TW202004183A

TW202004183A - 卵巢癌生物標記及其應用

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Publication number: TW202004183A
Application number: TW106132298A
Authority: TW
Inventors: 童寶玲; 蔡有光; 沈仁達; 周松男; 簡靜香
Original assignee: 豐宥科技股份有限公司
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2020-01-16
Also published as: TWI702400B

Abstract

本發明關於一種生物標記、方法及檢驗套組，用於辨識及篩檢卵巢癌以及監控卵巢癌之治療。

Description

卵巢癌生物標記及其應用

本發明關於生物標記、方法及檢驗套組，用於辨識及篩檢卵巢癌以及監控卵巢癌之治療。

卵巢癌是全球婦女常見的癌症之一，在已開發國家具有高盛行率，且其發生率與死亡率仍持續上升。無疑地，若能早期偵測卵巢癌，可提供最好之治癒機會，提高病人之存活率。超音波雖可看到疑似腫瘤的影像，但無法區辨是否為卵巢癌，且靈敏度不高，也受限於設備，難以推動大規模篩檢。目前已報導的卵巢癌標記包括CA-125(癌抗原125，cancer antigen 125)和HE4(副睪蛋白4，epididymis protein 4)，但主要還是作預後的指標，至於作為卵巢癌篩檢，尤其是檢測早期卵巢癌，效果仍不佳。

CA-125是婦產科範圍內最廣泛應用的腫瘤指標，但第I期的卵巢癌只有約50-60%的病人會出現CA-125表現量異常。此外，其他惡性腫瘤，例如，子宮頸癌和乳癌等癌症，或是懷孕期間、子宮內膜異位、骨盆腔炎等，也都會提高CA-125的水平。因此，CA-125對卵巢癌專一性並不佳。再者，有約20%的卵巢癌病患只能偵測到少量，甚至完全無法測到CA-125的表現(Moore RG.et al.,Curr Opin.Oncol.Sep.22(5)：492-7.2010)。

HE4基因位於染色體20，蛋白質結構由四個雙硫鍵組成，最早是從男性副睪中被鑑定出來(Hellström I.et al.,CANCER RESEARCH 63,3695-3700,July 1,2003)，在其他正常組織也有此蛋白的表現，例如，在氣管和唾液腺中基因表現量最高。雖然目前對於HE4的功能還不清楚，但近年來將HE4用於檢測卵巢癌，發現比CA-125較少出現偽陽性的情況，也較能區辨子宮內膜異位和惡性卵巢腫瘤，以及在部分未表現CA-125指標的卵巢癌病患中，可偵測到血液中的HE4的含量上升(Rosen DG.et al.,Gynecologic Oncology,November 2005 Volume 99,Issue 2,p255-526)。然而，即便如此，研究指出，HE4在血液中的含量只在病灶明顯經手術診斷為卵巢癌的病患才會明顯上升，所以，HE4主要還是作預後的指標，難以作為卵巢癌篩檢及早期診斷的有效標記。

卵巢癌種類複雜，至少包括子宮內膜型(endometrioid)卵巢癌、亮細胞型(clear cell)卵巢癌、漿液型(serous)卵巢癌、黏液型(mucinous)卵巢癌、及其他類型卵巢癌，例如，卵巢癌肉瘤(ovarian carcinosarcoma)、卵巢未成熟畸胎瘤(Immature teratoma)、卵巢黏液及顆粒型癌(ovarian mucinous and granulosa tumor)、及轉移性卵巢癌(Krukenberg，卵巢克魯根勃氏瘤)等。目前為止，並無有效的生物標記可用以廣泛性檢測出不同種類的卵巢癌，也無針對早期卵巢癌檢測的有效生物標記。

因此，仍有需要提出一種卵巢癌的生物標記，可用於廣泛性的卵巢癌篩檢，尤其是針對早期卵巢癌檢測。

本發明不可預期地發現，於卵巢癌病患中，其血漿蛋白補體成分3(complement component 3；C3)發生活化反應，產生一大小約40kDa之胜肽片段，此片段可專一地於不同型態的卵巢癌病患血漿中測得，尤其在早期也可測得，但在沒有卵巢癌個體中則無法或幾乎無法測得。此外，在惡化的卵巢癌病患測得此片段的含量提升。因此，該切割型態之C3蛋白，可做為專一的分子標記，用於診斷卵巢癌，特別是早期診斷，亦可用於監控患有卵巢癌病患之卵巢癌之進展，或評估卵巢癌療法之治療有效性。

在一方面，本發明提供一種偵測卵巢癌之方法，包含：(a)提供來自待測個體之生物樣本；(b)檢測該來自待測個體之生物樣本之切割型補體成分3(C3)多胜肽的含量，獲得切割型C3多胜肽檢測量；(c)比較該切割型C3多胜肽檢測量與來自正常個體之切割型C3多胜肽正常量，獲得比較結果；以及(d)根據該比較結果判斷該待測個體罹患卵巢癌之可能性，其中如該比較結果顯示切割型C3多胜肽檢測量高於切割型C3多胜肽正常量，則判斷該待測個體患有卵巢癌或有罹患卵巢癌之風險。

在另一方面，本發明提供一種監控卵巢癌病患之卵巢癌發展之方法，該方法包含：(a)於第一時間點，提供源自該病患之第一生物樣本；(b)於第二時間點，提供源自該病患之第二生物樣本，其中該第二時間點係晚於第一時間點； (c)檢測第一生物樣本中之切割型C3多胜肽的含量，獲得切割型C3多胜肽第一檢測量，以及檢測第二生物樣本中之切割型C3多胜肽的含量，獲得切割型C3多胜肽第二檢測量；(d)比較切割型C3多胜肽第一檢測量與切割型C3多胜肽第二檢測量，獲得比較結果；以及(e)基於該比較結果，判斷該病患中之卵巢癌進程，其中如該比較結果顯示切割型C3多胜肽第二檢測量高於切割型C3多胜肽第一檢測量，則表示卵巢癌進展中。

在部分具體實施例中，根據本發明之方法，該病患係接受卵巢癌治療中，以及該第一生物樣本及第二生物樣本係取自於治療之前或治療之後，或治療期間。

在部分具體實施例中，本發明之方法進一步包含評估該卵巢癌治療對於該病患之療效，其中如經治療後、或於治療期間，該切割型C3多胜肽的含量呈現降低趨勢，則代表該治療對於該病患有效。

在部分具體實施例中，該切割型C3多胜肽係C3阿法(α)鏈片段2。

在部分具體實施例中，該切割型C3多胜肽係具有對應於SEQ ID NO：1的C3蛋白之位置1321至位置1663的胺基酸序列。

在部分具體實施例中，該切割型C3多胜肽係具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的胜肽片段。

在部分具體實施例中，本發明之檢測步驟係由質譜分析或免疫分析法進行。

在部分具體實施例中，本發明之檢測步驟係由免疫分析法進行，該免疫分析法使用專一性結合至切割型C3多胜肽之抗體。

在部分具體實施例中，本發明之方法使用的生物樣本為體液樣本、組織樣本、或生物檢體樣本。

在部分具體實施例中，本發明之方法使用的生物樣本體液樣本，係選自由血液樣本(如血漿樣本、肝素化血漿樣本、EDTA-血漿樣本、血清樣本)、尿液樣本、及腹水樣本所組成之群組。

在部分具體實施例中，本發明之方法可檢測的卵巢癌可為子宮內膜型(endometrioid)卵巢癌、亮細胞型(clear cell)卵巢癌、漿液型(serous)卵巢癌、黏液型(mucinous)卵巢癌、及其他類型卵巢癌，例如，卵巢癌肉瘤(ovarian carcinosarcoma)、卵巢未成熟畸胎瘤(Immature teratoma)、卵巢黏液及顆粒型癌(ovarian mucinous and granulosa tumor)、及轉移性卵巢癌(Krukenberg，卵巢克魯根勃氏瘤)等。

在部分具體實施例中，本發明之方法可檢測第I期卵巢癌、第II期卵巢癌、第III期卵巢癌及第IV期卵巢癌。

在另一方面，本發明提供一種可辨識切割型C3多胜肽之試劑的用途，其係用於診斷卵巢癌或監控卵巢癌發展，或用於製備供診斷卵巢癌或監控卵巢癌發展之試劑或套組。

本發明之一種或多種具體實施例之詳細說明，皆於以下說明敘述之。本發明之其他特徵或優點將可藉由以下詳細說明各種具體實施例及所附之申請專利範圍得以明晰。

圖1顯示源自卵巢癌病患(P，patient)及正常個體(N，normal)之血漿樣本之西方墨點分析，係使用抗切割型補體成分3(C3)蛋白之抗體。將源自受測試個體之血漿樣本中之蛋白，於還原狀態進行電泳。左邊的數字，代表分子量(kDa)，是分子重量標記之位置。箭頭係指補體成分3蛋白之約40kDa的胜肽片段。

圖2顯示卵巢癌病患在不同時間點之血漿樣本之西方墨點分析，其中編號1是卵巢癌病患在第一時間點的血漿樣本分析結果，編號2是同一名病患在接受化療後約一年回診的血漿樣本分析結果，顯示切割型C3蛋白含量增加，該病患經進一步確認病情惡化，已發生癌症轉移；編號3是正常個體的血漿樣本分析結果，顯示未測得切割型C3蛋白。

為了提供一清晰且便於瞭解本發明之方式，部分術語係首先進行定義。其他定義亦於詳細說明中有說明。除非另有定義，本文中所有技術及科學性術語，具有與屬於本發明領域具有技藝者所習知之相同意義。

本文所用之術語「一(a)」及「一(an)」係指一種或一種以上(即至少一種)符合文義之物體。舉例，「一種元件」意旨一種元件或多於一種元件。

本文所用之「多胜肽」或「蛋白」乙詞係指透過胜肽鍵相連之由胺基酸殘基所組成之聚合物。「蛋白」乙詞一般係指分子量相對較大(胺基酸殘基較多)之聚合物(如含有高於500、600、700、800、900、1000、1100、1200、 1300、1400、或1500個胺基酸殘基)。「多胜肽」或「胜肽」乙詞一般係分子量相對較小(胺基酸殘基較少)之聚合物(如含有至多達500、400、300、或更少的胺基酸殘基)。胺基酸可以本領域所習知之三個字母或一個字母表示。

本文所述之「約」或「近似」乙詞係指對於該領域具有通常技藝者，可接受之變動程度，其根據所述之內容有可能會有不同程度之不同。一般而言，「約」或「近似」可能係指一數值具有所述數值±10%之範圍。

本文所述之「對象」、「個體」、及「病患」等詞，於此可交換替用，係指任何哺乳動物個體，其適用於診斷、預後、治療或療程，具體而言係指人類。其他個體可包含牛、狗、貓、天竺鼠、兔子、大鼠、小鼠、馬等。

本文所述之「診斷」乙詞，一般包含判定一個體是否有可能患有疾病、病症或喪失功能。此領域具有技藝者通常基於一種或多於一種指標(如一種標記，出現與否、或其的含量，可做為疾病、疾患或喪失功能之有無或嚴重程度的指標)以做出診斷。本領域可以理解的是，診斷並非指以100%準確度確定特定疾病的存在或不存在，而是指在受試者中存在某種疾病的可能性增加。

此處所使用的「治療」乙詞是指為了治癒、癒合、減輕、舒緩、改變、矯正、改善、改進或影響該疾病、該疾病的症狀、該疾病引起的殘疾或罹患該疾病的傾向的目的，而將一或多種活性成分施用或投與至患有該疾病、該疾病的症狀或有罹患該疾病的傾向的個體。

此處所使用的「正常個體」或「對照個體」可交互使用，是指健康正常未罹患所指疾病(如卵巢癌)之個體，可以是指單一正常個體或一群正常個體之族群。

本文所述之「不正常之量」乙詞意旨對於一指標而言，相較於沒有目標疾病(如卵巢癌)之個體或一參考量或一對照量，具有增加之量。具體而言，對於檢驗者而言，所測得之不正常的量，係相較於參考量或對照量，高於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。參考量或對照量可為來自正常個體或對照樣本(如不含有目標疾病之組織或細胞)中的生物標記所測得之量。此領域可運用習知檢測及統計方法，經由分析正常個體族群的樣本的標記檢測量，獲得正常量的數值範圍。

本文所用者，生物標記是一種特徵(如蛋白、基因、基因表現)，其可藉由客觀地測量及評估，以作為正常或不正常生物性反應、疾病、治病過程、或對於治療之反應、或介入治療之指標。標記可包含該特徵、或該特徵之模式、或集合之存在與否，該特徵可為一特定生物反應之指標。該生物標記之測量，可為增加或減少，以代表特定生物性事件或過程。標記主要用於診斷及預後之目的。然而，其亦可用於治療、監控、藥物篩選及其他本文所述之目的，包含評估癌症療法之有效性。

本文所述之生物樣本可藉由任何本文所述之方法分析，所分析之樣本類型可為任何從受診斷之個體中所取得之樣本，包含源自血液、尿液、或腹水之樣本。典型地，血液樣本可為全血或其部分，如血清或血漿、肝素化或EDTA處理後之樣本，以避免凝血。此外，該生物樣本可為組織樣本或生物檢體。

本發明主要(其中至少一部分)發現一種新穎之可信賴的卵巢癌生物標記，即切割型C3多胜肽。經以下實例證實，該生物標記專一性地顯著存在於各種階段及各種細胞態樣的卵巢癌病患的血液樣本中，但患有其它癌症種類或其他疾病的個體之血液樣本，則未檢出此生物標記。因此，本文所述之卵巢癌偵測方法，可辨識個體具有、疑似患有、或有罹患卵巢癌之風險。本文所述之偵測方法可供任何個體(如女性人類個體)，特別是進行初期、常規篩檢，以篩檢出患有卵巢癌之病患，或可能有進展中(progressing)卵巢癌之風險之病患。

I.切割型C3多胜肽可作為新穎的卵巢癌生物標記

補體成分3(C3)為一種血漿醣蛋白，是免疫系統的成員之一，具有約187kDa之分子量，為補體系統中含量最多的成分。補體系統活化時，C3可被轉化酶裂解為三個片段，包括一個較大的C3貝塔(β)片段，以及二段較小的C3阿法(α)片段，包括C3 α鏈片段1(C3 α chain fragment 1)及C3 α鏈片段2(C3 α chain fragment 2)。具體而言，人類C3蛋白包含全長胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示(1663胺基酸)，裂解後的C3β片段為位置23至位置667的胺基酸序列的多胜肽片段，C3 α鏈片段1為位置749至位置954的胺基酸序列的多胜肽片段，以及C3 α鏈片段2為位置1321至位置1663的胺基酸序列的多胜肽片段(約C3全長之C端約具342個胺基酸的胜肽片段)。

如本文所述，本發明係關於切割型C3多胜肽之存在及量與卵巢癌之出現及發展有關連。本文所用之「切割型C3多胜肽」乙詞或類似用語(如「切割型態之C3」)係指C3全長裂解後的C3 α鏈片段2。具體而言，本文所用之切割型C3多胜肽係指人類C3 α鏈片段2，位於人類C3多胜肽之C端約具342個胺基酸的胜肽片段，分子量約為40kDa，又更具體而言，係具有對應於SEQ ID NO：1的C3蛋白之位置1321至位置1663的胺基酸序列的多胜肽片段，其係在SEQ ID NO：1的C3蛋白之位置1320的Arg(R)與位置1321的Ser(S)之間發生水解切割而產生。更特定而言，本文所用之切割型C3多胜肽係具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的多胜肽片段。可以理解的是，多胜肽可以具有有限數量的變化或修飾，其可以在與其活性或功能無關的多胜肽的某一部分內進行，且仍然導致具有可接受程度的等同或類似的生物活性或功能。

根據本發明之切割型C3多胜肽可藉由傳統方法製備，如重組技術，使用適用之宿主細胞(如大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物、昆蟲或無細胞之宿主系統)或合成方式。於部分實例中，切割型C3多胜肽與天然存在者，於至少轉譯後修飾(像是醣化)部分不同。該切割型C3多胜肽可與一醫藥可接受試劑(如：自然界中不會與切割型C3多胜肽共同存在之載劑，或非自然存在之載劑，或如免疫佐劑)混合，以形成一組合物，用於如醫藥用途或如誘導抗體產生。

Ⅱ.偵測切割型C3多胜肽及測量其量之方法

可藉由任何常規技術以測定生物樣本中切割型C3多胜肽之存在及量。於部分具體實施例中，切割型C3多胜肽之存在及/或量，可藉由質譜分析測定，其可以高敏感性及再現性之直接測量該分析物。許多不同之質譜分析方法可被使用。質譜分析的例子包含，但不限於，介質輔助雷射脫附離子化/時差測距(MALDI-TOF)、表面增強鐳射脫附離子化/時差測距(SELDI-TOF)、液相色譜法-質譜聯用(LC-MS)、液相色譜法串聯式質譜儀(LC-MS-MS)、及電噴灑離子化質譜(ESI-MS)。一部分之該方法之實例為串聯式質譜儀(MS/MS)，其牽涉多個步驟以進行質量選擇或分析，通常藉由部分片段化型態分開。

在其他具體實施例中，切割型C3多胜肽的存在及/或量可藉由免疫分析方法判定。免疫分析法之實例包含，但不限於西方墨點分析(還原態或變性電泳)、酵素連結免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、放射免疫沉澱法(RIPA)、免疫螢光法(IFA)及電化學螢光法(ECL)。

在部分實例中，切割型C3多胜肽之存在及/或量，可藉由使用可專一地辨識切割型C3多胜肽的試劑，例如，抗體，予以檢測。

(i)專一性結合至切割型C3多胜肽之抗體

本文所述之「抗體」乙詞係指一種完整的免疫球蛋白，或其片段，以及包含一種含有抗原結合域或抗原結合片段之多胜肽，其可專一地與特定抗原結合。該術語包含但不限於單株的、單專一性的、多株的、多專一性的、人化的、人類的、單股的、嵌合的、合成的、重組的、突變的及雜合的抗體。可根據該領域所習知方法以製備適用的抗體。該抗體可能非自然存在者(如不經過人工方式，即不會於自然界中產生)。

完好的或完整的抗體，包含兩股重鏈，及兩股輕鏈。每一個重鏈係由可變區(V_H)及第一、第二及第三恆定區(C_H1、C_H2及C_H3)所組成，且每一個輕鏈係由一個可變區(V_L)及一個恆定區(C_L)所組成。

「抗原結合域(antigen-binding domain)」或「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」乙詞係指整個抗體分子之部分或區域，其負責與抗原結合。可被抗體所專一地結合或辨識之抗原的一部分，稱作「抗原決定基(或抗原表位，epitope)」。一抗原結合域可包含重鏈可變區(V_H)及輕鏈可變區(V_L)；然而，其並不一定要包含兩者。該於兩股鏈中之可變區域典型地含有三個高可變性區域，稱作互補決定區域(complementarity determining regions；CDRs)。該三個CDRs係由框架區域(framework regions；FRs)所隔開，該FRs較CDRs更為高度保守。重鏈及輕鏈之恆定區與抗原結合無關，但存在著不同功能子(effector)之功用。抗體之分類係基於其重鏈之恆定區之胺基酸序列以分類。5種主要抗體類型或同型為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE，其分別以重鏈之恆定區之γ、μ、α、δ及ε定義之。抗體之抗原結合片段之實例，包含：(1)一Fab片段，一具有V_L、V_H、C_L及C_H1域之單價片段；(2)一F(ab′)₂片段，一具有兩個Fab片段之二價片段，係透過雙硫鍵於橋接區進行連結，即Fab之雙體；(3)一具有V_L及V_H域之Fv片段之單股抗體；(4)一單離的互補決定區(CDR)；(5)一單股的Fv(scFv)，一單股多胜肽鏈，係由V_H域及V_L域所組成，其透過胜肽連接子連結；及(6)一種(scFv)₂包含三個胜肽鏈；兩個V_H域藉由胜肽連接子及雙硫鍵與兩個V_L域結合。

「人類抗體(human antibody)」乙詞包含具有可變的及恆定區之抗體，本質上對應於，或衍生自人類生殖系(germline)的免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體，然而，可包含非編碼人類生殖系免疫球蛋白序列之胺基酸殘基(如藉由隨機或體外特定位置突變所誘導之突變，或藉由體內之體突變)，例如於CDRs中。具體而言，該人類抗體可具有至少1、2、3、4、5或更多位置以胺基酸殘基替換，其非編碼人類生殖系免疫球蛋白序列。

於部分具體實施例中，被應用於本文所述之任何方法之抗體，為可專一性結合至切割型C3多胜肽結合之抗體，例如，可專一性結合至具有SEQ ID NO：2序列之切割型C3多胜肽。

一種抗體其可「專一性」辨認一標的(如切割型C3多胜肽)係為該領域所熟知之術語，且用於判斷該專一性辨認之方法亦是該領域所習知的。若一分子與特定標的抗原(而不與其他標的)之反應或關聯更為頻繁、更為快速、更長時間及/或更高的親和性，則該分子被稱作具有「專一性辨認」的能力。特定而言，若一抗體與其標的抗原(與其他物質相較)之結合，具有更高親和性、傾向、更快速、及/或更長時間，則該抗體對於標靶抗原有「專一性辨認」的能力。例如，一抗體可專一地(或優選地)與切割型C3多胜肽或其抗原決定基結合，則代表該抗體與其之標靶抗原(相較於其與其他抗原結合、，如全長的C3，或於相同抗原中之其他抗原決定基)具有更高之親和性、傾向、更快速、及/或更長時間之結合能力。應可被理解的是，「專一性結合」或「優選結合」並非一定要獨占式結合(雖然可包括獨占式結合)。一般而言，但非必要，提及結合係指優選地結合。

在具體實施例中，用於本文所述方法之抗體，係可專一性辨認切割型C3多胜肽之抗體，例如，可專一性辨認SEQ ID NO：2之多胜肽之抗體。更特定而言，本文所述抗體可專一性辨認切割型C3多胜肽係指抗體可專一性結合至切割型C3多胜肽中的抗原決定基(epitope，抗原表位)，以致於在待測的生物樣本中，該抗體可藉由習知的免疫分析方法(如，西方墨點法，例如，經由分子量大小的判斷)，區辨出是否存在切割型C3多胜肽，或測得切割型C3多胜肽的含量。又在某些實例中，本發明之可專一性辨認切割型C3多胜肽之抗體係可專一性辨認切割型C3多胜肽之N端單一胺基酸殘基，例如，SEQ ID NO：2的N端的絲胺酸(S)，故該抗體不會與全長的C3蛋白結合，並可用以區辨出是否存在切割型C3多胜肽，或進一步測得切割型C3多胜肽的含量。

任何本文所述之抗體，皆屬於本發明之範疇。

(ii)抗體製備

本文所述之抗體可與切割型C3結合，其可藉由該領域所習知之任何方法製備。請參閱，如Harlow and Lane,(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。

於部分具體實施例中，本文所述之抗體可為多株抗體，可依例行多株抗體製備方法獲得。具體而言，將從人類血清純化的切割型C3或以遺傳工程製得之重組胜肽作為抗原，可加入載體蛋白，如牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)或鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)，以增加其免疫原性。將抗原(或與載體蛋白混合者)注射於動物(如兔子)體內誘發免疫反應，可追加免疫，例如，每兩周免疫一次，共免疫約2-5次。後續先以酵素免疫分析法檢測，確保免疫後血清效價大於1：4000即可進行全部採血。採血後，待血液凝固，離心取上清液，即可取得含對抗切割型C3之多株抗體的抗血清。較佳地，可將抗血清予以純化，例如，利用親和性層析法(蛋白A/G)進行免疫球蛋白(Ig)的純化，更進一步以硫酸銨沉澱即可得到含有目標專一性的抗體，也可搭配結合離子交換管柱層析去除沉澱中的雜質。

於部分具體實施例中，抗體專一地與一標靶抗原(如切割型態之C3，如SEQ ID NO：2)結合，可藉由習知融合瘤技術而製備。全長標靶抗原或其片段，可視需要地與載體蛋白(如KLH)結合，以用於致免疫宿主動物，以產生可與該抗原結合之抗體。宿主動物之免疫時程及路徑，一般皆與已建立的及常規用於刺激抗體生成及產生之技術相同(本文進一步說明)。一般技術用於生產小鼠、人化的、及人類抗體，皆為該領域所習知者，且於本文所描述。應考慮的是，任何哺乳動物個體，包含人類或產生抗體之細胞，可被操作以作為生產哺乳動物包含人類之融合瘤細胞株之基礎。一般而言，該宿主動物以腹腔、肌肉、口服、皮下、足底、及/或皮內的方式，接種一定量之免疫原，包含本文所述者。

使用一般體細胞雜和技術(Kohler,B.and Milstein,C.(1975)Nature 256：495-497或修改自Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18：377-381(1982))，可自淋巴球及不死的骨髓瘤細胞以製備融合瘤。可取得之骨髓瘤細胞系，包含但不限於，X63-Ag8.653及該等源自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA之細胞，皆可用於雜合。一般而言，該技術涉及使用融合劑以融合骨髓瘤細胞及淋巴細胞，該融合劑諸如聚乙二醇、或藉由電力方式，皆為該領域具有技藝者所熟知者。經融合後，將細胞自融合培養基中分離出來，並置於選擇性生長培養基中培養，像是次黃嘌呤-氨喋呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine；HAT)培養基，以排出非融合之親代細胞。任何本文所述之培養基，可添加或不添加血清，可被用於培養融合瘤，其可分泌出單株抗體。該等融合瘤經增殖及繼代，如需要，可將上清液以常規免疫方法步驟(如放射免疫分析、酵素免疫分析、或螢光免疫分析)進行分析抗免疫原之活性。

融合瘤可做為抗體之來源，其包含所有衍生物，親代融合瘤之子代細胞，可產生單株抗體，其可與切割的C3結合。可產生該等抗體之融合瘤可使用習知方式於體外或體內進行培養。該單株抗體可從培養基或體液中分離出來，藉由傳統免疫球蛋白純化步驟，像是硫酸銨沉澱、膠體電泳、透析、層析法、及超過濾，如果適用的話。若出現不欲之活性，則可將之移除，例如藉由將該製備物，以一由免疫原所製備之吸收物作用，該免疫原係貼附於一固相，並將所欲之抗體從該免疫原上洗提或釋放出來。使用標的抗原或與蛋白連結之含有標的胺基酸序列之片段，免疫一宿主動物，以獲得產製之抗體(如單株抗體)；其中該抗原係對於免疫物種具有免疫原性，如鑰孔蟲戚血藍蛋白、血清白蛋白、牛的甲狀腺球蛋白、或使用雙功能或衍生劑之豆胰蛋白酶抑制子，例如馬來醯亞胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(透過與半胱胺酸殘基連結)、N-羥基丁二醯亞胺(透過離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl、或R1N=C=NR，其中R及R1為不同之烷基。

若需要，感興趣(如以融合瘤所生產)之抗體(如單株或多株)可進行定序，且該多核苷酸序列可被選殖至一載體中，用於表現或增殖。編碼感興趣抗體之序列可被維持於宿主細胞之載體中，且該宿主細胞可被增殖並冷凍以供未來使用。可選擇地，該多核苷酸序列可被用於進行基因改造成「人化(humanize)」抗體或改善其親和性(親合性成熟度)、或其他抗體之特徵。例如，若該抗體用於臨床試驗中，且對人類進行治療時，該恆定區可被改造以成為更與人類恆定區相似，以避免免疫反應。另外可能經由基因改造該抗體序列，以獲得對於標的抗原更高親和性，及偵測切割C3更高之效率。對於該領域具有技藝者，應可理解的是，可對該抗體進行一種或多種多核苷酸之改變，且仍可維持其與標的抗原之結合專一性。

於其他具體實施例中，完整的人類抗體可使用市售可得小鼠以製備，其經改造可表現專一的人類免疫球蛋白。該轉殖基因動物係設計用於產生更多所欲(如完整人類抗體)、或更強的免疫反應，亦可用於生成人化或人類抗體(humanized or human antibodies)。該技術之實例為Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)之Xenomouse^RTM，及Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)之HuMAb-MouseRTM及TC Mouse^TM。於另一種可能，該等抗體可藉由噬菌體表現或酵母菌技術以製備。請參閱，如，美國專利號5,565,332；5,580,717；5,733,743及6,265,150；及Winter et al.,(1994)Annu.Rev.Immunol.12：433-455。此外，噬菌體表現技術(McCafferty et al.,(1990)Nature 348：552-553)，源自未免疫之貢獻者之免疫球蛋白可變區(V)基因群，被用於產生人類抗體，及體外之抗體片段。

完整抗體(全長抗體)之抗原結合片段可藉由常規方法製備。例如，F(ab')₂片段可藉由胃蛋白酶水解抗體分子以製備，以及Fab片段可藉由還原F(ab')₂片段之雙硫鍵以生成。

基因工程抗體，像是人化抗體、嵌合型抗體、單鏈抗體、及雙特異性抗體，可藉由如傳統重組技術製備。於一實例中，可單離一編碼單株抗體(對標的抗原具專一性)之DNA，並使用常規步驟定序(如藉由使用寡核苷酸探針，其可專一的與編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因結合)。該融合瘤細胞可做為該等DNA之較佳來源。一旦分離後，該DNA可被置入一個或多個表現載體中，接著將其轉染至宿主細胞，像是大腸桿菌細胞、猿的COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞，其不會產生免疫球蛋白，以從該等重組宿主細胞中取得合成之單株抗體。請參閱，如PCT專利公開號WO 87/04462。該DNA可接著被修飾，例如，藉由取代方式，將編碼人類重鏈及輕鏈恆定區之序列，置換成同源的鼠序列，Morrison et al.,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851，或藉由共價結合方式，將編碼免疫球蛋白之序列，全部或部分之編碼序列與一非免疫球蛋白多胜肽之序列連結。於此種方式中，基因工程改造之抗體，像是「嵌合的」或「融合的」抗體，可被製備，且可與標的抗原具專一性結合。

涉及製備「嵌合型抗體(chimeric antibodies)」之技術，皆為該領域所習知者。請參閱如Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger et al.(1984)Nature 312,604；及Takeda et al.(1984)Nature 314：452。

用於構築人化抗體之方法，亦為該領域所熟知者。請參閱，如Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：10029-10033(1989)。於一實例中，親代非人類抗體之V_H及V_L可變區係以該領域所熟知方法進行三維分子模型分析。接著，框架胺基酸殘基被預測對於形成正確CDR結構是重要的，使用相同分子模型分析以辨識出該等框架胺基酸殘基。同時，人類V_H及V_L鏈具有之胺基酸序列，與該等親代非人類抗體係屬同源；該人類胺基酸序列係以親代V_H及V_L序列作為搜尋字，從各種抗體基因資料庫中所找出。接著挑選人類V_H及V_L接受器基因。

位於所挑選之人類接受器基因中之CDR區，可將之以親代非人類抗體之CDR區或其功能性變異體置換。當必需時，位於親代鏈之框架區中之殘基被預測為重要的，係用於與該CDR區交互作用(請參閱前述)，可被用於取代於人類接受器基因中之對應的殘基。

一單鏈抗體可藉由重組技術製備，藉由將編碼重鏈可變區之核苷酸序列，與一編碼輕鏈可變區之核苷酸序列連結。較佳地，一具彎折性之連接子可被加入該兩個可變區域間。或是，於(美國專利號4,946,778及4,704,692)所述之產生單股抗體之技術亦可被用於產生一噬菌體或酵母菌scFv庫及scFv聚落，其對於切割的C3具專一性，且可藉由常規方式從該資料庫中找出來。陽性聚落可接著進一步篩選以找出該等與切割C3結合者。

從該領域所習知方法、及本文所述之方法以製得之抗體，可藉由該領域所習知方法以確認其特性。例如，一種方法係用於辨識與抗原結合之抗原決定基，或「抗原決定基圖譜」。於該領域中有著許多不同已知方法可用於定位及分析蛋白上抗原決定基之位置，包含將抗體抗原複合體結晶結構之解析、競爭式分析、基因片段表現分析、及合成胜肽分析，例如，如Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999第11章所述者。於另一樣本中，抗原決定基圖譜可被用於決定抗體結合之序列。該抗原決定基可為一線性抗原決定基，例如，包含於一單股延伸之胺基酸中、或藉由三維的胺基酸交互作用以形成之構型抗原決定基，其可能不需包含於單股延伸支中(線性序列之主要結構)。可分離或合成(如重組地)不同長度之胜肽(如至少4-6個胺基酸長度)，及可用一抗體以進行結合分析。於另一實例中，該可被抗體結合之抗原決定基，可藉由使用重疊之胜肽(衍生自標的抗原序列)，於一系統性篩選中以判定，以決定抗體結合位置。根據基因片段表現分析，該開放式閱讀框架編碼標的抗原係經隨機片段化，或藉由特定基因構築以片段化，且所表現之抗原片段的反應性可使用抗體以測試判定之。該基因片段可能，例如，藉由PCR以製備之，接著於放射性胺基酸環境中，進行體外轉錄及轉譯成蛋白。抗體與已被放射性標記之抗原片段之結合與否，可藉由免疫沉澱法及膠體電泳判定。部分抗原決定基亦可使用展現於噬菌體顆粒表面之隨機胜肽序列之大型資料庫(噬菌體庫)中以辨識。此外，一個已分析之重疊胜肽片段資料庫，可於一簡單的結合試驗中，用於測試該測試抗體之結合情形。於另一實例中，抗原結合域之突變，可施行功能區切換試驗及丙胺酸篩選突變法以辨識所需、足夠、即/或必須之殘基，以供抗原決定基結合。例如，功能區切換試驗可使用標的抗原之一個突變以施行，其中一切割的C3多胜肽之各種片段，係以一相近、但非抗原性不同之蛋白序列以取代(置換)之。藉由分析與該突變C3結合之抗體，則可評估與特定抗原片段結合之抗體的重要性。與所欲之抗原決定基結合之抗體可藉由抗原決定基定位圖譜以辨識。

Ⅲ.新穎卵巢癌標記於診斷及預後之應用

如本文所述，經蛋白酶分解後之切割型C3多胜肽，被發現與卵巢癌之出現及進展有關係。因此，本文所述之用於篩檢卵巢癌病患的方法、監控卵巢癌進展、及評估卵巢癌治療效果之方法，可使用切割型C3多胜肽作為一可信賴之生物標記。如上所述，本文所述之偵測方法可被用作一種初步的篩檢方法，供任何女性個體以檢測其是否可能患有卵巢癌(尤其是早期卵巢癌)。

藉由該方法所分析之個體，可為任何女性哺乳動物個體，像是人類個體。於部分實例，該個體可具有一種或多種與卵巢癌相關之症狀。於其他實例中，該個體可能具有患有發展成卵巢癌之風險。於另一實例中，該個體為無症狀的。於再一實例中，本文所述之診斷方法可被用作常規篩檢方法，以供健康女性個體，如超過20、35、40、45、50或55歲之女性檢測，以監控潛在之卵巢癌風險或發展。

為了進行本文所述之方法，將取自一有需要之個體之生物樣本(如一人類病患其不具有任何卵巢癌之症狀、或一人類病患具有、疑似有、或患有卵巢癌之風險)偵測、或測量該樣本中切割型C3多胜肽，或其之量，係透過任何該領域所習知方法，像是該等本文所述者，如質譜分析及免疫分析。生物樣本可為生物性液體樣本，像是血液樣本，如血漿或血清樣本。切割的C3可為量化的或質化的方式偵測。任何該領域之有效方法，以測量標記之存在與否、量、或活性，皆包含於本發明中。對於該領域具有通常技藝者具有能力可判定何種方法最適用於測量特定標記。

於一具體實施例中，從須進行測試之個體中取得之樣本，測試切割型C3多胜肽之存在與否。若切割型C3多胜肽可於源自須測試之個體之樣本中測得，則代表該個體被診斷為罹患卵巢癌或具有罹患卵巢癌之風險。

於部分具體實施例中，源自候選個體之樣本中切割型C3多胜肽之量，可藉由與一標準值比較，以判斷是否該候選個體具有或患有卵巢癌之風險。該標準值代表對照組樣本中切割型C3多胜肽之量。該對照樣本可取自一個體(如一女性個體)，其不具有卵巢癌。此外，該對照組樣本可取自多個該等個體之混合物。可選擇地，該等對照組個體與候選個體於，如年齡、性別、及/或種族背景相符。較佳地，該對照組樣本及該候選個體之生物樣本為同一種類之樣本。於部分具體實施例中，若該切割型C3多胜肽被測得、或切割型C3多胜肽之量較標準值高(如高於標準值約10%或更多)，則該候選個體可能被診斷為具有、疑似有、或患有卵巢癌之風險。於部分實例中，使用常規方法，如該等本文所述者，於對照組樣本之切割型C3多胜肽的量係於對照組樣本中無法測得的(標準值係為0，低於偵測極限)。於此例子中，使用相同方法偵測源自一個體之生物樣本中，具有切割型C3多胜肽，係指該個體具有、疑似有、或患有卵巢癌之風險。

本發明之方法專一性且廣泛性辨識多種型態的卵巢癌，以及不同階段的卵巢癌，但患有其它癌症種類或其他疾病的個體之血液樣本，則未檢出此生物標記；且可以血液樣本進行檢測，無須複雜儀器，對受測者接受度高，適合用於大規模篩檢，有助於早期診斷及持續追蹤病況。

本文所述之卵巢癌包括但不限於子宮內膜型(endometrioid)卵巢癌、亮細胞型(clear cell)卵巢癌、漿液型(serous)卵巢癌、黏液型(mucinous)卵巢、及其他類型卵巢癌，例如，卵巢癌肉瘤(ovarian carcinosarcoma)、卵巢未成熟畸胎瘤(Immature teratoma)、卵巢黏液及顆粒型癌(ovarian mucinous and granulosa tumor)及轉移性卵巢癌(Krukenberg，卵巢克魯根勃氏瘤)。

本文所述之卵巢癌包括第I期卵巢癌、第II期卵巢癌、第III期卵巢癌及第IV期卵巢癌。各階段卵巢癌的症狀如表1所述。

表1：各階段卵巢癌的症狀。

於部分具體實施例中，源自候選個體(如卵巢癌病患)之多個樣本中，其切割型C3多胜肽的量可藉由測量，以判定疾病之進展。例如，至少兩個生物樣本(如血清樣本或血漿樣本)可自候選個體中，於不同時間點取得。切割型C3多胜肽的量，於該至少兩個生物樣本中，可藉由本文所述進行測量。若觀察到該切割型C3多胜肽的趨勢，隨著時間(如於較晚獲得之樣本中之切割型C3多胜肽的量，相較於較早獲得之樣本為高時)呈現增加的，該個體係被診斷具有、疑似有或有罹患卵巢癌之風險。若該個體為卵巢癌病患，則切割型C3多胜肽的量呈現增加的趨勢時，則代表卵巢癌進展(惡化)中。

當一個體如人類病患，被診斷為具有、疑似有或患有卵巢癌風險後，該個體可進行進一步之檢驗(如常規物理檢測，包含影像法，如X光攝像、核磁共振成像(MRI)、或超音波或以手術進行活組織檢驗)以確認疾病之發生及/或判定卵巢癌之時期及種類。

於部分具體實施例中，本文所述之方法可進一步包含治療該卵巢癌病患達到至少舒緩與該疾病有關之症狀。該治療可為任何傳統抗卵巢癌療法，包含放射療法、化學療法及外科手術。示例性抗卵巢癌化學療法藥劑包含但不限於，阿糖胞苷(ARA-C)、思停(bevacizumab)、撲類惡(bleomycin)、卡鉑(carboplatinum)、順鉑(cisplatin)、佳鉑帝(carboplatin)、癌德星(cyclophosphamide)、醫百幸(etoposide，VP-16)、剋癌易(docetaxel)、艾黴素(doxorubicin)、健擇(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、好克癌(ifosfamide)、尼拉帕尼(Niraparib)、奧拉帕尼(Olaparib)、汰癌勝(paclitaxel)、磷酸瑞卡帕布(Rucaparib)、太莫西芬(Tamoxifene)、癌康定(topotecan)、敏畢瘤(vinblastine)及敏克瘤(vincristine)。

於另一具體實施例中，於此提供之方法，用於評估於卵巢癌病患中所施予之卵巢癌治療之效力。例如，可從進行卵巢癌治療之卵巢癌病患，於治療期間，收集多個生物樣本。若經治療期間，該切割型C3多胜肽的量呈現減少的趨勢，即切割型C3多胜肽的量於較晚獲得之生物樣本中之量，相較於較早獲得之生物樣本之切割型C3多胜肽的量低的話，則代表該治療對於卵巢癌病患是有效的。相反的，若該切割型C3多胜肽的量，經治療期間，仍維持或甚至增加，則代表該治療對於該病患無效或病情惡化。

此處所使用的「較低」、「減少的」、「降低的」的量或類似用語，是指低於所欲比較的量(如治療前的標記檢測量)，其降低的程度具有一般此領域所認可之統計上之意義。在特定具體實施例中，此降低程度可以是相較於治療前的標記檢測量達20%或以上的降低，30%或以上的降低，40%或以上的降低，50%或以上的降低，60%或以上的降低，70%或以上的降低，80%或以上的降低，或90%或以上的降低。

此處所使用的「較高」、「增加的」、「提高的」的量或類似用語，是指高於所欲比較的量(如治療前的標記檢測量)，其提高的程度具有一般此領域所認可之統計上之意義。在特定具體實施例中，此提高程度可以是相較於所欲比較的量達20%或以上的增加，30%或以上的增加，40%或以上的增加，50%或以上的增加，60%或以上的增加，70%或以上的增加，80%或以上的增加，或90%或以上的增加。

若一卵巢癌療法被認為對於一卵巢癌病患無效時，則可調整治療策略，如增加藥劑量、治療頻率、或改變更適合之療法。

Ⅳ.活體外診斷套組

本發明亦提供施行該方法之套組，其包含本文所述之可專一性辨識切割型C3多胜肽的試劑(如抗體)。該套組可進一步包含供使用該套組之說明，偵測此處所述之切割型態C3多胜肽之存在或含量，藉此偵測卵巢癌，及亦可用於監控卵巢癌進展、或評估於卵巢癌病患所施用之治療效果。

V.抗切割型態C3多胜肽之抗體於偵測卵巢癌之用途

本文所述之任何抗體，其可專一地辨認切割型態C3多胜肽，用於偵測卵巢癌。例如，該抗體可共軛於可測得之標記(如該領域所習知之體內顯像劑)結合，用於診斷之目的。較佳地，該抗體係用於活體外分析來自待測個體的樣本，以免疫分析方法，如西方墨點分析、酵素連結免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、放射免疫沉澱法(RIPA)、免疫螢光法(IFA)及電化學螢光法(ECL)，測定樣本中是否存在切割型C3多胜肽或測定其含量判定。

以本文所述之診斷方法或治療方法所治療之個體可為一女性哺乳動物，較佳地為一人類女性個體。哺乳動物包含，但不限於農場動物、運動動物、寵物、靈長類、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。一個需要該治療之人類個體，可能為一患有卵巢癌之人類病患、疑似患有卵巢癌之人類病患、或患有卵巢癌風險之人類病患。該病患可藉由常規醫療方式或本文所述之診斷方法以辨識。

本文所用之「有效量」係指每一個活性物質之量，可於該個體上賦予療效，無論是單獨使用或與一種或多種其他活性物質合併使用。有效量可能會有所不同，須由該領域具有技藝者判斷，根據需施予時之特定情況、情況之嚴重性、個別病患參數，包含年齡、生理狀況、大小、性別及重量、治療時程、(如果有的話)併行療法的本質、特定施予路徑及其他醫療人員之知識及專業內判斷之可能因素。該等因素對於該領域具有通常技藝者而言為習知的，且可引入而無須進一步常規實驗。一般較佳地為，使用個別組成或其組合物之最大劑量，即為根據明智的醫學判斷之最高安全劑量。應可理解的是，該領域中具有通常技藝者，然而，一病患可能基於醫療理由、生理反應或其他可能的理由，堅持使用較低劑量或可忍受劑量。

根據經驗考量，像是半衰期，一般認為影響劑量之決定。例如，與人類免疫系統相容的抗體，像是人化的抗體、或完全的人類抗體，可以延長抗體之半衰期，及避免該抗體被宿主免疫系統所攻擊。施予的頻率可根據治療期間判定及調整，一般而言，如非必須，可根據治療及/或抑制，及/或改善卵巢癌以調整施予頻率。此外，持續性釋放之抗切割的C3配方亦可適用之。用於維持釋放之各種不同配方及裝置，皆為該領域所習知的。

根據施予路徑，結合的抗體可與適用之醫藥可接受載劑混合，以形成適合的配方。可注射型之組合物可能含有不同的載劑，像是植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、乙醇、及多元醇(甘油、丙二醇、液態聚乙二醇及其類似物)。為了靜脈注射，可藉由點滴方式施予水溶的抗體，係藉由注入含有抗體及生理可接受賦形劑之醫藥配方。生理可接受之賦形劑可包含，例如5%葡萄糖、0.9%生理食鹽水、Ringer’s溶液或其他適用之賦形劑。肌肉內用之配方，如一滅菌配方，其抗體為適用可溶之鹽類，可藉由施予醫藥賦形劑(如供注射用水、0.9%生理食鹽水、或5%葡萄糖溶液)以溶解。

不須進一步詳述，吾人相信該領域具有通常技藝者，可基於以上說明，可應用本發明至其最完整之延伸範圍。因此，以下特定具體實施例僅用於闡述，而非意欲以任何方式來限制本發明之可用範圍。所有本文所引用之文獻，皆以引用之目的或參考文獻方式引用於本文中。

實施例：卵巢癌病患中之補體成分3之特定的蛋白分解片段

首先，透過修飾的二維膠體電泳系統，吾人發現來自部分卵巢癌病患之血漿中，檢測出補體成分3(C3蛋白)之特定片段。透過LC-MS/MS分析其胰蛋白酶水解產物，我們發現該片段具分子量約40kDa。該等數據顯示該C3蛋白的特定片段可能為蛋白分解過程之產物。進一步分析胺基酸序列，得知該C3蛋白的特定片段是人類C3 α鏈片段2，是一段在相對於全長人類C3蛋白SEQ ID NO：1的1320位置與1321位置之間切出的C端片段，具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列。

接著，進行西方墨點法，以進一步瞭解該等蛋白片段之特性。

抗體製備

本發明多株抗體製備方式包含下列步驟：將純化的人類切割型C3多胜肽片段或重組蛋白作為抗原，抗原純度達95%以上。為增加抗原之免疫原性，可將胜肽交聯到適當的載體蛋白上，通常為牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)或鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)。將抗原注入一兔子體內誘發免疫反應，使不同的抗原表位(epitopes)分別誘導B細胞分泌很多不同的免疫球蛋白(抗體，antibodies)。每兩周免疫一次，共免疫5次。後續先以酵素免疫分析法檢測，確保免疫後血清效價大於1：4000即可進行全部採血。待血液凝固後，離心取上清液，即得抗血清。隨後此正確抗體分子之純化，即利用親和性層析法(蛋白A/G)進行免疫球蛋白(Ig)的純化，以硫酸銨沉澱即可得到含有目標專一性的抗體。可搭配結合離子交換管柱層析去除沉澱中的雜質。

西方墨點分析

將收集自人類個體之血漿樣本中之蛋白與6X Laemmli樣本緩衝液混合，該緩衝液含有120mM Tris-HCl、pH 6.8、2% SDS(w/v)及10%蔗糖(w/v)。於部分樣本，另外加入1%之2-巰基乙醇。經過電泳分離，使用標準技術將蛋白轉移至Immobilon PVDF膜(Millipore Corp.)上。將點墨後之膜以阻斷緩衝液(含有1%山羊血清)進行阻斷，於室溫作用1小時，接著以兔抗補體成分3抗體作用。經三次以Tris緩衝之生理食鹽水(含有0.1% Tween 20)清洗後，將膜以過氧化酶結合之山羊抗兔IgG(Sigma-Aldrich)作用。化學螢光係使用LAS-4000(Fujifilm，日本)偵測。

結果

西方墨點分析顯示，於卵巢癌病患樣本中偵測到一特定的補體成分3之片段(切割型C3多胜肽片段)，約40kDa大小。如圖1所示，來自卵巢癌病患之樣本可檢測到切割型C3多胜肽片段，但來自正常個體之樣本則未測出。因此，該切割型C3多胜肽片段可被作為一卵巢癌之診斷指標(特異性地出現在卵巢癌患者血漿樣本中，但在正常個體的血漿中則未檢出)。

為確認此切割型C3多胜肽片段對於卵巢癌之專一性，取用患有其它癌症種類或其他疾病的人類個體之血漿樣本，進行西方墨點分析。結果如表2所示。

結果顯示，其它癌症種類或其他疾病的人類個體之血漿樣本，均未檢出切割型C3多胜肽片段之存在(檢出率為零)。

相較之下，取用患有不同卵巢癌期別的人類個體之血漿樣本，進行西方墨點分析。結果如表3所示。

結果顯示，切割型C3多胜肽片段與卵巢癌有顯著關聯性，在不區分卵巢癌期數的病患中，總數28名病患中有22名病患檢出切割型C3多胜肽片段，陽性百分比高達78.6%，檢出率將近八成，故可作為卵巢癌的指標；特別是初期(I期)陽性百分比高達86.7%，檢出率接近九成，這是現有檢測技術都無法達到的高檢出率，對於卵巢癌的早期診斷及篩檢有極大助益。

我們進一步分析卵巢癌病患的型態，分析切割型C3多胜肽片段之生物標記是否廣泛性地存在於不同型態的卵巢癌病患中。結果如表4所示。

結果顯示，切割型C3多胜肽片段對於不同型態的卵巢癌有顯著關聯性，表示可經由檢測切割型C3多胜肽片段，廣泛地篩檢出多種型態的卵巢癌，尤其對於目前檢測率極低的亮細胞型卵巢癌，高達100.0%的檢出率，對於卵巢癌的早期診斷及篩檢有極大助益。

此外，圖2顯示卵巢癌病患在不同時間點之血漿樣本之西方墨點分析，其中編號1是卵巢癌病患在第一時間點的血漿樣本分析結果，編號2是同一名病患在接受化療後約一年回診的血漿樣本分析結果，顯示切割型C3蛋白含量增加，該病患經進一步確認病情惡化，已發生癌症轉移；編號3是正常個體的血漿樣本分析結果，顯示未測得切割型C3蛋白。結果顯示，切割型C3多胜肽片段可作為監測卵巢癌治療效果的指標，含量增加表示卵巢癌可能惡化。

吾人證實約40kDa之切割型C3多胜肽片段係特異性地存在於卵巢癌病患中，可作為篩檢卵巢癌之生物標記，也可作為監測卵巢癌治療效果的指標。因此，本發明首次提出一種卵巢癌篩檢技術，其可專一性地辨識患有卵巢癌、疑似患有卵巢癌、或可能患有卵巢癌風險之病患，可作為於早期(即於任何症狀發生前)或經治療後的預後指標。本發明之技術可發展出針對卵巢癌的檢驗試劑，以切割型C3蛋白作為卵巢癌之篩檢及追蹤治療後病況之生物標記。相較於先前技術，本發明之技術大幅提高卵巢癌檢出率，不但可廣泛性辨識各種類型的卵巢癌，也可辨識各種期別的卵巢癌，特別是早期檢出率相當高(可接近九成)，且偽陽性低(其他種類的癌症或病症的病患樣本未檢出切割型C3多胜肽片段之存在)，是卵巢癌篩檢的重大突破，又可從個體之血液樣本以簡單的蛋白測量方式完成檢測，屬於非侵入式的檢驗，病患接受度高，適合發展大規模的早期篩檢；另一方面，亦可作為監測卵巢癌治療效果的指標，可持續追蹤患者病況，以便對治療效果不佳的患者，能及時調整治療方案，避免或延緩惡化。

序列資訊

補體成分3(智人)-全長(SEQ ID NO：1)

補體成分3(智人)C3α鏈片段2(1321-1663 a.a.)(SEQ ID NO：2)

補體成分3(智人)C3α鏈片段1(749-954 a.a.)(SEQ ID NO：3)

補體成分3(智人)C3β片段(23-667 a.a.)(SEQ ID NO：4)

<110> 豐宥科技股份有限公司

<120> 卵巢癌生物標記及其應用

<130> 0579/OLC0002TW

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1663

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 343

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 206

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

<210> 4

<211> 645

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Claims

一種偵側卵巢癌之方法，包含：(a)提供來自待測個體之生物樣本；(b)檢測該來自待測個體之生物樣本之切割型補體成分3(C3)多胜肽的含量，獲得切割型C3多胜肽檢測量；(c)比較該切割型C3多胜肽檢測量與來自正常個體之切割型C3多胜肽正常量，獲得比較結果；以及(d)根據該比較結果判斷該待測個體罹患卵巢癌之可能性，其中如該比較結果顯示切割型C3多胜肽檢測量高於切割型C3多胜肽正常量，則判斷該待測個體患有卵巢癌或有罹患卵巢癌之風險。
如請求項1之方法，其中該切割型C3多胜肽為人類C3 α鏈片段2。
如請求項1之方法，其中該切割型C3多胜肽具有對應於SEQ ID NO：1的位置1321至位置1663的胺基酸序列。
如請求項1之方法，其中該切割型C3多胜肽具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
如請求項1之方法，其中步驟(b)之檢測係由質譜分析或免疫分析法進行。
如請求項1之方法，其中步驟(b)之檢測係由免疫分析法進行，該免疫分析法使用專一性結合至具有SEQ ID NO：2的切割型C3多胜肽之抗體。
如請求項1之方法，其中該生物樣本為體液樣本、組織樣本、或生物檢體樣本。
如請求項7之方法，其中該生物樣本為血液樣本、尿液樣本、或腹水樣本。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該卵巢癌係選自由子宮內膜型(endometrioid)卵巢癌、亮細胞型(clear cell)卵巢癌、漿液型(serous)卵巢癌、及黏液型(mucinous)卵巢癌所組成之群組，或選自由卵巢癌肉瘤(ovarian carcinosarcoma)、卵巢未成熟畸胎瘤(Immature teratoma)、卵巢黏液及顆粒型癌(ovarian mucinous and granulosa tumor)、及轉移性卵巢癌(Krukenberg，卵巢克魯根勃氏瘤)所組成之群組。
如請求項1至9中任一項之方法，其中該卵巢癌係選自由第I期卵巢癌、第II期卵巢癌、第III期卵巢癌及第IV期卵巢癌所組成之群組。
一種監控卵巢癌病患之卵巢癌發展之方法，該方法包含：(a)於第一時間點，提供源自該病患之第一生物樣本；(b)於第二時間點，提供源自該病患之第二生物樣本，其中該第二時間點係晚於第一時間點；(c)檢測第一生物樣本中之切割型C3多胜肽的含量，獲得切割型C3多胜肽第一檢測量，以及檢測第二生物樣本中之切割型C3多胜肽的含量，獲得切割型C3多胜肽第二檢測量；(d)比較切割型C3多胜肽第一檢測量與切割型C3多胜肽第二檢測量，獲得比較結果；以及(e)基於該比較結果，判斷該病患中之卵巢癌進程，其中如該比較結果顯示切割型C3多胜肽第二檢測量高於切割型C3多胜肽第一檢測量，則表示卵巢癌發展中。
如請求項11之方法，其中該病患係接受卵巢癌治療，以及該第一生物樣本及第二生物樣本係取自於治療之前或治療之後，或治療期間。
如請求項11之方法，其進一步包含評估該卵巢癌治療對於該病患之療效，其中如經治療後、或於療程期間，該切割型C3多胜肽的含量呈現降低趨勢，則代表該療法對於該病患有效。
如請求項11之方法，其中該切割型C3多胜肽為人類C3 α鏈片段2。
如請求項11之方法，其中該切割型C3多胜肽具有對應於SEQ ID NO：1的位置1321至位置1663的胺基酸序列。
如請求項11之方法，其中該切割型C3多胜肽具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
如請求項11之方法，其中步驟(c)之檢測係由質譜分析或免疫分析法進行。
如請求項11之方法，其中步驟(c)之檢測係由免疫分析法進行，該免疫分析法使用專一性結合至具有SEQ ID NO：2的切割型C3多胜肽之抗體。
如請求項11之方法，其中該生物樣本為體液樣本、組織樣本、或生物檢體樣本。
如請求項19之方法，其中該生物樣本為血液樣本、尿液樣本、或腹水樣本。
如請求項11至20中任一項之方法，其中該卵巢癌係選自由子宮內膜型(endometrioid)卵巢癌、亮細胞型(clear cell)卵巢癌、漿液型(serous)卵巢癌、及黏液型(mucinous)卵巢癌所組成之群組，或選自由卵巢癌肉瘤(ovarian carcinosarcoma)、卵巢未成熟畸胎瘤(Immature teratoma)、卵巢黏液及顆粒型癌(ovarian mucinous and granulosa tumor)、及轉移性卵巢癌(Krukenberg，卵巢克魯根勃氏瘤)所組成之群組。
如請求項11至20中任一項之方法，其中該卵巢癌係選自由第I期卵巢癌、第II期卵巢癌、第III期卵巢癌及第IV期卵巢癌所組成之群組。
一種可辨識切割型C3多胜肽之試劑的用途，其係用於診斷卵巢癌或監控卵巢癌發展，或用於製備供診斷卵巢癌或監控卵巢癌發展之試劑或套組。
如請求項23之用途，其中該切割型C3多胜肽為人類C3 α鏈片段2。
如請求項23之用途，其中該切割型C3多胜肽具有對應於SEQ ID NO：1的位置1321至位置1663的胺基酸序列。
如請求項23之用途，其中該切割型C3多胜肽具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
如請求項23之用途，其中該試劑為抗體。