TWI454698B - 用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌、方法與套組 - Google Patents
用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌、方法與套組 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI454698B TWI454698B TW101118213A TW101118213A TWI454698B TW I454698 B TWI454698 B TW I454698B TW 101118213 A TW101118213 A TW 101118213A TW 101118213 A TW101118213 A TW 101118213A TW I454698 B TWI454698 B TW I454698B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- polypeptide antigen
- seq
- antigen sequence
- detecting
- tumor
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本發明是有關於一種腫瘤標誌,且特別是有關於一種用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌。
許多研究顯示,腫瘤患者的血清或血漿中存在特定的腫瘤相關抗原能誘導有機體產生自身抗體,而在血清或血漿中既存在腫瘤抗原,也存在針對該腫瘤抗原的自身抗體。
因此,既可以利用抗體檢測特定的腫瘤相關抗原,也可以利用抗原檢測腫瘤患者所誘導產生的腫瘤自身抗體。利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原來檢測腫瘤是否發生要高得多。這是因為很多腫瘤相關抗原不僅在腫瘤患者體內存在,在正常人體內也存在,導致檢測腫瘤相關抗原作為診斷依據可信度差。反觀因受誘導產生的自身抗體,在正常人體內含量很低至檢測不到或完全不存在;倘若檢測出的體內特定受誘導產生的自身抗體水平明顯增高,則表示體內存在異常免疫情況。所以,體內特定相關抗原水平發生波動,預示著疾病(如腫瘤)的存在或原有疾病加重。
近年來的研究表明,在惡性腫瘤體積發展到可用現代影像學技術檢出之前3至5年,患者血中即會出現高濃度的腫瘤相關抗原自身抗體。因此,檢測血中腫瘤相關抗原自身抗體具有預測腫瘤發病風險和早期診斷腫瘤的重要價值,是腫瘤臨床診斷領域的重點發展方向之一。然而,目
前所使用的抗體檢測方法敏感度低,特異性差,假陰性比率可高達50%以上。其主要原因在於每一種腫瘤相關抗原自身抗體由於含量太低,故在患者中的陽性檢測率平均僅在10%左右,進而導致過高的假陰性比率。
傳統上,以重組蛋白為抗原,要經過載體構建、轉染、表現、篩選、純化等繁瑣的過程,蛋白空間結構複雜,抗原表位不易暴露,因此抗原抗體結合的特異性差。另外,習知的ELISA法的高靈敏性對純化技術的穩定性要求極高,成本昂貴。
如何提高診斷試劑敏感度是當前需要解決的關鍵問題。
本發明之一態樣係提供一種用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌,包含一FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及一CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)。其中FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)與一生物樣本中之一特異性自身抗體結合,並藉由分析特異性自身抗體之表現量,以檢測腫瘤是否發生。
根據本發明之提供一種用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌的一實施例,生物樣本係選自由血清、血漿、唾液、尿液、羊水、淚液、汗液、奶水、淋巴液及其組合所組成之群組。且上述之特異性自身抗體為IgG抗體。
根據本發明之另一實施例,FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)用以檢測之
實體腫瘤為肺癌、胃腸道腫瘤、食管癌、黑色素瘤、胰臟癌、常見婦科惡性腫瘤及泌尿科腫瘤。
本發明之另一態樣係提供一種用於檢測腫瘤發生之方法,步驟包含提供提供一生物樣本,此生物樣本係選自由血清、血漿、唾液、尿液、羊水、淚液、汗液、奶水、淋巴液及其組合所組成之群組。接著,提供上述之該FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及該CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)偵測該生物樣本中之一特異性自身抗體之表現量,其中上述之抗原與該特異性自身抗體結合。然後,分析該特異性自身抗體之表現量。
根據本發明之一實施例,更包含設計一內參多肽抗原序列(SEQ ID NO.3),係一與人類蛋白組無免疫交叉反應之大鼠多肽序列。
根據本發明之另一實施例,更包含設計一質控系統(Quality Control System,QC System),其中生物樣本質控系統包含製備一質控樣本,且質控樣本係為100至1000健康之生物樣本的混合樣本。生物樣本係來自人類
根據本發明之又一實施例,分析方法係使用一特異結合指數(SBI)分析系統。
本發明之又一態樣係提供一種用於檢測腫瘤發生之套組,包含至少一特異多肽抗原序列、一內參多肽抗原序列(SEQ ID NO.3)、一質控樣本以及一酶標抗體。
根據本發明之一實施例,特異多肽抗原序列至少包含FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)以及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)。內參多肽抗原序列係一與人類蛋白組無
免疫交叉反應之大鼠多肽序列(SEQ ID NO.3)。酶標抗體係一辣根過氧化物酶標記的羊抗人抗體。
根據本發明之另一實施例,此用於檢測腫瘤發生之套組更包含作為腫瘤發生之早期診斷。
本發明透過自行設計的FOXP3和CD25的多肽抗原序列,檢測腫瘤患者血清中自身抗體量,預測腫瘤發生的危險性,並為腫瘤新藥研究提供可靠的數據。應用以上多肽抗原發現FOXP3和CD25蛋白的自身抗體,可用於製備腫瘤早期診斷試劑和開發治療腫瘤的靶向藥物。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述;但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。以下所揭露的各實施例,在有益的情形下可相互組合或取代,也可在一實施例中附加其他的實施例,而無須進一步的記載或說明。
本發明係提供一種用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌,包含一FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)以及一CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)。FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)與一生物樣本中之一特異性自身抗體結合,並藉由分析該特異性自身抗體之表現量,以檢測腫瘤是否發生。
惡性腫瘤已知可通過各種直接或間接的機制來逃避機體免疫系統的監控。研究已經證明,調節性T細胞
(Regulatory T Cell,Treg cell)與腫瘤免疫逃避機制密切相關。利用新的可當腫瘤標誌物的自身抗體,然後與現有已知的自身抗體組合成具有敏感度高和特異性強的診斷試劑盒。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌以及出現淋巴結轉移的黑色素瘤患者的外周血淋巴細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞中,存在調節性T細胞比例增高現象。調節性T細胞透過細胞與細胞直接接觸或細胞因子的釋放,對效應性CD4+
CD8+
T細胞活化和增殖發揮抑制作用。其作用機制主要是抑制CD4+
T細胞增生、抑制腫瘤特異性抗原激活的CD4+
效應細胞分泌IL-2,抑制CD8+
IFN2C和TNF2A產生,並在腫瘤微環境中能限制毒殺性T細胞(Cytotoxin T Cell,CTL)毒性顆粒釋放,使腫瘤細胞逃避免疫殺傷。
根據本發明之一實施例,腫瘤標誌包含之FOXP3和CD25均為調節性T細胞的主要表面標誌。
FOXP3是叉頭樣轉錄因子家族的成員,早期被發現特異地表達在CD4+
CD25+
調節性T細胞表面,與其發育和功能密切相關,在一定程度上可以反映CD4+
CD25+
調節性T細胞的水平和功能活性。隨後的研究發現FOXP3在肺癌、黑色素瘤細胞、胰腺癌細胞等腫瘤細胞中都有表現。同時FOXP3是調節性T細胞發育的一個關鍵轉錄因子,雖然有個別研究顯示FOXP3在少量的CD4+
CD25-
T細胞和CD8+
T細胞上也有表達,但目前FOXP3仍然被認為是CD4+
CD25+
調節性T細胞的一個最特異標誌。越來越多的證據表明CD4+
CD25+
調節性T細胞可能在腫瘤免疫逃避機制具有關鍵作用。
調節性T細胞源於胸腺的CD4+
T細胞,其表現的IL-2受體的α鏈被命名為CD25,CD25是調節性T細胞活化的重要標誌。CD25作為I型跨膜蛋白對多種T細胞和B細胞活化亦發揮關鍵作用。CD25與CD122共同組成高親和力的IL 2受體,它們可溶性受體即sIL-2R被證實與多種腫瘤發生相關,已成為幾種腫瘤發生進展的臨床標誌物。國內外研究顯示,在CD4+
CD25+
T細胞中,只有高度表現CD4+
CD25+
的細胞才是具有免疫抑制功能的調節性T細胞。同時研究發現肺癌、食道癌、乳腺癌、卵巢癌、胃腸道腫瘤等多種腫瘤患者外周血和腫瘤局部調節性T細胞增加。調節性T細胞透過抑制活化的T細胞,以限制免疫反應的發生,從而在維持腫瘤免疫耐受中發揮重要作用。動物實驗已證實,給荷瘤小鼠(Tumor-bearing mice)應用抗CD25單抗可抑制動物體內調節性T細胞,可提高小鼠抗腫瘤免疫功能。體外實驗證實從外周血中去除調節性T細胞,可以產生更多的細胞毒細胞,包括CTL、淋巴球素活化的殺手細胞(Lymphokine-activated killer cell LAK)和自然殺手細胞(NK cell)等。最新研究發現,在腦膠質瘤患者中隨疾病發展,CD4+
FOXP3+
調節性T細胞時間依賴性增加的同時伴隨CD25的高度表現,而應用抗CD25單抗可顯著抑制CD4+
FOXP3+
調節性T細胞的增加。抗原抗體的結合實際上只發生在抗原決定基和抗體的抗原結合位點之間,兩者在空間結構和空間構型上完全互補。因此抗原決定基就可以代表整個蛋白與抗體結合的狀態與親和特性。
發明人遵循以下原則設計多肽抗原序列:
1.選擇細胞膜蛋白表面區域;2.選擇不形成a-helix的序列;3.兩端的肽段比中間的排列合理;4.避免蛋白內部重複;5.避免同源性強的肽段;6.序列中盡量避免Cys和Glu,不可以有太多的Pro,但有1-2個Pro利於肽鏈結構穩定,對產生特異性抗體有益。
此外,該多肽抗原必須含有人類白細胞二類抗原(HLA)系統的限制性表位,包括HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ的限制性表位。這些表位可被90%以上華人群體的HLA二類抗原系統所識別。
基於以上抗原設計原則及FOXP3和CD25蛋白的生物學特性,本發明利用生物信息學和多個表位預測模擬軟件,分析與抗原性相關的參數,設計了FOXP3和CD25的線性多肽抗原序列(請見表一)。
由以上多肽抗原序列可知,FOXP3線性多肽抗原由32個氨基酸殘基組成,共含11個重疊的抗原表位,可檢測至少11種單克隆抗體(monoclonal antibody)。CD25線性多肽抗原由31個氨基酸殘基組成,共含12個重疊的抗原表位,可檢測至少12種單克隆抗體(monoclonal antibody),具有高度的特異性。上述多肽抗原經固相化學法合成後純化製成95%純度的粉末狀,使用前溶於67%的乙酸中,濃度5mg/ml,作為儲備液(原液),並儲存於-20度冰箱內。
FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)會與生物樣本中之一特異性自身抗體結合。在一實施例中,生物樣本係選自由血清、血漿、唾液、尿液、羊水、淚液、汗液、奶水、淋巴液及其組合所組成之群組。此外,對生物體來說,FOXP3多肽抗原及CD25多肽抗原為外來抗原,會誘發生物體中IgG抗體表現量上升,使得IgG抗體與外來抗原結合並清除。在另一實施例中,特異性自身抗體為IgG抗體。
在又一實施例中,FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)用以檢測的實體腫瘤
為肺癌、胃腸道腫瘤、食管癌、黑色素瘤、胰臟癌、常見婦科惡性腫瘤及泌尿科腫瘤。
本發明之另一態樣係提供一種用於檢測腫瘤發生之方法,步驟包含提供一個體的生物樣本,此生物樣本係選自由血清、血漿、唾液、尿液、羊水、淚液、汗液、奶水、淋巴液及其組合所組成之群組。
提供上述之FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2),並且偵測該生物樣本中之一特異性自身抗體之表現量,其中上述之抗原與特異性自身抗體結合。在一實施例中,此特異性自身抗體為IgG抗體。
作為本發明的一實施例,可利用本發明實施例中之新穎腫瘤標誌物的自身抗體,結合現有已知的自身抗體,進而組合成具有敏感度高和特異性強的診斷套組。
在另一實施例中,偵測該生物樣本中之一特異性自身抗體之表現量的方法係應用上述之FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2),以一改良式之酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)偵測生物樣本的特異性抗體。本實施例中所使用之酵素免疫分析法包含提供一內參多肽抗原序列(SEQ ID NO.3),請參考表一,此內參多肽抗原序列(SEQ ID NO.3)係一與人類蛋白組無免疫交叉反應之大鼠多肽序列,目的是減少非特異性結合反應的干擾
根據本發明之一實施例,於酵素免疫分析法使用一質控系統(Quality Control System,QC System),此質控系統包
含製備一質控血樣。質控血樣係為100至1000健康之生物樣本的混合樣本。此所指生物樣本係與上述一樣。
分析該特異性自身抗體之表現量。在又一實施例中,分析方法係使用一特異結合指數(SBI)分析系統。特異結合指數(SBI)計算公式如下:SBI=(特異多肽抗原OD值-對應特異多肽抗原之陰性對照OD值)/(內參多肽抗原OD值-對應內參多肽抗原之陰性對照OD值)。
本發明之又一態樣係提供一種用於檢測腫瘤發生之套組,包含至少一特異多肽抗原序列、一內參多肽抗原序列(SEQ ID NO.3)以及一酶標抗體。
在一實施例中,特異多肽抗原序列為FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)以及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)。內參多肽抗原序列係一與人類蛋白組無免疫交叉反應之大鼠多肽序列(SEQ ID NO.3)。酶標抗體係一辣根過氧化物酶標記的羊抗人抗體。
在另一實施例中,此用於檢測腫瘤發生之套組更包含作為腫瘤發生之早期診斷。
首先,設計酶標板,每份血漿樣本各設人FOXP3和CD25多肽抗原雙重複、內參多肽抗原雙重複和陰性對照雙重複(NC)。內參多肽抗原為大鼠多肽抗原(gAg),其工作濃度範圍>15μg/ml。
多肽抗原用包被液(製備方法請參考表2)稀釋成工
作液濃度後,包被於96孔酶標板(Nunc-Immuno Maxisorp,mfr 442404,Sigma-Aldrich)上,每孔加100μl。根據抗原稀釋曲線確定FOXP3和CD25多肽抗原包被濃度為7.5至15.0μg/ml,內參多肽抗原包被濃度範圍為15至20μg/ml,塗抹內參多肽抗原,利用包被液稀釋內參多肽抗原濃度為10至20μ
g/ml濃度,每孔加100μ
l,對應特異多肽抗原三重複。覆蓋後於4℃過夜。其中特異多肽抗原濃度應以質控血樣(Quality control,QC)的特異結合指數(Specific Binding Index,SBI)參照標準,範圍在1至1.4之間。上述之質控血樣為100-1000健康人血清或血漿之混合樣本,分裝20μ
l為一管,保存於-20℃,長期保存則置於-80℃。
培養人血漿,以洗滌液(製備方法請參考表3)清洗每孔3至6次,利用分析液(DS98200,Invitrogen)將血漿1:200-500稀釋,每孔加100μl,於37℃或室溫培養2至3小時。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG並培養,以洗滌液清洗每孔3至6次,利用洗滌液(T9039,Sigma-Aldrich)稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG(A8667,Sigma-Aldrich),每孔加100μl,室溫(約25℃)培養約2小時。辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG工作範圍為1:30000至1:50000。
使樣本顯色,以洗滌液清洗每孔3至6次,顯色步驟可採用任何習知顯色方法,例如使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)過氧化物肽的底物(SB01,Invitrogen),每孔加100μl,室溫避光15至30分鐘。
接著檢測吸光值,每孔加50μl反應終止液(SS03100,
Invitrogen),10分鐘內使用光吸收酶標儀(BioTeck ELx800,美國)檢測OD值,以450nm為測試波長,630nm為參考波長,得到特異多肽抗原OD值、對應特異多肽抗原之陰性對照OD值、內參多肽抗原OD值及對應內參多肽抗原之陰性對照OD值。
質控系統系為各樣本設雙重複,可測得OD1和OD2,取平均OD值。接著計算標準差(SD),標準差(SD)=OD1-OD2/OD1+OD2,離散度0.1,為有效結果;離散度>0.1,為無效結果。質控血樣(Quality control,QC)為取100份健康人血清等體積混合,代表人群的普遍情況,每板均設2個QC血漿孔,以QC血漿孔的OD值變異水平判定結果的穩定性。批間變異CV=所有批次QC孔SD/所有批次QC孔OD均值<20%。批內變異CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值<10%。
數據分析係採用SPSS for Windows 17.0軟件進行統計學分析。採用特異結合指數(Specific binding index,SBI)來判定FOXP3和CD25多肽抗原與血漿自身抗體的結合程度,SBI=(FOXP3或CD25 OD值-NC OD)/(gAg OD值-NC OD),NC為各樣本的陰性對照。ROC曲線是根據一系列不同的二分類方式(分界值或決定閾),以真陽性率(靈敏度)為縱坐標,假陽性率(1-特異度)為橫坐標繪製的曲線。ROC曲線下的面積值在1.0和0.5之間。在AUC>0.5的情況下,AUC越接近於1,說明診斷準確度越好。ROC曲線將靈敏度與特異性以圖示方法結合在一起,可準確反映某分析方法特異性和敏感性的關係,是試驗準
確性的綜合代表。該發明採用Analyse-it for Microsoft Excel軟件繪製ROC曲線,計算曲線下面積(AUC),以健康人SBI平均值+2SD判為陽性,判定靈敏度和特異度;進行秩和(Z)檢驗,檢驗一類錯誤水準為a=0.05。
由第1圖可知,CD25濃度5至10μg/ml時,隨著濃度的增大,SBI值逐漸下降,當FOXP3多肽抗原濃度10至15μg/ml時,隨著濃度的增大,SBI值逐漸上升。此SBI結合曲線表明,當CD25多肽抗原為5μg/ml(0.5μg/well)的較低濃度時,96孔肽標板的板底沒有被鋪滿,導致非特異性反應高,所以此時SBI值偏高,為假陽性結果;隨著CD25多肽抗原濃度增高,抗原逐漸鋪滿整個板底,其阻斷作用顯現,非特異性反應逐漸減小,到10 μg/ml時非特異性反應最低,此時CD25多肽抗原與IgG抗體的特異性結合開始出現,並隨著抗原濃度的增高逐漸增強,至15μg/ml時結合力最強,之後趨於平穩。此SBI結合曲線充分展現了CD25多肽抗原與血漿中自身IgG抗體的特異性結合反應過程。
由第2圖可知,FOXP3濃度於5至12.5μg/ml時,隨著濃度的增大,SBI值逐漸下降,當FOXP3多肽抗原濃度
12.5至15μg/ml時,隨著濃度的增大,SBI值逐漸上升。此SBI結合曲線表明,當FOXP3多肽抗原為5μg/ml(0.5μg/well)的較低濃度時,96孔酶標板的板底沒有被鋪滿,導致非特異性反應高,所以此時SBI值偏高,為假陽性結果;隨著FOXP3多肽抗原濃度增高,抗原逐漸鋪滿整個板底,其阻斷作用顯現,非特異性反應逐漸減小,到12.5μg/ml時非特異性反應最低,此時FOXP3多肽抗原與IgG抗體的特異性結合開始出現,並隨著抗原濃度的增高逐漸增強,至15μg/ml時結合力最強,之後趨於平穩。此SBI結合曲線充分展現了FOXP3多肽抗原與血漿中自身IgG抗體的特異性結合反應過程。
收集501份腫瘤患者及健康人血漿樣本。健康組227例,平均年齡為57.07±10.36歲,其中男134例,女92例。肺癌組274例,平均年齡為57.5±9.2歲,其中男177例,女97例。健康組與肺癌組在性別、年齡匹配,具有可比性(P>0.05)。
檢測結果由表4和5可知,肺癌患者血漿中FOXP3多肽抗原的IgG抗體ROC曲線下面積(AUC)為0.7,靈敏度為20.4%,特異度為90.3%。肺癌患者血漿中與FOXP3多肽抗原結合的IgG抗體陽性率高於健康組(Z=-7.68,P<0.001)。
由表4和5可知,肺癌患者血漿中CD25多肽抗原的IgG抗體ROC曲線下面積(AUC)為0.7,靈敏度為35%,
特異度為90%。肺癌患者血漿中與CD25多肽抗原結合的IgG抗體陽性率高於健康組(Z=-7.48,P<0.001)。
以上數據充分表明,利用本發明所設計的多肽抗原檢測得到的肺癌患者自身抗體IgG水平與正常健康組比較有明顯統計學差異。
樣本來源為收集322份腫瘤患者及健康人血漿樣本。健康組227例,年齡,平均年齡為57.07±10.36歲,其中男134例,女92例。食道癌95例。食道癌組95例,平均年齡為58.62±7.46歲,其中男48例,女47例。健康組與食管癌組在性別、年齡匹配,具有可比性(P>0.05)。
檢測結果由表6和7可知,食管癌患者血漿中FOXP3多肽抗原的IgG抗體ROC曲線下面積(AUC)為0.7,靈敏度為31.6%,特異度為90.3%。食管癌患者血漿中與FOXP3多肽抗原結合的IgG抗體陽性率明顯高於健康組(Z=-7.11,P<0.001)。
由表6和7可知,食管癌患者血漿中CD25多肽抗原的IgG抗體ROC曲線下面積(AUC)為0.68,靈敏度為38.0%,特異度為90%。食管癌患者血漿中與CD25多肽抗原結合的IgG抗體陽性率明顯高於健康組(Z=-4.87,P<0.001)。
以上數據充分表明,利用本發明所設計的多肽抗原檢測得到的食管癌患者自身抗體IgG水平與正常健康組比較有顯著性統計學差異。
表6. 食道癌患者中FOXP3和CD25自身IgG抗體檢測對比分析結果
本發明利用自行設計的FOXP3和CD25多肽抗原,採用本發明之改良式ELISA法檢測肺癌和食管癌患者血清中特異性FOXP3和CD25蛋白自身IgG抗體。自身IgG抗體水平提高表明腫瘤患者體內FOXP3和CD25蛋白的表現量增加,預示患者可能出現原發性或繼發性腫瘤,可以預測腫瘤發生的危險性,指導臨床醫生對腫瘤的早期診斷。
此外,本發明應用FOXP3和CD25多肽抗原檢測到肺癌及食管癌患者血清中的特異性自身IgG抗體,並且此反應具有高特異性和高靈敏性。FOXP3和CD25多肽抗原可用於製備腫瘤診斷試劑。
由上述實施方式可知,本發明具有降低ELISA的非特異性結合之優點,並且能提高準確度、敏感度及可重複性。本發明首次提出應用質控樣本系統,置備足量QC樣本,且每次獨立試驗均以質控樣本之特異結合指數作為質控標準,以其批內變異CV<10%及披間變異CV<20%為標準,此有效提高人血抗體檢測方法的準確度和可重複性。此外,內參多肽抗原以大鼠多肽抗原檢測的訊號為背景訊號,透過計算SBI質來衡量所檢測特異抗體的表現量,此能有效提高人血抗檢測方法的特異性。
雖然本發明已以實施方式揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可作各種之更動與潤飾,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:第1圖係繪示依照本發明一實施例的特異性結合指數曲線圖。
第2圖係繪示依照本發明另一實施方式的特異性結合指數曲線圖。
<110> 光輝生命醫學股份有限公司
<120> 用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌、方法與套組
<140> TW 101118213
<141> 2012-05-22
<160> 3
<210> SEQ ID NO:1
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOXP3多肽抗原序列
<400> 1
<210> SEQ ID NO:2
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD25多肽抗原序列
<400> 2
<210> SEQ ID NO:3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 內參多肽抗原序列
<400> 3
Claims (17)
- 一種用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌,包含:一FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1);以及一CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2);其中該FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)與一生物樣本中之一特異性自身抗體結合,並藉由分析該特異性自身抗體之表現量,以檢測腫瘤是否發生。
- 如請求項1所述之腫瘤標誌,其中該生物樣本係選自由血清、血漿、唾液、尿液、羊水、淚液、汗液、奶水、淋巴液及其組合所組成之群組。
- 如請求項1所述之腫瘤標誌,其中該特異性自身抗體為IgG抗體。
- 如請求項1所述之腫瘤標誌,其中該FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)用以檢測肺癌、胃腸道腫瘤、食管癌、黑色素瘤、胰臟癌、常見婦科腫瘤及泌尿科腫瘤。
- 如請求項1所述之腫瘤標誌,其中該FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)用以預測或檢測實體惡性腫瘤的發生。
- 一種用於檢測腫瘤發生之方法,包含:提供一生物樣本;提供請求項1之該FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1)及該CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)偵測該生物樣本中之一特異性自身抗體之表現量,其中該抗原與該特異性自身抗體結合;以及分析該特異性自身抗體之表現量。
- 如請求項6所述之檢測腫瘤發生之方法,其中該檢驗方法更包含提供一內參多肽抗原序列(SEQ ID NO.3)。
- 如請求項7所述之檢測腫瘤發生之方法,其中該內參多肽抗原序列(SEQ ID NO.3)係一與人類蛋白組無免疫交叉反應之大鼠多肽序列。
- 如請求項6所述之檢測腫瘤發生之方法,更包含設計一質控系統(Quality Control System,QC System),其中該生物樣本質控系統包含製備一質控樣本,且該質控樣本係為100至1000健康之生物樣本的混合樣本。
- 如請求項6所述之檢測腫瘤發生之方法,其中該生物樣本係來自人類。
- 如請求項6所述之檢測腫瘤發生之方法,其中該分析係以一特異結合指數(Specific Binding Index,SBI)分析系統。
- 一種用於檢測腫瘤發生之套組,包含:至少一特異多肽抗原序列;一內參多肽抗原序列(SEQ ID NO.3);一質控樣本;以及一酶標抗體。
- 如請求項12所述之用於檢測腫瘤發生之套組,其中該特異多肽抗原序列包含:一FOXP3多肽抗原序列(SEQ ID NO.1);以及一CD25多肽抗原序列(SEQ ID NO.2)。
- 如請求項12所述之用於檢測腫瘤發生之套組,更包含一稀釋液、一清洗液、一顯色液、一終止液及其任意組合。
- 如請求項12所述之用於檢測腫瘤發生之套組,其中該內參多肽抗原序列(SEQ ID NO.3)係一與人類蛋白組無免疫交叉反應之大鼠多肽序列。
- 如請求項12所述之用於檢測腫瘤發生之套組,其中該酶標抗體係一辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標記的羊抗人抗體。
- 如請求項12所述之用於檢測腫瘤發生之套組,更包含作為腫瘤發生之早期診斷。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW101118213A TWI454698B (zh) | 2012-05-22 | 2012-05-22 | 用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌、方法與套組 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW101118213A TWI454698B (zh) | 2012-05-22 | 2012-05-22 | 用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌、方法與套組 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201348704A TW201348704A (zh) | 2013-12-01 |
TWI454698B true TWI454698B (zh) | 2014-10-01 |
Family
ID=50157347
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW101118213A TWI454698B (zh) | 2012-05-22 | 2012-05-22 | 用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌、方法與套組 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
TW (1) | TWI454698B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104277102B (zh) * | 2014-06-27 | 2017-04-12 | 李光辉 | 一种检测乳腺癌标志物Annexin A1抗原表位氨基酸序列及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7939263B2 (en) * | 2005-06-13 | 2011-05-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
US8158596B2 (en) * | 2007-05-11 | 2012-04-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Materials and methods for FOXP3 tumor suppression |
-
2012
- 2012-05-22 TW TW101118213A patent/TWI454698B/zh active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7939263B2 (en) * | 2005-06-13 | 2011-05-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
US8158596B2 (en) * | 2007-05-11 | 2012-04-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Materials and methods for FOXP3 tumor suppression |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
2008年10月15日,Tumor-Infiltrating T Cells Correlate with NY-ESO-1-Specific Autoantibodies in Ovarian Cancer,PLoS ONE,2008 3(10):e3409. doi: 10.1371/journal.pone.0003409CiteNPL. Epub 2008 Oct 15. 2009年11月09日,The architectural pattern of FOXP3-positive T cells in follicular lymphoma is an independent predictor of survival and histologic transformation,Pedro Farinha,January 14, 2010 Blood: 115 (2) 2006年GenBank:ABL74385.1 * |
年10月15日,Tumor-Infiltrating T Cells Correlate with NY-ESO-1-Specific Autoantibodies in Ovarian Cancer,PLoS ONE,2008;3(10):e3409. doi: 10.1371/journal.pone.0003409. Epub 2008 Oct 15. 2009年11月09日,The architectural pattern of FOXP3-positive T cells in follicular lymphoma is an independent predictor of survival and histologic transformation,Pedro Farinha,January 14, 2010; Blood: 115 (2) 2006年GenBank:.1 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TW201348704A (zh) | 2013-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Amlani et al. | Anti-NT5c1A autoantibodies as biomarkers in inclusion body myositis | |
CN112362871B (zh) | 食管癌的生物标志物及其应用 | |
CN103293308B (zh) | 一种检测肿瘤标志物p16抗原表位氨基酸序列及应用 | |
JP2020515826A (ja) | 抗体アッセイ | |
CN113287013A (zh) | 溃疡性大肠炎以及原发性硬化性胆管炎的检查方法 | |
CN102603892B (zh) | 一种肿瘤标志物foxp3抗原多肽及应用 | |
EP2330420B1 (en) | Diagnosis method and diagnosis kit for clinical amyopathic dermatomyositis | |
JPWO2013038696A1 (ja) | 胸膜中皮腫患者の早期発見のための分子マーカー及びその発現解析方法 | |
TWI454698B (zh) | 用於檢測腫瘤發生之腫瘤標誌、方法與套組 | |
CN113429470A (zh) | 检测食管癌标志物Survivin抗原表位氨基酸序列及应用 | |
CN105037534B (zh) | 一种检测肺癌标志物myc抗原表位氨基酸序列及应用 | |
WO2013039166A1 (ja) | 抗wt1抗体の測定方法 | |
US11193944B2 (en) | Kits for detecting breast or ovarian cancer in a body fluid sample and use thereof | |
US8697368B2 (en) | Diagnostic marker for lung cancer comprising HPαR as active ingredient | |
CN102532298B (zh) | 与自身抗体特异性结合的abcc3抗原多肽及应用 | |
CN104892746B (zh) | 一种检测宫颈癌标志物-foxp3自身抗体表位氨基酸序列及应用 | |
US20230375550A1 (en) | Method for diagnosing breast cancer by using biomarker | |
CN112175062B (zh) | Sft2b蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途 | |
CN107163131A (zh) | 肿瘤抑制因子p16的抗原多肽和其应用 | |
CN108427003B (zh) | 检测抗白介素2受体亚基a天然抗体的多肽序列、试剂盒和方法 | |
CN113549142A (zh) | 一种检测食管癌标志物p16抗原表位氨基酸序列及应用 | |
CN107022028B (zh) | 特异性抗CitH3单克隆抗体及其酶联免疫吸附试验试剂盒在脓毒症诊断中的应用 | |
TWI525101B (zh) | 用於檢測存活素抗體之多肽分子 | |
Stasik et al. | Serum level of sVAP-1 in relation to the severity of inflammation, predictive marker of prognosis in patients scheduled for colorectal surgery | |
JP2024070581A (ja) | Als検査用バイオマーカー及び検査方法 |