TW202219062A - 用於特性化ｍｈｃｉ肽結合的測定及試劑 - Google Patents

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俊豪 馮
溫蒂 諾爾 桑朵博
惠特利 勞倫 賓德
克雷格 布蘭奇提
沛峰 陳
馬婷 亞伯拉罕 達維許
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Abstract

本揭露涉及用於製備及檢測 MHCI/配體肽複合物之試劑及方法。

Description

用於特性化　MHCI　肽結合的測定及試劑
本申請係關於用於分析主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物的系統及方法。可使用天然質譜法、酵素連結免疫吸附測定 (ELISA)、時間解析螢光共振能量轉移 (TR-FRET) 光譜進行分析，視情況結合經由粒徑篩析層析法或毛細管電泳 (例如毛細管區帶電泳) 之 MHCI 複合物分離法。在一些實施例中，將方法應用於肽交換之 MHCI 複合物，例如，使用預期存在於患者樣品中的肽。
主要組織相容性複合物-I (MHCI) 是一種幾乎廣泛存在之蛋白複合物，其負責將抗原呈現細胞表面上之自身及外源來源之展示肽呈現至淋巴細胞。藉由 MHCI 之展示肽呈現是後天免疫反應朝破壞病變細胞或保護健康細胞的第一步。MHCI 複合物是一種非共價連接之蛋白異二聚體，其由重鏈 (α) 及輕鏈 (β 2微球蛋白，B2M) 所組成；一般而言，MHCI 複合物在沒有 8-11 個殘基展示肽配體的情況下是不穩定的。錐狀展示肽生成路徑利用將泛素化之細胞質蛋白降解成潛在展示肽的蛋白酶體。這些展示肽隨後被輸入至內質網中，在那裡其被進一步改質 (refine)，且活性 MHCI/展示肽複合物在運送至細胞表面以呈現至細胞毒性或 CD8(+) T 細胞前，係經由蛋白質伴護蛋白 (chaperone) 輔助過程形成，以辯識並確定細胞命運。
MHCI 蛋白由主要組織相容性複合物基因複合物所編碼，亦已知為人類白血球抗原 (HLA) 系統的成員。雖然總共有大約 24 個已知的 MHCI 家族成員，但是最常見的 MHCI 家族成員由 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C 基因座所編碼。每個 HLA 組包含至少幾十個或更多個等位基因，且這些等位基因的差異表現使蛋白輸出達到豐富多樣性。而且，有 ＞20,000 種不同的 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C 蛋白複合物，每一種都具有自己的穩定性及典型配體特異性。MHCI 蛋白系統的高度多樣性使整個系統能夠辯識大量可能的抗原，包括源自非人類來源的肽、轉譯後修飾之自身肽及 離體合成之肽。
治療規避性免疫標靶之所關注發展領域涉及生成用於特性化患者中之 CD8(+) T 細胞依賴性反應之先前未經特性化、未知或經設計的抗原 (包括新抗原肽序列)。然而，尚缺乏可用於生產、選擇及鑑別在 活體外具最佳MHCI 複合物：抗原 (包括新抗原) 結合之穩固、高通量方法。
本發明提供分析用於廣範圍之免疫療法之 MHCI 肽的組合物及方法。
本發明描述一種快速、高通量、多重監測測定法，以尋找潛在新抗原肽，其可能呈現在患者的 MHCI 分子上且可與 T 細胞結合，且可助於為癌症患者開發適當之治療。諸如 ELISA (酵素連結免疫吸附測定)、TR-FRET (時間解析螢光共振能量轉移) 及 2D-LC-MS (二維液相層析質譜法) 等分析法可用於分析 MHCI-肽複合物。層析法 (例如 2D-LC) 可與質譜法 (MS) 結合進行檢測。
本文所描述的方法及系統係利用天然質譜法以特性化與肽結合之 MHCI 複合物。在一些實施例中，在進行天然質譜法前，先進行粒徑篩析層析法 (SEC) 或在其他情況下先進行毛細管電泳 (CE)，例如毛細管區帶電泳 (CZE)。在一些情況下，天然質譜法可用於特性化與 MHCI 結合的肽，並確認特定肽與 MHCI 複合物為非共價結合。在一些情況下，相較於層析法 (如 SEC)，CE 還可允許用於檢測以較低濃度存在的結合肽。在一些情況下，例如與 2D-LC-MS 方法中的二維分離相比，僅以 SEC、CE 或 CZE 進行單一層析法分離，然後進行天然質譜法。在一些實施例中，相較於其他分析技術，本發明的方法亦可提供增加的通量。
在一態樣中，本發明提供主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 蛋白複合物，其包括 α 鏈、β 鏈及配體，該配體包含非天然 UV 可裂解胺基酸。
在一態樣中，本發明提供一種肽交換分析法，其藉由提供包含測試肽及 MHCI/配體複合物的第一組合物，以確定 MHCI 等位基因與測試肽之結合的，該 MHCI/配體複合物包括 (i) 包含 α 鏈、β 鏈的 MHCI 分子及 (ii) 配體，其中該配體為包含非天然紫外線 (UV) 可裂解胺基酸的肽；將該第一組合物暴露於 UV 光，以在 UV 可裂解胺基酸處裂解該配體；及將該第一組合物培育一段時間以形成包含游離測試肽、該 α 鏈、該 β 鏈及/或 MHCI/-第二肽複合物的第二組合物；並確定該 MHCI 等位基因是否與該第二肽結合。
在一態樣中，本發明提供一種確定最佳 MHCI 等位基因-配體組合的方法，該方法涉及：提供在變性條件下所純化的複數個 MHCIα 鏈單體，藉由合併該等複數個 MHCIα 鏈單體、複數個 β 鏈單體及含有非天然 UV 可裂解胺基酸的配體，以形成反應混合物，在允許形成 MHCI-配體複合物的條件下培育該反應混合物，並確定是否形成該 MHCI-配體複合物。
在一態樣中，本發明提供一種用於檢測 MHCI 等位基因與測試肽之結合的方法，該方法涉及：提供包括測試肽及 MHCI/配體複合物的第一複合物，其包括含有α 鏈、β 鏈的 MHCI 分子及配體，其中該配體為包括非天然、紫外線 (UV) 可裂解胺基酸的肽，然後將該第一複合物暴露於 UV 光下，以在 UV 可裂解胺基酸處裂解該配體，並檢測該第二複合物中的 MHCI/測試肽複合物，從而檢測該 MHCI 分子與該測試肽之結合。
在一態樣中，本發明提供鑑別 MHCI 結合配體的方法，該方法包括在允許形成 MHCI/配體複合物的條件下，將複數個 MHCI 等位基因鏈單體與複數個 β 鏈單體及配體接觸 ，其中該配體為含有非天然 UV 可裂解胺基酸的肽，並檢測該 MHCI/配體複合物，從而鑑別 MHCI 結合配體。
在一態樣中，本發明提供一種用於確定最佳主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 等位基因-配體組合的方法，該方法包括提供在變性條件下所純化的複數個 MHCIα鏈單體；藉由合併該等複數個 MHCIα 鏈單體、複數個 β 鏈單體及包含含有非天然 UV 可裂解胺基酸的配體，以形成反應混合物；在允許形成 MHCI/配體複合物的條件下培育該混合物；並確定是否形成該 MHCI/配體複合物。
在一態樣中，本發明提供含有肽的套組，該肽包含非天然UV可裂解胺基酸、MHCIα 鏈單體及 MHCIβ鏈單體。
在一態樣中，本發明提供一種系統，其含有：含有非天然 UV 可裂解胺基酸的肽；複數個 MHCIα 鏈單體；複數個 MHCIβ 鏈單體；及能夠允許形成 MHCI/配體複合物的第一試劑。
本發明進一步涉及使用粒徑篩析層析法或毛細管電泳併用天然質譜法，以監測肽交換之 MHCI 複合物的方法。
在一態樣中，本發明提供一種監測樣品中肽交換之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物的方法，其包括：(a) 獲得包含所關注肽之肽交換之 MHCI 複合物；(b) 對該肽交換之 MHCI 複合物進行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (c) 在 (b) 的層析法或毛細管電泳之後，對該 MHCI 複合物進行天然質譜法 (MS)，以鑑別包含所關注肽的 MHCI 複合物。
在一態樣中，本發明提供一種監測樣品中肽交換之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物的方法，其包括：(a) 獲得包含所關注肽之肽交換之 MHCI 複合物及在允許可交換肽與該所關注肽之間進行肽交換的條件下，將該複合物暴露至一個或複數個所關注肽；(b) 對該肽交換之 MHCI 複合物進行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (c) 在 (b) 的層析法或毛細管電泳之後，對該 MHCI 複合物進行天然質譜法 (MS)，以鑑別包含所關注肽的 MHCI 複合物。
在一態樣中，本發明提供一種監測 MHCI 複合肽之 T 細胞辯識的方法，其包括：(a) 獲得包含所關注肽之肽交換之 MHCI ；(b) 將該肽交換之 MHCI 複合物與包含 T 細胞的樣品接觸；(c) 將 T 細胞結合之 MHCI 複合物與未結合之 MHCI 複合物分開；(d) 對該肽交換之 MHCI 複合物進行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (e) 在 (d) 的層析法或毛細管電泳之後，對該 MHCI 複合物進行天然質譜法 (MS)，從該樣品中鑑別出包含被 T 細胞辯識之肽的 MHCI 複合物。
在一態樣中，本發明提供一種監測 MHCI 複合肽之T 細胞辯識的方法，其包括：(a) 獲得包含可交換肽之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物，並在允許肽交換的條件下，將該複合物暴露至一個或複數個所關注肽；(b) 將該肽交換之 MHCI 複合物與包含 T 細胞的樣品接觸；(c) 將 T 細胞結合之 MHCI 複合物與未結合之 MHCI 複合物分開；(d) 對該肽交換之 MHCI 複合物進行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (e) 在 (d) 的層析法或毛細管電泳之後，對該 MHCI 複合物進行天然質譜法 (MS)，從該樣品中鑑別出包含由 T 細胞辯識之肽的 MHCI 複合物。
相關申請的交叉引用
本申請案主張 2020 年 8 月 25 日提申的第 63/070,211 號、2020 年 9 月 29 日提申的第 63/085,113 號及 2021 年 7 月 2 日提申的第 63/218,073 號美國臨時申請案的優先權，其出於所有目的以引用方式以其全部內容併入本文。 序列表
本申請案包含序列表，該序列表已經以 ASCII 格式以電子方式提交，並以引用方式以其全部內容併入本文。該 ASCII 副本創建於 2021 年 8 月 19 日，命名為 048893-533001WO_ST25.txt，且大小為 13,352 位元組。
在閱讀本描述之後，對於熟習此項技術者而言，如何在各種替代實施例及替代應用中實施本揭示內容將變得顯而易見。然而，本文將不描述本發明之所有各種實施例。應理解，本文呈現之實施例僅以實例之方式呈現，而非限制性的。因此，各種替代實施例之此詳細描述不應解釋為限制如本文所闡述之本揭示內容的範疇或廣度。
在揭示及描述本技術之前，應理解，以下描述之態樣不限於特定組合物、製備該等組合物之方法或其用途，當然可改變。亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定態樣之目的，而無意於進行限制。
僅為了讀者之方便而將詳細描述分為多個部分，見於任何部分之揭示內容均可與另一部分中之內容組合。為了方便讀者，可在說明書中使用標題或副標題，其不意欲影響本揭示內容之範疇。
定義
除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本揭示內容所屬技術者通常所理解相同的含義。在本說明書及隨後之申請專利範圍中，將參考許多術語，該等術語應定義為具有以下含義：
如本文中所使用，任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所述範圍內的任何整數的值，以及在適當時包括其分數 (例如整數的十分之一及百分之一)，除非另有說明。
本文所使用之術語僅用於描述特定實施例之目的，而無意於進行限制。除非上下文另外明確指出，否則如本文中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該 (the)」亦意欲包括複數形式。
「視情況存在/發生的（optional）」或「視情況（optionally）」意指隨後描述之事件或情況可能發生或可能不發生，且該描述包括事件或情況發生之情形以及事件或情況不發生之情形。
術語「約」當在數字名稱、 例如溫度、時間、量、濃度等 (包括範圍) 之前使用時指示可能變化 (+) 或 (-) 10％、5％、1％ 之近似值或其間的任何子範圍或子值。較佳，術語「約」在關於一量使用時意指該量可能變化+/- 10％。
「包含（comprising/comprises）」旨在意指組合物及方法包括所列舉之要素，但不排除其他要素。當用於定義組合物及方法時，「基本上由……組成」應意指排除對於所述目的而言對組合具有任何實質意義之其他要素。因此，基本上由如本文所定義之要素組成的組合物將不排除不會實質上影響所主張之發明的基本及新穎特徵的其他物質或步驟。「由……組成」應意指排除超過痕量要素的其他成分及實質性的方法步驟。此等過渡術語之每一者定義的實施例皆落於本揭露之範疇內。
如本文中所使用，術語「癌症」係指在哺乳動物 (例如人) 中發現的所有類型之癌症、腫瘤或惡性腫瘤，包括白血病、淋巴瘤、癌瘤及肉瘤。可使用本文提供的化合物或方法治療的實例性癌症包括腦癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、前列腺癌、大腸直腸癌、胰腺癌、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、子宮頸癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、頭癌、霍奇金氏病及非霍奇金氏淋巴瘤。可用本文提供的化合物或方法治療的示例性癌症包括甲狀腺癌、內分泌系統癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、頭頸癌、肝癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、胃癌和子宮癌.另外的示例包括甲狀腺癌、膽管癌、胰腺癌、皮膚惡性黑色素瘤、大腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、浸潤性乳癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、間皮瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、原發性腦腫瘤、惡性胰腺胰島瘤、惡性類癌、尿路膀胱癌、癌前皮膚病變、睾丸癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血症、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、內分泌或外分泌胰腺腫瘤、甲狀腺髓樣癌症、甲狀腺髓樣癌、黑色素瘤、大腸直腸癌、乳頭狀甲狀腺癌、肝細胞癌或前列腺癌。
化合物之「選擇性 (selective 或 selectivity)」或諸如此類係指化合物能夠區分分子標靶 (舉例而言，化合物對 HMT SUV39H1 及/或 HMT G9a 具有選擇性)。
化合物之「特異性 (specific)」、「特異性地」、「特異性 (specificity)」或諸如此類係指化合物能夠針對特定分子標靶引起特定作用 (例如抑制) 且對細胞中之其他蛋白質具有極小作用 (舉例而言，對 HMT SUV39H1 及/或 HMT G9a 具有特異性之化合物可抑制該等 HMT 之活性，而同一化合物極小程度地抑制其他 HMT (例如 DOT1、EZH1、EZH2、GLP、MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、NSD2、SET1b、SET7/9、SET8、SETMAR、SMYD2、SUV39H2))。
本文所用之「樣品」係指意欲用於分析之任何樣品。在一些實施例中，樣品係自患者獲取。在一些實施例中，樣品為「生物流體樣品」。本文所用之「生物流體樣品」係指來自生物體或受試者的任何生物流體。實例包括全血、血漿、淚液、唾液、淋巴液、尿液、血清、腦脊髓液、胸膜滲出液及腹水。
術語「免疫反應」及諸如此類在常用及慣常意義上係指抵抗疾病之生物體反應。該反應可由先天性免疫系統或由適應性免疫系統所產生，如業內眾所周知。
術語「調節免疫反應」及諸如此類係指因投予藥劑 (例如如本文所揭示之化合物，包括其實施例) 而改變受試者之免疫反應。據此，免疫反應可因投予藥劑 (例如如本文所揭示之化合物，包括其實施例) 而活化或鈍化。
「B 細胞」或「B 淋巴球」係指業內所用之其標準。B 細胞係淋巴球中之一類白血球 (white blood cell、leukocyte)，其可發育成漿細胞 (「成熟 B 細胞」) 以產生抗體。「未成熟 B 細胞」係可發育成成熟 B 細胞之細胞。通常，祖-B 細胞發生免疫球蛋白重鏈重排而變成祖 B 前 B 細胞，且另外發生免疫球蛋白輕鏈重排而變成未成熟 B 細胞。未成熟 B 細胞包括 T1 及 T2 B 細胞。
本文所用之「T 細胞」或「T 淋巴球」係在細胞調介之免疫性中發揮核心作用的一類淋巴球 (白血球亞型)。其與其他淋巴球 (例如 B 細胞及自然殺手細胞) 之區別可在於在細胞表面上存在 T 細胞受體。T 細胞包括例如天然殺手 T (NKT) 細胞、細胞毒性 T 淋巴球 (CTL)、調控性 T (Treg) 細胞及 T 輔助細胞。可藉由使用 T 細胞檢測劑來區分不同類型之 T 細胞。
「調控性 T 細胞」或「抑制性 T 細胞」係調節免疫系統、維持自體抗原耐受性及預防自體免疫疾病之淋巴球。
胺基酸在本文中可以用它們一般已知的三個字母符號或 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission 推薦的單一字母符號來指稱。同樣地，核苷酸可用它們一般被接受的單個字母代碼來指稱。
術語「多肽 (polypeptide)」、「肽 (peptide)」及「蛋白質 (protein)」在本文中可互換使用且係指胺基酸殘基的聚合物，其中該聚合物可在實施例中與不由胺基酸組成的部分結合。該等術語適用於胺基酸聚合物，其一個或多個胺基酸殘基是對應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。「融合蛋白」涉及編碼兩個或更多個單獨蛋白質序列的嵌合蛋白，該兩個或更多個單獨蛋白質序列重組表現為單一部分。
關於胺基酸序列，熟習此項技術者將認識到，對於核酸、肽、多肽或蛋白質序列的個別取代、缺失或添加將會修改、添加或刪除編碼序列中的單一胺基酸或一小部分胺基酸，該序列為「保守修飾的變異體」，其中該改變導致胺基酸經化學類似的胺基酸取代。提供功能相似之胺基酸的保守取代表是本領域所熟知的。此類保守修飾的變異體尚有且不排除本揭露的多態變異體、種別間同系物和等位基因。
胺基酸或核苷酸鹼基的「位置」由一個數字表示，該數字基於其相對於 N-末端 (或 5’-端) 的位置依序鑑別參考序列中的每一胺基酸 (或核苷酸鹼基)。由於在確定最佳比對時必須考慮缺失、插入、截短、融合等，因此，一般而言藉由簡單從 N 端計數而確定的測試序列中的胺基酸殘基數目不一定與參考序列中其對應位置的數目相同。例如，在變異體相對於比對參考序列而具有缺失的情況下，在變異體中將不存在與參考序列中相對應缺失位點之位置處的胺基酸。在比對的參考序列中有插入的情況下，該插入將不對應於參考序列中的經編號之胺基酸位置。在截短或融合的情況下，參考序列或比對序列中可能存在不對應於對應序列中任何胺基酸的胺基酸序列。
當在編號給定胺基酸或多核苷酸序列的背景中使用時，術語「參考編號」或「對應於」涉及當將給定胺基酸或多核苷酸序列與參考序列進行比較時編號特定參考序列的殘基。
術語「胺基酸側鏈」係指含於胺基酸上之功能性取代基。舉例而言，胺基酸側鏈可為天然胺基酸之側鏈。天然胺基酸係彼等由基因代碼編碼者 (例如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸) 以及彼等隨後經修飾之胺基酸 (例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及 O-磷酸絲胺酸)。在實施例中，胺基酸側鏈可為非天然胺基酸側鏈。
術語「非天然胺基酸側鏈」係指具有與天然胺基酸相同的基本化學結構 (亦即與氫、羧基、胺基及 R 基團結合的 α 碳) 之化合物的功能性取代基， 例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸硫氧化物、磺酸甲基甲硫胺酸、烯丙基丙胺酸、2-胺基異丁酸。非天然胺基酸係天然出現或以化學方式合成之非蛋白原性胺基酸。此類類似物具有經修飾的 R 基團（例如正白胺酸）或經修飾的胜肽主鏈，但是保留了與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。
術語「UV-可裂解胺基酸側鏈」係指具有與天然胺基酸相同的基本化學結構 (亦即與氫、羧基、胺基及 R 基團結合的 α 碳) 之化合物的功能性取代基。UV-可裂解胺基酸係天然出現或以化學方式合成之非蛋白原性胺基酸。該等類似物可具有經修飾的 R 基團或經修飾的肽主鏈，但保留了與天然胺基酸相同的基本化學結構。UV-可裂解胺基酸包括但不限於 2-硝基苯基甘胺酸 (NPG)、擴展鄰-硝基苄基連接子、鄰-硝基苄基籠形酚、鄰-硝基苄基籠形硫醇、32 硝基藜蘆基氧羰基 (NVOC) 籠形苯胺、鄰-硝基苄基籠形硒化物、雙-偶氮苯、香豆素、桂醯基、螺吡喃、2-硝基苯丙胺酸 (2-nF) 及 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸 (ANP) 胺基酸類似物。
本文所提供之術語「MHCI」或「主要組織相容性複合物 I 類」或「主要組織相容性複合物 I」或「MHCI 單體」包括任一重組或天然形式之主要組織相容性複合物-1 (MHCI) 或維持 MHCI 活性 (例如與 MHCI 相比在至少 50%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 之活性內) 的其變異體或同系物。在一些方面，與天然 MHCI 多肽相比，變異體或同系物在整個序列或部分序列 ( 例如50 個、100 個、150 個或 200 個連續胺基酸部分) 中具有至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 之胺基酸序列同一性。在實施例中，MHCI 係兩種以非共價方式結合之蛋白質重鏈 (α) 及輕鏈 (β 2-微球蛋白) 的異源二聚體、其同系物或功能片段。在實施例中，MHCI 包括肽配體。
術語「HLA」或「人白血球抗原」係指由 MHC 基因複合物編碼之蛋白質群組。具體而言但不限於，MHCI 基因複合物編碼 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C 蛋白質群組。
術語「β-2 微球蛋白」或「B2M」或「β 2微球蛋白」或「β 鏈」係指細胞表面 MHCI 蛋白複合物之較小或輕鏈蛋白質。B2M 與一條 α 鏈 (重鏈) 形成異源二聚體複合物。B2M 係由 B2M 基因編碼。
術語「α 鏈」或 「阿爾法鏈」係指 MHCI 蛋白複合物之較大或重鏈蛋白質。α 鏈進一步分成次單元 α1、α2 及 α3 且含有一個跨膜螺旋。α 鏈經由 α3 次單元結合 B2M 以形成稱為 MHCI 複合物之異源二聚體。α 鏈係多型的，且主要由 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C 基因編碼，並在較小程度上由 HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K 及 HLA-L 編碼。
術語「配體」係指與生物分子形成複合物以提供生物功能之分子。結合可發生於 (但不限於) 蛋白質、肽、RNA、DNA、核酸、核酸衍生物、非天然核酸、胺基酸、胺基酸衍生物、非天然胺基酸、碳水化合物、單醣、二醣、寡醣、寡核苷酸、金屬、金屬錯合物、藥物、脂質、脂肪酸、代謝物、無機分子、有機分子、生物聚合物及聚合物之間。配體複合物可經由離子型鍵結、共價鍵結、凡得瓦 (Van der Waals) 相互作用及/或氫鍵結形成。MHCI 配體通常係肽。
本文所用之術語「結合」及「結合的」係根據其簡單及普通的含義使用且係指原子或分子之間的締合。締合可以是直接締合或間接締合。例如，結合的原子或分子可以是直接的，例如藉由共價鍵或連接子（例如第一連接子或第二連接子）；或是間接的，例如藉由非共價鍵（例如靜電相互作用（例如離子鍵、氫鍵、鹵鍵）、凡得瓦相互作用（例如偶極-偶極、偶極誘導偶極、倫敦分散）、環堆積（π 效應）、疏水相互作用等）。
術語「抗體」係指由免疫球蛋白基因或其功能性片段編碼的多肽，其特異性地結合並識別抗原。公認的免疫球蛋白基因包括 κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)、γ(gamma)、δ(delta)、ε(epsilon)及μ(mu) 恆定區基因，以及無數的免疫球蛋白變異區基因。輕鏈分為 κ 或 λ。重鏈被分類為 γ、μ、α、δ 或 ε，其依次分別定義了免疫球蛋白類別，IgG、IgM、IgA、IgD 及 IgE。
在片語「特異性地 (或選擇性地) 結合」至抗體或「特異性地 (或選擇性地) 與其發生免疫反應」提及蛋白質或肽時，其係指確定蛋白質存在的結合反應，通常係在蛋白質及其他生物製劑的異質群體中。因此，在指定的免疫測定條件下，指定的抗體與特定蛋白質的結合至少是背景的兩倍，更通常是背景的 10 到 100 倍以上。在此類條件下與抗體的特異性結合需要選擇針對特定蛋白質具有特異性的抗體。例如，可選擇多克隆抗體以僅獲得與所選抗原而非其他蛋白質發生特異性免疫反應的抗體的子集。該選擇可通過減去與其他分子交叉反應的抗體來實現。可使用各種免疫測定形式來選擇與特定蛋白質發生特異性免疫反應的抗體。例如，常規地，使用固相 ELISA 免疫測定來選擇與蛋白質發生特異性免疫反應的抗體（請參閱例如 Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) 之可用於確定特異性免疫反應性的免疫測定形式及條件的描述）。
術語「變性」係指蛋白質、多肽、DNA、RNA 或其他生物聚合物之三維結構藉由化學或機械方式或藉由加熱或冷卻破壞的過程。
「肽交換」過程係指首先形成與肽結合之 MHCI 複合物，該肽能夠代替為或交換為具有分析意義之另一肽 (例如推定新抗原肽)。在一些情形下，可藉由降低第一肽對所關注肽之結合親和力 (例如經由第一肽之化學裂解、酶促裂解或 UV-調介之裂解) 促進交換。
「新抗原」或「新抗原肽」係指可由宿主之免疫系統識別為「非自體」的肽。新抗原肽可衍生自例如腫瘤細胞中之突變蛋白。其亦可衍生自來自病毒或細菌或其他病原體之病原性蛋白質。或者，其亦可衍生自移植物，例如組織移植物或同種異體移植物或其他移植細胞。
「1D-LC」或「一維液相層析」過程係指單液相層析分離，與之相比，「2D-LC」或「二維液相層析」係指執行兩次分離之層析方法。
「粒徑篩析層析法」或「SEC」係根據固相層析介質上之大小來分離分子的層析方式，其中較大分子以不同於較小分子之速率穿過固相管柱。在一些實施例中，SEC 用於 1D-LC 過程中。SEC 亦可用於與不同分離形式 (例如反相液相層析步驟) 組合之 2D-LC 過程中，或可採用離子交換或陽離子交換或親和分離作為第二維。
「毛細管電泳」或「CE」係指使用電流使分子移經毛細管之過程。每一分子之遷移率可取決於其電荷、大小及形狀。存在若干類型之 CE，尤其包括毛細管區帶電泳 (CZE)、毛細管凝膠電泳 (CGE)、膠粒電動力學毛細管層析 (MEKC)、毛細管電層析 (CEC)、毛細管等電聚焦 (CIEF) 及毛細管等電泳 (CITP)。
本文所用之「毛細管區帶電泳」或「CZE」係指可基於不同遷移率來分離緩衝溶液中之不同分子的一類 CE。
「質譜法」或「MS」係指量測樣品中之一種或多種分子之質荷比 (m/z) 的技術。如本文所用，「串聯式 MS」或「MS/MS」係指將單個離子、多個離子或整個質量包絡 (前驅體) 移動至片段化腔室且接著將片段化產物送至質量分析儀。根據質譜儀之設計，片段化事件可能發生在單個質量分析儀之前、兩個或多個不同分析儀之間或單個質量分析儀內。
MS 分析可能有多種選擇。在一些實施例中，MS 儀器不包含四極杆。在一些實施例中，MS 儀器包含至少一個四極杆。在一些實施例中，MS 儀器包含至少 2 個四極分析儀。在一些情形下，MS 儀器包含八極。在一些實施例中，MS 儀器包含至少 3 個四極分析儀。在某些 MS 中，偵測器為離子阱、四極杆、軌道阱或 TOF。在一些實施例中，MS儀器或方法為多重反應監測 (MRM)、單一離子監測 (SIM)、三級四極杆 (TSQ)、四極杆/飛行時間 (QTOF)、四極杆線性離子阱 (QTRAP)、混合離子阱/ FTMS、飛行時間/飛行時間 (TOF/TOF)、Orbitrap 儀器、離子阱儀器、平行反應監測 (PRM)、資料相關采集 (DDA)、資料獨立采集 (DIA)、多級片段化或串聯時間 MS/MS。在一些實施例中，使用電噴霧 Orbitrap 儀器。
「天然質譜法」係對呈天然狀態之分子執行的 MS 過程，亦即，其中該分子係未摺疊或變性的。
如本文中所使用，縮寫「SEC-天然 MS」或「SEC-MS」係指 SEC 且緊接天然 MS 之過程。如本文中所使用，縮寫「CE-天然 MS」、「CZE-天然 MS」、「CE-MS」及「CZE-MS」係指毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE) 且緊接天然 MS 之過程。
術語「定量 (quantitation 或 quantitate)」在本文中意指以數值方式判定樣品中之分析物的水平或量或數量或濃度。
一般而言，本文所提及之「受試者」係測試其生物樣品中是否存在分析物的個體。在一些實施例中，該個體為人。然而，在一些實施例中，受試者還可以是另一種哺乳動物，諸如馴養或家畜物種，例如犬、貓、兔、馬、豬、牛、山羊、綿羊等，或實驗動物，諸如小鼠或大鼠。例如，哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。
如本文中所使用，「自動化」或「自動控制」過程係能夠 (例如) 藉由具有適當軟體之電腦化控制系統運行者，此不同於在至少一個步驟期間或之間需要主動人工干預的系統，諸如將含有分析物之樣品自系統的一個部件移動到另一部件的系統。
應理解，如本文所闡述之實例及實施例僅用於闡釋目的，且基於其之各種修改或改變應為熟習此項技術者所瞭解，且將包括於本申請案之精神及範圍內以及隨附申請專利範圍內。本文引用之所有出版物、專利及專利申請出於所有目的以引用之方式整體併入本文。
熟習此項技術者將理解，製備及使用本文所闡述之複合物的說明僅出於闡釋目的，且本揭露不受該闡釋之限制。
本文所論述之出版物僅由於其揭示內容先於本申請案的申請日期而提供。本文中之內容皆不應視為承認該等出版物構成隨附申請專利範圍的先前技術。本文所提及之所有出版物之所有教示內容 (包括但不限於所有組成物、組分、試劑及方法) 皆以全文引用方式併入本文中。
MHCI 組成物
在一方面，本文提供一種主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI)/配體複合物，其包括含有 α 鏈、β 鏈之 MHCI 分子及配體，其中配體為包含非天然 UV-可裂解胺基酸之肽。
在實施例中，MHCI/配體複合物含有 α 鏈，其中 α 鏈係由下列基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 或 HLA-C。在一些實施例中，α 鏈係由 HLA-A 基因座編碼。在一些實施例中，α 鏈係由 HLA-B 基因座編碼。在一些實施例中，α 鏈係由 HLA-C 基因座編碼。
在實施例中，MHCI/配體複合物含有 β-2微球蛋白域 (B2M)，其中 B2M域係由 MHCI 基因複合物編碼。
在實施例中，MHCI/配體複合物含有肽配體。在實施例中，肽配體的長度介於 8 至 11 個胺基酸殘基之間。在一些實施例中，肽配體之長度為 8 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體之長度為 9 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體之長度為 10 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體之長度為 11 個胺基酸殘基。
在實施例中，MHCI/配體複合物含有肽配體，其中肽配體含有非天然胺基酸。在一些實施例中，非天然胺基酸由 UV 輻射活化。在一些實施例中，含有非天然胺基酸之肽配體在藉由 UV 光輻照之後發生裂解。在一些實施例中，非天然胺基酸係選自 2-硝基苯基甘胺酸 (NPG)、擴展鄰-硝基苄基連接子、鄰-硝基苄基籠形酚、鄰-硝基苄基籠形硫醇、32 硝基藜蘆基氧羰基 (NVOC) 籠形苯胺、鄰-硝基苄基籠形硒化物、雙-偶氮苯、香豆素、桂醯基、螺吡喃、2-硝基苯丙胺酸 (2-nF) 及 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸 (ANP) 胺基酸類似物。在一些實施例中，非天然胺基酸為 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸 (ANP)。
在實施例中，非天然胺基酸可位於肽配體之 N-末端與 C-末端之間的任何位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之 N-末端處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第二位置 (亦即自 N-末端起之第二位置) 處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第三位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第四位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第五位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第六位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第七位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第八位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第九位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第十位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之 C-末端處。
在實施例中，肽配體為 FMYJDFHFI (SEQ ID NO.: 1)；FLPJDFFPSV(SEQ ID NO.: 2)；FLPSDJFPSV (SEQ ID NO.: 3)；FYIQMJTEL (SEQ ID NO.: 4)；YVIJDLAAM (SEQ ID NO.: 5)；HFFJWGTMF (SEQ ID NO.: 6)；AVVSLJRLLK (SEQ ID NO.: 7)；GTHJLLPFY (SEQ ID NO.: 8)；AMLTAJFLR (SEQ ID NO.: 9)；HLMFYJLPI (SEQ ID NO.: 10)；QLFJFSPRR (SEQ ID NO.: 11)；TJFFYRYGFV (SEQ ID NO.: 12)；DEFJPIVQY (SEQ ID NO.: 13)；RESFGJESF (SEQ ID NO.: 14)；TPAJYFHVL (SEQ ID NO.: 15)；AENJYVTVF (SEQ ID NO.: 16)；KEVLVLWJI (SEQ ID NO.: 17)；FMYEGJTPL (SEQ ID NO.: 18)； FPFJLAAII (SEQ ID NO.: 19)；FPIPSJWAF (SEQ ID NO.: 20)；ITAAAWYJW (SEQ ID NO.: 21)；LAVMGJAAW (SEQ ID NO.: 22)；HLPJGVKSL (SEQ ID NO.: 23)；FAAEAJKL (SEQ ID NO.: 24)；GAINSJLPY (SEQ ID NO.: 25)；FAIVPJLQI (SEQ ID NO.: 26)；FAMJVPLLI (SEQ ID NO.: 27)；ARFJDLRFV (SEQ ID NO.: 28)；ANNJRLWVY (SEQ ID NO.: 29)；YAAJTNFLL (SEQ ID NO.: 30)；ISDSAJNMM (SEQ ID NO.: 31)；WAWJFAAVL (SEQ ID NO.: 32)；MMHJSTSPF (SEQ ID NO.: 33)；或 RTFGQJLFF (SEQ ID NO.: 34)。
肽交換測定
在一方面，本文提供用於確定主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 等位基因與測試肽之結合的肽交換測定，其包括：提供第一混合物，其含有游離測試肽及含有 α 鏈、β 鏈及在序列內含有非天然、紫外線 (UV)-可裂解胺基酸之肽配體的 MHCI/配體複合物；將第一混合物暴露於 UV 光以在 UV-可裂解胺基酸處裂解肽配體；及將第一混合物培育一定時間段以形成含有第二 MHCI 複合物之第二混合物，該第二 MHCI 複合物含有 α 鏈、β 鏈及測試肽；及確定 MHCI 等位基因是否與測試肽結合。
在實施例中，與 MHCI/配體複合物相比，第一混合物中之游離測試肽的量為 1:100 至 100:1。在一些實施例中，與 MHCI/配體複合物相比，第一混合物中之游離測試肽的量為 1:10 至 10:1。在實施例中，與 MHCI/配體複合物相比，第一混合物中之游離測試肽的量為 1:1 至 100:1。在實施例中，與 MHCI/配體複合物相比，第一混合物中之游離測試肽的量為 10:1 至 100:1。在實施例中，與 MHCI/配體複合物相比，第一混合物中之游離測試肽的量為約 10:1。比率可為所提供範圍內之任何值或子範圍，包括端點。
在實施例中，藉由測量第二混合物中之 MHCI/測試肽複合物之含量來確定 MHCI 等位基因與測試肽的結合。在一些實施例中，測定中之 MHCI 複合物在第二混合物中部分地由所結合測試肽佔據 (第二混合物中之總 MHCI 複合物的一部分由測試肽結合)。在一些實施例中，MHCI 複合物在第二混合物中完全由所結合測試肽佔據 (第二混合物中之總 MHCI 複合物皆由測試肽結合)。
在實施例中，藉由第二混合物之 2 維液相層析-質譜 (2D LC/MS) 來測量 MHCI/第二肽複合物的含量。在一些實施例中，2D LC/MS 包括自第二混合物去除游離測試肽。在一些實施例中，藉由粒徑篩析層析法去除游離測試肽。在一些實施例中，藉由尺寸截留過濾去除游離測試肽。在一些實施例中，藉由透析去除游離肽。
在實施例中，使用高效液相層析 (HPLC) 及質譜 (MS) 來區分 MHCI 及測試肽之身份。在一些實施例中，在配備有粒徑篩析管柱之 HPLC (或 FPLC) 上運行第二混合物。在一些實施例中，HPLC (或 FPLC) 經配備以收集餾分。在一些實施例中， MHCI 及測試肽鑑別為溶析於同一 HPLC 餾分中。在一些實施例中，游離測試肽與游離 MHCI 及 MHCI/測試肽複合物溶析於不同餾分中。在一些實施例中，MHCI 及測試肽之共溶析指示，MHCI 能夠結合測試肽。
在實施例中，向第一 MHCI/測試肽混合物中添加一種以上之測試肽 (例如一個以上之肽序列)。在一些實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在兩種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在三種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在四種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在五種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在六種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在七種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在八種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在九種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在十種或更多種測試肽。
在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 10 - 1000 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 10 - 500 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 10 - 200 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 10 - 20 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 20 - 30 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 30 - 40 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 40 - 50 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 50 - 60 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 60 - 70 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 70 - 80 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 80 - 90 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 90 - 100 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 100 - 110 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 110 - 120 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 120 - 130 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 130 - 140 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 140 - 150 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 150 - 200 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 200 - 300 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 300 - 400 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 400 - 500 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 500 - 600 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 600 - 700 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 700 - 800 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 800 - 900 種測試肽。在實施例中，在第一 MHCI/測試肽混合物中存在 900 - 1000 種測試肽。測試肽之數量可為所提供範圍內之任何值或子範圍，包括端點。測試肽之數量僅受限於由熟習此項技術者識別為可用於交換測定中之測試肽的數量。
在實施例中，存在一種以上共溶析於 MHCI/肽複合物 HPLC 餾分中之測試肽。
在實施例中，使用質譜來鑑別第二混合物中之 MHCI 及/或測試肽的身份。在一些實施例中，質譜儀與 HPLC 串聯。在一些實施例中，首先收集 HPLC 餾分，然後藉由質譜分析。在實施例中，在 MHCI 複合物之質譜檢測之前去除游離測試肽。在實施例中，使用質譜藉由與內部標準肽進行比較來量化存在於餾分或第二混合物中之測試肽的量。
在實施例中，標記 MHCI/測試肽複合物。在一些實施例中，以螢光方式標記 MHCI/測試肽。在一些實施例中，藉由接觸經螢光標記之抗體來標記 MHCI/測試肽複合物。在一些實施例中，藉由接觸螢光抗體來標記 MHCI/測試肽複合物，其中螢光抗體為抗 HLA。在一些實施例中，藉由生物素化 α 蛋白來標記 MHCI/肽複合物。
在實施例中，藉由以下方式來確定肽交換程度：使經標記 MHCI/肽複合物與抗體複合物 (含有共價接附至螢光共振能量轉移 (FRET) 供體之抗 MHCI 等位基因抗體) 及 FRET 受體複合物 (包含與第二標記結合之 FRET 受體) 接觸，由此形成反應組成物；且檢測反應組成物中之第二標記的 FRET 發射，由此檢測穩定 MHCI 等位基因之形成，該形成係肽結合之替代量度。在一些實施例中，第一標記為抗 MHCI 抗體：抗-B2M。在一些實施例中，第一標記為螯合銪離子之抗 MHCI 抗體。在一些實施例中，MHCI/肽複合物之 α 蛋白經生物素化。在一些實施例中，生物素化 MHCI/肽複合物結合第二標記。在一些實施例中，第二標記為卵白素。在一些實施例中，第二標記為共價連接至別藻藍蛋白 (APC) 之卵白素。在一些實施例中，在存在含有第一標記及第二標記之 MHCI/肽複合物時，第一標記及第二標記具有適用於 FRET 之光譜重疊積分。在一些實施例中，FRET 供體/受體對標記包括螢光素及四甲基玫瑰紅。在一些實施例中，FRET 供體/受體對標記包括 5-({2-[(碘乙醯基)胺基]乙基}胺基)萘-1 磺酸 (IAEDANS) 及螢光素。在一些實施例中，FRET 供體/受體對標記包括 (5-((2-胺基乙基)胺基)萘-1-磺酸 (EDANS) 及 4-((4-(二甲基胺基)苯基)偶氮)苯甲酸 (Dabcyl)。在一些實施例中，FRET 供體/受體對標記包括 Alexa Fluor 488 及 Alexa Fluor 555。在一些實施例中，供體/受體對標記包括 Alexa Fluor 594 及 Alexa Fluor 647。在一些實施例中，供體/受體對標記包括銪 (Eu-穴狀化合物) 及別藻藍蛋白 (XL665)。在一些實施例中，供體/受體對標記包括鋱及螢光素。第一標記及第二標記可為業內已知之任何適宜標記對。
在實施例中，將肽交換檢測測定試劑及 MHCI/肽複合物一起培育約 1 小時至約 48 小時。在實施例中，將肽交換檢測測定試劑及 MHCI/肽複合物一起培育至少約 1 小時。在一些實施例中，將肽交換檢測測定試劑及 MHCI/肽複合物一起培育至少約 5 小時。在實施例中，將肽交換檢測測定試劑及 MHCI/肽複合物一起培育至少約 10 小時。在實施例中，將肽交換檢測測定試劑及 MHCI/肽複合物一起培育至少約 12 小時。在一些實施例中，將肽交換檢測測定試劑及 MHCI/肽複合物一起培育至少約 15 小時。在一些實施例中，將肽交換檢測測定試劑及 MHCI/肽複合物一起培育至少約 20 小時。在一些實施例中，將肽交換檢測測定試劑及 MHCI/肽複合物一起培育至少約 24 小時。培育時間可為所提供範圍內之任何值或子範圍，包括端點。
在一些實施例中，第一標記含有卵白素。在一些實施例中，第一標記含有抗 HLA 抗體。在一些實施例中，第一標記含有單體 (monobody)。在一些實施例中，第一標記含有部分抗體。在一些實施例中，第一標記含有 scFv 域。在一些實施例中，第一標記含有抗體片段。
在一些實施例中，第二標記為卵白素。
在實施例中，來自 FRET 受體之發射指示測試肽與 MHCI 複合物的結合。在一些實施例中，藉由時間解析 (TR) FRET 檢測來確定結合肽之含量。在一些實施例中，來自 TR-FRET 受體標記之訊號指示所存在 MHCI 複合物的含量。在一些實施例中，所存在 MHCI 複合物之含量指示是否存在 MHCI/肽複合物。在一些實施例中，MHCI/肽複合物含有測試肽。在一些實施例中，在兩種或更多種 MHCI 等位基因之間正規化來自 FRET 發射之訊號。在一些實施例中，在介於約 4℃ 與約 50℃ 之間的溫度下執行 TR-FRET 測定。在一些實施例中，在室溫下執行 TR-FRET 測定。在一些實施例中，在約 37℃ 下執行 TR-FRET 測定。
複合物檢測測定
在一方面，本文提供檢測主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 等位基因與測試肽之結合的方法，該方法包含：提供包含測試肽及 MHCI/配體複合物之第一組成物，該 MHCI/配體複合物包括：具有 α 鏈、β 鏈之 MHCI 分子及配體，其中配體係含有非天然紫外線 (UV)-可裂解胺基酸之肽；將第一組成物暴露於 UV 光以在 UV-可裂解胺基酸處裂解配體；及檢測第二混合物中之 MHCI/測試肽複合物，由此檢測 MHCI 分子與測試肽之結合。
在實施例中，檢測 MHCI/測試肽複合物之含量且與對照進行比較。在一些實施例中，檢測 MHCI/測試肽複合物之含量且與內部標準品進行比較。在一些實施例中，內部標準品為肽。
在實施例中，使用 2 維液相層析-質譜 (2D LC/MS) 檢測 MHCI/測試肽複合物之含量，例如如上文所闡述。在一些實施例中，將第二混合物轉移至適於藉由 2D LC/MS 分析之器皿中。在一些實施例中，在藉由 2D LC/MS 分析之前自第二混合物去除游離測試肽。在一些實施例中，在質譜分析之前藉由任何非變性管柱層析去除游離測試肽。非變性管柱層析之實例包括但不限於：粒徑篩析層析法、離子交換層析、疏水性相互作用層析、親和層析、正相層析或反相層析。在一些實施自第二混合物例中，在藉由 2D LC/MS 進行分析之前藉由粒徑篩析層析法去除游離測試肽。
MHCI 結合配體鑑別測定
在一方面，本文提供鑑別 MHCI 結合配體之方法，其包括：使複數個 MHCI α 鏈單體與複數個 β 鏈單體及配體在容許形成 MHCI/配體複合物之條件下接觸，其中配體係含有非天然 UV-可裂解胺基酸之肽；及檢測 MHCI/配體複合物，由此鑑別 MHCI 結合配體。
在實施例中，MHCI α 單體在接觸步驟之前發生變性。在一些實施例中，MHCI α 單體在接觸步驟之前未摺疊。在一些實施例中，使用胍 HCl、胍異硫氰酸酯及/或脲溶液使 MHCI α 單體變性。在一些實施例中，胍 HCl 或脲之濃度為 6M。在一些實施例中，在變性溶液中存在還原試劑。在一些實施例中，在變性溶液中存在還原試劑及氧化試劑之混合物。在一些實施例中，在變性溶液中存在緩衝試劑。在一些實施例中，在變性溶液中存在鹽。在一些實施例中，在變性溶液中存在清潔劑。在一些實施例中，自包涵體回收 MHCI α 單體。在一些實施例中，MHCI α 單體在施加至 SEC 管柱中之前發生變性。在一些實施例中，在 SEC 管柱上於變性條件下分離 MHCI α 單體。在一些實施例中，收集 MHCI α 單體並儲存於變性條件下。
在實施例中，在 B2M 存在下於再摺疊時程中再摺疊變性 α 單體。在實施例中，在 B2M 及肽配體存在下於再摺疊時程中再摺疊變性 α 單體。在實施例中，藉由在 B2M、肽配體及緩衝試劑、鹽、還原試劑、氧化試劑、相對離子、螯合劑及/或清潔劑中之任一者或多者存在下快速稀釋變性 α 鏈單體來引發再摺疊時程。在實施例中，藉由在 B2M、肽配體及緩衝試劑存在下快速稀釋變性 α 鏈單體來引發再摺疊時程。在實施例中，藉由在 B2M、肽配體及緩衝試劑以及鹽存在下快速稀釋變性 α 鏈單體來引發再摺疊時程。在實施例中，藉由在 B2M、肽配體及緩衝試劑、鹽以及還原試劑存在下快速稀釋變性 α 鏈單體來引發再摺疊時程。在實施例中，藉由在 B2M、肽配體、緩衝試劑、鹽、還原試劑及 氧化試劑存在下快速稀釋變性 α 鏈單體來引發再摺疊時程。在實施例中，藉由在 B2M、肽配體及緩衝試劑、鹽、還原試劑、氧化試劑以及相對離子存在下快速稀釋變性 α 鏈單體來引發再摺疊時程。在實施例中，藉由在B2M、肽配體及緩衝試劑、鹽、還原試劑、氧化試劑、相對離子以及螯合劑存在下快速稀釋變性 α 鏈單體來引發再摺疊時程。在實施例中，藉由在 B2M、肽配體及緩衝試劑、鹽、還原試劑、氧化試劑、相對離子、螯合劑及清潔劑存在下快速稀釋變性 α 鏈單體來引發再摺疊時程。在一些實施例中，再摺疊時程發生於 96 孔盤之孔內。在一些實施例中，再摺疊時程發生於 4℃ 下。在一些實施例中，緩衝試劑為參(羥基甲基)胺基甲烷-HCl (Tris HCl，pH 8.0)。在一些實施例中，相對離子為 L-精胺酸。在一些實施例中，還原劑為經還原麩胱甘肽。在一些實施例中，氧化試劑為經氧化麩胱甘肽。在一些實施例中，螯合劑為乙二胺四乙酸 (EDTA)。
在實施例中，MHCI α 單體、B2M 及肽配體在再摺疊溶液中接觸約 5 小時至約 5 天。在實施例中，MHCI α 單體、β 鏈單體及肽配體在再摺疊溶液中接觸至少約 12 小時、24 小時、48 小時。培育時間可為所提供範圍內之任何值或子範圍，包括端點。
在實施例中，使複數個配體與 MHCI α 及 β 鏈單體接觸。舉例而言，多個肽序列可用於複用測定形式中。
在實施例中，MHCI/肽配體複合物之檢測包括：使 MHCI/配體複合物與接附至固體載體之抗 MHCI α 鏈抗體結合，由此形成結合之 MHCI/配體複合物；使結合之 MHCI/配體複合物與經標記抗 β 鏈抗體接觸，由此形成結合之經標記 MHCI/配體複合物；及檢測結合之經標記 MHCI/配體複合物。在一些實施例中，在 MHCI/配體肽複合物檢測之前去除游離抗 β 鏈抗體。
MHCI 等位基因 - 配體組合最佳化測定
在一方面，本文提供確定最佳主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 等位基因-配體組合之方法，該方法包括：提供複數個在變性條件下純化之 MHCI α 鏈單體；藉由組合複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體 (包含含有非天然 UV-可裂解胺基酸之肽) 來形成反應混合物；在容許形成 MHCI/配體複合物之條件下培育混合物；及確定是否形成 MHCI/配體複合物。
在實施例中，將複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育至少約 5 小時至約 5 天。在實施例中，將複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育至少約 5 小時。在實施例中，將複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育至少約 10 小時。在實施例中，將複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育至少約 12 小時。在實施例中，將複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育至少約 24 小時。在實施例中，將複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育至少約 48 小時。在實施例中，將複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育至少約 72 小時。在實施例中，將複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育至少約 4 天。在實施例中，將複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育約 5 天。培育時間可為所提供範圍內之任何值或子範圍，包括端點。
在實施例中，篩選複數個配體，其中每一配體含有胺基酸序列，其中每一配體之胺基酸序列與每一其他配體之胺基酸序列之區別僅在於 UV-可裂解胺基酸在序列中的位置。
在實施例中，藉由酵素連結免疫吸附測定 (ELISA) 來確定 MHCI/配體複合物形成。在一些實施例中，ELISA 包括：將反應混合物引入容器中，該容器包括表面及與表面結合之抗 MHCI α 鏈抗體；將包含可檢測標記之經標記抗 β 鏈抗體引入容器中，從而經標記抗 β 鏈抗體結合可能存之 β 鏈單體洗滌以去除未結合之經標記抗 β 鏈抗體；及檢測在容器中是否存在可檢測標記。
在實施例中，可檢測標記包含生物素或肽標籤。在實施例中，可檢測標記包含生物素。在實施例中，藉由將卵白素-辣根過氧化物酶 (HRP) 結合物引入容器中且在添加 HRP 受質後確定化學發光值來使可檢測生物素標記可視化。在一些實施例中，容器為多孔盤。
在一些實施例中，重複檢測測定以確定一種 MHCI 複合物之兩種不同配體之間的最佳 MHCI/配體複合物形成。
在實施例中，肽含有非天然 UV-可裂解胺基酸，其中肽具有 SEQ ID NO.: 1 至 SEQ ID NO.: 34 中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 1。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 2。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 3。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 4。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 5。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 6。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 7。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 8。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 9。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 10。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 11。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 12。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 13。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 14。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 15。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 16。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 17。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 18。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 19。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 20。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 21。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 22。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 23。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 24。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 25。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 26。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 27。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 28。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 29。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 30。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 31。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 32。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 33。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 34。
天然 SEC-MS 及 CE-MS 方法
本揭露涉及使用與天然質譜偶合之粒徑篩析層析法或毛細管電泳來監測肽交換 MHCI 複合物的方法。監測樣品中之經肽交換之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物的一種實例性方法包含：(a) 獲得包含所關注肽之肽交換之 MHCI 複合物；(b) 對該肽交換之 MHCI 複合物進行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (c) 在 (b) 的層析法或毛細管電泳之後，對該 MHCI 複合物進行天然質譜法 (MS)，以鑑別包含所關注肽的 MHCI 複合物。本文中監測樣品中之經肽交換之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物的另一實例性方法包含：(a) 獲得包含所關注肽之肽交換之 MHCI 複合物及在允許可交換肽與該所關注肽之間進行肽交換的條件下，將該複合物暴露至一個或複數個所關注肽；(b) 對該肽交換之 MHCI 複合物進行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (c) 在 (b) 的層析法或毛細管電泳之後，對該 MHCI 複合物進行天然質譜法 (MS)，以鑑別包含所關注肽的 MHCI 複合物。
本文之方法亦包括例如監測 MHCI-複合肽之 T 細胞識別，該監測包含：(a) 獲得包含所關注肽之肽交換 MHCI 複合物；(b) 使肽交換 MHCI 複合物與包含 T 細胞之樣品接觸；(c) 分離結合 T 細胞之 MHCI 複合物與未結合之 MHCI 複合物；(d) 對肽交換 MHCI 複合物執行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (e) 在 (d) 之層析或毛細管電泳後，對 MHCI 複合物執行天然質譜法 (MS) 以鑑別包含由來自樣品之 T 細胞識別之肽的 MHCI 複合物。本文之方法亦包括例如監測 MHCI-複合肽之 T 細胞識別，該監測包含：(a) 獲得包含可交換肽之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物，並在允許肽交換的條件下，將該複合物暴露至一個或複數個所關注肽；(b) 將該肽交換之 MHCI 複合物與包含 T 細胞的樣品接觸；(c) 將 T 細胞結合之 MHCI 複合物與未結合之 MHCI 複合物分開；(d) 對該肽交換之 MHCI 複合物進行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (e) 在 (d) 的層析法或毛細管電泳之後，對該 MHCI 複合物進行天然質譜法 (MS)，從該樣品中鑑別出包含由 T 細胞辯識之肽的 MHCI 複合物。在一些情形下，藉由流式細胞分析技術分離結合 T 細胞之 MHCI 複合物與未結合之 MHCI 複合物。
在本文之一些方法中，樣品為生物流體樣品。在一些情形下，樣品為全血或血漿樣品。在一些實施例中，樣品包含一種或多種以合成方式產生之所關注肽。在本文之一些方法中，MHCI 複合物為人 MHCI 複合物。在本文之一些方法中，樣品係來自 MHCI 庫或陣列。
在一些實施例中，該方法包含對肽交換 MHCI 複合物執行 SEC。在一些該等情形下，注入 2-10 µL 之體積以用於天然 MS 分析，例如 3-6 µL 或 4-5 µL。在一些實施例中，天然 MS 緊跟於 SEC 之後。
在一些實施例中，該方法包含對肽交換 MHCI 複合物執行 CE。在一些實施例中，該方法包含對肽交換 MHCI 複合物執行 CZE。在一些情形下，經交換之肽可在 100 µg/mL 或更低、50-500 µg/mL、50-200 µg/mL、100-200 µg/mL 或 50-100 µg/mL 之濃度下檢測到。在該方法使用 CE 或 CZE 之一些情形下，注入之 2-100 nl 體積以用於天然 MS 分析，例如 2-50 nl、2-10 nl、3-10 nl 或 3-5 nl。在一些實施例中，天然 MS 緊跟於 CE 或 CZE 之後。
在一些情形下，本文之方法可確定及量化至少一種所關注肽已交換至 MHCI 複合物中的程度。因此，其可容許監測肽交換反應及/或確定在反應已達到其最大程度後之交換百分比或程度。
在一些實施例中，天然 MS 進一步包含特性化與 MHCI 複合物結合之所關注肽的結構或序列。在一些情形下，天然 MS 執行為串聯式 MS (「MS/MS」) (例如經由多重反應監測 (MRM)、單一離子監測 (SIM)、三階四極 (TSQ)、四極/飛行時間 (QTOF)、四極線性離子阱 (QTRAP)、混合離子阱/FTMS、飛行時間/飛行時間 (TOF/TOF) 或時間串聯式 MS/MS)。在一些情形下，天然 MS 包含電噴霧離子化至軌道阱 MS 儀器中。
在一些上述方法中，在乙酸銨或葉酸銨緩衝液中執行層析或電泳及天然 MS 及/或其中緩衝液不包含 TRIS 或 PBS。
本文之方法包括例如對樣品中之經肽交換之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物執行天然質譜法 (MS) 的方法。在一些情形下，該等方法包含：(a) 獲得包含所關注肽之肽交換 MHCI 複合物；(b) 對肽交換 MHCI 複合物執行粒徑篩析層析法 (SEC) 或執行毛細管電泳 (CE) (例如毛細管區帶電泳 (CZE))；及 (c) 在 (b) 之層析或毛細管電泳後，對 MHCI 複合物執行天然質譜法 (MS) 以鑑別包含所關注肽之 MHCI 複合物。在一些實施例中，在步驟 (b) 中使用 SEC。在一些實施例中，在步驟 (b) 中使用 CE。在一些情形下，在步驟 (b) 中使用 CZE。在一些實施例中，在 SEC、CE 或 CZE 與 MS 分析之間並不執行其他 (亦即無第二維) 層析或其他分離過程。因此，在一些實施例中，天然 MS 緊跟於 SEC、CE 或 CZE 之後而無其他洗滌、緩衝液交換或層析步驟。
本文之方法亦包括例如監測樣品中之經肽交換之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物的方法，其包含：(a) 獲得包含所關注肽之肽交換 MHCI 複合物；(b) 對肽交換 MHCI 複合物執行粒徑篩析層析法或毛細管電泳 (例如毛細管區帶電泳)；及 (c) 在 (b) 之層析或毛細管電泳後，對 MHCI 複合物執行天然質譜法 (MS) 以鑑別包含所關注肽之 MHCI 複合物。在一些實施例中，在步驟 (b) 中使用 SEC。在一些實施例中，在步驟 (b) 中使用 CE。在一些情形下，在步驟 (b) 中使用 CZE。在一些實施例中，在 SEC、CE 或 CZE 與 MS 分析之間並不執行其他 (亦即無第二維) 層析或其他分離過程。因此，在一些實施例中，天然 MS 緊跟於 SEC、CE 或 CZE 之後而無其他洗滌、緩衝液交換或層析步驟。
在上述方法之一些實施例中，部分 (a) 進一步包含對 MHCI 分子執行肽交換。舉例而言，可藉由使用可經裂解或修飾以減小其對 MHCI 結合袋之親和力 (從而致使其易於經受分析用肽之競爭) 的第一肽來促進肽交換。可例如使用第一、可交換肽來進行肽交換，該第一、可交換肽可在暴露於例如 UV 光、特定化學物質或酶時發生修飾或裂解，從而其對 MHCI 結合袋之親和力有所減小。(例如參見 Rodenko, B. 等人，「Generation of peptide-MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange,」 Nature Protocols, 1: 1120-32 (2006))。
本文之方法與各種類型之樣品及實驗背景相容。舉例而言，在一些方法中，樣品可為來自受試者之生物流體樣品。在一些方法中，樣品可為全血或血漿樣品。在一些方法中，樣品包含 T 細胞，例如 CD8+ 及/或 CD4+ T 細胞。在一些方法中，樣品包含周邊血單核細胞 (PBMC)。在其他方法中，樣品並非衍生自受試者。舉例而言，在一些方法中，樣品包含一種或多種以合成方式產生之肽以例如測試其與特定類型之 MHCI 複合物的結合。在一些方法中，可提供不同肽交換 MHCI 複合物之陣列或庫以供分析，視情況將許多不同之所關注肽與由不同 α 及 β 鏈構成的不同 MHCI 複合物混合。在一些方面，該等不同肽-MHCI 複合物可排列成包含許多樣品孔之陣列，舉例而言，每一孔包含獨特之所關注肽及/或 MHCI 複合物。以此方式，本文之方法可用於例如確定將以非共價方式與特定 MHCI 複合物結合的所關注肽。
本文之一些實施例可包括監測 MHCI 複合物以確定某些所關注肽是否由 T 細胞結合。因此，一些實施例可包含：(a) 獲得包含所關注肽之肽交換 MHCI 複合物；(b) 使肽交換 MHCI 複合物與包含 T 細胞之樣品 (例如生物流體樣品，例如全血或血漿) 接觸；(c) 分離結合 T 細胞之 MHCI 複合物與未結合之 MHCI 複合物；(d) 對肽交換 MHCI 複合物執行粒徑篩析層析法或毛細管電泳 (例如 CZE)；及 (e) 在 (d) 之層析或毛細管電泳後，對 MHCI 複合物執行天然質譜法 (MS) 以鑑別包含由來自樣品之 T 細胞識別之肽的 MHCI 複合物。舉例而言，在一些情形下，藉由螢光輔助性細胞分選 (FACS) 或流式細胞分析技術來分離結合 T 細胞之 MHCI 複合物與未結合之複合物。在一些情形下，在層析或毛細管電泳之前分離結合 T 細胞之 MHCI 複合物與不結合 T 細胞的複合物。此可容許確定 T 細胞所識別之肽-MHCI 複合物。在一些實施例中，在步驟 (b) 中使用 SEC。在其他實施例中，在步驟 (b) 中使用 CE。在一些情形下，在步驟 (b) 中使用 CZE。在一些上述實施例中，在 SEC、CE 或 CZE 與 MS 分析之間並不執行其他 (亦即無第二維) 層析或其他分離過程。因此，在一些實施例中，天然 MS 緊跟於 SEC、CE 或 CZE 之後而無其他洗滌、緩衝液交換或層析步驟。在一些實施例中，該方法之部分 (a) 進一步包含對 MHCI 複合物執行肽交換。舉例而言，可藉由使用可經裂解或修飾以減小其對 MHCI 結合袋之親和力 (從而致使其易於經受分析用肽之競爭) 的第一肽來促進肽交換。
在一些實施例中，在 MS 之前使用粒徑篩析層析法 (SEC) 來分離樣品中的分子。在其他實施例中，在 MS 之前，使用毛細管電泳來分離樣品中之分子。在上述方法之一些實施例中，毛細管電泳 (CE) 為毛細管區帶電泳 (CZE).亦可利用其他類型之 CE，尤其包括毛細管凝膠電泳 (CGE)、膠粒電動力學毛細管層析 (MEKC)、毛細管電層析 (CEC)、毛細管等電聚焦 (CIEF) 及毛細管等電泳 (CITP)。
天然 MS 分析可具有多種選擇。在一些實施例中，MS 儀器不包含四極杆。在一些實施例中，MS 儀器包含至少一個四極杆。在一些實施例中，MS 儀器包含至少兩個四極分析儀。在一些實施例中，MS 儀器包含至少三個四極分析儀。在某些 MS 中，偵測器為離子阱、四極杆、軌道阱或 TOF。在一些實施例中，MS儀器或方法為多重反應監測 (MRM)、單一離子監測 (SIM)、三級四極杆 (TSQ)、四極杆/飛行時間 (QTOF)、四極杆線性離子阱 (QTRAP)、混合離子阱/ FTMS、飛行時間/飛行時間 (TOF/TOF)、Orbitrap 儀器、離子阱儀器、平行反應監測 (PRM)、資料相關采集 (DDA)、資料獨立采集 (DIA)、多級片段化或串聯時間 MS/MS。
在一些實施例中，在不在 MS 期間顯著離子化之緩衝液中執行 SEC-天然 MS 或 CE-天然 MS (例如 CZE-MS)。在一些實施例中，在諸如乙酸銨或甲酸銨等緩衝液中執行天然 MS。在一些實施例中，並不使用離子化緩衝液 (例如 TRIS 或 PBS) 來執行天然 MS。在 SEC 或 CE 緊鄰於天然 MS 之前時，因此，在一些實施例中，SEC 或 CE 係在不在 MS 期間顯著離子化之緩衝液中執行，或在諸如乙酸銨或甲酸銨等緩衝液中執行。
在一些實施例中，經由電噴霧離子化至 Orbitrap™ MS 儀器 (例如 Thermo Exactive™ Plus EMR, ThermoFisher Scientific) 來執行天然 MS。在一些實施例中，最佳化特定 MS 參數以容許對 MHCI 肽交換複合物實施天然 MS。舉例而言，實例性參數提供於在實例章節後提供之表 1 中 (參見右兩行) 且與用於其他 SEC-MS 蛋白質分離之參數 (左兩行) 進行比較。在一些實施例中，將輔助氣體流速設定於 0-4 之值，例如 0-3 之值，例如 0-2 或 0。在一些實施例中，在輔助氣體流速為 0 下執行天然 MS。在一些實施例中，在執行 SEC-MS 時，將源內 CID 參數亦設定於零值。在一些實施例中，鞘氣體流速小於 15，例如 1-5 或 2-4。在一些實施例中，將捕集氣體壓力設定於 2-3。
在一些實施例中，本文之 CE-天然 MS 或 SEC-天然 MS 方法可證實，所關注肽實際上以非共價方式結合於 MHCI 分子之結合袋中，此乃因結合之複合物在 MS 分析期間保持締合。因此，舉例而言，本文之方法不僅可評價是否已發生肽交換，且亦可確定及量化不同所關注肽之肽交換百分比。在一些實施例中，天然 MS 分析亦容許至少部分地對所關注肽定序。與之相比，在不使用天然 MS 之其他 LC-MS 方法中，MHCI 複合物在 MS 期間發生分解，此意味著其不能用於證實相關肽實際上以非共價方式結合於 MHCI 結合袋中。
在一些實施例中，該等方法可較 2D-LC-MS 分析方法更快速地執行。其亦容許將相對較低之體積注入 MS 設備中。在本文之某些 SEC-天然 MS 方法中，可注入約 2-10 µL 之體積，例如 3-6 µL 或 4-5 µL。在本文之某些 EC-天然 MS 方法中，可注入約 2-100 nL 之體積，例如 2-50 nL、2-10 nL、3-10 nL 或 3-5 nL。在使用 CE 或 CZE 之一些該等情形下，可檢測約 100 µg/mL 之肽濃度，例如 100 µg/mL 或更低、50-500 µg/mL、50-200 µg/mL、100-200 µg/mL 或 50-100 µg/mL。
毛細管電泳方法可在一些實施例中具有其他益處。舉例而言，在一些實施例中，在使用 CZE 時，可在 1-10 分鐘內 (例如在 1-5 分鐘或 2-5 分鐘內) 執行電泳分離。在一些實施例中，與 LC-MS 方法相比，本文之 CE 方法可容許在肽交換後檢測樣品中較低濃度的特定所關注肽。在一些實施例中，可在 CE 方法中使用較小樣品體積，例如彼等將毛細管提供於晶片或柱上者。因此，舉例而言，使用一些 CE 平臺，體積。舉例而言，在一些實施例中，SEC-MS 方法並不容許檢測低於約 100 µg/mL 濃度之肽，而 CZE 方法能夠檢測低於約 100 µg/mL 濃度之肽。在一些實施例中，可藉由本文之 CE-MS 方法中檢測濃度為例如 100 µg/mL 或更低、50-500 µg/mL、50-200 µg/mL、100-200 µg/mL 或 50-100 µg/mL 之結合於 MHCI 複合物內的特定所關注肽。此潛在較高解析度可有助於挑選出特定 MHCI-抗原肽複合物。舉例而言，某些癌症之特徵可在於若干可能基因中之突變，此會潛在地產生諸多分析用新抗原 (例如最多 50 或最多 100 種可能新抗原)。在該等新抗原與大量可能之人 MHCI 複合物組合時，舉例而言，此可產生可能之數千種潛在新抗原-MHCI 組合，每一組合在肽交換後之濃度相對較低。
套組
在實施例中，套組含有包含非天然 UV-可裂解胺基酸之肽、MHCI α 鏈單體及 MHCI β 鏈單體。在一些實施例中，套組含有變性之 MHCI α 鏈單體。在一些實施例中，套組含有變性之 MHCI β 鏈單體。在一些實施例中，MHCI α 鏈及 MHCI β 鏈單體皆係變性的。
在實施例中，套組含有加標籤 MHCI α 鏈及加標籤 MHCI β 鏈。在一些實施例中，MHCI α 鏈含有標籤。在一些實施例中，MHCI β 鏈含有標籤。在一些實施例中，MHCI α 鏈及 MHCI β 鏈皆加有標籤。在一些實施例中，標籤為卵白素。
在實施例中，套組含有抗 HLA 抗體。在實施例中，套組含有抗 B2M 抗體。在實施例中，套組含有抗 HLA 抗體及抗 B2M 抗體。
在實施例中，套組含有包含非天然 UV-可裂解胺基酸之肽，其中該肽具有 SEQ ID NO.: 1 至 SEQ ID NO.: 34 中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 1。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 2。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 3。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 4。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 5。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 6。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 7。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 8。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 9。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 10。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 11。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 12。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 13。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 14。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 15。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 16。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 17。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 18。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 19。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 20。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 21。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 22。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 23。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 24。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 25。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 26。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 27。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 28。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 29。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 30。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 31。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 32。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 33。在一些實施例中，肽含有序列 SEQ ID NO.: 34。
本文之揭示內容亦涵蓋用於實施上述 SEC-天然 MS 及 CE-天然 MS 或 CZE-天然 MS 方法的套組或試劑組成物。在一些實施例中，該等套組可包括用於執行 (a) SEC、EC 或 CZE 分離、(b) 肽交換及 (c) 任何其他適用洗滌或緩衝液交換步驟之緩衝液或該等類型緩衝液中之任一者的組合。在一些實施例中，在不在 MS 期間顯著離子化之緩衝液中執行 SEC、EC 或 CZE。在一些實施例中，在乙酸銨或甲酸銨緩衝液中執行 SEC、EC 或 CZE。在一些實施例中，用於 SEC、EC 或 CZE 之緩衝液不包含 Tris 或 PBS。
本文之套組或試劑組成物亦可包括用於執行肽交換之試劑 (例如可交換肽) 及用於改良該等肽之結合親和力的任何必需試劑 (例如適當化學物質或酶)。本文之套組或試劑組成物亦可包括關於執行本文之方法或部分該等方法的說明。本文之套組或試劑組成物亦可包括可執行肽交換的 MHCI 複合物陣列或庫，例如不同人 MHCI 複合物之陣列或庫。本文之套組或試劑組成物亦可包括例如基於治病性疾病、腫瘤類型或諸如此類之推定新抗原肽的庫。
系統
在實施例中，系統含有：含有非天然 UV-可裂解胺基酸之肽；複數個 MHCI α 鏈單體；複數個 MHCI β 鏈單體；及能夠容許形成 MHCI/配體複合物之第一試劑。在一些實施例中，系統進一步含有能夠結合 MHCI α 鏈單體之第二試劑。在一些實施例中，第二試劑含有抗 HLA 抗體。在一些實施例中，系統含有能夠結合 MHCI β 鏈單體之第三試劑。在一些實施例中，第三試劑為抗 B2M 抗體。
實例
實例 1 ：高通量 MHCI 再摺疊
在變性條件下純化 MHCI α 鏈單體或使用標準變性試劑 (包括但不限於 6 M 胍-HCl、6 M 胍異硫氰酸酯或 8 M 脲) 使其變性。
一起添加變性 α 鏈、 B2M 及肽配體以供再摺疊及可溶性 MHCI/ 肽複合物形成。一實例性再摺疊方案如下：將 B2M (10 mg/L)、HLA (30 mg/L) 及肽 (10 µM) 添加至具有分別 0.5 mM 及 4 mM 經氧化麩胱甘肽及經還原麩胱甘肽之再摺疊緩衝液 (100 mM Tris (pH 8.0)、400 mM L-精胺酸及 2 mM EDTA) 中。將該等試劑以 100 µL 之最終體積添加至 96 孔盤中且在 4℃ 下培育 1-10 天之後測試複合物形成。
實例 2 ：用以鑑別用於 MHCI 再摺疊之肽的高通量 ELISA
鑑別用於 38 種不同 MHCI 複合物之含有非天然 UV 可裂解胺基酸的條件化肽配體。38 種不同 MHCI 複合物由獨特 HLA 等位基因 (α 鏈)、B2M 及含有非天然 UV 可裂解胺基酸之獨特肽組成。
用以鑑別容許適當 MHCI 再摺疊之肽的高通量酵素連結免疫吸附測定 (ELISA) ：鑑別表位結合物之一種方法係評估具有既定等位基因之 MHCI 是否可在表位存在下形成穩定的再摺疊複合物。此過程涉及混合較低濃度之變性 HLA 及 B2M 與所關注表位。在再摺疊 2-5 天之後，必須濃縮經稀釋再摺疊 MHCI 試劑、純化並特性化，其皆不適用於高通量。本文研發可在不存在純化下適當地檢測 nM 濃度之再摺疊 MHCI 的 ELISA 測定。該 ELISA 測定涉及使用生物素化偵測抗體及卵白素進行訊號放大。一實例性 ELISA 測定展示於圖 1 中。
使用 25 µL/孔之抗 HLA 小鼠 IgG1 單株抗體 (ABC W6/32, Cat # NB100-64775, Novus Biological，8 µg/mL，於 0.05 M 碳酸鈉 (pH 9.6) 中) 塗覆 384 孔 Maxisorp 盤 (Thermo, Nunc # 464718) 並在 4℃ 下培育過夜。在使用洗滌緩衝液 (具有 0.05% Tween 20 之 PBS 緩衝液) 將盤洗滌三次之後，添加 80 µL/孔之阻斷緩衝液 (PBS, 0.5% BSA, 15PPM Proclin) 並在室溫 (RT) 下培育 1 小時。然後使用洗滌緩衝液將盤洗滌三次且將 25 µL 含有 MHCI 單體與所關注肽之經稀釋樣品添加至適當孔中。將盤在室溫下培育 2 小時且藉由使用洗滌緩衝液將盤洗滌 6 次來去除未結合組分。然後藉由添加 25 µL/孔 之生物素化抗人 β2-微球蛋白 (B2M) 小鼠 IgG2a 單株抗體 (Cat# 316302, Biolegend，於測定緩衝液 (PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20, 15PPM Proclin, pH 7.4) 中，100 ng/mL) 來檢測結合之 MHCI 單體-肽複合物並在室溫下培育 1 小時。在洗滌 6 次之後，添加 25 µL/孔之於測定緩衝液中之結合辣根過氧化物酶之卵白素 (HRP-SA) 並在室溫下培育 30 min。在使用 3 次洗滌去除 HRP-SA 之後，使用過氧化物酶受質四甲基聯苯胺 (TMB, Moss Inc. cat# 1000) 引發酶促反應並在室溫下培育 15 min。使用 25 µL/孔之 1M 磷酸終止反應且在 Multiscan 分光光度計 (ThermoFisher) 上使用 620 nM參考於 450 nm 下來測量吸光度。
使用不含肽配體或不相關肽之經再摺疊 MHCI 異源二聚體複合物作為每一等位基因的陰性對照。如下列比率中所展示使樣品訊號正規化：OD450/620[樣品]/OD450/620[陰性對照]。結果提供於圖 2-5 及 7 中。
圖 2 (圖片 A 及 B) 係在 38 種不同 HLA、HLB 及 HLC 結合物中平均化之經捕獲 MHCI/B2M/肽複合物 (經由二級抗體報告基因) 之正規化 (相對於不存在肽，樣品訊號/陰性對照訊號) ELISA 訊號的條形圖圖示。圖 3 (圖片 A 及 B) 係MHCI/B2M/肽結合物中之平均化 ELISA 訊號的條形圖圖示，其展示係低捕獲抗體結合物之特定 MHCI 等位基因 (圖 A) 及在不存在肽下較為穩定之特定 MHCI/B2M 複合物 (圖 B)。圖 4 (圖片 A 及 B) 係在 UV 肽 (含有 UV-可裂解胺基酸之肽) 存在下 MHCI/B2A/UV 肽結合物中之平均化 ELISA 訊號的條形圖圖示。圖 5 展示比較 18 種不同 HLA/HLB 等位基因之擴大再摺疊純化之正規化 ELISA 結果及產率的條形圖。圖7提供基於在 ELISA 測定中具有最佳表現之肽所選擇結合每一等位基因之 UV 肽的列表。
實例 3 ：用以鑑別肽結合物之高通量時間解析螢光共振能量轉移測定
用以鑑別肽交換後之 MHCI 肽結合物的高通量時間解析 - 螢光能量轉移 (TR-FRET) 測定：鑑別表位結合物之另一方法係使用可在提供既定觸發時自複合物解離且容許肽結合物交換至 MHCI 凹槽中的條件化配體生成 MHCI 複合物。達成此目的之一種方式係使用含有 UV-可裂解非天然胺基酸的肽，從而在暴露於 UV 時該肽發生裂解且不再係結合物。在該等條件下，若在溶液中存在肽結合物，則其將與複合物結合並使複合物穩定。與之相比，在大部分情形下，若在溶液中並無肽結合物，則 HLA 及 B2M 蛋白將發生解離且 MHCI 複合物將發生分解。
為使用此系統來確定 MHCI 結合物，研發僅在 B2M 及 HLA 複合物緊鄰時提供訊號之 TR-FRET 測定。此測定使用含有 TR-FRET 供體之針對 B2M 的抗體 (抗 B2M-供體) 及卵白素，該卵白素與複合物之生物素化 HLA 組分結合且經 TR-FRET 受體標記 (卵白素-別藻藍蛋白 (SA)-受體)。若 B2M 及 HLA 複合至一起，則抗 B2M 供體及 SA-受體將在溶液中靠近以產生 TR-FRET 訊號。與之相比，若複合物發生分解，則該等試劑將均勻分佈且並無 TR-FRET 訊號。TR-FRET 測定工作流程之示意圖提供於圖 8 的圖片中。此測定適用於暴露於 UV 光後之肽交換中使用 UV 可裂解條件化配體生成的 MHCI 分子且成功地用於鑑別 MHCI 肽結合物。
將含有 UV-交換之 MHCI/肽複合物之 384 孔源盤 (Echo 合格 384 孔聚丙烯 2.0 Plus 微量盤，Labcyte PPL-0200) 在 37℃ 下培育過夜。將盤在室溫下平衡 1 小時，隨後離心。使用自動化聲學分配器 (Echo 550, Labcyte) 將源盤之每一孔以不同體積 (160 nL、80 nL、40 nL 及 20 nL) 分配至目標盤 (MAKO 1536 孔白色固體底，Aurora 微量盤，MT, USA) 的回填孔 (具有測定緩衝液) 中 4 次，總體積為 2 µL/孔且最終樣品濃度為 10、5、2.5 及 1.25 nM。將 2 µL 於測定緩衝液中之供體 (1.2 µg/mL 經銪 (Eu) LANCE-W1024-ITC 標記之 B2M) 及受體 (4.8 µg/mL Sure Light 與別藻藍蛋白結合之卵白素 (Perkin Elmer) 之混合物分配至目標盤的每一孔中。然後將目標盤離心並在室溫下培育一小時，使用配備有 HTRF 模組 (Eu 激發：337 nm，Eu 發射：615 nm；APC 發射：660/20 nm) 之 PHERAstar FSX 讀盤儀 (BMG Labtech, NC, USA) 記錄 TR-FRET 訊號。TR-FRET 原始訊號表示為相對螢光單位之比率 (RFU 比率 = (RFU[660 nm]/RFU[615 nm × 10 4])。藉由自不存在 MHCI/肽複合物下之測定混合物扣除背景訊號來計算檢測窗口。多種肽結合物之結果提供於圖 9 之圖片 A 中的條形圖中。TR-FRET 測定之相對準確度 (85% - 100%) 對 MHC 等位基因之條形圖提供於圖 9 的圖片 B 中。
基於與預測結合親和力 (使用結合預測演算法基於 Andreatta M 及 Nielsen, M. Gapped sequence alignment using artificial neural networks: application to the MHC class I system. Bioinformatics(2016) Feb 15;32(4):511-517 所計算) 之對比將肽確定為真正結合物。使用 TR-FRET 及 2D LC/MS 測定來鑑別肽結合物及相應 MHCI 等位基因。將肽序列提交至預測演算法，且向每一序列指派百分等級。2 或更小之百分等級可視為結合物。圖 12 展示自 TR-FRET 及 LC-MS 計算之真正結合物 % 及演算法生成之百分等級的對比。僅虛線左側之肽由演算法預測為結合物。
六個代表性 TR-FRET 實驗展示於圖 10 及圖 11 中。圖 10 展示比較含有 MHCI HLA*03:01 之複合物之肽結合物及非結合物的對比性 DSF 光譜。在低溫 (20℃) 下，存在結合肽之複合物的相對螢光 (RFU) 較低，且不結合肽之複合物的相對螢光較高。肽結合物 DSF 光譜展示類似之 Tm 溫度範圍，而非結合物則具有較低 Tm。圖片 B 係肽結合物 (黑色) 及非結合物 (灰色) 之總數對 Tm 溫度的條形圖。圖片 C 係肽結合物 (黑色) 及非結合物 (灰色) 之總數對 RFU 值的條形圖。圖 10 展示比較含有 MHCI HLA*08:01 之複合物之肽結合物及非結合物的對比性 DSF 光譜。在低溫 (20℃) 下，存在結合肽之複合物的相對螢光 (RFU) 較低，且不結合肽之複合物的相對螢光較高。肽結合物 DSF 光譜展示類似之 Tm 溫度範圍，而非結合物則具有較低 Tm。圖片 B 係肽結合物 (黑色) 及非結合物 (灰色) 之總數對 Tm 溫度的條形圖。圖片 C 係肽結合物 (黑色) 及非結合物 (灰色) 之總數對 RFU 值的條形圖。圖 10 及圖 11 中之圖片 D 係 4 種不同 MHCI 等位基因之測定準確度 % (在圖 10 中皆 ＞90%，或在圖 11 中為 60 - 85%) 的條形圖圖示。
實例 4 ：用以鑑別肽結合物之 LC-MS 測定
用以鑑別 MHCI 肽結合物之 2D LC-MS 測定：研發此測定以在 MHCI 試劑之肽交換過程之後鑑別肽結合物。肽交換過程之基於質譜之分析依賴於在分析之前首先分離 MHCI 複合物與溶液中的游離肽。此將需要複雜之前期純化且並不適用於高通量分析。研發 2D LC-MS 分析方法，其中首先在 SEC 管柱上運行樣品且然後僅將對應於 MHCI 複合物之峰注於第二 HPLC 管柱中以供質譜分析。此容許在單一步驟中完成 MHCI 試劑之分析。此過程可用於一次鑑別單一肽結合物或鑑別較大肽池內之結合物。圖 13 提供肽交換及鑑別測定之示意圖。
簡言之，將 2-3 µg MHCI/肽混合物注於儀器上並傳輸至第一維管柱。第一維 LC 方法採用分析型粒徑篩析管柱 (SEC) (Agilent AdvanceBio SEC 300Å, 2.7 µm, 4.6 × 15 mm) 來分離完整複合物與過量肽，其中在 0.7 mL/min 之等梯度流速下於 25 mM Tris (pH 8.0)、150 mM NaCl 中運行 10 min 且在 280 nm 下獲取訊號。採樣閥會收集溶析於 1.90 - 2.13 min 之間之體積為 160 µL 的全部複合物峰且將其注於第二維反相管柱 (Agilent PLRP-S 1000 Å, 8 µm, 50 × 2.1 mm) 上。使用 在 4.7 min 內 5-50% 移動相 B 之梯度在 0.55 mL/min 下來運行第二維管柱且將管柱加熱至 80℃。移動相 A 為於水中之 0.05% TFA。移動相 B 為於乙腈中之 0.05% TFA。將管柱溶析劑傳輸至 Agilent 6224 TOF LC-MS 中以供質譜資料獲取。
使用第一維中之 MHCI/肽複合物峰面積及第二維中之肽質譜檢測來確定成功肽結合。在肽交換反應期間於裂解條件化配體之後肽在複合物中之成功結合可穩定複合物，且幾乎完全回收第一維 SEC 分析中所測量之起始複合物。然後可在第二維中檢測交換至複合物中之肽，其中在變性條件下使用質譜分析運行複合物以直接檢測所關注肽。在肽不能結合及穩定複合物時，不成功肽交換反應會在裂解條件化配體之後產生去穩定複合物。此可測量為複合物在 SEC 上之 A 280峰面積的減小及在第二維中不存在肽 (SEC 層析圖之實例可參見圖 6 中之層析圖的最左邊左一組)。在一些情形下，未觀察到峰面積減小；然而，並未藉由質譜檢測到肽。少量肽不能藉由第二維層析管柱及方法捕獲。在該等情形下，在亦使用肽結合之陽性對照及陰性對照時，峰面積回收率足以確定成功交換。
HLC*08:01 之肽交換時程的一組代表性層析圖展示於圖 6 中。第一組層析圖係在再摺疊時程之後於粒徑篩析管柱上運行複合物混合物的結果，其中含有 MHCI/肽之峰以灰色突出顯示於每一層析圖中 (1D: SEC)。收集此峰之內容物，並注於配備有反相管柱之第二 HPLC 上。第二組層析圖展示複合物峰之含量，且藉由質譜確定峰組分之身份。確定存在於複合物中之肽的序列，且序列重疊展示於來自反相層析圖之所鑑別肽峰之相應提取離子層析圖 (EIC) 的放大插圖中。圖 14 展示作為每一等位基因之交換物或非交換物之 10 種肽的代表性驗證圖片，其展示為多種肽與 MHCI/B2M/UV-肽複合物隨時間之交換 % 的繪圖，如藉由 2-D LC/MS 所測量。
MHCI/UV-可裂解肽複合物可在 40 種肽之池存在下進行 UV-光暴露/肽交換測定，如圖 15 中所展示。藉由 1) SEC 及 2) LC-MS 在不同時長 (例如介於 5 小時與 10 小時之間，40 min 增量) 下運行自交換時程收集之樣品，藉由 LC-MS 測量來自藉由 SEC 分離之複合物峰之肽的身份及強度。該繪圖展示在與 MHCI HLA-A*01:01 之交換反應中 10 種肽隨時間的強度。在此實例性運行中，40 種肽之池中總共 25% 或 10 種肽可確定為真正結合物。
實例 5 ： MHC 正規化計算
除非另外指示，否則所有資料分析皆係使用 Genedata 及 Spotfire V7.8 來實施。
對於所執行之所有 MHC 篩選而言，使用基於對照之正規化來確保樣品訊號與基於每一等位基因之不含肽之 MHC 的相對對比且表示為 Δ F (%)。使用下列方程式計算 Δ F 的百分比： Δ F % (dF) = (RFU 原始 [pMHC] - RFU 原始 [陰性對照])/ RFU 原始 [陰性對照] × 100 其中 RFU 原始 [陰性對照] 為來自不含肽之 MHC 單體之孔之 660 nm/615 nm 的 TR-FRET 訊號比，其定義特定等位基因之命中選擇的最小訊號；RFU 原始 [pMHC] 為來自載有肽之 MHC 單體之孔之 660/615 的 TR-FRET 訊號比。
對於等位基因中之命中選擇而言，如下所述自正規化訊號 (dF) 來計算穩健 Z 分數 (RZ)： RZ 分數 = ([樣品] -中值 [所有樣品])/MAD 其中 [樣品] 及中值 [所有樣品] 分別為樣品之 ΔF 值及每一 384 孔盤中之所有樣品的中值。MAD 為每一 384 孔盤中之所有樣品的中值絕對偏差。
為評估 HTS 測定性能，使用下列方程式自陽性對照及陰性對照之訊號 (RFU 原始) 來計算 Z’ 因子： Z’ = 1- {(3σ RFU[pos] + 3σ RFU[neg])/|µ RFU[pos] - µ RFU[neg]|} 其中 σ [pos] 及 σ [neg] 為標準偏差且 µ [pos] 及 µ [neg] 分別為陽性對照及陰性對照之平均值。對於 RZ’ (穩健 Z’)。使用中值絕對偏差 (MAD) 及中值代替標準偏差及平均值。
實例 6. 天然 SEC-MS
使用 UltiMate™ 3000 RSLC 系統 (Thermo Fisher Scientific) 將 MHCI 蛋白注於加熱至 30℃ 之 ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 管柱 (200 Å, 1.7 µm, 4.6 mm × 150 mm, Waters Corporation) 上。使用二元幫浦以 50% 溶劑 B 之等梯度梯度形式在 300 µL/min 之流速下經 10 min 來遞送溶劑 A (水) 及溶劑 B (100 mM 乙酸銨，pH 7.0)。經由電噴霧離子化至 Thermo Exactive™ Plus EMR Orbitrap™ 儀器 (Thermo Fisher Scientific) 中使用用於資料獲取之下列最佳化參數來在線分析經分離蛋白質：ESI 源中之鞘氣體流速 4 及輔助氣體流速 0；4.0 kV 噴霧電壓；320℃ 毛細管溫度；200 S-lens RF 位準；350 - 10,000 m/z 掃描範圍；去溶劑化，源內 CID 0 eV, CE 0；m/z 200 下之解析度 8,750；正極性；10 個微掃描；3 × 106 個 AGC 標靶；固定 AGC 模式；0 平均化；50 ms 最大 IT；25 V 源 DC 偏移；8 V 注入扁平極 DC；7 V 扁平極間透鏡；6 V 彎曲扁平極 DC；0 V 轉移多極 DC 調諧偏移；0.8 V C-形離子阱入口透鏡調諧偏移；及設定為 3 之捕集氣體壓力。(參見表 1 及 2)
使用 PMI Intact Mass™ 軟體 (Protein Metrics Inc.) 在下列參數下分析所獲取質譜資料：1,500 - 6,000 m/z範圍；0.2 電荷向量間隔；15 m/z 基線半徑；0.02 m/z 平滑西格瑪；0.04 m/z 間隔；3 質量平滑西格瑪；0.5 質量間隔；10 最大迭代；及 5 - 100 電荷數範圍。相對量化係基於每一個別峰之強度對反褶積光譜中之總強度。
實例 7 ：天然 CZE-MS
在天然 CZE-MS 分析之前，使用 Zeba™ 96 孔旋轉去鹽盤 (Thermo Scientific) 緩衝液-交換 MHCI 蛋白。首先將去鹽盤平衡至室溫且然後在 1,000 × g 下離心 2 min 以去除儲存緩衝液。使用 250 µL 50 mM 乙酸銨 (pH 7.0) 藉由在 1,000 × g 下離心 2 min 來將樹脂洗滌 4 次。在每一旋轉之後將洗滌盤排空且然後更換為樣品收集盤。將樣品添加於樹脂上並在 1,000 × g 下離心 2 min。
使用 ZipChip™ 系統 (908 Devices Inc.) 將經緩衝液-交換之 MHCI 蛋白注於 HS 晶片 (908 Devices Inc.) 上。使用 ZipChip™ 自動採樣儀來遞送含有異丙醇、組胺酸、乙酸銨及二甲基亞碸之蛋白質複合物背景電解質 (BGE) 溶液 (pH 6.5)。使用下列參數最佳化最終 ZipChip™ 方法：500 V/cm 場強；3 nL 注入體積；0.5 min 壓力輔助性開始時間；2 min 複製延遲；及 3 min 分析時間。經由電噴霧離子化至 Thermo Exactive™ Plus EMR Orbitrap™ 儀器 (Thermo Fisher Scientific) 中使用用於資料獲取之下列參數來在線分析經分離蛋白質：ESI 源中之鞘氣體流速 2 及輔助氣體流速 0；0 kV 噴霧電壓；250℃ 毛細管溫度；200 S-lens RF 位準；1,500 - 6,000 m/z 掃描範圍；去溶劑化，源內 CID 75 eV, CE 0；m/z 200 下之解析度 17,500；正極性；3 個微掃描；3 × 10 6個 AGC 標靶；固定 AGC 模式；0 平均化；20 ms 最大 IT；15 V 源 DC 偏移；9 V 注入扁平極 DC；8 V 扁平極間透鏡；10 V 彎曲扁平極 DC；0 V 轉移多極 DC 調諧偏移；0 V C-形離子阱入口透鏡調諧偏移；及設定為 2 之捕集氣體壓力。(參見表 1 及 2)。
使用 PMI Intact Mass™ 軟體 (Protein Metrics Inc.) 在下列參數下分析所獲取質譜資料：1,500 - 6,000 m/z範圍；0.2 電荷向量間隔；15 m/z 基線半徑；0.02 m/z 平滑西格瑪；0.04 m/z 間隔；3 質量平滑西格瑪；0.5 質量間隔；10 最大迭代；及 5 - 100 電荷數範圍。相對量化係基於每一個別峰之強度對反褶積光譜中之總強度。
實例 8 ：肽交換過程： CZE-MS 前
藉由使用含有 UV-可裂解、非天然胺基酸之高親和力、合成肽再摺疊 HLA 及 B2M 次單元來產生 UV-MHCI。在 UV 暴露後，肽發生裂解，從而致使其失去其親和力且容許其與過量患者預測性表位肽交換以形成肽交換 MHCI (pMHCI)。然後將肽-交換 MHCI 組裝成用於 T 細胞染色之四聚體以供免疫反應監測。為驗證非共價、完整形式之肽交換，首先使用濃度大於 1 μg/μl 之 UV-MHCI 樣品評估天然條件下的 SEC-MS。UV-MHCI 之 SEC-MS 分析成功地證實了該等非共價複合物的穩定性。在 UV 處理之前，僅觀察到完整 UV-MHCI 複合物。在 UV 處理之後，複合物發生分解且所觀察主要質量峰為 HLA 及 B2M 次單元。然而，UV-MHCI 之檢測限值低於 0.3 μg，從而致使在使用所關注肽飽和之後 50 ng/μl 之肽交換 MHCI 不適於驗證肽交換。為規避靈敏度限制且同時維持天然質譜法之分析能力，代之以藉由 CZE 使用 ZipChip™ CZE 系統來檢測及分析該等肽。
實例 9 ：條件化 MHCI 配體之高通量鑑別及條件化 MHCI 複合物之擴大產生
本文研發能夠鑑別及驗證含有非天然 UV 可裂解胺基酸之肽 (條件性 MHCI 配體) 的新穎工作流程，該等肽在多種 HLA 等位基因中形成用於經由肽交換來高通量 (HTP) 地生成 MHCI 單體及四聚體之穩定 MHC 複合物。藉由形成穩定再摺疊 MHCI 複合物來篩選免疫表位資料庫 (IEDB) 中所鑑別之已知肽結合物且經由 ELISA 測定來檢測 MHCI/肽複合物。使用來自初始 ELISA 篩選之最高性能肽來設計條件化 MHCI 配體。然後在同一 ELISA 測定中評估條件化 MHCI 配體且選擇性能排名居前者進行擴大產生。研發能夠使用 HLA-A*02:01 等位基因之已知條件化 MHCI 配體進行大規模產生 (15 L) 的新穎 MHCI 純化及生物素化方案，該方案可在單一再摺疊產生運行中產生 ＞ 60 mg MHCI。亦使用次世代分析技術來特性化再摺疊複合物，該等技術包括 LC/MS、SEC-MALS 及 2D LC/MS。應用最佳化再摺疊產生方案及次世代分析技術以生成具有 ELISA 篩選中所鑑別條件化 MHCI 配體之 MHCI 複合物，且發現可適當地再摺疊並具有較高之純度及品質。最後，使用經驗證肽結合物使用 2D LC/MS 來評估使用新條件化 MHCI 配體生成之 MHCI 複合物之 UV 暴露後的肽交換程度。在肽結合物存在下於 UV 暴露後，針對所有條件化 MHCI 配體皆觀察到成功肽交換。該等組合結果證實，可使用此研究中所闡述之工作流程來鑑別新 HLA 等位基因的條件化 MHCI 配體。此方式可廣泛應用且使得能夠在較寬範圍之 HLA 等位基因中 HTP 生成 MHCI 單體及四聚體，此對於使得能夠在臨床中使用 MHCI 四聚體來監測新抗原特異性 T 細胞至關重要。
在過去 10 年，癌症新抗原之主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 呈現已成為免疫系統可控制腫瘤生長之關鍵作用模式。因新抗原特異性 T 細胞可用於殺死腫瘤，故學術界及生物技術中之大量資源已致力於研發擴大癌症免疫性週期且改良新抗原特異性 T 細胞反應之量級及廣度的臨床活性藥物，包括查核點抑制劑、細胞激素、TNF 超家族激動劑、癌症疫苗及免疫調節劑。儘管已進行該等藥物研發嘗試，但極有限之工具可用於監測治療對新抗原特異性 T 細胞反應 (T 細胞表型、T 細胞量級及廣度、表位擴散等) 的影響。
追蹤 T 細胞反應之最常用方法為 ELISPOT 及 MHC 四聚體染色。ELISPOT 測定係測量在使用抗原刺激 PBMC 細胞時 T 細胞之細胞激素釋放的功能測定。此測定之優點在於，其不依賴於等位基因及新表位 (亦即僅需已知新抗原) 且其為功能讀出。該測定之缺點在於，其係半定量的且及不能評價 T 細胞表型，T 細胞表型對於理解關於生成保護性免疫反應之重要因子至關重要。基於 MHCI 四聚體之檢測利用經由卵白素結合多聚合成四聚體之重組 MHCI 單體作為新抗原特異性 T 細胞染色試劑。此方法容許對多種特異性以及表型標記物進行染色。MHCI 四聚體亦容許定量分析新抗原特異性 T 細胞之確切數量及其在治療過程期間的可能變化方式。因此，在許多方面，基於 MHCI 四聚體之檢測可更詳細地理解治療對新抗原特異性 CD8+ T 細胞反應的效應。
儘管 MHCI 四聚體檢測具有該等優點，但此方式不能廣泛用作臨床項目中之生物標記物策略，此乃因存在與生成試劑有關之難題。MHCI 四聚體需要耗時及困難之多日再摺疊過程，包括用於試劑生成之多個層析步驟。另外，新抗原型態對於每一患者而言較為獨特且需要許多患者特異性 MHCI 四聚體方能獲得既定患者中之 T 細胞情景的完整圖片。另外，HLA 等位基因係高度多型的 (存在近 20,000 種 HLA I 類等位基因)，且每一人具有 6 種不同 HLA 等位基因。因此，新抗原特異性 T 細胞反應之基於 MHCI 四聚體之檢測需要啟用個性化 MHCI 四聚體平臺，該平臺不可能使用傳統 MHCI 生成方案。
為解決該等限制，Rodenko 等人研發了生成 MHCI 單體及四聚體之快速高通量 (HTP) 方法。此方法涉及生成具有 UV-可裂解肽之 MHCI 複合物，該肽以高親和力 (在完整時) 及低親和力 (在裂解時，條件性 MHCI 配體) 進行結合。當在所關注高親和力肽結合物存在下培育使用條件化 MHCI 配體組裝之 MHCI 複合物 (條件性 MHCI 複合物) 時，此功能性使得能夠在 UV 暴露後發生肽交換。可大規模地再摺疊既定 HLA 等位基因之條件化 MHCI 複合物，且最終使用者可然後將條件化 MHCI 配體交換為任何其他所關注肽。本發明突破性地使得能夠在臨床中使用個性化 MHCI 四聚體來監測新抗原特異性 T 細胞。然而，條件化 MHCI 配體對每一 HLA 等位基因具有特異性且必須重新鑑別。據所知，僅公開用於 24 種 HLA 等位基因之條件化 MHCI 配體。儘管該等等位基因係一些最常見者，但諸多不同患者中之新抗原覆蓋範圍仍極小。因此，需要研發使得能夠擴大等位基因覆蓋範圍之工作流程。
另外，再摺疊或肽交換後之 MHCI 複合物分析性驗證利用有限數量的分析技術，包括 ELISA 測定及凝膠電泳。儘管該等技術已證實可用於確定 MHCI 複合物是否存在及用於親和力及穩定性之半定量分析，但使用此類分析不能捕獲若干其他重要參數，例如 HLA:B2M 比率、聚集、氧化狀態及天然條件分析。存在用以評估該等參數之若干蛋白質分析工具 (包括液相層析/質譜 (LC/MS)、2D LC/MS 及粒徑篩析層析法-多角度光散射檢測 (SEC-MALS))，但極少應用該等工具來特性化再摺疊或肽交換後之 MHCI 複合物。
研發容許鑑別及驗證形成穩定條件化 MHCI 複合物之條件化 MHCI 配體及 HLA 等位基因之新組合的實驗工作流程。研發 ELISA 測定且驗證穩定條件化 MHCI 複合物之檢測。首先在 6 種 HLA 等位基因 (A*02:03、A*26:01、B*18:01、B*35:03、C*02:02、C*14:02) 中篩選免疫表位資料庫及分析 (IEDB) 中所報導之 5 種公開肽結合物，且基於排名居前之結合物來設計條件化 MHCI 配體。然後在 ELISA 測定中篩選條件化 MHCI 配體，且選擇性能排名居前者進行擴大產生。對於 MHCI 產生而言，研發新穎 MHCI 純化及生物素化方案且使用次世代分析技術來證實所生成複合物之品質。應用最佳化方案及分析技術來產生及特性化使用新鑑別條件化 MHCI 配體所生成之條件化 MHCI 複合物。使用 2D LC/MS 利用經驗證肽結合物來評估 UV 暴露後之肽交換程度。因此，研發經驗證工作流程來鑑別用於可廣泛應用之新 HLA 等位基因的條件化 UV 肽以極大地擴大 HLA 等位基因覆蓋範圍，此對於使得能夠在臨床中使用 MHCI 四聚體來監測新抗原特異性 T 細胞至關重要。
蛋白質表現及純化。在大腸桿菌 (E. coli) 中過度表現重組 HLA 及 B2M，自包涵體純化，並在 -80℃ 下儲存於變性緩衝液 (6M 胍 HCl、25 mM Tris (pH 8)) 中。在誘導表現之後，將 B2M 及 HLA 生質顆粒以 5 mL/g 再懸浮於裂解緩衝液 (PBS+1% Triton X-114) 中並在 1000 巴下於微細流體均質機中均質化兩次。然後將均質化懸浮液在超離心器中於 30000 g 下旋轉 20 min。收集顆粒，使用 500 mL 於 PBS 中之 0.5% Triton X-114 洗滌並在 30000 g 下離心 20 min。如上所述再次收集顆粒並再次洗滌。將經純化包涵體以 10 mL/g 之濃度溶於變性緩衝液 (20 mM MES (pH 6.0)、6M 胍 HCl) 中並在 4℃ 下攪拌過夜。將所溶解顆粒在 40000 g 下離心 60 min 且收集上澄液，並經由 0.22 µ 過濾器過濾。使用 BCA 測定來確定濃度。然後將樣品速凍並儲存於 -80℃ 下，然後生成 MHCI 複合物。
用於篩選之肽選擇。自免疫表位資料庫及分析資源 (www.iedb.org) 選擇用於初始結合篩選之肽。基於以實驗方式測量之親和力來分選資料庫中所鑑別的肽結合物，且選擇 5 種具有最高測量親和力之肽。在排名居前之 5 種之肽序列類似 (區別小於 4 個胺基酸) 的情形下，選擇具有獨特序列之次高親和力肽以確保篩選中的最大肽多樣性。
MHCI 再摺疊 ( 小規模 ) 。在 大腸桿菌中過度表現重組 HLA 等位基因及 B2M，自包涵體純化，並如上所述在 -80℃ 下儲存於變性條件 (6M 胍 HCL、25 mM Tris (pH 8)) 中。在 200 µL 反應中，將肽 (0.01 mM/孔)、經氧化麩胱甘肽及經還原麩胱甘肽 (分別為 0.5 mM 及 4.0 mM)、重組 HLA 等位基因 (0.03 mg/mL) 及 B2M (0.01 mg/mL) 皆組合於 96 孔盤內。如上所述使用 5 種不同肽針對每一所關注 HLA 執行再摺疊篩選 (表 3)，且將 MHCI 複合物在 4℃ 下培育 3-5 天以容許再摺疊。藉由 ELISA 分析經再摺疊樣品，且選擇最高性能肽用於進一步分析。相對於在不存在肽下 (標記為 NP) 執行之陰性對照再摺疊來分析所有資料。使用經 CMV pp65 病毒表位再摺疊之 HLA-A*02:01 作為陽性對照。
在鑑別出每一 HLA 等位基因之最穩定肽結合物之後，使用 UV-可裂解胺基酸 (表示為 「J」) 在沿肽序列 (表 4) 之不同位置處再設計肽。簡言之，再設計初始篩選中所鑑別之最穩定肽結合物的變異體，其中相對於 N-末端在位置 2、4、6 及 8 處取代 J 胺基酸。藉由如上文所闡述之 ELISA 鑑別在使用經再設計肽再摺疊時之穩定條件化 MHCI 複合物的形成。使用基於 ELISA 測定讀出產生最穩定複合物之條件化 MHCI 配體來擴大 MHCI 產生。使用原始肽 (不含 UV 胺基酸取代) 作為陽性對照。本文所用之所有肽皆購自 JPT (www.jpt.com) 或 ELIM Biopharm (www.elimbio.com)。
ELISA 測定。使用 25 µL/孔之於塗覆緩衝液 (0.05 碳酸鈉，pH 9.6) 中之 8 µg/mL 小鼠 IgG2a 抗 HLA ABC 純系 W6/32 (Novus Biological, Littleton, Co.) 塗覆 384 孔 Nunc Maxisorp 盤 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)。在 4 ℃下過夜培育之後，使用洗滌緩衝液 (PBS, 0.5% Tween 20) 將盤洗滌 3 次。然後使用 50 µL/孔之阻斷緩衝液 (PBS, 0.5% BSA, 10 ppm Proclin) 阻斷盤並在室溫 (RT) 及攪動下培育 1 小時。在使用洗滌緩衝液將盤洗滌 3 次之後，將 25 µL/孔之於測定稀釋劑 (PBS, 0.5% BSA + 0.05% Tween20 +10 ppm Proclin) 中之未純化再摺疊 MHC 複合物 (40 µg/mL，具有及不具有肽) 添加至盤中並在室溫下培育 1 小時。將盤洗滌 6 次且將 25 　L 於測定稀釋劑中之 100 ng/mL 生物素化小鼠 IgG1 抗人 B2M (BioLegend, San Diego, CA) 添加至每一孔中。在室溫下培育 1 小時且洗滌 6 次之後，將 25 µL/孔之卵白素-辣根過氧化物酶 (GE, Marlborough, MA) 添加至盤中並在室溫下培育 30 min。使用 TMB 過氧化物酶受質 (Moss, Pasadena, MD) 在室溫下使呈色反應發生 15 min，且使用 1M 磷酸終止反應。在 405 nm 波長與 620 nm 參考波長下測量吸光度。使用不含肽或不相關肽之再摺疊 MHC 單體作為每一等位基因的陰性對照以正規化訊號。
MHCI 再摺疊、生物素化及純化 ( 大規模 ) 。在 1、5 或 15 L 反應中，在再摺疊緩衝液 (100 mM Tris (pH 8.0)、400 mM L-精胺酸、2 mM EDTA) 中組合所選肽 (0.01 mM)、經氧化麩胱甘肽及經還原麩胱甘肽 (分別為 0.5 mM 及 4.0 mM)、重組 HLA (0.03 mg/mL) 及 B2M (0.01 mg/mL)。然後將再摺疊混合物在 4℃ 下攪拌 3-5 天，經由 0.22 µm 過濾器過濾，並濃縮且藉由切向流過濾 (TFF) (Millipore P2C010C01) 緩衝液交換至 25 mM Tris (pH 7.5)中。藉由 LC/MS 分析蛋白質組分以確保 HLA 處於適當還原狀態中。然後經由添加 BirA (1:50 (wt:wt) 酶:MHCI)、100 mM ATP 及 10X 反應緩衝液 (100 mM MgOAc、0.5 mM 生物素) 來使經濃縮及再摺疊之 MHCI 複合物生物素化。將生物素化反應液在室溫下混合 2 hr。透析樣品並藉由 LC/MS 分析以量化生物素化。藉由陰離子交換層析使用 1 或 5 mL HiTrap Q HP 管柱 (端視反應大小) 在 AKTA Avant FPLC 上純化生物素化 MHCI 複合物。使用 10 管柱體積 (CV) 之 25 mM Tris HCl (pH 7.5) 在 5 mL/min 之流速下來平衡管柱。將 MHCI 複合物以 5 mL/min 流速加載於管柱上並使用 30 CV 之 0-60% 2.5 mM Tris HCl (pH 7.5，1 M NaCl) 梯度溶析。在 SDS-PAGE 上運行溶析峰之餾分，且彙集含有 B2M 帶及 HLA 帶之餾分。將所彙集餾分緩衝液-交換至儲存緩衝液 (25 mM Tris HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl) 中。藉由 280 nm 下之 UV 吸光度確定蛋白質濃度，且將樣品速凍並儲存於 -80℃ 下。
LC/MS 分析。將 2 - 5 µg MHCI 複合物注於 AdvanceBio RP-mAb 二苯基管柱 (2.1 × 75 mm, 3.5 µm, Agilent) 上。將管柱加熱至 80℃ 並暴露於 25-40% 移動相 B 之梯度 (2.0 min，0.8 mL/min)。移動相 A 為於水中之 0.05% TFA。移動相 B 為於乙腈中之 0.05% TFA。將管柱溶析劑傳輸至 Agilent 6230 ESI-TOF LC/MS 以供質譜資料獲取。
為量化 MHCI 濃度及 B2M 與 HLA 之莫耳比率，藉由使用上述方法注入已知量之每一蛋白質來生成 B2M 及 HLA 等位基因的標準曲線。使用 A280 下峰面積生成標準曲線，該等標準曲線容許量化 MHCI 複合物中之個別蛋白質次單元。使用 MassHunter 定性分析軟體 (Agilent) 反褶積 HLA 及 B2M 質量。
SEC-MALS 分析。如先前所闡述來確定 MHCI 複合物之 MW。簡言之，將樣品注於 TSKgel SW3000 分析型 SEC 管柱 (Tosoh Bioscience) 上，該管柱使用磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS) (另外具有 150 mM NaCl) 之等梯度梯度且耦合至多角度光散射系統 (MALS) (Wyatt Instruments) 以測量莫耳質量。
2D LC/MS 分析：使用 2 維液相層析質譜 (2D LC/MS) 方法來特性化肽與 MHCI 複合物之結合。將 2-3 µg MHCI 複合物注於儀器上並傳輸至第一維管柱。第一維 LC 方法採用分析型粒徑篩析管柱 (SEC) (Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2.7 µm, 4.6 × 15 mm) 來分離完整複合物與過量肽，其中在 0.7 mL/min 之等梯度流速下於 25 mM TRIS (pH 8.0)、150 mM NaCl 中運行 10 min 且在 280 nm 下獲取訊號。採樣閥會收集溶析於 1.90 - 2.13 min 之間之體積為 160 µL 的全部複合物峰且將其注於第二維反相管柱 (Agilent PLRP-S 1000 Å, 8 µm, 50 × 2.1 mm) 上。將第二維管柱暴露於 5-50% 移動相 B 之梯度 (4.7 min，0.55 mL/min) 且將管柱加熱至 80℃。移動相 A 為 0.05% TFA。移動相 B 為於乙腈中之 0.05% TFA。將管柱溶析劑傳輸至 Agilent 6224 ESI-TOF LC/MS 以供質譜資料獲取。
MHCI 再摺疊之基於 ELISA 之分析。此手稿之主要目標之一在於研發用於鑑別可形成穩定條件化 MHCI 複合物之含有非天然 UV 可裂解胺基酸之肽 (條件性 MHCI 配體) 的穩健 HTP 工作流程。此過程中之第一步驟係研發可測量再摺疊篩選後之穩定 MHCI 複合物形成的 ELISA 測定。因 HLA 組分在此階段並不生物素化，故不能使用廣泛公開之基於卵白素之 ELISA。代之以評估以下兩種形式：1) 使用抗 B2M 捕獲且使用抗 HLA (純系 W6/32) 檢測，及 2) 使用抗 HLA (純系 W6/32) 捕獲且使用抗 B2M 檢測。在兩種情形下，使用生物素標記偵測抗體且在添加卵白素-HRP 及受質之後誘導訊號生成。使用 CMV pp65 肽及 HLA-A*02:01 進行該等初始篩選。儘管兩種形式之訊號及檢測範圍相當，但在高於 0.25 µg/mL 之濃度下，形式 2) (圖 41A，黑色條) 之正規化值遠高於形式 1) (圖 41A，白色條)。在該等較高濃度下，肽與無肽對照之間的 ELISA 訊號並無差異或具有極小差異。該等測定中所用之抗 HLA 識別 MHCI 上之構形表位且應對適當摺疊之 MHCI 具有選擇性。與之相比，抗 B2M 捕獲並不依賴於適當摺疊之 MHCI 且將捕獲具有適當摺疊之 HLA 以及部分變性之 HLA 的複合物。因此，ELISA 形式 1) 在較高濃度下之訊號/雜訊較低可能因為捕獲了部分摺疊之 MHCI。圖 41B 展示對於 ELISA 形式 2) 在最佳化測定條件下隨 MHCI 濃度而變化之 ELISA 結果，該形式使用經 CMV pp65 肽、BMRF1 肽及不經肽再摺疊之 MHCI 分子。隨著濃度增加可觀察到，CMV pp65 及 BMRF1 抗原之 OD450/620 ELISA 訊號有所增加，但無肽對照之訊號增加極小，此與適當再摺疊之 MHCI 複合物的檢測一致。圖 41C 展示對於 CMV pp65 及 BMRF1 ELISA 在 1 µg/mL 之 MHCI 濃度下正規化至無肽對照的訊號。兩種抗原之訊號皆 10 倍於背景，從而證實此測定形式產生高度靈敏之訊號/雜訊且可易於用於鑑別可在再摺疊步驟期間形成穩定 MHCI 複合物的抗原。
跨 HLA 等位基因之肽結合物及條件化 MHCI 配體的鑑別。自 IEDB 選擇肽 (表 3)。使用上述 ELISA 測定分析該等肽與相應 HLA 等位基因形成穩定 MHCI 複合物之能力。使用 5 種肽及 HLA-A*02:03 生成之再摺疊 MHCI 複合物的滴定曲線展示於圖 42A 中。在介於 0.1 µg/mL 至 3.0 µg/mL 之間的 MHCI 濃度下執行該測定，且如圖 41B 中針對陽性對照所觀察，在遞增 MHCI 濃度下 ELISA OD 有所增加且訊號在 1 µg/mL 下開始飽和。另外觀察到，陰性對照之訊號在滴定範圍內僅具有極小增加。因訊號似乎在 1.0 µg/mL 下飽和，故選擇此濃度來展示 A*02:03、B*35:01 及 C*0202 等位基因之正規化 ELISA 值 (圖 42B-42D)。針對 A*02:03 篩選之 5 種肽的訊號/背景相對較高，且其值介於 20 至 40 之間。此表明，所有選自 IEDB 之肽不僅係結合物，且亦可在再摺疊時形成穩定 MHCI 複合物。A0203-02 肽產生最高正規化 OD 值且選擇用於設計 UV 肽。對於 B*35:03 而言，所選肽之正規化 OD 亦具有介於 6.75-7.25 之間之相對較高的訊號/背景 (圖 42C)。B3503-04 產生最高 OD 值且隨後選擇用於設計候選條件化 MHCI 配體。C*02:02 肽之正規化 OD 皆介於 18 與 20 之間，C0202-02 除外，其正規化 OD 極低 (約 8) (圖 42D)。C0202-03 產生最高正規化 OD 值且選擇用於設計候選條件化 MHCI 配體。亦測試 A*26:01、B*18:01 及 C*14:02 且觀察到類似結果 (圖 54A-54F)。儘管所測試所有等位基因之訊號/雜訊皆相對較高且提供該測定鑑別形成穩定複合物之肽的信心，但各等位基因中之正規化訊號的量級存在顯著差異。據信，該等結果可能係因為不同 HLA 等位基因之泛-HLA 抗體的親和力有所變化。與之相比，既定等位基因 (例如 A*02:03 及 C*02:02) 內之可變性可能係因為所篩選不同肽中的肽親和力差異。
然後使用該等所選肽來設計含有非天然 UV 可裂解胺基酸之肽 (條件性 MHCI 配體)。使用在自 N-末端起之位置 2、4、6 及 8 處經取代之 UV-可裂解胺基酸 (表示為 J) 來設計初始篩選中之性能排名居前之肽的變異體 (亦即 A0203-02、B3503-04 及 C0202-03) (圖 42B-42D)，從而鑑別在不同 HLA 等位基因中形成穩定複合物之 UV-肽。衍生自 A0203-02 肽之 4 種所篩選條件化 MHCI 配體的滴定曲線展示於圖 42E 中。如針對非-UV 可裂解肽所觀察，在遞增 MHCI 濃度下觀察到 ELISA OD 有所增加且其值在 1 µg/mL 下開始飽和 (圖 42E)。所有條件化 MHCI 配體在不同等位基因中之正規化 ELISA 訊號展示於圖 42F-42H 中。有趣的是，在位置 2 處具有 J 胺基酸取代之所有條件化 MHCI 配體變異體皆展示極低正規化 ELISA 值 (圖 42F-42H)，從而指示相對於親代肽形成極少 MHC 複合物 (A0203-02-01、B3503-05-01、C0202-03-01 及 C0202-03-04) (圖 42F-42H，灰色條)。此發現可以預期，此乃因此位置已知係 MHCI-肽錨定位置。針對 A0203-02 及 B3503-04 篩選之所有其他條件化 MHCI 配體皆產生類似於親代肽的正規化 OD 讀出 (圖 42F-42G)。與之相比，C0202-02 之所有條件化 MHCI 配體的 OD 值皆低於親代；然而，C0202-02-02 及 C0202-02-03 之正規化 OD 仍相對較高 (分別為 6 及 8) (圖 42H)，從而指示 UV 可裂解胺基酸對 MHCI 穩定性具有輕微負面影響。然後選擇產生最高正規化 ELISA OD 值之條件化 MHCI 配體(A0302-02-02、B3503-05-02 及 C0202-03-03) 進行擴大產生。執行類似分析以鑑別 A*26:01、B*18:01 及 C*14:02 等位基因之最佳條件化 MHCI 配體 (圖 54A-54F)。
MHCI 單體之擴大再摺疊及純化。在 20 多年前首次研發經由在所關注肽存在下再摺疊自 大腸桿菌包涵體純化之變性 B2M 及 HLA 來生成重組 MHCI 複合物。自此初始報導以來，已研發許多研究及方法來使用再摺疊方案生成及純化 MHCI 複合物。該等方法中之大部分包括下列過程的一定變化形式：1) 在具有氧化還原/氧化劑之通用再摺疊緩衝液中混合 HLA 及 B2M 與肽 (培育時間可自 1-5 天不等)，2) 過濾再摺疊材料以去除聚集體，3) 濃縮至與粒徑篩析層析法 (SEC) 相容之體積 (端視管柱為 1-2 mL)，4) 使用 SEC 純化，5) 使經純化之再摺疊 MHCI 複合物生物素化，及 6) 純化來自生物素化反應之 MHCI 複合物 (SEC、旋轉管柱過濾器等)。該等產生方法中之大部分僅以 1 L 規模或更小規模實踐且僅產生幾毫克再摺疊材料；因此，需要多個產生運行來產生用於支持臨床項目之足夠材料。多個運行可潛在地產生批次間可變性，此可混淆下游四聚體染色資料之詮釋。為解決該等限制，研發使得能夠將 MHCI 再摺疊及純化擴大至 15 公升之新穎工作流程。
為達成方法最佳化，使用公開之 HLA-A*02:01 特異性條件化 MHCI 配體。擴大產生之主要限制係需要 SEC 純化步驟，該步驟需要將樣品濃縮至小於 1 mL。另外，通常對經純化之再摺疊 MHCI 複合物執行生物素化步驟且需要二級純化步驟，此會進一步限制擴大產生。為解決該等限制，研發 3-步驟產生過程，其包括再摺疊反應、過程中生物素化及陰離子交換層析純化。MHCI 複合物之 HLA 組分在生物素化步驟之前及之後的 LC/MS 分析展示於圖 43A 中。黑色線展示生物素化前之 HLA 蛋白。在 34812 Da 及 34943 Da 下觀察到兩個峰，其對應於具有及不具有 N-末端甲硫胺酸基團之 HLA 蛋白。該兩個群體可能係藉由不完全修飾且隨後分別藉由甲醯基甲硫胺酸去甲醯酶及甲硫胺酸胺基肽酶 (MAP) 去除甲醯基甲硫胺酸及 N-末端甲硫胺酸所產生，該去除可端視毗鄰胺基酸而有所變化且在一些情形下並不去除 N-末端甲硫胺酸。因此，N-末端 HLA 序列可能不適用於總 MAP 活性，故僅觀察到部分 N-末端去除。在生物素化之後觀察到，兩個峰之質量增加約 244，此對應於生物素質量 (圖 43A)。未觀察到非生物素化質量下之殘餘峰，從而指示 100% 生物素化。該等組合結果證實，可採用過程中生物素化步驟來消除兩個純化步驟之需要。
在完成生物素化步驟之後，將所得生物素化反應液緩衝液交換至 25 mM Tris 中且備用於經由陰離子交換層析之純化。相對於 SEC 選擇陰離子交換進行純化，此乃因後者適於直接加載用於生物素化步驟期間之較大體積 (10-100 mL)。1 L 再摺疊之代表性 Q-HP 陰離子層析圖展示於圖 43B 中。在約 130 mL 之溶析體積下觀察到較大峰以及若干較小峰，該等較小峰可能代表來自包涵體純化之較少污染物。在 SDS-PAGE 上運行來自主峰之餾分，且跨峰觀察到對應於 HLA-A*02:01 及 B2M 之預期 MW 的帶 (圖 43B)。基於 SDS-PAGE 分析中之帶強度來彙集餾分並運行於 LC/MS 及 SEC-MALS 上。經純化之生物素化 MHCI 複合物的 TIC 層析圖展示於圖 43C 中。滯留時間 1.7 min 及 1.75 min 下之兩個毗鄰峰對應於使用外消旋 UV胺基酸產生之條件化 MHCI 配體的 R 及 S 非對映異構體。滯留時間 1.8 min 及 2.2 min 下之峰分別對應於 B2M 及 HLA-A*02:01。生成 B2M 及 HLA-A*02:01 之標準曲線且使用曲線下面積來量化B2M 與 HLA 之莫耳濃度及莫耳比率。若再摺疊過程使得 B2M 與 HLA 適當配對，兩種組分之莫耳比率應接近 1。在此製備中，該比率經計算為 0.95，從而表明已適當配對。藉由 SEC-MALS 進一步分析 MHCI 複合物以供天然質量分析，從而進一步證實適當之 1:1 HLA:B2M 配對。A280 SEC 層析圖峰高度對稱 (指示均質蛋白質樣品)，且未觀察到聚集體峰 (圖 43D)。跨 MHCI 峰之 MW 介於 48.8 kDa 至 51.3 kDa 之間 (圖 43D，紅色虛線) 且平均值為 49.1 kDa，其接近 MHCI 複合物之預期 MW (48.1 kDa)。LC/MS 及 SEC-MALS 分析共同表明，再摺疊及純化方案會產生高純及適當摺疊之 MHCI 複合物。
研發新穎純化工作流程之主要目標之一在於使得能夠擴大產生。為測試可擴展性，在 5 L 及 15 L 規模下執行最佳化 1 L 方案。該等產生規模下之產率展示於圖 43E 中。有趣的是，據觀察，隨著該過程自 1 L (約 6%) 擴大至 5 L (約 8%) 至 15 L (約 10%)，產率逐漸增加，但此增加在統計學上並不顯著。自 1 L 規模及 15 L 規模生成之 MHCI 複合物的量分別為約 2.4 mg 及 約 60 mg，此對應於在 15 L 規模下每一再摺疊之材料生成增加 25 倍。該等組合發現證實，可使用此研究中所闡述之工作流程來擴大 MHCI 複合物的產生及純化。
6 種 MHCI 單體與自 HTP 篩選鑑別之 UV 肽的擴大產生及肽交換分析。應用上述再摺疊及純化方案以使用 HTP 篩選中所鑑別之條件化 MHCI 配體來大規模產生 MHCI 複合物。所有 6 種構築體之 Q-HP 陰離子層析圖及所彙集餾分的相應 SDS-PAGE 展示於圖 54A-54F 中。該等再摺疊物之層析圖極類似於 HLA-A*02:01 (圖 43B)，且在 SDS-PAGE 中具有清晰之 HLA 及 B2M 帶。在 SDS-PAGE 上運行每一 HLA 等位基因之所彙集餾分且觀察到對應於 HLA 及 B2M 的高純帶 (圖 44A)。1 L 再摺疊之產率在樣品間有所變化，其中 A*02:03、B*18:01 及 C*02:02 具有最高產率 (介於 8 - 11 % 之間)，隨後係 B*35:03 (約 5%)、C*14:02 (約 4%) 及 A*26:01 (約 2.5%)。此可變性可能係因為胺基酸序列含量差異及再摺疊期間之聚集易感性以及肽形成穩定複合物的能力。儘管存在可變性，但 2.5% 之最低產率仍自 1 公升再摺疊物產生 1 mg 材料且在 15 公升規模下此可擴大至 ＞ 15 mg，此足以涵蓋 ＞30,000 種四聚體染色劑。
執行 LC/MS 及 SEC-MALS 分析以進一步評估該等 MHCI 單體之品質且評價 B2M 及 HLA 是否適當配對。6 種等位基因中 B2M:HLA 比率之 LC/MS 分析的結果展示於圖 44C中。如針對 HLA-A*02:01 MHCI 複合物所觀察，所有該等樣品之B2M:HLA 比率皆接近 1。藉由 SEC-MALS 進一步分析 MHCI 複合物以供完整天然狀態質量分析。所分析所有 6 種 MHCI 複合物之 MHCI 峰的平均 MW 展示於圖 44D中。所有 6 種構築體之 MW 皆介於 47.4 kDa 至 48.8 kDa 之間，此完全在該等複合物之預期質量範圍 (47.5 - 48 kDa) 內。該等組合發現證實，再摺疊方案及純化工作流程不僅可廣泛應用，且亦在小規模 HTP 測定中所鑑別之條件化 MHCI 配體能夠在擴大後形成穩定 MHCI 複合物。
除鑑別可用於擴大產生 MHCI 單體之新穎條件化 MHCI 配體外，亦期望證實該等複合物可在 UV 暴露後發生肽交換以使得能夠 HTP 生成 MHCI 複合物。用於測量條件化 MHCI 配體在 UV 暴露後之肽交換之最廣泛使用之方法之一為 ELISA。儘管此測定已證實可用於證實 UV 暴露後之肽交換，但該測定係半定量的，且既不直接測量經交換之肽亦不容許量化所裂解肽。為解決該等限制，研發 2D LC-MS 分析方法以直接量化在交換過程期間加載至複合物中之肽。該測定之示意圖展示於圖 45A 中。此方法中之第一步驟 (第 1 維) 係將肽交換反應混合物 (暴露於 UV 後之 MHCI 複合物+ 100 倍莫耳過量之經交換之肽) 注於分析型 SEC 管柱上，此使得能夠藉由採樣閥收集 MHCI 複合物而無過量肽。第二步驟 (第 2 維) 係將自 MHCI 峰收集之材料注於 RP-HPLC 上。RP-HPLC 步驟之有機相可使 HLA、B2M 及含於複合物內的肽解離及變性，此使得能夠藉由 A280 及 LC/MS 來分析及量化 MHCI 複合物之個別組分。具有 CMV pp65 表位之對照 HLA-A*02:01 條件化 MHCI 配體之肽交換之第 1 維 SEC 層析圖的一實例展示於圖 45B 中。層析圖展示對應於 MHCI 複合物之一個主峰。在 2.5 min 與 3 min 之間始終觀察到層析圖 A280 訊號的波動，此對應於採樣閥之打開及關閉。因在第 1維與第 2 維之間存在較大壓力差，故此波動可能與隨著閥門打開及關閉壓力之突然變化有關。第 2 維 HPLC 步驟之 A280 層析圖的一實例展示於圖 45C 中。HLA 及 B2M 峰清晰可見，但未觀察到 CMV pp65 肽或條件化 MHCI 配體之 A280 峰，此乃因其不含任何色胺酸或酪胺酸殘基且並無固有 A280 吸光度。為分析肽組成，生成交換肽及未裂解條件化 MHCI 配體之提取離子交換層析圖 (圖 45D)。如所預計，觀察到對應於 CMV pp65 肽之較大峰，從而指示成功肽交換。然而，亦觀察到極低含量之完整條件化 MHCI 配體。此結果表明，經純化肽具有以類似質量攜載之合成源污染物，或小部分條件化 MHCI 配體在處於複合物中時可經保護以免於 UV 裂解。當在不存在 MHCI 下裂解單獨之肽時，亦觀察到此峰，從而表明此為污染物。無論如何，完整條件化 MHCI 配體之相對分率極低 (約 1%) 且應對下游四聚體染色具有最小影響。執行相同分析以驗證是否存在經裂解條件化 MHCI 配體，且未檢測到峰。藉由採用 2D LC/MS 測定來分析肽交換，能夠測量 MHCI 複合物中之肽含量在肽交換過程期間如何變化。據信，此係可用於較佳地理解與肽交換相關之參數的有效工具，該等參數不能使用其他傳統方法 (例如 ELISA) 來量化。
然後使用此方法來評價使用擴大產生工作流程生成之 MHCI 複合物與在 HTP 小規模測定中所鑑別之新穎條件化 MHCI 配體的肽交換。對於每一 MHCI 複合物而言，分別使用發現係小規模 HTP 篩選中之結合物之 4 -5 種肽 (圖 42B-D 及 54A-54C) 及一種已知非結合肽作為陽性對照及陰性對照。具有肽 A0203-05 之 HLA-A*02:03 的第 1 維 SEC 層析圖展示清晰單峰 (圖 45E)。肽交換複合物之第 2 維 HPLC A280 層析圖亦展示預期 B2M 及 HLA 峰 (圖 45F)。在第 2 維之 EIC 分析中，觀察到對應於 A0203-05 肽之提取質量的較大峰 (圖 45G，黑色線)。然而，類似於 A*02:01 及 CMV pp65 之肽交換，亦觀察到對應於完整條件化 MHCI 配體之較小峰(圖 45G，虛線)。此現象可見於所測試之所有條件化 MHCI 配體中且指示在肽交換過程中存在且攜載一些低含量污染物。值得注意地，在所有情形下，污染物肽之總分率皆小於 1%。HLA-A*02:03 MHCI 複合物在與已知非結合物肽交換之後的第 1 維 SEC 層析圖展示於圖 45H 中。該等條件下之總峰面積低於使用肽結合物執行肽交換過程時 (圖 41E 對 41H)。另外，第 2 維中之 A280 HPLC 層析圖含有兩個峰，但總峰面積遠低於使用肽結合物時 (圖 45F 對 45I)。該等組合資料表明，在使用非結合物執行肽交換時，存在顯著材料損失，此可能係因為蛋白質聚集。有趣的是，在所測試之所有等位基因中針對陰性對照交換樣品始終觀察到在 SEC 運行結束時的峰 (圖 45H，滯留時間約為 3.6 min)，據信此係因為部分變性之 HLA 與管柱發生相互作用。最後，在 EIC 分析中，未觀察到對應於 A*02:03 非結合肽之峰，從而指示並不發生肽交換 (圖 45J)。令人吃驚地，儘管沒有肽與複合物締合，但在第 1 維中觀察到相對顯著之 A280 峰，只是該峰遠小於使用肽交換觀察之峰。該等結果表明，一些複合物在不存在肽下保持締合，但可能具有較低品質且並不適當摺疊。
第 1維及第 2 維資料之量化展示於圖 46A-46F 中。在此分析中，評估在交換之後回收於第 1 維 (SEC) 中之 A280 MHCI 峰的分率及在第 2 維 (EIC) 中是否存在經交換之肽。圖 46A-46F 展示在 4 -5 種陽性對照及一種陰性對照中不同 MHCI 複合物之所回收 A280 MHCI 峰的分率 (正規化至非肽交換對照)。圖形上方之符號指示在第 2 維中是否檢測到肽 (+ =檢測到，- =未檢測到)。對於 HLA-A*02:03 (圖 46A)，陽性對照結合肽之回收分率自 0.9 至 1 不等且在第 2 維中針對所有肽皆觀察到交換肽。如上所述，陰性對照之回收分率仍相對較高 (約 0.76)，即使觀察到零經交換之肽、經裂解條件化 MHCI 配體及極低含量之完整條件化 MHCI 配體 (＜1%)。此表明，複合物在不存在肽下在一定時間段內保持一定程度的完整，但考慮到 HLA 等位基因在不存在肽下之不穩定性其可能並不適當摺疊。亦值得注意地，因陽性對照與陰性對照之間的回收分率差僅為 26%，故考慮到此測定僅測量 HLA 與 B2M 之間的配對且並不測量肽含量，此差異可能由 ELISA 遺漏。
針對 A*26:01 (圖 46B)、B*18:01 (圖 46C)、B*35:03 (圖 46D) 及 C*14:02 (圖 46F) 觀察到類似結果。在所有情形下，第一維中之陽性對照與陰性對照之間的峰面積差皆小於 20-25%。與之相比，陰性對照及陽性對照針對 C*02:02 具有顯著差異 (圖 46E)。對於此樣品而言，在已知非結合肽包括於肽交換中時，約 80% 之材料發生降解。儘管此現象之確切原因未知，但其可能係因為在已自 HLA 上之肽凹槽去除肽時不同等位基因能夠保持與 B2M 締合。無論如何，該等組合結果明確指示，可鑑別容許擴大產生 MHCI 肽且隨後發生肽交換以 HTP 生成 MHCI 單體及四聚體的條件化 MHCI 配體。
在此研究中，研發使得能夠鑑別及驗證形成穩定 UV 肽 MHC 複合物之新條件化 MHCI 配體的工作流程。此工作流程包括篩選 IEDB 中所鑑別之已知肽結合物以形成穩定的再摺疊 MHCI 複合物。基於初始篩選中之性能排名居前之肽來設計含有非天然 UV 可裂解胺基酸的肽。然後在同一 ELISA 測定中篩選 UV 肽且選擇性能排名居前者進行擴大產生。使用 HLA-A02:01 之公開條件化 MHCI 配體來研發新穎 MHCI 複合物純化及生物素化方案以使得能夠將產生擴大至超過傳統規模 (例如 1 L)。另外，使用次世代分析技術 (LC/MS、2D LC/MS 及 SEC-MALS) 來證實所生成複合物之品質。將最佳化再摺疊產生及純化方案以及次世代分析技術應用於 ELISA篩選中所鑑別的條件化 MHCI 配體。此分析證實，新條件化 MHCI 複合物已純化至高純度，經適當再摺疊，且具有高品質。最後，使用 2D LC/MS 評估條件化 MHCI 複合物在 UV 暴露之後與經驗證肽結合物的肽交換。所有條件化 MHCI 複合物皆能夠在 UV 暴露後發生肽交換。該等組合結果證實，所研發工作流程可用於鑑別新 HLA 等位基因之條件化 MHCI 配體。此方式已潛在地廣泛應用且使得能夠在較寬範圍之 HLA 等位基因中 HTP 生成 MHCI 單體及四聚體，此對於使得能夠在臨床中使用 MHCI 四聚體來監測新抗原特異性 T 細胞至關重要。
實例 10 ：條件化 MHCI 配體之高通量鑑別及條件化 MHCI 複合物之擴大產生
儘管需要監測癌症免疫療法 (CI)/免疫腫瘤學 (IO) 治療對新抗原特異性 T 細胞反應之影響，但極少臨床項目納入此方面之免疫監測，此乃因在寬範圍之 HLA 等位基因中 MHCI 四聚體之高通量 (HTP) 生成存在一定難題。最近經由研發使得能夠在 UV 暴露後進行 HTP 肽交換之具有含有非天然 UV 可裂解胺基酸之肽 (條件性 MHCI 配體) 的 MHCI 複合物來解決此限制。儘管具有此進展，但具有已知條件化 MHCI 配體之等位基因的數量有限。研發使得能夠在多種 HLA 等位基因中鑑別及驗證條件化 MHCI 配體之新穎工作流程。首先，經由酵素連結免疫吸附測定 (ELISA) 來篩選已知肽結合物。使用最高性能肽來設計條件化 MHCI 配體且在同一 ELISA 測定中進行評估。然後選擇性能排名居前者進行擴大產生。使用次世代分析技術 (LC/MS、SEC-MALS 及 2D LC/MS) 來特性化在使用條件化 MHCI 配體再摺疊之後的複合物。最後，使用 2D LC/MS 來評估該等擴大條件化 MHCI 複合物在 UV 暴露之後與經驗證肽結合物的肽交換。在 UV 暴露後針對所有條件化 MHCI 配體皆觀察到成功肽交換，從而驗證了篩選方式。此方式可廣泛應用且使得能夠在較寬範圍之 HLA 等位基因中 HTP 生成 MHCI 單體及四聚體，此對於使得能夠在臨床中使用 MHCI 四聚體來監測新抗原特異性 T 細胞至關重要。
追蹤 T 細胞反應之最常用方法為 ELISPOT 及 MHC 四聚體染色。ELISPOT 測定係測量在使用抗原刺激 PBMC 細胞時 T 細胞之細胞激素釋放的功能測定。此測定之優點在於，其不依賴於等位基因及新表位 (亦即僅需已知新抗原) 且其為功能讀出。該測定之缺點在於，其係半定量的且及不能評價 T 細胞表型，T 細胞表型對於理解關於生成保護性免疫反應之重要因子至關重要。基於 MHCI 四聚體之檢測利用經由卵白素結合多聚合成四聚體之重組 MHCI 單體作為新抗原特異性 T 細胞染色試劑。此方法容許對多種特異性以及表型標記物進行染色。MHCI 四聚體亦容許定量分析新抗原特異性 T 細胞之確切數量及其在治療過程期間的變化方式。在許多方面，基於 MHCI 四聚體之檢測可由此更詳細地理解治療對於新抗原特異性 CD8+ T 細胞反應的效應。
儘管 MHCI 四聚體檢測具有該等優點，但此方式不能廣泛用作臨床項目中之生物標記物策略，此乃因存在與生成試劑有關之難題。MHCI 四聚體生成需要耗時、多日、低產率之再摺疊過程，包括多個層析步驟。另外，每一人具有 6 種不同 HLA 等位基因且 HLA 等位基因係高度多型的 (存在近 20,000 種 HLA I 類等位基因)。另外，新抗原型態不僅對於每一患者而言較為獨特，且亦需要數十至數百個患者特異性 MHCI 四聚體方能獲得既定患者中之 T 細胞情景的完整圖片。因此，新抗原特異性 T 細胞反應之基於 MHCI 四聚體之檢測需要啟用個性化 MHCI 四聚體平臺，該平臺不可能使用傳統 MHCI 生成方案。
已研發製備 MHCI 試劑之若干新穎方法來解決該等限制。一種方式係在 HLA 等位基因中改造穩定二硫化物以使得能夠在二肽存在下形成穩定 MHCI 複合物。該等經二硫化物穩定之 MHCI 試劑稱為「空」 MHCI 複合物且可藉由將所關注肽簡單地添加至空 MHCI 複合物中來加載肽或表位。已針對鼠類及人 (A*02:01) MHCI 複合物證實此策略，且在使用此方式及傳統再摺疊方式產生之 MHCI 試劑之間報告可比的四聚體染色結果。另一方法使用等位基因特異性 UV-可裂解肽 (亦稱為條件化 MHCI 配體) 來形成 MHCI 複合物，其中肽以高親和力 (在完整時) 及低親和力 (在裂解時) 進行結合。當在所關注高親和力肽結合物存在下培育使用條件化 MHCI 配體組裝之 MHCI 複合物 (稱為條件性 MHCI 複合物) 時，此功能性使得能夠在 UV 暴露後發生肽交換。可大規模地再摺疊既定 HLA 等位基因之條件化 MHCI 複合物，且最終使用者可然後將條件化 MHCI 配體交換為任何其他所關注肽。
該等方法皆尋求突破性地使得能夠在臨床中使用個性化 MHCI 四聚體來監測新抗原特異性 T 細胞。「空」 MHCI 之主要缺點之一在於，需要鑑別穩定「空」複合物之新改造二硫化物及使得「空」複合物能夠針對每一不同 HLA 等位基因再摺疊的二肽。類似地，條件化 MHCI 方式之一個缺點在於，需要鑑別及設計用於每一 HLA 等位基因之特定肽。然而，考慮到自資源角度考慮肽結合物之高通量 (HTP) 篩選較生成多個經改造構築體且篩選「空」 MHCI 所需之二肽穩定劑更為容易，此手稿之目標在於進一步擴展條件化 MHCI 配體的組庫。據所知，僅公開用於 24 種 HLA 等位基因之條件化 MHCI 配體。儘管該等等位基因係一些最常見者，但諸多不同患者中之新抗原覆蓋範圍仍極小。因此，需要研發使得能夠擴大等位基因覆蓋範圍之工作流程。
另外，再摺疊或肽交換後之 MHCI 複合物分析性驗證利用有限數量的分析技術，包括酵素連結免疫吸附測定 (ELISA) 測定及凝膠電泳。儘管該等技術已證實可用於確定 MHCI 複合物是否存在及用於親和力及穩定性之半定量分析，但不能捕獲若干其他重要參數，例如 HLA:B2M 比率、聚集及氧化狀態。存在用以評估該等參數之若干蛋白質分析工具 (包括液相層析/質譜 (LC/MS)、2D LC/MS 及粒徑篩析層析法/多角度光散射檢測 (SEC-MALS))，但很少使用該等工具來特性化再摺疊或肽交換後之 MHCI 複合物。
本文之實驗工作流程容許鑑別及驗證形成穩定條件化 MHCI 複合物之條件化 MHCI 配體及 HLA 等位基因的新組合。研發及驗證用於檢測穩定條件化 MHCI 複合物之 ELISA 測定。首先在 6 種 HLA 等位基因 (A*02:03、A*26:01、B*18:01、B*35:03、C*02:02、C*14:02) 中篩選免疫表位資料庫及分析 (IEDB) 中所報導之 5 種公開肽結合物，且基於排名居前之結合物來設計條件化 MHCI 配體。然後在 ELISA 測定中篩選條件化 MHCI 配體，且選擇性能排名居前者進行擴大產生。對於 MHCI 產生而言，研發新穎 MHCI 純化及生物素化方案，且使用次世代分析技術來證實所生成複合物之品質。進一步應用該等方法來特性化使用新鑑別之條件化 MHCI 配體所生成的條件化 MHCI 複合物。最後，使用 2D LC/MS 驗證在 UV 暴露之後與經驗證肽結合物的肽交換。總而言之，研發經驗證工作流程來鑑別用於可廣泛應用之新 HLA 等位基因的條件化 UV 肽以極大地擴大 HLA 等位基因覆蓋範圍，此對於使得能夠在臨床中使用 MHCI 四聚體來監測新抗原特異性 T 細胞至關重要。
蛋白質表現及純化。自 Uniprot.org 獲得HLA 及 B2M 序列。合成編碼 HLA 及 B2M 之訊號序列以及 HLA 細胞外域及全長 B2M 之 DNA 並在 T7 lac 啟動子的控制下亞選殖至 pET 表現載體中。在 大腸桿菌中過度表現重組 HLA 及 B2M，自包涵體純化，並在 -80℃ 下儲存於變性緩衝液 (6M 胍 HCl、25 mM Tris (pH 8)) 中。在誘導表現之後，將 B2M 及 HLA 生質顆粒以 5 mL/g 再懸浮於裂解緩衝液 (PBS+1% Triton X-114) 中並在 1000 巴下於微細流體均質機中均質化兩次。然後將均質化懸浮液在超離心器中於 30000 g 下旋轉 20 min。收集顆粒，使用 500 mL 於 PBS 中之 0.5% Triton X-114 洗滌並在 30000 g下離心 20 min。如上所述再次收集顆粒並再次洗滌。將經純化包涵體以 10 mL/g 之濃度溶於變性緩衝液 (20 mM MES (pH 6.0)、6M 胍) 中並在 4℃ 下攪拌過夜。將所溶解顆粒在 40,000 g下離心 60 min 且收集上澄液，並經由 0.22 μm 過濾器過濾。藉由 UV-Vis 在 280 nm 下使用蛋白質之消光係數來確定濃度。然後將樣品速凍並儲存於 -80℃ 下，然後生成 MHCI 複合物。
用於篩選之肽選擇。自免疫表位資料庫及分析資源 (www.iedb.org) 選擇用於初始結合篩選之肽。基於親和力來分選資料庫中所鑑別的肽結合物，且選擇 5 種具有最高測量親和力之肽。在排名居前之 5 種之肽序列類似 (區別小於 4 個胺基酸) 的情形下，選擇具有獨特序列之次高親和力肽以確保篩選中的最大肽多樣性 (表 3)。
MHCI 再摺疊 ( 小規模 ) 。在 大腸桿菌中過度表現重組 HLA 等位基因及 B2M，自包涵體純化，並如上所述在 -80℃ 下儲存於變性條件 (6M 胍 HCl、25 mM Tris (pH 8)) 中。在 200 μL 反應中，將肽 (0.01 mM/孔)、經氧化麩胱甘肽及經還原麩胱甘肽 (分別為 0.5 mM 及 4.0 mM)、重組 HLA 等位基因 (0.03 mg/mL) 及 B2M (0.01 mg/mL) 皆組合於 96 孔盤中。如上所述使用 5 種不同肽針對每一所關注 HLA 執行再摺疊 (表 3)，且將 MHCI 複合物在 4℃ 下培育 3-5 天以容許再摺疊。亦在不存在肽下執行 MHCI 再摺疊複合物且用作陰性對照來計算實驗肽之訊號/雜訊 (S/N)。考慮到在不存在肽下應具有最少適當再摺疊之複合物，故該等樣品提供了用以計算 S/N 值之整體測定背景。使用經 CMV pp65 病毒表位再摺疊之 HLA-A*02:01 作為陽性對照。選擇產生最高訊號/雜訊比 (S/N) 之肽以供進一步分析。
在基於每一 HLA 等位基因之 ELISA 分析鑑別出最穩定肽結合物之後，使用 UV-可裂解胺基酸 (表示為 「J」) 在沿肽序列 (表 4) 之不同位置處再設計肽。簡言之，再設計初始篩選中所鑑別之最穩定肽結合物的變異體，其中相對於 N-末端在位置 2、4、6 及 8 處取代 J 胺基酸。藉由如上文所闡述之 ELISA 鑑別在使用經再設計肽再摺疊時之穩定條件化 MHCI 複合物的形成。使用基於 ELISA 測定讀出產生最穩定複合物之條件化 MHCI 配體來擴大 MHCI 產生。使用原始肽 (不含 UV 胺基酸取代) 作為陽性對照。本文所用之所有肽皆購自 JPT (www.jpt.com) 或 ELIM Biopharm (www.elimbio.com)。
ELISA 測定。評估兩種不同 ELISA 測定以最佳化測定靈敏度。在第一測定形式中，使用抗 B2M 抗體捕獲再摺疊 MHCI 並使用泛 ABC 抗 HLA 抗體 (純系 W6/32) 檢測。在第二測定形式中，使用泛 ABC 抗 HLA 抗體 (純系 W6/32) 捕獲MHCI 並使用抗 B2M 抗體檢測。在兩種測定中，使用 25 µL/孔之於塗覆緩衝液 (0.05 碳酸鈉，pH 9.6) 中之 8 µg/mL 捕獲抗體小鼠 IgG1 抗人 B2M (BioLegend, San Diego, CA) 或小鼠 IgG2a 抗 HLA ABC 純系 W6/32 (Novus Biological, Littleton, Co.) 塗覆 384 孔 Nunc Maxisorp 盤 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)。在 4℃ 下過夜培育之後，使用洗滌緩衝液 (PBS, 0.5% Tween 20) 將盤洗滌 3 次。然後使用 50 µL/孔之阻斷緩衝液 (PBS, 0.5% BASE, 10 ppm Proclin) 阻斷盤並在室溫 (RT) 及攪動下培育 1 小時。在使用洗滌緩衝液將盤洗滌 3 次之後，將 25 µL/孔之於測定稀釋劑 (PBS, 0.5% BSA + 0.05% Tween 20 +10 ppm Proclin) 中之未純化再摺疊 MHC 複合物 (40 µg/mL，具有及不具有肽) 添加至盤中並在室溫下培育 1 小時。將盤洗滌 6 次且將 25 μL 於測定稀釋劑中之 100 ng/mL 生物素化小鼠 IgG2a 抗 HLA ABC 純系 W6/32 (Novus Biological, Littleton, Co.) (測定形式 1) 或生物素化小鼠 IgG1 抗人 B2M (BioLegend, San Diego, CA) (測定形式 2) 添加至每一孔中。在室溫下培育 1 h 且洗滌 6 次之後，將 25 µL/孔之卵白素-辣根過氧化物酶 (GE, Marlborough, MA) 添加至盤中並在室溫下培育 30 min。使用 TMB 過氧化物酶受質 (Moss, Pasadena, MD) 在室溫下使呈色反應發生 15 min，且使用 1M 磷酸終止反應。在 405 nm 波長與 620 nm 參考波長下測量 OD 吸光度值。在每一測定中包括不含肽之再摺疊 MHC 單體以測量測定背景且計算實驗肽的訊號/雜訊 (S/N)。
MHCI- 肽再摺疊、生物素化及純化 ( 大規模 )。在 1、5 或 15 L 反應中，在再摺疊緩衝液 (100 mM Tris (pH 8.0)、400 mM L-精胺酸、2 mM EDTA) 中組合所選肽 (0.01 mM)、經氧化麩胱甘肽及經還原麩胱甘肽 (分別為 0.5 mM 及 4.0 mM)、重組 HLA (0.03 mg/mL) 及 B2M (0.01 mg/mL)。然後將再摺疊混合物在 4℃ 下攪拌 3-5 天，經由 0.22 µm 過濾器過濾，並濃縮且藉由切向流過濾 (TFF) (Millipore P2C010C01) 緩衝液交換至 25 mM Tris (pH 7.5)中。藉由 LC/MS 分析蛋白質組分以確保 HLA 處於適當還原狀態中。然後經由添加 BirA (1:50 [wt:wt] 酶:MHCI)、100 mM ATP 及 10X 反應緩衝液 (100 mM MgOAc、0.5 mM 生物素) 來使經濃縮及再摺疊之 MHCI 複合物生物素化。將生物素化反應液在室溫下混合 2 hr。透析樣品並藉由 LC/MS 分析以量化生物素化。藉由陰離子交換層析在 AKTA Avant FPLC 上使用 1 或 5 mL HiTrap Q HP 管柱 (端視反應大小) 純化生物素化 MHCI 複合物。使用 10 管柱體積 (CV) 之 25 mM Tris HCl (pH 7.5) 在 5 mL/min 之流速下來平衡管柱。將 MHCI 複合物以 5 mL/min 流速加載於管柱上並使用 30 CV 之緩衝液 B (2.5 mM Tris HCl (pH 7.5), 1 M NaCl) 之 0-60% 梯度溶析。在 SDS-PAGE 上運行溶析峰之餾分，且彙集含有 B2M 帶及 HLA 帶之餾分。將所彙集餾分緩衝液-交換至儲存緩衝液 (25 mM Tris HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl) 中。藉由 280 nm 下之 UV 吸光度確定蛋白質濃度，且將樣品速凍並儲存於 -80℃ 下。
液相層析 / 質譜 (LC/MS) 分析。將 2 - 5 µg MHCI 複合物注於 AdvanceBio RP-mAb 二苯基管柱 (2.1 × 75 mm, 3.5 µm, Agilent) 上。將管柱加熱至 80℃ 並暴露於 25–40% 移動相 B 之梯度 (2.0 min，0.8 mL/min)。移動相 A 為於水中之 0.05% TFA。移動相 B 為於乙腈中之 0.05% TFA。將管柱溶析劑傳輸至 Agilent 6230 ESI-TOF LC/MS 以供質譜資料獲取。為量化 MHCI 濃度及 B2M 與 HLA 之莫耳比率，藉由使用上述方法注入已知量之每一蛋白質來生成 B2M 及 HLA 等位基因的標準曲線。使用 A280 下峰面積生成標準曲線，該等標準曲線容許量化 MHCI 複合物中之個別蛋白質次單元。使用 MassHunter 定性分析軟體 (Agilent) 反褶積 HLA 及 B2M 質量。
粒徑篩析層析法 - 多角度光散射 (SEC-MALS) 分析。如先前所闡述來確定 MHCI 複合物之 MW。簡言之，將約 2 mg/mL 之樣品 (對於 A*02:01 MHC 使用 10 μ；對於其他 MHCI 等位基因使用 25 μl) 注於 TSKgel SW3000 分析型 SEC 管柱 (Tosoh Bioscience) 上，該管柱使用磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS，pH 7.2，另外具有 150 mM NaCl) 在環境溫度下之等梯度梯度且耦合至多角度光散射系統 (MALS) (Wyatt Instruments) 以測量莫耳質量。
2D LC/MS 分析。使用二維液相層析質譜 (2D LC/MS) 方法來特性化肽與 MHCI 複合物之結合。將 2-3 µg MHCI 複合物注於儀器上並傳輸至第一維管柱。第一維 LC 方法採用分析型粒徑篩析管柱 (SEC) (Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2.7 µm, 4.6 × 15 mm) 來分離完整複合物與過量肽，其中在 0.7 mL/min 之等梯度流速下於 25 mM TRIS (pH 8.0)、150 mM NaCl 中運行 10 min 且在 280 nm 下獲取訊號。採樣閥會收集溶析於 1.90 - 2.13 min 之間之體積為 160 µL 的全部複合物峰且將其注於第二維反相管柱 (Agilent PLRP-S 1000 Å, 8 µm, 50 × 2.1 mm) 上。將第二維管柱暴露於 5-50% 移動相 B 之梯度 (4.7 min，0.55 mL/min) 且將管柱加熱至 80 ℃。移動相 A 為 0.05% TFA。移動相 B 為於乙腈中之 0.05% TFA。將管柱溶析劑傳輸至 Agilent 6224 ESI-TOF LC/MS 以供質譜資料獲取 (Agilent Mass Hunter)。
MHCI 再摺疊之基於 ELISA 之分析。此手稿之主要目標之一在於研發用於鑑別可形成穩定條件化 MHCI 複合物之含有非天然 UV 可裂解胺基酸之肽 (條件性 MHCI 配體) 的穩健 HTP 工作流程。此過程中之第一步驟係研發可測量再摺疊篩選後之穩定 MHCI 複合物形成的 ELISA 測定。HTP 再摺疊方案涉及以 200 μL 反應形式在 96 孔盤內混合變性重組 HLA (0.03 mg/mL)、B2M (0.01 mg/mL)、肽 (0.01 mM)、經氧化麩胱甘肽及經還原麩胱甘肽 (分別為 0.5 mM 及 4.0 mM) 並在 4 ℃下於熟食冰箱中進行再摺疊反應 3-5 天，然後進行 ELISA 分析。因 HLA 組分在此階段並不生物素化，故不能使用廣泛公開之基於卵白素之 ELISA。代之以評估以下兩種形式：1) 使用抗 B2M 捕獲且使用抗 HLA 檢測，及 2) 使用抗 HLA (純系 W6/32) 捕獲且使用抗 B2M 檢測。在兩種情形下，使用生物素標記檢測抗體，且在添加卵白素-HRP 及受質之後誘導訊號生成。使用 CMV pp65 肽及 HLA-A*02:01 進行該等初始篩選。使用在不存在肽下再摺疊之 MHCI 複合物 (無肽對照) 計算 S/N 值以作為測定背景的量度。儘管兩種形式之訊號及檢測範圍相當，但在高於 0.25 µg/mL 之濃度下，形式 2 (圖 47A，黑色條) 之 S/N 值遠高於形式 1 (圖 47A，白色條)。據信，形式 2 之較高特異性係因為捕獲步驟使用識別 MHCI 上之構形表位且應僅對適當摺疊之 MHCI 具有選擇性的抗 HLA 抗體。與之相比，抗 B2M 捕獲並不依賴於適當摺疊之 MHCI 且將捕獲具有適當摺疊之 HLA 以及部分變性之 HLA 的複合物，據信，此可解釋形式 1 之無肽對照的較高檢測訊號。基於該等發現，選擇形式 2 進行剩餘篩選。圖 47B 展示在使用 ELISA 時隨 MHCI 或 MHCI-肽濃度而變化之 ELISA 結果。如材料及方法中所闡述之形式 2 使用經 CMV pp65 肽、BMRF1 肽及不使用肽 (背景對照) 再摺疊的 MHCI 分子。隨著 MHCI 濃度增加可觀察到，CMV pp65 及 BMRF1 肽之 OD450/620 ELISA 訊號有所增加，但無肽對照之訊號增加極小，此與適當再摺疊之 MHCI 複合物的檢測一致。圖 47C 展示使用無肽對照作為背景之 ELISA 分析在 1 μg/mL 之 MHCI 濃度下 CMV pp65 及 BMRF1 的 S/N。兩種抗原之訊號皆 10 倍於背景，從而證實此測定形式產生高度靈敏之 S/N 且可易於用於鑑別可在再摺疊步驟期間形成穩定 MHCI 複合物的抗原。另外，標準偏差極小 (圖 47B、47C)，從而指示該測定對於既定實驗而言可高度再現且可用於可靠地選擇最佳肽而無需一式兩份地執行測定。測定最佳化之目標在於研發可高度再現且無需一式兩份或一式三份地運行的測定以便於篩選數百種等位基因，且基於該等結果認為此目標已達成。
跨 HLA 等位基因之肽結合物及條件化 MHCI 配體的鑑別。自 IEDB 選擇肽 (表 3)。使用上述 ELISA 測定分析該等肽與相應 HLA 等位基因形成穩定 MHCI 複合物之能力。使用 5 種肽及 HLA-A*02:03 生成之再摺疊 MHCI 複合物的滴定曲線展示於圖 48A 中。在介於 0.1 µg/mL 至 3.0 µg/mL 之間的 MHCI 濃度下執行該測定，且如圖 47B 中針對陽性對照所觀察，在遞增 MHCI 濃度下 ELISA OD 有所增加且訊號在高於 1 µg/mL 下開始飽和。另外觀察到，陰性對照之訊號在滴定範圍內僅具有極小增加。選擇 1.0 μg/mL 濃度來比較 A*02:03、B*35:01 及 C*02:02 等位基因之 S/N ELISA 值，此乃因略低於飽和 (EC60-EC85，端視肽-HLA 組合) (圖 48B-48D)。針對 A*02:03 篩選之 5 種肽的 S/N 背景相對較高，且其值介於 20 至 40 之間。此表明，所有選自 IEDB 之肽不僅係結合物，且亦可在再摺疊時形成穩定 MHCI 複合物。A*02:03-02 肽產生最高 S/N 值且選擇用於設計 UV 肽。對於 B*35:03 而言，所選肽之 S/N 值亦具有介於 6.75 至 7.25 之間之相對較高的 S/N 背景 (圖 48C)。B*35:03-04 產生最高 OD 值且隨後選擇用於設計候選條件化 MHCI 配體。 C*02:02 肽之 S/N 值皆介於 18 與 20 之間，C*02:02-02 除外，其值極低 (約 8) (圖 48D)。C*02:02-03 產生最高 S/N 值且選擇用於設計候選條件化 MHCI 配體。亦測試 A*26:01、B*18:01 及 C*14:02 且觀察到類似結果 (圖 54A-54F)。儘管所測試所有等位基因之 S/N 皆相對較高且提供該測定鑑別形成穩定複合物之肽的信心，但各等位基因中之 S/N 的量級存在顯著差異。據信，該等結果可能係因為不同 HLA 等位基因之泛-HLA 抗體的親和力有所變化。與之相比，既定等位基因 (例如 A*02:03 及 C*02:02) 內之可變性可能係因為所篩選不同肽中的肽親和力差異。
使用在自 N-末端起之位置 2、4、6 及 8 處經取代之 UV-可裂解胺基酸 (表示為 J) 來設計初始篩選中之性能排名居前之肽的變異體 (亦即 A0203-02、B3503-04 及 C0202-03) (圖 48B-48D)，從而鑑別在不同 HLA 等位基因中形成穩定複合物之 UV-肽。使用衍生自 A0203-02 肽之 4 種所篩選條件化 MHCI 配體組裝之 MHCI 複合物的滴定曲線展示於圖 48E 中。如針對非-UV 可裂解肽所觀察，在遞增 MHCI 濃度下觀察到 ELISA OD 有所增加且其值在 1 µg/mL 下開始飽和 (圖 48E)。所有條件化 MHCI 配體在不同等位基因中之 ELISA S/N 展示於圖 48F-48H 中。在位置 2 處具有 J 胺基酸取代之所有條件化 MHCI 配體變異體皆展示極低 S/N ELISA 值 (圖 48F-H)，從而指示相對於親代肽形成極少 MHC 複合物 (A0203-02-01、B3503-05-01、C0202-03-01 及 C0202-03-04) (圖 48E-48F，灰色條)。此發現可以預期，此乃因此位置已知係 MHCI-肽錨定位置。針對 A0203-02 及 B3503-04 篩選之所有其他條件化 MHCI 配體皆產生類似於親代肽的 S/N 值 (圖 48F-48G)。與之相比，C0202-02 之所有條件化 MHCI 配體的 OD 值皆低於親代；然而，C0202-02-02 及 C0202-02-03 之 S/N 仍相對較高 (分別為 6 及 8) (圖 48H)，從而指示 UV 可裂解胺基酸對 MHCI 穩定性具有輕微負面影響。然後選擇產生最高 S/N 值之條件化 MHCI 配體 (A0302-02-02、B3503-04-02 及 C0202-03-03) 進行擴大產生。執行類似分析以鑑別 A*26:01、B*18:01 及 C*14:02 等位基因之最佳條件化 MHCI 配體 (圖 54A-54F)。
MHCI 單體之擴大再摺疊及純化。在 20 多年前首次研發經由在所關注肽存在下再摺疊自 大腸桿菌包涵體純化之變性 B2M 及 HLA 來生成重組 MHCI 複合物。自此初始報導以來，已研發許多研究及方法來使用再摺疊方案生成及純化 MHCI 複合物。該等方法中之大部分包括下列過程的一定變化形式：(1) 在具有氧化還原/氧化劑之通用再摺疊緩衝液中混合 HLA 及 B2M 與肽 (培育時間可自 1-5 天不等)，(2) 過濾再摺疊材料以去除聚集體，(3) 濃縮至與粒徑篩析層析法 (SEC) 相容之體積 (端視管柱為 1-2 mL)，(4) 使用 SEC 純化，(5) 使經純化之再摺疊 MHCI 複合物生物素化，及 (6) 在生物素化反應之後純化 MHCI 複合物 (SEC、旋轉管柱過濾器等)。該等產生方法中之大部分僅以 1 L 規模或更小規模實踐且僅產生幾毫克再摺疊材料；因此，需要多個產生運行來產生用於支持臨床項目之足夠材料。多個運行可潛在地產生批次間可變性，此可混淆下游四聚體染色資料之詮釋。為解決該等限制，研發使得能夠將 MHCI 再摺疊及純化擴大至 15 L 之新穎工作流程。
此研究中所研發之再摺疊及純化方案的示意圖展示於 圖 49 中。為達成方法最佳化，使用公開之 HLA-A*02:01 特異性條件化 MHCI 配體。擴大產生之主要限制係需要 SEC 純化步驟，該步驟需要高度濃縮之樣品。另外，通常對經純化之再摺疊 MHCI 複合物執行生物素化步驟且需要二級純化步驟，此會進一步限制擴大產生。為解決該等限制，研發三-步驟產生過程，其包括再摺疊反應、過程中生物素化及陰離子交換層析純化 (圖 49)。MHCI 複合物之 HLA 組分在生物素化步驟之前及之後的 LC/MS 分析展示於圖 50A 中。黑色線展示生物素化前之 HLA 蛋白。在 34812 Da 及 34943 Da 下觀察到兩個峰，其對應於具有及不具有 N-末端甲硫胺酸基團之 HLA 蛋白。該兩個群體可能係藉由不完全修飾且隨後分別藉由甲醯基甲硫胺酸去甲醯酶及甲硫胺酸胺基肽酶 (MAP) 去除甲醯基甲硫胺酸及 N-末端甲硫胺酸所產生，該去除可端視毗鄰胺基酸而有所變化且在一些情形下並不去除 N-末端甲硫胺酸。因此，N-末端 HLA 序列可能不適用於總 MAP 活性，故僅觀察到部分 N-末端去除。在生物素化之後觀察到，兩個峰之質量增加約 244 Da，此對應於生物素質量 (圖 50A)。未觀察到非生物素化質量下之殘餘峰，從而指示 100% 生物素化。該等組合結果證實，可採用過程中生物素化步驟來消除兩個純化步驟之需要。
在完成生物素化步驟之後，將所得生物素化反應液緩衝液交換至 25 mM Tris (pH 8.0) 中且備用於經由陰離子交換層析之純化。相對於 SEC 選擇陰離子交換進行純化，此乃因後者適於直接加載用於生物素化步驟期間之較大體積 (10–100 mL)。1 L 再摺疊之代表性 Q-HP 陰離子層析圖及梯度展示於圖 50B 中。在約 130 mL 之溶析體積下觀察到較大峰以及若干較小峰，該等較小峰可能代表來自包涵體純化之較少污染物。在 SDS-PAGE 上運行來自主峰之餾分，且跨峰觀察到對應於 HLA-A*02:01 及 B2M 之預期 MW 的帶 (圖 50C)。基於在 SDS-PAGE 分析中於 HLA 及 B2M 之預期分子量下存在帶來彙集餾分並運行於 LC/MS 及 SEC-MALS 上。經純化之生物素化 MHCI 複合物的 TIC 層析圖展示於圖 50D 中。滯留時間 1.7 min 及 1.75 min 下之兩個毗鄰峰對應於使用外消旋 UV胺基酸產生之條件化 MHCI 配體的 R 及 S 非對映異構體。滯留時間 1.8 min 及 2.2 min 下之峰分別對應於 B2M 及 HLA-A*02:01。生成 B2M 及 HLA-A*02:01 之標準曲線，且使用曲線下面積來量化B2M 與 HLA 之莫耳濃度及莫耳比率。若再摺疊過程使得 B2M 與 HLA 適當配對，兩種組分之莫耳比率應接近 1。在此製備中，該比率經計算為 0.95，從而表明已適當配對。藉由 SEC-MALS 進一步分析 MHCI 複合物以供天然質量分析，從而進一步證實適當之 1:1 HLA:B2M 配對及樣品單分散性。A280 SEC 層析圖峰高度對稱 (指示均質及單分散之蛋白質樣品)，且未觀察到聚集體峰 (圖 50E)。跨 MHCI 峰之 MW 介於 48.8 kDa 至 51.3 kDa 之間 (圖 50E，紅色虛線) 且平均值為 49.1 kDa，其接近 MHCI 複合物之預期 MW (48.1 kDa)。LC/MS 及 SEC-MALS 分析共同表明，再摺疊及純化方案會產生高純及適當摺疊之 MHCI 複合物 (圖 50F)。
研發新穎純化工作流程之主要目標之一在於使得能夠擴大產生。為測試可擴展性，在 5 L (200 mg) 及 15 L (600 mg) 規模下執行最佳化 1 L (40 mg HLA 及 B2M 起始材料) 方案。在該等產生規模下藉由計算相對於添加至再摺疊反應中之材料質量之最終經純化再摺疊材料的質量來量化再摺疊 (產率 % ± 標準偏差) (圖 50F)。有趣的是，據觀察，隨著該過程自 1 L (約 6%) 擴大至 5 L (約 8%) 至 15 L (約 11%)，平均產率 % 逐漸增加且發現 1 L 規模與 15 L 規模之間的產率差在統計學上較為顯著 ( p-值 ＜0.05)。自 1 L 規模及 15 L 規模生成之 MHCI 複合物的量分別為約 2.4 mg 及 約 60 mg，此對應於在 15 L 規模下每一再摺疊之材料生成增加 25 倍。該等組合發現證實，可使用此研究中所闡述之工作流程來擴大 MHCI 複合物的產生及純化。
6 種 MHCI 單體與自 HTP 篩選鑑別之 UV 肽的擴大產生及肽交換分析。應用上述再摺疊及純化方案以使用 HTP 篩選中所鑑別之條件化 MHCI 配體來大規模產生 MHCI 複合物。所有 6 種構築體之 Q-HP 陰離子層析圖及所彙集餾分的相應 SDS-PAGE 展示於中 圖 55A-F 中。該等再摺疊物之層析圖極類似於 HLA-A*02:01 (圖 50B)，且在 SDS-PAGE 中具有清晰之 HLA 及 B2M 帶。在 SDS-PAGE 上運行每一 HLA 等位基因之所彙集餾分且觀察到對應於 HLA 及 B2M 的高純帶 (圖 51A)。1 L 再摺疊之產率 % 在樣品間有所變化，其中 A*02:03、B*18:01 及 C*02:02 具有最高產率 (介於 8% 至 11% 之間)，隨後係 B*35:03 (約 5%)、C*14:02 (約 4%) 及 A*26:01 (約 2.5%) (圖 51B)。此可變性可能係因為胺基酸序列含量差異及再摺疊期間之聚集易感性以及肽形成穩定複合物的能力。儘管存在可變性，但 2.5% 之最低產率仍自 1 公升再摺疊物產生 1 mg 材料且在 15 公升規模下此可擴大至 ＞ 15 mg，此足以涵蓋 ＞30,000 種四聚體染色劑。執行 LC/MS 及 SEC-MALS 分析以進一步評估該等 MHCI 單體之品質且評價 B2M 及 HLA 是否適當配對。B2M 之 LC/MS 分析的結果：6 種等位基因中之 HLA 比率展示於 圖 51C 中。如針對 HLA-A*02:01 MHCI 複合物所觀察，所有該等樣品之B2M:HLA 比率皆接近 1。藉由 SEC-MALS 進一步分析 MHCI 複合物以供完整天然狀態質量分析。所分析所有 6 種 MHCI 複合物之 MHCI 峰的平均 MW 展示於圖 51D中。所有 6 種構築體之 MW 皆介於 47.4 kDa 至 48.8 kDa 之間，此完全在該等複合物之預期質量範圍 (47.5 - 48 kDa) 內。該等組合發現證實，再摺疊方案及純化工作流程不僅可廣泛應用，且亦在小規模 HTP 測定中所鑑別之條件化 MHCI 配體能夠在擴大後形成穩定 MHCI 複合物。
除鑑別可用於擴大產生 MHCI 單體之新穎條件化 MHCI 配體外，亦期望證實該等複合物可在 UV 暴露後發生肽交換以使得能夠 HTP 生成 MHCI 複合物。用於測量條件化 MHCI 配體在 UV 暴露後之肽交換之最廣泛使用之方法之一為 ELISA。儘管此測定已證實可用於證實 UV 暴露後之肽交換，但該測定係半定量的，且既不直接測量經交換之肽亦不容許量化所裂解肽。為解決該等限制，研發 2D LC-MS 分析方法以直接量化在交換過程期間加載至複合物中之肽。該測定之示意圖展示於圖 52A 中。此方法中之第一步驟 (第 1 維) 係將肽交換反應混合物 (暴露於 UV 後之 MHCI 複合物+ 100 倍莫耳過量之經交換之肽) 注於分析型 SEC 管柱上，此使得能夠藉由採樣閥收集不含過量肽之 MHCI 複合物。第二步驟 (第二維) 係將自 MHCI 峰收集之材料注於 RP-HPLC 上。RP-HPLC 步驟之有機相可使 HLA、B2M 及含於複合物內的肽解離及變性，此使得能夠藉由讀取 280 nm 下之吸光度及 LC/MS 來分析及量化 MHCI 複合物的個別組分。具有 CMV pp65 表位之對照 HLA-A*02:01 條件化 MHCI 配體之肽交換之第 1 維 SEC 層析圖的一實例展示於圖 52B 中。層析圖展示對應於 MHCI 複合物之一個主峰。在 2.5 min 與 3 min 之間始終觀察到層析圖 A280 訊號的波動，此對應於採樣閥之打開及關閉。因在第 1 維與第 2 維之間存在較大壓力差，故此波動可能與隨著閥門打開及關閉壓力之突然變化有關。第二維 HPLC 步驟之 A280 層析圖的一實例展示於圖 52C 中。HLA 及 B2M 峰清晰可見，但未觀察到 CMV pp65 肽或條件化 MHCI 配體之 A280 峰，此乃因其不含任何色胺酸或酪胺酸殘基且由此並無固有 A280 吸光度。為分析肽組成，生成交換肽及未裂解條件化 MHCI 配體之提取離子交換層析圖 (圖 52D)。如所預計，觀察到對應於 CMV pp65 肽之較大峰，從而指示成功肽交換。然而，亦觀察到極低含量之完整條件化 MHCI 配體。此結果表明，經純化肽具有與條件化 MHCI 配體具有類似質量之合成源污染物 (其複合至 MHCI 分子且攜載於 2D LC/MS 分析中)，或小部分條件化 MHCI 配體在處於複合物中時可經保護以免於 UV 裂解。當在不存在 MHCI 下裂解單獨之肽時，亦觀察到此峰，從而表明此為污染物。無論如何，完整條件化 MHCI 配體之相對分率極低 (約 1%) 且應對下游四聚體染色具有最小影響。執行相同分析以驗證是否存在經裂解條件化 MHCI 配體，且未檢測到峰。藉由採用 2D LC/MS 測定來分析肽交換，能夠測量 MHCI 複合物中之肽含量在肽交換過程期間如何變化。據信，此係可用於較佳地理解與肽交換相關之參數的有效工具，該等參數不能使用其他傳統方法 (例如 ELISA) 來量化。
然後使用此方法來評價使用擴大產生工作流程生成之 MHCI 複合物與在 HTP 小規模測定中所鑑別之新穎條件化 MHCI 配體的肽交換。對於每一 MHCI 複合物而言，分別使用發現係小規模 HTP 篩選中之結合物之 4 -5 種肽 (圖 48B-D、54A-54C) 及一種已知非結合肽作為陽性對照及陰性對照。具有肽 A0203-05 之 HLA-A*02:03 的第一維 SEC 層析圖展示清晰單峰 (圖 52E)。肽交換複合物之第二維 HPLC A280 層析圖亦展示預期 B2M 及 HLA 峰 (圖 52F)。在第二維之 EIC 分析中，觀察到對應於 A0203-05 肽之提取質量的較大峰 (圖 52G，黑色線)。
然而，類似於 A*02:01 及 CMV pp65 之肽交換，亦觀察到對應於完整條件化 MHCI 配體之較小峰(圖 52G，虛線)。此現象可見於所測試之所有條件化 MHCI 配體中且指示在肽交換過程期間存在且攜載一些低含量污染物。值得注意地，在所有情形下，污染物肽之總分率皆小於 1%。HLA-A*02:03 MHCI 複合物在與已知非結合物肽交換之後的第 1 維 SEC 層析圖展示於圖 52H 中。該等條件下之總峰面積低於使用肽結合物執行肽交換過程時 (圖 52E 對 52H)。另外，第二維中之 A280 HPLC 層析圖含有兩個峰，但總峰面積遠低於使用肽結合物時 (圖 52F 對 52I)。該等組合資料表明，在使用非結合物執行肽交換時，存在顯著材料損失，此可能係因為蛋白質聚集。
有趣的是，在所測試之所有等位基因中針對陰性對照交換樣品始終觀察到在 SEC 運行結束時的峰 (圖 52H，滯留時間約為 3.6 min)，據信此係因為部分變性之 HLA 與管柱發生相互作用。最後，在 EIC 分析中，未觀察到對應於 A0203 非結合肽之峰，從而指示並不發生肽交換 (圖 52J)。令人吃驚地，儘管沒有肽與複合物締合，但在第 1 維中觀察到相對顯著之 A280 峰，只是該峰遠小於使用肽交換觀察之峰。該等結果表明，一些複合物在不存在肽下保持締合，但可能具有較低品質且並不適當摺疊。
第一維及第二維資料之量化展示於 圖 53A-53F 中。在此分析中，評估在交換之後回收於第 1 維 (SEC) 中之 A280 MHCI 峰的分率及在第 2 維 (EIC) 中是否存在經交換之肽。圖 53A-53F 展示在 4 -5 種陽性對照及 1 種陰性對照中不同 MHCI 複合物之所回收 A280 MHCI 峰的分率 (繪製為相對於非肽交換對照之比率)。在第二維中檢測所有測試肽 (不相關肽除外)。對於 HLA-A*0203，陽性對照結合肽之回收分率自 0.9 至 1 不等且在第二維中針對所有肽皆觀察到交換肽。如上所述，陰性對照之回收分率仍相對較高 (約 0.76)，即使觀察到零經交換之肽、經裂解條件化 MHCI 配體及極低含量之完整條件化 MHCI 配體 (＜1%)。此表明，複合物在不存在肽下在一定時段內保持一定程度的完整，但考慮到 HLA 等位基因在不存在肽下之不穩定性其可能並不適當摺疊。
針對 A*26:01 (圖 53B)、B*18:01 (圖 53C)、B*35:03 (圖 53D) 及 C*14:02 (圖 53F) 觀察到類似結果。在所有情形下，第一維中之陽性對照與陰性對照之間的峰面積差皆小於 20–25%。與之相比，陰性對照及陽性對照針對 C*02:02 具有顯著差異 (圖 52E)。對於此樣品而言，在已知非結合肽包括於肽交換中時，約 80% 之材料發生降解。儘管此現象之確切原因未知，但其可能係因為在已自 HLA 上之肽凹槽去除肽時不同等位基因能夠保持與 B2M 締合。無論如何，該等組合結果明確指示，已鑑別容許擴大產生 MHCI 肽且隨後發生肽交換以 HTP 生成 MHCI 單體及四聚體的條件化 MHCI 配體。
結論 .需要研發用以擴大針對其鑑別條件化 MHCI 配體之 HLA 等位基因數量的工作流程，從而改良患者 CI/IO 療法反應之 MHCI 四聚體分析的覆蓋範圍。此手稿中所概述之方法提供了擴展至寬範圍之 HLA 等位基因的藍圖。使用此工作流程選擇之所有條件化 MHCI 配體皆在擴大時產生相對較高產率及較高品質的條件化 MHCI 複合物。基於此研究之組合發現，據信，此方式可普遍適用且使得能夠在較寬範圍之 HLA 等位基因中 HTP 生成 MHCI 單體及四聚體，此對於使得能夠在臨床中使用 MHCI 四聚體來監測新抗原特異性 T 細胞至關重要。
上述說明書中所提及之所有出版物皆以引用方式併入本文中。本發明之所闡述方法及系統之各種修改及變化為熟習此項技術者所明瞭，其並不背離本發明之範圍及精神。儘管已結合具體較佳實施例闡述了本發明，但應理解，所主張之本發明不應過度地限於該等具體實施例。實際上，熟習生物化學及生物技術或相關領域者所明瞭之對於用於實施本發明之所闡述模式之各種修改皆意欲屬申請專利範圍的範圍內。
表 1 ： SEC- 天然 MS 及 CZE- 天然 MS 之質譜參數
Figure 02_image001
* C. Ren 等人， Analytical Chem., 91: 903-911 (2019)；** K.K.Joshi 等人， MAbs11: 1254-65 (2019)
表 2 ：表 1 之參數說明
Figure 02_image003
表 3 ：用於初始再摺疊篩選之 IEDB 選擇肽。
Figure 02_image005
表 4 ：用於再摺疊篩選之條件化 MHCI 配體序列。
Figure 02_image007
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圖 1係繪示用以篩選 MHCI 之肽結合物之高通量測定的卡通圖。使泛-HLA 捕獲抗體接附至 ELISA 盤。在一鍋式再摺疊反應中於 ELISA 盤存在下混合未摺疊 HLA、變性/復性 B2M 及肽。藉由泛-HLA 捕獲抗體捕獲穩定 MHCI/B2M/肽複合物。藉由添加抗 B2M 生物素化二級抗體且隨後添加檢測用卵白素 (streptavidin)-HRP 複合物經由 HRP-HRP 受質生物發光反應來確定 MHCI/B2M/肽複合物之相對數量。 圖 2展示在各結合物中平均化之經捕獲 MHCI/B2M/肽複合物 (經由二級抗體報告基因) 之正規化 (相對於不存在肽，樣品訊號/陰性對照訊號) ELISA 訊號的條形圖圖示。圖片 A 展示 38 種不同 HLA、HLB 及 HLC 等位基因在 1 - 40 個反應單位範圍內之正規化訊號，且圖片 B 展示 38 種在 B2M 及肽存在下再摺疊之 HLA、HLB 及 HLC 等位基因在 1 - 5 個反應單位範圍內的正規化訊號。 圖 3A 及 3B展示 MHCI/B2M/肽結合物中之平均化 ELISA 訊號的條形圖圖示。圖 3A 中之條形圖展示，一些等位基因對用於標記 ELISA 盤之泛-HLA 抗體具有低親和力。圖 3B 中之條形圖展示，一些 MHCI/B2M 複合物在不存在肽下較為穩定。虛線指示 A 與 B 中之相同訊號位準。箭頭指示係低捕獲抗體結合物之特定 MHCI 等位基因 (A) 及在不存在肽下較為穩定之特定 MHCI/B2M 複合物 (B)。 圖 4A 及 4B展示在 UV 肽 (含有 UV-可裂解胺基酸之肽) 存在下 MHCI/B2M/UV 肽結合物中之平均化 ELISA 訊號的條形圖圖示。圖 4A 展示 MHCI/B2M/UV 肽複合物在 1 - 40 個反應單位範圍內之整體正規化訊號。圖 4B 展示 1 - 5 個反應單位範圍內之正規化訊號，從而指示在不存在肽下形成穩定複合物之特定等位基因 (S) 及捕獲抗體對其具有低親和力的等位基因 (L)。 圖 5係比較 18 種不同 HLA/HLB 等位基因之擴大再摺疊純化之正規化 ELISA 結果及產率的條形圖。黑色條指示如藉由 ELISA 所檢測由所形成 MHCI/B2M/肽複合物生成的相對訊號。灰色條指示產生 1 L 每一 MHCI/B2M/肽複合物之產率 %。水平線指示 MHCI/B2M/肽複合物品質控制之 1% 截止值。名稱 (S)、(L) 分別係指在不存在肽時較為穩定之 MHCI/B2M 複合物及捕獲抗體對其具有低親和力的 MHC/B2M/肽。 圖 6展示三種肽之 MHC/B2M/肽交換測定之 2-D LC/MS 特性化的代表性粒徑篩析及反相層析圖及質譜。 圖 7係 MHCI 等位基因及可與本文實施例中之等位基因締合之肽序列的列表。每一胺基酸由其標準單字母縮寫代表。J 代表非天然 UV 可裂解胺基酸。 圖 8A-8C.圖 8A 係用於檢測經組裝 MHCI/B2M/肽複合物之時間解析螢光共振轉移測定 (TR-FRET) 的卡通圖圖示。圖 8B 係表示用以測量 MHCI 複合物之熔融溫度之熱位移且由此測量結合之差示掃描螢光法 (DSF) 測定的示意圖。圖 8C 係 HLA*03:01 肽結合物及非結合物之代表性光譜，其中熔融溫度 (Tm) 發生移位以指示複合物形成的焓變化。 圖 9A 及 9B展示用以發現不同等位基因之高親和力肽之 TR-FRET 測定的條形圖圖示。圖 9A 繪製每一所測試複合物在 37℃ 及 4℃ 下之 665 nm 下螢光的變化。圖 9B 係 TR-FRET 測定之相對準確度對 MHCI 等位基因的條形圖，準確度自 85% 至 100% 不等。 圖 10A - 10D.圖 10A 提供比較含有 MHCI HLA*03:01 之複合物之肽結合物及非結合物的對比性 DSF 光譜。在低溫 (20℃) 下，存在結合肽之複合物的相對螢光 (RFU) 較低，且不結合肽之複合物的相對螢光較高。肽結合物 DSF 光譜展示類似之 Tm 溫度範圍，而非結合物則具有較低 Tm。圖 10B 係肽結合物 (黑色) 及非結合物 (灰色) 之總數對 RFU 值的條形圖。圖 10C 係肽結合物 (黑色) 及非結合物 (灰色) 之總數對 RFU 值的條形圖。圖 10D 係 4 種不同 MHCI 等位基因之測定準確度 % (皆 ＞90%) 的條形圖。 圖 11A - 11D.圖 11A 提供比較含有 MHCI HLA*08:01 之複合物之肽結合物及非結合物的對比性 DSF 光譜。在低溫 (20℃) 下，在存在肽結合物及非結合物時，相對螢光 (RFU) 類似。肽結合物/非結合物 DSF 光譜皆展示類似之 Tm 溫度範圍。圖 11B 的肽結合物 (黑色) 及非結合物 (灰色) 之總數對 Tm 溫度的條形圖。圖 11C 係肽結合物 (黑色) 及非結合物 (灰色) 之總數對 RFU 值的條形圖。圖 11D 係 4 種不同 MHCI 等位基因之測定之準確度 % (60 - 85% 之準確度) 的條形圖。 圖 12係 TR-FRET「真正結合物」百分比對預測百分等級之條形圖圖示。百分等級係藉由經由肽/MHCI 結合之預測演算法運行肽序列所計算的值 (Nielsen M 等人，Protein Sci. ( 2003) 12:1007-1017；Andreatta M 及 Nielsen, M. Bioinformatics ( 2016) Feb 15;32(4):511-517)。藉由演算法將百分等級小於 2.00 (虛線左側) 之肽歸類為 MHCI 結合物。本文所闡述之方法及測定鑑別出諸多係真正結合物但藉由預測演算法歸類為非結合物的肽-HLA 組合。 圖 13係用以確定隨時間變化之 MHCI/B2M/肽交換之 2-D LC/MS 測定的示意圖。在第二、交換肽存在下，將 MHCI/B2M/UV-可裂解肽複合物暴露於 UV 光，從而裂解 UV-可裂解肽之肽鍵。在 MHCI/B2M 複合物存在下，第一肽之裂解片段交換為全長第二肽。在某些時間點，藉由以下各項來分析交換混合物：1) 「第一維」：粒徑篩析層析法 (SEC)，其分離 MHCI/B2M/肽複合物與游離 MHCI、B2M 及肽；2) 「第二維」：SEC 峰之反相 HPLC，其分離峰組分；及 3) 個別反相峰之質譜分析，其鑑別及量化峰組分。 圖 14展示作為每一等位基因之交換物或非交換物之 10 種肽的驗證圖片，其展示為多種肽與 MHCI/B2M/UV-肽複合物隨時間之交換 % 的繪圖，如藉由 2-D LC/MS 所測量。上部資料點指示肽發生交換 (觀察於第二 HPLC 峰中) 且並不損失 MHCI 峰 (觀察於第一 SEC 峰中) 的 MHCI/肽複合物。中間資料點指示損失一定之 MHCI SEC 峰面積但滯留交換肽，且下部資料點指示大量損失 MHCI SEC 峰且並無交換肽。 圖 15係 2-D LC/MS 測定的示意圖，該測定用以確定 40 種肽之池隨時間的 MHCI/B2M/肽交換。在池交換肽存在下，使 MHCI/B2M/UV-可裂解肽複合物暴露於 UV 光，從而裂解 UV-可裂解肽之肽鍵 。在 MHCI/B2M 複合物存在下，第一肽之裂解片段交換為全長肽。在某些時間點，藉由以下各項來分析交換混合物：1) 粒徑篩析層析法 (SEC)，其分離 MHCI/B2M/肽複合物與游離 MHCI、B2M 及肽；2) SEC 峰之反相 HPLC，其分離峰組分；及 3) 個別反相峰之質譜分析，其鑑別及量化峰組分，包括量化來自交換池之不同肽的數量。本文之圖形展示與 MHCI HLA-A*01:01 之交換反應中所包括 40 種肽之池中之 10 種已知肽結合物隨時間的強度。此方法容許在單一運行中鑑別多種肽結合物。 圖 16展示使用 UV-可裂解第一肽 (淺色及深色圓) 之 MHCI 肽交換過程的示意圖，該第一肽在 UV 裂解之後對 MHCI 結合袋之親和力有所減小，且由此由可為患者預測表位之所關注肽 (較深色實心圓) 代替。 圖 17A 及 17B展示未結合肽、具有可交換肽 (具有雙色圓) 及在肽交換之後具有所關注肽 (具有淺色圓) 之 SEC-MS 量化之游離 HLA 及 MHCI 複合物的實例。圖 17A 展示 HLA 及完整 MHCI 複合物之量化，而圖 17B 展示來自肽交換前及肽交換後之 MHCI 複合物的訊號。 圖 18A-18D展示在 SEC 及 CZE 分離之後的 MS 分析。圖 18A 及 18B 展示在 SEC 分離後藉由 MS 對不同濃度之肽複合物的解析。注入體積為 4 µL。圖 18C 展示在 ZipChip™ CZE 裝置上進行 CZE 分離後藉由 MS 對實例性肽複合物進行的解析。在 100 µg/mL 下以 3 nL 注入體積進行注入。圖 18D 展示實例性可交換肽在 UV 暴露前(上圖；雙色圓) 及在 CZE 分離後實例性所關注經交換之肽在 UV 暴露後 (下圖，實心圓) 的 MS 分析。 圖 19A 及 19B展示實例性資料，其中評價來自 SEC-天然 MS 分析之諸多不同實例性肽的肽交換百分比。如圖 19A 中所展示，首先評價交換以確保飽和。交換為所關注肽之可交換肽的分率展示於圖 19B 中。 圖 20展示產生及組裝用於免疫監測患者 T 細胞之 MHCI 四聚體的工作流程示意圖。 圖 21展示評價 UV-可裂解肽與重組 MHCI 複合物之第二所關注肽之交換型態之方法 (包括 ELISA、TR-FRET 及 2D-LC/MS) 的卡通圖示意圖。 圖 22展示使用 SEC-MS 測量完整 MHCI 複合物之工作流程示意圖及兩個實例性質譜。 圖 23展示一實例性天然質譜，其係具有及不具有結合肽之各種天然 MHCI 物質之相對豐度對 m/z (質量對電荷) 的繪圖。使用具有或不具有結合肽之相應 MHCI 複合物之卡通圖圖示標記光譜中的每組電荷狀態。 圖 24展示具有結合肽之 MHCI 複合物之實例性天然質譜繪圖之單電荷狀態的放大視圖。各個峰指示不同電荷狀態，該等不同電荷狀態對應於具有及不具有肽或具有及不具有緩衝加合物或具有或不具有起始甲硫胺酸之不同 MHCI 複合物。 圖 25展示同一肽交換反應之兩個不同時間點的實例性質譜。具有或不具有結合肽之相應 MHCI 複合物標記於每一峰上方。 圖 26展示用於量化肽交換時程後之完整 MHCI 複合物的兩個實例性質譜。使用所存在 MHCI 物質之卡通圖圖示標記每一光譜中的峰。右側之反褶積光譜展示與 UV-可裂解肽或交換時程後之經交換之肽結合的 MHCI 複合物。 圖 27係展示藉由 SEC-MS 監測 MHCI 複合物及由 UV 光暴露引發之肽交換反應之三種基於質譜 (MS) 之方法的示意圖。藉由高解析度 MS (HR-MS) 測定每一樣品之組分，藉由天然 MS 實施天然 MHCI 複合物組成分析，且藉由使用天然 MS 測量隨時間之交換 % 來確定肽與 MHCI 複合物之間的結合親和力。 圖 28係不同 MHCI HLA 等位基因及不同肽之一次性高通量篩選示意圖的卡通圖圖示。在已自 PBMC 樣品分選患者源 T 細胞之後，可以高通量形式進一步測試該等 T 細胞對 MHCI HLA 等位基因/預測肽表位之數千種不同組合的 離體反應性。 圖 29展示具有及不具有 UV-可裂解結合肽之 HLA-A*02:01 MHCI 複合物在一定濃度範圍內的質譜。注於配備有 SEC 之 uHPLC 上之濃度範圍為 2.5 mg/mL 至 83 µg/mL，且每一注入之注入體積為 4 µL。所關注蛋白質物質 (具有或不具有結合肽之 MHCI 複合物) 以單峰形式共溶析於 SEC 層析圖中 (以強度對時間之繪圖形式，突出顯示)。每一可能之蛋白質物質以卡通圖形式指示於質譜中的相應峰 (對應於 SEC 層析圖單峰) 上方。 圖 30展示在配備有 HSN ZipChip 之質譜儀上重複注入3 nL 0.1 mg/mL HLA-A*02:01 MHCI 複合物的多個電泳圖及相應 MS1 質譜。 圖 31展示在配備有 HSBG ZipChip 之質譜儀上重複注入3 nL 41.0 或 20.5 µg/mL HLA-A*02:01 MHCI 複合物的多個電泳圖及相應 MS1 質譜。 圖 32展示在用以最佳化 MHCI 複合物分析之儀器條件之不同帽溫度及 ESI 鞘氣體源設定下所收集的質譜。 圖 33展示 SEC-MS 與 CZE-MS 之間的對比。頂列 (自左至右) 展示 HLA-A*01:01之 SEC-MS 分析的代表性層析圖、MS1 光譜及反褶積峰光譜。底列 (自左至右) 展示 HLA-A*01:01 之 CZE-MS 分析的代表性電泳圖、MS1 光譜及反褶積峰光譜。 圖 34展示多個蛋白質濃度之 HLA-A*01:01 的重複電泳圖及相應反褶積質譜。在每一運行中，在 500 V/cm 之電壓下將 3 nL 蛋白質注於 HSBG 晶片上。樣品濃度範圍為 41 - 2.05 µg/mL。 圖 35展示在分析之前藉由去鹽旋轉管柱或藉由旋轉去鹽盤緩衝液交換蛋白質樣品的兩種方法。 圖 36展示在 UV 光引發之肽交換反應之前及之後MHCI 蛋白複合物的所得反褶積質譜。每一峰中之 MHCI 物質組成由卡通標記指示。 圖 37展示對於諸多不同交換肽 (由 x 軸上所標記之數字指示，每條一個) 及 4 種不同 MHCI 等位基因 (指示於每一條群組下方) MHCI 複合物形成及 MHCI/肽交換反應之完整度 % (y 軸) 的兩種不同條形圖圖示。頂列展示游離 HLA 對 MHCI 複合物之相對量。底列展示具有 UV-可裂解結合肽 (UV-MHCI) 或經交換結合肽(pMHCI) 之 MHCI 複合物的相對量。 圖 38展示包括 α 鏈及 B2M 之 MHCI 複合結構之卡通示意圖以及具有及不具有起始甲硫胺酸與具有純化加合物之 MHCI 複合物的反褶積質譜，該等質譜係分析於擴展質量範圍 (EMR) Exactive Orbitrap (灰色光譜) 或 Orbitrap Eclipse (黑色光譜) 上且僅顯示 EMR 分析中之氣相肽解離。每一 MHCI 複合物質之卡通圖圖示展示於相應 MS 峰旁邊。星形標記指示存在起始甲硫胺酸。星號標記指示針對純化加合物觀察之額外質量。 圖 39展示當在 Orbitrap Eclipse 上於遞增電壓下分析時MHCI 複合物 (紅色電荷標記) 之 MS1 光譜。隨著源電壓有所增加，肽可自複合物解離且 重新獨立定序，其中 HLA/B2M 複合物得以保留 (綠色電荷標記)。 圖 40展示在氣相解離之後 MHCI 複合物組分的 MS1 光譜。游離肽展示於插圖中。 圖 41A - 41C展示 ELISA 測定研發。圖 41A 係 ELISA 形式之對比。CMV pp65 訊號正規化至 0.03-6.67 µg/mL 下之無肽對照。與抗 HLA 塗層及抗 B2M 檢測劑相比，以抗 B2M 作為塗層且以抗 HLA-生物素作為檢測劑之形式在 0.74、2.22 及 6.67 µg/mL 下於 CMV pp65 與無肽對照之間展示較小差異。圖 41B 展示在使用 CMV pp65、BMRF1 及不使用肽小規模再摺疊之後 HLA-A*02:01 的 ELISA 分析。在介於 0.005 µg/mL 至 3.33 µg/mL 之間的 MHCI 濃度下運行 ELISA 分析。圖 41C 展示正規化至 1 µg/mL 下之無肽對照之 CMV pp65 及 BMFR1肽的 ELISA OD 值。 圖 42A - 42H展示 A*02:03、B*35:03 及 C*02:02 之候選條件化 MHCI 配體的鑑別過程。圖 42A 展示使用 A*02:03 在不同濃度 (0.1 - 3 µg/mL) 下篩選之 5 種肽的 OD 值。圖 42B (A*02:03)、圖 42C (B*35:03) 及圖 42D (C*02:02) 展示具有所選肽之 MHC 複合物在 1 µg/mL 下的正規化 ELISA OD。選擇針對每一 HLA 產生最高正規化 OD 值之肽且設計在自 N-末端起之位置 2、4、6 及 8 處具有 UV-胺基酸取代的變異體。圖 42E 展示衍生自使用 HLA-A*02:03 在不同濃度下篩選之肽 A02:03-02 之 4 種條件化 MHCI 配體的 OD 值。圖 42F (HLA A*02:03)、圖 42G (B*35:03-05) 及圖 42H (C*02:02-03) 展示具有衍生自圖 42B、42C 及 42D 中所鑑別之肽之所選條件化 MHCI 配體之 MHC 複合物的正規化 ELISA OD。使用不含經改造 J 胺基酸之肽 (母體肽) 作為內部對照 (灰色條)。在所有測定中，使用無肽 (NP) 作為陰性對照。 圖 43A - 43E展示經擴大、再摺疊 A0201 MHCI 材料之生物素化分析、純化及特性化。圖 43A 係經再摺疊 MHCI 反應混合物中之 HLA 等位基因在生物素化之前 (黑色線) 及之後 (灰色線) 的 LC/MS 分析。兩個峰對應於全長 HLA 及具有 N-末端甲硫胺酸裂解之截短 HLA。兩個峰在生物素化之後之位移對應於生物素的分子量 (MW)。圖 43B 展示生物素化 MHCI 複合物在再摺疊之後之陰離子交換層析圖及突出顯示框中所收集餾分的 SDS-PAGE 分析。SDS-PAGE 帶之 MW 對應於 B2M 及 HLA。圖 43C 展示經純化 MHCI 複合物之 LC/MS TIC 層析圖。1.625 min 及 1.74 min 下之峰對應於 UV-肽且 1.8 min 及 2.2 min 下之峰分別對應於 B2M 及 HLA。圖 43D 展示經純化 MHCI 複合物之 SEC-MALS 分析。黑色線對應於 A280 層析圖 (左 y 軸) 且虛線對應於 MW 分析 (右 y 軸)。圖 43E 展示在 1、5 及 15 L 規模下之純化後 MHCI 產率。 圖 44A - 44D展示條件化 MHCI 複合物之擴大產生、純化及特性化。圖 44A 係使用在小規模篩選中鑑別之條件化 MHCI 配體生成之經純化再摺疊 MHCI 複合物的 SDS-PAGE 分析，圖 44B 係其再摺疊產率，圖 44C 展示其 B2M 對 HLA 比且圖 44D 係其 SEC-MALS MW 分析。 圖 45A - 45J展示肽交換之 2D LC/MS 分析。圖 45A 展示 2D LC/MS 工作流程之示意圖。圖 45B 展示 HLA-A*02:01 MHCI 複合物在與 CMV pp65 交換之後之 2D LC/MS 分析中之第 1 維的 A280 nm SEC 層析圖。圖 45C 展示 HLA-A*02:01 MHCI 複合物在與 CMV pp65 交換之後之 2D LC/MS 分析中之第 2 維的 A280 nm SEC 層析圖。圖 45D 展示 HLA-A*02:01 MHCI 複合物在與 CMV pp65 交換之後之 2D LC/MS 分析中之第 2 維中之交換肽 (黑色線) 及條件化 MHCI 配體 (虛線) 的 EIC 層析圖。圖 45E 展示 A*02:03 MHCI 複合物在與 A0203-05 肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第一維的 A280 nm SEC 層析圖。圖 45F 展示 A*02:03 MHCI 複合物在與 A0203-05 肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第 2 維的 A280 nm SEC 層析圖。圖 45G 展示 HLA-A*02:03 MHCI 複合物在與 A0203-05 肽交換之後之2D LC/MS 分析中之第 2 維中之交換肽 (黑色線) 及條件化 MHCI 配體 (虛線) 的 EIC 層析圖。圖 45H 展示 A0*02:03 MHCI 複合物在與已知非結合肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第 1 維的 A280 nm SEC 層析圖。圖 45I 展示 A*02:03 MHCI 複合物在與非結合肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第 2 維的 A280 nm SEC 層析圖。圖 45J 展示 HLA-A*02:03 MHCI 複合物在與不相關肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第 2 維中之交換肽 (黑色線) 及條件化 MHCI 配體 (虛線) 的 EIC 層析圖。 圖 46A - 46F展示在 2D LC/MS 分析中於肽交換之後之第 1 維 A280 MHCI 峰的量化。A*02:03 (圖 46A)、A*26:01 (圖 46B)、B*18:01 (圖 46C)、B*35:03 (圖 46D)、C*02:02 (圖 46E) 及 C*14:02 (圖 46F) 針對陽性對照肽 (已知結合物，黑色條) 及非結合肽 (灰色條) 之 MHCI 肽交換後峰面積(正規化至肽交換前峰面積)。正號指示在第二維之 EIC 分析中觀察到交換肽且負號指示在 EIC 分析中未觀察到交換肽。 圖 47A-47C展示 ELISA 測定研發。圖 47A 展示 ELISA 形式之對比。在 0.03-6.67 μg/mL 之 MHCI 濃度下 CMV pp65 及 HLA-A*02:01 的S/N 值。圖 47B 展示針對 ELISA 形式 2在使用 CMV pp65、BMRF1 及不使用肽小規模再摺疊之後 HLA-A*02:01 的 ELISA 分析。在介於 0.005 μg/mL 至 3.33 μg/mL 之間的 MHCI 濃度下運行 ELISA 分析。圖 47C 展示使用利用 CMV pp65 及 BMFR1 肽以及 HLA-A*02:01 組裝之 MHCI 複合物之 ELISA 形式 2 在 1 μg/mL 之 MHCI 濃度下的 ELISA S/N 值。 圖 48A-48H展示 A*02:03、B*35:03 及 C*02:02 之候選條件化 MHCI 配體的鑑別。圖 48A 展示使用 A*02:03 在不同濃度 (0.1-3 μg/mL) 下篩選之 5 種肽的 OD 值。圖 48B (A*02:03)、圖 48C (B*35:03) 及圖 48D (C*02:02) 展示具有所選肽之 MHC 複合物在 1 μg/mL 下的 S/N ELISA 值。圖 48E 展示衍生自使用 HLA-A*02:03 在不同濃度下篩選之肽 A02:03-02之 4 種條件化 MHCI 配體的 OD 值。圖 48F (HLA A*02:03)、圖 48G (B*35:03-05) 及圖 48H (C*02:02-03) 展示具有衍生自圖 48B、48C 及 48D 中鑑別之肽之所選條件化 MHCI 配體之 MHC 複合物的 S/N 值。使用不含經改造 J 胺基酸之肽 (母體肽) 作為內部對照 (灰色條)。在所有測定中，使用無肽 (NP) 作為陰性對照。 圖 49展示 A*02:01 MHCI 單體之擴大產生的示意圖。經研發用於擴大產生 MHCI 複合物之方案中之第一步驟係混合所有再摺疊組分且進行再摺疊。第二步驟係過程中生物素化，隨後在第三步驟中進行陰離子交換層析。 圖 50A-50F展示經擴大、再摺疊 A*02:01 MHCI 單體之生物素化分析、純化及特性化。圖 50A 展示經再摺疊 MHCI 反應混合物中之 HLA 等位基因在生物素化之前 (黑色線) 及之後 (灰色線) 的 LC/MS 分析。兩個峰對應於全長 HLA 及具有 N-末端甲硫胺酸裂解之截短 HLA。兩個峰在生物素化之後之位移對應於生物素的 MW。圖 50B 展示生物素化 MHCI 複合物在再摺疊之後之陰離子交換層析圖，且圖 50C 展示突出顯示框中所收集餾分的 SDS-PAGE 分析。SDS-PAGE 帶之 MW 對應於 B2M (13 kDa) 及 HLA (37 kDa)。圖 50D 展示經純化 MHCI 複合物之 LC/MS TIC 層析圖。1.625 min 及 1.74 min 下之峰對應於 UV-肽且 1.8 min 及 2.2 min 下之峰分別對應於 B2M 及 HLA。圖 50E 展示經純化 MHCI 複合物之 SEC-MALS 分析。黑色線對應於 A280 層析圖 (左 y軸) 且虛線對應於 MW 分析 (右 y軸)。圖 50F 展示在以 1、5 及 15 L 規模純化之後的 MHCI % 產率 (mg 經純化 MHCI/mg 再摺疊 MHCI *100) ± 標準偏差 ( N= 3)。 圖 51A-51D展示條件化 MHCI 複合物之擴大產生、純化及特性化。圖 51A 展示使用在小規模篩選中鑑別之條件化 MHCI 配體生成之經純化再摺疊 MHCI 複合物的 SDS-PAGE 分析，圖 51B 展示其平均再摺疊 % 產率 (mg 經純化 MHCI/mg 再摺疊 MHCI *100) ±標準偏差 ( N= 3)，圖 51C 展示其平均 B2M 對 HLA 比率 ±標準偏差 ( N= 3) 且圖 51D 展示其平均 SEC-MALS MW 分析 ±標準偏差 ( N= 3)。 圖 52A-52J展示肽交換之 2D LC/MS 分析。圖 52A 展示 2D LC/MS 工作流程之示意圖。圖 52B 展示 HLA-A*02:01 MHCI 複合物在與 CMV pp65 交換之後之 2D LC/MS 分析中之第一維的 A280 nm SEC 層析圖。虛線界定收集且注入第二管柱中之區域。圖 52C 展示 HLA-A*02:01 MHCI 複合物在與 CMV pp65 交換之後之 2D LC/MS 分析中之第二維的 A280 nm SEC 層析圖。圖 52D 展示 HLA-A*02:01 MHCI 複合物在與 CMV pp65 交換之後之 2D LC/MS 分析中之第二維中之交換肽 (黑色線) 及條件化 MHCI 配體 (虛線) 的 EIC 層析圖。圖 52E 展示 A*02:03 MHCI 複合物在與 A0203-05 肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第一維的 A280 nm SEC 層析圖。虛線界定收集且注入第二管柱中之區域。圖 52F 展示 A*02:03 MHCI 複合物在與 A0203-05 肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第二維的 A280 nm SEC 層析圖。圖 52G 展示 HLA-A*02:03 MHCI 複合物在與 A0203-05 肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第二維中之交換肽 (黑色線) 及條件化 MHCI 配體 (虛線) 的 EIC 層析圖。圖 52H 展示 A0*02:03 MHCI 複合物在與已知非結合肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第一維的 A280 nm SEC 層析圖。虛線界定收集且注入第二管柱中之區域。圖 52I 展示 A*02:03 MHCI 複合物在與非結合肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第二維的 A280 nm SEC 層析圖。圖 52J 展示 HLA-A*02:03 MHCI 複合物在與不相關肽交換之後之 2D LC/MS 分析中之第二維之交換肽 (黑色線) 及條件化 MHCI 配體 (虛線) 的 EIC 層析圖。 圖 53A-53F展示在 2D LC/MS 分析中於肽交換之後之第一維 A280 MHCI 峰的量化。圖 53A (A*02:03)、圖 53B (A*26:01)、圖 53C (B*18:01)、圖 53D (B*35:03)、圖 53E (C*02:02) 及圖 53F (C*14:02) 展示針對陽性對照肽 (已知結合物，黑色條) 及非結合肽 (灰色條) 之肽交換後 MHCI 峰面積相對於肽交換前峰面積的分率。正號指示在第二維之 EIC 分析中觀察到交換肽且負號指示在 EIC 分析中未觀察到交換肽。 圖 54A-54F展示 A*26:01、B*18:01 及 C*14:02 HLA 等位基因之條件化 MHCI 配體的鑑別。圖 54A (A*26:01)、圖 54B (B*18:01) 及圖 54C (C*14:02) 展示 1 µg/mL 之具有所選肽的 MHC 複合物。選擇針對每一 HLA 產生最高正規化 OD 值之肽且設計在自 N-末端起之位置 2、4、6 及 8 處具有 UV-胺基酸取代的變異體。具有衍生自圖 54A、54B 及 54C 中所鑑別之肽之所選條件化 MHCI 配體之 A*26:01 (圖 54D)、B*18:01 (圖 54E) 及 C*14:02 (圖 54F) MHC 複合物的正規化 ELISA OD使用不含經改造 J 胺基酸之肽 (母體肽) 作為內部對照 (灰色條)。在所有測定中，使用無肽 (NP) 作為陰性對照。 圖 55A-55F展示針對 A*02:03 (圖 55A)、A*26:01 (圖 55B)、B*18:01 (圖 55C)、B*35:03 (圖 55D)、C*02:02 (圖 55E) 及 C*14:02 (圖 55F) 生物素化 MHCI 複合物在再摺疊之後之陰離子交換層析圖及突出顯示框中所收集餾分的 SDS-PAGE 分析。 
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          Gly Thr His Xaa Leu Leu Pro Phe Tyr 
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          Ala Met Leu Thr Ala Xaa Phe Leu Arg 
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          His Leu Met Phe Tyr Xaa Leu Pro Ile 
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          Thr Xaa Phe Phe Tyr Arg Tyr Gly Phe Val 
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          Thr Pro Ala Xaa Tyr Phe His Val Leu 
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          Ala Glu Asn Xaa Tyr Val Thr Val Phe 
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          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Xaa Ile 
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          <![CDATA[<400>  18]]>
          Phe Met Tyr Glu Gly Xaa Thr Pro Leu 
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          Phe Pro Ile Pro Ser Xaa Trp Ala Phe 
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          Phe Ala Ala Glu Ala Xaa Lys Leu 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  UV-可裂解胺基酸殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Gly Ala Ile Asn Ser Xaa Leu Pro Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222>  (7)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Phe Ala Ile Val Pro Xaa Leu Gln Ile 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  UV-可裂解胺基酸殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Phe Ala Met Xaa Val Pro Leu Leu Ile 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(3)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222>  (5)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Ala Arg Phe Xaa Asp Leu Arg Phe Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(3)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  UV-可裂解胺基酸殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Ala Asn Asn Xaa Arg Leu Trp Val Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(3)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  UV-可裂解胺基酸殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Tyr Ala Ala Xaa Thr Asn Phe Leu Leu 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
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          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  UV-可裂解胺基酸殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Ile Ser Asp Ser Ala Xaa Asn Met Met 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(3)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  UV-可裂解胺基酸殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Trp Ala Trp Xaa Phe Ala Ala Val Leu 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(3)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  UV-可裂解胺基酸殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Met Met His Xaa Ser Thr Ser Pro Phe 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  UV-可裂解胺基酸殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(9)]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Arg Thr Phe Gly Gln Xaa Leu Phe Phe 
          1               5
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020

Claims (99)

  1. 一種主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI)/配體複合物，其包含 (i) 包含 α 鏈、β 鏈之 MHCI 分子及 (ii) 配體，其中該配體為包含非天然 UV-可裂解胺基酸之肽。
  2. 如請求項 1 之 MHCI/配體複合物，其中該 α 鏈為由下列基因座中之任一者編碼之 α 鏈：HLA-A、HLA-B 或 HLA-C。
  3. 如請求項 1 之 MHCI/配體複合物，其中該配體之長度介於 8 至 11 個胺基酸之間。
  4. 如請求項 3 之 MHCI/配體複合物，其中該配體之長度為 8 個胺基酸。
  5. 如請求項 3 之 MHCI/配體複合物，其中該配體之長度為 9 個胺基酸。
  6. 如請求項 3 之 MHCI/配體複合物，其中該配體之長度為 10 個胺基酸。
  7. 如請求項 3 之 MHCI/配體複合物，其中該配體之長度為 11 個胺基酸。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之 MHCI/配體複合物，其中該 UV-可裂解胺基酸。
  9. 如請求項 8 之 MHCI/配體複合物，其中該 UV-可裂解胺基酸係選自 2-硝基苯基甘胺酸 (NPG)、擴展鄰-硝基苄基連接子、鄰-硝基苄基籠形酚、鄰-硝基苄基籠形硫醇、32 硝基藜蘆基氧羰基 (NVOC) 籠形苯胺、鄰-硝基苄基籠形硒化物、雙-偶氮苯、香豆素、桂醯基、螺吡喃、2-硝基苯基丙胺酸 (2-nF) 及 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸 (ANP) 胺基酸類似物。
  10. 如請求項 9 之 MHCI/配體複合物，其中該 UV-可裂解胺基酸包含 3-胺基-3-(2-硝基苯基)-丙酸酯 (ANP) 胺基酸類似物。
  11. 如請求項 1 至 10 中任一項之 MHCI/配體複合物，其中該 UV-可裂解胺基酸位於該配體內之任何位置中。
  12. 如請求項 1 至 11 之 MHCI/配體複合物，其中該配體包含 SEQ ID NO.: 1 至 SEQ ID NO.: 34 中之任一者的胺基酸序列。
  13. 如請求項 1 至 12 中任一項之 MHCI/配體複合物，其中該 α 鏈及該配體包含 HLA 等位基因及胺基酸序列之下列組合中之任一者：
    Figure 03_image009
    。
  14. 一種用於確定主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 等位基因與測試肽之結合的肽交換測定，其包含： (a)  提供包含測試肽及 MHCI/配體複合物之第一組成物，該 MHCI/配體複合物包含 (i) 包含 α 鏈、β 鏈之 MHCI 分子及 (ii) 配體，其中該配體為包含非天然紫外線 (UV)-可裂解胺基酸之肽； (b) 將該第一組成物暴露於 UV 光以在該 UV-可裂解胺基酸處裂解該配體；及 (c)  將該第一組成物培育一定時間段以形成包含游離測試肽、α 鏈、β 鏈及/或 MHCI/-第二肽複合物之第二組成物；及 (d) 確定該 MHCI 等位基因是否與該第二肽結合。
  15. 如請求項 14 之肽交換測定，其中藉由測量該第二組成物中之 MHCI/肽複合物之含量來確定 MHCI 等位基因與該肽的結合。
  16. 如請求項 15 之肽交換測定，其中藉由該第二組成物之 2 維液相層析-質譜 (2D LC/MS) 測量 MHCI/第二肽複合物之該含量。
  17. 如請求項 16 之肽交換測定，其中 2D LC/MS 包含自該第二組成物去除游離第二肽。
  18. 如請求項 14 至 17 中任一項之肽交換測定，其進一步包含執行高效液相層析 (HPLC) 及質譜 (MS) 以區分該 MHCI 及該第二肽。
  19. 如請求項 14 至 18 中任一項之肽交換測定，其中藉由經由粒徑篩析層析法進行的分離自該第二組成物去除該游離第二肽。
  20. 如請求項 18 或 19 之肽交換測定，其中如藉由 HPLC 及 MS 所確定之該第二肽的存在指示該 MHCI 能夠與該第二肽結合。
  21. 如請求項 14 至 20 中任一項之肽交換測定，其中將複數種該 MHCI/配體複合物與至少兩種不同測試肽進行組合。
  22. 如請求項 21 之肽交換測定，其中該等測試肽係藉由質譜基於每種肽之預測質量來進行鑑別。
  23. 如請求項 14 至 22 中任一項之肽交換測定，其中該測試肽以至少 10:1 (測試肽:MHCI) 之比率存在於該第一組成物中。
  24. 如請求項 14 至 23 中任一項之肽交換測定，其中該 MHCI/配體複合物為如請求項 1 至 13 中任一項之 MHCI/配體複合物。
  25. 如請求項 14 至 24 中任一項之肽交換測定，其中該 MHCI/肽複合物進一步包含第一標記，由此形成經標記 MHCI/肽複合物。
  26. 如請求項 25 之肽交換測定，其中藉由以下方式來確定肽交換程度： (a)  使經標記 MHCI/配體肽複合物與以下各項接觸： (i)  抗體複合物，其包含共價接附至螢光共振能量轉移 (FRET) 受體之抗 MHCI 等位基因抗體；及 (ii) FRET 發射體複合物，其包含與第二標記結合之 FRET 發射體，由此形成反應組成物； (b) 檢測該反應組成物中之該第二標記的 FRET 發射，由此檢測 MHCI 等位基因與肽之結合。
  27. 如請求項 26 之肽交換測定，其中將該反應組成物培育至少約 10 小時。
  28. 如請求項 26 之肽交換測定，其中將該組成物培育至少約 15 小時。
  29. 如請求項 26 至 28 中任一項之肽交換測定，其中該第一標記為卵白素。
  30. 如請求項 26 至 28 中任一項之肽交換測定，其中該抗 MHCI 等位基因抗體包含抗 HLA 抗體、單體或部分抗體。
  31. 如請求項 29 之肽交換測定，其中該第二標記為生物素。
  32. 如請求項 26 至 28 中任一項之肽交換測定，其中該第一標記為生物素。
  33. 如請求項 32 之肽交換測定，其中該第二標記為卵白素。
  34. 如請求項 26 至 33 中任一項之肽交換測定，其中來自該 FRET 受體之發射指示該測試肽與該 MHCI 之結合。
  35. 如請求項 26 至 34 中任一項之肽交換測定，其中該 MHCI 與該測試肽之結合係藉由第二肽交換測定來證實。
  36. 如請求項 35 之肽交換測定，其中該第二肽交換測定為如請求項 15 至 16 中任一項之肽交換測定。
  37. 如請求項 26 至 35 中任一項之肽交換測定，其中藉由 TR-FRET 來確定與該 MHCI 分子結合之測試肽之量。
  38. 一種檢測主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 等位基因與測試肽之結合的方法，該方法包含： (a)  提供包含測試肽及 MHCI/配體複合物之第一組成物，該 MHCI/配體複合物包含 (i) 包含 α 鏈、β 鏈之 MHCI 分子及 (ii) 配體，其中該配體為包含非天然紫外線 (UV)-可裂解胺基酸之肽； (b) 將該第一組成物暴露於 UV 光以在該 UV-可裂解胺基酸處裂解該配體；及 (c)  檢測第二組成物中之 MHCI/測試肽複合物，由此檢測該 MHCI 分子與該測試肽之結合。
  39. 如請求項 38 之方法，其中 (c) 中之該檢測包含檢測 MHCI/肽複合物相對於對照的含量。
  40. 如請求項 39 之方法，其中藉由 2 維液相層析-質譜 (2D LC/MS) 來檢測該 MHCI/測試肽複合物之該含量。
  41. 如請求項 40 之方法，其中該第二組成物位於適用於 2D LC/MS 之器皿中。
  42. 如請求項 38 至 41 中任一項之方法，其中自該第二組成物去除該游離測試肽。
  43. 如請求項 42 之方法，其中藉由粒徑篩析層析法自該第二組成物去除該游離測試肽。
  44. 如請求項 38 至 43 中任一項之方法，其中 (c) 中之該檢測進一步包含高效液相層析 (HPLC) 及質譜 (MS) 以區分該 MHCI 分子及該測試肽。
  45. 一種鑑別 MHCI 結合配體之方法；該方法包含： (a)  使複數個 MHCI α 鏈單體與複數個 β 鏈單體及配體在容許形成 MHCI/配體複合物之條件下接觸，其中該配體為包含非天然 UV-可裂解胺基酸之肽；及 (b) 檢測該 MHCI/配體複合物，由此鑑別 MHCI 結合配體。
  46. 如請求項 45 之方法，其中該等 MHCI α 鏈單體為變性及/或未摺疊之 MHCI α 鏈單體。
  47. 如請求項 45 或 46 之方法，其中執行該接觸至少 48 小時。
  48. 如請求項 45 至 47 中任一項之方法，其中該配體為複數個配體。
  49. 如請求項 48 之方法，其中該複數個配體中之每一配體包含不同胺基酸序列。
  50. 如請求項 45 至 49 中任一項之方法，其中該檢測包含 (i) 使該 MHCI/配體複合物與接附至固體載體之抗 MHCI α 鏈抗體結合，由此形成結合之 MHCI/配體複合物；(ii) 使該結合之 MHCI/配體複合物與經標記抗 β 鏈抗體接觸，由此形成結合之經標記 MHCI/配體複合物；及 (iii) 檢測該結合之經標記 MHCI/配體複合物。
  51. 如請求項 50 之方法，其進一步包含在 (iii) 中之該檢測之前去除游離經標記抗 β 鏈抗體。
  52. 一種確定最佳主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 等位基因-配體組合之方法，該方法包含： (a)  提供複數個在變性條件下純化之 MHCI α 鏈單體； (b) 藉由組合該複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體來形成反應混合物，該配體包含含有非天然 UV-可裂解胺基酸之肽； (c)  在容許形成 MHCI/配體複合物之條件下培育該混合物；及 (d) 確定是否形成該 MHCI/配體複合物。
  53. 如請求項 52 之方法，其中將該複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育至少 48 小時。
  54. 如請求項 52 之方法，其中將該複數個 MHCI α 鏈單體、複數個 β 鏈單體及配體培育約 5 天。
  55. 如請求項 52 至 54 中任一項之方法，其中篩選複數個配體，其中每一配體均包含胺基酸序列，其中每一配體之該胺基酸序列與每一其他配體之胺基酸序列之區別僅在於該 UV-可裂解胺基酸在序列中的位置。
  56. 如請求項 52 至 55 中任一項之方法，其中步驟 d) 包含執行酵素連結免疫吸附測定 (ELISA)。
  57. 如請求項 56 之方法，其中該 ELISA 包含 (i) 將該反應混合物引入容器中，該容器包含表面及與該表面結合之抗 MHCI α 鏈抗體；(ii) 將包含可檢測標記之經標記抗 β 鏈抗體引入該容器中，從而該經標記抗 β 鏈抗體結合可能存在之該等 β 鏈單體；(iii) 洗滌以去除未結合之經標記抗 β 鏈抗體；及 (iv) 檢測該容器中是否存在該可檢測標記。
  58. 如請求項 57 之方法，其中該可檢測標記包含生物素或肽標籤。
  59. 如請求項 57 之方法，其中該可檢測標記包含生物素。
  60. 如請求項 57 之方法，其中步驟 (iv) 包含將卵白素-辣根過氧化物酶 (HRP) 結合物引入該容器中且在添加 HRP 受質後確定化學發光值。
  61. 如請求項 57 至 60 中任一項之方法，其中該容器係多孔盤之孔。
  62. 如請求項 45 至 61 中任一項之方法，其中針對至少兩個配體單獨執行步驟 a) 至 d)，其中步驟 d) 包含確定 MHCI/配體複合物形成之程度，其中具有最大 MHCI/配體複合物形成程度之配體為用於該 MHCI 等位基因的最佳 MHCI/配體組合。
  63. 一種包含非天然 UV-可裂解胺基酸之肽，其中該肽具有 SEQ ID NO.: 1 至 SEQ ID NO.: 34 中之任一者的胺基酸序列。
  64. 一種監測樣品中之經肽交換之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物的方法，其包含： (a)  獲得包含所關注肽之肽交換 MHCI 複合物； (b) 對該等肽交換 MHCI 複合物執行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (c)  在 (b) 之該層析或毛細管電泳後，對該等 MHCI 複合物執行天然質譜法 (MS) 以鑑別包含所關注肽之 MHCI 複合物。
  65. 一種監測樣品中之經肽交換之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物的方法，其包含： (a)  獲得包含可交換肽之 MHCI 複合物並將該等複合物在容許該可交換肽與所關注肽之間之肽交換的條件下暴露於一種或多種該所關注肽； (b) 對該等肽交換 MHCI 複合物執行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (c)  在 (b) 之該層析或毛細管電泳後，對該等 MHCI 複合物執行天然質譜法 (MS) 以鑑別包含所關注肽之 MHCI 複合物。
  66. 一種監測 MHCI-複合肽之 T 細胞識別的方法，其包含： (a)  獲得包含所關注肽之肽交換 MHCI 複合物； (b) 使該等肽交換 MHCI 複合物與包含 T 細胞之樣品接觸； (c)  使結合 T 細胞之 MHCI 複合物與未結合之 MHCI 複合物分離； (d) 對該等肽交換 MHCI 複合物執行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (e)  在 (d) 之該層析或毛細管電泳後，對該等 MHCI 複合物執行天然質譜法 (MS) 以鑑別包含由來自該樣品之 T 細胞識別之肽的 MHCI 複合物。
  67. 一種監測 MHCI-複合肽之 T 細胞識別的方法，其包含： (a)  獲得包含可交換肽之主要組織相容性 I 類 (MHCI) 複合物並將該等複合物在容許肽交換之條件下暴露於一種或多種所關注肽； (b) 使該等肽交換 MHCI 複合物與包含 T 細胞之樣品接觸； (c)  使結合 T 細胞之 MHCI 複合物與未結合之 MHCI 複合物分離； (d) 對該等肽交換 MHCI 複合物執行粒徑篩析層析法 (SEC)、毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE)；及 (e)  在 (d) 之該層析或毛細管電泳後，對該等 MHCI 複合物執行天然質譜法 (MS) 以鑑別包含由來自該樣品之 T 細胞識別之肽的 MHCI 複合物。
  68. 如請求項 66 或 67 之方法，其中藉由流式細胞分析技術來分離結合 T 細胞之 MHCI 複合物與未結合之 MHCI 複合物。
  69. 如請求項 1 至 68 中任一項之方法，其中該樣品為生物流體樣品。
  70. 如請求項 69 之方法，其中該樣品為全血或血漿樣品。
  71. 如請求項 64 至 70 中任一項之方法，其中該樣品包含一種或多種以合成方式產生之所關注肽。
  72. 如請求項 64 至 71 中任一項之方法，其中該等 MHCI 複合物為人 MHCI 複合物。
  73. 如請求項 64 至 72 中任一項之方法，其中該樣品係來自 MHCI 庫或陣列。
  74. 如請求項 64 至 73 中任一項之方法，其中該方法包含對該等肽交換 MHCI 複合物執行 SEC。
  75. 如請求項 74 之方法，其中注入 2 µL 至 10 µL 之體積以用於天然 MS 分析，諸如 3 µL 至 6 µL 或 4 µL 至 5 µL。
  76. 如請求項 74 或 75 之方法，其中該天然 MS 緊跟於該 SEC 之後。
  77. 如請求項 64 至 73 中任一項之方法，其中該方法包含對該等肽交換 MHCI 複合物執行 CE。
  78. 如請求項 64 至 73 中任一項之方法，其中該方法包含對該等肽交換 MHCI 複合物執行 CZE。
  79. 如請求項 77 或 78 之方法，其中經交換之肽可在 100 µg/mL 或更低、50 µg/mL 至 500 µg/mL、50 µg/mL 至 200 µg/mL、100 µg/mL 至 200 µg/mL 或 50 µg/mL 至 100 µg/mL 之濃度下檢測到。
  80. 如請求項 77、78 或 79 之方法，其中注入 2 nl 至 100 nl 之體積以用於天然 MS 分析，諸如 2 nl 至 50 nL、2 nl 至 10 nL、3 nl 至 10 nL 或 3 nl 至 5 nL。
  81. 如請求項 77 至 80 中任一項之方法，其中該天然 MS 緊跟於該 CE 或 CZE 之後。
  82. 如請求項 64 至 81 中任一項之方法，其中該方法允許確定及量化該至少一種所關注肽已交換至該 MHCI 複合物中之程度。
  83. 如請求項 64 至 82 中任一項之方法，其中天然 MS 包含特性化與該 MHCI 複合物結合之所關注肽的結構或序列。
  84. 如請求項 64 至 83 中任一項之方法，其中該天然 MS 為串聯式 MS(「MS/MS」) (例如多重反應監測 (MRM)、單一離子監測 (SIM)、三階四極 (TSQ)、四極/飛行時間 (QTOF)、四極線性離子阱 (QTRAP)、混合離子阱/FTMS、飛行時間/飛行時間 (TOF/TOF) 或時間串聯式 MS/MS)。
  85. 如請求項 64 至 83 中任一項之方法，其中該天然 MS 包含電噴霧離子化至軌道阱 MS 儀器中。
  86. 如請求項 64 至 85 中任一項之方法，其中該等層析或電泳及天然 MS 係在乙酸銨或葉酸銨緩衝液中執行及/或其中該緩衝液不包含 TRIS 或 PBS。
  87. 一種套組，其包含含有非天然 UV-可裂解胺基酸之肽、MHCI α 鏈單體及 MHCI β 鏈單體。
  88. 如請求項 87 之套組，其中該等 MHCI α 鏈單體係變性的。
  89. 如請求項 87 或 88 之套組，其中該等 MHCI β 鏈單體係變性的。
  90. 如請求項 87 至 89 中任一項之套組，其中該 MHCI α 鏈及/或該 MHCI β 鏈包含標籤。
  91. 如請求項 90 之套組，其中該標籤為卵白素。
  92. 如請求項 87 至 91 中任一項之套組，其進一步包含抗 HLA 抗體。
  93. 如請求項 87 至 92 中任一項之套組，其進一步包含抗 B2M 抗體。
  94. 如請求項 87 至 93 中任一項之套組，其中該肽包含 SEQ ID NO.: 1 至 SEQ ID NO.: 34 中之任一者的胺基酸序列。
  95. 一種系統，其包含： (a)  肽，其包含非天然 UV-可裂解胺基酸； (b) 複數個 MHCI α 鏈單體； (c)  複數個 MHCI β 鏈單體； (d) 及第一試劑，其能夠容許形成 MHCI/配體複合物。
  96. 如請求項 95 之系統，其進一步包含能夠結合 MHCI α 鏈單體之第二試劑。
  97. 如請求項 96 之系統，其中該第二試劑包含抗 HLA 抗體。
  98. 如請求項 95 至 97 中任一項之系統，其進一步包含能夠結合 MHCI β 鏈單體之第三試劑。
  99. 如請求項 98 之系統，其中該第三試劑為抗 B2M 抗體。
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