JP2023541807A - Ｍｈｃｉペプチド結合の特徴づけのためのアッセイおよび試薬 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＭＨＣＩ／リガンドペプチド複合体を作製および検出するための試薬および方法に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月２５日に出願された米国仮出願第６３／０７０，２１１号、２０２０年９月２９日に出願された同第６３／０８５，１１３号、および２０２１年７月２日に出願された同第６３／２１８，０７３号の優先権を主張し、これらは、あらゆる目的でそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２１年８月１９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０４８８９３－５３３００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、サイズは１３，３５２バイトである。
本出願は、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体を分析するための系および方法に関する。分析は、ネイティブ質量分析、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ－ＦＲＥＴ）分光法を、任意に、サイズ排除クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動、例えば、キャピラリーゾーン電気泳動によるＭＨＣＩ複合体単離と組み合わせて使用して、行うことができる。いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、患者試料に存在することが予測されるペプチドを使用して、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に適用される。
主要組織適合性複合体－Ｉ（ＭＨＣＩ）は、抗原提示細胞の表面上の自己および外来由来のディスプレイペプチドを、リンパ球に提示することを担う、ほぼ偏在的に発現されるタンパク質複合体である。ＭＨＣＩによるディスプレイペプチドの提示は、罹患細胞の破壊または健常細胞の保存のための獲得免疫応答の第１の工程のうちの１つである。ＭＨＣＩ複合体は、重鎖（α）および軽鎖（β２ミクログロブリン、Ｂ２Ｍ）からなる非共有結合的に連結されたタンパク質ヘテロダイマーであり、一般に、ＭＨＣＩ複合体は、８～１１残基のディスプレイペプチドリガンドなしでは不安定である。円錐形のディスプレイペプチドの生成経路には、ユビキチン化された細胞質タンパク質を分解して潜在的なディスプレイペプチドにするプロテアソームが関与している。これらのディスプレイペプチドは、続いて、小胞体内へと輸送され、そこで、それらはさらに精錬され、タンパク質シャペロンに補助されるプロセスによって活性なＭＨＣＩ／ディスプレイペプチド複合体が形成された後、細胞表面へと輸送され、細胞傷害性またはＣＤ８（＋）Ｔ細胞に提示され、細胞運命が認識および決定される。
ＭＨＣＩタンパク質は、主要組織適合性複合体遺伝子複合体によってコードされ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系のメンバーとしても知られている。もっとも一般的なＭＨＣＩファミリーメンバーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ遺伝子座によってコードされるが、ＭＨＣＩファミリーには合計およそ２４個が知られている。それぞれのＨＬＡ群は、少なくとも１２個またはそれよりも多くの対立遺伝子を含み、これらの対立遺伝子の差示的発現により、タンパク質出力に豊かな多様性が生じる。実際に、それぞれが独自の安定性およびカノニカルリガンド特異性を有する２０，０００個を上回る可能性のある異なるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃタンパク質複合体が存在する。タンパク質のＭＨＣＩ系の高い多様性により、系は、全体として、非ヒト源に由来するペプチド、翻訳後修飾された自己ペプチド、およびエクスビボで合成されたペプチドを含む、多数の可能性のある抗原を認識することが可能となっている。
捉えづらい免疫標的の処置に関する発展中の関心領域には、患者におけるＣＤ８（＋）Ｔ細胞依存性応答を特徴づけるための、ネオ抗原ペプチド配列を含む、これまでに特徴づけられていない抗原、未知の抗原、または設計された抗原の生成が含まれる。しかしながら、ネオ抗原を含め、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける最適なＭＨＣＩ複合体：抗原結合の産生、選択、および特定に利用できるロバストで高スループットな方法は欠如している。
本出願は、広範な免疫療法において使用するためのＭＨＣＩペプチドをアッセイするための組成物および方法を提供する。
患者のＭＨＣＩ分子上に提示される可能性が高く、Ｔ細胞に結合することができ、がん患者のための適切な処置を開発することにおいて有用であり得る、潜在的なネオ抗原ペプチドを探究するための高速で高スループットな多重モニタリングアッセイが、本明細書において記載される。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＴＲ－ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）、および２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ（二次元液体クロマトグラフィー質量分析）などのアッセイが、ＭＨＣＩ－ペプチド複合体を分析するために使用され得る。クロマトグラフィー、例えば、２Ｄ－ＬＣを、検出のために、質量分析（ＭＳ）と組み合わせてもよい。
本明細書に記載される方法および系は、ネイティブ質量分析を利用して、ペプチドに結合したＭＨＣＩ複合体を特徴づける。いくつかの実施形態において、ネイティブ質量分析は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、または他の事例ではキャピラリー電気泳動（ＣＥ）、例えば、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）に続いて行われる。いくつかの事例において、ネイティブ質量分析は、ＭＨＣＩ複合体に結合したペプチドの特徴づけ、および特定のペプチドがＭＨＣＩ複合体に非共有結合的に結合していることの確認を可能にする。ＣＥもまた、いくつかの事例において、クロマトグラフィー方法、例えば、ＳＥＣよりも低い濃度で存在する結合したペプチドの検出を可能にする。いくつかの事例において、例えば２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ方法における二次元分離とは対照的に、ＳＥＣ、ＣＥ、またはＣＺＥによる単一のクロマトグラフィー分離のみが、ネイティブ質量分析の前に行われる。いくつかの実施形態において、本明細書における方法はまた、他の分析技法と比較して増加したスループットも提供し得る。
ある態様において、アルファ鎖、ベータ鎖、および非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むリガンドを含む、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）タンパク質複合体が、本明細書に提供される。
ある態様において、試験ペプチドと、（ｉ）アルファ鎖、ベータ鎖を含むＭＨＣＩ分子、および（ｉｉ）非天然紫外線（ＵＶ）切断性アミノ酸を含むペプチドであるリガンドを含むＭＨＣＩ／リガンド複合体とを含む、第１の組成物を提供すること、第１の組成物をＵＶ光に曝露して、リガンドをＵＶ切断性アミノ酸において切断すること、第１の組成物をある期間インキュベートして、遊離した試験ペプチド、アルファ鎖、ベータ鎖、および／またはＭＨＣＩ／－第２のペプチド複合体を含む第２の組成物を形成すること、ならびにＭＨＣＩ対立遺伝子が第２のペプチドに結合しているかどうかを判定することによって、ＭＨＣＩ対立遺伝子の試験ペプチドへの結合を判定するためのペプチド交換アッセイが、本明細書において提供される。
ある態様において、最適なＭＨＣＩ対立遺伝子－リガンドの組合せを判定するための方法であって、変性条件下において精製された複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマーを提供することと、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、および非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むリガンドを組み合わせることによって反応混合物を形成することと、反応混合物を、ＭＨＣＩ－リガンド複合体の形成を可能にする条件下においてインキュベートすることと、ＭＨＣＩ－リガンド複合体が形成されたかどうかを判定することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
ある態様において、ＭＨＣＩ対立遺伝子の試験ペプチドへの結合を検出するための方法であって、試験ペプチドと、アルファ鎖、ベータ鎖を含むＭＨＣＩ分子、および非天然紫外線（ＵＶ）切断性アミノ酸を含むペプチドであるリガンドを含む、ＭＨＣＩ／リガンド複合体とを含む、第１の複合体を提供し、次いで、第１の複合体を、ＵＶ光に曝露して、リガンドをＵＶ切断性アミノ酸において切断することと、第２の複合体中のＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体を検出し、それによって、ＭＨＣＩ分子の試験ペプチドへの結合を検出することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
ある態様において、ＭＨＣＩ結合性リガンドを特定する方法であって、複数のＭＨＣＩ対立遺伝子鎖モノマーを、複数のベータ鎖モノマーおよび非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドであるリガンドと、ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成を可能にする条件下において接触させることと、ＭＨＣＩ／リガンド複合体を検出し、それによって、ＭＨＣＩ結合性リガンドを特定することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
ある態様において、最適な主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）対立遺伝子－リガンドの組合せを判定するための方法であって、変性条件下において精製された複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマーを提供することと、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、および非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドを含むリガンドを組み合わせることによって、反応混合物を形成することと、混合物を、ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成を可能にする条件下においてインキュベートすることと、ＭＨＣＩ／リガンド複合体が形成されたかどうかを判定することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
ある態様において、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチド、ＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、およびＭＨＣＩベータ鎖モノマーを含む、キットが、本明細書において提供される。
ある態様において、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドと、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマーと、複数のＭＨＣＩベータ鎖モノマーと、ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成を可能にすることができる第１の試薬とを含む、系が、本明細書において提供される。
本開示は、さらに、ネイティブ質量分析と組み合わせた、サイズ排除クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動のいずれかを使用して、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体をモニタリングするための方法に関する。
ある態様において、試料中のペプチド交換された主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体をモニタリングする方法であって、（ａ）目的のペプチドを含む、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を得ることと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、（ｃ）（ｂ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、目的のペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
ある態様において、試料中のペプチド交換された主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体をモニタリングする方法であって、（ａ）交換可能なペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を得、複合体を、交換可能なペプチドと目的のペプチドとの間におけるペプチド交換を可能にする条件下において、１つまたは複数の目的のペプチドに曝露することと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、（ｃ）（ｂ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、目的のペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
ある態様において、ＭＨＣＩと複合体を形成したペプチドのＴ細胞認識をモニタリングする方法であって、（ａ）目的のペプチドを含む、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を得ることと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を、Ｔ細胞を含む試料と接触させることと、（ｃ）Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体を、未結合のＭＨＣＩ複合体から分離することと、（ｄ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、（ｅ）（ｄ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、試料由来のＴ細胞によって認識されるペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
ある態様において、ＭＨＣＩと複合体を形成したペプチドのＴ細胞認識をモニタリングする方法方法であって、（ａ）交換可能なペプチドを含む主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体を得、複合体を、ペプチド交換を可能にする条件下において、１つまたは複数の目的のペプチドに曝露することと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を、Ｔ細胞を含む試料と接触させることと、（ｃ）Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体を、未結合のＭＨＣＩ複合体から分離することと、（ｄ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、（ｅ）（ｄ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、試料由来のＴ細胞によって認識されるペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
ＭＨＣＩのペプチド結合体についてスクリーニングするための高スループットアッセイの図である。汎ＨＬＡ捕捉抗体が、ＥＬＩＳＡプレートに結合している。アンフォールディングされたＨＬＡ、変性／再生Ｂ２Ｍ、およびペプチドを、ＥＬＩＳＡプレートの存在下において、ワンポットリフォールディング反応で混合する。安定なＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体が、汎ＨＬＡ捕捉抗体によって捕捉される。抗Ｂ２Ｍビオチン化二次抗体を添加し、続いて検出用のストレプトアビジン－ＨＲＰ複合体を添加することによって、ＨＲＰ－ＨＲＰ基質生物発光反応を介して、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体の相対数が判定される。 結合体にわたって平均した、捕捉されたＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体（二次抗体レポーターを通じて）の正規化された（ペプチドなし、試料シグナル／陰性対照シグナルに対して）ＥＬＩＳＡシグナルの棒グラフによる図を示す。パネルＡは、３８個の異なるＨＬＡ、ＨＬＢ、およびＨＬＣ対立遺伝子について１～４０応答単位の範囲内の正規化されたシグナルを示し、パネルＢは、Ｂ２Ｍおよびペプチドの存在下においてリフォールディングされた３８個のＨＬＡ、ＨＬＢ、およびＨＬＣ対立遺伝子について１～５応答単位の範囲内の正規化されたシグナルを示す。 ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド結合体にわたって平均したＥＬＩＳＡシグナルの棒グラフによる図を示す。図３Ａの棒グラフは、いくつかの対立遺伝子が、ＥＬＩＳＡプレートを標識化するために使用した汎ＨＬＡ抗体に対して低い親和性を有することを示す図３Ｂの棒グラフは、いくつかのＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ複合体が、ペプチドの存在なしに安定であることを示す。破線は、Ａ対Ｂにおいて同じシグナルレベルを示す。矢印は、低捕捉抗体結合体である特定のＭＨＣＩ対立遺伝子（Ａ）およびペプチドの存在なしに安定である特定のＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ複合体（Ｂ）を示す。 ＵＶペプチド（ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチド）の存在下における、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ＵＶペプチド結合体に対して平均したＥＬＩＳＡシグナルの棒グラフによる図を示す。図４Ａは、１～４０応答単位の範囲におけるＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ＵＶペプチド複合体の全体的な正規化シグナルを示す。図４Ｂは、１～５応答単位の範囲における正規化されたシグナルを示し、ペプチドの存在なしに安定な複合体を形成する特定の対立遺伝子（Ｓ）および捕捉抗体が低い親和性を有する対立遺伝子（Ｌ）を示す。 １８個の異なるＨＬＡ／ＨＬＢ対立遺伝子のスケールアップしたリフォールディング精製から得られた正規化されたＥＬＩＳＡ結果および収率を比較する棒グラフである。黒色のバーは、ＥＬＩＳＡによって検出された、形成されたＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体によって生成された相対シグナルを示す。灰色のバーは、１ＬのそれぞれのＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体の産生の収率％を示す。水平方向の線は、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体品質管理のための１％カットオフを示す。表記（Ｓ）、（Ｌ）は、それぞれ、ペプチドなしで安定なＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ複合体、および捕捉抗体が低い親和性を有するＭＨＣ／Ｂ２Ｍ／ペプチドを指す。 ３つのペプチドについてＭＨＣ／Ｂ２Ｍ／ペプチド交換アッセイの２－Ｄ ＬＣ／ＭＳ特徴づけにより得られた代表的なサイズ排除および逆相クロマトグラムならびに質量スペクトルを示す。 本明細書の実施形態における、ＭＨＣＩ対立遺伝子および対立遺伝子と会合され得るペプチド配列の一覧である。それぞれのアミノ酸は、その標準的な一文字の略語によって表されている。Ｊは、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を表す。 図８Ａは、アセンブルされたＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体を検出するための時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）の絵による表示である。図８Ｂは、融解温度の熱シフトを測定し、したがって、ＭＨＣＩ複合体の結合を測定するための、示差走査熱量測定（ＤＳＦ）アッセイを表す概略図である。図８Ｃは、融解温度（Ｔｍ）のシフトにより、複合体形成のエンタルピーの変化を示す、ＨＬＡ＊０３：０１ペプチド結合体および非結合体の代表的なスペクトルである。 異なる対立遺伝子に対する高親和性ペプチドを発見するためのＴＲ－ＦＲＥＴアッセイの棒グラフによる図を示す。図９Ａは、試験したそれぞれの複合体について、３７℃および４℃における６６５ｎｍでの蛍光の変化をプロットする。図９Ｂは、８５～１００％の正確度で変動する、ＭＨＣＩ対立遺伝子に対するＴＲ－ＦＲＥＴアッセイの相対正確度の棒グラフである。 図１０Ａは、ＭＨＣＩ ＨＬＡ＊０３：０１を含む複合体のペプチド結合体および非結合体を比較する、比較ＤＳＦスペクトルを提供する。低温（２０℃）では、相対蛍光（ＲＦＵ）は、ペプチドが結合した複合体については低く、ペプチド結合がない複合体については高い。ペプチド結合体のＤＳＦスペクトルは、類似のＴｍ温度範囲を示し、一方で、非結合体は、低いＴｍを有する。図１０Ｂは、ペプチド結合体（黒色）および非結合体（灰色）の、ＲＦＵ値に対する総数の棒グラフである。図１０Ｃは、ペプチド結合体（黒色）および非結合体（灰色）の、ＲＦＵ値に対する総数の棒グラフである。図１０Ｄは、４つの異なるＭＨＣＩ対立遺伝子に関するアッセイの正確度％（すべて９０％を上回る）の棒グラフである。 図１１Ａは、ＭＨＣＩ ＨＬＡ＊０８：０１を含む複合体のペプチド結合体および非結合体を比較する、比較ＤＳＦスペクトルを提供する。低温（２０℃）では、相対蛍光（ＲＦＵ）は、ペプチド結合体および非結合体が存在する場合、同様である。ペプチド結合体／非結合体のいずれのＤＳＦスペクトルも、Ｔｍについて、類似の温度範囲を示す。図１１Ｂは、ペプチド結合体（黒色）および非結合体（灰色）の、Ｔｍ温度に対する総数の棒グラフである。図１１Ｃは、ペプチド結合体（黒色）および非結合体（灰色）の、ＲＦＵ値に対する総数の棒グラフである。図１１Ｄは、４つの異なるＭＨＣＩ対立遺伝子に関するアッセイの正確度％（６０～８５％の正確度）の棒グラフである。 ＴＲ－ＦＲＥＴ「真の結合体」パーセント対予測百分位順位の棒グラフによる図である。百分位順位は、ペプチド配列を、ペプチド／ＭＨＣＩ結合の予測アルゴリズムにかけることによって計算された値である（Nielsen M, et al. Protein Sci. (2003) 12:1007-1017, Andreatta M, and Nielsen, M. Bioinformatics (2016) Feb 15;32(4):511-517）。２．００未満の百分位順位を有するペプチド（破線の左側）は、アルゴリズムによって、ＭＨＣＩ結合体として分類される。本明細書に記載される方法およびアッセイにより、真の結合体であるが予測アルゴリズムによって非結合体として分類されているであろういくつかのペプチド－ＨＬＡ組合せが特定された。 経時的にＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド交換を判定するための２－Ｄ ＬＣ／ＭＳアッセイの概略図である。ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ＵＶ切断性ペプチド複合体を、ＵＶ光に曝露し、第２の交換ペプチドの存在下において、ＵＶ切断性ペプチドのペプチド結合を切断する。第１のペプチドの切断された断片は、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ複合体の存在下において、全長の第２のペプチドと交換される。ある特定の時点において、交換混合物は、１）「第１次元」：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体を、遊離したＭＨＣＩ、Ｂ２Ｍ、およびペプチドから分離すること、２）「第２次元」：ＳＥＣピークの逆相ＨＰＬＣにより、ピーク成分を分離すること、ならびに３）ピーク成分の特定および定量化のために個々の逆相ピークを質量分析することによって、分析される。 それぞれの対立遺伝子について交換体または非交換体としての１０個のペプチドの検証パネルを示し、ある範囲のペプチドの経時的な交換％のプロットとして示されており、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ＵＶ－ペプチド複合体は、２－Ｄ ＬＣ／ＭＳによって測定した。上部のデータ点は、ペプチドが交換されたＭＨＣＩ／ペプチド複合体（第２のＨＰＬＣピークで観察）、およびＭＨＣＩピークの消失が生じなかったＭＨＣＩ／ペプチド複合体（第１のＳＥＣピークで観察）を示す。中央のデータ点は、ＭＨＣＩ ＳＥＣピーク面積がいくらか消失したが交換ペプチドの保持を示し、下部のデータ点は、ＭＨＣＩ ＳＥＣピークの大きな消失および交換ペプチドの不在を示す。 ４０個のペプチドプールについて、経時的にＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド交換を判定するための２－Ｄ ＬＣ／ＭＳアッセイの概略図である。ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ＵＶ切断性ペプチド複合体を、ＵＶ光に曝露し、交換ペプチドプールの存在下において、ＵＶ切断性ペプチドのペプチド結合を切断する。第１のペプチドの切断された断片は、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ複合体の存在下において、全長ペプチドと交換される。ある特定の時点において、交換混合物は、１）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体を、遊離したＭＨＣＩ、Ｂ２Ｍ、およびペプチドから分離すること、２）：ＳＥＣピークの逆相ＨＰＬＣにより、ピーク成分を分離すること、ならびに３）交換プールからの異なるペプチドの数を定量することを含む、ピーク成分の特定および定量化のために個々の逆相ピークを質量分析することによって、分析される。このグラフは、経時的なＭＨＣＩ ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１の交換反応に含まれる４０個のペプチドのプールにおける１０個の公知のペプチド結合体の強度を示す。この方法は、１回の実行における複数のペプチド結合体の特定を可能にする。 ＵＶ切断後に、ＭＨＣＩ結合ポケットに対する低減された親和性を有し、したがって、患者予測エピトープであり得る目的のペプチド（より濃い色の円）で置き換えられる、ＵＶ切断性の第１のペプチド（薄い色および濃い色の円）を使用した、ＭＨＣＩペプチド交換プロセスの概略図を示す。 遊離したＨＬＡ、ならびに結合ペプチドなしのＭＨＣＩ複合体、交換可能なペプチドを有するＭＨＣＩ複合体（２色の円）、およびペプチド交換後の目的のペプチドを有するＭＨＣＩ複合体（薄い色の円）のＳＥＣ－ＭＳ定量化の例を示す。図１７Ａは、ＨＬＡおよびインタクトなＭＨＣＩ複合体の定量化を示し、一方で図１７Ｂは、ペプチド交換前および後のＭＨＣＩ複合体からのシグナルを示す。 遊離したＨＬＡ、ならびに結合ペプチドなしのＭＨＣＩ複合体、交換可能なペプチドを有するＭＨＣＩ複合体（２色の円）、およびペプチド交換後の目的のペプチドを有するＭＨＣＩ複合体（薄い色の円）のＳＥＣ－ＭＳ定量化の例を示す。図１７Ａは、ＨＬＡおよびインタクトなＭＨＣＩ複合体の定量化を示し、一方で図１７Ｂは、ペプチド交換前および後のＭＨＣＩ複合体からのシグナルを示す。 ＳＥＣおよびＣＺＥ分離後のＭＳ分析を示す。図１８Ａおよび１８Ｂは、ＳＥＣ分離後のＭＳによる異なる濃度におけるペプチド複合体の分解能を示す。注入体積は、４μＬであった。 ＳＥＣおよびＣＺＥ分離後のＭＳ分析を示す。図１８Ａおよび１８Ｂは、ＳＥＣ分離後のＭＳによる異なる濃度におけるペプチド複合体の分解能を示す。注入体積は、４μＬであった。 ＺｉｐＣｈｉｐ（商標）ＣＺＥデバイスでのＣＺＥ分離後のＭＳによる例示的なペプチド複合体の分解能を示す。注入は、３ｎＬの注入体積で１００μｇ／ｍＬであった。 ＵＶ曝露前の例示的な交換可能なペプチド（上部、２色の円）、およびＣＺＥ分離後のＵＶ曝露後の目的の例示的な交換されたペプチド（下部、黒塗りの円）のＭＳ分析を示す。 ペプチド交換のパーセンテージを、ＳＥＣ－ネイティブＭＳ分析から得られたいくつかの異なる例示的なペプチドについて評価した、例示的なデータを示す。図１９Ａに示されるように、交換をまず評価して、飽和を確実にした。目的のペプチドと交換された交換可能なペプチドの画分を、図１９Ｂに示す。 患者Ｔ細胞の免疫モニタリングにおいて使用するためのＭＨＣＩテトラマーの産生およびアセンブリのワークフローの概略図を示す。 ＥＬＩＳＡ、ＴＲ－ＦＲＥＴ、および２Ｄ－ＬＣ／ＭＳを含む、組換えＭＨＣＩ複合体のための目的の第２のペプチドについてＵＶ切断性ペプチドの交換プロファイルを評価するため方法の絵による概略図を示す。 ＳＥＣ－ＭＳを使用してインタクトなＭＨＣＩ複合体を測定するワークフローの概略図、および２つの例示的な質量スペクトルを示す。 ペプチドが結合したまたは結合していない様々なネイティブＭＨＣＩ種のｍ／ｚ（質量対電荷）に対する相対存在度のプロットである、例示的なネイティブ質量スペクトルを示す。スペクトルにおけるそれぞれの電荷状態セットは、ペプチドが結合したまたは結合していない、対応するＭＨＣＩ複合体の絵による表示でラベル付けされている。 ペプチドが結合したＭＨＣＩ複合体の例示的なネイティブ質量スペクトルプロットの単一電荷状態の拡大図を示す。複数のピークは、異なる電荷状態を示し、これは、ペプチドありおよびなし、またはバッファー付加物ありおよびなし、または開始メチオニンありもしくはなしの、異なるＭＨＣＩ複合体に対応する。 同じペプチド交換反応の２つの異なる時点の例示的な質量スペクトルを示す。ペプチドが結合したまたは結合していない、対応するＭＨＣＩ複合体は、それぞれのピークの上にラベルづけされている。 ペプチド交換過程後のインタクトなＭＨＣＩ複合体の定量化に使用される２つの例示的な質量スペクトルを示す。それぞれのスペクトルにおけるピークは、存在するＭＨＣＩ種の絵による表示でラベルづけされている。右側のデコンボリューションしたスペクトルは、ＵＶ切断性ペプチドまたは交換過程後の交換されたペプチドのいずれかが結合したＭＨＣＩ複合体を示す。 は、ＳＥＣ－ＭＳによる、ＵＶ光曝露によって開始される、ＭＨＣＩ複合体およびペプチド交換反応をモニタリングするための３つの質量分析（ＭＳ）に基づく方法を示す概略図である。それぞれの試料の成分は、高分解能ＭＳ（ＨＲ－ＭＳ）によって判定され、ネイティブＭＨＣＩ複合体組成分析は、ネイティブＭＳによって判定され、ペプチドとＭＨＣＩ複合体との間の結合親和性は、ネイティブＭＳによって経時的な交換％を測定することによって判定される。 異なるＭＨＣＩ ＨＬＡ対立遺伝子および異なるペプチドの両方の一回での高スループットなスクリーニングの概要の絵による表示である。患者由来のＴ細胞を、ＰＢＭＣ試料から分取した後に、それらを、数１０００個の異なる組合せのＭＨＣＩ ＨＬＡ対立遺伝子／予測ペプチドエピトープに対する応答性について、エクスビボにおいて高スループットな形式でさらに試験することができる。 ＵＶ切断性ペプチド結合が結合したおよび結合していないＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体のある濃度範囲にわたる質量スペクトルを示す。ＳＥＣを装備したｕＨＰＬＣに注入される濃度の範囲は、２．５ｍｇ／ｍＬ～８３μｇ／ｍＬであり、注入体積は、それぞれの注入について、４μＬであった。目的のタンパク質種、ペプチドが結合したまたは結合していないＭＨＣＩ複合体は、ＳＥＣクロマトグラムにおいて単一のピークとして共溶出される（時間に対する強度のプロットにおいて、強調表示）。可能性のあるタンパク質種のそれぞれが、単一のＳＥＣクロマトグラムピークに対応する質量スペクトルにおける対応するピークの上に絵として示されている。 ＨＳＮ ＺｉｐＣｈｉｐを装備した質量分析計への０．１ｍｇ／ｍＬのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体の３ｎＬの反復注入に関する複数の電気泳動図および対応するＭＳ１質量スペクトルを示す。 ＨＳＢＧ ＺｉｐＣｈｉｐを装備した質量分析計への４１．０または２０．５μｇ／ｍＬのいずれかのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体の３ｎＬの反復注入に関する複数の電気泳動図および対応するＭＳ１質量スペクトルを示す。 ＭＨＣＩ複合体分析について機器の条件を最適化するように、様々なキャピラリー温度およびＥＳＩシースガスソース設定で収集した質量スペクトルを示す。 ＳＥＣ－ＭＳとＣＺＥ－ＭＳとの間の比較を示す。上の段は、左から右に、ＳＥＣ－ＭＳ分析により得られたＨＬＡ－Ａ＊０１：０１についての代表的なクロマトグラム、ＭＳ１スペクトル、およびデコンボリューションしたピークスペクトルを示す。下の段は、左から右に、ＣＺＥ－ＭＳ分析により得られたＨＬＡ－Ａ＊０１：０１についての代表的な電気泳動図、ＭＳ１スペクトル、およびデコンボリューションしたピークスペクトルを示す。 ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１のタンパク質濃度範囲の反復電気泳動図および対応するデコンボリューションした質量スペクトルを示す。それぞれの実行について、３ｎＬのタンパク質を、５００Ｖ／ｃｍの電圧でＨＳＢＧチップに注入した。試料濃度範囲は、４１～２．０５μｇ／ｍＬであった。 脱塩スピンカラムまたはスピン脱塩プレートによる、分析の前にタンパク質試料にバッファー交換を行うための２つの方法を示す。 ＵＶ光により開始されるペプチド交換反応の前および後のＭＨＣＩタンパク質複合体の結果として得られるデコンボリューションした質量スペクトルを示す。それぞれのピークにおけるＭＨＣＩ種組成を、絵によるラベルによって示す。 ４つの異なるＭＨＣＩ対立遺伝子（それぞれのバーのグルーピングの下に示される）について、いくつかの異なる交換ペプチド（ｘ軸上のラベルづけされた番号によって示されており、バーごとに１つ）のＭＨＣＩ複合体形成およびＭＨＣＩ／ペプチド交換反応の完了％（ｙ軸）という２つの異なる棒グラフによる図を示す。上の段は、遊離したＨＬＡ対ＭＨＣＩ複合体の相対量を示す。下の段は、ＵＶ切断性ペプチドが結合したＭＨＣＩ複合体（ＵＶ－ＭＨＣＩ）または交換されたペプチドが結合したＭＨＣＩ複合体（ｐＭＨＣＩ）の相対量を示す。 α鎖およびＢ２Ｍを含むＭＨＣＩ複合体構造の概略図、ならびにＥｘｔｅｎｄｅｄ Ｍａｓｓ Ｒａｎｇｅ（ＥＭＲ）Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ（灰色のスペクトル）またはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｃｌｉｐｓｅ（黒色のスペクトル）で分析した、開始メチオニンありおよびなし、ならびに精製付加物ありのＭＨＣＩ複合体のデコンボリューションした質量スペクトルを示し、ＥＭＲ分析においてのみペプチドの気相解離を示す。それぞれのＭＨＣＩ複合体種の絵による表示は、対応するＭＳピークの隣に示されている。星印のラベルは、開始メチオニンが存在することを示す。アスタリスクのラベルは、精製付加物について観察された追加の質量を示す。 Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｃｌｉｐｓｅにおいて漸増電圧で分析した場合のＭＨＣＩ複合体のＭＳ１スペクトル（赤色の電荷ラベル）を示す。ソース電圧が増加すると、ペプチドは、複合体から解離され得、独立してデノボシーケンシングされ、ＨＬＡ／Ｂ２Ｍ複合体が残る（緑色の電荷ラベル）。 気相解離後のＭＨＣＩ複合体成分のＭＳ１スペクトルを示す。遊離したペプチドは、挿入図に示されている。 ＥＬＩＳＡアッセイ開発を示す。図４１Ａは、ＥＬＩＳＡ形式の比較である。ＣＭＶ ｐｐ６５シグナルは、０．０３～６．６７μｇ／ｍＬでペプチドなしの対照に対して正規化されている。コーティングとして抗Ｂ２Ｍおよび検出として抗ＨＬＡ－ビオチンを用いた形式は、０．７４、２．２２、および６．６７μｇ／ｍＬにおいて、抗ＨＬＡコーティングおよび抗Ｂ２Ｍ検出と比較して、ＣＭＶ ｐｐ６５とペプチドなし対照との間で示された差が小さかった。図４１Ｂは、ＣＭＶ ｐｐ６５を用いた、ＢＭＲＦ１を用いた、およびペプチドなしでの、小スケールリフォールディング後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１のＥＬＩＳＡ分析を示す。ＥＬＩＳＡ分析は、０．００５～３．３３μｇ／ｍＬの範囲のＭＨＣＩ濃度で実行した。図４１Ｃは、１μｇ／ｍＬでペプチドなし対照に対して正規化したＣＭＶ ｐｐ６５およびＢＭＦＲ１ペプチドのＥＬＩＳＡ ＯＤ値を示す。 Ａ＊０２：０３、Ｂ＊３５：０３、およびＣ＊０２：０２の候補条件的ＭＨＣＩリガンドの特定のプロセスを示す。図４２Ａは、様々な濃度（０．１～３μｇ／ｍＬ）におけるＡ＊０２：０３での５つのペプチドのスクリーニングのＯＤ値を示す。１μｇ／ｍＬの選択されたペプチドを用いたＡ＊０２：０３のＭＨＣ複合体（図４２Ｂ）、Ｂ＊３５：０３のＭＨＣ複合体（図４２Ｃ）、およびＣ＊０２：０２のＭＨＣ複合体（図４２Ｄ）の正規化されたＥＬＩＳＡ ＯＤ。それぞれのＨＬＡについて、もっとも高い正規化されたＯＤ値をもたらしたペプチドを選択し、Ｎ末端から２位、４位、６位、および８位にＵＶ－アミノ酸置換を有する変異体を設計した。図４２Ｅは、様々な濃度においてＨＬＡ－Ａ＊０２：０３を用いてスクリーニングした、ペプチドＡ０２：０３－０２に由来する４つの条件的ＭＨＣＩリガンドのＯＤ値を示す。図４２Ｂ、４２Ｃ、および４２Ｄにおいて特定されたペプチドに由来する選択された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いたＨＬＡ Ａ＊０２：０３のＭＨＣ複合体（図４２Ｆ）、Ｂ＊３５：０３－０５のＭＨＣ複合体（図４２Ｇ）、およびＣ＊０２：０２－０３のＭＨＣ複合体（図４２Ｈ）の正規化されたＥＬＩＳＡ ＯＤ。操作されたＪアミノ酸を含まないペプチド（親ペプチド）は、内部標準として使用した（灰色のバー）。すべてのアッセイについて、ペプチドなし（ＮＰ）は、陰性対照として使用した。 スケールアップしたリフォールディングＡ０２０１ ＭＨＣＩ材料のビオチン化分析、精製、および特徴づけを示す。図４３Ａは、ビオチン化前（黒色の線）および後（灰色の線）のリフォールディングされたＭＨＣＩ反応混合物におけるＨＬＡ対立遺伝子のＬＣ／ＭＳ分析である。２つのピークは、全長ＨＬＡ、およびメチオニンのＮ末端切断を有するトランケーション型ＨＬＡに対応する。ビオチン化後の両方のピークにおけるシフトは、ビオチンの分子量（ＭＷ）に対応する。図４３Ｂは、リフォールディング後のビオチン化ＭＨＣＩ複合体の陰イオン交換クロマトグラム、および強調表示した枠内で収集された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの分子量は、Ｂ２ＭおよびＨＬＡに対応する。図４３Ｃは、精製されたＭＨＣＩ複合体のＬＣ／ＭＳ ＴＩＣクロマトグラムを示す。１．６２５および１．７４分におけるピークは、ＵＶ－ペプチドに対応し、１．８および２．２分におけるピークは、それぞれ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡに対応する。図４３Ｄは、精製されたＭＨＣＩ複合体のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析を示す。黒色の線は、Ａ２８０クロマトグラム（左側のｙ軸）に対応し、破線は、分子量分析（右側のｙ軸）に対応する。図４３Ｅは、１、５、および１５Ｌのスケールでの精製後のＭＨＣＩ収率を示す。 条件的ＭＨＣＩ複合体のスケールアップ産生、精製、および特徴づけを示す。小スケールスクリーニングにおいて特定された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いて生成された、精製されリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体について、図４４Ａは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であり、図４４Ｂは、リフォールディング収率であり、図４４Ｃは、Ｂ２Ｍ対ＨＬＡの比であり、図４４Ｄは、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分子量分析である。 ペプチド交換の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析を示す。図４５Ａは、２Ｄ ＬＣ／ＭＳワークフローの概略図を示す。図４５Ｂは、ＣＭＶ ｐｐ６５を用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第１次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムを示す。図４５Ｃは、ＣＭＶ ｐｐ６５を用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムを示す。図４５Ｄは、ＣＭＶ ｐｐ６５を用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元での交換ペプチド（黒色の線）および条件的ＭＨＣＩリガンド（破線）のＥＩＣクロマトグラムを示す。図４５Ｅは、Ａ０２０３－０５ペプチドを用いた交換後のＡ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第１次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムを示す。図４５Ｆは、Ａ０２０３－０５ペプチドを用いた交換後のＡ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムを示す。図４５Ｇは、Ａ０２０３－０５ペプチドを用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元での交換ペプチド（黒色の線）および条件的ＭＨＣＩリガンド（破線）のＥＩＣクロマトグラムを示す。図４５Ｈは、公知の非結合ペプチドを用いた交換後のＡ０＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第１次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムを示す。図４５Ｉは、非結合ペプチドを用いた交換後のＡ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムを示す。図４５Ｊは、無関係のペプチドを用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元での交換ペプチド（黒色の線）および条件的ＭＨＣＩリガンド（破線）のＥＩＣクロマトグラムを示す。 ２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析におけるペプチド交換後の第１次元のＡ２８０ ＭＨＣＩピークの定量化を示す。Ａ＊０２：０３（図４６Ａ）、Ａ＊２６：０１（図４６Ｂ）、Ｂ＊１８：０１（図４６Ｃ）、Ｂ＊３５：０３（図４６Ｄ）、Ｃ＊０２：０２（図４６Ｅ）、およびＣ＊１４：０２（図４６Ｆ）、陽性対照ペプチド（公知の結合体、黒色のバー）および非結合体ペプチド（灰色のバー）の、ペプチド交換前のピーク面積によって正規化されたペプチド交換後のＭＨＣＩピーク面積である。正符号は、交換ペプチドが、第２次元のＥＩＣ分析において観察されたことを示し、負符号は、交換ペプチドが、ＥＩＣ分析において観察されなかったことを示す。 ＥＬＩＳＡアッセイ開発を示す。図４７Ａは、ＥＬＩＳＡ形式の比較である。０．０３～６．６７μｇ／ｍＬのＭＨＣＩ濃度におけるＣＭＶ ｐｐ６５およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１のＳ／Ｎ値。図４７Ｂは、ＥＬＩＳＡ形式２について、ＣＭＶ ｐｐ６５を用いた、ＢＭＲＦ１を用いた、およびペプチドなしでの、小スケールリフォールディング後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１のＥＬＩＳＡ分析である。ＥＬＩＳＡ分析は、０．００５～３．３３μｇ／ｍＬの範囲のＭＨＣＩ濃度で実行した。図４７Ｃは、ＥＬＩＳＡ形式２について、ＣＭＶ ｐｐ６５およびＢＭＦＲ１ペプチド、ならびにＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を用いてアセンブルしたＭＨＣＩ複合体を、１μｇ／ｍＬのＭＨＣＩ濃度で用いた、ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｎ値を示す。 Ａ＊０２：０３、Ｂ＊３５：０３、およびＣ＊０２：０２の候補条件的ＭＨＣＩリガンドの特定を示す。図４８Ａは、様々な濃度（０．１～３μｇ／ｍＬ）におけるＡ＊０２：０３でスクリーニングした５つのペプチドのＯＤ値である。１μｇ／ｍＬの選択されたペプチドを用いたＡ＊０２：０３のＭＨＣ複合体（図４８Ｂ）、Ｂ＊３５：０３のＭＨＣ複合体（図４８Ｃ）、およびＣ＊０２：０２のＭＨＣ複合体（図４８Ｄ）のＳ／Ｎ ＥＬＩＳＡ値である。図４８Ｅは、様々な濃度においてＨＬＡ－Ａ＊０２：０３を用いてスクリーニングした、ペプチドＡ０２：０３－０２に由来する４つの条件的ＭＨＣＩリガンドのＯＤ値である。図４８Ｂ、４８Ｃ、および４８Ｄにおいて特定されたペプチドに由来する選択された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いたＨＬＡ Ａ＊０２：０３のＭＨＣ複合体（図４８Ｆ）、Ｂ＊３５：０３－０５のＭＨＣ複合体（図４８Ｇ）、およびＣ＊０２：０２－０３のＭＨＣ複合体（図４８Ｈ）のＳ／Ｎ値である。操作されたＪアミノ酸を含まないペプチド（親ペプチド）は、内部標準として使用した（灰色のバー）。すべてのアッセイについて、ペプチドなし（ＮＰ）は、陰性対照として使用した。 Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩモノマーのスケールアップした産生の概略図である。ＭＨＣＩ複合体のスケールアップした産生のために開発したプロトコールにおける第１の工程は、すべてのリフォールディング成分を混合し、リフォールディングを生じさせることである。第２の工程は、プロセス内でのビオチン化であり、第３の工程における陰イオン交換クロマトグラフィーがそれに続く。 スケールアップしたリフォールディングＡ＊０２：０１ ＭＨＣＩモノマーのビオチン化分析、精製、および特徴づけ。図５０Ａは、ビオチン化前（黒色の線）および後（灰色の線）のリフォールディングされたＭＨＣＩ反応混合物におけるＨＬＡ対立遺伝子のＬＣ／ＭＳ分析である。２つのピークは、全長ＨＬＡ、およびメチオニンのＮ末端切断を有するトランケーション型ＨＬＡに対応する。ビオチン化後の両方のピークにおけるシフトは、ビオチンの分子量に対応する。図５０Ｂは、リフォールディング後のビオチン化されたＭＨＣＩ複合体の陰イオン交換クロマトグラムおよび強調表示した枠内で収集された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である（図５０Ｃ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドの分子量は、Ｂ２Ｍ（１３ｋＤａ）およびＨＬＡ（３７ｋＤａ）に対応する。図５０Ｄは、精製されたＭＨＣＩ複合体のＬＣ／ＭＳ ＴＩＣクロマトグラムである。１．６２５および１．７４分におけるピークは、ＵＶ－ペプチドに対応し、１．８および２．２分におけるピークは、それぞれ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡに対応する。図５０Ｅは、精製されたＭＨＣＩ複合体のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析である。黒色の線は、Ａ２８０クロマトグラム（左側のｙ軸）に対応し、破線は、分子量分析（右側のｙ軸）に対応する。図５０Ｆは、１、５、および１５Ｌスケールでの精製後のＭＨＣＩ収率％（精製されたＭＨＣＩのｍｇ数／リフォールディングにおけるＭＨＣＩのｍｇ数×１００）±標準偏差（Ｎ＝３）である。 条件的ＭＨＣＩ複合体のスケールアップ産生、精製、および特徴づけを示す。小スケールスクリーニングにおいて特定された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いて生成された、精製されリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体について、図５１Ａは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であり、図５１Ｂは、平均リフォールディング収率％（精製されたＭＨＣＩのｍｇ数／リフォールディングにおけるＭＨＣＩのｍｇ数×１００）±標準偏差（Ｎ＝３）であり、図５１Ｃは、平均Ｂ２Ｍ対ＨＬＡ比±標準偏差（Ｎ＝３）であり、図５１Ｄは、平均ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分子量分析±標準偏差（Ｎ＝３）である。 ペプチド交換の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析を示す。図５２Ａは、２Ｄ ＬＣ／ＭＳワークフローの概略図である。図５２Ｂは、ＣＭＶ ｐｐ６５を用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第１次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムである。破線は、収集され、第２のカラムに注入された、領域を定義する。図５２Ｃは、ＣＭＶ ｐｐ６５を用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムである。図５２Ｄは、ＣＭＶ ｐｐ６５を用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元での交換ペプチド（黒色の線）および条件的ＭＨＣＩリガンド（破線）のＥＩＣクロマトグラムである。図５２Ｅは、Ａ０２０３－０５ペプチドを用いた交換後のＡ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第１次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムである。破線は、収集され、第２のカラムに注入された、領域を定義する。図５２Ｆは、Ａ０２０３－０５ペプチドを用いた交換後のＡ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムである。図５２Ｇは、Ａ０２０３－０５ペプチドを用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元での交換ペプチド（黒色の線）および条件的ＭＨＣＩリガンド（破線）のＥＩＣクロマトグラムである。図５２Ｈは、公知の非結合ペプチドを用いた交換後のＡ０＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第１次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムである。破線は、収集され、第２のカラムに注入された、領域を定義する。図５２Ｉは、非結合ペプチドを用いた交換後のＡ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元のＡ２８０ｎｍ ＳＥＣクロマトグラムである。図５２Ｊは、無関係のペプチドを用いた交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析における第２次元での交換ペプチド（黒色の線）および条件的ＭＨＣＩリガンド（破線）のＥＩＣクロマトグラムである。 ２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析におけるペプチド交換後の第１次元のＡ２８０ ＭＨＣＩピークの定量化を示す。Ａ＊０２：０３（図５３Ａ）、Ａ＊２６：０１（図５３Ｂ）、Ｂ＊１８：０１（図５３Ｃ）、Ｂ＊３５：０３（図５３Ｄ）、Ｃ＊０２：０２（図５３Ｅ）、およびＣ＊１４：０２（図５３Ｆ）、陽性対照ペプチド（公知の結合体、黒色のバー）および非結合体ペプチド（灰色のバー）の、ペプチド交換前のピーク面積に対するペプチド交換後のＭＨＣＩピーク面積の画分である。正符号は、交換ペプチドが、第２次元のＥＩＣ分析において観察されたことを示し、負符号は、交換ペプチドが、ＥＩＣ分析において観察されなかったことを示す。 Ａ＊２６：０１、Ｂ＊１８：０１、およびＣ＊１４：０２のＨＬＡ対立遺伝子の条件的ＭＨＣＩリガンドの特定を示す。１μｇ／ｍＬの選択されたペプチドを用いたＡ＊２６：０１のＭＨＣ複合体（図５４Ａ）、Ｂ＊１８：０１のＭＨＣ複合体（図５４Ｂ）、およびＣ＊１４：０２のＭＨＣ複合体（図５４Ｃ）である。それぞれのＨＬＡについて、もっとも高い正規化されたＯＤ値をもたらしたペプチドを選択し、Ｎ末端から２位、４位、６位、および８位にＵＶ－アミノ酸置換を有する変異体を設計した。図５４Ａ、５４Ｂ、および５４Ｃにおいて特定されたペプチドに由来する選択された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いたＡ＊２６：０１のＭＨＣ複合体（図５４Ｄ）、Ｂ＊１８：０１のＭＨＣ複合体（図５４Ｅ）、およびＣ＊１４：０２（図５４Ｆ）ＭＨＣ複合体の正規化されたＥＬＩＳＡ ＯＤである。操作されたＪアミノ酸を含まないペプチド（親ペプチド）は、内部標準として使用した（灰色のバー）。すべてのアッセイについて、ペプチドなし（ＮＰ）は、陰性対照として使用した。 Ａ＊０２：０３（図５５Ａ）、Ａ＊２６：０１（図５５Ｂ）、Ｂ＊１８：０１（図５５Ｃ）、Ｂ＊３５：０３（図５５Ｄ）、Ｃ＊０２：０２（図５５Ｅ）、およびＣ＊１４：０２（図５５Ｆ）について、リフォールディング後のビオチン化ＭＨＣＩ複合体の陰イオン交換クロマトグラム、ならびに強調表示された枠内で収集された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
この説明を読んだ後、様々な代替の実施形態および代替の適用において本開示を実施する方法が当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の様々な実施形態のすべてについてここでは説明しない。ここに提示される実施形態は、一例としてのみ提示され限定でないことが理解されよう。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、本明細書に記載の本開示の範囲または幅を限定すると解釈されるべきではない。
本技術を開示および説明する前に、以下に記載される態様は、特定の組成物、そのような組成物を調製する方法、またはその使用に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の態様を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
読者の便宜のためだけに様々なセクションに分けられた詳細な説明および任意のセクションに見られる開示は、別のセクションのものと組み合わされてもよい。タイトルまたはサブタイトルが、読者の便宜のために本明細書で使用され得、本開示の範囲に影響を及ぼすことを意図しない。
定義
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されなければならないいくつかの用語が参照される。
本明細書に記載される場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率の範囲、または整数範囲は、別途指示がない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数、および適切な場合には、それらの分数（整数の１０分の１および１００分の１など）の値を含むと理解されるべきである。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと示さない限りは、複数形を同様に含むことが意図されている。
「任意の（optional）」または「任意に（optionally）」は、続いて記載される事象または状況が起こり得るか、または起こり得ないこと、およびその説明が、その事象または状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。
「約」という用語は、例えば、温度、時間、量、濃度など、範囲を含む数値表記の前に使用される場合、（＋）もしくは（－）１０％、５％、１％、またはそれらの間の任意の部分範囲もしくは部分値によって変化し得る近似値を示す。好ましくは、「約」という用語は、量に関して使用される場合、量が±１０％変化し得ることを意味する。
「含んでいる（comprising）」または「含む（comprises）」は、組成物、および方法が、記載された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。「から本質的になる（consisting essentially of）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記載された目的のための組合せにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本発明で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される技術の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない他の材料または工程を排除しない。「からなる（consisting of）」は、他の成分および実質的な方法工程の微量よりも多い要素を除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、白血病、リンパ腫、癌腫、および肉腫を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）において見出されるすべての種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指す。本明細書において提供される化合物または方法を用いて処置され得る例示的ながんとしては、脳のがん、神経膠腫、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、髄芽腫、メラノーマ、子宮頸がん、胃がん、卵巣がん、肺がん、頭部のがん、ホジキン病、および非ホジキンリンパ腫が挙げられる。本明細書において提供される化合物または方法を用いて処置され得る例示的ながんとしては、甲状腺、内分泌系、脳、乳房、子宮頸、結腸、頭頸部、肝臓、腎臓、肺、卵巣、膵臓、直腸、胃、および子宮のがんが挙げられる。さらなる例としては、甲状腺癌、胆管癌、膵臓腺癌、皮膚黒色腫、結腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、乳房侵襲性がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、非小細胞肺癌、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、多形神経膠芽腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増加性、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前悪性皮膚病変、精巣がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、尿生殖器管がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、内分泌性もしくは外分泌性膵臓の新生物、髄様甲状腺がん、髄様甲状腺癌、メラノーマ、結腸直腸がん、乳頭様甲状腺がん、肝細胞癌、または前立腺がんが挙げられる。
化合物に関する「選択的」または「選択性」などは、化合物が分子標的を区別する能力を指す（例えば、化合物はＨＭＴ ＳＵＶ３９Ｈ１および／またはＨＭＴ Ｇ９ａに対する選択性を有する）。
化合物に関する「特異的」、「特異的に」、「特異性」などは、特定の分子標的に対して、特定の作用、例えば、阻害を引き起こす、化合物の能力を指し、細胞内の他のタンパク質に対する作用が最小限またはないことを指す（例えば、ＨＭＴ ＳＵＶ３９Ｈ１および／またはＨＭＴ Ｇ９ａに対する特異性を有する化合物は、それらのＨＭＴの活性の阻害を提示し、一方で同じ化合物は、他のＨＭＴ、例えば、ＤＯＴ１、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＧＬＰ、ＭＬＬ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬ４、ＮＳＤ２、ＳＥＴ１ｂ、ＳＥＴ７／９、ＳＥＴ８、ＳＥＴＭＡＲ、ＳＭＹＤ２、ＳＵＶ３９Ｈ２の阻害をほとんどまたはまったく示さない）。
「試料」は、本明細書で使用される場合、分析が意図される任意の標本を指す。いくつかの実施形態において、試料は、患者から採取される。いくつかの実施形態において、試料は、「生体液試料」である。「生体液試料」は、本明細書で使用される場合、生物体または対象に由来する任意の生体液を指す。例としては、全血、血漿、涙、唾液、リンパ液、尿、血清、脳脊髄液、胸水、および腹水が挙げられる。
「免疫応答」などの用語は、通常の慣例的意味で、生物体による、疾患から保護する応答を指す。応答は、当該技術分野において周知のように、自然免疫系または獲得免疫系によって開始され得る。
「免疫応答をモジュレートする」などの用語は、薬剤、例えば、本明細書においてその実施形態を含めて開示される化合物の投与の結果としての、対象の免疫応答における変化を指す。したがって、免疫応答は、薬剤、例えば、本明細書においてその実施形態を含めて開示される化合物の投与の結果として、活性化または脱活性化され得る。
「Ｂ細胞」または「Ｂリンパ球」は、当該技術分野におけるそれらの標準的な使用法を指す。Ｂ細胞は、白血球（white blood cell）（白血球（leukocyte））の一種であるリンパ球であり、抗体を産生する血漿細胞（「成熟Ｂ細胞」）へと発達する。「未成熟Ｂ細胞」は、成熟Ｂ細胞へと発達することができる細胞である。一般に、プロＢ細胞は、免疫グロブリン重鎖再配列を受けて、プロＢプレＢ細胞となり、さらに、免疫グロブリン軽鎖再配列を受けて、未成熟Ｂ細胞となる。未成熟Ｂ細胞には、Ｔ１およびＴ２ Ｂ細胞が含まれる。
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、本明細書で使用される場合、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種（白血球のサブタイプ）である。それらは、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によって、他のリンパ球、例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞とは区別することができる。Ｔ細胞には、例えば、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、およびヘルパーＴ細胞が含まれる。異なる種類のＴ細胞は、Ｔ細胞検出剤の使用によって、区別することができる。
「制御性Ｔ細胞」または「抑制性Ｔ細胞」は、免疫系をモジュレートし、自己抗原に対する寛容性を維持し、自己免疫疾患を予防する、リンパ球である。
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されるアミノ酸の一般的に公知の３文字表記によってまたは１文字表記によって本明細書で言及されてもよい。ヌクレオチドも同様に、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって言及され得る。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指して本明細書で互換可能に使用され、ポリマーは、実施形態において、アミノ酸からなるものではない部分にコンジュゲートされ得る。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「融合タンパク質」は、単一部分として組換え発現される２つまたはそれよりも多くの別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされる配列における単一のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を改変、付加、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、改変によりあるアミノ酸と化学的に類似のアミノ酸との置換が生じる「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の一覧は、当該技術分野において周知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本開示の多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子に対する追加であり、それらを排除するものではない。
アミノ酸またはヌクレオチド塩基の「位置」は、Ｎ末端（または５’末端）に対するその位置に基づいて、参照配列におけるそれぞれのアミノ酸（またはヌクレオチド塩基）を順に特定する番号によって指定される。最適なアライメントを判定するときに考慮に入れなければいけない欠失、挿入、トランケーション、融合などに起因して、一般に、Ｎ末端から単純にカウントすることによって判定される試験配列におけるアミノ酸残基番号は、参照配列におけるその対応する位置の番号と必ずしも同じにはならないであろう。例えば、変異体が、アライメントされる参照配列と比べて欠失を有する事例において、変異体には、欠失の部位に、参照配列における位置に対応するアミノ酸が存在しないであろう。アライメントされる参照配列に挿入が存在する場合、その挿入は、参照配列における番号づけされたアミノ酸位に対応しないであろう。トランケーションまたは融合の事例においては、参照配列またはアライメントされる配列のいずれかにおいて、対応する配列における任意のアミノ酸に対応しないアミノ酸のストレッチが存在し得る。
「を参照して番号づけされた」または「に対応する」という用語は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号づけの文脈において使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列に比較したときの、指定される参照配列の残基の番号づけを指す。
「アミノ酸側鎖」という用語は、アミノ酸に含まれる官能性置換基を指す。例えば、アミノ酸側鎖は、天然に存在するアミノ酸の側鎖であってもよい。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン）、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、およびＯ－ホスホセリンである。実施形態において、アミノ酸側鎖は、非天然アミノ酸側鎖であってもよい。
「非天然アミノ酸側鎖」という用語は、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、アリルアラニン、２－アミノイソ酪酸の官能性置換基を指す。非天然アミノ酸は、天然に存在するか、または化学的に合成されたかのいずれかである、非タンパク質原性アミノ酸である。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基化学構造を保有している。
「ＵＶ切断性アミノ酸側鎖」という用語は、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素の官能性置換基を指す。ＵＶ切断性アミノ酸は、天然に存在するか、または化学的に合成されたかのいずれかである、非タンパク質原性アミノ酸である。そのようなアナログは、修飾されたＲ基または修飾されたペプチド骨格を有し得るが、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基化学構造を保有している。ＵＶ切断性アミノ酸としては、限定することなく、２－ニトロフェニルグリシン（ＮＰＧ）、拡張型ｏ－ニトロベンジルリンカー、ｏ－ニトロベンジルケージドフェノール、ｏ－ニトロベンジルケージドチオール、３２ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）ケージドアニリン、ｏ－ニトロベンジルケージドセレン化物、ビス－アゾベンゼン、クマリン、シンナミル、スピロピラン、２－ニトロフェニルアラニン（２－ｎＦ）、および３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）アミノ酸アナログが挙げられる。
本明細書に提供される「ＭＨＣＩ」または「主要組織適合性複合体クラスＩ」または「主要組織適合性複合体Ｉ」または「ＭＨＣＩモノマー」という用語は、主要組織適合性複合体－１（ＭＨＣＩ）またはＭＨＣＩ活性（例えば、ＭＨＣＩと比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％以内の活性）を維持するその変異体もしくはホモログのあらゆる組換え形態または天然に存在する形態を含む。いくつかの態様において、変異体またはホモログは、天然に存在するＭＨＣＩポリペプチドと比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、５０、１００、１５０、もしくは２００の連続的なアミノ酸の部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態において、ＭＨＣＩは、重鎖（α）および軽鎖（β２－ミクログロブリン）、そのホモログまたは機能的断片の２つの非共有結合的に結合したタンパク質のヘテロダイマーである。実施形態において、ＭＨＣＩは、ペプチドリガンドを含む。
「ＨＬＡ」または「ヒト白血球抗原」という用語は、ＭＨＣ遺伝子複合体によってコードされるタンパク質の群を指す。具体的には、限定されないが、ＭＨＣＩ遺伝子複合体は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃの群のタンパク質をコードする。
「ベータ－２ミクログロブリン」または「Ｂ２Ｍ」または「β２ミクログロブリン」または「ベータ鎖」という用語は、細胞表面ＭＨＣＩタンパク質複合体の小さい方、または軽鎖のタンパク質を指す。Ｂ２Ｍは、１つのα鎖（重鎖）とヘテロダイマー複合体を形成する。Ｂ２Ｍは、Ｂ２Ｍ遺伝子によってコードされる。
「α鎖」または「アルファ鎖」という用語は、ＭＨＣＩタンパク質複合体の大きい方、または重鎖のタンパク質を指す。α鎖は、さらに、サブユニットα１、α２、およびα３に分割され、１つの膜貫通ヘリックスを含む。α鎖は、α３サブユニットを介してＢ２Ｍに結合して、ＭＨＣＩ複合体として知られるヘテロダイマーを形成する。α鎖は、多型であり、主として、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ遺伝子によってコードされ、より低い程度で、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｋ、およびＨＬＡ－Ｌによってコードされる。
「リガンド」という用語は、生体分子と複合体を形成して生物学的機能を果たす、分子を指す。結合は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸、核酸誘導体、非天然の核酸、アミノ酸、アミノ酸誘導体、非天然のアミノ酸、炭水化物、単糖類、二糖類、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、金属、金属錯体、薬物、脂質、脂肪酸、代謝産物、無機分子、有機分子、バイオポリマー、およびポリマーの間で起こり得るが、これらに限定されない。リガンド複合体は、イオン結合、共有結合、ファンデルワールス相互作用、および／または水素結合によって形成され得る。ＭＨＣＩのリガンドは、一般に、ペプチドである。
「結合する」および「結合した」という用語は、本明細書で使用される場合、その明白かつ通常の意味に従って使用され、原子間または分子間の会合を指す。会合は、直接的であっても間接的であってもよい。例えば、結合した原子または分子は、例えば、共有結合的結合もしくはリンカー（例えば、第１のリンカーもしくは第２のリンカー）による、直接的なものであってもよく、または非共有結合的結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子－双極子、双極子－誘起双極子、ロンドン分散）、環スタッキング（ｐｉ効果）、疎水性相互作用など）による、間接的なものであってもよい。
「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合しそれを認識する免疫グロブリン遺伝子またはその機能的断片によってコードされるポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは、それぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。
タンパク質またはペプチドに言及する場合、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応性である」という語句は、しばしばタンパク質および他の生物製剤の不均一な集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下において、指定された抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍超で特定のタンパク質に結合する。そのような条件下における抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質とは免疫反応性でない抗体のサブセットのみを得るように選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成され得る。様々なイムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために日常的に使用されている（特異的免疫反応性を決定するために使用することができる免疫アッセイ形式および条件の説明については、例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい）。
「変性する」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のバイオポリマーの三次元構造が、化学的もしくは機械的手段によって、または加熱もしくは冷却によって、破壊されるプロセスを指す。
「ペプチド交換」のプロセスは、まず、分析目的の別のペプチド、例えば、推定上のネオ抗原ペプチドで置き換えるかまたはそれと交換することが可能であるペプチドに結合したＭＨＣＩ複合体を形成することを指す。いくつかの事例において、交換は、例えば、第１のペプチドの化学的、酵素的、またはＵＶ媒介性の切断を通じて、第１のペプチドの、目的のペプチドに対する結合親和性を減少させることによって、促進され得る。
「ネオ抗原」または「ネオ抗原ペプチド」は、宿主の免疫系によって「非自己」として認識され得るペプチドを指す。ネオ抗原ペプチドは、例えば、腫瘍細胞における、突然変異体タンパク質に由来し得る。それらはまた、ウイルスもしくは細菌、または他の病原体に由来する病原性タンパク質に由来してもよい。あるいは、それらはまた、移植片、例えば、組織移植片、または同種移植片もしくは他の移植された細胞に由来してもよい。
「１Ｄ－ＬＣ」または「一次元液体クロマトグラフィー」プロセスは、単一の液体クロマトグラフィー分離を指し、対照的に、「２Ｄ－ＬＣ」または「二次元液体クロマトグラフィー」は、２回の分離が行われるクロマトグラフィーの方法を指す。
「サイズ排除クロマトグラフィー」または「ＳＥＣ」は、分子が、固相クロマトグラフィー培地において、サイズによって分離され、大きな分子が、小さな分子とは異なる速度で、固相カラムを通って移動する、クロマトグラフィーの手段である。いくつかの実施形態において、ＳＥＣは、１Ｄ－ＬＣプロセスにおいて使用される。ＳＥＣはまた、異なる形態の分離、例えば、逆相液体クロマトグラフィー工程と組み合わせて、２Ｄ－ＬＣプロセスにおいて使用されてもよく、またはイオン交換もしくは陽イオン交換もしくは親和性分離が、第２次元として用いられてもよい。
「キャピラリー電気泳動」または「ＣＥ」は、電流を使用して、キャピラリーを通して分子を移動させるプロセスを指す。それぞれの分子の移動度は、その電荷、サイズ、および形状に依存し得る。複数の種類のＣＥが存在し、とりわけ、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）、キャピラリー等電点電気泳動法（ＣＩＥＦ、capillary isoelectric focusing）、およびキャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＴＰ、capillary isoelectrophoresis）が挙げられる。
「キャピラリーゾーン電気泳動」」または「ＣＺＥ」は、本明細書で使用される場合、バッファー溶液中の異なる分子が、それらの異なる移動度に基づいて分離され得る、ＣＥの一種を指す。
「質量分析」または「ＭＳ」は、試料中の１つまたは複数の分子の質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定する技法を指す。本明細書で使用される場合、「タンデムＭＳ」または「ＭＳ／ＭＳ」は、単一のイオン、複数のイオン、または全質量エンベロープ（前駆体）が、断片化チャンバに移動され、断片化された産物が、次いで、質量分析装置に送られる、プロセスを指す。質量分析計の設計に応じて、断片化事象は、単一の質量分析装置の前、２つもしくは複数の異なる分析装置の間、または単一の質量分析装置内に発生し得る。
ＭＳ分析は、様々な選択肢を有し得る。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器は、四重極を含まない。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器は少なくとも１つの四重極を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器は少なくとも２つの四重極分析器を含む。いくつかの事例において、ＭＳ機器は、八重極を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器は少なくとも３つの四重極分析器を含む。いくつかのＭＳにおいて、検出器は、イオントラップ、四重極、ｏｒｂｉｔｒａｐ、またはＴＯＦである。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器または方法は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、シングルイオンモニタリング（ＳＩＭ）、トリプル四重極（ＴＳＱ）、四重極／飛行時間型（ＱＴＯＦ）、四重極線形イオントラップ（ＱＴＲＡＰ）、ハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳ、飛行時間／飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器、イオントラップ機器、平行反応モニタリング（ＰＲＭ）、データ依存性取得（ＤＤＡ）、データ独立取得（ＤＩＡ）、マルチステージ断片化、またはタンデムインタイムＭＳ／ＭＳである。いくつかの実施形態において、エレクトロスプレー、Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器が、使用される。
「ネイティブ質量分析」は、そのネイティブな状態にある分子に対して行われるＭＳプロセスである、すなわち、分子は、アンフォールディングも変性もされていない。
本明細書で使用される場合、「ＳＥＣ－ネイティブＭＳ」または「ＳＥＣ－ＭＳ」という略語は、ＳＥＣに続いてネイティブＭＳが行われるプロセスを指す。本明細書で使用される場合、「ＣＥ－ネイティブＭＳ」、「ＣＺＥ－ネイティブＭＳ」、「ＣＥ－ＭＳ」、および「ＣＺＥ－ＭＳ」という略語は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）に続いて、ネイティブＭＳが行われるプロセスを指す。
「定量化」または「定量化する」という用語は、本明細書において、試料中の被分析物のレベルまたは量または数または濃度を数値的に決定することを意味する。
一般に、本明細書において言及される「対象」は、生物学的試料が被分析物の存在について試験される個体である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。しかしながら、いくつかの実施形態において、対象はまた、別の哺乳動物、例えば、家畜種もしくは畜産動物種、例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど、または実験動物、例えば、マウスもしくはラットであってもよい。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、および非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、ならびにげっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「自動化された」または「自動的に制御された」プロセスは、システムの一部から別の部分に被分析物含有試料を移動させるなどのために、少なくとも１つの工程中またはその間に能動的な手動介入を必要とするシステムとは対照的に、例えば、適切なソフトウェアを備えたコンピュータ制御システムによって実行することができるプロセスである。
本明細書に記載の実施例および実施形態が、例示を目的とするものに過ぎないこと、ならびにそれを考慮に入れた様々な改変または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることを、理解されたい。本明細書で引用されるすべての公開公報、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
当業者は、本明細書に記載の複合体の作製および使用の説明が例示のみを目的としており、本開示がこの例示によって限定されないことを理解するであろう。
本明細書に記載される刊行物は、本特許出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書におけるいかなる部分も、そのような刊行物が添付の特許請求の範囲の先行技術であることを認めると解釈されるものではない。本明細書において参照されるすべての刊行物は、すべての組成物、成分、試薬、および方法を含むがこれらに限定されない、それらの教示のすべてに関して、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
ＭＨＣＩ組成物
ある態様において、アルファ鎖、ベータ鎖を含むＭＨＣＩ分子と、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドであるリガンドとを含む、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）／リガンド複合体が、本明細書において提供される。
実施形態において、ＭＨＣＩ／リガンド複合体は、アルファ鎖を含み、ここで、アルファ鎖は、以下の遺伝子座のうちのいずれか１つによってコードされる：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ。いくつかの実施形態において、アルファ鎖は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、アルファ鎖は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、アルファ鎖は、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子座によってコードされる。
実施形態において、ＭＨＣＩ／リガンド複合体は、ベータ－２ミクログロブリンドメイン（Ｂ２Ｍ）を含み、ここで、Ｂ２Ｍドメインは、ＭＨＣＩ遺伝子複合体によってコードされる。
実施形態において、ＭＨＣＩ／リガンド複合体は、ペプチドリガンドを含む。実施形態において、ペプチドリガンドは、８個と１１個の間のアミノ酸残基の長さである。いくつかの実施形態において、ペプチドリガンドは、８個のアミノ酸残基の長さである。いくつかの実施形態において、ペプチドリガンドは、９個のアミノ酸残基の長さである。いくつかの実施形態において、ペプチドリガンドは、１０個のアミノ酸残基の長さである。いくつかの実施形態において、ペプチドリガンドは、１１個のアミノ酸残基の長さである。
実施形態において、ＭＨＣＩ／リガンド複合体は、ペプチドリガンドを含み、ここで、ペプチドリガンドは、非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ＵＶ照射によって活性化される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸を含むペプチドリガンドは、ＵＶ光による照射の後に、切断される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、２－ニトロフェニルグリシン（ＮＰＧ）、拡張型ｏ－ニトロベンジルリンカー、ｏ－ニトロベンジルケージドフェノール、ｏ－ニトロベンジルケージドチオール、３２ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）ケージドアニリン、ｏ－ニトロベンジルケージドセレン化物、ビス－アゾベンゼン、クマリン、シンナミル、スピロピラン、２－ニトロフェニルアラニン（２－ｎＦ）、および３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）アミノ酸アナログから選択される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）である。
実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドのＮ末端とＣ末端との間の任意の位置に配置され得る。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドのＮ末端に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドの第２の位置（すなわち、Ｎ末端から２つ目の位置）に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドの第３の位置に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドの第４の位置に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドの第５の位置に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドの第６の位置に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドの第７の位置に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドの第８の位置に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドの第９の位置に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドの第１０の位置に配置される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ペプチドリガンドのＣ末端に配置される。
実施形態において、ペプチドリガンドは、ＦＭＹＪＤＦＨＦＩ（配列番号１）、ＦＬＰＪＤＦＦＰＳＶ（配列番号２）、ＦＬＰＳＤＪＦＰＳＶ（配列番号３）、ＦＹＩＱＭＪＴＥＬ（配列番号４）、ＹＶＩＪＤＬＡＡＭ（配列番号５）、ＨＦＦＪＷＧＴＭＦ（配列番号６）、ＡＶＶＳＬＪＲＬＬＫ（配列番号７）、ＧＴＨＪＬＬＰＦＹ（配列番号８）、ＡＭＬＴＡＪＦＬＲ（配列番号９）、ＨＬＭＦＹＪＬＰＩ（配列番号１０）、ＱＬＦＪＦＳＰＲＲ（配列番号１１）、ＴＪＦＦＹＲＹＧＦＶ（配列番号１２）、ＤＥＦＪＰＩＶＱＹ（配列番号１３）、ＲＥＳＦＧＪＥＳＦ（配列番号１４）、ＴＰＡＪＹＦＨＶＬ（配列番号１５）、ＡＥＮＪＹＶＴＶＦ（配列番号１６）、ＫＥＶＬＶＬＷＪＩ（配列番号１７）、ＦＭＹＥＧＪＴＰＬ（配列番号１８）、ＦＰＦＪＬＡＡＩＩ（配列番号１９）、ＦＰＩＰＳＪＷＡＦ（配列番号２０）、ＩＴＡＡＡＷＹＪＷ（配列番号２１）、ＬＡＶＭＧＪＡＡＷ（配列番号２２）、ＨＬＰＪＧＶＫＳＬ（配列番号２３）、ＦＡＡＥＡＪＫＬ（配列番号２４）、ＧＡＩＮＳＪＬＰＹ（配列番号２５）、ＦＡＩＶＰＪＬＱＩ（配列番号２６）、ＦＡＭＪＶＰＬＬＩ（配列番号２７）、ＡＲＦＪＤＬＲＦＶ（配列番号２８）、ＡＮＮＪＲＬＷＶＹ（配列番号２９）、ＹＡＡＪＴＮＦＬＬ（配列番号３０）、ＩＳＤＳＡＪＮＭＭ（配列番号３１）、ＷＡＷＪＦＡＡＶＬ（配列番号３２）、ＭＭＨＪＳＴＳＰＦ（配列番号３３）、またはＲＴＦＧＱＪＬＦＦ（配列番号３４）である。
ペプチド交換アッセイ
ある態様において、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）対立遺伝子の試験ペプチドへの結合を判定するためのペプチド交換アッセイであって、遊離した試験ペプチドと、アルファ鎖、ベータ鎖、および非天然紫外線（ＵＶ）切断性アミノ酸をその配列内に含むペプチドリガンドを含むＭＨＣＩ／リガンド複合体とを含む第１の混合物を提供することと、第１の混合物をＵＶ光に曝露して、ペプチドリガンドをＵＶ切断性アミノ酸において切断することと、第１の混合物をある期間インキュベートして、アルファ鎖、ベータ鎖、および試験ペプチドを含む第２のＭＨＣＩ複合体を含む第２の混合物を形成することと、ＭＨＣＩ対立遺伝子が、試験ペプチドに結合したかどうかを判定することとを含む、ペプチド交換アッセイが、本明細書において提供される。
実施形態において、第１の混合物中の遊離した試験ペプチドの量は、ＭＨＣＩ／リガンド複合体と比較して、１：１００～１００：１である。いくつかの実施形態において、第１の混合物中の遊離した試験ペプチドの量は、ＭＨＣＩ／リガンド複合体と比較して、１：１０～１０：１である。実施形態において、第１の混合物中の遊離した試験ペプチドの量は、ＭＨＣＩ／リガンド複合体と比較して、１：１～１００：１である。実施形態において、第１の混合物中の遊離した試験ペプチドの量は、ＭＨＣＩ／リガンド複合体と比較して、１０：１～１００：１である。実施形態において、第１の混合物中の遊離した試験ペプチドの量は、ＭＨＣＩ／リガンド複合体と比較して、約１０：１である。この比は、端点を含む、提供される範囲内の任意の値または部分範囲であってもよい。
実施形態において、ＭＨＣＩ対立遺伝子の試験ペプチドへの結合は、第２の混合物中のＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体のレベルを測定することによって、判定される。いくつかの実施形態において、アッセイにおけるＭＨＣＩ複合体は、第２の混合物中の結合した試験ペプチドによって部分的に占有される（第２の混合物中の全ＭＨＣＩ複合体の一部分が、試験ペプチドによって結合されている）。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩ複合体は、第２の混合物中の結合した試験ペプチドによって完全に占有される（第２の混合物中の全ＭＨＣＩ複合体のすべてが、試験ペプチドによって結合されている）。
実施形態において、ＭＨＣＩ／第２のペプチド複合体のレベルは、第２の混合物の２次元液体クロマトグラフィー－質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）によって測定される。いくつかの実施形態において、２Ｄ ＬＣ／ＭＳは、遊離した試験ペプチドを、第２の混合物から除去することを含む。いくつかの実施形態において、遊離した試験ペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去される。いくつかの実施形態において、遊離した試験ペプチドは、サイズカットオフ濾過によって除去される。いくつかの実施形態において、遊離したペプチドは、透析によって除去される。
実施形態において、ＭＨＣＩおよび試験ペプチドの同一性を区別するための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析（ＭＳ）。いくつかの実施形態において、第２の混合物を、サイズ排除カラムを備えるＨＰＬＣ（またはＦＰＬＣ）に流す。いくつかの実施形態において、ＨＰＬＣ（またはＦＰＬＣ）は、画分を収集するために装備されている。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩおよび試験ペプチドが特定されて、同じＨＰＬＣ画分に溶出される。いくつかの実施形態において、遊離した試験ペプチドは、遊離したＭＨＣＩおよびＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体とは異なる画分中に溶出される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩおよび試験ペプチドの共溶出は、ＭＨＣＩが、試験ペプチドに結合することができることを示す。
実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物に添加される１つを上回る試験ペプチド（例えば、１つを上回るペプチド配列）が存在する。いくつかの実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、２つまたはそれよりも多くの試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、３つまたはそれよりも多くの試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、４つまたはそれよりも多くの試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、５つまたはそれよりも多くの試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、６つまたはそれよりも多くの試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、７つまたはそれよりも多くの試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、８つまたはそれよりも多くの試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、９つまたはそれよりも多くの試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１０個またはそれよりも多くの試験ペプチドが存在する。
実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１０～１０００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１０～５００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１０～２００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１０～２０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、２０～３０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、３０～４０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、４０～５０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、５０～６０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、６０～７０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、７０～８０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、８０～９０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、９０～１００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１００～１１０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１１０～１２０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１２０～１３０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１３０～１４０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１４０～１５０個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、１５０～２００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、２００～３００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、３００～４００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、４００～５００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、５００～６００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、６００～７００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、７００～８００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、８００～９００個の試験ペプチドが存在する。実施形態において、第１のＭＨＣＩ／試験ペプチド混合物には、９００～１０００個の試験ペプチドが存在する。試験ペプチドの数は、端点を含む、提供される範囲内の任意の値または部分範囲であってもよい。試験ペプチドの数は、当業者が交換アッセイにおいて使用するのに適していると認識する試験ペプチド数によってのみ制限される。
実施形態において、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体ＨＰＬＣ画分に共溶出する１つを上回る試験ペプチドが存在する。
実施形態において、質量分析を使用して、第２の混合物中のＭＨＣＩおよび／または試験ペプチドの同一性を特定する。いくつかの実施形態において、質量分析計は、ＨＰＬＣとインラインである。いくつかの実施形態において、ＨＰＬＣ画分は、まず収集され、次いで、質量分析によって分析される。実施形態において、遊離した試験ペプチドは、ＭＨＣＩ複合体の質量分析による検出の前に除去される。実施形態において、画分または第２の混合物中に存在する試験ペプチドの量は、内標準ペプチドとの比較によって、質量分析によって定量化される。
実施形態において、ＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体は、標識される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩ／試験ペプチドは、蛍光標識される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体は、蛍光標識化抗体と接触させることによって、標識される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体は、蛍光抗体と接触させることによって標識され、ここで、蛍光抗体は、抗ＨＬＡである。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、アルファタンパク質のビオチン化によって標識される。
実施形態において、ペプチド交換のレベルは、標識化ＭＨＣＩ／ペプチド複合体を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーに共有結合的に結合した抗ＭＨＣＩ対立遺伝子抗体を含む抗体複合体および第２の標識にコンジュゲートしたＦＲＥＴアクセプターを含むＦＲＥＴアクセプター複合体と接触させ、それによって、反応組成物を形成すること、ならびに反応組成物における第２の標識のＦＲＥＴ放出を検出し、それによって、ペプチド結合の代理尺度である安定なＭＨＣＩ対立遺伝子の形成を検出することによって、判定される。いくつかの実施形態において、第１の標識は、抗ＭＨＣＩ抗体であり、これは、抗Ｂ２Ｍである。いくつかの実施形態において、第１の標識は、抗ＭＨＣＩ抗体であり、ユーロピウムイオンをキレートする。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体のアルファタンパク質は、ビオチン化される。いくつかの実施形態において、ビオチン化されたＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、第２の標識に結合する。いくつかの実施形態において、第２の標識は、ストレプトアビジンタンパク質である。いくつかの実施形態において、第２の標識は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に共有結合的に連結されたストレプトアビジンタンパク質である。いくつかの実施形態において、第１および第２の標識は、第１および第２の標識を含むＭＨＣＩ／ペプチド複合体が存在する場合に、ＦＲＥＴに好適なスペクトル重なり積分を有する。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴドナー／アクセプターペア標識としては、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴドナー／アクセプターペア標識としては、５－（｛２－［（ヨードアセチル）アミノ］エチル｝アミノ）ナフタレン－１スルホン酸（ＩＡＥＤＡＮＳ）およびフルオレセインが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴドナー／アクセプターペア標識としては、（５－（（２－アミノエチル）アミノ）ナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）および４－（（４－（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（Ｄａｂｃｙｌ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴドナー／アクセプターペア標識としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５が挙げられる。いくつかの実施形態において、ドナー／アクセプターペア標識としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７が挙げられる。いくつかの実施形態において、ドナー／アクセプターペア標識としては、ユーロピウム（Ｅｕ－ｃｒｙｐｔａｔｅ）およびアロフィコシアニン（ＸＬ６６５）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ドナー／アクセプターペア標識としては、テルビウムおよびフルオレセインが挙げられる。第１および第２の標識は、当該技術分野において公知の任意の好適な標識ペアであり得る。
実施形態において、ペプチド交換検出アッセイ試薬およびＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、約１時間と約４８時間の間にわたって、インキュベートされる。実施形態において、ペプチド交換検出アッセイ試薬およびＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、少なくとも約１時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、ペプチド交換検出アッセイ試薬およびＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、少なくとも約５時間インキュベートされる。実施形態において、ペプチド交換検出アッセイ試薬およびＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、少なくとも約１０時間インキュベートされる。実施形態において、ペプチド交換検出アッセイ試薬およびＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、少なくとも約１２時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、ペプチド交換検出アッセイ試薬およびＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、少なくとも約１５時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、ペプチド交換検出アッセイ試薬およびＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、少なくとも約２０時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、ペプチド交換検出アッセイ試薬およびＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、少なくとも約２４時間インキュベートされる。インキュベーション時間は、端点を含む、提供される範囲内の任意の値または部分範囲であってもよい。
いくつかの実施形態において、第１の標識は、ストレプトアビジンタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、第１の標識は、抗ＨＬＡ抗体を含む。いくつかの実施形態において、第１の標識は、モノボディを含む。いくつかの実施形態において、第１の標識は、部分抗体を含む。いくつかの実施形態において、第１の標識は、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１の標識は、抗体断片を含む。
いくつかの実施形態において、第２の標識は、ストレプトアビジンである。
実施形態において、ＦＲＥＴアクセプターからの放出は、試験ペプチドのＭＨＣＩ複合体への結合を示す。いくつかの実施形態において、結合したペプチドのレベルは、時間分解（ＴＲ）ＦＲＥＴ検出によって判定される。いくつかの実施形態において、ＴＲ－ＦＲＥＴアクセプター標識からのシグナルは、存在するＭＨＣＩ複合体のレベルを示す。いくつかの実施形態において、存在するＭＨＣＩ複合体のレベルは、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体の存在を示す。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体は、試験ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴ放出からのシグナルは、２つまたはそれよりも多くのＭＨＣＩ対立遺伝子間で正規化される。いくつかの実施形態において、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイは、約４℃と約５０℃の間の温度で行われる。いくつかの実施形態において、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイは、室温で行われる。いくつかの実施形態において、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイは、約３７℃で行われる。
複合体検出アッセイ
ある態様において、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）対立遺伝子の試験ペプチドへの結合を検出する方法であって、試験ペプチドと、アルファ鎖、ベータ鎖を有するＭＨＣＩ分子、および非天然紫外線（ＵＶ）切断性アミノ酸を含むペプチドであるリガンドを含むＭＨＣＩ／リガンド複合体とを含む、第１の組成物を提供することと、第１の組成物をＵＶ光に曝露して、リガンドをＵＶ切断性アミノ酸において切断することと、第２の混合物中のＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体を検出し、それによって、ＭＨＣＩ分子の試験ペプチドへの結合を検出することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
実施形態において、ＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体のレベルを検出し、対照と比較する。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体のレベルを検出し、内標準と比較する。いくつかの実施形態において、内標準は、ペプチドである。
実施形態において、ＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体のレベルは、例えば、上述のような、２次元液体クロマトグラフィー－質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）を使用して検出される。いくつかの実施形態において、第２の混合物は、２Ｄ ＬＣ／ＭＳによる分析に好適な器に移される。いくつかの実施形態において、遊離した試験ペプチドは、２Ｄ ＬＣ／ＭＳによる分析の前に、第２の混合物から除去される。いくつかの実施形態において、遊離した試験ペプチドは、任意の非変性カラムクロマトグラフィーによって、質量スペクトル分析の前に、除去される。非変性カラムクロマトグラフィーの例としては、サイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、順相、または逆相クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、遊離した試験ペプチドは、２Ｄ ＬＣ／ＭＳによる分析の前に、サイズ排除クロマトグラフィーによって、第２の混合物から除去される。
ＭＨＣＩ結合性リガンド特定アッセイ
ある態様において、ＭＨＣＩ結合性リガンドを特定する方法であって、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマーを、複数のベータ鎖モノマーおよび非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドであるリガンドと、ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成を可能にする条件下において接触させることと、ＭＨＣＩ／リガンド複合体を検出し、それによって、ＭＨＣＩ結合性リガンドを特定することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
実施形態において、ＭＨＣＩアルファモノマーは、接触工程の前に変性される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩアルファモノマーは、接触工程の前にアンフォールディングされる。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩアルファモノマーは、グアニジンＨＣｌ、グアニジンイソチオシアネート、および／または尿素溶液を使用して、変性される。いくつかの実施形態において、グアニジンＨＣｌまたは尿素の濃度は、６Ｍである。いくつかの実施形態において、還元試薬が、変性溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、還元試薬および酸化試薬の混合物が、変性溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、緩衝化試薬が、変性溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、塩が、変性溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、界面活性剤が、変性溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩアルファモノマーは、封入体から回収される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩアルファモノマーは、ＳＥＣカラムへの適用の前に、変性される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩアルファモノマーは、ＳＥＣカラムで変性条件下において分離される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩアルファモノマーは、変性条件下において収集および保管される。
実施形態において、変性したアルファモノマーは、リフォールディング過程において、Ｂ２Ｍの存在下でリフォールディングされる。実施形態において、変性したアルファモノマーは、リフォールディング過程において、Ｂ２Ｍおよびペプチドリガンドの存在下でリフォールディングされる。実施形態において、リフォールディング過程は、Ｂ２Ｍ、ペプチドリガンド、ならびに緩衝化試薬、塩、還元試薬、酸化試薬、対イオン、キレート剤、および／または界面活性剤のうちのいずれか１つまたはそれ以上の存在下において、変性したアルファ鎖モノマー急速な希釈によって、開始される。実施形態において、リフォールディング過程は、Ｂ２Ｍ、ペプチドリガンド、および緩衝化試薬の存在下において、変性したアルファ鎖モノマーの急速な希釈によって、開始される。実施形態において、リフォールディング過程は、Ｂ２Ｍ、ペプチドリガンド、ならびに緩衝化試薬および塩の存在下において、変性したアルファ鎖モノマーの急速な希釈によって、開始される。実施形態において、リフォールディング過程は、Ｂ２Ｍ、ペプチドリガンド、ならびに緩衝化試薬、塩、および還元試薬の存在下において、変性したアルファ鎖モノマーの急速な希釈によって、開始される。実施形態において、リフォールディング過程は、Ｂ２Ｍ、ペプチドリガンド、緩衝化試薬、塩、還元試薬、および酸化試薬の存在下において、変性したアルファ鎖モノマーの急速な希釈によって、開始される。実施形態において、リフォールディング過程は、Ｂ２Ｍ、ペプチドリガンド、ならびに緩衝化試薬、塩、還元試薬、酸化試薬、および対イオンの存在下において、変性したアルファ鎖モノマー急速な希釈によって、開始される。実施形態において、リフォールディング過程は、Ｂ２Ｍ、ペプチドリガンド、ならびに緩衝化試薬、塩、還元試薬、酸化試薬、対イオン、およびキレート剤の存在下において、変性したアルファ鎖モノマー急速な希釈によって、開始される。実施形態において、リフォールディング過程は、Ｂ２Ｍ、ペプチドリガンド、ならびに緩衝化試薬、塩、還元試薬、酸化試薬、対イオン、キレート剤、および界面活性剤の存在下において、変性したアルファ鎖モノマー急速な希釈によって、開始される。いくつかの実施形態において、リフォールディング過程は、９６ウェルプレートのウェル内で生じる。いくつかの実施形態において、リフォールディング過程は、４℃で生じる。いくつかの実施形態において、緩衝化試薬は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン－ＨＣｌ（トリスＨＣｌ）、ｐＨ８．０である。いくつかの実施形態において、対イオンは、Ｌ－アルギニンである。いくつかの実施形態において、還元剤は、還元グルタチオンである。いくつかの実施形態において、酸化試薬は、酸化グルタチオンである。いくつかの実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
実施形態において、ＭＨＣＩアルファモノマー、Ｂ２Ｍ、およびペプチドリガンドは、約５時間と約５日間の間にわたって、リフォールディング溶液との接触にある。実施形態において、ＭＨＣＩアルファモノマー、ベータ鎖モノマー、およびペプチドリガンドは、少なくとも約１２時間、２４時間、４８時間、リフォールディング溶液との接触にある。インキュベーション時間は、端点を含む、提供される範囲内の任意の値または部分範囲であってもよい。
実施形態において、複数のリガンドが、ＭＨＣＩアルファおよびベータ鎖モノマーと接触する。例えば、複数のペプチド配列が、多重アッセイ形式において使用され得る。
実施形態において、ＭＨＣＩ／ペプチドリガンド複合体を検出することは、ＭＨＣＩ／リガンド複合体が、固体支持体に結合した抗ＭＨＣＩアルファ鎖抗体に結合し、それによって、結合したＭＨＣＩ／リガンド複合体を形成すること、結合したＭＨＣＩ／リガンド複合体を、標識化抗ベータ鎖抗体と接触させ、それによって、結合した標識化ＭＨＣＩ／リガンド複合体を形成すること、および結合した標識化ＭＨＣＩ／リガンド複合体を検出することを含む。いくつかの実施形態において、遊離した抗ベータ鎖抗体は、ＭＨＣＩ／リガンドペプチド複合体検出の前に除去される。
ＭＨＣＩ対立遺伝子－リガンドの組合せの最適化アッセイ
ある態様において、最適な主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）対立遺伝子－リガンドの組合せを判定するための方法であって、変性条件下において精製された複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマーを提供することと、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、および非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドを含むリガンドを組み合わせることによって、反応混合物を形成することと、混合物を、ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成を可能にする条件下においてインキュベートすることと、ＭＨＣＩ／リガンド複合体が形成されたかどうかを判定することとを含む、方法が、本明細書において提供される。
実施形態において、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドは、少なくとも約５時間と約５日間の間にわたって、インキュベートされる。実施形態において、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドは、少なくとも約５時間インキュベートされる。実施形態において、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドは、少なくとも約１０時間インキュベートされる。実施形態において、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドは、少なくとも約１２時間インキュベートされる。実施形態において、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドは、少なくとも約２４時間インキュベートされる。実施形態において、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドは、少なくとも約４８時間インキュベートされる。実施形態において、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドは、少なくとも約７２時間インキュベートされる。実施形態において、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドは、少なくとも約４日間インキュベートされる。実施形態において、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドは、約５日間インキュベートされる。インキュベーション時間は、端点を含む、提供される範囲内の任意の値または部分範囲であってもよい。
実施形態において、複数のリガンドがスクリーニングされ、それぞれのリガンドはアミノ酸配列を含み、それぞれのリガンドのアミノ酸配列は、互いのリガンドのアミノ酸配列とは、配列内のＵＶ切断性アミノ酸の位置のみが異なる。
実施形態において、ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって判定される。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡは、反応混合物を、表面および表面にコンジュゲートした抗ＭＨＣＩアルファ鎖抗体を含む容器に導入すること、存在する場合に、標識化抗ベータ鎖抗体がベータ鎖モノマーに結合するように、検出可能な標識を含む標識化抗ベータ鎖抗体を容器に導入すること、洗浄して、未結合の標識化抗ベータ鎖抗体を除去すること、ならびに容器内の検出可能な標識の存在を検出することを含む。
実施形態において、検出可能な標識は、ビオチンまたはペプチドタグを含む。実施形態において、検出可能な標識は、ビオチンを含む。実施形態において、検出可能なビオチン標識は、ストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを容器に導入すること、およびＨＲＰ基質を添加した後に化学発光のレベルを判定することによって、視覚化される。いくつかの実施形態において、容器は、マルチウェルプレートである。
いくつかの実施形態において、検出アッセイは、１つのＭＨＣＩ複合体について、２つの異なるリガンド間で最適なＭＨＣＩ／リガンド複合体形成を判定するために、反復される。
実施形態において、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドであって、配列番号１～配列番号３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ペプチド。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号５の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号６の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１３の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１４の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１５の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１６の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２３の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２４の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２５の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２６の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３３の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３４の配列を含む。
ネイティブＳＥＣ－ＭＳおよびＣＥ－ＭＳ方法
本開示は、ネイティブ質量分析と組み合わせた、サイズ排除クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動のいずれかを使用して、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体をモニタリングするための方法に関する。試料中のペプチド交換された主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体をモニタリングする１つの例示的な方法は、（ａ）目的のペプチドを含む、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を得ることと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、（ｃ）（ｂ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、目的のペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む。試料中のペプチド交換された主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体をモニタリングする、本明細書における別の例示的な方法は、（ａ）交換可能なペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を得、複合体を、交換可能なペプチドと目的のペプチドとの間におけるペプチド交換を可能にする条件下において、１つまたは複数の目的のペプチドに曝露することと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、（ｃ）（ｂ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、目的のペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む。
本明細書における方法はまた、例えば、ＭＨＣＩと複合体を形成したペプチドのＴ細胞認識をモニタリングすることであって、（ａ）目的のペプチドを含む、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を得ることと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を、Ｔ細胞を含む試料と接触させることと、（ｃ）Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体を、未結合のＭＨＣＩ複合体から分離することと、（ｄ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、（ｅ）（ｄ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、試料由来のＴ細胞によって認識されるペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む、モニタリングすることも含む。本明細書における方法はまた、例えば、ＭＨＣＩと複合体を形成したペプチドのＴ細胞認識をモニタリングすることであって、（ａ）交換可能なペプチドを含む主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体を得、複合体を、ペプチド交換を可能にする条件下において、１つまたは複数の目的のペプチドに曝露することと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を、Ｔ細胞を含む試料と接触させることと、（ｃ）Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体を、未結合のＭＨＣＩ複合体から分離することと、（ｄ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、（ｅ）（ｄ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、試料由来のＴ細胞によって認識されるペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む、モニタリングすることも含む。いくつかの事例において、Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体を、未結合のＭＨＣＩ複合体から分離することは、フローサイトメトリーによって行われる。
本明細書におけるいくつかの方法において、試料は、生体液試料である。いくつかの事例において、試料は、全血または血漿試料である。いくつかの実施形態において、試料は、１つまたは複数の合成により産生された目的のペプチドを含む。本明細書におけるいくつかの方法において、ＭＨＣＩ複合体は、ヒトＭＨＣＩ複合体である。本明細書におけるいくつかの方法において、試料は、ＭＨＣＩライブラリーまたはアレイ由来である。
いくつかの実施形態において、本方法は、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体にＳＥＣを行うことを含む。いくつかのそのような事例において、２～１０μＬの体積、例えば、３～６μＬまたは４～５μＬが、ネイティブＭＳ分析のために注入される。いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、ＳＥＣの直後に続く。
いくつかの実施形態において、本方法は、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体にＣＥを行うことを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体にＣＺＥを行うことを含む。いくつかの事例において、交換されたペプチドは、１００μｇ／ｍＬ以下、５０～５００μｇ／ｍＬ、５０～２００μｇ／ｍＬ、１００～２００μｇ／ｍＬ、または５０～１００μｇ／ｍＬの濃度で検出可能である。本方法がＣＥまたはＣＺＥを使用するいくつかの事例において、２～１００ｎｌ、例えば、２～５０ｎｌ、２～１０ｎｌ、３～１０ｎｌ、または３～５ｎｌの体積が、ネイティブＭＳ分析のために注入される。いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、ＣＥまたはＣＺＥの直後に続く。
いくつかの事例において、本明細書における方法は、少なくとも１つの目的のペプチドが、ＭＨＣＩ複合体に交換された程度の判定および定量化を可能にする。したがって、それらは、ペプチド交換反応をモニタリングすること、および／または反応がその最大範囲に達すると、交換のパーセントもしくは程度を判定することを可能にし得る。
いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、ＭＨＣＩ複合体に結合した目的のペプチドの構造または配列を特徴づけることをさらに含む。いくつかの事例において、ネイティブＭＳは、タンデムＭＳ（「ＭＳ／ＭＳ」）（例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、シングルイオンモニタリング（ＳＩＭ）、トリプル四重極（ＴＳＱ）、四重極／飛行時間型（ＱＴＯＦ）、四重極線形イオントラップ（ＱＴＲＡＰ）、ハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳ、飛行時間／飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）、またはタンデムインタイムＭＳ／ＭＳを介する）として行われる。いくつかの事例において、ネイティブＭＳは、ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ機器へのエレクトロスプレーイオン化を含む。
上記のいくつかの方法において、クロマトグラフィーまたは電気泳動およびネイティブＭＳは、酢酸アンモニウムまたは葉酸アンモニウムバッファーにおいて行われ、かつ／またはバッファーが、ＴＲＩＳまたはＰＢＳを含まない。
本明細書における方法は、例えば、試料中のペプチド交換された主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体に、ネイティブ質量分析（ＭＳ）を行う方法を含む。いくつかの事例において、本方法は、（ａ）目的のペプチドを含む、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を得ることと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行うか、またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）、例えば、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、（ｃ）（ｂ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、目的のペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む。いくつかの実施形態において、ＳＥＣが、工程（ｂ）において使用される。いくつかの実施形態において、ＣＥが、工程（ｂ）において使用される。いくつかの事例において、ＣＺＥが、工程（ｂ）において使用される。いくつかの実施形態において、ＳＥＣ、ＣＥ、またはＣＺＥと、ＭＳ分析との間に、さらなる（すなわち、第２次元の）クロマトグラフィーまたは他の分離プロセスは、行われない。したがって、いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、さらなる洗浄、バッファー交換、またはクロマトグラフィー工程なしに、ＳＥＣ、ＣＥ、またはＣＺＥの直後に続く。
本明細書における方法はまた、例えば、試料中のペプチド交換された主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体をモニタリングする方法であって、（ａ）目的のペプチドを含む、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を得ることと、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー、またはキャピラリー電気泳動、例えば、キャピラリーゾーン電気泳動を行うことと、（ｃ）（ｂ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、目的のペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することとを含む、方法も含む。いくつかの実施形態において、ＳＥＣが、工程（ｂ）において使用される。いくつかの実施形態において、ＣＥが、工程（ｂ）において使用される。いくつかの事例において、ＣＺＥが、工程（ｂ）において使用される。いくつかの実施形態において、ＳＥＣ、ＣＥ、またはＣＺＥと、ＭＳ分析との間に、さらなる（すなわち、第２次元の）クロマトグラフィーまたは他の分離プロセスは、行われない。したがって、いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、さらなる洗浄、バッファー交換、またはクロマトグラフィー工程なしに、ＳＥＣ、ＣＥ、またはＣＺＥの直後に続く。
上記の方法のいくつかの実施形態において、（ａ）の部分は、ＭＨＣＩ分子にペプチド交換を行うことをさらに含む。例えば、ペプチド交換は、ＭＨＣＩ結合ポケットに対するその親和性を低減させ、それを分析のためのペプチドとの競合に感受性にするように切断または修飾され得る、第１のペプチドを使用することによって促進され得る。ペプチド交換は、例えば、ＵＶ光、特定の化学物質、または酵素に曝露されると修飾または切断され得、例えば、それによって、ＭＨＣＩ結合ポケットへのその親和性が低減される、第１の交換可能なペプチドを使用して、行うことができる。（例えば、Rodenko, B. et al., “Generation of peptide-MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange,” Nature Protocols, 1: 1120-32 (2006)を参照されたい）。
本明細書における方法は、様々な種類の試料および実験の状況と適合性がある。例えば、いくつかの方法において、試料は、対象に由来する生体液試料である。いくつかの方法において、試料は、全血または血漿試料であり得る。いくつかの方法において、試料は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。いくつかの方法において、試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。他の方法において、試料は、対象に由来しない。例えば、いくつかの方法において、試料は、例えば、特定の種類のＭＨＣＩ複合体への結合について試験するための、１つまたは複数の合成で産生されたペプチドを含む。いくつかの方法において、異なるペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体のアレイまたはライブラリーが、任意に、異なるアルファおよびベータから構成される異なるＭＨＣＩ複合体と混合された多数の異なる目的のペプチドとともに、提供されてもよい。いくつかの態様において、これらの異なるペプチド－ＭＨＣＩ複合体は、例えば、それぞれのウェルが固有の目的のペプチドおよび／またはＭＨＣＩ複合体を含む、多数の試料ウェルを含むアレイに配置されてもよい。この様式において、本明細書における方法は、例えば、どの目的のペプチドが、特定のＭＨＣＩ複合体に非共有結合的に結合するであろうかを判定するために使用することができる。
本明細書におけるいくつかの実施形態は、ＭＨＣＩ複合体をモニタリングして、ある特定の目的のペプチドに、Ｔ細胞が結合するかどうかを判定することを含み得る。したがって、いくつかの実施形態は、（ａ）目的のペプチドを含む、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を得ること、（ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を、Ｔ細胞を含む試料（例えば、生体液試料、例えば、全血または血漿）と接触させること、（ｃ）Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体を、未結合のＭＨＣＩ複合体から分離すること、（ｄ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動（例えば、ＣＺＥ）を行うこと、ならびに（ｅ）（ｄ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、試料由来のＴ細胞によって認識されるペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することを含み得る。例えば、いくつかの事例において、Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体と、未結合の複合体とは、蛍光補助細胞分取（ＦＡＣＳ）またはフローサイトメトリーによって分離される。いくつかの事例において、Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体を、Ｔ細胞が結合していない複合体から分離することは、クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動の前に行われる。これは、どのペプチド－ＭＨＣＩ複合体をＴ細胞が認識するかの判定を可能にし得る。いくつかの実施形態において、ＳＥＣが、工程（ｂ）において使用される。他の実施形態において、ＣＥが、工程（ｂ）において使用される。いくつかの事例において、ＣＺＥが、工程（ｂ）において使用される。上記の実施形態のうちのいくつかにおいて、ＳＥＣ、ＣＥ、またはＣＺＥと、ＭＳ分析との間に、さらなる（すなわち、第２次元の）クロマトグラフィーまたは他の分離プロセスは、行われない。したがって、いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、さらなる洗浄、バッファー交換、またはクロマトグラフィー工程なしに、ＳＥＣ、ＣＥ、またはＣＺＥの直後に続く。いくつかの実施形態において、方法の（ａ）の部分は、ＭＨＣＩ複合体に、ペプチド交換を行うことをさらに含む。例えば、ペプチド交換は、ＭＨＣＩ結合ポケットに対するその親和性を低減させ、それを分析のためのペプチドとの競合に感受性にするように切断または修飾され得る、第１のペプチドを使用することによって促進され得る。
いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が、ＭＳの前に、試料中の分子を分離するために使用される。他の実施形態において、キャピラリー電気泳動が、ＭＳの前に、試料中の分子を分離するために使用される。他の実施形態において、キャピラリー電気泳動が、ＭＳの前に、試料中の分子を分離するために使用される。上記の方法のいくつかの実施形態において、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）である。他の種類のＣＥもまた、利用可能であり、とりわけ、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）、キャピラリー等電点電気泳動法（ＣＩＥＦ）、およびキャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＴＰ）が挙げられる。
ネイティブＭＳ分析は、様々な選択肢を有し得る。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器は、四重極を含まない。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器は少なくとも１つの四重極を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器は少なくとも２つの四重極分析器を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器は少なくとも３つの四重極分析器を含む。いくつかのＭＳにおいて、検出器は、イオントラップ、四重極、ｏｒｂｉｔｒａｐ、またはＴＯＦである。いくつかの実施形態において、ＭＳ機器または方法は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、シングルイオンモニタリング（ＳＩＭ）、トリプル四重極（ＴＳＱ）、四重極／飛行時間型（ＱＴＯＦ）、四重極線形イオントラップ（ＱＴＲＡＰ）、ハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳ、飛行時間／飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器、イオントラップ機器、平行反応モニタリング（ＰＲＭ）、データ依存性取得（ＤＤＡ）、データ独立取得（ＤＩＡ）、マルチステージ断片化、またはタンデムインタイムＭＳ／ＭＳである。
いくつかの実施形態において、ＳＥＣ－ネイティブＭＳまたはＣＥ－ネイティブＭＳ（例えば、ＣＺＥ－ＭＳ）は、ＭＳ中に有意にイオン化しないバッファーにおいて行われる。いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、バッファー、例えば、酢酸アンモニウムまたはギ酸アンモニウムにおいて行われる。いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、イオン化バッファー、例えば、ＴＲＩＳまたはＰＢＳを用いて行われない。ＳＥＣまたはＣＥが、ネイティブＭＳの直後に行われる場合、したがって、いくつかの実施形態において、ＳＥＣまたはＣＥは、ＭＳ中に有意にイオン化しないバッファーにおいて行われるか、または酢酸アンモニウムまたはギ酸アンモニウムなどのバッファーにおいて行われる。
いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）ＭＳ機器（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ ＥＭＲ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へのエレクトロスプレーイオン化によって行われる。いくつかの実施形態において、特定のＭＳパラメーターは、ＭＨＣＩペプチド交換された複合体に対するネイティブＭＳを可能にするように、最適化される。例えば、例示的なパラメーターは、実施例のセクションに続いて提供される表１に提供されており（右側の２つのカラムを参照されたい）、他のＳＥＣ－ＭＳタンパク質分離に使用したパラメーターと比較される（左側の２つのカラム）。いくつかの実施形態において、補助ガス流量は、０～４の値、例えば、０～３、例えば、０～２、または０の値に設定される。いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳは、補助ガス流量０で行われる。いくつかの実施形態において、インソースＣＩＤパラメーターもまた、ＳＥＣ－ＭＳを行う場合に、ゼロの値に設定される。いくつかの実施形態において、シースガス流量は、１５未満、例えば、１～５または２～４である。いくつかの実施形態において、トラッピングガス圧は、２～３に設定される。
いくつかの実施形態において、結合した複合体がＭＳ分析の間会合したままとなるため、本明細書におけるＣＥ－ネイティブＭＳまたはＳＥＣ－ネイティブＭＳ方法は、目的のペプチドが、実際にＭＨＣＩ分子の結合ポケット内に非共有結合的に結合していることの確認を可能にする。したがって、例えば、本明細書における方法は、ペプチド交換が起こったかどうかの評価だけでなく、異なる目的のペプチドについて、ペプチド交換のパーセンテージの判定および定量化も可能にする。いくつかの実施形態において、ネイティブＭＳ分析はまた、目的のペプチドの少なくとも部分的なシーケンシングも可能にする。対照的に、ネイティブＭＳを使用しない他のＬＣ－ＭＳ方法においては、ＭＨＣＩ複合体は、ＭＳ中に崩壊し、これは、会合したペプチドが実際にＭＨＣＩ結合ポケット内に非共有結合的に結合していることを確認するためにそれらを使用することができないことを意味する。
いくつかの実施形態において、本方法は、２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ分析方法よりも高速で行われ得る。それらはまた、比較的低体積でのＭＳ装置への注入も可能にする。本明細書におけるある特定のＳＥＣ－ネイティブＭＳ方法において、２～１０μＬ程度、例えば、３～６μＬまたは４～５μＬの体積が、注入され得る。本明細書におけるある特定のＥＣ－ネイティブＭＳ方法において、２～１００ｎＬ程度、例えば、２～５０ｎＬ、２～１０ｎＬ、３～１０ｎＬ、または３～５ｎＬの体積が、注入され得る。ＣＥまたはＣＺＥを使用するいくつかのそのような事例において、１００μｇ／ｍＬ程度、例えば、１００μｇ／ｍＬ以下、５０～５００μｇ／ｍＬ、５０～２００μｇ／ｍＬ、１００～２００μｇ／ｍＬ、または５０～１００μｇ／ｍＬのペプチド濃度が、検出され得る。
キャピラリー電気泳動方法は、いくつかの実施形態において、追加の利点を有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＺＥが使用される場合、電気泳動による分離は、１～１０分以内、例えば、１～５分または２～５分以内に行われ得る。いくつかの実施形態において、本明細書におけるＣＥ方法は、ＬＣ－ＭＳ方法よりも低い濃度で、ペプチド交換後の試料中の特定の目的のペプチドの検出を可能にし得る。いくつかの実施形態において、キャピラリーがチップまたはカートリッジに提供されるものなど、ＣＥ方法において、低減された試料体積が使用され得る。したがって、例えば、いくつかのＣＥプラットフォームを使用して、例えば、の体積、例えば、いくつかの実施形態において、ＳＥＣ－ＭＳ方法は、約１００μｇ／ｍＬよりも低い濃度のペプチドの検出は可能ではなかったが、一方で、ＣＺＥ方法は、約１００μｇ／ｍＬの濃度でペプチドを検出することができた。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩ複合体内に結合した目的のペプチドは、例えば、１００μｇ／ｍＬ以下、５０～５００μｇ／ｍＬ、５０～２００μｇ／ｍＬ、１００～２００μｇ／ｍＬ、または５０～１００μｇ／ｍＬの濃度で、本明細書におけるＣＥ－ＭＳ方法によって検出され得る。この潜在的に高い分解能は、特定のＭＨＣＩ－抗原ペプチド複合体を見分けるのに役立ち得る。例えば、ある特定のがんは、複数の可能性のある遺伝子における突然変異によって特徴づけられ得、分析のための多数のネオ抗原が生じる可能性がある（例えば、最大５０または最大１００個の可能性のあるネオ抗原）。これが、多数の可能性のあるヒトＭＨＣＩ複合体と組み合わさると、例えば、これにより、ペプチド交換の後に、それぞれが比較的低い濃度の数千個のネオ抗原－ＭＨＣＩの組合せが生じ得る。
キット
実施形態において、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチド、ＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、およびＭＨＣＩベータ鎖モノマーを含む、キット。いくつかの実施形態において、キットは、変性したＭＨＣＩアルファ鎖モノマーを含む。いくつかの実施形態において、キットは、変性したＭＨＣＩベータ鎖モノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩアルファ鎖およびＭＨＣＩベータ鎖の両方のモノマーが、変性している。
実施形態において、キットは、タグ化ＭＨＣＩアルファ鎖およびタグ化ＭＨＣＩベータ鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩアルファ鎖は、タグを含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩベータ鎖は、タグを含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩアルファ鎖およびＭＨＣＩベータ鎖の両方が、タグ化されている。いくつかの実施形態において、タグは、ストレプトアビジンである。
実施形態において、キットは、抗ＨＬＡ抗体を含む。実施形態において、キットは、抗Ｂ２Ｍ抗体を含む。実施形態において、キットは、抗ＨＬＡ抗体および抗Ｂ２Ｍ抗体を含む。
実施形態において、キットは、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドであって、配列番号１～配列番号３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号５の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号６の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１３の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１４の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１５の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１６の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号１９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２３の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２４の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２５の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２６の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２８の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号２９の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３３の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、配列番号３４の配列を含む。
本明細書における開示はまた、上述のＳＥＣ－ネイティブＭＳおよびＣＥ－ネイティブＭＳまたはＣＺＥ－ネイティブＭＳ方法を実行するためのキットまたは試薬組成物も包含する。いくつかの実施形態において、そのようなキットは、（ａ）ＳＥＣ、ＥＣ、もしくはＣＺＥ分離、（ｂ）ペプチド交換、および（ｃ）任意の他の該当する洗浄もしくはバッファー交換工程を行うためのバッファー、またはこれらの種類のバッファーのうちのいずれかの組合せを含み得る。いくつかの実施形態において、ＳＥＣ、ＥＣ、またはＣＺＥは、ＭＳ中に有意にイオン化しないバッファーにおいて行われる。いくつかの実施形態において、ＳＥＣ、ＥＣ、またはＣＺＥは、酢酸アンモニウムまたはギ酸アンモニウムバッファーにおいて行われる。いくつかの実施形態において、ＳＥＣ、ＥＣ、またはＣＺＥのためのバッファーは、トリスもＰＢＳも含まない。
本明細書におけるキットまたは試薬組成物はまた、ペプチド交換を行うための試薬、例えば、交換可能なペプチド、およびそのようなペプチドの結合親和性を修飾するために必要な任意の試薬、例えば、適切な化学物質または酵素も含み得る。本明細書におけるキットまたは試薬組成物はまた、本明細書における方法またはそのような方法の一部分を行うための説明書も含み得る。本明細書におけるキットまたは試薬組成物はまた、ペプチド交換が行われ得るＭＨＣＩ複合体のアレイまたはライブラリー、例えば、異なるヒトＭＨＣＩ複合体のアレイまたはライブラリーも含み得る。本明細書におけるキットまたは試薬組成物はまた、例えば、病原性疾患、腫瘍の種類などに基づく推定上のネオ抗原ペプチドのライブラリーも含み得る。
系
実施形態において、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドと、複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマーと、複数のＭＨＣＩベータ鎖モノマーと、ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成を可能にすることができる第１の試薬とを含む、系。いくつかの実施形態において、系は、ＭＨＣＩアルファ鎖モノマーに結合することができる第２の試薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の試薬は、抗ＨＬＡ抗体を含む。いくつかの実施形態において、系は、ＭＨＣＩベータ鎖モノマーに結合することができる第３の試薬を含む。いくつかの実施形態において、第３の試薬は、抗Ｂ２Ｍ抗体である。
実施例１：高スループットなＭＨＣＩリフォールディング
ＭＨＣＩアルファ鎖モノマーは、変性条件下において精製されるか、または標準的な変性試薬を使用して変性されるかのいずれかであり、試薬としては、６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、６Ｍグアニジンイソチオシアネート、または８Ｍ尿素が挙げられるが、これらに限定されない。
変性されたアルファ鎖、Ｂ２Ｍ、およびペプチドリガンドは、リフォールディングおよび可溶性ＭＨＣＩ／ペプチド複合体形成のために一緒に添加される。例示的なリフォールディングプロトコールは、次の通りである：Ｂ２Ｍ（１０ｍｇ／Ｌ）、ＨＬＡ（３０ｍｇ／Ｌ）、およびペプチド（１０μＭ）を、それぞれ０．５ｍＭおよび４ｍＭの酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンとともに、リフォールドバッファー（１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０、４００ｍＭ Ｌ－アルギニン、および２ｍＭ ＥＤＴＡ）に添加する。これらの試薬を、９６ウェルプレートにおいて１００μＬの最終体積まで添加し、４℃で１～１０日間インキュベートした後、複合体の形成について試験した。
実施例２：ＭＨＣＩリフォールディングのためのペプチドを特定するための高スループットなＥＬＩＳＡ
非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含む条件的ペプチドリガンドを、３８個の異なるＭＨＣＩ複合体について特定した。３８個の異なるＭＨＣＩ複合体は、固有のＨＬＡ対立遺伝子（アルファ鎖）、Ｂ２Ｍ、および非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含む固有のペプチドからなっていた。
適正なＭＨＣＩリフォールディングを可能にするペプチドを特定するための高スループットな酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）：エピトープ結合体を特定するための１つの方法は、所与の対立遺伝子のＭＨＣＩが、エピトープの存在下において、安定なリフォールディングされた複合体を形成することができるかどうかを評価することである。このプロセスは、希釈濃度の変性したＨＬＡおよびＢ２Ｍを、目的のエピトープと混合することを含む。２～５日間のリフォールディングの後、希釈したリフォールディングされたＭＨＣＩ試薬を濃縮、精製、および特徴づける必要があるが、これらはいずれも高スループットには適していない。ここで、本発明者らは、精製の不在下において、ｎＭ濃度で適正にリフォールディングされたＭＨＣＩを検出することができるＥＬＩＳＡアッセイを開発した。ＥＬＩＳＡアッセイは、ビオチン化検出抗体およびストレプトアビジンを用いたシグナル増幅を含む。例示的なＥＬＩＳＡアッセイは、図１に示されている。
３８４ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｎｕｎｃ番号４６４７１８）を、２５μＬ／ウェルで、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６中８μｇ／ｍＬの抗ＨＬＡマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＡＢＣ Ｗ６／３２、カタログ番号ＮＢ１００－６４７７５、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳバッファー）で３回洗浄した後、８０μＬ／ウェルのブロックバッファー（ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、１５ＰＰＭ Ｐｒｏｃｌｉｎ）を添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファーで３回洗浄し、目的のペプチドとともにＭＨＣＩモノマーを含む希釈試料２５μＬを、適切なウェルに添加した。プレートを、室温で２時間インキュベートし、プレートを洗浄バッファーで６回洗浄することによって、未結合の成分を除去した。次いで、アッセイバッファー（ＰＢＳ ０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１５ＰＰＭ Ｐｒｏｃｌｉｎ、ｐＨ７．４）中１００ｎｇ／ｍＬで、２５μＬ／ウェルのビオチン化抗ヒトβ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（カタログ番号３１６３０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加することによって、結合したＭＨＣＩモノマー－ペプチド複合体を検出し、室温で１時間インキュベートした。６回洗浄した後、アッセイバッファー中のホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたストレプトアビジン（ＨＲＰ－ＳＡ）を２５μＬ／ウェルで添加し、室温で３０分間インキュベートした。３回洗浄してＨＲＰ－ＳＡを除去した後、酵素反応を、ペルオキシダーゼ基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．カタログ番号１０００）で発色させ、室温で１５分間インキュベートした。２５μＬ／ウェルの１Ｍリン酸で反応を停止させ、吸収度を、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において参照６２０ｎＭを使用して４５０ｎｍで測定した。
ペプチドリガンドなしまたは無関係のペプチドを用いてリフォールディングされたＭＨＣＩヘテロダイマー複合体は、それぞれの対立遺伝子の陰性対照として使用した。試料シグナルは、以下の比に示されるように正規化した：ＯＤ４５０／６２０［試料］／ＯＤ４５０／６２０［陰性対照］。結果を、図２～５、および７に示す。
図２のパネルＡおよびＢは、３８個の異なるＨＬＡ、ＨＬＢ、およびＨＬＣ結合体にわたって平均した、捕捉されたＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド複合体（二次抗体レポーターを介して）の正規化された（ペプチドなしに対して、試料シグナル／陰性対照シグナル）ＥＬＩＳＡシグナルの棒グラフによる図である。図３のパネルＡおよびＢは、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ペプチド結合体にわたって平均したＥＬＩＳＡシグナルの棒グラフでの表示であり、低捕捉抗体結合体である特定のＭＨＣＩ対立遺伝子（パネルＡ）およびペプチドの存在なしで安定である特定のＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ複合体（パネルＢ）を示す。図４のパネルＡおよびＢは、ＵＶペプチド（ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチド）の存在下における、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ａ／ＵＶペプチド結合体にわたって平均したＥＬＩＳＡシグナルの棒グラフによる図である。図５は、１８個の異なるＨＬＡ／ＨＬＢ対立遺伝子のスケールアップしたリフォールディング精製から得られた正規化されたＥＬＩＳＡ結果および収率を比較する棒グラフである。図７は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて性能が最良であったペプチドに基づいて選択された、それぞれの対立遺伝子に結合するＵＶペプチドの一覧を提供する。
実施例３：ペプチド結合体を特定するための高スループットな時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ
ペプチド交換後にＭＨＣＩペプチド結合体を特定するための高スループットな時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ－ＦＲＥＴ）アッセイ：エピトープ結合体を特定するための別の方法は、所与のトリガーが提供されたときに、複合体から解離され得、ペプチド結合体のＭＨＣＩ溝への交換を可能にすることができる、条件的リガンドを有するＭＨＣＩ複合体を生成することである。これを達成する１つの手段は、ＵＶに曝露されると、ペプチドが切断され、もはや結合体ではなくなるような、ＵＶ切断性非天然アミノ酸を含むペプチドを使用することである。これらの条件下において、溶液中にペプチド結合体が存在する場合、それが複合体に結合し、それを安定させる。対照的に、ほとんどの事例において、溶液中にペプチド結合体が存在しない場合、ＨＬＡおよびＢ２Ｍタンパク質が解離し、ＭＨＣＩ複合体が崩壊することになる。
この系を使用してＭＨＣＩ結合体を判定するために、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ複合体が近接している場合にのみシグナルを提供するＴＲ－ＦＲＥＴアッセイを開発した。このアッセイは、ＴＲ－ＦＲＥＴドナー（抗Ｂ２Ｍドナー）を含むＢ２Ｍに対する抗体、およびＴＲ－ＦＲＥＴアクセプター（ストレプトアビジン－アロフィコシアニン（ＳＡ）－アクセプター）で標識化された、複合体のビオチン化ＨＬＡ成分に結合する、ストレプトアビジンを使用する。Ｂ２ＭおよびＨＬＡが一緒に複合体を形成した場合、抗Ｂ２ＭドナーおよびＳＡアクセプターが、溶液中で近接し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルをもたらすことになる。対照的に、複合体が崩壊した場合、これらの試薬は、均一に分散され、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルは存在しないであろう。ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイワークフローの概略図は、図８のパネルに提供されている。このアッセイを、ＵＶ切断性条件的リガンドを用いて生成したＭＨＣＩ分子のＵＶ光曝露後のペプチド交換に適用し、これを使用してＭＨＣＩペプチド結合体を特定することに成功した。
ＵＶ交換されたＭＨＣＩ／ペプチド複合体を含む３８４ウェルのソースプレート（Ｅｃｈｏ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ３８４－Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ２．０ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、Ｌａｂｃｙｔｅ ＰＰＬ－０２００）を、３７℃で一晩インキュベートした。プレートを、室温で１時間平衡処理し、続いて遠心分離した。ソースプレートのそれぞれのウェルから、自動化音響分注器（Ｅｃｈｏ ５５０、Ｌａｂｃｙｔｅ）を用いて様々な体積（１６０ｎＬ、８０ｎＬ、４０ｎＬ、および２０ｎＬ）を、デスティネーションプレート（ＭＡＫＯ １５３６ウェル、白色底、Ａｕｒｏｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、ＭＴ、ＵＳＡ）の戻し充填ウェル（アッセイバッファーを含む）に、２μＬ／ウェルの総体積、１０、５、２．５、および１．２５ｎＭの最終試料濃度で、４回分注した。アッセイバッファー中のドナー（１．２μｇ／ｍＬのユーロピウム（Ｅｕ）ＬＡＮＣＥ－Ｗ１０２４－ＩＴＣ標識化Ｂ２Ｍ）およびアクセプター（４．８μｇ／ｍＬのＳｕｒｅ Ｌｉｇｈｔアロフィコシアニンをコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の混合物２μＬを、デスティネーションプレートのそれぞれのウェルに分注した。デスティネーションプレートを、次いで、室温で１時間、遠心分離およびインキュベートし、ＨＴＲＦモジュール（Ｅｕ励起３３７ｎｍ、Ｅｕ放出６１５ｎｍ；ＡＰＣ放出６６０／２０ｎｍ）を装備したＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳＸプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを記録した。ＴＲ－ＦＲＥＴの未加工シグナルを、相対蛍光単位の比（ＲＦＵ比＝（ＲＦＵ［６６０ｎｍ］／ＲＦＵ［６１５ｎｍ×１０４］）として表した。検出枠は、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体の不在下におけるアッセイミックスからのバックグラウンドシグナルを差し引くことによって計算した。ある範囲のペプチド結合体の結果を、図９のパネルＡの棒グラフに提供する。ＭＨＣ対立遺伝子に対するＴＲ－ＦＲＥＴアッセイの相対正確度（８５％～１００％）の棒グラフを、図９のパネルＢに提供する。
ペプチドは、その予測結合親和性（Andreatta M, and Nielsen, M. Gapped sequence alignment using artificial neural networks: application to the MHC class I system. Bioinformatics (2016) Feb 15;32(4):511-517に基づく結合予測アルゴリズムを使用して計算、との比較に基づいて、真の結合体であることを判定した。ペプチド結合体および対応するＭＨＣＩ対立遺伝子を、ＴＲ－ＦＲＥＴおよび２Ｄ ＬＣ／ＭＳアッセイを使用して特定した。ペプチド配列を、予測アルゴリズムにかけて、それぞれの配列に、百分位順位を割り当てた。百分位順位が２またはそれよりも低ければ、それは結合体と考えられる。図１２は、ＴＲ－ＦＲＥＴおよびＬＣ－ＭＳから計算された真の結合体％と、アルゴリズムにより生成された百分位順位との比較を示す。破線の左側のペプチドのみが、アルゴリズムによって結合体であると予測される。
２つの代表的なＴＲ－ＦＲＥＴ実験を、図１０および図１１に示す。図１０は、ＭＨＣＩ ＨＬＡ＊０３：０１を含む複合体のペプチド結合体および非結合体を比較する、比較ＤＳＦスペクトルを示す。低温（２０℃）では、相対蛍光（ＲＦＵ）は、ペプチドが結合した複合体については低く、ペプチド結合がない複合体については高い。ペプチド結合体のＤＳＦスペクトルは、類似のＴｍ温度範囲を示し、一方で、非結合体は、低いＴｍを有する。パネルＢは、ペプチド結合体（黒色）および非結合体（灰色）の、Ｔｍ温度に対する総数の棒グラフである。パネルＣは、ペプチド結合体（黒色）および非結合体（灰色）の、ＲＦＵ値に対する総数の棒グラフである。図１０は、ＭＨＣＩ ＨＬＡ＊０８：０１を含む複合体のペプチド結合体および非結合体を比較する、比較ＤＳＦスペクトルを示す。低温（２０℃）では、相対蛍光（ＲＦＵ）は、ペプチドが結合した複合体については低く、ペプチド結合がない複合体については高い。ペプチド結合体のＤＳＦスペクトルは、類似のＴｍ温度範囲を示し、一方で、非結合体は、低いＴｍを有する。パネルＢは、ペプチド結合体（黒色）および非結合体（灰色）の、Ｔｍ温度に対する総数の棒グラフである。パネルＣは、ペプチド結合体（黒色）および非結合体（灰色）の、ＲＦＵ値に対する総数の棒グラフである。図１０および図１１のパネルＤは、４つの異なるＭＨＣＩ対立遺伝子に関するアッセイ正確度％の棒グラフによる表示である（図１０ではすべてが９０％を上回り、または図１１では６０～８５％）。
実施例４：ペプチド結合体を特定するためのＬＣ－ＭＳアッセイ
ＭＨＣＩペプチド結合体を特定するための２Ｄ ＬＣ－ＭＳアッセイ：このアッセイは、ＭＨＣＩ試薬のペプチド交換プロセス後のペプチド結合体を特定するために開発された。ペプチド交換プロセスの質量分析に基づく分析は、まず、分析前に溶液中のＭＨＣＩ複合体を遊離したペプチドから分離することに依存する。これは、複合体の事前精製を必要とし、高スループットな分析には適さないであろう。試料を、まず、ＳＥＣカラムに流し、次いで、ＭＨＣＩ複合体に対応するピークのみを、質量分析のために第２のＨＰＬＣカラムに注入する、２Ｄ ＬＣ－ＭＳ分析方法を開発した。これにより、単一工程におけるＭＨＣＩ試薬の完全な分析が可能となる。このプロセスを使用して、１度に単一のペプチドを特定することができるか、またはより大きなペプチドプール内で複数のペプチドを特定することができる。図１３は、ペプチド交換および特定アッセイの概略図を提供する。
簡単に述べると、２μｇ～３μｇの間のＭＨＣＩ／ペプチド混合物を、機器に注入し、第１次元のカラムに送った。第１次元のＬＣ方法は、分析用サイズ排除カラム（ＳＥＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Å、２．７μｍ、４．６×１５ｍｍ）を利用して、インタクトな複合体を、１０分間、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、０．７ｍＬ／分の一定流速で泳動する過剰なペプチドから分離し、シグナルを２８０ｎｍで取得した。試料採取バルブにより、１６０μＬの体積で１．９０分間～２．１３分間の間にわたって溶出した複合体ピークの全体を収集し、第２次元の逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓ １０００Å、８μｍ、５０×２．１ｍｍ）に注入した。第２次元のカラムに、０．５５ｍＬ／分で４．７分間で５～５０％の勾配の移動相Ｂを流し、カラムを８０℃に加熱した。移動相Ａは、水中０．０５％ ＴＦＡであった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０５％ ＴＦＡであった。カラム溶出液を、質量分析データ取得のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２２４ ＴＯＦ ＬＣ－ＭＳに送った。
第１次元におけるＭＨＣＩ／ペプチド複合体ピーク面積および第２次元におけるペプチドの質量スペクトル検出を使用して、ペプチド結合の成功を判定した。ペプチド交換反応中の条件的リガンドの切断後の複合体へのペプチド結合の成功は、複合体を安定させ、第１次元のＳＥＣ分析において測定された開始複合体のほぼ完全な回収をもたらす。複合体へと交換されたペプチドは、次いで、第２次元において検出することができ、そこでは、複合体を、質量スペクトル分析による目的のペプチドの直接的な検出を可能にする変性条件下に流す。ペプチド交換反応の失敗は、条件的リガンドの切断後にペプチドが複合体に結合しそれを安定させることに失敗し、複合体の不安定化をもたらす。これは、ＳＥＣにおいて複合体のＡ２８０ピーク面積の低減および第２次元におけるペプチドの不在として測定される（ＳＥＣクロマトグラムの例については、図６の左端のクロマトグラムセットを参照されたい）。いくつかの事例において、ピーク面積の低減は観察されないが、しかしながら、質量分析によってペプチドは検出されない。少数のペプチドは、第２次元のクロマトグラフィーカラムおよび方法では捕捉されない。これらの事例において、ペプチド結合の陽性対照および陰性対照も使用される場合には、ピーク面積回収が、交換の成功を判定するのに十分である。
ＨＬＣ＊０８：０１のペプチド交換過程のクロマトグラムの代表的なセットを、図６に示す。第１のクロマトグラムセットは、リフォールディング過程の後にサイズ排除カラムに複合体混合物を流した結果であり、ＭＨＣＩ／ペプチドを含むピークが、それぞれのクロマトグラムにおいて灰色で強調表示されている（１Ｄ：ＳＥＣ）。このピークの内容物を収集し、逆相カラムを装備した第２のＨＰＬＣに注入した。第２のクロマトグラムセットは、複合体ピークの内容物を示し、ピーク成分の同一性を、質量分析によって判定した。複合体に存在するペプチドの配列を判定し、この配列を、逆相クロマトグラムから特定されたペプチドピークの対応する抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の拡大挿入図に重ねて示す。図１４は、それぞれの対立遺伝子について交換体または非交換体としての１０個のペプチドの代表的な検証パネルを示し、ある範囲のペプチドの経時的な交換％のプロットとして示されており、ＭＨＣＩ／Ｂ２Ｍ／ＵＶ－ペプチド複合体は、２－Ｄ ＬＣ／ＭＳによって測定した。
ＭＨＣＩ／ＵＶ切断性ペプチド複合体は、図１５に示されるように、４０個のペプチドのプールの存在下において、ＵＶ光曝露／ペプチド交換アッセイを受け得る。交換過程から収集した試料を、１）ＳＥＣおよび２）ＬＣ－ＭＳによって、様々な時間の長さ（例えば、５時間と１０時間の間、４０分の増分）で実行し、ＳＥＣによって単離された複合体ピークに由来するペプチドの同一性および強度を、ＬＣ－ＭＳによって測定する。プロットは、経時的なＭＨＣＩ ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１の交換反応における経時的な１０個のペプチドの強度を示す。この例の実行については合計で、 ４０個のペプチドのプールから得られた２５％または１０個のペプチドが、真の結合体であると判定された。
実施例５：ＭＨＣ正規化の計算
すべてのデータ分析は、他の箇所に示されていない限り、Ｇｅｎｅｄａｔａ ａｎｄ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ Ｖ７．８を使用して実行した。
行ったすべてのＭＨＣスクリーニングについて、対照に基づく正規化を使用して、それぞれの対立遺伝子に基づいてペプチドなしのＭＨＣに対する試料シグナルの相対的な比較を確実に行い、デルタＦ（％）として表した。デルタＦのパーセンテージは、以下の式を使用して計算した。
デルタＦ％（ｄＦ）＝（ＲＦＵ未加工［ｐＭＨＣ］－ＲＦＵ未加工［陰性対照］）／ＲＦＵ未加工［陰性対照］×１００
ＲＦＵ未加工［陰性対照］は、ペプチドなしのＭＨＣモノマーのウェルに由来する６６０ｎｍ／６１５ｎｍのＴＲ－ＦＲＥＴシグナル比であり、これにより、特定の対立遺伝子についてのヒット選択の最小シグナルが定義され、ＲＦＵ未加工［ｐＭＨＣ］は、ペプチドがロードされたＭＨＣモノマーのウェルに由来する６６０／６１５のＴＲ－ＦＲＥＴシグナル比である。
対立遺伝子にわたるヒット選択については、ロバストＺスコア（ＲＺ）を、以下のように、正規化シグナル（ｄＦ）から計算した。
ＲＺスコア＝（［試料］－中央値［すべての試料］）／ＭＡＤ
［試料］および中央値［すべての試料］は、それぞれ、試料のデルタＦ値、およびそれぞれの３８４ウェルプレートにおけるすべての試料の中央値である。ＭＡＤは、それぞれの３８４ウェルプレートにおけるすべての試料の中央値絶対偏差である。
ＨＴＳアッセイ性能を評価するために、Ｚ’因子を、以下の式を使用して、陽性対照および陰性対照のシグナル（ＲＦＵ未加工）から計算した。
Ｚ’＝１－｛（３σＲＦＵ［陽性］＋３σＲＦＵ［陰性］）／｜μＲＦＵ［陽性］－μＲＦＵ［陰性］｜｝
式中、σ［陽性］およびσ［陰性］は、標準偏差であり、μ［陽性］およびμ［陰性］は、それぞれ、陽性対照および陰性対照の平均値である。ＲＺ’（ロバストＺ’）について。中央値絶対偏差（ＭＡＤ）および中央値は、標準偏差および平均の値の代用である。
実施例６．ネイティブＳＥＣ－ＭＳ
ＭＨＣＩタンパク質を、ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、３０℃に加熱したＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に注入した。バイナリポンプを使用して、溶媒Ａ（水）および溶媒Ｂ（１００ｍＭ、酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０）を５０％溶媒Ｂの一定勾配として、３００μＬ／分の流速で１０分間送達した。分離したタンパク質を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ ＥＭＲ Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へのエレクトロスプレーイオン化を通じて、以下の最適化されたデータ取得パラメーターを使用してオンラインで分析した：ＥＳＩソースにおけるシースガス流量４および補助ガス流量０；スプレー電圧４．０ｋＶ；キャピラリー温度３２０℃；Ｓ－ｌｅｎｓ ＲＦレベル２００；スキャン範囲３５０～１０，０００ｍ／ｚ；脱溶媒和、インソースＣＩＤ ０ ｅＶ、ＣＥ ０；ｍ／ｚ２００での分解能８，７５０；正極性；１０回のマイクロスキャン；３×１０６ ＡＧＣ標的；固定ＡＧＣモード；平均化０；最大ＩＴ５０ミリ秒；ソースＤＣオフセット２５Ｖ；注入フラタポールＤＣ８Ｖ；インターフラタポールレンズ７Ｖ；湾曲フラタポールＤＣ６Ｖ；トランスファーマルチポールＤＣ調整オフセット０Ｖ；Ｃトラップ進入レンズ調整オフセット０．８Ｖ；およびトラッピングガス圧設定３。（表１および２を参照されたい）
取得した質量スペクトルデータを、ＰＭＩ Ｉｎｔａｃｔ Ｍａｓｓ（商標）ソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用して、以下のパラメーター下で分析した：１，５００～６，０００ｍ／ｚ範囲；電荷ベクター間隔０．２；ベースライン半径１５ｍ／ｚ；スムージングシグマ０．０２ｍ／ｚ；スペーシング０．０４ｍ／ｚ；質量スムージングシグマ３；質量スペーシング０．５；反復最大値１０；および電荷状態範囲５～１００。相対的定量化は、デコンボリューションしたスペクトルにおける合計強度に対するそれぞれの個々のピークの強度に基づいていた。
実施例７：ネイティブＣＺＥ－ＭＳ
ＭＨＣＩタンパク質を、ネイティブＣＺＥ－ＭＳ分析の前に、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩プレート、９６ウェル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してバッファー交換した。脱塩プレートを、まず、室温に対して平衡化させ、次いで、１，０００×ｇで２分間遠心分離して、保管バッファーを除去した。樹脂を、１，０００×ｇで２分間遠心分離することによって、２５０μＬの５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０で４回洗浄した。洗浄プレートを、それぞれの回転の後に空にし、次いで、試料収集プレートと置き換えた。試料を、樹脂に添加し、１，０００×ｇで２分間遠心分離した。
バッファー交換したＭＨＣＩタンパク質を、ＺｉｐＣｈｉｐ（商標）システム（９０８ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、ＨＳチップ（９０８ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）に注入した。ＺｉｐＣｈｉｐ（商標）オートサンプラーを使用して、イソプロピルアルコール、ヒスチジン、酢酸アンモニウム、およびジメチルスルホキシドを含むタンパク質複合体バックグラウンド電解質（ＢＧＥ）溶液、ｐＨ６．５を送達した。最終的なＺｉｐＣｈｉｐ（商標）方法は、以下のパラメーターで最適化した：場の強度５００Ｖ／ｃｍ；注入体積３ｎＬ；圧力補助開始時間０．５分；複製遅延２分；および分析時間３分。分離したタンパク質を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ ＥＭＲ Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へのエレクトロスプレーイオン化を通じて、以下のデータ取得パラメーターを使用してオンラインで分析した：ＥＳＩソースにおけるシースガス流量２および補助ガス流量０；スプレー電圧０ ｋＶ；キャピラリー温度２５０℃；Ｓ－ｌｅｎｓ ＲＦレベル２００；スキャン範囲１，５００～６，０００ ｍ／ｚ；脱溶媒和、インソースＣＩＤ ７５ｅＶ、ＣＥ ０；ｍ／ｚ２００での分解能１７，５００；正極性；３回のマイクロスキャン；３×１０６ ＡＧＣ標的；固定ＡＧＣモード；平均化０；最大ＩＴ２０ミリ秒；ソースＤＣオフセット１５Ｖ；注入フラタポールＤＣ ９Ｖ；インターフラタポールレンズ８Ｖ；湾曲フラタポールＤＣ １０Ｖ；トランスファーマルチポールＤＣ調整オフセット０Ｖ；Ｃトラップ進入レンズ調整オフセット０ Ｖ；およびトラッピングガス圧設定２。（表１および２を参照されたい）。
取得した質量スペクトルデータを、ＰＭＩ Ｉｎｔａｃｔ Ｍａｓｓ（商標）ソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用して、以下のパラメーター下で分析した：１，５００～６，０００ｍ／ｚ範囲；電荷ベクター間隔０．２；ベースライン半径１５ｍ／ｚ；スムージングシグマ０．０２ｍ／ｚ；スペーシング０．０４ｍ／ｚ；質量スムージングシグマ３；質量スペーシング０．５；反復最大値１０；および電荷状態範囲５～１００。相対的定量化は、デコンボリューションしたスペクトルにおける合計強度に対するそれぞれの個々のピークの強度に基づいていた。
実施例８：ペプチド交換プロセス：プレＣＺＥ－ＭＳ
ＵＶ切断性非天然アミノ酸を含む高親和性合成ペプチドを用いてＨＬＡおよびＢ２Ｍサブユニットをリフォールディングすることによって、ＵＶ－ＭＨＣＩを産生させた。ＵＶに曝露すると、ペプチドが切断され、その親和性を失うようになり、それが過剰量の患者予測エピトープペプチドと交換され、ペプチド交換されたＭＨＣＩ（ｐＭＨＣＩ）を形成することが可能となる。ペプチド交換されたＭＨＣＩを、次いで、免疫応答モニタリングのためのＴ細胞染色のために、テトラマーにアセンブルした。それらの非共有結合的でインタクトな形態でのペプチド交換を検証するために、ネイティブな条件下におけるＳＥＣ－ＭＳを、１μｇ／μｌを上回る濃度を有するＵＶ－ＭＨＣＩ試料を用いてまず評価した。ＵＶ－ＭＨＣＩのＳＥＣ－ＭＳ分析は、これらの非共有結合的複合体の安定性を示すことに成功した。ＵＶ処置の前には、インタクトなＵＶ－ＭＨＣＩ複合体のみが観察されていた。ＵＶ処置後には、複合体は、崩壊し、観察された主な質量ピークは、ＨＬＡおよびＢ２Ｍサブユニットであった。しかしながら、ＵＶ－ＭＨＣＩの検出限界は、０．３μｇ未満であったため、目的のペプチドでの飽和後に５０ｎｇ／μｌであったペプチド交換されたＭＨＣＩは、ペプチド交換を検証するのに好適でないものとなった。ネイティブ質量分析によって分析する能力を維持しながら感度制限を回避するために、これらのペプチドは、代わりに、ＺｉｐＣｈｉｐ（商標）ＣＺＥシステムを使用してＣＺＥによって検出および分析した。
実施例９：条件的ＭＨＣＩリガンドの高スループットな特定および条件的ＭＨＣＩ複合体のスケールアップした産生
これは、ペプチド交換によるＭＨＣＩモノマーおよびテトラマーの高スループットな（ＨＴＰ）生成において使用するためのＨＬＡ対立遺伝子の範囲全体にわたって安定なＭＨＣ複合体を形成する非天然ＵＶ切断性アミノ酸（条件的ＭＨＣＩリガンド）を含むペプチドの特定および検証を可能にする、新規なワークフローである。安定なリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体を形成することによって、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）において特定された公知のペプチド結合体をスクリーニングし、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体を、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。初回ＥＬＩＳＡスクリーニングから得られたもっとも高い性能のペプチドを使用して、条件的ＭＨＣＩリガンドを設計した。条件的ＭＨＣＩリガンドを、次いで、同じＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価し、上位性能のものを、スケールアップ産生に選択した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子に対する条件的ＭＨＣＩリガンドを使用して大スケール産生（１５Ｌ）を可能にする新規なＭＨＣＩ精製およびビオチン化プロトコールを開発し、これにより、１回のリフォールディング産生実行で６０ｍｇを上回るＭＨＣＩが得られた。さらに、ＬＣ／ＭＳ、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ、および２Ｄ ＬＣ／ＭＳを含む、次世代分析技法を使用して、リフォールディングされた複合体を特徴づけた。最適化されたリフォールディング産生プロトコールおよび次世代分析技法を適用して、ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて特定された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いてＭＨＣＩ複合体を生成し、適正にリフォールディングされており、高い純度および品質であることが見出された。最後に、新しい条件的ＭＨＣＩリガンドを用いて生成したＭＨＣＩ複合体について、ＵＶ曝露後のペプチド交換の程度を、２Ｄ ＬＣ／ＭＳを使用して、検証されたペプチド結合体を用いて評価した。すべての条件的ＭＨＣＩリガンドについて、ペプチド結合体の存在下においてＵＶ曝露時のペプチド交換の成功が観察された。これらの結果を合わせると、この研究において記載されるワークフローを使用して、新しいＨＬＡ対立遺伝子について、条件的ＭＨＣＩリガンドを特定することができることが示される。このアプローチは、広く適用され、広範なＨＬＡ対立遺伝子にわたってＭＨＣＩモノマーおよびテトラマーのＨＴＰ生成を可能にする可能性を有し、これは、臨床においてＭＨＣＩテトラマーを使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞をモニタリングすることを可能にするために、極めて重要であり得る。
過去１０年間にわたり、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）によるがんネオ抗原の提示は、免疫系が腫瘍成長を制御することができる重要な作用様式として生じてきた。ネオ抗原特異的Ｔ細胞が腫瘍殺滅において果たす役割に起因して、学術およびバイオテクノロジー全体で相当な資力が、がん免疫サイクルを増幅させ、ネオ抗原特異的Ｔ細胞応答の規模および幅を向上させる臨床的に活性な薬物、例えば、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、ＴＮＦスーパーファミリーアゴニスト、がんワクチン、および免疫モジュレーターの開発に投入されている。これらの薬物開発の取り組みにもかかわらず、ネオ抗原特異的Ｔ細胞応答（Ｔ細胞表現型、Ｔ細胞の規模および幅、エピトープ拡大など）に対する処置の影響をモニタリングするために利用可能なツールはごく限られている。
Ｔ細胞応答を追跡するためのもっとも一般的な方法は、ＥＬＩＳＰＯＴおよびＭＨＣテトラマー染色である。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＰＢＭＣを抗原で刺激したときのＴ細胞からのサイトカイン放出を測定する機能的アッセイである。このアッセイの利点は、それが、対立遺伝子およびネオエピトープに依存しない（すなわち、ネオ抗原のみが判明している必要がある）こと、ならびにそれが機能的リードアウトであることである。このアッセイの欠点は、それが、半定量的であること、およびＴ細胞表現型を評価する手段がないことであり、これは、防御免疫応答を生成するための重要な因子を理解するために極めて重要であり得る。ＭＨＣＩテトラマーに基づく検出は、ネオ抗原特異的Ｔ細胞染色試薬としてストレプトアビジンコンジュゲーションを介して多量体化してテトラマーとなる組換えＭＨＣＩモノマーを利用する。この方法は、複数の特異性ならびに表現型マーカーの染色を可能にする。ＭＨＣＩテトラマーはまた、ネオ抗原特異的Ｔ細胞の正確な数およびこれが処置過程の間にどのように変化し得るかに関する定量的分析も可能にする。したがって、多くの点において、ＭＨＣＩテトラマーに基づく検出は、ネオ抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に対する処置の作用に関してより詳細な理解を提供し得る。
ＭＨＣＩテトラマー検出の利点にもかかわらず、このアプローチは、試薬を生成することに関する問題に起因して、臨床プログラムにわたりバイオマーカー戦略として広く採用されてはいない。ＭＨＣＩテトラマーは、試薬生成のための複数回のクロマトグラフィー工程を含む、長時間かつ難しい数日間のリフォールディングプロセスを必要とする。加えて、ネオ抗原プロファイルは、それぞれの患者に固有であり、所与の患者においてＴ細胞の状況の全体像を得るためには、多くの患者特異的ＭＨＣＩテトラマーが、必要とされるであろう。さらに、ＨＬＡ対立遺伝子は、高度に多型であり（ほぼ２０，０００個のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子が存在する）、それぞれのヒトが、６つの異なるＨＬＡ対立遺伝子を有する。したがって、ＭＨＣＩテトラマーに基づくネオ抗原特異的Ｔ細胞応答の検出には、個別化されたＭＨＣＩテトラマープラットフォームが必要となるであろうが、これは、従来的なＭＨＣＩ生成プロトコールの使用では不可能である。
これらの制限に対処するために、Ｒｏｄｅｎｋｏらは、ＭＨＣＩモノマーおよびテトラマーの生成のための高速で高スループット（ＨＴＰ）な方法を開発した。この方法は、インタクトなときには高い親和性で結合し、切断されると低い親和性で結合するＵＶ切断性ペプチド（条件的ＭＨＣＩリガンド）を用いてＭＨＣＩ複合体を生成することを含む。この機能性により、条件的ＭＨＣＩリガンドを用いてアセンブルしたＭＨＣＩ複合体（条件的ＭＨＣＩ複合体）を、目的の高親和性ペプチド結合体の存在下でインキュベートした場合に、ＵＶ曝露によるペプチド交換が可能となる。所与のＨＬＡ対立遺伝子の条件的ＭＨＣＩ複合体は、大スケールでリフォールディングすることができ、エンドユーザは、次いで、条件的ＭＨＣＩリガンドを、目的の任意の他のペプチドと交換することができる。本発明は、臨床において個別化されたＭＨＣＩテトラマーを使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞をモニタリングすることを可能にするという点で、打開策を提供した。しかしながら、条件的ＭＨＣＩリガンドは、それぞれのＨＬＡ対立遺伝子に特異的であり、デノボで特定しなければならない。本発明者らが知る限り、条件的ＭＨＣＩリガンドは、２４個のＨＬＡ対立遺伝子に関してのみ公開されている。これらの対立遺伝子は、もっとも存在度の高いもののうちの一部であるが、多様な患者の広範なコホートにわたるネオ抗原のカバレッジは、依然として最小限である。したがって、対立遺伝子カバレッジの拡大を可能にするワークフローを開発する必要がある。
さらに、リフォールディングまたはペプチド交換後のＭＨＣＩ複合体の分析的検証は、ＥＬＩＳＡアッセイおよびゲル電気泳動を含む、限られた数の分析技法を使用している。これらの技法は、ＭＨＣＩ複合体が存在しているかどうかを判定するため、ならびに親和性および安定性の半定量的分析には有用であることが証明されているが、ＨＬＡ：Ｂ２Ｍ比、凝集、酸化状態、およびネイティブ条件の分析など、いくつかの他の重要なパラメーターは、この種類の分析を使用して捕捉されない。液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、２Ｄ ＬＣ／ＭＳ、およびサイズ排除クロマトグラフィー－多角度光散乱検出（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を含め、これらのパラメーターを評価するための複数のタンパク質分析ツールが存在しているが、これらのツールをリフォールディングまたはペプチド交換後のＭＨＣＩ複合体の特徴づけに適用するために行われていることは、ほとんどない。
安定な条件的ＭＨＣＩ複合体を形成する条件的ＭＨＣＩリガンドおよびＨＬＡ対立遺伝子の新しい組合せの特定および検証を可能にする、実験的ワークフローを開発した。安定な条件的ＭＨＣＩ複合体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイを開発し、検証した。免疫エピトープデータベースおよび分析（ＩＥＤＢ）において報告されている５つの公開されているペプチド結合体を、まず６つのＨＬＡ対立遺伝子（Ａ＊０２：０３、Ａ＊２６：０１、Ｂ＊１８：０１、Ｂ＊３５：０３、Ｃ＊０２：０２、Ｃ＊１４：０２）にわたってスクリーニングし、設計された条件的ＭＨＣＩリガンドは、上位結合体に基づいていた。条件的ＭＨＣＩリガンドを、次いで、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてスクリーニングし、上位性能のものを、スケールアップ産生に選択した。ＭＨＣＩ産生のために、新規なＭＨＣＩ精製およびビオチン化プロトコールを開発し、次世代分析技法を使用して、生成された複合体の品質を確認した。最適化されたプロトコールおよび分析技法を適用して、新しく特定された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いて生成された条件的ＭＨＣＩ複合体を産生させ、特徴づけた。ＵＶ曝露後のペプチド交換の程度を、２Ｄ ＬＣ／ＭＳを使用して検証したペプチド結合体を用いて評価した。したがって、ＨＬＡ対立遺伝子カバレッジを大幅に拡大するために広く適用することができる、新しいＨＬＡ対立遺伝子の条件的ＵＶペプチドを特定するための検証されたワークフローを開発したが、これは、臨床においてＭＨＣＩテトラマーを使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞をモニタリングすることを可能にするために、極めて重要であり得る。
タンパク質の発現および精製。組換えＨＬＡおよびＢ２Ｍを、大腸菌（E. coli）において過剰発現させ、封入体から精製し、変性バッファー（６ＭグアニジンＨＣｌ、２５ｍＭトリス、ｐＨ８）において－８０℃で保管した。発現の誘導後、Ｂ２ＭおよびＨＬＡバイオマスペレットを、５ｍＬ／ｇで溶解バッファー（ＰＢＳ＋１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４）中に再懸濁させ、１０００バールでマイクロ流体形成装置において２回ホモジナイズした。ホモジナイズした懸濁液を、次いで、３００００ｇで２０分間、超遠心装置において回転処理した。ペレットを収集し、ＰＢＳ中の０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、５００ｍＬで洗浄し、３００００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを再度収集し、上述のように２回目の洗浄を行った。精製した封入体を、変性バッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、６ＭグアニジンＨＣｌ）中に、１０ｍＬ／ｇの濃度で溶解させ、４℃で一晩撹拌した。溶解したペレットを、４００００ｇで６０分間遠心分離し、上清を収集し、０．２２μのフィルターを通して濾過した。濃度を、ＢＣＡアッセイを使用して判定した。試料を、次いで、瞬間凍結させ、－８０℃で保管した後に、ＭＨＣＩ複合体の生成を行った。
スクリーニングのためのペプチドの選択。初回結合スクリーニングのためのペプチドを、免疫エピトープデータベースおよび分析リソース（ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）から選択した。データベースにおいて特定されたペプチド結合体を、実験的に測定した親和性に基づいて分類し、測定した親和性がもっとも高かった５つのペプチドを選択した。上位５つのペプチド配列が類似していた（４個未満のアミノ酸が異なる）場合、固有の配列を有する次点で高い親和性のペプチドを選択して、スクリーニングにおいて最大のペプチド多様性を確保した。
ＭＨＣＩリフォールディング（小スケール）。組換えＨＬＡ対立遺伝子およびＢ２Ｍを、大腸菌（E. coli）において過剰発現させ、封入体から精製し、上述のように、変性条件下（６ＭグアニジンＨＣＬ、２５ｍＭトリス、ｐＨ８）において－８０℃で保管した。２００μＬの反応において、ペプチド（０．０１ｍＭ、１ウェル当たり）、酸化および還元グルタチオン（それぞれ、０．５ｍＭおよび４．０ｍＭ）、組換えＨＬＡ対立遺伝子（０．０３ｍｇ／ｍＬ）、ならびにＢ２Ｍ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を、すべて、９６ウェルプレート内で合わせた。リフォールディングスクリーニングを、上述（表３）のように、それぞれの目的のＨＬＡについて、５つの異なるペプチドを用いて行い、リフォールディングを可能にするために、ＭＨＣＩ複合体を、４℃で３～５日間インキュベートした。リフォールディングされた試料を、ＥＬＩＳＡによって分析し、もっとも高い性能のペプチドを、さらなる分析に選択した。すべてのデータは、陰性対照のリフォールディングと比べて分析し、これは、ペプチド（標識化ＮＰ）の不在下において行われた。ＣＭＶ ｐｐ６５ウイルスエピトープを用いてリフォールディングされたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を、陽性対照として使用した。
それぞれのＨＬＡ対立遺伝子についてもっとも安定なペプチド結合体を特定した後、ペプチド配列に沿った異なる位置にＵＶ切断性アミノ酸（「Ｊ」と表記する）を有するペプチドを、再設計した（表４）。簡単に述べると、初回スクリーニングにおいて特定されたもっとも安定なペプチド結合体の、Ｊアミノ酸がＮ末端に対して２位、４位、６位、および８位で置換された変異体を、再設計した。再設計したペプチドを用いたリフォールディング時の安定な条件的ＭＨＣＩ複合体の形成を、上述のようにＥＬＩＳＡによって特定した。ＥＬＩＳＡアッセイのリードアウトに基づいてもっとも安定な複合体をもたらした条件的ＭＨＣＩリガンドを、スケールアップしたＭＨＣＩ産生に使用した。もともとのペプチド（ＵＶアミノ酸置換を含まない）を、陽性対照として使用した。ここで使用したすべてのペプチドは、ＪＰＴ（ｗｗｗ．ｊｐｔ．ｃｏｍ）またはＥＬＩＭ Ｂｉｏｐｈａｒｍ（ｗｗｗ．ｅｌｉｍｂｉｏ．ｃｏｍ）から購入した。
ＥＬＩＳＡアッセイ。３８４ウェルのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、２５μＬ／ウェルで、コーティングバッファー（０．０５炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中８μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ２ａ抗ＨＬＡ ＡＢＣクローンＷ６／３２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏ．）でコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。プレートを、次いで、５０μＬ／ウェルのブロックバッファー（ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、１０ｐｐｍ Ｐｒｏｃｌｉｎ）でブロッキングし、室温（ＲＴ）で１時間、撹拌しながらインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した後、ペプチドありおよびなしでアッセイ希釈剤（ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０＋１０ｐｐｍ Ｐｒｏｃｌｉｎ）中４０μｇ／ｍＬの未精製のリフォールディングされたＭＨＣ複合体を、２５μＬ／ウェルでプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを６回洗浄し、アッセイ希釈剤中１００ｎｇ／ｍＬのビオチン化マウスＩｇＧ１抗ヒトＢ２Ｍ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）２５μＬを、それぞれのウェルに添加した。室温で１時間インキュベートし、６回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＧＥ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。呈色反応を、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）を用いて室温で１５分間発色させ、反応を、１Ｍリン酸で停止させた。吸収度を、参照６２０ｎｍで、４０５ｎｍの波長で測定した。ペプチドなしまたは無関係のペプチドを用いてリフォールディングされたＭＨＣモノマーを、それぞれの対立遺伝子の陰性対照として使用して、シグナルを正規化した。
ＭＨＣＩリフォールディング、ビオチン化、および精製（大スケール）。１、５、または１５Ｌの反応において、選択したペプチド（０．０１ｍＭ）、酸化および還元グルタチオン（それぞれ、０．５ｍＭおよび４．０ｍＭ）、組換えＨＬＡ（０．０３ｍｇ／ｍＬ）、ならびにＢ２Ｍ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を、リフォールディングバッファー（１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０、４００ｍＭ Ｌ－アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で合わせた。リフォールディング混合物を、次いで、４℃で３～５日間撹拌し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５中へのタンジェント流濾過（ＴＦＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐ２Ｃ０１０Ｃ０１）によって濃縮およびバッファー交換した。タンパク質成分を、ＬＣ／ＭＳによって分析して、ＨＬＡが適切な還元状態にあることを確実にした。濃縮およびリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体を、次いで、ＢｉｒＡ（１：５０（重量：重量）の酵素：ＭＨＣＩ）、１００ｍＭ ＡＴＰ、および１０×反応バッファー（１００ｍＭ ＭｇＯＡｃ、０．５ｍＭビオチン）の添加を通じてビオチン化した。ビオチン化反応を、室温で２時間混合した。試料を透析し、ＬＣ／ＭＳによって分析して、ビオチン化を定量化した。ビオチン化されたＭＨＣＩ複合体を、反応サイズに応じて１または５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラムを使用して、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ＦＰＬＣで陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムを、５ｍＬ／分の流速で、１０カラム容積（ＣＶ）の２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡処理した。ＭＨＣＩ複合体を、５ｍＬ／分の流速でカラムにロードし、３０ＣＶにわたって０～６０％の２．５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌの勾配を使用して溶出させた。溶出ピーク全体の画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに流し、Ｂ２ＭおよびＨＬＡの両方のバンドを含む画分をプールした。プールした画分を、保管バッファー（２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中にバッファー交換した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ吸収度によって判定し、試料を、瞬間凍結させて－８０℃で保管した。
ＬＣ／ＭＳ分析。２μｇと５μｇの間のＭＨＣＩ複合体を、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＲＰ－ｍＡｂジフェニルカラム、２．１×７５ｍｍ、３．５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に注入した。カラムを、８０℃に加熱し、０．８ｍＬ／分で２．０分間に２５～４０％の移動相Ｂの勾配に曝露した。移動相Ａは、水中０．０５％ ＴＦＡであった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０５％ ＴＦＡであった。カラム溶出液を、質量分析データ取得のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳに送った。
ＭＨＣＩ濃度およびＨＬＡに対するＢ２Ｍのモル比を定量化するために、上述の方法を使用して、公知の量のそれぞれのタンパク質を注入することによって、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ対立遺伝子の標準曲線を生成した。Ａ２８０におけるピーク面積を使用して、ＭＨＣＩ複合体における個々のタンパク質サブユニットの定量化を可能にする標準曲線を生成した。ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ＨＬＡおよびＢ２Ｍ質量をデコンボリューションした。
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析。ＭＨＣＩ複合体の分子量を、前述のように判定した。簡単に述べると、試料を、一定勾配のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（追加の１５０ｍＭ ＮａＣｌを有する）とともに、多角度光散乱システム（ＭＡＬＳ）（Ｗｙａｔｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に連結したＴＳＫｇｅｌ ＳＷ３０００分析用ＳＥＣカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に注入して、モル質量を測定した。
２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析：２次元液体クロマトグラフィー質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）方法を使用して、ＭＨＣＩ複合体に結合するペプチドを特徴づけた。２μｇと３μｇの間のＭＨＣＩ複合体を、機器に注入し、第１次元のカラムに送った。第１次元のＬＣ方法は、分析用サイズ排除カラム（ＳＥＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Å、２．７μｍ、４．６×１５ｍｍ）を利用して、インタクトな複合体を、１０分間、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、０．７ｍＬ／分の一定流速で泳動する過剰なペプチドから分離し、シグナルを２８０ｎｍで取得した。試料採取バルブにより、１６０μＬの体積で１．９０分間と２．１３分間の間にわたって溶出した複合体ピークの全体を収集し、第２次元の逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓ １０００Å、８μｍ、５０×２．１ｍｍ）に注入した。第２次元のカラムを、０．５５ｍＬ／分の流速で４．７分間で５～５０％の移動相Ｂの勾配に曝露し、カラムを８０℃に加熱した。移動相Ａは、０．０５％ ＴＦＡであった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０５％ ＴＦＡであった。カラム溶出液を、質量分析データ取得のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２２４ ＥＳＩ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳに送った。
ＥＬＩＳＡに基づくＭＨＣＩリフォールディングの分析。この計画の主要な目的の１つは、安定な条件的ＭＨＣＩ複合体を形成することができる非天然ＵＶ切断性アミノ酸（条件的ＭＨＣＩリガンド）を含むペプチドの特定のためのロバストなＨＴＰワークフローを開発することであった。このプロセスの第１の工程は、リフォールディングスクリーニング後に安定なＭＨＣＩ複合体の形成を測定することができるＥＬＩＳＡアッセイを開発することであった。ＨＬＡ成分は、この段階ではビオチン化されていないため、本発明者らは、広く公開されているストレプトアビジンに基づくＥＬＩＳＡを使用することができなかった。本発明者らは、代わりに、以下の２つの形式を評価した：１）抗Ｂ２Ｍを用いた捕捉および抗ＨＬＡ（クローンＷ６／３２）を用いた検出、ならびに２）抗ＨＬＡ（クローンＷ６／３２）を用いた捕捉および抗Ｂ２Ｍを用いた検出。いずれの事例においても、検出抗体を、ビオチンで標識し、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよび基質の添加後に、シグナル生成を誘導した。ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を、これらの初回スクリーニングに使用した。シグナルおよび検出範囲は、両方の形式について同程度であったが、正規化された値は、０．２５μｇ／ｍＬを上回る濃度において、形式２）（図４１Ａの黒色のバー）では、形式１）（図４１Ａの白色のバー）よりもはるかに高かった。これらの高い濃度では、ペプチドと、ペプチドなし対照との間でＥＬＩＳＡシグナルに差はなかったか、または最小限であった。これらのアッセイにおいて使用した抗ＨＬＡは、ＭＨＣＩ上の立体構造エピトープを認識し、適切にフォールディングされたＭＨＣＩに選択的であるはずである。対照的に、抗Ｂ２Ｍ捕捉は、適切にフォールディングされたＭＨＣＩに依存せず、適切にフォールディングされたＨＬＡならびに部分的に変性したＨＬＡを有する複合体を捕捉するであろう。したがって、高い濃度におけるＥＬＩＳＡ形式１）のシグナル対ノイズの減少は、部分的にフォールディングされたＭＨＣＩの捕捉に起因する可能性が高い。図４１Ｂは、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドを用いて、ＢＭＲＦ１ペプチドを用いて、またはペプチドなしでリフォールディングされたＭＨＣＩ分子を使用した、ＥＬＩＳＡ形式２）の最適化されたアッセイ条件下におけるＭＨＣＩ濃度の関数として、ＥＬＩＳＡ結果を示す。濃度の増加に伴い、本発明者らは、ＣＭＶ ｐｐ６５およびＢＭＲＦ１抗原の両方について、ＯＤ４５０／６２０ ＥＬＩＳＡシグナルの増加を観察したが、ペプチドなし対照についてはシグナルの増加はほとんどまたはまったく観察されず、これは、適正にリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体の検出と一致する。図４１Ｃは、ＣＭＶ ｐｐ６５およびＢＭＲＦ１の両方について、１μｇ／ｍＬのＭＨＣＩ濃度において、ペプチドなし対照に対して正規化したＥＬＩＳＡシグナルを示す。いずれの抗原も、バックグラウンドよりも１０倍高いシグナルを有し、このアッセイ形式が、高度に選択的なシグナル対ノイズをもたらし、リフォールディング工程中に安定なＭＨＣＩ複合体を形成することができる抗原を特定するために容易に使用することができることを示した。
ＨＬＡ対立遺伝子にわたるペプチド結合体および条件的ＭＨＣＩリガンドの特定。ペプチドを、ＩＥＤＢから選択した（表３）。対応するＨＬＡ対立遺伝子と安定なＭＨＣＩ複合体を形成するこれらのペプチドの能力を、上述のＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析した。５つのペプチドおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０３を用いて生成したリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体の滴定曲線を、図４２Ａに示す。アッセイは、０．１～３．０μｇ／ｍＬの範囲のＭＨＣＩ濃度で行い、図４１Ｂにおいて陽性対照に観察されたように、漸増ＭＨＣＩ濃度ではＥＬＩＳＡ ＯＤが増加し、シグナルは、１μｇ／ｍＬで飽和し始めた。さらに、本発明者らは、滴定範囲全体にわたって陰性対照のシグナルの増加が最小限しかなかったことを観察した。シグナルは、１．０μｇ／ｍＬで飽和すると見られたことから、本発明者らは、Ａ＊０２：０３、Ｂ＊３５：０１、およびＣ＊０２０２対立遺伝子の正規化されたＥＬＩＳＡ値を示すためにこの濃度を選択した（図４２Ｂ～４２Ｄ）。Ａ＊０２：０３に対してスクリーニングした５つのペプチドのシグナル対バックグラウンドは、比較的高く、値は２０と４０の間の範囲に及んだ。このことは、ＩＥＤＢから選択したすべてのペプチドが、結合体であっただけでなく、リフォールディング時に安定なＭＨＣＩ複合体を形成することも可能であったことを示唆する。Ａ０２０３－０２ペプチドが、もっとも高い正規化ＯＤ値をもたらし、これを、ＵＶペプチドの設計に選択した。Ｂ＊３５：０３について、選択したペプチドから得られた正規化ＯＤもまた、６．７５～７．２５の範囲に及ぶ比較的高いシグナル対バックグラウンドを有した（図４２Ｃ）。Ｂ３５０３－０４が、もっとも高いＯＤ値をもたらし、これを、続いて、候補条件的ＭＨＣＩリガンドを設計するために選択した。Ｃ＊０２：０２ペプチドについて、正規化ＯＤは、すべてが１８と２０の間であったが、はるかに低かった（約８）Ｃ０２０２－０２は除く（図４２Ｄ）。Ｃ０２０２－０３が、もっとも高い正規化ＯＤ値をもたらし、これを、候補条件的ＭＨＣＩリガンドの設計に選択した。Ａ＊２６：０１、Ｂ＊１８：０１、およびＣ＊１４：０２もまた試験し、同様の結果が観察された（図５４Ａ～５４Ｆ）。試験したすべての対立遺伝子についてシグナル対ノイズは比較的高く、アッセイが安定な複合体を形成するペプチドを特定していたという信頼性を提供したが、対立遺伝子にわたって正規化されたシグナルの規模には有意差があった。本発明者らは、これらの結果が、異なるＨＬＡ対立遺伝子に対する汎ＨＬＡ抗体の親和性における変動性に起因する可能性が高いと考える。対照的に、所与の対立遺伝子（例えば、Ａ＊０２：０３およびＣ＊０２：０２）内の変動性は、スクリーニングした異なるペプチドにわたるペプチド親和性の差に起因する可能性が高かった。
次いで、これらの選択したペプチドを使用して、非天然ＵＶ切断性アミノ酸（条件的ＭＨＣＩリガンド）を含むペプチドを設計した。異なるＨＬＡ対立遺伝子にわたって安定な複合体を形成するＵＶペプチドを特定するために、初回スクリーニングにおいて上位性能であったペプチド（すなわち、Ａ０２０３－０２、Ｂ３５０３－０４、およびＣ０２０２－０３）（図４２Ｂ～４２Ｄ）の、Ｎ末端から２位、４位、６位、および８位にＵＶ切断性アミノ酸（Ｊと表記する）の置換を有する変異体を、設計した。Ａ０２０３－０２ペプチドに由来するスクリーニングした４つの条件的ＭＨＣＩリガンドの滴定曲線を、図４２Ｅに示す。非ＵＶ切断性ペプチドについて観察されたように、ＭＨＣＩ濃度の増加に伴うＥＬＩＳＡ ＯＤの増加が観察され、値は、１μｇ／ｍＬで飽和し始めた（図４２Ｅ）。異なる対立遺伝子にわたるすべての条件的ＭＨＣＩリガンドの正規化されたＥＬＩＳＡシグナルを、図４２Ｆ～４２Ｈに示す。興味深いことに、２位にＪアミノ酸置換を有するすべての条件的ＭＨＣＩリガンド変異体は、非常に低い正規化ＥＬＩＳＡ値を示し（図４２Ｆ～４２Ｈ）、親ペプチド（灰色のバー、図４２Ｆ～４２Ｈ）と比べて、ＭＨＣ複合体の形成が最小限またはまったくないことを示す（Ａ０２０３－０２－０１、Ｂ３５０３－０５－０１、Ｃ０２０２－０３－０１、およびＣ０２０２－０３－０４）。この発見は、この位置が、ＭＨＣＩ－ペプチドアンカー位置として知られているため、予想されていた。Ａ０２０３－０２およびＢ３５０３－０４についてスクリーニングしたすべての他の条件的ＭＨＣＩリガンドは、親ペプチドと同様の正規化ＯＤリードアウトをもたらした（図４２Ｆ～４２Ｇ）。対照的に、Ｃ０２０２－０２についてはすべての条件的ＭＨＣＩリガンドが、親と比較して低いＯＤ値を有したが、しかしながら、Ｃ０２０２－０２－０２およびＣ０２０２－０２－０３の正規化ＯＤは、それぞれ、６および８で依然として比較的高く（図４２Ｈ）、ＵＶ切断性アミノ酸が、ＭＨＣＩ安定性に対してわずかに負の影響を有したことを示す。もっとも高い正規化ＥＬＩＳＡ ＯＤ値をもたらした条件的ＭＨＣＩリガンド（Ａ０３０２－０２－０２、Ｂ３５０３－０５－０２、およびＣ０２０２－０３－０３）を、次いで、スケールアップした産生に選択した。同様の分析を行って、Ａ＊２６：０１、Ｂ＊１８：０１、およびＣ＊１４：０２対立遺伝子について、最適な条件的ＭＨＣＩリガンドを特定した（図５４Ａ～５４Ｆ）。
ＭＨＣＩモノマーのスケールアップリフォールディングおよび精製。目的のペプチドの存在下における、大腸菌（E. coli）封入体から精製した変性したＢ２ＭおよびＨＬＡのリフォールディングを通じた、組換えＭＨＣＩ複合体の生成は、２０年以上前に最初に開発された。この最初の報告以来、リフォールディングプロトコールを使用したＭＨＣＩ複合体の生成および精製のための多数の研究が存在しており、多数の方法が開発されている。これらの方法の大半は、以下のプロセスの何らかのバリエーションを含む：１）酸化還元剤／酸化剤を含む一般的なリフォールディングバッファーにおいてＨＬＡおよびＢ２Ｍをペプチドと混合し（インキュベーション時間は１～５日間で変動し得る）、２）リフォールディングされた材料を濾過して凝集体を除去し、３）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に適合する体積まで濃縮し（カラムに応じて１～２ｍＬ）、４）ＳＥＣを使用して精製し、５）精製したリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体をビオチン化し、６）ビオチン化反応からＭＨＣＩ複合体を精製する（ＳＥＣ、スピンカラムフィルターなど）。これらの産生方法の大半は、１Ｌまたはそれよりも小さなスケールでのみ実践的であり、数ミリグラムのリフォールディング材料しか得られず、したがって、臨床プログラムを支持するのに使用するための十分な材料を産生するためには、複数回の産生実行が必要とされるであろう。複数回の実行は、ロットごとの変動性をもたらし得る可能性があり、これは、下流のテトラマー染色データの解釈を混同させ得る。これらの制限に対処するために、本発明者らは、ＭＨＣＩリフォールディングおよび精製を１５リットルまでスケールアップすることを可能にする新規なワークフローを開発した。
方法の最適化のために、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１特異的な公開されている条件的ＭＨＣＩリガンドを使用した。スケールアップした産生に対する主要な制限は、試料を１ｍＬ未満に濃縮することを必要とするＳＥＣ精製工程の必要性である。さらに、精製したリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体に対して、典型的にビオチン化工程が行われ、これには、二次精製工程が必要であり、これによってスケールアップした産生がさらに制限される。これらの制限に対処するために、本発明者らは、リフォールディング反応、プロセス内ビオチン化、および陰イオン交換クロマトグラフィー精製を含む、３工程の産生プロセスを開発した。ビオチン化工程の前および後のＭＨＣＩ複合体のＨＬＡ成分のＬＣ／ＭＳ分析は、図４３Ａに示されている。黒色の線は、ビオチン化前のＨＬＡタンパク質を示す。２つのピークが、３４８１２Ｄａおよび３４９４３Ｄａにおいて観察されているが、これらは、Ｎ末端メチオニン基ありおよびなしのＨＬＡタンパク質に対応する。これらの２つの集団は、不完全な修飾、ならびにそれに続く、それぞれホルミルメチオニン脱ホルミル酵素およびメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）によるホルミルメチオニンおよびＮ末端メチオニンの除去によって引き起こされる可能性が高く、これは、隣接するアミノ酸に応じて変動し得、いくつかの事例では、Ｎ末端メチオニンは除去されない。したがって、Ｎ末端ＨＬＡ配列は、全ＭＡＰ活性には理想的ではなかったため、部分的なＮ末端の除去のみが観察された可能性が高い。ビオチン化後に、本発明者らは、両方のピークについて、質量に約２４４の増加を観察したが、これは、ビオチンの質量に対応する（図４３Ａ）。非ビオチン化質量に残留ピークは観察されず、１００％のビオチン化が示された。これらの結果を合わせると、プロセス内ビオチン化工程を取り入れて、２つの精製工程の必要性を排除することの実現可能性が示される。
ビオチン化工程の完了後、得られたビオチン化反応を、２５ｍＭトリスにバッファー交換を行い、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製のために調製した。陰イオン交換は、ビオチン化工程中に使用される大きな体積（１０～１００ｍＬ）の直接的なローディングに適しているため、精製にはＳＥＣよりも陰イオン交換を選択した。１Ｌのリフォールディングの代表的なＱ－ＨＰ陰イオンクロマトグラムを、図４３Ｂに示す。封入体精製によるわずかな夾雑物を表す可能性の高い、いくつかの小さなピークとともに、約１３０ｍＬの溶出体積で大きなピークが観察された。主要なピークに由来する画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに流し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびＢ２Ｍの予測分子量に対応するバンドが、ピークにわたって観察された（図４３Ｂ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析におけるバンド強度に基づいて画分をプールし、ＬＣ／ＭＳおよびＳＥＣ－ＭＡＬＳを実行した。精製したビオチン化ＭＨＣＩ複合体のＴＩＣクロマトグラムを、図４３Ｃに示す。１．７および１．７５分の保持時間における２つの隣接するピークは、ラセミＵＶアミノ酸の使用により得られた条件的ＭＨＣＩリガンドのＲおよびＳジアステレオマーに対応する。１．８分および２．２分の保持時間におけるピークは、それぞれ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対応する。Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の両方の標準曲線を生成し、曲線下面積を使用して、Ｂ２ＭのＨＬＡに対するモル濃度およびモル比を定量化した。リフォールディングプロセスが、Ｂ２ＭのＨＬＡとの適正なペアリングをもたらした場合、２つの成分のモル比は、１に近似するはずである。この調製物について、比を計算すると０．９５となり、適正なペアリングが示唆された。ＭＨＣＩ複合体を、ネイティブ質量分析のためのＳＥＣ－ＭＡＬＳによってさらに分析して、適正な１：１のＨＬＡ：Ｂ２Ｍペアリングを確認した。Ａ２８０ ＳＥＣクロマトグラムピークは、高度に対称であり、均質なタンパク質試料を示し、凝集物ピークは観察されなかった（図４３Ｄ）。ＭＨＣＩピーク全体の分子量は、４８．８～５１．３ｋＤａの範囲に及び（図４３Ｄ、赤色の破線）、平均値は、４９．１ｋＤａであり、ＭＨＣＩ複合体の予測分子量（４８．１ｋＤａ）に近かった。集合的ＬＣ／ＭＳおよびＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、リフォールディングおよび精製プロトコールにより、高度に純粋かつ適正にフォールディングされたＭＨＣＩ複合体が得られたことを示唆する。
新規な精製ワークフローを開発する主要な目標の１つは、スケールアップした産生を可能にすることであった。スケーラビリティを試験するために、最適化された１Ｌプロトコールを、５Ｌおよび１５Ｌのスケールで行った。これらの産生スケールにおける収率を、図４３Ｅに示す。興味深いことに、本発明者らは、プロセスを１Ｌ（約６％）から５Ｌ（約８％）、さらに１５Ｌ（約１０％）へとスケールアップさせるにつれて、収率の段階的な増加を観察したが、この増加は、統計学的に有意ではなかった。１Ｌスケールおよび１５Ｌスケールで生成されるＭＨＣＩ複合体の量は、それぞれ、約２．４ｍｇおよび約６０ｍｇであり、これは、１５Ｌスケールではリフォールディングごとの材料生成における２５倍の増加に対応する。これらの発見を合わせると、この研究において記載されるワークフローを使用して、ＭＨＣＩ複合体の産生および精製をスケールアップすることの実現可能性が示される。
ＨＴＰスクリーニングから特定されたＵＶペプチドを用いた６つのＭＨＣＩモノマーのスケールアップした産生およびペプチド交換分析。上述のリフォールディングおよび精製プロトコールを、ＨＴＰスクリーニングにおいて特定された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いたＭＨＣＩ複合体の大スケール産生に適用した。６つすべての構築物のＱ－ＨＰ陰イオンクロマトグラム、および対応するプールした画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥを、図５４Ａ～５４Ｆに示す。これらのリフォールドのクロマトグラムは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１（図４３Ｂ）に非常に類似しており、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて明確なＨＬＡおよびＢ２Ｍバンドがある。それぞれのＨＬＡ対立遺伝子のプールした画分にＳＤＳ－ＰＡＧＥを実行し、ＨＬＡおよびＢ２Ｍに対応するバンドが、高い純度で観察された（図４４Ａ）。１Ｌのリフォールドから得られた収率は、試料ごとに変動し、Ａ＊０２：０３、Ｂ＊１８：０１、およびＣ＊０２：０２が、８～１１％の範囲のもっとも高い収率を有し、それに続いてＢ＊３５：０３（約５％）、Ｃ＊１４：０２（約４％）、およびＡ＊２６：０１（約２．５％）であった。この変動性は、アミノ酸配列の内容における差、およびリフォールディング中の凝集に対する感受性、ならびに安定な複合体を形成するペプチドの能力に起因する可能性が高い。変動性はあったものの、もっとも低い２．５％の収率でも、依然として１リットルのリフォールドから１ｍｇの材料が産生され、これを１５リットルのスケールにスケールすると１５ｍｇを上回ることになり得、これは、３０，０００個を上回るテトラマー染色をカバーするのに十分である。
ＬＣ／ＭＳおよびＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析を行って、これらのＭＨＣＩモノマーの品質をさらに評価し、Ｂ２ＭおよびＨＬＡが適正にペアリングしたかどうかを評価した。６つの対立遺伝子にわたるＢ２Ｍ：ＨＬＡ比のＬＣ／ＭＳ分析の結果を、図４４Ｃに示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体について観察されたように、これらのすべての試料について、Ｂ２Ｍ：ＨＬＡ比は、１に近かった。ＭＨＣＩ複合体を、インタクトなネイティブ状態質量分析のために、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによってさらに分析した。６つすべてのＭＨＣＩ複合体について、ＭＨＣＩピークにわたる平均分子量を、図４４Ｄに示す。６つすべての構築物の分子量は、４７．４～４８．８ｋＤａの範囲に及び、これは、十分にこれらの複合体の予測質量範囲（４７．５～４８ｋＤａ）内であった。これらの発見を合わせると、リフォールディングプロトコールおよび精製ワークフローが広く適用可能であっただけでなく、小スケールＨＴＰアッセイにおいて特定された条件的ＭＨＣＩリガンドが、スケールアップ時に安定なＭＨＣＩ複合体を形成することができたことが示される。
ＭＨＣＩモノマーのスケールアップした産生に使用することができる新規な条件的ＭＨＣＩリガンドを特定することに加えて、これは、これらの複合体が、ＵＶ曝露時にペプチド交換を受けて、ＭＨＣＩ複合体のＨＴＰの生成を可能にすることができることを示すために、望ましかった。ＵＶ曝露後の条件的ＭＨＣＩリガンドのペプチド交換を測定するためのもっとも広く使用されている方法のうちの１つは、ＥＬＩＳＡである。このアッセイは、ＵＶ曝露時のペプチド交換を示すことにおいて有益であることが証明されているが、このアッセイは、半定量的であり、交換されたペプチドの直接的な測定を提供するものでも、切断されたペプチドの定量化を可能にするものでもない。これらの制限に対処するために、本発明者らは、交換プロセス中に複合体にロードされたペプチドの直接的な定量化のための２Ｄ ＬＣ－ＭＳ分析方法を開発した。アッセイの概略図を、図４５Ａに示す。この方法の第１の工程（第１次元）は、ペプチド交換反応混合物（ＵＶへの曝露後のＭＨＣＩ複合体＋１００倍過剰モルの交換されたペプチド）を、分析用ＳＥＣカラムに注入することであり、これにより、過剰なペプチドを用いることなく試料採取バルブによるＭＨＣＩ複合体の収集が可能となる。第２の工程（第２次元）は、ＭＨＣＩピークから収集された材料のＲＰ－ＨＰＬＣへの注入である。ＲＰ－ＨＰＬＣ工程の有機相は、複合体内に含まれるＨＬＡ、Ｂ２Ｍ、およびペプチドの解離および変性をもたらし、これにより、Ａ２８０およびＬＣ／ＭＳによるＭＨＣＩ複合体の個々の成分の分析および定量化が可能となる。ＣＭＶ ｐｐ６５エピトープを用いた対照ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１条件的ＭＨＣＩリガンドのペプチド交換の第１次元のＳＥＣクロマトグラムの例を、図４５Ｂに示す。クロマトグラムは、ＭＨＣＩ複合体に対応する１つの優勢なピークを示す。クロマトグラムＡ２８０シグナルの変動は、一貫して２．５分と３分の間で観察されており、これは、試料採取バルブの開閉に対応する。第１次元と第２次元との間には大きな圧力差があるため、この変動は、バルブの開閉時の圧力の急激な変化と関連する可能性が高い。第２次元のＨＰＬＣ工程のＡ２８０クロマトグラムの例を、図４５Ｃに示す。ＨＬＡおよびＢ２Ｍのピークは、はっきりと視認できるが、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドまたは条件的ＭＨＣＩリガンドのＡ２８０ピークは、これらがいずれのトリプトファンまたはチロシン残基も含まず、本質的なＡ２８０吸収度を有さないため、観察されない。ペプチド組成を分析するために、交換ペプチドおよび切断されていない条件的ＭＨＣＩリガンドの抽出されたイオン交換クロマトグラムを生成した（図４５Ｄ）。予測した通り、本発明者らは、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドに対応する大きなピークを観察し、これは、ペプチド交換の成功を示す。しかしながら、非常に低いレベルのインタクトな条件的ＭＨＣＩリガンドもまた、観察された。この結果は、精製されたペプチドが、類似の質量で持ち越された合成に由来する夾雑物を有するか、または少量の条件的ＭＨＣＩリガンドが、複合体内にあるときにＵＶ切断から保護されたかのいずれかであることを示唆する。このピークはまた、ペプチド単独が、ＭＨＣＩの不在下において切断された場合にも観察され、これが夾雑物であることを示唆する。いずれにせよ、インタクトな条件的ＭＨＣＩリガンドの相対画分は、非常に低く（約１％）、下流のテトラマー染色に対する影響は最小限のはずである。同じ分析を行って、切断された条件的ＭＨＣＩリガンドの存在を検証したところ、ピークは検出されなかった。２Ｄ ＬＣ／ＭＳアッセイを用いてペプチド交換を分析することによって、本発明者らは、ＭＨＣＩ複合体におけるペプチド含有量が、ペプチド交換プロセス中にどのように変化するかを測定することができた。本発明者らは、これが、他の従来的な方法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して定量化することができないペプチド交換に関連するパラメーターをより良好に理解するために使用することができる強力なツールであると考える。
次いで、この方法を使用して、ＨＴＰ小スケールアッセイにおいて特定された新規な条件的ＭＨＣＩリガンドを用いてスケールアップした産生ワークフローを使用して生成したＭＨＣＩ複合体を用いてペプチド交換を評価した。それぞれのＭＨＣＩ複合体について、小スケールＨＴＰスクリーニング（図４２Ｂ～Ｄおよび５４Ａ～５４Ｃ）において結合体であることが見出された４～５つのペプチド、および１つの公知の非結合ペプチドを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。ペプチドＡ０２０３－０５を用いたＨＬＡ－Ａ＊０２：０３の第１次元のＳＥＣクロマトグラムは、明確な単一のピークを示した（図４５Ｅ）。ペプチド交換された複合体の第２次元のＨＰＬＣ Ａ２８０クロマトグラムもまた、予測されるＢ２ＭおよびＨＬＡピークを示した（図４５Ｆ）。第２次元のＥＩＣ分析において、Ａ０２０３－０５ペプチドの抽出質量に対応する大きなピークが、観察された（黒色の線、図４５Ｇ）。しかしながら、Ａ＊０２：０１およびＣＭＶ ｐｐ６５ペプチド交換に類似して、インタクトな条件的ＭＨＣＩリガンドに対応する小さなピークもまた、観察された（破線、図４５Ｇ）。この現象は、試験したすべての条件的ＭＨＣＩリガンドについても確認され、いくつかの低いレベルの夾雑物が存在し、ペプチド交換プロセスから持ち越されたことを示す。すべての事例において、夾雑物ペプチドの全画分は、１％未満であったことは、注目に値する。公知の非結合体を用いたペプチド交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の第１次元のＳＥＣクロマトグラムを、図４５Ｈに示す。これらの条件下における全体的なピーク面積は、ペプチド交換プロセスをペプチド結合体を用いて行った場合よりも低かった（図４１Ｅ対４１Ｈ）。さらに、第２次元におけるＡ２８０ ＨＰＬＣクロマトグラムは、２つのピークを含んでいたが、全体的なピーク面積は、ペプチド結合体を使用した場合よりもはるかに低かった（図４５Ｆ対４５Ｉ）。これらのデータを合わせると、ペプチド交換を非結合体を用いて行った場合に、高い可能性でタンパク質凝集に起因して、有意な材料の喪失があったことが示唆される。興味深いことに、ＳＥＣ実行の終了時のピーク（図４５Ｈ、保持時間約３．６分）が、試験したすべての対立遺伝子にわたって陰性対照の交換試料について一貫して観察され、本発明者らは、これが、部分的に変性したＨＬＡがカラムと相互作用することに起因すると考える。最終的に、ＥＩＣ分析において、Ａ＊０２：０３非結合体ペプチドに対応するピークは観察されず、ペプチド交換が生じなかったことを示す（図４５Ｊ）。ペプチドが複合体と会合しなかったとはいえ、ペプチド交換で観察されたピークよりもはるかに小さいものであるが比較的顕著なＡ２８０ピークが第１次元において観察されたことは、驚くべきことであった。これらの結果は、複合体の一部が、ペプチドの不在下において会合したままであるが、それは低い品質のものであり適正にフォールディングされていない可能性が高いことを示唆する。
第１および第２次元のデータの定量化を、図４６Ａ～４６Ｆに示す。この分析について、第１次元（ＳＥＣ）において交換後に回収されたＡ２８０ ＭＨＣＩピークの画分、および第２次元（ＥＩＣ）において交換されたペプチドの存在を、評価した。図４６Ａ～４６Ｆは、４～５つの陽性対照および１つの陰性対照にわたる異なるＭＨＣＩ複合体について回収されたＡ２８０ ＭＨＣＩピークの画分（非ペプチド交換対照に対して正規化）を示す。グラフの上部の符号は、ペプチドが、第２次元において検出されたかどうかを示す（＋＝検出、－＝非検出）。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３（図４６Ａ）については、陽性対照結合体ペプチドの回収された画分は、０．９～１で変動し、交換ペプチドは、すべてのペプチドについて、第２次元において観察された。上述のように、陰性対照の回収された画分は、交換されたペプチドがなかったとはいえ、依然として比較的高く（約０．７６）、切断された条件的ＭＨＣＩリガンドおよび非常に低いレベルのインタクトな条件的ＭＨＣＩリガンド（１％未満）が観察された。これは、複合体が、ペプチドの不在下においてある期間、いくらかインタクトなままであるが、ペプチドの不在下におけるＨＬＡ対立遺伝子の不安定性を考慮すると適正にフォールディングされていない可能性が高いことを示唆する。陽性対照と陰性対照との間の回収される画分の差は、たった２６％であったため、このアッセイがペプチド含有量ではなくＨＬＡとＢ２Ｍとの間のペアリングを測定するだけであることを考慮すると、これがＥＬＩＳＡによって見逃されている可能性があることは注目に値する。
同様の結果が、Ａ＊２６：０１（図４６Ｂ）、Ｂ＊１８：０１（図４６Ｃ）、Ｂ＊３５：０３（図４６Ｄ）、およびＣ＊１４：０２（図４６Ｆ）について観察された。すべての事例において、第１次元の陽性対照と陰性対照との間のピーク面積の差は、２０～２５％未満であった。対照的に、Ｃ＊０２：０２については、陰性対照および陽性対照において、劇的な差があった（図４６Ｅ）。この試料については、公知の非結合体ペプチドをペプチド交換に含めた場合に材料の約８０％が分解した。この正確な理由は不明であるが、ペプチドがＨＬＡ上のペプチド溝から除去されている場合に異なる対立遺伝子がＢ２Ｍに会合したままとなる能力に起因する可能性が高い。いずれにせよ、これらの結果を合わせると、ＭＨＣＩペプチドのスケールアップした産生、ならびにそれに続くＭＨＣＩモノマーおよびテトラマーのＨＴＰ生成のためのペプチド交換を可能にする条件的ＭＨＣＩリガンドが特定されたことが、明確に示される。
この研究において、安定なＵＶペプチドＭＨＣ複合体を形成する新しい条件的ＭＨＣＩリガンドの特定および検証を可能にするワークフローを開発した。このワークフローには、安定なリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体を形成することがＩＥＤＢにおいて特定されている公知のペプチド結合体をスクリーニングすることが含まれた。初回スクリーニングにおける上位性能のペプチドに基づいて、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドを、設計した。ＵＶペプチドを、次いで、同じＥＬＩＳＡアッセイにおいてスクリーニングし、上位性能のものを、スケールアップした産生に選択した。従来的なスケールを上回るスケールアップ産生を可能にするために、ＨＬＡ－Ａ０２：０１の公開されている条件的ＭＨＣＩリガンドを使用する新規なＭＨＣＩ複合体精製およびビオチン化プロトコールを開発した（図１Ｌ）。さらに、次世代分析技法（ＬＣ／ＭＳ、２Ｄ ＬＣ／ＭＳ、およびＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を使用して、生成される複合体の品質を確認した。最適化されたリフォールド産生および精製プロトコール、ならびに次世代分析技法を、ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて特定された条件的ＭＨＣＩリガンドに適用した。この分析により、新しい条件的ＭＨＣＩ複合体が、高い純度まで精製されており、適正にリフォールディングされており、高い品質のものであったことが示された。最後に、本発明者らは、２Ｄ ＬＣ／ＭＳを使用して検証されたペプチド結合体を用いたＵＶ曝露後の条件的ＭＨＣＩ複合体のペプチド交換を評価した。すべての条件的ＭＨＣＩ複合体は、ＵＶ曝露時にペプチド交換を受けることができた。これらの結果を合わせると、新しいＨＬＡ対立遺伝子について、条件的ＭＨＣＩリガンドを特定するために使用することができるワークフローが開発されたことが示される。このアプローチは、広く適用され、広範なＨＬＡ対立遺伝子にわたってＭＨＣＩモノマーおよびテトラマーのＨＴＰ生成を可能にする可能性を有し、これは、臨床においてＭＨＣＩテトラマーを使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞をモニタリングすることを可能にするために、極めて重要であり得る。
実施例１０：条件的ＭＨＣＩリガンドの高スループットな特定および条件的ＭＨＣＩ複合体のスケールアップした産生
がん免疫療法（ＣＩ）／免疫－腫瘍学（ＩＯ）治療法のネオ抗原特異的Ｔ細胞応答に対する影響をモニタリングする必要性にもかかわらず、広範なＨＬＡ対立遺伝子にわたるＭＨＣＩテトラマーの高スループット（ＨＴＰ）な生成における課題に起因して、この免疫モニタリングの態様を組み込む臨床プログラムは、非常にわずかである。この制限は、近年、ＵＶ曝露時にＨＴＰペプチド交換を可能にする非天然ＵＶ切断性アミノ酸（条件的ＭＨＣＩリガンド）を含むペプチドを有するＭＨＣＩ複合体の開発を通じて対処されてきた。この進化にもかかわらず、条件的ＭＨＣＩリガンドが判明している対立遺伝子の数は、限られている。本発明者らは、ある範囲のＨＬＡ対立遺伝子にわたる条件的ＭＨＣＩリガンドの特定および検証を可能にする新規なワークフローを開発した。まず、公知のペプチド結合体を、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）アッセイによってスクリーニングした。もっとも高い性能のペプチドを使用して、条件的ＭＨＣＩリガンドを設計し、同じＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価した。上位性能のものを、次いで、スケールアップ産生に選択した。次世代分析技法（ＬＣ／ＭＳ、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ、および２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）を使用して、条件的ＭＨＣＩリガンドを用いたリフォールディング後の複合体を特徴づけた。最後に、本発明者らは、２Ｄ ＬＣ／ＭＳを使用して、検証されたペプチド結合体を用いたＵＶ曝露後のこれらのスケールアップした条件的ＭＨＣＩ複合体を用いてペプチド交換を評価した。すべての条件的ＭＨＣＩリガンドについて、ＵＶ曝露時のペプチド交換の成功が観察され、本発明者らのスクリーニングアプローチが検証された。このアプローチは、広く適用され、広範なＨＬＡ対立遺伝子にわたってＭＨＣＩモノマーおよびテトラマーのＨＴＰ生成を可能にする可能性を有し、これは、臨床においてＭＨＣＩテトラマーを使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞をモニタリングすることを可能にするために、極めて重要であり得る。
Ｔ細胞応答を追跡するためのもっとも一般的な方法は、ＥＬＩＳＰＯＴおよびＭＨＣテトラマー染色である。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＰＢＭＣを抗原で刺激したときのＴ細胞からのサイトカイン放出を測定する機能的アッセイである。このアッセイの利点は、それが、対立遺伝子およびネオエピトープに依存しない（すなわち、ネオ抗原のみが判明している必要がある）こと、ならびにそれが機能的リードアウトであることである。このアッセイの欠点は、それが、半定量的であること、およびＴ細胞表現型を評価する手段がないことであり、これは、防御免疫応答を生成するための重要な因子を理解するために極めて重要であり得る。ＭＨＣＩテトラマーに基づく検出は、ネオ抗原特異的Ｔ細胞染色試薬としてストレプトアビジンコンジュゲーションを介して多量体化してテトラマーとなる組換えＭＨＣＩモノマーを利用する。この方法は、複数の特異性ならびに表現型マーカーの染色を可能にする。ＭＨＣＩテトラマーはまた、ネオ抗原特異的Ｔ細胞の正確な数およびこれが処置過程の間にどのように変化するかに関する定量的分析も可能にする。したがって、多くの点において、ＭＨＣＩテトラマーに基づく検出は、ネオ抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に対する処置の作用に関してより詳細な理解を提供し得る。
ＭＨＣＩテトラマー検出の利点にもかかわらず、このアプローチは、試薬を生成することに関する問題に起因して、臨床プログラムにわたりバイオマーカー戦略として広く採用されてはいない。ＭＨＣＩテトラマー生成は、複数回のクロマトグラフィー工程を含む、長時間で数日間にわたる低い収率のリフォールディングプロセスを必要とする。さらに、それぞれのヒトは、６つの異なるＨＬＡ対立遺伝子を有し、ＨＬＡ対立遺伝子は、高度に多型である（ほぼ２０，０００個のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子が存在する）。加えて、ネオ抗原プロファイルは、それぞれの患者に固有であるだけでなく、所与の患者においてＴ細胞の状況の全体像を得るためには、１０～数１００個の患者特異的ＭＨＣＩテトラマーが必要とされるであろう。したがって、ＭＨＣＩテトラマーに基づくネオ抗原特異的Ｔ細胞応答の検出には、個別化されたＭＨＣＩテトラマープラットフォームが必要となるであろうが、これは、従来的なＭＨＣＩ生成プロトコールの使用では不可能である。
ＭＨＣＩ試薬を調製するいくつかの新規な方法が、これらの制限に対処するために開発されている。１つのアプローチは、ＨＬＡ対立遺伝子において安定化ジスルフィドを操作して、ジペプチドの存在下において安定なＭＨＣＩ複合体の形成を可能にすることである。これらのジスルフィド安定化ＭＨＣＩ試薬は、「空の」ＭＨＣＩ複合体と称されており、単純に空のＭＨＣＩ複合体に目的のペプチドをロードすることによって、ペプチドまたはエピトープをロードすることができる。この戦略は、マウスおよびヒト（Ａ＊０２：０１）ＭＨＣＩ複合体について実証されており、このアプローチおよび従来的なリフォールディングアプローチを使用して産生されたＭＨＣＩ試薬間で、同等のテトラマー染色結果が報告されている。別の方法は、条件的ＭＨＣＩリガンドとも称される対立遺伝子特異的ＵＶ切断性ペプチドを使用して、ＭＨＣＩ複合体を形成し、この場合には、ペプチドは、インタクトな場合には高い親和性で結合し、切断された場合には低い親和性で結合する。この機能性により、条件的ＭＨＣＩ複合体と称される条件的ＭＨＣＩリガンドを用いてアセンブルされているＭＨＣＩ複合体を、目的の高親和性ペプチド結合体の存在下でインキュベートした場合に、ＵＶ曝露によるペプチド交換が可能となる。所与のＨＬＡ対立遺伝子の条件的ＭＨＣＩ複合体は、大スケールでリフォールディングすることができ、エンドユーザは、次いで、条件的ＭＨＣＩリガンドを、目的の任意の他のペプチドと交換することができる。
これらの方法のいずれも、臨床において個別化されたＭＨＣＩテトラマーを使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞をモニタリングすることを可能にするという試みで、打開策を提供した。「空の」ＭＨＣＩの主要な欠点のうちの１つは、「空の」複合体を安定化させる新規な操作されたジスルフィド、および「空の」複合体がそれぞれの異なるＨＬＡ対立遺伝子についてリフォールディングすることを可能にするジペプチドを特定することが必要であることである。同様に、条件的ＭＨＣＩアプローチの欠点のうちの１つは、それぞれのＨＬＡ対立遺伝子に特異的なペプチドを特定および設計することが必要であることである。しかしながら、ペプチド結合体の高スループット（ＨＴＰ）なスクリーニングが、リソースの観点から、「空の」ＭＨＣＩに必要なジペプチド安定化剤のスクリーニングと組み合わせて複数の操作構築物を生成することよりも容易であることを考慮すると、この計画の目標は、条件的ＭＨＣＩリガンドのレパートリーをさらに拡大することであった。本発明者らが知る限り、条件的ＭＨＣＩリガンドは、２４個のＨＬＡ対立遺伝子に関してのみ公開されている。これらの対立遺伝子は、もっとも存在度の高いもののうちの一部であるが、多様な患者の広範なコホートにわたるネオ抗原のカバレッジは、依然として最小限である。したがって、対立遺伝子カバレッジの拡大を可能にするワークフローを開発する必要がある。
さらに、リフォールディングまたはペプチド交換後のＭＨＣＩ複合体を分析的検証は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）アッセイおよびゲル電気泳動を含む、限られた数の分析技法を使用している。これらの技法は、ＭＨＣＩ複合体が存在しているかどうかを判定するため、ならびに親和性および安定性の半定量的分析には有用であることが証明されているが、ＨＬＡ：Ｂ２Ｍ比、凝集、および酸化状態など、いくつかの他の重要なパラメーターは捕捉されない。液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、２Ｄ ＬＣ／ＭＳ、およびサイズ排除クロマトグラフィー－多角度光散乱検出（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を含め、これらのパラメーターを評価するための複数のタンパク質分析ツールが存在しているが、これらのツールは、リフォールディングまたはペプチド交換後のＭＨＣＩ複合体の特徴づけのためにはほとんど使用されていない。
これは、安定な条件的ＭＨＣＩ複合体を形成する条件的ＭＨＣＩリガンドおよびＨＬＡ対立遺伝子の新しい組合せの特定および検証を可能にする実験的ワークフローである。本発明者らは、安定な条件的ＭＨＣＩ複合体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイを開発し、検証した。本発明者らは、免疫エピトープデータベースおよび分析（ＩＥＤＢ）において報告されている５つの公開されているペプチド結合体を、６つのＨＬＡ対立遺伝子（Ａ＊０２：０３、Ａ＊２６：０１、Ｂ＊１８：０１、Ｂ＊３５：０３、Ｃ＊０２：０２、Ｃ＊１４：０２）にわたってスクリーニングし、上位結合体に基づいて、条件的ＭＨＣＩリガンドを設計した。条件的ＭＨＣＩリガンドを、次いで、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてスクリーニングし、上位性能のものを、スケールアップ産生に選択した。ＭＨＣＩ産生のために、新規なＭＨＣＩ精製およびビオチン化プロトコールを開発し、次世代分析技法を使用して、生成された複合体の品質を確認した。これらの方法を、さらに適用して、新しく特定された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いて生成された条件的ＭＨＣＩ複合体を特徴づけた。最後に、本発明者らは、２Ｄ ＬＣ／ＭＳを使用して、ＵＶ後の検証されたペプチド結合体を用いてペプチド交換を検証した。まとめると、本発明者らは、ＨＬＡ対立遺伝子カバレッジを大幅に拡大するために広く適用することができる、新しいＨＬＡ対立遺伝子の条件的ＵＶペプチドを特定するための検証されたワークフローを開発したが、これは、臨床においてＭＨＣＩテトラマーを使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞をモニタリングすることを可能にするために、極めて重要であり得る。
タンパク質の発現および精製。ＨＬＡおよびＢ２Ｍ配列を、Ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇから得た。ＨＬＡおよびＢ２Ｍのシグナル配列、ＨＬＡの細胞外ドメイン、ならびにＢ２Ｍの全長をコードするＤＮＡを合成し、Ｔ７ ｌａｃプロモーターの制御下において、ｐＥＴ発現ベクターにサブクローニングした。組換えＨＬＡおよびＢ２Ｍを、大腸菌（Escherichia coli）において過剰発現させ、封入体から精製し、変性バッファー（６ＭグアニジンＨＣｌ、２５ｍＭトリス、ｐＨ８）において－８０℃で保管した。発現の誘導後、Ｂ２ＭおよびＨＬＡバイオマスペレットを、５ｍＬ／ｇで溶解バッファー（ＰＢＳ＋１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４）中に再懸濁させ、１０００バールでマイクロ流体形成装置において２回ホモジナイズした。ホモジナイズした懸濁液を、次いで、３００００ｇで２０分間、超遠心装置において回転処理した。ペレットを収集し、ＰＢＳ中の０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、５００ｍＬで洗浄し、３０，０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを再度収集し、上述のように２回目の洗浄を行った。精製した封入体を、変性バッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、６Ｍグアニジン）中に、１０ｍＬ／ｇの濃度で溶解させ、４℃で一晩撹拌した。溶解したペレットを、４０，０００ｇで６０分間遠心分離し、上清を収集し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。濃度を、タンパク質の消衰係数を使用して、ＵＶ－Ｖｉｓによって２８０ｎｍで判定した。試料を、次いで、瞬間凍結させ、－８０℃で保管した後に、ＭＨＣＩ複合体の生成を行った。
スクリーニングのためのペプチドの選択。初回結合スクリーニングのためのペプチドを、免疫エピトープデータベースおよび分析リソース（ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）から選択した。データベースにおいて特定されたペプチド結合体を、親和性に基づいて分類し、測定した親和性がもっとも高かった５つのペプチドを選択した。上位５つのペプチド配列が類似していた（４個未満のアミノ酸が異なる）場合、固有の配列を有する次点で高い親和性のペプチドを選択して、スクリーニングにおいて最大のペプチド多様性を確保した（表３）。
ＭＨＣＩリフォールディング（小スケール）。組換えＨＬＡ対立遺伝子およびＢ２Ｍを、大腸菌（E. coli）において過剰発現させ、封入体から精製し、上述のように、変性条件下（６ＭグアニジンＨＣｌ、２５ｍＭトリス、ｐＨ８）において－８０℃で保管した。２００μＬの反応において、ペプチド（０．０１ｍＭ、１ウェル当たり）、酸化および還元グルタチオン（それぞれ、０．５ｍＭおよび４．０ｍＭ）、組換えＨＬＡ対立遺伝子（０．０３ｍｇ／ｍＬ）、ならびにＢ２Ｍ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を、すべて、９６ウェルプレートにおいて合わせた。リフォールディングを、上述（表３）のように、それぞれの目的のＨＬＡについて、５つの異なるペプチドを用いて行い、リフォールディングを可能にするために、ＭＨＣＩ複合体を、４℃で３～５日間インキュベートした。ＭＨＣＩ複合体のリフォールディングを、ペプチドの不在下においても行い、これを陰性対照として使用して、実験的ペプチドのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）を計算した。ペプチドの不在下においては適正にリフォールディングした複合体が最小限となるはずであることを考慮すると、これらの試料は、Ｓ／Ｎ値を計算するためのアッセイの全体的なバックグラウンドを提供した。ＣＭＶ ｐｐ６５ウイルスエピトープを用いてリフォールディングされたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を、陽性対照として使用した。もっとも高いシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を生じたペプチドを、さらなる分析に選択した。
ＥＬＩＳＡ分析に基づいてそれぞれのＨＬＡ対立遺伝子についてもっとも安定なペプチド結合体を特定した後、ペプチド配列に沿った異なる位置にＵＶ切断性アミノ酸（「Ｊ」と表記する）を有するペプチドを、再設計した（表４）。簡単に述べると、初回スクリーニングにおいて特定されたもっとも安定なペプチド結合体の、Ｊアミノ酸がＮ末端に対して２位、４位、６位、および８位で置換された変異体を、再設計した。再設計したペプチドを用いたリフォールディング時の安定な条件的ＭＨＣＩ複合体の形成を、上述のようにＥＬＩＳＡによって特定した。ＥＬＩＳＡアッセイのリードアウトに基づいてもっとも安定な複合体をもたらした条件的ＭＨＣＩリガンドを、スケールアップしたＭＨＣＩ産生に使用した。もともとのペプチド（ＵＶアミノ酸置換を含まない）を、陽性対照として使用した。ここで使用したすべてのペプチドは、ＪＰＴ（ｗｗｗ．ｊｐｔ．ｃｏｍ）またはＥＬＩＭ Ｂｉｏｐｈａｒｍ（ｗｗｗ．ｅｌｉｍｂｉｏ．ｃｏｍ）から購入した。
ＥＬＩＳＡアッセイ。２つの異なるＥＬＩＳＡアッセイを評価して、アッセイの感度を最適化した。第１のアッセイ形式において、リフォールディングされたＭＨＣＩを、抗Ｂ２Ｍ抗体を用いて捕捉し、汎ＡＢＣ抗ＨＬＡ抗体（クローンＷ６／３２）を用いて検出した。第２のアッセイ形式においては、ＭＨＣＩを、汎ＡＢＣ抗ＨＬＡ抗体（クローンＷ６／３２）を用いて捕捉し、抗Ｂ２Ｍ抗体を用いて検出した。いずれのアッセイにおいても、３８４ウェルのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、コーティングバッファー（０．０５炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中８μｇ／ｍＬで、２５μＬ／ウェルの捕捉抗体、マウスＩｇＧ１抗ヒトＢ２Ｍ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、またはマウスＩｇＧ２ａ抗ＨＬＡ ＡＢＣクローンＷ６／３２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏ．）でコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。プレートを、次いで、５０μＬ／ウェルのブロックバッファー（ＰＢＳ、０．５％ ＢＡＳＥ、１０ｐｐｍ Ｐｒｏｃｌｉｎ）でブロッキングし、室温（ＲＴ）で１時間、撹拌しながらインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した後、ペプチドありおよびなしでアッセイ希釈剤（ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０＋１０ｐｐｍ Ｐｒｏｃｌｉｎ）中４０μｇ／ｍＬで、２５μＬ／ウェルの未精製のリフォールディングされたＭＨＣ複合体をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、６回洗浄し、アッセイ希釈剤中１００ｎｇ／ｍＬで、２５μＬのビオチン化マウスＩｇＧ２ａ抗ＨＬＡ ＡＢＣクローンＷ６／３２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏ．）（アッセイ形式１）またはビオチン化マウスＩｇＧ１抗ヒトＢ２Ｍ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（アッセイ形式２）を、それぞれのウェルに添加した。室温で１時間インキュベートし、６回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＧＥ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。呈色反応を、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）を用いて室温で１５分間発色させ、反応を、１Ｍリン酸で停止させた。ＯＤ吸収度値を、参照６２０ｎｍで、４０５ｎｍの波長で測定した。アッセイのバックグラウンドを測定し、実験的ペプチドのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）を計算するために、ペプチドなしでリフォールディングしたＭＨＣモノマーを、それぞれのアッセイに含めた。
ＭＨＣＩ－ペプチドリフォールディング、ビオチン化、および精製（大スケール）。１、５、または１５Ｌの反応において、選択したペプチド（０．０１ｍＭ）、酸化および還元グルタチオン（それぞれ、０．５ｍＭおよび４．０ｍＭ）、組換えＨＬＡ（０．０３ｍｇ／ｍＬ）、ならびにＢ２Ｍ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を、リフォールディングバッファー（１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０、４００ｍＭ Ｌ－アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で合わせた。リフォールディング混合物を、次いで、４℃で３～５日間撹拌し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５中へのタンジェント流濾過（ＴＦＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐ２Ｃ０１０Ｃ０１）によって濃縮およびバッファー交換した。タンパク質成分を、ＬＣ／ＭＳによって分析して、ＨＬＡが適切な還元状態にあることを確実にした。濃縮およびリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体を、次いで、ＢｉｒＡ（１：５０［重量：重量］の酵素：ＭＨＣＩ）、１００ｍＭ ＡＴＰ、および１０×反応バッファー（１００ｍＭ ＭｇＯＡｃ、０．５ｍＭビオチン）の添加を通じてビオチン化した。ビオチン化反応を、室温で２時間混合した。試料を透析し、ＬＣ／ＭＳによって分析して、ビオチン化を定量化した。ビオチン化ＭＨＣＩ複合体を、反応サイズに応じて１または５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラムを使用して、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ＦＰＬＣにおける陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムを、５ｍＬ／分の流速で、１０カラム容積（ＣＶ）の２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡処理した。ＭＨＣＩ複合体を、５ｍＬ／分の流速でカラムにロードし、３０ＣＶにわたって０～６０％のバッファーＢ（２．５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ）の勾配を使用して溶出させた。溶出ピーク全体の画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに流し、Ｂ２ＭおよびＨＬＡの両方のバンドを含む画分をプールした。プールした画分を、保管バッファー（２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中にバッファー交換した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ吸収度によって判定し、試料を、瞬間凍結させて－８０℃で保管した。
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）による分析。２μｇと５μｇの間のＭＨＣＩ複合体を、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＲＰ－ｍＡｂジフェニルカラム、２．１×７５ｍｍ、３．５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に注入した。カラムを、８０℃に加熱し、０．８ｍＬ／分で２．０分間に２５～４０％の移動相Ｂの勾配に曝露した。移動相Ａは、水中０．０５％ ＴＦＡであった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０５％ ＴＦＡであった。カラム溶出液を、質量分析データ取得のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳに送った。ＭＨＣＩ濃度およびＨＬＡに対するＢ２Ｍのモル比を定量化するために、上述の方法を使用して、公知の量のそれぞれのタンパク質を注入することによって、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ対立遺伝子の標準曲線を生成した。Ａ２８０におけるピーク面積を使用して、ＭＨＣＩ複合体における個々のタンパク質サブユニットの定量化を可能にする標準曲線を生成した。ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ＨＬＡおよびＢ２Ｍ質量をデコンボリューションした。
サイズ排除クロマトグラフィー－多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）分析。ＭＨＣＩ複合体の分子量を、前述のように判定した。簡単に述べると、約２ｍｇ／ｍＬの試料を、室温で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ ｐＨ７．２、追加の１５０ｍＭ ＮａＣｌ）とともに、多角度光散乱システム（ＭＡＬＳ）（Ｗｙａｔｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に連結したＴＳＫｇｅｌ ＳＷ３０００ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＳＥＣカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に注入して（Ａ＊０２：０１ ＭＨＣについては１０μｌ、他のＭＨＣＩ対立遺伝子については２５μｌ）、モル質量を測定した。
２Ｄ ＬＣ／ＭＳ分析。２次元液体クロマトグラフィー質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）方法を使用して、ＭＨＣＩ複合体に結合するペプチドを特徴づけた。２μｇと３μｇの間のＭＨＣＩ複合体を、機器に注入し、第１次元のカラムに送った。第１次元のＬＣ方法は、分析用サイズ排除カラム（ＳＥＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Å、２．７μｍ、４．６×１５ｍｍ）を利用して、インタクトな複合体を、１０分間、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、０．７ｍＬ／分の一定流速で泳動する過剰なペプチドから分離し、シグナルを２８０ｎｍで取得した。試料採取バルブにより、１．９０分間と２．１３分間の間にわたって溶出した複合体ピークの全体を１６０μＬの体積で収集し、第２次元の逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓ １０００Å、８μｍ、５０×２．１ｍｍ）に注入した。第２次元のカラムを、０．５５ｍＬ／分で４．７分間で５～５０％の移動相Ｂの勾配に曝露し、カラムを８０℃に加熱した。移動相Ａは、０．０５％ ＴＦＡであった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０５％ ＴＦＡであった。カラム溶出液を、質量分析データ取得のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２２４ ＥＳＩ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳに送った（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ）。
ＥＬＩＳＡに基づくＭＨＣＩリフォールディングの分析。この計画の主要な目的の１つは、安定な条件的ＭＨＣＩ複合体を形成することができる非天然ＵＶ切断性アミノ酸（条件的ＭＨＣＩリガンド）を含むペプチドの特定のためのロバストなＨＴＰワークフローを開発することであった。このプロセスの第１の工程は、リフォールディングスクリーニング後に安定なＭＨＣＩ複合体の形成を測定することができるＥＬＩＳＡアッセイを開発することであった。ＨＴＰリフォールディングプロトコールには、９６ウェルプレート内で、２００μＬの反応において、変性した組換えＨＬＡ（０．０３ｍｇ／ｍＬ）、Ｂ２Ｍ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、ペプチド（０．０１ｍＭ）、酸化および還元グルタチオン（それぞれ、０．５および４．０ｍＭ）を混合し、リフォールディング反応を、ＥＬＩＳＡ分析の前にデリ冷蔵庫において４℃で３～５日間進行させることが含まれた。ＨＬＡ成分は、この段階ではビオチン化されていないため、本発明者らは、広く公開されているストレプトアビジンに基づくＥＬＩＳＡを使用することができなかった。本発明者らは、代わりに、以下の２つの形式を評価した１）抗Ｂ２Ｍを用いた捕捉および抗ＨＬＡを用いた検出、ならびに２）抗ＨＬＡ（クローンＷ６／３２）を用いた捕捉および抗Ｂ２Ｍを用いた検出。いずれの事例においても、検出抗体を、ビオチンで標識し、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよび基質の添加後に、シグナル生成を誘導した。ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を、これらの初回スクリーニングに使用した。Ｓ／Ｎ値は、ペプチドの不在下においてリフォールディングしたＭＨＣＩ複合体（ペプチドなし対照）を、アッセイのバックグラウンドの尺度として使用して計算した。シグナルおよび検出範囲は、両方の形式について同程度であったが、Ｓ／Ｎ値は、０．２５μｇ／ｍＬを上回る濃度において、形式２（図４７Ａの黒色のバー）では、形式１（図４７Ａの白色のバー）よりもはるかに高かった。本発明者らは、形式２の高い特異性が、捕捉工程がＭＨＣＩ上の立体構造エピトープを認識する抗ＨＬＡ抗体を使用しており、適正にフォールディングされたＭＨＣＩに対してのみ選択的であるはずであることに起因すると考える。対照的に、抗Ｂ２Ｍ捕捉は、適正にフォールディングされたＭＨＣＩに依存せず、適切にフォールディングされたＨＬＡ、ならびに部分的に変性したＨＬＡを有する複合体を捕捉するが、本発明者らは、これが、形式１のペプチドなし対照の高い検出シグナルを説明すると考えている。これらの発見に基づいて、本発明者らは、残りのスクリーニングには形式２を選択した。図４７Ｂは、ＥＬＩＳＡでのＭＨＣＩまたはＭＨＣＩ－ペプチド濃度の関数としてのＥＬＩＳＡ結果を示す。材料および方法に記載される形式２は、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチド、ＢＭＲＦ１ペプチド、およびペプチドなし（バックグラウンド対照）を用いてリフォールディングしたＭＨＣＩ分子を使用している。ＭＨＣＩ濃度の増加に伴い、本発明者らは、ＣＭＶ ｐｐ６５およびＢＭＲＦ１ペプチドの両方について、ＯＤ４５０／６２０ ＥＬＩＳＡシグナルの増加を観察したが、ペプチドなし対照についてはシグナルの増加はほとんどまたはまったく観察されず、これは、適正にリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体の検出と一致する。図４７Ｃは、ＣＭＶ ｐｐ６５およびＢＭＲＦ１の両方について、１μｇ／ｍＬのＭＨＣＩ濃度において、ペプチドなし対照をバックグラウンドとして使用したＥＬＩＳＡ分析のＳ／Ｎを示す。いずれの抗原も、バックグラウンドよりも１０倍高いシグナルを有し、このアッセイ形式が、高度に選択的なＳ／Ｎをもたらし、リフォールディング工程中に安定なＭＨＣＩ複合体を形成することができる抗原を特定するために使用することができることを示した。さらに、標準偏差は、非常に小さく（図４７Ｂ、４７Ｃ）、このアッセイが、所与の実験について高度に再現性であり、これを使用して、二連にアッセイを行う必要なしに最適なペプチドを容易に選択することができることを示す。アッセイ最適化の目標は、高度に再現性であり、二連または三連に実行することを必要とせず数百個の対立遺伝子のスクリーニングを緩和するアッセイを開発することであり、これらの結果に基づいて、本発明者らは、これが達成されたと考える。
ＨＬＡ対立遺伝子にわたるペプチド結合体および条件的ＭＨＣＩリガンドの特定。ペプチドを、ＩＥＤＢから選択した（表３）。対応するＨＬＡ対立遺伝子と安定なＭＨＣＩ複合体を形成するこれらのペプチドの能力を、上述のＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析した。５つのペプチドおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０３を用いて生成したリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体の滴定曲線を、図４８Ａに示す。アッセイは、０．１～３．０μｇ／ｍＬの範囲のＭＨＣＩ濃度で行い、図４７Ｂにおける陽性対照について観察されたように、漸増ＭＨＣＩ濃度においてＥＬＩＳＡ ＯＤが増加し、シグナルは、１μｇ／ｍＬを超えると飽和し始めた。さらに、本発明者らは、滴定範囲全体にわたって陰性対照のシグナルの増加が最小限しかなかったことを観察した。Ａ＊０２：０３、Ｂ＊３５：０１、およびＣ＊０２：０２対立遺伝子のＳ／Ｎ ＥＬＩＳＡ値を比較するために、１．０μｇ／ｍＬの濃度を選択したが、それは、この濃度が、飽和をわずかに下回るためであった（ペプチド－ＨＬＡの組合せに応じてＥＣ６０－ＥＣ８５）（図４８Ｂ～４８Ｄ）。Ａ＊０２：０３に対してスクリーニングした５つのペプチドのＳ／Ｎバックグラウンドは、比較的高く、値は２０と４０の間の範囲に及んだ。このことは、ＩＥＤＢから選択したすべてのペプチドが、結合体であっただけでなく、リフォールディング時に安定なＭＨＣＩ複合体を形成することも可能であったことを示唆する。Ａ＊０２：０３－０２ペプチドが、もっとも高いＳ／Ｎ値をもたらし、これを、ＵＶペプチドの設計に選択した。Ｂ＊３５：０３について、選択したペプチドから得られたＳ／Ｎ値もまた、６．７５～７．２５の範囲に及ぶ比較的高いＳ／Ｎバックグラウンドを有した（図４８Ｃ）。Ｂ＊３５：０３－０４が、もっとも高いＯＤ値を生じ、これを、続いて、候補条件的ＭＨＣＩリガンドの設計に選択した。Ｃ＊０２：０２ペプチドについて、Ｓ／Ｎ値は、すべてが１８と２０の間であったが、はるかに低かった（約８）Ｃ＊０２：０２－０２は除く（図４８Ｄ）。Ｃ＊０２：０２－０３が、もっとも高い正規化Ｓ／Ｎ値を生じ、これを、候補条件的ＭＨＣＩリガンドの設計に選択した。Ａ＊２６：０１、Ｂ＊１８：０１、およびＣ＊１４：０２もまた試験し、同様の結果が観察された（図５４Ａ～５４Ｆ）。試験したすべての対立遺伝子についてＳ／Ｎは比較的高く、アッセイが安定な複合体を形成するペプチドを特定していたという信頼性を提供したが、対立遺伝子にわたってＳ／Ｎシグナルの規模には有意差があった。本発明者らは、これらの結果が、異なるＨＬＡ対立遺伝子に対する汎ＨＬＡ抗体の親和性における変動性に起因する可能性が高いと考える。対照的に、所与の対立遺伝子（例えば、Ａ＊０２：０３およびＣ＊０２：０２）内の変動性は、スクリーニングした異なるペプチドにわたるペプチド親和性の差に起因する可能性が高かった。
異なるＨＬＡ対立遺伝子にわたって安定な複合体を形成するＵＶペプチドを特定するために、初回スクリーニングにおいて上位性能であったペプチド（すなわち、Ａ０２０３－０２、Ｂ３５０３－０４、およびＣ０２０２－０３）（図４８Ｂ～４８Ｄ）の、Ｎ末端から２位、４位、６位、および８位にＵＶ切断性アミノ酸（Ｊと表記する）の置換を有する変異体を、設計した。Ａ０２０３－０２ペプチドに由来するスクリーニングした４つの条件的ＭＨＣＩリガンドを用いてアセンブルしたＭＨＣＩ複合体の滴定曲線を、図４８Ｅに示す。非ＵＶ切断性ペプチドについて観察されたように、ＭＨＣＩ濃度の増加に伴うＥＬＩＳＡ ＯＤの増加が観察され、値は、１μｇ／ｍＬで飽和し始めた（図４８Ｅ）。異なる対立遺伝子にわたるすべての条件的ＭＨＣＩリガンドのＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｎを、図４８Ｆ～４８Ｈに示す。２位にＪアミノ酸置換を有するすべての条件的ＭＨＣＩリガンド変異体は、非常に低いＳ／Ｎ ＥＬＩＳＡ値を示し（図４８Ｆ～Ｈ）、親ペプチド（灰色のバー、図４８Ｅ～４８Ｆ）と比べて、ＭＨＣ複合体の形成が最小限またはまったくないことを示す（Ａ０２０３－０２－０１、Ｂ３５０３－０５－０１、Ｃ０２０２－０３－０１、およびＣ０２０２－０３－０４）。この発見は、この位置が、ＭＨＣＩ－ペプチドアンカー位置として知られているため、予想されていた。Ａ０２０３－０２およびＢ３５０３－０４についてスクリーニングしたすべての他の条件的ＭＨＣＩリガンドは、親ペプチドと同様のＳ／Ｎ値をもたらした（図４８Ｆ～４８Ｇ）。対照的に、Ｃ０２０２－０２についてはすべての条件的ＭＨＣＩリガンドは、親と比較して低いＯＤ値を有したが、しかしながら、Ｃ０２０２－０２－０２およびＣ０２０２－０２－０３のＳ／Ｎは、それぞれ、６および８で依然として比較的高く（図４８Ｈ）、ＵＶ切断性アミノ酸が、ＭＨＣＩ安定性に対してわずかに負の影響を有したことを示す。もっとも高いＳ／Ｎ値をもたらした条件的ＭＨＣＩリガンド（Ａ０３０２－０２－０２、Ｂ３５０３－０４－０２、およびＣ０２０２－０３－０３）を、次いで、スケールアップした産生に選択した。同様の分析を行って、Ａ＊２６：０１、Ｂ＊１８：０１、およびＣ＊１４：０２対立遺伝子について、最適な条件的ＭＨＣＩリガンドを特定した（図５４Ａ～５４Ｆ）。
ＭＨＣＩモノマーのスケールアップしたリフォールディングおよび精製。目的のペプチドの存在下における、大腸菌（E. coli）封入体から精製した変性したＢ２ＭおよびＨＬＡのリフォールディングを通じた、組換えＭＨＣＩ複合体の生成は、２０年以上前に最初に開発された。この最初の報告以来、リフォールディングプロトコールを使用したＭＨＣＩ複合体の生成および精製のための多数の研究が存在しており、多数の方法が開発されている。これらの方法の大半は、以下のプロセスの何らかのバリエーションを含む：（１）酸化還元剤／酸化剤を含む一般的なリフォールディングバッファーにおいてＨＬＡおよびＢ２Ｍをペプチドと混合し（インキュベーション時間は１～５日間で変動し得る）、（２）リフォールディングされた材料を濾過して凝集体を除去し、（３）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に適合する体積まで濃縮し（カラムに応じて１～２ｍＬ）、（４）ＳＥＣを使用して精製し、（５）精製したリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体をビオチン化し、（６）ビオチン化反応後にＭＨＣＩ複合体を精製する（ＳＥＣ、スピンカラムフィルターなど）。これらの産生方法の大半は、１Ｌまたはそれよりも小さなスケールでのみ実践的であり、数ミリグラムのリフォールディング材料しか得られず、したがって、臨床プログラムの支持に置いて使用するのに十分な材料を産生するためには、多数回の産生実行が必要とされるであろう。複数回の実行は、ロットごとの変動性をもたらし得る可能性があり、これは、下流のテトラマー染色データの解釈を混同させ得る。これらの制限に対処するために、本発明者らは、ＭＨＣＩリフォールディングおよび精製を１５Ｌまでスケールアップすることを可能にする新規なワークフローを開発した。
この研究において開発したリフォールディングおよび精製プロトコールの概略図を、図４９に示す。方法の最適化のために、公開されているＨＬＡ－Ａ＊０２：０１特異的な条件的ＭＨＣＩリガンドを使用した。スケールアップした産生に対する主要な制限は、高度に濃縮された試料を必要とするＳＥＣ精製工程の必要性である。さらに、精製したリフォールディングされたＭＨＣＩ複合体に対して、典型的にビオチン化工程が行われ、これには、二次精製工程が必要であり、これによってスケールアップした産生がさらに制限される。これらの制限に対処するために、本発明者らは、リフォールディング反応、プロセス内ビオチン化、および陰イオン交換クロマトグラフィー精製を含む、３工程の産生プロセスを開発した（図４９）。ビオチン化工程の前および後のＭＨＣＩ複合体のＨＬＡ成分のＬＣ／ＭＳ分析は、図５０Ａに示されている。黒色の線は、ビオチン化前のＨＬＡタンパク質を示す。２つのピークが、３４，８１２および３４，９４３Ｄａにおいて観察されているが、これらは、Ｎ末端メチオニン基ありおよびなしのＨＬＡタンパク質に対応する。これらの２つの集団は、不完全な修飾、ならびにそれに続く、それぞれホルミルメチオニン脱ホルミル酵素およびメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）によるホルミルメチオニンおよびＮ末端メチオニンの除去によって引き起こされる可能性が高く、これは、隣接するアミノ酸に応じて変動し得、一部の事例では、Ｎ末端メチオニンは除去されない。したがって、Ｎ末端ＨＬＡ配列は、全ＭＡＰ活性には理想的ではなかったため、部分的なＮ末端の除去のみが観察された可能性が高い。ビオチン化後に、本発明者らは、両方のピークについて、質量に約２４４Ｄａの増加を観察したが、これは、ビオチンの質量に対応する（図５０Ａ）。非ビオチン化質量に残留ピークは観察されず、１００％のビオチン化が示された。これらの結果を合わせると、プロセス内ビオチン化工程を取り入れて、２つの精製工程の必要性を排除することの実現可能性が示される。
ビオチン化工程の完了後、得られたビオチン化反応を、２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）にバッファー交換を行い、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製のために調製した。陰イオン交換は、ビオチン化工程中に使用される大きな体積（１０～１００ｍＬ）の直接的なローディングに適しているため、精製にはＳＥＣよりも陰イオン交換を選択した。１Ｌのリフォールディングの代表的なＱ－ＨＰ陰イオンクロマトグラムおよび勾配を、図５０Ｂに示す。封入体精製によるわずかな夾雑物を表す可能性の高い、いくつかの小さなピークとともに、約１３０ｍＬの溶出体積で大きなピークが観察された。主要なピークに由来する画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびＢ２Ｍの予測分子量に対応するバンドが、ピーク全体で観察された（図５０Ｃ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析においてＨＬＡおよびＢ２Ｍの予測分子量におけるバンドの存在に基づいて画分をプールし、ＬＣ／ＭＳおよびＳＥＣ－ＭＡＬＳに流した。精製したビオチン化ＭＨＣＩ複合体のＴＩＣクロマトグラムを、図５０Ｄに示す。１．７および１．７５分の保持時間における２つの隣接するピークは、ラセミＵＶアミノ酸の使用により得られた条件的ＭＨＣＩリガンドのＲおよびＳジアステレオマーに対応する。１．８分および２．２分の保持時間におけるピークは、それぞれ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対応する。Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の両方の標準曲線を精製し、曲線下面積を使用して、Ｂ２ＭのＨＬＡに対するモル濃度およびモル比を定量化した。リフォールディングプロセスが、Ｂ２ＭのＨＬＡとの適正なペアリングをもたらした場合、２つの成分のモル比は、１に近似するはずである。この調製物について、比を計算すると０．９５となり、適正なペアリングが示唆された。ＭＨＣＩ複合体を、ネイティブ質量分析のためのＳＥＣ－ＭＡＬＳによってさらに分析して、適正な１：１のＨＬＡ：Ｂ２Ｍペアリングおよび試料の単分散性を確認した。Ａ２８０ ＳＥＣクロマトグラムピークは、高度に対称であり、均質かつ単分散性のタンパク質試料を示し、凝集物ピークは観察されなかった（図５０Ｅ）。ＭＨＣＩピーク全体の分子量は、４８．８～５１．３ｋＤａの範囲に及び（図５０Ｅ、赤色の破線）、平均値は、４９．１ｋＤａであり、ＭＨＣＩ複合体の予測分子量（４８．１ｋＤａ）に近かった。集合的ＬＣ／ＭＳおよびＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、リフォールディングおよび精製プロトコールにより、高度に純粋かつ適正にフォールディングされたＭＨＣＩ複合体が得られたことを示唆する（図５０Ｆ）。
新規な精製ワークフローを開発する主要な目標の１つは、スケールアップした産生を可能にすることであった。スケーラビリティを試験するために、最適化された１Ｌ（４０ｍｇのＨＬＡおよびＢ２Ｍ開始材料）プロトコールを、５Ｌ（２００ｍｇ）および１５Ｌ（６００ｍｇ）のスケールで行った。リフォールディングを、リフォールディング反応に添加した材料の質量に対する最終的な精製されたリフォールディング材料の質量を計算することによって、これらの産生スケールで定量化した（収率％±標準偏差）（図５０Ｆ）。興味深いことに、本発明者らは、プロセスを１Ｌ（約６％）から５Ｌ（約８％）、さらには１５Ｌ（約１１％）にスケールアップした場合に、平均収率％の漸増を観察し、１Ｌのスケールと１５Ｌのスケールとの間の収率の差は、統計学的に有意であることが見出された（ｐ値＜０．０５）。１Ｌスケールおよび１５Ｌスケールで生成されるＭＨＣＩ複合体の量は、それぞれ、約２．４ｍｇおよび約６０ｍｇであり、これは、１５Ｌスケールではリフォールディングごとの材料生成における２５倍の増加に対応する。これらの発見を合わせると、この研究において記載されるワークフローを使用して、ＭＨＣＩ複合体の産生および精製をスケールアップすることの実現可能性が示される。
ＨＴＰスクリーニングから特定されたＵＶペプチドを用いた６つのＭＨＣＩモノマーのスケールアップした産生およびペプチド交換分析。上述のリフォールディングおよび精製プロトコールを、ＨＴＰスクリーニングにおいて特定された条件的ＭＨＣＩリガンドを用いたＭＨＣＩ複合体の大スケール産生に適用した。６つすべての構築物のＱ－ＨＰ陰イオンクロマトグラム、およびプールした画分の対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥを、図５５Ａ～Ｆに示す。これらのリフォールドのクロマトグラムは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１（図５０Ｂ）に非常に類似しており、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて明確なＨＬＡおよびＢ２Ｍバンドがあった。それぞれのＨＬＡ対立遺伝子のプールした画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに流し、ＨＬＡおよびＢ２Ｍに対応するバンドが、高い純度で観察された（図５１Ａ）。１Ｌのリフォールドについて得られた収率％は、試料ごとに変動し、Ａ＊０２：０３、Ｂ＊１８：０１、およびＣ＊０２：０２が、８％～１１％の範囲のもっとも高い収率を有し、それに続いてＢ＊３５：０３（約５％）、Ｃ＊１４：０２（約４％）、およびＡ＊２６：０１（約２．５％）であった（図５１Ｂ）。この変動性は、アミノ酸配列の内容における差、およびリフォールディング中の凝集に対する感受性、ならびに安定な複合体を形成するペプチドの能力に起因する可能性が高い。変動性はあったものの、もっとも低い２．５％の収率でも、依然として１Ｌのリフォールドから１ｍｇの材料が産生され、これを１５Ｌのスケールにスケールすると１５ｍｇを上回ることになり得、これは、３０，０００個のテトラマー染色をカバーするのに十分である。ＬＣ／ＭＳおよびＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析を行って、これらのＭＨＣＩモノマーの品質をさらに評価し、Ｂ２ＭおよびＨＬＡが適正にペアリングしたかどうかを評価した。６つの対立遺伝子にわたるＢ２Ｍ：ＨＬＡ比のＬＣ／ＭＳ分析の結果を、図５１Ｃに示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣＩ複合体について観察されたように、これらのすべての試料について、Ｂ２Ｍ：ＨＬＡ比は、１に近かった。ＭＨＣＩ複合体を、インタクトなネイティブ状態質量分析のために、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによってさらに分析した。６つすべてのＭＨＣＩ複合体について、ＭＨＣＩピークにわたる平均分子量を、図５１Ｄに示す。６つすべての構築物の分子量は、４７．４～４８．８ｋＤａの範囲に及び、これは、十分にこれらの複合体の予測質量範囲（４７．５～４８ｋＤａ）内であった。これらの発見を合わせると、リフォールディングプロトコールおよび精製ワークフローが広く適用可能であっただけでなく、小スケールＨＴＰアッセイにおいて特定された条件的ＭＨＣＩリガンドが、スケールアップ時に安定なＭＨＣＩ複合体を形成することができたことが示される。
ＭＨＣＩモノマーのスケールアップした産生に使用することができる新規な条件的ＭＨＣＩリガンドを特定することに加えて、本発明者らはまた、これらの複合体が、ＵＶ曝露時にペプチド交換を受けて、ＭＨＣＩ複合体のＨＴＰ精製を可能にすることができることを示すことも目指した。ＵＶ曝露後の条件的ＭＨＣＩリガンドのペプチド交換を測定するためのもっとも広く使用されている方法のうちの１つは、ＥＬＩＳＡである。このアッセイは、ＵＶ曝露時のペプチド交換を示すことにおいて有益であることが証明されているが、このアッセイは、半定量的であり、交換されたペプチドの直接的な測定を提供するものでも、切断されたペプチドの定量化を可能にするものでもない。これらの制限に対処するために、本発明者らは、交換プロセス中に複合体にロードされたペプチドの直接的な定量化のための２Ｄ ＬＣ－ＭＳ分析方法を開発した。アッセイの概略図を、図５２Ａに示す。この方法の第１の工程（第１次元）は、ペプチド交換反応混合物（ＵＶへの曝露後のＭＨＣＩ複合体＋１００倍過剰モルの交換されたペプチド）を、分析用ＳＥＣカラムに注入することであり、これにより、過剰なペプチドを用いることなく試料採取バルブによるＭＨＣＩ複合体の収集が可能となる。第２の工程（第２次元）は、ＭＨＣＩピークから収集された材料のＲＰ－ＨＰＬＣへの注入である。ＲＰ－ＨＰＬＣ工程の有機相は、複合体内に含まれるＨＬＡ、Ｂ２Ｍ、およびペプチドの解離および変性をもたらし、これにより、Ａ２８０ｎｍでの吸収度の読み取りおよびＬＣ／ＭＳによるＭＨＣＩ複合体の個々の成分の分析および定量化が可能となる。ＣＭＶ ｐｐ６５エピトープを用いた対照ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１条件的ＭＨＣＩリガンドのペプチド交換の第１次元のＳＥＣクロマトグラムの例を、図５２Ｂに示す。クロマトグラムは、ＭＨＣＩ複合体に対応する１つの優勢なピークを示す。クロマトグラムＡ２８０シグナルの変動は、一貫して２．５分と３分の間で観察されており、これは、試料採取バルブの開閉に対応する。第１次元と第２次元との間には大きな圧力差があるため、この変動は、バルブの開閉時の圧力の急激な変化と関連する可能性が高い。第２次元のＨＰＬＣ工程のＡ２８０クロマトグラムの例を、図５２Ｃに示す。ＨＬＡおよびＢ２Ｍのピークは、はっきりと視認できるが、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドまたは条件的ＭＨＣＩリガンドのＡ２８０ピークは、これらがいずれのトリプトファンまたはチロシン残基も含まず、したがって本質的なＡ２８０吸収度を有さないため、観察されない。ペプチド組成を分析するために、交換ペプチドおよび切断されていない条件的ＭＨＣＩリガンドの抽出されたイオンクロマトグラムを生成した（図５２Ｄ）。予測した通り、本発明者らは、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドに対応する大きなピークを観察し、これは、ペプチド交換の成功を示す。しかしながら、非常に低いレベルのインタクトな条件的ＭＨＣＩリガンドもまた、観察された。この結果は、精製されたペプチドが、ＭＨＣＩ分子と複合体を形成する条件的ＭＨＣＩリガンドと類似の、質量の２Ｄ ＬＣ／ＭＳから持ち越された合成に由来する夾雑物を有するか、または少量の条件的ＭＨＣＩリガンドが、複合体内にあるときにＵＶ切断から保護されたかのいずれかであることを示唆する。このピークはまた、ペプチド単独が、ＭＨＣＩの不在下において切断された場合にも観察され、これが夾雑物であることを示唆する。いずれにせよ、インタクトな条件的ＭＨＣＩリガンドの相対画分は、非常に低く（約１％）、下流のテトラマー染色に対する影響は最小限のはずである。同じ分析を行って、切断された条件的ＭＨＣＩリガンドの存在を検証したところ、ピークは検出されなかった。２Ｄ ＬＣ／ＭＳアッセイを用いてペプチド交換を分析することによって、本発明者らは、ＭＨＣＩ複合体におけるペプチド含有量が、ペプチド交換プロセス中にどのように変化するかを測定することができた。本発明者らは、これが、他の従来的な方法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して定量化することができないペプチド交換に関連するパラメーターをより良好に理解するために使用することができる強力なツールであると考える。
次いで、この方法を使用して、ＨＴＰ小スケールアッセイにおいて特定された新規な条件的ＭＨＣＩリガンドを用いてスケールアップした産生ワークフローを使用して生成したＭＨＣＩ複合体を用いてペプチド交換を評価した。それぞれのＭＨＣＩ複合体について、小スケールＨＴＰスクリーニング（図４８Ｂ～Ｄおよび５４Ａ～５４Ｃ）において結合体であることが見出された４～５つのペプチド、および１つの公知の非結合ペプチドを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。ペプチドＡ０２０３－０５を用いたＨＬＡ－Ａ＊０２：０３の第１次元のＳＥＣクロマトグラムは、明確な単一のピークを示した（図５２Ｅ）。ペプチド交換された複合体の第２次元のＨＰＬＣ Ａ２８０クロマトグラムもまた、予測されるＢ２ＭおよびＨＬＡピークを示した（図５２Ｆ）。第２次元のＥＩＣ分析において、Ａ０２０３－０５ペプチドの抽出質量に対応する大きなピークが、観察された（黒色の線、図５２Ｇ）。
しかしながら、Ａ＊０２：０１およびＣＭＶ ｐｐ６５ペプチド交換に類似して、インタクトな条件的ＭＨＣＩリガンドに対応する小さなピークもまた、観察された（破線、図５２Ｇ）。この現象は、試験したすべての条件的ＭＨＣＩリガンドについても確認され、いくつかの低いレベルの夾雑物が存在し、ペプチド交換プロセス中に持ち越されたことを示す。すべての事例において、夾雑物ペプチドの全画分は、１％未満であったことは、注目に値する。公知の非結合体を用いたペプチド交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０３ ＭＨＣＩ複合体の第１次元のＳＥＣクロマトグラムを、図５２Ｈに示す。これらの条件下における全体的なピーク面積は、ペプチド交換プロセスをペプチド結合体を用いて行った場合よりも低かった（図５２Ｅ対５２Ｈ）。さらに、第２次元におけるＡ２８０ ＨＰＬＣクロマトグラムは、２つのピークを含んでいたが、全体的なピーク面積は、ペプチド結合体を使用した場合よりもはるかに低かった（図５２Ｆ対５２Ｉ）。これらのデータを合わせると、ペプチド交換を非結合体を用いて行った場合に、高い可能性でタンパク質凝集に起因して、有意な材料の喪失があったことが示唆される。
興味深いことに、ＳＥＣ実行の終了時のピーク（図５２Ｈ、保持時間約３．６分）が、試験したすべての対立遺伝子にわたって陰性対照の交換試料について一貫して観察され、本発明者らは、これが、部分的に変性したＨＬＡがカラムと相互作用することに起因すると考える。最終的に、ＥＩＣ分析において、Ａ０２０３非結合体ペプチドに対応するピークは観察されず、ペプチド交換が生じなかったことを示す（図５２Ｊ）。ペプチドが複合体と会合しなかったとはいえ、ペプチド交換で観察されたピークよりもはるかに小さいものであるが比較的顕著なＡ２８０ピークが第１次元において観察されたことは、驚くべきことであった。これらの結果は、複合体の一部が、ペプチドの不在下において会合したままであるが、それは低い品質のものであり適正にフォールディングされていない可能性が高いことを示唆する。
第１および第２次元のデータの定量化を、図５３Ａ～５３Ｆに示す。この分析において、本発明者らは、第１次元（ＳＥＣ）における交換後に回収されたＡ２８０ ＭＨＣＩピークの画分、および第２次元（ＥＩＣ）における交換されたペプチドの存在を、評価した。図５３Ａ～５３Ｆは、４～５つの陽性対照および１つの陰性対照にわたる異なるＭＨＣＩ複合体について回収されたＡ２８０ ＭＨＣＩピークの画分（非ペプチド交換対照に対する比としてプロット）を示す。無関係のペプチドを除き、試験したすべてのペプチドが、第２次元において検出された。ＨＬＡ－Ａ＊０２０３については、陽性対照結合体ペプチドの回収された画分は、０．９～１で変動し、交換ペプチドは、すべてのペプチドについて、第２次元において観察された。上述のように、陰性対照の回収された画分は、交換されたペプチドがなかったとはいえ、依然として比較的高く（約０．７６）、切断された条件的ＭＨＣＩリガンドおよび非常に低いレベルのインタクトな条件的ＭＨＣＩリガンド（１％未満）が観察された。これは、複合体が、ペプチドの不在下においてある期間、いくらかインタクトなままであるが、ペプチドの不在下におけるＨＬＡ対立遺伝子の不安定性を考慮すると適正にフォールディングされていない可能性が高いことを示唆する。
同様の結果が、Ａ＊２６：０１（図５３Ｂ）、Ｂ＊１８：０１（図５３Ｃ）、Ｂ＊３５：０３（図５３Ｄ）、およびＣ＊１４：０２（図５３Ｆ）について観察された。すべての事例において、第１次元の陽性対照と陰性対照との間のピーク面積の差は、２０～２５％未満であった。対照的に、Ｃ＊０２：０２については、陰性対照および陽性対照において、劇的な差があった（図５２Ｅ）。この試料については、公知の非結合体ペプチドをペプチド交換に含めた場合に材料の約８０％が分解した。本発明者らはこれについて正確な理由を把握していないが、ペプチドがＨＬＡ上のペプチド溝から除去されている場合に異なる対立遺伝子がＢ２Ｍに会合したままとなる能力に起因する可能性が高い。いずれにせよ、これらの結果を合わせると、本発明者らが、ＭＨＣＩペプチドのスケールアップした産生、ならびにそれに続くＭＨＣＩモノマーおよびテトラマーのＨＴＰ生成のためのペプチド交換を可能にする条件的ＭＨＣＩリガンドを特定したことが明確に示される。
結論。ＣＩ／ＩＯ療法に対する患者応答のＭＨＣＩテトラマー分析のカバレッジを改善するために、本発明者らが条件的ＭＨＣＩリガンドを特定したＨＬＡ対立遺伝子の数を拡大するためのワークフローを開発することが必要である。この計画において概説される方法は、広範なＨＬＡ対立遺伝子にわたる拡大案を提供する。このワークフローを使用して選択されたすべての条件的ＭＨＣＩリガンドが、スケールアップしたときに、比較的高い収率および高い品質の条件的ＭＨＣＩ複合体をもたらした。この研究の発見の組合せに基づいて、本発明者らは、このアプローチが、広く適用され、広範なＨＬＡ対立遺伝子にわたってＭＨＣＩモノマーおよびテトラマーのＨＴＰ生成を可能にする可能性を有し、それが、臨床においてＭＨＣＩテトラマーを使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞をモニタリングすることを可能にするために極めて重要であり得ると考える。
上記の明細書において言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に援用される。本発明の記載される方法および系の様々な修正形態および変化形態が、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているものの、特許請求された発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者には自明である本発明を実施するための記載される様式の様々な修正形態は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
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Claims (99)

  1. （ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）／リガンド複合体であって、アルファ鎖、ベータ鎖を含むＭＨＣＩ分子と、（ｉｉ）非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドであるリガンドとを含む、ＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  2. アルファ鎖が、以下の遺伝子座：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つによってコードされるアルファ鎖である、請求項１に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  3. リガンドが、８個と１１個の間のアミノ酸の長さである、請求項１に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  4. リガンドが、８個のアミノ酸の長さである、請求項３に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  5. リガンドが、９個のアミノ酸の長さである、請求項３に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  6. リガンドが、１０個のアミノ酸の長さである、請求項３に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  7. リガンドが、１１個のアミノ酸の長さである、請求項３に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  8. ＵＶ切断性アミノ酸、請求項１から７のいずれか一項に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  9. ＵＶ切断性アミノ酸が、２－ニトロフェニルグリシン（ＮＰＧ）、拡張型ｏ－ニトロベンジルリンカー、ｏ－ニトロベンジルケージドフェノール、ｏ－ニトロベンジルケージドチオール、３２ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）ケージドアニリン、ｏ－ニトロベンジルケージドセレン化物、ビス－アゾベンゼン、クマリン、シンナミル、スピロピラン、２－ニトロフェニルアラニン（２－ｎＦ）、および３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）アミノ酸アナログから選択される、請求項８に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  10. ＵＶ切断性アミノ酸が、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）－プロピオネート（ＡＮＰ）アミノ酸アナログを含む、請求項９に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  11. ＵＶ切断性アミノ酸が、リガンド内の任意の位置にある、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  12. リガンドが、配列番号１～配列番号３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  13. アルファ鎖およびリガンドが、以下のＨＬＡ対立遺伝子およびアミノ酸配列の組合せ：
    Figure 2023541807000006
    のうちのいずれか１つを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体。
  14. 主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）対立遺伝子の試験ペプチドへの結合を判定するためのペプチド交換アッセイであって、
    （ａ）試験ペプチド、ならびに（ｉ）アルファ鎖、ベータ鎖を含むＭＨＣＩ分子と、（ｉｉ）非天然紫外線（ＵＶ）切断性アミノ酸を含むペプチドであるリガンドとを含むＭＨＣＩ／リガンド複合体を含む、第１の組成物を提供することと、
    （ｂ）第１の組成物をＵＶ光に曝露して、リガンドをＵＶ切断性アミノ酸において切断することと、
    （ｃ）第１の組成物を、ある期間インキュベートして、遊離した試験ペプチド、アルファ鎖、ベータ鎖、および／またはＭＨＣＩ／第２のペプチド複合体を含む、第２の組成物を形成することと、
    （ｄ）ＭＨＣＩ対立遺伝子が、第２のペプチドに結合するかどうかを判定することと
    を含む、ペプチド交換アッセイ。
  15. ＭＨＣＩ対立遺伝子のペプチドへの結合が、第２の組成物中のＭＨＣＩ／ペプチド複合体のレベルを測定することによって判定される、請求項１４に記載のペプチド交換アッセイ。
  16. ＭＨＣＩ／第２のペプチド複合体のレベルが、第２の組成物の２次元液体クロマトグラフィー－質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）によって測定される、請求項１５に記載のペプチド交換アッセイ。
  17. ２Ｄ ＬＣ／ＭＳが、遊離した第２のペプチドを第２の組成物から除去することを含む、請求項１６に記載のペプチド交換アッセイ。
  18. 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析（ＭＳ）を行って、ＭＨＣＩと第２のペプチドとを区別することをさらに含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  19. 遊離した第２のペプチドが、サイズ排除クロマトグラフィーによる分離によって、第２の組成物から除去される、請求項１４から１８のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  20. ＨＰＬＣおよびＭＳによって判定される第２のペプチドの存在が、ＭＨＣＩが第２のペプチドに結合することができることを示す、請求項１８または１９に記載のペプチド交換アッセイ。
  21. 複数のＭＨＣＩ／リガンド複合体が、少なくとも２つの異なる試験ペプチドと組み合わされる、請求項１４から２０のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  22. 試験ペプチドが、それぞれのペプチドの予測質量に基づいて、質量分析によって特定される、請求項２１に記載のペプチド交換アッセイ。
  23. 試験ペプチドが、少なくとも１０：１（試験ペプチド：ＭＨＣＩ）の比で、第１の組成物中に存在する、請求項１４から２２のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  24. ＭＨＣＩ／リガンド複合体が、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＭＨＣＩ／リガンド複合体である、請求項１４から２３のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  25. ＭＨＣＩ／ペプチド複合体が、第１の標識をさらに含み、それによって、標識化ＭＨＣＩ／ペプチド複合体が形成される、請求項１４から２４のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  26. ペプチド交換のレベルが、
    （ａ）標識化ＭＨＣＩ／リガンドペプチド複合体を、
    （ｉ）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アクセプターに共有結合的に結合した抗ＭＨＣＩ対立遺伝子抗体を含む、抗体複合体、および
    （ｉｉ）第２の標識にコンジュゲートされたＦＲＥＴエミッターを含む、ＦＲＥＴエミッター複合体
    と接触させ、それによって反応組成物を形成すること、
    （ｂ）反応組成物中の第２の標識のＦＲＥＴ放出を検出し、それによって、ＭＨＣＩ対立遺伝子のペプチドへの結合を検出すること
    によって判定される、請求項２５に記載のペプチド交換アッセイ。
  27. 反応組成物が、少なくとも約１０時間インキュベートされる、請求項２６に記載のペプチド交換アッセイ。
  28. 組成物が、少なくとも約１５時間インキュベートされる、請求項２６に記載のペプチド交換アッセイ。
  29. 第１の標識が、ストレプトアビジンである、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  30. 抗ＭＨＣＩ対立遺伝子抗体が、抗ＨＬＡ抗体、モノボディ、または部分抗体を含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  31. 第２の標識が、ビオチンである、請求項２９に記載のペプチド交換アッセイ。
  32. 第１の標識が、ビオチンである、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  33. 第２の標識が、ストレプトアビジンである、請求項３２に記載のペプチド交換アッセイ。
  34. ＦＲＥＴアクセプターからの放出が、試験ペプチドのＭＨＣＩへの結合を示す、請求項２６から３３のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  35. ＭＨＣＩの試験ペプチドへの結合が、第２のペプチド交換アッセイによって確認される、請求項２６から３４のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  36. 第２のペプチド交換アッセイが、請求項１５から１６のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイである、請求項３５に記載のペプチド交換アッセイ。
  37. ＭＨＣＩ分子に結合する試験ペプチドの量が、ＴＲ－ＦＲＥＴによって判定される、請求項２６から３５のいずれか一項に記載のペプチド交換アッセイ。
  38. 主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）対立遺伝子の試験ペプチドへの結合を検出する方法であって、
    （ａ）試験ペプチド、ならびに（ｉ）アルファ鎖、ベータ鎖を含むＭＨＣＩ分子と、（ｉｉ）非天然紫外線（ＵＶ）切断性アミノ酸を含むペプチドであるリガンドとを含むＭＨＣＩ／リガンド複合体を含む、第１の組成物を提供することと、
    （ｂ）第１の組成物をＵＶ光に曝露して、リガンドをＵＶ切断性アミノ酸において切断することと、
    （ｃ）第２の組成物中のＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体を検出し、それによって、ＭＨＣＩ分子の試験ペプチドへの結合を検出することと
    を含む、方法。
  39. （ｃ）における検出が、対照と比べたＭＨＣＩ／ペプチド複合体のレベルを検出することを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. ＭＨＣＩ／試験ペプチド複合体のレベルが、２次元液体クロマトグラフィー－質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）によって検出される、請求項３９に記載の方法。
  41. 第２の組成物が、２Ｄ ＬＣ／ＭＳに好適な器内にある、請求項４０に記載の方法。
  42. 遊離した試験ペプチドが、第２の組成物から除去される、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 遊離した試験ペプチドが、サイズ排除クロマトグラフィーによって第２の組成物から除去される、請求項４２に記載の方法。
  44. （ｃ）における検出が、ＭＨＣＩ分子と試験ペプチドとを区別するための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析（ＭＳ）をさらに含む、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. ＭＨＣＩ結合性リガンドを特定する方法であって、
    （ａ）複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマーを、複数のベータ鎖モノマーおよびリガンドと、ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成を可能にする条件下において接触させることであって、リガンドが、非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドである、接触させることと、
    （ｂ）ＭＨＣＩ／リガンド複合体を検出し、それによって、ＭＨＣＩ結合性リガンドを特定することと
    を含む、方法。
  46. ＭＨＣＩアルファ鎖モノマーが、変性および／またはアンフォールディングされたＭＨＣＩアルファ鎖モノマーである、請求項４５に記載の方法。
  47. 接触させることが、少なくとも４８時間行われる、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. リガンドが、複数のリガンドである、請求項４５から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 複数のリガンドにおけるそれぞれのリガンドが、異なるアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 検出することが、（ｉ）ＭＨＣＩ／リガンド複合体が、固体支持体に結合した抗ＭＨＣＩアルファ鎖抗体に結合し、それによって、結合したＭＨＣＩ／リガンド複合体を形成すること、（ｉｉ）結合したＭＨＣＩ／リガンド複合体を、標識化抗ベータ鎖抗体と接触させ、それによって、結合した標識化ＭＨＣＩ／リガンド複合体を形成すること、ならびに（ｉｉｉ）結合した標識化ＭＨＣＩ／リガンド複合体を検出することを含む、請求項４５から４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. （ｉｉｉ）において検出する前に、遊離した標識化抗ベータ鎖抗体を除去することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 最適な主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）対立遺伝子－リガンドの組合せを判定するための方法であって、
    （ａ）変性条件下において精製された複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマーを提供することと、
    （ｂ）複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、および非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドを含むリガンドを組み合わせることによって、反応混合物を形成することと、
    （ｃ）ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成を可能にする条件下において、混合物をインキュベートすることと、
    （ｄ）ＭＨＣＩ／リガンド複合体が形成されたかどうかを判定することと
    を含む、方法。
  53. 複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドが、少なくとも４８時間インキュベートされる、請求項５２に記載の方法。
  54. 複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、複数のベータ鎖モノマー、およびリガンドが、約５日間インキュベートされる、請求項５２に記載の方法。
  55. 複数のリガンドがスクリーニングされ、それぞれのリガンドがアミノ酸配列を含み、それぞれのリガンドのアミノ酸配列が、互いのリガンドのアミノ酸配列とは、配列内のＵＶ切断性アミノ酸の位置のみが異なる、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 工程ｄ）が、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を行うことを含む、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. ＥＬＩＳＡが、（ｉ）反応混合物を、表面と表面にコンジュゲートした抗ＭＨＣＩアルファ鎖抗体とを含む容器に導入すること、（ｉｉ）存在する場合に、標識化抗ベータ鎖抗体がベータ鎖モノマーに結合するように、検出可能な標識を含む標識化抗ベータ鎖抗体を、容器に導入すること、（ｉｉｉ）洗浄して、未結合の標識化抗ベータ鎖抗体を除去すること、ならびに（ｉｖ）容器内の検出可能な標識の存在を検出することを含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 検出可能な標識が、ビオチンまたはペプチドタグを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 検出可能な標識が、ビオチンを含む、請求項５７に記載の方法。
  60. 工程（ｉｖ）が、ストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを容器に導入すること、およびＨＲＰ基質を添加した後に化学発光のレベルを判定することを含む、請求項５７に記載の方法。
  61. 容器が、マルチウェルプレートのウェルである、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 工程ａ）からｄ）が、少なくとも２つのリガンドについて別個に行われ、工程ｄ）が、ＭＨＣＩ／リガンド複合体形成のレベルを判定することを含み、もっとも高いＭＨＣＩ／リガンド複合体形成レベルを有するリガンドが、ＭＨＣＩ対立遺伝子の最適なＭＨＣＩ／リガンドの組合せである、請求項４５から６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドであって、配列番号１～配列番号３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、ペプチド。
  64. 試料中のペプチド交換された主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体をモニタリングする方法であって、
    （ａ）目的のペプチドを含む、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を得ることと、
    （ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、
    （ｃ）（ｂ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、目的のペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することと
    を含む、方法。
  65. 試料中のペプチド交換された主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体をモニタリングする方法であって、
    （ａ）交換可能なペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を得、複合体を、交換可能なペプチドと目的のペプチドとのペプチド交換を可能にする条件下において、１つまたは複数の目的のペプチドに曝露することと、
    （ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、
    （ｃ）（ｂ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、目的のペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することと
    を含む、方法。
  66. ＭＨＣＩと複合体を形成したペプチドのＴ細胞認識をモニタリングする方法であって、
    （ａ）目的のペプチドを含む、ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を得ることと、
    （ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を、Ｔ細胞を含む試料と接触させることと、
    （ｃ）Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体を、未結合のＭＨＣＩ複合体から分離することと、
    （ｄ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、
    （ｅ）（ｄ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、試料由来のＴ細胞によって認識されるペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することと
    を含む、方法。
  67. ＭＨＣＩと複合体を形成したペプチドのＴ細胞認識をモニタリングする方法であって、
    （ａ）交換可能なペプチドを含む主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）複合体を得、複合体を、ペプチド交換を可能にする条件下において、１つまたは複数の目的のペプチドに曝露することと、
    （ｂ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体を、Ｔ細胞を含む試料と接触させることと、
    （ｃ）Ｔ細胞が結合したＭＨＣＩ複合体を、未結合のＭＨＣＩ複合体から分離することと、
    （ｄ）ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を行うことと、
    （ｅ）（ｄ）のクロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動に続いて、ＭＨＣＩ複合体にネイティブ質量分析（ＭＳ）を行って、試料由来のＴ細胞によって認識されるペプチドを含むＭＨＣＩ複合体を特定することと
    を含む、方法。
  68. Ｔ細胞に結合したＭＨＣＩ複合体を、未結合のＭＨＣＩ複合体から分離することが、フローサイトメトリーによって行われる、請求項６６または６７に記載の方法。
  69. 試料が、生体液試料である、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 試料が、全血または血漿試料である、請求項６９に記載の方法。
  71. 試料が、１つまたは複数の合成により産生された目的のペプチドを含む、請求項６４から７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. ＭＨＣＩ複合体が、ヒトＭＨＣＩ複合体である、請求項６４から７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 試料が、ＭＨＣＩライブラリーまたはアレイ由来である、請求項６４から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体にＳＥＣを行うことを含む、請求項６４から７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. ２～１０μＬの体積、例えば、３～６μＬまたは４～５μＬの体積が、ネイティブＭＳ分析のために注入される、請求項７４に記載の方法。
  76. ネイティブＭＳが、ＳＥＣの直後に続く、請求項７４または７５に記載の方法。
  77. ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体にＣＥを行うことを含む、請求項６４から７３のいずれか一項に記載の方法。
  78. ペプチド交換されたＭＨＣＩ複合体にＣＺＥを行うことを含む、請求項６４から７３のいずれか一項に記載の方法。
  79. 交換されたペプチドが、１００μｇ／ｍＬ以下、５０～５００μｇ／ｍＬ、５０～２００μｇ／ｍＬ、１００～２００μｇ／ｍＬ、または５０～１００μｇ／ｍＬの濃度で検出可能である、請求項７７または７８に記載の方法。
  80. ２～１００ｎｌ、例えば、２～５０ｎＬ、２～１０ｎＬ、３～１０ｎＬ、または３～５ｎＬの体積が、ネイティブＭＳ分析のために注入される、請求項７７、７８、または７９に記載の方法。
  81. ネイティブＭＳが、ＣＥまたはＣＺＥの直後に続く、請求項７７～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 少なくとも１つの目的のペプチドがＭＨＣＩ複合体に交換された程度の判定および定量化を可能にする、請求項６４から８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. ネイティブＭＳが、ＭＨＣＩ複合体に結合した目的のペプチドの構造または配列を特徴づけることを含む、請求項６４から８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. ネイティブＭＳが、タンデムＭＳ（「ＭＳ／ＭＳ」）（例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、シングルイオンモニタリング（ＳＩＭ）、トリプル四重極（ＴＳＱ）、四重極／飛行時間型（ＱＴＯＦ）、四重極線形イオントラップ（ＱＴＲＡＰ）、ハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳ、飛行時間／飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）、またはタンデムインタイムＭＳ／ＭＳ）である、請求項６４から８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. ネイティブＭＳが、ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ機器へのエレクトロスプレーイオン化を含む、請求項６４から８３のいずれか一項に記載の方法。
  86. クロマトグラフィーまたは電気泳動およびネイティブＭＳが、酢酸アンモニウムまたは葉酸アンモニウムバッファーにおいて行われ、かつ／またはバッファーが、ＴＲＩＳまたはＰＢＳを含まない、請求項６４から８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチド、ＭＨＣＩアルファ鎖モノマー、およびＭＨＣＩベータ鎖モノマーを含む、キット。
  88. ＭＨＣＩアルファ鎖モノマーが、変性している、請求項８７に記載のキット。
  89. ＭＨＣＩベータ鎖モノマーが、変性している、請求項８７または８８に記載のキット。
  90. ＭＨＣＩアルファ鎖および／またはＭＨＣＩベータ鎖が、タグを含む、請求項８７から８９のいずれか一項に記載のキット。
  91. タグが、ストレプトアビジンである、請求項９０に記載のキット。
  92. 抗ＨＬＡ抗体をさらに含む、請求項８７から９１のいずれか一項に記載のキット。
  93. 抗Ｂ２Ｍ抗体をさらに含む、請求項８７から９２のいずれか一項に記載のキット。
  94. ペプチドが、配列番号１～配列番号３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項８７から９３のいずれか一項に記載のキット。
  95. （ａ）非天然ＵＶ切断性アミノ酸を含むペプチドと、
    （ｂ）複数のＭＨＣＩアルファ鎖モノマーと、
    （ｃ）複数のＭＨＣＩベータ鎖モノマーと、
    （ｄ）ＭＨＣＩ／リガンド複合体の形成を可能にすることができる第１の試薬と
    を含む、系。
  96. ＭＨＣＩアルファ鎖モノマーに結合することができる第２の試薬をさらに含む、請求項９５に記載の系。
  97. 第２の試薬が、抗ＨＬＡ抗体を含む、請求項９６に記載の系。
  98. ＭＨＣＩベータ鎖モノマーに結合することができる第３の試薬をさらに含む、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の系。
  99. 第３の試薬が、抗Ｂ２Ｍ抗体である、請求項９８に記載の系。
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