CN116234813A - 用于表征mhci肽结合的测定和试剂 - Google Patents

用于表征mhci肽结合的测定和试剂 Download PDF

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Abstract

本公开涉及制备以及检测MHCI/配体肽复合物的试剂和方法。

Description

用于表征MHCI肽结合的测定和试剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月25日提交的第63/070,211号、2020年9月29日提交的第63/085,113号以及2021年7月2日提交的第63/218,073号美国临时申请的优先权，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并通过引用整体并入本文。该ASCII副本创建于2021年8月19日，命名为048893-533001WO_ST25.txt，并且大小为13,352位元组。
技术领域
本申请涉及用于分析主要组织相容性I类(MHCI)复合物的系统和方法。可使用非变性质谱分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)光谱进行分析，任选地结合经由尺寸排阻色谱法或毛细管电泳(例如毛细管区带电泳)的MHCI复合物分离。在一些实施例中，这些方法应用于肽交换的MHCI复合物，例如，使用预期存在于患者样品中的肽。
背景技术
主要组织相容性复合物-I(MHCI)是一种几乎广泛存在的蛋白复合物，其负责将抗原提呈细胞表面上的自身和外源来源的展示肽呈递至淋巴细胞。通过MHCI的展示肽呈递是后天免疫应答朝破坏病变细胞或保护健康细胞的第一步。MHCI复合物是一种非共价连接的蛋白异二聚体，其由重链(α)和轻链(β2微球蛋白，B2M)组成；一般而言，MHCI复合物在没有8-11个残基展示肽配体的情况下是不稳定的。锥状展示肽生成路径利用将泛素化的细胞质蛋白降解成潜在展示肽的蛋白酶体。这些展示肽随后被输入至内质网中，在那里其被进一步改质(refine)，并且活性MHCI/展示肽复合物在运送至细胞表面以呈递至细胞毒性或CD8(+)T细胞前，经由蛋白质伴护蛋白(chaperone)辅助过程形成，以识别并确定细胞命运。
MHCI蛋白由主要组织相容性复合物基因复合物编码，并且也被称为人类白细胞抗原(HLA)系统的成员。虽然总共有大约24个已知的MHCI家族成员，但是最常见的MHCI家族成员由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座编码。每个HLA组包含至少几十个或更多个等位基因，并且这些等位基因的差异表达导致蛋白输出的丰富多样性。实际上，有>20,000种不同的HLA-A、HLA-B和HLA-C蛋白复合物，每种都具有自己的稳定性和典型的配体特异性。MHCI蛋白系统的高度多样性使整个系统能够识别大量可能的抗原，包括源自非人来源的肽、转译后修饰的自身肽和体外合成的肽。
治疗规避性免疫标靶的目的发展领域涉及生成用于表征患者中的CD8(+)T细胞依赖性应答的先前未经表征的、未知的或经设计的抗原(包括新抗原肽序列)。然而，缺乏可用于生产、选择和鉴定体外最佳MHCI复合物:抗原(包括新抗原)结合的稳固、高通量方法。
发明内容
本申请提供了用于测定用于广范围免疫疗法的MHCI肽的组合物和方法。
本文描述了一种快速、高通量、多重监测测定法，以寻找潜在的新抗原肽，其可能呈递在患者的MHCI分子上并且可与T细胞结合，并且可有助于为癌症患者开发适当的治疗。诸如ELISA(酶联免疫吸附测定)、TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)和2D-LC-MS(二维液相色谱质谱法)等测定法可用于分析MHCI-肽复合物。色谱法(诸如2D-LC)可与质谱法(MS)结合进行检测。
本文所描述的方法和系统利用非变性质谱分析表征与肽结合的MHCI复合物。在一些实施例中，在进行非变性质谱分析前，先进行尺寸排阻色谱法(SEC)或在其他情况下先进行毛细管电泳(CE)，例如毛细管区带电泳(CZE)。在一些情况下，非变性质谱分析允许表征与MHCI结合的肽，并证实特定肽与MHCI复合物为非共价结合。在一些情况下，相较于色谱法(诸如SEC)，CE还可允许用于检测以较低浓度存在的结合肽。在一些情况下，例如与2D-LC-MS方法中的二维分离相比，仅以SEC、CE或CZE进行单次色谱法分离，然后进行非变性质谱分析。在一些实施例中，与其他分析技术相比较，本文的方法还可提供增加的通量。
在一方面，本文提供了一种主要组织相容性复合物I类(MHCI)蛋白复合物，其包括α链、β链和配体，该配体包含非天然UV可裂解氨基酸。
在一方面，本文提供了一种肽交换分析法，其通过提供包含测试肽和MHCI/配体复合物的第一组合物，以确定MHCI等位基因与测试肽的结合，该MHCI/配体复合物包括(i)包含α链、β链的MHCI分子和(ii)配体，其中该配体为包含非天然紫外线(UV)可裂解氨基酸的肽；将该第一组合物暴露于UV光，以在UV可裂解氨基酸处裂解该配体；以及将该第一组合物孵育一段时间以形成包含游离测试肽、该α链、该β链和/或MHCI/-第二肽复合物的第二组合物；并确定该MHCI等位基因是否与该第二肽结合。
在一方面，本文提供了一种用于确定最佳MHCI等位基因-配体组合的方法，该方法涉及：提供在变性条件下纯化的多个MHCIα链单体，通过合并该多个MHCIα链单体、多个β链单体以及含有非天然UV可裂解氨基酸的配体，以形成反应混合物，在允许形成MHCI-配体复合物的条件下孵育该反应混合物，并确定是否形成该MHCI-配体复合物。
在一方面，本文提供了一种用于检测MHCI等位基因与测试肽的结合的方法，该方法涉及：提供包括测试肽和MHCI/配体复合物的第一复合物，其包括含有α链、β链的MHCI分子和配体，其中该配体为包括非天然、紫外线(UV)可裂解氨基酸的肽，然后将该第一复合物暴露于UV光下，以在UV可裂解氨基酸处裂解该配体，并检测该第二复合物中的MHCI/测试肽复合物，从而检测该MHCI分子与该测试肽的结合。
在一方面，本文提供了一种鉴定MHCI结合配体的方法，该方法包括在允许形成MHCI/配体复合物的条件下，将多个MHCI等位基因链单体与多个β链单体和配体接触，其中该配体为含有非天然UV可裂解氨基酸的肽，并检测该MHCI/配体复合物，从而鉴定MHCI结合配体。
在一方面，本文提供了一种用于确定最佳MHCI等位基因-配体组合的方法，该方法涉及：提供在变性条件下所纯化的多个MHCIα链单体，通过合并该多个MHCIα链单体、多个β链单体以及含有非天然UV可裂解氨基酸的配体，以形成反应混合物，在允许形成MHCI-配体复合物的条件下孵育该反应混合物，并确定是否形成该MHCI-配体复合物。
在一方面，本文提供了一种含有肽的试剂盒，该肽包含非天然UV可裂解氨基酸、MHCIα链单体和MHCIβ链单体。
在一方面，本文提供了一种系统，其含有：含有非天然UV可裂解氨基酸的肽；多个MHCIα链单体；多个MHCIβ链单体；以及能够允许形成MHCI/配体复合物的第一试剂。
本公开进一步涉及使用尺寸排阻色谱法或毛细管电泳结合非变性质谱分析，以监测肽交换的MHCI复合物的方法。
在一方面，本发明提供了一种监测样品中肽交换的主要组织相容性I类(MHCI)复合物的方法，其包括：(a)获得包含目的肽的经肽交换的MHCI复合物；(b)对该肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱法(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及(c)在(b)的色谱法或毛细管电泳之后，对该MHCI复合物进行非变性质谱分析(MS)，以鉴定包含目的肽的MHCI复合物。
在一方面，本发明提供了一种监测样品中肽交换的主要组织相容性I类(MHCI)复合物的方法，其包括：(a)获得包含目的肽的肽交换的MHCI复合物以及在允许可交换肽与该目的肽之间进行肽交换的条件下，将该复合物暴露至一种或多种目的肽；(b)对该肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱法(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及(c)在(b)的色谱法或毛细管电泳之后，对该MHCI复合物进行非变性质谱分析(MS)，以鉴定包含目的肽的MHCI复合物。
在一方面，本发明提供了一种监测MHCI复合肽的T细胞识别的方法，其包括：(a)获得包含目的肽的经肽交换的MHCI；(b)将该肽交换的MHCI复合物与包含T细胞的样品接触；(c)将T细胞结合的MHCI复合物与未结合的MHCI复合物分开；(d)对该肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱法(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及(e)在(d)的色谱法或毛细管电泳之后，对该MHCI复合物进行非变性质谱分析(MS)，从该样品中鉴定出包含被T细胞识别的肽的MHCI复合物。
在一方面，本发明提供了一种监测MHCI复合肽的T细胞识别的方法，其包括：(a)获得包含可交换肽的主要组织相容性I类(MHCI)复合物，并在允许肽交换的条件下，将该复合物暴露至一种或多种目的肽；(b)将该肽交换的MHCI复合物与包含T细胞的样品接触；(c)将T细胞结合的MHCI复合物与未结合的MHCI复合物分开；(d)对该肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱法(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及(e)在(d)的色谱法或毛细管电泳之后，对该MHCI复合物进行非变性质谱分析(MS)，从该样品中鉴定出包含由T细胞识别的肽的MHCI复合物。
附图说明
图1是描绘用于筛选MHCI的肽结合物的高通量测定的卡通图。使泛-HLA捕获抗体附接至ELISA板。在一个锅式再折叠反应中在ELISA板存在下混合未折叠HLA、变性/复性B2M和肽。通过泛-HLA捕获抗体捕获稳定的MHCI/B2M/肽复合物。通过添加抗B2M生物素化二抗并且随后添加检测用链霉亲和素(streptavidin)-HRP复合物经由HRP-HRP底物生物发光反应来确定MHCI/B2M/肽复合物的相对数量。
图2示出了在各结合物中平均化的经捕获MHCI/B2M/肽复合物(经由二抗报告基因)的归一化(相对于不存在肽，样品信号/阴性对照信号)ELISA信号的条形图图示。图片A示出了38种不同HLA、HLB和HLC等位基因在1-40个反应单位范围内的归一化信号，并且图片B示出了38种在B2M和肽存在下再折叠的HLA、HLB和HLC等位基因在1-5个反应单位范围内的归一化信号。
图3A和图3B示出了MHCI/B2M/肽结合物中的平均化ELISA信号的条形图图示。图3A中的条形图示出了一些等位基因对用于标记ELISA板的泛-HLA抗体具有低亲和力。图3B中的条形图示出了一些MHCI/B2M复合物在不存在肽下较为稳定。虚线指示A与B中的相同信号电平。箭头指示低捕获抗体结合物的特定MHCI等位基因(A)以及在不存在肽下较为稳定的特定MHCI/B2M复合物(B)。
图4A和图4B示出了在UV肽(含有UV-可裂解氨基酸的肽)存在下MHCI/B2M/UV肽结合物中的平均化ELISA信号的条形图图示。图4A示出了MHCI/B2M/UV肽复合物在1-40个反应单位范围内的整体归一化信号。图4B示出了1-5个反应单位范围内的归一化信号，从而指示在不存在肽下形成稳定复合物的特定等位基因(S)以及捕获抗体对其具有低亲和力的等位基因(L)。
图5是比较18种不同HLA/HLB等位基因的扩大再折叠纯化的归一化ELISA结果和产率的条形图。黑色条指示如通过ELISA所检测由所形成MHCI/B2M/肽复合物生成的相对信号。灰色条指示产生1L每一MHCI/B2M/肽复合物的产率％。水平线指示MHCI/B2M/肽复合物品质控制的1％截止值。名称(S)、(L)分别是指在不存在肽时较为稳定的MHCI/B2M复合物以及捕获抗体对其具有低亲和力的MHC/B2M/肽。
图6示出了三种肽的MHC/B2M/肽交换测定的2-D LC/MS表征的代表性尺寸排阻以及反相色谱图和质谱。
图7是MHCI等位基因以及可与本文实施例中的等位基因缔合的肽序列的列表。每个氨基酸由其标准单字母缩写代表。J代表非天然UV可裂解氨基酸。
图8A-8C.图8A是用于检测经组装MHCI/B2M/肽复合物的时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的卡通图图示。图8B是表示用于测量MHCI复合物的熔融温度的热位移并且由此测量结合的差示扫描荧光法(DSF)测定的示意图。图8C是HLA*03:01肽结合物和非结合物的代表性光谱，其中熔融温度(Tm)发生移位以指示复合物形成的焓变化。
图9A和图9B示出了用于发现不同等位基因的高亲和力肽的TR-FRET测定的条形图图示。图9A绘制每种所测试复合物处于37℃和4℃在665nm下荧光的变化。图9B是TR-FRET测定的相对准确度对MHCI等位基因的条形图，准确度在85％至100％之间变化。
图10A-10D.图10A提供了比较含有MHCI HLA*03:01的复合物的肽结合物和非结合物的对比性DSF光谱。在低温(20℃)下，存在结合肽的复合物的相对荧光(RFU)较低，并且不结合肽的复合物的相对荧光较高。肽结合物DSF光谱示出了类似的Tm温度范围，而非结合物则具有较低Tm。图10B是肽结合物(黑色)和非结合物(灰色)的总数对RFU值的条形图。图10C是肽结合物(黑色)和非结合物(灰色)的总数对RFU值的条形图。图10D是4种不同MHCI等位基因的测定准确度％(均>90％)的条形图。
图11A-11D.图11A提供了比较含有MHCI HLA*08:01的复合物的肽结合物和非结合物的对比性DSF光谱。在低温(20℃)下，在存在肽结合物和非结合物时，相对荧光(RFU)类似。肽结合物/非结合物DSF光谱均示出了类似的Tm温度范围。图11B的肽结合物(黑色)和非结合物(灰色)的总数对Tm温度的条形图。图11C是肽结合物(黑色)和非结合物(灰色)的总数对RFU值的条形图。图11D是4种不同MHCI等位基因的测定的准确度％(60-85％的准确度)的条形图。
图12是TR-FRET“真正结合物”百分比对预测百分等级的条形图图示。百分等级是通过经由肽/MHCI结合的预测演算法运行肽序列所计算的值(Nielsen M等人，ProteinSci.(2003)12:1007-1017；Andreatta M和Nielsen,M.Bioinformatics(2016)Feb 15；32(4):511-517)。通过演算法将百分等级小于2.00(虚线左侧)的肽归类为MHCI结合物。本文所述的方法和测定鉴定出许多是真正结合物但通过预测演算法归类为非结合物的肽-HLA组合。
图13是用于确定随时间变化的MHCI/B2M/肽交换的2-D LC/MS测定的示意图。在第二、交换肽存在下，将MHCI/B2M/UV-可裂解肽复合物暴露于UV光，从而裂解UV-可裂解肽的肽键。在MHCI/B2M复合物存在下，第一肽的裂解片段交换为全长第二肽。在某些时间点，通过以下各项来分析交换混合物：1)“第一维”：尺寸排阻色谱法(SEC)，其分离MHCI/B2M/肽复合物与游离MHCI、B2M和肽；2)“第二维”：SEC峰的反相HPLC，其分离峰组分；以及3)单独反相峰的质谱分析，其鉴定并量化峰组分。
图14示出了作为每个等位基因的交换物或非交换物的10种肽的验证图片，其示出为如通过2-D LC/MS所测量的，多种肽与MHCI/B2M/UV-肽复合物随时间的交换％的绘图。上部数据点指示肽发生交换(在第二HPLC峰中观察)并且并不损失MHCI峰(在第一SEC峰中观察)的MHCI/肽复合物。中间数据点指示损失一定的MHCI SEC峰面积但暴力流交换肽，并且下部数据点指示大量损失MHCI SEC峰并且并无交换肽。
图15是用于确定40种肽的池随时间的MHCI/B2M/肽交换的2-DLC/MS测定的示意图。在池交换肽存在下，使MHCI/B2M/UV-可裂解肽复合物暴露于UV光，从而裂解UV-可裂解肽的肽键。在MHCI/B2M复合物存在下，第一肽的裂解片段交换为全长肽。在某些时间点，通过以下各项来分析交换混合物：1)尺寸排阻色谱法(SEC)，其分离MHCI/B2M/肽复合物与游离MHCI、B2M和肽；2)SEC峰的反相HPLC，其分离峰组分；以及3)单独反相峰的质谱分析，其鉴定并量化峰组分，包括量化来自交换池的不同肽的数量。本文的图形示出了与MHCI HLA-A*01:01的交换反应中所包括的40种肽的池中的10种已知肽结合物随时间的强度。此方法允许在单次运行中鉴定多种肽结合物。
图16示出了使用UV-可裂解第一肽(浅色和深色圆)的MHCI肽交换过程的示意图，该第一肽在UV裂解之后对MHCI结合口袋的亲和力有所减小，并且因此由可为患者预测表位的目的肽(较深色实心圆)代替。
图17A和图17B示出了未结合肽、具有可交换肽(具有双色圆)以及在肽交换之后具有目的肽(具有浅色圆)的SEC-MS量化的游离HLA和MHCI复合物的实例。图17A示出了HLA和完整MHCI复合物的量化，而图17B示出了来自肽交换前以及肽交换后的MHCI复合物的信号。
图18A-18D示出了在SEC和CZE分离之后的MS分析。图18A和18B示出了在SEC分离后通过MS对不同浓度的肽复合物的解析。注入体积为4μL。图18C示出了在ZipChipTM CZE装置上进行CZE分离后通过MS对示例性肽复合物进行的解析。在100μg/mL下以3nL注入体积进行注入。图18D示出了示例性可交换肽在UV暴露前(上图；双色圆)以及在CZE分离后示例性目的经交换肽在UV暴露后(下图，实心圆)的MS分析。
图19A和图19B示出了示例性数据，其中评价来自SEC-非变性MS分析的多种不同示例性肽的肽交换百分比。如图19A中所示，首先评价交换以确保饱和。交换为目的肽的可交换肽的分数示出于图19B中。
图20示出了产生并组装用于免疫监测患者T细胞的MHCI四聚体的工作流程示意图。
图21示出了评价UV-可裂解肽与重组MHCI复合物的第二目的肽的交换谱的方法(包括ELISA、TR-FRET和2D-LC/MS)的卡通图示意图。
图22示出了使用SEC-MS测量完整MHCI复合物的工作流程示意图以及两个示例性质谱。
图23示出了为具有和不具有结合肽的各种天然MHCI物质的相对丰度对m/z(质量对电荷)的绘图的示例性非变性质谱。使用具有或不具有结合肽的相应MHCI复合物的卡通图图示标记光谱中的每组电荷状态。
图24示出了具有结合肽的MHCI复合物的示例性非变性质谱绘图的单电荷状态的放大视图。各个峰指示不同电荷状态，这些不同电荷状态对应于具有和不具有肽或具有和不具有缓冲加合物或具有或不具有起始甲硫氨酸的不同MHCI复合物。
图25示出了同一肽交换反应的两个不同时间点的示例性质谱。具有或不具有结合肽的相应MHCI复合物标记于每个峰上方。
图26示出了用于量化肽交换时程后的完整MHCI复合物的两个示例性质谱。使用所存在MHCI物质的卡通图图示标记每个光谱中的峰。右侧的解卷积光谱示出了与UV-可裂解肽或交换时程后的经交换肽结合的MHCI复合物。
图27是示出了通过SEC-MS监测MHCI复合物以及由UV光暴露引发的肽交换反应的三种基于质谱(MS)的方法的示意图。通过高解析度MS(HR-MS)确定每个样品的组分，通过非变性MS实施天然MHCI复合物复合物分析，并且通过使用非变性MS测量随时间的交换％来确定肽与MHCI复合物之间的结合亲和力。
图28是不同MHCI HLA等位基因和不同肽的一次性高通量筛选示意图的卡通图图示。在从PBMC样品分选患者源T细胞之后，可以高通量形式进一步测试这些T细胞对MHCIHLA等位基因/预测肽表位的数千种不同组合的体外反应性。
图29示出了具有和不具有UV-可裂解结合肽的HLA-A*02:01MHCI复合物在一定浓度范围内的质谱。注入配备有SEC的uHPLC上的浓度范围为2.5mg/mL至83μg/mL，并且每次注入的注入体积为4μL。目的蛋白质物质(具有或不具有结合肽的MHCI复合物)以单峰形式共洗脱于SEC色谱图中(以强度对时间的绘图形式，突出显示)。每种可能的蛋白质物质以卡通图形式指示于质谱中的相应峰(对应于SEC色谱图单峰)上方。
图30示出了在配备有HSN ZipChip的质谱仪上重复注入3nL 0.1mg/mL HLA-A*02:01MHCI复合物的多个电泳图和相应MS1质谱。
图31示出了在配备有HSBG ZipChip的质谱仪上重复注入3nL 41.0或20.5μg/mLHLA-A*02:01MHCI复合物的多个电泳图和相应MS1质谱。
图32示出了在用于最佳化MHCI复合物分析的仪器条件的不同帽温度和ESI鞘气体源设定下所收集的质谱。
图33示出了SEC-MS与CZE-MS之间的对比。顶列(从左到右)示出了HLA-A*01:01的SEC-MS分析的代表性色谱图、MS1光谱和解卷积峰光谱。底列(从左到右)示出了HLA-A*01:01的CZE-MS分析的代表性电泳图、MS1光谱和解卷积峰光谱。
图34示出了多个蛋白质浓度的HLA-A*01:01的重复电泳图和相应解卷积质谱。在每次运行中，在500V/cm的电压下将3nL蛋白质注射在HSBG芯片上。样品浓度范围为41-2.05μg/mL。
图35示出了在分析之前通过去盐旋转管柱或通过旋转去盐板缓冲液交换蛋白质样品的两种方法。
图36示出了在UV光引发的肽交换反应之前和之后MHCI蛋白复合物的所得解卷积质谱。每个峰中的MHCI物质组成由卡通标记指示。
图37示出了对于多种不同交换肽(由x轴上所标记的数字指示，每条一个)以及4种不同MHCI等位基因(指示于每条群组下方)MHCI复合物形成和MHCI/肽交换反应的完整度％(y轴)的两种不同条形图图示。顶列示出了游离HLA对MHCI复合物的相对量。底列示出了具有UV-可裂解结合肽(UV-MHCI)或经交换结合肽(pMHCI)的MHCI复合物的相对量。
图38示出了包括α链和B2M的MHCI复合物结构的卡通示意图以及具有和不具有起始甲硫氨酸以及具有纯化加合物的MHCI复合物的解卷积质谱，这些质谱在扩展质量范围(EMR)Exactive Orbitra(灰色光谱)或Orbitrap Eclipse(黑色光谱)上分析，仅通过EMR分析证明了肽的气相解离。每种MHCI复合物质的卡通图图示显示于相应MS峰旁边。星形标记指示存在起始甲硫氨酸。星号标记指示针对纯化加合物观察的额外质量。
图39示出了当在Orbitrap Eclipse上在递增电压下分析时MHCI复合物(红色电荷标记)的MS1光谱。随着源电压增加，肽可从复合物解离并且重新独立定序，其中HLA/B2M复合物得以保留(绿色电荷标记)。
图40示出了在气相解离之后MHCI复合物组分的MS1光谱。游离肽示于插图中。
图41A-41C示出了ELISA测定开发。图41A是ELISA形式的对比。CMV pp65信号归一化至0.03-6.67μg/mL下的无肽对照。与抗HLA涂层和抗B2M检测剂相比，以抗B2M作为涂层并且以抗HLA-生物素作为检测剂的形式在0.74、2.22和6.67μg/mL下在CMV pp65与无肽对照之间显示较小差异。图41B示出了在使用CMV pp65、BMRF1以及不使用肽的情况下小规模再折叠之后HLA-A*02:01的ELISA分析。在0.005μg/mL至3.33μg/mL之间的MHCI浓度下运行ELISA分析。图41C示出了归一化至1μg/mL下的无肽对照的CMV pp65和BMFR1肽的ELISA OD值。
图42A-42H示出了A*02:03、B*35:03和C*02:02的候选条件化MHCI配体的鉴定过程。图42A示出了使用A*02:03在不同浓度(0.1-3μg/mL)下筛选的5种肽的OD值。图42B(A*02:03)、图42C(B*35:03)和图42D(C*02:02)示出了具有所选肽的MHC复合物在1μg/mL下的归一化ELISA OD。选择针对每种HLA产生最高归一化OD值的肽并且设计从N-末端起的位置2、4、6和8处具有UV-氨基酸取代的变体。图42E示出了衍生自使用HLA-A*02:03在不同浓度下筛选的肽A02:03-02的4种条件化MHCI配体的OD值。图42F(HLA A*02:03)、图42G(B*35:03-05)和图42H(C*02:02-03)示出了具有衍生自图42B、图42C和图42D中所鉴定的肽的所选条件化MHCI配体的MHC复合物的归一化ELISA OD。使用不含经改造J氨基酸的肽(亲本肽)作为内部对照(灰色条)。在所有测定中，无肽(NP)用作阴性对照。
图43A-43E示出了经扩大、再折叠A0201 MHCI材料的生物素化分析、纯化和表征。图43A是经再折叠MHCI反应混合物中的HLA等位基因在生物素化之前(黑色线)和之后(灰色线)的LC/MS分析。两个峰对应于全长HLA以及具有N-末端甲硫氨酸裂解的截短HLA。两个峰在生物素化之后的位移对应于生物素的分子量(MW)。图43B示出了生物素化MHCI复合物在再折叠之后的阴离子交换色谱图以及突出显示框中所收集馏分的SDS-PAGE分析。SDS-PAGE带的MW对应于B2M和HLA。图43C示出了经纯化MHCI复合物的LC/MS TIC色谱图。1.625min和1.74min下的峰对应于UV-肽并且1.8min和2.2min下的峰分别对应于B2M和HLA。图43D示出了经纯化MHCI复合物的SEC-MALS分析。黑色线对应于A280色谱图(左y轴)并且虚线对应于MW分析(右y轴)。图43E示出了在1L、5L和15L规模下的纯化后MHCI产率。
图44A-44D示出了条件化MHCI复合物的扩大产生、纯化和表征。图44A是使用在小规模筛选中鉴定的条件化MHCI配体生成的经纯化再折叠MHCI复合物的SDS-PAGE分析，图44B是其再折叠产率，图44C示出了其B2M与HLA的比率并且图44D是其SEC-MALS MW分析。
图45A-45J示出了肽交换的2D LC/MS分析。图45A示出了2DLC/MS工作流程的示意图。图45B示出了HLA-A*02:01MHCI复合物在与CMV pp65交换之后的2D LC/MS分析中的第1维的A280 nm SEC色谱图。图45C示出了HLA-A*02:01MHCI复合物在与CMV pp65交换之后的2D LC/MS分析中的第2维的A280 nm SEC色谱图。图45D示出了HLA-A*02:01MHCI复合物在与CMV pp65交换之后的2D LC/MS分析中的第2维的交换肽(黑色线)和条件化MHCI配体(虚线)的EIC色谱图。图45E示出了A*02:03MHCI复合物在与A0203-05肽交换之后的2D LC/MS分析中的第一维的A280 nm SEC色谱图。图45F示出了A*02:03MHCI复合物在与A0203-05肽交换之后的2D LC/MS分析中的第2维的A280 nm SEC色谱图。图45G示出了HLA-A*02:03MHCI复合物在与A0203-05肽交换之后之2D LC/MS分析中的第2维的交换肽(黑色线)和条件化MHCI配体(虚线)的EIC色谱图。图45H示出了A0*02:03MHCI复合物在与已知非结合肽交换之后的2DLC/MS分析中的第1维的A280 nm SEC色谱图。图45I示出了A*02:03MHCI复合物在与非结合肽交换之后的2DLC/MS分析中的第2维的A280 nm SEC色谱图。图45J示出了HLA-A*02:03MHCI复合物在与不相关肽交换之后的2D LC/MS分析中的第2维的交换肽(黑色线)和条件化MHCI配体(虚线)的EIC色谱图。
图46A-46F示出了在2D LC/MS分析中在肽交换之后的第1维的A280MHCI峰的量化。A*02:03(图46A)、A*26:01(图46B)、B*18:01(图46C)、B*35:03(图46D)、C*02:02(图46E)和C*14:02(图46F)针对阳性对照肽(已知结合物，黑色条)和非结合肽(灰色条)的MHCI肽交换后峰面积(归一化至肽交换前的峰面积)。正号指示在第二维的EIC分析中观察到交换肽并且负号指示在EIC分析中未观察到交换肽。
图47A-47C示出了ELISA测定开发。图47A示出了ELISA形式的对比。在0.03-6.67μg/mL的MHCI浓度下CMV pp65和HLA-A*02:01的S/N值。图47B示出了针对ELISA形式2在使用CMV pp65、BMRF1以及不使用肽的情况下的小规模再折叠之后HLA-A*02:01的ELISA分析。在0.005μg/mL至3.33μg/mL之间的MHCI浓度下运行ELISA分析。图47C示出了利用CMV pp65和BMFR1肽以及HLA-A*02:01组装的MHCI复合物的ELISA形式2在1μg/mL的MHCI浓度下的ELISAS/N值。
图48A-48H示出了A*02:03、B*35:03和C*02:02的候选条件化MHCI配体的鉴定。图48A示出了使用A*02:03在不同浓度(0.1-3μg/mL)下筛选的5种肽的OD值。图48B(A*02:03)、图48C(B*35:03)和图48D(C*02:02)示出了具有所选肽的MHC复合物在1μg/mL下的S/NELISA值。图48E示出了衍生自使用HLA-A*02:03在不同浓度下筛选的肽A02:03-02的4种条件化MHCI配体的OD值。图48F(HLA A*02:03)、图48G(B*35:03-05)和图48H(C*02:02-03)示出了具有衍生自图48B、48C和48D中鉴定的肽的所选条件化MHCI配体的MHC复合物的S/N值。使用不含经改造J氨基酸的肽(亲本肽)作为内部对照(灰色条)。在所有测定中，无肽(NP)用作阴性对照。
图49示出了A*02:01MHCI单体的扩大产生的示意图。经开发用于扩大产生MHCI复合物的方案中的第一步骤是混合所有再折叠组分并且进行再折叠。第二步骤是过程中生物素化，随后在第三步骤中进行阴离子交换色谱。
图50A-50F示出了经扩大、再折叠A*02:01MHCI单体的生物素化分析、纯化和表征。图50A示出了经再折叠MHCI反应混合物中的HLA等位基因在生物素化之前(黑色线)和之后(灰色线)的LC/MS分析。两个峰对应于全长HLA以及具有N-末端甲硫氨酸裂解的截短HLA。两个峰在生物素化之后之位移对应于生物素的MW。图50B示出了生物素化MHCI复合物在再折叠之后的阴离子交换色谱图，并且图50C示出了突出显示框中所收集馏分的SDS-PAGE分析。SDS-PAGE带的MW对应于B2M(13kDa)和HLA(37kDa)。图50D示出了经纯化MHCI复合物的LC/MSTIC色谱图。1.625min和1.74min下的峰对应于UV-肽并且1.8min和2.2min下的峰分别对应于B2M和HLA。图50E示出了经纯化MHCI复合物的SEC-MALS分析。黑色线对应于A280色谱图(左y轴)并且虚线对应于MW分析(右y轴)。图50F示出了在以1L、5L和15L规模纯化之后的MHCI产率％(mg经纯化MHCI/mg再折叠MHCI*100)±标准偏差(N＝3)。
图51A-51D示出了条件化MHCI复合物的扩大产生、纯化和表征。图51A示出了使用在小规模筛选中鉴定的条件化MHCI配体生成的经纯化再折叠MHCI复合物的SDS-PAGE分析，图51B示出了其平均再折叠％产率(mg经纯化MHCI/mg再折叠MHCI*100)±标准偏差(N＝3)，图51C示出了其平均B2M对HLA比率±标准偏差(N＝3)并且图51D示出了其平均SEC-MALS MW分析±标准偏差(N＝3)。
图52A-52J示出了肽交换的2D LC/MS分析。图52A示出了2DLC/MS工作流程的示意图。图52B示出了HLA-A*02:01MHCI复合物在与CMV pp65交换之后的2D LC/MS分析中的第一维的A280 nm SEC色谱图。虚线界定收集并且注入第二柱中的区域。图52C示出了HLA-A*02:01MHCI复合物在与CMV pp65交换之后的2D LC/MS分析中的第二维的A280 nm SEC色谱图。图52D示出了HLA-A*02:01MHCI复合物在与CMV pp65交换之后的2D LC/MS分析中的第二维的交换肽(黑色线)和条件化MHCI配体(虚线)的EIC色谱图。图52E示出了A*02:03MHCI复合物在与A0203-05肽交换之后的2D LC/MS分析中的第一维的A280 nm SEC色谱图。虚线界定收集并且注入第二柱中的区域。图52F示出了A*02:03MHCI复合物在与A0203-05肽交换之后的2D LC/MS分析中的第二维的A280 nm SEC色谱图。图52G示出了HLA-A*02:03MHCI复合物在与A0203-05肽交换之后的2D LC/MS分析中的第二维的交换肽(黑色线)和条件化MHCI配体(虚线)的EIC色谱图。图52H示出了A0*02:03MHCI复合物在与已知非结合肽交换之后的2DLC/MS分析中的第一维的A280 nm SEC色谱图。虚线界定收集并且注入第二柱中的区域。图52I示出了A*02:03MHCI复合物在与非结合肽交换之后的2D LC/MS分析中的第二维的A280nm SEC色谱图。图52J示出了HLA-A*02:03MHCI复合物在与不相关肽交换之后的2D LC/MS分析中的第二维的交换肽(黑色线)和条件化MHCI配体(虚线)的EIC色谱图。
图53A-53F示出了在2D LC/MS分析中于肽交换之后的第一维A280MHCI峰的量化。图53A(A*02:03)、图53B(A*26:01)、图53C(B*18:01)、图53D(B*35:03)、图53E(C*02:02)和图53F(C*14:02)示出了针对阳性对照肽(已知结合物，黑色条)和非结合肽(灰色条)的肽交换后MHCI峰面积相对于肽交换前峰面积的分数。正号指示在第二维的EIC分析中观察到交换肽并且负号指示在EIC分析中未观察到交换肽。
图54A-54F示出了A*26:01、B*18:01和C*14:02HLA等位基因的条件化MHCI配体的鉴定。图54A(A*26:01)、图54B(B*18:01)和图54C(C*14:02)示出了1μg/mL的具有所选肽的MHC复合物。选择针对每种HLA产生最高归一化OD值的肽并且设计从N-末端起的位置2、4、6和8处具有UV-氨基酸取代的变体。具有衍生自图54A、54B和54C中所鉴定的肽的所选条件化MHCI配体的A*26:01(图54D)、B*18:01(图54E)和C*14:02(图54F)MHC复合物的归一化ELISAOD使用不含经改造J氨基酸的肽(亲本肽)作为内部对照(灰色条)。在所有测定中，无肽(NP)用作阴性对照。
图55A-55F示出了针对A*02:03(图55A)、A*26:01(图55B)、B*18:01(图55C)、B*35:03(图55D)、C*02:02(图55E)和C*14:02(图55F)生物素化MHCI复合物在再折叠之后的阴离子交换色谱图和突出显示框中所收集馏分的SDS-PAGE分析。
具体实施方式
在阅读本说明书之后，对于本领域技术人员而言，如何在各种替代实施例和替代应用中实施本公开内容将变得显而易见。然而，本文将不描述本发明的所有各种实施例。应理解，本文提呈的实施例仅以实例的方式提呈，而非限制性的。因此，各种替代实施例的详细描述不应解释为限制如本文所阐述的本公开的范围或广度。
在公开和描述本技术之前，应理解，以下描述的方面不限于特定组合物、制备此类组合物所述的方法或其用途，当然可改变。也应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而无意于进行限制。
仅为了读者的方便而将具体实施方式分为多个部分，见于任何部分的公开均可与另一部分中的公开组合。为了方便读者，可在说明书中使用标题或副标题，其不意欲影响本公开的范围。
定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在本说明书及随后的申请专利范围中，将参考许多术语，这些术语应定义为具有以下含义：
如本文中所使用，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所述范围内的任何整数的值，以及在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。
本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而无意于进行限制。除非上下文另外明确指出，否则如本文中所使用，单数形式“一(a/an)”和“该(the)”也意欲包括复数形式。
“任选地存在/发生的(optional)”或“任选地(optionally)”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括事件或情况发生的情况以及事件或情况不发生的情况。
术语“约”当在数字名称、例如温度、时间、量、浓度等(包括范围)之前使用时指示可能变化(+)或(-)10％、5％、1％的近似值或其间的任何子范围或子值。优选地，术语“约”在关于量使用时意指该量可能变化+/-10％。
“包含(comprising/comprises)”旨在意指组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应意指排除对于所述目的而言对组合具有任何实质意义的其他要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除不会实质上影响所要求的本发明的基本并且新颖特征的其他物质或步骤。“由……组成”应意指排除超过痕量要素的其他成分以及实质性的方法步骤。这些过渡术语中的每一者定义的实施例都在本公开的范围内。
如本文所使用，术语“癌症”指在哺乳动物(例如人)中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、癌瘤和肉瘤。可使用本文提供的化合物或方法治疗的示例性癌症包括脑癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、前列腺癌、大肠直肠癌、胰腺癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、子宫颈癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、头癌、霍奇金氏病和非霍奇金氏淋巴瘤。可用本文提供的化合物或方法治疗的示例性癌症包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、大肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌和子宫癌，另外的实例包括甲状腺癌、胆管癌、胰腺癌、皮肤恶性黑色素瘤、大肠腺癌、直肠腺癌、胃腺癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、浸润性乳癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、尿路膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌症、甲状腺髓样癌、黑色素瘤、大肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌或前列腺癌。
化合物的“选择性(selective或selectivity)”等是指化合物能够区分分子标靶(例如，化合物对HMT SUV39H1和/或HMT G9a具有选择性)。
化合物的“特异性(specific)”、“特异性地”、“特异性(specificity)”等是指化合物能够针对特定分子标靶引起特定作用(例如抑制)并且对细胞中的其他蛋白质具有极小作用(例如，对HMT SUV39H1和/或HMT G9a具有特异性的化合物可抑制这些HMT的活性，而同一化合物几乎没有抑制其他HMT(例如DOT1、EZH1、EZH2、GLP、MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、NSD2、SET1b、SET7/9、SET8、SETMAR、SMYD2、SUV39H2))。
本文所用的“样品”指意欲用于分析的任何样品。在一些实施例中，样品取自患者。在一些实施例中，样品为“生物流体样品”。本文所用的“生物流体样品”指来自生物体或受试者的任何生物流体。实例包括全血、血浆、泪液、唾液、淋巴液、尿液、血清、脑脊髓液、胸膜渗出液和腹水。
术语“免疫应答”等在常用和通常意义上指抵抗疾病的生物体应答。该应答可由先天性免疫系统或由适应性免疫系统产生，如本领域众所周知。
术语“调节免疫应答”等指因施用药剂(例如如本文所公开的化合物，包括其实施例)而改变受试者的免疫应答。据此，免疫应答可因施用药剂(例如如本文所公开的化合物，包括其实施例)而活化或钝化。
“B细胞”或“B淋巴球”指本领域所用的其标准。B细胞是淋巴球中的一种白血球(white blood cell、leukocyte)，其发育成浆细胞(“成熟B细胞”)以产生抗体。“未成熟B细胞”是可发育为成熟B细胞的细胞。通常，祖-B细胞发生免疫球蛋白重链重排而变成祖B前B细胞，并且另外发生免疫球蛋白轻链重排而变成未成熟B细胞。未成熟B细胞包括T1和T2 B细胞。
本文所用的“T细胞”或“T淋巴球”是在细胞介导的免疫中发挥核心作用的一类淋巴球(白血球亚型)。它们与其他淋巴球(诸如B细胞和自然杀伤细胞)的区别可在于在细胞表面上存在T细胞受体。T细胞包括例如天然杀伤T(NKT)细胞、细胞毒性T淋巴球(CTL)、调控性T(Treg)细胞和辅助性T细胞。可通过使用T细胞检测剂来区分不同类型的T细胞。
“调控性T细胞”或“抑制性T细胞”是调节免疫系统、维持自体抗原耐受性以及预防自体免疫疾病的淋巴球。
氨基酸在本文中可以用它们通常已知的三个字母符号或IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission推荐的一个字母符号来指代。同样地，核苷酸可用它们一般被接受的单个字母代码来指代。
术语“多肽(polypeptide)”、“肽(peptide)”和“蛋白质(protein)”在本文中可互换使用并且指氨基酸残基的聚合物，其中该聚合物可在实施例中与不由氨基酸组成的部分结合。这些术语适用于氨基酸聚合物，其一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。“融合蛋白”指编码两个或更多个单独蛋白质序列的嵌合蛋白，该两个或更多个单独蛋白质序列重组表现为单个部分。
关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对于核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独取代、缺失或添加将会修改、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸，该序列为“保守修饰的变体”，其中该改变导致氨基酸经化学类似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域所熟知的。此类保守修饰的变体是对本公开的多态变体、种别间同源物和等位基因的补充并且不排除它们。
氨基酸或核苷酸碱基的“位置”由数字表示，该数字基于其相对于N-末端(或5'-端)的位置顺序鉴定参考序列中的每个氨基酸(或核苷酸碱基)。由于在确定最佳比对时必须考虑缺失、插入、截短、融合等，因此，一般而言通过简单从N-末端计数而确定的测试序列中的氨基酸残基数目不一定与参考序列中其对应位置的数量相同。例如，在变体相对于比对参考序列而具有缺失的情况下，在变体中将不存在与参考序列中相对应缺失位点的位置处的氨基酸。在比对的参考序列中有插入的情况下，该插入将不对应于参考序列中的经编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下，参考序列或比对序列中可能存在不对应于对应序列中任何氨基酸的氨基酸序列。
当在编号给定氨基酸或多核苷酸序列的背景中使用时，术语“参考编号”或“对应于”涉及当将给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列进行比较时编号特定参考序列的残基。
术语“氨基酸侧链”指含于氨基酸上的功能性取代基。例如，氨基酸侧链可为天然氨基酸的侧链。天然氨基酸是由以下遗传密码编码的那些氨基酸：例如，丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天门冬氨酸、半胱氨酸、氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸，以及随后经以下修饰的那些氨基酸：例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。在实施例中，氨基酸侧链可为非天然氨基酸侧链。
术语“非天然氨基酸侧链”是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物的功能性取代基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍、烯丙基丙氨酸、2-氨基异丁酸。非天然氨基酸是天然出现或以化学方式合成的非蛋白原性氨基酸。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
术语“UV-可裂解氨基酸侧链”是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物的功能性取代基。UV-可裂解氨基酸系天然出现或以化学方式合成的非蛋白原性氨基酸。该等类似物可具有经修饰的R基团或经修饰的肽主链，但保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。UV-可裂解氨基酸包括但不限于2-硝基苯甘氨酸(NPG)、扩展邻-硝基苄基连接子、邻-硝基苄基笼形酚、邻-硝基苄基笼形硫醇、32硝基藜芦氧羰基(NVOC)笼形苯胺、邻-硝基苄基笼形硒化物、双-偶氮苯、香豆素、肉桂基、螺吡喃、2-硝基苯丙氨酸(2-nF)和3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸(ANP)氨基酸类似物。
本文所提供的术语“MHCI”或“主要组织相容性复合物I类”或“主要组织相容性复合物I”或“MHCI单体”包括任一重组或天然形式的主要组织相容性复合体-1(MHCI)或维持MHCI活性(例如与MHCI相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性内)的其变体或同源物。在一些方面，与天然MHCI多肽相比，变体或同源物在整个序列或部分序列(例如50个、100个、150个或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，MHCI是两种以非共价方式结合的蛋白质重链(α)和轻链(β2-微球蛋白)的异源二聚体、其同源物或功能片段。在实施例中，MHCI包括肽配体。
术语“HLA”或“人白血球抗原”是指由MHC基因复合物编码的蛋白质群组。具体地但不限于，MHCI基因复合物编码HLA-A、HLA-B和HLA-C蛋白质群组。
术语“β-2微球蛋白”或“B2M”或“β2微球蛋白”或“β链”是指细胞表面MHCI蛋白复合物的较小或轻链蛋白质。B2M与一条α链(重链)形成异源二聚体复合物。B2M由B2M基因编码。
术语“α链”或“阿尔法链”是指MHCI蛋白复合物的较大或重链蛋白质。α链进一步分成亚基α1、α2和α3并且含有一个跨膜螺旋。α链经由α3亚基结合B2M以形成称为MHCI复合物的异源二聚体。α链是多形的，并且主要由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因编码，并在较小程度上由HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K和HLA-L编码。
术语“配体”是指与生物分子形成复合物以提供生物功能的分子。结合可发生于(但不限于)蛋白质、肽、RNA、DNA、核酸、核酸衍生物、非天然核酸、氨基酸、氨基酸衍生物、非天然氨基酸、碳水化合物、单糖、二糖、寡糖、寡核苷酸、金属、金属复合物、药物、脂质、脂肪酸、代谢物、无机分子、有机分子、生物聚合物和聚合物之间。配体复合物可经由离子型键合、共价键合、范德华力(Van der Waals)相互作用和/或氢键合形成。MHCI配体通常是肽。
本文所用的术语“结合”和“结合的”是根据其简单且普通的含义使用并且是指原子或分子之间的缔合。缔合可以是直接缔合或间接缔合。例如，结合的原子或分子可以是直接的，例如通过共价键或连接子(例如第一连接子或第二连接子)；或是间接的，例如通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键)、范德华力相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导偶极、伦敦分散)、环堆积(π效应)、疏水相互作用等)。
术语“抗体”是指由免疫球蛋白基因或其功能性片段编码的多肽，其特异性地结合并识别抗原。公认的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)、γ(gamma)、δ(delta)、ε(epsilon)和μ(mu)恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白变异区基因。轻链分为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义了免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
在片语“特异性地(或选择性地)结合”至抗体或“特异性地(或选择性地)与其发生免疫应答”提及蛋白质或肽时，其是指确定蛋白质存在的结合反应，通常是在蛋白质和其他生物制剂的异质群体中。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的抗体与特定蛋白质的结合至少是背景的两倍，更通常是背景的10至100倍以上。在此类条件下与抗体的特异性结合需要选择针对特定蛋白质具有特异性的抗体。例如，可选择多克隆抗体以仅获得与所选抗原而非其他蛋白质发生特异性免疫应答的抗体的子集。该选择可通过减去与其他分子交叉反应的抗体来实现。可使用各种免疫测定形式来选择与特定蛋白质发生特异性免疫应答的抗体。例如，常规地，使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质发生特异性免疫应答的抗体(参见例如Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998)用于描述可用于确定特异性免疫应答性的免疫测定形式和条件)。
术语“变性”是指蛋白质、多肽、DNA、RNA或其他生物聚合物的三维结构通过化学或机械方式或通过加热或冷却破坏的过程。
“肽交换”过程是指首先形成与肽结合的MHCI复合物，该肽能够代替为或交换为具有分析意义的另一肽(诸如推定新抗原肽)。在一些情况下，可通过降低第一肽对目的肽的结合亲和力(诸如通过第一肽的化学裂解、酶促裂解或UV-介导的裂解)促进交换。
“新抗原”或“新抗原肽”是指可由宿主的免疫系统识别为“非自体”的肽。新抗原肽可衍生自例如肿瘤细胞中的突变蛋白。它们也可衍生自来自病毒或细菌或其他病原体的病原性蛋白质。或者，它们可衍生自移植物，诸如组织移植物或同种异体移植物或其他移植细胞。
“1D-LC”或“一维液相色谱”过程是指单液相色谱分离，与“2D-LC”或“二维液相色谱”相比，其是指执行两次分离的色谱方法。
“尺寸排阻色谱法”或“SEC”是根据固相色谱介质上的大小来分离分子的色谱方式，其中较大分子以不同于较小分子的速率穿过固相柱。在一些实施例中，SEC用于1D-LC过程中。SEC也可用于与不同分离形式(诸如反相液相色谱步骤)组合的2D-LC过程中，或可采用离子交换或阳离子交换或亲和分离作为第二维。
“毛细管电泳”或“CE”是指使用电流使分子移经毛细管的过程。每个分子的迁移率可取决于其电荷、大小和形状。存在若干类型的CE，尤其包括毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、胶束电动毛细管色谱(MEKC)、毛细管电色谱(CEC)、毛细管等电聚焦(CIEF)和毛细管等电泳(CITP)。
本文所用的“毛细管区带电泳”或“CZE”是指可基于不同迁移率来分离缓冲溶液中的不同分子的一种CE。
“质谱法”或“MS”是指测量样品中的一种或多种分子的质荷比(m/z)的技术。如本文所用，“串联式MS”或“MS/MS”是指将单个离子、多个离子或整个质量包络(前驱体)移动至片段化腔室并且接着将片段化产物送至质量分析仪。根据质谱仪的设计，片段化事件可能发生在单个质量分析仪之前、两个或多个不同分析仪之间或单个质量分析仪内。
MS分析可能有多种选择。在一些实施例中，MS仪器不包含四极杆。在一些实施例中，MS仪器包含至少一个四极杆。在一些实施例中，MS仪器包含至少2个四极分析仪。在一些情况下，MS仪器包含八极。在一些实施例中，MS仪器包含至少3个四极分析仪。在某些MS中，检测器为离子阱、四极杆、轨道阱或TOF。在一些实施例中，MS仪器或方法为多反应监测(MRM)、单离子监测(SIM)、三级四极杆(TSQ)、四极杆/飞行时间(QTOF)、四极杆线性离子阱(QTRAP)、混合离子阱/FTMS、飞行时间/飞行时间(TOF/TOF)、Orbitrap仪器、离子阱仪器、平行反应监测(PRM)、数据相关采集(DDA)、数据独立采集(DIA)、多级片段化或串联时间MS/MS。在一些实施例中，使用电喷雾Orbitrap仪器。
“非变性质谱分析”是对在非变性状态的分子执行的MS过程，即，其中该分子是未折叠或变性的。
如本文中所使用，缩写“SEC-非变性MS”或“SEC-MS”是指SEC并且紧接非变性MS的过程。如本文中所使用，缩写“CE-非变性MS”、“CZE-非变性MS”、“CE-MS”和“CZE-MS”是指毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)并且紧接非变性MS的过程。
术语“定量(quantitation或quantitate)”在本文中意指以数值方式判定样品中的分析物的水平或量或数量或浓度。
一般而言，本文所提及的“受试者”是测试其生物样品中是否存在分析物的个体。在一些实施例中，该个体为人。然而，在一些实施例中，受试者还可以是另一种哺乳动物，诸如驯养或家畜物种，例如狗、猫、兔、马、猪、牛、山羊、绵羊等，或实验动物，诸如小鼠或大鼠。例如，哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物诸如猴)、兔以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。
如本文中所使用，“自动化”或“自动控制”过程是能够(例如)通过具有适当软件的电脑化控制系统运行的过程，其不同于在至少一个步骤期间或之间需要主动人工干预的系统，诸如将含有分析物的样品从系统的一个部件移动到另一部件的系统。
应理解，如本文所述的实例和实施例仅用于说明目的，并且基于其的各种修改或改变应为本领域技术人员所了解，并且将包括在本申请的精神和范围内以及随附权利要求范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的全文以引用方式并入本文。
本领域技术人员将理解，制备和使用本文所述的复合物的描述仅出于说明目的，并且本公开不受该说明的限制。
本文所论述的出版物仅由于其公开在本申请的申请日期之前而提供。本文中的内容皆不应视为承认此类出版物构成随附权利要求的现有技术。本文所提及的所有出版物的所有教导内容(包括但不限于所有组合物、组分、试剂和方法)都以全文引用方式并入本文中。
MHCI组合物
在一方面，本文提供一种主要组织相容性复合物I类(MHCI)/配体复合物，其包括含有α链、β链的MHCI分子和配体，其中配体为包含非天然UV-可裂解氨基酸的肽。
在实施例中，MHCI/配体复合物含有α链，其中α链由下列基因座中的任一者编码：HLA-A、HLA-B或HLA-C。在一些实施例中，α链由HLA-A基因座编码。在一些实施例中，α链由HLA-B基因座编码。在一些实施例中，α链由HLA-C基因座编码。
在实施例中，MHCI/配体复合物含有β-2微球蛋白域(B2M)，其中B2M域由MHCI基因复合物编码。
在实施例中，MHCI/配体复合物含有肽配体。在实施例中，肽配体的长度在8至11个氨基酸残基之间。在一些实施例中，肽配体的长度为8个氨基酸残基。在一些实施例中，肽配体的长度为9个氨基酸残基。在一些实施例中，肽配体的长度为10个氨基酸残基。在一些实施例中，肽配体的长度为11个氨基酸残基。
在实施例中，MHCI/配体复合物含有肽配体，其中肽配体含有非天然氨基酸。在一些实施例中，非天然氨基酸由UV辐射活化。在一些实施例中，含有非天然氨基酸的肽配体在通过UV光辐照之后发生裂解。在一些实施例中，非天然氨基酸包括但不限于2-硝基苯基甘氨酸(NPG)、扩展邻-硝基苄基接头、邻-硝基苄基笼型酚、邻-硝基苄基笼型硫醇、32硝基藜芦基氧基羰基(NVOC)笼型苯胺、邻-硝基苄基笼型硒化物、双-偶氮苯、香豆素、肉桂基、螺吡喃、2-硝基苯基丙氨酸(2-nF)和3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸(ANP)氨基酸类似物。在一些实施例中，非天然氨基酸为3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸(ANP)。
在实施例中，非天然氨基酸可位于肽配体的N-末端与C-末端之间的任何位置处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的N-末端处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的第二位置(即从N-末端起的第二位置)处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的第三位置处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的第四位置处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的第五位置处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的第六位置处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的第七位置处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的第八位置处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的第九位置处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的第十位置处。在一些实施例中，非天然氨基酸位于肽配体的C-末端处。
在实施例中，肽配体为FMYJDFHFI(SEQ ID NO.:1)；FLPJDFFPSV(SEQ ID NO.:2)；FLPSDJFPSV(SEQ ID NO.:3)；FYIQMJTEL(SEQ ID NO.:4)；YVIJDLAAM(SEQ ID NO.:5)；HFFJWGTMF(SEQ ID NO.:6)；AVVSLJRLLK(SEQ ID NO.:7)；GTHJLLPFY(SEQ ID NO.:8)；AMLTAJFLR(SEQ ID NO.:9)；HLMFYJLPI(SEQ ID NO.:10)；QLFJFSPRR(SEQ ID NO.:11)；TJFFYRYGFV(SEQ ID NO.:12)；DEFJPIVQY(SEQ ID NO.:13)；RESFGJESF(SEQ ID NO.:14)；TPAJYFHVL(SEQ ID NO.:15)；AENJYVTVF(SEQ ID NO.:16)；KEVLVLWJI(SEQ ID NO.:17)；FMYEGJTPL(SEQ ID NO.:18)；FPFJLAAII(SEQ ID NO.:19)；FPIPSJWAF(SEQ ID NO.:20)；ITAAAWYJW(SEQ ID NO.:21)；LAVMGJAAW(SEQ ID NO.:22)；HLPJGVKSL(SEQ ID NO.:23)；FAAEAJKL(SEQ ID NO.:24)；GAINSJLPY(SEQ ID NO.:25)；FAIVPJLQI(SEQ ID NO.:26)；FAMJVPLLI(SEQ ID NO.:27)；ARFJDLRFV(SEQ ID NO.:28)；ANNJRLWVY(SEQ ID NO.:29)；YAAJTNFLL(SEQ ID NO.:30)；ISDSAJNMM(SEQ ID NO.:31)；WAWJFAAVL(SEQ ID NO.:32)；MMHJSTSPF(SEQ ID NO.:33)；或RTFGQJLFF(SEQ ID NO.:34)。
肽交换测定
在一方面，本文提供了用于确定主要组织相容性复合物I类(MHCI)等位基因与测试肽的结合的肽交换测定，其包括：提供第一混合物，其含有游离测试肽以及含有α链、β链并且在序列内含有非天然、紫外线(UV)-可裂解氨基酸的肽配体的MHCI/配体复合物；将第一混合物暴露于UV光以在UV-可裂解氨基酸处裂解肽配体；将第一混合物孵育一定时间段以形成含有第二MHCI复合物的第二混合物，该第二MHCI复合物含有α链、β链和测试肽；以及确定MHCI等位基因是否与测试肽结合。
在实施例中，与MHCI/配体复合物相比，第一混合物中的游离测试肽的量为1:100至100:1。在一些实施例中，与MHCI/配体复合物相比，第一混合物中的游离测试肽的量为1:10至10:1。在实施例中，与MHCI/配体复合物相比，第一混合物中的游离测试肽的量为1:1至100:1。在实施例中，与MHCI/配体复合物相比，第一混合物中的游离测试肽的量为10:1至100:1。在实施例中，与MHCI/配体复合物相比，第一混合物中的游离测试肽的量为约10:1。比率可为所提供范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，通过测量第二混合物中的MHCI/测试肽复合物的含量来确定MHCI等位基因与测试肽的结合。在一些实施例中，测定中的MHCI复合物部分地由第二混合物中所结合的测试肽(第二混合物中的总MHCI复合物的一部分由测试肽结合)占据。在一些实施例中，MHCI复合物完全由第二混合物中所结合的测试肽(第二混合物中之总MHCI复合物皆由测试肽结合)占据。
在实施例中，通过第二混合物的2维液相色谱-质谱(2D LC/MS)来测量MHCI/第二肽复合物的含量。在一些实施例中，2D LC/MS包括从第二混合物去除游离测试肽。在一些实施例中，通过尺寸排阻色谱法去除游离测试肽。在一些实施例中，通过尺寸截留过滤去除游离测试肽。在一些实施例中，通过透析去除游离肽。
在实施例中，使用高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)来区分MHCI和测试肽的身份。在一些实施例中，在配备有尺寸排阻柱的HPLC(或FPLC)上运行第二混合物。在一些实施例中，HPLC(或FPLC)经配备以收集馏分。在一些实施例中，MHCI和测试肽鉴定为在同一HPLC馏分中洗脱。在一些实施例中，游离测试肽与游离MHCI和MHCI/测试肽复合物在不同馏分中洗脱。在一些实施例中，MHCI和测试肽的共洗脱指示，MHCI能够结合测试肽。
在实施例中，向第一MHCI/测试肽混合物中添加一种以上的测试肽(例如一个以上的肽序列)。在一些实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在两种或更多种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在三种或更多种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在四种或更多种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在五种或更多种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在六种或更多种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在七种或更多种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在八种或更多种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在九种或更多种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在十种或更多种测试肽。
在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在10-1000种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在10-500种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在10-200种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在10-20种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在20-30种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在30-40种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在40-50种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在50-60种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在60-70种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在70-80种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在80-90种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在90-100种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在100-110种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在110-120种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在120-130种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在130-140种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在140-150种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在150-200种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在200-300种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在300-400种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在400-500种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在500-600种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在600-700种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在700-800种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在800-900种测试肽。在实施例中，在第一MHCI/测试肽混合物中存在900-1000种测试肽。测试肽的数量可为所提供范围内的任何值或子范围，包括端点。测试肽的数量仅受限于由本领域技术人员识别为可用于交换测定中的测试肽的数量。
在实施例中，存在一种以上在MHCI/肽复合物HPLC馏分中共洗脱的测试肽。
在实施例中，使用质谱来鉴定第二混合物中的MHCI和/或测试肽的身份。在一些实施例中，质谱仪与HPLC串联。在一些实施例中，首先收集HPLC馏分，然后通过质谱分析。在实施例中，在MHCI复合物的质谱检测之前去除游离测试肽。在实施例中，使用质谱通过与内部标准肽进行比较来量化存在于馏分或第二混合物中的测试肽的量。
在实施例中，标记MHCI/测试肽复合物。在一些实施例中，以荧光方式标记MHCI/测试肽。在一些实施例中，通过接触经荧光标记的抗体来标记MHCI/测试肽复合物。在一些实施例中，通过接触荧光抗体来标记MHCI/测试肽复合物，其中荧光抗体为抗HLA。在一些实施例中，通过生物素化α蛋白来标记MHCI/肽复合物。
在实施例中，通过以下方式来确定肽交换程度：使经标记的MHCI/肽复合物与抗体复合物(含有共价附接至荧光共振能量转移(FRET)供体的抗MHCI等位基因抗体)和FRET受体复合物(包含与第二标记缀合的FRET受体)接触，由此形成反应组合物；并且检测反应组合物中的第二标记的FRET发射，从而检测稳定MHCI等位基因的形成，该形成是肽结合的替代量度。在一些实施例中，第一标记为抗MHCI抗体：抗-B2M。在一些实施例中，第一标记为螯合铕离子的抗MHCI抗体。在一些实施例中，MHCI/肽复合物的α蛋白经生物素化。在一些实施例中，生物素化MHCI/肽复合物结合第二标记。在一些实施例中，第二标记为链霉亲和素。在一些实施例中，第二标记为共价连接至别藻蓝蛋白(APC)的链霉亲和素。在一些实施例中，在存在含有第一标记和第二标记的MHCI/肽复合物时，第一标记和第二标记具有适用于FRET的光谱重叠积分。在一些实施例中，FRET供体/受体对标记包括荧光素和四甲基罗丹明。在一些实施例中，FRET供体/受体对标记包括5-({2-[(碘乙酰)氨基]乙基}氨基)萘-1磺酸(IAEDANS)和荧光素。在一些实施例中，FRET供体/受体对标记包括(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸(EDANS)和4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(Dabcyl)。在一些实施例中，FRET供体/受体对标记包括Alexa Fluor 488和Alexa Fluor555。在一些实施例中，供体/受体对标记包括Alexa Fluor 594和Alexa Fluor 647。在一些实施例中，供体/受体对标记包括铕(Eu-穴状化合物)和别藻蓝蛋白(XL665)。在一些实施例中，供体/受体对标记包括铽和荧光素。第一标记和第二标记可为本领域已知的任何合适的标记对。
在实施例中，将肽交换检测测定试剂和MHCI/肽复合物一起孵育约1小时至约48小时。在实施例中，将肽交换检测测定试剂和MHCI/肽复合物一起孵育至少约1小时。在一些实施例中，将肽交换检测测定试剂和MHCI/肽复合物一起孵育至少约5小时。在实施例中，将肽交换检测测定试剂和MHCI/肽复合物一起孵育至少约10小时。在实施例中，将肽交换检测测定试剂和MHCI/肽复合物一起孵育至少约12小时。在一些实施例中，将肽交换检测测定试剂和MHCI/肽复合物一起孵育至少约15小时。在一些实施例中，将肽交换检测测定试剂和MHCI/肽复合物一起孵育至少约20小时。在一些实施例中，将肽交换检测测定试剂和MHCI/肽复合物一起孵育至少约24小时。孵育时间可为所提供范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一些实施例中，第一标记含有链霉亲和素。在一些实施例中，第一标记含有抗HLA抗体。在一些实施例中，第一标记含有单体(monobody)。在一些实施例中，第一标记含有部分抗体。在一些实施例中，第一标记含有scFv域。在一些实施例中，第一标记含有抗体片段。
在一些实施例中，第二标记为链霉亲和素。
在实施例中，来自FRET受体的发射指示测试肽与MHCI复合物的结合。在一些实施例中，通过时间分辨(TR)FRET检测来确定结合肽的含量。在一些实施例中，来自TR-FRET受体标记的信号指示所存在MHCI复合物的含量。在一些实施例中，所存在MHCI复合物的含量指示是否存在MHCI/肽复合物。在一些实施例中，MHCI/肽复合物含有测试肽。在一些实施例中，在两种或更多种MHCI等位基因之间归一化来自FRET发射的信号。在一些实施例中，在约4℃与约50℃之间的温度下执行TR-FRET测定。在一些实施例中，在室温下执行TR-FRET测定。在一些实施例中，在约37℃下执行TR-FRET测定。
复合物检测测定
在一方面，本文提供了一种检测主要组织相容性复合物I类(MHCI)等位基因与测试肽的结合的方法，该方法包含：提供包含测试肽和MHCI/配体复合物的第一组合物，该MHCI/配体复合物包括：具有α链、β链的MHCI分子和配体，其中配体是含有非天然紫外线(UV)-可裂解氨基酸的肽；将第一组合物暴露于UV光以在UV-可裂解氨基酸处裂解配体；以及检测第二混合物中的MHCI/测试肽复合物，从而检测MHCI分子与测试肽的结合。
在实施例中，检测MHCI/测试肽复合物的含量并且与对照进行比较。在一些实施例中，检测MHCI/测试肽复合物的含量并且与内标物进行比较。在一些实施例中，内标物为肽。
在实施例中，使用2维液相色谱-质谱(2D LC/MS)检测MHCI/测试肽复合物的含量，例如如上文所述。在一些实施例中，将第二混合物转移至适于通过2D LC/MS分析的器皿中。在一些实施例中，在通过2D LC/MS分析之前从第二混合物去除游离测试肽。在一些实施例中，在质谱分析之前通过任何非变性柱色谱去除游离测试肽。非变性柱色谱的实例包括但不限于：尺寸排阻色谱法、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱、正相色谱或反相色谱。在一些实施例中，在通过2D LC/MS进行分析之前通过尺寸排阻色谱法去除游离测试肽。
MHCI结合配体鉴定测定
在一方面，本文提供了鉴定MHCI结合配体所述的方法，其包括：使多个MHCIα链单体与多个β链单体和配体在允许形成MHCI/配体复合物之条件下接触，其中配体是含有非天然UV-可裂解氨基酸的肽；以及检测MHCI/配体复合物，从而鉴定MHCI结合配体。
在实施例中，MHCIα单体在接触步骤之前发生变性。在一些实施例中，MHCIα单体在接触步骤之前未折叠。在一些实施例中，使用盐酸胍、异硫氰酸胍和/或脲溶液使MHCIα单体变性。在一些实施例中，盐酸胍或脲的浓度为6M。在一些实施例中，在变性溶液中存在还原试剂。在一些实施例中，在变性溶液中存在还原试剂和氧化试剂的混合物。在一些实施例中，在变性溶液中存在缓冲试剂。在一些实施例中，在变性溶液中存在盐。在一些实施例中，在变性溶液中存在清洁剂。在一些实施例中，从包涵体中回收MHCIα单体。在一些实施例中，MHCIα单体在施加至SEC柱中之前发生变性。在一些实施例中，在SEC柱上在变性条件下分离MHCIα单体。在一些实施例中，收集MHCIα单体并储存于变性条件下。
在实施例中，在B2M存在下在再折叠时程中再折叠变性α单体。在实施例中，在B2M和肽配体存在下在再折叠时程中再折叠变性α单体。在实施例中，通过在B2M、肽配体和缓冲试剂、盐、还原试剂、氧化试剂、相对离子、螯合剂和/或清洁剂中的任一者或多者存在下快速稀释变性α链单体来引发再折叠时程。在实施例中，通过在B2M、肽配体和缓冲试剂存在下快速稀释变性α链单体来引发再折叠时程。在实施例中，通过在B2M、肽配体和缓冲试剂以及盐存在下快速稀释变性α链单体来引发再折叠时程。在实施例中，通过在B2M、肽配体和缓冲试剂、盐以及还原试剂存在下快速稀释变性α链单体来引发再折叠时程。在实施例中，通过在B2M、肽配体、缓冲试剂、盐、还原试剂和氧化试剂存在下快速稀释变性α链单体来引发再折叠时程。在实施例中，通过在B2M、肽配体和缓冲试剂、盐、还原试剂、氧化试剂以及相对离子存在下快速稀释变性α链单体来引发再折叠时程。在实施例中，通过在B2M、肽配体和缓冲试剂、盐、还原试剂、氧化试剂、相对离子以及螯合剂存在下快速稀释变性α链单体来引发再折叠时程。在实施例中，通过在B2M、肽配体和缓冲试剂、盐、还原试剂、氧化试剂、相对离子、螯合剂以及清洁剂存在下快速稀释变性α链单体来引发再折叠时程。在一些实施例中，再折叠时程发生于96孔板的孔内。在一些实施例中，再折叠时程发生在4℃下。在一些实施例中，缓冲试剂为三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl，pH 8.0)。在一些实施例中，相对离子为L-精氨酸。在一些实施例中，还原剂为经还原谷胱甘肽。在一些实施例中，氧化试剂为经氧化谷胱甘肽。在一些实施例中，螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。
在实施例中，MHCIα单体、B2M和肽配体在再折叠溶液中接触约5小时至约5天。在实施例中，MHCIα单体、β链单体和肽配体在再折叠溶液中接触至少约12小时、24小时、48小时。孵育时间可为所提供范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，使多个配体与MHCIα和β链单体接触。例如，多个肽序列可用于多重测定形式中。
在实施例中，检测MHCI/肽配体复合物包括：使MHCI/配体复合物与附接至固体载体的抗MHCIα链抗体结合，从而形成结合的MHCI/配体复合物；使结合的MHCI/配体复合物与经标记抗β链抗体接触，从而形成结合的经标记MHCI/配体复合物；以及检测结合的经标记MHCI/配体复合物。在一些实施例中，在MHCI/配体肽复合物检测之前去除游离抗β链抗体。
MHCI等位基因-配体组合优化测定
在一方面，本文提供了确定最佳主要组织相容性复合物I类(MHCI)等位基因-配体组合所述的方法，该方法包括：提供多个在变性条件下纯化的MHCIα链单体；通过组合多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体(包含含有非天然UV-可裂解氨基酸的肽)来形成反应混合物；在允许形成MHCI/配体复合物的条件下孵育混合物；以及确定是否形成MHCI/配体复合物。
在实施例中，将多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育至少约5小时至约5天。在实施例中，将多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育至少约5小时。在实施例中，将多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育至少约10小时。在实施例中，将多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育至少约12小时。在实施例中，将多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育至少约24小时。在实施例中，将多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育至少约48小时。在实施例中，将多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育至少约72小时。在实施例中，将多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育至少约4天。在实施例中，将多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育约5天。孵育时间可为所提供范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，筛选多个配体，其中每个配体含有氨基酸序列，其中每个配体的氨基酸序列与每个其他配体的氨基酸序列的区别仅在于UV-可裂解氨基酸在序列中的位置。
在实施例中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定MHCI/配体复合物形成。在一些实施例中，ELISA包括：将反应混合物引入容器中，该容器包括表面以及与表面缀合的抗MHCIα链抗体；将包含可检测标记的经标记抗β链抗体引入容器中，从而经标记抗β链抗体结合可能存在的β链单体；洗涤以去除未结合的经标记抗β链抗体；以及检测在容器中是否存在可检测标记。
在实施例中，可检测标记包含生物素或肽标签。在实施例中，可检测标记包含生物素。在实施例中，通过将链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物引入容器中并且在添加HRP底物后确定化学发光值来使可检测生物素标记可视化。在一些实施例中，容器为多孔板。
在一些实施例中，重复检测测定以确定一种MHCI复合物的两种不同配体之间的最佳MHCI/配体复合物形成。
在实施例中，肽含有非天然UV-可裂解氨基酸，其中肽具有SEQ ID NO.:1至SEQ IDNO.:34中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:1。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:2。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:3。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:4。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:5。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:6。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:7。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:8。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:9。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:10。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:11。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:12。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:13。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:14。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:15。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:16。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:17。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:18。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:19。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:20。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:21。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:22。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:23。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:24。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:25。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:26。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:27。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:28。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:29。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:30。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:31。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:32。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:33。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:34。
天然SEC-MS和CE-MS方法
本公开涉及使用与非变性质谱偶合的尺寸排阻色谱法或毛细管电泳来监测肽交换的MHCI复合物的方法。一种监测样品中的经肽交换的主要组织相容性I类(MHCI)复合物的示例性方法，其包括：(a)获得包含目的肽的经肽交换的MHCI复合物；(b)对该经肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱法(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及(c)在(b)的色谱法或毛细管电泳之后，对该MHCI复合物进行非变性质谱(MS)，以鉴定包含目的肽的MHCI复合物。本文中另一种监测样品中的经肽交换的主要组织相容性I类(MHCI)复合物的示例性方法，其包括：(a)获得包含可交换肽的MHCI复合物以及在允许可交换肽与该目的肽之间进行肽交换的条件下，将该复合物暴露至一种或多种目的肽；(b)对该经肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱法(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及(c)在(b)的色谱法或毛细管电泳之后，对该MHCI复合物进行非变性质谱(MS)，以鉴定包含目的肽的MHCI复合物。
本文所述的方法还包括例如监测MHCI-复合肽的T细胞识别，该监测包含：(a)获得包含目的肽的经肽交换MHCI复合物；(b)使肽交换MHCI复合物与包含T细胞的样品接触；(c)分离结合T细胞的MHCI复合物与未结合的MHCI复合物；(d)对肽交换的MHCI复合物执行尺寸排阻色谱法(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及(e)在(d)的色谱或毛细管电泳后，对MHCI复合物执行非变性质谱分析(MS)以鉴定包含由来自样品的T细胞识别的肽的MHCI复合物。本文所述的方法还包括例如监测MHCI-复合肽的T细胞识别，该监测包含：(a)获得包含可交换肽的主要组织相容性I类(MHCI)复合物，并在允许肽交换的条件下，将该复合物暴露至一种或多种目的肽；(b)将该肽交换的MHCI复合物与包含T细胞的样品接触；(c)将T细胞结合的MHCI复合物与未结合的MHCI复合物分开；(d)对该肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱法(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及(e)在(d)的色谱法或毛细管电泳之后，对该MHCI复合物进行非变性质谱分析(MS)，从该样品中鉴定出包含由T细胞识别的肽的MHCI复合物。在一些情况下，通过流式细胞分析技术分离结合T细胞的MHCI复合物与未结合的MHCI复合物。
在本文的一些方法中，样品为生物流体样品。在一些情况下，样品为全血或血浆样品。在一些实施例中，样品包含一种或多种以合成方式产生的目的肽。在本文的一些方法中，MHCI复合物为人MHCI复合物。在本文的一些方法中，样品来自MHCI库或阵列。
在一些实施例中，该方法包含对肽交换MHCI复合物执行SEC。在一些此类情况下，注入2-10μL(诸如3-6μL或4-5μL)的体积以用于非变性MS分析。在一些实施例中，非变性MS紧跟SEC之后。
在一些实施例中，该方法包含对肽交换MHCI复合物执行CE。在一些实施例中，该方法包含对肽交换MHCI复合物执行CZE。在一些情况下，经交换的肽可在100μg/mL或更低、50-500μg/mL、50-200μg/mL、100-200μg/mL或50-100μg/mL的浓度下检测到。在该方法使用CE或CZE的一些情况下，注入2-100nl(诸如2-50nl、2-10nl、3-10nl或3-5nl)体积以用于非变性MS分析，。在一些实施例中，非变性MS紧跟CE或CZE之后。
在一些情况下，本文所述的方法可确定并量化至少一种目的肽已交换至MHCI复合物中的程度。因此，它们可允许监测肽交换反应和/或确定在反应已达到其最大程度后的交换百分比或程度。
在一些实施例中，非变性MS进一步包含表征与MHCI复合物结合的目的肽的结构或序列。在一些情况下，非变性MS执行为串联式MS(“MS/MS”)(例如经由多反应监测(MRM)、单离子监测(SIM)、三重四极杆(TSQ)、四极杆飞行时间(QTOF)、四极杆-线形离子阱(QTRAP)、混合离子阱/FTMS、飞行时间/飞行时间(TOF/TOF)或时间串联式MS/MS)。在一些情况下，非变性MS包含电喷雾离子化至轨道阱MS仪器中。
在一些上述方法中，在乙酸铵或叶酸铵缓冲液中执行色谱或电泳和非变性MS和/或其中缓冲液不包含TRIS或PBS。
本文所述的方法包括例如对样品中的经肽交换的主要组织相容性I类(MHCI)复合物执行非变性质谱分析(MS)的方法。在一些情况下，此类方法包含：(a)获得包含目的肽的经肽交换MHCI复合物；(b)对肽交换MHCI复合物执行尺寸排阻色谱法(SEC)或执行毛细管电泳(CE)(例如毛细管区带电泳(CZE))；以及(c)在(b)的色谱或毛细管电泳后，对MHCI复合物执行非变性质谱分析(MS)以鉴定包含目的肽的MHCI复合物。在一些实施例中，在步骤(b)中使用SEC。在一些实施例中，在步骤(b)中使用CE。在一些情况下，在步骤(b)中使用CZE。在一些实施例中，在SEC、CE或CZE与MS分析之间并不执行其他(即无第二维)色谱或其他分离过程。因此，在一些实施例中，非变性MS紧跟SEC、CE或CZE之后而无其他洗涤、缓冲液交换或色谱步骤。
本文所述的方法还包括例如监测样品中的经肽交换的主要组织相容性I类(MHCI)复合物的方法，其包含：(a)获得包含目的肽的经肽交换的MHCI复合物；(b)对肽交换MHCI复合物执行尺寸排阻色谱法或毛细管电泳(例如毛细管区带电泳)；以及(c)在(b)的色谱或毛细管电泳后，对MHCI复合物执行非变性质谱分析(MS)以鉴定包含目的肽的MHCI复合物。在一些实施例中，在步骤(b)中使用SEC。在一些实施例中，在步骤(b)中使用CE。在一些情况下，在步骤(b)中使用CZE。在一些实施例中，在SEC、CE或CZE与MS分析之间并不执行其他(即无第二维)色谱或其他分离过程。因此，在一些实施例中，非变性MS紧跟SEC、CE或CZE之后而无其他洗涤、缓冲液交换或色谱步骤。
在上述方法的一些实施例中，部分(a)进一步包含对MHCI分子执行肽交换。例如，可通过使用可经裂解或修饰以减小其对MHCI结合口袋的亲和力(从而致使其易于经受分析用肽的竞争)的第一肽来促进肽交换。可例如使用第一、可交换肽来进行肽交换，该第一、可交换肽可在暴露于例如UV光、特定化学物质或酶时发生修饰或裂解，从而其对MHCI结合口袋的亲和力有所减小。(例如参见Rodenko,B.等人，“Generation of peptide-MHC class Icomplexes through UV-mediated ligand exchange,”Nature Protocols,1:1120-32(2006))。
本文所述的方法与各种类型的样品和实验背景相容。例如，在一些方法中，样品可为来自受试者的生物流体样品。在一些方法中，样品可为全血或血浆样品。在一些方法中，样品包含T细胞，诸如CD8+和/或CD4+T细胞。在一些方法中，样品包含外周血单核细胞(PBMC)。在其他方法中，样品并非衍生自受试者。例如，在一些方法中，样品包含一种或多种以合成方式产生的肽以例如测试其与特定类型的MHCI复合物的结合。在一些方法中，可提供不同肽交换MHCI复合物的阵列或库以供分析，任选地将许多不同的目的肽与由不同α和β链构成的不同MHCI复合物混合。在一些方面，这些不同肽-MHCI复合物可排列成包含许多样品孔的阵列，例如，每个孔包含独特的目的肽和/或MHCI复合物。以此方式，本文所述的方法可用于例如确定将以非共价方式与特定MHCI复合物结合的目的肽。
本文之一些实施例可包括监测MHCI复合物以确定某些目的肽是否由T细胞结合。因此，一些实施例可包含：(a)获得包含目的肽的经肽交换的MHCI复合物；(b)使肽交换MHCI复合物与包含T细胞的样品(例如生物流体样品，诸如全血或血浆)接触；(c)分离结合T细胞的MHCI复合物与未结合的MHCI复合物；(d)对肽交换MHCI复合物执行尺寸排阻色谱法或毛细管电泳(例如CZE)；以及(e)在(d)的色谱或毛细管电泳后，对MHCI复合物执行非变性质谱分析(MS)以鉴定包含由来自样品的T细胞识别的肽的MHCI复合物。例如，在一些情况下，通过荧光辅助性细胞分选(FACS)或流式细胞分析技术来分离结合T细胞的MHCI复合物与未结合的复合物。在一些情况下，在色谱或毛细管电泳之前分离结合T细胞的MHCI复合物与不结合T细胞的复合物。此可允许确定T细胞所识别的肽-MHCI复合物。在一些实施例中，在步骤(b)中使用SEC。在其他实施例中，在步骤(b)中使用CE。在一些情况下，在步骤(b)中使用CZE。在一些上述实施例中，在SEC、CE或CZE与MS分析之间不执行其他(即无第二维)色谱或其他分离过程。因此，在一些实施例中，非变性MS紧跟SEC、CE或CZE之后而无其他洗涤、缓冲液交换或色谱步骤。在一些实施例中，该方法的部分(a)进一步包含对MHCI复合物执行肽交换。例如，可通过使用可经裂解或修饰以减小其对MHCI结合口袋的亲和力(从而致使其易于经受分析用肽的竞争)的第一肽来促进肽交换。
在一些实施例中，在MS之前使用尺寸排阻色谱法(SEC)来分离样品中的分子。在其他实施例中，在MS之前，使用毛细管电泳来分离样品中的分子。在上述方法之一些实施例中，毛细管电泳(CE)为毛细管区带电泳(CZE).也可利用其他类型的CE，尤其包括毛细管凝胶电泳(CGE)、胶束电动毛细管色谱(MEKC)、毛细管电色谱(CEC)、毛细管等电聚焦(CIEF)和毛细管等电泳(CITP)。
非变性MS分析可具有多种选择。在一些实施例中，MS仪器不包含四极杆。在一些实施例中，MS仪器包含至少一个四极杆。在一些实施例中，MS仪器包含至少两个四极分析仪。在一些实施例中，MS仪器包含至少三个四极分析仪。在某些MS中，检测器为离子阱、四极杆、轨道阱或TOF。在一些实施例中，MS仪器或方法为多反应监测(MRM)、单离子监测(SIM)、三级四极杆(TSQ)、四极杆/飞行时间(QTOF)、四极杆线性离子阱(QTRAP)、混合离子阱/FTMS、飞行时间/飞行时间(TOF/TOF)、Orbitrap仪器、离子阱仪器、平行反应监测(PRM)、数据相关采集(DDA)、数据独立采集(DIA)、多级片段化或串联时间MS/MS。
在一些实施例中，在不在MS期间显著离子化的缓冲液中执行SEC-非变性MS或CE-非变性MS(例如CZE-MS)。在一些实施例中，在诸如乙酸铵或甲酸铵等缓冲液中执行非变性MS。在一些实施例中，不使用离子化缓冲液(例如TRIS或PBS)来执行非变性MS。在SEC或CE紧邻非变性MS之前时，因此，在一些实施例中，SEC或CE在不在MS期间显著离子化的缓冲液中执行，或在诸如乙酸铵或甲酸铵等缓冲液中执行。
在一些实施例中，经由电喷雾离子化至OrbitrapTM MS仪器(例如ThermoExactiveTM Plus EMR,ThermoFisher Scientific)来执行非变性MS。在一些实施例中，最佳化特定MS参数以允许对MHCI肽交换复合物实施非变性MS。例如，示例性参数提供于在实例章节后提供的表1中(参见右两行)并且与用于其他SEC-MS蛋白质分离的参数(左两行)进行比较。在一些实施例中，将辅助气体流速设定在0-4的值，例如0-3的值，例如0-2或0。在一些实施例中，在辅助气体流速为0下执行非变性MS。在一些实施例中，在执行SEC-MS时，将源内CID参数也设定在零值。在一些实施例中，鞘气体流速小于15，例如1-5或2-4。在一些实施例中，将捕集气体压力设定在2-3。
在一些实施例中，本文的CE-非变性MS或SEC-非变性MS方法可证实，目的肽实际上以非共价方式结合在MHCI分子的结合口袋中，因为结合的复合物在MS分析期间保持缔合。因此，例如，本文所述的方法不仅可评价是否已发生肽交换，也可确定和量化不同目的肽的肽交换百分比。在一些实施例中，非变性MS分析还允许至少部分地对目的肽定序。相比之下，在不使用非变性MS的其他LC-MS方法中，MHCI复合物在MS期间发生分解，这意味着其不能用于证实相关肽实际上以非共价方式结合于MHCI结合口袋中。
在一些实施例中，这些方法可较2D-LC-MS分析方法更快速地执行。它们还允许将相对较低的体积注入MS设备中。在本文的某些SEC-非变性MS方法中，可注入约2-10μL的体积，例如3-6μL或4-5μL。在本文的某些EC-非变性MS方法中，可注入约2-100nL的体积，例如2-50nL、2-10nL、3-10nL或3-5nL。在使用CE或CZE的一些此类情况下，可检测约100μg/mL的肽浓度，诸如100μg/mL或更低、50-500μg/mL、50-200μg/mL、100-200μg/mL或50-100μg/mL。
毛细管电泳方法可在一些实施例中具有其他益处。例如，在一些实施例中，在使用CZE时，可在1-10分钟内(例如在1-5分钟或2-5分钟内)执行电泳分离。在一些实施例中，与LC-MS方法相比，本文的CE方法可允许在肽交换后检测样品中较低浓度的特定目的肽。在一些实施例中，可在CE方法中使用较小样品体积，诸如那些将毛细管提供于芯片或柱上的体积。因此，例如，使用一些CE平台，体积。例如，在一些实施例中，SEC-MS方法不允许检测低于约100μg/mL浓度的肽，而CZE方法能够检测低于约100μg/mL浓度的肽。在一些实施例中，可通过本文的CE-MS方法中检测浓度为例如100μg/mL或更低、50-500μg/mL、50-200μg/mL、100-200μg/mL或50-100μg/mL的结合在MHCI复合物内的特定目的肽。该潜在较高解析度可有助于挑选出特定的MHCI-抗原肽复合物。例如，某些癌症的特征可在于若干可能基因中的突变，这会潜在地产生若干分析用新抗原(例如最多50或最多100种可能的新抗原)。在这些新抗原与大量可能的人MHCI复合物组合时，例如，这可产生可能的数千种潜在的新抗原-MHCI组合，每种组合在肽交换后的浓度相对较低。
试剂盒
在实施例中，试剂盒含有包含非天然UV-可裂解氨基酸的肽、MHCIα链单体和MHCIβ链单体。在一些实施例中，试剂盒含有变性的MHCIα链单体。在一些实施例中，试剂盒含有变性的MHCIβ链单体。在一些实施例中，MHCIα链和MHCIβ链单体都是变性的。
在实施例中，试剂盒含有加标签的MHCIα链和加标签的MHCIβ链。在一些实施例中，MHCIα链含有标签。在一些实施例中，MHCIβ链含有标签。在一些实施例中，MHCIα链和MHCIβ链都加有标签。在一些实施例中，标签为链霉亲和素。
在实施例中，试剂盒含有抗HLA抗体。在实施例中，试剂盒含有抗B2M抗体。在实施例中，试剂盒含有抗HLA抗体和抗B2M抗体。
在实施例中，试剂盒含有包含非天然UV-可裂解氨基酸的肽，其中该肽具有SEQ IDNO.:1至SEQ ID NO.:34中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:1。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:2。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:3。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:4。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:5。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:6。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:7。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:8。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:9。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:10。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:11。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:12。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:13。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:14。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:15。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:16。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:17。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:18。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:19。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:20。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:21。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:22。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:23。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:24。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:25。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:26。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:27。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:28。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:29。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:30。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:31。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:32。在一些实施例中，肽含有序列SEQ IDNO.:33。在一些实施例中，肽含有序列SEQ ID NO.:34。
本文的公开内容还涵盖用于实施上述SEC-非变性MS和CE-非变性MS或CZE-非变性MS方法的试剂盒或试剂组合物。在一些实施例中，此类试剂盒可包括用于执行(a)SEC、EC或CZE分离、(b)肽交换以及(c)任何其他适用洗涤或缓冲液交换步骤的缓冲液或这些类型缓冲液中的任一者的组合。在一些实施例中，在不在MS期间显著离子化的缓冲液中执行SEC、EC或CZE。在一些实施例中，在乙酸铵或甲酸铵缓冲液中执行SEC、EC或CZE。在一些实施例中，用于SEC、EC或CZE的缓冲液不包含Tris或PBS。
本文的试剂盒或试剂组合物还可包括用于执行肽交换的试剂(诸如可交换肽)以及用于修饰此类肽的结合亲和力的任何必需试剂(诸如合适的化学物质或酶)。本文的试剂盒或试剂组合物还可包括关于执行本文的方法或部分此类方法的说明。本文的试剂盒或试剂组合物还可包括可执行肽交换的MHCI复合物阵列或库，诸如不同人MHCI复合物的阵列或库。本文的试剂盒或试剂组合物还可包括例如基于致病性疾病、肿瘤类型等的推定新抗原肽的库。
系统
在实施例中，系统含有：含有非天然UV-可裂解氨基酸的肽；多个MHCIα链单体；多个MHCIβ链单体；以及能够允许形成MHCI/配体复合物的第一试剂。在一些实施例中，系统进一步含有能够结合MHCIα链单体的第二试剂。在一些实施例中，第二试剂含有抗HLA抗体。在一些实施例中，系统含有能够结合MHCIβ链单体的第三试剂。在一些实施例中，第三试剂为抗B2M抗体。
实例
实例1：高通量MHCI再折叠
在变性条件下纯化MHCIα链单体或使用标准变性试剂(包括但不限于6M胍-HCl、6M异硫氰酸胍或8M脲)使其变性。
一起添加变性α链、B2M和肽配体以供再折叠和可溶性MHCI/肽复合物的形成。一示例性再折叠方案如下：将B2M(10mg/L)、HLA(30mg/L)和肽(10μM)添加至分别具有0.5mM和4mM经氧化的谷胱甘肽和经还原的谷胱甘肽的再折叠缓冲液(100mM Tris(pH 8.0)、400mML-精氨酸和2mM EDTA)中。将这些试剂以100μL的最终体积添加至96孔板中并且在4℃下孵育1-10天之后测试复合物的形成。
实例2：用于鉴定用于MHCI再折叠的肽的高通量ELISA
鉴定用于38种不同MHCI复合物的含有非天然UV可裂解氨基酸的条件化肽配体。38种不同MHCI复合物由独特的HLA等位基因(α链)、B2M以及含有非天然UV可裂解氨基酸的独特肽组成。
用于鉴定允许适当MHCI再折叠的肽的高通量酶联免疫吸附测定(ELISA)：鉴定表位结合物的一种方法是评估具有既定等位基因的MHCI是否可在表位存在下形成稳定的再折叠复合物。此过程涉及混合较低浓度的变性的HLA和B2M与目的表位。在再折叠2-5天之后，必须浓缩经稀释再折叠MHCI试剂、纯化并表征，这些都不适用于高通量。本文开发了可在不存在纯化下适当地检测nM浓度的再折叠MHCI的ELISA测定。该ELISA测定涉及使用生物素化检测抗体合链霉亲和素进行信号放大。一示例性ELISA测定示于图1中。
使用25μL/孔的抗HLA小鼠IgG1单克隆抗体(ABC W6/32,Cat#NB100-64775,NovusBiological，8μg/mL，在0.05M碳酸钠(pH 9.6)中)涂覆384孔Maxisorp板(Thermo,Nunc#464718)并在4℃下孵育过夜。在使用洗涤缓冲液(具有0.05％Tween 20的PBS缓冲液)将板洗涤三次之后，添加80μL/孔的阻断缓冲液(PBS,0.5％BSA,15PPM Proclin)并在室温(RT)下孵育1小时。然后使用洗涤缓冲液将板洗涤三次并且将25μL含有MHCI单体与目的肽的经稀释样品添加至合适的孔中。将板在室温下孵育2小时并且通过使用洗涤缓冲液将板洗涤6次来去除未结合组分。然后通过添加25μL/孔的生物素化抗人β2-微球蛋白(B2M)小鼠IgG2a单克隆抗体(Cat#316302,Biolegend，在测定缓冲液(PBS,0.5％BSA,0.05％Tween 20,15PPM Proclin,pH 7.4)中，100ng/mL)来检测结合的MHCI单体-肽复合物并在室温下孵育1小时。在洗涤6次之后，添加25μL/孔的在测定缓冲液中的缀合辣根过氧化物酶的链霉亲和素(HRP-SA)并在室温下孵育30min。在使用3次洗涤去除HRP-SA之后，使用过氧化物酶底物四甲基联苯胺(TMB,Moss Inc.cat#1000)引发酶促反应并在室温下孵育15min。使用25μL/孔的1M磷酸终止反应并且在Multiscan分光光度计(ThermoFisher)上使用620nM参考在450nm下来测量吸光度。
使用不含肽配体或不相关肽的经再折叠MHCI异源二聚体复合物作为每一等位基因的阴性对照。如下列比率中所示使样品信号归一化：OD450/620[样品]/OD450/620[阴性对照]。结果提供于图2-5和图7中。
图2(图片A和B)是在38种不同HLA、HLB和HLC结合物中平均化的经捕获MHCI/B2M/肽复合物(经由二抗报告基因)的归一化(相对于不存在肽，样品信号/阴性对照信号)ELISA信号的条形图图示。图3(图片A和B)是MHCI/B2M/肽结合物中的平均化ELISA信号的条形图图示，其示出了低捕获抗体结合物的特定MHCI等位基因(图A)以及在不存在肽下较为稳定的特定MHCI/B2M复合物(图B)。图4(图片A和B)是在UV肽(含有UV-可裂解氨基酸的肽)存在下MHCI/B2A/UV肽结合物中的平均化ELISA信号的条形图图示。图5示出了比较18种不同HLA/HLB等位基因的扩大再折叠纯化的归一化ELISA结果和产率的条形图。图7提供了基于在ELISA测定中具有最佳表现的肽所选择结合每个等位基因的UV肽的列表。
实例3：用于鉴定肽结合物的高通量时间分辨荧光共振能量转移测定
用于鉴定肽交换后的MHCI肽结合物的高通量时间分辨-荧光能量转移(TR-FRET)测定：鉴定表位结合物的另一方法是使用可在提供既定触发时从复合物解离并且允许肽结合物交换至MHCI凹槽中的条件化配体生成MHCI复合物。实现该目的的一种方式是使用含有UV-可裂解非天然氨基酸的肽，从而在暴露于UV时该肽发生裂解并且不再是结合物。在这些条件下，若在溶液中存在肽结合物，则其将与复合物结合并使复合物稳定。相比之下，在大部分情况下，若在溶液中没有肽结合物，则HLA和B2M蛋白将发生解离并且MHCI复合物将发生分解。
为使用该系统来确定MHCI结合物，开发了仅在B2M和HLA复合物紧邻时提供信号的TR-FRET测定。该测定使用含有TR-FRET供体(抗B2M-供体)的针对B2M的抗体和链霉亲和素，该链霉亲和素与复合物的生物素化HLA组分结合并且经TR-FRET受体(链霉亲和素-别藻蓝蛋白(SA)-受体)标记。若B2M和HLA复合在一起，则抗B2M供体和SA-受体将在溶液中靠近以产生TR-FRET信号。相比之下，若复合物发生分解，则这些试剂将均匀分布并且没有TR-FRET信号。TR-FRET测定工作流程的示意图提供于图8的图片中。该测定应用于暴露于UV光后MHCI分子的肽交换中，该MHCI分子使用UV可裂解条件化配体生成并且成功地用于鉴定MHCI肽结合物。
将含有UV-交换的MHCI/肽复合物的384孔源板(Echo合格384孔聚丙烯2.0Plus微孔板，Labcyte PPL-0200)在37℃下孵育过夜。将板在室温下平衡1小时，随后离心。使用自动化声学分配器(Echo 550,Labcyte)将源板的每个孔以不同体积(160nL、80nL、40nL和20nL)分配至目标板(MAKO 1536孔白色固体底，Aurora微孔板，MT,USA)的回填孔(具有测定缓冲液)中4次，总体积为2μL/孔并且最终样品浓度为10、5、2.5和1.25nM。将2μL在测定缓冲液中的供体(1.2μg/mL经铕(Eu)LANCE-W1024-ITC标记的B2M)和受体(4.8μg/mL SureLight与别藻蓝蛋白缀合的链霉亲和素(Perkin Elmer)的混合物分配至目标板的每个孔中。然后将目标板离心并在室温下孵育一小时，使用配备有HTRF模组(Eu激发：337nm，Eu发射：615nm；APC发射：660/20nm)的PHERAstar FSX读板仪(BMG Labtech,NC,USA)记录TR-FRET信号。TR-FRET原始信号表示为相对荧光单位的比率(RFU比率＝(RFU[660nm]/RFU[615nm×104])。通过从不存在MHCI/肽复合物下的测定混合物中减去背景信号来计算检测窗口。多种肽结合物的结果提供于图9的图片A中的条形图中。TR-FRET测定的相对准确度(85％-100％)对MHC等位基因的条形图提供于图9的图片B中。
基于与预测结合亲和力(使用结合预测演算法基于Andreatta M和Nielsen,M.Gapped sequence alignment using artificial neural networks:application tothe MHC class I system.Bioinformatics(2016)Feb 15；32(4):511-517所计算)的对比将肽确定为真正结合物。使用TR-FRET和2D LC/MS测定来鉴定肽结合物和相应的MHCI等位基因。将肽序列提交至预测演算法，并且向每个序列指派百分等级。2或更小的百分等级可视为结合物。图12示出了从TR-FRET和LC-MS计算的真正结合物％以及演算法生成的百分等级的对比。仅虚线左侧的肽由演算法预测为结合物。
六个代表性TR-FRET实验示于图10和图11中。图10示出了比较含有MHCI HLA*03:01的复合物的肽结合物和非结合物的对比性DSF光谱。在低温(20℃)下，存在结合肽的复合物的相对荧光(RFU)较低，并且不结合肽的复合物的相对荧光较高。肽结合物DSF光谱示出了类似的Tm温度范围，而非结合物则具有较低Tm。图片B是肽结合物(黑色)和非结合物(灰色)的总数对Tm温度的条形图。图片C是肽结合物(黑色)和非结合物(灰色)的总数对RFU值的条形图。图10示出了比较含有MHCI HLA*08:01的复合物的肽结合物和非结合物的对比性DSF光谱。在低温(20℃)下，存在结合肽的复合物的相对荧光(RFU)较低，并且不结合肽的复合物的相对荧光较高。肽结合物DSF光谱示出了类似的Tm温度范围，而非结合物则具有较低Tm。图片B是肽结合物(黑色)和非结合物(灰色)的总数对Tm温度的条形图。图片C是肽结合物(黑色)和非结合物(灰色)的总数对RFU值的条形图。图10和图11中的图片D是4种不同MHCI等位基因的测定准确度％(在图10中都>90％，或在图11中为60％-85％)的条形图图示。
实例4：用于鉴定肽结合物的LC-MS测定
用于鉴定MHCI肽结合物的2D LC-MS测定：开发了该测定以在MHCI试剂的肽交换过程之后鉴定肽结合物。肽交换过程的基于质谱的分析依赖于在分析之前首先分离MHCI复合物与溶液中的游离肽。这将需要复杂的前期纯化并且并不适用于高通量分析。开发了2DLC-MS分析方法，其中首先在SEC柱上运行样品并且然后仅将对应于MHCI复合物的峰注射在第二HPLC柱中以供质谱分析。者允许在单个步骤中完成MHCI试剂的分析。该过程可用于一次鉴定单个肽结合物或鉴定较大肽池内的结合物。图13提供肽交换和鉴定测定的示意图。
简言之，将2-3μg MHCI/肽混合物注射在仪器上并传输至第一维柱。第一维LC方法采用分析尺寸排阻柱(SEC)(Agilent AdvanceBio SEC
Figure BDA0004093111910000471
2.7μm,4.6×15mm)来分离完整复合物与过量肽，其中在0.7mL/min的等梯度流速下在25mM Tris(pH 8.0)、150mM NaCl中运行10min并且在280nm下获取信号。采样阀收集在160μL的体积在1.90-2.13min之间洗脱的全部复合物峰并且将其注射在第二维反相柱(Agilent PLRP-S/>
Figure BDA0004093111910000472
8μm,50×2.1mm)上。使用在4.7min内5-50％移动相B的梯度在0.55mL/min下来运行第二维柱并且将柱加热至80℃。移动相A为在水中的0.05％TFA。移动相B为在乙腈中的0.05％TFA。将柱洗脱剂传输至Agilent 6224TOF LC-MS中以供质谱数据获取。
使用第一维中的MHCI/肽复合物峰面积以及第二维中的肽质谱检测来确定成功肽结合。在肽交换反应期间在裂解条件化配体之后肽在复合物中的成功结合可稳定复合物，并且几乎完全回收第一维SEC分析中所测量的起始复合物。然后可在第二维中检测交换至复合物中的肽，其中在变性条件下使用质谱分析运行复合物以直接检测目的肽。在肽不能结合并稳定复合物时，不成功的肽交换反应会在裂解条件化配体之后产生不稳定的复合物。这可测量为复合物在SEC上的A280峰面积的减小以及在第二维中肽的不存在(SEC色谱图的实例可参见图6中的色谱图的最左边左一组)。在一些情况下，没有观察到峰面积减小；然而，没有通过质谱检测到肽。少量肽不能通过第二维色谱柱和方法捕获。在这些情况下，在还使用肽结合的阳性对照和阴性对照时，峰面积回收率足以确定成功交换。
HLC*08:01的肽交换时程的一组代表性色谱图示于图6中。第一组色谱图是在再折叠时程之后在尺寸排阻柱上运行复合物混合物的结果，其中含有MHCI/肽的峰以灰色突出显示于每个色谱图中(1D:SEC)。收集该峰的内容物，并注射在配备有反相柱的第二HPLC上。第二组色谱图显示复合物峰的含量，并且通过质谱确定峰组分的身份。确定存在于复合物中的肽的序列，并且序列重叠显示于来自反相色谱图的所鉴定的肽峰的相应提取离子色谱图(EIC)的放大插图中。图14示出了作为每个等位基因的交换物或非交换物的10种肽的代表性验证图片，其显示为多种肽与MHCI/B2M/UV-肽复合物随时间的交换％的绘图，如通过2-D LC/MS所测量。
MHCI/UV-可裂解肽复合物可在40种肽的池存在下进行UV-光暴露/肽交换测定，如图15中所示。通过1)SEC和2)LC-MS在不同时长(例如在5小时与10小时之间，40min增量)下运行自交换时程收集的样品，通过LC-MS测量来自通过SEC分离的复合物峰的肽的身份和强度。该绘图显示在与MHCI HLA-A*01:01的交换反应中10种肽随时间的强度。在此示例性运行中，40种肽的池中总共25％或10种肽可确定为真正结合物。
实例5：MHC归一化计算
除非另外指示，否则所有数据分析都使用Genedata和Spotfire V7.8来实施。
针对所执行的所有MHC筛选，使用基于对照的归一化来确保样品信号与基于每个等位基因的不含肽的MHC的相对对比并且表示为ΔF(％)。使用下列方程式计算ΔF的百分比：
ΔF％(dF)＝(RFU原始[pMHC]-RFU原始[阴性对照])/RFU原始
[阴性对照]×100
其中RFU原始[阴性对照]为来自不含肽的MHC单体的孔的660nm/615nm的TR-FRET信号比，其定义特定等位基因的命中选择的最小信号；RFU原始[pMHC]为来自负载有肽的MHC单体的孔的660/615的TR-FRET信号比。
对于等位基因中的命中选择而言，如下所述根据归一化信号(dF)来计算稳健Z分数(RZ)：
RZ分数＝([样品]-中值[所有样品])/MAD
其中[样品]和中值[所有样品]分别为样品的ΔF值和每个384孔板中的所有样品的中值。MAD为每个384孔板中的所有样品的中值绝对偏差。
为评估HTS测定性能，使用下列方程式根据阳性对照和阴性对照的信号(RFU原始)来计算Z'因子：
Z’＝1-{(3σRFU[pos]+3σRFU[neg])/|μRFU[pos]-μRFU[neg]|}
其中σ[pos]和σ[neg]为标准偏差并且μ[pos]和μ[neg]分别为阳性对照和阴性对照的平均值。对于RZ'(稳健Z')。使用中值绝对偏差(MAD)和中值代替标准偏差和平均值。
实例6.天然SEC-MS
使用UltiMateTM 3000 RSLC系统(Thermo Fisher Scientific)将MHCI蛋白注射在加热至30℃的ACQUITY UPLC Protein BEH SEC柱(
Figure BDA0004093111910000491
1.7μm,4.6mm×150mm,WatersCorporation)上。使用二元帮浦以50％溶剂B的等梯度梯度形式在300μL/min的流速下经10min来递送溶剂A(水)和溶剂B(100mM乙酸铵，pH 7.0)。经由电喷雾离子化至ThermoExactiveTM Plus EMR OrbitrapTM仪器(Thermo Fisher Scientific)中使用用于数据获取的下列最佳化参数来在线分析经分离蛋白质：ESI源中的鞘气体流速4以及辅助气体流速0；4.0kV喷雾电压；320℃毛细管温度；200S-lens RF电平；350-10,000m/z扫描范围；去溶剂化，源内CID 0eV,CE 0；m/z 200下的解析度8,750；正极性；10个微扫描；3×106个AGC标靶；固定AGC模式；0平均化；50ms最大IT；25V源DC偏移；8V注入扁平极DC；7V扁平极间透镜；6V弯曲扁平极DC；0V转移多极DC调谐偏移；0.8V C-形离子阱入口透镜调谐偏移；以及设定为3的捕集气体压力。(参见表1和2)
使用PMI Intact MassTM软件(Protein Metrics Inc.)在下列参数下分析所获取d质谱数据：1,500-6,000m/z范围；0.2电荷向量间隔；15m/z基线半径；0.02m/z平滑西格玛；0.04m/z间隔；3质量平滑西格玛；0.5质量间隔；10最大迭代；以及5-100电荷数范围。相对量化是基于每个单独峰的强度对解卷积光谱中的总强度。
实例7：天然CZE-MS
在天然CZE-MS分析之前，使用ZebaTM 96孔旋转脱盐板(Thermo Scientific)缓冲液-交换MHCI蛋白。首先将脱盐板平衡至室温并且然后在1,000×g下离心2min以去除储存缓冲液。使用250μL 50mM乙酸铵(pH7.0)通过在1,000×g下离心2min来将树脂洗涤4次。在每一旋转之后将洗涤板排空并且然后更换为样品收集板。将样品添加在树脂上并在1,000×g下离心2min。
使用ZipChipTM系统(908Devices Inc.)将经缓冲液-交换的MHCI蛋白注射在HS芯片(908Devices Inc.)上。使用ZipChipTM自动采样仪来递送含有异丙醇、组氨酸、乙酸铵和二甲基亚砜的蛋白质复合物背景电解质(BGE)溶液(pH 6.5)。使用下列参数最佳化最终ZipChipTM方法：500V/cm场强；3nL注入体积；0.5min压力辅助性开始时间；2min复制延迟；以及3min分析时间。经由电喷雾离子化至Thermo ExactiveTM Plus EMR OrbitrapTM仪器(Thermo Fisher Scientific)中使用用于数据获取的下列参数来在线分析经分离蛋白质：ESI源中的鞘气体流速2和辅助气体流速0；0kV喷雾电压；250℃毛细管温度；200S-lens RF电平；1,500-6,000m/z扫描范围；去溶剂化，源内CID 75eV,CE 0；m/z 200下的解析度17,500；正极性；3个微扫描；3×106个AGC标靶；固定AGC模式；0平均化；20ms最大IT；15V源DC偏移；9V注入扁平极DC；8V扁平极间透镜；10V弯曲扁平极DC；0V转移多极DC调谐偏移；0V C-形离子阱入口透镜调谐偏移；以及设定为2的捕集气体压力。(参见表1和表2)。
使用PMI Intact MassTM软件(Protein Metrics Inc.)在下列参数下分析所获取d质谱数据：1,500-6,000m/z范围；0.2电荷向量间隔；15m/z基线半径；0.02m/z平滑西格玛；0.04m/z间隔；3质量平滑西格玛；0.5质量间隔；10最大迭代；以及5-100电荷数范围。相对量化是基于每个单独峰的强度对解卷积光谱中的总强度。
实例8：肽交换过程：CZE-MS前
通过使用含有UV-可裂解、非天然氨基酸的高亲和力、合成肽再折叠HLA和B2M亚基来产生UV-MHCI。在UV暴露后，肽发生裂解，从而致使其失去其亲和力并且允许其与过量患者预测性表位肽交换以形成肽交换MHCI(pMHCI)。然后将肽-交换MHCI组装成用于T细胞染色的四聚体以供免疫应答监测。为验证非共价、完整形式的肽交换，首先使用浓度大于1μg/μl的UV-MHCI样品评估天然条件下的SEC-MS。UV-MHCI的SEC-MS分析成功地证实了这些非共价复合物的稳定性。在UV处理之前，仅观察到完整UV-MHCI复合物。在UV处理之后，复合物发生分解并且所观察的主要质量峰为HLA和B2M亚基。然而，UV-MHCI的检测限值低于0.3μg，从而致使在使用目的肽饱和之后50ng/μl的肽交换MHCI不适于验证肽交换。为规避灵敏度限制并且同时维持非变性质谱分析的分析能力，通过CZE而不是使用ZipChipTM CZE系统来检测和分析这些肽。
实例9：条件化MHCI配体的高通量鉴定以及条件化MHCI复合物的扩大产生
本文开发了能够鉴定和验证含有非天然UV可裂解氨基酸的肽(条件化MHCI配体)的新工作流程，这些肽在多种HLA等位基因中形成用于经由肽交换来高通量(HTP)地生成MHCI单体和四聚体的稳定MHC复合物。通过形成稳定再折叠MHCI复合物来筛选免疫表位数据库(IEDB)中所鉴定的已知肽结合物并且经由ELISA测定来检测MHCI/肽复合物。使用来自初始ELISA筛选的最高性能肽来设计条件化MHCI配体。然后在同一ELISA测定中评估条件化MHCI配体并且选择性能排名居前者进行扩大产生。开发了能够使用HLA-A*02:01等位基因的已知条件化MHCI配体进行大规模产生(15L)的新MHCI纯化和生物素化方案，该方案可在单次再折叠产生运行中产生>60mg MHCI。下一代分析技术也用于表征再折叠复合物，这些技术包括LC/MS、SEC-MALS和2D LC/MS。将优化的再折叠产生方案和下一代分析技术应用于生成具有ELISA筛选中所鉴定的条件化MHCI配体的MHCI复合物，并且发现可适当地再折叠并且具有较高的纯度和品质。最后，使用经验证肽结合物使用2D LC/MS来评估使用新条件化MHCI配体生成的MHCI复合物的UV暴露后的肽交换程度。在肽结合物存在下在UV暴露后，针对所有条件化MHCI配体都观察到成功的肽交换。这些组合结果证实，可使用该研究中所述的工作流程来鉴定新HLA等位基因的条件化MHCI配体。该方式可广泛应用并且使得能够在较宽范围的HLA等位基因中HTP生成MHCI单体和四聚体，这对于使得能够在临床中使用MHCI四聚体来监测新抗原特异性T细胞至关重要。
在过去10年，癌症新抗原的主要组织相容性复合物I类(MHCI)提呈已成为免疫系统可控制肿瘤生长的关键作用模式。由于新抗原特异性T细胞可用于杀死肿瘤，因此学术界和生物技术中的大量资源已致力于开发扩大癌症免疫性周期并且改良新抗原特异性T细胞应答的量级和广度的临床活性药物，包括检查点抑制剂、细胞激素、TNF超家族激动剂、癌症疫苗和免疫调节剂。尽管已进行这些药物开发尝试，但极有限的工具可用于监测治疗对新抗原特异性T细胞应答(T细胞表型、T细胞量级和广度、表位扩散等)的影响。
追踪T细胞应答的最常用方法为ELISPOT和MHC四聚体染色。ELISPOT测定是测量在使用抗原刺激PBMC细胞时T细胞的细胞激素释放的功能测定。此测定的优点在于，其不依赖于等位基因和新表位(即仅需已知新抗原)并且其为功能读出。该测定的缺点在于，其是半定量的并且不能评价T细胞表型，T细胞表型对于理解关于生成保护性免疫应答的重要因子至关重要。基于MHCI四聚体的检测利用经由链霉亲和素缀合多聚合成四聚体的重组MHCI单体作为新抗原特异性T细胞染色试剂。该方法允许对多种特异性以及表型标记物进行染色。MHCI四聚体还允许定量分析新抗原特异性T细胞的确切数量及其在治疗过程期间的可能变化方式。因此，在许多方面，基于MHCI四聚体的检测可更详细地理解治疗对新抗原特异性CD8+T细胞应答的效应。
尽管MHCI四聚体检测具有这些优点，但该方式不能广泛用作临床项目中的生物标记物策略，归因于与生成试剂有关的难题。MHCI四聚体需要耗时并且困难的多日再折叠过程，包括用于试剂生成的多个色谱步骤。另外，不仅每个患者的新抗原谱是独特的，而且需要许多患者特异性MHCI四聚体才能获得既定患者中的T细胞情况的完整图片。另外，HLA等位基因是高度多形的(存在近20,000种HLA I类等位基因)，并且每个人具有6种不同HLA等位基因。因此，新抗原特异性T细胞应答的基于MHCI四聚体的检测需要启用个性化MHCI四聚体平台，该平台不可能使用传统MHCI生成方案。
为解决这些限制，Rodenko等人开发了生成MHCI单体和四聚体的快速高通量(HTP)方法。该方法涉及生成具有UV-可裂解肽的MHCI复合物，该肽以高亲和力(在完整时)和低亲和力(在裂解时，条件化MHCI配体)进行结合。当在目的高亲和力肽结合物存在下孵育使用条件化MHCI配体组装的MHCI复合物(条件化MHCI复合物)时，此功能性使得能够在UV暴露后发生肽交换。可大规模地再折叠既定HLA等位基因的条件化MHCI复合物，并且最终使用者可然后将条件化MHCI配体交换为任何其他目的肽。本发明突破性地使得能够在临床中使用个性化MHCI四聚体来监测新抗原特异性T细胞。然而，条件化MHCI配体对每个HLA等位基因具有特异性并且必须重新鉴定。据所知，仅公开用于24种HLA等位基因的条件化MHCI配体。尽管这些等位基因是一些最常见者，但诸多不同患者中的新抗原覆盖范围仍极小。因此，需要开发使得能够扩大等位基因覆盖范围的工作流程。
另外，再折叠或肽交换后的MHCI复合物分析性验证利用有限数量的分析技术，包括ELISA测定和凝胶电泳。尽管这些技术已证实可用于确定MHCI复合物是否存在以及用于亲和力和稳定性的半定量分析，但使用此类分析不能捕获若干其他重要参数，诸如HLA:B2M比率、聚集、氧化状态和天然条件分析。存在用于评估这些参数的若干蛋白质分析工具(包括液相色谱/质谱(LC/MS)、2D LC/MS和尺寸排阻色谱法-多角度光散射检测(SEC-MALS))，但极少应用这些工具来表征再折叠或肽交换后的MHCI复合物。
开发了允许鉴定和验证形成稳定的条件化MHCI复合物的条件化MHCI配体和HLA等位基因的新组合的实验工作流程。开发了ELISA测定并且验证了稳定的条件化MHCI复合物的检测。首先在6种HLA等位基因(A*02:03、A*26:01、B*18:01、B*35:03、C*02:02、C*14:02)中筛选免疫表位数据库和分析(IEDB)中所报导的5种公开肽结合物，并且基于排名居前的结合物来设计条件化MHCI配体。然后在ELISA测定中筛选条件化MHCI配体，并且选择性能排名居前者进行扩大产生。针对MHCI产生，开发了新的MHCI纯化和生物素化方案并且使用下一代分析技术来证实所生成复合物的品质。应用优化的方案和分析技术来产生和表征使用新鉴定的条件化MHCI配体所生成的条件化MHCI复合物。使用2D LC/MS利用经验证肽结合物来评估UV暴露后的肽交换程度。因此，开发了经验证工作流程来鉴定用于可广泛应用的新HLA等位基因的条件化UV肽以极大地扩大HLA等位基因覆盖范围，这对于使得能够在临床中使用MHCI四聚体来监测新抗原特异性T细胞至关重要。
蛋白质的表达和纯化。重组HLA和B2M在大肠杆菌(E.coli)中过表达，从包涵体中纯化，并在-80℃下储存在变性缓冲液(6M盐酸胍、25mM Tris(pH 8))中。在诱导表达之后，将B2M和HLA生物质颗粒以5mL/g再悬浮于裂解缓冲液(PBS+1％Triton X-114)中并在1000巴下在高压微射流纳米均质机中均质化两次。然后将均质化悬浮液在超速离心机中在30000g下旋转20min。收集颗粒，使用500mL在PBS中的0.5％Triton X-114洗涤并在30000g下离心20min。如上所述再次收集颗粒并再次洗涤。将经纯化包涵体以10mL/g的浓度溶解在变性缓冲液(20mM MES(pH6.0)、6M盐酸胍)中并在4℃下搅拌过夜。将所溶解颗粒在40000g下离心60min并且收集上清液，并经由0.22μ过滤器过滤。使用BCA测定来确定浓度。然后将样品速冻并储存于-80℃下，然后生成MHCI复合物。
用于筛选的肽选择。从免疫表位数据库和分析资源(www.iedb.org)中选择用于初始结合筛选的肽。基于以实验方式测量的亲和力来分选数据库中所鉴定的肽结合物，并且选择5种具有最高测量亲和力的肽。在前五种的肽序列类似(区别少于4个氨基酸)的情况下，选择具有独特序列的第二最高亲和力肽以确保筛选中的最大肽多样性。
MHCI再折叠(小规模)。重组HLA等位基因和B2M在大肠杆菌中过表达，从包涵体中纯化，并如上所述在-80℃下储存在变性条件(6M盐酸胍、25mM Tris(pH 8))中。在200μL反应中，将肽(0.01mM/孔)、经氧化谷胱甘肽和经还原谷胱甘肽(分别为0.5mM和4.0mM)、重组HLA等位基因(0.03mg/mL)和B2M(0.01mg/mL)都组合于96孔板内。如上所述使用5种不同肽针对每各目的HLA执行再折叠筛选(表3)，并且将MHCI复合物在4℃下孵育3-5天以允许再折叠。通过ELISA分析经再折叠样品，并且选择最高性能肽用于进一步分析。相对于在不存在肽下(标记为NP)执行的阴性对照再折叠来分析所有数据。使用经CMV pp65病毒表位再折叠的HLA-A*02:01作为阳性对照。
在鉴定出每个HLA等位基因的最稳定肽结合物之后，使用UV-可裂解氨基酸(表示为“J”)在沿肽序列(表4)的不同位置处再设计肽。简言之，再设计初始筛选中所鉴定的最稳定肽结合物的变体，其中相对于N-末端在位置2、4、6和8处取代J氨基酸。通过如上文所述的ELISA鉴定在使用经再设计肽再折叠时的稳定条件化MHCI复合物的形成。使用基于ELISA测定读出产生最稳定复合物的条件化MHCI配体来扩大MHCI产生。使用原始肽(不含UV氨基酸取代)作为阳性对照。本文所用的所有肽均购自JPT(www.jpt.com)或ELIM Biopharm(www.elimbio.com)。
ELISA测定。使用25μL/孔的在涂覆缓冲液(0.05碳酸钠，pH 9.6)中的8μg/mL小鼠IgG2a抗HLA ABC克隆W6/32(Novus Biological,Littleton,Co.)涂覆384孔Nunc Maxisorp板(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)。在4℃下过夜孵育之后，使用洗涤缓冲液(PBS,0.5％Tween 20)将板洗涤3次。然后使用50μL/孔的阻断缓冲液(PBS,0.5％BSA,10ppmProclin)阻断板并在室温(RT)和搅拌下孵育1小时。在使用洗涤缓冲液将板洗涤3次之后，将25μL/孔的在测定稀释剂(PBS,0.5％BSA+0.05％Tween20+10ppm Proclin)中的未纯化的再折叠MHC复合物(40μg/mL，具有和不具有肽)添加至板中并在室温下孵育1小时。将板洗涤6次并且将25L在测定稀释剂中的100ng/mL生物素化小鼠IgG1抗人B2M(BioLegend,SanDiego,CA)添加至每个孔中。在室温下孵育1小时并且洗涤6次之后，将25μL/孔的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(GE,Marlborough,MA)添加至板中并在室温下孵育30min。使用TMB过氧化物酶底物(Moss,Pasadena,MD)在室温下使成色反应发生15min，补兵且使用1M磷酸终止反应。在405nm波长与620nm参考波长下测量吸光度。使用不含肽或不相关肽的再折叠MHC单体作为每个等位基因的阴性对照以归一化信号。
MHCI再折叠、生物素化和纯化(大规模)。在1、5或15L反应中，在再折叠缓冲液(100mM Tris(pH 8.0)、400mM L-精氨酸、2mM EDTA)中组合所选肽(0.01mM)、经氧化谷胱甘肽和经还原谷胱甘肽(分别为0.5mM和4.0mM)、重组HLA(0.03mg/mL)和B2M(0.01mg/mL)。然后将再折叠混合物在4℃下搅拌3-5天，经由0.22μm过滤器过滤，并浓缩并且通过切向流过滤(TFF)(Millipore P2C010C01)缓冲液交换至25mM Tris(pH 7.5)中。通过LC/MS分析蛋白质组分以确保HLA处于适当还原状态中。然后经由添加BirA(1:50(wt:wt)酶:MHCI)、100mMATP和10X反应缓冲液(100mM MgOAc、0.5mM生物素)来使经浓缩和再折叠的MHCI复合物生物素化。将生物素化反应液在室温下混合2hr。透析样品并通过LC/MS分析以量化生物素化。通过阴离子交换色谱使用1或5mL HiTrap Q HP柱(取决于反应大小)在AKTA Avant FPLC上纯化生物素化MHCI复合物。使用10柱体积(CV)的25mM Tris HCl(pH 7.5)在5mL/min的流速下来平衡管柱。将MHCI复合物以5mL/min流速加载于柱上并使用30CV的0-60％2.5mM TrisHCl(pH 7.5，1M NaCl)梯度洗脱。在SDS-PAGE上运行洗脱峰的馏分，并且汇集含有B2M带和HLA带的馏分。将所汇集馏分缓冲液-交换至储存缓冲液(25mM Tris HCl(pH 8.0),150mMNaCl)中。通过280nm下的UV吸光度确定蛋白质浓度，并且将样品速冻并储存于-80℃下。
LC/MS分析。将2-5μg MHCI复合物注射在AdvanceBio RP-mAb二苯基柱(2.1×75mm,3.5μm,Agilent)上。将柱加热至80℃并暴露于25-40％移动相B的梯度(2.0min，0.8mL/min)。移动相A为在水中的0.05％TFA。移动相B为在乙腈中的0.05％TFA。将柱洗脱剂传输至Agilent 6230ESI-TOF LC/MS以供质谱数据获取。
为量化MHCI浓度以及B2M与HLA的莫耳比率，通过使用上述方法注入已知量的每种蛋白质来生成B2M和HLA等位基因的标准曲线。使用A280下峰面积生成标准曲线，这些标准曲线允许量化MHCI复合物中的单独蛋白质亚基。使用MassHunter定性分析软件(Agilent)解卷积HLA和B2M质量。
SEC-MALS分析。如先前所述来确定MHCI复合物的MW。简言之，将样品注射在TSKgelSW3000分析型SEC柱(Tosoh Bioscience)上，该柱使用磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)(另外具有150mM NaCl)的等梯度梯度并且耦合至多角度光散射系统(MALS)(WyattInstruments)以测量莫耳质量。
2D LC/MS分析：使用2维液相色谱质谱(2D LC/MS)方法来表征肽与MHCI复合物的结合。将2-3μg MHCI复合物注射在仪器上并传输至第一维柱。第一维LC方法采用分析尺寸排阻柱(SEC)(Agilent AdvanceBio SEC
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2.7μm,4.6×15mm)来分离完整复合物与过量肽，其中在0.7mL/min的等梯度流速下在25mM TRIS(pH 8.0)、150mM NaCl中运行10min并且在280nm下获取信号。采样阀收集在160μL的体积在1.90-2.13min之间洗脱的全部复合物峰并且将其注射在第二维反相柱(Agilent PLRP-S/>
Figure BDA0004093111910000572
8μm,50×2.1mm)上。将第二维柱暴露于5-50％移动相B的梯度(4.7min，0.55mL/min)并且将柱加热至80℃。移动相A为0.05％TFA。移动相B为在乙腈中的0.05％TFA。将柱洗脱剂传输至Agilent 6224ESI-TOFLC/MS以供质谱数据获取。
MHCI再折叠的基于ELISA的分析。此手稿的主要目标中的一个在于开发用于鉴定可形成稳定的条件化MHCI复合物的含有非天然UV可裂解氨基酸的肽(条件化MHCI配体)的稳健HTP工作流程。此过程中的第一步骤是开发了可测量再折叠筛选后的稳定的MHCI复合物形成的ELISA测定。因为HLA组分在此阶段并不生物素化，因此，不能使用广泛公开的基于链霉亲和素的ELISA。替代地评估以下两种形式：1)使用抗B2M捕获并且使用抗HLA(克隆W6/32)检测，以及2)使用抗HLA(克隆W6/32)捕获并且使用抗B2M检测。在两种情况下，使用生物素标记检测抗体并且在添加链霉亲和素-HRP和底物之后诱导信号生成。使用CMV pp65肽和HLA-A*02:01进行这些初始筛选。尽管两种形式的信号和检测范围相当，但在高于0.25μg/mL的浓度下，形式2)(图41A，黑色条)的归一化值远高于形式1)(图41A，白色条)。在这些较高浓度下，肽与无肽对照之间的ELISA信号并无差异或具有极小差异。这些测定中所用的抗HLA识别MHCI上的构形表位并且应对适当折叠的MHCI具有选择性。相比之下，抗B2M捕获并不依赖于适当折叠的MHCI并且将捕获具有适当折叠的HLA以及部分变性的HLA的复合物。因此，ELISA形式1)在较高浓度下的信噪比较低可能因为捕获了部分折叠的MHCI。图41B示出了对于ELISA形式2)在优化测定条件下随MHCI浓度而变化的ELISA结果，该形式使用经CMVpp65肽、BMRF1肽和不经肽再折叠的MHCI分子。随着浓度增加可观察到，CMV pp65和BMRF1抗原的OD450/620ELISA信号有所增加，但无肽对照的信号增加极小，这与适当再折叠的MHCI复合物的检测一致。图41C示出了对于CMV pp65和BMRF1 ELISA在1μg/mL的MHCI浓度下归一化至无肽对照的信号。两种抗原的信号都比背景大10倍，从而证实该测定形式产生高度灵敏的信噪比并且可易于用于鉴定可在再折叠步骤期间形成稳定的MHCI复合物的抗原。
跨HLA等位基因的肽结合物和条件化MHCI配体的鉴定。从IEDB中选择肽(表3)。使用上述ELISA测定分析这些肽与相应HLA等位基因形成稳定MHCI复合物的能力。使用5种肽和HLA-A*02:03生成的再折叠MHCI复合物的滴定曲线示于图42A中。在0.1μg/mL至3.0μg/mL之间的MHCI浓度下执行该测定，并且如图41B中针对阳性对照所观察，在递增MHCI浓度下ELISA OD有所增加并且信号在1μg/mL下开始饱和。另外观察到，阴性对照的信号在滴定范围内仅具有极小增加。因为信号似乎在1.0μg/mL下饱和，所以选择该浓度来显示A*02:03、B*35:01和C*0202等位基因的归一化ELISA值(图42B-42D)。针对A*02:03筛选的5种肽的信号/背景相对高，并且其值在20至40之间。此表明，所有选自IEDB的肽不仅是结合物，还可在再折叠时形成稳定的MHCI复合物。A0203-02肽产生最高归一化OD值并且选择用于设计UV肽。对于B*35:03而言，所选肽的归一化OD还具有在6.75-7.25之间的相对较高的信号/背景(图42C)。B3503-04产生最高OD值并且随后选择用于设计候选条件化MHCI配体。C*02:02肽的归一化OD都在18与20之间，C0202-02除外，其归一化OD极低(约8)(图42D)。C0202-03产生最高归一化OD值并且选择用于设计候选条件化MHCI配体。还测试了A*26:01、B*18:01和C*14:02并且观察到类似结果(图54A-54F)。尽管所测试的所有等位基因的信噪比都相对高并且提供该测定鉴定形成稳定复合物的肽的信心，但各等位基因中的归一化信号的量级存在显著差异。据信，这些结果可能是因为不同HLA等位基因的泛-HLA抗体的亲和力有所变化。相比之下，既定等位基因(例如A*02:03和C*02:02)内的可变性可能是因为所筛选的不同肽中的肽亲和力差异。
然后使用这些所选肽来设计含有非天然UV可裂解氨基酸的肽(条件化MHCI配体)。使用在从N-末端起的位置2、4、6和8处经取代的UV-可裂解氨基酸(表示为J)来设计初始筛选中的性能排名居前的肽的变体(即A0203-02、B3503-04和C0202-03)(图42B-42D)，从而鉴定在不同HLA等位基因中形成稳定复合物的UV-肽。衍生自A0203-02肽的4种所筛选条件化MHCI配体的滴定曲线示于图42E中。如针对非-UV可裂解肽所观察，在递增MHCI浓度下观察到ELISA OD有所增加并且其值在1μg/mL下开始饱和(图42E)。所有条件化MHCI配体在不同等位基因中的归一化ELISA信号示于图42F-42H中。有趣的是，在位置2处具有J氨基酸取代的所有条件化MHCI配体变体都显示了极低的归一化ELISA值(图42F-42H)，从而指示相对于亲代肽形成极少的MHC复合物(A0203-02-01、B3503-05-01、C0202-03-01和C0202-03-04)(图42F-42H，灰色条)。该发现可以预期，这是因为已知该位置是MHCI-肽锚定位置。针对A0203-02和B3503-04筛选的所有其他条件化MHCI配体都产生类似于亲代肽的归一化OD读出(图42F-42G)。相比之下，C0202-02的所有条件化MHCI配体的OD值都低于亲代；然而，C0202-02-02和C0202-02-03的归一化OD仍相对较高(分别为6和8)(图42H)，从而指示UV可裂解氨基酸对MHCI稳定性具有轻微负面影响。然后选择产生最高归一化ELISA OD值的条件化MHCI配体(A0302-02-02、B3503-05-02和C0202-03-03)进行扩大产生。执行类似分析以鉴定A*26:01、B*18:01和C*14:02等位基因的最佳条件化MHCI配体(图54A-54F)。
MHCI单体的扩大再折叠和纯化。在20多年前首次开发了经由在目的肽存在下再折叠从大肠杆菌包涵体中纯化的变性B2M和HLA来生成重组MHCI复合物。从初始报导以来，已开发了许多研究和方法来使用再折叠方案生成和纯化MHCI复合物。这些方法中的大部分包括下列过程的一定变化形式：1)在具有氧化还原/氧化剂的通用再折叠缓冲液中混合HLA和B2M与肽(孵育时间可从1-5天不等)，2)过滤再折叠材料以去除聚集体，3)浓缩至与尺寸排阻色谱法(SEC)相容的体积(取决于柱为1-2mL)，4)使用SEC纯化，5)使经纯化的再折叠MHCI复合物生物素化，以及6)纯化来自生物素化反应的MHCI复合物(SEC、旋转柱过滤器等)。这些产生方法中的大部分仅以1L规模或更小规模实践并且仅产生几毫克再折叠材料；因此，需要多个产生运行来产生用于支持临床项目的足够材料。多个运行可潜在地产生批次间可变性，这可混淆下游四聚体染色数据的诠释。为解决这些限制，开发了使得能够将MHCI再折叠和纯化以扩大至15公升的新工作流程。
为达成方法优化，使用公开的HLA-A*02:01特异性条件化MHCI配体。扩大产生的主要限制是需要SEC纯化步骤，该步骤需要将样品浓缩至小于1mL。另外，通常对经纯化的再折叠MHCI复合物执行生物素化步骤并且需要二级纯化步骤，这会进一步限制扩大产生。为解决这些限制，开发了3-步骤产生过程，其包括再折叠反应、过程中生物素化和阴离子交换色谱纯化。MHCI复合物的HLA组分在生物素化步骤之前和之后的LC/MS分析示于图43A中。黑色线显示生物素化前的HLA蛋白。在34812Da和34943Da下观察到两个峰，其对应于具有和不具有N-末端甲硫氨酸基团的HLA蛋白。该两个群体可能是通过不完全修饰并且随后分别通过甲酰甲硫氨酸脱甲酰酶和甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)去除甲酰甲硫氨酸和N-末端甲硫氨酸所产生，该去除可取决于邻近的氨基酸而有所变化并且在一些情况下不去除N-末端甲硫氨酸。因此，N-末端HLA序列可能不适用于总MAP活性，所以仅观察到部分N-末端去除。在生物素化之后观察到，两个峰的质量增加约244，这对应于生物素质量(图43A)。未观察到非生物素化质量下的残余峰，从而指示100％生物素化。这些组合结果证实，可采用过程中生物素化步骤来消除两个纯化步骤的需要。
在完成生物素化步骤之后，将所得生物素化反应液缓冲液交换至25mM Tris中并且经制备用于经由阴离子交换色谱的纯化。选择阴离子交换用于SEC上的纯化，因为它易于直接装载用于生物素化步骤期间的较大体积(10-100mL)。1L再折叠的代表性Q-HP阴离子色谱图示于图43B中。在约130mL的洗脱体积下观察到较大峰以及若干较小峰，这些较小峰可能代表来自包涵体纯化的较少污染物。在SDS-PAGE上运行来自主峰的馏分，并且跨峰观察到对应于HLA-A*02:01和B2M的预期MW的带(图43B)。基于SDS-PAGE分析中的带强度来汇集馏分并运行于LC/MS和SEC-MALS上。经纯化的生物素化MHCI复合物的TIC色谱图示于图43C中。滞留时间1.7min和1.75min下的两个毗邻峰对应于使用外消旋UV氨基酸产生的条件化MHCI配体的R和S非对映异构体。滞留时间1.8min和2.2min下的峰分别对应于B2M和HLA-A*02:01。生成B2M和HLA-A*02:01的标准曲线并且使用曲线下面积来量化B2M与HLA的莫耳浓度和莫耳比率。若再折叠过程使得B2M与HLA适当配对，两种组分的莫耳比率应接近1。在此制备中，该比率经计算为0.95，从而表明已适当配对。通过SEC-MALS进一步分析MHCI复合物以供天然质量分析，从而进一步证实适当的1:1HLA:B2M配对。A280 SEC色谱图峰高度对称(指示均质蛋白质样品)，并且未观察到聚集体峰(图43D)。跨MHCI峰的MW在48.8kDa至51.3kDa之间(图43D，红色虚线)并且平均值为49.1kDa，其接近MHCI复合物的预期MW(48.1kDa)。LC/MS和SEC-MALS分析共同表明，再折叠和纯化方案会产生高纯的和适当折叠的MHCI复合物。
开发了新的纯化工作流程的主要目标中的一者在于使得能够扩大产生。为测试可扩展性，在5L和15L规模下执行优化的1L方案。这些产生规模下的产率示于图43E中。有趣的是，据观察，随着该过程从1L(约6％)扩大至5L(约8％)至15L(约10％)，产率逐渐增加，但该增加在统计学上并不显著。从1L规模和15L规模生成的MHCI复合物的量分别为约2.4mg和约60mg，这对应于在15L规模下每个再折叠的材料生成增加25倍。这些组合发现证实，可使用此研究中所述的工作流程来扩大MHCI复合物的产生和纯化。
6种MHCI单体与从HTP筛选鉴定的UV肽的扩大产生和肽交换分析。应用上述再折叠和纯化方案以使用HTP筛选中所鉴定的条件化MHCI配体来大规模产生MHCI复合物。所有6种构建体的Q-HP阴离子色谱图和所汇集馏分的相应SDS-PAGE示于图54A-54F中。这些再折叠物的色谱图极类似于HLA-A*02:01(图43B)，并且在SDS-PAGE中具有清晰的HLA和B2M带。在SDS-PAGE上运行每个HLA等位基因的所汇集馏分并且观察到对应于HLA和B2M的高纯带(图44A)。1L再折叠的产率在样品间有所变化，其中A*02:03、B*18:01和C*02:02具有最高产率(在8％-11％之间)，随后是B*35:03(约5％)、C*14:02(约4％)和A*26:01(约2.5％)。此可变性可能是因为氨基酸序列含量差异以及再折叠期间的聚集易感性以及肽形成稳定复合物的能力。尽管存在可变性，但2.5％的最低产率仍由1公升再折叠物产生1mg材料并且在15公升规模下者可扩大至>15mg，这足以涵盖>30,000种四聚体染色剂。
执行LC/MS和SEC-MALS分析以进一步评估这些MHCI单体的品质并且评价B2M和HLA是否适当配对。6种等位基因中B2M:HLA比率的LC/MS分析的结果示于图44C中。如针对HLA-A*02:01MHCI复合物所观察，所有这些样品的B2M:HLA比率均接近1。通过SEC-MALS进一步分析MHCI复合物以供完整的非变性状态质量分析。所分析的所有6种MHCI复合物的MHCI峰的平均MW示于图44D中。所有6种构建体的MW都在47.4kDa至48.8kDa之间，这完全在这些复合物的预期质量范围(47.5-48kDa)内。这些组合发现证实，再折叠方案和纯化工作流程不仅可广泛应用，而且在小规模HTP测定中所鉴定的条件化MHCI配体能够在扩大后形成稳定的MHCI复合物。
除鉴定可用于扩大产生MHCI单体的新的条件化MHCI配体外，还期望证实这些复合物可在UV暴露后发生肽交换以使得HTP能够生成MHCI复合物。在UV暴露后，用于测量条件化MHCI配体的肽交换的最广泛使用的方法中的一种为ELISA。尽管该测定已证实可用于证实UV暴露后的肽交换，但该测定是半定量的，并且既不直接测量经交换的肽也不允许量化所裂解的肽。为解决这些限制，开发了2D LC-MS分析方法以直接量化在交换过程期间加载至复合物中的肽。该测定的示意图示于图45A中。此方法中的第一步骤(第1维)是将肽交换反应混合物(暴露于UV后的MHCI复合物+100倍莫耳过量的经交换的肽)注射在分析型SEC柱上，这使得能够通过采样阀收集MHCI复合物而无过量肽。第二步骤(第2维)是将从MHCI峰收集的材料注射在RP-HPLC上。RP-HPLC步骤的有机相可使HLA、B2M以及含在复合物内的肽解离和变性，这使得能够通过A280和LC/MS来分析和量化MHCI复合物的单独组分。具有CMVpp65表位的对照HLA-A*02:01条件化MHCI配体的肽交换的第1维SEC色谱图的实例示于图45B中。色谱图显示对应于MHCI复合物的一个主峰。在2.5min与3min之间始终观察到色谱图A280信号的波动，这对应于采样阀的打开和关闭。因为在第1维与第2维之间存在较大压力差，因此该波动可能与随着阀门打开和关闭压力的突然变化有关。第2维HPLC步骤的A280色谱图的实例示于图45C中。HLA和B2M峰清晰可见，但未观察到CMV pp65肽或条件化MHCI配体的A280峰，这是因为它们不含任何色氨酸或酪氨酸残基并且并没有固有的A280吸光度。为分析肽组成，生成交换肽和未裂解的条件化MHCI配体的提取离子交换色谱图(图45D)。如所预计，观察到对应于CMV pp65肽的较大峰，从而指示成功的肽交换。然而，也观察到极低含量的完整的条件化MHCI配体。该结果表明，经纯化肽具有以类似质量携带的合成源污染物，或小部分条件化的MHCI配体在处于复合物中时可经保护以免于UV裂解。当在不存在MHCI下裂解单独的肽时，也观察到该峰，从而表明其为污染物。无论如何，完整的条件化MHCI配体的相对分数极低(约1％)并且应对下游四聚体染色具有最小影响。执行相同的分析以验证是否存在经裂解的条件化MHCI配体，并且未检测到峰。通过采用2D LC/MS测定来分析肽交换，能够测量MHCI复合物中的肽含量在肽交换过程期间如何变化。据信，这是可用于更好地理解与肽交换相关的参数的有效工具，这些参数不能使用其他传统方法(例如ELISA)来量化。
然后使用该方法来评价使用扩大产生工作流程生成的MHCI复合物与在HTP小规模测定中所鉴定的新的条件化MHCI配体的肽交换。针对每种MHCI复合物，分别使用发现是小规模HTP筛选中的结合物的4 -5种肽(图42B-D和54A-54C)以及一种已知非结合肽作为阳性对照和阴性对照。具有肽A0203-05的HLA-A*02:03的第1维SEC色谱图显示清晰单峰(图45E)。肽交换复合物的第2维HPLC A280色谱图还显示预期的B2M和HLA峰(图45F)。在第2维的EIC分析中，观察到对应于A0203-05肽的提取质量的较大峰(图45G，黑色线)。然而，类似于A*02:01和CMV pp65的肽交换，还观察到对应于完整的条件化MHCI配体的较小峰(图45G，虚线)。该现象可见于所测试的所有条件化MHCI配体中并且指示在肽交换过程中存在并且携带一些低含量污染物。值得注意的是，在所有情况下，污染物肽的总分数都小于1％。HLA-A*02:03MHCI复合物在与已知非结合物肽交换之后的第1维SEC色谱图示于图45H中。这些条件下的总峰面积低于使用肽结合物执行的肽交换过程时(图41E对41H)。另外，第2维中的A280 HPLC色谱图含有两个峰，但总峰面积远低于使用肽结合物时(图45F对45I)。这些组合数据表明，在使用非结合物执行肽交换时，存在显著的材料损失，这可能是因为蛋白质聚集。有趣的是，在所测试的所有等位基因中针对阴性对照交换样品始终观察到在SEC运行结束时的峰(图45H，滞留时间约为3.6min)，据信这是因为部分变性的HLA与柱发生相互作用。最后，在EIC分析中，未观察到对应于A*02:03非结合肽的峰，从而指示并不发生肽交换(图45J)。令人吃惊的是，尽管没有肽与复合物缔合，但在第1维中观察到相对显著的A280峰，只是该峰远小于使用肽交换观察的峰。这些结果表明，一些复合物在不存在肽下保持缔合，但可能具有较低品质并且并不适当折叠。
第1维和第2维数据的量化示于图46A-46F中。在该分析中，评估在交换之后回收在第1维(SEC)中的A280 MHCI峰的分数以及在第2维(EIC)中是否存在经交换肽。图46A-46F示出了在4 -5种阳性对照和一种阴性对照中不同的MHCI复合物的所回收A280 MHCI峰的分数(归一化至非肽交换对照)。图形上方的符号指示在第2维中是否检测到肽(+＝检测到，-＝未检测到)。对于HLA-A*02:03(图46A)，阳性对照结合肽的回收分数在0.9至1之间变化并且在第2维中针对所有肽均观察到交换肽。如上所述，阴性对照的回收分数仍相对较高(约0.76)，即使没有观察到经交换的肽、经裂解的条件化MHCI配体以及极低含量的完整的条件化MHCI配体(<1％)。这表明，复合物在不存在肽下在一定时间段内保持一定程度的完整，但考虑到HLA等位基因在不存在肽下的不稳定性其可能没有适当折叠。还值得注意的是，因为阳性对照与阴性对照之间的回收分数差仅为26％，因此考虑到该测定仅测量HLA与B2M之间的配对并且不测量肽含量，该差异可能被ELISA遗漏。
针对A*26:01(图46B)、B*18:01(图46C)、B*35:03(图46D)和C*14:02(图46F)观察到类似结果。在所有情况下，第一维中的阳性对照与阴性对照之间的峰面积差均小于20％-25％。相比之下，阴性对照和阳性对照针对C*02:02具有显著差异(图46E)。对于该样品而言，在已知非结合肽包括在肽交换中时，约80％的材料发生降解。尽管该现象的确切原因未知，但其可能是因为在已从HLA上的肽凹槽去除肽时不同等位基因能够保持与B2M缔合。无论如何，这些组合结果明确指示，鉴定了允许扩大产生MHCI肽并且随后发生肽交换用于HTP生成MHCI单体和四聚体的条件化MHCI配体。
在该研究中，开发了使得能够鉴定和验证形成稳定UV肽MHC复合物的新的条件化MHCI配体的工作流程。该工作流程包括筛选IEDB中所鉴定的已知肽结合物以形成稳定的再折叠MHCI复合物。基于初始筛选中性能排名居前的肽来设计含有非天然UV可裂解氨基酸的肽。然后在同一次ELISA测定中筛选UV肽并且选择性能排名居前者进行扩大产生。使用已公开的HLA-A02:01的条件化MHCI配体来开发新的MHCI复合物纯化和生物素化方案以使得能够将产生扩大至超过传统规模(例如1L)。另外，使用下一代分析技术(LC/MS、2D LC/MS和SEC-MALS)来证实所生成复合物的品质。将优化的再折叠产生和纯化方案以及下一代分析技术应用于ELISA筛选中所鉴定的条件化MHCI配体。该分析证实，新的条件化MHCI复合物纯化到了高纯度，经适当再折叠，并且具有高品质。最后，使用2D LC/MS评估条件化MHCI复合物在UV暴露之后与经验证肽结合物的肽交换。所有条件化MHCI复合物均能够在UV暴露后发生肽交换。这些组合结果证实，所开发的工作流程可用于鉴定新的HLA等位基因的条件化MHCI配体。该方式已潜在地广泛应用并且使得能够在较宽范围的HLA等位基因中HTP生成MHCI单体和四聚体，这对于使得能够在临床中使用MHCI四聚体来监测新抗原特异性T细胞至关重要。
实例10：条件化MHCI配体的高通量鉴定以及条件化MHCI复合物的扩大产生
尽管需要监测癌症免疫疗法(CI)/免疫肿瘤学(IO)治疗对新抗原特异性T细胞应答的影响，但极少临床项目纳入该方面的免疫监测，这是因为在宽范围的HLA等位基因中MHCI四聚体的高通量(HTP)生成存在一定难题。最近经由开发使得能够在UV暴露后进行HTP肽交换的具有含有非天然UV可裂解氨基酸的肽(条件化MHCI配体)的MHCI复合物来解决该限制。尽管具有该进展，但具有已知条件化MHCI配体的等位基因的数量有限。开发了使得能够在多种HLA等位基因中鉴定并验证条件化MHCI配体的新的工作流程。首先，经由酶联免疫吸附测定(ELISA)来筛选已知的肽结合物。使用最高性能肽来设计条件化MHCI配体并且在同一ELISA测定中进行评估。然后选择性能排名居前者进行扩大产生。使用下一代分析技术(LC/MS、SEC-MALS和2D LC/MS)来表征在使用条件化MHCI配体再折叠之后的复合物。最后，使用2D LC/MS来评估这些扩大条件化MHCI复合物在UV暴露之后与经验证肽结合物的肽交换。在UV暴露后针对所有条件化MHCI配体均观察到成功的肽交换，从而验证了筛选方式。该方式可广泛应用并且使得能够在较宽范围的HLA等位基因中HTP生成MHCI单体和四聚体，这对于使得能够在临床中使用MHCI四聚体来监测新抗原特异性T细胞至关重要。
追踪T细胞应答的最常用方法为ELISPOT和MHC四聚体染色。ELISPOT测定是测量在使用抗原刺激PBMC细胞时T细胞的细胞激素释放的功能测定。此测定的优点在于，其不依赖于等位基因和新表位(即仅需已知新抗原)并且其为功能读出。该测定的缺点在于，其是半定量的并且不能评价T细胞表型，T细胞表型对于理解关于生成保护性免疫应答的重要因子至关重要。基于MHCI四聚体的检测利用经由链霉亲和素缀合多聚合成四聚体的重组MHCI单体作为新抗原特异性T细胞染色试剂。该方法允许对多种特异性以及表型标记物进行染色。MHCI四聚体还允许定量分析新抗原特异性T细胞的确切数量及其在治疗过程期间的变化方式。在许多方面，基于MHCI四聚体的检测可因此更详细地理解治疗对于新抗原特异性CD8+T细胞应答的效应。
尽管MHCI四聚体检测具有这些优点，但该方式不能广泛用作临床项目中的生物标记物策略，归因于与生成试剂有关的难题。MHCI四聚体的生成需要耗时、多日、低产率的再折叠过程，包括多个色谱步骤。另外，每个人具有6种不同HLA等位基因并且HLA等位基因是高度多形的(存在近20,000种HLA I类等位基因)。另外，不仅每个患者的新抗原谱是独特的，而且需要数十至数百个患者特异性MHCI四聚体才能获得既定患者中的T细胞情况的完整图片。因此，新抗原特异性T细胞应答的基于MHCI四聚体的检测需要启用个性化MHCI四聚体平台，该平台不可能使用传统MHCI生成方案。
已开发了若干制备MHCI试剂的新的方法来解决这些限制。一种方式是在HLA等位基因中改造稳定二硫化物以使得能够在二肽存在下形成稳定的MHCI复合物。这些经二硫化物稳定的MHCI试剂称为“空”MHCI复合物并且可通过将目的肽简单地添加至空MHCI复合物中来加载肽或表位。该策略已针对鼠和人(A*02:01)MHCI复合物得到了证实，并且在使用该方式和传统再折叠方式产生的MHCI试剂之间报告相当的四聚体染色结果。另一个方法使用等位基因特异性UV-可裂解肽(也称为条件化MHCI配体)来形成MHCI复合物，其中肽以高亲和力(在完整时)和低亲和力(在裂解时)进行结合。当在目的高亲和力肽结合物存在下孵育使用条件化MHCI配体组装的MHCI复合物(称为条件化MHCI复合物)时，此功能性使得能够在UV暴露后发生肽交换。可大规模地再折叠既定HLA等位基因的条件化MHCI复合物，并且最终使用者可然后将条件化MHCI配体交换为任何其他目的肽。
这些方法均寻求突破性地使得能够在临床中使用个性化MHCI四聚体来监测新抗原特异性T细胞。“空”MHCI的主要缺点中的一种在于，需要鉴定稳定“空”复合物的新改造二硫化物以及使得“空”复合物能够针对每个不同HLA等位基因再折叠的二肽。类似地，条件化MHCI方式的一个缺点在于，需要鉴定并设计用于每个HLA等位基因的特定肽。然而，考虑到从资源角度考虑肽结合物的高通量(HTP)筛选比生成多个经改造构建体以及筛选“空”MHCI所需的二肽稳定剂更为容易，该手稿的目标在于进一步扩展条件化MHCI配体的组库。据所知，仅公开用于24种HLA等位基因的条件化MHCI配体。尽管这些等位基因是一些最常见者，但诸多不同患者中的新抗原覆盖范围仍极小。因此，需要开发使得能够扩大等位基因覆盖范围的工作流程。
另外，再折叠或肽交换后的MHCI复合物分析性验证利用有限数量的分析技术，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)测定和凝胶电泳。尽管已证明这些技术可用于确定MHCI复合物是否存在并用于亲和力和稳定性的半定量分析，但不能捕获若干其他重要参数，诸如HLA:B2M比率、聚集和氧化状态。存在用于评估这些参数的若干蛋白质分析工具(包括液相色谱/质谱(LC/MS)、2D LC/MS和尺寸排阻色谱法/多角度光散射检测(SEC-MALS))，但很少使用这些工具来表征再折叠或肽交换后的MHCI复合物。
本文的实验工作流程允许鉴定并验证形成稳定的条件化MHCI复合物的条件化MHCI配体和HLA等位基因的新组合。开发并验证用于检测稳定条件化MHCI复合物的ELISA测定。首先在6种HLA等位基因(A*02:03、A*26:01、B*18:01、B*35:03、C*02:02、C*14:02)中筛选免疫表位数据库和分析(IEDB)中所报导的5种公开肽结合物，并且基于排名居前的结合物来设计条件化MHCI配体。然后在ELISA测定中筛选条件化MHCI配体，并且选择性能排名居前者进行扩大产生。针对MHCI产生，开发了新的MHCI纯化和生物素化方案，并且使用下一代分析技术来证实所生成复合物的品质。进一步应用这些方法来表征使用新鉴定的条件化MHCI配体所生成的条件化MHCI复合物。最后，使用2D LC/MS验证在UV暴露之后与经验证肽结合物的肽交换。总而言之，开发了经验证工作流程来鉴定用于可广泛应用的新的HLA等位基因的条件化UV肽以极大地扩大HLA等位基因覆盖范围，这对于使得能够在临床中使用MHCI四聚体来监测新抗原特异性T细胞至关重要。
蛋白质的表达和纯化。从Uniprot.org获得HLA和B2M序列。合成编码HLA和B2M的信号序列以及HLA细胞外域和全长B2M的DNA并在T7 lac启动子的控制下亚克隆至pET表达载体中。重组HLA和B2M在大肠杆菌中过表达，从包涵体中纯化，并在-80℃下储存在变性缓冲液(6M盐酸胍、25mM Tris(pH 8))中。在诱导表达之后，将B2M和HLA生物质颗粒以5mL/g再悬浮于裂解缓冲液(PBS+1％Triton X-114)中并在1000巴下在高压微射流纳米均质机中均质化两次。然后将均质化悬浮液在超速离心机中在30000g下旋转20min。收集颗粒，使用500mL在PBS中的0.5％Triton X-114洗涤并在30000g下离心20min。如上所述再次收集颗粒并再次洗涤。将经纯化包涵体以10mL/g的浓度溶于变性缓冲液(20mM MES(pH 6.0)、6M胍)中并在4℃下搅拌过夜。将所溶解颗粒在40,000g下离心60min并且收集上清液，并经由0.22μm过滤器过滤。通过UV-Vis在280nm下使用蛋白质的消光系数来确定浓度。然后将样品速冻并储存于-80℃下，然后生成MHCI复合物。
用于筛选的肽选择。从免疫表位数据库和分析资源(www.iedb.org)中选择用于初始结合筛选的肽。基于亲和力来分选数据库中所鉴定的肽结合物，并且选择5种具有最高测量亲和力的肽。在前5种肽序列相似(区别小于4个氨基酸)的情况下，选择具有独特序列的第二最高亲和力肽以确保筛选中的最大肽多样性(表3)。
MHCI再折叠(小规模)。重组HLA等位基因和B2M在大肠杆菌中过表达，从包涵体中纯化，并如上所述在-80℃下储存在变性条件(6M盐酸胍、25mM Tris(pH 8))中。在200μL反应中，将肽(0.01mM/孔)、经氧化谷胱甘肽以及经还原谷胱甘肽(分别为0.5mM和4.0mM)、重组HLA等位基因(0.03mg/mL)和B2M(0.01mg/mL)均组合在96孔板中。如上所述使用5种不同肽针对每种目的HLA执行再折叠(表3)，并且将MHCI复合物在4℃下孵育3-5天以允许再折叠。在不存在肽下也执行了MHCI再折叠复合物并且用作阴性对照来计算实验肽的信噪比(S/N)。考虑到在不存在肽下应具有最少适当再折叠的复合物，因此这些样品提供了用于计算S/N值的整体测定背景。使用经CMV pp65病毒表位再折叠的HLA-A*02:01作为阳性对照。选择产生最高信噪比(S/N)的肽以供进一步分析。
在基于每个HLA等位基因的ELISA分析鉴定出最稳定肽结合物之后，使用UV-可裂解氨基酸(表示为“J”)在沿肽序列(表4)的不同位置处再设计肽。简言之，再设计初始筛选中所鉴定的最稳定肽结合物的变体，其中相对于N-末端在位置2、4、6和8处取代J氨基酸。通过如上文所述的ELISA鉴定在使用经再设计肽再折叠时的稳定条件化MHCI复合物的形成。使用基于ELISA测定读出产生最稳定复合物的条件化MHCI配体来扩大MHCI产生。使用原始肽(不含UV氨基酸取代)作为阳性对照。本文所用的所有肽均购自JPT(www.jpt.com)或ELIMBiopharm(www.elimbio.com)。
ELISA测定。评估两种不同ELISA测定以最优化测定灵敏度。在第一测定形式中，使用抗B2M抗体捕获再折叠MHCI并使用泛ABC抗HLA抗体(克隆W6/32)检测。在第二测定形式中，使用泛ABC抗HLA抗体(克隆W6/32)捕获MHCI并使用抗B2M抗体检测。在两种测定中，使用25μL/孔的在涂覆缓冲液(0.05碳酸钠，pH 9.6)中的8μg/mL捕获抗体小鼠IgG1抗人B2M(BioLegend,San Diego,CA)或小鼠IgG2a抗HLA ABC克隆W6/32(Novus Biological,Littleton,Co.)涂覆384孔Nunc Maxisorp板(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)。在4℃下过夜孵育之后，使用洗涤缓冲液(PBS,0.5％Tween 20)将板洗涤3次。然后使用50μL/孔的阻断缓冲液(PBS,0.5％BASE,10ppm Proclin)阻断板并在室温(RT)和搅拌下孵育1小时。在使用洗涤缓冲液将板洗涤3次之后，将25μL/孔的在测定稀释剂(PBS,0.5％BSA+0.05％Tween 20+10ppm Proclin)中的未纯化的再折叠MHC复合物(40μg/mL，具有和不具有肽)添加至板中并在室温下孵育1小时。将板洗涤6次并且将25μL在测定稀释剂中的100ng/mL生物素化小鼠IgG2a抗HLA ABC克隆W6/32(Novus Biological,Littleton,Co.)(测定形式1)或生物素化小鼠IgG1抗人B2M(BioLegend,San Diego,CA)(测定形式2)添加至每个孔中。在室温下孵育1h并且洗涤6次之后，将25μL/孔的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(GE,Marlborough,MA)添加至板中并在室温下孵育30min。使用TMB过氧化物酶底物(Moss,Pasadena,MD)在室温下使成色反应发生15min，补兵且使用1M磷酸终止反应。在405nm波长与620nm参考波长下测量OD吸光度值。在每次测定中包括不含肽的再折叠MHC单体以测量测定背景并且计算实验肽的信噪比(S/N)。
MHCI-肽再折叠、生物素化和纯化(大规模)。在1、5或15L反应中，在再折叠缓冲液(100mM Tris(pH 8.0)、400mM L-精氨酸、2mM EDTA)中组合所选肽(0.01mM)、经氧化谷胱甘肽和经还原谷胱甘肽(分别为0.5mM和4.0mM)、重组HLA(0.03mg/mL)和B2M(0.01mg/mL)。然后将再折叠混合物在4℃下搅拌3-5天，经由0.22μm过滤器过滤，并浓缩并且通过切向流过滤(TFF)(Millipore P2C010C01)缓冲液交换至25mM Tris(pH 7.5)中。通过LC/MS分析蛋白质组分以确保HLA处于适当还原状态中。然后经由添加BirA(1:50[wt:wt]酶:MHCI)、100mMATP和10X反应缓冲液(100mM MgOAc、0.5mM生物素)来使经浓缩和再折叠的MHCI复合物生物素化。将生物素化反应液在室温下混合2hr。透析样品并通过LC/MS分析以量化生物素化。通过阴离子交换色谱在AKTA Avant FPLC上使用1或5mL HiTrap Q HP柱(取决于反应大小)纯化生物素化MHCI复合物。使用10柱体积(CV)的25mM Tris HCl(pH 7.5)在5mL/min的流速下来平衡管柱。将MHCI复合物以5mL/min流速加载于柱上并使用30CV的缓冲液B(2.5mM TrisHCl(pH 7.5),1M NaCl)的0-60％梯度洗脱。在SDS-PAGE上运行洗脱峰的馏分，并且汇集含有B2M带和HLA带的馏分。将所汇集馏分缓冲液-交换至储存缓冲液(25mM Tris HCl(pH8.0),150mM NaCl)中。通过280nm下的UV吸光度确定蛋白质浓度，并且将样品速冻并储存于-80℃下。
液相色谱/质谱(LC/MS)分析。将2-5μg MHCI复合物注射在AdvanceBio RP-mAb二苯基柱(2.1×75mm,3.5μm,Agilent)上。将柱加热至80℃并暴露于25％-40％移动相B的梯度(2.0min，0.8mL/min)。移动相A为在水中的0.05％TFA。移动相B为在乙腈中的0.05％TFA。将柱洗脱剂传输至Agilent 6230ESI-TOF LC/MS以供质谱数据获取。为量化MHCI浓度以及B2M与HLA的莫耳比率，通过使用上述方法注入已知量的每种蛋白质来生成B2M和HLA等位基因的标准曲线。使用A280下峰面积生成标准曲线，这些标准曲线允许量化MHCI复合物中的单独蛋白质亚基。使用MassHunter定性分析软件(Agilent)解卷积HLA和B2M质量。
尺寸排阻色谱法-多角度光散射(SEC-MALS)分析。如先前所述来确定MHCI复合物的MW。简言之，将约2mg/mL的样品(针对A*02:01MHC使用10μ；针对其他MHCI等位基因使用25μl)注射在TSKgel SW3000分析型SEC柱(Tosoh Bioscience)上，该柱使用在环境温度下等梯度的磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS，pH 7.2，另外具有150mM NaCl)并且耦合至多角度光散射系统(MALS)(Wyatt Instruments)以测量莫耳质量。
2D LC/MS分析。使用二维液相色谱质谱(2D LC/MS)方法来表征肽与MHCI复合物的结合。将2-3μg MHCI复合物注射在仪器上并传输至第一维柱。第一维LC方法采用分析尺寸排阻柱(SEC)(Agilent AdvanceBio SEC
Figure BDA0004093111910000711
2.7μm,4.6×15mm)来分离完整复合物与过量肽，其中在0.7mL/min的等梯度流速下在25mM TRIS(pH 8.0)、150mM NaCl中运行10min并且在280nm下获取信号。采样阀收集在160μL的体积在1.90-2.13min之间洗脱的全部复合物峰并且将其注射在第二维反相柱(Agilent PLRP-S/>
Figure BDA0004093111910000721
8μm,50×2.1mm)上。将第二维柱暴露于5-50％移动相B的梯度(4.7min，0.55mL/min)并且将柱加热至80℃。移动相A为0.05％TFA。移动相B为在乙腈中的0.05％TFA。将柱洗脱剂传输至Agilent 6224ESI-TOFLC/MS以供质谱数据获取(Agilent Mass Hunter)。
MHCI再折叠的基于ELISA的分析。此手稿的主要目标中的一个在于开发用于鉴定可形成稳定的条件化MHCI复合物的含有非天然UV可裂解氨基酸的肽(条件化MHCI配体)的稳健HTP工作流程。此过程中的第一步骤是开发了可测量再折叠筛选后的稳定的MHCI复合物形成的ELISA测定。HTP再折叠方案涉及以200μL反应形式在96孔板内混合变性重组HLA(0.03mg/mL)、B2M(0.01mg/mL)、肽(0.01mM)、经氧化谷胱甘肽以及经还原谷胱甘肽(分别为0.5mM和4.0mM)并在4℃分析前，在熟食冰箱中进行再折叠反应3-5天，然后进行ELISA分析。因为HLA组分在此阶段并不生物素化，因此，不能使用广泛公开的基于链霉亲和素的ELISA。替代地，评估以下两种形式：1)使用抗B2M捕获并且使用抗HLA检测，以及2)使用抗HLA(克隆W6/32)捕获并且使用抗B2M检测。在两种情况下，使用生物素标记检测抗体，并且在添加链霉亲和素-HRP和底物之后诱导信号生成。使用CMV pp65肽和HLA-A*02:01进行这些初始筛选。使用在不存在肽下再折叠的MHCI复合物(无肽对照)计算S/N值以作为测定背景的量度。尽管两种形式的信号和检测范围相当，但在高于0.25μg/mL的浓度下，形式2(图47A，黑色条)的S/N值远高于形式1(图47A，白色条)。据信，形式2的较高特异性是因为捕获步骤使用识别MHCI上的构形表位并且应仅对适当折叠的MHCI具有选择性的抗HLA抗体。相比之下，抗B2M捕获并不依赖于适当折叠的MHCI并且将捕获具有适当折叠的HLA以及部分变性的HLA的复合物，据信，这可解释形式1的无肽对照的较高检测信号。基于这些发现，选择形式2进行剩余筛选。图47B示出了在使用ELISA时随MHCI或MHCI-肽浓度而变化的ELISA结果。如材料和方法中所述的形式2使用经CMV pp65肽、BMRF1肽和不使用肽(背景对照)再折叠的MHCI分子。随着MHCI浓度增加可观察到，CMV pp65和BMRF1肽的OD450/620ELISA信号有所增加，但无肽对照的信号几乎没有增加，这与适当再折叠之MHCI复合物的检测一致。图47C示出了使用无肽对照作为背景的ELISA分析在1μg/mL的MHCI浓度下CMV pp65和BMRF1的S/N。两种抗原的信号均比背景大10倍，从而证实该测定形式产生高度灵敏的S/N并且可易于用于鉴定可在再折叠步骤期间形成稳定的MHCI复合物的抗原。另外，标准偏差极小(图47B、47C)，从而指示该测定对于既定实验而言可高度再现并且可用于可靠地选择最佳肽而无需一式两份地执行测定。测定优化的目标在于开发可高度再现并且无需一式两份或一式三份地运行的测定以便于筛选数百种等位基因，并且基于这些结果认为该目标已达成。
跨HLA等位基因的肽结合物和条件化MHCI配体的鉴定。从IEDB中选择肽(表3)。使用上述ELISA测定分析这些肽与相应HLA等位基因形成稳定MHCI复合物的能力。使用5种肽和HLA-A*02:03生成的再折叠MHCI复合物的滴定曲线示于图48A中。在0.1μg/mL至3.0μg/mL之间的MHCI浓度下执行该测定，并且如图47B中针对阳性对照所观察的，在递增MHCI浓度下ELISA OD有所增加并且信号在高于1μg/mL下开始饱和。另外观察到，阴性对照的信号在滴定范围内仅具有极小增加。选择1.0μg/mL浓度来比较A*02:03、B*35:01和C*02:02等位基因的S/N ELISA值，这是因为略低于饱和(EC60-EC85，取决于肽-HLA组合)(图48B-48D)。针对A*02:03筛选的5种肽的S/N背景相对较高，并且其值在20至40之间。此表明，所有选自IEDB的肽不仅是结合物，还可在再折叠时形成稳定的MHCI复合物。A*02:03-02肽产生最高的S/N值并且被选择用于设计UV肽。针对B*35:03，所选肽的S/N值也具有在6.75至7.25之间的相对较高的S/N背景(图48C)。B*35:03-04产生最高的OD值并且随后被选择用于设计候选条件化MHCI配体。C*02:02肽的S/N值均在18与20之间，C*02:02-02除外，其值非常低(约8)(图48D)。C*02:02-03产生最高的S/N值并且被选择用于设计候选条件化MHCI配体。还测试了A*26:01、B*18:01和C*14:02并且观察到类似结果(图54A-54F)。尽管所测试所有等位基因的S/N均相对较高并且提供了该测定鉴定形成稳定复合物的肽的信心，但各等位基因中的S/N的量级存在显著差异。据信，这些结果可能是因为不同HLA等位基因的泛-HLA抗体的亲和力有所变化。相比之下，既定等位基因(例如A*02:03和C*02:02)内的可变性可能是因为所筛选的不同肽中的肽亲和力差异。
使用在从N-末端起的位置2、4、6和8处经取代的UV-可裂解氨基酸(表示为J)来设计初始筛选中的性能排名居前的肽的变体(即A0203-02、B3503-04和C0202-03)(图48B-48D)，从而鉴定在不同HLA等位基因中形成稳定复合物的UV-肽。使用衍生自A0203-02肽的4种所筛选的条件化MHCI配体组装的MHCI复合物的滴定曲线示于图48E中。如针对非-UV可裂解肽所观察，在递增MHCI浓度下观察到ELISA OD有所增加并且其值在1μg/mL下开始饱和(图48E)。所有条件化MHCI配体在不同等位基因中的ELISA S/N示于图48F-48H中。在位置2处具有J氨基酸取代的所有条件化MHCI配体变体均显示非常低的S/N ELISA值(图48F-H)，从而指示相对于亲代肽，MHC复合物(A0203-02-01、B3503-05-01、C0202-03-01和C0202-03-04)(图48E-48F，灰色条)形成最少或没有形成。该发现可以预期，这是因为已知该位置是MHCI-肽锚定位置。针对A0203-02和B3503-04筛选的所有其他条件化MHCI配体均产生类似于亲代肽的S/N值(图48F-48G)。相比之下，C0202-02的所有条件化MHCI配体的OD值均低于亲代；然而，C0202-02-02和C0202-02-03的S/N仍相对较高(分别为6和8)(图48H)，从而指示UV可裂解氨基酸对MHCI稳定性具有轻微负面影响。然后选择产生最高S/N值的条件化MHCI配体(A0302-02-02、B3503-04-02和C0202-03-03)进行扩大产生。执行类似分析以鉴定A*26:01、B*18:01和C*14:02等位基因的最佳条件化MHCI配体(图54A-54F)。
MHCI单体的扩大再折叠和纯化。在20多年前首次开发了经由在目的肽存在下再折叠从大肠杆菌包涵体中纯化的变性B2M和HLA来生成重组MHCI复合物。从初始报导以来，已开发了许多研究和方法来使用再折叠方案生成和纯化MHCI复合物。这些方法中的大部分包括下列过程的一定变化形式：(1)在具有氧化还原/氧化剂的通用再折叠缓冲液中混合HLA和B2M与肽(孵育时间可为1-5天)，(2)过滤再折叠材料以去除聚集体，(3)浓缩至与尺寸排阻色谱法(SEC)相容的体积(取决于柱为1-2mL)，(4)使用SEC纯化，(5)使经纯化的再折叠MHCI复合物生物素化，以及(6)在生物素化反应之后纯化MHCI复合物(SEC、旋转柱过滤器等)。这些产生方法中的大部分仅以1L规模或更小规模实践并且仅产生几毫克再折叠材料；因此，需要多个产生运行来产生用于支持临床项目的足够材料。多个运行可潜在地产生批次间可变性，这可混淆下游四聚体染色数据的诠释。为解决这些限制，开发了使得能够将MHCI再折叠和纯化以扩大至15L的新的工作流程。
此研究中所开发的再折叠和纯化方案的示意图示于图49中。为达成方法优化，使用公开的HLA-A*02:01特异性条件化MHCI配体。扩大产生的主要限制是需要SEC纯化步骤，该步骤需要高度浓缩的样品。另外，通常对经纯化的再折叠MHCI复合物执行生物素化步骤并且需要二级纯化步骤，这会进一步限制扩大产生。为解决这些限制，开发了三-步产生过程，其包括再折叠反应、过程中生物素化和阴离子交换色谱纯化(图49)。MHCI复合物的HLA组分在生物素化步骤之前和之后的LC/MS分析示于图50A中。黑色线显示生物素化前的HLA蛋白。在34812Da和34943Da下观察到两个峰，其对应于具有和不具有N-末端甲硫氨酸基团的HLA蛋白。该两个群体可能是通过不完全修饰并且随后分别通过甲酰甲硫氨酸脱甲酰酶和甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)去除甲酰甲硫氨酸和N-末端甲硫氨酸所产生，该去除可取决于邻近的氨基酸而有所变化并且在一些情况下不去除N-末端甲硫氨酸。因此，N-末端HLA序列可能不适用于总MAP活性，所以仅观察到部分N-末端去除。在生物素化之后观察到，两个峰的质量增加约244Da，此对应于生物素质量(图50A)。未观察到非生物素化质量下的残余峰，从而指示100％生物素化。这些组合结果证实，可采用过程中生物素化步骤来消除两个纯化步骤的需要。
在完成生物素化步骤之后，将所得生物素化反应液缓冲液交换至25mM Tris(pH8.0)中并且备用于经由阴离子交换色谱的纯化。选择阴离子交换用于SEC上的纯化，因为它易于直接装载用于生物素化步骤期间的较大体积(10-100mL)。1L再折叠的代表性Q-HP阴离子色谱图和梯度示于图50B中。在约130mL的洗脱体积下观察到较大峰以及若干较小峰，这些较小峰可能代表来自包涵体纯化的较少污染物。在SDS-PAGE上运行来自主峰的馏分，并且跨峰观察到对应于HLA-A*02:01和B2M的预期MW的带(图50C)。基于在SDS-PAGE分析中在HLA和B2M的预期分子量下存在带来汇集馏分并在LC/MS和SEC-MALS上运行。经纯化的生物素化MHCI复合物的TIC色谱图示于图50D中。滞留时间1.7min和1.75min下的两个毗邻峰对应于使用外消旋UV氨基酸产生的条件化MHCI配体的R和S非对映异构体。滞留时间1.8min和2.2min下的峰分别对应于B2M和HLA-A*02:01。生成B2M和HLA-A*02:01的标准曲线，并且使用曲线下面积来量化B2M与HLA的莫耳浓度和莫耳比率。若再折叠过程使得B2M与HLA适当配对，两种组分的莫耳比率应接近1。在此制备中，该比率经计算为0.95，从而表明已适当配对。通过SEC-MALS进一步分析MHCI复合物以供天然质量分析，从而进一步证实适当的1:1HLA:B2M配对以及样品单分散性。A280 SEC色谱图峰高度对称(指示均质并且单分散的蛋白质样品)，并且未观察到聚集体峰(图50E)。跨MHCI峰的MW在48.8kDa至51.3kDa之间(图50E，红色虚线)并且平均值为49.1kDa，其接近MHCI复合物的预期MW(48.1kDa)。LC/MS和SEC-MALS分析共同表明，再折叠和纯化方案会产生高纯并且适当折叠的MHCI复合物(图50F)。
开发了新的纯化工作流程的主要目标中的一者在于使得能够扩大产生。为测试可扩展性，在5L(200mg)和15L(600mg)规模下执行优化的1L(40mg HLA和B2M起始材料)方案。在这些产生规模下通过计算相对于添加至再折叠反应中的材料的质量的最终经纯化再折叠材料的质量来量化再折叠(产率％±标准偏差)(图50F)。有趣的是，据观察，随着该过程从1L(约6％)扩大至5L(约8％)至15L(约11％)，平均产率％逐渐增加并且发现1L规模与15L规模之间的产率差在统计学上较为显著(p-值<0.05)。从1L规模和15L规模生成的MHCI复合物的量分别为约2.4mg和约60mg，这对应于在15L规模下每个再折叠的材料生成增加25倍。这些组合发现证实，可使用此研究中所述的工作流程来扩大MHCI复合物的产生和纯化。
6种MHCI单体与从HTP筛选鉴定的UV肽的扩大产生和肽交换分析。应用上述再折叠和纯化方案以使用HTP筛选中所鉴定的条件化MHCI配体来大规模产生MHCI复合物。所有6种构建体的Q-HP阴离子色谱图和所汇集馏分的相应SDS-PAGE示于图55A-F中。这些再折叠物的色谱图极类似于HLA-A*02:01(图50B)，并且在SDS-PAGE中具有清晰的HLA和B2M带。在SDS-PAGE上运行每个HLA等位基因的所汇集馏分并且观察到对应于HLA和B2M的高纯带(图51A)。1L再折叠的产率％在样品间有所变化，其中A*02:03、B*18:01和C*02:02具有最高产率(在8％至11％之间)，随后是B*35:03(约5％)、C*14:02(约4％)和A*26:01(约2.5％)(图51B)。此可变性可能是因为氨基酸序列含量差异以及再折叠期间的聚集易感性以及肽形成稳定复合物的能力。尽管存在可变性，但2.5％的最低产率仍由1公升再折叠物产生1mg材料并且在15公升规模下者可扩大至>15mg，这足以涵盖>30,000种四聚体染色剂。执行LC/MS和SEC-MALS分析以进一步评估这些MHCI单体的品质并且评价B2M和HLA是否适当配对。B2M的LC/MS分析的结果：6种等位基因中的HLA比率示于图51C中。如针对HLA-A*02:01MHCI复合物所观察，所有这些样品的B2M:HLA比率均接近1。通过SEC-MALS进一步分析MHCI复合物以供完整的非变性状态质量分析。所分析的所有6种MHCI复合物的MHCI峰的平均MW示于图51D中。所有6种构建体的MW都在47.4kDa至48.8kDa之间，这完全在这些复合物的预期质量范围(47.5-48kDa)内。这些组合发现证实，再折叠方案和纯化工作流程不仅可广泛应用，而且在小规模HTP测定中所鉴定的条件化MHCI配体能够在扩大后形成稳定的MHCI复合物。
除鉴定可用于扩大产生MHCI单体的新的条件化MHCI配体外，还期望证实这些复合物可在UV暴露后发生肽交换以使得HTP能够生成MHCI复合物。在UV暴露后，用于测量条件化MHCI配体的肽交换的最广泛使用的方法中的一种为ELISA。尽管该测定已证实可用于证实UV暴露后的肽交换，但该测定是半定量的，并且既不直接测量经交换的肽也不允许量化所裂解的肽。为解决这些限制，开发了2D LC-MS分析方法以直接量化在交换过程期间加载至复合物中的肽。该测定的示意图示于图52A中。该方法中的第一步骤(第1维)是将肽交换反应混合物(暴露于UV后的MHCI复合物+100倍莫耳过量的经交换的肽)注射在分析型SEC柱上，这使得能够通过采样阀收集不含过量肽的MHCI复合物。第二步骤(第二维)是将从MHCI峰收集的材料注射在RP-HPLC上。RP-HPLC步骤的有机相可使HLA、B2M以及含于复合物内的肽解离和变性，这使得能够通过读取280nm下的吸光度和LC/MS来分析和量化MHCI复合物的单独组分。具有CMV pp65表位的对照HLA-A*02:01条件化MHCI配体的肽交换的第1维SEC色谱图的实例示于图52B中。色谱图显示对应于MHCI复合物的一个主峰。在2.5min与3min之间始终观察到色谱图A280信号的波动，这对应于采样阀的打开和关闭。因为在第1维与第2维之间存在较大压力差，因此该波动可能与随着阀门打开和关闭压力的突然变化有关。第二维HPLC步骤的A280色谱图的实例示于图52C中。HLA和B2M峰清晰可见，但未观察到CMV pp65肽或条件化MHCI配体的A280峰，这是因为它们不含任何色氨酸或酪氨酸残基并且没有固有的A280吸光度。为分析肽组成，生成交换肽和未裂解的条件化MHCI配体的提取离子交换色谱图(图52D)。如所预计，观察到对应于CMV pp65肽的较大峰，从而指示成功的肽交换。然而，也观察到极低含量的完整的条件化MHCI配体。该结果表明，经纯化肽与条件化MHCI配体(其复合至MHCI分子并且通过2D LC/MS分析携带)具有类似质量的合成源污染物，或小部分条件化MHCI配体在处于复合物中时可经保护以免于UV裂解。当在不存在MHCI下裂解单独的肽时，也观察到该峰，从而表明其为污染物。无论如何，完整的条件化MHCI配体的相对分数极低(约1％)并且应对下游四聚体染色具有最小影响。执行相同的分析以验证是否存在经裂解的条件化MHCI配体，并且未检测到峰。通过采用2D LC/MS测定来分析肽交换，能够测量MHCI复合物中的肽含量在肽交换过程期间如何变化。据信，这是可用于更好地理解与肽交换相关的参数的有效工具，这些参数不能使用其他传统方法(例如ELISA)来量化。
然后使用该方法来评价使用扩大产生工作流程生成的MHCI复合物与在HTP小规模测定中所鉴定的新的条件化MHCI配体的肽交换。针对每种MHCI复合物，分别使用发现是小规模HTP筛选中的结合物的4-5种肽(图48B-D、54A-54C)以及一种已知非结合肽作为阳性对照和阴性对照。具有肽A0203-05的HLA-A*02:03的第一维SEC色谱图显示清晰单峰(图52E)。肽交换复合物的第二维HPLC A280色谱图还显示预期B2M和HLA峰(图52F)。在第二维的EIC分析中，观察到对应于A0203-05肽的提取质量的较大峰(图52G，黑色线)。
然而，类似于A*02:01和CMV pp65的肽交换，还观察到对应于完整的条件化MHCI配体的较小峰(图52G，虚线)。在所测试的所有条件化MHCI配体中都观察到该现象，并且指示在肽交换过程期间存在并且携带一些低含量污染物。值得注意的是，在所有情况下，污染物肽的总分数都小于1％。HLA-A*02:03MHCI复合物在与已知非结合物肽交换之后的第1维SEC色谱图示于图52H中。这些条件下的总峰面积低于使用肽结合物执行的肽交换过程时(图52E对52H)。另外，第二维中的A280 HPLC色谱图含有两个峰，但总峰面积远低于使用肽结合物时(图52F对图52I)。这些组合数据表明，在使用非结合物执行肽交换时，存在显著的材料损失，这可能是因为蛋白质聚集。
有趣的是，在所测试的所有等位基因中针对阴性对照交换样品始终观察到在SEC运行结束时的峰(图52H，滞留时间约为3.6min)，据信这是因为部分变性的HLA与柱发生相互作用。最后，在EIC分析中，未观察到对应于A0203非结合肽的峰，从而指示没有发生肽交换(图52J)。令人吃惊的是，尽管没有肽与复合物缔合，但在第1维中观察到相对显著的A280峰，只是该峰远小于使用肽交换观察的峰。这些结果表明，一些复合物在不存在肽下保持缔合，但可能具有较低品质并且并不适当折叠。
第一维和第二维数据的量化示于图53A-53F中。在该分析中，评估在交换之后回收在第1维(SEC)中的A280 MHCI峰的分数以及在第2维(EIC)中是否存在经交换肽。图53A-53F显示在4-5种阳性对照和1种阴性对照中不同MHCI复合物的所回收的A280 MHCI峰的分数(绘制为相对于非肽交换对照的比率)。在第二维中检测所有测试肽(不相关肽除外)。对于HLA-A*0203，阳性对照结合肽的回收分数为0.9至1并且在第二维中针对所有肽均观察到交换肽。如上所述，阴性对照的回收分数仍相对较高(约0.76)，即使没有观察到经交换的肽、经裂解的条件化MHCI配体以及极低含量的完整的条件化MHCI配体(<1％)。这表明，复合物在不存在肽下在一定时段内保持一定程度的完整，但考虑到HLA等位基因在不存在肽下的不稳定性其可能没有适当折叠。
针对A*26:01(图53B)、B*18:01(图53C)、B*35:03(图53D)和C*14:02(图53F)观察到类似结果。在所有情况下，第一维中的阳性对照与阴性对照之间的峰面积差均小于20％-25％。相比之下，阴性对照和阳性对照针对C*02:02具有显著差异(图52E)。对于该样品而言，在已知非结合肽包括在肽交换中时，约80％的材料发生降解。尽管该现象的确切原因未知，但其可能是因为在已从HLA上的肽凹槽去除肽时不同等位基因能够保持与B2M缔合。无论如何，这些组合结果明确指示，已鉴定允许扩大产生MHCI肽并且随后发生肽交换以HTP生成MHCI单体和四聚体的条件化MHCI配体。
结论。需要开发用于扩大针对其鉴定条件化MHCI配体的HLA等位基因数量的工作流程，从而改善患者对CI/IO疗法应答的MHCI四聚体分析的覆盖范围。该手稿中所概述的方法提供了扩展至宽范围的HLA等位基因的蓝图。使用该工作流程选择的所有条件化MHCI配体均在扩大时产生相对高产率和高品质的条件化MHCI复合物。基于该研究的组合发现，据信，该方式可普遍适用并且使得能够在较宽范围的HLA等位基因中HTP生成MHCI单体和四聚体，这对于使得能够在临床中使用MHCI四聚体来监测新抗原特异性T细胞至关重要。
上述说明书中所提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已结合特定的优选实施例描述了本发明，但应理解，所要求保护的本发明不应过度地限于此类具体实施例。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说是显而易见的，均旨在本申请的范围内。
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Claims (99)

1.一种主要组织相容性复合物I类(MHCI)/配体复合物，其包含(i)含有α链、β链的MHCI分子和(ii)配体，其中所述配体为包含非天然UV-可裂解氨基酸的肽。
2.根据权利要求1所述的MHCI/配体复合物，其中所述α链为由下列基因座中的任一者编码的α链：HLA-A、HLA-B或HLA-C。
3.根据权利要求1所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度在8个与11个氨基酸之间。
4.根据权利要求3所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度为8个氨基酸。
5.根据权利要求3所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度为9个氨基酸。
6.根据权利要求3所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度为10个氨基酸。
7.根据权利要求3所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度为11个氨基酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的MHCI/配体复合物，其中所述UV-可裂解氨基酸。
9.根据权利要求8所述的MHCI/配体复合物，其中所述UV-可裂解氨基酸选自：2-硝基苯基甘氨酸(NPG)、扩展邻-硝基苄基接头、邻-硝基苄基笼型酚、邻-硝基苄基笼型硫醇、32硝基藜芦基氧基羰基(NVOC)笼型苯胺、邻-硝基苄基笼型硒化物、双-偶氮苯、香豆素、肉桂基、螺吡喃、2-硝基苯基丙氨酸(2-nF)和3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸(ANP)氨基酸类似物。
10.根据权利要求9所述的MHCI/配体复合物，其中所述UV-可裂解氨基酸包括3-氨基-3-(2-硝基苯基)-丙酸酯(ANP)氨基酸类似物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的MHCI/配体复合物，其中所述UV-可裂解氨基酸在所述配体内的任何位置。
12.根据权利要求1至11所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体包含SEQ ID NO.：1至SEQ ID NO.：34中的任一者的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的MHCI/配体复合物，其中所述α链和所述配体包含HLA等位基因和氨基酸序列的下列组合中的任一者：
等位基因 序列 A*02：03 FMYJDFHFI A*02：06 FLPJDFFPSV A*02：07 FLPSDJFPSV A*23：01 FYIQMJTEL A*26：01 YVIJDLAAM A*29：02 HFFJWGTMF A*30：01 AVVSLJRLLK A*30：02 GTHJLLPFY A*31：01 AMLTAJFLR A*32：01 HLMFYJLPI A*68：01 QLFJFSPRR A*68：02 TJFFYRYGFV B*18：01 DEFJPIVQY B*35：03 TPAJYFHVL B*40：01 RESFGJESF B*40：02 AENJYVTVF B*40：06 KEVLVLWJI B*46：01 FMYEGJTPL B*51：01 FPFJLAAII B*53：01 FPIPSJWAF B*57：01 ITAAAWYJW B*58：01 LAVMGJAAW C*01：02 HLPJGVKSL C*02：02 FAAEAJKL C*03：02 GAINSJLPY C*03：03 FAIVPJLQI C*05：01 FAMJVPLLI C*06：02 ARFJDLRFV C*07：01 ANNJRLWVY C*08：01 YAAJTNFLL C*08：02 lSDSAJNMM C*12：03 WAWJFAAVL C*14：02 MMHJSTSPF C*15：02 RTFGQJLFF
。
14.一种用于确定主要组织相容性复合物I类(MHCI)等位基因与测试肽的结合的肽交换测定，其包括：
(a)提供包含测试肽和MHCI/配体复合物的第一组合物，所述MHCI/配体复合物包含(i)含有α链、β链的MHCI分子和(ii)配体，其中所述配体为包含非天然紫外线(UV)-可裂解氨基酸的肽；
(b)将所述第一组合物暴露于UV光以在所述UV-可裂解氨基酸处裂解所述配体；以及
(c)将所述第一组合物孵育一定时间段以形成包含游离测试肽、所述α链、所述β链和/或MHCI/-第二肽复合物的第二组合物；以及
(d)确定所述MHCI等位基因是否与所述第二肽结合。
15.根据权利要求14所述的肽交换测定，其中通过测量所述第二组合物中的MHCI/肽复合物的水平来确定MHCI等位基因与所述肽的结合。
16.根据权利要求15所述的肽交换测定，其中通过所述第二组合物的2维液相色谱-质谱(2D LC/MS)来测量MHCI/第二肽复合物的水平。
17.根据权利要求16所述的肽交换测定，其中2D LC/MS包括从所述第二组合物去除游离第二肽。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的肽交换测定，其进一步包括进行高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)以区分所述MHCI和所述第二肽。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的肽交换测定，其中通过经由尺寸排阻色谱的分离从所述第二组合物去除所述游离第二肽。
20.根据权利要求18或19所述的肽交换测定，其中如通过HPLC和MS所确定的所述第二肽的存在指示所述MHCI能够与所述第二肽结合。
21.根据权利要求14至20中任一项所述的肽交换测定，其中将多个所述MHCI/配体复合物与至少两种不同测试肽进行组合。
22.根据权利要求21所述的肽交换测定，其中所述测试肽通过质谱基于每种肽的预测质量来进行鉴定。
23.根据权利要求14至22中任一项所述的肽交换测定，其中所述测试肽以至少10:1(测试肽:MHCI)的比率存在于所述第一组合物中。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的肽交换测定，其中所述MHCI/配体复合物为根据权利要求1至13中任一项所述的MHCI/配体复合物。
25.根据权利要求14至24中任一项所述的肽交换测定，其中所述MHCI/肽复合物进一步包含第一标记物，由此形成经标记的MHCI/肽复合物。
26.根据权利要求25所述的肽交换测定，其中通过以下来确定肽交换的水平：
(a)使经标记的MHCI/配体肽复合物与以下接触：
(i)抗体复合物，其包含共价连接至荧光共振能量转移(FRET)受体的抗MHCI等位基因抗体；和
(ii)FRET发射体复合物，其包含与第二标记物缀合的FRET发射体，由此形成反应组合物；
(b)检测所述反应组合物中的所述第二标记物的FRET发射，由此检测MHCI等位基因与肽的结合。
27.根据权利要求26所述的肽交换测定，其中将所述反应组合物孵育至少约10小时。
28.根据权利要求26所述的肽交换测定，其中将所述组合物孵育至少约15小时。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的肽交换测定，其中所述第一标记物为链霉亲和素。
30.根据权利要求26至28中任一项所述的肽交换测定，其中所述抗MHCI等位基因抗体包含抗HLA抗体、单体或部分抗体。
31.根据权利要求29所述的肽交换测定，其中所述第二标记物为生物素。
32.根据权利要求26至28中任一项所述的肽交换测定，其中所述第一标记物为生物素。
33.根据权利要求32所述的肽交换测定，其中所述第二标记物为链霉亲和素。
34.根据权利要求26至33中任一项所述的肽交换测定，其中来自所述FRET受体的发射指示所述测试肽与所述MHCI的结合。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的肽交换测定，其中所述MHCI与所述测试肽的结合通过第二肽交换测定来证实。
36.根据权利要求35所述的肽交换测定，其中所述第二肽交换测定为根据权利要求15至16中任一项所述的肽交换测定。
37.根据权利要求26至35中任一项所述的肽交换测定，其中通过TR-FRET来确定与所述MHCI分子结合的测试肽的量。
38.一种检测主要组织相容性复合物I类(MHCI)等位基因与测试肽的结合的方法，所述方法包括：
(a)提供包含测试肽和MHCI/配体复合物的第一组合物，所述MHCI/配体复合物包含(i)含有α链、β链的MHCI分子和(ii)配体，其中所述配体为包含非天然紫外线(UV)-可裂解氨基酸的肽；
(b)将所述第一组合物暴露于UV光以在所述UV-可裂解氨基酸处裂解所述配体；以及
(c)检测所述第二组合物中的MHCI/测试肽复合物，由此检测所述MHCI分子与所述测试肽的结合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中(c)中的所述检测包括检测MHCI/肽复合物相对于对照的水平。
40.根据权利要求39所述的方法，其中通过2维液相色谱-质谱(2DLC/MS)来检测所述MHCI/测试肽复合物的水平。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第二组合物在适用于2DLC/MS的器皿中。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中从所述第二组合物去除所述游离测试肽。
43.根据权利要求42所述的方法，其中通过尺寸排阻色谱从所述第二组合物去除所述游离测试肽。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其中(c)中的所述检测进一步包括高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)以区分所述MHCI分子和所述测试肽。
45.一种鉴定MHCI结合配体的方法；所述方法包括：
(a)使多个MHCIα链单体与多个β链单体和配体在允许形成MHCI/配体复合物的条件下接触，其中所述配体为包含非天然UV-可裂解氨基酸的肽；以及
(b)检测所述MHCI/配体复合物，由此鉴定MHCI结合配体。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述MHCIα链单体为变性和/或未折叠的MHCIα链单体。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述接触进行至少48小时。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述配体为多个配体。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述多个配体中的每个配体包含不同氨基酸序列。
50.根据权利要求45至49中任一项所述的方法，其中所述检测包括(i)使所述MHCI/配体复合物与连接至固体支持物的抗MHCIα链抗体结合，由此形成结合的MHCI/配体复合物；(ii)使所述结合的MHCI/配体复合物与经标记的抗β链抗体接触，由此形成结合的经标记的MHCI/配体复合物；以及(iii)检测所述结合的经标记的MHCI/配体复合物。
51.根据权利要求50所述的方法，其进一步包括在(iii)中的所述检测之前去除游离的经标记的抗β链抗体。
52.一种用于确定最佳的主要组织相容性复合物I类(MHCI)等位基因-配体组合的方法，所述方法包括：
(a)提供在变性条件下纯化的多个MHCIα链单体；
(b)通过组合所述多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体来形成反应混合物，所述配体包含含有非天然UV-可裂解氨基酸的肽；
(c)在允许形成MHCI/配体复合物的条件下孵育所述混合物；以及
(d)确定是否形成了所述MHCI/配体复合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中将所述多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育至少48小时。
54.根据权利要求52所述的方法，其中将所述多个MHCIα链单体、多个β链单体和配体孵育约5天。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中筛选多个配体，其中每个配体包含氨基酸序列，其中每个配体的所述氨基酸序列与每个其他配体的氨基酸序列的区别仅在于所述UV-可裂解氨基酸在序列中的位置。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中步骤d)包括进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述ELISA包括(i)将所述反应混合物引入容器中，所述容器包括表面以及与所述表面缀合的抗MHCIα链抗体；(ii)将包含可检测标记物的经标记的抗β链抗体引入所述容器中，使得所述经标记的抗β链抗体结合如果存在的所述β链单体；(iii)洗涤以去除未结合的经标记的抗β链抗体；以及(iv)检测所述容器中所述可检测标记物的存在情况。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述可检测标记物包含生物素或肽标签。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述可检测标记物包含生物素。
60.根据权利要求57所述的方法，其中步骤(iv)包括将链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物引入所述容器中并且一经添加HRP底物即确定化学发光的水平。
61.根据权利要求57至60中任一项所述的方法，其中所述容器为多孔板的孔。
62.根据权利要求45至61中任一项所述的方法，其中针对至少两个配体单独进行步骤a)至d)，其中步骤d)包括确定MHCI/配体复合物形成的水平，其中具有MHCI/配体复合物形成的最大水平的配体为用于MHCI等位基因的最佳MHCI/配体组合。
63.一种包含非天然UV-可裂解氨基酸的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO.:1至SEQ IDNO.:34中的任一者的氨基酸序列。
64.一种监测样品中的经肽交换的主要组织相容性I类(MHCI)复合物的方法，其包括：
(a)获得包含目的肽的经肽交换的MHCI复合物；
(b)对所述经肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及
(c)在(b)的所述色谱或毛细管电泳后，对所述MHCI复合物进行非变性质谱(MS)以鉴定包含目的肽的MHCI复合物。
65.一种监测样品中的经肽交换的主要组织相容性I类(MHCI)复合物的方法，其包括：
(a)获得包含可交换肽的MHCI复合物并将所述复合物在允许所述交换肽与所述目的肽之间的肽交换的条件下暴露于一种或多种目的肽；
(b)对所述经肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及
(c)在(b)的所述色谱或毛细管电泳后，对所述MHCI复合物进行非变性质谱(MS)以鉴定包含目的肽的MHCI复合物。
66.一种监测MHCI-复合肽的T细胞识别的方法，其包括：
(a)获得包含目的肽的经肽交换的MHCI复合物；
(b)使所述经肽交换的MHCI复合物与包含T细胞的样品接触；
(c)使结合T细胞的MHCI复合物与未结合的MHCI复合物分离；
(d)对所述经肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及
(e)在(d)的所述色谱或毛细管电泳后，对所述MHCI复合物进行非变性质谱(MS)以鉴定包含由来自所述样品的T细胞识别的肽的MHCI复合物。
67.一种监测MHCI-复合肽的T细胞识别的方法，其包括：
(a)获得包含可交换肽的主要组织相容性I类(MHCI)复合物并将所述复合物在允许肽交换的条件下暴露于一种或多种目的肽；
(b)使所述经肽交换的MHCI复合物与包含T细胞的样品接触；
(c)使结合T细胞的MHCI复合物与未结合的MHCI复合物分离；
(d)对所述经肽交换的MHCI复合物进行尺寸排阻色谱(SEC)、毛细管电泳(CE)或毛细管区带电泳(CZE)；以及
(e)在(d)的所述色谱或毛细管电泳后，对所述MHCI复合物进行非变性质谱(MS)以鉴定包含由来自所述样品的T细胞识别的肽的MHCI复合物。
68.根据权利要求66或67所述的方法，其中通过流式细胞术使结合T细胞的MHCI复合物与未结合的MHCI复合物分离。
69.根据权利要求1至68中任一项所述的方法，其中所述样品为生物流体样品。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述样品为全血或血浆样品。
71.根据权利要求64至70中任一项所述的方法，其中所述样品包含一种或多种以合成方式产生的目的肽。
72.根据权利要求64至71中任一项所述的方法，其中所述MHCI复合物为人MHCI复合物。
73.根据权利要求64至72中任一项所述的方法，其中所述样品来自MHCI文库或阵列。
74.根据权利要求64至73中任一项所述的方法，其中所述方法包括对所述经肽交换的MHCI复合物进行SEC。
75.根据权利要求74所述的方法，其中注入2μL至10μL诸如3μL至6μL或4μL至5μL的体积以用于非变性MS分析。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述非变性MS紧跟于所述SEC之后。
77.根据权利要求64至73中任一项所述的方法，其中所述方法包括对所述经肽交换的MHCI复合物进行CE。
78.根据权利要求64至73中任一项所述的方法，其中所述方法包括对所述经肽交换的MHCI复合物进行CZE。
79.根据权利要求77或78所述的方法，其中经交换的肽在100μg/mL或更低、50μg/mL至500μg/mL、50μg/mL至200μg/mL、100μg/mL至200μg/mL或50μg/mL至100μg/mL的浓度是可检测到的。
80.根据权利要求77、78或79所述的方法，其中注入2nl至100nl诸如2nl至50nL、2nl至10nL、3nl至10nL或3nl至5nL的体积以用于非变性MS分析。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的方法，其中所述非变性MS紧跟于所述CE或CZE之后。
82.根据权利要求64至81中任一项所述的方法，其中所述方法允许确定并定量至少一种目的肽已交换至所述MHCI复合物中的程度。
83.根据权利要求64至82中任一项所述的方法，其中非变性MS包括表征与所述MHCI复合物结合的所述目的肽的结构或序列。
84.根据权利要求64至83中任一项所述的方法，其中所述非变性MS为串联MS(“MS/MS”)(诸如多反应监测(MRM)、单离子监测(SIM)、三重四级杆(TSQ)、四级杆/飞行时间(QTOF)、四极杆线性离子阱(QTRAP)、混合离子阱/FTMS、飞行时间/飞行时间(TOF/TOF)或时间串联MS/MS)。
85.根据权利要求64至83中任一项所述的方法，其中所述非变性MS包括电喷雾离子化至轨道阱MS仪器中。
86.根据权利要求64至85中任一项所述的方法，其中所述色谱或电泳以及非变性MS在乙酸铵或叶酸铵缓冲液中进行，并且/或者其中所述缓冲液不包括TRIS或PBS。
87.一种试剂盒，其包含含有非天然UV-可裂解氨基酸的肽、MHCIα链单体和MHCIβ链单体。
88.根据权利要求87所述的试剂盒，其中所述MHCIα链单体是变性的。
89.根据权利要求87或88所述的试剂盒，其中所述MHCIβ链单体是变性的。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的试剂盒，其中所述MHCIα链和/或所述MHCIβ链包含标签。
91.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述标签为链霉亲和素。
92.根据权利要求87至91中任一项所述的试剂盒，其进一步包含抗HLA抗体。
93.根据权利要求87至92中任一项所述的试剂盒，其进一步包含抗B2M抗体。
94.根据权利要求87至93中任一项所述的试剂盒，其中所述肽包含SEQ ID NO.:1至SEQID NO.:34中的任一者的氨基酸序列。
95.一种体系，其包含：
(a)肽，其包含非天然UV-可裂解氨基酸；
(b)多个MHCIα链单体；
(c)多个MHCIβ链单体；
(d)和第一试剂，其能够允许形成MHCI/配体复合物。
96.根据权利要求95所述的体系，其进一步包含能够结合MHCIα链单体的第二试剂。
97.根据权利要求96所述的体系，其中所述第二试剂包含抗HLA抗体。
98.根据权利要求95至97中任一项所述的体系，其进一步包含能够结合MHCIβ链单体的第三试剂。
99.根据权利要求98所述的体系，其中所述第三试剂为抗B2M抗体。
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