CN104448001A

CN104448001A - 抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN104448001A
Application number: CN201410649239.1A
Authority: CN
Inventors: 金洪传; 王娴; 冯利锋; 陈定伟; 许首芳
Original assignee: HANGZHOU BOPU MEDICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: HANGZHOU BOPU MEDICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明公开了一种抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体及其应用；从用5-甲基胞嘧啶免疫的兔子获得的脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细胞产生的特异性兔抗5-甲基胞嘧啶单克隆抗体以及从该杂交瘤细胞重组克隆获得该特异性抗体全长cDNA序列及其体外表达生产的抗体。另外，本发明涵盖以该抗体为基础的甲基化DNA检测方法。该5-甲基胞嘧啶兔单克隆抗体能特异性的结合5-甲基胞嘧啶（ELISA法），而对胞嘧啶的结合能力很低。因此表明，该抗体具有特异性结合5-甲基胞嘧啶的能力。

Description

抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及兔抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体，抗体重组cDNA序列，蛋白序列及使用该抗体用于检测DNA中5-甲基-胞嘧啶的相关方法。

背景技术

表观遗传修饰(包括DNA甲基化，组蛋白甲基化、乙酰化等)的发现是对生命体遗传图谱的重要补充，研究表明表观遗传修饰在正常的生理状态中发挥十分重要的作用，例如胚胎初期的基因印迹，X染色体失活，染色体稳定等。

近年来研究发现，恶性肿瘤的发生发展不仅仅是细胞内各种基因突变的结果，更同表观遗传调控网络的紊乱密切相关。

DNA甲基化修饰，作为DNA本身的化学修饰，是表观遗传调控网络的主要组成部分之一。DNA甲基化修饰是指构成DNA的碱基之一胞嘧啶(C)的5位有被甲基化修饰成5-甲基-胞嘧啶(5-mC)的情况。DNA甲基化修饰主要发生在DNA序列中的CpG区域中的C上。

近年来的研究揭示，DNA甲基化异常在恶性肿瘤发生发展中起重要作用。例如，抑癌基因的启动子CpG岛(CGI)高甲基化是肿瘤发生中频发的早期事件，并且常表现出肿瘤特异性的“表观基因组”。迄今为止，已发现许多与细胞凋亡增殖等基本生命活动相关的抑癌基因在肿瘤细胞中因启动子高甲基化而表达沉默。启动子区DNA的甲基化也因此被广泛用于新抑癌基因的发现和鉴定(1-8)。

而且现有研究发现人体外周血中也存在DNA包括甲基化修饰的DNA，不同的生理或病理状态下DNA的量，甲基化DNA的量和种类也各有不同，可以很好的表征不同的生理和病理状态。因此检测外周血中特异的甲基化DNA可以用于各种病理状态(尤其是癌症)的诊断辅助和预后预测等。

作为用于检测甲基化DNA的重要工具之一，特异性的甲基化DNA抗体的制备，以及使用该特异性抗体免疫沉淀，富集甲基化DNA，然后可以分析特定的DNA甲基化情况，也可以用于微列阵芯片分析总的DNA甲基化状态。

目前市场上也有多种识别5-甲基-胞嘧啶的抗体出售。例如Zymo Research的5-mC抗体(鼠单克隆抗体)等。另外也有相关的5-mC抗体的专利(包括特开2003-125766号公报和申请号为：201080042414.0等)。

发明内容

本发明旨在以制备兔特异性抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体及以此为基础的甲基化DNA检测方法，提供大肠癌等相关肿瘤诊断、预防或治疗中的应用。

目前市场上已有的5-甲基胞嘧啶抗体亲和能力不一，特异性不一，这些抗体对甲基化DNA的检测灵敏度和特异性都不一而足，存在检测不到低丰度样本及出现假阳性的可能。

本发明鉴于上述事实，旨在制备一种高亲和力、高特异性的5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体。

为实现发明目的，发明人提供如下技术方案：

一种抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体包括：

SEQ ID NO:1所示的重链氨基酸序列；

SEQ ID NO:2所示的轻链氨基酸序列。

一种编码如权利要求1所述抗体的DNA序列包括：

SEQ ID NO:3所示的重链cDNA序列；

SEQ ID NO:4所示的轻链cDNA序列。

所述抗体的应用是用于DNA甲基化检测。

利用兔子特有的免疫系统，能产生比鼠具有更高亲和力，更高特异性的抗体，而且兔子的免疫球蛋白(IgG)只有一种亚型，体外克隆重组生产极其方便。以5-甲基胞嘧啶盐酸盐(Sigma-M6751)与BSA(牛血清白蛋白)交联作为免疫抗原。然后用该抗原免疫新西兰大白兔，将从该免疫后新西兰大白兔的抗体产生细胞(脾脏细胞)和骨髓瘤细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选能产生高特异性和高亲和力结合5-甲基胞嘧啶的抗体，进而通过分子克隆技术获得表达该抗体的特异cDNA，用于体外重组生产该抗体，从而完成本发明。

本发明从实验得知，该5-甲基胞嘧啶兔单克隆抗体能特异性的结合5-甲基胞嘧啶(ELISA法)，而对胞嘧啶的结合能力很低。因此表明，该抗体具有特异性结合5-甲基胞嘧啶的能力。

作为优选，根据本发明所述的5-甲基胞嘧啶特异性兔单克隆抗体为基础的检测手段，包括ELISA、Med-IP、PCR、实时定量PCR和微阵列分析。

附图说明

图1为5-甲基胞嘧啶交联BSA作为免疫抗原的交联结果电泳图；

图2为5-甲基胞嘧啶交联OVA作为免疫后血清检测原的交联结果电泳图；

图3为胞嘧啶交联OVA作为免疫后血清检测原的交联结果电泳图；

图4为体外重组生产抗体纯化后SDS-PAGE跑胶鉴定结果；

图5为重组抗体竞争性ELISA鉴定结果。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

一种抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体包括：

SEQ ID NO:1所示的重链氨基酸序列；

SEQ ID NO:2所示的轻链氨基酸序列。

一种编码如权利要求1所述抗体的DNA序列包括：

SEQ ID NO:3所示的重链cDNA序列；

SEQ ID NO:4所示的轻链cDNA序列。

所述抗体的应用是用于DNA甲基化检测。

SEQ ID NO:1：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGGLVQPEGSLTLTCIASGFSFSSSYWMSWVRQA

PGKELEWIGDISYGNSGNTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARYTT

SGGYYIDLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTW

NSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKP

TCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARP

PLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYT

MGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLS

VPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK。

SEQ ID NO:2：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAQVLTQTPASVSAPVGGTVTINCQASQSVYSNNALAW

YQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGAYSDNF

PFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTT

GIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC。

SEQ ID NO:3：

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC

AGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACAC

TCACCTGCATAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAGCTATTGGATGTCCTGGGTCCGC

CAGGCTCCAGGGAAGGAGCTGGAGTGGATCGGAGACATTAGTTATGGTAATAGTGGTA

ACACTTATTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGAC

CACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGT

GCGAGATATACTACTAGTGGTGGTTATTATATTGATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTAGTC

ACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCG

GGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGG

AGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCC

GTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCA

AGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGAC

AAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGG

GGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACG

CACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCA

GTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGA

GCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGA

CTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCC

CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACAC

CATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATC

AACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAG

GACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACA

GCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCG

TGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGG

TAAATGA。

SEQ ID NO:4：

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG

CCAGATGCGCCCAAGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCACCTGTGGGAG

GCACAGTCACCATCAACTGCCAGGCCAGTCAAAGTGTTTATAGTAACAACGCCTTAGC

CTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTC

TGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTTACTCT

CACCATCAGCGATCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGCTTATA

GTGATAATTTTCCTTTTGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGC

ACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACC

ATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGG

CACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGT

ACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAA

GAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGG

GGTGACTGTTAG。

实施例1：免疫和ELISA包被抗原交联制备

(1)5-甲基胞嘧啶-BSA

一、试剂

二、交联步骤

1.称取41.25mgBSA溶解在1ml 1*PBS溶液中，待溶解后放在磁力搅拌器搅拌；

2.称取1mg EDC室温溶解在0.5ml 1*PBS溶解，充分溶解；

3.将EDC溶液逐滴加入搅拌中的BSA中，加完后室温反应10Min；

4.称取10mg 5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine hydrochloride)加入0.5ml 1*PBS中至完全溶解；

5.将溶解的5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine hydrochloride)加入至步骤3的溶液中，室温下继续搅拌反应30Min；

6.将反应的溶液装入透析袋中，4度1*PBS溶液中透析过夜；

7.收集透析后的交联物电泳，BSA作对照。

8.交联产物纯度和大小如图1所示。

(2)5-甲基胞嘧啶-OVA

一、试剂

二、交联步骤

1.称取28.1mgOVA溶解在1ml 1*PBS溶液中，待溶解后放在磁力搅拌器搅拌；

2.称取1mg EDC室温溶解在0.5ml 1*PBS溶解，充分溶解；

3.将EDC溶液逐滴加入搅拌中的OVA中，加完后室温反应10Min；

6.将反应的溶液装入透析袋中，4度1*PBS溶液中透析过夜；

7.收集透析后的交联物电泳，BSA作对照。

8.交联产物纯度和大小如图2所示。

(3)胞嘧啶-OVA

交联步骤

1.称取49.95mgOVA溶解在1ml 1*PBS溶液中，待溶解后放在磁力搅拌器搅拌；

2.称取1mg EDC室温溶解在0.5ml 1*PBS溶解，充分溶解；

3.将EDC溶液逐滴加入搅拌中的OVA中，加完后室温反应10Min；

4.称取10mg胞嘧啶(Cytosine，SLBG2407V，SIGMA)加入0.5ml 1*PBS中至完全溶解；

5.将溶解的胞嘧啶(Cytosine)加入至步骤3的溶液中，室温下继续搅拌反应30Min；

6.将反应的溶液装入透析袋中，4度1*PBS溶液中透析过夜；

7.收集透析后的交联物电泳，BSA作对照。

8.交联产物纯度和大小如图3所示。

实施例2 单克隆抗体的制备

2.1 新西兰大白兔免疫

初次免疫：250ug抗原加等体积氟氏完全佐剂(Sigma)乳化后，皮下注射兔子，注射体积1000ul/只。三周后，第二次免疫：250ug抗原加等体积氟氏不完全佐剂(Sigma)乳化，皮下注射兔子，注射体积1000ul/只。两周后，第三次免疫：250ug抗原加等体积氟氏不完全佐剂乳化，皮下注射兔子，注射体积1000ul/只。一周后，采兔子耳缘静脉血，离心取血清测效价(用ELISA方法检测)。一周后，第四次免疫：250ug抗原加等体积氟氏不完全佐剂乳化，皮下注射兔子，注射体积1000ul/只。二周后，第五次免疫：250ug抗原加等体积氟氏不完全佐剂乳化，皮下注射兔子，注射体积1000ul/只。一周后，采兔子耳缘静脉血，离心取血清测效价(用ELISA方法检测)。效价达六万以上的兔子，在取脾细胞融合前三天取抗原250ug加强免疫，注射体积500ul/只。

2.2 细胞融合

兔子处死。先用一套剪刀，镊子剪开兔子的皮毛。再用一套剪刀，镊子取其脾脏。修剪脾脏，尽量除去表面的脂肪等异物。用RPMI-1640(内含三抗)加入10个平皿中，洗涤脾脏10次。用2ml注射器吸取RPMI-1640，选取不同点注入到脾脏内部，用3ml注射器柄挤压脾，将挤压的脾通过150目筛网至一新的平皿中。过筛的液体转移到50ml离心管。将残留在筛网上的脾细胞磨出至平皿。离心，1500rp，5min。去上清，加入5倍体积的红细胞裂解液，吹散细胞团，裂解5min。离心，1500rp，5min。去上清，再洗涤一次，离心，1500rp，5min。去上清，用20ml RPMI-1640重悬细胞。台盼兰染色计数，取2*10⁸细胞至50ml离心管。

将培养至对数生长期的240E细胞上清倒掉，加入1640AB不完全培养基(9％血清，1％GlutaMAX)吹打细胞(在融合前2周培养240E细胞，培养基内含8-氮鸟嘌呤)计数，>10⁸。收集细胞，1500rpm，5min。计数，取1*10⁸细胞加至脾细胞中，混匀，离心，1500rpm，5min。吸除上清(除去液体残留)，轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，用1ml吸管在30秒加预热至37℃的PEG 1ml，轻轻搅拌30秒。用1min时间匀速滴加22ml预热至37℃的RPMI-1640。再用1min时间匀速滴加1640AB培养液(9％血清，1％GlutaMAX)，轻轻混匀。离心，1200rpm，5min。吸除上清，加入10ml 1640AB培养液(9％血清，1％GlutaMAX),轻轻吹匀，加入至含有190ml 1640AB培养液(9％血清，1％GlutaMAX)瓶中，晃匀，铺20块96孔板，100ul/孔。放入5％的二氧化碳培养箱中。第二天加入含2XHAT的1640AB培养液(9％血清，1％GlutaMAX)，100ul/孔。10天后预筛，根据背景换液，15天初筛，筛出阳性克隆。

实施例3：ELISA检测血清或抗体效价

基本流程:

1、包板：用包被缓冲液(coating buffer:Na2CO3和NaHCO3的缓冲液)将已知抗原(BSA-5mC或OVA-胞嘧啶)稀释至1μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次。

2、封闭：每孔加60μl的1％BSA(TBST配制)进行封闭，置37℃孵育1小时。之后弃封闭液。

3、加样：加一定稀释的待检样品(把待检样品按照1:200、1:1000、1:5000、1:10000、1:20000、1:60000、1:240000的比例稀释)，50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(阳性血清)与阴性对照孔(BSA)。置37℃孵育1小时，之后弃封闭液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次。

4、加酶标抗体：将新鲜稀释的二抗-HRP(1:10K，用1％BSA进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃封闭液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次。

5、加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl(A液【磷酸氢二钠，柠檬酸，双氧水，去离子水配制】与B液【TMB,柠檬酸，EDTA,甘油，DMSO，去离子水配制】以1:1配制，现配现用)，置37℃反应5min。

6、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸90μl。

7、读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据，进行分析。

8、血清滴度结果如附表一所示，杂交瘤上清抗体效价如附表二所示，重组抗体效价如附表三所示，所有结果表明该抗体可以特异性结合5-甲基胞嘧啶。

表1是免疫后兔子血清用ELISA检测其与5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶的结合能力。表明该兔子血清对5-甲基胞嘧啶具有很高的特异性。

抗原	5-mC	C
			1:200	2.45	0.81
1:1000	2.484	0.594
			1:5000	2.383	0.381
1:10000	2.317	0.285
			1:20000	1.942	0.217
1:60000	1.031	0.132
			1:240000	0.37	0.087
BSA	0.048	0.057

表2为融合后杂交瘤细胞ELISA检测其与5-甲基胞嘧啶的结合能力

抗原	5-mC
		1	2.302
1/20	2.216

表3为克隆重组cDNA体外表达生产的抗体与5-甲基胞嘧啶的结合能力，表明该重组生产的抗体能特异性结合5-甲基胞嘧啶。

实施例4：竞争ELISA：

(1)与胞嘧啶竞争

1、包板:用包被缓冲液(coating buffer:Na2CO₃和NaHCO₃的缓冲液)将抗原(OVA-5mC)稀释至1μg/ml，分别在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1*TBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次。

2、封闭:每孔加60μl的1％BSA(1*TBST配制)进行封闭，置37℃孵育1小时。之后弃封闭液。

3、加样：将1:10000稀释的待检样品(兔杂交瘤上清)50μl与胞嘧啶(浓度梯度)50μl混合反应后加入上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(未加胞嘧啶)与阴性对照孔(1％BSA)。置37℃孵育1小时，之后弃封闭液，用1*TBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次。

4、加酶标抗体：将新鲜稀释的羊抗兔-HRP(1:10K，1％BSA进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃封闭液，用1*TBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次。

5、加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，置37℃反应5min。

6、终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸90μl。

(2)与5-甲基胞嘧啶竞争

1、包板:用包被缓冲液(coating buffer:Na2CO₃和NaHCO₃的缓冲液)将已知抗原(OVA-5mC)稀释至1μg/ml，分别在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1*TBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次。

3、加样：将兔杂交瘤上清原液50μl与5-甲基胞嘧啶(1μg/50μl)50μl混合反应后加入上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(未加5-甲基胞嘧啶)与阴性对照孔(1％BSA)。置37℃孵育1小时，之后弃封闭液，用1*TBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次。

6、终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸90μl。

8、结果分析：竞争性ELISA结果如图5所示，表明该抗体能特异性结合5-甲基胞嘧啶而不能与胞嘧啶结合。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州博谱医药科技有限公司

<120> 抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体及其应用

<130> 12345

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Glu Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly Phe Ser Phe

35 40 45

Ser Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Ser Tyr Gly Asn Ser Gly Asn Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser

85 90 95

Thr Thr Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Thr Thr Ser Gly Gly Tyr Tyr Ile Asp

115 120 125

Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys

130 135 140

Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser

145 150 155 160

Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr

180 185 190

Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His

210 215 220

Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys

225 230 235 240

Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

245 250 255

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu

275 280 285

Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg

290 295 300

Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser

305 310 315 320

Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys

325 330 335

Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly

355 360 365

Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met

370 375 380

Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn

385 390 395 400

Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu

420 425 430

Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 2

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser

20 25 30

Val Ser Ala Pro Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser

35 40 45

Gln Ser Val Tyr Ser Asn Asn Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Gly Ala Tyr Ser Asp Asn Phe Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val

115 120 125

Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala

145 150 155 160

Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr

165 170 175

Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala

180 185 190

Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln

195 200 205

Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr

210 215 220

Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

225 230 235

<210> 3

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

gagcagctgg tggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 120

tgcatagcct ctggattctc cttcagtagc agctattgga tgtcctgggt ccgccaggct 180

ccagggaagg agctggagtg gatcggagac attagttatg gtaatagtgg taacacttat 240

tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact 300

ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagatatact 360

actagtggtg gttattatat tgatttgtgg ggcccaggca ccctagtcac cgtctcctca 420

gggcaaccta aggctccatc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 480

tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa gggtacctcc cggagccagt gaccgtgacc 540

tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 600

ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 660

aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 720

agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 780

ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 840

gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 900

cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 960

accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 1020

aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 1080

gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 1140

ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 1200

gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 1260

ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 1320

tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 1380

ccgggtaaat ga 1392

<210> 4

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

agatgcgccc aagtgctgac ccagactcca gcctcggtgt ctgcacctgt gggaggcaca 120

gtcaccatca actgccaggc cagtcaaagt gtttatagta acaacgcctt agcctggtat 180

cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatt ctgcatccac tctggcatct 240

ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agtttactct caccatcagc 300

gatctggagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gcgcttatag tgataatttt 360

ccttttggcg gagggaccga ggtggtggtc aaaggtgatc cagttgcacc tactgtcctc 420

atcttcccac cagctgctga tcaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 480

aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 540

ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 600

actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 660

cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc aataggggtg actgttag 708

Claims

1.一种抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体，其特征在于包括：

SEQ ID NO:1 所示的重链氨基酸序列；

SEQ ID NO:2 所示的轻链氨基酸序列。

2.一种编码如权利要求1所述抗体的DNA序列，其特征在于包括：

SEQ ID NO:3所示的重链cDNA序列；

SEQ ID NO:4所示的轻链cDNA序列。

3.一种如权利要求1所述抗体的应用，其特征在于用于DNA甲基化检测。