KR20170029414A

KR20170029414A - 암을 스크리닝하고 검출하는 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20170029414A
Application number: KR1020167033190A
Authority: KR
Inventors: 낸시 토미에 앤 조던
Original assignee: 이디피 바이오테크 코퍼레이션
Priority date: 2014-04-29
Filing date: 2015-04-28
Publication date: 2017-03-15
Also published as: HK1231405A1; EP3137109A1; WO2015168144A9; US9753036B2; US20150309028A1; AU2015253282A1; WO2015168144A1; EP3137109A4

Abstract

본 발명은 결장 또는 폐의 암종을 포함하는 인간 종양에 관련된 새로운 항원, 뿐만 아니라 상기 항원에 특이적으로 결합하는 새로운 단클론성 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 종양 세포보다 훨씬 더 적은 정도로 정상 인간 세포에 결합한다. 상기 항원은 대장암 막 결합성 및 가용성 형태를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지고, ACT에 특이적인 항체에 실질적으로 결합하지 않는 100 kDa 당단백질을 포함한다. 상기 항체는 종양에 관련된 악성 세포의 검출과 같은 방법, 및 종양을 가지고 있는 인간의 치료적 처치의 모니터링 둘 다에서 유용하다.

Description

암을 스크리닝하고 검출하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR SCREENING AND DETECTING CANCER}

본 출원은 PCT 국제 특허 출원으로서 2015년 4월 28일에 출원되었고 2014년 4월 29일에 출원된 미국 유틸리티 특허 출원 일련 번호 14/264,801에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문은 본원에 참고로 포함된다.

암종(carcinoma)은 매년 수백만 명의 사망의 원인이다. 모든 암 중에서, 대장암은 미국에서 두 번째로 높은 암 관련 사망의 원인이다. 암종의 많은 사례는 질환의 초기 단계에 검출되어 치료되지 않으면 화학요법 및 방사선 요법으로 치유 불가능하다. 암은 진단될 때 이미 너무 많이 진행된 경우라면, 치료법이 효과적일 가능성이 작다. 따라서, 암 연구의 발달에도 불구하고, 결장 및 폐 암종의 조기 진단 및 치료에 유용한 새로운 항체에 대한 필요성이 남아있다.

일반적으로, 항체는 진단에서 유용한 시약으로 사용된다. 실제로, 항체는 생합성 경로에서 다양한 생체 분자의 기능을 해독하는데 있어서 주요 역할을 한다. 항체는 또한 종양 특이적 항원의 동정 및 특성화를 위해 선택되는 시약이 되며 암의 분류에서 중요한 도구이다. 일단 종양-관련 항원이 조직 추출물로부터 정제되면, 이러한 항원들은 동물로의 주사에 의해 항원에 대한 항체의 생산을 유도하는데 사용될 수 있다. 그 이후 단클론성 항체가 생산될 수 있다. 이러한 항체는 치료적 그리고 진단적으로 유용하다.

시험관 내 진단 방법은 업계에 공지되어 있으며, 종양 세포의 면역조직학적 검출(예를 들어, 인간 조직, 세포 또는 절제된 종양 표본 상에서) 또는 종양-관련 항원의 혈청학적 검출(예를 들어, 혈액 샘플 또는 다른 생물학적 유체에서)을 포함한다. 면역조직학적 기술은 생물학적 표본, 예를 들어 종양 조직 표본을 본 발명의 항체와 접촉시킨 다음 항원과 복합체를 형성한 항체의 표본 상에서 그 존재를 검출하는 것을 수반한다. 표본을 이용한 이러한 항체-항원 복합체의 형성은 조직에서의 종양 세포의 존재를 나타낸다. 표본 상에서의 항체의 검출은 업계에 공지된 기술, 예를 들어 면역퍼옥시다제 염색 기술, 아비딘-비오틴(ABC) 기술 또는 면역형광 기술을 사용하여 달성될 수 있다(Ciocca et al, Meth. Enzymol., 121:562-79 (1986); Kimball (ed.), Introduction To Immunology (2nd Ed.), pp. 113-117, Macmillan Publ. Co. (1986) 참조).

혈청학적 진단 기술은 암종으로 고통받고 있을 것으로 생각되는 환자의 혈청 또는 다른 생물학적 유체로 분비되거나 또는 "셰딩된(shed)" 종양-관련 항원의 검출 및 정량을 수반한다. 이러한 항원은 업계에 공지된 기술, 예를 들어 방사선 면역 검정(radioimmunoassays, RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)을 사용하여 체액에서 검출될 수 있으며, "셰딩된" 항원과 반응하는 항체가 유체 샘플에서의 항원의 존재를 검출하는데 사용된다(Uotila et al., J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981); Allum et al., "Monoclonal Antibodies in the Diagnosis and Treatment of Malignant Conditions" Surg. Ann., 18:41-64, 48-51 (1986); Sikora et al. (eds.), Monoclonal Antibodies, pp. 32-52, Blackwell Scientific Publications, (1984) 참조).

그러나, 일부 경우에서는, 혈청학적 기술은 암 스크리닝에 유용할 정도로 충분히 강력한 결과를 생산하지는 않았다. 혈청 마커, 예를 들어 CEA, CA19-9 및 CA242는 모두 결장암에 대하여 불량한 민감도 및 특이성을 갖는 것으로 나타났다. CEA는 1969년에 발견되었으며 결장암에 대한 민감성 및 특이적 마커인 것으로 생각되었다. 그러나, 이후의 연구들은 같은 결과를 나타내지 않았다. 2.5ug/L의 컷오프(cutoff) 농도에서의 CEA 스크리닝은 30% 내지 40%의 민감도 및 87%의 특이성을 수득하는 것으로 나타났다. 이 수치들을 활용하면, CEA-기반 검정으로 식별된 매 1명의 결장암 환자에 대하여 250의 위양성(false-positive)이 있을 것이고, 암의 60%를 놓칠 것이다. 이러한 전체적으로 불량한 결과들로 인해 이 마커들은 결장암 스크리닝에 사용되지 않는다.

이러한 이유로 대변 잠혈(Fecal Occult Blood, FOB) 테스트가 오랫동안 결장암 스크리닝의 주축을 이루고 있었다. 대규모 무작위 연구는 일련의 FOB 테스트를 이용한 스크리닝이 결장암의 치사율을 감소시키는 것으로 나타냈다. FOB 테스트의 전형적인 예는 두 가지 유형인, 상표명 SKB-Hemoccult II^® & Hemocult II SENSA^® 하에 이용 가능한 구아약(guaiac)-기반 테스트, 및 상표명 SKB-HemeSelect^® 및 Entrerix-InSure Fit^® 하에 이용 가능한 면역화학적 테스트에 관여한다. 구아약-기반 FOB 테스트의 단점은 힘든 식사 제한, 불편한 수거 과정, 제한된 단일 적용 민감도, 및 불량한 특이성(5 내지 10% 비율의 위양성)과 관련된 비용을 포함한다. 상기 FOB 테스트는 25% 내지 40%의 민감도 및 80% 내지 90%의 특이성을 가진다. 면역화학 기반 FOB 테스트는 사용의 용이함으로 인한 개선된 준수성 및 식사 제한 없음의 장점을 가지는 한편, 민감도 문제는 여전히 남아있다.

따라서, 다양한 종양에 의해 높은 수준으로 발현된 항원과 반응하는 항체가 암의 조기 진단, 암 환자의 면역학적 모니터링, 및 암 치료를 위한 개선된 방법의 개발에 유용할 수 있다는 것은 분명하다. 또한, 신체의 특정 기관 및 조직으로부터 유래된 암종과 관련되는 정제된 항원이 이러한 단클론성 항체의 생성, 및 암 백신의 생성에 유용한 것일 수 있다는 것은 분명하다. 또한, 혈청학적 검정에 대하여 개선된 물질 및 방법이 인간의 암 존재를 식별하는데 유용할 것이라는 것은 분명하다.

본 명세서는 암의 조기 검출 또는 암 치료의 모니터링에 유용한 면역원성 조성물, 항체, 키트 및 방법을 제공한다. 구체예에서, 암은 대장암 및 폐암이다. 상기 면역원성 조성물은 막 결합성 및 가용성 형태(예를 들어, 암세포막에 결합된 형태)를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지며, 항-키모트립신(anti-chymotrypsin, ACT)에 특이적인 항체에 실질적으로 결합하지 않는 약 100 kDa 당단백질을 구성요소로 가지는 대장암 및/또는 간암 세포 샘플로부터 단리된 분획을 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다. 구체예에서, 100 kDa 단백질은 CEACAM 5 아이소폼(isoform) 2의 아미노산 서열을 가진다(서열 번호 1, 도 14). 구체예에서, 100 kDa 당단백질은 위치 320에서 알라닌의 결실이 있고 180 kDa CEA와 비교하여 변화된 글리코실화 패턴을 가진다.

일부 경우, 면역원성 조성물은 대장 및/또는 간 종양 세포를 산과 접촉시켜 추출물을 형성하는 단계; 추출물의 구성요소를 분자량에 따라 분리시켜 약 60 kDa 이상의 분자량을 가지는 구성요소를 포함하는 제1 분획을 형성하는 단계; 약 75 kDa 이상이고 약 200 kDa 미만의 분자량을 가지는 제1 분획의 구성요소를 단리시키는 단계, 및 약 100 kDa의 분자량을 가지는 분획을 추가로 단리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진다.

구체예에서, 상기 조성물은 보조제를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 보조제는 명반, 무라밀 디펩티드 및 프로인트 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)로 구성된 군으로부터 선택된다. 면역원성 조성물은 항체를 얻는데 유용하다. 본원에서 기술된 항원은 또한 검출 가능하게 라벨링되거나 스크리닝 검정에 사용되는 고체 기질에 부착될 수 있다.

본 명세서는 막 결합성 및 가용성 형태를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지고, ACT에 실질적으로 결합하지 않는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 개시한다.

구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 2에서 나타난 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3에서 나타난 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드 및/또는 서열 번호 4에서 나타난 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는다. 구체예에서, 항체는 아미노산 146-237(A1 Ig-2), 아미노산 238-323(B1 Ig-3), 아미노산 324-415(A2 Ig-4), 아미노산 416-498(B2 Ig-5), 아미노산 502-593(A3 Ig-6) 및 아미노산 594-677(B3 Ig-7) 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 CEACAM5의 도메인 내 에피토프에 실질적으로 결합하지 않는다. CEACAM5의 아미노산 넘버링(numbering)은 NP_004354;gI 98986445; Uniprot P06731-1의 것에 해당한다.

구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 180 kDa의 분자량의 CEA, CEACAM 6(NCA), 모든 글리코실화되지 않는 CEACAM5, 및/또는 모든 글리코실화되지 않는 서열 번호 1의 서열을 가진 100 kDa 당단백질과 실질적으로 교차반응하지 않는다.

구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 100 kDa 당단백질 상 에피토프에 특이적으로 결합하며, 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 61-69 HLFGYSWYK(서열 번호 6), 73-77 VDGNR(서열 번호 7) 또는 69-82 KGERVDGNRQIIGY(서열 번호 8), 및 96-107 SGREI IYPNASL(서열 번호 9)을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 구성되거나, 또는 이것들로 구성된다. 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 100 kDa 당단백질 상 에피토프에 특이적으로 결합하며, 에피토프는 아미노산 61-69(서열 번호 6), 78-98 QIIGYVIGTQQAT PGPAYSGR(서열 번호 10), 96-107(서열 번호 9), 및 127-139 SDLVNEEATGQFR(서열 번호 11)을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 구성되거나, 또는 이것들로 구성된다. 아미노산 넘버링은 서열 번호 1의 것에 해당한다. 구체예에서, 에피토프는 100 kDa 당단백질의 N 말단 아미노산(아미노산 1-150, 서열 번호 5)에 있는 입체구조적 에피토프이다. 구체예에서, 항체는 CEACAM5의 다른 도메인 내 에피토프에 실질적으로 결합하지 않는다.

구체예에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 CDRH1: DSYIN(서열 번호 14) 또는 GNTFTDSYIN(서열 번호 15); CDRH2: EIYPGNGDVYYNENFK(서열 번호 16); CDRH3: TTVFAY(서열 번호 17) 또는 LCAGSNMITTVFAY(서열 번호 18)를 포함하는 중쇄 CDR을 포함한다. 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 CDRH1: GYTFTNYWIN(서열 번호 19) 또는 NYWIN(서열 번호 20); CDRH2: NIYPGSTRANYNEKFK(서열 번호 21); CDRH3: YCTRTHSI(서열 번호 22)를 포함하는 중쇄 CDR을 포함한다.

구체예에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 CDRL1: RASQDIRNYLN(서열 번호 26); CDRL2: YTSRLHS(서열 번호 27) 또는 서열 번호 27의 YTS; CDRL3: QQGNTLPW(서열 번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR을 포함한다. 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 CDRL1: RASQSISSYLN(서열 번호 31); CDRL2: 서열 번호 32의 AAS의 AASSLQS(서열 번호 32); CDRL3: QQTVVAPP(서열 번호 33)를 포함하는 경쇄 CDR을 포함한다.

구체예에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호 14/16/17, 서열 번호 15/16/17, 서열 번호 14/16/18, 또는 서열 번호 15/16/18의 HCDR1/HCDR2/HCDR3; 및 서열 번호 26/27/28의 LCDR1/LCDR2/LCDR3을 포함한다. 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호 20/21/22 또는 서열 번호 19/21/22의 HCDR1/HCDR2/HCDR3, 및 서열 번호 31/32/33의 LCDR1/LCDR2/LCDR3을 포함한다.

구체예에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호 119의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 120의 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 121의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

항체는 다클론성, 단클론성, 또는 재조합의 것일 수 있다. 항체는 항원 결합 단편, 예를 들어 Fab, 단일 사슬 항체, scFv, F(ab)₂ 및 Fv 단편일 수 있다. 항체는 인간, 합성(예를 들어, 파지 디스플레이(phage display)), 키메라, 또는 인간화 항체일 수 있다. 구체예에서, 항체는 신호 발생 요소로 라벨링될 수 있다. 다른 구체예에서, 라벨은 비오틴, 형광 염료, 화학발광 태그, 방사성 태그, 효소 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 항체는 고체 표면 상에 고정화된다.

본 명세서는 면역검정을 제공한다. 구체예에서, 상기 방법은 대장암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택된 암에 대하여 대상체를 테스트하는 단계를 더 포함한다. 구체예에서, 상기 테스트는 암의 생체마커의 검출, 대상체 신체의 이미징, 예를 들어 CAT, Pet 또는 MRI 스캔, 및/또는 대장내시경 검사(colonoscopy)의 실시를 수반한다.

구체예에서, 면역검정은 샌드위치 검정이다. 면역검정은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하고, 고체 기질(예를 들어, 캡쳐 항체)에 부착된 ACT에 실질적으로 결합하지 않는 제1 항체, 및 신호 발생 요소로 라벨링된 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 제2 항체를 포함한다. 구체예에서, 제1 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체이다. 구체예에서, 제2 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체이다.

본 명세서는 또한 키트를 제공한다. 구체예에서, 상기 키트는 a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지고 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하며 ACT에 실질적으로 결합하지 않는 제1 항체; 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지고 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하며 신호 발생 요소로 라벨링된 제2 항체; 및 c) 캘리브레이터(calibrator)를 포함한다. 구체예에서, 제1 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체이다. 구체예에서, 제2 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체이다. 구체예에서, 제1 항체는 제2 항체와 다른 에피토프 특이성을 가진다. 구체예에서, 상기 키트는 또한, 검출된 항원의 양이 약 6.5 유닛/mL 이상인 경우 대상체를 대장암에 대한 위험이 있는 것으로 판정하기 위한 설명서를 제공한다.

도 1은 환자 422명의 임상 연구의 모든 데이터의 요약을 나타낸다. 도 1a(패널 A)는 모든 비-암성 및 암성 환자에 대하여 결합된 데이터를 나타낸다. 박스는 데이터의 가운데 50%를 커버하는 한편, 선은 중간값이다. 세선(위스커, whisker)은 데이터의 가운데 90%를 커버한다(5% 내지 95%). 도 1b(패널 B)는 암성 대 비-암성 샘플을 비교하는 수신자 조작 특성(receiver operator characteristic, ROC) 곡선이다.
도 2는 종양 및 정상 조직 과염소산 추출물의 SDS-PAGE 및 염소 항-CA11-19 다클론성 항체 컨쥬게이트 웨스턴(Conjugate Western) 블롯을 나타낸다. CODES 1, 2, 7, 8, 15, 23, 25, 27, 32, 38, 39, 41, 42, 45, 50은 정상 조직 과염소산 추출물이다. 패널 A 및 패널 B(도 2a 및 도 2b)는 ~50 종양 추출물의 초기 조사이다.
도 3는 세파로스 B(Sepharose B)에서 두 개의 별개의 대장 종양 세포 샘플의 과염소산 추출물의 분별을 나타낸다. 280 nm에서 각 샘플에 대한 흡광도는 (▲; ■)로 나타난다. 샘플 중 하나의 분획은 또한 ELISA 검정으로 평가되었다(◆).
도 4는 결장암 세포의 산성 추출물로부터 얻은 당단백질 100 kDa의 MALDI-MS에 의한 N-글리칸 프로파일링 방법을 나타낸다.
도 5a는 CA11-19 168B에서 관찰된 표적 당단백질 100 kDa 밴드 및 45 kDa에서 추가적인 밴드의 국소화를 나타낸다. 도 5b는 샘플 분석에 사용된 실제 겔의 사진을 나타낸다.
도 6a는 100 kDa 밴드의 MALDI-전체 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 6b는 45 kDa 밴드의 MALDI-전체 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 MALDI-MS에 의한 O-글리칸 프로파일링을 위해 샘플을 제조하는 방법을 나타낸다.
도 8은 겔 내(in-gel) 분해(digestion)를 위해 SDS-PAGE에 의해 분리된 CA11-19 168BNC 및 CA11-19 168BSTK를 나타낸다.
도 9는 두 샘플의 100 kDa 밴드로부터의 O-글리칸의 NSI-FTMS 스펙트럼을 나타낸다. A는 항원 샘플 NC에 대한 프로파일이다. B는 항원 샘플 STK에 대한 프로파일이다.
도 10에서 A는 m/z 936에서의 분자 이온의 MSMS 프로파일(NeuAc-HexNAc-HexNAc), 진단적 b 이온은 m/z 561, m/z 659, 및 m/z 677에서 상보적 y 이온과 함께, m/z 398에서 나타난다. B는 m/z 953에서의 분자 이온의 MSMS 프로파일(Hex-DHex-HexNAc2)(10B)이고, C는 m/z 1157에서의 분자 이온의 MSMS 프로파일(Hex2-DHex-HexNAc2)(10C)이다.
도 11은 168B로 지정된 100 kDa 항원으로, 항체 5E5-1 및 항체 5A1-1로 지정된 결장암 또는 간암 세포로부터 단리된 100 kDa 항원에 특이적인 단클론성 항체의 결합의 분석이다. 도 11a에서 혼합체 A: 5E5-1/168B의 분석은 항원 및 항체가 관찰된 MH+=92.879 kDa(168B-항원) 및 MH+=158.498 kDa(5E5-1 항체)로 검출되었다는 것을 보여준다; 도 11b에서 교차 결합 실험은 교차 결합 시약 K200과 함께 180분 인큐베이션 이후 완료되었다. 교차 결합 이후, MH+=258.945 kDa[5E5-1·B168] 및 MH+=354.164 kDa[5E5-1·2B168-두 개의 항원 결합]로 두 개의 추가적인 피크를 검출하였다. 도 11c는 컴플렉스 트래커(Complex Tracker) 소프트웨어를 사용하여, 대조군 및 교차 결합 스펙트럼을 중첩시켰다. 상기 중첩은 두 개의 비 공유결합 복합체 [5E5-1·B168] 및 [5E5-1·2B168]의 검출을 확인하였다.
도 12a는 혼합체 C(둘 다 단클론성 항체 + 항원): 5E5-1/5A1-1/168B의 분석은 항원 및 항체가 MH+=92.910 kDa(168B) 및 MH+=158.988 kDa(5E5, 5A1-1)로 검출되었다는 것을 나타냈다. 도 12b는 교차 결합 실험은 교차 결합 시약 K200과 함께 180분 인큐베이션 이후 완료되었다. 교차 결합 이후, MH+=260.155 kDa 및 MH+=356.012 kDa로 두 개의 추가적인 피크를 검출하였다. 도 12c는 컴플렉스 트래커(Complex Tracker) 소프트웨어를 사용하여, 대조군 및 교차 결합 스펙트럼을 중첩시켰다. 상기 중첩은 두 개의 비 공유결합 복합체 [5E5-1·B168] 및 [5E5-1·2B168]의 검출을 확인하였다.
도 13a는 트립신 펩타이드와의 경쟁 후, 항원 168B 상에서의 항체 5E5-1의 결합의 억제를 검출할 수 없었음을 나타낸 것이다. 도 13b는 경쟁 후, 두 개의 비 공유결합 복합체 [5E5-1·B168] 및 [5E5-1·2B168]을 관찰한 것이다. 도 13c는 컴플렉스 트래커(Complex Tracker) 소프트웨어를 사용하여, 대조군 및 교차 결합 스펙트럼을 중첩시킨 것이다. 상기 중첩은 두 개의 비 공유결합 복합체 [5E5-1·B168] 및 [5E5-1·2B168]의 검출을 확인하였다.
도 14는 168B 항원의 서열을 나타낸다. 트립신, 키모트립신 및 ASP-N 펩타이드의 중첩 맵핑은 서열의 85.6%를 커버하였다.
도 15는 항체 5E5-1에 의해 결합된 에피토프의 맵을 나타낸다. 볼드체의 아미노산은 항체 5E5-1 및 항원 168B 간의 잠재적인 접촉 지점을 나타낸다.
도 16은 항체 5A1-1에 의해 결합된 에피토프의 맵을 나타낸다. 볼드체의 아미노산은 항체 5A1-1 및 항원 168B 간의 잠재적인 접촉 지점을 나타낸다.
도 17은 항체 5E5-1의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. CDR 영역은 볼드체로 강조된다. CDR의 더 작은 한정은 밑줄 그어져 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 N 말단 서열은 이탤릭체로 식별된다.
도 18은 항체 5E5-1의 중쇄 및 경쇄의 핵산 서열을 나타낸다.
도 19는 항체 5A1-1의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. CDR 영역은 볼드체로 강조된다. CDR의 더 작은 한정은 밑줄 그어져 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 N 말단 서열은 이탤릭체로 식별된다.
도 20은 항체 5A1-1의 중쇄 및 경쇄의 핵산 서열을 나타낸다.
도 21은 혈청 또는 소변에서 CA11-19 항원을 검출하기 위한 측면 유동 테스트(lateral flow test)를 나타내는데, 대장(# 2) 및 폐(# 4 및 6) CA 환자에서는 + 선이 있고 정상 개체(# 1,3,5 및 7)에서는 + 선이 없는 것으로 나타났다.

본 명세서는 본원에서 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며 달라질 수 있다고 생각해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니며, 청구범위에 의해서만 한정된다.

본원 및 청구범위에서 사용된 단수형 "한(어떤)," "하나", 및 "상기(그)"는 문맥상 분명하게 달리 지시되지 않으면 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 어느 항체에 대한 지시대상은 하나 이상의 이러한 항체에 대한 지시대상이며, 당업자에게 공지된 이것들의 등가물을 포함한다. 작동 중인 예에서와 달리, 또는 달리 지시된 경우, 성분의 양 또는 본원에서 사용된 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 조정된 것으로 생각되어야 한다. 용어 "약"은 수치와 관련하여 사용될 때 ± 20%를 의미하고 퍼센트와 관련해서는 ±1%를 의미한다.

식별된 모든 특허 및 다른 간행물들은, 예를 들어 본 발명에 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에서 기술된 방법론을 기술하고 개시할 목적을 위해 명확하게 본원에 참고로 포함된다. 이 간행물들은 단지 본 출원의 출원일 이전에 그것들의 개시를 위해서만 제공된다. 이 점에 있어서, 본 발명자들이 선행 발명 덕분에 또는 어떤 다른 이유를 위해서 이러한 발명에 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 날짜에 관한 모든 기술 또는 이 문서들의 내용물에 관한 모든 표현은 본 출원에 이용 가능한 정보에 근거하고 이 문서들의 날짜 또는 내용물의 정확성에 관한 어떠한 인정도 성립되지 않는다.

달리 한정되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 가진다.

본 출원서에서 사용된 하기 용어들은 다음과 같은 의미를 가진다:

"에피토프"는 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 어떤 분자의 일부를 나타낸다(해당 항체의 결합 영역은 파라토프(paratope)로 불릴 수 있다). 일반적으로, 에피토프는 분자, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 군을 포함하고, 특이적인 3-차원 구조적 특성뿐 아니라 특이적인 전하 특성을 가진다.

"항원"은 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부이다. 항원은 하나 또는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 항원은 매우 선택적인 방식으로 해당 항체와 결합하지만 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 많은 다른 항체와는 결합하지 않을 것이다.

"항체"는 두 개의 온전한 면역글로불린 분자뿐 아니라 이것의 일부, 단편, 펩타이드 및 유도체, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, CDR 영역, 또는 항원이나 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 어느 일부 또는 펩타이드 서열을 포함한다. 항체는 분자와 특이적으로 반응하여 분자를 항체에 결합시킬 수 있으면 분자에 "결합할 수 있다"고 한다.

항체는 또한 어떤 공지된 기술, 예를 들어 효소적 분열, 펩타이드 합성, 파지 디스플레이, 또는 재조합 기술에 의해 제공되는 키메라 항체, 가용성 또는 결합된 형태로 라벨링될 수 있는 항체에 대한 항-유전자형(항-Id) 항체, 및 이것들의 단편, 일부, 영역, 펩타이드 또는 유도체를 포함한다. 항체 단편 또는 일부는 온전한 항체의 Fc 단편이 결핍될 수 있고, 순환에서 더 신속하게 제거될 수 있으며, 온전한 항체보다 더 적은 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다. 항체의 이러한 예들은 업계에 잘 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 파파인(Fab 단편을 생산하기 위해서) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생산하기 위해서)과 같은 효소를 이용한 단백질 가수분해 분열에 의해 온전한 항체로부터 생산될 수 있다(Wahl et al, 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983) 참조). 항체의 일부는 상기 방법들 중 어느 것에 의해서도 만들어질 수 있거나, 재조합 분자의 일부를 발현함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 재조합 항체의 CDR 영역(들)은 단리되어 적절한 발현 벡터로 서브클로닝될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 6,680,053 참조).

"단클론성 항체"는 매우 특이적인 인식 및 단일 항원 결정요인(에피토프)의 결합에 수반된 균질한 항체 집단을 말한다. 이것은 전형적으로 상이한 항원 결정요인에 대항하는 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체와 대조적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 및 전장 단클론성 항체, 뿐만 아니라 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(scFv) 돌연변이, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 어느 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 또한, "단클론성 항체"는 하이브리도마(hybridoma), 파지 선택, 재조합 발현, 및 트랜스제닉(transgenic) 동물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 방식으로 만들어진 항체를 말한다.

용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산되는 항체 또는 업계에 공지된 어떤 기술을 사용하여 만들어진, 인간에 의해 생산되는 항체에 해당하는 아미노산 서열을 가진 항체를 의미한다. 인간 항체는 온전한 또는 전장 항체, 이것의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체, 예를 들어 쥐 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다.

용어 "인간화 항체"는 특이적 면역글로불린 사슬, 키메라 면역글로불린, 또는 최소한의 비-인간(예를 들어, 쥐) 서열을 함유하는 이것의 단편인 비-인간(예를 들어, 쥐) 항체의 형태를 말한다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 가진 비-인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다(Jones et al, 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al, 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al, 1988, Science, 239: 1534-1536). 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 가진 비-인간 종의 항체에서 해당하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개량하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서 추가적인 잔기의 치환에 의해 더 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린에 해당하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역을 함유하는 적어도 하나, 및 전형적으로는 둘 또는 세 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하는 반면에 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하는데 사용된 방법의 예는 미국 특허 5,225,539에서 기술된다.

용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 둘 이상의 종으로부터 유래된 항체를 말한다. 전형적으로는, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 가진 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 등)의 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 해당하는 한편, 불변 영역은 상기 종에서 면역 반응의 유도를 방지하기 위해 또 다른 종(보통 인간)으로부터 유래된 항체의 서열에 상동성이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "알파-1-항키모트립신(alpha-1-antichymotrypsin)" 또는 "ACT"는 자연 발생하여 복합체를 형성하지 않은 폴리펩타이드로부터 유래된 것과 같은 아미노산 서열을 가지고 세린 프로테아제 억제 활성을 가진 폴리펩타이드를 말한다. ACT는 SERPINA3, AACT, 성장 억제 단백질 24(GIG24), 성장 억제 단백질 25(GIG25), 세포 성장 억제 유전자 24/25 단백질 및 세린 프로테이나제 억제제 클레이드(clade) A, 멤버 3로도 공지되어 있다. ACT의 대표적인 서열은 NP_001076/gI 50659080이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "암종 배아 항원(carcinoembryonic antigen)" 또는 "CEA"는 자연 발생한 폴리펩타이드와 같은 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드의 한 과를 말하며, 글리코실 포스파티딜 이노시톨 세포 표면 고정된 당단백질이다. CEA는 일반적으로 180 kDa의 분자량의 당단백질을 말하는 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "CEACAM5"는 암종 배아 항원 과의 멤버인 암종 배아 항원을 말한다. 글리코실화되지 않은 CEACAM5는 NP_004354;gI 98986445; Uniprot P06731-1에서 발견된 예시적 아미노산 서열을 가진다. CEACAM5의 아이소폼은 아미노산 위치 320에서 아미노산 결실을 가지고 서열 번호 1의 아미노산 서열(Uniprot P06731-2에서 발견된 예시적 서열)을 가진다. 글리코실화되지 않은 CEACAM5는 성숙형에서는 제거된 1-34의 신호 펩타이드, 35-685의 단백질, 및 아미노산 686-702를 함유한다. 단백질 내에서 아미노산 35-145(N 말단 Ig-1), 아미노산 146-237(A1 Ig-2), 아미노산 238-323(B1 Ig-3), 아미노산 324-415(A2 Ig-4), 아미노산 416-498(B2 Ig-5), 아미노산 502-593(A3 Ig-6) 및 아미노산 594-677(B3 Ig-7)에서 여러 도메인이 발견되었다. 아미노산 번호는 NP_004354;gI 98986445; Uniprot P06731-1에서 발견된 것을 말한다. 아미노산 번호는 아미노산 320의 결실로 인해 서열 번호 1의 아미노산 참조 서열로부터 한 번호씩 옮겨갈 것이다. CEACAM5의 도메인에 대한 항체는 Gold 에피토프 명칭, Gold 1-A3B3; Gold 2-A2B2; Gold 3-A3B3; Gold 4-A1B1; 및 Gold 5-N 말단으로서 특성화되었다. CEACAM5는 180 kDa의 분자량을 가지고 28개의 잠재적 N 글리코실화 부위를 가진 글리코실화된 형태로 생산될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "실질적으로 결합하지 않는다" 또는 "결합하지 않는다"는 교체 가능하게 사용될 수 있고 샘플 내 구성요소로의 항체의 결합으로부터 검출 가능한 신호가 무관한 폴리펩타이드 대조군, 예를 들어 소 혈청 알부민의 존재로 인해 발생된 신호의 하나 또는 두 개의 표준 편차 내에 있다는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 항체가 무관한 단백질을 포함하는 대안의 물질보다 에피토프 또는 단백질에 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 긴 기간 동안, 더 높은 친화도로, 또는 상기의 것들의 몇몇 조합으로 반응하거나 회합하는 것을 말한다. 예를 들어, 특이적으로 결합하는 샘플 내 구성요소로의 항체의 결합으로부터 검출 가능한 신호가 무관한 폴리펩타이드 대조군, 예를 들어 소 혈청 알부민의 존재로 인해 발생된 신호의 하나 또는 두 개의 표준 편차보다 더 크다는 것을 의미한다.

특정 구체예에서, "특이적으로 결합하다"는, 예를 들어 항체가 약 0.1 mM 이하, 구체적으로 약 1μM 미만의 KD로 단백질에 결합한다는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, "특이적으로 결합하다"는 항체가 약 0.1 μM 이하, 구체적으로 약 0.01 μM 이하의 KD로 단백질에 결합한다는 것을 의미한다. 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 모이어티는 제2 표적에 특이적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 이와 같이, "특이적 결합"은 반드시 독점적 결합, 즉 단일 표적으로의 결합을 필요로 하는 것은 아니다(그것이 포함할 수 있지만). 따라서, 특정 구체예에서, 항체는 하나 이상의 표적에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 항체는 이중 특이적일 수 있고 다른 특이성을 가진 적어도 두 개의 항원-결합 부위를 포함할 수 있다.

용어 "~를 포함하는"은 조성물, 화합물, 제형 또는 방법이 포함되고 추가적인 요소 또는 단계를 배제하지 않는 것을 말한다.

용어 "~로 구성된"은 화합물, 조성물, 제형 또는 방법 내에 어떤 추가적인 구성요소 또는 단계의 존재를 독점하는 것을 말한다.

용어 "본질적으로 ~로 구성된"은 조성물, 화합물, 제형 또는 방법의 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 추가적인 요소 또는 단계가 포함되는 것을 말한다.

용어 "단리된"은 혼합물에서의 적어도 하나의 다른 물질 또는 물질과 자연적으로 회합되는 물질로부터의 물질의 분리를 말한다.

용어 "환자" 또는 "대상체"는 교체 가능하게 사용되고 동물계(Kingdom Animalia)의 어떠한 멤버를 말할 수 있다. 바람직하게는 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간, 길들여진 포유동물 또는 가축 포유동물이다.

용어 "약학적으로 허용 가능한"은, 적절한 의학적 판단의 범위 내에서, 타당한 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉한 채로 사용에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투약 형태를 말한다.

용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 한 기관 또는 신체의 일부에서 다른 기관 또는 신체의 일부로의 화합물 또는 유사체 또는 유도체를 운반하거나 수송하는데 수반되는 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 필러, 희석제, 부형제, 용제 또는 캡슐화 물질을 말한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 호환성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 역할을 할 수 있는 물질의 몇몇 예는 (1) 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 그것의 유도체, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트래거캔스(tragacanth); (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스터, 예를 들어 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어 마그네슘 하이드록시드 및 알루미늄 하이드록시드; (15) 알긴산; (16) 무발열원 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액(Ringer's solution); (19) 에틸 알콜; (20) 포스페이트 버퍼 용액; 및 (21) 약학적 제형에서 이용되는 다른 비-독성 호환성 물질을 포함한다.

용어 "정제된", "정제하기 위해" 또는 "실질적으로 정제된"은 조성물의 10% 이하(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하)는 활성 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 담체가 아닌 정도로 조성물로부터의 비활성 또는 억제 구성요소(예를 들어, 오염물질)의 제거를 말한다.

본원에서 사용된 용어 "질환에 걸릴 위험이 있는"(예를 들어, 암 등에 걸릴 위험이 있는)은 대상체(예를 들어, 인간)가 특정 질환(예를 들어, 암 등)에 걸리는데 취약한 것을 말한다. 이러한 성향은 유전적일 수 있고(예를 들어, 유전적 장애와 같은 질환에 걸리기 쉬운 특정 유전적 성향), 또는 다른 인자(예를 들어, 고혈압, 나이, 체중, 환경 조건, 환경에 존재하는 해로운 화합물에 노출 등)로 인한 것일 수 있다.

면역원성 조성물

본 명세서는 막 결합성 및 가용성 형태(예를 들어, 암세포막 결합된 형태)를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지고, ACT에 특이적인 항체에 실질적으로 결합하지 않는 100 kDa 당단백질을 포함하는 분자량을 가진 구성요소를 가진 대장암 및/또는 간암 세포 샘플로부터 단리된 분획을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 구체예에서, 면역원성 조성물은 중량 당 기준으로 상당한 양의 ACT, 예를 들어 10% 이하의 단백질을 포함하지 않는다. 구체예에서, 면역원성 조성물은 막 결합된 형태의 100 kDa 당단백질의 가용성 형태를 포함한다.

구체예에서, 면역원성 조성물 및/또는 단리된 분획은 대장 및/또는 간 암 세포를 산과 접촉시켜 추출물을 형성하는 단계; 추출물의 구성요소를 분자량에 따라 분리시켜 약 60 kDa 이상의 분자량을 가진 구성요소를 가진 제1 분획을 형성하는 단계; 약 75 kDa 이상 약 200 kDa 미만의 분자량을 가지는 제1 분획의 구성요소를 단리시키는 단계; 및 100 kDa 단백질을 추가로 단리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진다. 구체예에서, 산은 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리브롬산, 트리플루오르산, 나트륨 트리클로로아세테이트, 염산 및 과염소산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 구체예에서, 산의 농도는 약 1 내지 약 50%의 범위에 있다. 구체예에서, 구성요소는 겔 여과에 의해 분리된다. 구체예에서, 겔 여과 매질은 세파로스(Sepharose) 및 수퍼덱스(Superdex) 겔 여과 매질로 구성된 군으로부터 선택된다.

구체예에서, 면역원성 조성물은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지는 100 kDa 당단백질을 포함한다. 구체예에서, 100 kDa 당단백질은 서열 번호 1의 아미노산 1-34의 선도 서열을 포함하지 않는 서열을 가진다. 본 명세서의 범위를 제한하려는 의미는 아니지만 100 kDa 당단백질은 180 kDa CEA와 비교하여 위치 320에서 아미노산의 결실 및 변화된 글리코실화를 가지는 CEACAM5의 형태인 것으로 생각된다.

면역원성 조성물은 선택적으로 보조제와 조합된다. 항원의 면역원성 유효량은 면역 반응을 자극하는 양이다. 면역원성 유효량은 면역화에 사용된 동물을 기반으로 하여 결정될 수 있다. 보조제는 명반, 무라밀 펩타이드, 모노포스포릴 지질 a, 리포솜, 불완전 프로인트 보조제(incomplete Freunds' adjuvant) 및 완전 프로인트 보조제를 포함한다.

전형적인 면역화 프로토콜은 동물, 예를 들어 마우스, 염소, 양 또는 영장류에 면역원성 조성물을 주사하는 단계를 수반한다. 최초 면역화 후 약 2주에 적어도 하나의 부스터(booster)가 투여된다.

또는, 면역원성 조성물은 고체 기질에 부착되어 동물 모델에서 또는 파지 디스플레이에 의해 생산된 항체에 결합하는데 사용될 수 있다. 고체 표면은 막, 멀티웰 플레이트, 크로마토그래피 매질, 유리 슬라이드, 라텍스 비드, 자성 비드, 마이크로어레이 칩, 모세관 및 칩을 포함한다. 또한, 면역원성 조성물은 신호 발생 요소로 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 이러한 라벨은 형광 마커, 비오틴, 효소, 방사성 라벨 등을 포함한다.

항체

본 명세서는 새로운 항체, 상기 항체의 생산 방법, 및 상기 항체를 이용하는 진단적 및 치료적 방법을 제공한다.

구체예에서, 항체는 특이적으로 대장암 막 결합성 및 가용성 형태를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지고, 180 kDa 글리코실화된 CEA 및/또는 ACT에 실질적으로 결합하지 않는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합한다. 구체예에서, 항체는 특히 폐 및/또는 결장의 인간 암 세포로의 결합에 대하여 더 스크리닝된다. 항체는 특정 암(예를 들어, 고체 종양)에 반응하도록 선택되는 한편 본질적으로 정상 인간 조직 또는 다른 유형의 종양, 예를 들어 림프종(lymphoma)과 반응성을 나타내지 않는다.

구체예에서, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180 kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고 및/또는 서열 번호 2의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 110 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는다. 구체예에서, 항체는 대장암 세포와 반응하도록 추가로 선택된다.

구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 입체구조적 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 61-69(HLFGYSWYK; 서열 번호 6), 73-77(VDGNR;서열 번호 7) 또는 69-82 KGERVDGNRQIIGY(서열 번호 8), 및 96-107(SGREI IYPNASL;서열 번호 9)을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 구성되거나, 이것들로 구성되는 에피토프에 특이적으로 결합하고 및/또는 상기 에피토프로의 결합에 대하여 경쟁한다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 61-69(서열 번호 6), 78-98(QII GYVIGTQQAT PGPAYSGR;서열 번호 10), 96-107(서열 번호 9) 및 127-139(SDLVNEEATGQFR;서열 번호 11)를 포함하거나, 본질적으로 이것들로 구성되거나, 이것들로 구성되는 에피토프에 결합한다. 구체예에서, 입체구조적 에피토프는 글리코실화를 보유한다.

항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 40-101로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 선형 펩타이드 중 하나 이상에 실질적으로 결합하지 않는다.

구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 아미노산 146-237(A1 Ig-2), 아미노산 238-322(B1 Ig-3), 아미노산 324-415(A2 Ig-4), 아미노산 416-498(B2 Ig-5), 아미노산 502-593(A3 Ig-6) 및 아미노산 594-677(B3 Ig-7)로 구성된 군으로부터 선택된 CEACAM5의 하나 또는 모든 다른 도메인에서 에피토프에 실질적으로 결합하지 않는다.

구체예에서, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEA, CEACAM6(NCA) 또는 글리코실화되지 않은 CEACAM5에 실질적으로 결합하지 않고 및/또는 서열 번호 2의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드, 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 선도 서열을 포함하는 아미노산 1-32의 펩타이드(서열 번호 35), 선도 서열이 없는 아미노산 1-32의 펩타이드(서열 번호 36), 아미노산 42-60의 펩타이드(서열 번호 37), 선도 서열을 가지는 아미노산 117-127의 펩타이드(서열 번호 38), 선도 서열을 가지는 아미노산 117-127의 펩타이드(서열 번호 39), 및 이것들의 조합으로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는다.

구체예에서, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고 다음을 포함한다: (a) 서열 번호 119 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 (b) 서열 번호 120 및 서열 번호 122로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3).

다른 구체예에서, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호 15/16/17, 14/16/17, 18/20/21 및 서열 번호 19/20/21로 구성된 군으로부터 선택된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 b) 서열 번호 26/27/28 및 서열 번호 31/32/33로 구성된 군으로부터 선택된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3.

다른 구체예에서, 단리된 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호 119의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 120의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는 (b) 서열 번호 121의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역.

항체는 어떤 공지된 기술(제한되는 것은 아님), 예를 들어 효소적 분열, 펩타이드 합성, 파지 디스플레이 또는 재조합 기술에 의해 제공되는 단클론성, 다클론성, 인간, 인간화, 키메라 항체, 가용성 또는 결합된 형태로 라벨링될 수 있는 항체에 대한 항-유전자형(항-Id) 항체, 및 이것들의 단편, 일부, 영역, 펩타이드 또는 유도체를 포함한다.

항체 단편 또는 일부, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, CDR 영역, 또는 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 어떠한 일부 또는 펩타이드 서열은 온전한 항체의 Fc 단편이 결핍될 수 있고, 순환으로부터 더 신속하게 제거되고, 온전한 항체보다 더 적은 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다. 항체 단편은 업계에 잘 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 파파인 (Fab 단편을 생산하기 위해) 또는 펩신 (F(ab')2 단편을 생산하기 위해)과 같은 효소를 이용하는 단백질 가수분해 분열에 의해 온전한 항체로부터 생산될 수 있다(Wahl et al, 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983) 참조). 항체의 일부는 상기 방법 중 어느 것에 의해서도 만들어질 수 있거나, 재조합 분자의 일부를 발현함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 재조합 항체의 CDR 영역(들)은 단리되어 적절한 발현 벡터로 서브클로닝될 수 있다(미국 특허 6,680,053 참조).

다클론성 항체는 어떤 공지된 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 다클론성 항체는 안정한 에멀젼을 형성하기 위해 멸균 식염수에 희석되고 보조제(예를 들어, 완전 또는 불완전 프로인트 보조제)와 조합된 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH), 혈청 알부민 등에 선택적으로 컨쥬게이션된 적절한 항원(정제된 펩타이드 단편, 전장 재조합 단백질, 융합 단백질 등)의 다회수 피하 또는 복강 내 주사에 의해 동물(예를 들어, 토끼, 염소, 래트, 마우스, 당나귀 등)을 면역화함으로써 발생한다. 다클론성 항체는 이렇게 면역화된 동물의 혈액, 복수 등으로부터 회수된다.

수거된 혈액은 응고되고, 혈청은 디캔팅되고(decant), 원심분리에 의해 정화되고, 항체 역가에 대하여 분석된다. 다클론성 항체는 친화도 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등을 포함하는 업계의 표준 방법에 따라 혈청 또는 복수로부터 정제될 수 있다.

본 명세서의 단클론성 항체는 하이브리도마 융합 기술에 의해 제조될 수 있다(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Brown et al, J. Immunol, 127 (2):539-46 (1981); and Yeh et al, Int. J. Cancer, 29:269-75 (1982) 참조). 이 기술은 동물에서 원하는 면역 반응(즉, 항체의 생산)을 유도하기 위해 동물(예를 들어, 마우스)에의 면역원(예를 들어, 정제된 항원 또는 항원을 가지고 있는 세포 또는 세포 추출물)의 주사를 수반한다. 면역원성 조성물은, 예를 들어 마우스에 주사되고, 충분한 시간이 지난 후 마우스가 희생되고 체세포 항체-생산 림프구가 얻어진다. 항체-생산 세포는 준비된 동물의 림프절, 비장 및 말초 혈액으로부터 유래될 수 있다. 비장 세포가 바람직하다. 마우스 림프구는 하기 기술된 마우스 골수종(myeloma)을 이용하여 더 높은 퍼센트의 안정한 융합을 제공한다. 래트, 토끼 및 개구리 체세포의 사용이 또한 가능하다. 원하는 면역글로불린을 암호화하는 비장 세포 염색체는 일반적으로 융제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 존재시 비장 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써 불멸화된다. 많은 골수종 세포주, 예를 들어 P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/0-Agl4 골수종 라인 중 어느 것도 표준 기술에 따라 융합 파트너로 사용될 수 있다. 이 골수종 라인은 American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md로부터 이용 가능하다.

원하는 하이브리도마를 포함하는 세포는 선택 배지, 예를 들어 HAT 배지에서 키워지며, 여기에서 융합되지 않은 모체 골수종 또는 림프구 세포는 결국 죽는다. 단지 하이브리도마 세포만이 생존하고 한계 희석 조건 하에 키워져서 단리된 클론을 얻을 수 있다. 하이브리도마의 상층액은, 예를 들어 면역화에 사용된 항원을 사용하는 면역검정 기술에 의해 원하는 특이성의 항체의 존재에 대하여 스크리닝된다. 양성 클론은 한계 희석 조건 하에서 서브클로닝될 수 있고, 생산된 단클론성 항체가 단리될 수 있다. 다른 단백질 및 다른 오염물질로부터 단클론성 항체를 해방시키기 위해 단클론성 항체의 단리 및 정제를 위한 다양한 통상적인 방법이 존재한다. 단클론성 항체를 정제하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 암모늄 설페이트 침전, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피를 포함한다(Zola et al., in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell (ed.) pp. 51-52 (CRC Press 1982) 참조). 이러한 방법들에 따라 생산된 하이브리도마는 업계에 공지된 기술을 사용하여 시험관 내에서 또는 생체 내에서(복수액에서) 증식될 수 있다(Fink et al, supra, 페이지 123, 도 6-1 참조).

일반적으로, 개개의 세포주는 시험관 내에서, 예를 들어 실험실 배양 용기에서 증식될 수 있고, 고농도 단일 특이적 단클론성 항체를 함유하는 배양 배지는 디캔테이션(decantation), 여과 또는 원심분리에 의해 수확될 수 있다. 또는, 단클론성 항체의 수율은 하이브리도마의 샘플을 원래의 융합을 위해 체세포 및 골수종 세포를 제공하는데 사용된 유형의 조직 호환성 동물에 주사함으로써 향상될 수 있다.

또는, 단클론성 항체는 또한 미국 특허 4,816,567에서 기술된 바와 같이 재조합 DNA 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 단클론성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 RT-PCR에 의해 성숙한 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리되고, 그것들의 서열은 통상적인 과정을 사용하여 결정된다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 벡터로 클로닝되며, 숙주 세포, 예를 들어 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포, 대장균(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로 트랜스펙션될 때, 단클론성 항체는 숙주 세포에 의해 생성된다. 또한, 원하는 종의 재조합 단클론성 항체 또는 이것의 단편은 기술된 바와 같이 원하는 종의 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다(McCafferty et al, 1990, Nature, 348:552-554; 및 Marks et al, 1991, J. Mol. Biol, 222:581-597 참조).

단클론성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)는 대안의 항체를 생성하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용하는 많은 다른 방식으로 추가 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 마우스 단클론성 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은 1) 키메라 항체를 생성하기 위해 인간 항체의 상기 영역에 대하여 또는 2) 융합 항체를 생성하기 위해 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대하여 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 단클론성 항체의 원하는 항체 단편을 생성하기 위해 절단되거나 제거된다. 가변 영역의 부위-관련 또는 고밀도 돌연변이 생성은 단클론성 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화하는데 사용될 수 있다.

인간 또는 인간화 항체는 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 직접 제조될 수 있다. 시험관 내에서 면역화된 또는 표적 항원에 대항하는 항체를 생산하는 면역화된 개체로부터 단리된 불멸화된 인간 B 림프구가 생성될 수 있다(미국 특허 5,750,373 참조). 인간 항체는 또한 면역화 시 내인성 면역글로불린의 부재에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 만들어질 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에서 기술된다. 인간화 항체를 생성하는데 사용된 방법의 예는 미국 특허 5,225,539에서 기술된다.

항체는, 예를 들어 Vaughan et al, 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381, 및 Marks et al, 1991, J. Mol. Biol, 222:581에서 기술된 바와 같이, 파지 라이브러리로부터 제조되고 선택될 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 사용을 위한 기술은 또한 미국 특허 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404에서 기술된다(이것들 각각은 그 전문이 참고로서 본원에 포함된다). 친화도 성숙화 전략 및 사슬 셔플링(shuffling) 전략(Marks et al, 1992, Bio/Technology 10:779-783, 그 전문이 참고로 본원에 포함됨)은 업계에 공지되어 있고 고친화도 인간 항체를 생성하는데 이용될 수 있다.

구체예에서, 본원에서 기술된 특이성의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 19 및 20에 제시된다. 본원에서 기술된 항체의 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열 번호 12 또는 서열 번호 24의 핵산 서열을 포함한다. 본원에서 기술된 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열 번호 25 또는 서열 번호 30의 핵산 서열을 포함한다. 구체예에서, 본 명세서는 서열 번호 12 또는 서열 번호 24 및/또는 서열 번호 25 또는 서열 번호 30의 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 포함한다.

원하는 결합 특이성에 대한 항체의 스크리닝은 표준 방법에 따라 실시된다. 구체예에서, 항체는 대장암 막 결합성 및 가용성 형태를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합한다. 구체예에서, 항체는 또한 100 kDa 당단백질으로의 결합에 대해서는 스크리닝되지만, 180 kDa CEA 및/또는 ACT로의 실질적인 결합에 대해서는 스크리닝되지 않는다. 구체예에서, a) 대장 및/또는 간 암 세포를 산과 접촉시켜 추출물을 형성하는 단계; b) 추출물의 구성요소를 분자량에 따라 분리시켜 약 60 kDa 이상의 분자량을 가진 구성요소를 가진 제1 분획을 형성하는 단계; c) 약 75 kDa 이상 및 약 200 kDa 미만의 분자량을 가지는 제1 분획의 구성요소를 단리시키는 단계, 및 d) 100 kDa 분획을 단리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 암세포 추출물에 결합하는 항체가 단리된다.

일부 구체예에서, 항체는 같은 조직 유형의 정상 조직과 비교하여 암의 조직 샘플에 결합하는 능력에 대하여 추가로 스크리닝된다. 구체예에서, 항체는 결장 또는 폐 종양 세포로의 결합에 대하여 및 건강한 조직, 예를 들어 결장, 또는 폐 조직으로의 결합의 결핍에 대하여 추가로 스크리닝된다. 다른 구체예에서, 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지는 100 kDa 당단백질로의 결합에 대하여 선택적으로 스크리닝된다.

본 명세서는 본원에서 기술된 항체 및 항체의 활성 결합 영역을 함유하는 이것의 어떤 단편, 예를 들어 Fab, F(ab) 2 및 Fv 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 단편은 업계에서 잘 확립되어 있는 기술을 사용하여 항체로부터 생산될 수 있다(Rousseaux et al, in Methods EnzymoL, 121:663-69, Academic Press (1986) 참조).

또한, 본 명세서의 일부 구체예는 항체와 같은 에피토프에 결합하고 및/또는 그 부위에서의 결합에 대하여 항체와 경쟁하는 항체를 포함한다. 이것들은 본원에서 기술된 서열 번호 1의 서열을 가지고, 본원에서 기술된 CEACAM5의 다른 선형 에피토프에 실질적으로 결합하지 않는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 에피토프 특이성을 가진 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서의 항체의 클래스, 아이소타입(isotype) 및 다른 변이는 업계에 공지된 재조합 클래스-스위칭(class-switching) 및 융합 기술을 사용하여 구성될 수 있다(Thammana et al, Eur. J. Immunol, 13:614 (1983); Spira et al, J. Immunol. Meth., 74:307-15 (1984); Neuberger et al, Nature, 312:604-08 (1984); 및 Oi et al., 상동 참조). 따라서, 항체와 같은 결합 특이성을 가진 키메라 항체 또는 다른 재조합 항체(예를 들어, 림포카인과 같은 제2 단백질에 융합된 항체)는 본 명세서의 범위 내에 있다.

또한, 대장암 막 결합성 및 가용성 형태를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지고, 180 kDa CEA 및/또는 ACT에 실질적으로 결합하지 않는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 항-유전자형 항체가 본 명세서의 범위 내에 포함된다. 이 항-유전자형 항체는 면역원으로서 항체를 사용하여 생산될 수 있고 환자에서 항-종양 반응을 유도하기 위해서, 종양에 대한 체액 반응을 검출하는데 있어서 및 치료적 적용에서, 예를 들어 백신에서 진단 목적을 위해 유용하다(Nepom et al, Cancer And Metastasis Reviews, 6:487-501 (1987); 및 Lee et al, Proc. Nafl. Acad. Sci. (USA), 82:6286-90 (1985) 참조).

인간 단클론성 항체는 시험관 내에서 항원에 대한 인간 림프구를 민감화 하기 위해서 본 발명의 100 kDa 항원을 사용한 후, Borrebaeck et al.에 의해 기술된 바와 같이 항원-민감화된 림프구의 EBV-형질전환 또는 마우스 또는 인간 림프구와 항원-민감화된 림프구와의 잡종형성(hybridization)을 수행함으로써 만들어질 수 있다(Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 85:3995-99 (1988) 참조). 따라서, 100 kDa 항원에 결합하는 인간 단클론성 항체 또는 키메라 항체가 또한 본 명세서의 범위 내에 포함된다.

방법

본 명세서는 암, 예를 들어 결장암 또는 폐암에 걸린 환자의 스크리닝, 진단, 및 치료 모니터링 방법을 제공한다.

구체예에서, 방법은 인간 조직 또는 유체 샘플에서, 대장암 막 결합성 및 가용성 형태를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지며, 및 180 kDa CEA 및/또는 ACT에 실질적으로 결합하지 않는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 조합하는 단계; 및 샘플에서 100 kDa 당단백질 항원와 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 검출된 100 kDa 당단백질의 존재 또는 양은 암이 없는 대조군 샘플과 비교하여 암의 존재 또는 위험을 나타낸다. 구체예에서, 샘플에서의 100 kDa 당단백질 양은 암에 걸리지 않은 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 증가된다. 구체예에서, 약 6.5 유닛/mL 이상의 100 kDa 당단백질을 가진 대상체는 대장암 또는 관상선종(tubular adenoma)에 대하여 증가된 위험이 있다.

구체예에서, 대상체의 샘플은 혈액 또는 혈청 샘플이고 면역검정은 병기 1 결장 암종 및/또는 관상선종의 위험 또는 존재를 검출할 수 있다. 구체예에서, 검정은 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 및 70 내지 100%의 어떤 숫자의 민감도 및/또는 특이성으로 이 질병들을 검출한다.

한 양태에서, 면역검정은 본원에서 기술된 바와 같이 항체 중 어느 것의 하나 이상을 포함한다. 구체예에서, 대상체가 대장암에 걸릴 위험이 있는지를 결정하기 위한 면역검정은 a) 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 대상체의 인간 조직 또는 유체 샘플과 조합하는 단계(항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고 서열 번호 2의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는다); 및 b) 인간 조직 또는 유체에서 항체 항원 복합체의 양을 결정함으로써 항원의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 고체 기질에 부착된 캡쳐 항체이다. 구체예에서, 항체는 검출 가능하게 라벨링된다. 구체예에서, 하나 이상의 캡쳐 항체가 이용될 수 있다.

다른 구체예에서, 면역검정은 a) 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고 서열 번호 2의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 110 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는 제2 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 대상체의 인간 조직 또는 유체 샘플과 조합하는 단계; 및 b) 인간 조직 또는 유체에서 항체 항원 복합체의 양을 결정함으로써 항원의 양을 결정하는 단계를 더 포함한다. 구체예에서, 제2 항체는 단클론성 항체이다. 다른 구체예에서, 제2 항체는 고체 기질에 부착된 캡쳐 항체이다. 구체예에서, 상기 항체는 검출 가능하게 라벨링된다.

구체예에서, 면역검정에서의 항체의 쌍은 본원에서 기술된 바와 같이 CEACAM5의 N 말단 도메인(서열 번호 5)에서 에피토프에 결합하고 CEACAM5의 다른 도메인에서 에피토프에 결합하지 않으며, 캡쳐 항체로서 사용된다. 구체예에서, 면역검정은 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 추가적인 항체를 더 포함한다. 구체예에서, 추가적인 항체는 검출 가능하게 라벨링된다. 구체예에서, 추가적인 항체는 다클론성 항체이다.

구체예에서, 검출 가능한 라벨은 방사성 핵종, 효소, 형광 약제, 콜로이드 금, 및 발색단을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

구체예에서, 검정은 케어 검정의 포인트이다. 구체예에서, 케어 검정의 포인트는 측면 유동 검정이다. 측면 유동 검정은 샌드위치 검정 또는 경쟁적 검정일 수 있다. 구체예에서, 제1 항체는 고체 표면의 일부에 침착되고, 컨쥬게이트 패드로 불릴 수 있다. 제1 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 제1 항체는 콜로이드 금, 형광 약제 또는 발색단으로 검출 가능하게 라벨링될 수 있다. 제1 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합한다. 구체예에서, 제1 항체는 다클론성 항체이다. 구체예에서, 하나 또는 하나 이상의 추가적인 항체는 테스트 선 또는 대조군 선을 형성하도록 캡쳐 항체로서 고체 기질에 침착된다. 추가적인 항체는 테스트 라인을 형성하도록 본원에서 기술된 바와 같이 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 단클론성 및/또는 다클론성 항체를 포함한다. 구체예에서, 하나 이상의 캡쳐 단클론성 항체가 이용된다. 다른 구체예에서, 항체는, 예를 들어 대조군 선을 형성하도록 IgG에 결합하는 대조군 항체이다. 구체예에서, 고체 표면은 니트로셀룰로스 막이다. 구체예에서, 테스트라인에 침착된 물질의 양은 샘플에서의 테스트 항원의 정량적 또는 반정량적 양을 제공하기 위해 판독기에 의해 판독될 수 있다.

구체예에서, 본 명세서의 방법은 대상체에 대한 스크리닝 방법을 수반한다. 대상체는, 예를 들어 일상적인 검진의 일부로서 건강 관리 시설을 방문할 수 있고, 샘플은 대상체로부터 얻어진다. 샘플은 본원에서 기술된 방법에 따라 100 kDa 당단백질의 존재에 대하여 스크리닝된다. 샘플에서 대조군과 비교하여 100 kDa 당단백질의 증가가 보이는 경우 또는 항원의 존재 또는 양이 사전 결정된 컷오프 값을 초과하는 경우, 의료계 종사자는 대상체에게 추가의 암 스크리닝을 지시한다.

구체적인 예에서, 대상체는 매년 신체검사를 받고 혈액 샘플 및/또는 소변 샘플이 채취된다. 혈액 샘플은 100 kDa 당단백질의 존재 또는 양에 대하여 본원에서 기술된 바와 같이 키트 및 방법에 따라 테스트된다. 샘플에서 검출된 100 kDa 항원의 양이 대조군과 비교하여 약 6.5 유닛/mL 이상인 경우, 의료계 종사자는 일상적인 스크리닝을 실시하기 위한 권장 시간 동안 기다리는 대신에 대상체에게 추가의 암 스크리닝, 예를 들어 대장내시경 검사를 지시한다. 이에 더하여, 의료계 종사자는 대상체에게 단독으로 또는 다른 생체마커 테스트와 함께 더 특이적 진단 방법, 예를 들어 생검, CT 스캔, MRI, PET 스캔을 지시할 수 있다.

구체예에서, 본원에서 기술된 면역검정 방법은 95% 민감도로 대장암의 병기 I(조직학적으로 확인된 최초 단계)을 식별한다. 다른 구체예에서, 면역검정은 또한 제거되지 않으면 암이 될 가능성이 큰 관상선종 폴립(polyp)의 60% 이상을 식별한다. 구체예에서, 면역검정에서 항체는 적어도 70% 내지 100%의 민감도 및 적어도 70% 내지 100%의 특이성으로 관상선종 또는 병기 I 대장암을 검출하기 위한 면역검정을 제공하기 위해 선택되거나 변형된다.

구체예에서, 본 명세서의 방법은 a) 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 대상체의 인간 조직 또는 유체 샘플과 조합함으로써(항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고 서열 번호 2의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는다); 및 b) 항체 항원 복합체의 양의 결정에 의해 인간 조직 또는 유체에서 항원의 양을 결정함으로써 암에 걸린 환자의 치료 효능에 대하여 모니터링하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 치료의 시작시 값과 비교하여 검출된 항원의 존재 또는 양의 감소는 암 치료의 효능을 나타낸다. 구체예에서, 암은 결장암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 구체예에서, 치료는 적어도 20% 이상의 100 kDa 항원의 양의 감소를 초래하는 경우 효과적인 것으로 식별된다. 구체예에서, 치료의 시작시 값은 약 6.5 유닛/mL 이상이다.

구체예에서, 본원에서 기술된 방법에서 사용되는 면역검정 키트가 제공된다. 일부 구체예에서, 면역검정 키트는 a) 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고 서열 번호 2의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 110 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는 제1 및/또는 제2 항체; b) 신호 발생 요소로 라벨링된, 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 추가적인 항체; 및 c) 캘리브레이터를 포함한다.

구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 입체구조적 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 61-69(서열 번호 6), 73-77(서열 번호 7), 또는 69-82 KGERVDGNRQIIGY(서열 번호 8), 및 96-107(서열 번호 9)을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 및/또는 이것으로의 결합에 대하여 경쟁한다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 61-69(서열 번호 6), 78-98(서열 번호 10), 96-107(서열 번호 9), 및 127-139(서열 번호 11)를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.

구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 아미노산 146-237(A1 Ig-2), 아미노산 238-322(B1 Ig-3), 아미노산 324-415(A2 Ig-4), 아미노산 416-498(B2 Ig-5), 아미노산 502-593(A3 Ig-6), 아미노산 594-677(B3 Ig-7)로 구성된 군으로부터 선택되는 CEACAM5의 하나의 또는 모든 다른 도메인에서 에피토프에 실질적으로 결합하지 않는다. 아미노산 번호는 아미노산 320의 결실로 인해 서열 번호 1로부터 한 번호씩 옮겨갈 것이다. 구체예에서, 제1 및/또는 제2 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 에피토프 특이성을 가진 단클론성 항체이고, 추가적인 항체는 많은 다른 에피토프에 결합하는 다클론성 항체이다. 구체예에서, 다른 에피토프 특이성을 가진 하나 이상의 단클론성 항체가 캡쳐 항체로서 사용된다.

구체예에서, 제1 및 제2 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 CDR 및/또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 검출 가능한 판독기 상에서 샘플에서의 100 kDa 당단백질의 존재 또는 양을 디스플레이하는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 샘플에서의 100 kDa 당단백질의 존재 또는 양 및/또는 암의 존재 또는 부재를 의료계 종사자에게 전달하는 단계를 더 포함한다. 구체예에서, 암은 결장암 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 구체예에서, 샘플은 생검, 혈청 또는 혈액 샘플의 것이다. 구체예에서, 검출 가능하게 라벨링된 항체는 암을 식별하기 위해 생체 내로 투여된다. 구체예에서, 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 중쇄 및/또는 경쇄 CDR을 포함하는 인간 또는 인간화 항체이다.

구체예에서, 면역검정은 적어도 두 개의 캡쳐 항체 및 하나의 검출 가능하게 라벨링된 검출 항체를 포함한다. 구체예에서, 적어도 두 개의 캡쳐 항체는 단클론성 항체이다. 구체예에서, 단클론성 항체는 유사한 또는 다른 에피토프에 결합한다. 구체예에서, 적어도 하나의 항체가 서열 번호 1의 아미노산 61-69(서열 번호 6), 73-77(서열 번호 7), 또는 69-82 KGERVDGNRQIIGY(서열 번호 8), 및 96-107(서열 번호 9)을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 구성되거나, 또는 이것들로 구성되는 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 61-69(서열 번호 6), 78-98(서열 번호 10), 96-107(서열 번호 9), 및 127-139(서열 번호 11)를 포함하거나, 본질적으로 이것들로 구성되거나, 또는 이것들로 구성되는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 구체예에서, 항체는 서열 번호 119 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 서열 번호 120 및 서열 번호 122로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함한다. 구체예에서, 캡쳐 항체는 5A1-1 또는 5E5-1로 지정된 항체이다. 구체예에서, 캡쳐 항체는 테스트 스트립의 고체 표면에 침착된다. 구체예에서, 검출 가능하게 라벨링된 검출 항체는 다클론성 항체이다. 구체예에서, 검출 항체는 컨쥬게이트 패드 상에서 고체 표면에 침착된다.

구체예에서, 검출 가능한 판독기는 검출 가능하게 라벨링된 항체의 신호를 수치로 전환할 수 있다. 이용된 검출 가능한 판독기는 면역검정에서 이용된 라벨에 의존적이다. 예를 들어, 형광 라벨 또는 형광 라벨로 라벨링된 기질을 전환하는 효소로 라벨링된 항체에 대하여, 검출 가능한 판독기는 분광 형광계이다. 다른 구체예에서, 검출 가능한 판독기는 방사성 라벨을 검출한다. 구체예에서, 검출 가능한 판독기는 디스플레이 및/또는 프린터를 포함한다. 리더는 수치를 제공하기 위해 자동적으로 배경을 고려하고 적절한 캘리브레이터를 기반으로 하는 표준 곡선을 사용하는 소프트웨어를 포함할 수 있다. 구체예에서, 수치는 무선 네트워크를 포함하는 네트워크를 통해 의료계 종사자에게 전달된다.

본 발명의 방법 및 키트는 케어 검정의 포인트로서 유용하다. 상기 방법 및 검정은 본원에서 기술된 바와 같이 다른 암 스크리닝 방법, 예를 들어 대장내시경 검사, 폐 이미징, 생검, PET 스캔, 자기 공명 이미징, CT 스캔 및 암과 관련된 다른 생체마커에 대한 검정과 함께 사용될 수 있다.

구체예에서, 본원에서 기술된 바와 같이 암에 걸린 환자의 조직, 소변 또는 혈청 샘플에서 적어도 70% 내지 100%의 특이성 및/또는 민감도로 100 kDa 당단백질의 존재 또는 부재를 검출할 수 있는 면역검정을 제공하기 위해 하나 이상의 항체가 선택된다. 구체예에서, 제1 항체 및/또는 제2 항체는 단클론성 항체이다. 구체예에서, 추가적인 항체는 다클론성 항체이다.

구체예에서, 면역검정에서 인간 조직 또는 체액 샘플에서 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 항체 쌍을 형성하기 위해 적어도 두 개의 항체가 선택된다. 구체예에서, 100 kDa 당단백질에 결합하는 항체는 단백질 상의 같은 에피토프 또는 다른 에피토프에 결합할 수 있다.

면역조직학적 기술은 생물학적 표본, 예를 들어 종양 조직 표본을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계 및 항원과 복합체를 형성한 항체의 표본 상에서 그 존재를 검출하는 단계를 수반한다. 표본을 이용한 이러한 항체-항원 복합체의 형성은 조직에서의 종양 세포의 존재를 나타낸다. 표본 상에서의 항체의 검출은 업계에 공지된 기술, 예를 들어 면역퍼옥시다제 염색 기술, 아비딘-비오틴(ABC) 기술 또는 면역형광 기술을 사용하여 달성될 수 있다(Ciocca et al, Meth. EnzymoL, 121:562-79 (1986); Hellstrom et al, Cancer Research, 46:3917-23 (1986); 및 Kimball (ed.), Introduction To Immunology (2nd Ed.), pp. 113-117, Macmillan Publ. Co. (1986) 참조).

혈청학적 진단 기술은 암종으로 고통받고 있는 것으로 고려되는 환자의 혈청 또는 다른 생물학적 유체로 분비되거나 "셰딩(shed)"된 종양-관련 항원의 검출 및 정량을 수반한다. 이러한 항원은 업계에 공지된 기술, 예를 들어 방사선 면역 검정(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 체액에서 검출될 수 있으며, "셰딩된" 항원과 반응성인 항체는 유체 샘플에서 항원의 존재를 검출하는데 사용된다(Uotila et al., J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) 및 Allum et al., "Monoclonal Antibodies in the Diagnosis and Treatment of Malignant Conditions" Surg. Ann., 18:41-64, 48-51 (1986) 참조). 따라서, 본원에서 개시된 항체를 사용하는 검정들은 생물학적 유체에서 항체가 반응하는 항원의 검출에 사용될 수 있으므로 인간 환자에서 다양한 암종의 검출을 제공한다. 따라서, 전술된 것들로부터 본 발명의 항체가 항원-항체 반응을 수반하는 대부분의 검정에 사용될 수 있다는 것은 명백하다. 이 검정들은 표준 RIA 기술(액체상 및 고체상 둘 다), 뿐만 아니라 ELISA 검정, 측면 유동 테스트, 면역형광 기술, 및 다른 면역 세포 화학적 검정을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(Sikora et al. (eds.), Monoclonal Antibodies, pp. 32-52, Blackwell Scientific Publications, (1984) 참조).

본 발명의 항체는 또한 인간 종양의 검출을 위한 생체 내 진단 적용에 유용하다. 이러한 접근법은 검출 가능한 신호를 생성하는 적절한 이미징 시약으로 라벨링된 항체를 사용하는 종양 이미징 기술에 의한 생체 내 종양의 검출을 수반한다. 이미징 시약 및 이러한 시약으로 항체를 라벨링하는 과정은 잘 공지되어 있다(Wensel and Meares, Radio Immunoimaging and Radioimmunotherapy, Esevier, N.Y. (1983); Colcher et al, Meth. EnzymoL, 121:802-16 (1986) 참조). 라벨링된 항체는 방사성 핵(radionuclear) 스캐닝과 같은 기술에 의해 검출될 수 있다(Bradwell et al. in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 65-85, Academic Press (1985) 참조).

일부 구체예에서, 항체는, 특히 독성 분자에 결합된 경우, 치료제로서 유용하다. 본원에서 기술된 바와 같이 암세포 조직으로의 결합에 대하여 스크리닝된 항체는 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체에서 대장암 막 결합성 및 가용성 형태를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지고, 서열 번호 1의 서열을 가지고, 180 kDa CEA 및/또는 ACT에 실질적으로 결합하지 않는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법에 유용하다. 구체예에서, 항체는 본원에서 기술된 중쇄 CDR 및/또는 경쇄 CDR을 포함하는 인간 또는 인간화 항체이다. 구체예에서, 암은 결장암 및 폐암으로부터 선택된다. 구체예에서, 암은 결장암이다.

진단 목적을 위해서, 항체는 고체 표면에 부착될 수 있다. 고체 표면은 막, 멀티웰 플레이트, 크로마토그래피 매질, 유리 슬라이드, 라텍스 비드, 자성 비드, 마이크로어레이 칩, 모세관 및 칩을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항체는 또한 신호 발생 요소로 라벨링될 수 있다. 신호 발생 요소는 염료, 효소, 방사성 라벨 및 화학발광 시약을 포함한다.

일부 구체예에서, 미지의 샘플을 질환에 걸렸거나 또는 질환에 걸리지 않은 것으로 분류하기 위한 컷오프 값이 식별된다. 구체예에서, 컷오프 값은 암에 걸린 것으로 공지된 대상체의 복수의 샘플 각각을 희석하고 암에 걸리지 않은 것으로 공지된 샘플 대상체의 희석액의 유사한 세트와 비교하여 100 kDa 당단백질의 양을 검출함으로써 결정된다. 구체예에서, 암에 걸리지 않은 것으로 공지된 샘플과 비교하여 암의 존재를 나타내는 체액 샘플, 예를 들어 혈청 샘플을 구별하는 컷오프가 선택된다. 구체예에서, 혈청 샘플에서의 대장암 또는 관상선종의 존재에 대한 컷오프 값은 적어도 약 6.5 유닛/mL이다.

키트

본 발명은 또한 암, 예를 들어 결장암 또는 폐암의 진단용 키트를 제공한다. 키트는 대장암 막 결합성 및 가용성 형태를 가지고, 약 228nm에서의 UV 흡광도 피크, 약 3.5 내지 4의 등전점, 약 20%의 시알산 함량을 가지고, 180 kDa CEA 및/또는 ACT에 실질적으로 결합하지 않는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 포함한다. 구체예에서, 항체는 신호 발생 요소로 라벨링된다.

다른 구체예에서, 키트는 a) 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEACAM5에 실질적으로 결합하지 않고 서열 번호 2의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는 제1 및/또는 제2 항체; b) 신호 발생 요소로 라벨링된, 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 추가적인 항체; 및 c) 캘리브레이터를 포함한다. 항체는 같은 에피토프 또는 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 항체 중 하나는 선택적으로 고체 표면에 부착된다. 고체 표면은 막, 비드, 자성 비드, 마이크로웰 플레이트, 슬라이드 및 마이크로어레이를 포함한다. 다른 항체는 선택적으로 검출 가능한 라벨 또는 신호 발생 요소로 라벨링된다. 검출 가능한 라벨 또는 신호 발생 요소는 비오틴, 형광 염료, 화학발광 태그, 콜로이드 금, 방사성 태그 및 효소를 포함한다.

또한, 키트는 선택적으로 양성 또는 음성 대조군으로서 캘리브레이터 또는 표준을 포함한다. 표준은 a) 대장 및/또는 간 종양 세포를 산과 접촉시켜 추출물을 형성하는 단계; b) 추출물의 구성요소를 분자량에 따라 분리시켜 약 60 kDa 이상의 구성요소를 가지는 제1 분획을 형성하는 단계; c) 약 75 kDa 이상 및 약 200 kDa 미만의 분자량을 가지는 제1 분획의 구성요소를 단리시키는 단계; 및 d) 100 kDa 분자량의 단백질을 단리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 암세포 추출물을 포함할 수 있다. 구체예에서, 캘리브레이터는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지는 100 kDa 당단백질이다. 구체예에서, 캘리브레이터는 적어도 mL 당 6.5 유닛 이상의 농도를 가진다. 구체예에서, 종양 세포는 대장암의 것이다. 다른 구체예에서, 키트는 음성 대조군, 예를 들어 소 혈청 알부민, ACT, 및/또는 180 kDA CEA를 포함한다.

구체예에서, 키트는 100 kDa 당단백질의 존재를 검출하는 면역검정의 실시를 위한 설명서를 포함한다. 설명서는 양성 및 음성 대조군을 희석하기 위한 표준 곡선 및 설명서를 제공한다. 설명서는 6.5 유닛/mL의 컷오프 값을 제공한다. 항원이 6.5 유닛/mL 이상의 수준으로 검출되면, 샘플은 대장암 또는 폐암의 증가된 위험에 대하여 양성으로 판정된다.

또한, 케어 키트 및 검정 포맷의 포인트가 본 발명에 포함된다. 이러한 검정에서, 생물학적 샘플은 혈액, 소변, 타액 및/또는 눈물이고 테스트는 병원, 응급실, 병실, 외래환자 센터 등에서 실시된다. 구체예에서, 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 고체 기질, 예를 들어 멀티웰 플레이트, 계량봉 또는 막 기반 테스트 스트립에 부착된다. 항체가 환자 샘플과 접촉될 때, 항원이 환자 샘플에서 검출되면, 고체 기질은 적어도 한 위치에서 색상이 변화하며, 이것은 시각적으로 판독될 수 있다. 다른 구체예에서, 항체는 혈액 샘플을 뽑은 다음 항원이 검출되면 계량기로 판독되는 검출 가능한 신호를 제공하는 계량기에 포함될 수 있다.

본원에서 기술된 본 발명이 더 완전히 이해될 수 있기 위해서, 하기 실시예가 제시된다. 이 실시예들은 단지 예시의 목적을 위한 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예 1

간암 및 결장암 조직으로부터 제조된 과염소산 종양 추출물을 사용하여 다클론성 및 단클론성 항체를 제조하였다. Tennagen 검정으로 불리는 HAI 테스트를 단지 다클론성 항체만을 사용하여 개발하였고 결장암을 진단하는데 사용하였다. 캡쳐 항체로서 두 개의 특이적 단클론성 항체 및 신호 발생 항체로서 다클론성 항체를 사용하는 ELISA 테스트를 이후에 개발하였다. ELISA 검정에서의 두 개의 특이적 단클론성 항체의 칵테일은 초기 단계 대장 암종에 걸리지 않은 것으로 공지된 환자의 혈청 샘플을 분석할 때 초기 단계 대장 암종에 대하여 반복적으로 95+%의 민감도 및 94+%의 특이성을 가진다.

면역 조직학적 연구는 대장암의 선암종(adenocarcinoma)의 세포막에 부착되지만 정상 조직에는 부착되지 않는 두 개의 단클론성 항체를 나타냈다. 방광 또는 유방 조직에서는 세포로의 부착이 보이지 않는다.

물질 및 방법

면역화

염소의 면역화에서 다클론성 항체의 생산에 사용된 Tennessee 항원(CA11-19)의 로트를 사용하여 마우스 하이브리도마 생산용 Balb/C 마우스를 면역화하였다. Tennessee 항원(CA11-19) 로트는 항원의 초기 특성화 후 염소 및 마우스의 면역화에 대하여 승인된 모든 항원에 사용된 바와 같이 Sepharose 4B 및 Sephadex G200 크로마토그래피를 포함하는 정제 단계를 거친 선암종 조직의 과염소산 추출물이었다.

많은 단클론성 항체를 면역화된 마우스 세 마리에서 생성된 하이브리도마로부터 클로닝하였다. 하이브리도마 및 단클론성 항체는 처음에는 승인된 Tennessee 항원 코팅된 RBC, TennaGen™ 검정의 구성요소를 사용하여 스크리닝하였다. 하이브리도마 및 단클론성 상층액을 Tennessee 항원 코팅된 RBC와 혼합하여 헤마글루티닌화 역가를 결정하였다. Tennessee 항원(CA11-19)에 대한 항체를 함유하는 하이브리도마 및 단클론성 세포 배양물 상층액은 부드럽고 매트한 응집을 초래하였다. HA 검정을 많은 하이브리도마의 스크리닝 및 차후 세포 배양 상층액에서 단클론성 항체 생산을 위한 스크리닝 테스트로서 사용하였다.

제한 희석 기술을 사용하여, 23개의 단클론성 항체를 최상의 하이브리도마로부터 생산하였다. 23개의 클론의 광범위한 평가와 함께, ELISA 검정에서 추가의 평가를 위해 7개의 클론을 선택하였다. 면역 조직학적 연구는 단클론성 항체가 결장 및 폐의 선암종에 결합한다는 것을 확인하였다. 두 개의 단클론성 항체는 또한 폐의 편평상피세포 및 선암종을 이용하여 양성 염색하였다. 음성 대조군은 방광 및 유방 조직이었다. 캡쳐 항체에 대한 최종 선택은 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 제2 블라인드(blind) 혈청 패널에 따라 5E5-1 및 5A1-1을 이용하는 단클론성 칵테일이었다. CA11-19 Mono-Poly ELISA Sandwich Assay에 대하여 메이오 클리닉(Mayo Clinic)을 통해 NCI에 의해 공급된 이차 블라인드 혈청 패널(second blind serum panel)을 사용하는 NCI 평가의 요약이 제시되었다.

ELISA 검정

ELISA는 두 개의 마우스 단클론성 항체, 5E5-1 및 5A1-1, 검출 항체로서 사용되는 알칼리성 포스파타제에 컨쥬게이션된 항-Tennessee 항원 다클론성 항체의 칵테일로 코팅된 높은 결합 미세역가 플레이트를 사용하고, 캘리브레이터로서 사용에 대하여 승인된 Tennessee 항원 로트는 CA11-19 ELISA Kit의 캘리브레이터이다. ELISA는 소 혈청을 사용하지만 과염소산 추출물을 사용하지는 않는다.

ELISA에 대한 프로토콜은 다음과 같다:

코팅: 높은 결합 96웰 Easy Wash EIA/RIA 플레이트의 각 웰을, 적정에 의해 최적화된, ELISA 코팅 버퍼 중의 단클론성 칵테일(캡쳐 항체)의 용액 125 uL로 실온(~21℃)에서 2시간 동안 코팅한 후 냉장고에서(4 내지 8℃) 밤새도록 코팅하였다. 이것은 웰 당 대략 항체 1μg과 같다.

블로킹: PBS T 20 세척 버퍼 300 μL로 3 x 세척한 후, 플레이트를 ELISA 코팅 버퍼 중 1.2% SEA Block의 웰 당 300 μL로 2시간 동안 실온에서 블로킹하였다. 미세역가 플레이트를 2% 수크로스 및 4% 폴리비닐피롤리돈 버퍼로 45분 동안 추가로 블로킹한다.

저장: 플레이트를 실온에서 24시간 동안 플라스틱 건조 랙(rack) 상에서 뒤집어서 건조시킨 다음, 제습 패킷(desiccant packet) 및 습도 인디케이터(humidity indicator)와 함께 포일 파우치에 배치하였고, 이어서 40℃에서 저장하였다.

샘플: 플레이트, 캘리브레이터 및 샘플 버퍼를 실온으로 옮겨서 평형화시켰다. 캘리브레이터 및 대조군 25 μL를 미지의 샘플 25 μL와 함께 플레이트의 2개의 미세역가 웰에 첨가한 후, 샘플 희석 버퍼 75 uL를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하여, 지퍼백(ziplock bag)에 넣고 37℃에서 밤새도록 2시간 동안 인큐베이션하였다.

CA11-19 플레이트를 증류수 300 μL로 6x 세척한 다음, CA11-19 다클론성 알칼리성 포스파타제 컨쥬게이트 100 uL을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하여, 지퍼백에 넣고 37℃에서 2시간 동안 놔두었다.

CA11-19 플레이트를 증류수 300 μL로 6x 세척하였고 100 uL CA11-19 기질을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 놔두었다.

측정: 405 nm에서의 각 웰의 흡광도를 표준 플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정하였다.

정량: 표준의 흡광도를 점 대 점(point to point) 곡선을 사용하여 플롯팅하였고 대조군 및 미지의 것들의 흡광도를 곡선에 대하여 판독한다.

캘리브레이터로서 사용에 대하여 승인된 Tennessee 항원(CA11-19) 로트를 사용하는 SOP/Procedure에 따라 ELISA 테스트에 대한 캘리브레이터를 제조하였다. 단위량은 볼트(vault) 참조 표준의 원래의 단위량을 기반으로 하고, 표준 단위량을 얻기 위해서 항원의 로트를 희석한다. FDA 미팅에서, 과학 자문 위원회는 종양 마커가 균일한 표준을 가질 정도로 순수하게 정제되지 않았다고 진술하였다. 세계 보건 기구(World Health Organization)는 단백질이 참조 표준에 대하여 100% 순수해질 때까지 종양 마커 테스트는 중량, 예를 들어 ng 또는 pc가 아니라 "유닛/mL"로 보고되어야 하는 것으로 결론 내리면서 유사하게 진술하였다. 많은 종양 마커, 예를 들어 AFP, B-HCG, CA15-3, CA19-9, CA125, CA27-29 및 PAP는 U/mL로 보고되는 한편 CEA 및 PSA는 ng/mL로 보고된다.

면역조직화학법

TennaGen 검정을 위해 생성된 다양한 단클론성(클로닝된 하이브리도마) 항체 및 염소 항체를 두 개의 다른 독립적인 시설, Summa Medical, TX 및 Hawaii of U, HI에서 면역조직화학법 연구를 사용하여 추가로 특성화하였다. 단클론성 5E5-1 및 5A1-1은 결장 및 폐의 선암종, 뿐만 아니라 폐의 편평상피세포 암종, 예를 들어 염소 항혈청을 염색하였다; 하지만, 5E5-1 항체의 신호가 더 강력하였다.

결과

이 테스트 구성을 사용하여 422명의 환자에서 CA11-19 수준을 측정하였다. 222개의 샘플을 GI Associates, TN으로부터 수거하였고 200개의 샘플을 Equitech Bio, TX로부터 상업적으로 구입하였다. 이 환자들의 혈청을 CA11-19 ELISA 검정으로 분석하였다. 결과는 도 1 및 하기 표 1, 2 및 3에서 요약된다. 다른 ELISA 시약의 개선과 함께 5E5-1 및 5A1-1의 단클론성 칵테일의 사용으로, 환자의 임상적 상태에 따라 민감도는 90% 이상이었으며 특이성은 84 내지 92%였다.

도 1은 422명 환자 임상 연구의 모든 데이터의 요약을 나타낸다. 도 1a(패널 A)는 비-암성 및 암성 환자 모두에 대하여 결합된 데이터를 나타낸다. 박스는 데이터의 가운데 50%를 커버하는 한편 선은 중간값이다. 위스커는 데이터의 가운데 90%를 커버한다(5% 내지 95%). 도 1b(패널 B)는 암성 대 비-암성 샘플을 비교하는 수신자 조작 특성(ROC) 곡선이다.

박스 & 위스커 플롯(도 1a)은 비암성 조직의 CA11-19 수준이 암성 환자보다 전체적으로 더 낮다는 것을 보여준다. 대조군 샘플과 비교하여 암에 걸린 것으로 공지된 환자의 샘플에서 검출된 항원의 수준을 비교하는 박스 및 위스커 플롯은 6.5 유닛/mL에 대한 컷오프 값을 확립하며 데이터의 가운데 90%에 대한 위스커의 하한 근거하여 대장암의 존재를 나타낸다. 이 데이터가 ROC 곡선으로 플롯팅될 때(도 1b), CA11-19 및 암 사이의 양성 상관관계와 일치하는 좌측 상단 사분면으로의 분명한 시프트가 존재한다. 이 테스트의 민감도 및 특이성은 6.5 유닛/mL의 컷오프가 사용될 때 각각 95% 및 84%이다. 비-암성 환자(표 3) 및 암성 환자(표 1)를 조건에 따라 구분하고 6.5 유닛/mL 컷오프를 적용할 때, 가장 높은 진양성, 위양성, 진음성 및 위음성 비율을 제공하는 조건을 볼 수 있다. 가장 높은 위음성 비율은 관상선종에서 볼 수 있었다(표 2). 병기 I-III의 결장암은 100% 검출을 제공하는 한편 병기 IV는 64%였다.

5E5-1 및 5A1-1로부터 수확된 단클론성 항체 상층액을 정제하여 추가의 임상적 평가를 위해 높은 결합 미세역가 플레이트 상에서 캡쳐 항체로서 칵테일에서 사용하였다. 두 개의 다른 블라인드 혈청 패널을 코팅된 미세역가 플레이트의 두 개의 다른 로트를 사용하여 분석하였다. 새로운 로트는 캡쳐 항체로서 2012년 칵테일을 사용하는 한편 제2 로트는 2009 내지 2010년에 실시된 평가에서 이전에 사용된, 2009 내지 2010년에 제조된 미세역가 플레이트를 사용하였다. 혈청 패널을 EDP Biotech에서 조립하였고, Gastrointestinal Associates(GIA)에 있는 Dr. B.F.Overholt의 사무실로 배달하여 검정을 위해 블라인드 코딩하였다. CA11-19(CA1-18로 나타남) 검정을 수행하였고, 결과는 코드가 식별되는 GIA로 가져갔다. 결과는 표 4 및 5에 제시된다.

상기 표 4는 대장내시경 검사에 의해 확인된 대장암 및 정상을 비교한다. 혈청 패널 A(2012년 7월 23일)는 84.4%의 민감도 및 78.9%의 특이성을 나타낸다. 폴립 및 폐암은 계산에 포함시키지 않았다. CA11-19 로트 2012는 80.0%의 특이성과 함께 95.5%의 민감도를 나타냈으며 대장 및 양성 GI 데이터를 사용하는 혈청 패널 B에서 볼 수 있다. 폴립 및 폐암은 계산에 포함시키지 않았다. 혈청 패널 A 및 B의 데이터를 결합한 경우, 병기 I 대장암에서는 양성 GI 질환과 비교하여 92.3%의 민감도 및 85%의 특이성을 볼 수 있다.

논의

이 결과들은 두 개의 캡쳐 단클론성 항체 및 Tennessee 항원에 대하여 제조된 검출 가능하게 라벨링된 다클론성 항체를 이용한 ELISA 검정이 혈청에서 측정된 바와 같이 반복적으로 초기 단계 대장 암종에 대하여 95+%의 민감도 및 94+%의 특이성을 가진다는 것을 나타낸다.

면역 조직학적 연구는 두 개의 단클론성 항체가 대장암의 선암종의 세포막에 부착되지만 정상 조직에는 부착되지 않는다는 것을 나타냈다. 방광 또는 유방 조직에서 세포로의 부착을 볼 수 없다.

실시예 2

상기 기술된 항체 검정에 의해 검출되는 항원의 정체성은 결정하기 어렵다. 과염소산 암종 세포 추출물 CA11-19는 많은 다른 단백질을 함유한다. 과염소산 추출물의 추가 정제는 약 60 내지 65 kDa의 분획 및 약 100 kDa의 분획을 식별하였다. 하지만, 60 내지 65 kDa 분획은, 동물을 면역화하는데 사용될 때, 초기 단계 대장 암종을 특이적으로 검출하는 어떠한 항체도 제공하지 않았다.

CA11-19 조제물에 존재하는 항원의 단리 및 특성화

결장 및 간의 인간 선암종 종양 조직을 추출하였다. 정제 과정은 Sepharose 4B^® 및 Sephadex G200^® 크로마토그래피를 포함하는 추가 정제 단계와 함께 과염소산 추출을 수반하였다. SOP 가이드라인에 따라, SDS 겔, 웨스턴 블롯, 면역전기영동 및 항원 함량/단백질 결정을 모든 항원 로트에 사용하였다. 100개 이상의 다른 종양 조직을 개개의 Tennessee 항원(CA11-19) 추출물 로트로 추출하였다.

아미노산 분석, 228nm에서의 UV 흡광도 및 분자량 결정은 다른 항원 로트로 반복적으로 이루어졌고 CEA와 비교하였다. 결과는 표 6에서 나타난다.

100 kDa 항원을 알파 1 항-키모트립신(ACT)의 특성과 비교하여 유사한 특성화를 실시하였다. 결과는 표 7에서 나타난다.

SDS PAGE 및 웨스턴 블롯

종양 및 정상 조직의 많은 과염소산 추출물을 -20℃ 저장으로부터 제거하였고 멸균 여과하였다. 모든 Tennessee 항원 및 정상 조직 추출물은 추가로 정제되지 않은 과염소산 추출물이었다. Tennessee 항원 과염소산 추출물은 면역원으로서 및 특성화 작업에 사용을 위해 추가 정제된 Tennessee 항원 로트보다 더 안정하였다. 이 샘플들을 SDS-PAGE 분리에 의해 CA11-19의 존재에 대하여 스크리닝한 다음(도 2a) 염소 항-CA11-19 다클론성 항체를 두 개의 다른 배치에서 컨쥬게이션 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 2b).

샘플의 서브세트는 55 내지 76kDa 영역에서 깔끔한 단일 밴드 반응성을 나타내는 한편 다른 것들은 일반적인 반응성을 나타냈으며 전체 단백질 풀(pool)은 웨스턴 블롯에서 스트리크(streak)를 나타냈다. 단지 이용 가능한 면역화 항원(#19)만이 아미노산 분석에 사용되기에 충분히 반응성인 것으로 보이는 또 다른 샘플(#28)에서와 같이 우수한 웨스턴 반응성을 나타냈다. 깨끗한 단일 밴드 반응성을 나타내는 선택된 샘플을 단백질 동정을 위해 웨스턴 반응 영역을 잘라낼 목표로 SDS-PAGE를 재실행하였다. 11개의 겔 슬라이스를 제거하였고 Protein Discovery에 제공하였다. 그들은 샘플을 분해하여, 질량 분석법을 통해 방출된 펩타이드를 시퀀싱한 다음 이용 가능한 데이터베이스를 조사하여 겔 슬라이스를 구성하는 단백질을 결정하였다. 흥미롭게도, ACT를 어떤 다른 단백질보다 3x 더 자주 검출하였으며 알부민이 2등이었다.

논의

대장 및/또는 간 종양으로부터 단리된 분획은 55 내지 75 kDa의 분자량을 가지는 구성요소 및 100 kDa를 가지는 구성요소를 가진다(도 2a). 웨스턴 블롯은 60 kDa 이상의 분자량 단백질과 반응성을 나타낸다(도 2b). 이 밴드들의 정체성을 연구하였다.

두 독립적인 기관의 초기 데이터는 항체 생산을 위해 면역원으로 사용된 Tennessee 항원이 100 kDa에 가까운 분자량을 가진다는 것을 보여주었다. 특성화 연구에 중요한 두 가지 포인트 중 첫 번째는 Tennessee 항원의 면역학적 활성 부분은 100,000 분자량을 가진다는 것이다. 면역원으로 사용된 정제된 100,000 MW 물질만이 90% 이상의 정확도로 대장암 및 폐암 혈청의 초기 단계 선암종 간의 차이를 측정할 수 있는 항체(단클론성 및 다클론성)를 생산하였다. 토끼, 염소 및 마우스에서 면역원으로 사용된 60kDa 분획은 사용 가능한 항체를 생산하는데 성공적이지 않았다. 닭 및 마우스에서 항체 생산을 위한 면역원으로서 60kDa 물질의 추가 사용은 또한 ELISA에서 캡쳐 항체로 사용될 때, 대장암 및 폐암의 검출에 사용 가능한 항체를 생산하지 않았다. Tennessee 항원 특성화에서 두 번째로 중요한 포인트는 228 nm에서 주요 UV 피크 및 280 nm에서 작은 소수 피크를 가지며 이것은 알파 1 항키모트립신(ACT)-UV 피크 395 nm 및 알파 1 항트립신-UV 피크 296 nm와는 매우 다르다는 것이다. 이전의 물리적 특성화는 또한 물질의 이 밴드를 180 kDa CEA와 구별한다.

Tennessee 항원에 대하여 총 23개의 다른 단클론성 항체를 생산하였으며, 초기에 잠재적으로 유용한 것으로 연구하였고 그것들의 진단적 및 치료적 유용성에 대한 추가 평가를 위해 냉동탱크에 저장한다. 추가의 면역 조직학적 연구는 Tennessee 항원에 대한 추가적인 21개의 단클론성 항체의 기대치를 식별할 것이다. 100 kDa 항원을 더 특성화하기 위한 실험은 정제된 물질의 아미노산 시퀀싱 및 단클론성 항체의 에피토프 맵핑을 수반한다.

실시예 3

100 kDa 물질 및 60 내지 65 kDa 물질의 분리

고분자량 분획의 아미노산 시퀀싱에 대비하여 선암종 종양 세포 추출물에서 저분자량 물질로부터 고분자량 물질의 분리

물질 및 방법

종양 세포 물질

두 개의 다른 종양 세포 표본을 대장 조직의 선암종으로부터 얻었다. 제1 종양 세포 표본은 167B-80로 동정된 병기 II 선암종이다. 제2 종양 세포 표본은 또한 173-81로 동정된 선암종 병기 II이다. 대조군 대장 및 관상선종 혈청 표본을 HF 번호로 식별한다.

종양 세포 추출물

각 종양 세포 표본의 종양 세포 추출물을 매우 작은 조각으로 자르고 물질을 1.4% 과염소산으로 추출함으로써 제조하였다.

컬럼 크로마토그래피

각 종양 세포 추출물의 수성 과염소산 추출물을 Sepharose 4B 상에서 컬럼 크로마토그래피로 분리하였다. 분획을 수거하였고 각각의 분획을 280 nm에서의 흡광도에 대하여 및 ELISA 검정에서 테스트하였다. 280 nm에서의 피크 흡광도 및 ELISA 활성을 함유하는 분획을 모아서 Superdex 200 크로마토그래피를 사용하여 더 분리하였다. 분획을 Superdex 200 컬럼으로부터 수거하여 280 nm에서의 흡광도에 대하여 및 ELISA에서 테스트하였다. 분획을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 실행하였다.

ELISA

ELISA는 두 개의 마우스 단클론성 항체, 5E5-1 및 5A1-1, 검출 항체로서 사용되는 알칼리성 포스파타제에 컨쥬게이션된 항-Tennessee 항원 다클론성 항체의 칵테일로 코팅된 높은 결합 미세역가 플레이트를 사용한다. 컬럼 크로마토그래피의 고분자량 및 저분자량 분획을 ELISA 검정에서 암에 걸린 환자의 혈청 샘플을 검출할 수 있는 항체와의 반응에 대하여 테스트하였다.

ELISA에 대한 프로토콜은 다음과 같다:

코팅: 높은 결합 96웰 Easy Wash EIA/RIA 플레이트의 각 웰을, 적정에 의해 최적화된, ELISA 코팅 버퍼 중의 단클론성 칵테일(캡쳐 항체)의 용액 125 uL로 실온(~21℃)에서 2시간 동안 코팅한 후 냉장고에서(4 내지 8℃) 밤새도록 코팅하였다. 이것은 웰 당 대략 항체 1 μg과 같다.

저장: 플레이트를 실온에서 24시간 동안 플라스틱 건조 랙 상에서 뒤집어서 건조시킨 다음, 제습 패킷 및 습도 인디케이터와 함께 포일 파우치에 배치하였고, 이어서 40℃에서 저장하였다.

샘플: 플레이트, 캘리브레이터 및 샘플 버퍼를 실온으로 옮겨서 평형화시켰다. 캘리브레이터 및 대조군 25 μL를 미지의 샘플 25 μL와 함께 플레이트의 2개의 미세역가 웰에 첨가한 후, 샘플 희석 버퍼 75 uL를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하여, 지퍼백에 넣고 37℃에서 밤새도록 2시간 동안 인큐베이션하였다.

CA11-19 플레이트를 증류수 300 μL로 6x 세척한 다음 CA11-19 다클론성 알칼리성 포스파타제 컨쥬게이트 100 uL을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하여, 지퍼백에 넣고 37℃에서 2시간 동안 놔두었다.

측정: 405 nm에서 각 웰의 흡광도를 표준 플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정하였다.

정량: 표준의 흡광도를 점 대 점 곡선을 사용하여 플롯팅하였고 대조군 및 미지의 것들의 흡광도를 곡선에 대하여 판독한다.

캘리브레이터로서 사용에 대하여 승인된 Tennessee 항원(CA11-19) 로트를 사용하는 SOP/Procedure에 따라 ELISA 테스트에 대한 캘리브레이터를 제조하였다. 단위량은 볼트 참조 표준의 원래의 단위량을 기반으로 하고, 표준 단위량을 얻기 위해서 항원의 로트를 희석한다.

다클론성 항체는 인간 혈청, 180 kDa CEA 조제물 또는 CEACAM 6(NCA)의 풀에 실질적으로 결합하지 않는다.

결과

도 3의 결과는 각각의 종양 세포 추출물에 대하여 단백질의 밴드는 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정된 바와 같이 분획 F9 내지 F13에서 발견된다는 것을 보여준다. 분획의 ELISA 활성의 피크는 항원의 활성이 분획 F10 내지 F12에서 대부분 발견된다는 것을 나타낸다. 분획 F9 내지 F12를 모았다. 종양 표본 각각으로부터 모아진 분획을 Superdex 200 컬럼 상에서 실행하였다(데이터 도시하지 않음). 분획 F7 내지 F13에서 단백질의 넓은 밴드가 발견된다. 각 분획을 ELISA에서 테스트하였고 피크 활성을 나타내는 분획을 모아서 SDS 겔 상에서 실행하였다. 밴드를 대략 100 kDa에서 발견하였다(데이터 도시하지 않음).

100 kDa의 밴드를 추가로 분석할 것이다. 밴드를 잘라내서 아미노산 서열에 대하여 분석할 것이다.

논의

이전의 연구들은 환자의 혈액 샘플에서 대장암의 존재를 예측하는 CA11-19 ELISA 검정에서 검출 가능한 종양 세포 추출물로부터 유래된 항원을 동정하였다. 종양 세포 추출물의 특성화는 50 내지 60 kDa에서 비활성 단백질 분획 및 100 kDa에서 활성 분획을 나타냈다. 100 kDa 분획을 더 특성화하기 위해서, 50 내지 60 kDa의 분자량을 가진 물질을 분리 및 제거하였다. 고분자량 물질로부터의 저분자량 물질의 분리를 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 달성하였다. 대부분 100 kDa 물질을 함유하고 ELISA 검정에서 활성인 분획을 아미노산 서열에 대하여 분석한다. 이 분석은 항원의 정체성을 제공할 것이다.

실시예 4

CA11-19 항원의 N 글리칸 프로파일링

MALDI-MS에 의한 N-글리칸 프로파일링을 위해 샘플을 제조하는 방법은 도 4에서 요약된다.

SDS-PAGE

100 kDa CA11-19 물질은 168B 항원으로 불리며 실시예 3에서 기술된 바와 같이 제조하였다. 동량의 2 X SDS 샘플 버퍼를 첨가함으로써 샘플을 변성시켰고 100 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 소량으로 나누어서 각 레인에 로딩하였다. 샘플을 7.5% SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 Coomassie Brilliant Blue(CBB)로 염색하였다(도 5).

겔 내 PNGase F 분해 및 방출된 N- 글리칸의 추출

겔에서의 PNGase F 분해를 Kuster et al Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high performance liquid chromatography. Anal. Biochem., (1997) 250, 52-101의 방법에 따라 수행하였다. 간략히 말하면, 표적 당단백질 밴드를 CBB-염색된 겔 시트로부터 절제하고 겔 밴드를 추가로 더 작은 조각으로 잘랐다. 이어서 겔 조각을 색상이 투명하게 바뀔 때까지 교대로 50 mM 암모늄 바이카보네이트(AmBic) 및 100% 아세토니트릴을 이용하여 탈색하였다. 이어서 겔 내 단백질을 디티오트레이톨(DTT)로 환원시킨 후, 아이오도아세트아미드(IAM)로 카르복시아미도메틸화하였다. 겔 내 DTT 및 IAM을 교대로 50 mM AmBic 및 100% 아세토니트릴를 이용하여 씻어냈다. 탈수화된 겔 조각을 처음 45분 동안 얼음 위에서 PNGase F 용액(50 mM AmBic 중 PNGase F)으로 다시 부풀린 다음, 37℃에서 밤새도록 분해를 수행하였다. 방출된 N-글리칸을 5% 포름산 중 아세토니트릴의 비율이 증가하는 단계적 추출에 의해 겔에서 추출하였다. 추출물을 건조시켰다.

N- 글리칸 제조

방출된 N-글리칸을 Sep-Pak C18 카트리지를 통과시켜 펩타이드로부터 정제하였다. 글리칸 분획을 5% 아세트산으로 용출하여 동결건조시켰다. 분획을 동결건조시킨 다음 C18 카트리지로 다시 정제하기 전에 Anumula 및 Taylor의 방법에 기초하여 페르메틸화하였다(Anumula et al., A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal Biochem, 1992. 203(1): p. 101-108). 페르메틸화된 N-글리칸을 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS)으로 분석하였다.

MALDI - TOF 분석

매트릭스로서 α-디하이드록시벤조산(DHBA, 50% 메탄올 중 20 mg/mL 용액)을 사용하는 리플렉터 양이온 방식으로 페르메틸화된 N-결합된 글리칸의 MALDI/TOF-MS를 수행하였다. AB Sciex TOF/TOF 5800 MADLI 질량 분석 시스템을 사용하여 스펙트럼을 얻었다.

결과:

SDS-PAGE에 의한 CAll -19 168B의 분리

CA11-19 168B를 겔 내 분해를 위해 SDS-PAGE로 분리하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 CBB로 염색하였으며 겔의 이미지는 도 5에 제시된다. 도 5A는 표적 당단백질 100 KD 밴드 및 CA11-19 168B에서 관찰된 45 KD의 추가적인 밴드의 국소화를 나타낸다. 도 5B는 샘플 분석에 사용된 실제 겔의 사진을 나타낸다.

100 KD 밴드를 도 5B에서 명확하게 관찰할 수 없었기 때문에, 100 KD의 분자량에 해당하는 영역을 잘라냈고 N-글리칸 프로파일링을 위해 절제하였다. 참조와 같은 과정을 이용하여 45 KD 밴드 상에서도 N-글리칸 분석을 수행하였다.

MALDI / TOF -MS에 의한 N- 글리칸 프로파일링

제공된 샘플의 페르메틸화된 N-글리칸을 MALDI/TOF MS 분석에 의해 프로파일링하였다. 각 샘플의 MALDI-전체 질량 스펙트럼은 도 6a 및 도 6b에서 나타난다.

100 KD 밴드의 겔 내 분해 및 N-글리칸 분석은 여러 글리칸 구조에 해당할 수 있는 피크를 나타낸다(m/z 1416.6, m/z 1661.7 및 m/z 2039.9). 그러나, 피크의 강도는 노이즈(noise) 수준과 거의 같은데, 이는 미량의 샘플 농도 때문이다(도 6a). 비록 샘플과 회합된 글리칸을 분명하게 검출할 수 있고 그것들은 갈락토스가 있고 없는 바이안테너리(biantennary) 구조이지만, 100 kD 밴드에 대하여 얻어진 샘플의 적은 양으로부터의 민감도가 충분하지 않기 때문에 존재하는 모든 글리칸을 검출하는 것은 불가능하다.

MALDI/TOF-MS를 사용하여 45 kDa 밴드에서 검출된 1차 구조는 복합형 N-글리칸, 예를 들어 GlcNAclMan3GlcNAc2(m/z 1416.6) 및 GlcNAc2Man3GlcNAc2(m/z 1661.7)이었다. 푸코스를 가지는 복합형 N-글리칸을 또한 45 kDa 밴드에서 관찰하였다(도 6b). 이 글리칸들에 대한 상대적인 피크 강도는 100 kDa 밴드보다 훨씬 더 높았다는 것에 주목해야 한다.

N-글리칸 프로파일링 이후 모든 결과의 요약은 표 8에서 나타난다.

논의

100 KD 밴드의 N-글리칸 분석은 피크가 표 8에서 나타난 바와 같이 여러 글리칸 구조에 해당한다는 것을 나타낸다. SDS-PAGE에서(도 5), 45 KDa 밴드 및 100 KDa 밴드의 농도 간의 차이를 분명하게 알 수 있다. 결론적으로, 100 KD 밴드와 비교하여 45 KD 밴드로부터 훨씬 더 강력한 신호를 관찰할 수 있었다.

실시예 5

CAll -19의 O- 글리칸 프로파일링

MALDI-MS에 의한 O-글리칸 프로파일링을 위해 샘플을 제조하는 방법이 도 7에서 요약된다.

SDS-PAGE

샘플 물질 CA11-19BSTK 및 CA11-19 168BNC를 실시예 3에서 기술된 바와 같이 제조하였다. 샘플 STK는 5배 농축된 것으로 NC와는 다르다. 샘플을 동량의 2 X SDS 샘플 버퍼를 첨가함으로써 변성시켰고 100℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 소량으로 나누어 각 레인에 로딩하였다. 샘플을 7.5% SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 Coomassie Brilliant Blue(CBB)로 염색하였다.

환원성 β-제거에 의한 겔 내 O- 글리칸 방출

겔에서의 환원성 β-제거를 Dell, A et al의 방법에 따라 수행하였다(Dell, A. et al. Mass spectrometry of Carbohydrate-Containing Biopolymers. Methods Enzymol, (1994) 230, 105-132). 간략히 말하면, 표적 당단백질 밴드를 CBB-염색된 겔 시트로부터 절제하고 겔 밴드를 추가로 더 작은 조각으로 잘랐다. 이어서 겔 조각을 색상이 투명하게 바뀔 때까지 교대로 50 mM 암모늄 바이카보네이트(AmBic) 및 100% 아세토니트릴을 이용하여 탈색하였다. 이어서 겔 조각을 에틸 아세테이트로 세척하였고 아세토니트릴로 세척하였다. O-글리칸을 β-제거에 의해 겔로부터 방출시켰다. 겔을 100 mM 나트륨 하이드록시드 및 1M 나트륨 보로하이드레이트를 첨가함으로써 재수화시켰다. 샘플을 45℃에서 18h 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 얼음 위에 두고 10% 아세트산으로 중화시켰다. 중화된 샘플을 AG-50WX8 양이온 교환 컬럼에 로딩하여 탈염하였다. 메탄올 중 10% 아세트산을 샘플에 첨가하여 보레이트를 제거하였다.

O- 글리칸 제조

방출된 O-글리칸을 Sep-Pak C18 카트리지를 통과시켜 펩타이드로부터 정제하였다. 글리칸 분획을 5% 아세트산으로 용출하여 동결건조시켰다. 분획을 동결건조시킨 다음 C18 카트리지로 다시 정제하기 전에 Anumula 및 Taylor의 방법에 기초하여 페르메틸화하였다(상기 인용됨). 페르메틸화된 O-글리칸을 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS)으로 분석하였다.

MALDI - TOF 분석

나노스프레이 이온화 FTMS

NSI-MSMS 분석을 나노스프레이 이온원이 장착된 LTQ Orbitrap XL 질량 분석기(ThermoFisher)를 사용하여 수행하였다. 페르메틸화된 O-결합된 글리칸을 50% 메탄올 중 1mM NaOH에 용해시킨 다음 0.5 μL/분의 일정한 유속으로 기구에 직접 주입하였다. 전체 FTMS 스펙트럼을 3 마이크로스캔을 이용하여 30000 해상도에서 수거하였다. 모세관 온도를 210℃로 설정하였고 MS 분석을 양이온 방식으로 수행하였다. 총 이온 맵핑(자동화된 MS/MS 분석)을 위해서, m/z 범위, 500 내지 2000을 연속적인 2 질량 단위 창에서 ITMS 방식을 이용하여 스캔하였다.

결과:

SDS-PAGE에 의한 CA11-19 168BSTK 및 CA11-19 168BNC의 분리

CA11-19 168BNC 및 CA11-19 168BSTK를 겔 내 분해를 위해 SDS-PAGE로 분리하였다(도 8 참조). 전기영동 후, 겔을 CBB로 염색하였다. 도 8은 CA11-19 168BNC 및 CA11-19 168BSTK의 표적 당단백질 10 KDa의 국소화를 나타낸다. CA11-19 168BSTK의 100 kDa 밴드가 도 8에서 명확하게 관찰되지 않기 때문에, 겔의 100 KDa의 분자량에 해당하는 영역을 잘라냈고 겔 슬라이스를 O-글리칸 프로파일링을 위해 절제하였다.

MALDI / TOF -MS에 의한 O- 글리칸 프로파일링

샘플의 페르메틸화된 O-글리칸을 MALDI/TOF-MS, 뿐만 아니라 NSI-MS 및 총 이온 맵핑으로 분석하였다.

두 샘플에서의 100 KDa 밴드의 MALDI-TOF-전체 질량 스펙트럼은 이 보고서에 도시되지 않는데, 이는 MALDI-TOF 분석이 주요 글리칸 신호를 나타내지 않은 대신에 주로 비-글리칸 신호를 제공했기 때문이다. 샘플을 LTQ Orbitrap XL 질량 분석기로 더 분석하였다. 샘플의 전체 FTMS 스캔은 일부 O-글리칸 신호를 이용하여 MALDI-TOF 분석과 유사한 결과를 나타낸다. 두 샘플의 100 KDa 밴드의 O-글리칸의 NSI-FTMS 스펙트럼은 도 9에서 도시된다. 상단 스펙트럼은 CA11-19 168BNC의 O-글리칸을 나타내고(A) 하단 스펙트럼은 CA11-19 168BSTK의 O-글리칸을 나타낸다(B). 주요 O-글리칸 구조는 코어 2 구조(m/z 779) 및 푸코스를 가지고 있는 코어 3 구조(m/z 953)이다. SDS-PAGE에서(도 8), CA11-19 168BNC 및 CA11-19 168BSTK 간의 샘플 농도 차이를 분명하게 알 수 있었다. 결론적으로, 샘플 CA11-19 168BSTK에서 샘플 CA11-19 168BNC의 강력한 O-글리칸 신호를 관찰하지 못했다.

O-글리칸 구조를 확인하기 위해서, 총 이온 맵핑(TIM)을 NSI LTQ Orbitrap XL MS에 의해 수행하였다. TIM 스캔 방법을 사용하여, 표 9에서 요약된 여러 O-글리칸을 확인할 수 있었다. 두 분석은 유사한 경향을 나타냈다. 샘플 농도 때문에 CA11-19 168BNC 샘플은 CA 11-19 168BSTK 샘플보다 더 분명한 MSMS 스펙트럼을 나타낸다.

CA 11-19 168BNC의 O-글리칸 스펙트럼(도 9 상단 스펙트럼)으로부터 유래된 m/z 936, m/z 953 및 m/z 1157에서 페르메틸화된 O-글리칸의 MSMS 스펙트럼은 예로서 도 10에서 나타난다. 도 10A, m/z 936(NeuAc-HexNAc-HexNAc)에서의 분자 이온의 MSMS 프로파일에서 설명된 바와 같이, 진단 b 이온은 m/z 561, m/z 659 및 m/z 677에서 상보적 y 이온과 함께 m/z 398에서 나타난다. m/z 953(Hex-DHex-HexNAc2) 및 m/z 1157 (Hex2-DHex-HexNAc2)에서의 분자 이온의 MSMS 프로파일은 도 10B 및 10C에서 설명된다.

CA 11-19 168BNC 및 CA 11-19 168BSTK의 MSMS 프로파일은 같은 패턴을 나타냈고 본 명세서에서는 CA 11-19 168BNC의 스펙트럼을 제공한다.

논의

본 발명자는 CA11-19 168BNC 및 CA11-19 168BSTK의 주요 O-결합된 글리칸이 코어 2 구조(m/z 779) 및 푸코스를 가지고 있는 코어 3 구조(m/z 953)라는 결론을 얻었다. CA11-19 168BSTK 당단백질의 양이 CA11-19 168BNC보다 더 작기 때문에, CA11-19 168BNC의 전체 ms는 더 많은 O-글리칸 신호를 나타냈다. 본 명세서에서 제시된 글리칸 구조는 일반적인 생합성 경로를 기반으로 한다.

실시예 6

100 kDa 물질의 아미노산 서열

100 kDa(168B) 물질을 단리시켜 아미노산 서열에 대하여 분석하였다.

아미노산 서열 분석

한 샘플(용액 중의)을 수령하였다. 단백질을 환원시켜, 알킬화하였고, FASP 프로토콜을 사용하여 트립신으로 분해시켰다. 샘플을 2% 아세토니트릴/0.1% 포름산에 재현탁하였고 LC-ESI-MS/MS로 분석하였다. 120 분 구배를 사용하여 MS 분석을 LTQ Orbitrap Velos 질량 분석기로 수행하였다. MS 스펙트럼을 MASCOT 알고리즘을 사용하여 검색하여 엑셀 스프레드시트(Exel spreadsheet)를 생성하였다. 트립신 펩타이드를 사용하는 검색을 인간 uniprot 데이터베이스에 대하여 실행하였다. 단백질을 CEACAM5 아이소폼 2의 서열(서열 번호 1)을 가진 것으로 동정하였다.

항원 168B의 펩타이드 질량 핑거프린트

항원 168B를 특성화하기 위해, 샘플을 트립신, 키모트립신 및 ASP-N 단백질 가수분해에 적용한 후, LC-LTQ Orbitrap MS/MS 분석을 실시하였다. 항원의 특성화를 위해서, 나노-LC 크로마토그래피를 LTQ Orbitrap XL 질량 분석기(Thermo)를 구비한 라인에서 Ultimate 3000(Dionex) 시스템을 사용하여 수행하였다.

샘플 제조:

항원(2.5 μM) 5 μL를 암모늄 바이카보네이트(25 mM, pH 8.3) 20 μL와 혼합하였다. 혼합 후, DTT(500 mM) 2.5 μL를 용액에 첨가하였다. 이어서 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 아이오다이오아세트아미드(1M) 2.5 μL를 암실에서 실온에서 1시간 인큐베이션 전에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 단백질 가수분해에 사용된 버퍼 120 μL를 첨가함으로써 용액을 1/5 희석한다.

환원된/알킬화된 항원 145 μL을 트립신 (Roche Diagnostic) 2 μL와 1/20 비율로 혼합하였다. 단백질 가수분해 혼합물을 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.

환원된/알킬화된 항원 145 μL을 키모트립신(Roche Diagnostic) 2 μL와 1/20 비율로 혼합하였다. 단백질 가수분해 혼합물을 30℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.

환원된/알킬화된 항원 145 μL을 ASP-N(Roche Diagnostic) 2 μL와 1/20 비율로 혼합하였다. 단백질 가수분해 혼합물을 30℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.

단백질 가수분해 후, 단백질 가수분해에 의해 생성된 펩타이드 10 uL를 나노-액체 크로마토그래피 시스템 (Ultimate 3000, Dionex)에 로딩하였다.

- A 95/05/0.1 H20/ACN/HCOOH v/v/v

- B 20/80/0.1 H20/ACN/HCOOH v/v/v

- 35분에서 구배 5 내지 40% B

- 주입된 부피 10 μL

- 전치컬럼 300 μm ID x 5 mm C4 PepMapTM

- 전치컬럼 유속 30 μL/분

- 컬럼 75 μm ID x 5 cm C4 PepMapTM

- 컬럼 유속 200 nL/분

LTQ orbitrap MS 분석을 다음 파라미터를 이용하여 수행하였다:

- 바늘 전압 1.8 V

- 모세관 전압 5 V

- μ스캔 MS 1

- μ스캔 MS2 1

- MS 범위 m/z 300-1700

-MS/MS 계획 MS+6CID MS/MS

-필요한 최소 신호 500

-이온 단리 창 3 m/z 유닛

-표준화된 충돌 에너지 35%

-기본 전하 상태 2

-활성화 Q 0.25

-활성화 시간 30

-동적 배제 ON

-동적 배제 Params RC 1, RD 30s, ED 30s

-전하 상태 스크리닝 ON

-전하 상태 거절 ON

-전하 상태 거절. Params +1 및 비할당 거절

검증 필터

펩타이드 Delta CN>0.1

펩타이드 Xcorrvs 전하 상태>1.5(+1), 2.00(+2), 2.50(+3), 3.00(>+4)

펩타이드 확률<0.001

펩타이드 일치=1

다른 펩타이드의 단백질 수>2

이 참조를 제외하는 단백질: 케라틴

결과

CEACAM5 아이소폼 2의 서열을 사용하여 트립신 펩타이드의 질량 분석 데이터를 분석하였다. 18개의 트립신 펩타이드를 168B의 서열에서 동정하였으며, 29.8%를 커버한다:

168B의 동정된 트립신 펩타이드

펩타이드 MH+ 위치 유의성 서열 번호

MESPSAPPHR 1108.52 1-10 94.9 40

WCIPWQR 988.48 11-18 95.7 41

LLLTASLLTFWNPPTTAK 1987.12 18-35 96.8 42

VDGNR 560.27 73-77 95.9 43

QIIGYVIGTQQATPGPAYSGR 2177.13 78-98 92.4 44

SDLVNEEATGQFR 1465.69 127-139 95.8 45

VYPELPKPSISSNNSKPVEDK 2328.2 140-160 94.6 46

LQLSNGNR 901.48 191-198 99.2 47

TLTLFVTR 1064.6 199-207 97.1 48

NDTASYK 798.36 208-214 98.9 49

CETQNPVSAR 1104.51 215-224 93.6 50

LQLSNDNR 959.49 368-375 98.5 51

TLTLLSVTR 1003.61 376-384 92.2 52

NSGLYTCQANNSASGHSR 1866.81 470-487 97.2 53

AYVCGIQNSVSANR 1481.71 567-580 92.5 54

INGIPQQHTQVLFIAK 1807.02 628-643 95.3 55

ITPNNNGTYACFVSNLATGR 2113.01 644-663 95.1 56

NNSIVK 674.38 664-669 96.5 57

CEACAM5 아이소폼 2의 서열을 사용하여 키모트립신 펩타이드의 질량 분석 데이터를 분석하였다. 35개의 키모트립신 펩타이드를 B168의 서열에서 동정하였으며, 65.3%를 커버한다:

168B의 동정된 키모트립신 펩타이드

펩타이드 MH+ 위치 유의성 서열 번호

ESPSAPPHRW 1163.55 2-11 92.5 58

ESTPFNVAEGKEVLLLVHNL 2209.5 39-58 94.4 59

HLFGYSWYK 1199.56 61-69 96.5 60

KGERVDGNRQIIGY 1604.85 69-82 90.3 61

VIGTQQATPGPAY 1302.66 83-95 94.5 62

SGREIIYPNASL 1319.69 96-107 96.6 63

IQNIIQNDTGF 1262.63 109-119 97 64

VNEEATGQF 994.44 130-138 92.3 65

TCEPETQDATY 1257.49 166-176 93.5 66

VNNQSLPVSPRL 1323.73 180-191 94 67

NVTRNDTASY 1140.52 204-213 96.1 68

TISPLNTSYRSGENLNL 1877.93 241-257 98.1 69

SCHAASNPPAQY 1245.53 258-269 94.3 70

IPNITVNNSGSY 1278.63 286-297 93.6 71

TCQAHNSDTGL 1146.48 298-308 90.5 72

NRTTVTTITVY 1268.68 309-319 92.8 73

ITSNNSNPVEDEDAVAL 1787.82 326-342 96.5 74

TCEPEIQNTTY 1298.55 343-353 97.6 75

SVTRNDVGPYECGIQNEL 1993.92 381-398 92.6 76

SVDHSDPVIL 1081.55 399-408 93.3 77

GPDDPTISPSY 1148.51 413-423 94.5 78

YRPGVNLSLSCHAASNPPAQYS 2331.09 426-447 96.3 79

IDENIQQHTQEL 1467.7 450-461 91.5 80

ISNITEKNSGL 1175.62 463-473 92.5 81

VKTITVSAELPKPSISSNNSKP 2296.25 490-511 93.8 82

TCEPEAQNTTY 1256.5 521-531 94.5 83

VNGQSLPVSPRL 1266.71 535-546 96.2 84

NVTRNDARAY 1179.58 559-568 98.1 85

VCGIQNSVSANRSDPVTL 1859.92 569-586 95.6 86

GPDTPIISPPDSSY 1445.67 591-604 95.6 87

SCHSASNPSPQY 1277.52 613-624 90.5 88

RINGIPQQHTQVL 1503.83 627-639 90.6 89

IAKITPNNNGTY 1305.67 641-652 92.2 90

SGTSPGLSAGAT 1004.46 676-687 94.8 91

ATVGIMIGVLVGVA 1298.75 686-699 96.2 92

9개의 펩타이드를 Asp N 단백질 가수분해에 의해 B168의 서열에서 동정하였으며, 16.8%를 커버한다:

168B의 동정된 ASP-N 펩타이드

펩타이드 MH+ 위치 유의성 서열 번호

DTGFYTLHVIKS 1380.7158 116-127 94.5 93

DAVAFTCEPETQ 1310.5569 161-172 96.2 94

DTASYKCETQNPVSARRS 2012.9454 209-226 92.5 95

DSVILNVLYGP 1189.6463 227-237 94.7 96

DNRTLTLLSVTRN 1502.8285 373-385 92 97

DVGPYECGIQNELSV 1622.7366 386-400 98.6 98

DPVILNVLYGP 1199.667 404-414 93.3 99

DARAYVCGIQNSVSANRS 1910.9137 564-581 95.7 100

DTPIISPP 839.4509 593-600 96.1 101

얻어진 결과에 근거하여, 트립신, 키모트립신 및 ASP-N 펩타이드의 중첩 맵핑을 설계하였다(도 14). 트립신, 키모트립신 및 ASP-N 단백질 가수분해의 펩타이드를 조합하면, 서열의 85.6%를 커버한다. 폴리펩타이드를 도 14에서 나타난 바와 같이 CEACAM5 아이소폼 2(서열 번호 1)로 동정한다.

실시예 7

항체 특성화: 항원과 교차결합된 항체의 질량 분석법

샘플 제조

제공된 샘플은 항체 15E5-1: 0.2 mg/mL; 2mL; 글리신 버퍼; 항체 25A1-1: 1.2 mg/mL; 2mL; 글리신 버퍼; 및 항원 168B: 0.8 mg/mL; 100 μL; PBS pH 7.4를 포함하였다. 항체 5E5 및 항체 5A1-1는 환자의 혈청에서 대장암에 대한 생체마커를 동정하는 것으로 나타났다. 항원은 본원에서 기술된 바와 같이 168B로 동정되고 CEACAM5의 부분적으로 글리코실화된 형태이다.

세 개의 mAb/Ag 상호작용 샘플을 다음 농도로 제조하였다:

A 항원: 168B 항체: 5E5 -1 혼합체 168B/ 5E5 -1

항원(4 마이크로몰) 5 마이크로리터를 항체(2 마이크로몰) 5 마이크로리터와 혼합하여 10 마이크로리터의 혼합물(2 마이크로몰 항원 및 1 마이크로몰 항체)를 형성하였다.

B 항원: 168B 항체: 5A1-1 혼합체 168B/5A1-1

항원(4 마이크로몰) 5 마이크로리터를 항체(2 마이크로몰) 5 마이크로리터와 혼합하여 10 마이크로리터의 혼합물(2 마이크로몰 항원 및 1 마이크로몰 항체)을 형성하였다.

C 항원: 168B 항체: 5A1- 1/5E5 -1 혼합체 168B/5A1- 1/5E5 -1

항원(4 마이크로몰) 5 마이크로리터를 각각의 항체(2 마이크로몰) 2 마이크로리터와 혼합하여 10 마이크로리터의 혼합물(2 마이크로몰 항원/1 마이크로몰 항체5A1-1/1 마이크로몰 항체 5E5-1)을 형성하였다.

얻어진 혼합물 1 μL를 아세토니트릴/물(1: 1, v/v) 중 재결정화된 시나핀산 매트릭스(10 mg/mL), TFA 0.1%(K200 MALDI Kit)로 구성된 매트릭스 1 μL와 혼합하였다. 혼합 후, 각 샘플 1 μL를 MALDI 플레이트(SCOUT 384) 상에 스폿팅하였다. 실온에서 결정화 후, 플레이트를 MALDI 질량 분석기에서 인큐베이션하였고 즉시 분석하였다. 분석을 세 번 반복하였다.

교차 결합 실험

상기 제조된 혼합물(각각의 혼합물에 대하여 남아있는 9μL)을 CovalX's K200 MALDI MS 분석 키트를 사용하여 교차 결합에 적용하였다. 혼합물 9 μL를 K200 Stabilizer 시약(2 mg/mL) 1 μL와 혼합하였고 실온에서 인큐베이션하였다. CovalX는 항체 및 항원 간의 상호작용을 안정화시키기 위해 아민 기반 가교제의 혼합물을 사용한다. 인큐베이션 시간(180분) 후, 샘플을 MALDI 분석을 위해 제조하였다. 샘플을 결정화 후 즉시 High-Mass MALDI 분석으로 분석하였다.

High-Mass MALDI MS 분석

표준 질소 레이저를 구비하고 0 내지 2000 kDa의 다른 질량 범위에 초점을 맞추는 CovalX's HM3 상호작용 모듈을 사용하여 MALDI ToF MS 분석을 수행하였다.

분석을 위해, 다음 파라미터가 적용되었다:

질량 분석기:

선형 및 양성 방식

이온원 1: 20 kV

이온원 2: 17 kV

렌즈: 12 kV

펄스 이온 추출: 400 ns

HM3:

이득 전압: 3.14 kV

가속 전압: 20 kV

기구를 보정하기 위해서, 인슐린, BSA 및 IgG의 클러스터를 이용하는 외부 보정(캘리브레이션)이 적용되었다. 각 샘플에 대하여, 3개의 스폿을 분석하였다(스폿 당 300번의 레이저 발사). 제공된 스펙트럼은 300번의 레이저 발사의 합계에 해당한다. MS 데이터를 CovalX's Complex Tracker 분석 소프트웨어 버전 2.0을 사용하여 분석하였다.

결과

혼합체 A: 5E5-1/168B의 분석은 관찰치 MH+=92.879 kDa(168B-항원) 및 MH+=158.498 kDa(5E5-1 항체)를 가지는 항원 및 항체가 검출된다는 것을 나타냈다(도 11a). 교차 결합 실험을 교차 결합 시약 K200과 함께 180분 인큐베이션 후 완료하였다. 교차 결합 후, MH+=258.945 kDa[5E5-1·B168] 및 MH+=354.164 kDa [5E5-1·2B168]를 가지는 두 개의 추가적인 피크를 검출하였다(도 11b). Complex Tracker 소프트웨어를 사용하여, 대조군 및 교차 결합 스펙트럼을 중첩시켰다. 상기 중첩은 두 개의 비 공유결합 복합체 [5E5-1·B168] 및 [5E5-l·2B168]의 검출을 확인하였다(도 11c).

혼합체 B: 5A1-1/168B의 분석은 MH+=92.743 kDa(168B) 및 MH+=159.125 kDa(5A1-1)를 가지는 항원 및 항체를 검출하였다(데이터 도시하지 않음). 교차 결합 실험을 교차 결합 시약 K200과 함께 180분 인큐베이션 후 완료하였다. 교차 결합 후, MH+=259.155kDa[5A1-1·B168] 및 MH+=355.025 kDa[5A1-1·2B168]를 가지는 두 개의 추가적인 피크를 검출하였다(데이터 도시하지 않음). Complex Tracker 소프트웨어를 사용하여, 대조군 및 교차 결합 스펙트럼을 중첩시켰다. 상기 중첩은 두 개의 비 공유결합 복합체 [5A1-1·B168](단일 항원에 결합하는 항체) 및 [5A1-1·2B168](두 개의 항원에 결합하는 항체)의 검출을 확인하였다(데이터 도시하지 않음).

혼합체 C: 5E5-1/5A1-1/168B의 분석은 MH+=92.910 kDa(168B) 및 MH+=158.988 kDa(5E5, 5A1-1)를 가지는 항원 및 항체를 검출하였다(도 12a). 교차 결합 실험을 교차 결합 시약 K200과 함께 180분 인큐베이션 후 완료하였다. 교차 결합 후, MH+=260.155 kDa 및 MH+=356.012 kDa를 가지는 두 개의 추가적인 피크를 검출하였다(도 12b). Complex Tracker 소프트웨어를 사용하여, 대조군 및 교차 결합 스펙트럼을 중첩시켰다. 상기 중첩은 두 개의 비 공유결합 복합체 복합체 [5E5-1·B168] 및 [5E5-1·2B168]의 검출을 확인하였다(도 12c).

논의

샌드위치 검정은 항원 168B 상에서 단클론성 항체 5E5-1 및 5A1-1의 동시 결합이 관찰되지 않았다는 것을 나타낸다. 상기 분석은 항원 168B 상의 이 두 개의 단클론성 항체의 에피토프가 단백질은 가까운 영역에 위치한다는 것을 나타낸다.

실시예8

항체 5E5 -1의 에피토프 맵핑

항원으로부터 유래된 펩타이드를 이용한 경쟁 검정을 실시하여 에피토프가 선형인지를 결정하였다.

펩신 단백질 가수분해

에피토프의 성질을 결정하기 위해서, 고정화된 펩신으로 168B 항원의 단백질 가수분해를 수행하였다. 2.5 μM의 농도를 가지는 항원 10 μL를 고정화된 펩신 2.5 μM과 혼합하였고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리하였고 상층액을 피펫을 이용하여 옮겼다. 단백질 가수분해의 완료를 High-Mass MALDI 질량 분석법에 의해 선형 방식 및 리플렉트론 방식으로 제어하였다. 1000 내지 3500 Da 범위에서 대량의 펩타이드를 얻기 위해서 펩신 단백질 가수분해를 최적화하였다.

펩신 펩타이드 /항체/항원 혼합 및 인큐베이션

단백질 가수분해에 의해 생성된 항원 펩타이드 5 μL를 speed vac을 사용하여 10X 농축하였고 5E5-1 항체(4 μM) 5 μL와 혼합하였고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.

항원 펩타이드 /항원/항체 혼합

항원 펩타이드와 함께 항체의 인큐베이션 후, 혼합물 5μL를 온전한 항원(4 μM) 5μL과 혼합하였다. 혼합 후, 혼합물은 다음 단백질을 함유한다:

168B 펩타이드 5E5-1 항체/168B 항원 펩타이드 혼합체 5E5-1 항체/168B 펩타이드/168B 항원.

상호작용 분석

경쟁 검정을 위해서, 실시예 6에서 기술된 것과 같은 프로토콜을 이용하여 항체/항원 상호작용 분석을 수행하였다.

결과

이 실험에서, 항원 및 항체는 MH+=92.879 kDa 및 MH+=158.498 kDa로 검출되었다(도 13a). 교차 결합 실험을 교차 결합 시약 K200과 함께 180분 인큐베이션 시간 후 완료하였다. 교차 결합 후, MH+=258.945 kDa 및 MH+=354.164 kDa를 가지는 두 개의 추가적인 피크를 검출하였다. Complex Tracker 소프트웨어를 사용하여, 대조군 및 교차 결합 스펙트럼을 중첩시켰다(도 13b). 상기 중첩은 두 개의 비 공유결합 복합체 [5E5-1·B168] 및 [5E5-1·2B168]의 검출을 확인하였다(도 13c).

경쟁 후, 항원 168B 상에서의 항체 5E5-1의 결합의 억제를 검출할 수 없었다. 경쟁 후, 두 개의 비 공유결합 복합체 [5E5-1·B168] 및 [5E5-1·2B168]을 관찰하였다(도 13).

논의

경쟁 검정은 항원의 펩타이드가 결합하는 항체/항원을 억제하지 않는다는 것을 나타낸다. 168B 상에서의 에피토프 5E5-1은 선형이 아니다. 에피토프는 항원의 입체구조를 기반으로 한다.

분자 계면 B168/ 5E5 -1의 특성화

고해상도로 168B 항원 상에서의 5E5-1 항체의 에피토프를 결정하기 위해, 항체/항원 복합체를 중수소화된 가교제와 함께 배양하고 다중효소적 분열시켰다. 교차 결합된 펩타이드의 농후화 후, 샘플을 고해상도 질량 분석법(nLC-Orbitrap MS)로 분석하였고 발생한 데이터를 XQuest 및 Stavrox 소프트웨어를 사용하여 분석한다.

이 분석을 위해서, Orbitrap 질량 분석법과 결합한 nLC를 상기 기술된 바와 같이 사용하였다. 최종 농도(1μM/2μM)로 항체/항원 혼합체를 얻기 위해 항원 샘플(농도 4 μM) 5μL를 항체 샘플(농도 2μM) 5μL와 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 180분 동안 인큐베이션하였다. 제1 단계에서, d0 가교제 1 mg을 d12 가교제 1 mg와 혼합하였다. DSS d0/d12의 2 mg/mL 용액을 얻기 위해, 제조된 2 mg을 DMF 1 mL와 혼합하였다. 이전에 제조된 항체/항원 혼합체 10 μL를 제조된 가교제 d0/dl2의 용액 (2 mg/ml) 1 μL와 혼합하였다. 교차 결합 반응을 달성하기 위해 용액을 실온에서 180분 동안 인큐베이션하였다.

단백질 가수분해를 용이하게 하기 위해서, 이 단백질에 존재하는 이황화 결합을 감소시키는 것이 필수적이다. 교차 결합된 샘플을 암모늄 바이카보네이트(25 mM, pH 8.3) 20 μL와 혼합하였다. 혼합한 후, DTT(500 mM) 2.5 μL를 용액에 첨가하였다. 이어서 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 아이오다이오아세트아미드(1M) 2.5 μL를 암실에서 실온으로 인큐베이션 1시간 전에 첨가한다. 인큐베이션 후, 단백질 가수분해에 사용된 버퍼 120 μL를 첨가하여 용액을 1/5로 희석한다.

환원/알킬화된 교차 결합된 샘플 145 μL를 트립신(Roche) 2 μL와 혼합하였다. 단백질 가수분해 혼합물을 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.

이 단백질 가수분해에 대하여, 버퍼는 Tris-HCl 100 mM, CaCl₂ 10 mM, pH7.8이다. 환원/알킬화된 교차 결합된 복합체 145μL를 α-키모트립신(200 μM) 2 μL와 혼합하였고 30℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.

환원/알킬화된 교차 결합된 샘플 145 μL를 ASP-N(Roche) 2 μL와 혼합하였다. 단백질 가수분해 혼합물을 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.

결과

교차 결합 후, 다중효소적 단백질 가수분해에 의해 생성된 펩타이드는 전체 항원 서열의 81%를 커버한다. 중수소화된 d0 d12와 항체/항원 교차 결합된 복합체의 트립신 분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 단일결합을 가지는 32개의 펩타이드를 검출하였다. 이 단일결합된 펩타이드를 Xquest 및 Stavrox 소프트웨어를 둘 다 이용하여 검출하였다.

중수소화된 d0 d12와 항체/항원 교차 결합된 복합체의 트립신 분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 항원 168B 및 항체 5E5-1 중쇄 사이에서 4개의 교차 결합된 펩타이드를 검출하였다. 이 교차 결합된 펩타이드를 Xquest 및 Stavrox 소프트웨어를 둘 다 이용하여 검출하였다.

동정된 트립신 교차 결합: 168B/ 5E5 -1

단백질 1/단백질 2

QIIGYVIGTQQATPGPAYSGR-LSGTAGVHSQVQL-a19-b2

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 78-98 5E5-1 HC 11-24(중쇄 가변 도메인 1-4개)

단백질 1/단백질 2

QIIGYVIGTQQATPGPAYSGR-LSGTAGVHSQVQL-a21-b2

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 78-98 5E5-1 HC 11-24(중쇄 가변 도메인 1-4개)

단백질 1/단백질 2

SDLVNEEATGQFR-VQLQQSGAD-a1-b6

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 127-139 5E5-1 HC 21-29(중쇄 가변 도메인 1-9개)

단백질 1/단백질 2

SDLVNEEATGQFR-VQLQQSGAD-a13-b6

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 127-139 5E5-1 HC 21-29(중쇄 가변 도메인 1-9개)

중수소화된 d0 d12와 항체/항원 교차 결합된 복합체의 키모트립신 분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 168B 항원과 5E5-1 항체 중쇄 및 경쇄 사이에서 4개의 교차 결합된 펩타이드를 검출하였다. 이 교차 결합된 펩타이드를 Xquest 및 Stavrox 소프트웨어를 둘 다 이용하여 검출하였다.

동정된 키모트립신 교차 결합: 168B/ 5E5 -1

단백질 1/단백질 2

HLFGYSWYK-QLLGLLLLCFQGTRC-a6-b14

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 61-69 5E5-1 LC 6-20

단백질 1/단백질 2

HLFGYSWYK-IQMTQITSS-a9-b8

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 61-69 5 E5-1 LC 22-30(경쇄 가변 도메인 2-9개)

단백질 1/단백질 2

SGREIIYPNASL-GVHSQVQLQQS-a1-b4

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 96-107 5E5-1 HC 16-26(중쇄 가변 도메인 1-7개)

단백질 1/단백질 2

SGREIIYPNASL-GVHSQVQLQQS-a3-b11

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 96-107 5E5-1 HC 16-26(중쇄 가변 도메인 1-7개)

항체/항원 교차 결합된 복합체의 ASP-N 분해 후, 168B 및 5E5-1 사이에서 어떠한 교차 결합된 펩타이드도 검출할 수 없었다.

논의

화학적 교차 결합, High-Mass MALDI 질량 분석법 및 nLC-Orbitrap 질량 분석법을 사용하여 항원 168B 및 단클론성 항체 5E5-1 사이의 상호작용 계면을 특성화할 수 있었다. 상기 분석은 이 단클론성 항체의 에피토프가 168B 상에서 다음의 아미노산을 포함한다는 것을 나타낸다: 66; 69; 96; 98; 127; 139.

항체 상에서 파라토프는 다음의 아미노산을 포함한다: 중쇄: 6 경쇄: 9. 이 결과는 도 15에 도시된다.

실시예 9

항원으로부터 유래된 펩타이드와의 경쟁 검정을 실시하여 에피토프가 항체 5A1-1에 대하여 선형인지를 결정하였다.

펩신 단백질 가수분해

펩신 펩타이드 /항체/항원 혼합 및 인큐베이션

단백질 가수분해에 의해 생성된 항원 펩타이드 5 μL를 speed vac을 사용하여 10X 농축하였고 5A1-1 항체(4 μM) 5 μL와 혼합하였고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.

항원 펩타이드 /항원/항체 혼합

항원 펩타이드와 함께 항체의 인큐베이션 후, 혼합물 5μL를 온전한 항원(4 μM) 5μL과 혼합하였다. 혼합 후, 혼합물은 다음의 단백질을 함유한다:

168B 펩타이드 5A1-1 항체/168B 항원 펩타이드 혼합체 5A1-1 항체/168B 펩타이드/168B 항원.

상호작용 분석

결과

이 실험에서, 항원 및 항체는 MH+=92.879 kDa 및 MH+=158.498 kDa로 검출되었다(데이터 도시하지 않음). 교차 결합 실험을 교차 결합 시약 K200과 함께 180분 인큐베이션후 완료하였다. 교차 결합 후, MH+=258.945 kDa 및 MH+=354.164 kDa를 가지는 두 개의 추가적인 피크를 검출하였다. Complex Tracker 소프트웨어를 사용하여, 대조군 및 교차 결합 스펙트럼을 중첩시켰다(데이터 도시하지 않음). 상기 중첩은 두 개의 비 공유결합 복합체 [5A1-1·B168] 및 [5A1-1·2B168]의 검출을 확인하였다(데이터 도시하지 않음).

경쟁 후, 항원 168B 상에서의 항체 5A1-1의 결합의 억제를 검출할 수 없었다. 경쟁 후, 두 개의 비 공유결합 복합체 [5A1-1·B168] 및 [5A1-1·2B168]을 관찰하였다(데이터 도시하지 않음). 이것은 에피토프가 선형이 아니라는 것을 나타낸다.

분자 계면 B168/5A1-1의 특성화

고해상도로 168B 항원 상에서의 5A1-1 항체의 에피토프를 결정하기 위해, 항체/항원 복합체를 중수소화된 가교제와 함께 배양하고 다중효소적 분열시켰다. 교차 결합된 펩타이드의 농후화 후, 샘플을 고해상도 질량 분석법(nLC-Orbitrap MS)로 분석하였고 발생한 데이터를 XQuest 및 Stavrox 소프트웨어를 사용하여 분석한다.

이 분석을 위해서, Orbitrap 질량 분석법과 결합한 nLC를 상기 기술된 바와 같이 사용하였다. 최종 농도(1μM/2μM)로 항체/항원 혼합체를 얻기 위해 항원 샘플(농도 4 μM) 5μL를 항체 샘플(농도 2μM) 5μL와 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 180분 동안 인큐베이션하였다. 제1 단계로, d0 가교제 1 mg을 d12 가교제 1 mg와 혼합하였다. DSS d0/d12의 2 mg/mL 용액을 얻기 위해, 제조된 2 mg을 DMF 1 mL와 혼합하였다. 이전에 제조된 항체/항원 혼합체 10 μL를 제조된 가교제 d0/dl2의 용액(2 mg/ml) 1 μL와 혼합하였다. 교차 결합 반응을 달성하기 위해 용액을 실온에서 180분 동안 인큐베이션하였다.

결과

교차 결합 후, 다중효소적 단백질 가수분해에 의해 생성된 펩타이드는 전체 항원 서열의 81%를 커버한다. 중수소화된 d0 d12와의 항체/항원 교차 결합된 복합체의 트립신 분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 단일결합을 가지는 35개의 펩타이드를 검출하였다. 이 단일결합된 펩타이드를 Xquest 및 Stavrox 소프트웨어 둘 다를 이용하여 검출하였다.

중수소화된 d0 d12와 항체/항원 교차 결합된 복합체의 트립신 분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 항원 168B 및 항체 5A1-1 중쇄 사이에서 4개의 교차 결합된 펩타이드를 검출하였다. 이 교차 결합된 펩타이드를 Xquest 및 Stavrox 소프트웨어 를 둘 다 이용하여 검출하였다.

동정된 트립신 교차 결합: 168B/5A1-1

단백질 1/단백질 2

VDGNR-VKPGASVKL-a5-b2

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 73-77 5A1-1 HC 11-19

단백질 1/단백질 2

VDGNR-VKPGASVKL-a5-b2

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 73-77 5A1-1 HC 11-19

중수소화된 d0 d12와 항체/항원 교차 결합된 복합체의 키모트립신 분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 168 B 항원과 5A1-1 항체 중쇄 및 경쇄 사이에서 10개의 교차 결합된 펩타이드를 검출하였다. 이 교차 결합된 펩타이드를 Xquest 및 Stavrox 소프트웨어를 둘 다 이용하여 검출하였다.

동정된 키모트립신 교차 결합: 168B/5A1-1

단백질 1/단백질 2

HLFGYSWYK-VGDRVTITCRA-a6-b4

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 61-69 5A1-1 LC 15-25

단백질 1/단백질 2

HLFGYSWYK-VGDRVTITCRA-a9-b10

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 61-69 5A1-1 LC 15-25

단백질 1/단백질 2

KGERVDGNRQIIGY-TCRASQSISSYLN-a1-b2

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 69-82 5A1-1 LC 22-34

단백질 1/단백질 2

KGERVDGNRQIIGY-TCRASQSISSYLN-a4-b10

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 69-82 5A1-1 LC 22-34

단백질 1/단백질 2

KGERVDGNRQIIGY-VKPGASVKLS-a9-b2

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 69-82 5A1-1 HC 11-19

단백질 1/단백질 2

KGERVDGNRQIIGY-VKPGASVKLS-a9-b6

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 69-82 5A1-1 HC 11-19

단백질 1/단백질 2

SGREIIYPNASL-ASVKLSC-a1-b2

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 96-107 5A1-1 HC 16-22

단백질 1/단백질 2

SGREIIYPNASL-ASVKLSC-a3-b4

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 96-107 5A1-1 HC 16-22

단백질 1/단백질 2

SGREIIYPNASL-CKASGYTFTNYWINWVKP-a11-b2

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 96-107 5A1-1 HC 21-39

단백질 1/단백질 2

SGREIIYPNASL-CKASGYTFTNYWINWVKP-a11-b17

위치 단백질 1/ 단백질2

168B 96-107 5A1-1 HC 21-39

항체/항원 교차 결합된 복합체의 ASP-N 분해 후, 168B 및 5A1-1 사이에서 어떠한 교차 결합된 펩타이드도 검출할 수 없었다.

논의

화학적 교차 결합, High-Mass MALDI 질량 분석법 및 nLC-Orbitrap 질량 분석법을 사용하여 항원 168B 및 단클론성 항체 5A1-1 사이의 상호작용 계면을 특성화할 수 있었다. 상기 분석은 이 단클론성 항체의 에피토프가 168B 상에서 다음의 아미노산을 포함한다는 것을 나타낸다: 66; 69; 72; 77; 96; 98; 106.

항체 상에서 파라토프는 다음의 아미노산을 포함한다: 중쇄: 15; 19; 21; 23; 25; 40 및 CDRH1. 경쇄: 18; 24; 31 및 CDRL1. 이 결과는 도 16에 도시된다.

실시예 10: 측면 유동 테스트(Lateral flow test)

"계량봉(Dipstick)" 측면 유동 테스트(CA11-19)를 설계하였고 환자를 구별하기 위해서 혈청 및/또는 소변-기반 테스트에서 항원의 검출에 대하여 평가하였다. 환자 샘플은 A) 초기 단계 대장 선암종; B) 선종(adenoma); C) 정상 개체(대장내시경 검사로 확인됨)의 혈청 및 소변을 포함하였다. 측면 유동 테스트는 컨쥬게이트 패드 상에서 콜로이드 금에 컨쥬게이션된 염소 CA11-19 다클론성 항체와 함께 니트로셀룰로스 막 상의 같은 단클론성 칵테일(예를 들어, 단클론성 5A1-1 및 5E5-1)을 이용하였다. 예비 테스트는 정상 개체 및 대장암 환자의 혈청 및 소변의 훌륭한 상관관계를 나타냈다(도 21 참조). 같은 암 환자로부터의 혈청 및 "신선한" 소변의 공급원의 결핍은 소변 샘플에 대해 추가 평가하는 것을 어렵게 하였다. 혈청 또는 소변에서의 CA11-19 항원은 CA 환자의 대장(# 2) 및 폐(# 4 및 6)에서 + 선이 있고 정상 개체(# 1,3,5 및 7)에서는 + 선이 없는 것으로 나타났다(도 21 참조).

이 결과는 측면 유동을 이용하는 면역검정이 암 환자의 혈청 및 소변에서 본원에서 기술된 100 kDa CA11-19 항원의 존재를 쉽게 검출할 수 있다는 것을 보여준다.

상기 제시된 바와 같이 많은 변형 및 변이가 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 가능하다는 것은 명백하다. 기술된 특정 구체예는 단지 예로서 제공되고, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다.

<110> EDP BIOTECH CORPORATION <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR SCREENING AND DETECTING CANCER <130> IF16P244US <150> US 14/264,801 <151> 2014-04-29 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 701 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln 1 5 10 15 Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30 Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly 35 40 45 Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly 50 55 60 Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile 65 70 75 80 Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser 85 90 95 Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile 100 105 110 Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp 115 120 125 Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu 130 135 140 Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys 145 150 155 160 Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr 165 170 175 Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 180 185 190 Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn 195 200 205 Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg 210 215 220 Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro 225 230 235 240 Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn 245 250 255 Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe 260 265 270 Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn 275 280 285 Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser 290 295 300 Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Glu 305 310 315 320 Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp 325 330 335 Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr 340 345 350 Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu 355 360 365 Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg 370 375 380 Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val 385 390 395 400 Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Asp 405 410 415 Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu 420 425 430 Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp 435 440 445 Leu Ile Asp Glu Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile Ser 450 455 460 Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn Asn 465 470 475 480 Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val Ser 485 490 495 Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val 500 505 510 Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn 515 520 525 Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro 530 535 540 Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val 545 550 555 560 Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val 565 570 575 Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly Pro 580 585 590 Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala 595 600 605 Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr 610 615 620 Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe 625 630 635 640 Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val 645 650 655 Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr 660 665 670 Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr Val 675 680 685 Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile 690 695 700 <210> 2 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln 1 5 10 15 Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30 Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly 35 40 45 Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln 50 55 60 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Ile Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 551 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr 1 5 10 15 Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn 20 25 30 Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg 35 40 45 Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Thr Ala Ser Tyr Lys 50 55 60 Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser Asp Ser Val Ile 65 70 75 80 Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro Leu Asn 85 90 95 Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ala Ala 100 105 110 Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe Gln 115 120 125 Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr Val Asn Asn Ser 130 135 140 Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr Gly Leu Asn Arg 145 150 155 160 Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile 165 170 175 Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu 180 185 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cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 720 ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 780 aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 840 atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 900 acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 960 cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 1020 gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1080 ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1140 acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200 cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1260 gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1320 tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1380 ggtaaatag 1389 <210> 13 <211> 462 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Met Glu Cys Ser Trp Val Met Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu 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<211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gln Ile Ile Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro 1 5 10 15 Ala Tyr Ser Gly Arg 20 <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg 1 5 10 <210> 46 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys 1 5 10 15 Pro Val Glu Asp Lys 20 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Asn Asp Thr Ala Ser Tyr Lys 1 5 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg 1 5 10 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg 1 5 <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn Asn Ser Ala Ser Gly His 1 5 10 15 Ser Arg <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg 1 5 10 <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys 1 5 10 15 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ala Thr Gly Arg 20 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Asn Asn Ser Ile Val Lys 1 5 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp 1 5 10 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val His Asn Leu 20 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 His Leu Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys 1 5 <210> 61 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile Gly Tyr 1 5 10 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ser Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ile Gln Asn Ile Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe 1 5 10 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe 1 5 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Asn Val Thr Arg Asn Asp Thr Ala Ser Tyr 1 5 10 <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn 1 5 10 15 Leu <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ile Pro Asn Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Thr Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu Asp Ala Val Ala 1 5 10 15 Leu <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Ser Val Thr Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn 1 5 10 15 Glu Leu <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Ser Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Gly Pro Asp Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn 1 5 10 15 Pro Pro Ala Gln Tyr Ser 20 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Ile Asp Glu Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu 1 5 10 <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Ile Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu 1 5 10 <210> 82 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Val Lys Thr Ile Thr Val Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser 1 5 10 15 Ser Asn Asn Ser Lys Pro 20 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn Thr Thr Tyr 1 5 10 <210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu 1 5 10 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr 1 5 10 <210> 86 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val 1 5 10 15 Thr Leu <210> 87 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gly Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr 1 5 10 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr 1 5 10 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu 1 5 10 <210> 90 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr 1 5 10 <210> 91 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Ala Thr Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala 1 5 10 <210> 93 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln 1 5 10 <210> 95 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg 1 5 10 15 Arg Ser <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro 1 5 10 <210> 97 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn 1 5 10 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val 1 5 10 15 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro 1 5 10 <210> 100 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn 1 5 10 15 Arg Ser <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro 1 5 <210> 102 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Gln Ile Ile Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro 1 5 10 15 Ala Tyr Ser Gly Arg 20 <210> 103 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu 1 5 10 <210> 104 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Ser Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg 1 5 10 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 His Leu Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys 1 5 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly Thr Arg Cys 1 5 10 15 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Ile Gln Met Thr Gln Ile Thr Ser Ser 1 5 <210> 109 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Ser Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu 1 5 10 <210> 110 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser 1 5 10 <210> 111 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Val Asp Gly Asn Arg 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu 1 5 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 1 5 10 <210> 114 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile Gly Tyr 1 5 10 <210> 115 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 116 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser 1 5 10 <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys 1 5 <210> 118 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Asn Trp Val 1 5 10 15 Lys Pro <210> 119 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Met Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Val Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Asn Met Ile Thr Thr Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 120 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 121 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Thr Arg Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr His Ser Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 100 105 110 <210> 122 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Val Ala Pro Pro 85 90 95 Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp 100 105 110

Claims

a) 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고, 서열 번호 2의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는 제1 항체;
b) 신호 발생 요소로 라벨링된, 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 추가 항체; 및
c) 캘리브레이터
를 포함하고, 상기 제1 항체는 제2 항체와 다른 에피토프 특이성을 가지는, 면역검정 키트.
제1 항에 있어서, 상기 키트는 제2 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 더 포함하며, 상기 제2 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고, 서열 번호 2의 아미노산 1-60 중 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701 중 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는 것인 면역검정 키트.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 제1 항체 및/또는 제2 항체는 고체 기질에 부착된 것인, 면역검정 키트.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캘리브레이터는 서열 번호 1을 포함하는 단리된 100 kDa 당단백질인, 면역검정 키트.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 샘플에서 검출된 항원의 양이 약 6.5 유닛/mL 또는 그 이상인 경우에 상기 대상체를 대장암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하기 위한 설명서를 더 포함하는, 면역검정 키트.
제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체는 고체 기질에 부착된 단클론성 항체이고, 상기 추가 항체는 검출 가능하게 라벨링된 다클론성 항체인, 면역검정 키트.
제6 항에 있어서, 상기 제2 항체는 고체 기질에 부착된 단클론성 항체인, 면역검정 키트.
제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체와 제2 항체 또는 둘 다는
서열 번호 1의 61-69, 73-77, 및 96-107의 아미노산 서열; 및
서열 번호 1의 61-69, 78-98, 96-107, 및 127-139의 아미노산 서열
로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 에피토프에 결합하는 것인, 면역검정 키트.
제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체, 제2 항체 또는 둘 다는 서열 번호 119 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR을 포함하는 것인, 면역검정 키트.
제9 항에 있어서, 상기 제1 항체, 제2 항체 또는 둘 다는 서열 번호 120 및 서열 번호 122로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR을 포함하는 것인, 면역검정 키트.
서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180 kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고, 서열 번호 2의 아미노산 1-60 중 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701 중 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제11 항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은, 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하거나 또는 이 결합에 대하여 경쟁하며, 상기 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 61-69, 73-77 및 96-107을 포함하는, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제11 항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은, 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하거나 또는 이 결합에 대하여 경쟁하며, 상기 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 61-69, 78-98, 96-107 및 127-139을 포함하는, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 글리코실화된 180kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않는, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 : (a) 서열 번호 119 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR(HCDRl, HCDR2 및 HCDR3); 및 (b) 서열 번호 120 및 서열 번호 122로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 영역의 경쇄 CDR(LCDRl, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제14 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 : a) 서열 번호 15/16/17 및 서열 번호 20/21/22로 구성된 군으로부터 선택된 HCDRl, HCDR2 및 HCDR3; 및 b) 서열 번호 26/27/28 및 서열 번호 31/32/33으로 구성된 군으로부터 선택된 LCDRl, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제14 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 : 서열 번호 119의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는 서열 번호 121의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편.
대상체가 대장암에 걸릴 위험이 있는지를 결정하기 위한 면역검정으로서,
a) 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 대상체의 인간 조직 또는 유체 샘플과 결합시키는 단계로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만 글리코실화된 180 kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고, 서열 번호 2의 아미노산 1-60 중 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는 것인, 단계; 및
b) 항체 항원 복합체의 양을 결정함으로써 인간 조직 또는 유체에서의 항원의 양을 결정하는 단계
를 포함하는 면역검정.
제17 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 면역검정.
제18 항에 있어서, 상기 항체는 캡쳐 항체인 것을 특징으로 하는 면역검정.
제17 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 더 포함하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하지만 글리코실화된 180 kDa CEA에 실질적으로 결합하지 않고, 서열 번호 2의 아미노산 1-60의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드, 서열 번호 3의 아미노산 111 내지 125의 선형 펩타이드, 및/또는 서열 번호 4의 아미노산 150-701의 15개의 아미노산의 선형 펩타이드로 구성된 하나 이상의 선형 펩타이드에 실질적으로 결합하지 않는 것인, 면역검정.
제20 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 단클론성 항체인 면역검정.
제21 항에 있어서, 상기 항체는 캡쳐 항체인 면역검정.
제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1을 포함하는 100 kDa 당단백질에 특이적으로 결합하는 추가 항체를 더 포함하는 것인, 면역검정.
제17 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 항체 또는 항원 결합 단편은 방사성 핵종, 효소, 형광 약제, 콜로이드 금 및 발색단으로 구성된 군으로부터 선택된 라벨로 라벨링된 것인, 면역검정.
제23 항에 있어서, 상기 추가 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 다클론성 항체인, 면역검정.
제17 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 조직 또는 유체에서의 항원의 양이 약 6.5 유닛/mL 또는 그 이상인 경우 대상체를 대장암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것인, 면역검정.
제17 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체와 제2 항체 또는 둘 다는
서열 번호 1의 61-69, 73-77, 및 96-107의 아미노산 서열; 및
서열 번호 1의 아미노산 61-69, 78-98, 96-107, 및 127-139의 아미노산 서열
로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 에피토프에 결합하는 것인, 면역검정.
제17 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체, 제2 항체 또는 둘 다는 서열 번호 119 및 서열 번호 121로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR을 포함하는 것인, 면역검정 키트.
제28 항에 있어서, 상기 제1 항체, 제2 항체 또는 둘 다는 서열 번호 120 및 서열 번호 122로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR을 포함하는 것인, 면역검정 키트.