CN110174515B

CN110174515B - 一种检测抗肺癌天然抗体的组合物、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN110174515B
Application number: CN201910384896.0A
Authority: CN
Inventors: 韩传伟; 张萱; 徐宏海
Original assignee: Qingdao Hailanshen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Hailanshen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: CN110174515A

Abstract

本发明涉及用于检测抗肺癌天然抗体(NALC)的组合物、由该组合物制成的试剂盒、使用该组合物或该试剂盒检测样品中NALC浓度的方法、以及该组合物或该试剂盒在样品NALC检测中的应用。本发明利用与目标NALC完全互补的3种线性抗原多肽,实现对样品中NALC的定性、定量检测，可用于预测肺癌发病风险和早期诊断肺癌。

Description

一种检测抗肺癌天然抗体的组合物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，涉及3种肽类抗原，可应用于制备酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测试剂盒，用于检测人血液中抗肺癌天然抗体(Natual antibody for lung cancer，NALC)浓度。

背景技术

恶性肿瘤是威胁整个人类健康的最主要杀手之一。基于灰霾雾霾等环境污染状况的持续存在，中国人群主要癌症的发病率呈逐年上升趋势。据统计，目前我国癌症平均每年发病率高达3/1000以上。肿瘤早期治疗手段，如手术切除或放射线治疗已发展的比较成熟，能够明显延长病人的存活时间。但是，如何预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤是有效防治肿瘤的重要途径。

先前的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。在国外,已有早期诊断肺癌和乳腺癌的诊断试剂盒市售。例如，由英国诺丁汉Oncimmune有限公司推出的Early CDT^TM-Lung诊断试剂盒已用于临床早期诊断肺癌近10年。然而，这种抗体检测方法敏感度相对低，特异性差。其中主要原因是，每一种肿瘤相关抗原自身抗体在患者血中的平均阳性检测率只有5-10％；即便是多种抗原混合，早期肺癌阳性检测率也难以突破40％。近年来的研究表明，血液循环中的肿瘤DNA(Circulating tumour DNA,ctDNA)检测可以使早期诊断肺癌的阳性率达到50％。但由于技术复杂、检测费用昂贵，难以普及和推广。因此，研发一种简便、可靠、廉价、适用于大面积人群筛查和早期诊断肿瘤的技术成为需要亟待解决的重大难题。

大量的研究报道显示，人血中50％以上的抗体属于天然抗体，主要由B1淋巴细胞产生,在不需要特异性抗原的刺激下自发地分泌。天然抗体参与机体的各种生理调节和免疫功能稳定,充当固有免疫和特异免疫系统之间的桥梁。特别值得注意的是，某些天然抗体具有免疫监视功能，随时清除体内形成的恶性变细胞,以维持内环境稳定。因此，保持一定水平的天然抗体可以起到防癌作用。据此推测，天然抗体缺乏者发生肿瘤的风险可能明显高于正常人群。在肿瘤治疗领域，数种单克隆抗体相继问世，已成为肿瘤靶向治疗的主要手段。例如，临床上广泛应用的曲妥株单抗(Trastuzumab)、贝伐株单抗(Bevacizumab)和PD-1单抗(Nivolumab)等。用于肿瘤治疗的单克隆抗体多数是以细胞膜蛋白为靶向分子。本发明人的近期研究发现，某些细胞膜蛋白靶向分子的天然抗体在早期肿瘤病人血中的浓度明显低于正常人。提示，这些天然抗体可能参与免疫监视功能，随时清除体内形成的恶性变细胞，检测这些天然抗体可能具有早期诊断肿瘤的价值。

血管内皮细胞生长因子一型受体(Vascular endothelial growthfactorreceptor 1,VEGFR1)是一种跨膜蛋白。大量的研究工作发现，许多人类实体肿瘤可以大量地表达VEGFR1，如肝癌，肺癌，肾癌，肠癌及乳腺癌等。因为VEGFR1抗原表位多肽主要位于肿瘤细胞表面，成为相应抗体直接攻击杀伤肿瘤的靶点(如贝伐株单抗治疗原理)，也可间接地影响其功能而限制肿瘤的生长与发展。上皮粘蛋白1(Mucin 1,MUC1)是一种醣化的细胞膜蛋白，多数上皮恶性肿瘤细胞均大量表达MUC1，且与恶性细胞的快速增生有关。故MUC1是非常重要的肿瘤标靶，在发展癌症免疫疗法中具有重大意义。基于MUC1蛋白为靶标的肿瘤疫苗技术目前已在国外进入临床试验阶段。

已经证实，调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg细胞)与肿瘤免疫逃逸机制密切相关。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌及黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞群中，Treg细胞比例明显增高。Treg细胞通过直接接触免疫细胞或通过释放细胞因子，抑制效应性CD4⁺和CD8⁺T细胞的活化与增殖。白细胞介素2受体亚基A(Interleukin-2receptorsubunit alpha,IL2RA),也称CD25，是Treg细胞的主要表面标志物。CD25作为I型跨膜蛋白，对多种T细胞和B细胞活化发挥关键的调节作用。本发明人的近期研究工作表明，早期肺癌病人血中抗CD25的天然抗体明显低于正常人，这可能会引发Treg细胞功能上调，抑制活化的T细胞及限制免疫反应的发生，在维持肿瘤免疫耐受过程中发挥重要作用。动物实验证实，抗CD25单抗可抑制荷瘤小鼠体内Treg细胞活性，提高小鼠抗肿瘤免疫功能。体外实验证实，去除外周血中Treg细胞，可以增强细胞毒细胞(包括CTL和LAK/NK细胞等)活性。近来研究发现，脑胶质瘤患者随疾病进程的发展，CD4⁺/FOXP3⁺阳性Treg细胞呈现时间依赖性地增加，同时伴随CD25高度表达；而应用抗CD25单抗可显著抑制CD4⁺/FoxP3⁺阳性Treg细胞的增殖。

发明内容

本发明人研究发现，早期肺癌病人血中抗CD25、VEGFR1和MUC1的天然抗体明显低于正常人健康人。检测这些天然抗体可能具有早期诊断肺癌的价值。本发明的主要目的是提供一组用于检测人血液中抗肺癌天然抗体(Natual antibody for lung cancer，NALC)浓度的线性抗原多肽和由这组抗原多肽制备的试剂盒，以及使用该组抗原多肽或该试剂盒检测人血液中NALC的方法。所述抗原多肽为衍生于CD25、VEGFR1和MUC1三种蛋白的抗原表位。这些抗原表位能够与针对人血浆或血清中抗CD25、抗VEGFR1和抗MUC1的天然抗体发生特异性结合。

本发明所定义的“抗肺癌天然抗体(NALC)”是自然存在于健康人体内的抗体或抗体混合物，它由人体自发产生，可能参与肺癌的发生。检测人血液中NALC具有预测肺癌发病风险和早期诊断肺癌的重要价值。在本发明的特定实施方案中，所述NALC是指能识别表4所列的SEQ ID NO:1-3中的一个或多个抗原多肽序列的天然抗体或天然抗体混合物。

已经公认，抗原抗体的结合主要发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。抗原与抗体在空间结构和构型上越接近完全互补，抗原抗体的结合就越稳定，特异性就越强，结合效率就越高。因此，目标抗体(待检测样品中的抗体)及其结合位点结构是先决因素，抗原决定簇可代表整个蛋白抗原与抗体结合状态和亲和特性。

本发明人利用免疫信息学方法和表位制图技术，分析CD25、VEGFR1和MUC1三种蛋白序列上的人类白细胞二类抗原(Humanleukocyte antigen II,HLA-II)表位和B细胞表位，甄别具有高度亲和力的氨基酸序列，进而设计被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的HLA-II限制性表位及线性抗原多肽。所设计的三种抗原多肽在空间结构和构型上与目标抗体完全互补的线性抗原多肽，它们在相应蛋白序列上的位置分别列于表1-3中，并用斜体和下划线标示。

表1.人CD25蛋白序列

表2.人VEGFR1蛋白序列

表3.人MUC1蛋白序列

这三种线性抗原多肽的氨基酸序列见表4。

表4.检测人血液中NALC的线性抗原多肽序列

经固相化学法合成上述3种抗原多肽，并按比例混合后制备ELISA抗体检测试剂盒，按设定的流程规范检测样品中NALC浓度。上述3种抗原多肽在实际应用中可制备成简单易用的便捷试剂盒，以玻璃、医用塑料等非金属材料真空密封包装，在4℃环境下可保存6个月以上。简言之，可将3种多肽抗原混合液包被的马来酰亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板在40-45℃烤箱中干燥后，用非金属包装材料真空密封包装，制成试剂盒。优选3种多肽抗原均为纯度>90％的制品。

因此，根据本发明之一，提供一种用于检测NALC的组合物，其包括下述3种抗原多肽：

H-RIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESD-OH；

H-DEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDK-OH；和

H-RYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG-OH。

在一些实施方案中，所述3种抗原多肽为高纯度制品，优选为纯度>90％的化学合成制品。

在一些实施方案中，所述组合物中3种抗原多肽的质量体积浓度比为1:1:1。

根据本发明的另一个方面，提供一种包含上述组合物的试剂盒。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含用非金属医用包装材料真空密封包装的干燥的96孔微量检测板，所述96孔微量检测板是马来酰亚胺活化的并用所述3种抗原多肽混合液包被。

在另一些优选的实施方案中，所述非金属医用包装材料为玻璃或医用塑料。

在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。

根据本发明的另一个方面，提供一种使用上述组合物或上述试剂盒检测样品中NALC的方法，优选该方法为体外的、非诊断目的的检测技术。

在一些实施方案中，所述方法包括将上述组合物中的3种抗原多肽等比混合，然后通过抗原抗体结合反应检测样品中NALC浓度。

在优选的实施方案中，所述“通过抗原抗体结合反应检测样品中NALC浓度”是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法实现的。

在更优选的实施方案中，所述酶联免疫吸附测定为夹心法ELISA。

在更优选的实施方案中，将上述组合物中的3种抗原多肽等比混合后，包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板，放置4℃过夜孵育，洗板，再对待测样品进行检测分析。

在更优选的实施方案中，所述对待测样品进行检测包括分步加样分析，所述分步加样分析包括将待测样品设双复孔，同时设2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，用分析液将血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl 10-12％硫酸溶液作为终止液，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。

其中，硫酸溶液的浓度是体积/体积比。

在更优选的实施方案中，所述样品为人血液，例如人血浆或血清。

在更优选的实施方案中，所述方法的具体操作步骤为：

1.操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5mg/ml储存液,然后等体积混合并放置-20℃(误差在±2℃范围内)冰箱中保存。

2.操作开始时，首先将表4中所列3种抗原多肽的混合液用包被液稀释为10～50μg/ml的工作液，该包被液为含0.15M氯化钠和10mMEDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。

3.用工作液包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板(ThermoScientific,美国)，4℃过夜孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间。

4.然后按以下步骤分步加样和分析：

a)待测样品设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为不含抗CD25抗体、抗VEGFR1抗体和抗MUC1抗体的阴性对照液，如牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司提供)，藉此可反映表4所述的3种多肽抗原在NALC阴性反应体系中的实验指标值)和2个阳性对照孔(PC，参照物为抗人CD25抗体、抗人VEGFR1抗体和抗人MUC1抗体的等比混合物)，藉此可反映表4所述的3种多肽抗原在NALC阳性反应体系中的实验指标值。

b)用分析液将待测样品1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH为7.0～7.4之间，每孔加100μl,25℃孵育1-2小时，然后洗板3遍。

c)用分析液(即含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，酸碱度为7.0～7.4之间)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(用以验证样品中被检测的物质是否是特异性抗体)，抗体稀释比例为1:10000～1:50000，每孔加100μl，25℃孵育1-2小时。

d)用洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～7.4之间)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟。

e)每孔加50μl 10-12％硫酸溶液作为终止液，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。检测过程在加入终止液后10分钟内完成，由此定量分析个体血浆中NALC水平。

在一些实施方案中，可针对每一个样品测得数据进行分析，采用阳性样品比值(Positive sample ratio，PSR)判定样品中NALC的相对水平。PSR计算方法如下：

PSR＝[待测样品OD值–OD_NC值]/[阳性标准品OD值–OD_NC值]，NC为各样本的阴性对照。

在本发明的另一个方面，提供上述组合物或试剂盒在体外的、非诊断目的检测样品中NALC中的应用。

在本发明的另一个方面，还提供上述组合物在制备用于检测样品中NALC的试剂中的应用。

在优选的实施方案中，所述样品为人血液，例如人血浆或人血清。

在一些实施方案中，通过对样品中NALC水平的检测可以预测肺癌发病风险或诊断肺癌。因此在本发明的另一个方面，还提供上述组合物在制备用于预测肺癌发病风险或诊断肺癌的试剂中的应用。

基于以上方案，本发明提供了精度高、操作简易、成本适中的NALC检测技术，并在此基础上，进一步提供了对样品中NALC的半定量(或相对定量)的分析和应用方案，进而为发展基于血液中NALC的全新早期诊断肺癌和早期实施治疗策略奠定重要基础。

本发明提供了一种简便的NALC的检测手段，可用于辅助定性、定量检测样品NALC水平，辅助量化测定不同群体(例如健康人群)和不同个体的血液NALC水平。NALC水平较低或者阴性个体可能具有较高的肺癌发病风险，具有预测肺癌发病风险和早期诊断肺癌的重要价值。用本发明产品检测出的血液NALC阴性个体，可能具有较高的肺癌发病风险，可以对其进行临床随访和追踪，达到早期发现肺癌和早期实施治疗的目的。本发明的NALC检测方法可用于群体普查，检测获得该项指标的分布状态及平均值，由此可为探究肿瘤发生过程中的呈现机制((如肿瘤免疫“逃逸”机制及免疫监视机制等)提供关联指标。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。

附图说明

图1是早期肺癌患者血浆中NALC IgG水平的ROC曲线图。

图2是早中期肺癌患者血浆中NALC IgG水平的ROC曲线图。

图3是中期肺癌患者血浆中NALC IgG水平的ROC曲线图。

图4是晚期肺癌患者血浆中NALC IgG水平的ROC曲线图。

实施例

1、样本收集

收集213份非小细胞肺癌细胞癌(鳞状上皮肺癌和腺上皮肺癌)患者手术治疗前的血浆样品及200例健康人血浆样品用于检测血浆NALCIgG水平。操作前所有血浆样品均在-80℃条件下保存，经核实保存时间未超过两年，没有反复冻融(次数不超过3次)。

2、样本检测

在4℃环境下解冻血浆样品，本实验所采用的3条肽抗原(见表4)系由英国SEVERNBIOTECH有限公司合成，纯度为95％，具体进行如下操作步骤：

(1)操作前，每种抗原用67％乙酸溶解为5.7mg/ml储存液,然后等体积混合并放置-20℃冰箱中保存。

(2)操作开始时，首先将3种抗原混合液用包被液稀释为30μg/ml，该包被液为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH值)为7.2。

(3)然后包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔检测板(ThermoScientific,美国)，4℃过夜16.5小时孵育后，用洗液洗板3遍,所述洗液为含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度pH值为7.2。

(4)然后分步加样分析如下：

a)待测血浆样本设双复孔，另设2个阴性对照孔(NC，参照物为牛血清白蛋白，由Sigma-Aldrich公司提供)和2个阳性对照孔(PC，参照物为抗人CD25抗体、抗人VEGFR1抗体和抗人MUC1抗体的等比混合物，由Sigma-Aldrich公司提供)。

b)用分析液将血浆1:200稀释，所述分析液与抗原包被液相同，为含0.15M氯化钠和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度(pH)为7.2，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。

c)以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测得酸碱度为7.2)洗板3遍后，用分析液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(由Sigma-Aldrich公司提供)，抗体工作浓度为1:30000，每孔加100μl，25℃孵育1.5小时。

d)以前述洗液(即含0.15M氯化钠和0.1％TWEEN-20的0.1M磷酸盐缓冲液，测酸碱度PH值为7.2)洗板3遍后，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液(由Life Technologies公司提供)，室温避光25分钟。

e)每孔加50μl 12％硫酸溶液作为终止液，然后用酶标仪检测光密度(OD)值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，加入终止液后10分钟内检测完毕，后续步骤将依据此结果针对每一个体进行NALC IgG的定量对比分析。

3.数据分析

针对前述检测所得数据进行分析时，采用阳性样品比值(Positivesample ratio，PSR)判定血浆中NALC IgG水平，PSR计算公式为：PSR＝[待测样品OD值–OD_NC值]/[阳性标准品OD值–OD_NC值]，NC为各样本的阴性对照。本方法的阈值是以健康对照组95％特异性(即真阴性率)相对应的病人组PSR值，低于该阈值被定义为NALC IgG低水平个体。本实施例随机抽取的108份健康人血浆样品中，其NALC IgG浓度平均值为PSR＝0.61，变异系数为26.7％；以95％特异性确定的血浆NALC IgG低水平阈值为0.36。

为了突显早期诊断的意义，根据实体肿瘤TNM分期标准将213个非小细胞肺癌病人分为早期、早中期、中期和晚期四组。将肺癌1A期定义为早期(21例)，肺癌1B+2A期定义为早中期(101例)，肺癌2B期定义为中期(41例)，肺癌3-4期定义为晚期(50例)。应用接收者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线图分别处理四组数据。在该曲线图中，NALC IgG呈低水平的血浆被定义为阳性样品。ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式确定分界值或决定阈，即以病人血浆样品中真阳性率(灵敏度)为纵坐标，以健康人血浆样品中假阳性率(1-特异性)为横坐标绘制曲线。ROC曲线下的面积(AUC)值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。采用SPSS统计学软件对前述检测实验数据拟制ROC曲线，计算AUC值，判定灵敏度和特异性。

如图1所示，早期肺癌患者血浆中NALC IgG水平的ROC曲线下面积(AUC)为0.85(95％可信区间为0.76-0.93)，灵敏度为47.6％，特异性为95％。

如图2所示，早中期肺癌患者血浆中NALC IgG水平的ROC曲线下面积(AUC)为0.80(95％可信区间为0.74-0.86)，灵敏度为34.0％，特异性为95％。

如图3所示，中期肺癌患者血浆中NALC IgG水平的ROC曲线下面积(AUC)为0.70(95％可信区间为0.60-0.80)，灵敏度为12.0％，特异性为95％。

如图4所示，晚期肺癌患者血浆中NALC IgG水平的ROC曲线下面积(AUC)为0.76(95％可信区间为0.68-0.84)，灵敏度为22.0％，特异性为95％。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛海兰深生物科技有限公司

<120> 一种检测抗肺癌天然抗体的组合物、试剂盒和方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence (人工序列)

<400> 1

Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val

1 5 10 15

Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val

20 25 30

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence (人工序列)

<400> 2

Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val

1 5 10 15

Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser Asp Lys

20 25 30

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence (人工序列)

<400> 3

Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe

1 5 10 15

Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly

20 25

Claims

1.用于检测抗肺癌天然抗体(NALC)的组合物，包括下述3种抗原多肽:

H-RIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESD-OH；

H-DEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDK-OH；和

H-RYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG-OH。

2.根据权利要求1的组合物，其特征在于：所述组合物中各抗原多肽的质量体积浓度比为1:1:1。

3.包含权利要求1或2的组合物的试剂盒。

4.根据权利要求3的试剂盒，其中包含用非金属医用包装材料真空密封包装的干燥的96孔微量检测板，所述96孔微量检测板是马来酰亚胺活化的并用所述3种抗原多肽混合液包被。

5.根据权利要求4的试剂盒，其中所述材料为玻璃或医用塑料。

6.一种体外的非诊断目的的抗肺癌天然抗体检测方法，包括使用权利要求1或2所述的组合物或权利要求3-5任一项所述的试剂盒检测样品中的抗肺癌天然抗体。

7.根据权利要求6的方法，包括将所述3种抗原多肽等比混合，然后包被马来酰亚胺(Maleimide)活化的96孔微量检测板，4℃过夜孵育，洗板，再进行分步加样分析。

8.根据权利要求7的方法，其中所述分步加样分析包括将待测样品样品双复孔检测，同时设2个阴性对照孔和2个阳性对照孔；用分析液将血浆稀释，并稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，洗板，每孔加100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)及过氧化物酶混合液，室温避光20～30分钟，每孔添加50μl 10-12％的硫酸溶液作为终止液，然后用酶标仪检测光密度值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。

9.权利要求1或2所述的组合物或权利要求3-5任一项所述的试剂盒在体外非诊断目的检测样品中抗肺癌天然抗体中的应用。

10.权利要求1或2所述的组合物在制备用于检测样品中抗肺癌天然抗体的试剂中的应用。