KR20050027211A

KR20050027211A - 백혈병, 전(前)백혈병 또는 비(非)백혈병성악성혈액질환의 판정방법 및 진단약

Info

Publication number: KR20050027211A
Application number: KR1020047016144A
Authority: KR
Inventors: 키요시 안도; 토모미츠 호타; 치에 이토; 히데나오 사토; 아키코 후루야; 켄야 시타라; 세이지 스기모토; 히로아키 코노
Original assignee: 각꼬호우징 토카이다이가꾸; 교와 학꼬 고교 가부시키가이샤; 교와메덱스 코리미티드
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2003-04-09
Publication date: 2005-03-18
Also published as: CA2481710A1; EP1496360A4; CN1646910A; WO2003085399A1; AU2003236028A1; US20060084122A1; US7479371B2; EP1496360A1; JPWO2003085399A1

Abstract

조혈간세포 증식인자(SCGF)를 정량하는 것을 특징으로 하는, 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판정하는 방법, 백혈병과 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판정하는 방법, 재생불량성 빈혈과 골수이형성 증후군을 판정하는 방법, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착의 지연을 판정하는 방법, 또는 이식편 대 숙주반응병을 판정하는 방법에 관한 것이다. 또, 조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 유효성분으로서 함유하여 이루어지는 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환의 진단약, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착지연 또는 이식편 대 숙주반응병(GVHD)의 진단약을 제공할 수가 있다.

Description

백혈병, 전(前)백혈병 또는 비(非)백혈병성 악성혈액질환의 판정방법 및 진단약{METHOD OF JUDGING LEUKEMIA, PRE-LEUKEMIA OR ALEUKEMIC MALIGNANT BLOOD DISEASE AND DIAGNOSTIC THEREFOR}

본 발명은, 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 측정하는 것을 특징으로 하는, 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판정하는 방법, 백혈병과 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판별하는 방법, 재생불량성 빈혈과 골수이형성 증후군을 판별하는 방법, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착(生着)상태를 판정하는 방법, 또는 이식편 대 숙주반응병을 판정하는 방법에 관한 것이다. 또, 조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 유효성분으로서 함유하여 이루어진 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착상태 또는 이식편 대 숙주반응병의 진단약 및 진단 킷(Kit)에 관한 것이다.

백혈병, 전백혈병 및 비백혈병성 악성혈액질환의 진단, 또는 백혈병, 전백혈병 및 비백혈병성 악성혈액질환의 치료 후의 진단은, 백혈병, 전백혈병 및 비백혈병성 악성혈액질환을 치료하기 위한 방침을 결정하는데 중요하다.

백혈병의 초기발생의 진단으로서는, 환자의 말초혈중의 백혈구수를 측정하여, 계측치가 정상치를 웃도는 경우에 백혈병의 발생을 의심하는 방법을 들 수 있다. 그러나, 감기 등의 백혈병 이외의 질환에 있어서도, 체내의 면역 반응의 항진에 의해 백혈구수는 증대하므로, 백혈구수의 측정만으로는, 의사양성(擬似陽性)의 가능성이 있다. 또, 말초혈중의 백혈구수의 정상치는, 4,000~8,000개/μL로서 폭이 넓고, 의사음성(擬似陰性)의 가능성이 있다. 따라서, 보다 확실도가 높은 백혈병의 진단방법이 요구되고 있다.

백혈병 재발의 진단방법으로서는, WT-1 유전자의 RT-PCR에 의한 검출이 있다［임상병리 48,155(2000), Blood, 84, 3071 (1994), 일본특허제 3122771호］. 그렇지만, 그 진단방법은 조작이 번잡함과 동시에, 특수한 장치를 필요로 하고 있다.

또, 상술한 백혈병, 전백혈병 및 비백혈병성 악성혈액질환, 선천성 대사 질환, 고형암등의 치료방법의 하나로서, 조혈간세포 이식요법을 들 수 있다. 조혈간세포 이식요법의 문제점으로서는, 제공자의 조혈간세포와 환자의 조혈간세포와의 HLA 타입의 부적합, 환자측의 몸 컨디션이나 감염증 등에 의해, 이식한 조혈간세포가 생착하지 않는다, 조혈간세포의 생착이 지연된다, 이식편 대 숙주반응병(이하, GVHD라고 칭한다)이 발증하는 등, 조혈간세포 이식치료의 효과를 충분히 얻을 수 없다는 문제들을 들 수 있으며, 최악의 경우, 사망으로 이르게 하는 일도 있다.

조혈간세포의 생착지연에 대해서는, G-CSF를 생체내에 투여하는 것에 의하여, 조혈간세포의 생착을 촉진시킬 수가 있다. 또, GVHD에 대해서는, 면역 억제제를 생체내에 투여함으로써, 제공된 조혈간세포의 거부반응을 억제시킬 수가 있다. 그러나, 어느 약제라도 과잉으로 투여하였을 경우에는, 부작용이 염려된다. 그러므로, 조혈간세포의 생착상태, GVHD 발증을 진단 혹은 예지(豫智)하는 것은 치료방침의 결정에 중요하다.

조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착을 확인하는 방법으로서는, 말초혈중의 백혈구수나 혈소판수를 측정하고, 이들 측정값가 상승하면 조혈간세포가 생착한 것으로 진단할 수가 있다. 그렇지만, 조혈간세포의 생착은, 이식 후 10일부터 1개월 이상을 필요로 하는 일도 있기 때문에, 말초혈중의 백혈구 수나 혈소판 수를 측정하는 것만으로는 조기에 조혈간세포의 생착을 판단할 수가 없다.

GVHD 발증의 판정방법으로서는, 조혈간세포 이식 후의 회복기에 나타나는 피부의 발진등을 관찰하는 것을 들 수 있다. 그러나, 간편하고 확실도가 높은 GVHD 발증의 판정방법은 아직 알려지지 않고 있다. 또한, GVHD 발증 이전에 GVHD의 발증을 예지하는 방법도 알려지지 않고 있다.

인간 조혈간세포 증식인자(Stem Cell Growth Factor；이하, SCGF로 약기한다)는, 배열번호 1 또는 배열번호 2의 아미노산 배열을 갖는 단백질이다［WO98/08859, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7577 (1997), Biochem. Biophys. Res. Comm., 249, 124 (1998)］.

상기 SCGF를 인식하는 항체로서는, 유전자 재조합법에 의해 얻어진 SCGF, 및 SCGF의 N말단으로부터 6잔기째로부터 25잔기째까지의 부분 펩티드를 면역원으로하여 조제한 폴리클론항체 및 세포배양 상청으로부터 부분정제된 SCGF나, 유전자 재조합법에 의해 얻어진 SCGF를 면역원으로하여 조제한 모노클론항체가 알려져 있다［WO98/08859］. 상기 모노클론항체가 중화활성을 갖는 것, 또 유전자 재조합법에 의해 얻어진 SCGF를 면역원으로하여 조제한 폴리클론항체가 ELISA로 유전자 재조합법에 의해 얻어진 SCGF와 반응하는 것, SCGF의 N말단으로부터 6잔기째부터 25잔기째까지의 부분펩티드를 면역원으로하여 조제한 폴리클론항체를 사용한 웨스턴블롯팅에 의해 유전자 재조합법에 따라 얻어진 SCGF를 검출할 수 있다는 것이 보고되고 있다.

또, SCGF의 N말단으로부터 6잔기째부터 25잔기째까지의 부분 펩티드를 면역원으로 한 항SCGF 모노클론항체 KM2142가 보고되어 있다［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］.

인간정상조직에 대해서 노던블롯팅을 실시한 결과, SCGF 유전자의 발현은 신장에 많고, 심장에 적으며, 뇌, 태반, 폐, 간장, 골격근, 췌장에서는 발현을 볼 수 없다는 것［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7577 (1997)］, 비장, 흉선, 맹장, 골수, 태아간에 많고, 말초혈에 적다는 것［Biochem. Biophys. Res. Comm., 249, 124 (1998)］이 알려져 있다. 또, 정상 신생아 마우스에 인사이튜하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 실시한 결과, 골수, 증식연골, 골막 부근에 SCGF가 발현하고 있다는 것이 보고되어 있다［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］.

또한, 골수세포주(HT60, KPB-M15), 단핵구 세포주(THP-1, U-937), 적아구(赤芽球)세포주(HEL), 섬유아(纖維芽) 세포주(NHF)로 SCGF 유전자의 발현을 볼 수 있으나, B세포주(U266B1, IM-9), T세포주(MOLT-4), 적아구 세포주(K562), 상피계 암세포주(HeLaS3, A431), 멜라노마 세포주(Bowes), 아데노바이러스 형질전환 태생 신장 세포주(293), 섬유아 세포주(CCD-8Lu)에서는, SCGF 유전자의 발현을 볼 수 없다는 것이 보고되어 있다［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7577 (1997)］.

그러나, 정상 및 혈액질환의, 혹은 조혈간세포 이식을 받은 인간을 포함한 동물의 말초혈, 골수중의 혈구세포에서의 SCGF의 mRNA량의 차이에 관한 보고는 없다.

조직이나 세포의 mRNA와 코드되는 단백질의 양과의 상관은 낮고(상관계수=0.48)［Electrophoresis, 18, 533 (1997)］, SCGF의 mRNA량으로부터 SCGF 단백질량을 추정하는 것도 곤란하다.

이상과 같이, 인간을 포함한 동물의 혈청, 혈장 등의 체액 및 조직중의 SCGF 단백질의 존재, 기능, 질환과의 관계에 대해서는 밝혀지지 않고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은, 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환의 판정, 백혈병과 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환과의 판별, 재생불량성 빈혈과 골수이형성(異形成) 증후군과의 판별, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착상태 및 GVHD를 판정하는 방법, 및 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착상태 및 GVHD의 진단약 및 진단 킷을 제공하는 데에 있다.

도 1은, 모노클론항체의 인간SCGF 부분펩티드(화합물 1)에 대한 반응성을 나타내는 도면이다(바인딩 ELISA).

도 2는, 정제 인간SCGF 단백질의 SDS-PAGE와 웨스턴블롯팅 결과를 나타낸다. 레인(lane) 1 및 2는 분자량 마커(marker)와 정제 인간SCGF 단백질의 SDS-PAGE 패턴을 나타낸다. 레인 3, 4, 5는 각각 KM2142, KM2804, KM2945를 사용한 정제 인간SCGF 단백질의 웨스턴블롯팅 결과를 나타내는 도면이다.

1 : 분자량 마커의 레인

2 : 정제 SCGF를 해석하고, 은(銀) 염색한 레인

3 : 항SCGF항체 KM2142를 사용하여 웨스턴블롯팅한 레인

4 : 항SCGF항체 KM2804를 사용하여 웨스턴블롯팅한 레인

5 : 항SCGF항체 KM2945를 사용하여 웨스턴블롯팅한 레인

A : SCGF 단백질의 분자량을 나타낸다.

B : N말단 28잔기 결실 SCGF 단백질 Δ28체의 분자량을 나타낸다.

C : N말단 59잔기 결실 SCGF 단백질 Δ59체의 분자량을 나타낸다.

도 3은, 모노클론항체의, CHO 세포발현 인간SCGF 단백에 대한 반응성을 나타내는 도면이다(바인딩 ELISA).

도 4는, 모노클론항체의, SDS 변성 인간SCGF 단백(CHO세포발현)에 대한 반응성을 나타내는 도면이다(바인딩 ELISA).

도 5는, 모노클론항체의, 인간 및 마우스 SCGF 단백(CHO세포발현)에 대한 반응성을 나타낸다. (바인딩 ELISA)

도 6은, 모노클론항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의한 인간SCGF 단백의 정량곡선을 나타내는 도면이다.

도 7은, 각종 혈액질환 환자의 혈청중 SCGF농도를 나타낸다. 가로실선은 각종 혈액질환군의 중앙값을, 가로점선은 정상인군으로부터 얻은 절단값(18.2ng/mL)을 나타내는 도면이다.

* ： Normal(정상인군) 혹은 AA(재생불량성 빈혈군)와의 의미있는 차이　p<0.05,

＃： NHL(비악성 임파종)과의 의미있는 차이　P<0.05,＄：MM(다발성 골수종)와의 의미있는 차이　p<0.05

도 8은, 조혈간세포 이식환자의 혈청중 SCGF농도에 의한 GVHD 발증 및 비발증의 차이를 나타내는 도면이다. 가로실선은 각 군의 중앙값을 나타낸다.

* ： GVHD비발증예와의 의미있는 차이　p<0.05,

＃： 프리컨디쇼닝기와의 의미있는 차이　p<0.05,

＄： 어플러스틱기(aplastic)와의 의미있는 차이　p<0.05,

＆： 회복기와의 의미있는 차이　p<0.05

도 9는, 조혈간세포 이식환자의 혈청중 SCGF농도와 GVHD발증환자의 검출감도, 비발증환자의 특이도(特異度)와의 관계를 나타내는 도면이다. ●：감도, ○：특이도, 세로점선은 가(假)절단값을 나타낸다.

도 10은, 조혈간세포 이식환자의 혈청중 SCGF농도에 의한 생착지연 및 비지연의 차이를 나타내는 도면이다. 가로실선은 각 군의 중앙값을 나타낸다.

＃： 프리컨디쇼닝와의 의미있는 차이　p<0.05,

＄： 어플러스틱기와의 의미있는 차이　p<0.05,

＆： 회복기와의 의미있는 차이　p<0.05

도 11은, 조혈간세포 이식환자의 혈청중 SCGF농도와 조혈간세포 생착지연예의 검출감도, 비지연예의 특이도와의 관계를 나타내는 도면이다. ●：감도, ○：특이도, 세로점선은 가절단값을 나타낸다.

본 발명을 이하(1)~(20)항으로 기술한다.

(1) 생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 측정하는 것을 특징으로 하는, 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판정하는 방법.

(2) 생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 측정하는 것을 특징으로 하는, 백혈병과 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판별하는 방법.

(3) 생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 측정하는 것을 특징으로 하는, 재생불량성 빈혈과 골수이형성 증후군을 판별하는 방법.

(4) 생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 측정하는 것을 특징으로 하는, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착상태를 판정하는 방법.

(5) 생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 정량(定量)하는 것을 특징으로 하는, 이식편 대 숙주반응병을 판정하는 방법.

(6) 상기 판정 또는 판별하는 방법이, 면역학적 측정방법인, 상기(1)~(5)의 어느한 항에 기재된 방법.

(7) 상기 면역학적 측정방법이, 샌드위치법인, 상기 (6)항 기재의 방법.

(8) 상기 샌드위치법이, 조혈간세포 증식인자(SCGF)의 다른 에피토프(epitope)에 반응하는 2종류의 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 (7)항 기재의 방법.

(9) 상기 항체가, 폴리클론항체 및 모노클론항체로부터 선택되는 항체인 상기 (8)항 기재의 방법.

(10) 상기 모노클론항체가, 배열번호 1의 6~28번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체 및 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모노클론항체인, 상기 (9)항 기재의 방법.

(11) 조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 유효성분으로 함유하여 이루어진 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환의 진단약.

(12) 조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 유효성분으로 함유하여 이루어진 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착상태의 진단약.

(13) 조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 유효성분으로 함유하여 이루어진 이식편 대 숙주반응병의 진단약.

(14) 상기 항체가, 폴리클론항체 및 모노클론항체로부터 선택되는 항체인 상기(11)~(13)항의 어느 한 항에 기재된 진단약.

(15) 상기 모노클론항체가, 배열번호 1의 6~28번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체 및 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모노클론항체인, 상기 (14)항 기재의 진단약.

(16) 조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 포함하는, 백혈병, 전백혈병 혹은 비백혈병성 악성혈액질환, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착상태 또는 이식편 대 숙주반응병의 진단용 킷.

(17) 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 포함하는, 상기 (16)항 기재의 진단용 킷.

(18) 배열번호 1의 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체.

(19) 배열번호 1 기재의 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체.

(20) 상기 (18) 또는 (19) 항에 기재된 모노클론항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma).

본 발명은, 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판정하는 방법에 관한 것이다.

백혈병으로서는, 조혈계 세포 가운데 조혈세포 등의 미숙한 세포가 종양화된 것이라면 어떠한 것도 포함되는바, 급성임파성 백혈병(이하, ALL이라고 칭한다), 급성골수성 백혈병(이하, AML이라고 칭한다), 만성골수성 백혈병(이하, CML라고 칭한다) 등을 들 수 있다.

전(前)백혈병으로서는, 조혈계 세포중, 임파구 등의 성숙한 세포가 종양화된 것이라면 어떠한 것도 포함되는바, 골수이형성 증후군(이하, MDS라고 칭한다) 등을 들 수 있다.

비백혈병성 악성혈액질환으로서는 임파종이나 골수종 등을 들 수 있다.

임파종으로서는, 악성임파종이나 비악성임파종(이하, NHL이라고 칭한다) 등을 들 수 있다.

골수종으로서는, 다발성 골수종(이하, MM이라고 칭한다) 등을 들 수 있다.

백혈병, 전백혈병 및 비백혈병성 악성혈액질환 환자의 생체시료 중에 포함되는 SCGF농도는, 정상인의 생체시료 중에 포함되는 SCGF농도에 비해 의미있게 상승하고 있다. 따라서, SCGF농도에 절단값을 설정하고, 채취한 생체시료 중의 SCGF를 정량하여, SCGF농도가 절단값보다 높을 경우에 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환이라고 판정할 수가 있다.

상기의 절단값이란, 어떤 물질에 착안하여 목적으로 하는 질환군과 비질환군을 판정하는 경우에 정하는 값을 말한다. 목적으로 하는 질환과 비질환을 판정하는 경우에, 절단값 이하이면 음성, 절단값 이상이면 양성으로하여, 또는 절단값 이하이면 양성, 절단값 이상이면 음성으로하여 질환을 판정할 수가 있다(카나이 마사미츠편, 임상 검사법제요 카네하라 출판주식회사).

절단값의 임상적 유용성을 평가하는 목적으로 사용되는 지표로서는, 감도와 특이도를 들 수 있다.

어떤 모(母)집단을 절단값을 이용하여 판정하고, 질병환자 가운데, 판정에서 양성으로 된 것을 a(진양성), 질병환자이면서도 판정에서 음성으로 된 것을 b(가 음성), 질병환자가 아님에도 불구하고 판정에서 양성으로 된 것을 c(가양성), 질병환자가 아니고 판정에서 음성으로 된 것을 d(진 음성)로 나타내었을 때에, a/(a＋b)로 나타내는 값을 감도(진양성율), d/(c＋d)로 나타내는 값을 특이도(진음성율)로서 나타낼 수가 있다.

목적으로 하는 질환군과 비질환군과의 측정값의 분포는 통상, 일부 중복한다. 따라서, 절단값을 상하(上下)시키는 것에 따라서, 감도와 특이도는 변화한다. 절단값을 내리는 것에 의해 감도는 높아지지만, 특이도는 저하하고, 절단값을 올리는 것에 의해 감도는 낮아지지만, 특이도는 올라간다. 판정방법으로서는, 감도와 특이도 양자의 값이 높은 쪽이 바람직하다. 또, 감도와 특이도의 값이 50%를 넘지않는 판정방법은, 유용하다고 인정되지 않는다.

절단값을 설정하는 방법으로서는, 비질환군의 분포의 95%를 포함하는, 중앙으로부터의 양끝의 어느 값을 절단값으로서 설정하는 방법, 비질환군의 분포가 정규분포를 나타내는 경우, 평균치 ＋2배의 표준편차(SD) 또는 평균치-2SD를 절단값으로서 설정하는 방법 등을 들 수 있다.

백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환인지 아닌지를 판정하는 경우, 절단값을 15.0ng/mL로 설정한 경우에는, 감도 89.5%, 특이도70%로 판정할 수가 있으며, 절단값을 13.0ng/mL로 설정한 경우에는, 감도100%, 특이도60%로 판정할 수가 있다. 정상인의 SCGF농도보다 절단값을 평균치 ＋2SD의 18.2ng/mL로 설정하면, 감도 89.5%, 특이도100%로 판정할 수가 있다. 또, 이 절단값으로 백혈병인지 아닌지를 감도 95%, 특이도100%로, 비백혈병성 악성혈액질환인지 아닌지를 감도 76.9%, 특이도100%, 다시 전백혈병인지 아닌지를 감도100%, 특이도100%로 판정할 수가 있다.

생체시료로서는, 혈액, 뇨, 골수액, 천자액 등 어떠한 것이라도 좋으나, 바람직하게는 혈액을 들 수 있다. 혈액으로서는, 전혈, 혈장, 혈청, 혈구용혈액, 혈구내액 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 혈청 또는 혈장을 들 수 있다.

본 발명은, 백혈병과 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판별하는 방법에 관한 것이다.

백혈병 환자의 생체시료 중에 포함되는 SCGF농도는, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액환자의 생체시료 중에 포함되는 SCGF농도에 비해 의미있게 상승하고 있다. 따라서, 상술한 방법으로 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환으로 판정된 후, 다시 백혈병으로 판정되는 절단값을 설정하고, 채취한 생체시료 중의 SCGF농도가 그 절단값보다도 높은 경우에는 백혈병, 낮은 경우는 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환이다고 판단할 수가 있다.

백혈병과 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판별하는 경우, 절단값을 23.8ng/mL로 설정한 경우에는, 감도85%, 특이도 69.2%로 판별할 수가 있다. 또, 절단값을 비백혈병성 악성혈액질환환자의 평균치 ＋2SD로부터 32.8 ng/mL로 설정한 경우에는, 감도80%, 특이도100%로 판별할 수가 있다.

본 발명은, 재생불량성 빈혈과 골수이형성 증후군을 판별하는 방법에 관한 것이다.

재생불량성 빈혈과 골수이형성 증후군은, 골수 및 말초혈에 있어서 백혈구의 수나 형태에 이상이 발생하는 것을 특징으로 하는 병태로서, 2개의 질환을 판별하는 것은 어렵다고 여겨져 왔다.

골수이형성 증후군 환자의 SCGF농도는 정상인의 혈액 중에 포함되는 SCGF농도에 비해 의미있게 상승하고 있지만, 재생불량성 빈혈환자의 혈액 중 SCGF농도는 정상인과 마찬가지이다. 골수이형성 증후군 환자의 혈중SCGF농도는 재생불량성 빈혈환자의 혈중SCGF농도보다 의미있게 높고, 양자의 혈중SCGF농도를 측정하는 것으로서, 재생불량성 빈혈인지 골수이형성 증후군인지를 판별할 수가 있다.

따라서, 백혈구의 이상이 보이는 환자 가운데, 재생불량성 빈혈환자와 골수이형성 증후군 환자를 판별하는 경우, 재생불량성 빈혈환자의 SCGF농도보다 절단값(평균치＋2SD=16.6ng/mL)를 설정하고, 이 절단값에 의해 판단하면, 감도100%, 특이도100%로 재생불량성 빈혈환자와 골수이형성 증후군 환자를 판별할 수가 있다. 또, 기준치를 15.6ng/mL~18.6ng/mL로 설정하면, 감도100%, 특이도100%로 재생불량성 빈혈환자와 골수이형성 증후군 환자를 판별할 수가 있다.

또, 본 발명은, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착지연을 판정하는 방법에 관한 것이다.

조혈간세포 이식으로서는, 조혈간세포를 이식하는 방법이라면 어떠한 것이라도 좋으나, 골수이식, 제대혈 이식, 말초혈 간세포이식 등을 들 수 있다.

조혈간세포 이식으로부터 조혈간세포의 생착까지의 기간은, 환자의 말초혈의 혈구수를 기준으로하여 이하에 드는 4개의 시기로 분류된다. 즉, 이식 전에, 항암제 등을 대량 투여한 상태에 있는 프리컨디쇼닝기, 이식을 실시한 후에 혈구수가 감소한 상태에 있는 어플러스틱기, 이식 후에 혈구수가 회복한 상태에 있는 회복기, 및 이식 후에 조혈간세포가 생착하는 안정기이다.

조혈간세포 이식을 실시한 환자의 프리컨디쇼닝기 및 어플러스틱기에 있어서의 생체시료 중에 포함되는 SCGF농도는, 조혈간세포의 생착이 지연되는 환자의 생체시료 중에 포함되는 SCGF농도의 쪽이 조혈간세포의 생착이 지연되지 않는 환자의 생체시료 중에 포함되는 SCGF농도에 비해 높다. 따라서, 상기 각각의 시기의 SCGF농도를 측정하여, 조혈간세포의 생착이 지연될 우려가 있다고 판단되는 SCGF농도를 절단값으로서 정하고, SCGF농도가 절단값보다 낮은 값의 경우에는 생착의 지연은 보이지 않고, SCGF농도가 절단값보다 높은 값의 경우에는 생착의 지연이 일어난다고 판정할 수가 있다.

조혈간세포의 생착지연을 판정하는데에는, 프리컨디쇼닝기의 경우는, 예를 들면, 절단값을 9.5ng/mL으로 정하는 것에 의하여 감도75%, 특이도67%로, 어플러스 틱기의 경우는, 절단값을 12ng/mL로 정하는 것에 의하여 감도75%, 특이도63%로 판정할 수가 있다.

또한, 본 발명은 GVHD의 발증을 판정하는 방법에 관한 것이다.

조혈간세포 이식을 실시한 환자의 어플러스틱기 및 회복기에서의 생체시료 중에 포함되는 SCGF농도는, GVHD를 발증하는 환자의 쪽이, GVHD를 발증하지 않는 환자에 비하여 높다. 따라서, 각각의 시기의 SCGF농도를 측정하고, 각각의 시기에있어서 GVHD를 발증할 우려가 있다고 판정되는 절단값을 정하여, SCGF농도가 절단값보다 낮은 값의 경우에는 GVHD가 발증할 우려가 없으나, SCGF농도가 절단값보다 높은 값의 경우에는 GVHD가 발증할 우려가 있다고 판단할 수가 있다.

조혈간세포 이식 후의 GVHD의 발증을 판정하는데에는, 프리컨디쇼닝기에 있어서는, 절단값을 예를 들면, 5ng/mL로 정하는 것에 의하여 감도87%, 특이도57%로, 어플러스틱기에 있어서는 절단값을 예를 들면, 10ng/mL로 정하는 것에 의하여 감도87%, 특이도63%로, 회복기에서는 절단값을 예를 들면, 15ng/mL로 정하는 것에 의하서 감도87%, 특이도63%로, GVHD 발증환자와 비발증환자를 판정할 수가 있다.

생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(이하, SCGF로 칭한다)를 측정하는 방법으로서는, 면역학적 측정법, 분자생물학적 측정법 등 어떠한 방법이라도 좋으나, 바람직하게는 면역학적 측정법을 들 수 있다.

면역학적 측정법으로서는, 면역검출법, 면역블롯팅법, 응집반응, 보체(補體)결합 반응, 용혈반응, 침강반응, 금 콜로이드법, 크로마토그래피법, 면역염색법 등 항원 항체반응을 이용한 방법이라면 어떠한 것도 포함될 수 있으나, 바람직하게는 면역검출법을 들 수 있다.

분자생물학적 측정법으로서는, RT-PCR법, 노던블롯팅법, 인사이튜하이브리다이제이션법 등을 들 수 있다.

면역검출법은, 각종 표지를 한 항원 또는 항체를 사용하여, 항체 또는 항원을 검출 혹은 정량하는 방법이며, 항원 또는 항체의 표지방법에 따라서, 방사면역 검출법(RIA), 효소면역 검출법(EIA 또는 ELISA), 형광면역 검출법(FIA), 발광면역 검출법(luminescent immunoassay), 물리화학적 검출법(TIA, LAPIA, PCIA), 플로사이토메트리(Flow Cytometry) 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 효소면역 검출법을 들 수 있다.

방사면역 검출법에서 사용하는 방사성 표지체로서는, 임의의 공지된된(이시카와에이지편, 효소면역측정법, 의학서원) 방사성 동위원소를 사용할 수가 있다. 예를 들면, ³²P, ¹²⁵I, ¹³¹I 등을 사용할 수가 있다.

효소면역 검출법에서 사용하는 효소표지체로서는, 임의의 공지된된(이시카와에이지편, 효소면역측정법, 의학서원)의 효소를 사용할 수가 있다. 예를 들면, 알칼리포스파타제, 페르옥시다제, 루시페라제 등을 사용할 수가 있다.

또한, 효소면역측정법은 효소의 작용에 의해 생성한 물질을 측정하는 것에 의하여, 측정·검출을 실시하는바, 자외부(紫外部) 또는 가시부에 흡수극대를 갖는 물질의 흡광도를 측정하는 방법, 생성한 형광물질의 형광강도를 측정하는 방법, 생성한 물질의 발광강도를 측정하는 방법 등 다양한 측정방법을 채택할 수가 있다. 예를 들면, 효소표지체로서 알칼리포스파타제를 사용하는 경우는, 알칼리포스파타제작용에 의하여 자외부 또는 가시부에 흡수극대를 갖는 물질을 생성하는 알칼리성 포스파타제의 기질로서는, 예를 들면, 4－니트로페닐인산 등을 들 수 있다. 4－니트로페닐인산은 알칼리포스파타제에 의해 4－니트로페놀로 변환된다. 알칼리포스파타제작용에 의해 발광을 생성하는것 같은 알칼리포스파타제의 기질(基質)로서는, 예를 들면, 3－(2＇－스피로아다만탄)－4－메톡시-4－(3＇－포스포릴옥신)페닐-1,2－디옥세탄·2나트륨염(AMPPD), 2－클로로-5－｛4－메톡시스피로［1, 2－디옥세탄-3,2＇－(5＇클로로)트리시클로［3. 3. 1^3,7］데칸］－4－일｝페닐 포스페이트·2나트륨염(CDP－Star^TM), 3－｛4－메톡시스피로［1,2－디옥세탄-3,2＇－(5＇－클로로)트리시클로［3. 3. 1^3,7］데칸］－4－일｝페닐 포스페이트·2나트륨염(CSPD^TM),［10－메틸-9(10H)－아크리디닐이덴］페녹시메틸인산·2나트륨염(Lumigen^TM　APS－5) 등을 들 수 있다. 또, 알칼리포스파타제의 작용에 의하여 색소를 생성하는 시약으로서는 알칼리포스파타제의 기질인 NADPH를 함유하는 효소사이클링 반응시약 AmpliQ(다코사 제조)를 들 수 있다.

발광면역 검출법에서 사용하는 발광표지체로서는, 임의의 공지된［이마이이찌요우편, 생물발광과 화학발광, 히로카와서점； 임상검사 42(1998)］의 발광체를 사용할 수가 있다. 예를 들면, 아크리디늄에스테르, 로핀 등을 사용할 수가 있다.

형광면역 검출법에서 사용하는 형광표지체로서는, 임의의 공지된(카와오이 아키라 저, 형광항체법, soft science사 제조)의 형광을 사용할 수가 있다. 예를 들면, FITC, RITC 등을 사용할 수가 있다.

면역검출법에 있어서의 측정방법으로서는, 경합법(競合法), 샌드위치법［면역학 일러스트레이테드 제5판(난코도우)］등을 들 수 있으나, 바람직하게는 샌드위치법을 들 수 있다.

샌드위치법은, 항원항체반응으로 결합한 시료 중의 목적물질과 제1의 항체에, 제2의 항체(2차항체)를 동시에, 또는 따로따로 반응시켜, 시료 중의 목적물질을 동일 또는 각각의 항체로 검출 또는 정량하는 방법이다. 대부분의 경우, 측정조작 중에 시료중의 비반응의 샘플성분이나 측정계 성분을 세정하는 공정을 포함한다. 예를 들면, 고상(固相)에 제1의 항체(1차항체)를 고정한 후, 측정하고자 하는 시료를 제1의 시료와 접촉시킨다. 시료 중의 비반응의 샘플성분을 세정하고, 반응계로부터 제거한 후, 항원항체반응으로 결합한 시료 중의 목적물질과 제1의 항체의 복합체에, 제2의 항체(2차항체)를 반응시켜, 측정계 중의 반응에 관여하지 않았던 제２차 항체 등의 성분을 세정제거한 후, 반응계에 존재하는 시료 중의 목적물질을 검출 또는 정량하는 방법이다.

샌드위치법에 사용하는 고상으로서는, 폴리염화비닐제 마이크로타이타플레이트, 폴리스틸렌제 마이크로타이타플레이트 등을 들 수 있다.

샌드위치법에 사용하는 항체로서는, 폴리클론항체, 모노클론항체의 어느 것을 사용해도 좋으며, Fab, Fab', F(ab)₂ 등의 항체 프래크멘트(fragment)를 사용하여도 좋다.

샌드위치법에서 사용하는 1차항체와 2차항체의 조합으로서는, 다른 에피토프를 인식하는 항체의 조합이라면 어떠한 것이라도 좋으나, 적어도 하나가 모노클론항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 샌드위치법에서 사용되는 모노클론항체로서는, 배열번호 1의 6~28번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 배열번호 1의 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 배열번호 1의 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체 등을 들 수 있다.

배열번호 1의 6~28번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로서는, 하이브리도마 KM2142［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］가 생산하는 모노클론항체 KM2142를 들 수 있다. 배열번호 1의 29~59번째의 아미노산 배열에서 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로서는, 하이브리도마 KM2804가 생산하는 모노클론항체 KM2804를 들 수 있다. 배열번호 1 기재의 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로서는, 하이브리도마 KM2945가 생산하는 모노클론항체 KM2945를 들 수 있다.

모노클론항체 KM2142를 생산하는 하이브리도마 KM2142, 모노클론항체 KM2804를 생산하는 하이브리도마 KM2804, 모노클론항체 KM2945를 생산하는 하이브리도마 KM2945는, 2002년 2월 26일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1 중앙제6)에 FERM BP-7922, FERM BP-7923 및 FERM BP-7924로서 각각 기탁되어 있다.

상술한 모노클론항체는 SCGF를 인식하는 부위가 각각 다르므로, 이들 모노클론항체를 조합하여 샌드위치법을 실시할 수가 있다. 바람직한 모노클론항체의 조합으로서는, 배열번호 1의 6~28번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 더 구체적으로 하이브리도마 KM2142［The Hematology Journal, 2, 307 (2001)］가 생산하는 모노클론항체 KM2142와 배열번호 1 기재의 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 더 구체적으로 하이브리도마 KM2804(FERM BP-7923)가 생산하는 모노클론항체 KM2804와의 조합을 들 수 있다.

본 발명의 샌드위치법에 의한 SCGF를 검출 또는 정량하는 방법의 구체적인 예를 이하에 설명한다.

우선, 적당한 고정담체의 표면에 상술한 항SCGF항체(1차항체)를 흡착고정한다. 1차항체의 고정은, 예를 들면, 해당 항체를 적당한 완충액, 예를 들면, 인산완충액, 붕산완충액, 탄산완충액 등에 희석한 후, 이것을 고정담체의 표면에 접촉시키고, 그리고 4~37℃에서 30분간 이상 반응시키는 것 등에 의해 실시할 수가 있다.

다음에, 고정담체 표면의 단백질 결합능을 블록한다. 예를 들면, 고정담체 표면상의 유리결합기(遊離結合基)를 블로킹완충액과 접촉시킨다.

블로킹완충액으로서는, 예를 들면, 1~10%의 소 혈청알부민, 10~30% 블록에이스(유키지루시유업사 제조)를 함유하는 완충액, 예를 들면, 인산완충액, 붕산완충액, 탄산완충액 등을 들 수 있다.

블로킹처리는, 4~37℃에서 30분간 이상 반응시켜 실시할 수가 있다.

다음에, 1차항체를 생체시료와 접촉시킨다. 생체시료는 필요에 따라서, 예를 들면, 0.01~1%의 소 혈청알부민 등의 단백질을 함유하는 완충액, 인산완충액, 붕산완충액, 탄산완충액 등으로 희석시켜도 좋다.

1차항체와 생체시료와의 접촉은, 4~37℃에서 30분간 이상 반응시켜 실시할 수가 있다.

접촉시킨 후, 필요에 따라서 Tween20 등의 계면활성제를 함유하는 완충액, 예를 들면, 인산완충액, 붕산완충액, 탄산완충액 등을 사용하여 수차 세정한다.

이 때, 생체시료 중에 존재하는 SCGF가, 미리 고정되어 있는 항SCGF항체와 특이적으로 결합하는 것에 의하여, 항SCGF항체에 의하여 고정담체에 고정된다.

다음에, SCGF가 고정된 상기 담체를, 2차항체를 함유하는 용액과 접촉시킨다.

2차항체로서는, 1차항체와 에피토프가 다른 항SCGF항체라면 어떠한 것이라도 좋다. 또, 2차항체는 필요에 따라서, 상술한 표지체로 미리 표지해 둘 수가 있다.

미흡착의 2차항체를 제거하는데에는, 필요에 따라서 Tween20 등의 계면활성제를 함유하는 완충액, 예를 들면, 인산완충액, 붕산완충액, 탄산완충액 등을 사용하여 담체를 수차 세정한다. 이에 의해 상기 2차항체는, 미리 결합되어 있는 1차항체 및 SCGF에 의하여, 고정담체에 결합하고, 2차항체의 결합량이 생체시료 중의 SCGF의 양을 반영하게 된다.

상기와 같이 하여 고정된 2차항체는, 2차항체의 표지체에 따라서 측정할 수가 있다. 또, 2차항체에 대해서 특이적인 3차항체를 사용하고, 이 3차항체를 여러가지 방법으로 표지해 두어, 3차항체의 표지를 검출 또는 측정할 수도 있다.

상기와 같이 하여, 결합된 2차항체의 양을 측정하고, 표준물질을 사용하여 검량선(檢量線)을 작성하여 생체시료 중의 SCGF의 양을 측정할 수가 있다.

상기 검량선은, 표준물질로서 농도가 공지의 인간SCGF 단백질을 포함하는 용액을 몇점 단계로 희석한 것을 준비하고, 생체시료와 함께 상술한 샌드위치법을 실시하는 것에 의하여 얻을 수가 있다.

본 발명의 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환의 진단약, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착지연의 진단약, 및 GVHD 발증의 진단약에 함유 되는 SCGF에 대한 항체로서는, SCGF에 반응하는 항체라면, 폴리클론항체, 모노클론항체 혹은 항체프래그멘트 등 어떠한 것이라도 좋으나, 바람직하게는 모노클론항체가 사용된다.

모노클론항체로서는, 배열번호 1의 6~28번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 배열번호 1의 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 배열번호 1의 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체를 들 수 있다.

배열번호 1의 6~28번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로서는, 하이브리도마 KM2142(FERM BP-7922)가 생산하는 모노클론항체 KM2142를 들 수 있다. 배열번호 1의 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로서는, 하이브리도마 KM2804(FERM BP-7923)가 생산하는 모노클론항체 KM2804를 들 수 있다. 배열번호 1의 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로서는, 하이브리도마 KM2945(FERM BP-7924)가 생산하는 모노클론항체 KM2945를 들 수 있다.

본 발명의 킷으로서는, 기기 또는 시약의 조합에 의해 구성되지만, 이하에 설명하는 각 구성요소와 본질적으로 동일하고, 또는 그 일부와 본질적으로 동일한 물질이 포함되어 있으면, 구성 또는 형태가 달라도, 본 발명의 킷에 포함된다.

시약으로서는 SCGF에 반응하는 항체를 포함하며, 또, 필요에 따라서 생체시료의 희석액, 항체고정화 고상, 반응완충액, 세정액, 표지된 2차항체 또는 그 항체의 단편, 표지체의 검출용 시약, SCGF 등의 표준물질 등도 포함된다.

생체시료의 희석액으로서는, 계면활성제, 완충제 등에 BSA나 카제인 등의 단백질을 포함한 수용액 등을 들 수 있다.

항체고정화 고상으로서는, 각종 고분자소재를 용도에 맞게 정형한 소재에, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편을 고상화한 것이 사용된다. 형상으로서는 튜브, 비즈, 플레이트, 라텍스 등의 미립자, 스틱 등이, 소재로서는 폴리스틸렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐톨루엔, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 나일론, 폴리메타크릴레이트, 젤라틴, 아가로스, 셀룰로오스, 폴리에틸렌텔레프탈레이트 등의 고분자소재, 유리, 세라믹스나 금속 등을 들 수 있다. 항체의 고상화 방법으로서는 물리적 방법과 화학적 방법 또는 이들 방법의 병용 등 공지의 방법에 의하여 조제할 수가 있다. 예를 들면, 폴리스티렌제96웰의 면역측정용 마이크로타프레이트에 항체 등을 소수(疏水) 고상화한 것을 들 수 있다.

반응완충액은, 항체고정화 고상의 항체와 생체시료 중의 항원이 결합반응할 때의 용매환경을 제공하는 것이면 어떠한 것이라도 좋으나, 계면활성제, 완충제, BSA나 카제인 등의 단백질, 방부제, 안정화제, 반응촉진제 등을 들 수 있다.

세정액으로서는, 인산이나 트리스(트리스히드록시메틸아미노메탄), HEPES나 MOPS 등의 Good의 생화학적 완충제류 등의 완충제 등에, 트윈20, 트윈40, 트윈60, 트윈80, 트리톤 ^TMX－705 등의 계면활성제, NaCl, KCl나 황산암모늄 등의 염, BSA나 카제인 등의 단백질, 아지화나트륨 등의 방부제, 염산구아니딘, 요소나 소듐도데실설페이트 등의 변성제(變性劑), 폴리에틸렌글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트런황산, 콘드로이친황산 등의 안정화제의 적어도 1종류를 포함한 액을 들 수 있다. 구체적으로는, 0.15mol/L염화나트륨, 0.05% 트윈20 및 pH7.4의 10mmol/L인산완충액으로 이루어진 트윈 PBS, 0.15mol/L염화나트륨, 0.05% 트윈20 및 pH7.4의 10mmol/L트리스염산완충액(pH7.4)으로 이루어진 트윈TBS 등을 들 수 있다.

표지된 2차항체 또는 그 항체단편으로서는, 본 발명의 항체 또는 항체단편에 서양 고추냉이페르옥시다제(HRP), 소 소장 알칼리포스파타제, β－갈락톡시다제 등의 표지용 효소를 라벨한 것, 완충제, BSA나 카제인 등의 단백질, 방부제 등을 혼합한 것이 사용된다.

표지체의 검출용시약으로서는 상기 표지용 효소에 따라서, 예를 들면, 서양 고추냉이페르옥시다제라면, 테트라메틸벤디진이나 오르토페닐렌디아민 등의 흡광측정용 기질, 히드록시페닐히드록시페닐프로피온산이나 히드록시페닐초산 등의 형광기질, 루미놀 등의 발광기질이, 알칼리포스파타제라면, 4－니트로페닐포스페이트 등의 흡광도측정용 기질, 4－메틸운베리페릴포스페이트 등의 형광기질 등을 들 수 있다.

표준물질로서는, WO98/08869에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있는 SCGF, 킷에 사용되는 2종류의 항체의 에피토프를 함유하는 펩티드 등을 들 수 있다.

본 발명은, 또, 배열번호 1 기재의 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체 및 배열번호 1 기재의 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체에 관한 것이다.

배열번호 1 기재의 29~59번째의 아미노산 배열로 나타난 영역을 인식하는 모노클론항체로서는, 하이브리도마 KM2804(FERM BP-7923)가 생산하는 모노클론항체 KM2804를 들 수 있다. 배열번호 1 기재의 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로서는, 하이브리도마 KM2945(FERM BP-7924)가 생산하는 모노클론항체 KM2945를 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 모노클론항체의 제조방법으로서는, 공지의 모노클론항체의 제조방법에 의하여 제조할 수가 있다.

이하에, 본 발명에 사용하는 모노클론항체의 제조방법을 상세하게 설명한다.

(1) 항원의 조제

항원으로서는, 인간SCGF를 코드하는 cDNA를 포함한 발현벡터를 대장균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등에 도입하여 얻어진 인간SCGF단백질, 펩티드합성에 의하여 얻어진 인간SCGF 부분배열을 갖는 합성펩티드 등을 들 수 있다.

항원용 부분펩티드로서는, 5~30잔기 정도의 단백질 부분배열이 선택된다. 변성하고 있지 않은 천연구조를 가지고 있는 상태의 상기 단백질을 인식하는 항체를 취득하기 위해서는, 입체구조상 단백질의 표면에 존재하고 있는 부분배열을 항원펩티드로서 선택할 필요가 있다. Kyte와 Doolittle의 방법 Journal of Molecular Biology, 157, 105-132 (1982)］등에 의해, 친수성이 높은 부분배열을 예측하는 것으로서, 입체구조상 단백질표면에 존재하는 부분을 추측할 수가 있다. 즉, 일반적으로 친수성이 낮은 부분은 입체구조상 단백질의 내부에 존재하는 경우가 많고, 친수성이 높은 부분은 단백질표면에 존재하는 경우가 많기 때문이다. 또, 단백질의 N말단, C말단은 단백질표면에 존재하는 경우가 많다. 또한, 단백질의 2차구조정보도 참고로 할 수 있다. Chou-Fasman의 방법 Advances in Enzymology, 47, 45-147 (1978)］등에 의해 아미노산 배열로부터 예측한 단백질 2차구조에 있어서, 턴구조나 랜덤코일 구조를 갖는 부분이 항원용 펩티드로서 적합하다고 생각할 수가 있다. 그렇지만, 이와 같이 선택한 부분펩티드가 목적하는대로 항체를 확립하는 항원이 된다고는 할 수가 없다.

부분펩티드에는, 단백질과 가교(架橋)하기 위하여 시스테인을 말단에 부가한다. 단백질의 내부배열을 선택한 경우에는, 필요에 따라서 펩티드의 N말단은 아세틸화, C말단은 아미드화한다.

부분펩티드는 일반적인 액상, 고상 펩티드합성법 및 이들을 적당히 조합하는 방법, 또는 이것에 준하는 방법에 의해서 합성할 수가 있다. International Journal of Peptide Protein Research, 35, 161-214 (1990), Solid-Phase Peptide Synthesis, Methods in Enzymology, vol. 289 , Gregg B. Fields편, Academic Press, (1997), Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 35, Michael W. Pennington, Ben M.Dunn편, Humana Press, (1994).

또, 자동 펩티드합성기를 사용할 수도 있다. 펩티드합성기에 의한 펩티드의 합성은, 시마즈세이사쿠쇼 제조 펩티드합성기, Advanced ChemTech Inc., USA (이하 ACT사로 약칭한다) 제조 펩티드합성기 등의 시판 펩티드 합성기 상에서, 적당히 측쇄를 보호한 Nα-Fmoc-아미노산 혹은 Nα-Boc-아미노산 등을 사용하여 각각의 합성프로그램에 따라서 실시할 수가 있다. 원료가 되는 보호아미노산 및 담체수지는, ABI사, 시마즈세이사쿠쇼, 코쿠산카가쿠(주), NovaBiochem사, 와타나베카가쿠(주), ACT사, AnaSpec Inc., 또는 펩티드연구소(주) 등으로부터 입수할 수가 있다.

(2) 동물의 면역과 항체산생세포의 조제

생후 3~20주의 마우스, 쥐 또는 햄스터에 상기 (1)로 조제한 항원을 면역하고, 그 동물의 비장(脾), 임파절, 말초혈중의 항체산생 세포를 채취한다.

면역은, 동물의 피하 혹은 정맥 내 혹은 복강내에에, 적당한 아쥬반트［예를 들면, 프로인드의 완전아쥬반트(complete freund's adjuvant)나 수산화알루미늄겔과 백일해균 백신 등］과 함께 항원을 투여하는 것에 의하여 실시한다. 항원이 부분펩티드인 경우에는, BSA(소 혈청알부민)나 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin) 등의 캐리어단백질과 칸저게이트(Conjugate)를 제작하여, 이것을 면역원으로서 사용한다.

항원의 투여는, 1회째의 투여 후 1~2주간 간격으로 3~10회 실시한다. 각 투여 후 3~7 일째에 안저정맥총에서 채혈하고, 그 혈청이 항원과 반응하는 것을 효소면역측정법［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］등으로 조사한다. 면역에 사용한 항원에 대해, 그 혈청이 충분한 항체값을 나타낸 마우스, 쥐 또는 햄스터를 항체산생세포의 공급원으로서 제공한다.

항체산생세포와 골수종세포의 융합에 제공함에 있어서, 항원물질의 최종투여 후 3~7일째에, 면역된 마우스, 쥐 또는 햄스터로부터 비장을 적출하고, 비장세포를 채취한다. 비장을 MEM배지(닛스이제약사 제조) 중에서 잘게절단하고, 핀셋으로 풀어서, 원심분리(1,200rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고 트리스-염화암모늄완충액(pH 7.65)으로 1~2분간 처리하여 적혈구를 제거하고, MEM배지에서 3회 세정하여 융합용비장세포로서 제공한다.

(3) 골수종세포의 조제

골수종세포로서는, 마우스로부터 얻은 줄기화세포를 사용한다. 예를 들면, 8－아자구아닌 내성마우스(BALB/c유래) 골수종세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18:1-7 (1978)］, P3-NS1/1-Ag41(NS-1)［European J. Immunology, 6: 511-519 (1976)］, SP2/O-Ag14(SP-2)［Nature,276: 269-270 (1978)］, P3-X63-Ag8653(653)［J.Immunology, 123:1548-1550 (1979)］, P3-X63-Ag8(X63)［Nature, 256:495-497 (1975)］등이 사용된다. 이들 세포주는, 8－아자구아닌배지［RPMI－1640배지에 글루타민(1.5mmol/L), 2－메르캅트에탄올(5×10^-5mol/L), 젠타마이신(10μg/mL) 및 소 태아혈청(FCS)을 첨가한 배지(이하, 정상배지라고 한다.)에, 다시, 8－아자구아닌(15μg/mL)을 첨가한 배지］로 계대(繼代)하는바, 세포융합의 3~4일 전에 정상배지에 계대하고, 융합당일 2×10⁷개 이상의 세포수를 확보한다.

(4) 세포융합

상기 (2)에서 면역된 항체산생세포와 상기 (3)에서 얻은 골수종세포를 MEM배지 또는 PBS(인산2나트륨 1.83g, 인산1칼륨 0.21g, 식염 7.65g, 증류수 1리터, pH 7.2)로 잘 세정하여, 세포수가 항체산생세포：골수종세포=5~10：1이 되도록 혼합하고, 원심분리(1,200rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고 침전한 세포군을 잘 풀어준 후, 교반하면서, 37℃에서 폴리에틸렌글리코올-1,000(PEG-1,000)2g, MEM2mL 및 디메틸술폭시드 0.7mL의 혼액 0.2~1mL/10⁸항체산생세포를 첨가하여 1~2분간마다 MEM배지 1~2mL를 수차 첨가한 후, MEM배지를 첨가하여 전량이 50mL가 되도록 한다. 원심분리(900rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고, 천천히 세포를 풀어준 후, 메스파이펫에 의한 흡입과 흡출을 하여 천천히 세포를 HAT배지［정상배지에 히폭산틴(10^-4mol/L), 티미딘(1.5×10^-5mol/L) 및 아미노프테린(4×10^-7mol/L)을 첨가한 배지］100mL 중에 현탁한다. 이 현탁액을 96홀배양용 플레이트에 100μL/홀씩 나누어 주입하고, 5% CO₂인큐베이터 중, 37℃에서 7~14일간 배양한다.

배양 후, 배양상청의 일부를 채취하여 하기에 기술하는 효소면역측정법 등에 의하여, 인간SCGF에 반응시키고, 인간SCGF를 함유하지 않은 항원에 반응하지 않는 것을 선택한다. 이어서, 한계희석법에 의하여 클로닝을 2회 반복하고［1회째는, HT배지(HAT배지로부터 아미노프테린을 제거한 배지), 2회째는, 정상배지를 사용한다］, 안정되고 강한 항체값이 인정된 것을 항 인간SCGF 모노클론항체생산 하이브리도마주로서 선택한다.

효소면역측정법

항원 혹은 항원을 발현한 세포 등을 96웰플레이트에 코트하고, 하이브리도마 배양상청 혹은 상술한 방법으로 얻어지는 정제항체를 제1항체로서 반응시킨다.

제1항체 반응 후, 플레이트를 세정하여 제2항체를 첨가한다.

제2항체란, 제1항체의 면역글로블린을 인식할 수 있는 항체를, 비오틴, 효소, 화학발광물질 혹은 방사선화합물 등으로 표지한 항체이다. 구체적으로는 하이브리도마 제작시에 마우스를 사용한 것이면, 제2항체로서는, 마우스 면역글로블린을 인식할 수 있는 항체를 사용한다.

반응 후, 제2항체를 표지한 물질에 따른 반응을 실시하고, 항원에 특이적으로 반응하는 모노클론항체를 생산하는 하이브리도마로서 선택한다.

(5) 모노클론항체의 조제

프리스탄처리［2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(Pristane) 0.5mL를 복강내에 투여하고, 2주간 사육한다］한 생후 8~10주의 마우스 또는 누드마우스에, 상기(4)에서 얻은 항 인간SCGF 모노클론항체산생 하이브리도마세포 2×10⁶~ 5×10⁷세포/마리를 복강내에 주사한다. 10~21일에서 하이브리도마는 복수암화(腹水癌化)한다. 이 마우스로부터 복수를 채취하여, 원심분리(3,000rpm, 5분간)해 고형분을 제거한 후, 40~50% 황산암모늄으로 염석(鹽析)한 후, 카프릴산침전법, DEAE－세파로스컬럼, 프로테인A－컬럼 혹은 겔여과컬럼에 의한 정제를 실시하고, IgG 혹은, IgM획분(劃分)을 모아서, 정제모노클론항체로 한다.

항체의 서브클라스의 결정은, 서브클라스 타이핑킷을 사용하여 효소면역측정법에 의하여 실시한다. 단백량의 정량은, 롤리법 및 280nm에서의 흡광도로부터 산출한다.

(실시예 1) 인간SCGF 부분펩티드를 사용한 항 인간SCGF 모노클론항체의 제작

(1) 인간SCGF 부분펩티드의 합성

인간SCGF 단백배열을 해석하고, 친수성이 높은 부분, N말단, C말단, 2차구조상 턴구조, 랜덤코일구조를 갖는 부분 중에서, 항원으로서 적당하다고 생각되는 부분배열로서 화합물 1(SCGF-1)을 선택하였다.

(약호에 대해)

본 발명에 있어서 사용한 아미노산 및 그 보호기에 관한 약호는, 생화학명명에 관한 IUPAC-IUB 위원회(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature)의 권고 European Journal of Biochemistry, 138권, 9페이지(1984년)에 따른 것이다.

이하의 약호는, 특별히 한정하지 않는 한 대응하는 하기의 아미노산을 나타낸다.

Ala : L-알라닌

Arg : L-아르기닌

Cys : L-시스테인

Gln : L-글루타민

Glu : L-글루타민산

Glx : L-글루타민산

Gly : 글리신

Leu : L-로이신

Trp : L-트리프트판

이하의 약호는, 대응하는 하기의 아미노산의 보호기 및 측쇄보호 아미노산을 나타낸다.

Fmoc : 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐

tBu : t-부틸

Trt : 트리틸

Boc : t-부틸옥시카르보닐

Pmc : 2, 2, 5, 7, 8-펜타메틸크로만-6-술포닐

Fmoc-Arg(Pmc) -OH : Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-N^g-2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐-L-아르기닌

Fmoc-Gln(Trt)-OH : Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-Nε-트리틸-L-글루타민

Fmoc-Glu(OtBu)-OH : Nα－9－플루오레닐메틸옥시카르보닐-L-글루타민산-γ-t-부틸에스테르

Fmoc-Trp(Boc)-OH : Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 N^ind-t-부틸옥시카르보닐-L-트리프트판

이하의 약호는, 대응하는 하기의 반응용매, 반응시약 등을 나타낸다.

PyBOP : 벤조트리아졸-1-일옥시트리프롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트

HOBt : N-히드록시벤조트리아졸

NMM : N-메틸몰포린

DMF : N, N-디메틸포름아미드

TFA : 트리플루오로초산

이하의 실시예에 있어서, 화합물의 이화학적 성질은 다음의 방법에 의해 측정하였다.

질량분석은, 일본전자 JMS-HX110A를 사용하여 FAB-MS법에 의해, 또는 불카-사 제조 질량분석장치 REFLEX를 사용하여 MALDI-TOFMS법에 의하여 실시하였다. 아미노산 분석은, 코엔(Cohen,S.A.)등의 방법 [Analytical Biochemistry, 222, 19 (1994)］에 의하여 실시하였다. 가수분해는 염산증기 중 110℃에서 20시간 실시하고, 가수분해물의 아미노산 조성은 Waters AccQ-Tag 아미노산 분석계(Waters사 제조)를 사용하여 분석하였다.

① 화합물 1(SCGF-1)(배열번호 4)(Ac-Arg-Glu-Trp-Glu-Gly-Gly-Trp-Gly-Gly-Ala-Gln-Glu-Glu-Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Ala-Leu-Cys-OH)의 합성

Fmoc-Cys(Trt), 14.1μmol이 결합한 담체수지(H-Cys(Trt) -2-ClTrt resin 수지, 노바비오켐사 제조) 30mg를 자동합성기(시마즈세이사쿠쇼)의 반응용기에 넣어 600μL의 DMF를 첨가하여 3분간 교반하여 용액을 배출시킨 후, 시마즈세이사쿠쇼의 합성 프로그램에 따라 다음의 조작을 실시하였다.

(a) 30%피페리딘-DMF용액 900μL를 첨가하여 혼합물을 4분간 교반하여, 그 용액을 배출하고, 이 조작을 다시 1회 반복하였다.

(b) 담체수지를 900μL의 DMF로 1분간 세정하여, 그 용액을 배출하고, 이 조작을 5회 반복하였다.

(c) Fmoc-Leu-OH (141μmol), PyBOP (141μmol), HOBt1 수화물(141μmol) 및 NMM(212μmol)를 DMF (494μL) 중에서 3분간 교반하고, 얻어진 용액을 수지에 첨가하여 혼합물을 30분간 교반하고 용액을 배출하였다.

(d) 담체수지를 900μL의 DMF로 1분간 세정한 후 용액을 배출하고, 이것을 5회 반복하였다.

이렇게 하여, Fmoc-Leu-Cys(Trt)가 담체상에 합성되었다.

다음에, (a) (b)의 공정 후, (c)의 공정에서 Fmoc-Ala-OH를 사용하여 축합 반응을 실시하고, (d)의 세정공정을 거쳐, Fmoc-Ala-Leu-Cys(Trt)가 담체상에 합성되었다.

이하, 공정(c)에 있어서, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH를 차례로 사용하여, (a)~(d)를 반복한 후, (a) (b)의 탈보호, 세정공정을 거쳐, 메탄올, 부틸에테르로 차례로 세정하여, 감압하에서 12시간 건조하고, N말단이 무보호이며 측쇄가 보호된 펩티드가 결합한 담체수지를 얻었다. 다음에 얻어진 담체수지에 대하여 다음의 (e)~(g)의 조작을 실시하였다.

(e) 담체수지를 800μL의 DMF로 1분간 세정하고, 그 용액을 배출하고, 이 조작을 3회 반복하였다.

(f) 무수초산 (282μmol) 및 DMF(500μL)를 수지에 첨가하여 혼합물을 2시간 교반하여, 용액을 배출하였다.

(g) 담체수지를 800μL의 DMF로 1분간 세정하고, 그 용액을 배출하고, 이 조작을 3회 반복하였다.

이 후, 메탄올, 부틸에테르로 차례로 세정하고, 감압하에서 12시간 건조하고, N말단이 아세틸화된 측쇄보호펩티드가 결합한 담체수지를 얻었다. 이것에, 5 mg/mL의 농도로 2-메틸인돌을 함유하는 TFA(82.5%), 티오아니솔(5%), 물(5%), 에틸메틸술피드(3%), 1,2-에탄디티올(2.5%) 및 티오페놀(2%)로 이루어진 혼합용액 1mL를 첨가하여 실온에서 6시간 방치하여, 측쇄보호기를 제거함과 동시에 수지로부터 펩티드를 잘라냈다. 수지를 여과하여 나눈 후, 얻어진 용액에 에테르 약 10mL를 첨가하고, 생성한 침전을 원심분리 및 디캔테이션에 의하여 회수하고, 조(粗)펩티드로서 44.6mg를 취득하였다. 이 조생성물 전량을 디티오슬레이톨 및 DMF로 이루어진 혼합용액에 용해하고, 역상 컬럼(시세이도제, CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X250 mm)을 사용한 HPLC로 정제하였다. 0.1% TFA수용액에, TFA 0.1%를 포함하는 90% 아세트니트릴 수용액을 첨가해 가는 직선농도구배법으로 용출하고, 220nm로 검출하여, 화합물 1을 포함하는 획분을 얻었다. 이 획분을 동결건조하여, 화합물 1을 1.6mg 얻었다.

질량분석［TOFMS］; m/z = 2520.7 (M+H⁺)

아미노산분석 ; Glx 7.6 (8), Gly 4.0 (4), Arg 2.9 (3), Ala 2.2 (2), Leu 1.2 (1), Cys 1.7 (1)

(2) 면역원의 조제

실시예 1의(1)에서 얻어진 인간SCGF 부분펩티드는, 면역원성을 높이는 목적으로 이하의 방법으로 KLH(카르비오켐사 제조)와의 칸저게이트(Conjugate)를 제작하고, 면역원으로 하였다. 즉, KLH를 PBS로 용해하여 10mg/mL로 조정하고, 1/10용량의 25mg/mL MBS(나카라이테스크사 제조)를 적하하여 30분간 교반반응시킨다. 미리 PBS로 평형화(平衡化)한 세파덱스 G-25컬럼 등의 겔 여과컬럼으로 프리의 MBS를 제거하고 얻어진 KLH-MB 2.5mg을 0.1mol/L 인산나트륨버퍼(pH 7.0)에 용해한 펩티드 1mg로 혼합하고, 실온에서 3시간 교반반응시켰다. 반응 후 PBS로 투석하였다.

(3) 동물의 면역과 항체산생세포의 조제

실시예 1(2)에서 조제한 펩티드-KLH 칸저게이트 100μg를 알루미늄겔 2mg 및 백일해 백신(치바현 혈청연구소 제조) 1×10⁹세포와 함께 생후 5주의 암컷쥐(SD)에게 투여하여, 2주일간 후부터 100μg의 칸저게이트를 1주일 간에 1회, 합계 4회 투여하였다. 안저 정맥총으로부터 채혈하고, 그 혈청항체값을 이하의 (4)에 나타내는 효소면역측정법으로 조사하고, 충분한 항체값을 나타낸 쥐로부터 최종면역 3일 후에 비장을 적출하였다.

비장을 MEM배지(닛스이제약사 제조) 중에서 잘게절단하고, 핀셋으로 풀어서, 원심분리(1,200rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고 트리스-염화암모늄완충액(pH 7.65)으로 1~2분간 처리하여 적혈구를 제거하고, MEM배지에서 3회 세정하여, 세포융합에 사용하였다.

(4) 효소면역측정법(바인딩 ELISA)

검출용 항원에는 실시예 1(1)에서 얻어진 인간SCGF 부분펩티드를 싸일로글로블린(이하, THY로 약기한다.)과 칸저게이트 한 것을 사용하였다. 제작방법은 실시예 1(2)에 기재한 바와 같지만, 가교제에는 MBS 대신에 SMCC(시그마사 제조)를 사용하였다. 96홀의 EIA용 플레이트(그라이너사 제조)에, 상술한 바와 같이 조제한 칸저게이트를 10μg/mL, 50μL/홀에 나누어 주입하고, 4℃에서 하룻밤 방치하여 흡착시켰다. 세정한 후, 1% BSA-PBS를 100μL/홀에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 남아있는 활성기를 블록하였다. 1% BSA-PBS를 버리고, 피면역 마우스 항 혈청, 항 인간SCGF 모노클론항체의 배양상청 혹은 정제모노클론항체를 50μL/홀에 나누어 주입하고, 2시간 반응시켰다. tween-PBS로 세정한 후, 페르옥시다제 표지 토끼 항쥐 면역글로블린(다코사 제조)을 50μL/홀에 첨가하여 실온에서, 1시간 반응시켜, tween-PBS로 세정한 후 ABTS 기질액［2.2-아디노비스(3-에틸벤조티아졸-6-술폰산) 암모늄］을 사용하여 발색시켜 OD415nm의 흡광도를 플레이트리더(E-max;Molecular Devices사 제조)로 측정하였다.

(5) 마우스 골수종세포의 조제

8－아자구아닌 내성 마우스 골수종세포주 P3-U1를 정상 배지에서 배양하고, 세포융합시에 2×10⁷이상의 세포를 확보하여, 세포융합에 어미줄기로서 제공하였다.

(6) 하이브리도마의 제작

실시예 1(3)에서 얻어진 쥐의 비장세포와 (5)에서 얻어진 골수종세포를 10：1이 되도록 혼합하여, 원심분리(1,200rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고 침전한 세포군을 잘 풀어준 후, 교반하면서, 37℃에서, 폴리에틸렌글리콜-1,000(PEG-1,000) 2g, MEM배지 2mL 및 디메틸술폭시드 0.7mL의 혼액 0.2~1mL/10⁸ 쥐 비장세포를 첨가하여 1~2분간마다 MEM배지 1~2mL를 수차 첨가한 후, MEM배지를 첨가하여 전량이 50mL가 되도록 하였다. 원심분리(900rpm, 5분간) 후, 상청을 버리고 천천히 세포를 풀어준 후, 메스피펫트에 의하여 흡입, 흡출하여 천천히 세포를 HAT배지 100mL 중에 현탁하였다.

이 현탁액을 96홀 배양용 플레이트에 100μL/홀씩 나누어 주입하고, 5% CO₂인큐베이터 중, 37℃에서 10~14일간 배양하였다. 이 배양상청을 실시예 1(4)에 기재한 효소면역측정법으로 조사하여, 인간SCGF 부분펩티드(화합물 1)에 반응시켜, 다른 SCGF 부분펩티드인 배열번호 1의 140~156번째의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드에 반응하지 않는 홀을 선택하고, 다시, HT배지와 정상배지로 바꾸어 2회 클로닝을 반복하여, 항 인간SCGF 모노클론항체산생 하이브리도마 KM2141, KM2142, KM2143, KM2144, KM2145를 확립하였다.

(7) 모노클론항체의 정제

프리스탄 처리한 생후 8주의 누드암컷마우스(Balb/c)에 실시예1(6)에서 얻어진 하이브리도마줄기를 5~20×10⁶ 세포/마리의 각각의 복강내에 주사하였다. 10~21일 후에, 하이브리도마는 복수암화하였다. 복수가 찬 마우스로부터, 복수를 채취(1~8mL/마리)하여, 원심분리(3,000rpm, 5분간)하여 고형분을 제거하였다. 모노클론항체가 IgM일 때는, 50%황산암모늄으로 염석하고, 염화나트륨 0.5M를 첨가한 PBS로 투석한 후, 셀로파인 GSL2000(생화학공업사 제조)(배트볼륨 750mL)의 컬럼에 유속 15mL/H로 통탑(通塔)하고, IgM획분을 모아 정제모노클론항체로 하였다. 모노클론항체가 IgG일 때는, 카프릴산침전법［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］에 의해 정제하여, 정제모노클론항체로 하였다.

항체의 서브클라스는 서브클라스 타이핑킷을 사용하여 효소면역측정법에 따라 실시하고 결정하였다 (표 1).

(표 1)

항체명	항체 클래스
KM2141	G2a
KM2142	G2a
KM2143	G2a
KM2144	G2a
KM2145	G1

(8) 인간SCGF 부분 펩티드와의 반응성(효소면역측정법)

실시예 1(6)에서 선택된 항 인간SCGF 모노클론항체의 인간SCGF 부분펩티드(화합물 1)와의 반응성을 (4)에 나타낸 효소면역측정법으로 조사하였다. 컨트롤펩티드로서는, 화합물 1과는 다른 SCGF 부분펩티드인 배열번호 1의 140~156번째의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드를 사용하였다. 도 1에 도시하는 바와 같이, 항 인간SCGF 모노클론항체(KM2141~2145)는 화합물 1에 특이적으로 반응하고, 컨트롤펩티드에는 반응하지 않았다.

(실시예 2) 동물세포를 사용한 인간SCGF의 발현과 정제

(1) 인간SCGF 발현용 플라스미드 pAGE-SCGFα의 구축 및 인간SCGF의 동물세포에서의 발현

동물세포용 발현벡터 pAGE210(WO96/34016)의 HindIII/KpnI 처리단편과 SCGF 단백질을 코드하는 DNA［Mio et.al., BBRC 249, 124- 130 (1998)］를 연결하는 것에 의하여, 인간SCGF 발현벡터 pAGE-SCGFα를 구축하였다.

동물세포에의 플라스미드의 도입은 「미야지」 등의 방법에 따라 전기영동법［Miyaji et al., Cytotechnology, 3, 133-140 (1990)］에 의하여 실시하였다. 4μg의 pAGE-SCGF-a를 4×10⁶개의 dhfr유전자결손 CHO세포주［Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)］에 도입하였다. 이 세포를 10mL의 MEMa2000-dFCS(5) 배지［dFCS를 5%, 7.5% NaHCO₃를 1/40양, 200mL 글루타민 용액(GIBCO/BRL사 제조)을 3%, 페니실린·스트렙토마이신 용액(GIBCO/BRL사 제조, 5,000단위/mL 페니실린 및 5,000mg/mL 스트렙토마이신 함유)을 0.5% 함유하는 MEM a2000배지(GIBCO/BRL사 제조)］에 현탁하고, 10cm 플레이트(IWAKI사 제조)에 넣고 37℃의 CO₂ 인큐베이터 중에서 24시간 배양하였다. 하이그로마이신(GIBCO/BRL사 제조)을 최종농도 0.3mg/mL가 되도록 첨가하고, 다시 1~2주간 배양하였다. 형질전환세포가 융합(confluent)이 된 시점에서 회수하여, 하이그로마이신을 0.3mg/mL, methotrexate(MTX)를 50nmol/L 함유하는 MEMa2000-dFCS(5)배지에 1~2×10⁶ 세포/mL이 되도록 현탁하고, F75 프라스코(Greiner사 제조)에 2mL 나누어 부었다. 1~2주간의 배양 후, 50nmol/L MTX 내성의 세포를 0.3mg/mL 하이그로마이신, 200nmol/L MTX 함유 MEMa2000-dFCS(5) 배지에 1~2×10⁵ 세포/mL이 되도록 현탁하고, F75 프라스코(Greiner사 제조)에 2mL 나누어 부었다. 1~2주간의 배양 후, 200nmol/L MTX 내성의 세포를 얻었다. 이 200nmol/L MTX 내성세포를 하기에 나타내는 배지 1) 및 배지 2)를 사용하여, 2L의 롤러보틀(Greiner사 제조)로 37℃, 80회전/분으로 배양을 실시하였다.

배지 1) 무혈청Ex-cell 301 배지(JRH Biosciences사 제조)

배지 2) 10mg/L의 aprotinin(Sigma사 제조)를 포함하는 무혈청 Ex-cell 301

배지

약 5일간의 배양 후, 세포를 원심분리하여, 배양상청 샘플을 얻었다.

(2) 모노클론항체 KM2142를 사용한 웨스턴블롯팅에 의한 배양상청 중의 SCGF 단백질의 존재를 확인

실시예 1에서 얻어진 항 인간SCGF 모노클론항체 KM2142를 사용한 웨스턴블롯팅에 의해, 상기(1)에서 얻어진 배양상청 중의 SCGF 단백질의 존재를, 이하의 방법에 의해 확인하였다.

후술하는 (3) 및 (4)의 SCGF단백질의 크로마토그래피에 의한 정제에 있어서의 각 정제획분을 SDS-PAGE로 분리 후, P. Matsudaira의 방법［J.B.C. 262, 10035-10038 (1987)］에 따라 PVDF막(Immobilon Transfer Membranes, 미리포아사 제조)에 전기적으로 전사하였다. 전사막은 블로킹용액［1% BSA를 포함하는 PBS 버퍼(137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 9.6mmol/L Na₂HPO₄/KH₂PO₄ (pH 7.2))］중에서 30분간 진탕한 후, 블로킹용액으로 1mg/mL에 희석한 항SCGF 모노클론항체를 포함하는 용액 중에서 실온에서 60분간 진탕하였다. 이 전사막은 다시 0.05% tween20을 함유한 PBS버퍼로 5분간 세정을 2회, PBS버퍼에서의 5분간 세정을 1회 실시한 후, 퍼옥시다제로 표지된 항 쥐 IgG항체(anti-rat immunoglobulin 1.3g/L, DAKO사 제조)를 PBS로 1/1,000로 희석한 용액 중에서 실온에서 60분간 진탕하였다. 0.05% tween20를 함유하는 PBS버퍼로 5분간 세정을 2회, PBS버퍼에서의 5분간 세정을 1회 실시한 후, 발광법(ECL Western blotting detection reagents, 아마샴 펄머시아 바이오텍사 제조)에 의해 검출을 실시하였다.

(3) CHO 세포배양 상청으로부터의 인간SCGF 단백질의 정제

실시예 3에 기재하는 항 인간SCGF 모노클론항체의 제작을 실시하기 위하여, 상기(1)의 배지 1)의 배양조건에서 얻은 CHO 세포배양 상청으로부터 이하의 2단계의 크로마토그래피에 의해 정제 인간SCGF 단백질을 취득하였다.

제1 단계：아연킬레이트 크로마토그래피

Zn²⁺이온으로 포화시킨 Chelating Sepharose Fast Flow 담체(아마샴 펄머시아 바이오텍사 제조)를 2.5cm φ×20cm의 컬럼(BioRad사 제조)에 11cm의 높이까지 충전하고, 0.5mol/L 염화나트륨을 포함하는 20mmol/L 인산나트륨 완충액(pH 7.1)으로 평형화하였다. 이것에 상기(1)에서 얻은 CHO 세포배양 상청 2.4L를 첨가하고, 동완충액으로 충분히 세정한 후, 0~100mmol/L 히스티딘 직선농도구배로 용출시켰다. 용출획분의 일부를 사용하여 SDS-PAGE를 실시하고, 상기(2)에서 나타낸 모노클론항체 KM2142에 의한 웨스턴블롯팅에서 교차하는 약 45kDa의 밴드를 포함하는 획분을 회수하였다.

제2 단계：MonoQ 음이온교환 크로마토그래피

상기 아연킬레이트 크로마토그래피 조(粗)정제 획분에 최종농도 65%가 되도록 황산암모늄을 첨가하여 교반한 후, 4℃에서 2시간 방치하였다. 18,800×g로 30분간 원심분리하여 얻어진 침전을 10mmol/L 트리스염산완충액(pH 7.0)에 용해하고, 동 트리스염산완충액으로 평형화한 MonoQ HR 5/5 컬럼(아마샴 펄머시아 바이오텍사 제조)에 첨가하였다. 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 0~1 mol/L 염화나트륨 직선농도구배로 용출시켰다. 용출획분의 일부를 사용하여 SDS-PAGE를 실시하고, 상기(2)에서 나타낸 모노클론항체 KM2142에 의한 웨스턴블롯팅에서 교차하는 약 45kDa의 밴드를 포함하는 획분을 회수하였다(도 2의 레인 2).

(4) CHO 배양상청으로부터의 인간SCGF 단백질의 고순도 정제

실시예 6에 기재하는 인간SCGF 정량계에서 사용하는 인간SCGF 단백질 표준품은, 상기(1)의 배지 2)의 배양조건에서 얻은 CHO 세포배양 상청으로부터 이하의 3 단계의 크로마토그래피에 의해 정제하여 취득하였다.

제1 단계：아연킬레이트 크로마토그래피

Zn²⁺이온으로 포화시킨 Chelating Sepharose Fast Flow 담체(아마샴 펄머시아 바이오텍사 제조)를 5.0cmφx20cm의 컬럼(BioRad사 제조)에 14.5cm의 높이까지 충전하고, 0.5mol/L 염화나트륨을 포함하는 20mmol/L 인산나트륨 완충액(pH 7.1)으로 평형화하였다. 이것에 상기(1)에서 얻은 CHO 세포배양 상청 12L를 첨가하고, 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 0~100mmol/L 히스티딘 직선농도구배로 용출시켰다. 용출획분의 일부를 사용하여 SDS-PAGE를 실시하고, 상기(2)에서 나타낸 KM2142에 의한 웨스턴블롯팅에서 교차하는 약 45kDa의 밴드를 포함하는 획분을 회수하였다.

제2 단계：MonoQ 음이온교환 크로마토그래피

상기 아연킬레이트 크로마토그래피 조정제획분에 최종농도 50%가 되도록 황산암모늄을 첨가하여 교반한 후, 4℃에서 2시간 방치하였다. 18,800g로 30분간 원심분리하여 얻어진 침전을 10mmol/L 트리스염산완충액(pH 7.0)에 용해하고, 동 트리스염산완충액으로 평형화한 MonoQ HR 10/10 컬럼(아마샴 펄머시아 바이오텍사 제조)에 첨가하였다. 동 완충액으로 충분히 세정한 후, 0~1 mol/L 염화나트륨 직선농도구배로 용출시켰다. 용출획분의 일부를 사용하여 SDS-PAGE를 실시하고, 상기(2)에서 나타낸 KM2142에 의한 웨스턴블롯팅에서 교차하는 약 45kDa의 밴드를 포함하는 획분을 회수하였다.

제3 단계：S-400 겔 여과 크로마토그래피

Sephacryl S-400 HR담체(아마샴 펄머시아 바이오텍사 제조)를 XK50/60 컬럼(아마샴 펄머시아 바이오텍사 제조)에 51.5cm의 높이까지 충전한 컬럼과 XK50/100 컬럼(아마샴 펄머시아 바이오텍사 제조)에 93cm의 높이까지 충전한 컬럼을 직렬로 연결하여, PBS버퍼로 충분히 평형화하였다. 이것에 상기 MonoQ 음이온 교환 크로마토그래피 정제획분 28mL를 첨가하고, 6mL/분의 유속으로 PBS버퍼에 의해 용출시켰다. 용출획분의 일부를 사용하여 SDS-PAGE를 실시하고, 상기(2)에서 나타낸 모노클론항체 KM2142에 의한 웨스턴블롯팅에서 교차하는 약 45kDa의 밴드를 포함하는 획분을 회수하였다.

(5) 인간SCGF 단백질의 N말단 아미노산배열 해석

실시예 2(3)에서 얻어진 정제 인간SCGF 단백질의 N말단 아미노산배열은 단백질화학의 일반법에 따라 결정하였다. 정제 인간SCGF 단백질을 포함하는 획분을 SDS-PAGE한 후, 은 염색(도 2 레인 2) 혹은 P. Matsudaira의 방법에 따라 PVDF막(ProBlott, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조)에 전기적으로 전사하였다. 전사한 막은 쿠마디블루 염색하고, 외관상 분자량이 45kDa(도 2 레인 2, 밴드 A), 41kDa(도 2 레인 2, 밴드 B), 34kDa(도 2 레인 2, 밴드 C)의 각 밴드를 잘라내어, 기상(氣相) 프로테인 시퀸서(PPSQ-10, 시마즈세이사쿠쇼)를 사용하여 메이커 추천의 방법에 의해 아미노산배열을 결정하였다. 얻어진 아미노산 배열은 배열번호 5, 6, 7에 기재한 바와같이, 배열번호 1에 기재한 SCGF의 아미노산 배열의 N말단으로부터 1아미노산 잔기째, 29 아미노산 잔기째, 60아미노산 잔기째로부터의 아미노산 배열에 각각 일치하였다. 이하, 도 2의 레인 2에 나타낸 외관 분자량 약 41kDa의 N말단 28잔기 결실 SCGF단백질을 Δ28체, 약 34kDa의 N말단 59잔기 결실 SCGF 단백질을 Δ59체라고 칭한다.

(실시예 3) CHO 세포발현 인간SCGF 단백질을 사용한 항 인간SCGF 모노클론항체의 제작

(1) 동물의 면역과 항체산생 세포의 조제

실시예 2(3)에서 얻어진 CHO 세포발현 인간SCGF 단백질(SCGF, Δ28체, Δ59체의 SCGF 혼합물) 100μg를 알루미늄 겔 2mg 및 백일해 백신(치바현 혈청연구소 제조) 1×10⁹ 세포와 함께 생후 6주 암컷쥐(Balb/c)에 투여하여, 2주일 후부터 100μg의 인간SCGF 단백을 1주간에 1회, 합계 3회 투여하였다. 안저정맥총에서 채혈하여, 그 혈청항체값을 실시예 1(4)에서 나타낸 효소면역측정법(단 검출용의 항원에는 CHO 세포발현 인간SCGF 단백질, 컨트롤항원으로서 1% BSA－PBS를 사용하였다.) 및 이하에 나타내는 샌드위치 ELISA법으로 조사하여, 충분한 항체값을 나타낸 마우스로부터 최종면역 3일 후에 비장을 적출하였다.

항체산생세포의 조제는 실시예 1(3)과 동일하게 실시하였다.

(2) 샌드위치 ELISA법

96홀의 EIA 플레이트(그라이너사 제조)에 실시예 1에서 얻어진 항 인간SCGF 모노클론항체 KM2142를 10μg/mL, 50μL/홀에 나누어 주입하고, 4℃에서 하룻밤 방치해 흡착시켰다. 세정한 후, 1% BSA-PBS를 100μL/홀 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 남아 있는 활성기를 블록하였다. 1% BSA-PBS를 버리고 CHO 세포발현 인간SCGF 단백질을 5μg/mL로 1% BSA-PBS 희석한 것을 50μL/홀에 나누어 주입하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 대상으로서 1% BSA-PBS를 50μL/홀에 나누어 주입하고, 동일하게 반응시켰다. tween-PBS로 세정한 후, 상기(1)에서 얻어진 피면역 마우스 항혈청의 배양상청을 50μL/홀에 나누어 주입하고, 2시간 반응시켰다. tween-PBS로 세정한 후, 펠옥시다제 표지 항마우스면역글로블린(쥐 혈청 단백 흡수완료；카르타그사 제조)을 50μL/홀에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. tween-PBS로 세정한 후, ABTS 기질액［2. 2－아디노비스(3－에틸벤조티아졸-6－술폰산)암모늄］을 사용하여 발색시키고 OD415nm의 흡광도를 플레이트리더(Emax;Molecular Devices사 제조)로 측정하였다.

(3) 마우스 골수종세포의 조제

실시예 1(5)와 동일하게 하여 조제를 실시하였다.

(4) 하이브리도마의 제작

실시예 1(6)과 동일하게 하여 실시예 3(1)에서 얻어진 마우스 비장세포와 (3)에서 얻어진 골수종세포와의 세포융합을 실시하였다.

얻어진 세포현탁액을 96홀 배양용 플레이트에 100μL/홀씩 나누어 주입하고, 5% CO₂ 인큐베이터 중, 37℃에서 10~14일간 배양하였다. 이 배양상청을 실시예 3(2)에 기재한 샌드위치 ELISA법으로 조사하고, 인간SCGF 단백질에 반응시켜 컨트롤인 1% BSA-PBS에 반응하지 않는 홀을 선택하고, 다시 HT 배지와 정상 배지로 바꾸어 2회 클로닝을 반복하여, 항 인간SCGF 모노클론항체 산생 하이브리도마 KM2801, KM2802, KM2803 및 KM2804를 확립하였다.

(5) 모노클론항체의 정제

실시예 1(7)과 동일하게 하여 실시예 3(4)에서 얻어진 하이브리도마주를 누드암컷 쥐에 복강내 투여를 실시하여, 얻어진 복수로부터 정제모노클론항체를 취득하였다.

항체의 서브클라스는 서브클라스 타이핑킷을 사용하여 효소면역측정법에 의하여 실시하여 결정하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

(표 2)

항체명	항체 클래스
KM2801	G1
KM2802	G1
KM2803	G1
KM2804	G1

(6) CHO세포발현 인간SCGF단백질과의 반응성(효소면역측정법)

실시예 3(4)에서 얻어진 항 인간SCGF 모노클론항체의 CHO세포발현 인간SCGF 단백질과의 반응성을 실시예 1(4)에 나타낸 효소면역측정법으로 조사하였다. 도 3에 도시하는 바와 같이, 항 인간SCGF 모노클론항체(KM2801, KM2802, KM2803 및 KM2804)는 CHO세포발현 인간SCGF단백질에 특이적으로 반응하고, 컨트롤의 1%BSA-PBS에는 반응하지 않았다.

(실시예 4) SDS변성 인간SCGF단백질(CHO세포발현)을 사용한 항 인간SCGF 모노클론항체의 제작

실시예 3 기재의 미변성 인간SCGF단백질을 면역원으로 사용한 경우에는, Δ59체에 반응하는 모노클론항체는 얻을 수 없었다. 따라서, △59체에 반응하는 모노 클론항체를 제작하기 위하여, SDS변성 SCGF를 면역원으로 사용하여 하이브리도마의 제작을 시도하였다.

(1) 면역원의 조제

실시예 2(3)로 얻어진 CHO세포발현 인간SCGF단백질을 SDS(라우릴 황산나트륨；나카라이테스크사 제조)를 첨가하여 변성시킨 것을 제작하여, 면역원으로 하였다. 즉 5%SDS－PBS를 조제하고, CHO세포발현 인간SCGF단백질에 9분의 1의 양을 첨가하여 100℃에서 5분간 삶아 끓인 것을 SDS변성 인간SCGF단백질로 하였다.

(2) 동물의 면역과 항체산생세포의 조제

실시예 4(1)로 얻어진 SDS변성 인간SCGF단백질 100μg를 알루미늄겔 2mg 및 백일해백신(치바현 혈청연구소 제조) 1×10⁹ 세포와 함께 생후 6주의 암컷쥐(Balb/c)에 투여하고, 2주일 후부터 100μg의 SDS변성 인간SCGF단백질을 1주간 1회, 합계 3회 투여하였다. 안저정맥총에서 채혈하고, 그 혈청항체값을 실시예 1(4)에서 나타낸 효소면역측정법(단 검출용의 항원에는 SDS변성 인간SCGF 단백질, 컨트롤항원으로서 1%BSA-PBS를 사용하였다.)으로 조사하고, 충분한 항체값을 나타낸 쥐로부터 최종면역 3일 후에 비장을 적출하였다.

항체산생 세포의 조제는 실시예 1(3)에 기재한 방법과 동일하게 실시하였다.

(3) 마우스 골수종세포의 조제

실시예 1(5)에 기재된 방법과 동일한 조제를 실시하였다.

(4) 하이브리도마의 제작

실시예 1(6)과 동일하게 실시하고, 실시예 4(2)로 얻어진 마우스 비장세포와 (3)에서 얻어진 골수종세포와의 세포융합을 실시하였다.

얻어진 세포현탁액을 96홀 배양용 플레이트에 100μL/홀에 나누어 주입하고, 5% CO₂ 인큐베이터 중, 37℃에서 10~14일간, 배양하였다. 이 배양상청을 실시예 1(4)에서 나타낸 효소면역측정법으로 조사하고, SDS변성 인간SCGF단백에 반응하여 컨트롤인 1%BSA-PBS에 반응하지 않는 홀을 선택하고, 다시 HT배지와 정상배지로 바꾸어 2회 클로닝을 반복하여 항 인간SCGF 모노클론항체산생 하이브리도마 KM2941, KM2942, KM2943, KM2944 및 KM2945를 확립하였다.

(5) 모노클론항체의 정제

실시예 1(7)과 동일하게 실시예 4(4)로 얻어진 하이브리도마주를 누드암컷 마우스의 복강내 투여를 실시하여, 얻어진 복수로부터 정제모노클론항체를 취득하였다.

항체의 서브클라스는 서브클라스 타이핑킷을 사용하여 효소면역측정법에 의하여 실시하고, 결정하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.

(표 3)

항체명	항체 클래스
KM2941	G1
KM2942	G1
KM2943	G1
KM2944	G1
KM2945	G1

(6) SDS변성 인간SCGF단백질과의 반응성(효소면역측정법)

실시예 4(4)에서 얻어진 항 인간SCGF 모노클론항체의 SDS변성 인간SCGF 단백질과의 반응성을 실시예 1(4)에 나타낸 효소면역측정법으로 조사하였다. 도 4에 도시하는 바와 같이, 항 인간SCGF 모노클론항체(KM2941, KM2942, KM2943, KM2944 및 KM2945)는 SDS변성 인간SCGF 단백질에 특이적으로 반응하고, 컨트롤의 1%BSA-PBS에는 반응하지 않았다.

(실시예 5) 항 인간SCGF 모노클론항체의 반응성 검토

(1) 인간 및 마우스 SCGF단백질에 대한 반응성

실시예 1, 3 및 4로 제작된 항 인간SCGF 모노클론항체의 인간 및 마우스 SCGF단백질에 대한 반응성을 효소면역측정법(바인딩 ELISA)으로 검토하였다. 마우스 SCGF단백질은 실시예 2 기재의 방법에 준하여 제작하였다.

검출용의 항원으로서 CHO세포발현 인간 및 마우스 SCGF단백질을 사용하여 실시예 1(4)에 기재의 방법에 의해 실시하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

항SCGF 모노클론항체 KM2142는 배열번호 1에 나타내는 SCGF의 아미노산 배열의 N말단으로부터 6잔기째로부터 25잔기째까지 상당하는 부분펩티드(화합물 1)를 항원으로 사용하여 제작된 하이브리도마 유래의 항체이다. 항SCGF 모노클론항체 KM2142는, SCGF단백질에 대한 반응성도 갖고 있는 것으로 나타났다. 또, 항SCGF 모노클론항체 KM2142는 인간 및 마우스 SCGF 단백질 양쪽 모두에 반응성을 가지고 있었다.

항SCGF 모노클론항체 KM2804는 CHO세포발현 인간SCGF를 항원으로 사용하여 제작한 하이브리도마 유래의 항체이다. 항SCGF 모노클론항체 KM2804는 인간SCGF에만 반응하고, 마우스 SCGF에 대한 교차반응성은 나타나지 않았다.

항SCGF 모노클론항체 KM2945는 SDS변성 SCGF단백질(CHO세포발현)을 항원으로사용하여 제작한 하이브리도마 유래의 항체이다. 항SCGF 모노클론항체 KM2945는, 미변성의 SCGF단백질에 대한 반응성도 갖고 있는 것으로 나타났다. 또, 항SCGF 모노클론항체 KM2945는 마우스 SCGF에 대한 교차반응성은 나타나지 않았다.

(2) 웨스턴블롯팅

실시예 2(3)에서 얻어진 CHO세포발현 인간SCGF 단백질을 사용하여 실시예 3 및 4로 제작된 항 인간SCGF 모노클론항체 KM2804 및 KM2945의 웨스턴블롯팅에 있어서의 반응성을 검토하였다.

실시예 2(2)와 동일하게 PVDF막에 전사한 샘플을, 블로킹용액중에서 실온에서 30분간 진탕한 후, 블로킹용액으로 1mg/mL로 희석한 항SCGF 모노클론항체로 실온에서 60분간 진탕하였다. 전사막은 다시 0.05% tween20를 포함하는 PBS버퍼로 5분간 세정을 2회, PBS버퍼에서의 5분간 세정을 1회 실시한 후, PBS로 1/1,000로 희석한 퍼옥시시다제 표지 항마우스 IgG 항체(아마샴 펄머시아 바이오텍사 제조) 용액중에서 실온에서 60분간 진탕하였다. 0.05% tween20를 포함하는 PBS버퍼로 5분간 세정을 2회, PBS 버퍼에서의 5분간 세정을 1회 실시한 후, 상술한 ECL발광법에 의해 검출하였다.

도 2에 있어서의 레인 3, 4, 5는 각각 KM2142, KM2804, KM2945를 사용한 정제 인간SCGF단백질의 웨스턴블롯팅 결과를 나타낸다. KM2804는 N말단 59잔기결실 SCGF단백질인 Δ59체에는 반응성을 갖지 않지만, 전체길이 SCGF 및 N말단 28잔기결실 SCGF단백질인 Δ28체에는 반응성을 갖고 있었다. 또, KM2945는 전체길이 SCGF 및 결실체 모두 반응성을 갖고 있었다.

(실시예 6) 인간SCGF 정량계(定量系)

실시예 1에서 얻어진 항 인간SCGF 모노클론항체 KM2142를 이하의 방법에 의해 비오틴표지하였다. 실시예 1에서 얻어진 KM2142 정제항체를 PBS로 1mg/mL로 희석하고, 1/4용량의 0.5mol/L 탄산버퍼(pH9.2)를 첨가하였다. 다시 버퍼와 동량의 NHS-Lc-Biotin(1 mg/mL에 디메틸포름아미드로 용해；피어스사 제조)를 교반하면서 적하하였다. 3시간, 실온에서 교반반응을 실시한 후, PBS로 하룻밤 투석한 것을 비오틴 표지 KM2142로서 사용하였다.

96홀의 EIA용 플레이트(그라이너사 제조)에, 실시예 3에서 얻어진 항 인간SCGF 모노클론항체 KM2804를 5μg/mL, 50μL/홀에 나누어 주입하고, 4℃에서 하룻밤 방치하여 흡착시켰다. 세정한 후, 1%BSA-PBS를 100μL/홀에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시키고 남아있는 활성기를 블록하였다. 1%BSA-PBS를 버리고 실시예 2(4)에서 얻어진 CHO세포발현 인간SCGF단백질을 혈청희석액(교와메덱스사 제조)으로 17.5ng/mL로부터 2배 희석계열로 14점 희석한 것을 50μL/홀에 나누어 주입하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. tween-PBS로 세정한 후, 상기에서 얻어진 비오틴표지 KM2142(0.2μg/mL에 BSA-PBS로 희석)를 50μL/홀에 나누어 주입하고, 실온에서, 2시간 반응시켜, tween-PBS로 세정한 후, 다시 알칼리포스파타제표지아비딘(자이멧드사 제조)을 32,000배 희석으로 50μL/홀에 첨가하여 실온에서, 1시간 반응시켰다. tween-PBS로 세정한 후, AmpliQ(DAKO사 제조)를 사용하여 발색시키고 OD490nm의 흡광도를 플레이트리더(E-max；Molecular Devices사 제조)로 측정하였다. 그 결과, 도 6에 도시하는 바와 같이, 본 정량계에 의해 인간SCGF단백질을 0.04~2.0ng/mL의 범위로 정량하는 것이 가능하였다.

(실시예 7) 백혈병, 전백혈병 환자 및 비백혈병성 악성혈액질환의 혈청SCGF농도

인폼드 콘센트(informed consent)를 얻은 백혈병, 전백혈병 환자 및 비백혈병성 악성혈액질환의 혈청중의 SCGF농도를 실시예 6의 방법으로 측정하였다. 또 혈구검사치가 정상치를 나타낸 남녀 10명의 정상인을 대상예로하여 동일하게 혈청중의 SCGF농도를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.

정상인의 값의 분포가 정규분포를 나타내는 것을 확인한 후, 이 군으로부터 평균치와 스탠더드 디비에이션(SD)을 계산하고, 평균치 ＋2SD의 값을 정상과 이상으로 구별하는 기준치로 설정하였다. 이 기준치를 기초로 하여, 백혈병, 전백혈병환자 및 비백혈병성 악성혈액질환의 값을 정상·이상으로 분별하고, 백혈병, 전백혈병환자 및 비백혈병성 악성혈액질환이 SCGF측정값으로 검출가능한지 아닌지를 확인하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.

(표 4)

환자수 양성자수 양성율(%)

ALL 7 7 100.0 AML 7 6 85.7 CML 6 6 100.0 MDS 5 5 100.0 NHL 7 6 85.7 MM 6 4 66.7 AA 7 0 0.0

절단값은 정상인의 평균치 +2SD=18. 2ng/mL로 하였다.

정상인군과 비교하여, 급성골수성 백혈병(AML), 급성임파성 백혈병(ALL), 만성골수성 백혈병(CML), 골수이형성증후군(MDS), 비악성임파종(NHL), 다발성 골수종(MM)의 환자의 중앙치는 의미있게 높고, SCGF측정값이 이들 질환에서 의미있게 상승하고 있는 것이 나타났다(도 7).

또 정상인의 값으로 정한 절단치를 사용하여 백혈병, 전백혈병환자 및 비백혈병성 악성혈액질환을 높은 감도로 검출할 수 있는 것이 나타났다(표 4). 한편, 같은 혈액질환이면서, 재생불량성 빈혈(AA) 환자의 값은 정상인과의 의미있는 차이가 관찰되지 않고, 또 절단치를 사용해도 이 질환을 검출 할 수가 없었다.

혈액세포수의 이상을 수반하는 질환인 비악성임파종(NHL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 급성골수성 백혈병(AML), 급성임파성 백혈병(ALL), 만성골수성 백혈병(CML)을 비교하면, 급성골수성 백혈병(AML), 급성임파성 백혈병(ALL), 만성골수성 백혈병(CML) 등의 백혈병환자의 F혈액중 SCGF농도는, 비악성임파종(NHL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS) 등의 다른 전백혈병이나 비백혈병성 악성혈액질환 환자의 혈액중 SCGF농도와 비교하여 의미있게 높고, 혈액중 SCGF농도는 백혈병과 전백혈병이나 비백혈병성 악성혈액질환과의 판별에 이용가능하였다. 또, 판별진단이 어려운 AA환자와 MDS환자를 비교해보면, MDS환자혈중 SCGF농도는 AA환자의 SCGF농도와 비교하여 의미있게 높으며, 양자를 혈중 SCGF농도로 판별진단하는 것이 가능하였다.

(실시예 8) 조혈간세포 이식 후 GVHD발증과 SCGF농도

인폼드 콘센트를 얻은 백혈병 및 전백혈병환자로 조혈간세포 이식을 받은 23예 중, GVHD를 발증한 예 15예, 발증하지 않았던 예 8예의 혈청중 SCGF농도를 실시예 6의 방법을 이용하여 각 스테이지마다 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.

조혈간세포 이식을 받은 환자의 SCGF농도는 프리컨디쇼닝기나 어플러스틱기에 비해, 회복기나 안정기의 쪽이 의미있게 높은 값을 나타냈다.

조혈간세포 이식을 받은 환자 가운데, GVHD를 발증한 증례는 발증하지 않았던 예에 비해, 어플러스틱기 및 회복기에 있어서 의미있게 혈청중 SCGF농도가 높기 때문에, 혈청중의 SCGF농도를 측정하는 것에 의하여, GVHD발증이 판정가능하였다.

다시 절단값을 정하여 GVHD발증예와 비발증예를 판정할 수 없는가를 검토하였다. 그 결과를 도 9에 나타낸다. 프리컨디쇼닝기에 있어서는, 절단치를 예를 들면, 5ng/mL로 정하는 것에 의하여 감도87%, 특이도57%로, 어플러스틱기에 있어서는 절단값을 10ng/mL에 정하는 것으로 감도87%, 특이도63%로, 회복기에서는 절단값을 15ng/mL로 정하는 것으로 감도87%, 특이도63%로, 각각 SCGF농도를 측정하고, 이것을 진단에 이용하지 않았던 때와 비교하여 의미있게(p<0.05) GVHD발증예와 비발증예의 판별이 가능하였다.

(실시예 9) 이식 조혈간세포의 생착과 혈청 SCGF농도

인폼드 콘센트를 얻은 혈액질환환자로 조혈간세포 이식을 받은 23예 가운데, 생착이 지연된 예 4예, 지연되지 않았던 예 19예의 혈청중 SCGF농도를 실시예 6의 방법을 이용해 각 스테이지마다 측정하였다. 결과를 도 10에 나타낸다.

생착 비지연예에서는, 회복기 및 안정기의 SCGF농도는, 프리컨디쇼닝기에 비교하여 의미있게 상승하였다. 한편, 생착 지연예에서는, 이들 기에 있어서도 의미있는 상승은 관찰되지 않았다.

따라서, 조혈간세포 이식환자의 SCGF농도를 측정하고, 그 절단값을 정하고 그 값과 각각의 환자의 값의 비교로부터 조혈간세포 생착지연예와 비지연예를 판정할 수 없는가를 검토하였다. 그 결과를 제11도에 나타낸다. 프리컨디쇼닝기에 있어서는, 절단값을 예를 들면, 9.5ng/mL으로 정하는 것으로 감도75%, 특이도67%로, 어플러스틱기에 있어서는 절단값을 12ng/mL으로 정하는 것으로 감도75%, 특이도63%로, 조혈간세포 생착지연예와 비지연예를 판별하는 것이 가능하였다.

(실시예 10) 백혈병환자의 말초혈세포에 있어서의 SCGF의 발현

인폼드 콘센트를 얻은 여러가지 백혈병환자의 말초혈세포를 Rneasy Mini Kit (Qiagen사 제조)를 사용하여 프로토콜에 따라 전체RNA를 추출하고, 전체RNA1μg를 DNaseI (GIBCO사 제조) 처리하여, SuperScript First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR (GIBCO사 제조)를 사용하여 역전사하고, First-Strand DNA를 조제하였다. Taq Polymerase (TaKaRa사 제조)를 사용하여 조제한 First-Strand DNA를 주형으로 하고, 배열번호 8 및 9, 배열번호 10 및 11의 염기배열을 갖는 올리고DNA를 프라이머로하여 각각, 인간 G3PDH, SCGF유전자의 검출을 검토한 바, G3PDH의 검출량이 거의 동등하게 되는 조건하에서, 정상인 1인에서는, SCGF의 발현을 검출할 수 없었지만, 급성임파성 백혈병(ALL)의 2예 중 1예, 급성골수성 백혈병(AML) 2예 중 2예에서 SCGF의 발현이 검출되었다.

본 발명은, SCGF에 반응하는 항체를 사용한, 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판정하는 방법, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포 생착지연 및 이식편 대 숙주반응병을 판정하는 방법, 및 이들 진단약 및 진단 킷을 제공한다.

<110> TOKAI UNIVERSITY KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. KYOWA MEDEX CO., LTD. <120> METHOD OF JUDGING LEUKEMIA, PRE-LEUKEMIA OR ALEUKEMIC MALIGNANT BLOOD DISEASE AND DIAGNOSTIC THEREFOR <130> PI-4K1058JP <150> JP2002-106786 <151> 2002-04-09 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 302 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Arg Gly Ala Glu Arg Glu Trp Glu Gly Gly Trp Gly Gly Ala Gln 1 5 10 15 Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Leu Met Leu Lys His Leu Gln Glu 20 25 30 Ala Leu Gly Leu Pro Ala Gly Arg Gly Asp Glu Asn Pro Ala Gly Thr 35 40 45 Val Glu Gly Lys Glu Asp Trp Glu Met Glu Glu Asp Gln Gly Glu Glu 50 55 60 Glu Glu Glu Glu Ala Thr Pro Thr Pro Ser Ser Gly Pro Ser Pro Ser 65 70 75 80 Pro Thr Pro Glu Asp Ile Val Thr Tyr Ile Leu Gly Arg Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asp Ala Gly Leu His Gln Leu His Val Arg Leu His Ala Leu Asp 100 105 110 Thr Arg Val Val Glu Leu Thr Gln Gly Leu Arg Gln Leu Arg Asn Ala 115 120 125 Ala Gly Asp Thr Arg Asp Ala Val Gln Ala Leu Gln Glu Ala Gln Gly 130 135 140 Arg Ala Glu Arg Glu His Gly Arg Leu Glu Gly Cys Leu Lys Gly Leu 145 150 155 160 Arg Leu Gly His Lys Cys Phe Leu Leu Ser Arg Asp Phe Glu Ala Gln 165 170 175 Ala Ala Ala Gln Ala Arg Cys Thr Ala Arg Gly Gly Ser Leu Ala Gln 180 185 190 Pro Ala Asp Arg Gln Gln Met Glu Ala Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Leu Ala Pro Tyr Asn Trp Pro Val Trp Leu Gly Val His Asp Arg 210 215 220 Arg Ala Glu Gly Leu Tyr Leu Phe Glu Asn Gly Gln Arg Val Ser Phe 225 230 235 240 Phe Ala Trp His Arg Ser Pro Arg Pro Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ser 245 250 255 Ala Ser Pro His Pro Leu Ser Pro Asp Gln Pro Asn Gly Gly Thr Leu 260 265 270 Glu Asn Cys Val Ala Gln Ala Ser Asp Asp Gly Ser Trp Trp Asp His 275 280 285 Asp Cys Gln Arg Arg Leu Tyr Tyr Val Cys Glu Phe Pro Phe 290 295 300 <210> 2 <211> 224 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Arg Gly Ala Glu Arg Glu Trp Glu Gly Gly Trp Gly Gly Ala Gln 1 5 10 15 Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Leu Met Leu Lys His Leu Gln Glu 20 25 30 Ala Leu Gly Leu Pro Ala Gly Arg Gly Asp Glu Asn Pro Ala Gly Thr 35 40 45 Val Glu Gly Lys Glu Asp Trp Glu Met Glu Glu Asp Gln Gly Glu Glu 50 55 60 Glu Glu Glu Glu Ala Thr Pro Thr Pro Ser Ser Gly Pro Ser Pro Ser 65 70 75 80 Pro Thr Pro Glu Asp Ile Val Thr Tyr Ile Leu Gly Arg Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asp Ala Gly Leu His Gln Leu His Val Arg Leu His Ala Leu Asp 100 105 110 Thr Arg Val Val Glu Leu Thr Gln Gly Leu Arg Gln Leu Arg Asn Ala 115 120 125 Ala Gly Asp Thr Arg Asp Ala Val Gln Ala Leu Gln Glu Ala Gln Gly 130 135 140 Arg Ala Glu Arg Glu His Gly Arg Leu Glu Gly Cys Leu Lys Gly Leu 145 150 155 160 Arg Leu Gly His Lys Cys Phe Leu Leu Ser Arg Asp Phe Glu Ala Gln 165 170 175 Pro Ser Ala Ser Pro His Pro Leu Ser Pro Asp Gln Pro Asn Gly Gly 180 185 190 Thr Leu Glu Asn Cys Val Ala Gln Ala Ser Asp Asp Gly Ser Trp Trp 195 200 205 Asp His Asp Cys Gln Arg Arg Leu Tyr Tyr Val Cys Glu Phe Pro Phe 210 215 220 <210> 3 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr 1 5 10 15 Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr 20 25 30 Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met 35 40 45 Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser 50 55 60 Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val 65 70 75 80 Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys 85 90 95 Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro 100 105 110 Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp 115 120 125 Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu 130 135 140 Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu 145 150 155 160 Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn 165 170 175 Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala 180 185 190 Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly 195 200 205 Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu 210 215 220 Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu 225 230 235 240 Lys Glu Arg Glu Phe Gln Glu Val 245 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Glu Trp Glu Gly Gly Gly Trp Gly Gly Ala Gln Glu Glu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Arg Glu Ala Leu Cys 20 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Arg Gly Ala Glu Arg Glu Trp Glu Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> Xaa is unsure <400> 6 Xaa Leu Gln Glu Ala Leu Gly Leu Pro Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Gln Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <400> 8 cccatcacca tcttccagga gc 22 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <400> 9 ttcaccacct tcttgatgtc atcata 26 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <400> 10 gtcctctttt ccctcaaca 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <400> 11 ttttgggggc tttggtgg 18

Claims

생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 측정하는 것을 특징으로 하는, 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판정하는 방법.
생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 측정하는 것을 특징으로 하는, 백혈병과 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환을 판별하는 방법.
생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 측정하는 것을 특징으로 하는, 재생불량성 빈혈과 골수이형성 증후군을 판별하는 방법.
생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 측정하는 것을 특징으로 하는, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착상태를 판정하는 방법.
생체시료 중의 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 정량하는 것을 특징으로 하는, 이식편 대 숙주반응병을 판정하는 방법.
제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서, 판정 또는 판별하는 방법이, 면역학적 측정방법인 방법.
제 6항에 있어서, 상기 면역학적 측정방법이, 샌드위치법인 방법.
제 7항에 있어서, 상기 샌드위치법이, 조혈간세포 증식인자(SCGF)의 다른 에피토프에 반응하는 2종류의 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 항체가, 폴리클론항체 및 모노클론항체로부터 선택되는 항체인 방법.
제 9항에 있어서, 상기 모노클론항체가, 배열번호 1의 6~28번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체 및 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모노클론항체인 방법.
조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 유효성분으로서 함유하여 이루어진 백혈병, 전백혈병 또는 비백혈병성 악성혈액질환의 진단약.
조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 유효성분으로서 함유하여 이루어진 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착상태의 진단약.
조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 유효성분으로서 함유하여 이루어지는 이식편 대 숙주반응병의 진단약.
제 11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가, 폴리클론항체 및 모노클론항체로부터 선택되는 항체인 진단약.
제 14항에 있어서, 상기 모노클론항체가, 배열번호 1의 6~28번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체, 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체 및 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모노클론항체인 진단약.
조혈간세포 증식인자(SCGF)에 반응하는 항체를 포함하는, 백혈병, 전백혈병 혹은 비백혈병성 악성혈액질환, 조혈간세포 이식 후의 조혈간세포의 생착상태 또는 이식편 대 숙주반응병의 진단용 킷.
제16항에 있어서, 조혈간세포 증식인자(SCGF)를 포함하는 진단용 킷.
배열번호 1의 29~59번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체.
배열번호 1 기재의 60~302번째의 아미노산 배열로 나타낸 영역을 인식하는 모노클론항체.
제 18항 또는 제 19항 기재의 모노클론항체를 생산하는 하이브리도마.