은 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")가 결합하는 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드")의 서열에 비해 변경되거나 돌연변이된다.

하나의 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")가 결합하는 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드")의 일련의 돌연변이체가 생성되고 단계 a)에서 샘플에 첨가된다. 그 안에서, 각각의 돌연변이체는, 이의 전체 길이에 걸쳐 또는 적어도 이의 하위분획(subfraction)에 걸쳐, 한 위치에서 대체 아미노산으로 치환된 아미노산 잔기를 갖는다.

하나의 실시양태에 따르면, 각 돌연변이체는, 이의 전체 길이에 걸쳐 또는 적어도 이의 하위분획에 걸쳐, 예를 들어 실시예 5에 예시된 바와 같이 한 위치에서 알라닌 또는 글리신으로 치환된 아미노산 잔기를 갖는다.

말한 바와 같이, 이렇게 수득된 돌연변이 펩티드는 제시된 방법의 단계 a)에서 샘플(예를 들어, pHLA 라이브러리 또는 세포 용해물)에 스파이킹될 수 있다. 이러한 접근법은 상위 결합 모티프를 훨씬 더 잘 특성화하고 잠재적인 표적외 펩티드를 식별할 수 있게 한다.

하나의 실시양태에 따르면, 스파이킹에 사용되는 합성 펩티드는 예를 들어 질량 분석 또는 게놈 데이터를 기반으로 하여 자연 발생 펩티드로부터 유래되며 실시예 4에 예시된 바와 같이 표적 펩티드에 대한 화학적 유사성과 같은 정의된 기준을 기반으로 하여 선택된다.

하나의 실시양태에서, 본원에 논의된 바와 같은 방법을 사용하면, 표적 펩티드 서열을 이들 펩티드의 평가를 위한 샘플에 포함시킬 필요가 없다. 또한, 상기 실시양태에서는, 표적 펩티드 서열 또는 다른 펩티드 서열과 관련하여 임의의 비율을 계산할 필요가 없다. 돌연변이된 펩티드의 결합 강도는 결합제 대 BB7.2 제제에서의 이들의 회수를 통해서만 결정된다.

하나의 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")가 결합하는 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드")의 고정 위치는 변경/돌연변이되지 않는다.

이러한 맥락에서, 소위 "고정 잔기"(본원에서 "AR"로 약칭됨)는 MHC에서 펩티드 결합 홈에 대한 펩티드의 결합을 매개한다는 것을 주지한다. HLA-A^*02:01에서, 이러한 고정 잔기는 P2에서 가장 흔히 류신이고, P9에서 류신 또는 발린이며, 결합 폴리펩티드와 펩티드:MHC 복합체 사이의 결합 반응에서 단지 미미한 역할을 한다.

본 발명에 따른 방법의 추가의 바람직한 측면에서, 펩티드:MHC 분자의 혼합물은 생물공학적 생산에 의해 인공적으로 생성될 수 있다. 후자는 원핵생물(예를 들어 대장균) 시스템에서 MHC 분자의 형질전환 및 발현으로 달성될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 MHC 분자는 예를 들면 이러한 분자의 막관통 부분을 대체하거나 변경함으로써 용해도를 증가시키도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 분자의 펩티드 부하 및 재구성은 관심 펩티드 뿐만 아니라 원하는 분자의 재구성을 촉진하는 추가 화학 물질(글루타티온, 아르기닌 등)의 존재하에 MHC 성분의 봉입체(예를 들어 단백질 중쇄(들) 및 베타-2 마이크로글로불린)의 재접힘으로 달성될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

숙련가는 제시된 방법에 따라 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드로 시험될 수 있는 수십 내지 수백 내지 수천, 수만 또는 수십만 개의 상이한 펩티드:MHC 분자의 라이브러리를 생성하기 위해 상이한 펩티드가 부하된 이러한 인공적으로 생성된 펩티드:MHC 분자 여러 개를 조합하기를 원할 수 있다. 숙련가는 인공적으로 생성된 펩티드:MHC 분자의 이러한 혼합물을 생물학적 공급원으로부터의 펩티드:MHC 분자의 또 다른 혼합물에 스파이킹하기를 추가로 원할 수 있다. 또 다른 측면에서 숙련가는 이러한 인공적으로 생성된 펩티드:MHC 분자를 ¹³C, ¹⁵N, 또는 ²H와 같지만 이에 제한되지 않는 하나 또는 여러 개의 안정한 중동위원소 표지를 포함하는 펩티드로 재구성할 수 있다. 그후 이러한 펩티드:MHC 분자는 예를 들면 생물학적 샘플로부터의 펩티드:MHC 분자의 다른 혼합물에 스파이킹되어 중질 표지를 포함하는 관심 펩티드의 추가 정보를 얻고 제시된 방법을 사용하여 펩티드 단리의 효율에 대한 정량적 질량 분석 데이터를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 추가의 바람직한 측면에서, 상기 방법은 상기 확인 및/또는 표적외 결합의 컴퓨터 분석과 조합된다.

이러한 추가 정보는 PMBEC, Blosum62, Pam250, NetMHC, NetMHCpan, SYFPEITHI와 같은 MHC 분자에 대한 펩티드 결합 및 펩티드 유사성에 대한 점수 계산으로 구성될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

두 펩티드의 "유사성"이라는 용어는 주어진 위치에서의 두 아미노산의 관련성을 고려한다(예를 들면, 아래 표 1a 참조). 유사한 아미노산 서열, 예를 들어, 표적 펩티드 서열과 유사한 표적외 펩티드 서열은 두 서열 간의 유사성의 통계적 분석을 수행하는 BLAST 알고리즘을 사용하여 단백질 데이터베이스에서 검색할 수 있다(예를 들어, 참조 (Karlin and Altschul, 1993)). 이러한 정렬에 대한 바람직한 설정은 단어 길이 3, 기대값(E) 10, BLOSUM62 또는 PMBEC 스코어링 매트릭스의 사용(Kim et al., 2009)이며, 바람직하게는 PMBEC 스코어링 매트릭스가 유사성의 결정에 사용된다. 이러한 매트릭스는 예를 들면 물리화학적 매개변수에 따른 유사성과 상관관계가 있는 아미노산 간의 진화적 또는 기능적 유사성을 기반으로 하여 아미노산 유사성을 정량화한다. 주어진 표적 펩티드 서열에서 아미노산의 각 치환에 대해 점수(소수 값)는 표적 펩티드 서열의 아미노산과 표적외 펩티드 서열의 치환된 아미노산의 유사성을 나타내는 이러한 매트릭스를 사용하여 계산할 수 있다. 다중 치환은 표적 펩티드 서열에서 개별 치환의 효과(점수)를 합산함으로써 고려될 수 있다. 정의상, 표적외 펩티드에 대해 달성될 수 있는 최대 점수는 치환되지 않은 표적 펩티드 서열에 의해 제공되는 반면, 표적외 펩티드를 야기하는 임의의 치환은 스코어링 매트릭스에서 벌점을 받으며 궁극적으로 표적외 펩티드의 더 낮은 점수로 이어진다. 그러나 이러한 최대 점수는 표적 펩티드의 길이 및 아미노산 서열에 따라 좌우된다(즉, 상이한 표적 펩티드 서열은 상이한 최대 점수를 가질 것이다). 전형적으로, 더 긴 아미노산 서열은 더 높은 점수를 초래한다. 그러나, 표적 펩티드의 점수는 이것이 구성하는 아미노산에 할당된 점수에 따라 좌우된다. 별개의 표적 펩티드 서열의 최대 점수의 차이를 고려하지 않고 표적 펩티드를 참조하여 표적외 펩티드의 유사성을 계산하고 비교할 수 있도록 하기 위해 표적 펩티드를 참조하여 표적외 펩티드의 유사성을 계산한 결과인 각 소수 값(decimal value)을 백분율 점수로 변환하며, 여기서 표적 펩티드 서열의 최대 점수는 항상 100%일 것이다.

표 1a: 각각 아미노산 및 보존적 및 반보존적 치환. 새로운 시스테인이 유리 티올로 남아 있는 경우 A, F, H, I, L, M, P, V, W 또는 Y에서 C로 변경하는 것은 반보존적이다. 또한, 숙련가는 입체적으로 요구되는 위치에서의 글리신은 치환되어서는 안된다는 것을 인지할 것이다.

이제 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 설명할 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에 인용된 모든 참고문헌은 전문이 참고로 포함된다.

도면 범례
도 1: 본 발명에 따른 실험적 접근법의 개략도. 펩티드:MHC 분자를 함유하는 샘플은 예를 들면 조직 또는 세포주로부터 유래된 펩티드:MHC 발현 세포의 용해물을 생성함으로써 제공된다. 대안적으로, 샘플은 인공적으로 생성된 펩티드:MHC 분자의 혼합물에 의해 구성되거나 이의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 특정 펩티드:MHC 분자는 예를 들면 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드가 부착된 매트릭스에 이를 접촉시킴으로써 이 샘플로부터 단리된다. 부착된 폴리펩티드를 함유하지 않는 글리신 컬럼은 매트릭스와 비특이적으로 상호작용하는 비특이적으로 단리된 펩티드:MHC 분자로부터 샘플을 고갈시키는데 사용될 수 있다. 질량 분석법이 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 의해 인식되는 펩티드 공간을 식별하고 서열분석하기 위해 샘플로부터 단리된 MHC 결합 펩티드를 식별하는데 사용될 수 있다. 그렇게 함으로써 예측 도구의 필요 없이도 이전에 알려지지 않은 표적외 위험을 설명할 수 있다. 이 접근법의 변형에서 동일한 펩티드:MHC 분자 함유 샘플은 분할될 수 있고 동시에 결합된 펩티드 종과 관계없이 이들 분자에 결합하는 HLA 광범위 특이성 항체 또는 TCR을 사용하여 두 번째 친화성 크로마토그래피를 거칠 수 있다. 예시된 예에서 HLA-A^*02 pan 특이성 항체 BB7.2가 본원에서 HLA-A^*02 면역펩티돔이라고 하는, 펩티드 서열에 관계없이 HLA-A^*02에 의해 제시된 모든 펩티드를 단리하기 위해 사용된다. 두 가지 단리 모두에서 관심(예를 들어, 표적외) 펩티드의 존재비(abundance)는 사용된 광범위 특이성 항체 또는 TCR, 이 예에서는 BB7.2와 비교하여 상기 펩티드에 대한 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 결합 친화도를 평가하는데 사용될 수 있다.
도 2: PRAME-004 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 두 가지 변이체를 사용한 표적 양성(U20S) 및 표적 음성(T98G) 세포주의 사멸을 보여주는 세포독성 실험(흑색 직사각형: 원래 변이체, 백색 점: 확인된 표적외 펩티드를 선택 결정인자로서 사용하여 PRAME-004에 대해 지시된 펩티드:MHC 특이성 결합제의 추가 성숙 라운드 후 특이성 개선된 변이체). 표적 음성 세포주 T98G의 사멸은 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 특이성-개선된 변이체를 사용할 때 크게 감소되는 반면, 표적 양성 세포주 U20S의 사멸은 약간만 영향을 받는다.
도 3: 샘플 생성을 위한 여러 세포주의 조합을 사용하여 HLA-A^*02 제시된 면역펩티돔의 높은 커버리지를 달성할 수 있다. 60개 세포주에 대한 XPRESIDENT^® 면역펩티돔 데이터에 기반하여, 정상 조직에서 적어도 10개의 펩티드 식별이 이전에 검출된 펩티드를 고려하고자 한다면 이미 이러한 세포주 중 10개의 조합이 HLA-A^*02 면역펩티돔의 60% 이상의 커버리지를 가능하게 할 것으로 나타났다.
도 4: 실시예 1로부터의 PRAME-004 특이성 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 사용한 분석에서 확인된 모든 펩티드의 세포독성 분석. 간단히 말해서, 10nM의 각각의 펩티드가 부하된 T2 세포를 표시된 농도의 PRAME-004 특이성 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 존재하에 인간 CD8+ T-세포와 공동-배양하였다. 48시간 후 LDH 방출을 측정함으로써 세포독성을 정량화하였다.
도 5: 상이한 정상 조직 및 종양 조직에서 IFT17-003의 소스 엑손을 암호화하는 펩티드의 발현 프로파일의 분석. 종양(흑색 점) 및 정상(회색 점) 샘플은 기원 기관에 따라 그룹화된다. 상자-수염 플롯(box-and-whisker plot)은 중간 FPKM 값, 25th 및 75th 백분위수(상자) + 하위 사분위수의 여전히 1.5 사분위수 범위(IQR) 내에 있는 가장 낮은 데이터 포인트 및 상위 사분위수의 여전히 1.5 IQR 내에 있는 가장 높은 데이터 포인트까지 확장되는 수염을 나타낸다. 정상 장기는 알파벳순으로 정렬된다. FPKM: 매핑된 리드 백만개 당 킬로베이스당 단편. 조직(좌측에서 우측으로): 정상 샘플: adipose (지방 조직); adrenal gl (부신); 담관; 방광; 혈구; bloodvess (혈관); 골수; 뇌; 유방; esoph (식도); 눈; gall bl (담낭); 머리&목; 심장; intest la (대장); intest sm (소장); 신장; 간; 폐; 림프절; nerve periph (말초 신경); 난소; 췌장; parathyr (부갑상선); perit (복막); pituit (뇌하수체); 태반; 흉막; 전립선; skel. mus (골격근); 피부; 척수; 비장; 위; 고환; 흉선; 갑상선; 기관; 수뇨관; 자궁. 종양 샘플: AML(급성 골수성 백혈병); BRCA(유방암); CCC(담관세포 암종); CLL(만성 림프구성 백혈병); CRC(결장직장암); GBC(담낭암); GBM(교모세포종); GC(위암); HCC(간세포 암종); HNSCC(두경부 편평 세포 암종); MEL(흑색종); NHL(비호지킨호지킨 림프종); NSCLCadeno(비소세포 폐암 선암종); NSCLCother(NSCLCadeno 또는 NSCLCsquam에 명확하게 할당할 수 없는 NSCLC 샘플); NSCLCsquam(편평 세포 비소세포 폐암); OC(난소암); OSCAR(식도암); PACA(췌장암); PRCA(전립선암); RCC(신세포 암종); SCLC(소세포 폐암); UBC(방광 암종); UEC(자궁내막암).
도 6: 상이한 정상 조직 및 종양 조직에 대한 IFT17-003의 펩티드 제시의 분석. 상단: 기술적 중복 측정으로부터의 중간 MS 신호 강도는 펩티드가 검출된 단일 HLA-A^*02 양성 정상(회색 점, 도면의 좌측 부분) 및 종양 샘플(흑색 점, 도면의 우측 부분)에 대한 점으로 표시된다. 상자는 정규화된 신호 강도의 중간, 25th 및 75th 백분위수를 표시하는 반면 수염은 하위 사분위수의 여전히 1.5 사분위수 범위(IQR) 내에 있는 가장 낮은 데이터 포인트, 및 상위 사분위수의 여전히 1.5 IQR 내에 있는 가장 높은 데이터 포인트까지 확장된다. 정상 장기는 알파벳순으로 정렬된다. 하단: 모든 장기에서 상대적인 펩티드 검출 빈도는 척추 플롯(spine plot)으로 표시된다. 패널 아래의 숫자는 각 장기에 대해 분석된 총 샘플 수 중 펩티드가 검출된 샘플의 수를 나타낸다(정상 샘플의 경우 N = 592, 종양 샘플의 경우 N = 710). 펩티드가 샘플에서 검출되었지만 기술적인 이유로 정량화할 수 없는 경우, 샘플은 이 검출 빈도 표현에 포함되지만 도면 상단에는 점이 표시되지 않는다. 조직(좌측에서 우측으로): 정상 샘플: adipose (지방 조직); adrenal gl (부신); 담관; 방광; 혈구; bloodvess (혈관); 골수; 뇌; 유방; esoph (식도); 눈; gall bl (담낭); 머리&목; 심장; intest la (대장); intest sm (소장); 신장; 간; 폐; 림프절; nerve cent (중추 신경); nerve periph (말초 신경); 난소; 췌장; parathyr (부갑상선); perit (복막); pituit (뇌하수체); 태반; 흉막; 전립선; skel. mus (골격근); 피부; 척수; 비장; 위; 고환; 흉선; 갑상선; 기관; 수뇨관; 자궁. 종양 샘플: AML(급성 골수성 백혈병); BRCA(유방암); CCC(담관세포 암종); CLL(만성 림프구성 백혈병); CRC(결장직장암); GBC(담낭암); GBM(교모세포종); GC(위암); GEJC (위-식도 접합부 암); HCC(간세포 암종); HNSCC(두경부 편평 세포 암종); MEL(흑색종); NHL(비호지킨호지킨 림프종); NSCLCadeno(비소세포 폐암 선암종); NSCLCother(NSCLCadeno 또는 NSCLCsquam에 명확하게 할당할 수 없는 NSCLC 샘플); NSCLCsquam(편평 세포 비소세포 폐암); OC(난소암); OSCAR(식도암); PACA(췌장암); PRCA(전립선암); RCC(신세포 암종); SCLC(소세포 폐암); UBC(방광 암종); UEC(자궁내막암).
도 7: 기술된 방법을 사용하여 결정되고 서열 로고 형식으로 표시된 PRAME-004 지시된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 상위 결합 모티프. 선택된 위치에 있는 개별 아미노산의 크기는 확인된 표적외 중에서 이들의 존재비를 반영한다. 따라서 이러한 접근법은 PRAME-004 지시된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 결합 모티프에 대한 정확한 정보를 전달한다.
예를 들면, 확인된 표적외 내에서 펩티드 서열의 위치 5의 히스티딘(H)은 리신(K)에 비해 더 빈번했으며, 이것은 상기 위치에서 히스티딘이 PRAME-004 결합 폴리펩티드에 의해 선호됨을 의미한다. 즉: 위치 5에 히스티딘 잔기를 갖는 펩티드는 위치 5에 리신 잔기를 갖는 펩티드보다 더 높은 친화도로 각각의 PRAME-004 결합 폴리펩티드에 의해 결합될 것이다. 위치 5에서 히스티딘 또는 리신 이외의 다른 아미노산은 각각의 펩티드의 친화도를 더욱 감소시킬 것이다.
알 수 있는 바와 같이, 각각의 PRAME-004 결합 폴리펩티드에 의해 수용되는 결합 모티프는 위치 1, 3 및 4에서 매우 유연하지만, 위치 5 - 8에서는 선택된 아미노산 잔기에 대한 명확한 선호도가 표 1b에 나타낸 바와 같은 하기 계층으로 결정될 수 있다:
표 1b: 각각의 PRAME-004 결합 폴리펩티드에 의한 PRAME-004의 위치 5, 6, 7 및 8에서 아미노산의 선호도의 계층

이러한 맥락에서, 소위 "고정 잔기"(본원에서 "AR"로 약칭됨)는 MHC에서 펩티드 결합 홈에 대한 펩티드의 결합을 매개한다는 것을 주지한다. HLA-A^*02:01에서, 이들 고정 잔기는 P2에서 가장 흔히 류신이고, P9에서 류신 또는 발린이며, 결합 폴리펩티드와 펩티드:MHC 복합체 사이의 결합 상호작용에서 단지 미미한 역할만을 한다.
하기에는, PRAME(종양에서 우선적으로 발현되는 흑색종 항원, UniProt: P78395)의 전장 서열이 표시되며, PRAME-004 표적 펩티드(SLLQHLIGL, 서열 번호 1)의 서열은 굵은 밑줄로 표시된다:
>sp｜P78395｜PRAME_인간 종양에서 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 OS=호모 사피엔스 OX=9606 GN=PRAME PE=1 SV=1

따라서, 상기 데이터에 기반하여, 하기 표 1c 및 1d에 나타낸 바와 같이 위치-기반 결합 모티브 및 상위 결합 모티브를 결정할 수 있다:
표 1c: 각각의 PRAME-004 결합 폴리펩티드의 위치-기반 결합 모티프 및 상위 결합 모티프.

이 정보를 사용하여, 선호하는 잔기를 단순히 셔플링함으로써 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 표적외 펩티드를 확인 수 있으며 선호도가 없는 잔기에서는 플레이스홀더를 확인할 수 있다. 그후 잠재적인 표적외 펩티드 서열의 목록을 완성하게 될 것이다.
다음 단계로, 펩티드:MHC 복합체에 표시된 펩티드가 보관된 각 데이터베이스에서 이러한 결합 모티프를 포함하는 펩티드에 대해, 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 검색할 수 있다.
표 1d: 상기 결정된 바와 같은 상위 결합 모티프를 공유하는 제시된 방법에 의해 확인된 펩티드

그후 이러한 펩티드를 합성하고 각각의 PRAME-004 결합 폴리펩티드와의 교차-반응성에 대해 시험할 수 있다.
도 8: 고정 잔기를 제외한 펩티드 서열의 위치 1-9에 있는 각 아미노산을 알라닌으로 대체하는 위치 스캐닝을 사용하여 PRAME-004에 대해 지시된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 위치-기반 결합 모티프의 확인. 펩티드 서열의 알라닌 치환된 변이체에 대한 표적 펩티드 PRAME-004의 KD의 비율이 모든 펩티드에 대해 제시된다. 결합제에 의해 인식되는 위치를 결정하기 위해 KD 비율의 50%의 임계값(점선)이 적용된다. KD 값은 생물층 간섭법에 의해 결정되었다.
상위 결합 모티프 및 표적외 펩티드 서열에 대한 상세한 정보를 전달하고, 따라서 상기 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 대한 교차 반응성을 탐색 및/또는 확인할 수 있게 하는 본 발명에 따른 방법과 비교하여, 각 아미노산을 단순히 알라닌으로 대체하는 것은 매우 제한된 정보, 즉 주어진 아미노산 잔기가 결합제에 의한 인식에 필요한 위치의 단순한 식별 만을 제공한다.
도 9: 위치당 모든 단백질 생성 아미노산으로의 아미노산 치환(시스테인 제외)을 사용한 복합 결합 모티프 결정. 각각의 위치 스캐닝 변이체에 대한 표적 펩티드 PRAME-004의 KD의 비율이 표시되며 회색톤으로 부호화된다(낮은 값에서 높은 값까지 흰색에서 짙은 회색으로 표시됨). KD 값은 생물층 간섭법에 의해 결정되었다.
도 10: 상이한 정상 조직 및 종양 조직에서 MAGEA1의 소스 엑손을 암호화하는 펩티드의 발현 프로파일의 분석. 자세한 도면 설명을 위해 도 5의 범례를 참조한다.
도 11: 상이한 정상 조직 및 종양 조직에 대한 MAGEA1의 펩티드 제시의 분석. 자세한 도면 설명을 위해 도 6의 범례를 참조한다.
도 12: 제시된 방법에 의해 확인된 PRAME-004 지시된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 대한 잠재적인 표적외 펩티드. HLA-A^*02 특이성("MHC pan 특이성") 항체 BB7.2를 사용하여 친화성 크로마토그래피 후에 수득된 MS 신호 강도에 대한 PRAME-004 지시된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 사용하여 친화성 크로마토그래피 후에 수득된 MS 신호 강도가 도시되어 있다. 예를 들어 표 1에 나타낸 바와 같은 다른 pan-HLA 특이성 결합제가 마찬가지로 사용될 수 있다. BB7.2와 결합제 사이의 개별 펩티드의 회수 비율은 이러한 펩티드(표적 및 표적외)에 대한 결합제의 결합 친화도와 상관관계가 있다.
신호 강도의 비율은 좌측 상단에 약한 결합 펩티드가 위치하고 우측 하단에 강한 결합 펩티드가 위치하는 대각선까지의 거리(점선)에 해당한다. 화살표는 PRAME-004를 나타낸다. 모든 결합제에 대한 친화성 크로마토그래피는 과량의 모든 결합제가 사용되는 방식으로 수행된다. 따라서 각 펩티드의 회수는 사용 가능한 결합 부위의 수에 의해 제한되지 않는다. 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2에 대한 근접 정량 침전(nearly quantitative precipitation)은 1 부근에서 최대값을 유발하며, 이것은 결합제에 의해 강하게 인식되는 펩티드가 대각선에 가깝게 나타남을 의미한다. 회색 톤은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 HIS1K 바이오센서를 사용한 생물층 간섭법에 의해 결정된 표적에 비한 결합 친화도 배수 감소를 나타낸다. 생물층 간섭법의 검출 한계 미만의 결합을 갖는 펩티드의 경우, 결합 친화도 배수 감소는 1000/0.1%로 설정되었다.
두 접근법((i) pMHC 결합 폴리펩티드 및 MHC pan-특이성 결합 분자를 사용한 병렬 결합 실험 및 (ii) 생물층 간섭법) 모두는 표적외 펩티드의 친화성에 관해 유사한 결과를 제공한다는 것을 알 수 있다. MHC pan-특이성 항체의 MS 신호 강도는 매우 낮은 신호 강도에서의 질량 분광 측정의 확률성으로 인해 3개의 펩티드(예를 들어 IFIT1-001)에 대해 정량화할 수 없었으므로 도면에서 "NA"로 표시된다. 따라서, 이러한 표적외 펩티드에 대해서는 비율을 계산할 수 없다. 그러나, 친화성 크로마토그래피 후 이러한 고유하게 식별된 펩티드는 또한 생물층 간섭법 측정에 의해 확인된 바와 같이 매우 관련성이 높은 표적외 펩티드를 나타낸다.
그후 임계값은 PRAME-004 지시된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드와 교차-반응성인 펩티드를 교차-반응성이 더 이상 너무 약하여 관련이 없는 것으로 간주되는 펩티드와 구별하기 위해 결합 친화도 배수 감소를 기반으로 설정될 수 있다. 일반적으로, 확인된 펩티드는 강한 결합 펩티드(결합 친화도 배수 감소 ≥ 0.1), 중간 결합 펩티드(0.01 ≥ 결합 친화도 배수 감소 > 0.1) 및 약한 결합 펩티드(0.001 ≥ 결합 친화도 배수 감소 > 0.01)로 분류될 수 있다.
도 13: 제시된 방법에 의해 결정된 신호 영역의 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]과 생물층 간섭법에 의해 결정된 표적에 비한 결합 친화도 배수 감소의 상관관계. 상관 분석(스피어만 순위 상관) 결과 rho 값은 0.84였다. 함수 f(x) = a - exp(b^*x-c)를 사용하여 지수 회귀를 수행하였다. 95% 확률 예측 밴드는 점선으로 표시된다. 3개의 펩티드가 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 커플링된 매트릭스 상에서 독점적으로 검출되었고, 따라서 신호 강도의 비율을 계산할 수 없었다. 값은 최대 검출 값으로 설정되었다. 검출 한계 미만의 결합을 갖는 펩티드의 경우, 결합 친화도 배수 감소는 지수 회귀에 대해 1000으로 설정되었다.
도 14: 관련 표적외 펩티드를 확인하는데 사용되는 합성 펩티드:MHC 라이브러리의 입증. HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2를 사용한 친화성 크로마토그래피 후에 수득된 MS 신호 강도에 대한 PRAME-004 지시된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 사용한 친화성 크로마토그래피 후에 수득된 MS 신호 강도가 표시되어 있다. 신호 강도의 비율은 좌측 상단에 약한 결합 펩티드가 위치하고 우측 하단에 강한 결합 펩티드가 위치하는 대각선까지의 거리(점선)에 해당한다. 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2에 대한 근접 정량 침전은 1 부근에서 최대값을 유발한다. 입증을 위해, 이전에 확인된 5개의 표적외 펩티드, 표적 펩티드 및 2개의 비결합 펩티드를 동위원소로 표지하고, HLA-A^*02:01 알로타입의 재조합적으로 생성되고 재접힘된 MHC 단량체에 부하하고, 합성 스파이크-인(spike-in)으로 사용하였다.
도 15: 표적 펩티드의 개별 아미노산의 위치 돌연변이에 기반한 합성 펩티드 라이브러리로 제시된 방법을 사용한 PRAME-004 지시된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 위치-기반 결합 모티프의 결정. 이 경우, 고정 잔기(AR)를 제외한 모든 위치 1 내지 9는 알라닌으로 교환되었다. 합성 펩티드를 pMHC 복합체에 통합하고 세포 용해물 매트릭스에 첨가하였다. 각 아미노산 교환 위치에 대해 다른 곳에서 기술된 바와 같이 결정된 결합 친화도 배수 감소가 도시되어 있다. 최대값은 1로 정규화되었다. 오차 막대는 두 가지 기술적 중복의 표준 편차를 나타낸다. 수득된 위치-기반 결합 모티프는 생물층 간섭법을 이용하여 비교예에서 결정된 위치-기반 모티프와 전반적으로 일치한다(도 8). 제시된 방법은 더 높은 감도를 가져 약하게 결합하는 돌연변이 펩티드도 인식하는 것으로 보이며, 이것은 위치 8의 상대적으로 높은 비율로부터 알 수 있다. 동적 범위는 두 방법 간에 다르지만, 개별 약한 결합 펩티드의 순서는 위치 5가 가장 강하게 인식되는 위치이고 그 다음이 위치 7, 6 및 8인 것과 일치한다. 이것은 위치 5에서 가장 높은 선택성을 보여주고 위치 7, 6, 8이 뒤따르는 결정된 상위 결합 모티프(도 7)와도 일맥상통한다. 위치 스캐닝 접근법에 따라, 도 7은 위치 8에 대해서 뿐만 아니라 글리신 및 다양한 허용 아미노산에 대한 감소된 선택성을 보여준다.

실시예

실시예 1:

HLA-A^*02의 맥락에서 제시되는 당해 실시예에서 사용된 표적 MHC 펩티드는 종양에서 우선적으로 발현되는 흑색종 항원(PRAME)으로부터 유래되며 서열 SLLQHLIGL((서열 번호 1), 본원에서는 PRAME-004로도 지칭됨)을 나타낸다.

이들 실험에 사용된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드는 가용성이도록 조작되고 PRAME-004 펩티드에 대한 향상된 친화성을 나타내고 CD3-결합 항체 모이어티를 추가로 포함하는 변형된 T-세포 수용체 분자에 의해 예시되었다.

이들 실험에 사용된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드, 이것이 수득되는 방법 및 이의 기술적 특징은 제PCT/EP2020/050936호에 개시되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다.

펩티드:MHC 혼합물의 생물학적 공급원으로서, 인간 HLA-A^*02 고 발현 교모세포종 유래 세포주 T98G가 사용되었다. 이 세포주는 PRAME-004에 대해 지시된 기술된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 사용한 세포독성 실험에서 이전에 시험되었으며 양성 사멸을 나타내었다.

5억 개의 T98G 세포를 CHAPS 세제-함유 완충액에서 용해시키고 초음파 처리의 도움으로 균질화하였다.

펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 BrCN 활성화 후 화학적 커플링을 사용하여 미리 결정된 비율로 고체 Sepharose^® 매트릭스에 커플링시켰다. 동시에, 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 첨가 없이, 동일한 전략을 사용하여 커플링을 위해 동일한 양의 Sepharose^®를 또한 활성화하였다. 대신에 아미노산 글리신의 0.1M 용액을 Sepharose^®에 첨가하였으며, 이것은 대신에 화학적으로 활성화된 그룹에 커플링되었다. 펩티드:MHC 분자의 혼합물을 함유하는 T98G 용해물을 200μl의 글리신 커플링된 Sepharose^® 매트릭스 또는 200μl의 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드와 커플링된 Sepharose^® 매트릭스가 부하된 2개의 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. 그렇게 함으로써 T98G 유래된 용해물을 먼저 글리신 커플링된 Sepharose^®(본원에서는 글리신 컬럼으로 지칭함) 위로 흘려보내, 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 결합하는 펩티드의 단리 전에 컬럼 또는 Sepharose^® 매트릭스에 비특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩티드를 제거하거나 고갈시키는 방식으로 적용하였다(도 1). PBS 및 ddH₂O로 친화성 컬럼을 세척한 후, 결합된 펩티드:MHC 복합체를 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 컬럼으로부터 용출시켰다.

이 단계 동안, MHC 결합된 펩티드가 또한 MHC 모이어티로부터 방출되며 분자량 컷오프가 10kDa 미만인 특수 장치를 사용하여 한외여과에 의해 고분자량 분자로부터 분리할 수 있다.

그후 단리된 펩티드 혼합물을 최종적으로 nanoACQUITY UPLC 시스템(Waters)에 이어 Orbitrap fusion™ Tribrid™ 질량 분석기(Thermo Scientific)를 사용하여 액체 크로마토그래피 결합 질량 분석법(LC-MS)에 적용하였다.

질량 분석 기기는 상이한 단편화 기술(당해 실시예에서는 CID 및 FICD 단편화) 및 두 개의 상이한 분석기(당해 실시예에서는 lonTrap 및 Orbitrap 분석기)의 MS/MS 스펙트럼 판독을 사용하여 데이터-종속 모드(DDA)에서 작동되었다.

펩티드 단편 스펙트럼을 검색 엔진 SEQUEST와 함께 수정된 버전의 International protein index(IPI v.378) 및 Universal protein resource(UniProt) 서열 데이터베이스를 사용하여 인간 프로테옴에 대해 검색하였다. 글리신 컬럼으로부터 용출되고 확인된 모든 펩티드는 비특이성 결합 펩티드를 나타내므로 추가 분석에서 제외되었다. 또한, 이들의 식별을 위한 사내 데이터베이스 및 알고리즘에 따라 알려진 오염 물질을 분석에서 제거하였다.

단리 및 처리 후에 표 2에 나타낸 총 20개의 펩티드가 확인되었다. 참고로, 표적 펩티드 PRAME-004도 나타내어져 있으나, 이것은 단리된 펩티드 중에서 확인되지 않았으며 확인될 것으로 기대되지도 않았다.

이들의 관련성을 확인하고 표적 펩티드와 비교하여 결합 강도를 분석하기 위해, 모든 펩티드를 생물층 간섭법에 적용하였다. 생물층 간섭법(이 경우, 제조업체에서 권장하는 설정을 사용하는 Octet RED384 시스템)으로 측정을 수행하였다. 간략하게 말해서, 완충액으로서 PBS, 0.05% Tween-20, 0.1% BSA를 사용하여 30℃ 및 1000rpm 진탕 속도에서 결합 동역학을 측정하였다. 펩티드:MHC 특이성 결합제의 연속 희석물을 분석하기 전에 펩티드:MHC 복합체를 바이오센서(HIS1K)에 부하하였다. PRAME-004와 비교한 평형 해리 상수(KD)의 비율은 표 2의 마지막 열에 제시되어 있다.

엄선된 이들 펩티드를 세포독성 실험에서 추가로 시험하였다. 간략하게 말해서, 10nM의 각각의 펩티드가 부하된 T2 세포(10,000개 세포/웰)를 지시된 농도의 PRAME-004 특이 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 존재하에 인간 CD8+ T 세포(50,000개 세포/웰)와 공동-배양하였다(도 4). 48시간 후 세포독성을 CytoTox 96 비-방사성 세포독성 분석 키트(PROMEGA)를 사용하여 LDH 방출을 측정함으로써 정량화하였다. 시험된 펩티드의 해당 EC50 값이 또한 표 2에 나열되어 있다. 이 분석에서 나오는 주요 표적외 펩티드는 표적 펩티드 PRAME-004와 비교하여 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 대해 유사한 KD 및 EC50 값을 나타내는 IFT17-003이었다.

XPRESIDENT^® 펩티드 제시 및 유전자 발현 데이터는 다른 종양 조직의 맥락에서만 제시/발현되는 덜 관련성이 있는 표적외 펩티드로부터 관련 표적외 펩티드를 구별함으로써 표적외 펩티드의 잠재적인 안전 위험을 평가하는데 사용될 수 있다. 당해 실시예에서, IFT17-003은 상이한 정상 조직에서 펩티드의 편재적 발현(도 5) 및 제시(도 6)로 인해 매우 관련성이 높은 표적외 펩티드로 간주된다. 따라서 당해 실시예로부터의 제시된 데이터와 추가의 대규모 펩티드 제시 또는 발현 데이터의 조합은 표적외 위험 평가에 추가 가치가 있다.

펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 특이성을 개선하기 위해, 확인된 펩티드를 선택 결정인자로서 사용하여 추가 성숙 라운드를 수행하였다. 그렇게 함으로써 새로 생성된 분자의 특이성은 도 2에서 표적 음성 세포주 T98G의 사멸 감소에 의해 나타난 바와 같이 크게 개선될 수 있었다.

사멸 검정은 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 표적 양성 또는 표적 음성 세포(10,000개 세포/웰)의 LDFI 방출을 인간 PBMC(100,000개 세포/웰) 및 지시된 농도의 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드와 48시간 동안 공동-배양한 후 정량화하였다. 펩티드 단리에 사용된 원래 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 분자는 채워진 사각형으로 표시되는 반면 특이성 개선된 변이체는 열린 원으로 표시된다. 대조군 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 분자(별표가 있는 사각형) 및 이중특이성 분자가 없는 대조군(별표가 있는 원)은 표적 세포 사멸을 유도하지 않는다.

표 2: 확인된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 특이성 펩티드의 개요. 상단에 표시된 것은 표적 PRAME-004이다. 펩티드 부하된 T2 세포를 사용한 세포독성 실험의 EC50 값 뿐만 아니라 HIS1K 바이오센서를 사용한 생물층 간섭법에 의해 결정된 결합 친화도가 명시된다.

결합 모티프의 확인

확인된 펩티드는 펩티드 서열의 아미노산 중 어느 것이 상기 폴리펩티드의 결합과 관련이 있는지에 대한 정보를 제공하는 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 대한 결합 모티프를 추론하기 위해 추가로 사용될 수 있다.

또한, 결합 모티프에 대한 추가 정보는 관련 위치 내의 아미노산으로부터 추론할 수 있다. 확인된 펩티드 세트에 기초하여, 아미노산의 하위집합만 아미노산 서열의 위치 1-9에서 허용된다(도 7 및 표 3 참조).

표 3: 제시된 방법에 의해 확인된 각 위치에 대해 허용되는 아미노산의 개요.

아미노산이 돌연변이에 의해 개별 위치에서 대체되고 이어서 시험관내 검정에서 시험되는 일반적인 아미노산 스캐닝 접근법과 대조적으로, 또한 전체 결합 강도에 대해 잠재적으로 반대되는 상이한 효과를 갖는 다중 치환이 설명될 수 있다. 예를 들면, 천연 아미노산 서열의 위치 6에서의 치환이 전체 결합 친화도의 감소를 초래하는 경우, 이것은 펩티드:MHC 분자에 대한 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 결합 친화도의 강한 증가를 초래할 수 있는 위치 8에서의 유사한 치환에 의해 구제될 수 있다.

이렇게 생성된 결합 모티프는 결합 모티프에 의해 부과된 제한 사항(즉, 결합 모티프의 관련 위치에서 허용되는 정의된 아미노산 세트)을 반영하고 이에 적합한 추가의 표적외 펩티드를 찾기 위해 상이한 단백질 서열 데이터베이스(예를 들어 UniProt, IPI)를 검색하는데 사용되었다.

비교 실시예 1

하기 실험은 당업계에서 현재 이용 가능한 방법이 어떻게 실시예 1에서 확인된 가장 관련있는 표적외 펩티드를 식별하지 못하고 따라서 생체내 투여를 위해 의도된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 원치 않는 부작용을 예측할 수 없는지를 보여준다.

위치 스캐닝을 사용한 결합 모티브의 식별:

각각의 아미노산이 이후에 아미노산 알라닌으로 대체되는 천연 PRAME-004 서열의 변이체를 생물층 간섭법을 사용하여 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 결합할 가능성에 대해 시험하였다.

ALLQHLIGL (서열 번호 38)

SALQHLIGL (서열 번호 39)

SLAQHLIGL (서열 번호 40)

SLLAHLIGL (서열 번호 41)

SLLQALIGL (서열 번호 42)

SLLQHAIGL (서열 번호 43)

SLLQHLAGL (서열 번호 44)

SLLQHLIAL (서열 번호 45)

SLLQHLIGA (서열 번호 46)

도 8은 이들 실험의 결과를 보여준다. 5개의 알라닌-치환된 펩티드는 야생형 서열과 비교하여 결합 친화도에 있어 50% 이상 감소(또는 각각 KD의 2배 이상 증가)를 유도하므로 결합에 필수적인 것으로 간주되었다. 이러한 결과에 기반하여 결합 모티프는 XXXXHLIGL(서열 번호 22)을 생성하며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다.

위치 스캐닝 접근법의 확장된 변형에서 PRAME-004 서열은 이전에 기술된 것과 유사한 방식으로 각 위치에서 임의의 자연 발생 아미노산으로 치환되었다. PRAME-004의 치환에 사용되지 않은 유일한 단백질 생성 아미노산은 시스테인이었으며, 이 아미노산은 여러 가지 화학적 변형을 빠르게 거쳐 시험 동안 펩티드의 인식에 관한 잘못된 해석을 야기할 수 있기 때문이다. 따라서 총 9^*18 = 162개의 펩티드가 조사되었다.

각 펩티드를 생물층 간섭법을 사용하여 이의 결합 친화도에 대해 다시 시험하였다(도 9). 야생형 서열과 비교하여 결합 친화도의 50% 이상 감소(또는 각각 KD의 2배 이상 증가)를 초래하는 펩티드는 펩티드 결합에 대해 허용되지 않거나 유해한 것으로 간주되었다. 이것은 아미노산 서열의 위치 1-9에서 허용되거나 용인되는 일련의 상이한 아미노산을 갖는 복합 결합 모티프를 생성하였다:

X₁X₂X₃X₄HX₅IX₆X₇

여기서 X₁은 ADEFGHIKLMNPQRSTVWY 중 어느 것으로부터 선택되고; X₂는 AFGILMQSTVY 중 어느 것으로부터 선택되고; X₃은 ADGIKLMNQSTVW 중 어느 것으로부터 선택되고; X₄는 AFGHIKLMNPQRSTVWY 중 어느 것으로부터 선택되고; X₅는 ILM 중 어느 것으로부터 선택되고; X₆은 GST 중 어느 것으로부터 선택되고; X₇은 EFHIKLMPQTVY 중 어느 것으로부터 선택된다.

Ala-Scan 유도된 결합 모티브에 기반한 유사성 검색:

사내 소프트웨어 도구를 확인된 모티프 서열(X-X-X-X-X-H-L-I-G-L) (서열 번호 22)을 포함하는 인간 단백질에 대한 다양한 단백질 서열 데이터베이스(IPI v. 3.78, SNV를 포함한 Ensembl 버전 77 GrCH38, NCBI 비중복 단백질 데이터베이스)를 검색하는데 사용하였으며, 여기서 X는 임의의 아미노산에 의해 구성될 수 있다. 8개의 독특한 펩티드가 확인되었다: 표적 자체, PRAME-004 및 상이한 인간 단백질로부터 유래한 7개 펩티드: VEZT(Vezatin), HTR2C(5-하이드록시트립타민 수용체 2C), HEPHL1(헤페스틴-유사 단백질 1), COL28A1(콜라겐 알파-1 (XXVIII) 사슬), SLC2A1(용질 운반체 패밀리 2, 촉진 포도당 수송체 구성원 1), SLC44A3(콜린 수송체-유사 단백질 3), PIEZ02(피에조 타입 기계수용 이온 채널 구성요소 2).

이들 펩티드의 아미노산 서열은 아래에 나타내어져 있다.

모두 HLA-A^*02 유형의 개인으로부터 유래된 592개의 정상 조직 샘플과 710개의 종양 조직 샘플로부터의 사내 XPRESIDENT^® 면역펩티돔 데이터는 7개의 예측된 표적외 펩티드 중 어느 것도 분석된 샘플 중 어느 것에서 HLA-A^*02와 관련하여 제시되는 것으로 확인된 적이 없음을 보여주었다. 특히, VEZT 및 SLC2A1 유래 펩티드는 비-A^*02 양성 개인의 조직 샘플에서 XPRESIDENT^®에 의해 이전에 확인되었으며, 이것은 이들이 상이한 HLA 알로타입(VEZT 유래 펩티드의 경우 HLA-B^*07 및 SLC2A1 유래 펩티드의 경우 HLA-B^*27)에 의해 제시되고 따라서 HLA-A^*02 제한된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드와 관련하여 표적외 위험을 생성할 가능성이 없음을 시사한다. 그러나 위치 스캐닝 및 예측 접근법은 본 출원에 기술된 우수한 방법으로 식별될 수 있는 관련 표적외 펩티드를 식별하는데 실패하였다.

상위 결합 모티브에 기반한 유사성 검색:

동일한 사내 소프트웨어 도구를 복합 결합 모티프의 기준을 충족하는 인간 프로테옴으로부터 유래된 펩티드를 예측하는데 사용하였다. 시스테인은 치환 동안 배제되었기 때문에, 이 아미노산은 아미노산 서열의 모든 위치에 추가로 허용되어 다음 모티브가 생성되었다:

X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆

여기서 X₈은 ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY 중 어느 것으로부터 선택되고; X₉는 ACFGILMQSTVY 중 어느 것으로부터 선택되고; X₁₀은 ACDGIKLMNQSTVW 중 어느 것으로부터 선택되고; X₁₁은 ACFGHIKLMNPQRSTVWY 중 어느 것으로부터 선택되고; X₁₂는 CH 중 어느 것으로부터 선택되고; X₁₃은 CILM 중 어느 것으로부터 선택되고; X₁₄는 CI 중 어느 것으로부터 선택되고; X₁₅는 CGST 중 어느 것으로부터 선택되고; X₁₆은 CEFHIKLMPQTVY 중 어느 것으로부터 선택된다.

검색 결과 결합 모티프 기준을 충족하는 888개의 상이한 펩티드의 전체 목록이 생성되었다. 888개의 모든 펩티드가 다운스트림 시험관내 분석에서 나중에 시험되더라도, 2개의 펩티드(IFT17-003 및 ATP1A1-001)만이 실시예 1에서 본 출원에 기술된 우수한 방법에 의해 확인된 관련 표적외 펩티드의 목록과 중복되는 반면 나머지는 예측-기반 접근법에서 확인되지 않았다.

실시예 2:

HLA-A^*02의 맥락에서 제시되는 당해 실시예에서 사용된 표적 MHC 펩티드는 흑색종 관련 항원 A4 및 A8(MAGEA4/A8)로부터 유래되고 서열 KVLEHVVRV(서열 번호 24)를 나타내며, 본원에서는 MAGEA4/8로도 지칭된다.

펩티드:MHC 결합 폴리펩티드는 가용성이도록 조작되고 MAGEA4/A8 유래 펩티드에 대한 향상된 친화성을 나타내고 CD3 결합 항체 모이어티를 추가로 포함하는 변형된 T-세포 수용체 분자로 구성된다. 펩티드:MHC 혼합물의 생물학적 공급원으로서 인간 HLA-A^*02 고 발현 및 MAGEA4/8 양성 폐 선암종 유래 세포주 NCI-H1755가 사용되었다. 이 세포주의 5억 개 세포를 CHAPS 세제-함유 완충액에서 용해시키고 초음파 처리의 도움으로 균질화하였다.

펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 커플링 및 친화성 크로마토그래피를 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 펩티드:MHC 분자의 혼합물을 함유하는 NCI-H1755 용해물을 글리신 커플링된 및 펩티드:MHC 결합제 커플링된 Sepharose^®에 적용하기 전에 용량을 반 반으로 나누었다. 용량의 두 번째 절반을 상이한 글리신 커플링된 Sepharose^® 매트릭스에 이어 HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2와 커플링된 Sepharose^® 매트릭스에 걸쳐 동시에 흘려보냈다. 후자는 이 세포주에서 HLA-A^*02에 의해 제시된 펩티드의 전체 스펙트럼을 단리하는 것을 목표로 한다(또한 도 1 참조).

펩티드를 모든 컬럼으로부터 용출시키고 실시예 1에 개략된 바와 같이 질량 분석계 분석에 적용하였다. 글리신 컬럼으로부터 용출된 펩티드 및 알려진 오염 물질은 추가 분석에서 다시 제외하였다. 또한, SuperHirn 알고리즘(Mueller et al., 2007)을 사용하여 모든 다른 실행에 걸쳐 모든 펩티드 전구체 신호를 정량화하였다. ± 3분의 고정 체류 시간 창과 ± 5ppm의 질량 정확도를 사용하여 모든 질량 분석 실험에서 특징을 추출하고 정량화하였다.

MAGEA4/8 특이성 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드로부터의 개별 펩티드 전구체 신호 대 BB7.2 제제로부터의 동일한 전구체 신호의 생성된 영역의 비율을 계산하였다. 이러한 비율은 HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2와 비교하여 MAGEA4/8 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 단리 효율을 반영한다. 이들의 표적 뿐만 아니라 HLA-A^*02 분자에 결합된 잠재적인 표적외 펩티드에 대한 MAGEA4/8 특이성 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 높은 친화성으로 인해, 이들 펩티드에 대한 단리 효율은 결합된 펩티드 종과 크게 무관하게 HLA-A^*02에 대해 더 낮은 나노몰 범위의 친화도를 갖는 BB7.2에 비해 훨씬 더 높다(Parham and Brodsky, 1981). 질량 분석 데이터의 분석은 표적 펩티드 MAGEA4/8을 포함한 10개의 펩티드를 확인하였다(표 4 참조). 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 BB7.2의 영역의 비율에 따른 이들 펩티드의 순위는 실시예 1에 기술된 바와 같이 생물층 간섭법을 사용하여 결합 친화도와 상관관계가 있는 BB7.2와 비교한 이들 펩티드의 단리 효율을 결정할 수 있게 한다. 그렇게 함으로써 표적외 독성의 위험 및 표적 펩티드와 표적외 펩티드 사이의 잠재적인 치료 창이 질량 분석 실험의 정량적 데이터로부터 직접 추론될 수 있다.

표 4에 제시된 예에서 MAGEA1에 대한 영역의 비율은 표적 펩티드 MAGEA4/8(~10.6과 비교하여 ~11)에 비해 더 작으며, 이것은 4.1의 결합 친화도의 매우 작은 감소로 해석된다. 대조적으로, 펩티드 HEAT5RA의 경우 MAGEA4/8에 비해 약 800배 더 낮은 영역 비율의 큰 감소는 MAGEA4/8에 비해 238의 크게 감소된 결합 친화도에도 반영된다.

XPRESIDENT^®의 펩티드 제시 및 유전자 발현 데이터의 심층 분석은 MAGEA1이 암 조직에만 제시되고(도 10) 암-고환 유사 발현 패턴을 나타내기 때문에(도 11) 관련 표적외 위험을 제시하지 않는다는 것을 보여준다.

표 4: 확인된 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 특이성 펩티드의 개요. 질량 분석에 의한 HLA-A^*02 특이성 결합 펩티드 BB7.2에 대한 MAGEA4/8 결합 폴리펩티드로부터 용출된 펩티드의 비율이 나타내어져 있다. 맨 윗줄에는 가장 높은 신호 영역 비율을 보여주는 표적 펩티드 MAGEA4/A8이 제시되어 있다. PMBEC 점수는 표적 서열에 대한 펩티드 유사성에 대한 척도이다. 결합 친화도는 HIS1K 바이오센서를 사용한 생물층 간섭법에 의해 결정되었다.

실시예 3:

당해 실시예에서 사용된 표적 MHC 펩티드는 실시예 1에서 기술된 것과 동일하다(PRAME-004, 서열 번호 1). 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드는 마찬가지로, 가용성이도록 조작되고 PRAME-004 펩티드에 대한 향상된 친화성을 나타내며 CD3-결합 항체 모이어티를 추가로 포함하지만, 표적외 인식의 변화를 초래하는 실시예 1과 비교하여 상이한 변이체인 변형된 T-세포 수용체 분자에 의해 예시된다.

펩티드:MHC 혼합물의 생물학적 공급원으로서, 10개의 별개의 세포주의 혼주물이 사용되었다. 세포주는 HLA-A^*02:01 펩티드 양 및 다양성을 최대화하도록 선택되었다. 세포주당 5억 개의 세포를 CHAPS 세제-함유 완충액에서 용해시키고 균질화하고 혼주하였다. 개별 분석을 위해, 5억 개 정도의 세포 수를 가진 분취량을 사용하였다.

펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2의 커플링 및 친화성 크로마토그래피는 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하지만, 용해물과 매트릭스 커플링된 펩티드:MHC 결합 펩티드의 접촉 시간을 증가시키기 위해, 배양을 반응 튜브에서 16시간 동안 진탕하면서 수행하였다.

단리 및 처리 후에 총 79개의 펩티드가 확인되었다. 표적 펩티드 PRAME-004를 포함하여 가장 관련있는 10개의 표적외 펩티드가 표 5에 나타내어져 있다. 79개 펩티드 중 32개는 낮은 신호 강도 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2](0.005 미만)을 보였고, 따라서 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 대한 결합이 낮거나 없을 것으로 예상되었다. 이러한 펩티드는 참조로 추가 분석에 포함되었다. HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2를 사용한 정제 후 MS 신호 강도와 비교하여 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드를 사용한 정제 후 수득된 MS 신호 강도에 따라 선택된 펩티드가 도 12에 표시된다. 대각선까지의 거리가 신호 강도의 비율을 나타낸다. 표적 및 강한 표적외의 경우 근접 정량 친화성 크로마토그래피에서는 대략 1(점선)의 신호 강도의 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]을 유도할 것으로 예상된다. 10개의 가장 강한 결합 표적외 펩티드의 이름이 그래프에 표시되어 있으며, 모두 예상대로 대각선에 가깝게 있다. 신호 강도의 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]이 매우 낮은 펩티드는 참조로 생물층 간섭법을 사용하여 극도로 크거나 정량화할 수 없는 결합 친화도 배수 감소를 보이지 않았다.

표 5: HIS1K 바이오센서를 사용한 생물층 간섭법에 의해 결정된 결합 친화도 배수 감소에 기반하여 가장 관련있는 10개 표적외 펩티드에 대한 개요. 질량 분석에 의한 HLA-A^*02 특이성 결합 펩티드 BB7.2에 대한 PRAME-004 결합 폴리펩티드로부터 용출된 펩티드의 비율이 나타내어져 있다. 별표로 표시된 값의 경우, HLA-A^*02 특이성 결합 펩티드 BB7.2로부터 용출된 펩티드의 낮은 존재비로 인해 비율을 계산할 수 없으며 최대 측정값을 가정하였다.

이들의 관련성을 확인하고 표적 펩티드와 비교하여 결합 강도를 분석하기 위해, 모든 펩티드를 실시예 1에 기술된 바와 같이 생물층 간섭법에 적용하였다. PRAME-004와 비교하여 평형 해리 상수(KD)의 비율을 결정하고 제시된 방법에 의해 결정된 신호 강도의 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]과 상관시켰다. 결정된 결합 친화도 배수 감소는 도 12에서 회색톤으로 표시되어 있다. 제시된 방법에 의해 결정된 신호 강도의 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]과 결합 친화도 배수 감소의 상관관계는 도 13에서 입증된다. 상기 논의된 바와 같이, 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 대한 강한 결합을 갖는 펩티드는 높은 신호 강도 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]로 확인될 수 있는 반면 비결합 펩티드는 0.001 미만의 신호 강도의 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]을 보였다. 방법의 최대 감도를 수득하기 위해, 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2를 과량으로 적용하여 두 경우 모두에서 표적외 펩티드의 근접 정량 추출 및 대략 1의 최대 신호 영역 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]을 야기한다. 이러한 포화 효과를 고려하기 위해 지수 회귀를 수행하였다(도 13).

데이터는 제시된 방법을 적용한 단일 실험의 신호 강도의 비율을 사용하여 결합 친화도를 추정할 수 있음을 입증한다.

실시예 4:

당해 실시예에서 사용된 표적 MHC 펩티드는 실시예 1에서 기술된 것과 동일하다(PRAME-004, 서열 번호 1). 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드는 마찬가지로, 가용성이도록 조작되고 PRAME-004 펩티드에 대한 향상된 친화성을 나타내며 CD3-결합 항체 모이어티를 추가로 포함하지만 실시예 1 및 3과 비교하여 상이한 변이체인 변형된 T-세포 수용체 분자에 의해 예시된다.

합성 펩티드 라이브러리로부터 잠재적인 표적외 펩티드를 식별하기 위한 제시된 방법의 능력을 입증하기 위해, 8개의 동위원소 표지된 펩티드:MHC 복합체의 혼합물을 신장 세포 암종 조직 샘플에서 유래된 생물학적 매트릭스에 스파이킹하였다. 실험을 위해 0.3g 조직을 전술한 바와 같이 용해시키고 2pmol의 펩티드:MHC 복합체를 첨가하였다. 용해물을 동일한 부분으로 분할하고 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 적용하였다. 동위원소 표지된 펩티드는 표적, 5개의 알려진 교차-반응성 펩티드 및 음성 대조군으로서 2개의 비결합 펩티드로 구성되었다(표 6).

PRAME 결합 폴리펩티드 대 HLA-A^*02 특이 항체 BB7.2의 신호 영역은 도 14에 표시되어 있다. 예상대로, 표적 및 이미 알려진 표적외 펩티드는 대략 1 정도 크기의 높은 신호 영역 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]을 나타내며 따라서 제시된 방법에 의해 매우 관련있는 것으로 분류될 것이다. 마찬가지로, 두 음성 대조군 펩티드는 모두 매우 낮은 신호 영역 비율[pMHC 결합 폴리펩티드/BB7.2]을 나타내며 따라서 제시된 방법에 기반하여 덜 관련있는 것으로 간주될 것이다.

표 6: 스파이킹된 동위원소 표지된 펩티드:MHC 복합체의 개요. 동위원소 표지된 아미노산은 별표로 표시된다. 질량 분석에 의한 HLA-A^*02 특이성 결합 펩티드 BB7.2에 대한 PRAME 결합 폴리펩티드로부터 용출된 펩티드의 비율이 나타내어져 있다. 맨 윗줄에는 표적 펩티드 PRAME-004가 제시되어 있고, 그 다음에는 이미 알려진 5개의 표적외 펩티드 및 2개의 비결합 음성 대조군 펩티드가 뒤따른다. PMBEC 점수는 표적 서열에 대한 펩티드 유사성에 대한 척도이다. 결합 친화도는 HIS1K 바이오센서를 사용한 생물층 간섭법에 의해 결정되었다.

실시예 5:

당해 실시예에서 사용된 표적 MHC 펩티드는 실시예 4에서 기술된 것과 동일하다(PRAME-004, 서열 번호 1). 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드는 마찬가지로, 가용성이도록 조작되고 PRAME-004 펩티드에 대한 향상된 친화성을 나타내며 CD3-결합 항체 모이어티를 추가로 포함하는 변형된 T-세포 수용체 분자에 의해 예시된다.

펩티드:MHC 결합 폴리펩티드의 결합 모티프에 대한 정보를 검색하기 위한 제시된 방법의 추가 접근법을 입증하기 위해, 표적 펩티드의 합성 펩티드 변이체를 스파이크-인 라이브러리로 사용하였다. 이 접근법에서, 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드에 의한 인식과 관련된 각 아미노산 위치는 알라닌에 의해 개별적으로 교환("스캔")되었다(서열 번호 38 내지 46). 관련 위치는 당해 실시예에서 펩티드-MHC 결합에 중요한 위치 2 및 9에 고정 아미노산이 없는 모든 위치(1 내지 9)였다. 합성 펩티드를 HLA-A^*02:01 알로타입의 재조합적으로 생산되고 재접힘된 MHC 분자에 부하하고 신장 세포 암종 조직 샘플에서 유래된 생물학적 매트릭스에 스파이킹하였다. 실험을 위해 0.1g 조직을 전술한 바와 같이 용해시키고 140fmol의 펩티드:MHC 복합체를 첨가하였다. 용해물을 동일한 부분으로 분할하고 펩티드:MHC 결합 폴리펩티드 및 HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 적용하였다. 표적 질량 분광 측정을 사용하여 펩티드 정량을 수행하였다.

앞서 기술된 바와 같이, PRAME를 표적화하는 pMHC 결합 폴리펩티드 대 HLA-A^*02 특이성 항체 BB7.2의 신호 강도 비율은 결합 친화도에 대한 추정치로서 계산되었다. 수득된 MS 신호 강도 비율은 도 15에 도시되어 있다. 비율은 생물층 간섭 측정을 사용하여 도 8에서 비교 실시예와의 더 나은 비교를 위해 최대값으로 정규화되었다. 위치-기반 결합 모티프 결정을 위한 비교 실시예(도 8)와 일치하게, 위치 1, 3 및 4는 pMHC 복합체에 대한 결합과 관련이 없다. 제시된 방법은 예를 들어 제시된 방법의 상이한 동적 범위를 나타내는 위치 8의 상대적으로 높은 비율로부터 알 수 있는 약하게 결합하는 돌연변이 펩티드도 인식하는 더 높은 감도를 갖는 것으로 보인다. 그러나, 개별 펩티드의 순서는 위치 5가 가장 강하게 인식되는 위치이고 그 다음이 위치 7, 6 및 8인 것과 일치한다. 데이터에 따르면, 위치 8은 결합과 관련이 있는 것으로 간주되지 않지만 MS 신호 강도 비율은 현저히 감소된다. 이것은 또한 위치 8에서 글리신 및 다양한 기타 허용된 아미노산에 대한 감소된 선택성을 보이는 결정된 상위 결합 모티프(도 7)와 일치한다. 도 7과의 비교는 위치 5가 지금까지 결합에 가장 관련있는 위치임을 보여주며, 이것은 제시된 위치-기반 결합 모티프에 의해서도 매우 잘 반영된다.

알라닌 이외의 다른 대체 아미노산도 포함하도록 스파이크-인 라이브러리를 확장하면 단일 실험에서 결합 모티프에 대해 수득된 정보가 증가할 수 있다. 또한, 수백 내지 수천 개의 자연 발생 펩티드의 합성 라이브러리가 합성 라이브러리로서 적용될 수 있다. 제시된 방법의 입증된 측면의 한 가지 주요한 이점은 각각의 결합 친화도를 동시에 결정할 수 있다는 것이다.

약어

AR 고정 잔기

APC 항원 제시 세포

BIRD 흑체 적외선 복사 해리

BiTE 이중특이성 T-세포 관여항체

CAR 키메라 항원 수용체

CDR 상보성 결정 영역

CID 충돌-유도 해리

DART 이중-친화성 재표적화 항체

DDA 데이터-종속성 획득

DIA 데이터-독립성 획득

DRIP 결함 리보솜 입자

ECD 전자-포획 해리

EDD 전자-분리 해리

ETC ID 전자-이동 및 충돌-유도 해리

ETD 전자-이동 해리

ETHCD 전자 이동/고에너지 충돌 해리

HCD 고에너지 충돌 해리

IRMPD 적외선 다광자 해리

IQR 사분위수 범위

KD 해리 상수

NETD 음전자-이동 해리

LDH 젖산 탈수소효소

PBMC 말초 혈액 단핵구

SID 표면-유도 해리

SMITE 동시 다중 상호작용 T-세포 관여

TandAb 탠덤 항체

TCR T-세포 수용체

TFA 트리플루오로아세트산

TIL 종양 침윤 림프구

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Immatics Biotechnologies GmbH <120> Method for the characterization of peptide:MHC binding polypeptides <130> ID41000/P192PC00 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Met Asn Pro His Leu Ile Ser Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Leu Ala Lys His Val Ile Thr Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Leu Leu His His Gln Ile Gly Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Leu Leu Ala His Ile Ile Ala Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Leu Met Tyr His Thr Ile Thr Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Leu Ala Met His Leu Ile Asp Val 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Phe Leu Pro Ile His Leu Leu Gly Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Tyr Leu Ile Leu His Leu Ile Ser Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Leu Ala Lys His Leu Ile Lys Ile 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Leu Val Tyr His Val Val Gly Val 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Leu Ala Asn His Leu Ile Lys Val 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Leu Thr Leu Gly His Leu Met Gly Val 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ile Leu Gly Thr His Asn Ile Thr Val 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Lys Leu Thr Ser His Ala Ile Thr Leu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 His Leu Met Pro His Leu Leu Thr Leu 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Ile Trp Glu Lys Leu Ile Ser Leu 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ser Leu Thr Lys His Leu Pro Pro Leu 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Leu Ser Pro His Asn Ile Leu Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT 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Val Thr Val 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Lys Leu Gly Ser Val Pro Val Thr Val 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Lys Ile Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ser Phe Leu Val His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Arg Val Ser Trp His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ile Asn Glu Ser His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Arg Arg Thr Leu His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Trp Ser Tyr His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Phe Thr Ala Gly His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ala Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Ser Ala Leu Gln His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ser Leu Ala Gln His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Ser Leu Leu Ala His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ser Leu Leu Gln Ala Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ser Leu Leu Gln His Ala Ile Gly Leu 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ser Leu Leu Gln His Leu Ala Gly Leu 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Ala Leu 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Ala 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Tyr Met Asn Asn Asp Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ala Met Met Tyr His Thr Ile Thr Leu 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 His Leu Leu Met His Leu Ile Gly Ser 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Ser Leu Asp Pro Ser Ser Pro Gln Val 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Val Leu Asp Asp Ser Ile Tyr Leu Val 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> XAA is selected from any of ADEFGHIKLMNPQRSTVWY <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> XAA is selected from any of AFGILMQSTVY <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> XAA is selected from any of ADGIKLMNQSTVW <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> XAA is selected from any of AFGHIKLMNPQRSTVWY <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> XAA is selected from any of ILM <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> XAA is selected from any of GST <220> <221> Xaa <222> (9)..(9) <223> XAA is selected from any of EFHIKLMPQTVY <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Ile Xaa Xaa 1 5

Claims (30)

1. 펩티드:MHC 복합체(complex)의 펩티드("표적 펩티드(target peptide)")에 대한 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인(domain)을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")의 결합을 특성화하는 방법으로서,
   a) 분석할 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
   b) 상기 샘플을 상기 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")와 접촉시키고, 상기 폴리펩티드 분자의 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인이 상기 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체에 결합하도록 하는 단계,
   c) 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인에 결합된 상기 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체를 단리하는 단계, 및
   d) 단계 c)에서 단리된 바와 같은 상기 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체의 상기 펩티드를 확인함으로써, 상기 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체의 상기 펩티드에 대한 상기 폴리펩티드 분자의 결합을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드 분자가 임의로 매트릭스 물질(matrix material)에 부착되고/되거나 상기 폴리펩티드 분자가 매트릭스 물질에 결합하거나 부착되는 적어도 하나의 부착 부위를 추가로 포함하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 특성화하는 것이 펩티드:MHC 복합체의 상기 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 확인하는 것을 포함하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 세포 용해물과 같은 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체를 포함하는 천연 또는 인공 샘플, 또는 정제되거나 농축된(enriched) 펩티드:MHC 복합체를 포함하는 샘플로부터 선택되는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드 분자가 이중특이성(bispecific), 삼중특이성, 사중특이성 또는 다중특이성 분자로부터 선택되는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드 분자가 항체, 동시 다중 상호작용 T-세포 관여(engaging)(SMITE) 이중특이성, 이중특이성 T-세포 관여항체(engager)(BiTE), scFV, 디아바디(diabody), 이중-친화성 재표적화 항체(DART), 탠덤(tandem) 항체(TandAb), 가용성 TCR, scTCR, 돌연변이된 TCR, 예를 들면 S-브릿지(S-bridge)를 포함하는 돌연변이된 TCR, 절두된(truncated) TCR, 및 이중특이성 T-세포 수용체(TCR)-항체 융합 분자로부터 선택된 분자이거나 이러한 분자로부터 유래되는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 분자가 면역 세포의 활성화를 유도하는 것으로 알려진 세포 표면 분자에 결합하는 도메인, 및 면역 반응-관련 분자로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 결합 도메인, 바람직하게는 CD3, 또는 CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 사슬과 같은 이의 사슬 중 하나, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45RA, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD152, CD163, CD193, CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FcεRI, TCRα/β, TCRγ/δ, 및/또는 HLA-DR에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드 분자가 T-세포 수용체(TCR)로부터 유래된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 분자인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드 분자가 가용성 분자인 방법.
10. 제2항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 부착 부위가 적어도 하나의 결합 도메인, 적어도 하나의 제2 도메인에 위치하거나 별도의 부착 그룹이고, 본질적으로 상기 분자의 결합을 방해하지 않는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d)의 확인하는 단계가 질량 분석 및 펩티드 서열분석(sequencing)으로부터 선택되는 방법을 포함하는 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 특성화하는 것이 상기 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 상위 결합 모티프(superordinate binding motif)를 확인하는 것을 포함하는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 특성화하는 것이
    a) 상기 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 폴리펩티드 분자의 위치-기반 및/또는 상위 결합 모티프를 확인하는 것, 및/또는
    b) 제시된 출원에 의해 확인된 펩티드를 사용하여 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 폴리펩티드 분자의 표적외 펩티드(off-target peptide)를 확인하는 것을 포함하는 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드에 대한 폴리펩티드 분자의 결합을 특성화하는 것이 다른 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 상기 펩티드의 교차-반응성(cross-reactivity)을 탐색 및/또는 확인하는 것을 포함하는 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 암성(cancerous) 및/또는 비-암성 세포 또는 조직에서 상기 펩티드 모티프 또는 펩티드 모티프들의 제시(presentation)를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단계 a)에서 상기 샘플에 적어도
    · 공지된 서열을 갖는 하나의 펩티드 및/또는
    · 이의 펩티드가 공지된 서열을 갖는 하나의 정의된 및/또는 미리 선택된 펩티드:MHC 복합체를,
    바람직하게는 미리 결정된 양으로 첨가하는 것("스파이킹(spiking)")을 추가로 포함하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 펩티드의 서열이 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")가 결합하는 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드")의 서열에 비해 변경되거나 돌연변이되는 방법.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")가 결합하는 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드")의 일련의 돌연변이체가 생성되고 단계 a)에서 샘플에 첨가되며, 각각의 돌연변이체는, 이의 전체 길이에 걸쳐 또는 적어도 이의 하위분획(subfraction)에 걸쳐, 한 위치에서 대체 아미노산으로 치환된 아미노산 잔기를 갖는 방법.
19. 제16항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 각각의 돌연변이체가, 이의 전체 길이에 걸쳐 또는 적어도 이의 하위분획에 걸쳐, 한 위치에서 알라닌 또는 글리신으로 치환된 아미노산 잔기를 갖는 방법.
20. 제16항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")가 결합하는 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드")의 고정 위치가 변경/돌연변이되지 않는 방법.
21. 제2항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스 물질이 Sepharose^® 또는 아가로스(agarose)로부터 선택되는 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단계 b) 및/또는 c)에서 상기 샘플을, 예를 들면, 광범위 특이성(broad specific) TCR 및/또는 항체와 같은 하나 이상의 다른 결합 도메인 분자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 적어도 하나의 광범위 특이성 결합 도메인 분자가, 이에 결합된 펩티드와 관계없이, 하나 이상의 MHC 분자 단독에 대해 결합 특이성을 갖는 MHC pan-특이성 결합 분자인 방법.
    제21항 또는 제22항에 있어서,
    (i) 샘플의 제1 분획은 pMHC 결합 폴리펩티드와 접촉되고,
    (ii) 샘플의 제2 분획은 다른 pMHC 결합 폴리펩티드 또는 MHC pan-특이성 결합 분자와 접촉되며,
    여기서 추가로, pMHC 결합 폴리펩티드 및 다른 pMHC 결합 폴리펩티드 또는 MHC pan-특이성 결합 분자에 결합된 펩티드:MHC 복합체를 단리한 후, 두 분획에서 달성된 단리 효율(isolation efficiency)이 비교되는 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 또는 c)에서, 과량의 pMHC 결합 폴리펩티드 및 임의로 MHC pan-특이성 결합 분자가 적용되는 방법.
25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 샘플의 다른 펩티드에 대한 제1 및 제2 분획에 사용된 결합제(결합 폴리펩티드 또는 결합 분자)의 결합 친화도가 단리 효율의 비교에 기반하여 결정되는 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에서 적어도 하나의 분자가 검출가능한 마커(marker) 또는 표지(label)를 포함하는 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 확인 및/또는 표적외 결합의 컴퓨터 분석(computational analysis)을 추가로 포함하는 방법.
28. 제14항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드:MHC 결합 도메인에 대한 교차-반응성이 적어도 하나의 세포독성 실험에 의해 추가로 조사되는 방법.
29. 예를 들면, a) 매트릭스 물질, 및 b) 적어도 하나의 펩티드:MHC 복합체에 결합하는 적어도 하나의 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자와 같은, 제1항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 따르는 방법을 수행하기 위한 물질을 함유하는 키트(kit).
30. 적어도 하나의 정의된 펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자("pMHC 결합 폴리펩티드")로서, 펩티드:MHC 복합체의 펩티드("표적 펩티드")에 대한 결합이 제1항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 따른 방법으로 특성화되는 폴리펩티드 분자.

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