PT1919503E

PT1919503E - Identificação e manipulação de anticorpos com a regiões de fc variantes e métodos de utilização dos mesmos

Info

Publication number: PT1919503E
Application number: PT68011469T
Authority: PT
Inventors: Jeffery Stavenhagen; Sergey Gorlatov; Christopher Rankin; Nadine Tuaillon
Original assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2005-08-10
Filing date: 2006-08-10
Publication date: 2015-01-05
Also published as: CA2618681C; EP2573114A1; DK2573114T3; EP1919503B1; IL189263A0; WO2007021841A3; AU2006279945A1; PL2573114T3; SI2573114T1; EP2573114B1; LT2573114T; ES2579602T3; US8697071B2; WO2007021841A2; CA2618681A1; EP1919503A4; US8217147B2; JP5105485B2; IL189263B; US20070036799A1

Description

DESCRIÇÃO "IDENTIFICAÇÃO E MANIPULAÇÃO DE ANTICORPOS COM A REGIÕES DE FC VARIANTES E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO DOS MESMOS"

1. DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a moléculas, particularmente a polipeptídeos, mais particularmente, imunoglobulinas (por exemplo anticorpos), que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando a FcyRIIIA com uma maior afinidade, em relação a uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem. As moléculas da presente invenção são particularmente úteis na prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados com uma doença, distúrbio ou infeção. As moléculas da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio em que uma eficácia melhorada da função das células efetoras (por exemplo, ADCC) mediada por FcyR é desejada, por exemplo, no cancro, doenças infecciosas e no aumento da eficácia terapêutica dos anticorpos terapêuticos cujo efeito é mediado por ADCC.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 2.1 Recetores e seus papéis no sistema imunológico A interação de complexos anticorpo-antigeno com as células do sistema imune resulta em uma ampla gama de respostas, que vão desde as funções efetoras, tais como citotoxicidade dependente do anticorpo, a desgranulação dos mastócitos, e fagocitose aos sinais imunomoduladores, tais como a regulação da proliferação de linfócitos e secreção de anticorpos. Todas estas interações são iniciadas através da ligação do domínio Fc de anticorpos ou de complexos imunes a recetores da superfície celular especializados sobre células hematopoiéticas. A diversidade de respostas celulares desencadeadas por anticorpos e complexos imunes resulta da heterogeneidade estrutural dos recetores de Fc. Os recetores de Fc partilham domínios de ligação de ligantes estruturalmente relacionados que, presumivelmente medeiam a sinalização intracelular.

Os recetores de Fc, os membros da superfamília dos genes da imunoglobulina de proteínas, são glicoproteínas de superfície que se podem ligar à porção Fc das moléculas de imunoglobulina. Cada membro da família reconhece as imunoglobulinas de um ou mais isotipos através de um domínio de reconhecimento na cadeia α do recetor de Fc. Recetores de Fc são definidos pela sua especificidade para subtipos de imunoglobulinas. Os recetores de Fc para IgG são referidos como FcyR, para IgE como FsR, e para IgA como FcaR. Diferentes células acessórias suportam recetores Fc para anticorpos do isotipo diferente, e o isotipo do anticorpo determina quais as células acessórias que serão envolvidas numa dada resposta (revisto por Ravetch JV et al 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. et al. 2001 Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. et al. 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2(109) : 161-1681; Ravetch J.V. et al. 2000, Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. et al., 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. 1994, Cell, 78(4) : 553-60) . Os diferentes recetores Fc, as células que os expressam e sua especificidade de isotipo é resumida na Tabela 1 (adaptada de humunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, Nova Iorque).

Recetores Fey

Cada membro desta família é uma glicoproteína de membrana integral, possuindo domínios extracelulares relacionados a um conjunto C2 de domínios relacionados com a imunoglobulina, um domínio de expansão de membrana única e um domínio intracitoplasmático de comprimento variável. Existem três FcyRs conhecidos, designados FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII (CD16) . Os três recetores são codificados por genes distintos; no entanto, a extensa homologia entre os três membros da família sugere que surgiu a partir de um antepassado comum, talvez por duplicação de genes.

FcyRII(CD 32)

As proteínas FcyRII são glicoproteínas de membrana integrante 40 kDa que se ligam apenas ao IgG complexado devido a uma baixa afinidade para com Ig monomérica (106 M~ λ). Este recetor é o FcyR mais amplamente expresso, presente em todas as células hematopoiéticas, incluindo monócitos, macrófagos, células B, células NK, neutrófilos, mastócitos e plaquetas. FcyRII tem apenas duas regiões semelhantes a imunoglobulina na sua cadeia de ligação à imunoglobulina e, consequentemente, uma afinidade muito mais baixa para IgG do que FcyRI . Há três genes humanos FcyRII (FcyRII-A, FcyRII-B, FcyRII-C), todos os quais se ligam a IgG em complexos agregados ou imunes.

Diferenças distintas dentro dos domínios citoplasmáticos de FcyRII-A e FcyRII-B criam duas respostas funcionalmente heterogéneas para a ligação do recetor. A diferença fundamental é que a isoforma A inicia a sinalização intracelular que conduz à ativação da célula, tais como fagocitose e a explosão respiratória, enquanto a isoforma B inicia sinais inibidores, por exemplo, inibindo a ativação de células-B. A sinalização através FcyRs

Tanto os sinais de ativação como de inibição são transduzidas através da ligação seguinte de FcyRs. Estas funções diametralmente opostas resultam de diferenças estruturais entre as diferentes isoformas do recetor. Dois domínios distintos dentro dos domínios de sinalização citoplasmáticos do recetor denominados motivos de ativação à base do imunorecetor tirosina (ITAMs) ou motivos de inibição à base do imunorecetor tirosina (ITIMS) têm em consideração as diferentes respostas. 0 recrutamento de diferentes enzimas citoplasmáticas para estas estruturas dita o resultado das respostas celulares mediadas por FcyR. Complexos de FcyR contendo ITAM incluem FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, enquanto que os complexos contendo ITIM apenas incluem FcyRIIB.

Os neutrófilos humanos expressam o gene FcyRIIA. 0 agrupamento FcyRIIA através de complexos imunes ou anticorpos específicos de reticulação serve para agregar ITAMs juntamente com cinases associadas ao recetor que facilitam a fosforilação ITAM. A fosforilação ITAM serve como um local de encaixe para a cinase Syk, cuja ativação resulta na ativação de substratos a jusante (por exemplo, PI3K). A ativação celular conduz à libertação de mediadores pró-inflamatórios. 0 gene FcyRIIB é expresso em linfócitos B; o seu domínio extracelular é 96% idêntica ao FcyRIIA e liga-se a complexos de IgG de forma indistinguível. A presença de um ITIM no domínio citoplasmático de FcyRIIB define esta subclasse inibidora de FcyR. Recentemente foi criada a base molecular desta inibição. Quando coligadas, juntamente com um FcyR de ativação, o ITIM em FcyRIIB torna-se fosforilado e atrai o domínio SH2 do inositol polifosfato 5'-fosfatase (SHIP), que hidrolisa mensageiros fosfoinositol libertados em consequência da ativação de cinase de tirosina mediada por FcyR contendo ITAM, consequentemente, prejudicando o fluxo de Ca++ intracelular. Assim, a reticulação de FcyRIIB amortece a resposta de ativação para a ligação de FcyR e inibe a capacidade de resposta celular. A ativação de células B, a proliferação de células B e a secreção de anticorpos é assim abortada.

2.2 DOENÇAS DE RELEVÂNCIA

2.2.1 CANCRO

Um neoplasma, ou tumor, é uma massa neoplástica, resultante do crescimento descontrolado anormal de células, que podem ser benignas ou malignas. Os tumores benignos geralmente permanecem localizados. Os tumores malignos são chamados coletivamente de cancros. 0 termo "maligno", em geral, significa que o tumor pode invadir e destruir as estruturas do corpo vizinhas e espalhar-se para locais distantes de modo a causar a morte (para revisão, ver Robbins e Angell, 1976, Basic Pathology, 2a Ed., WB Saunders Co., Filadélfia, pp. 68-122). 0 cancro pode surgir em muitos locais do corpo e se comportar de forma diferente dependendo da sua origem. As células cancerosas destroem a parte do corpo em que se originam e depois espalham-se para outra (s) parte (s) do corpo onde começam um novo crescimento e causam mais destruição.

Mais de 1,2 milhões de americanos desenvolvem cancro a cada ano. 0 cancro é a segunda causa principal de morte nos Estados Unidos e se as tendências atuais continuarem, espera-se que o cancro seja a principal causa de morte até ao ano 2010. O cancro do pulmão e da próstata são os cancros assassinos de topo para os homens nos Estados Unidos. O cancro do pulmão e da mama são os cancros assassinos de topo para as mulheres nos Estados Unidos. Um em cada dois homens nos Estados Unidos será diagnosticado com cancro em algum momento durante a sua vida. Uma em cada três mulheres nos Estados Unidos será diagnosticada com cancro em algum momento durante a sua vida. A cura para o cancro ainda não foi encontrada. As opções de tratamento atuais, tais como a cirurgia, quimioterapia e tratamento de radiação, são, muitas vezes, ineficazes ou colocam efeitos secundários graves.

Terapia do Cancro

Actualmente, a terapia do cancro pode envolver cirurgia, quimioterapia, terapia hormonal e/ou tratamento com radiação para erradicar as células neoplásicas num paciente (Ver, por exemplo, Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", in Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Capitulo 12, Secção IV) . Recentemente, a terapia do cancro também poderia envolver a terapia biológica ou imunoterapia. Todas estas abordagens apresentam desvantagens significativas para o paciente. A cirurgia, por exemplo, pode ser contraindicada devido à saúde do paciente ou pode ser inaceitável para o paciente. Além disso, a cirurgia pode não remover completamente o tecido neoplásico. A terapia de radiação só é eficaz quando o tecido neoplásico exibe uma maior sensibilidade à radiação do que o tecido normal, e a terapia de radiação também pode provocar frequentemente efeitos secundários graves. A terapia hormonal raramente é dada como um único agente e, embora possa ser eficaz, é frequentemente usada para prevenir ou retardar a recorrência de cancro após outros tratamentos terem removido a maioria das células cancerígenas. As terapias biológicas/imunoterapias são limitadas em número e podem causar efeitos secundários, tais como erupções cutâneas ou inchaços, sintomas semelhantes aos da gripe, incluindo febre, calafrios e fadiga, problemas do aparelho digestivo ou reações alérgicas.

No que se refere à quimioterapia, existe uma variedade de agentes quimioterapêuticos disponíveis para tratamento de cancro. Uma maioria significativa dos agentes quimioterapêuticos do cancro atuam por inibição da síntese do ADN, quer direta, quer indiretamente através da inibição da biossintese dos precursores desoxirribonucleotideo-trifosfato, para impedir a replicação de ADN e divisão celular concomitante (Ver, por exemplo, Gilman et al, Goodman e Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a Ed. (Pergamom Press, Nova Iorque, 1990)). Estes agentes, que incluem agentes alquilantes, tais como nitrossoureia, anti-metabolitos, tais como metotrexato e a hidroxiureia e outros agentes, tais como etoposideo, campatecinas, bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, etc., embora não necessariamente específicos do ciclo celular, matam as células durante a fase S por causa do seu efeito sobre a replicação do ADN. Outros agentes, especificamente a colchicina e os alcaloides de vinca, tais como vinblastina e vincristina, interferem com a montagem de microtúbulos resultando na paragem da mitose. Os protocolos de quimioterapia geralmente envolvem a administração de uma combinação de agentes quimioterapêuticos utilizados para aumentar a eficácia do tratamento.

Apesar da disponibilidade de uma variedade de agentes quimioterapêuticos, a quimioterapia tem muitos inconvenientes (Ver, por exemplo, Stockdale, 1998, "Principles Of Cancro Patient Management" em Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein e Federman, eds. , cap. 12, sect. 10) . Quase todos os agentes quimioterapêuticos são tóxicos, e a quimioterapia provoca efeitos secundários significativos, e muitas vezes perigosos, incluindo náuseas, depressão da medula óssea, imunossupressão, etc. Além disso, até mesmo com administração de combinações de agentes quimioterapêuticos, muitas células de tumor são resistentes ou desenvolvem resistência aos agentes quimioterapêuticos. Na verdade, as células resistentes aos agentes quimioterapêuticos particulares usados no protocolo de tratamento, muitas vezes revelam-se resistentes a outros fármacos, mesmo aqueles agentes que atuam por mecanismos diferentes dos mecanismos de ação dos fármacos utilizados no tratamento especifico; este fenómeno é denominado de fármacos pleiotrópicos ou resistência a multifármacos. Assim, por causa da resistência aos fármacos, muitos cancros provaram ser refratários aos protocolos de tratamento quimioterapêuticos padrão.

Existe uma necessidade significativa de tratamentos alternativos do cancro, particularmente para o tratamento de cancro que se mostrou refratário aos tratamentos de cancro convencionais, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia e terapia hormonal. Uma alternativa promissora é a imunoterapia, na qual as células cancerígenas são especificamente orientadas pelos anticorpos específicos de antígenos do cancro. Grandes esforços têm sido dirigidos a aproveitar a especificidade da resposta imunitária, por exemplo, a tecnologia do hibridoma permitiu o desenvolvimento de anticorpos monoclonais seletivos de tumor (Ver Green M.C. et al, 2000 Cancer Treat Rev., 26: 269-286; Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26(supl. 14):43-51), e, nos últimos anos, a Food and Drug Administration aprovou os primeiros MAbs para terapia do cancro: Rituxin (anti-CD20) para o linfoma não-Hodgkin e

Herceptin [anti-(c-erb-2/HER-2) ] para o cancro de mama metastático (Suzanne A. Eccles, 2001, Breast Cancer Res, 3: 86-90). No entanto, a potência de função efetora do anticorpo, por exemplo, para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo ("ADCC") é um obstáculo a esse tratamento. Métodos para melhorar a eficácia de tais imunoterapia são, portanto, necessários. 2.2.2 Doenças inflamatórias e doenças autoimunes A inflamação é um processo pelo qual os leucócitos do corpo e produtos químicos protegem o corpo contra infeções por substâncias estranhas, tais como bactérias e vírus. É geralmente caracterizada por dor, inchaço, calor e vermelhidão da área afetada. Os agentes químicos conhecidos como prostaglandinas e citocinas controlam este processo, e são libertados numa cascata autolimitante e ordenada no sangue ou nos tecidos afetados. Esta libertação de produtos químicos aumenta o fluxo sanguíneo para a área de lesão ou infeção, e pode resultar na vermelhidão e calor. Alguns dos produtos químicos causam uma fuga de fluido para os tecidos, resultando em inchaço. Este processo de proteção pode estimular os nervos e causar dor. Essas mudanças, quando ocorrem durante um período limitado na área em questão, trabalham para o benefício do corpo.

Em doenças autoimunes e/ou inflamatórias, o sistema imunológico desencadeia uma resposta inflamatória quando não há substâncias estranhas contra as quais lutar e o sistema imune normalmente protetor do corpo é causa danos aos seus próprios tecidos ao se atacar a si mesmo por engano. Existem muitas doenças autoimunes diferentes que afetam o corpo de maneiras diferentes. Por exemplo, o cérebro é afetado em indivíduos com esclerose múltipla, o intestino é afetado em indivíduos com doença de Crohn e a membrana sinovial, o osso e a cartilagem de várias articulações são afetadas em indivíduos com artrite reumatoide. À medida que as doenças autoimunes progridem, pode resultar uma destruição de um ou mais tipos de tecidos do corpo, um crescimento anormal de um órgão, ou alterações na função de órgãos. A doença autoimune pode afetar apenas um órgão ou tipo de tecido ou pode afetar vários órgãos e tecidos. Os órgãos e tecidos comummente afetados por doenças autoimunes incluem os glóbulos vermelhos, vasos sanguíneos, tecidos conjuntivos, glândulas endócrinas (por exemplo, a tiroide ou pâncreas), músculos, articulações e pele. Exemplos de doenças autoimunes incluem, mas não estão limitadas a, tiroidite de Hashimoto, anemia perniciosa, doença de Addison, diabetes do tipo 1, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistémico, dermatomiosite, síndroma de Sjogren, dermatomiosite, lúpus eritematoso, esclerose múltipla, doença autoimune do ouvido interno miastenia grave, síndroma de Reiter, doença de Graves, hepatite autoimune, polipose adenomatosa familiar e colite ulcerosa. A artrite reumatoide (RA) e artrite reumatoide juvenil são tipos de artrite inflamatória. A artrite é um termo geral que descreve a inflamação nas articulações. Alguns, mas não todos, os tipos de artrite são o resultado de inflamação mal direcionada. Além da artrite reumatoide, outros tipos de artrite associada com a inflamação incluem o seguinte: artrite psoriática, síndrome de Reiter, artrite da espondilite anquilosante e artrite gotosa. A artrite reumatoide é um tipo de artrite crónica que ocorre nas articulações em ambos os lados do corpo (tal como ambas as mãos, pulsos ou joelhos). Essa simetria ajuda a distinguir a artrite reumatoide a partir de outros tipos de artrite.

Além de afetar as articulações, a artrite reumatoide pode ocasionalmente afetar a pele, olhos, pulmões, coração, sangue ou nervos. A artrite reumatoide afeta cerca de 1% da população mundial e é potencialmente incapacitante. Existem aproximadamente 2,9 milhões de incidências de artrite reumatoide, nos Estados Unidos. As mulheres são afetadas duas a três vezes mais do que os homens. A idade típica que a artrite reumatoide ocorre é entre 25 e 50 anos. A artrite reumatoide juvenil afeta 71 mil jovens norte-americanos (com idade até dezoito anos) afetando seis vezes mais as meninas do que os meninos. A artrite reumatoide é uma doença autoimune em que o sistema imunitário do corpo identifica incorretamente as membranas sinoviais que segregam o fluido lubrificante nas articulações como substância estranha. Resulta a inflamação, e a cartilagem e os tecidos em torno das articulações são danificados ou destruídos. Em casos graves, esta inflamação estende-se a outros tecidos articulares e cartilagem ao redor, em que pode corroer ou destruir os ossos e cartilagens e levar a deformidades articulares. O corpo substitui o tecido danificado por tecido cicatricial, fazendo com que os espaços normais no interior das articulações se tornem estreitos e os ossos se fundam. A artrite reumatoide cria rigidez, inchaço, fadiga, anemia, perda de peso, febre, e, muitas vezes, a dor incapacitante. Alguns sintomas comuns da artrite reumatoide incluem rigidez articular ao despertar, que dura uma hora ou mais; inchaço em articulações específicas de um dedo ou pulso; inchaço nos tecidos moles em torno das articulações; e inchaço em ambos os lados da articulação. O inchaço pode ocorrer com ou sem dor e pode piorar progressivamente ou permanecer na mesma durante anos antes de progredir. 0 diagnóstico da artrite reumatoide é baseado numa combinação de fatores, incluindo: o local especifico e a simetria de articulações dolorosas, a presença de rigidez de manhã, a presença de saliências e nódulos sob a pele (nódulos reumatoides), resultados de testes de raios X que sugerem artrite reumatoide, e/ou resultados positivos de uma análise ao sangue chamada de fator reumatoide. Muitas, mas não todas, as pessoas com artrite reumatoide têm o anticorpo do fator reumatoide no sangue. 0 fator reumatoide pode estar presente em pessoas que não têm artrite reumatoide. Outras doenças também podem fazer com que o fator reumatoide seja produzido no sangue. É por isso que o diagnóstico da artrite reumatoide é baseado numa combinação de vários fatores, que não apenas a presença do fator reumatoide no sangue. 0 curso típico da doença é um dos sintomas persistentes, mas flutuantes, das articulações, e após cerca de 10 anos, 90% dos doentes demonstrarão dano estrutural no osso e cartilagem. Uma pequena percentagem terá uma curta doença que apura-se completamente, e outra pequena percentagem terá doença muito grave, com muitas deformidades articulares, e, ocasionalmente, outras manifestações da doença. O processo inflamatório provoca a erosão ou a destruição do osso e da cartilagem nas articulações. Na artrite reumatoide, há um ciclo autoimune de apresentação de antígeno persistente, estimulação de células T, secreção de citocinas, ativação de células sinoviais, e destruição da articulação. A doença tem um grande impacto tanto sobre o indivíduo como na sociedade, causando-lhes dor, função prejudicada e deficiência significativas, bem como custa milhões de dólares em despesas de saúde e salários perdidos. (Ver, por exemplo, o site da NIH e o site da NIAID) . A terapia atualmente disponível para a artrite centra-se na redução da inflamação das articulações com medicamentos anti-inflamatórios ou imunossupressores. A primeira linha de tratamento de qualquer artrite são geralmente anti-inflamatórios, tais como aspirina, ibuprofeno e inibidores de Cox-2 tais como celecoxib e rofecoxib. Os "fármacos de segunda linha" incluem ouro, metotrexato e esteroides. Embora estes sejam tratamentos para a artrite bem estabelecidos, muito poucos pacientes remetem a estas linhas de tratamento por si só. Recentes avanços na compreensão da patogenia da artrite reumatoide têm levado ao uso de metotrexato em combinação com os anticorpos para as citocinas ou recetores solúveis recombinantes. Por exemplo, os recetores solúveis recombinantes para o fator de necrose tumoral (TNF)-a têm sido utilizados em combinação com o metotrexato no tratamento da artrite. No entanto, apenas cerca de 50% dos pacientes tratados com uma combinação de metotrexato e agentes anti-TNF-α, tais como recetores solúveis recombinantes para TNF-a, mostram melhoria clinicamente significativa. Muitos pacientes permanecem refratários apesar do tratamento. Questões de difícil tratamento ainda permanecem para pacientes com artrite reumatoide. Muitos tratamentos atuais têm uma alta incidência de efeitos secundários ou não podem impedir completamente a progressão da doença. Até agora, nenhum tratamento é ideal, e não há nenhuma cura. Novos agentes terapêuticos são necessários que de forma mais eficaz tratem a artrite reumatoide e outras doenças autoimunes

2.2.3 DOENÇAS INFECCIOSAS

Agentes infecciosos que causam a queda doença em cinco grupos: vírus, bactérias, fungos, protozoários e helmintos (vermes). A variedade notável desses patógenos causou a seleção natural das duas características cruciais da imunidade adaptativa. Em primeiro lugar, a vantagem de ser capaz de reconhecer uma grande variedade de diferentes agentes patogénicos tem conduzido ao desenvolvimento de recetores nas células B e T de diversidade igual ou maior. Em segundo lugar, os habitats distintos e ciclos de vida de patógenos têm de ser combatidos através de uma série de mecanismos efetores distintos. As características de cada agente patogénico são o seu modo de transmissão, o seu mecanismo de replicação, a sua patogénese ou os meios através dos quais causa a doença, e a resposta que elicita. 0 recorde de sofrimento humano e de morte causada pela varíola, cólera, febre tifoide, disenteria, malária, etc. estabelece a eminência das doenças infecciosas. Apesar dos êxitos notáveis no controlo oferecido pela melhoria do saneamento, imunização e terapia antimicrobiana, as doenças infecciosas continuam a ser um problema comum e significativo da medicina moderna. A doença mais comum da humanidade, a constipação comum, é uma doença infecciosa, tal como é a doença moderna mais temida, a SIDA. Algumas doenças neurológicas crónicas que foram pensadas anteriormente como sendo doenças degenerativas, têm provado ser infecciosas. Há pouca dúvida de que o futuro vai continuar a revelar as doenças infecciosas como principais problemas médicos.

Um enorme número de doenças humanas e animais resulta de infeções virulentas e oportunistas de qualquer um dos agentes infecciosos acima mencionados (ver Belshe (Ed.) 1984 Textbook of Human Virology, PSG Publishing, Littleton, MA) .

Uma categoria de doenças infecciosas são as infeções virais, por exemplo. As doenças virais de uma grande variedade de tecidos, incluindo o trato respiratório, o CNS, pele, trato geniturinário, olhos, ouvidos, sistema imunológico, trato gastrointestinal e sistema musculoesquelético, afetam um grande número de seres humanos de todas as idades (ver Tabela 328-2 In: Wyngaarden e Smith, 1988, Cecil Textbook of Medicine, 18a Ed., W.B. Saunders Co., Filadélfia, pág.1750-1753) . Apesar de um esforço considerável ter sido investido no projeto de terapias antivirais eficazes, as infeções virais continuam a ameaçar as vidas de milhões de pessoas em todo o mundo. Em geral, as tentativas para desenvolver medicamentos antivirais têm-se centrado em várias fases do ciclo de vida virai (Ver, por exemplo, Mitsuya et al, 1991, FASEB J. 5:. 2369-2381, discussing HIV) . No entanto, uma desvantagem comum associada com o uso de muitos medicamentos antivirais correntes são os seus efeitos secundários nocivos, tais como a toxicidade para o hospedeiro ou resistência por algumas estirpes virais.

Shields et al. (2001), J. Biol. Chem. 276(9): buscam determinar o local de ligação em IgGl humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII, e recetores FcRn e divulgam variantes de IgGl seletivas e as afinidades de ligação das mesmas. 0 documento WO 04/063351 A2 (MacroGenics, Inc.; Stavenhagen et al.) descreve moléculas compreendendo variantes particulares da região de Fc, que se ligam a FcyRIIIA e/ou FcyRIIA com maior afinidade em relação às moléculas comparáveis compreendendo a região de Fc do tipo selvagem. O documento WO 00/42072 A2 (Genentech, Inc.) divulga polipeptideos compreendendo regiões variantes de Fc especificas e seu efeito sobre a função de afinidade e efetora vinculativa.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada, em parte, na identificação de regiões de Fc de cadeia pesada de IgGl humanas mutantes, com afinidades alteradas para recetores FcyR (por exemplo, FcyRs activadores, FcyRs inibitórios), através de um sistema de visualização de leveduras. A modelagem animal in vivo e experiências clinicas indicam que a região de Fc desempenha um papel essencial na determinação do resultado de terapia de anticorpo monoclonal. As abordagens actuais para optimizar a função da região de Fc (por exemplo, a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC)) em anticorpos monoclonais terapêuticos e polipeptideos solúveis fundidos com regiões de Fc concentraram-se num número limitado de mudanças de aminoácidos simples com base na análise estrutural e/ou projetos assistidos por computador. Abordagens alternativas na manipulação de regiões de Fc têm-se centrado na glicosilação da região de Fc para otimizar a função da região de Fc. A presente invenção é baseada, em parte, na seleção de possíveis mutantes para alteração numa ou mais atividades funcionais de Fc, tais como, mas não limitados a ADCC e CDC, a partir de uma biblioteca de variantes de Fc. A presente invenção proporciona métodos para manipular regiões de Fc e para a identificação e triagem de novas variantes de Fc fora das regiões esperadas identificadas por estudos estruturais. As regiões esperadas, tal como usadas aqui, referem-se às regiões que, com base em estudos estruturais e/ou bioquímicos, estão em contacto com um ligante Fc. A presente invenção proporciona uma plataforma de descoberta para a identificação de variantes de Fc com melhoria numa ou mais funções efetoras de Fc, combinando ensaios baseados em células funcionais e construção da biblioteca combinatória com a automação do estado da técnica. A presente invenção reúne bibliotecas combinatórias completas saturando regiões de interesse dentro do Fc com modificações que cobrem todas as possíveis mudanças de aminoácidos. As bibliotecas combinatórias serão testadas usando um conjunto de ensaios de ligação e funcionais para selecionar mutantes com base na melhoria da função biológica. A presente invenção proporciona um polipeptídeo compreendendo uma região de Fc de IgGl variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de IgGl de tipo selvagem, de tal modo que: (I) a referida região de Fc variante do referido polipeptídeo se liga: (A) FcyRIIIA com uma maior afinidade, e (B) FcyRIIB com afinidade de ligação equivalente ou alterada; em que as referidas afinidades de ligação maiores, equivalentes ou alteradas são em relação às afinidades de ligação exibidas por tal polipeptídeo ao dito FcyR se compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem; e (II) em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina; em que as posições são numeradas de acordo com o índice EU como em Rabat.

Em consequência, a invenção refere-se a moléculas, de preferência polipeptídeos, e mais preferencialmente imunoglobulinas (por exemplo, anticorpos), que compreendem uma região de Fc variante, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, mas também incluindo inserções ou deleções) em uma ou mais regiões, cujas modificações alteram, por exemplo, aumentam ou diminuem, a afinidade da região de Fc variante para um FcyR. Preferencialmente, a referida uma ou mais modificações de aminoácidos aumenta a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA. Numa forma de realização preferida, as moléculas da invenção ainda se ligam especificamente a FcyRIIB (através da região de Fc) com uma afinidade mais baixa do que uma molécula comparável (isto é, tendo a mesma sequência de aminoácidos que a molécula da invenção, exceto para uma ou mais modificações de aminoácidos na região de Fc) compreendendo a região de Fc de tipo selvagem que se liga a FcyRIIB. Em algumas formas de realização, a invenção abrange moléculas com regiões de Fc variantes, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA e aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIB em relação a uma molécula comparável com uma região de Fc de tipo selvagem. Noutras formas de realização, a invenção abrange moléculas com regiões de Fc variantes, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA mas não alteram a afinidade das regiões variantes de Fc para FcyRIIB em relação a uma molécula comparável com uma região de Fc de tipo selvagem. Uma forma de realização preferida é uma região de Fc variante que tem maior afinidade para FcyRIIIA mas reduzida afinidade para FcyRIIB em relação a uma molécula comparável com uma região de Fc de tipo selvagem.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras modificações de Fc, incluindo mas não se limitando a alterações que modificam a função efetora. A invenção engloba uma combinação de Fc variante da invenção com outras modificações Fc para fornecer propriedades aditivas, sinérgicas, ou novas em anticorpos ou fusões de Fc. De preferência, as variantes de Fc da invenção melhoram o fenótipo da modificação com a qual estão combinadas. Por exemplo, se uma variante Fc da invenção for combinada com um mutante que se sabe ligar FcyRIIIA com uma maior afinidade do que uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem; a combinação com um mutante da invenção resulta num maior realce de vezes na afinidade de FcyRIIIA.

Numa forma de realização, as variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras variantes de Fc, tais como as divulgadas em Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sei USA 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, J Immunol 157:49634969; Armour et al, 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:41784184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); US 5,624,821; US 5,885,573; US 6,194,551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572. Em certas formas de realização, as variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com uma ou mais das variantes de Fc, ou seja, modificações de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, apresentadas nas tabelas 5, 6, 7 e 8, Infra. A invenção abrange moléculas que são homodímeros ou heterodímeros de regiões de Fc. Os heterodimeros que compreendem regiões de Fc referem-se a moléculas de onde as duas cadeias Fc têm as mesmas ou diferentes sequências. Em algumas formas de realização, em que as moléculas heterodiméricas compreendem regiões de Fc variantes, cada cadeia tem uma ou mais modificações diferentes da outra cadeia. Noutras formas de realização, em que as moléculas heterodiméricas compreendem de regiões de Fc variantes, uma cadeia contém a região de Fc de tipo selvagem e as outras cadeias compreendem uma ou mais modificações. Os métodos de manipulação de Fc heterodimérico contendo moléculas são conhecidos na arte e englobados no âmbito da invenção. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante não se ligando a qualquer FcyR ou se ligando com uma afinidade reduzida, em relação a uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaios correntes (por exemplo, ensaios in vitro) conhecidos de um perito na arte. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando apenas a um FcyR, em que o referido FcyR é F ογΐIIA. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando apenas a um FcyR, em que o referido FcyR é FcyRIIA. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando apenas a um FcyR, em que o referido FcyR é FcyRIIB.

As afinidades e propriedades de ligação das moléculas da invenção a um FcyR são inicialmente determinadas utilizando ensaios in vitro (ensaios com base imunológica ou bioquímica) conhecidos na técnica para determinar as interações Fc-FcyR, isto é, a ligação específica de uma região de Fc a um FcyR incluindo mas não limitado a ensaio de ELISA, ensaio de ressonância de plasmon de superfície, ensaios de imunoprecipitação (Ver Secção 5.2.1) . De preferência, as propriedades de ligação das moléculas da presente invenção também são caracterizadas por ensaios funcionais in vitro para determinar uma ou mais funções das células efetoras mediadoras de FcyR (ver secção 5.2.6). Na maioria das formas de realização preferidas, as moléculas da invenção têm propriedades de ligação semelhantes em modelos in vivo (tal como os aqui descritos e divulgados) e os ensaios com base in vitro. No entanto, na presente invenção não se excluem moléculas da invenção que não exibam o fenótipo desejado em ensaios com base in vitro mas que exibem o fenótipo desejado in vivo. É aqui descrita uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que uma molécula comparável que compreende uma região de Fc do tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, desde que a referida região de Fc variante não tenha apenas uma substituição em qualquer uma das posições 329, 331, ou 332, e não inclua ou não seja exclusivamente substituída por qualquer uma: alanina em qualquer das posições 256, 290, 298, 312, 333, 334, 359, 360, 326, ou 430; uma lisina na posição 330; uma treonina na posição 339; uma metionina na posição 320; uma serina na posição 326; uma asparagina na posição 326; um ácido aspártico na posição 326; um ácido glutâmico na posição 326; uma glutamina na posição 334; um ácido glutâmico na posição 334; uma metionina na posição 334; uma histidina na posição 334; uma valina na posição 334; ou uma leucina na posição 334; uma lisina na posição 335. É aqui descrita uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIA com uma maior afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc do tipo selvagem se liga a FcyRIIA, desde que a uma ou mais modificações de aminoácidos não inclua, ou não seja substituída exclusivamente por uma alanina em qualquer uma das posições 256, 290, 326, 255, 258, 267, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 331, 337, 268, 272, ou 430; uma asparagina na posição 268; uma glutamina na posição 272; uma glutamina, serina, ou ácido aspártico na posição 286; uma serina na posição 290; uma metionina, glutamina, ácido glutâmico, ou arginina na posição 320; um ácido glutâmico na posição 322; uma serina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico na posição 326; uma lisina na posição 330; uma glutamina na posição 335; ou uma metionina na posição 301.

Descreve-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula tem uma afinidade alterada para um FcyR, desde que a referida região de Fc variante não tenha uma substituição nas posições que fazem um contacto direto com FcyR com base na análise cristalográfica e estrutural de interações Fc-FcyR tais como as divulgadss por Sondermann et al, (2000 Nature, 406.: 267-273. Exemplos de posições dentro da região de Fc que fazem um contacto direto com FcyR são os aminoácidos 234-239 (região de charneira), aminoácidos 265-269 (ansa B/C), aminoácidos 297-299 (ansa C'/E), e os aminoácidos 327-332 (ansa F/G). Em alguns exemplos, as moléculas da presente invenção que compreendem regiões de Fc variantes compreendem a modificação de pelo menos um resíduo que não faz um contacto direto com uma FcyR com base na análise estrutural e cristalográfica, por exemplo, não se encontra dentro do local de ligação de Fc-FcyR.

Descreve-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula se liga a um FcyR com uma afinidade alterada em relação a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem, desde que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos não inclua, ou não seja unicamente uma substituição em qualquer das posições 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359; 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439. Também se descreve aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula se liga a um FcyR com uma afinidade alterada em relação a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem, desde que a referida região de Fc variante não inclua ou não seja unicamente uma substituição em qualquer uma das posições 255, 258, 267, 269, 270, 276, 278, 280, 283, 285, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 300, 303, 305, 307, 309, 322, 329, 332, 331, 337, 338, 340, 373, 376, 416, 419, 434, 435, 437, 438, 439 e não tenha uma alanina em qualquer das posições 256, 290, 298,312, 333, 334, 359, 360, 326, ou 430; uma lisina na posição 330; uma treonina na posição 339; uma metionina na posição 320; uma serina na posição 326; uma asparagina na posição 326; um ácido aspártico na posição 326; um ácido glutâmico na posição 326; uma glutamina na posição 334; um ácido glutâmico na posição 334; uma metionina na posição 334; uma histidina na posição 334; uma valina na posição 334; ou uma leucina na posição 334; uma lisina na posição 335 uma asparagina na posição 268; uma glutamina na posição 272; uma glutamina, serina, ou ácido aspártico na posição 286; uma serina na posição 290; uma metionina, glutamina, ácido glutâmico, ou arginina na posição 320; um ácido glutâmico na posição 322; uma serina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico na posição 326; uma lisina na posição 330; uma glutamina na posição 335; ou uma metionina na posição 301.

Descreve-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante não inclui ou não é apenas uma substituição em qualquer uma das posições 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439 e não tem uma histidina, glutamina, ou tirosina na posição 280; uma serina, glicina, treonina ou tirosina na posição 290, uma leucina ou isoleucina na posição 300; uma asparagina na posição 294, uma prolina na posição 296; uma prolina, asparagina, ácido aspártico ou valina na posição 298; uma lisina na posição 295. Também é aqui descrita uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula se liga a um FcyR com afinidade reduzida em relação a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem, desde que a referida região de Fc variante não tenha ou não seja apenas uma substituição em qualquer das posições 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292 , 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434 , 435, 437, 438, ou 439. Também é aqui divulgada uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula se liga a um FcyR com uma afinidade melhorada em relação a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem, desde que a referida região de Fc variante não tenha ou não seja apenas uma substituição em qualquer das posições 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, ou 430.

Também se descreve aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante não inclui uma substituição ou não tem exclusivamente, uma substituição em qualquer das posições 330, 243, 247, 298, 241, 240, 244, 263, 262, 235, 269, ou 328 e não tem uma leucina na posição 243, uma asparagina na posição 298, uma leucina na posição 241 e isoleucina ou uma alanina na posição 240, uma histidina na posição 244, uma valina na posição 330, ou uma isoleucina na posição 328.

Numa forma de realização especifica, as moléculas da invenção compreendem uma região de Fc variante possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições), modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA em, pelo menos, 2 vezes, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Em certas formas de realização, as moléculas da invenção compreendem uma região de Fc variante possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições), em que as modificações aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA em mais de 2 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos, 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 10 vezes em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Noutras formas de realização da invenção, as moléculas da invenção compreendem uma região de Fc variante que se liga especificamente a FcyRIIIA com pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 150 %, pelo menos 200% de maior afinidade em relação a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem. Essas medições estão de preferência em ensaios in vitro. São aqui divulgadas moléculas com afinidades alteradas para com os recetores Fcy de ativação e/ou inibitórios. Em particular, a invenção contempla moléculas com regiões de Fc variantes, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIB mas diminuem a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA e/ou FcyRIIA, em relação a uma molécula comparável com uma região de Fc de tipo selvagem. São aqui divulgadas moléculas com regiões de Fc variantes, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos, modificações essas que diminuem a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIB e também diminuem a afinidade das regiões de Fc variantes para com FcyRIITA e/ou FcyRIIA em relação a uma molécula comparável com uma região de Fc de tipo selvagem. A invenção abrange moléculas com regiões de Fc variantes, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIB e também aumentam a afinidade das regiões de Fc variantes para com FcyRIIIA em relação a uma molécula comparável com uma região de Fc de tipo selvagem. São aqui divulgadas moléculas com regiões de Fc variantes, modificações essas que diminuem a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA e/ou FcyRIIA mas que não alteram a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIB em relação a uma molécula comparável com uma região de Fc de tipo selvagem. Ainda noutras formas de realização, a invenção abrange moléculas com regiões de Fc variantes, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA mas reduzem a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIB em relação a uma molécula comparável com uma região de Fc do tipo selvagem.

Numa forma de realização especifica, as moléculas da invenção compreendem uma região de Fc variante, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições), cujas uma ou mais modificações aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA e diminuem a afinidade da região de Fc variante para com

FcyRIIB, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem que se liga a FcyRIIIA e FcyRIIB e com afinidade do tipo selvagem. Conforme divulgado uma ou mais modificações de aminoácidos não são uma substituição por alanina em qualquer das posições 256, 298, 333, ou 334. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições), essa uma ou mais modificações aumentando a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIA e diminuindo a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIB, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem que se liga a FcyRIIA e FcyRIIB com afinidade do tipo selvagem. Num determinado exemplo, a uma ou mais modificações de aminoácidos não é uma substituição com arginina na posição 320. São aqui divulgadas moléculas com afinidades alteradas para com recetores de ativação e/ou inibitórios com regiões de Fc variantes, que têm uma ou mais modificações de aminoácidos, em que a referida uma ou mais modificações de aminoácidos é uma substituição na posição 288 por asparagina, na posição 330 por serina e na posição 396 por leucina (MgFclO) (Ver Tabelas 5 e 6) ; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 359 por asparagina, e na posição 366 por serina (MgFcl3) ; ou uma substituição na posição 316 por ácido aspártico, na posição 378 por valina, e na posição 399 por ácido glutâmico (MgFc27); ou uma substituição na posição 392 por treonina, e na posição 396 por leucina (MgFc38); ou uma substituição na posição 221 por ácido glutâmico, na posição 270 por ácido glutâmico, na posição 308 por alanina, na posição 311 por histidina, na posição 396 por leucina, e na posição 402 por ácido aspártico (MgFc42); ou uma substituição na posição 240 por alanina, e na posição 396 por leucina (MgFc52); ou uma substituição na posição 410 com histidina, e na posição 396 por leucina (MgFc53); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 305 com isoleucina, na posição 378 por ácido aspártico, na posição 404 por serina, e na posição 396 por leucina (MgFc54); ou uma substituição na posição 255 por isoleucina e na posição 396 por leucina (MgFc55); ou uma substituição na posição 370 por ácido glutâmico na posição 396 por leucina (MgFc59); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina (MgFc88); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, e na posição 396 por leucina (MgFc88A); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina (MgFcl55); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, e na posição 292 por prolina; ou uma substituição na posição 243 por leucina; ou uma substituição na posição 273 por fenilalanina. Num exemplo relacionado, a região de Fc variante compreende ainda uma ou mais modificações de aminoácidos descritas nas tabelas 5, 6, 7 e 8, infra. O método preferido para o rastreio e identificação de moléculas que compreende regiões de Fc variantes com afinidades FcyR alteradas (por exemplo, afinidade melhorada para com FcyRIIIA) é a tecnologia de exposição de superfície de levedura (para revisão ver Boder e Wittrup, 2000, Methods in Enzymology, 328: 430-444, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade) . Especificamente, a exposição de superfície de levedura é um método genético através do qual os polipeptídeos compreendendo mutantes de Fc são expressos na parede da célula de levedura numa forma acessível para interagir com FcyR. A exposição de superfície de levedura do mutante de Fc contendo polipeptídeos da invenção pode ser realizada de acordo com qualquer das técnicas conhecidas dos peritos na técnica ou os métodos específicos aqui descritos. A exposição de levedura oferece a vantagem de utilizar ligação real a um recetor desejado para identificar regiões de Fc variantes que melhoraram a ligação a esse recetor.

Um aspeto da invenção proporciona um método para a seleção de proteínas de fusão mutantes de Fc com uma propriedade desejável de ligação, por exemplo, a capacidade do mutante de proteína de fusão de Fc se ligar a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que um polipeptideo comparável compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem que se liga a FcyRIIIA. As células de levedura que exibem as proteínas de fusão mutantes de Fc podem ser rastreadas e caracterizam-se por quaisquer ensaios com base bioquímica ou imunológica conhecidos dos peritos na arte para avaliar as interações de ligação. Numa forma de realização especifica, o rastreio das proteínas de fusão mutantes de Fc é feito usando um ou mais ensaios de base bioquímica, por exemplo, um ensaio ELISA.

Em formas de realização preferidas, o rastreio e identificação de moléculas que compreendem regiões de Fc variantes com afinidades FcyR alteradas (por exemplo, maior afinidade a FcyRIIIA) são feitos usando a tecnologia de exibição de levedura como aqui descrita em combinação com um ou mais ensaios de base bioquímica, de preferência numa forma de alto rendimento. 0 um ou mais ensaios bioquímicos pode ser qualquer ensaio conhecido na especialidade para a identificação da interação Fc-FcyR, isto é, a ligação específica de uma região de Fc a um FcyR, incluindo, mas não limitado a, um ensaio ELISA, ensaios de ressonância de plasmon de superfície, ensaio de imunoprecipitação, cromatografia de afinidade, e diálise de equilíbrio. Em algumas formas de realização, o rastreio e identificação de moléculas que compreendem regiões de Fc variantes com afinidades FcyR alteradas (por exemplo, afinidade melhorada FcyRIIIA) são feitos usando a tecnologia de exibição de levedura como aqui descrita em combinação com um ou mais ensaios de base funcional, de preferência numa maneira de alto rendimento. Os ensaios funcionais podem ser qualquer ensaio conhecido na especialidade para a caracterização de uma ou mais funções celulares efetoras mediadas por FcyR tais como as aqui descritas na Secção 5.2.6. Exemplos não limitativos de funções de células efetoras que podem ser utilizados de acordo com os métodos da invenção, incluem mas não estão limitados a, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), fagocitose dependente de anticorpos, fagocitose, opsonização, opsonofagocitose, ligação de células, rosetas, ligação a Clq, e citotoxicidade mediada por células dependentes em complementos. Em algumas formas de realização, o rastreio e identificação de moléculas que compreendem regiões de Fc variantes com afinidades FcyR alteradas (por exemplo, afinidade melhorada FcyRIIIA) são feitos usando a tecnologia de exibição de levedura como aqui descrita em combinação com um ou mais ensaios com base bioquímica em combinação ou em paralelo com um ou mais ensaios de base funcional, de preferência de uma forma de alto rendimento.

Um método preferido para medir a interação FcyR-Fc, de acordo com a invenção é um ensaio desenvolvido pelos inventores, que permite a deteção e quantificação da interação, apesar da afinidade inerentemente fraca do recetor ao seu ligante, por exemplo, na gama micromolar para FcyRIIB e FcyRIIIA. 0 método envolve a formação de um complexo FcyR (por exemplo, FcyRIIIA, FcyRIIB) que tem uma avidez melhorada para uma região de Fc, em relação a um FcyR não complexado. Numa forma de realização específica, a invenção abrange um método para produzir um complexo FcyR tetramérico, em que o referido complexo tetramérico tem uma afinidade melhorada para uma região de Fc, em relação com a afinidade de um FcyR monomérico para a região de Fc, compreendendo o referido método: (i) a produção de uma proteína de fusão, de tal modo que uma sequência de 15 aminoácidos AVITAG operativamente ligada à região de FcyR solúvel; (ii) a biotinilação da proteína produzida utilizando uma enzima de E. coli BirA; (iii) a mistura da proteína biotinilada produzida com streptaividn-ficoeritrina numa razão molar adequada, de tal modo que um complexo tetramérico FcyR é formado.

Numa forma de realização preferida da invenção, os polipeptídeos compreendendo as regiões de Fc ligam-se aos complexos tetraméricos FcyR, formados de acordo com os métodos da invenção, com, pelo menos, uma afinidade 8 vezes maior do que se ligam ao FcyR monomérico não complexado. A ligação de polipeptídeos compreendendo as regiões de Fc aos complexos tetraméricos FcyR pode ser determinada utilizando técnicas padrão conhecidas dos peritos na arte, tais como, por exemplo, fluorescência de células ativadas (FACS), radioimunoensaios, ensaios ELISA, etc. A invenção abrange a utilização dos complexos imunitários formados de acordo com os métodos descritos acima para a determinação da funcionalidade de moléculas que compreendem uma região de Fc em ensaios baseados em células ou isentos de células.

Numa forma de realização especifica, a invenção proporciona imunoglobulinas modificadas compreendendo uma região de Fc variante com uma afinidade aumentada para com FcyRIIIA. Tais imunoglobulinas incluem moléculas de IgG que contêm naturalmente regiões de ligação a FcyR (por exemplo, regiões de ligação a FcyRIIIA e/ou FcyRIIB), ou derivados de imunoglobulina que foram manipulados para conter uma região de ligação a FcyR (por exemplo, regiões de ligação a FcyRIIIA e/ou FcyRIIB). As imunoglobulinas modificadas da presente invenção incluem qualquer molécula de imunoglobulina que se liga, de preferência, imunoespecificamente, ou seja, compete com a ligação não especifica como determinada por imunoensaios bem conhecidos na arte para o ensaio de ligação de ant igeno-anticorpo especifica, um antigeno e contém uma região de ligação a FcyR (por exemplo, uma região de ligação a FcyRIIIA e/ou FcyRIIB). Tais anticorpos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, bi-especificos, multi-especificos, humanos, humanizados, quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fvs ligados por dissulfureto, e fragmentos contendo ou um domínio VL ou VH, ou até mesmo uma região determinante de complementaridade (CDR) que se liga especificamente a um antígeno, em determinados casos, manipulada para conter ou fundida numa região de ligação a FcyR .

Em certas formas de realização, a invenção abrange imunoglobulinas compreendendo uma região de Fc variante com uma afinidade aumentada para FcyRIIIA de tal modo que a imunoglobulina tem uma função efetora aumentada, por exemplo, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos. A função efetora das moléculas da invenção pode ser testada utilizando qualquer ensaio aqui descrito ou conhecido dos peritos na arte. Em algumas formas de realização, as imunoglobulinas que compreendem uma região de Fc variante com uma afinidade aumentada para com FcyRIIIA têm uma atividade ADCC aumentada relativamente ao tipo selvagem por pelo menos 2 vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos, 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes. A invenção abrange anticorpos terapêuticos humanizados ou humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais específicos de tumores) na região de Fc por modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de um ou mais resíduos de aminoácidos, modificações essas que modulam a afinidade do anticorpo terapêutico para um recetor de ativação FcyR e/ou um recetor inibitório FcyR. Numa forma de realização, a invenção refere-se a anticorpos terapêuticos humanos ou humanizados manipulados (por exemplo, anticorpos monoclonais específicos de tumores) na região de Fc, por modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Numa outra forma de realização, a invenção refere-se a anticorpos terapêuticos humanos ou humanizados manipulados (por exemplo, anticorpos monoclonais específicos de tumores) na região de Fc, por modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc e para com FcyRIIIA e diminui ainda a afinidade da região de Fc para com FcyRIIB. Os anticorpos terapêuticos manipulados podem ainda ter uma função efetora aumentada, por exemplo, uma atividade ADCC aumentada, atividade de fagocitose, etc, tal como determinado por ensaios padrão conhecidos dos peritos na arte.

Numa forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo monoclonal humanizado especifico para o proto-oncogene Her2/neu (por exemplo, o anticorpo humanizado Ab4D5 tal como descrito em Carter et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89: 4285 -9) através de modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um resíduo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Numa outra forma de realização especifica, a modificação do anticorpo monoclonal humanizado Her2/neu também pode ainda diminuir a afinidade da região de Fc para com FcyRIIB. Ainda noutra forma de realização específica, os anticorpos monoclonais humanizados manipulados específicos para Her2/neu podem ainda ter uma função efetora aumentada como determinado por ensaios padrão conhecidos na arte e aqui divulgados e exemplificados.

Numa outra forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo anti-CD20, por modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um resíduo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Numa forma de realização relacionada, o anticorpo anti-CD20 é o anticorpo monoclonal quimérico humano anti-CD20 de ratinho, 2H7. Mais exemplos não limitativos de anticorpos anti-CD20 que podem ser utilizados nos métodos da invenção são divulgados na Publicação dos Estados Unidos n° : US 2006/0134709. Numa outra forma de realização especifica, a modificação do anticorpo monoclonal anti-CD20, 2H7 também pode diminuir ainda mais a afinidade da região de Fc para com FcyRIIB. Ainda noutra forma de realização especifica, o anticorpo monoclonal anti-CD20 manipulado, 2H7 pode ainda ter uma função efetora aumentada como determinado por ensaios padrão conhecidos na arte e aqui divulgados e exemplificados.

Numa outra forma de realização especifica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo antí-FcyRIIB, em particular um anticorpo anti-FcYRIIB que se liga especificamente ao FcyRIIB humano, mais particularmente ao FcyRIIB nativo humano, por modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um resíduo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA e/ou FcyRIIA. Exemplos não limitativos representativos de anticorpos anti-FcYRIIB são divulgados na Publicação nos EUA n° US 2009/0076251; Publicação nos EUA n° US 2009/0017026; e publicações de pedidos de patente nos EUA n°: 2004-0185045; 2005-0260213; e 2006-0013810. Exemplos de anticorpos anti-FcYRIIB que podem ser manipulados de acordo com os métodos da invenção são os anticorpos monoclonais produzidos pelo clone 2B6, 3H7, 8B5.34, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 e 1F2 tendo os números de acesso ATCC PTA- 4591, PTA-4592, PTA-7610, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, e PTA-5959, respetivamente (depositados na ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 02209-2011, todos aqui incorporadas a titulo de referência), ou versões quiméricas, humanizadas ou outras versões de manipulação dos mesmos.

Numa forma de realização especifica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável da cadeia pesada e/ou domínio variável da cadeia leve de 2B6, 3H7 ou 8B5.3.4. Numa outra forma de realização específica, a invenção engloba a manipulação de um anticorpo humanizado compreendendo as CDRs de 2B6, 3H7 ou 8B5.3.4. Numa forma de realização específica, a invenção engloba a manipulação de um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 e o domínio variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Numa forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9 e o domínio variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10.

Numa outra forma de realização específica, a modificação do anticorpo anti-FcyRIIB pode também ainda diminuir a afinidade da região de Fc para com FcyRIIB. Ainda noutra forma de realização especifica, o anticorpo anti-FcyRIIB manipulado pode ainda ter uma função efetora aumentada como determinado por ensaios padrão conhecidos na arte e aqui divulgados e exemplificados. Tal como aqui divulgado o anticorpo monoclonal anti-FcyRIIB compreende uma modificação na posição 334 com ácido glutâmico, na posição 359 com asparagina, e na posição 366 com serina (MgFcl3) ; ou uma substituição na posição 316 por ácido aspártico, na posição 378 por valina, e na posição 399 por ácido glutâmico (MgFc27); ou uma substituição na posição 243 com isoleucina, na posição 379 por leucina, e na posição 420 por valina (MgFc29); ou uma substituição na posição 392 por treonina e na posição 396 com leucina (MgFc38); ou uma substituição na posição 221 por ácido glutâmico, na posição 270 por ácido glutâmico, na posição 308 por alanina, na posição 311 por histidina, na posição 396 por leucina, e na posição 402 por aspártico (MgFc42); ou uma substituição na posição 410 por histidina, e na posição 396 por leucina (MgFc53); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 305 por isoleucina, na posição 378 por ácido aspártico, na posição 404 por serina, e na posição 396 por leucina (MgFc54); ou uma substituição na posição 255 por isoleucina e na posição 396 por leucina (MgFc55) ; ou uma substituição na posição 370 por ácido glutâmico, e na posição 396 por leucina (MgFc59); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina (MgFc88); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, e na posição 396 por leucina (MgFc88A); ou uma substituição na posição 234 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina (MgFcl55); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, e na posição 292 por prolina; ou uma substituição na posição 243 por leucina; ou uma substituição na posição 273 por fenilalanina. Num exemplo relacionado, a região de Fc variante compreende ainda uma ou mais modificações de aminoácidos descritas nas tabelas 5, 6, 7 e 8, infra. A presente invenção também inclui polinucleotídeos que codificam uma molécula da invenção, incluindo polipeptídeos e anticorpos, identificados pelos métodos da invenção. Os polinucleotídeos que codificam as moléculas da invenção podem ser obtidos, e a sequência de nucleotídeos dos polinucleotídeos pode ser determinada, por qualquer método conhecido na arte. A invenção refere-se a um ácido nucleico isolado que codifica uma molécula da invenção. A invenção também fornece um vetor compreendendo o referido ácido nucleico. A invenção proporciona ainda células hospedeiras contendo os vetores ou polinucleotídeos da invenção. A invenção proporciona ainda métodos para a produção das moléculas da invenção. As moléculas da presente invenção, incluindo polipeptídeos e anticorpos, podem ser produzidas por qualquer método conhecido dos peritos na arte, em particular, por expressão recombinante. A invenção refere-se a um método para a produção de forma recombinante de uma molécula da presente invenção, o referido método compreendendo: (i) a cultura num meio de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica a referida molécula, sob condições adequadas para a expressão da referida molécula; e (ii) recuperação da referida molécula a partir do referido meio.

As moléculas identificadas de acordo com os métodos da invenção são úteis na prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados com uma doença, distúrbio ou infeção. As moléculas da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio em que uma eficácia melhorada da função das células efetoras (por exemplo, ADCC) mediada por FcyR é desejada, por exemplo, cancro, doenças infecciosas e no aumento da eficácia terapêutica dos anticorpos terapêuticos cujo efeito é mediado por ADCC. É aqui divulqado um método de tratamento de cancro num paciente possuindo um cancro caracterizado por um antigeno de cancro, compreendendo o referido método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo terapêutico que se liga ao antigeno do cancro, que foi manipulado em conformidade com os métodos da invenção. É também aqui descrito um método para tratar o cancro num paciente com um cancro caracterizado por um antigeno de cancro, compreendendo o referido método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo terapêutico que se liga especificamente ao referido antigeno do cancro, o referido anticorpo terapêutico compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido anticorpo terapêutico se liga especificamente a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que o anticorpo terapêutico, que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, desde que a referida região de Fc variante não tenha uma substituição nas posições 329,331, ou 332, e não tenha uma alanina em qualquer das posições 256, 290, 298, 312, 333, 334, 359, 360, ou 430; uma lisina na posição 330; uma treonina na posição 339; uma metionina na posição 320; uma serina na posição 326; uma asparagina na posição 326; um ácido aspártico na posição 326; um ácido glutâmico na posição 326; uma glutamina na posição 334; um ácido glutâmico na posição 334; uma metionina na posição 334; um histidina na posição 334; uma valina na posição 334; ou uma leucina na posição 334. É aqui revelado um método para tratar o cancro num paciente com um cancro caracterizado por um antigeno de cancro, compreendendo o referido método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo terapêutico que se liga especificamente a um antigeno de cancro, compreendendo o referido anticorpo terapêutico uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem de modo a que o referido anticorpo terapêutico se liga especificamente a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que um anticorpo terapêutico, que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, e o referido anticorpo terapêutico se liga ainda especificamente a FcyRIIB com uma afinidade mais baixa do que um anticorpo terapêutico, que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIB, desde que a referida região de Fc variante não tenha uma alanina em qualquer das posições 256, 298, 333, ou 334. É aqui divulgado um método para tratar o cancro num paciente, caracterizado por um antigeno de cancro, compreendendo o referido método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo terapêutico que se liga especificamente ao referido antigeno de cancro e o referido anticorpo terapêutico compreende uma região de Fc variante, de modo a que o anticorpo tenha uma atividade ADCC melhorada. É aqui revelado um método de tratamento de uma doença autoimune e/ou doença inflamatória num paciente com necessidade do mesmo, compreendendo o referido método a administração ao referido paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula se liga especificamente a FcyRIIB com uma maior afinidade do que uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, e a referida molécula se liga ainda especificamente a FcyRIIIA uma afinidade mais baixa do que uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, e a referida molécula se liga a um complexo imune (por exemplo, um complexo antigeno/anticorpo). É aqui revelado um método de tratamento de uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, que compreende ainda a administração de um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos adicionais, por exemplo, agentes imunomoduladores, agentes anti-inflamatórios, utilizados para o tratamento e/ou prevenção de tais doenças.

Também são aqui divulgados métodos para o tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa num indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma ou mais moléculas aqui divulgadas que se ligam a um agente infeccioso ou recetor celular para o mesmo. As doenças infecciosas que podem ser tratadas ou prevenidas pelas moléculas da invenção, são causadas por agentes infecciosos, incluindo mas não se limitando a vírus, bactérias, fungos, protozae e vírus.

De acordo com um aspeto da invenção, as moléculas da invenção compreendendo regiões de Fc variantes têm uma função efetora do anticorpo aumentada para um agente infeccioso, por exemplo, uma proteína patogénica, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Numa forma de realização específica, as moléculas da invenção aumentam a eficácia do tratamento de uma doença infecciosa, aumentando a fagocitose e/ou opsonização do agente infeccioso que causa a doença infecciosa. Numa outra forma de realização específica, as moléculas da invenção aumentam a eficácia do tratamento de uma doença infecciosa, melhorando a ADCC das células infetadas que causam a doença infecciosa.

As moléculas aqui divulgadas podem ser administradas em combinação com uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, conhecidos dos peritos na arte para o tratamento e/ou prevenção de uma doença infecciosa. A invenção contempla a utilização das moléculas da presente invenção em combinação com antibióticos conhecidos dos peritos na arte para o tratamento e ou prevenção de uma doença infecciosa. A invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo uma molécula da invenção, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma região de Fc variante, uma imunoglobulina compreendendo uma região de Fc variante, um anticorpo terapêutico manipulado de acordo com a invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção fornece adicionalmente composições farmacêuticas compreendendo ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais, incluindo, mas não limitado a agentes anticancerígenos, agentes anti-inflamatórios, agentes imunomoduladores.

3.1 DEFINIÇÕES

Tal como aqui utilizado, o termo "região de Fc" é utilizado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de IgG. Embora os limites possam variar ligeiramente, a região de Fc de cadeia pesada de IgG humana é definida para se esticar a partir de Cys226 para o terminal carboxilo. A região de Fc de uma IgG compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3. 0 domínio CH2 de uma região de Fc de IgG humana (também referido como domínio "Cy2") geralmente se estende desde o aminoácido 231 até ao aminoácido 338. 0 domínio CH3 de uma região de Fc de IgG humana normalmente estende-se a partir dos aminoácidos 342 a 447. 0 domínio CH2 é único na medida em que não está intimamente emparelhado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de hidratos de carbono ramificadas ligadas a N estão interpostas entre os dois domínios CH2 de uma IgG nativa intacta.

Ao longo da presente descrição, a numeração dos resíduos de uma cadeia pesada de IgG é a constante do índice UE como em Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Serviço de Saúde Pública, NH1, MD (1991), aqui expressamente incorporado por referência. 0 "índice UE como em Rabat" refere-se à numeração do anticorpo de IgGl humana UE. A "região flexível" é geralmente definida como se alongando desde Flu216 para Pro230 da IgGl humana. As regiões flexíveis de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgGl através da colocação do primeiro e último resíduos de cisteína que formam ligações internas de cadeia pesada S-S nas mesmas posições.

Tal como aqui utilizados, os termos "anticorpo" e "anticorpos" referem-se a anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos sintéticos, anticorpos quiméricos, anticorpos policlonais, anticorpos camelizados, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F (ab'), Fvs biespecíficos ligados por dissulfureto (sdFv), intracorpos e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo anticorpos, por exemplo, anti-Id e anticorpos anti-anti-Id para os anticorpos da invenção), e os fragmentos de ligação a epítopos de qualquer um dos acima. Em particular, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contêm um local de ligação ao antígeno. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , classe (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) ou subclasse.

Tal como aqui utilizado, o termo "derivado", no contexto de polipeptídeos ou proteínas, refere-se a um polipeptídeo ou proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que tenha sido alterada pela introdução de substituições, deleções ou adições de resíduos de aminoácidos. 0 termo "derivado", tal como aqui utilizado, refere-se também a um polipeptídeo ou proteína que tenha sido modificado, isto é, por meio da ligação covalente de qualquer tipo de molécula do polipeptídeo ou proteína. Por exemplo, mas não como limitação, um anticorpo pode ser modificado, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou a outra proteína, etc. Um polipeptídeo ou proteína derivados podem ser produzidos através de modificações químicas, utilizando técnicas conhecidas dos especialistas na arte, incluindo, mas não se limitando a, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, um derivado de polipeptídeo ou derivado de proteína possui uma função semelhante ou idêntica à do polipeptídeo ou proteína a partir dos quais derivou.

Tal como aqui utilizado, o termo "derivado", no contexto de um derivado não-proteico, refere-se a uma segunda molécula orgânica ou inorgânica que é formada com base na estrutura de uma primeira molécula orgânica ou inorgânica. Um derivado de uma molécula orgânica inclui, mas não está limitado a, uma molécula modificada, por exemplo, através da adição ou deleção de um grupo hidroxilo, metilo, etilo, carboxilo ou amina. Uma molécula orgânica pode também ser esterifiçada, alquilada e/ou fosforilada.

Tal como aqui utilizados, os termos "distúrbio" e "doença" são utilizados indiferentemente para se referir a uma condição num indivíduo. Em particular, o termo "doença autoimune" é utilizado alternadamente com o termo "distúrbio autoimune" para se referir a um estado num indivíduo, caracterizado por dano celular, de tecido e/ou de órgão causado por uma reação imunológica do indivíduo às suas próprias células, tecidos e/ou órgãos. 0 termo "doença inflamatória" é utilizado alternadamente com o termo "distúrbio inflamatório" para se referir a um estado num indivíduo, caracterizado por inflamação, de preferência, inflamação crónica. As doenças autoimunes podem ou não estar associadas com a inflamação. Além disso, a inflamação pode ser ou não ser causada por uma doença autoimune.

Assim, certas doenças podem ser caracterizadas tanto como autoimunes como inflamatórias.

Tal como aqui utilizado, o termo "cancro" refere-se a um neoplasma ou tumor resultante do crescimento descontrolado anormal de células. Tal como aqui utilizado, o cancro inclui explicitamente, leucemias e linfomas. Em algumas formas de realização, o cancro refere-se a um tumor benigno, que permaneceu localizado. Noutras formas de realização, o cancro refere-se a um tumor maligno, que invadiu e destruiu as estruturas do corpo vizinhas e se espalhou para locais distantes. Em algumas formas de realização, o cancro está associado a um antigeno especifico do cancro.

Tal como aqui utilizado, o termo "agente imunomodulador" e suas variações referem-se a um agente que modula o sistema imunológico de um hospedeiro. Em certas formas de realização, um agente imunomodulador é um agente imunossupressor. Em certas outras formas de realização, um agente imunomodulador é um agente imunoestimulante. Os agentes imunomoduladores incluem, mas não estão limitados a, pequenas moléculas, péptidos, polipeptideos, proteínas de fusão, anticorpos, moléculas inorgânicas, agentes miméticos, e moléculas orgânicas.

Tal como aqui utilizado, o termo "epitopo" refere-se a um fragmento de um polipeptídeo ou proteína ou uma molécula não proteica tendo atividade antigénica ou imunogénica num animal, de preferência num mamífero, e mais preferivelmente num ser humano. Um epitopo que possui atividade imunogénica é um fragmento de um polipeptídeo ou proteína que induz uma resposta de anticorpos num animal. Um epitopo que possui atividade antigénica é um fragmento de uma proteina ou polipeptideo ao qual um anticorpo imuno-especificamente se liga, tal como determinado por qualquer método bem conhecido para um perito na arte, por exemplo, por imunoensaios. Os epitopos antigénicos não necessitam de ser necessariamente imunogénicos.

Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento" refere-se a um péptido ou polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 residuos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 residuos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos, 125 residuos de aminoácidos contíguos, pelo menos, 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos, 200 resíduos de aminoácidos contíguos, ou pelo menos250 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de um outro polipeptideo. Numa forma de realização específica, um fragmento de um polipeptideo, pelo menos, retém uma função do polipeptideo.

Tal como aqui utilizados, os termos "ácidos nucleicos" e "sequências de nucleotídeos" incluem moléculas de ADN (por exemplo, ADNc ou ADN genómico) , moléculas de ARN (por exemplo, ARNm) , combinações de moléculas de ADN e ARN ou moléculas de ADN/ARN híbridas, e análogos de moléculas de ADN ou ARN. Tais análogos podem ser gerados utilizando, por exemplo, análogos de nucleotídeos, que incluem, mas não se limitam a, inosina ou bases tritiladas. Tais análogos podem também conter moléculas de ADN ou de ARN compreendendo estruturas modificadas que conferem atributos benéficos para as moléculas, tais como, por exemplo, resistência a nuclease ou uma maior capacidade de atravessar as membranas celulares. Os ácidos nucleicos ou sequências de nucleotídeos podem ser de cadeia simples, de cadeia dupla, podem conter tanto porções de cadeia simples como de cadeia dupla, e podem conter porções de cadeia tripla, mas é dada preferência ao ADN de cadeia dupla.

Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade do agente terapêutico suficiente para tratar ou controlar uma doença ou distúrbio. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode referir-se à quantidade de agente terapêutico suficiente para retardar ou minimizar o aparecimento da doença, por exemplo, atrasar ou minimizar a propagação do cancro. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também pode referir-se à quantidade do agente terapêutico, que proporciona um benefício terapêutico no tratamento ou controlo de uma doença. Além disso, uma quantidade terapeuticamente eficaz no que diz respeito a um agente terapêutico da invenção, significa a quantidade de agente terapêutico sozinho, ou em combinação com outras terapias, que proporciona um benefício terapêutico no tratamento ou controlo de uma doença.

Tal como aqui utilizados, os termos "agente profilático" e "agentes profiláticos" referem-se a qualquer(quaisquer) agente(s) que pode(m) ser utilizado(s) na prevenção de um distúrbio, ou na prevenção de recorrência ou propagação de um distúrbio. Uma quantidade profilaticamente eficaz pode referir-se à quantidade suficiente de agente profilático para prevenir a reincidência ou propagação de doença hiperproliferativa, particularmente cancro, ou a ocorrência de tal num paciente, incluindo mas não se limitando a pessoas predispostas à doença hiperproliferativa, por exemplo, os geneticamente predispostos ao cancro ou previamente expostos a agentes cancerígenos. Uma quantidade profilaticamente eficaz também pode referir-se à quantidade do agente profilático que proporciona um beneficio profilático na prevenção da doença. Além disso, uma quantidade profilacticamente eficaz no que diz respeito a um agente profiláctico da invenção significa a quantidade de agente profiláctico sozinho, ou em combinação com outros agentes, que proporciona um benefício profilático na prevenção da doença.

Tal como aqui utilizados, os termos "prevenir", "que previne" e "prevenção" referem-se à prevenção da recorrência ou aparecimento de um ou mais sintomas de um distúrbio num indivíduo como resultado da administração de um agente profilático ou terapêutico.

Tal como aqui utilizado, o termo "em combinação" refere-se ao uso de mais de um agente profilático e/ou terapêutico. 0 uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que os agentes profiláticos e/ou terapêuticos são administrados a um indivíduo com um distúrbio. Um primeiro agente profilático ou terapêutico pode ser administrado antes (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou posteriormente (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas após) a administração de um segundo agente profilático ou terapêutico a um indivíduo com um distúrbio. O termo "função efetora", tal como aqui utilizado, significa um evento bioquímico que resulta da interação de uma região de Fc de anticorpo com um recetor de Fc ou um ligante. As funções efetoras incluem, mas não estão limitadas à citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada por células dependentes de anticorpos (ADCP), e citotoxicidade dependente do complemento (CDC). As funções efetoras incluem tanto as que operam após a ligação de um antigeno como as que operam independentemente da ligação ao antigeno. O termo "célula efetora", tal como aqui utilizado, significa uma célula do sistema imunitário que expressa um ou mais recetores Fc e medeia uma ou mais funções efetoras. As células efetoras incluem, mas não estão limitadas a monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, células mastro, plaquetas, células B, linfócitos granulares grandes, células de Langerhans, células assassinas naturais (NK), e podem ser de qualquer organismo, incluindo, mas não se limitando a seres humanos, ratinhos, ratos, coelhos e macacos. 0 termo "ligante Fc" como aqui usado significa uma molécula, preferencialmente um polipeptideo, a partir de qualquer organismo que se ligue à região de Fc de um anticorpo para formar um complexo de Fc-ligante. Os ligantes Fc incluem, mas não estão limitados a, FcyRs, FcyRs, FcyRs, FcRn, Clq, C3, proteína A estafilocócica, proteína G de estreptococos, e FcyR virai. Os ligantes Fc podem incluir moléculas desconhecidas que se ligam a Fc.

4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG. 1 ESQUEMA DE SEQUÊNCIA DO DOMÍNIO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE DE 8B5.3.4 A representação do nucleotídeo e sequência de aminoácidos de 8B5.3.4 VL (SEQ ID NOS: 11 e 10, respetivamente). FIG. 2 ESQUEMA DE SEQUÊNCIA DO DOMÍNIO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA DE 8B5.3.4 A representação do nucleotídeo e sequência de aminoácidos de 8B5.3.4 VH (SEQ ID NOS: 12 e 9, respetivamente).

FIG. 3 ANÁLISE SDS-PAGE DE FcyR SOLÚVEL RECOMBINANTE A pureza das proteínas FcyR solúveis recombinantes foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%. Os géis foram corados com azul de Coomassie. Linha 1: FcyRIIIA solúvel recombinante purificado; Linha 2: marcador de peso molecular; Linha 3: marcador de peso molecular;

Linha 4: FcyRIIB solúvel recombinante purificado. Os traços referem-se ao peso molecular dos marcadores, de cima para baixo, que correspondem a um peso molecular de 98, 50, 36, e 22 kDa, respetivamente.

FIG. 4 ENSAIO ELISA DE FcyR SOLÚVEL RECOMBINANTE A ligação direta de FcyRIIIA solúvel recombinante purificado a IgG agregada e monomérica foi determinada utilizando um ensaio ELISA. A ligação de (A) IgG agregada a 3G8; (♦) IgG Biotinilada; () agregados de IgG; (X) agregados de IgG com IgGl de ratinho.

FIGS. 5 A E B CARACTERIZAÇÃO DO COMPLEXO TETRAMÉRICO DE FcyRIIIA UTILIZANDO UM ENSAIO ELISA A. O complexo solúvel tetramérico de FcyRIIIA liga-se especificamente a IgG humana monomérica solúvel. A ligação de FcyRIIIA tetramérico solúvel a IgG humana está bloqueada por 3 G8 (♦) , um anticorpo monoclonal anti-FcYlIIA de ratinho; o anticorpo monoclonal 4-4-20 portador da mutação D265A não foi capaz de bloquear a ligação de FcyRIIIA solúvel tetramérico a IgG humana agregada (Δ) . B. A ligação do complexo FcyRIIIA tetramérico solúvel a IgG humana monomérica solúvel () é comparada com a ligação de FcyRIIIA monomérico solúvel a IgG humana monomérica solúvel (♦) ·

FIGS. 6 A E B CARACTERIZAÇÃO DO COMPLEXO TETRAMÉRICO FcyRIIIA USANDO UM ENSAIO DE ESFERAS MAGNÉTICAS A. Complexo FcyRIIIA: dois FcyRIIIA (forma preenchida) são unidos por um anticorpo monoclonal DJl30c (Io Ab) ; o anti-ratinho F(ab)2 é conjugado com PE (circulo). B. Análise de FACS de FcyRIIIA ligado a esferas revestidas com Fc: (a) esferas sozinhas; (b) complexo sem FcyRIIIA; (c) complexo com FcyRIIIA; (d) complexo com FcyRIIIA e LNK16. FIG. 7 REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE CONSTRUÇÕES CONTENDO Fc

Um diagrama esquemático dos domínios Fc de IgGl clonados em pYDl é apresentado. A caixa aberta representa os domínios flexíveis CH2-CH3; as linhas verticais paralelas representam o domínio CHI. No caso das construções GIF206 e 227; os aminoácidos N-terminais são mostrados. Os resíduos sublinhados correspondem à região flexível; o * representa a etiqueta do epitopo Xpress; as caixas a tracejado representam o ligante Gly4-Ser, e as caixas a ponteado representam o gene Aga2p.

FIGS. 8A-H ANÁLISE FACS DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO DE Fc NA PAREDE CELULAR DE LEVEDURA

As células foram incubadas ou com um anticorpo policlonal Fc anti-humano de cabra conjugado com PE (FIGs. 8A-D) ou com HP6017 (Sigma), um anticorpo monoclonal específico Fc de IgGl anti-humana de ratinho (CH3) (FIGs 8E-H) . A e E representam o vector sozinho; Os painéis B e C representam a construção CH1-CH3; Os painéis C e G representam a GIF227; e os painéis D e H representam a construção GIF 206.

FIGS. 9A-C LIGAÇÃO DE FCTRIIIA TETRAMÉRICO SOLÚVEL À SUPERFÍCIE EXPOSTA DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DE FC

As células contendo pYDl-CHl (A); PYD-CH1-D265A (B) ; e o vector P YD (C) foram cultivadas sob condições para expressar proteínas de fusão Aga2p na superfície da célula. As células foram incubadas com FcyRIIIA a 0,15 mM, 7,5 mM e 7,5 mM, respetivamente, e analisadas por FACS. FIG. 10 CARACTERIZAÇÃO DA LIGAÇÃO DE FcyRIIIA TETRAMÉRICO SOLÚVEL À SUPERFÍCIE EXPOSTA DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DE Fc A ligação do complexo tetramérico FcyRIIIA a proteínas de fusão de Fc na superfície da célula de levedura foi analisada. Complexos tetraméricos de FcyRIIIA conjugados com PE foram pré-incubados com diferentes concentrações de 3 G8 (♦) , LNK (A) ou um controlo de isotipo irrelevante (), e subsequentemente incubados com as células de levedura. As células foram analisadas por FACS para a fluorescência EP. A percentagem de células, que se ligam ao complexo tetramérico de FcyRIIIA, foi representada graficamente no eixo y.

FIG. 11 EXEMPLO DE ORDENAÇÃO PARA A SELEÇÃO DE Mutantes de Fc COM O AUMENTO DA LIGAÇÃO A FcyRIIIA

As células foram coradas com complexos tetraméricos FcyRIIIA conjugados com PE (eixo y) e anticorpo conjugado anti-Fc-FITC (eixo x). A área dentro da caixa representa a ordenação para selecionar -1,0% da população de células.

FIGS. 12A-N ANÁLISE FACS DE ALGUNS DOS Mutantes de Fc IDENTIFICADOS COM UMA AFINIDADE AUMENTADA PARA COM COMPLEXOS TETRAMÉRICOS FcyRIIIA

Os clones individuais portadores do plasmídeo PYD CH1-Fc contendo mutações independentes de Fc foram amplificados em meio seletivo contendo glucose, induzidos para a expressão de Fc em meio seletivo contendo galactose e subsequentemente analisados por FACS. As FIGs. 12A e B representam células portadoras do tipo selvagem Fc; As FIGS. 12C e D representam o mutante # 5; As FIGS. 12E e F representam o mutante # 20; As FIGS. 12G e H representam o mutante # 21; As FIGS. 121 e J representam o mutante # 24; As FIGS. 12K e L representam o mutante # 25; As FIGS. 12M e N representam o mutante # 27. As células foram coradas com complexos tetraméricos FcyRIIIA (Figs. 12A, C, E, G, I, K, e M) ou complexo tetramérico FcyRIIB (figs. 12B, D, F, H, J, L e N) .

AS FIGS. 13 A-B CARACTERIZAÇÃO DE Mutantes de Fc NO ANTICORPO MONOCLONAL 4-4-20 POR ELISA

Domínios de Fc dos plasmídeos pYD-CHl foram clonados na cadeia pesada do anticorpo monoclonal quimérico 4-4-20. O anticorpo monoclonal 4-4-20 foi expresso em 293 células e os sobrenadantes foram recolhidos. As placas de ELISA foram revestidas com BSA conjugado com fluoresceína para capturar os anticorpos mutantes quiméricos 4-4-20. Recetores de FcyRIIIA (A) e (B) FcyRIIB foram então revestidos sobre as placas de ELISA nas quais os anticorpos monoclonais 4-4-20 tinham sido absorvidos, a fim de determinar as afinidades relativas dos recetores variantes para com os domínios Fc. Os mutantes # 15 e # 29 foram isolados não ligados incluídos como controlo. FIG. 14 ATIVIDADE ADCC DE MUTANTES NO ANTICORPO MONOCLONAL 4-4-20

Anticorpos 4-4-20 contendo regiões de Fc mutantes foram avaliados, em termos da sua atividade de ADCC e comparados com o anticorpo 4-4-20 do tipo selvagem com atividade de ADCC. Os mutantes analisados são os seguintes: MGFc-10 (K288N, A330S, P396L), MGFc-26 (D265A), MGFc-27 (G316D, A378V, D399E), MGFc28 (N315I, A379M, D399E), MGFc29 (F243I, V379L, G420V), MGFc30 (F275V), MGFc-31 (P247L, N421K), MGFc-32 (D280E, S354F, A431D, L441I), MGFc-33 (K317N, F423 eliminado), MGFc-34 (F241L, E258G), MGFc-35 (R255Q, K326E), MGFc-36 (K218R, G281D, G385R)

AS FIGS. 15 A E B. ATIVIDADE ADCC DE MUTANTES NO ANTICORPO MONOCLONAL HUMANIZADO HER2/NEU A. anticorpos monoclonais HER2/neu humanizados contendo regiões mutantes de Fc foram avaliados quanto à sua atividade de ADCC e comparados com a atividade de ADCC de um anticorpo de tipo selvagem Her2/neu. Os mutantes analisados são os seguintes: MGFc-5 (V379M), MGFc-9 (F243I, V379L), MGFc-10 (K288N, A330S, P396L), MGFc-13 (K334E, T359N, T366S), MGFc-27 (G316D, A378V, D399E). B. A atividade de ADCC de mutantes adicionais, no contexto do anticorpo monoclonal humanizado Her2/neu MGFc- 37 (K248M), MGFc-39 (E293V Q295E, A327T), MGFc-38 (K392T, P396L), MGFc-41 (H268N, P396L), MGFc-23 (K334E, R292L), MGFc-44, MGFc-45. Dois clones independentes foram testados para cada mutante.

FIG. 16 CAPTURA DO ANTICORPO CH 4-4-20 NA SUPERFÍCIE BSA— FITC 6 pL de anticorpo numa concentração de aproximadamente 20 pg/mL foram injetados a 5 pL/min ao longo de uma superfície de BSA-isotiocianato de fluoresceína (FITC). Um sensograma BIAcore da ligação de anticorpos ch 4-4-20 com regiões de Fc mutantes na superfície do sensor imobilizado BSA-FITC é mostrado. O marcador foi definido na resposta de anticorpos capturados do tipo selvagem.

FIG. 17 SENSOGRAMA DE LIGAÇÃO EM TEMPO REAL DE FCTRIIIA A ANTICORPOS CH 4-4-20 PORTADORES DE REGIÕES DE Fc VARIANTES A ligação de FcyRIIIA a anticorpos CH-4-4-20 que transportam regiões de Fc variantes foi analisada em 200 nM de concentração. As respostas foram normalizadas no plano do anticorpo ch 4-4-20 obtido para o tipo selvagem.

Os mutantes utilizados foram os seguintes: Mut 6 (S219V), Mut 10 (P396L, A330S, K288N); Mut 18 (K326E); Mut 14 (K334E, K288N); Mut 11 (R255L, F243L); Mut 16 (F372Y); Mut 19 (K334N, K246I).

FIGS. 18 A-H ANÁLISE DOS PARÂMETROS CINÉTICOS DA LIGAÇÃO DE FCrRIIIA AOS ANTICORPOS PORTADORES DE REGIÕES DE Fc VARIANTES

Os parâmetros cinéticos para ligação de FcyRIIIA a anticorpos portadores de regiões de Fc variantes foram obtidos através da geração de melhores curvas de ajuste separadas para 200 nM e 800 nM. A linha continua indica um ajuste de associação que foi obtido com base nos valores de k0ff calculados para as curvas de dissociação no intervalo de 32-34 seg. Os valores de Kd e k0ff representam a média das duas concentrações.

FIG. 19 SENSOGRAMA DE LIGAÇÃO EM TEMPO REAL DE PROTEÍNAS DE FUSÃO FcyRIIB-FC A ANTICORPOS PORTADORES DE REGIÕES DE Fc VARIANTES A ligação de proteínas de fusão FcyRIIB-Fc a anticorpos CH-4-4-20 que transportam regiões de Fc variantes foi analisada em 200 nM de concentração. As respostas foram normalizadas no plano do anticorpo ch 4-4-20 obtido para o tipo selvagem.

FIGS. 20 A-C ANÁLISE DOS PARÂMETROS CINÉTICOS DE PROTEÍNAS DE FUSÃO FcyRIIB-Fc PARA ANTICORPOS PORTADORES DE REGIÕES DE Fc VARIANTES

Os parâmetros cinéticos para ligação de FcyRIIB-Fc a anticorpos portadores de regiões de Fc variantes foram obtidos através da geração de melhores curvas de ajuste separadas para 200 nM e 800 nM. A linha contínua indica um ajuste de associação que foi obtido com base nos valores de k0ff calculados para as curvas de dissociação no intervalo de 32-34 seg. Os valores de Kd e k0ff representam a média das duas concentrações.

Os mutantes utilizados foram os seguintes: Mut 6 (S219V),

Mut 10 (P396L, A330S, K288N); Mut 18 (K326E); Mut 14 (K334E, K288N); Mut 11 (R255L, F243L); Mut 16 (F372Y); Mut 19 (K334N, K246I).

FIG. 21 RAZÕES DE K0ff (WT) /K0ff (MUT) PARA FcyRIIIA-Fc REPRESENTADO CONTRA DADOS ADCC

Os números mais elevados do que um mostram uma diminuição da taxa de dissociação para a ligação a FcyRIIIA e aumento da taxa de dissociação para a ligação a FcyRIIB-Fc em relação ao tipo selvagem. Os mutantes na caixa têm menor taxa de dissociação para a ligação a FcyRIIIA e maior taxa de dissociação para a ligação a FcyRIIB-Fc.

FIG. 22 CONCORRÊNCIA COM FcyRIIIA NÃO MARCADO

Uma peneira cinética foi implementada para identificar mutantes de região de Fc com melhores taxas de K0ff para ligação a FcyRIIIA. Uma biblioteca de variantes de região de Fc contendo a mutação P396L foi incubada com 0,1 μΜ de ligante biotinilado Avitag de FcyRIIIA durante uma hora e em seguida lavou-se. Posteriormente 0,8 μΜ de FcyRIIIA não marcado foram incubados com a levedura marcada para diferentes pontos do tempo. A levedura foi centrifugada e o FcyRIIIA não marcado foi removido, a levedura ligada ao recetor foi corada com SA (estreptavidina): PE (ficoeritrina) por análise de FACS.

FIGS. 23 A-C ANÁLISE FACS BASEADA NA PENEIRA CINÉTICA

Com base no valor K0ff calculado a partir dos dados apresentados na FIG. 22, uma seleção de ponto de tempo de um minuto foi escolhida. Um excesso de 10 vezes de biblioteca foi incubado com 0,1 μΜ de monómero biotinilado do ligante Avitag de FcyRIIIA; as células foram lavadas e incubadas com ligante não marcado, durante um minuto; em seguida, lavou-se e foram marcadas com SA: PE. As células foram, então, classificadas por FACS, escolhendo os melhores 0,3% de agentes ligantes. A biblioteca P396L não selecionada foi comparada com as células de levedura selecionadas para ligação melhorada por FACS. Os histogramas mostram a percentagem de células que são contidas com FcyRIIIA/ΡΕ e Fc/FITC de cabra anti-humano.

FIGS. 24 A-B SELEÇÃO BASEADA EM DEPLEÇÃO DE FASE SÓLIDA DE LIGANTES Fc DE FcyRIIB A. A biblioteca P396L foi rastreada com base na depleção de FcyRIIB e seleção de FcyRIIIA utilizando esferas magnéticas. A depleção de FcyRIIB por esferas magnéticas foi repetida 5 vezes. A população de levedura resultante foi analisada e verificou-se que apresentava mais de 50% das células coradas com Fc de cabra anti-humana e uma percentagem muito pequena de células coradas com FcyRIIIA. Subsequentemente, as células foram selecionadas por FACS duas vezes usando 0,1 μΜ de ligante biotinilado avitag de FcyRIIIA. As células de levedura foram analisadas tanto em termos de ligação a FcyRIIIA como a FcyRIIB depois de cada classificação e foram comparadas com a ligação ao tipo selvagem. B. Os mutantes de Fc foram selecionados a partir da população de leveduras empobrecida de FcyRIIB utilizando o monómero ligante biotinilado de FcyRIIIA 158F avitag como ligante. 0 gate de classificação foi criado para selecionar os melhores 0,25% ligantes de FcyRIIIA 158F. A população enriquecida resultante foi analisada por FACS em termos da ligação ao diferente FcyRIIIA (158F e 158v), FcyRIIIB e FcyRIIA (13IR).

FIG. 25 TAXAS RELATIVAS DE LISE CELULAR DO ALVO SKBR3 MEDIADA PELOS Mutantes de Fc PORTADORES DO 4D5 QUIMÉRICO

As taxas relativas de lise foram calculadas para cada mutante de Fc testado. As taxas de lise para o anticorpo 4D5 com mutantes de Fc foram divididas pela taxa de lise mediada pelo anticorpo de tipo selvagem 4D5. Os dados de pelo menos dois ensaios independentes foram calculados em média e representados graficamente no histograma. Para cada um dos mutantes de Fc, dados de duas concentrações de anticorpos diferentes são mostrados. As concentrações de anticorpos foram escolhidas para flanquear o ponto ao longo da curva na qual a lise ocorreu -50%.

FIG. 26 TAXAS RELATIVAS DE LISE CELULAR DAUDI MEDIADA PELOS MUTANTES DE FC PORTADORES DO 2H7 QUIMÉRICO

As taxas relativas de lise foram calculadas para cada mutante de Fc testado. As taxas de lise para o anticorpo 2H7 com mutantes de Fc foram divididas pela taxa de lise mediada pelo anticorpo de tipo selvagem 2H7. Os dados de pelo menos 1-2 ensaios independentes foram calculados em média e representados graficamente no histograma. Para cada um dos mutantes de Fc, dados de duas concentrações de anticorpos diferentes são mostrados. As concentrações de anticorpos foram escolhidas com base num ponto ao longo da curva na qual a lise ocorreu -50%. FIG. 27 ESQUEMA PARA A PRODUÇÃO DA BIBLIOTECA. cadeias de ADN são representadas. As setas para a frente representam primers contendo codões mutantes. A seta invertida representa o oligo especifico do gene. FIG. 28 ESTRATÉGIA PARA PRODUÇÃO DE BIBLIOTECAS ATRAVÉS DA CONSTRUIÇÃO DE UM PROTOCOLO DE GENES.

As caixas retangulares representam os domínios flexíveis CH2 e CH3, respetivamente. As linhas pretas curtas representam os oligos de cadeia dupla com 5' saliências. FIG. 29 NOVOS Mutantes de Fc MELHORAM A ADCC MEDIADA POR PBMC EM CÉLULAS SKBR3. 0 gráfico mostra a análise de regressão linear de um ensaio de ADCC padrão. 0 anticorpo foi titulado durante 3 ciclos usando uma proporção de efetor para alvo de 75: 1. % de lise = (liberação Experimental - SR)/(MR-SR) * 100. FIG. 30 NOVOS Mutantes de Fc MELHORAM A ADCC MEDIADA POR PBMC EM CÉLULAS DAUDI. O gráfico mostra a análise de regressão linear de um ensaio de ADCC padrão. 0 anticorpo foi titulado durante 3 ciclos usando uma proporção de efetor para alvo de 75: 1. % de lise = (liberação Experimental - SR)/(MR-SR) * 100. FIG. 31 PERFIS DO RECPETOR Fc VIA FACS COM TRATAMENTO COM CITOCINA DE MONÓCITOS. O tratamento com citocinas de monócitos aumenta a baixa afinidade de expressão do recetor Fc. Os monócitos elutriados foram cultivados utilizando citocinas específicas em meio livre de soro. Os perfis dos recetores de Fc foram ensaiados utilizando FACS.

FIG. 32 MELHORIA NA MORTE DE CÉLULAS TUMORAIS USANDO MUTANTES DE FC EM ADCC À BASE DE MONÓCITOS DERIVADOS DE MACRÓFAGOS A concentração de Ch4D5 MAb durante 2 ciclos foi testada utilizando uma razão efetor: alvo de 35: 1. A percentagem de lise foi calculada tal como na FIG. 30. FIG. 33 FLUXOGRAMA DO ENSAIO DE CITOTOXICIDADE DEPENDENTE DE COMPLEMENTO. O fluxograma resume os ensaios CDC utilizados. FIG.34 ATIVIDADE DE CITOTOXICIDADE DEPENDENTE DE COMPLEMENTO.

Os mutantes de Fc que apresentam ligação aumentada a FcyRIIIA também mostraram atividade do complemento. Anti-CD20 ChMAb em mais de 3 ordens de grandeza foi titulada. A percentagem de lise foi calculada como na FIG. 30. FIG. 35 ÁRVORE DE DECISÃO PARA SELEÇÃO DE Mutantes de Fc

Um protocolo exemplificativo para a seleção de mutantes de Fc. FIG. 36 LIGAÇÃO DE C1Q AO ANTICORPO 2B6 A. O diagrama ilustra o formato BIAcore de análise da ligação de 2B6 ao primeiro componente da cascata do complemento. B. Sensograma de ligação em tempo real do anticorpo 2B6 portador de regiões de Fc variantes a Clq. FIGS. 37 A-D LIGAÇÃO DE Clq AO ANTICORPO MUTANTE 2B6

Sensograma de ligação em tempo real de mutantes de 2B6 a Clq (3,25 nM). Os mutantes descritos em MgFc51 (Q419H, P396L); MgFc51/60 no Painel A; MgFc55 e MgFc55/60 (Painel B) , e MgFc59 e MgFc59/60 (painel C) ; e MgFc31/60 (painel D) .

FIGS. 38 A-D VARIANTES Fc COM DIMINUIÇÃO DA LIGAÇÃO A FcyRIIB A ligação do FcR a anticorpos ch4D5 para comparar o efeito da D270E (60) em R255L, duplo mutante P396L (MgFc55) . 0 valor de Kd foi analisado em diferentes concentrações de FcR; 400 nM de CD16A 158V; 800nM de CD16A 158F; 200nM de CD32B; 200nM de CD32A 131H. A análise foi feita utilizando Kd separado usando software Biacore 3000. FIGS. 39 A-D CARACTERÍSTICAS CINÉTICAS DE MUTANTES DE 4D5 SELECIONADOS A PARTIR DE DEPLEÇÕES DE FCrRIIB/SELEÇÃO DE FcyRIIAH131 A ligação de FcR a anticorpos ch4D5 portadores de diferentes mutações Fc selecionadas pela depleção de CD32B e estratégia de rastreio de CD32A H131. O valor de Kd foi analisado em diferentes concentrações de FcR; 400 nM de CD16A 158V; 800nM de CD16A 158F; 200nM de CD32B; 200nM de CD32A 131H. A análise foi feita utilizando Kd separado usando software Biacore 3000. FIG. 40. LOTE DE DADOS MDM ADCC CONTRA O K0ff DETERMINADO PARA A LIGAÇÃO DE CD32A 131H CONFORME DETERMINADO POR BIACORE.

Os mutantes são os seguintes: MgFc 25 (E333A, K334A, S298A); MgFc68 (D270E); MgFc38 (K392T, P396L); MgFc55 (R255L, P396L); MgFc31 (P247L, N421K); MgFc59(K370E, P396L).

FIGS. 41 A-B. ATIVIDADE ADCC DE MUTANTES NUM ANTICORPO MONOCLONAL QUIMÉRICO HER2/NEU

Anticorpos monoclonais quiméricos HER2/neu contendo regiões de Fc mutantes foram avaliados, em duplicado, em termos da sua atividade de ADCC e comparados o anticorpo quimérico Her2/neu do tipo selvagem com a atividade de ADCC. Os mutantes analisados são os seguintes: MGFc88 (F243L, R292P, Y300L, V305I, P396L), MGFc88A (F243L, R292P, Y300L, P396L), MGFC155 (F243L, R292P, Y300L).

FIGS. 42 A-B. PESO DO TUMOR ESTIMADO EM RATINHOS TRATADOS COM H2B6 DE FC MUTANTE OU DO TIPO SELVAGEM

Ratinhos Balb/c nus foram inoculados subcutaneamente com células de Daudi e administrados com 25 pg, 2,5 pg ou 0,25 pg de doses semanais de h2B6 de tipo selvagem (A) ou h2B6 portadora de mutante de Fc MGFc 0088 (F243L, R292P, Y300L, V305I, P396L) (B). Ratinhos administrados apenas com tampão foram utilizados como controlo. O peso do tumor foi calculado com base no volume estimado do tumor subcutâneo de acordo com a fórmula (comprimento2 x largura)/2.

FIGS. 43 A-B. SOBREVIVÊNCIA EM RATINHOS PORTADORES DE TUMOR TRATADOS COM H2B6 DE FC MUTANTE OU DO TIPO SELVAGEM

Ratinhos nus foram inoculados com células de Daudi e administrados com 25 pg, 2,5 pg ou 0,25 pg de doses semanais de h2B6 de tipo selvagem (A) ou h2B6 portadora de mutante de Fc MGFc 0088 (F243L, R292P, Y300L, V305I , P396L) (B) . Ratinhos administrados apenas com tampão foram utilizados como controlo.

5. DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS A presente invenção proporciona um polipeptideo compreendendo uma região de Fc de IgGl variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de IgGl de tipo selvagem, de tal modo que: (I) a referida região de Fc variante do referido polipeptideo se liga: (A) a FcyRIIIA com uma maior afinidade, e (B) a FcyRIIB com afinidade de ligação equivalente ou alterada; em que as referidas afinidades de ligação maiores, equivalentes ou alteradas são em relação às afinidades de ligação exibidas por tal polipeptideo ao dito FcyR se compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem; e (II) em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina; em que as posições são numeradas de acordo com o índice EU como em Rabat. A invenção refere-se a moléculas, de preferência polipeptídeos, e mais preferencialmente imunoglobulinas (por exemplo, anticorpos), que compreendem uma região de Fc variante, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, mas também incluindo inserções ou deleções) em uma ou mais regiões, cujas modificações alteram, por exemplo, aumentam ou diminuem, a afinidade da região de Fc variante para com um FcyR. Em algumas formas de realização, a invenção compreende as modificações à região de Fc, incluindo, mas não limitado a qualquer uma das modificações descritas na publicação nos EUA n° US 2005 037 000. Em algumas formas de realização, a invenção proporciona moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, região de Fc variante essa que se liga a FcyRIIIA com uma afinidade maior, em relação a uma molécula comparável, i. e., sendo a mesma que a referida molécula com uma região de Fc variante, mas que não tem a uma ou mais modificações de aminoácidos, compreendendo a região de Fc de tipo selvagem como determinada por métodos conhecidos por um perito na arte para a determinação de interações Fc-FcyR e métodos aqui descritos, por exemplo, um ensaio ELISA ou um ensaio de ressonância de plasmon de superfície. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando a FcyRIIIA com uma menor afinidade, em relação a uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem. Numa forma de realização preferida, as moléculas da invenção ainda se ligam especificamente a FcyRIIB (através da região de Fc) com uma afinidade mais baixa do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc do tipo selvagem se liga a FcyRIIB. Em algumas formas de realização, a invenção abrange moléculas, que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando a FcyRIIIA e FcyRIIB com uma maior afinidade, em relação a uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem. Noutras formas de realização, a invenção abrange moléculas, que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando a FcyRIIB com uma maior afinidade, em relação a uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem. Noutras formas de realização, a invenção abrange moléculas, que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando a FcyRIIB com uma menor afinidade, em relação a uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, região de Fc variante essa que não mostra uma ligação detetável a qualquer um de FcyR (p.ex., não se liga a FcyRIIA, FcyRIIB, ou FcyRIIIA, como determinado, por exemplo, num ensaio ELISA), em relação a uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando apenas a um FcyR, em que o referido FcyR é FcyIIIA. São também aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando apenas a um

FcyR, em que o referido FcyR é FcyRIIA. São também aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante se ligando apenas a um FcyR, em que o referido FcyR é FcyRIIB. A invenção refere-se particularmente à modificação de anticorpos terapêuticos humanos ou humanizados (por exemplo, anticorpos monoclonais anti-angiogénicos ou anti-inflamatórios específicos de tumores) para aumentar a eficácia de anticorpos terapêuticos, aumentando, por exemplo, a função efetora dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, aumentando a ADCC.

As afinidades e propriedades de ligação das moléculas da invenção a um FcyR são inicialmente determinadas utilizando ensaios in vitro (ensaios com base imunológica ou bioquímica) conhecidos na técnica para determinar as interações Fc-FcyR, isto é, a ligação específica de uma região de Fc a um FcyR incluindo mas não limitado a ensaio de ELISA, ensaio de ressonância de plasmon de superfície, ensaios de imunoprecipitação (Ver Secção 5.2.5.1) . De preferência, as propriedades de ligação das moléculas da presente invenção também são caracterizadas por ensaios funcionais in vitro para determinar uma ou mais funções das células efetoras mediadoras de FcyR (ver secção 5.2.7). Na maioria das formas de realização preferidas, as moléculas da invenção têm propriedades de ligação semelhantes em modelos in vivo (tal como os aqui descritos e divulgados) e os ensaios com base in vitro. No entanto, na presente invenção não se excluem moléculas da invenção que não exibam o fenótipo desejado em ensaios com base in vitro mas que exibem o fenótipo desejado in vivo.

As moléculas da presente divulgação que compreendem uma região de Fc variante compreendem pelo menos uma modificação de aminoácidos no domínio CH3 da região de Fc, que é definida como se estendendo desde os aminoácidos 342-447. Noutros exemplos, as moléculas da presente divulgação que compreendem uma região de Fc variante compreendem pelo menos uma modificação de aminoácidos no domínio CH2 da região de Fc, que é definida como se estendendo desde os aminoácidos 231-341. Em alguns exemplos, as moléculas da divulgação aqui descritas compreendem, pelo menos, duas modificações de aminoácidos, em que uma modificação é na região CH3 e uma modificação é na região de CH2. A divulgação engloba ainda a modificação de aminoácidos na região flexível. As moléculas aqui divulgadas com uma ou mais modificações de aminoácidos nos domínios CH2 e/ou CH3 têm afinidades alteradas para com um FcyR como determinado utilizando métodos aqui descritos ou conhecidos de um perito na arte. A presente divulgação engloba modificações de aminoácidos no domínio CHI da região de Fc. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante em que a referida variante tem uma ligação aumentada a FcyRIIA (CD32A) e/ou um aumento da atividade de ADCC, conforme medido usando métodos conhecidos de um perito na arte e aqui exemplificados. Os ensaios de ADCC utilizados em conformidade com os métodos da invenção podem ser dependentes de NK ou dependentes de macrófagos.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras modificações de Fc, incluindo mas não se limitando a alterações que modificam a função efetora e modificação que altere a afinidade de ligação a FcyR. Num exemplo particular, uma variante de Fc da presente divulgação que compreende uma primeira modificação de aminoácidos no domínio CH3, domínio CH2 ou região flexível, pode ser combinada com uma segunda modificação de Fc de tal modo que a segunda modificação de Fc não está no mesmo domínio que a primeira, de modo que a primeira modificação de Fc confere uma propriedade aditiva, sinérgica ou nova à segunda modificação de Fc. Em alguns exemplos, as variantes de Fc da presente invenção não têm qualquer modificação de aminoácidos no domínio CH2.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com qualquer uma das modificações de Fc conhecidas na arte, tais como as divulgadas na Tabela 2 abaixo.

Noutras formas de realização, as variantes Fc da presente invenção podem ser combinadas com quaisquer das modificações de Fc conhecidas na arte tais como as descritas nas Tabelas 3A e B abaixo.

Descreve-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula tem uma afinidade alterada para um FcyR, desde que a referida região de Fc variante não tenha uma substituição nas posições que fazem um contacto direto com FcyR com base na análise cristalográfica e estrutural de interações Fc-FcyR tais como as divulgadas por Sondermann et al, (2000 Nature, 406.: 267-273, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Exemplos de posições dentro da região de Fc que fazem um contacto direto com FcyR são os aminoácidos 234-239 (região de charneira), aminoácidos 265-269 (ansa B/C), aminoácidos 297-299 (ansa C'/E), e os aminoácidos 327-332 (ansa F/G). Em alguns exemplos, as moléculas aqui divulgadas, que compreendem regiões de Fc variantes compreendem a modificação de pelo menos um resíduo que faz um contacto direto com um FcyR com base na análise estrutural e cristalográfica. O domínio de interação de FcyR mapeia a região flexível inferior e seleciona sítios dentro dos domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada de IgG. Os resíduos de aminoácidos que flanqueiam as posições reais de contacto e os resíduos de aminoácidos no domínio CH3 desempenham um papel em interações de IgG/FcYR como indicado por estudos de mutagénese e estudos que utilizam inibidores peptidicos pequenos, respectivamente (Sondermann et al, 2000 Nature, 406: 267-273; Diesenhofer et al., 1981, Biochemistry, 20: 2361-2370; Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591- 6604, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência na sua totalidade). O contacto direto, tal como aqui utilizado refere-se aos aminoácidos que estão dentro de, pelo menos, IA, pelo menos, 2, ou, pelo menos, 3 angstroms um do outro ou um dentro de 1 Â, 1,2 Â, 1,5 Á, 1,7 Â ou 2 Â raio de Van Der Waals. Uma lista com exemplos de locais previamente identificados no Fc que efetuam ligação das proteínas que interagem com Fc está listada na Tabela 4 abaixo. Em algumas formas de realização, a invenção engloba variantes de Fc que não têm quaisquer modificações nos locais listados abaixo. Noutras formas de realização, a invenção engloba variantes de Fc que compreendem modificações de aminoácidos num ou mais locais listados abaixo em combinação com outras modificações aqui divulgadas, de tal modo que a modificação tem um efeito sinérgico ou aditivo sobre a propriedade do mutante.

A Tabela 4 mostra os locais dentro da região de Fc, que foram previamente identificados como sendo importantes para a interação Fc-FcR. Colunas marcadas com FcR-Fc identificam a cadeia de Fc contactada pelo FcR. As letras identificam a referência em que os dados foram citados. C é Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591-6604; D é Jefferis et ai., 1995, Immunol. Lett. 44: 111-7; E é Hinton et al; 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6; F é Idusogie et al., 2000, J. Immunol. 164: 4178-4184.

Descreve-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula se liga a um FcyR com uma afinidade alterada em relação a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem, desde que a referida região de Fc variante não inclua, ou não seja unicamente uma substituição em qualquer das posições 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359; 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439. Divulga-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula se liga a um FcyR com uma afinidade alterada em relação a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem, desde que a referida região de Fc variante não tenha ou não seja unicamente uma substituição em qualquer uma das posições 255, 258, 267, 269, 270, 276, 278, 280, 283, 285, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 300, 303, 305, 307, 309, 322, 329, 332, 331, 337, 338, 340, 373, 376, 416, 419, 434, 435, 437, 438, 439 e não tenha uma alanina em qualquer das posições 256, 290, 298, 312, 333, 334, 359, 360, 326, ou 430; uma lisina na posição 330; uma treonina na posição 339; uma metionina na posição 320; uma serina na posição 326; uma asparagina na posição 326; um ácido aspártico na posição 326; um ácido glutâmico na posição 326; uma glutamina na posição 334; um ácido glutâmico na posição 334; uma metionina na posição 334; uma histidina na posição 334; uma valina na posição 334; ou uma leucina na posição 334; uma lisina na posição 335; uma asparagina na posição 268; uma glutamina na posição 272; uma glutamina, serina, ou ácido aspártico na posição 286; uma serina na posição 290; uma metionina, glutamina, ácido glutâmico, ou arginina na posição 320; um ácido glutâmico na posição 322; uma serina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico na posição 326; uma lisina na posição 330; uma glutamina na posição 335; ou uma metionina na posição 301.

Descreve-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante não ten ou não é apenas uma substituição em qualquer uma das posições 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, ou 439 e não tem uma histidina, glutamina, ou tirosina na posição 280; uma serina, glicina, treonina ou tirosina na posição 290, uma leucina ou isoleucina na posição 300; uma asparagina na posição 294, uma prolina na posição 296; uma prolina, asparagina, ácido aspártico ou valina na posição 298; uma lisina na posição 295. Divulga-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula se liga a um FcyR com afinidade reduzida em relação a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem, desde que a referida região de Fc variante não tenha ou não seja apenas uma substituição em qualquer das posições 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438, ou 439. Divulga-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que a referida molécula se liga a um FcyR com uma afinidade melhorada em relação a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem, desde que a referida região de Fc variante não tenha ou não seja apenas uma substituição em qualquer das posições 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, ou 430.

Divulga-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante não inclui ou não tem exclusivamente, uma substituição em qualquer das posições 330, 243, 247, 298, 241, 240, 244, 263, 262, 235, 269, ou 328 e não tem uma leucina na posição 243, uma asparagina na posição 298, uma leucina na posição 241 e isoleucina ou uma alanina na posição 240, uma histidina na posição 244, uma valina na posição 330, ou uma isoleucina na posição 328.

As moléculas aqui divulgadas com afinidades alteradas para com recetores de ativação e/ou inibitórios com regiões de Fc variantes, que têm uma ou mais modificações de aminoácidos, em que a referida uma ou mais modificações de aminoácidos é uma substituição na posição 288 por asparagina, na posição 330 por serina e na posição 396 por leucina (MgFclO) (Ver Tabelas 5 e 6) ; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 359 por asparagina, e na posição 366 por serina (MgFcl3) ; ou uma substituição na posição 316 por ácido aspártico, na posição 378 por valina, e na posição 399 por ácido glutâmico (MgFc27); ou uma substituição na posição 392 por treonina, e na posição 396 por leucina (MgFc38); ou uma substituição na posição 221 por ácido glutâmico, na posição 270 por ácido glutâmico, na posição 308 por alanina, na posição 311 por histidina, na posição 396 por leucina, e na posição 402 por ácido aspártico (MgFc42); ou uma substituição na posição 240 por alanina, e na posição 396 por leucina (MgFc52); ou uma substituição na posição 410 com histidina, e na posição 396 por leucina (MgFc53); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 305 com isoleucina, na posição 378 por ácido aspártico, na posição 404 por serina, e na posição 396 por leucina (MgFc54); ou uma substituição na posição 255 por isoleucina e na posição 396 por leucina (MgFc55); ou uma substituição na posição 370 por ácido glutâmico na posição 396 por leucina (MgFc59); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina (MgFc88); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, e na posição 396 por leucina (MgFc88A); ou uma substituição na posição 234 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina (MgFcl55); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, e na posição 292 por prolina; ou uma substituição na posição 243 por leucina; ou uma substituição na posição 273 por fenilalanina.

Descreve-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 396 por leucina, na posição 270 por ácido glutâmico e na posição 243 por leucina. A molécula compreende ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, tais como as aqui divulgadas. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante possuindo uma modificação de aminoácidos numa ou mais das seguintes posições: 119, 125, 132, 133, 141, 142, 147, 149, 162, 166, 185, 192, 202, 205, 210, 214, 217, 219, 215, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 288, 229, 231, 232, 233, 235, 240, 241, 242, 243, 244, 246, 247, 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 258, 261, 262, 263, 268, 269, 270, 272, 273, 274, 275, 276, 279, 280, 281, 282, 284, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 295, 298, 300, 301, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 323, 326, 327, 328, 330, 333, 334, 335, 337, 339, 340, 343, 344, 345, 347, 348, 352, 353, 354, 355, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 369, 370, 371, 372, 375, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 440, 401, 402, 404, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 414, 415, 416417, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 427, 428, 431, 433, 435, 436, 438, 440, 441, 442, 443, 446, 447. De preferência, tais mutações resultam em moléculas que têm uma afinidade alterada para com um FcyR e/ou têm uma função efetora alterada mediada por células conforme determinado utilizando os métodos aqui revelados e exemplificados e conhecidos de um perito na arte. São aqui divulgadas moléculas compreendendo regiões de Fc variantes que consistem em, ou compreendem qualquer uma das mutações listadas na Tabela 5 abaixo.

São aqui divulgadas moléculas compreendendo regiões de Fc variantes com mais de duas modificações de aminoácidos.

Um exemplo não limitativo de tais variantes está enumerado na tabela abaixo (Tabela 6). A presente divulgação abrange mutações enumeradas na Tabela 6 que compreendem ainda uma ou mais modificações de aminoácidos tais como as aqui descritas.

Em algumas formas de realização, as moléculas, de preferência, as imunoglobulinas da invenção compreendem ainda um ou mais locais de glicosilação, de modo que uma ou mais porções de hidratos de carbono estão covalentemente ligadas à molécula. De preferência, os anticorpos da invenção com um ou mais locais de glicosilação e/ou uma ou mais modificações na região de Fc têm uma função efetora mediada por anticorpos melhorados, por exemplo, a atividade ADCC aumentada. Em algumas formas de realização, a invenção compreende ainda anticorpos compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos que são conhecidos direta ou indiretamente por interagir com uma porção de hidratos de carbono do anticorpo, incluindo, mas não se limitando a aminoácidos nas posições 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299, e 301. Os aminoácidos que, direta ou indiretamente, interagem com uma porção de hidratos de carbono de um anticorpo são conhecidos na arte, ver, por exemplo, Jefferis et al., 1995 imunologia Letters, 44: 111-7. A invenção engloba anticorpos que foram modificados pela introdução de um ou mais locais de glicosilação num ou mais locais de anticorpos, de preferência, sem alterar a funcionalidade do anticorpo, por exemplo, a atividade de ligação a FcyR. Os locais de glicosilação podem ser introduzidos na região variável e/ou constante dos anticorpos da invenção. Tal como aqui utilizados, "locais de glicosilação" incluem qualquer sequência específica de aminoácidos num anticorpo ao qual um oligossacárido (ou seja, hidratos de carbono contendo dois ou mais açúcares simples ligados entre si) se ligará especificamente e covalentemente. As cadeias laterais de oligossacáridos estão tipicamente ligadas ao esqueleto de um anticorpo através de ligações ou O. A N-glicosilação refere-se à ligação de uma porção de oligossacáridos à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. A glicosilação ligada a O refere-se à ligação de uma porção de oligossacáridos a um hidroxiaminoácido, por exemplo, serina, treonina. Os anticorpos da invenção podem compreender um ou mais locais de glicosilação, incluindo locais de glicosilação ligados a N e a O. Qualquer local de glicosilação para a glicosilação ligada a N ou 0 conhecida na arte pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Um local de glicosilação ligado a N exemplar que é útil de acordo com os métodos da presente invenção, é a sequência de aminoácidos: Asn-X-Thr / Ser, em que X pode ser qualquer aminoácido e Thr/Ser indica uma treonina ou uma serina. Um tal local ou locais podem ser introduzidos num anticorpo da invenção, utilizando métodos bem conhecidos na arte à qual esta invenção pertence. Veja-se, por exemplo, "In vitro Mutagenesis", Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, Nova Iorque, 1983, capítulo 8, pp. 106-116. Um método exemplificativo para a introdução de um sítio de glicosilação num anticorpo da invenção pode compreender: a modificação ou mutação de uma sequência de aminoácidos do anticorpo de modo que a sequência Asn-X-Thr/Ser desejada seja obtida.

Em algumas formas de realização, a invenção abrange métodos para a modificação do conteúdo de hidratos de carbono de um anticorpo da invenção, adicionando ou excluindo um local de glicosilação. Os métodos para modificar o teor de hidratos de carbono de anticorpos são bem conhecidos na arte e englobados no âmbito da invenção, ver, por exemplo, as Patentes nos EUA n° 6,218,149; EP 0 359 096 Bl; Publicação nos EUA n° US 2002/0028486; WO 03/035835; Publicação nos EUA n°2003/0115614; Patente nos EUA n° 6,218,149; Patente nos EUA n° 6,472,511. Noutras formas de realização, a invenção abrange métodos para a modificação do conteúdo de hidratos de carbono de um anticorpo da invenção por eliminar uma ou mais porções endógenas de hidratos de carbono do anticorpo. Numa forma de realização específica, a invenção abrange a deslocação do local de glicosilação da região de Fc de um anticorpo, modificando as posições adjacentes a 297. Numa forma de realização específica, a invenção engloba a modificação da posição 296 de modo que a posição 296 e não a posição 297 seja glicosilada.

5.1 POLIPEPTÍDEOS E ANTICORPOS COM REGIÕES DE Fc VARIANTES A presente invenção é baseada, em parte, na identificação de regiões de Fc de cadeia pesada de IgGl humana mutante, com afinidades alteradas para com diferentes recetores FcyR, através de um sistema de exibição de leveduras. Em conformidade, a invenção refere-se a moléculas, de preferência polipeptídeos, e mais preferencialmente imunoglobulinas (por exemplo, anticorpos), que compreendem uma região de Fc variante, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, mas também incluindo inserções ou deleções) em uma ou mais regiões, cujas modificações alteram a afinidade da região de Fc variante para com um FcyR.

Será apreciado por um perito na arte que, além das substituições de aminoácidos, a presente invenção contempla outras modificações da sequência de aminoácidos da região de Fc de forma a gerar uma região de Fc variante com uma ou mais propriedades alteradas, por exemplo, função efetora alterada. A invenção contempla a deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos da região de Fc de modo a reduzir a ligação a um FcyR. De preferência, não mais do que 5, não mais do que 10, não mais do que 20, não mais do que 30, não mais do que 50 resíduos da região de Fc serão excluídos de acordo com esta forma de realização da invenção. A região de Fc do presente documento compreendendo uma ou mais deleções de aminoácidos irá de preferência reter pelo menos cerca de 80%, e de preferência pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, da região de

Fc de tipo selvagem. Em algumas formas de realização, uma ou mais propriedades das moléculas são mantidas tal como, por exemplo, a não imunogenicidade, ligação a FcyRIIIA, ligação a FcyRIIA, ou uma combinação destas propriedades.

Em formas de realização alternativas, a invenção abrange a inserção de aminoácidos para gerar as variantes de região de Fc, variantes essas que possuem propriedades alteradas incluindo a função efetora alterada. Numa forma de realização especifica, a invenção engloba a introdução de pelo menos um resíduo de aminoácidos, por exemplo, um ou dois resíduos de aminoácidos e de preferência não mais do que 10 resíduos de aminoácidos adjacentes a uma ou mais das posições da região de Fc aqui identificada. Em formas de realização alternativas, a invenção engloba ainda a introdução de pelo menos um resíduo aminoácidos, por exemplo, um ou dois resíduos de aminoácidos e de preferência não mais do que 10 resíduos de aminoácidos adjacentes a uma ou mais das posições da região de Fc conhecida na arte como tendo impacto sobre a interação e/ou ligação a FcyR. A invenção abrange ainda a incorporação de aminoácidos não naturais para gerar as variantes de Fc da invenção. Tais métodos são conhecidos dos peritos na arte, tais como aqueles que utilizam a maquinaria biossintética natural para permitir a incorporação de aminoácidos não naturais em proteínas, ver, por exemplo, Wang et ai., 2002 Chem. Comm. 1: 1-11; Wang et al., 2001, Science, 292: 498-500; van Hest et al. , 2001. Chem. Comm. 19: 1897-1904, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência na sua totalidade). Estratégias alternativas focam as enzimas responsáveis pela biossíntese de aminoacilo-ARNt, ver, por exemplo, Tang et ai., 2001, J. Am. Chem. 123(44) : 11089-11090; Kiick et al.r 2001, FEBS Lett. 505(3): 465.

As afinidades e propriedades de ligação das moléculas da invenção a um FcyR são inicialmente determinadas utilizando ensaios in vitro (ensaios com base imunológica ou bioquímica) conhecidos na técnica para determinar as interações Fc-FcyR, isto é, a ligação específica de uma região de Fc a um FcyR incluindo mas não limitado a ensaio de ELISA, ensaio de ressonância de plasmon de superfície, ensaios de imunoprecipitação (Ver Secção 5.2.5.1) . De preferência, as propriedades de ligação das moléculas da presente invenção também são caracterizadas por ensaios funcionais in vitro para determinar uma ou mais funções das células efetoras mediadoras de FcyR (ver secção 5.2.7) . Na maioria das formas de realização preferidas, as moléculas da invenção têm propriedades de ligação semelhantes em modelos in vivo (tal como os aqui descritos e divulgados) e os ensaios com base in vitro. No entanto, na presente invenção não se excluem moléculas da invenção que não exibam o fenótipo desejado em ensaios com base in vitro mas que exibem o fenótipo desejado in vivo. Um fluxograma representativo do rastreio e caracterização de moléculas da invenção é descrito na FIG. 35. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante que se liga com uma afinidade maior a um ou mais FcyRs. Tais moléculas, de preferência mediam a função efetora de modo mais eficaz como discutido infra. São aqui divulgadas moléculas que compreendem uma região de Fc variante que se liga com uma afinidade menor a um ou mais FcyRs. A redução ou eliminação da função efetora é desejável, em certos casos, por exemplo no caso de anticorpos cujo mecanismo de ação envolve o bloqueio ou antagonismo mas não a morte das células portadoras de um antigeno alvo. A redução ou eliminação da função efetora seria desejável nos casos de doença autoimune onde uma bloquearia os recetores ativadores de FcyR nas células efetoras (Este tipo de função estaria presente nas células hospedeiras). De um modo geral, a função efetora melhorada seria direcionada para células tumorais e estrangeiras.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras modificações de Fc, incluindo mas não se limitando a alterações que modificam a função efetora. A invenção engloba uma combinação de Fc variante da invenção com outras modificações Fc para fornecer propriedades aditivas, sinérgicas, ou novas em anticorpos ou fusões de Fc. De preferência, as variantes de Fc da invenção melhoram o fenótipo da modificação com a qual estão combinadas. Por exemplo, se uma variante de Fc da invenção for combinada com um mutante que se sabe ligar a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem; a combinação com um mutante da invenção resulta num maior realce de vezes na afinidade de FcyRIIIA.

Numa forma de realização, as variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras variantes de Fc, tais como as divulgadas em Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et ai., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al. 1995, Proc Natl. Acad Sei USA 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, J Immunol 157:49634969; Armour et al, 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:41784184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 27 6:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); US 5,624,821; US 5,885,573; US 6,194,551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572.

Em algumas formas de realização, as variantes de Fc da presente invenção são incorporadas num anticorpo ou fusão de Fc que compreende uma ou mais glicoformas modificadas, i. e., uma composição de hidratos de carbono que está ligada covalentemente a uma molécula compreendendo uma região de Fc, em que a referida composição de hidratos de carbono difere quimicamente da de uma molécula-mãe que compreende uma região de Fc. As glicoformas modificadas podem ser úteis para uma variedade de fins, incluindo mas não se limitando a aumentar ou reduzir a função efetora. As glicoformas modificadas podem ser geradas por qualquer método conhecido de um perito na arte, por exemplo pela utilização de estirpes manipuladas ou de expressão variante, por co-expressão com uma ou mais enzimas, por exemplo Dl N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIll), por expressão de uma molécula que compreende uma região de Fc em várias linhas celulares ou organismos a partir de vários organismos, ou por modificação de hidratos de carbono depois da molécula compreendendo a região de Fc ter sido expressa. Os métodos para gerar glicoformas modificadas são conhecidos na arte, e incluem, mas não estão limitados aos descritos em Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol

Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113, 929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, NJ) ; GlycoMAb™ glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland) ver, por exemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

As variantes de Fc da presente divulgação podem ser otimizadas para uma variedade de propriedades. As propriedades que podem ser otimizadas incluem mas não estão limitadas a afinidade aumentada ou reduzida para com um FcyR, função efetora aumentada ou reduzida. Num exemplo preferido, as variantes de Fc da presente divulgação são otimizadas para possuir afinidade melhorada para um FcyR de ativação humano, de preferência FcyR, FcyRIIA, FcyRIIc, FcyRIIIA, e FcyRIIIB, mais preferencialmente FcyRIIIA. Num exemplo preferido alternativo, as variantes de Fc são otimizadas para possuir afinidade reduzida para o recetor inibitório FcyRIIB humano. Estes exemplos preferidos são antecipados para proporcionar anticorpos e fusões Fc com propriedades terapêuticas melhoradas em seres humanos, por exemplo, a função efetora aumentada e uma maior potência anticancro, tal como descrito e exemplificado aqui. Estes exemplos preferidos são esperados para fornecer anticorpos e fusões Fc com eliminação de tumor reforçada em modelos de tumores de xenotransplante de ratinhos.

Num exemplo alternativo as variantes de Fc da presente divulgação são otimizadas para ter afinidade reduzida para com um FcyR humano, incluindo mas não se limitando a FcyRI,

FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIc, FcyRIIIA, e FcyRIIIB. Estes exemplos são antecipados para proporcionar anticorpos e fusões de Fc compropriedades terapêuticas melhoradas em seres humanos, por exemplo, redução da função efetora e da toxicidade.

Nos exemplos alternativos as variantes de Fc da presente divulgação possuem afinidade aumentada ou reduzida para FcyRs de organismos não-humanos, incluindo, mas não limitados a ratinhos, ratos, coelhos e macacos. As variantes de Fc que estão otimizadas para a ligação a um FcyR não humano podem encontrar utilização em experimentação. Por exemplo, modelos de ratinho estão disponíveis para uma variedade de doenças que permitem o teste de propriedades tais como a eficácia, toxicidade e farmacocinética para um dado fármaco candidato. Como é conhecido na arte, as células cancerosas podem ser enxertadas ou injetadas em ratinhos para imitar um cancro humano, um processo conhecido como xeno-enxerto. Ensaios de anticorpos ou fusões de Fc que compreendem variantes de Fc que foram otimizadas para um ou mais FcyRs de ratinho, podem fornecer informação valiosa no que respeita à eficácia do anticorpo ou fusão de Fc, e seu mecanismo de ação.

Embora seja preferido alterar a ligação a um FcyR, a presente divulgação contempla ainda variantes de Fc com afinidade de ligação alterada para com o recetor neonatal (FcRn). Embora não pretendendo estar ligado a um mecanismo particular de ação, espera-se que a região de Fc variante com uma maior afinidade para com FcRn tenha meias-vidas no soro mais longas, e tais moléculas irão ter aplicações úteis em métodos de tratamento de mamíferos onde a meia- vida longa do polipeptídeo administrado é desejada, por exemplo, para tratar uma doença ou distúrbio crónicos Embora não se pretenda estar limitado por um mecanismo de ação particular, as variantes de região de Fc com redução da afinidade de ligação ao FcRn, pelo contrário, espera-se ter semividas mais curtas, e estas moléculas podem, por exemplo, ser administradas a um mamífero em que uma circulação encurtada de tempo pode ser vantajosa, por exemplo, para imagiologia de diagnóstico in vivo ou para polipeptídeos que possuem efeitos colaterais tóxicos, quando deixados em circulação na corrente sanguínea por períodos prolongados. As variantes de região de Fc com redução da afinidade de ligação ao FcRn são antecipadas como sendo menos suscetíveis de atravessar a placenta, e podem assim ser utilizadas no tratamento de doenças ou patologias em mulheres grávidas.

Noutros exemplos, estas variantes podem ser combinadas com outras modificações conhecidas de Fc com afinidade FcRn alterada, tais como as divulgadas nas Publicações Internacionais n° WO 98/23289; e WO 97/34631; e Patente nos EUA n° 6,277,375, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A invenção abrange qualquer outro método conhecido na arte para gerar anticorpos que possuem uma maior semivida in vivo, por exemplo, através da introdução de uma ou mais alterações de aminoácidos (isto é, substituições, inserções ou deleções) para um domínio constante da IgG) . Ver, por exemplo, a Publicação Internacional n° WO 98/23289; e WO 97/34631; e Patente nos EUA n° 6,277,375, para ser utilizado em combinação com as variantes de Fc da invenção. Além disso, os anticorpos da invenção podem ser conjugados com a albumina, a fim de fazer o anticorpo ou fragmento de anticorpo mais estável in vivo ou ter uma semivida mais longa in vivo. As técnicas bem conhecidas na arte, ver, por exemplo, Publicações Internacionais n° WO 93/15199, WO 93/15200, e WO 01/77137, e Patente Europeia N°. EP 413,622. A (s) variante(s) aqui descrita(s) podem ser sujeitas a mais modificações, muitas vezes dependendo do uso pretendido da variante. Tais modificações podem envolver alteração adicional da sequência de aminoácidos (substituição, inserção e/ou deleção de resíduos de aminoácidos), fusão de polipeptídeo(s) heterólogo(s) e/ou modificações covalentes. Tais outras modificações podem ser efetuadas antes de, em simultâneo com, ou após, a(s) modificação (ões) de aminoácidos aqui divulgadas o que resulta em propriedades alteradas tais como uma alteração da ligação ao recetor Fc e/ou atividade ADCC.

Em alternativa, ou além disso, a invenção engloba a combinação das modificações de aminoácidos aqui divulgadas com uma ou mais outras modificações de aminoácidos que alteram a ligação Clq e/ou a função de citotoxicidade dependente de complemento da região de Fc, tal como determinado in vitro e / ou in vivo. De preferência, a molécula de partida de interesse particular aqui é geralmente uma que se liga a Clq e exibe citotoxicidade dependente do complemento (CDC). As restantes substituições de aminoácidos descritas no presente documento geralmente servem para alterar a capacidade da molécula de partida para se ligar a Clq e/ou modificar a sua função de citotoxicidade dependente de complemento, por exemplo, para reduzir e, preferivelmente, abolir estas funções efetoras. Em outras formas de realização, as moléculas compreendendo substituições numa ou mais das posições descritas com função de ligação melhorada a Clq e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) estão aqui contempladas. Por exemplo, a molécula de partida pode ser incapaz de se ligar a Clq e/ou mediar CDC e pode ser modificada de acordo com os presentes ensinamentos de tal modo que ela adquire estas outras funções efetoras. Além disso, as moléculas com atividade de ligação preexistente Clq, opcionalmente possuindo ainda a capacidade para mediar CDC podem ser modificadas de tal modo que uma ou ambas as atividades são alteradas, por exemplo, aumentadas. Em algumas formas de realização, a invenção abrange regiões de Fc variantes com atividade de CDC alterada sem qualquer alteração na ligação a Clq. Em ainda outras formas de realização, a invenção abrange regiões de Fc variantes com atividade de CDC alterada e ligação a Clq modificada.

Para gerar uma região de Fc com ligação a Clq alterada e/ou função de citotoxicidade dependente de complemento (CDC), as posições de aminoácidos a serem modificadas são geralmente selecionadas a partir das posições 270, 322, 326, 327,329, 331, 333, e 334, em que a numeração dos resíduos de uma cadeia pesada de IgG é a do índice EU como em Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (199) . Estas modificações de aminoácidos podem ser combinadas com uma ou mais modificações de Fc aqui divulgadas para proporcionar um efeito sinérgico ou aditivo na ligação de Clq e/ou atividade CDC. Em outras formas de realização, a invenção engloba variantes de Fc com ligação a Clq alterada e/ou função de citotoxicidade dependente de complemento (CDC), que compreende uma substituição de aminoácidos na posição 396 por leucina e na posição 255 por leucina; ou uma substituição de aminoácidos na posição 396 por leucina na posição 419 por histidina; uma substituição de aminoácidos na posição 396 por leucina na posição 370 por ácido glutâmico; uma substituição de aminoácidos na posição 396 por leucina e na posição 240 por alanina; uma substituição de aminoácidos na posição 396 por leucina e na posição 392 por treonina; uma substituição de aminoácidos na posição 247 por leucina e na posição 421 por lisina. A invenção abrange qualquer modificação conhecida da região de Fc que altera a ligação de Clq e/ou função de citotoxicidade dependente de complemento (CDC), tais como as divulgadas em Idusogie et al. , 2001, J.Immunol. 166(4) 2571-5; Idusogie et al., J. Immunol. 2000 164(8): 4178-4184.

Tal como descrito acima, a invenção abrange uma região de Fc com função efetora alterada, por exemplo, ligação a Clq modificada e/ou ligação de FcR e assim atividade de CDC modificada e/ou atividade ADCC. Em formas de realização especificas, a invenção abrange regiões de Fc variantes com ligação melhorada a Clq e ligação melhorada a FcyRIII; por exemplo, tendo tanto atividade de ADCC melhorada como atividade CDC melhorada. Em exemplos alternativos, a divulgação engloba uma região de Fc variante com reduzida atividade de CDC e/ou atividade ADCC reduzida. Em outros exemplos, pode-se aumentar apenas uma dessas atividades, e opcionalmente também reduzir a outra atividade, por exemplo, para gerar uma região de Fc variante com atividade ADCC melhorada, mas reduzida atividade de CDC e vice-versa.

A. MUTANTES COM AFINIDADES ALTERADAS MELHORADAS PARA FcyRIIIA e/ou FcyRIIA A invenção refere-se a moléculas compreendendo uma região de Fc variante tendo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) numa ou mais regiões, em que tas modificações alteram a afinidade da região de Fc variante para um FcyR de ativação. Em algumas formas de realização da invenção, as moléculas da invenção compreendem uma região de Fc variante possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições), numa ou mais regiões, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA em, pelo menos, 2 vezes, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Numa outra forma de realização especifica, as moléculas da invenção compreendem uma região de Fc variante possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições), numa ou mais regiões, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA em, pelo menos, 2 vezes, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Em outras formas de realização da invenção, a uma ou mais modificações de aminoácidos aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA em pelo menos 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, ou 10 vezes em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Em outras formas de realização da invenção, a uma ou mais modificações de aminoácidos diminuem a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA em pelo menos 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, ou 10 vezes em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Tais aumentos de dobragem são de preferência determinados por um ensaio ELISA ou ensaios de ressonância de plasmon de superfície. Num exemplo específico, as uma ou mais modificações de aminoácidos não incluem ou não são apenas uma substituição em qualquer uma das posições 329, 331, 322 por qualquer aminoácido. Em certos exemplos, as uma ou mais modificações de aminoácidos não incluem ou não são unicamente uma substituição por qualquer um de alanina nas posições 256, 290, 298, 312, 333, 334, 359, 360, ou 430; por lisina na posição 330; por treonina na posição 339; por metionina na posição 320; por serina, asparagina, ácido aspártico ou ácido glutâmico na posição 326 por glutamina, ácido glutâmico, metionina, histidina, valina ou leucina na posição 334. Noutro exemplo especifico, as uma ou mais alterações de aminoácidos não incluem ou não são apenas uma substituição em qualquer das posições 280, 290, 300, 294, ou 295. Noutro exemplo mais especifico, a uma ou mais modificações de aminoácidos não incluem ou não são unicamente uma substituição na posição 300 por leucina ou isoleucina; na posição 295 por lisina; na posição 294 por asparagina; na posição 298 por valina; prolina ácido aspártico, asparagina ou valina; na posição 280 por histidina, glutamina ou tirosina; na posição 290 por serina, glicina, teonina ou tirosina. É aqui descrita uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIA com uma maior afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc do tipo selvagem se liga a FcyRIIA, desde que a referida região de Fc não inclua uma alanina em qualquer uma das posições 256, 290, 326, 255, 258, 267, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 331, 337, 268, 272, ou 430; uma asparagina na posição 268; uma glutamina na posição 272; uma glutamina, serina, ou ácido aspártico na posição 286; uma serina na posição 290; uma metionina, glutamina, ácido glutâmico, ou arginina na posição 320; um ácido glutâmico na posição 322; uma serina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico na posição 326; uma lisina na posição 330; uma glutamina na posição 335; ou uma metionina na posição 301. As moléculas da invenção compreendem em posição uma região de Fc variante possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições), numa ou mais regiões, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIA em, pelo menos, 2 vezes, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. As moléculas da invenção compreendem uma região de Fc variante possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições), numa ou mais regiões, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIA maior a 2 vezes, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Noutros exemplos da invenção, a uma ou mais modificações de aminoácidos aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIA em pelo menos 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, ou 10 vezes em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem.

Numa forma de realização especifica, a invenção abrange moléculas de preferência polipeptideos, e mais de preferência imunoglobulinas (por exemplo, anticorpos), que compreendem uma região de Fc variante, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, mas também incluem inserções ou deleções), modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA por pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, pelo menos 100%,pelo menos 150%, e pelo menos 200%, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem.

Uma ou mais modificações de aminoácidos que podem aumentar a afinidade da região de Fc variante para com um ou mais FcyRs de ativação compreendem uma substituição na posição 347 por histidina, e na posição 339 por valina; ou uma substituição na posição 425 por isoleucina e na posição 215 por fenilalanina; ou uma substituição na posição 408 por isoleucina, na posição 215 por isoleucina e na posição 125 por leucina; ou uma substituição na posição 385 por ácido glutâmico e na posição 247 por histidina; ou uma substituição na posição 348 por metionina, na posição 334 por asparagina, na posição 275 por isoleucina, na posição 202 por metionina, e na posição 147 por treonina; ou uma substituição na posição 275 por isoleucina, na posição 334 por asparagina, e na posição 348 por metionina; ou uma substituição na posição 279 por leucina e na posição 395 por serina; ou uma substituição na posição 246 por treonina e na posição 319 por fenilalanina; ou uma substituição na posição243 por isoleucina e na posição 379 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 255 por leucina e na posição 318 por lisina; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 359 por asparagina, e na posição 366 por serina; ou uma substituição na posição 288 por metionina e na posição 334 por ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico e na posição 380 por ácido aspártico; ou uma substituição na posição 256 por serina na posição 305 por isoleucina, na posição 334 por ácido glutâmico na posição 390 por serina; ou uma substituição na posição 335 por asparagina, na posição 370 por ácido glutâmico, na posição 378 por valina, na posição 394 por metionina, e na posição 424 por leucina; ou uma substituição na posição 233 por ácido aspártico e na posição 334 por ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 359 por asparagina, na posição 366 por serina, e na posição 386 por arginina; ou uma substituição na posição 246 por treonina na posição 396 por histidina; ou uma substituição na posição 268 por ácido aspártico e na posição 318 por ácido aspártico; ou uma substituição na posição 288 por asparagina, na posição 330 por serina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 244 por histidina, a posição relativamente 358 por metionina, na posição 379 por metionina, na posição 384 por lisina e na posição 397 por metionina; ou uma substituição na posição 217 por serina, na posição 378 por valina, e na posição 408 por arginina; ou uma substituição na posição 247 por leucina, na posição 253 por asparagina, e na posição 334 por asparagina; ou uma substituição na posição 246 por isoleucina e na posição 334 por asparagina; ou uma substituição na posição 320 por ácido glutâmico na posição 326 e por ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 375 por cisteina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 234 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina; ou uma substituição na posição 234 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 234 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 305 por isoleucina; ou uma substituição na posição 234 por leucina e na posição 292 por prolina; ou uma substituição na posição 234 por leucina. Exemplos de outras substituições de aminoácidos que resultam numa afinidade melhorada para com FcyRIIIA in vitro são descritos abaixo e resumidos na Tabela 5.

Descreve-se aqui uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 243 por isoleucina e na posição 379 por leucina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 1,5 vezes mais afinidade do que uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo especifico, a presente descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 288 por asparagina, na posição 330 por serina, e na posição 396 por leucina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 5 vezes mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo especifico, a presente descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 243 por leucina, e na posição 255 por leucina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 1 vez mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo especifico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 359 por asparagina, e na posição 366 por serina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 1,5 vezes mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo específico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 288 por metionina, e na posição 334 por ácido glutâmico, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 3 vez mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo específico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 316 por ácido aspártico, na posição 378 por valina, e na posição 399 por ácido glutâmico, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 1,5 vezes mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo específico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 315 por isoleucina, na posição 379 por metionina, e na posição 399 por ácido glutâmico, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 1 vez mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo específico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 243 por isoleucina, na posição 379 por leucina, e na posição 420 por valina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 2,5 vezes mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo específico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 247 por leucina, e na posição 421 por lisina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 3 vezes mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo específico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 392 por treonina, e na posição 396 por leucina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 4,5 vez mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo específico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 293 por valina, na posição 295 por ácido glutâmico, e na posição 327 por treonina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 1,5 vezes mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo específico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 268 por asparagina, e na posição 396 por leucina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 2 vezes mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA. Num exemplo específico, a descrição engloba uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende uma substituição na posição 319 por fenilalanina, na posição 352 por leucina, e na posição 396 por leucina, de tal modo que a referida molécula se liga a FcyRIIIA com cerca de 2 vezes mais afinidade do que uma molécula comparável que compreende a região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, como determinado por um ensaio ELISA.

Num exemplo específico, a divulgação engloba um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 396 por histidina. Num exemplo específico, a divulgação engloba um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 248 por metionina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade semelhante à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 392 por arginina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade semelhante à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 315 por isoleucina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade semelhante à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 132 por isoleucina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade semelhante à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 162 por valina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 396 por leucina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 379 por metionina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 219 por tirosina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 282 por metionina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 401 por valina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 222 por asparagina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 334 por ácido glutâmico. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 377 por fenilalanina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 334 por isoleucina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 247 por leucina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 326 por ácido glutâmico. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 372 por tirosina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 224 por leucina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 275 por tirosina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 398 por valina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 334 por asparagina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 400 por prolina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 407 por isoleucina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 372 por tirosina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade semelhante à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 366 por asparagina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade menor à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 414 por asparagina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade menor à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 225 por serina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade menor à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 377 por asparagina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 243 por leucina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 292 por prolina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 300 por leucina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 305 por isoleucina. A invenção abrange um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 396 por leucina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 273 por fenilalanina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior em 2 vezes à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaio ELISA, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 379 por metionina. É aqui divulgado um polipeptideo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptideo se liga especificamente a FcyRIIIA com uma afinidade maior em 1,5 vezes à de um polipeptideo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaio ELISA, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 248 por metionina.

Em algumas formas de realização, as moléculas da invenção têm uma afinidade alterada para com FcyRIIIA, tal como determinado utilizando ensaios in vitro (ensaios com base imunológica ou bioquímica) conhecidos na técnica para determinar as interações Fc-FcyR, isto é, a ligação específica de uma região de Fc a um FcyR incluindo mas não limitado a ensaio de ELISA, ensaio de ressonância de plasmon de superfície, ensaios de imunoprecipitação (Ver Secção 5.2.5.1) . De preferência, as propriedades de ligação destas moléculas com afinidades alteradas para ativar recetores FcyR também estão correlacionadas com a sua atividade como determinada por ensaios funcionais in vitro para a determinação de uma ou mais funções das células efetoras mediadoras de FcyR (Ver secção 5.2.7), por exemplo, moléculas com regiões de Fc variantes com maior afinidade para FcyRIIIA têm uma atividade ADCC reforçada. Em formas de realização mais preferidas, as moléculas da invenção que possuem uma propriedade alterada de ligação a um recetor de Fc de ativação, por exemplo, FcyRIIIA num ensaio in vitro também têm uma propriedade de ligação alterada em modelos in vivo (tal como aqueles aqui descritos e divulgados). No entanto, a presente invenção não exclui as moléculas da invenção que não exibem uma FcyR alterada de ligação em ensaios in vitro, mas não apresentam o fenótipo desejado in vivo.

B. MUTANTES COM MAIOR AFINIDADE PARA COM FcyRIIIA E AFINIDADE REDUZIDA OU NENHUMA PARA COM FcyRIIB

Numa forma de realização específica, as moléculas da invenção compreendem uma região de Fc variante, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições) , em uma ou mais regiões, cujas uma ou mais modificações aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA e diminuem a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIB, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem que se liga a FcyRIIIA e FcyRIIB e com afinidade do tipo selvagem. Tal como aqui divulgado as uma ou mais modificações de aminoácidos não incluem ou não são unicamente uma substituição por alanina em qualquer das posições 256, 298, 333, 334, 280, 290, 294, 298, ou 296; ou uma substituição na posição 298 por asparagina, valina, ácido aspártico, ou prolina; ou uma substituição 290 por serina. Em certas formas de realização, a uma ou mais modificações de aminoácidos aumenta a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA em pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, no menos de 400% e diminui a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIB em pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%. A molécula da presente divulgação que compreende uma região de Fc variante com uma afinidade aumentada para FcyRIIIA e uma afinidade reduzida ou nenhuma afinidade para FcyRIIB, como determinado com base num ensaio ELISA e/ou um ensaio baseado em ADCC utilizando o anticorpo ch-4-4-20, ou um ensaio de ressonância de plasmon de superfície utilizando um anticorpo quimérico 4D5, transportando a região de Fc variante, compreende uma substituição na posição 275 por isoleucina, na posição 334 por asparagina, e na posição 348 por metionina; ou uma substituição na posição 279 por leucina e na posição 395 por serina; ou uma substituição na posição 246 por treonina e na posição 319 por fenilalanina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 255 por leucina, e na posição 318 por lisina; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 359 e por a asparagina na posição 366 por serina; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico na posição 380 por ácido aspártico; ou uma substituição na posição 256 por serina na posição 305 por isoleucina, na posição 334 por ácido glutâmico, e na posição 390 por serina; ou uma substituição na posição 335 por asparagina, na posição 370 por ácido glutâmico, na posição 378 por valina, na posição 394 por metionina e na posição 424 por leucina; ou uma substituição na posição 233 por ácido aspártico na posição 334 e por o ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 359 por asparagina, na posição 366 por serina e na posição 386 por arginina; ou uma substituição na posição 312 por ácido glutâmico, na posição 327 por asparagina, e na posição 378 por serina; ou uma substituição na posição 288 por asparagina e na posição 326 por asparagina; ou uma substituição na posição 247 por leucina e na posição 421 por lisina; ou uma substituição na posição 298 por asparagina e na posição 381 por arginina; ou uma substituição na posição 280 por ácido glutâmico, na posição 354 por f enilalanina, na posição 431 por ácido aspártico, e na posição 441 por isoleucina; ou uma substituição na posição 255 por glutamina na posição 326 e por o ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 218 por arginina, na posição 281 por ácido aspártico na posição 385 e por arginina; ou uma substituição na posição 247 por leucina, na posição 330 por treonina na posição 440 e por glicina; ou uma substituição na posição 284 por alanina e na posição 372 por leucina; ou uma substituição na posição 335 por asparagina, poro a posição 387 por serina na posição 435 por glutamina; ou uma substituição na posição 247 por leucina, na posição 431 por valina e na posição 442 por fenilalanina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 305 por isoleucina; ou uma substituição na posição 292 por prolina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, e na posição 292 por prolina; ou uma substituição na posição 292 por prolina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina.

Num exemplo especifico, a molécula da divulgação que compreende uma região de Fc variante com uma afinidade aumentada para FcyRIIIA e uma afinidade reduzida ou nenhuma afinidade para FcyRIIB como determinado com base num ensaio ELISA e/ou um ensaio com base em ADCC utilizando anticorpo ch-4-4-20 transportando a região de Fc variante compreende uma substituição na posição 379 por metionina; na posição 219 por tirosina; na posição 282 por metionina; na posição 401 por valina; na posição 222 por asparagina; na posição 334 por isoleucina; na posição 334 por ácido glutâmico; na posição 275 por tirosina; na posição 398 por valina. Ainda noutro exemplo especifico, a molécula da divulgação que compreende uma região de Fc variante com uma afinidade aumentada para FcyRIIIA e uma afinidade reduzida ou nenhuma afinidade para FcyRIIB como determinado com base num ensaio ELISA e/ou num ensaio baseado em ADCC usando o anticorpo ch-4-4-20, ou um ensaio de ressonância de plasmon de superfície utilizando um anticorpo quimérico 4D5, transportando a região de Fc variante compreende uma substituição na posição 243 por leucina; na posição 292 por prolina; e na posição 300 por leucina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIB com uma afinidade menor em 3 vezes à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaio ELISA, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 288 por asparagina, na posição 330 por serina, e na posição 396 por leucina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIB com uma afinidade menor em 10-15 vezes à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaio ELISA, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 316 por ácido aspártico, na posição 378 por valina, e na posição 399 por ácido glutâmico. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIB com uma afinidade menor em 10 vezes à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaio ELISA, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 315 por isoleucina, na posição 379 por metionina, e na posição 399 por ácido glutâmico. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIB com uma afinidade menor em 7 vezes à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaio ELISA, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 243 por isoleucina, na posição 379 por leucina, e na posição 420 por valina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIB com uma afinidade menor em 3 vezes à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaio ELISA, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 392 por treonina, e na posição 396 por leucina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIB com uma afinidade menor em 5 vezes à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaio ELISA, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 268 por asparagina, e na posição 396 por leucina. É aqui divulgado um polipeptídeo isolado compreendendo uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos relativa a uma região de Fc de tipo selvagem, de tal modo que o referido polipeptídeo se liga especificamente a FcyRIIB com uma afinidade menor em 2 vezes à de um polipeptídeo comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaio ELISA, em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende a substituição na posição 319 por fenilalanina, na posição 352 por leucina, e na posição 396 por leucina.

C. MUTANTES COM AFINIDADEAUMENTADA PARA FcyRIIIA E FcyRIIA A invenção abrange moléculas compreendendo regiões de Fc variantes, tendo uma ou mais modificações de aminoácidos, modificações essas que aumentam a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA e FcyRIIB em pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos de 400% e diminui a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIB em pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%. A molécula da presente divulgação que compreende uma região de Fc variante com uma afinidade aumentada para com FcyRIIIA e numa afinidade aumentada para com FcyRIIB (como determinado com base num ensaio ELISA e/ou um ensaio à base de ADCC utilizando o anticorpo ch-4-4-20, ou um ensaio de ressonância de plasmon de superfície utilizando um anticorpo quimérico 4D5, transportando a região de Fc variante tal como aqui descrito) compreende uma substituição na posição 415 por isoleucina e na posição 251 por fenilalanina; ou uma substituição na posição relativamente 399 por ácido glutâmico, na posição 292 por leucina, e na posição 185 por metionina; ou uma substituição na posição 408 por isoleucina, na posição 215 por isoleucina e na posição 125 por leucina; ou uma substituição na posição 385 por ácido glutâmico e na posição 247 por histidina; ou uma substituição na posição 348 por metionina, na posição 334 por asparagina, na posição 275 por isoleucina, na posição 202 por metionina e na posição 147 por treonina; ou uma substituição na posição 246 por treonina e na posição 396 por histidina; ou uma substituição na posição 268 por ácido aspártico e na posição 318 por ácido aspártico; ou uma substituição na posição 288 por asparagina, na posição 330 por serina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 244 por histidina, na posição 358 por metionina, na posição 379 por metionina, na posição 384 por lisina e na posição 397 por metionina; ou uma substituição na posição 217 por serina, na posição 378 por valina, e na posição 408 por arginina; ou uma substituição na posição 247 por leucina, na posição 253 por asparagina, e na posição 334 por asparagina; ou uma substituição na posição 246 por isoleucina e na posição 334 por asparagina; ou uma substituição na posição 320 por ácido glutâmico, e na posição 326 por ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 375 por cisteína e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 343 por serina, na posição 353 por leucina, na posição 375 por isoleucina, na posição 383 por asparagina; ou uma substituição na posição 394 por metionina, na posição 397 por metionina; ou uma substituição na posição 216 por ácido aspártico, na posição 345 por lisina e na posição 375 por isoleucina; ou uma substituição na posição 288 por asparagina, na posição 330 por serina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 247 por leucina, e na posição 389 por glicina; ou uma substituição na posição 222 por asparagina, na posição 335 por asparagina, na posição 370 por ácido glutâmico, na posição 378 por valina e na posição 394 por metionina; ou uma substituição na posição 316 por ácido aspártico, na posição 378 por valina e na posição 399 por o ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 315 por isoleucina, na posição 379 por metionina, e na posição 394 por metionina; ou uma substituição na posição 290 por treonina e na posição 371 por ácido aspártico; ou uma substituição na posição 247 por leucina e na posição 398 por glutamina; ou uma substituição na posição 326 por glutamina; na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 359 por asparagina, e na posição 366 por serina; ou uma substituição na posição 247 por leucina e na posição 377 por fenilalanina; ou uma substituição na posição 378 por valina, na posição 390 por isoleucina e na posição 422 por isoleucina; ou uma substituição na posição 326 por ácido glutâmico e na posição 385 por o ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 282 por ácido glutâmico, na posição 369 por isoleucina e na posição 406 por fenilalanina; ou uma substituição na posição 397 por metionina; na posição 411 por alanina e na posição 415 por a asparagina; ou uma substituição na posição 223 por isoleucina, na posição 256 por serina e na posição 406 por fenilalanina; ou uma substituição na posição 298 por asparagina e na posição 407 por arginina; ou uma substituição na posição 246 por arginina, na posição 298 por asparagina, e na posição 377 por fenilalanina; ou uma substituição na posição 235 por prolina, na posição 382 por metionina, na posição 304 por glicina, na posição 305 por isoleucina e na posição 323 por isoleucina; ou uma substituição na posição 247 por leucina, na posição 313 por arginina, e na posição 388 por glicina; ou uma substituição na posição 221 por tirosina, na posição 252 por isoleucina, na posição 330 por glicina, na posição 339 por treonina, na posição 359 por asparagina, na posição 422 por isoleucina e na posição 433 por leucina; ou uma substituição na posição 258 por ácido aspártico, e na posição 384 por lisina; ou uma substituição na posição 241 por leucina na posição 258 e por glicina; ou uma substituição na posição 370 por asparagina e na posição 440 por asparagina; ou uma substituição na posição 317 por asparagina e uma deleção na posição 423; ou uma substituição na posição 243 por isoleucina, na posição 379 por leucina e na posição 420 por valina; ou uma substituição na posição 227 por serina e na posição 290 por ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 231 por valina, na posição 386 por histidina, e na posição 412 por metionina; ou uma substituição na posição 215 por prolina, na posição 274 por asparagina, na posição 287 por glicina, na posição 334 por asparagina, na posição 365 por valina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 293 por valina, na posição 295 por ácido glutâmico e na posição 327 por treonina; ou uma substituição na posição 319 por fenilalanina, na posição 352 por leucina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 392 por treonina e na posição 396 por leucina; uma substituição na posição 268 por a asparagina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 290 por treonina, na posição 390 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 326 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 268 por ácido aspártico e a posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 210 por metionina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 358 por prolina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 288 por arginina, na posição 307 por alanina, na posição 344 por ácido glutâmico, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 273 por isoleucina, na posição 326 por ácido glutâmico, na posição 328 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 326 por isoleucina, na posição 408 por asparagina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 334 por asparagina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 379 por metionina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 227 por serina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 217 por serina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 261 por asparagina, na posição 210 por metionina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 419 por histidina na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 370 por ácido glutâmico e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 242 por fenilalanina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 255 por leucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 240 por alanina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 250 por serina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 247 por serina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 410 por histidina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 419 por leucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 427 por alanina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 258 por ácido aspártico e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 384 por lisina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 323 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 244 e por histidina na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 305 por leucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 400 por fenilalanina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 303 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 305 por isoleucina, na posição 378 por ácido aspártico, na posição 404 por serina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 290 por ácido glutâmico, na posição 369 por alanina, na posição 393 por alanina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 210 por asparagina, na posição 222 por isoleucina, na posição 320 por metionina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 217 por serina na posição 305 por isoleucina, na posição 309 por leucina, na posição 390 por histidina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 246 por asparagina; na posição 419 por arginina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 217 por alanina, na posição 359 por alanina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 215 por isoleucina, na posição 290 por valina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 275 por leucina, na posição 362 por histidina, na posição 384 por lisina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 334 por asparagina; ou uma substituição na posição 400 por prolina; ou uma substituição na posição 407 por isoleucina; ou uma substituição na posição 372 por tirosina; ou uma substituição na posição 366 por asparagina; ou uma substituição na posição 414 por asparagina; ou uma substituição na posição 352 por leucina; ou uma substituição na posição 225 por serina; ou uma substituição na posição 377 por asparagina; ou uma substituição na posição 248 por metionina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, e na posição 396 por leucina; ou na posição 292 por prolina, e na posição 305 por isoleucina. D. MUTANTES QUE NÃO SE LIGAM A QUALQUER Fc

Em alguns exemplos, a invenção abrange moléculas, que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de tipo selvagem, a região de Fc variante não se ligando a qualquer FcyR, como determinado por ensaio normalizados na arte e aqui descritos, em relação a uma molécula comparável compreendendo a região de Fc de tipo selvagem. Num exemplo especifico, as uma ou mais modificações de aminoácidos que suprimem a ligação a todos os FcyRs compreendem uma substituição na posição 232 por serina na posição 304 por glicina; ou uma substituição na posição 269 por lisina, na posição 290 por asparagina, na posição 311 por arginina, e na posição 433 por tirosina; ou uma substituição na posição 252 por leucina; ou uma substituição na posição 216 por ácido aspártico, na posição 334 por arginina, e na posição 375 por isoleucina; ou uma substituição na posição 247 por leucina e na posição 406 por f enilalanina, ou uma substituição na posição 335 por asparagina, na posição 387 por serina, e na posição 435 por glutamina; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 380 por ácido aspártico, e na posição 446 por valina; ou uma substituição na posição 303 por isoleucina, na posição 369 por fenilalanina e na posição 428 por leucina; ou uma substituição na posição 251 por fenilalanina e na posição 372 por leucina; ou uma substituição na posição 246 por ácido glutâmico, na posição 284 por e na posição 308 por alanina; ou uma substituição na posição 399 por ácido glutâmico, e na posição 402 por ácido aspártico; ou uma substituição na posição 399 por ácido glutâmico e na posição 428 por leucina.

D. MUTANTES COM FUNÇÕES EFETORAS MEDIADAS POR FcyR ALTERADAS A invenção engloba imunoglobulina compreendendo variantes de Fc com funções efetoras alteradas. Em algumas formas de realização, as imunoglobulinas compreendendo variantes de Fc mediam a função efetora de forma mais eficaz na presença de células efetoras, conforme determinado por meio de ensaios conhecidos na arte e aqui exemplificados. Em outras formas de realização, as imunoglobulinas compreendendo variantes de Fc mediam a função efetora menos eficazmente na presença de células efetoras, conforme determinado por meio de ensaios conhecidos na arte e aqui exemplificados. Em formas de realização especificas, as variantes de Fc da invenção podem ser combinadas com outras modificações conhecidas de Fc que alteram a função efetora, de modo que a combinação tem um efeito aditivo sinérgico. As variantes de Fc da invenção têm uma alteração na função efetora in vitro e/ou in vivo.

Numa forma de realização específica, as imunoglobulinas da invenção com maior afinidade para com FcyRIIIA têm uma função efetora melhorada mediada por FcyR como determinado usando os ensaios de atividade de ADCC aqui descritos. Exemplos de funções efetoras que podem ser mediadas pelas moléculas da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, ligação de Clq, citotoxicidade dependente de complemento, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC), fagocitose, etc.. As funções efetoras das moléculas da invenção podem ser testadas usando métodos padrão conhecidos na técnica, exemplos dos quais são descritos na Secção 5.2.6. Numa forma de realização especifica, as imunoglobulinas da invenção, que compreendem uma região de Fc variante com afinidade melhorada para com FcyRIIIA mediam a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), de forma 2 vezes mais eficaz do que uma imunoglobulina compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem. Noutras formas de realização, as imunoglobulinas da invenção, que compreendem uma região de Fc variante com afinidade aumentada para com FcyRIIIA mediam a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC), pelo menos, 4 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 104 vezes, pelo menos 105 vezes de modo mais eficaz do que uma imunoglobulina compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem. Numa outra forma de realização especifica, as imunoglobulinas da invenção com afinidade aumentada para com FcyRIIIA alteraram a atividade de ligação a Clq. Em algumas formas de realização, as imunoglobulinas da invenção com afinidade melhorada para com FcyRIIIA têm pelo menos 2 vezes, pelo menos, 4 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 104 vezes, pelo menos 105 vezes mais atividade de ligação a Clq do que uma imunoglobulina compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem. Ainda noutra forma de realização específica, as imunoglobulinas da invenção com afinidade aumentada para com FcyRIIIA alteraram a citotoxicidade dependente do complemento. Ainda noutra forma de realização especifica, as imunoglobulinas da invenção com maior afinidade para com FcyRIIIA têm citotoxicidade dependente do complemento melhorada de que uma imunoglobulina que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Em algumas formas de realização, as imunoglobulinas da invenção com afinidade melhorada para com FcyRIIIA têm pelo menos 2 vezes, pelo menos, 4 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 104 vezes, pelo menos 105 vezes mais citotoxicidade dependente de complemento do que uma imunoglobulina que compreende uma região de Fc de tipo selvagem.

Noutras formas de realização, as imunoglobulinas da invenção com afinidade melhorada para com FcyRIIIA têm atividade de fagocitose aumentada relativamente a uma imunoglobulina compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado por ensaios padrão conhecidos de um perito na arte ou aqui descritos. Em algumas formas de realização, as imunoglobulinas da invenção com afinidade reforçada para com FcyRIIIA têm pelo menos 2 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 10 vezes mais atividade de fagocitose em relação a uma imunoglobulina compreendendo uma região de Fc do tipo selvagem.

Numa forma de realização específica, a invenção abrange uma imunoglobulina compreendendo uma região de Fc variante com uma ou mais modificações de aminoácidos, com uma afinidade melhorada para com FcyRIIIA de tal modo que a imunoglobulina tem uma função efetora aumentada, por exemplo, citotoxicidade mediada células dependentes de anticorpo, ou fagocitose. As uma ou mais modificações de aminoácidos, que podem aumentar a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA e/ou FcyRIIA e aumentar a atividade de ADCC da imunoglobulina compreendem uma substituição na posição 379 com metionina; ou uma substituição na posição 243 por isoleucina e na posição 379 por leucina; ou uma substituição na posição 288 por asparagina, na posição 330 por serina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina e na posição 255 por leucina; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico, na posição 359 por asparagina, e na posição 366 por serina; ou uma substituição na posição 288 por metionina e na posição 334 por ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 334 por ácido glutâmico e na posição 292 por leucina; ou uma substituição na posição 316 por ácido aspártico, na posição 378 por valina, e na posição 399 por ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 315 por isoleucina, na posição 379 por metionina, e na posição 399 por ácido glutâmico; ou uma substituição na posição 243 por isoleucina, na posição 379 por leucina, e na posição 420 por valina; ou uma substituição na posição 247 por leucina e na posição 421 por lisina; ou uma substituição na posição 248 por metionina; ou uma substituição na posição 392 por treonina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 293 por valina, na posição 295 por ácido glutâmico, e na posição 327 por treonina; ou uma substituição na posição 268 por asparagina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 319 por fenilalanina, na posição 352 por leucina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina.

Num outro exemplo especifico, as uma ou mais modificações de aminoácidos que aumentam a atividade de ADCC da imunoglobulina é qualquer das mutações listadas abaixo, na tabela 7.

Em alternativa ou adicionalmente, pode ser útil combinar as modificações de aminoácidos acima ou quaisquer outras modificações de aminoácidos aqui descritas com uma ou mais outras modificações de aminoácidos que alterem a ligação sw Clq e/ou complementem a função de citotoxicidade dependente da região de Fc. A molécula de partida de interesse particular aqui é geralmente uma que se liga a Clq e exibe citotoxicidade dependente do complemento (CDC) . As restantes substituições de aminoácidos descritas no presente documento geralmente servem para alterar a capacidade da molécula de partida para se ligar a Clq e/ou modificar a sua função de citotoxicidade dependente de complemento, por exemplo, para reduzir e, preferivelmente, abolir estas funções efetoras. No entanto, as moléculas compreendendo substituições numa ou mais das posições descritas com função de ligação melhorada a Clq e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) estão aqui contempladas. Por exemplo, a molécula de partida pode ser incapaz de se ligar a Clq e/ou mediar CDC e pode ser modificada de acordo com os presentes ensinamentos de tal modo que ela adquire estas outras funções efetoras. Além disso, as moléculas com atividade de ligação preexistente Clq, opcionalmente possuindo ainda a capacidade para mediar CDC podem ser modificadas de tal modo que uma ou ambas as atividades são aumentadas.

Tal como descrito acima, pode ser configurada uma região de Fc com função efetora alterada, por exemplo, por modificação da ligação a Clq e/ou ligação de FcR e assim alterar a atividade de CDC e/ou atividade ADCC. Por exemplo, pode ser gerada uma região de Fc variante com ligação melhorada a Clq e ligação melhorada a FcyRIII; por exemplo, tendo tanto atividade de ADCC melhorada como atividade CDC melhorada. Em alternativa se for desejado que a função efetora seja reduzida ou ablada, pode ser manipulada uma região de Fc variante com atividade reduzida CDC e/ou atividade reduzida de ADCC Em outros exemplos, pode-se aumentar apenas uma dessas atividades, e opcionalmente também reduzir a outra atividade, por exemplo, para gerar uma região de Fc variante com atividade ADCC melhorada, mas reduzida atividade de CDC e vice-versa. A presente invenção engloba variantes específicas da região de Fc, que foram identificadas utilizando os métodos da invenção a partir de uma biblioteca de mutantes de levedura após a 2a - 4a rodada de triagem estão listados na Tabela 8. A Tabela 8 resume os diferentes mutantes que foram identificados utilizando os métodos da invenção. Os mutantes foram ensaiados usando um ensaio de ELISA para a determinação da ligação a FcyRIIIA e FcyRIIB. Os mutantes também foram testados num ensaio de ADCC, por clonagem das variantes de Fc num anticorpo ch-4-4-20 usando métodos aqui revelados e exemplificados. Os itens em negrito referem-se a experiências, em que ch4-4-20 foi purificado antes do ensaio ADCC. A concentração de anticorpo utilizada foi na gama de 0,5 pg/mL - 1,0 pg/mL.

Em formas de realização preferidas, a invenção proporciona moléculas de imunoglobulina modificadas (por exemplo, anticorpos) com regiões de Fc variantes, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos, essas uma ou mais modificações de aminoácidos aumentando a afinidade da molécula para com FcyRIIIA. Tais imunoglobulinas incluem moléculas de IgG que contêm naturalmente regiões de ligação a FcyR (por exemplo, regiões de ligação a FcyRIIIA e/ou FcyRIIB), ou derivados de imunoglobulina que foram manipulados para conter uma região de ligação a FcyR (por exemplo, regiões de ligação a FcyRIIIA e/ou FcyRIIB). As imunoglobulinas modificadas da presente invenção incluem qualquer molécula de imunoglobulina que se liga, de preferência, imunoespecificamente, ou seja, compete com a ligação não específica como determinada por imunoensaios bem conhecidos na arte para o ensaio de ligação de antígeno-anticorpo específica, um antígeno e contém uma região de ligação a FcyR (por exemplo, uma região de ligação a FcyRIIIA e FcyRIIB). Tais anticorpos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, bi-especificos, multi-especificos, humanos, humanizados, quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fvs ligados por dissulfureto, e fragmentos contendo ou um domínio VL ou VH, ou até mesmo uma região determinante de complementaridade (CDR) que se liga especificamente a um antígeno, em determinados casos, manipulada para conter ou fundida numa região de ligação a FcyR.

Em algumas formas de realização, as moléculas da invenção compreendem porções de uma região de Fc. Tal como aqui usado o termo "porção de uma região de Fc" refere-se a fragmentos da região de Fc, de preferência uma porção com atividade efetora e/ou atividade de ligação a FcyR (ou uma região comparável de um mutante ao qual falta tal atividade). 0 fragmento de uma região de Fc pode variar em tamanho desde 5 aminoácidos para toda a região de Fc menos um aminoácido. A porção de uma região de Fc pode estar em falta até 10, até 20, até 30 aminoácidos do N-terminal ou C-terminal.

As moléculas de IgG da invenção são da subclasse IgGl das IgGs. Também são aqui divulgadas outras subclasses de IgG de determinados animais. Por exemplo, em humanos, a classe IgG inclui IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4; e IgG de ratinho inclui IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG2c e IgG3.

As imunoglobulinas (e outros polipeptideos aqui utilizados) podem ser de qualquer origem animal, incluindo as aves e os mamíferos. De preferência, os anticorpos são humanos, roedores (por exemplo, ratinho e rato), jumento, ovelha, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelo, cavalo, ou frango. Tal como aqui utilizado, anticorpos "humanos" incluem anticorpos que possuem a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgénicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, como descrito infra e, por exemplo, na Patente nos EUA n° 5, 939, 598 de Kucherlapati et al.

Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecificos, biespecificos, triespecificos ou de multi-especificidade maior. Os anticorpos multiespecificos podem ser específicos para epitopos diferentes de um polipeptídeo ou podem ser específicos para epitopos heterólogos, tais como um polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido. Ver, por exemplo, as publicações de PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al. , J. Immunol., 147:60-69, 1991; Patente nos EUA n° 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553, 1992.

Os anticorpos multiespecificos têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigenos diferentes. Embora estas moléculas normalmente se liguem apenas a dois antigenos (ou seja, anticorpos biespecificos, BsAb), os anticorpos com especificidades adicionais tais como anticorpos triespecificos são englobadas pela presente invenção. Exemplos de BsAbs incluem, sem limitação, aqueles com um braço dirigido contra um antigeno de célula de tumor e o outro braço dirigido contra uma molécula citotóxica.

Os métodos para preparar anticorpos biespecificos são conhecidos na arte. A produção tradicional de anticorpos biespecificos de comprimento completo baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeias pesadas - cadeias leves de imunoglobulina, onde as duas cadeias possuem diferentes especificidades (Millstein et al, Nature, 305: 537-539 (1983)). Devido ao arranjo aleatório de imunoglobulina de cadeias pesadas e leves, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecifica correta. A purificação da molécula correta, que é usualmente realizada por passos de cromatografia de afinidade, é bastante trabalhosa e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos semelhantes são divulgados em WO 93/08829, e em Traunecker et al, EMBO J., 10: 3655-3659 (1991) .

De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpo-antígeno) são fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é preferivelmente com um domínio de imunoglobulina de cadeia pesada constante, que compreende pelo menos uma parte das regiões flexíveis, CH2 e CH3. Prefere-se que a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para ligação da cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os ADNs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são co-transfectados para um organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em concretizações em que proporções desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam os rendimentos óptimos. É, contudo, possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas num vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em proporções iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não têm significado particular.

Numa forma de realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecificos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par de cadeias de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado das combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é divulgada no documento WO 94/04690. Para mais detalhes sobre a produção de anticorpos biespecificos ver, por exemplo, Suresh et al, Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acordo com outra abordagem descrita em WO96/27011, um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulado para maximizar a percentagem de heterodimeros que são recuperados da cultura celular recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpos. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) lateral(ais) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo substituindo cadeias laterais grandes de aminoácidos por mais pequenas (por exemplo alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como os homodímeros.

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos "heteroconjugados" ou reticulados. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direcionar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente nos EUA n° 4,676,980), e para tratamento de infeção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na arte, e são divulgados na Patente nos EUA 4,676,980, juntamente com várias técnicas de reticulação. São contemplados anticorpos com mais do que duas valências. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecificos. Ver, e.g., Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991), que é aqui incorporado por referência.

Os anticorpos da presente invenção incluem os derivados que são modificados de outra maneira, isto é, por ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal que a ligação covalente não impede o anticorpo de se ligar ao antigeno e/ou a gerar uma resposta anti-idiotipica. Por exemplo, mas não a titulo de limitação, os derivados de anticorpos incluem os anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, por derivatização por grupos protectores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolitica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc.. Qualquer das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

Para algumas utilizações, incluindo a utilização in vivo de anticorpos em seres humanos e em ensaios de deteção in vitro, pode ser preferível utilizar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções diferentes do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, tais como anticorpos que possuem uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante derivada de uma imunoglobulina humana. Os métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na arte. Ver por exemplo, Morrison, Science, 229:1202, 1985; Oi et ai.,

BioTechniques, 4:214 1986; Gillies et al. , J. Immunol. Methods, 125:191-202, 1989; Patente nos EUA n° 5,807,715; 4,816,567; e 4,816,397. Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo a partir de espécies não-humanas que se ligam ao antígeno desejado possuindo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) a partir das espécies não humanas e regiões de estrutura e domínios constantes de uma molécula de imunoglobulina humana. Muitas vezes, os resíduos estruturais nas regiões de esqueleto humanas serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo dador de CDR para alterar, preferencialmente melhorar, a ligação ao antígeno. Estas substituições de estrutura são identificadas por métodos bem conhecidos na arte, por exemplo, por modelação das interacções da CDR e os resíduos estruturais para identificar os resíduos estruturais importantes para a ligação ao antígeno e comparação posterior de sequência para identificar os resíduos estruturais invulgares em posições particulares. Ver, por exemplo, Queen et al., Patente nos EUA n° 5,585,089; Riechmann et al., Nature, 332:323, 1988. Os anticorpos podem ser humanizados utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na arte, incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239,400; publicação de PCT WO 91/09967; Patente nos EUA n° 5,225,539; 5,530,101 e 5,585,089), folheamento ou renovação da superfície (EP 592,106; EP 519,596; Padian, Molecular Immunology, 28 (4/5): 489-498, 1991; Studnicka et al, Protein Engineering, 7 (6):805-814, 1994; Roguska et al, Proc Natl Acad. Sci. EUA, 91:. 969-973, 1994), e arranjo combinatorial de cadeia (Patente dos EUA n° 5,565, 332) . Os anticorpos humanizados podem ser produzidos utilizando qualquer dos métodos descritos nas Patentes nos EUA n° 5,693,762 (Protein Design Labs), 5,693,761, (Protein Design Labs) 5,585,089 (Protein Design Labs), 6,180,370 (Protein Design Labs), e Publicações nos EUA n° 20040049014, 200300229208.

Os anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos. Os anticorpos humanos podem ser feitos por uma variedade de métodos conhecidos na arte, incluindo métodos de exibição de fagos descritos acima utilizando bibliotecas de anticorpos derivados a partir de sequências de imunoglobulinas humanas. Ver Patentes nos EUA n° 4,444,887 e 4,716,111; e publicações de PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; e WO 91/10741.

Os anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando ratinhos transgénicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Para uma visão geral desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, ver Lonberg e Huszar, Int. Rev. Immunol, 13: 65-93, 1995. Para uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir tais anticorpos, ver, por exemplo, as publicações de PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente Europeia n° 0 598 877; Patentes nos EUA n° 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; e 5,939,598. Além disso, empresas tais como a Abgenix, Inc. (Freemont, CA), Medarex (NJ) e Genpharm (San Jose, CA) podem comprometer-se em proporcionar anticorpos humanos dirigidos contra um antigeno selecionado utilizando tecnologia semelhante à descrita acima.

Os anticorpos completamente humanos que reconhecem um epitopo selecionado podem ser gerados utilizando uma técnica conhecida como "seleção guiada". Nesta abordagem um anticorpo monoclonal não-humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de ratinho, é utilizado para orientar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epitopo (Jespers et al, Bio/technology, 12:899-903, 1988). A invenção abrange anticorpos terapêuticos humanos ou humanizados manipulados (por exemplo, anticorpos monoclonais específicos de tumores) na região de Fc, por modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um resíduo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Numa outra forma de realização, a invenção refere-se a anticorpos terapêuticos humanos ou humanizados manipulados (por exemplo, anticorpos monoclonais específicos de tumores) na região de Fc, por modificação de pelo menos um resíduo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA e diminui ainda a afinidade da região de Fc para com FcyRIIB. Os anticorpos terapêuticos manipulados podem ainda ter uma função efetora aumentada, por exemplo, uma atividade ADCC aumentada, atividade de fagocitose, etc, tal como determinado por ensaios padrão conhecidos dos peritos na arte.

Numa forma de realização especifica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo monoclonal humanizado especifico para o proto-oncogene Her2/neu (por exemplo, o anticorpo humanizado Ab4D5 tal como descrito em Carter et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4285-9) através de modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um residuo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Noutra forma de realização especifica, a modificação do anticorpo monoclonal humanizado Her2/neu pode também diminuir ainda a afinidade da região de Fc para com FcyRIIB. Ainda noutra forma de realização especifica, os anticorpos monoclonais humanizados manipulados específicos para Her2/neu podem ainda ter uma função efetora aumentada como determinado por ensaios padrão conhecidos na arte e aqui divulgados e exemplificados.

Numa outra forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico humano de ratinho, 2H7, por modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um resíduo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Numa outra forma de realização específica, a modificação do anticorpo monoclonal anti-CD20, 2H7 também pode diminuir ainda mais a afinidade da região de Fc para com FcyRIIB. Ainda noutra forma de realização específica, o anticorpo monoclonal anti-CD20 manipulado, 2H7 pode ainda ter uma função efetora aumentada como determinado por ensaios padrão conhecidos na arte e aqui divulgados e exemplificados.

Em certas formas de realização, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo (ou sua versão quimérica, humanizada ou outras versões de manipulação do mesmo), que compreende o domínio variável de cadeia pesada e/ou domínio variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal produzido pelo clone 2B6, 3H7, 8B5.4.3, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 ou 1F2 com os números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-7610, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, e PTA-5959, respetivamente (depositado na ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 02209-2011) . Numa forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada e/ou domínio variável de cadeia leve de 2B6, 3H7 ou 8B5.3.4. Numa outra forma de realização específica, a invenção engloba a manipulação de um anticorpo humanizado compreendendo as CDRs de 2B6, 3H7 ou 8B5.3.4. Numa outra forma de realização específica, a invenção engloba a manipulação de um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 e o domínio variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8. Numa outra forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo anti-FcyRIIB compreendendo o domínio variável de cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13 e o domínio variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14. Numa outra forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo humanizado anti-FcyRIIB compreendendo o domínio variável de cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 e o domínio variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8.

Numa outra forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo humanizado anti-FcyRIIB compreendendo o domínio variável de cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9 e o domínio variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10.

Numa outra forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo anti-FcYRIIB incluindo mas não se limitando a qualquer um dos anticorpos descritos no Pedido Provisório nos EUA n° 60/403,266 depositado em 12 de agosto de 2002, Pedido nos EUA n° 10/643,857 depositado em 14 de agosto de 2003, Pedido Provisório nos EUA n° 60/562,804 depositado em 16 de abril de 2004, Pedido Provisório nos EUA n° 60/582,044 depositado em 21 de junho de 2004, Pedido Provisório nos EUA n° 60/582,045 depositado em 21 de junho de 2004, Pedido Provisório nos EUA n° 60/636,663 depositado em 15 de dezembro de 2004 e Pedido nos EUA n° 10/524,134 depositado em 11 de fevereiro de 2005 por modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um resíduo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Numa outra forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo humanizado anti-FcYRIIB incluindo mas não se limitando a qualquer um dos anticorpos descritos no Pedido Provisório nos EUA n° 60/569, 882 depositado em 10 de maio de 2004, Pedido Provisório nos EUA n° 60/582, 043 depositado em 21 de junho de 2004 e Pedido nos EUA n° 11/126, 978, depositado em 10 de maio de 2005 por modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um resíduo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Exemplos de anticorpos anti-FcYRIIB, que podem ou não ser humanizados, que podem ser manipulados de acordo com os métodos da invenção são o anticorpo monoclonal 2B6 com o número de acesso ATCC PTA-4591 e 3H7 possuindo o número de acesso ATCC PTA-4592, o anticorpo monoclonal 1D5 com o número de acesso ATCC PTA-5958, o anticorpo monoclonal 1F2 com o número de acesso ATCC PTA-5959, o anticorpo monoclonal 2D11 com o número de acesso ATCC PTA-5960, o anticorpo monoclonal 2E1 com o número de acesso ATCC PTA-5961, 8B5.3.4 com o número de acesso ATCC PTA-7610, e o anticorpo monoclonal 2H9 com o número de acesso ATCC PTA-5962 (todos depositados em 10801 University Boulevard, Manassas, VA 02209-2011). Numa outra forma de realização especifica, a modificação do anticorpo anti-FcYRIIB pode também ainda diminuir a afinidade da região de Fc para com FcyRIIB. Ainda noutra forma de realização especifica, o anticorpo anti-FcYRIIB manipulado pode ainda ter uma função efetora aumentada como determinado por ensaios padrão conhecidos na arte e aqui divulgados e exemplificados.

Numa forma de realização especifica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo anti-FcYRIIB de acordo com os métodos da presente invenção, que compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência todas as 6 CDRs, do anticorpo produzido pelo clone 2B6, 3H7, ou 8B5.3.4 com os números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592 e PTA-7610, respetivamente (por exemplo, a CDR3 de cadeia pesada). Numa forma de realização especifica, um anticorpo anti-FcYRIIB manipulado de acordo com os métodos da invenção compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência todas as 6 CDRs, do anticorpo produzido pelo clone 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, e 1F2 com números de acesso ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 e PTA-5959, respetivamente (por exemplo, a CDR3 de cadeia pesada). Numa outra forma de realização, um anticorpo anti-FcYRIIB manipulado de acordo com os métodos da invenção liga-se ao mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal de ratinho produzido a partir do clone 2B6, 3H7, ou 8B5.3.4 com os números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592 e PTA-7610, respetivamente e/ou compete com o anticorpo monoclonal de ratinho produzido a partir do clone 2B6, 3H7, ou 8B5.3.4 com os números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592 e PTA-7610, respetivamente, como determinado, por exemplo, num ensaio ELISA ou outro imunoensaio competitivo apropriado, e que também se liga a FcyRIIB com uma maior afinidade do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga FcyRIIA. Numa outra forma de realização, um anticorpo anti-FcYRIIB manipulado de acordo com os métodos da invenção liga-se ao mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal de ratinho produzido a partir do clone 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, 1F2 com números de acesso ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, e PTA-5959, respetivamente, e/ou compete com o anticorpo monoclonal de ratinho produzido a partir do clone 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, e 1F2 com números de acesso ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 e PTA-5959, respetivamente, como determinado, por exemplo, num ensaio ELISA ou outro imunoensaio competitivo apropriado, e também se liga a FcyRIIB, através da sua região variável, com uma afinidade maior do que o referido anticorpo ou um seu fragmento se liga a FcyRIIA. A presente invenção também engloba a manipulação de um anticorpo anti-FcYRIIB compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e/ou uma sequência de aminoácidos de domínio variável da cadeia leve que é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada e/ou do domínio variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal de ratinho produzido pelo clone 2B6, 3H7, 8B5.3.4, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ou 1F2 possuindo os números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-7610, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, e PTA-5959, respetivamente. A presente invenção engloba ainda a manipulação de anticorpos anti-FcYRIIB compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma ou mais CDRs que é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de uma ou mais CDRs de anticorpo monoclonal de ratinho produzido pelo clone 2B6, 3H7, 8B5.3.4, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ou 1F2 com os números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-7610, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, e PTA-5959, respetivamente. A determinação da percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos pode ser determinada por qualquer método conhecido de um perito na arte, incluindo pesquisas BLAST de proteínas. A presente invenção também engloba a manipulação de um ou mais anticorpos anti-FcYRIIB compreendendo um ou mais domínios variáveis codificados por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a sequência de nucleotídeos de um ou mais domínios variáveis de um anticorpo monoclonal de ratinho produzido pelo clone 2B6, 3H7, 8B5.3.4, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ou 1F2 com números de Acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-7610, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA- 5960 e PTA-5959, respetivamente, sob condições rigorosas. Numa forma de realização preferida, a invenção abrange a manipulação de um ou mais anticorpos anti-FcyRIIB compreendendo um domínio de cadeia leve variável e/ou domínio variável da cadeia pesada codificado por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com a sequência de nucleotídeos do domínio variável de cadeia leve e/ou domínio variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de ratinho produzido pelo clone 2B6, 3H7, 8B5.3.4, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ou 1F2 com números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-7610, PTA- 5958, PTA- 5961, PTA-5962, PTA-5960, e PTA-5959, respetivamente, sob condições rigorosas. Numa outra forma de realização preferida, a invenção abrange a manipulação de anticorpos anti-FcyRIIB compreendendo uma ou mais CDRs codificadas por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições rigorosas com a sequência de nucleotídeos de uma ou mais CDRs do anticorpo monoclonal de ratinho produzido pelo clone 2B6, 3H7, 8B5.3.4, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ou 1F2 com números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-7610, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, e PTA- 5959, respetivamente. As condições de hibridação rigorosas incluem, mas não estão limitadas a hibridação com ADN de ligação a filtro em 6x de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC/SDS a 0,1% a cerca de 50- 65 °C, condições altamente rigorosas, tais como hibridação com ADN de ligação a filtro em 6X SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,1X SSC/SDS a 0,2% a cerca de 60 °C, ou quaisquer outras condições de hibridação rigorosas conhecidas dos peritos na arte (ver, por exemplo, Ausubel, FM et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. e John

Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque nas páginas 6.3.1 a 6.3.6 e 2.10.3) .

Numa forma de realização preferida, os anticorpos manipulados da presente invenção são humanizados por qualquer método conhecido na técnica ou aqui descritos e/ou compreendem as regiões de CDR de um anticorpo humanizado especifico para FcyRIIB ou anticorpo CD20 humanizado especifico, em que as referidas CDRs são derivadas de um anticorpo de murino especifico para FcyRIIB ou CD20, respetivamente. Em algumas formas de realização, os anticorpos humanizados aqui descritos compreendem alterações, incluindo mas não se limitando a deleções, inserções, modificações de aminoácidos do anticorpo aceitador, isto é, as regiões de estrutura de domínio humano variável de cadeia pesada e/ou leve, que são necessárias para a retenção de especificidade de ligação do anticorpo monoclonal dador. Em algumas formas de realização, as regiões estruturais dos anticorpos humanizados aqui descritos não consistem necessariamente na sequência de aminoácidos exata da região estrutural de uma região variável de anticorpo humano de ocorrência natural, mas contém várias alterações, incluindo mas não se limitando a deleções, inserções, modificações de aminoácidos que alteram a propriedade do anticorpo humanizado, por exemplo, melhoram as propriedades de ligação de uma região variável do anticorpo humanizado específica para o mesmo alvo que o FcyRIIB de murino ou anticorpo específico de CD20. Em formas de realização mais preferidas, um número mínimo de alterações são feitas à região estrutural, a fim de evitar introduções em larga escala de resíduos de estrutura não-humanos e para assegurar a imunogenicidade mínima do anticorpo humanizado da invenção em seres humanos. 0 anticorpo monoclonal dador é de preferência um anticorpo monoclonal produzido pelo clone 2B6, 3H7, 8B5.3.4, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ou 1F2 (possuindo os números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-7610, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA- 5960 e PTA-5959, respetivamente) que se ligam a FcyRIIB, ou o anticorpo monoclonal é um anticorpo CD20, tal como rituximab, ou 2H7.

Numa forma de realização especifica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo enxertado com CDR, que compreende um domínio de região variável de cadeia pesada compreendendo os resíduos estruturais do anticorpo recetor, e os resíduos do anticorpo monoclonal dador, que se liga especificamente a FcyRIIB, por exemplo, o anticorpo monoclonal produzido a partir de clones 2B6, 3H7, 8Β5.3.4, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ou 1F2 com os números de acesso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-7610, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, e PTA-5959, respetivamente. Numa outra forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo enxertado com CDR, que compreende um domínio de região variável de cadeia leve compreendendo os resíduos estruturais do anticorpo recetor, e os resíduos do anticorpo monoclonal dador, que se liga especificamente a FcyRIIB, por exemplo, o anticorpo monoclonal produzido a partir de clones 2B6, 3H7, 8B5.3.4, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ou 1F2 .

De preferência, os anticorpos humanizados FcyRIIB ligam-se ao domínio extracelular de FcyRIIB nativo humano. Os anticorpos humanizados anti-FcYRIIB das combinações podem ter uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de CDR1 (SEQ.ID. NO: 15 ou SEQ ID NO: 16) e/ou CDR2 (SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18) e/ou CDR3 (SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO:20) e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de CDR1 (SEQ ID NO:21 ou SEQ ID NO:22) e/ou a CDR2 (SEQ ID NO: 2 3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, ou SEQ ID NO: 2 6) e/ou CDR3 (SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:28).

Numa forma de realização especifica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo humanizado anti-FcYRIIB com o dominio variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 e um dominio variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

Numa forma de realização especifica, a invenção engloba a manipulação de um anticorpo humanizado antí-FcyRIIB, em que a região VH do anticorpo FcyRIIB consiste nos segmentos FR de VH da linha germinal humana VH1-18 segmento (Matsuda et al., 1998, J. Exp. Med. 188:2151062) e JH6 (Ravetch et al.r 1981, Cell 27(3 Pt. 2): 583-91), a uma ou mais regiões de CDRs de um VH de 2B6, com a sequência de aminoácidos SED ID NO: 1, SEQ ID NO: 17, ou SEQ ID NO: 19. Numa forma de realização, o VH de 2B6 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 29. Numa outra forma de realização especifica, o anticorpo humanizado anti-FcyRIIB compreende ainda uma região VL, que consiste em segmentos de FR do VL do segmento de linha germinal humana VK-A26 (Lautner-Rieske et al. , 1992, Eur. J. Immunol. 22:1023-1029) e JK4 (Hieter et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-22), e uma ou mais regiões de CDRs de um VL de 2B6, com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 2 3, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:27. Numa forma de realização, o VL de 2B6 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 30, e opcionalmente em combinação com um VHs de 2B6 acima referenciados.

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-FcYRIIB manipulado de acordo com os métodos da invenção tem uma cadeia VH e/ou um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos (H2B6VH-3):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDTYPNYN

KKFKGRWMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYSGMDYWGQGTTVTVSS

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-FcYRIIB manipulado de acordo com os métodos da invenção tem uma cadeia VL e/ou um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos (H2B6VL-5): EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTFTCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKEVSESISGVPSR FSGSGS6TDFTLTINSLEAEDÃÃTYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:8).

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGVIDPSDTYPNYN

KKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYSGMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 3) e uma cadeia VL e/ou um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos (H2B6VL-5): EIVLTQSPDBOSVTL’PKEKVTFTCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKBVSESISGVPSR FSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEIK (SEQ Π>ΝΟ:8).

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-FcYRIIB manipulado de acordo com os métodos da invenção tern urn domínio VH e/ou uma cadeia VH que compreende a sequência de aminoácidos (8B5.3.4 VH, ver FIG. 2):

EVKLEESGQGLVQPGGSMKLSCBASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRNKAKNHATY YAESVIGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYyCGALGLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:9).

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-FcYRIIB manipulado de acordo com os métodos da invenção tern urn domínio VL e/ou uma cadeia VL que compreende a sequência de aminoácidos (8B5.3.4 VL, ver FIG. 1): DIQMTQSPSSLLAALGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGT1KRLIYAASTLDSGVPKR FSGSESGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYFSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:10).

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-FcYRIIB manipulado de acordo com os métodos da invenção tern urn domínio VH e/ou uma cadeia VH que compreende a sequência de aminoácidos (8B5.3.4 VH): EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCEASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRNKAKNHA TY YAESVIGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCGALGLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 9, ver FIG. 2) e um domínio VL e/ou uma cadeia VL que compreende a sequência de aminoácidos (8B5.3.4 VL, ver FIG. 1): DIQMTQSPSSLLAALGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKR FSGSESGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYFSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:10).

Numa outra forma de realização específica, o anticorpo anti-FcYRIIB manipulado de acordo com os métodos da invenção é um anticorpo humanizado 3H7, em que a região VH de FcyRIIB consiste nos segmentos FR a partir de um segmento VH de linha germinal humana e as regiões CDR do VH de 3H7, possuindo a sequência de aminoácidos de SED ID NO: 37. Noutra forma de realização especifica, o anticorpo humanizado 3H7 compreende ainda uma região VL, que consiste em segmentos de FR de um segmento VL de linha germinal humana e as regiões CDR de 3H7VL, possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

Em particular, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo anti-FcYRIIB em que o anticorpo se liga imuno-especificamente a um domínio extracelular de FcyRIIB nativo humano, o referido anticorpo FcyRIIB compreendendo (ou, em alternativa, consistindo de) sequências de CDR de 2B6, 3H7, ou 8B5.3.4 em qualquer das seguintes combinações uma CDR1 de VH e uma CDR1 de VL; uma CDR1 de VH e uma CDR2 de VL; uma CDR1 de VH e uma CDR3 de VL; uma CDR2 de VH e uma CDR1 de VL; CDR2 de VH e CDR2 de VL; uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VL; uma CDR3 de VH e uma CDR1 de VH; uma CDR3 de VH e uma CDR2 de VL; uma CDR3 de VH e uma CDR3 de VL; uma VH1 CDR1, uma CDR2 de VH e uma CDR1 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR2 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VL; uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH e uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH e uma CDR2 de VL; uma CDR2 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR2 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR3 de VL; uma CDR2 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR2 de VL; uma CDR2 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR3 de VL; uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR2 de VL; uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR3 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH e uma CDR1 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH e uma CDR2 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH e uma CDR3 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR2 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR3 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR2 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR3 de VL; uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR2 de VL; uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR3 de VL; uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR2 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL e uma CDR3 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH, uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e uma CDR3 de VL; uma CDR1 de VH, uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e uma CDR3 de VL; , uma CDR2 de VH, uma CDR3 de VH, uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL, e uma CDR3 de VL; ou qualquer combinação das CDRs de VH e CDRs de VL aqui descritas. 0 anticorpo monoclonal anti-FcYRIIB pode compreender uma modificação na posição 334 com ácido glutâmico, na posição 359 com asparagina, e na posição 366 com serina (MgFcl3) ; ou uma substituição na posição 316 por ácido aspártico, na posição 378 por valina, e na posição 399 por ácido glutâmico (MgFc27); ou uma substituição na posição 243 com isoleucina, na posição 379 por leucina, e na posição 420 por valina (MgFc29); ou uma substituição na posição 392 por treonina e na posição 396 com leucina (MgFc38); ou uma substituição na posição 221 por ácido glutâmico, na posição 270 por ácido glutâmico, na posição 308 por alanina, na posição 311 por histidina, na posição 396 por leucina, e na posição 402 por aspártico (MgFc42); ou uma substituição na posição 410 por histidina, e na posição 396 por leucina (MgFc53); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 305 por isoleucina, na posição 378 por ácido aspártico, na posição 404 por serina, e na posição 396 por leucina (MgFc54); ou uma substituição na posição 255 por isoleucina e na posição 396 por leucina (MgFc55) ; ou uma substituição na posição 370 por ácido glutâmico, e na posição 396 por leucina (MgFc59); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina (MgFc88); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, e na posição 396 por leucina (MgFc88A); ou uma substituição na posição 234 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina (MgFcl55); ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 300 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 243 por leucina, e na posição 292 por prolina; ou uma substituição na posição 243 por leucina; ou uma substituição na posição 273 por fenilalanina (ver tabelas 5&6).

5.1.1 CONJUGADOS DE polipeptídeos e ANTICORPOS

As moléculas da presente invenção (isto é, polipeptídeos, anticorpos) que compreende regiões de Fc variantes podem ser fundidas de forma recombinante ou conjugadas quimicamente (incluindo as conjugações covalentes e não covalentes) com polipeptídeos heterólogos (ou seja, um polipeptídeo não relacionado; ou uma sua porção, de preferência pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos do polipeptideo) para gerar proteínas de fusão. A fusão não precisa necessariamente de ser direta, mas pode ocorrer através de sequências de ligação.

Além disso, as moléculas da invenção (isto é, polipeptídeos, anticorpos) que compreendem regiões de Fc variantes podem ser conjugadas com um agente terapêutico ou uma porção de fármaco que modifica uma dada resposta biológica. Os agentes terapêuticos ou porções de fármaco não são para ser interpretados como limitados a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptideo possuindo uma atividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas (isto, PE-40) ou toxina da difteria, ricina, gelonina, e proteína antiviral de pokeweed, uma proteína tal como fator de necrose tumoral, interferões incluindo, mas não se limitando a, α-interferão (IFN-α), β-interferão (IFN-β), fator de crescimento do nervo (NGF) , fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), ativador do plasminogénio tissular (TPA), um agente de apoptose (por exemplo, o TNF-a, TNF-β, AIM I tal como descrito na Publicação de PCT N 0 WO 97/33899), AIM II (ver, publicação de PCT n° WO 97/34911), ligante Fas (Takahashi et al.r J. Immunol., 6:1567-1574, 1994), e VEGI (publicação de PCT n° WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente anti-angiogénico (por exemplo, angiostatina ou endostatina), ou um modificador da resposta biológica, tais como, por exemplo, uma linfocina (por exemplo, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos ("GM-CSF"), e fator estimulador de colónias de granulócitos ("G-CSF"), fator de estimulação de colónias de macrófagos ("M-CSF"), ou um fator de crescimento (por exemplo, hormona de crescimento ("GH"); proteases ou ribonucleases.

As moléculas da presente invenção (isto é, os polipeptideos, anticorpos) podem ser fundidas em sequências de marcador, tal como um péptido para facilitar a purificação. Em formas de realização preferenciais, a sequência de aminoácidos do marcador é um péptido hexa-histidina, tal como a etiqueta fornecida num vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Tal como descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 86:821-824, por exemplo, a hexa-histidina proporciona a purificação conveniente da proteína de fusão. Outras etiquetas peptídicas úteis para a purificação incluem, mas não estão limitadas à etiqueta de hemaglutinina "HA", que corresponde a um epitopo derivado da proteína da hemaglut inina da gripe (Wilson et al, Cell, 37:767 1984) e a etiqueta "flag" (Knappik et al, Biotechniques, 17 (4) : 754-761, 1994) .

Proteínas adicionais de fusão podem ser geradas através das técnicas de arranjo combinatorial de genes, arranjo combinatorial de motivos, arranjo combinatorial de exões e/ou arranjo combinatorial de codões (colectivamente referidos como "arranjo combinatorial de ADN"). 0 arranjo combinatorial de ADN pode ser empregue para alterar as atividades de moléculas da presente invenção (por exemplo, anticorpos com afinidades mais elevadas e taxas de dissociação mais baixas). Veja-se, geralmente, nas Patentes nos EUA n° 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; e 5, 837,458, e em Patten et al. , 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265; e Lorenzo e Blasco, 1998, BioTechniques 24:308 (cada uma destas patentes e publicações sendo aqui incorporadas por referência na sua totalidade). As moléculas da invenção compreendendo regiões de Fc variantes, ou os ácidos nucleicos que codificam as moléculas da invenção, podem ainda ser alteradas ao serem submetidas a mutagénese aleatória por PCR propensa a erros, inserção aleatória de nucleotideos ou outros métodos anteriores à recombinação. Uma ou mais porções de um polinucleotideo que codifica uma molécula da invenção, podem ser recombinadas com um ou mais componentes, motivos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc., de uma ou mais moléculas heterólogas. A presente invenção também abrange moléculas da invenção compreendendo regiões de Fc variantes (ou seja, anticorpos, polipeptídeos) conjugadas com um agente terapêutico ou de diagnóstico, ou qualquer outra molécula para a qual a semivida sérica é desejada como sendo aumentada e/ou direcionada para um subconjunto específico de células. As moléculas da invenção podem ser utilizadas diagnosticamente para, por exemplo, monitorizar o desenvolvimento ou a progressão de uma doença, distúrbio ou infeção como parte de um procedimento de ensaio clínico para, por exemplo, determinar a eficácia de um dado regime de tratamento. A deteção pode ser facilitada pelo acoplamento das moléculas da presente invenção a uma substância detetável. Exemplos de substâncias detetáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de positrões, iões metálicos paramagnéticos e não radioativos. A substância detetável pode ser acoplada ou conjugada quer diretamente com as moléculas da presente invenção ou indiretamente, através de um intermediário (tal como, por exemplo, um ligante conhecido na especialidade), utilizando técnicas conhecidas na arte. Ver, por exemplo, a Patente nos EUA n° 4,741,900 para iões metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para utilização como agentes de diagnóstico de acordo com a presente invenção. Tal diagnóstico e deteção podem ser conseguidos por acoplamento de moléculas da invenção a substâncias detetáveis, incluindo, mas não limitado a, diversas enzimas, incluindo enzimas, mas não se limitando a, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, betagalactosidase, ou acetilcolinesterase; complexos de grupos prostéticos tais como, mas não limitado a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, mas não limitados a, umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, fluoresceina de diclorotriazinilamina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; material luminescente, tal como, mas não limitado a luminol; materiais bioluminescentes tais como, mas não limitados a, luciferase, luciferina e aequorina; material radioativo tal como, mas não limitado a, bismuto (213Bi) , carbono (14C) , crómio (51Cr) , cobalto (17Co) , flúor (18F) , gadolinio (153Gd, 159Gd) , gálio (68Ga, 67Ga) , germânio (68Ge) , hólmio (166Ho) , índio (115In, 113In, 112In, 711In) , iodo (131I, 125I, 123I, 121I), lantânio (140La) , lutécio (177Lu) , manganês (54Mn) , molibdénio ("Mo) , paládio (103Pd) , fósforo (32P) , praseodimio (142Pr) , prometio (149Pm) , rénio (186Re, 188Re) , ródio (105Rh) , rutémio (97Ru) , samário (153Sm) , escândio (47Sc) , selénio (75Se) , estrôncio (85Sr) , enxofre (35S) , tecnécio ("Tc) , tálio (201Ti) , estanho (113Sn, 117Sn) , trítio (3H) , xénon (133Xe) , itérbio (169Yb, 175Yb) , ítrio (90Y) , zinco (55Zn) ; metais emissores de positrões usando várias tomografias de emissão de positrões, e iões metálicos paramagnéticos não radioativos.

As moléculas da invenção (isto é, anticorpos, polipeptideos) que compreendem uma região de Fc variante podem ser conjugadas com uma porção terapêutica tal como uma citotoxina (por exemplo, um agente citostático ou citocida), um agente terapêutico ou um elemento radioativo (por exemplo, alfa-emissores, gama-emissores, etc.). As citotoxinas ou agentes citotóxicos incluem qualquer agente que seja prejudicial para as células. Os exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- dihidrotestosterona, glucocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos destes. Os agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, decarbazina de 5-fluorouracilo), agentes alquilantes (p.ex., mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, canustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cisdiclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (p.ex., daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC), e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

Além disso, uma molécula da invenção pode ser conjugada com porções terapêuticas, tais como materiais radioativos ou quelantes macrocíclicos úteis para a conjugação de iões radiometálicos (ver acima para os exemplos de materiais radioactivos). Em certas formas de realização, o agente quelante macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,Ν',N",N"'-tetra-acético (DOTA), que pode ser ligado ao anticorpo através de uma molécula ligante. Tais moléculas de ligação são vulgarmente conhecidas na arte e estão descritas em Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; e Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50.

As técnicas para conjugação de tais porções terapêuticas com anticorpos são bem conhecidas; ver, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; e Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58, 1982.

Num exemplo, em que a molécula da divulgação é um anticorpo que compreende uma região de Fc variante, ela pode ser administrada com ou sem uma quantidade terapêutica conjugado a ela, administrada sozinha, ou em combinação com fator (es) citotóxico(s) e/ou citocina(s) para uso como um tratamento terapêutico. Alternativamente, um anticorpo da presente invenção pode ser conjugado com um segundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado como descrito por Segai na Patente nos EUA 4,676,980. Os anticorpos da invenção também podem ser ligados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antígeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinilo ou polipropileno. 5.2 RASTREIO DE moléculas com REGIÕES de Fc VARIANTes para ligação melhorada a FcyRIII E CARACTERIZAÇÃO das mesmas

Em formas de realização preferidas, o rastreio e identificação de moléculas que compreendem regiões de Fc variantes com afinidades FcyR alteradas (por exemplo, maior afinidade a FcyRIIIA) são feitos usando a tecnologia de exibição de levedura como aqui descrita em combinação com um ou mais ensaios de base bioquímica, de preferência numa forma de alto rendimento. O um ou mais ensaios bioquímicos pode ser qualquer ensaio conhecido na especialidade para a identificação da interação Fc-FcyR, isto é, a ligação específica de uma região de Fc a um FcyR, incluindo, mas não limitado a, um ensaio ELISA, ensaios de ressonância de plasma de superfície, ensaio de imunoprecipitação, cromatografia de afinidade, e diálise de equilíbrio. Em algumas formas de realização, o rastreio e identificação de moléculas que compreendem regiões de Fc variantes com afinidades FcyR alteradas (por exemplo, afinidade melhorada FcyRIIIA) são feitos usando a tecnologia de exibição de levedura como aqui descrita em combinação com um ou mais ensaios de base funcional, de preferência numa maneira de alto rendimento. Os ensaios funcionais podem ser qualquer ensaio conhecido na especialidade para a caracterização de uma ou mais funções celulares efetoras mediadas por FcyR tais como as aqui descritas na Secção 5.2.7. Exemplos não limitativos de funções de células efetoras que podem ser utilizados de acordo com os métodos da invenção, incluem mas não estão limitados a, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), fagocitose dependente de anticorpos, fagocitose, opsonização, opsonofagocitose, ligação de células, rosetas, ligação a Clq, e citotoxicidade mediada por células dependentes em complementos. Em algumas formas de realização, o rastreio e identificação de moléculas que compreendem regiões de Fc variantes com afinidades FcyR alteradas (por exemplo, afinidade melhorada FcyRIIIA) são feitos usando a tecnologia de exibição de levedura como aqui descrita em combinação com um ou mais ensaios com base bioquímica em combinação ou em paralelo com um ou mais ensaios de base funcional, de preferência de uma forma de alto rendimento. 0 termo "ligação específica" de uma região de Fc a um FcyR refere-se a uma interação da região de Fc e um determinado FcyR que tem uma constante de afinidade de pelo menos cerca de 150 nM, no caso de FcyRIIIA inonomérico e, pelo menos, cerca de 60 nM no caso de FcyRIIB dimérico como determinada utilizando, por exemplo, um ensaio ELISA ou um ensaio de ressonância de plasmon de superfície (por exemplo, um BIAcore™) . A constante de afinidade de uma região de Fc para com FcyRIIIA monomérico pode ser de 150 nM, 200 nM ou 300 nM. A constante de afinidade de uma região de Fc para com FcyRIIB dimérica pode ser de 60 nM, 80 nM, 90 nM, ou 100 nM. FcyRIIB dimérico para utilização nos métodos da invenção pode ser produzido utilizando métodos conhecidos de um perito na arte. Tipicamente, a região extracelular de FcyRIIB é ligada covalentemente a um polipeptídeo heterólogo que é capaz de dimerização, de modo que a proteína de fusão resultante é um dímero, por exemplo, ver, pedido nos EUA n° 60/439,709 depositado em 13 de janeiro 2003 (Arquivo n° 1118 3-005-888) . Uma interação específica é geralmente estável sob condições fisiológicas, incluindo, por exemplo, as condições que ocorrem num indivíduo vivo tal como um ser humano ou outro vertebrado ou invertebrado, bem como as condições que ocorrem numa cultura de células tais como as condições utilizadas para a manutenção e cultura de células de mamíferos ou células de outro organismo vertebrado ou organismo invertebrado.

Numa forma de realização específica, o rastreio e a identificação de moléculas que compreendem regiões de Fc variantes e afinidades alteradas para com FcyR compreendem: a exibição da molécula que compreende uma região de Fc variante na superfície da levedura; e caracterizar a ligação da molécula compreendendo a região de Fc variante para com um FcyR (um ou mais), utilizando um ensaio bioquímico para determinar a interação de Fc-FcyR, de preferência, um ensaio baseado em ELISA. Uma vez que a molécula que compreende uma região de Fc variante tenha sido caracterizada pela sua interação com um ou mais FcyRs e que tenha sido determinada como tendo uma afinidade alterada para com um ou mais FcyRs, por pelo menos um ensaio de base bioquímica, por exemplo, um ensaio ELISA, a molécula pode ser manipulada numa imunoglobulina completa, usando métodos de tecnologia de ADN recombinante padrão conhecidos na arte, e a imunoglobulina compreendendo a região de Fc variante expressa em células de mamífero para posterior caracterização bioquímica. A imunoglobulina em que uma região de Fc variante da invenção, é introduzida (por exemplo, substituindo a região de Fc da imunoglobulina) pode ser qualquer imunoglobulina, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, anticorpos multi-específicos, anticorpos e anticorpos humanizados quiméricos. Em formas de realização preferidas, uma região de Fc variante é introduzida numa imunoglobulina especifica para um recetor da superfície celular, um antígeno do tumor, ou um antígeno de cancro. A imunoglobulina em que uma região de Fc variante da invenção é introduzida pode se ligar especificamente a um antígeno de cancro ou tumor, por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, um antígeno de KS 1/4 de pan-carcinoma (Perez e Walker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4) : 407-415), o antígeno de carcinoma de ovário (CA125) (Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2): 468-475), fosfato de ácido prostático (Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16): 4928), antígeno específico da próstata (Henttu e Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2) : 903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227-230), antígeno associado a melanoma p97 (Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6): 445-446), antígeno de melanoma gp75 (Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4) : 1375-1380), antígeno de alto peso molecular de melanoma (HMWMAA) (Natali et al., 1987, Cancer 59: 55-63; Mittelman et al., 1990, J. Clin. Invest. 86: 2136-2144), antígeno da membrana específico da próstata, antígeno carcinoembrionário (CEA) (Foon et al, 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294), antígeno de mucina epitelial polimórfica, antígeno de glóbulos de gordura do leite humano, antígenos associados a tumor colorectal, tais como: CEA, TAG-72 (Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52: 3402- 3408), C017-1A (Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Cancer 53: 751-758); GICA 19-9 (Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135), CTA-1 and LEA, e LEA, antígeno-38.13 do linfoma de Burkitt, CD19 (Ghetie et al., 1994, Blood 83: 329-1336), antígeno de linfoma B humano CD20 (Reff et al, 1994, Blood 83: 435-445), CD33 (Sgouros et al, 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430), antígenos específicos de melanoma tais como gangliósido GD2 (Saleh et al., 1993, J. Immunol., 151, 3390-3398), gangliósido GD3 (Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380), gangliósido GM2 (Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044), gangliósido GM3 (Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53: 5244- 5250), tipo de antígeno da superfície celular de transplante específico de tumor (TSTA), tais como os antígenos tumorais induzidos por vuris, incluindo vírus Τ'-antígeno de tumor de ADN e antígenos do envelope de vírus de ARN de tumor, antígeno oncofetal-alfa-fetoproteína, tais como CEA do cólon, antígeno oncofetal do tumor da bexiga (Hellstrom et al, 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188), antígeno de diferenciação, tais como antígeno de carcinoma de pulmão humano L6, L20 (Hellstrom et al., 1986, Cancer

Res. 46: 3917-3923), antígenos de fibrossarcoma, antígeno- GP37 de leucemia de células T humanas (Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141:1398-1403), neoglicoproteína, esfingolípidos, antígeno do cancro da mama, tais como o EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) , antígeno HER2 (pl85HER2) , mucina epitelial polimórfica (PEM) (PEM) (Hilkens et al., 1992, Trends in

Bio. Chem. Sci. 17:359), antigeno-APO-1 de linfócitos humanos malignos (Bernhard et al. , 1989, Science 245: 301- 304), antigeno de diferenciação (Feizi, 1985, Nature 314: 53-57), como o antigeno encontrado em eritrócitos fetais, antigeno endoderme primário I encontrado em eritrócitos adultos, embriões pré-implantação, I(Ma) encontrado em adenocarcinomas gástricos, M18, M39 encontrado no epitélio mamário, SSEA-1 encontrado em células mieloides, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, Di56-22 encontrado no cancro colorretal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), C14 encontrado em adenocarcinoma do cólon, F3 encontrado em adenocarcinoma de pulmão, AH6 encontrado em cancro gástrico, hapteno Y, Le^ encontrado em células de carcinoma embrionário, TL5 (grupo sanguíneo A), recetor EGF encontrado em células A431, série Ei (grupo sanguíneo B) encontrado no cancro do pâncreas, FC10.2 encontrado em células de carcinoma embrionário, antigeno do adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado no adenocarcinoma, NS-10 encontrados em adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb), G49 encontrado em recetor de EGF de células A431, MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado em adenocarcinoma do cólon, 19,9 encontrado em cancro de cólon, mucinas de cancro gástrico, T5A7 encontrado em células mieloides, R24 encontrado em melanoma, 4.2, Gd3, Dl.l, OFA-1, Gm2, OFA-2,

Gd2 e Ml: 22: 25: 8 encontrado em células de carcinoma embrionário, e SSEA-3 e SSEA-4 encontrado em embriões de estágio celular 4 a 8. Numa forma de realização, o antigeno é um péptido derivado de recetor de células T de um Linfoma de Células T cutâneo (ver, Edelson, 1998, The Cancer

Journal 4:62) .

Em algumas formas de realização, uma região de Fc variante da invenção, é introduzida num anticorpo monoclonal anti- fluoresceína, 4-4-20 (Kranz et al, 1982, J. Biol. Chem. 257(12): 6987-6995). Noutras formas de realização, uma região de Fc variante da invenção, é introduzida num anticorpo monoclonal quimérico anti-CD20 de ratinho-humano 2H7, que reconhece a fosfoproteina de superfície celular CD20 em células B (Liu et al, 1987, Journal of Immunology, 139.: 3521-6is) . Ainda noutras formas de realização, uma região de Fc variante da invenção, é introduzida num anticorpo humanizado (Ab4D5) contra o recetor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (pl85 HER2), tal como descrito por Carter et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89: 4285-9) . Ainda noutras formas de realização, uma região de Fc variante da invenção, é introduzida num anticorpo humanizado anti-TAG 72 (CC49) (Sha et al., 1994

Cancer Biother. 9(4): 341-9). Noutras formas de realização, uma região de Fc variante da invenção, é introduzida em Rituxan que é utilizado para o tratamento de linfomas.

Numa outra forma de realização específica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo anti-FcyRIIB incluindo mas não se limitando a qualquer um dos anticorpos descritos no Pedido Provisório nos EUA n° 60/403,266 depositado em 12 de agosto de 2002, Pedido nos EUA n° 10/643,857 depositado em 14 de agosto de 2003, Pedido

Provisório nos EUA n° 60/562,804 depositado em 16 de abril de 2004, Pedido Provisório nos EUA n° 60/582,044 depositado em 21 de junho de 2004, Pedido Provisório nos EUA n° 60/582,045 depositado em 21 de junho de 2004, Pedido

Provisório nos EUA n° 60/636,663 depositado em 15 de dezembro de 2004 e Pedido nos EUA n° 10/524,134 depositado em 11 de fevereiro de 2005 por modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um resíduo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Numa outra forma de realização especifica, a invenção abrange a manipulação de um anticorpo humanizado anti-FcYRIIB incluindo mas não se limitando a qualquer um dos anticorpos descritos no Pedido Provisório nos EUA n° 60/569, 882 depositado em 10 de maio de 2004, Pedido Provisório nos EUA n° 60/582, 043 depositado em 21 de junho de 2004 e Pedido nos EUA n° 11/126, 978, depositado em 10 de maio de 2005 por modificação (por exemplo, substituição, inserção, deleção) de pelo menos um residuo de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc para com FcyRIIIA. Exemplos de anticorpos anti-FcYRIIB, que podem ou não ser humanizados, que podem ser manipulados de acordo com os métodos da invenção são o anticorpo monoclonal 2B6 com o número de acesso ATCC PTA-4591 e 3H7 possuindo o número de acesso ATCC PTA-4592, anticorpo monoclonal 1D5 com o número de acesso ATCC PTA- 5958, anticorpo monoclonal 1F2 com o número de acesso ATCC PTA-5959, anticorpo monoclonal 2D11 com o número de acesso ATCC PTA-5960, anticorpo monoclonal 2E1 com o número de acesso ATCC PTA- 5961 e anticorpo monoclonal 2H9 com o número de acesso ATCC PTA-5962 (todos depositados em 10801 University Boulevard, Manassas, VA 02209-2011), que são aqui incorporados por referência. Numa outra forma de realização especifica, a modificação do anticorpo anti-FcYRIIB pode também ainda diminuir a afinidade da região de Fc para com FcyRIIB. Ainda noutra forma de realização especifica, o anticorpo anti-FcYRIIB manipulado pode ainda ter uma função efetora aumentada como determinado por ensaios padrão conhecidos na arte e aqui divulgados e exemplificados. Em algumas formas de realização, uma região de Fc variante da invenção, é introduzida um anticorpo monoclonal terapêutico especifico para um recetor de antigeno de cancro ou de superfície celular, incluindo mas não se limitando a, Erbitux™ (também conhecido como IMC-C225) (ImClone Systems Inc.), um anticorpo quimerizado monoclonal contra EGFR; HERCEPTIN® (Trastuzumab) (Genentech, CA) que é um anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado para o tratamento de pacientes com cancro da mama metastático; REOPRO® (abciximab) (Centocor) que é um receptor anti-glicoproteína Ilb/IIIa nas plaquetas para a prevenção da formação de coágulos; ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suíça), que é um imunossupressor, anticorpo monoclonal anti-CD25 humanizado, para a prevenção da rejeição do aloenxerto renal agudo. Outros exemplos são um anti-CD18 F(ab')2 humanizado (Genentech); CDP860 que é um anti-CD18 F(ab')2 humanizado (Celltech, UK) ; PR0542 que é um anticorpo anti-HIV gpl20 fundido com CD4 (Progenics/Genzyme Transgenics); C14 que é um anticorpo anti-CD14 (ICOS Pharm); um anticorpo humanizado anti-VEGF IgGl (Genentech); OVAREX™, que é um anticorpo anti-CA 125 de murino (Altarex); PANOREX™, que é um anticorpo IgG2a de antígeno de superfície celular anti-17-IA de murino (Glaxo Wellcome/Centocor); IMC-C225 que é um anticorpo IgG anti-EGFR quimérico (ImClone System); VITAXIN™, que é um anticorpo anti-integrina humanizado οΛ/β3 (Applied Molecular Evolution/Medlmmune); Campath 1H/LDP-03 que é um anticorpo anti-CD52 de IgGl humanizado (Leukosite); Smart M195 é um anticorpo anti-CD33 de IgG humanizado (Protein Design Lab/Kanebo); RITUXAN™, que é um anticorpo anti-CD20 quimérico de IgGl (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); LYMPHOCIDE™, que é um anticorpo anti-CD22 de IgG humanizado (Immunomedics); Smart ID10 que é um anticorpo anti-HLA humanizado (Protein Design Lab); ONCOLYM™ (Lym-1) é um anticorpo de murino anti-HLA DR radiomarcado (Techniclone) ; anti-CDlla é um anticorpo de IgGl humanizado (Genetech/Xoma) ; ICM3 é um anticorpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 é um anticorpo anti-CD80 primatizado (IDEC Pharm/Mitsubishi); ZEVALIN™ é um anticorpo anti-CD20 de murino radiomarcado (IDEC/Schering AG); IDEC-131 é um anticorpo humanizado anti-CD40L (IDEC/Eisai); IDEC- 151 é um anticorpo anti-CD4 primatizado (IDEC); IDEC-152 é um anticorpo anti-CD23 primatizado (IDEC/Seikagaku); SMART Anti-CD3 é um anticorpo humanizado anti-CD3 de IgG (Protein Design Lab); 5G1.1 é um anticorpo de fator 5 anti-complemento humanizado (C5) (Alexion Pharm); IDEC-151 é um anticorpo anti-CD4 de IgGl primatizado (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 é um anticorpo de IgG humano anti-CD4 (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 é um anticorpo anti-TNF-α de IgG4 humanizado (Celltech) ; LDP-02 é um anticorpo humanizado anti-o^7 (LeukoSite/Genentech); Orthoclone 0KT4A é um anticorpo anti-CD4 de IgG humanizado (Ortho Biotech); ANTOVA™ é um anticorpo anti-CD40L de IgG humanizado (Biogen); ANTEGREN™ é um anticorpo anti-VLA-4 de IgG humanizado (Elan); MDX-33 é um anticorpo anti-CD64 (FcyR) humano (Medarex/Centeon); rhuMab- E25 é um anticorpo anti-IgE de IgGl humanizado (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems); IDEC-152 é um anticorpo anti-CD23 primatizados (IDEC Phann); ABX-CBL é um anticorpo anti-CD-147 de IgM de murino (Abgenix); BTI-322 é um anticorpo de ratinho anti-CD2 de IgG (Medimmune/Bio Transplant); 0rthoclone/0KT3 é um anticorpo anti-CD3 de IgG2a de murino (Ortho Biotech); SIMULECT™ é um anticorpo anti-CD25 guimérico de IgGl (Novartis Phann); LDP-01 é um anticorpo anti-32-integrina de IgG humanizado (LeukoSite); Anti-LFA-1 é um anti-CD18 F(ab')2 de murino (Pasteur-Merieux/Immunotech); CAT-152 é um anticorpo anti-TGF-p2 humano (Cambridge Ab Tech); e Corsevin M é um anticorpo anti-Fator VII quimérico (Centocor).

As regiões de Fc variante da invenção, de preferência no âmbito de uma imunoglobulina, podem ainda ser caracterizadas utilizando um ou mais ensaios bioquímicos e/ou um ou mais ensaios funcionais, de preferência numa forma de alto rendimento. Em algumas formas de realização alternativas, as regiões de Fc variantes da invenção, não são introduzidas numa imunoglobulina, e são ainda caracterizadas utilizando um ou mais ensaios bioquímicos e/ou um ou mais ensaios funcionais, de preferência numa forma de alto rendimento. 0 um ou mais ensaios bioquímicos pode ser qualquer ensaio conhecido na especialidade para a identificação de interações Fc-FcyR, incluindo, mas não limitado a, um ensaio de ELISA, e ensaio à base de ressonância de plasmon de superfície para determinar os parâmetros cinéticos de interação Fc-FcyR, por exemplo, ensaio BIAcore. Os um ou mais ensaios funcionais podem ser qualquer ensaio conhecido na especialidade para a caracterização de uma ou mais funções de células efetoras mediadas por FcyR, como conhecido para um especialista na técnica ou aqui descrito. Em formas de realização especificas, as imunoglobulinas que compreendem as regiões de Fc variantes são ensaiadas num ensaio de ELISA quanto à ligação a um ou mais FcyRs, por exemplo, FcyRIIIA, FcyRIIA, FcyRIIA; seguido por um ou mais ensaios de ADCC. Em algumas formas de realização, as imunoglobulinas que compreendem as regiões de Fc variantes são ensaiadas utilizando ainda um ensaio à base de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIAcore. Os ensaios à base de ressonância de plasmon de superfície são bem conhecidos na arte, e são discutidos na Secção 5.2.7, e aqui exemplificados no Exemplo 6.8.

Um ensaio de elevado rendimento exemplificativo para a caracterização de imunoglobulinas que compreende regiões de Fc variantes pode compreender: a introdução de uma região de Fc variante da invenção, por exemplo, por métodos de tecnologia de ADN recombinante convencionais, num anticorpo 4-4-20; caracterização de ligação especifica do anticorpo 4-4-20 compreendendo a região de Fc variante a um FcyR (por exemplo, FcyRIIIA, FcyRIIB) num ensaio ELISA; caracterização do anticorpo 4-4-20 compreendendo a região de Fc variante num ensaio de ADCC (utilizando métodos aqui descritos) , em que as células alvo são opsonizadas com o anticorpo 4-4-20 compreendendo a região de Fc variante; a região de Fc variante pode então ser clonada numa segunda imunoglobulina, por exemplo, 4D5, 2H7, e essa segunda imunoglobulina caracterizada por um ensaio ADCC, em que as células alvo são opsonizadas com o segundo anticorpo compreendendo a região de Fc variante. O segundo anticorpo compreendendo a região de Fc variante é então analisado adicionalmente utilizando um ensaio à base de ELISA para confirmar a ligação especifica a um FcyR.

De preferência, uma região de Fc variante da invenção, liga-se a FcyRIIIA e/ou FcyRIIA com uma maior afinidade do que uma região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado num ensaio ELISA. Mais preferencialmente, uma região de Fc variante da invenção liga-se a FcyRIIIA com uma afinidade mais elevada e liga-se a FcyRIIB com uma afinidade mais baixa do que uma região de Fc de tipo selvagem, tal como determinado num ensaio ELISA. Em algumas formas de realização, a região de Fc variante liga-se a FcyRIIIA com pelo menos 2 vezes, pelo menos 4 vezes, mais preferencialmente pelo menos 6 vezes, mais preferivelmente pelo menos 8 a 10 vezes mais afinidade do que uma região de

Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA e liga-se a FcyRIIB com pelo menos 2 vezes, pelo menos 4 vezes, mais preferencialmente pelo menos 6 vezes, mais preferivelmente pelo menos 8 a 10 vezes menos afinidade do que uma região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIB como determinado num ensaio de ELISA. A imunoglobulina compreendendo as regiões de Fc variantes pode ser analisada em qualquer ponto, usando um ensaio à base de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIAcore, para a definição dos parâmetros cinéticos da interação Fc-FcyR, utilizando métodos aqui descritos e conhecidos dos peritos na arte. De preferência, o Kd de uma região de Fc variante da invenção para se ligar a um FcyRIIIA monomérico, tal como determinado por análise BIAcore é de cerca de 100 nM, preferivelmente cerca de 70 nM, mais preferencialmente cerca de 40 nM; e o Kd da região de Fc variante da invenção para se ligar a um FcyRIIB dimérico é de cerca de 80 nM, cerca de 100 nM, mais preferencialmente cerca de 200 nM.

Em formas de realização mais preferidas, a imunoglobulina compreendendo as regiões de Fc variantes é ainda caracterizada por um modelo animal para a interação com um modelo animal FcyR preferido para utilização nos métodos da invenção são, por exemplo, os ratinhos transgénicos que expressam FcyRs humanos, por exemplo, qualquer modelo de ratinho descrito na patente nos EUA n° 5,877,397, e 6,676,927. Os ratinhos transgénicos para o uso nos métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a, ratinhos knockout nus FcyRIIIA portadores de FcyRIIIA humano; ratinhos knockout nus FcyRIIIA portadores de FcyRIIA humano; ratinhos knockout nus FcyRIIIA portadores de

FcyRIIB humano e FcyRIIIA humano; ratinhos knockout nus FcyRIIIA portadores de FcyRIIB humano e FcyRIIA humano; ratinhos knockout nus FcyRIIIA e ratinhos FcyRIIA portadores de FcyRIIIA humano e FcyRIIA e ratinhos knockout nus FcyRIIIA, FcyRIIA e FcyRIIB portadores de FcyRIIIA, FcyRIIA e FcyRIIB humano. 5.2.1 Estratégias de conceção A presente invenção abrange métodos de manipulação para gerar variantes de Fc, incluindo mas não se limitando a estratégias de conceção computacionais, métodos de geração de bibliotecas, e produção experimental e métodos de rastreio. Estas estratégias podem ser aplicadas individualmente ou em várias combinações para a manipulação das variantes de Fc da presente invenção.

Os métodos de manipulação aqui divulgados compreendem os métodos em que os aminoácidos na interface entre uma região de Fc e o ligante de Fc não são modificados. Os ligantes Fc incluem, mas não estão limitados a, FcyRs, Clq, FcRn, C3, recetor de manose, proteína A, proteína G, recetor de manose, e as moléculas desconhecidas que se ligam a Fc. Os aminoácidos na interface entre uma região de Fc e um ligante de Fc são definidos como aqueles aminoácidos que formam um contacto direto e/ou indireto, entre a região de Fc e o ligante, desempenham um papel estrutural na determinação da conformação da interface, ou estão dentro de, pelo menos, 3 angstroms, de um modo preferido, pelo menos, 2 angstroms um do outro, tal como determinado por análise estrutural, tais como cristalografia de raios-x e modelagem molecular. Os aminoácidos na interface entre uma região de Fc e um ligante de Fc incluem os aminoácidos que formam um contacto direto com um FcyR com base na análise de cristalografia estrutural e de interações de Fc-FcyR, tais como as divulgadas por Sondermann et al, (2000, Nature, 406: 267-273, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Exemplos de posições dentro da região de Fc que fazem um contacto direto com FcyR são os aminoácidos 234-239 (região de charneira), aminoácidos 265-269 (ansa B/C), aminoácidos 297-299 (ansa C'/E), e os aminoácidos 327-332 (ansa F/G) . Em algumas formas de realização, as moléculas da invenção que compreendem regiões de Fc variantes compreendem a modificação de pelo menos um resíduo que não faz um contacto direto com uma FcyR com base na análise estrutural e cristalográfica, por exemplo, não se encontra dentro do local de ligação de Fc-FcyR.

Os métodos de manipulação aqui divulgados não modificam qualquer um dos aminoácidos como identificado por Shields et al,. que esteja localizado no domínio CH2 de uma região de Fc próxima da região flexível, por exemplo, Leu234-PR0238; Ala327, Pro329, e afetam a ligação de uma região de Fc de todos os FcyRs humanos.

Noutras formas de realização, a invenção engloba variantes de Fc com afinidades FcyR alteradas e/ou funções efetoras alteradas, de tal modo que a variante Fc não tem uma modificação de aminoácidos numa posição, na interface entre uma região de Fc e ligante Fc. De preferência, tais variantes de Fc em combinação com uma ou mais outras modificações de aminoácidos que estão, na interface entre uma região de Fc e o ligante Fc possuem um impacto adicional na propriedade alterada em particular, por exemplo, afinidade alterada para com FcyR. A modificação de aminoácidos na interface entre o Fc e um ligante de Fc pode ser feita utilizando métodos conhecidos na arte, por exemplo, com base na análise estrutural dos complexos de Fc-ligante. Por exemplo, mas não a titulo de limitação, ao explorar as substituições nas posições favoráveis energeticamente de Fc que impactam a interface de ligação, as variantes podem ser manipuladas de modo a se conformar com a nova interface de amostra, algumas de tais conformações podendo melhorar a ligação ao ligante Fc, algumas das quais podem reduzir a ligação do ligante Fc, e algumas das quais podem ter outras propriedades favoráveis. Tais novas conformações de interface podem ser o resultado de, por exemplo, a interação direta com os resíduos de ligantes Fc que formam a interface, ou efeitos indiretos causados pelas modificações de aminoácidos, tais como a perturbação da cadeia lateral ou conformações de esqueleto. A presente divulgação engloba a manipulação de variantes de Fc compreendendo qualquer uma das modificações de aminoácidos aqui descritas em combinação com outras modificações em que a conformação do hidrato de carbono Fc na posição 297 é alterada. A divulgação engloba alterações conformacionais e composicionais no hidrato de carbono N297 o que resultará numa propriedade desejada, por exemplo, uma afinidade aumentada ou reduzida para com um FcyR. Tais modificações podem aumentar ainda mais o fenótipo da modificação de aminoácidos original das variantes de Fc da invenção. Apesar de não se pretender ficar ligado a um mecanismo especial de ações, tal estratégia é suportada pela observação de que a estrutura de hidratos de carbono e conformação afetam drasticamente a ligação Fc-FcyR e Fc/Clq (Umaha et al, 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al, 2001, J Biol Chem 276:45539; Radaev et al, 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473).

Outra estratégia de conceção para a geração de variantes de Fc, de acordo com a invenção é proporcionada, em gue a região de Fc é novamente manipulada para eliminar a dependência estrutural e funcional da glicosilação. Esta estratégia de conceção envolve a otimização da estrutura Fc, estabilidade, solubilidade, e/ou função de Fc (por exemplo, afinidade de Fc para um ou mais ligantes Fc) na ausência do hidrato de carbono N297. Numa abordagem, as posições gue são expostas ao solvente, na ausência de glicosilação são concebidas de tal modo gue são estáveis, estruturalmente consistentes com a estrutura Fc, e não têm tendência para se agregar. Abordagens para a otimização aglicosilada de Fc podem envolver, mas não estão limitadas à conceção de modificações de aminoácidos gue melhoram a estabilidade aglicosilada e/ou solubilidade de Fc por incorporação de resíduos polares e/ou carregados gue enfrentam para o interior do eixo do dímero Cg2-Cg2, e por meio da formulação de modificações de aminoácidos que aumentam diretamente a interface Fc-FcyR aglicosilada ou a interface de Fc aglicosilado com algum outro ligante Fc.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras modificações de Fc, incluindo mas não se limitando a alterações que modificam a função efetora. A invenção engloba uma combinação de Fc variante da invenção com outras modificações Fc para fornecer propriedades aditivas, sinérgicas, ou novas em anticorpos ou fusões de Fc. Tais modificações podem ser nos domínios de CHI, CH2 ou CH3 ou uma combinação dos mesmos. De preferência, as variantes de Fc da invenção melhoram a propriedade da modificação com a qual estão combinadas. Por exemplo, se uma variante Fc da invenção for combinada com um mutante que se sabe ligar FcyRIIIA com uma maior afinidade do que uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem; a combinação com um mutante da invenção resulta num maior realce de vezes na afinidade de FcyRIIIA.

Numa forma de realização, as variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras variantes de Fc, tais como as divulgadas em Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al. 1995, Proc Natl. Acad Sei USA 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, J Immunol 157:49634969; Armour et al, 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:41784184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); US 5,624,821; US 5,885,573; US 6,194,551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572. 5.2.2 ENSAIO DE LIGAÇÃO FcyR-Fo

Um ensaio de ligação FcyR-Fc foi desenvolvido para determinar a ligação das moléculas da invenção compreendendo regiões de Fc variantes a FcyR, que permitiu a deteção e quantificação da interação, apesar da afinidade inerentemente fraca do recetor ao seu ligante, por exemplo, na gama micromolar para FcyRIIB e FcyRIIIA. O método envolve a formação de um complexo FcyR que tem uma avidez melhorada para uma região de Fc, em relação a um FcyR não complexado. De acordo com a invenção, o complexo molecular preferido é um complexo tetramérico imune, compreendendo: (a) a região de FcyR solúvel (por exemplo, a região solúvel de FcyRIIIA ou FcyRIIB) ; (b) uma sequência de 15 aminoácidos AVITAG biotinilada (AVITAG) operativamente ligada ao terminal C da região de FcyR solúvel (por exemplo, a região solúvel de FcyRIIIA ou FcyRIIB); e (c) , estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE); numa proporção molar para formar um complexo FcyR tetramérico (de preferência numa relação de 5: 1 molar) . De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, a proteína de fusão é biotinilada enzimaticamente, utilizando, por exemplo, a enzima E. coli Bir A, uma ligase de biotina que biotinila especificamente um resíduo de lisina na sequência AVITAG de 15 aminoácidos. Numa forma de realização específica da invenção, 85% da proteína de fusão é biotinilado, conforme determinado por métodos padrão conhecidos dos peritos na arte, incluindo mas não se limitando a análise de desvio em estreptavidina. De acordo com formas de realização preferidas da invenção, as proteínas solúveis FcyR biotiniladas são misturadas com SA-PE numa razão molar de IX SA-PE: 5X FcyR solúvel biotinilado, para formar um complexo FcyR tetramérico.

Por uma questão de conveniência, os reagentes podem ser proporcionados num kit de ensaio, isto é, uma combinação embalada de reagentes para ensaiar a capacidade de moléculas que compreendem regiões de Fc variante de se ligarem a complexos tetraméricos FcyR. Outras formas de complexos moleculares para utilização na determinação de interações Fc-FcyR também são contempladas para utilização nos métodos da invenção, por exemplo, proteínas de fusão formadas como descrito no Pedido Provisório dos Estados Unidos 60/439,709, depositado em 13 de janeiro de 2003 (Rolo n° 11183-005-888).

5.2.3 MUTAGÉNESE E CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE EXIBIÇÃO DE LEVEDURAS

As interações moleculares entre os receptores de IgG Fc e Fc têm sido previamente estudadas por técnicas estruturais e genéticas. Estes estudos identificaram os resíduos de aminoácidos que são críticos para a ligação funcional de Fc a FcyRs diferentes. Nenhuma destas alterações tem sido mostrada como melhorando a eficácia mediada por FcyR humana de anticorpos terapêuticos em modelos animais. Não foi relatada uma análise completa de todas as mudanças de aminoácidos potenciais nestes resíduos ou outros resíduos potencialmente importantes. A plataforma aqui descrita tem a capacidade de construir bibliotecas mutantes com todas as possíveis alterações de aminoácidos, pesquisar bibliotecas utilizando vários ensaios funcionais, e finalmente analisar bibliotecas em modelos animais humanizados relevantes. A presente divulgação engloba a construção de múltiplas bibliotecas baseadas em dados genéticos e estruturais conhecidos na arte ou a ser desenvolvidos. 0 método descrito e exemplificado aqui incorpora a construção de bibliotecas individuais que contêm mutantes de teste de todas as mudanças de 20 aminoácidos entre 3-6 resíduos na região de Fc. O conjunto completo de mutações será montado em todas as combinações possíveis de mutações. O número de mutações independentes geradas baseia-se no número de locais a ser saturados durante a montagem da biblioteca (Tabela 9 abaixo). O tamanho da biblioteca vai determinar a escolha do rastreio principal e, portanto, a escolha do vetor para as etapas iniciais de clonagem.

A presente divulgação engloba a construção de bibliotecas combinatórias, incidindo sobre um número limitado de resíduos críticos (por exemplo, 3-6). Usando uma biblioteca de Fc de IgGl mutagenizada aleatoriamente e os ensaios de rastreio aqui descritos e exemplificados, as variantes de Fc serão identificadas. Nos ciclos iniciais, as melhores 5 mutações, com base tanto no perfil de ligação FcR como na atividade funcional, serão selecionadas. Serão necessários 205 mutantes individuais para cobrir todas as possíveis mudanças de aminoácidos e suas combinações em cinco locais. Uma biblioteca com uma cobertura, pelo menos, 10 vezes para cada mutante será gerada. Em adição, regiões serão escolhidas com base na informação disponível, por exemplo, a estrutura de dados de cristal, as diferenças de ligação ratinho/isótipo Human FcyR, os dados genéticos e locais adicionais identificados por mutagênese. A maior desvantagem dos protocolos mutagénicos dirigidos a locais atuais é a produção das populações de viés, variações de representação excessiva em algumas regiões e sub-representação ou completamente desprovidas de mutações noutras. A presente invenção ultrapassa este problema através da geração de matrizes imparciais de mutantes de Fc desejáveis utilizando uma tecnologia de construção de genes bem desenvolvida para eliminar os viés introduzidos na construção da biblioteca, por abordagens baseadas em PCR, tais como PCR de sobreposição e PCR invertida. As distinções fundamentais da abordagem da presente invenção são: 1) O emprego da mistura equimolar de 20 oligos individuais para cada codão alvo, em vez de iniciadores degenerados. Desta forma, cada um dos aminoácidos é representado por um único codão mais utilizado, enquanto que os iniciadores degenerados sobre-representam os aminoácidos codificados por mais codões mais do que os codificados por menos codões. 2) Construção de mutantes por uma abordagem de substituição de cadeia. Isto garante a introdução imparcial de todas as mudanças desejáveis para o produto final.

Um protocolo exemplar compreende os seguintes passos: 1) oligos fosforilados, representando alterações desejáveis em um ou vários locais, todos complementares à mesma cadeia, adicionados a modelo juntamente com uma polimerase de ADN e ligase termoestável, deficiente em 5' > 3' exonuclease, (Fig. 27 a). 2) a mistura montada sofre um certo número de ciclos de polimerização/ligação, suficientes para gerar uma quantidade desejada de produto. 0 uso de uma polimerase de ADN deficiente em 5' > 3' exonuclease assegura a integridade da sequência de iniciadores e do seu resíduo de fosfato, quando uma ligase termoestável monta fragmentos estendidos de iniciadores individuais numa cadeia de cadeia simples contígua. Os ciclos de reação podem continuar até à exaustão completa da ansa dos oligos sem enviesar para o produto final (Fig. 27 b) . 3) a ansa gerada de mutantes de cadeia simples é convertida em ADN de cadeia dupla pela adição de um iniciador específico do gene para a reação inversa (Fig. 27 lc) . 4) o produto de cadeia dupla fica digerido nos locais de restrição concebidos na terminação e é clonado num vetor de expressão apropriado (Fig. 27 ld).

Para garantir a qualidade da biblioteca, os fragmentos amplificados de PCR serão analisados por electroforese para determinar o comprimento final dos produtos de PCR. A reação será caracterizada como bem sucedida, se > 99% dos produtos de PCR forem do comprimento esperado. A biblioteca final será clonada num vetor de expressão. Uma fração da biblioteca de mutantes será sequenciada para determinar a taxa de incorporação do codão mutante. 0 número de fragmentos sequenciados será com base no número de locais alvo mutados e a validação da biblioteca será determinada pela taxa observada de mutações em sítios alvo (Tabela 10). A taxa de vetor sem inserções deve ser inferior a 2%. A taxa de mutação em locais não alvo deve ser inferior a 8%. As bibliotecas contendo clones com > 90% de inserções corretas permitirá rastrear cronogramas.

Noutras formas de realização, a invenção engloba a sobreposição ou inversão de PCR para a construção de bibliotecas. A fim de permanecer imparcial, iniciadores individuais para cada codão serão usados ao invés de iniciadores degenerativos. Um esquema de validação semelhante como supra divulgado será empregado. A maioria dos protocolos automatizados preferidos será empregue para a produção de bibliotecas de alto rendimento. A automação permite um maior rendimento, funcionamento de afastamento, e uma redução global de erro experimental para tarefas que exigem operações repetitivas tediosas. As capacidades de síntese oligo são baseadas em 2 sintetizadores de ADN Mermade (Bioautomation, Inc.), com uma capacidade de produção total de 575 Oligos 60mer/12 hrs. Software proprietário lida com todos os aspetos de conceção, síntese e armazenamento dos oligonucleotídeos finais. Manipuladores de líquidos robóticos serão empregues para configurar os oligos para a síntese de mutantes de Fc de comprimento completo e reações de ligação para incorporar os Fcs mutantes em vetores de expressão de cadeia pesada de anticorpo serão criadas. Após a ligação, estima-se que seriam necessários 1 FTE ~ 10 dias para selecionar os clones de bibliotecas e gerar -8000 minipreparados, o equivalente a uma biblioteca combinatória saturada em 3 locais. Subsequentemente a uma transformação bacteriana, um robô coletor de clones Qpix-2 será utilizado para a colheita de colónias em placas de 96 poços profundos. O crescimento da cultura será feito usando um agitador magnético de levitação, capaz de incubação de 12 placas e resultando em crescimento denso em 12 -16 h a 37 °C. Um robot de minipreparação Qiagen vai ser usado para executar preparados de ADN à razão de 4 placas de 96 poços em 2,5 horas. Por sobreposição de funções 5 tais bibliotecas poderiam ser construídas em 9 meses com 1 FTE. A afinidade de maturação exige a montagem de um novo conjunto de combinações de mutações, a partir de uma ansa mutante pré-selecionada ou membros de uma família de genes, que podem ser enriquecidos por um protocolo de seleção. O processo é repetido várias vezes até que o isolamento de um mutante com o fenótipo desejado seja alcançado. A desvantagem da abordagem enzimática atual, arranjo combinatorial de ADN, para realizar este processo é de viés que pode ser introduzido devido a locais específicos dentro do gene que são pontos quentes para nucleases, o domínio de mutantes específicos na ansa reagrupada final e perda de alguns dos originais mutantes na ansa final. De modo a ultrapassar este inconveniente, uma tecnologia de construção de um gene (BAG) será utilizada para gerar uma biblioteca altamente complexa de mutantes de Fc contendo as alterações de aminoácidos aleatórias em todos os locais potenciais que podem ser importantes para a ligação de recetor(es). Conjuntos de oligonucleotídeos degenerados que abrangem regiões específicas de Fc de IgG serão utilizados (Ver Fig. 28).

Os oligos serão ~30 nt e oligos degenerados e sintetizados para alterar um (4 oligos) ou dois AAs (8 oligos) serão construídos. Os oligos são projetados para serem sobrepostos, sem lacunas. Levará aproximadamente -200 oligos para acomodar todas as alterações individuais AA e -2000 para mudar dois AAs por oligonucleotídeo. Todos os oligos 2000+ oligos serão utilizados individualmente e em combinações para gerar matrizes de mutantes de Fc utilizando o protocolo descrito acima (A.20). Usaremos um programa de aleatorização doméstico e um manipulador de líquidos robótico para reunir combinações selecionadas de oligos mutantes e de tipo selvagem. As grandes bibliotecas serão clonadas em vetores que permitem a o rastreio usando a exibição de superfície de levedura. Esta abordagem utiliza uma esfera magnética de seleção seguida por citometria de fluxo e foi aplicada com sucesso a bibliotecas com uma complexidade > 109 (Feldhaus et al, 2003, Nat Biotech 21(2): 163-170). Isto limita o número de locais a testar em qualquer ansa para 7, resultando em -1,3 x 109 possíveis mutações/ansas.

Para garantir a qualidade da biblioteca, os fragmentos amplificados de PCR serão analisados por eletroforese para determinar o comprimento final dos produtos de PCR. A reação será caracterizada como bem sucedida, se > 99% dos produtos de PCR forem do comprimento esperado. Uma fração da biblioteca de mutantes será sequenciada para determinar a taxa de incorporação do codão mutante. O número de fragmentos sequenciados será com base no número de locais alvo mutados e a validação da biblioteca será determinada pela taxa observada de mutações em sítios alvo (Tabela 10). A taxa de vetores sem inserções deve ser inferior a 2%. A taxa de mutação em locais não alvo deve ser inferior a 8%. A capacidade de gerar o desejado nível de eficiência de mutagénese por esta abordagem será determinada por sequenciação de um subconjunto de clones. A alternativa à BAG estará a usar um protocolo de "arranjo combinatorial de ADN". Isso requer reunir todos os mutantes, individuais, duplos, triplos, etc. A seguir à preparação de ADN, regiões de Fc serão amplificadas por PCR usando iniciadores flanqueadores que amplificam seletivamente a região mutada do Fc, -700 bp. Novos mutantes são construídos por rearranjo de mutações no Fc por meio do tratamento com DNAsel do ADN amplificado e isolamento de fragmentos de 150-200 bp (ver, por exemplo, Stemmer et al. , 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91: 10747-51) . Os fragmentos serão religados, amplificados por PCR com iniciadores aninhados e clonados no vetor de exibição de superfície de levedura, pYDl. A biblioteca recombinada será selecionada novamente no rastreio de exibição de levedura do Fc como aqui descrito e exemplificado.

As bibliotecas BAG utilizarão na maior parte o mesmo equipamento que a biblioteca combinatória. No entanto a clonagem será num vetor adequado para a exibição de superfície de levedura e não vai exigir a seleção de clones individuais, como a exibição de superfície de levedura inicialmente utilizada para o enriquecimento de bibliotecas grandes. Após um nível adequado de enriquecimento, clones individuais serão assim selecionados.

Uma biblioteca inicial de moléculas que compreendem regiões de Fc variantes é produzida utilizando quaisquer técnicas de mutagénese aleatória conhecida na arte. Será apreciado por um perito na arte que as variantes da sequência de aminoácidos das regiões de Fc variantes podem ser obtidas por qualquer técnica de mutagénese conhecida dos peritos na arte. Algumas dessas técnicas são brevemente aqui descritas, no entanto, será reconhecido que os processos alternativos podem produzir um resultado equivalente. Em formas de realização preferidas, as moléculas da invenção, que compreendem regiões de Fc variantes são preparadas por PCR propensa a erros, tal como exemplificado no Exemplo 6, infra (Ver Leung et al., 1989, Technique, 1:11) . É especialmente preferido taxas de erro de 2-3 pb/Kb para utilização nos métodos da invenção. Numa forma de realização, com a utilização de uma PCR propensa a erro obteve-se uma frequência de mutação de 2-3 mutações/Kb. A mutagénese pode ser efetuada em conformidade com qualquer uma das técnicas conhecidas na arte, incluindo, mas não se limitando a, síntese de um oligonucleotídeo possuindo uma ou mais modificações na sequência da região de Fc de um anticorpo ou um polipeptídeo compreendendo uma região de Fc (por exemplo, o domínio CH2 ou CH3) a ser modificada. A mutagénese específica do local permite a produção de mutantes através da utilização de sequências oligonucleotídicas específicas que codificam a sequência de ADN da mutação desejada, bem como um número suficiente de nucleotídeos adjacentes, para proporcionar uma sequência iniciadora de tamanho e complexidade de sequência suficientes para formar um dúplex estável em ambos os lados da junção da deleção a atravessar. Tipicamente, um iniciador de cerca de 30 a cerca de 45 nucleotídeos ou mais de comprimento é preferido, com cerca de 10 a cerca de 25 ou mais resíduos em ambos os lados da junção da sequência a ser alterada. Um número de tais iniciadores que introduzem uma variedade de diferentes mutações numa ou mais posições pode ser usado para gerar uma biblioteca de mutantes. A técnica de mutagénese específica do local é bem conhecida na arte, como exemplificado por várias publicações (ver, por exemplo, Kunkel et al, Methods Enzymol., 154: 367-82, 1987). Em geral, a mutagénese dirigida ao local é realizada obtendo primeiro um vetor de cadeia simples ou em fusão, com exceção de duas cadeias de um vetor de cadeia dupla que inclui na sua sequência uma sequência de ADN que codifica o péptido desejado. Um iniciador oligonucleotídico possuindo a sequência mutada desejada é preparado, geralmente sinteticamente. Este iniciador é então emparelhado com o vetor de cadeia simples, e submetido a enzimas de polimerização de ADN tal como polimerase de ADN de T7, de modo a completar a síntese da cadeia que possui a mutação. Assim, se um heteroduplex em que uma cadeia codifica a sequência não mutada original e a segunda cadeia possui a mutação desejada. Este vetor heteroduplex é então utilizado para transformar ou transfectar células apropriadas, tais como células de E. coli, e são selecionados os clones que incluem vetores recombinantes portadores do arranjo da sequência mutada. Como será apreciado, a técnica tipicamente emprega um vetor de fago que existe tanto na cadeia simples como na forma de cadeia dupla. Os vetores típicos úteis em mutagénese dirigida ao local incluem vetores tais como o fago M13. Estes fagos estão disponíveis comercialmente e a sua utilização é geralmente bem conhecida dos peritos na arte. Plasmídeos de cadeia dupla também são rotineiramente empregues na mutagénese dirigida ao local o que elimina o passo de transferência do gene de interesse de um plasmídeo para um fago.

Em alternativa, a utilização de PCR™ com enzimas termostáveis disponíveis comercialmente tal como a Taq DNA polimerase pode ser utilizada para incorporar um iniciador oligonucleotideo mutagénico no fragmento de ADN amplificado que pode ser depois clonado num vetor de clonagem ou de expressão adequado. Ver, por exemplo, Tomic et al., Nucleic Acids Res., 18(6):1656, 1987, e Upender et al., Biotechniques, 18(1):29-30, 32, 1995, para procedimentos de mutegénese mediada por PCR™. A PCR™ que emprega uma ligase termostável em adição a uma polimerase termoestável pode também ser utilizada para incorporar um oligonucleotideo mutagénico fosforilado num fragmento de ADN amplificado que pode ser depois clonado num vetor apropriado de clonagem ou de expressão (ver, por exemplo, Michael, Biotechniques, 16 (3) : 410-2, 1994) .

Outro método para preparar variantes para utilização na invenção, é a mutagénese por cassete baseada na técnica descrita por Wells et al. (1985, Gene, 34: 315). O material de partida é o plasmídeo que compreende o ADN desejado que codifica a proteína a ser mutada (por exemplo, o ADN que codifica um polipeptídeo compreendendo uma região de Fc). O codão(ões) na sequência de ADN a mutar são identificados; deve existir um local de endonuclease de restrição único de cada lado do local (ais) de mutação identificado(s) . Se não existir tal local de restrição, este pode ser gerado por mutagénese dirigida a oligonucleotídeos. Após os locais de restrição terem sido introduzidos no plasmídeo, o plasmídeo é cortado nestes locais e linearizado. Um oligonucleotideo de cadeia dupla que codifica a sequência do ADN entre os locais de restrição mas que contém a mutação é sintetizado utilizando procedimentos padrão conhecidos para os peritos na arte. 0 oligonucleotídeo de cadeia dupla é referido como cassete. Esta cassete é desenhada para ter extremidades 3' e 5' que sejam compatíveis com as extremidades do plasmídeo linearizado, de modo a que possa ser diretamente ligada ao plasmídeo.

Outros métodos conhecidos dos peritos na arte para a produção de variantes de sequência da região de Fc de um anticorpo ou polipeptídeos que compreendem uma região de Fc podem ser utilizados. Por exemplo, vetores recombinantes que codificam a sequência de aminoácidos do domínio constante de um anticorpo ou um seu fragmento podem ser tratados com agentes mutagénicos, tais como hidroxilamina, para obter variantes da sequência.

Uma vez que a biblioteca mutante é produzida de acordo com os métodos descritos, a biblioteca mutagenizada é transformada numa estirpe de levedura, de preferência EBY100 (Invitrogen), MATa ura3-52 trpl leu2Al his3A200 pep4::HIS3 prblAl.6R canl GAL::GAL-AGA1 utilizando um protocolo convencional de transformação de acetato de lítio padrão conhecidos dos peritos na arte (ref).

Será apreciado por um perito na arte que, uma vez que as moléculas da invenção com propriedades de ligação desejadas (por exemplo, moléculas com regiões de Fc variantes com pelo menos uma modificação de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA em relação a uma molécula comparável, que compreende uma região de Fc de tipo selvagem) tenham sido identificadas (Ver Secção 5.1 e Tabela 2) de acordo com os métodos da invenção, outras moléculas (isto é, anticorpos terapêuticos) podem ser manipuladas utilizando técnicas padrão de ADN recombinante e quaisquer técnicas de mutagénese conhecidas, tal como descritas nesta secção para produzir moléculas manipuladas que transportam os locais de mutação identificados.

5.2.4 EXIBIÇÃO DE SUPERFÍCIE DE LEVEDURA 0 método preferido para o rastreio e identificação de moléculas que compreende regiões de Fc variantes com afinidades FcyR alteradas (por exemplo, afinidade melhorada para com FcyRIIIA) é a tecnologia de exposição de superfície de levedura (para revisão ver Boder e Wittrup, 2000, Methods in Enzymology, 328: 430-444) que aborda a deficiência no estado da técnica no rastreio de interações de ligação de proteínas extracelulares modificadas pós-translacionalmente. Especificamente, a exposição de superfície de levedura é um método genético através do qual os polipeptídeos compreendendo mutantes de Fc são expressos na parede da célula de levedura numa forma acessível para interagir com FcyR. A exposição de superfície de levedura do mutante de Fc contendo polipeptídeos da invenção pode ser realizada de acordo com qualquer das técnicas conhecidas dos peritos na técnica. Ver Patentes nos EUA n° 6, 423,538; 6,114,147; e 6,300,065. Ver Boder et al. , 1997 Nat. Biotechnol., 15:553-7; Boder et al. , 1998 Biotechnol. Prog., 14:55-62; Boder et al., 2000 Methods Enzymol., 328:430-44; Boder et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 2000, 97:10701-5; Shusta et al., 1998 Nat. Biotechnol., 1998, 16:773-7; Shusta et al., 1999 J Mol. Biol., 292:949-56; Shusta et al., 1999 Curr. Opin. Biotechnol., 10:117-22; Shusta et al., 2000 Nat. Biotechnol., 18:754-9; Wittrup et al., 1994 Ann. N.Y. Acad.

Sci., 745:321-30; Wittrup et al., 1994 Cytometry, 16:206-13; Wittrup, 1995 Curr. Opin. Biotechnol., 6:203-8; Wittrup, 1999 Trends Biotechnol., 17:423-4; Wittrup, 2000 Nat. Biotechnol., 18:1039-40; Wittrup, 2001 Curr. Opin. Biotechnol., 12:395-9. A exibição de superfície de levedura será usada para enriquecer bibliotecas contendo > 107 clones independentes. Esta abordagem irá fornecer a capacidade de enriquecer grandes bibliotecas > 20 vezes na única espécie. Bibliotecas de mutantes de Fc com > 10.000 mutantes independentes (4 ou mais locais) serão clonadas nos vetores apropriados para exibição de superfície de levedura e enriquecidas por seleção por FACS até <8000 mutantes serem capazes de ser testados por outros ensaios bioquímicos e funcionais, tal como descrito abaixo. A invenção proporciona métodos para a construção de uma biblioteca de mutantes de Fc em levedura para a exibição de moléculas que compreendem regiões de Fc, que foram mutadas como se descreveu na Secção 5.2.2. De preferência, as bibliotecas de mutantes de Fc para utilização nos métodos da invenção contêm, pelo menos, 107 células, até 109 células. Um método exemplificativo para a construção de uma biblioteca de Fc para utilização nos métodos da invenção compreende o seguinte: os ácidos nucleicos que codificam as moléculas que compreendem regiões de Fc são clonados no local de clonagem múltipla de um vetor derivado de um vetor de replicação de levedura, por exemplo, pCT302; de tal modo que os ácidos nucleicos que codificam o Fc são expressos sob o controlo do promotor indutível por galactose GAL1 e estrutura interna com uma sequência de nucleotídeos que codifica Aga2p, a aglutinina de acasalamento na proteína da parede celular. Numa forma de realização preferida, os ácidos nucleicos que codificam moléculas compreendendo regiões de Fc são clonados no C-terminal para a região codificadora de Aga2p, de tal forma que uma região de Fc da proteína de fusão Aga2p é codificada. Uma proteína de fusão compreendendo a proteína Aga2p e polipeptídeos compreendendo regiões de Fc será secretada extracelularmente e exibida na parede celular através de ligação dissulfureto à proteína Agalp, uma proteína integrante da parede celular, utilizando a construção preferida da invenção. Numa forma de realização alternativa, as construções podem ainda compreender sequências nucleotídicas que codificam marcadores de epitopo. Qualquer sequência de codificação de nucleotideos do marcador de epitopo conhecida dos peritos na arte pode ser utilizada de acordo com a invenção, incluindo, mas não limitado a sequências de nucleotideos que codificam a hemaglutinina (HA), c-myc Xpress TAG, His-TAG, ou V5TAG. A presença da proteína de fusão sobre a superfície da célula de levedura pode ser detectada utilizando a análise por FACS, microscopia confocal de fluorescência ou métodos padrão de imunocoloração, todos os quais são conhecidos dos peritos na arte. Numa forma de realização, a presença das proteínas de fusão Fc da invenção sobre a superfície da célula de levedura é detectada utilizando anticorpos monoclonais específicos de Fc (específicos de CH3), incluindo mas não se limitando a anticorpo monoclonal especifico de Fc de IgGl, HP6017 (Sigma), JL512 (Immunotech), e qualquer anticorpo divulgado em Partridge et al, 1986, Molecular Immunology, 23 (12) : 1365-72. Numa outra forma de realização, a presença das proteínas de fusão Fc da invenção é detetada por marcação imunofluorescente de marcadores de epitopo, utilizando técnicas conhecidas dos peritos na arte. É particularmente útil nos métodos da invenção utilizar as sequências de nucleotideos que codificam marcadores de epitopo para flanquear os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão de Fc, como um controlo interno, para detetar se as proteínas de fusão são apresentadas na parede celular de uma forma parcialmente proteolizada.

5.2.5 RASTREIO DE BIBLIOTECAS DE EXIBIÇÃO DE LEVEDURAS A invenção abrange o rastreio das bibliotecas de exibição de levedura utilizando ensaios de base imunológica incluindo mas não se limitando a ensaios à base de células, ensaios à base de solução, e ensaios à base de fase sólida.

Em algumas formas de realização, a invenção abrange a identificação de mutantes de Fc com afinidades alteradas para com FcyR usando maturação de afinidade, métodos que são conhecidos dos peritos na arte e aqui englobados. Resumidamente, a maturação da afinidade cria novos alelos ao recombinar aleatoriamente mutações individuais presentes numa biblioteca mutante, ver, por exemplo, Hawkins et al. , 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896; Stemmer et al. , 1994 Nature, 370: 389-91. Tem sido usada com sucesso para aumentar a afinidade de anticorpos, recetores de células T e de outras proteínas. A invenção abrange a utilização de mutações que mostram aumento da ligação FcyR como uma linha de base para a construção de novas bibliotecas de mutantes com fenótipos aprimorados. Com a utilização dos métodos da invenção, uma população de mutantes de Fc de IgGl enriquecidos por exibição de superfície de levedura para aumentar a ligação a um FcyR, por exemplo, FcyRIIIA, pode ser selecionada. Após preparação do ADN, as regiões de Fc podem ser amplificadas por PCR utilizando iniciadores de flanqueamento que amplificam seletivamente a região mutada do Fc, que é de cerca de -700 pb utilizando métodos conhecidos de um perito na arte e exemplificados ou aqui descritos. Novos mutantes podem então ser calculados por rearranjo de mutações na região de Fc, por exemplo, através de tratamento com DNAsel do ADN amplificado e isolamento de fragmentos, utilizando métodos tais como aqueles divulgados por Stemmer et ai., 1994 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91: 10747-51. Os fragmentos podem então ser re-ligados, amplificado por PCR com iniciadores aninhados e clonados no vetor de exibição de levedura, por exemplo, pYDl utilizando métodos conhecidos de um perito na arte. A biblioteca recombinada pode então ser selecionada novamente na tela de exibição de levedura do Fc. À medida que o Kd diminui, abaixo de 10 nM, condições podem ser estabelecidas para permitir novos aumentos na afinidade, com base na redução da taxa de dissociação do ligante FcyRIIIA do recetor de Fc utilizando métodos conhecidos na arte tais como aqueles divulgados em Boder et al., 1998, Biotechnol. Prog. 14: 55-62. A invenção abrange um rastreio cinético da biblioteca de levedura. Um rastreio cinético pode ser estabelecido por meio de etiquetagem das células que exibem o Fc até à saturação com um ligante marcado, por exemplo, um ligante fluorescente seguido por incubação com um excesso de ligante não marcado, durante um período predeterminado. Após terminação da reação pela adição de tampão em excesso (por exemplo, PBS IX, 0,5 mg/mL de BSA) , as células serão analisadas por FACS e gate de classificaçãos são definidos para seleção. Após cada ronda de enriquecimento, mutantes individuais podem ser testados para aumentos na afinidade de dobragem e sequenciados para diversidade. O processo de recombinação in vitro pode ser repetido. Em algumas formas de realização, in vitro é repetido pelo menos três vezes. A seleção das variantes de Fc da invenção pode ser feita usando qualquer FcyR incluindo mas não limitado às variantes polimórficas de FcyR. Em algumas formas de realização, a seleção de variantes de Fc é feita usando uma variante polimórfica do FcyRIIIA que contém uma fenilalanina na posição 158. Noutras formas de realização, a seleção de variantes de Fc é feita usando uma variante polimórfica do FcyRIIIA que contém uma valina na posição 158. 0 FcyRIIIA 158V exibe uma afinidade mais elevada para a IgGl do que 158F e uma maior atividade de ADCC (ver, por exemplo, Koene et ai., 1997, Blood, 90:1109-14; Wu et ai., 1997, J. Clin, Invest. 100: 1059-1070); este resíduo de facto interage diretamente com a região flexível inferior de IgGl como recentemente mostrado por estudos de co-cristalização de IgGl-FcYRIIIA, ver, por exemplo, Sonderman et al. , 2000, Nature, 100: 1059-70. Estudos têm mostrado que, em alguns casos, os anticorpos terapêuticos têm uma eficácia melhorada em pacientes homozigóticos FcyRIIIA-158v. Por exemplo, o anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado Rituximab foi terapeuticamente mais eficaz em pacientes homozigóticos FcyRIIIA158V em comparação com os doentes homozigóticos FcyRIIIA 158F (Ver, por exemplo, Cartron et al. , 2002 Blood, 99(3) : 754-8) . Embora não se pretenda estar limitado por um mecanismo de acção particular, a seleção de variantes de Fc da invenção com FcyRIIIA 158F alotipo podem prever variantes que uma vez manipuladas em anticorpos terapêuticos serão clinicamente mais eficazes para pacientes homozigóticos FcyRIIIA 158F. A invenção abrange o rastreio de bibliotecas de leveduras com base na depleção de FcyRIIB e seleção de FcyRIIIA para que mutantes de Fc sejam selecionados que não só tenham uma afinidade melhorada para FcyRIIIIA mas também tenham uma afinidade reduzida para com FcyRIIB. As bibliotecas de levedura podem ser enriquecidas para clones que possuem uma afinidade reduzida para com FcyRIIB por métodos de depleção sequencial, por exemplo, através da incubação da biblioteca de levedura com esferas magnéticas revestidas com FcyRIIB. A depleção de FcyRIIB é preferencialmente realizada sequencialmente, de modo que a biblioteca é enriquecida em clones que têm uma afinidade reduzida para FcyRIIB. Em algumas formas de realização, os resultados da etapa de depleção de FcyRIIB de uma população de células, de modo que apenas 30%, de preferência, só 10%, mais de preferência, apenas 5%, mais preferivelmente menos de 1% se liga a FcyRIIB. Em algumas formas de realização, a depleção de FcyRIIB é levada a cabo em, pelo menos, 3 ciclos, pelo menos 4 ciclos, pelo menos 6 ciclos. O passo de depleção de FcyRIIB é de preferência combinado com um passo de seleção de FcyRIIIIA, por exemplo, utilizando classificação FACS de modo a que as variantes de Fc com uma afinidade melhorada para FcyRIIIIA sejam selecionadas.

5.2.5.1 ENSAIOS FACS; ENSAIOS DE FASE SÓLIDA E ENSAIOS DE BASE IMUNOLÓGICA A invenção abrange a caracterização das proteínas de fusão de Fc mutante que são exibidas na parede da célula da superfície de levedura, de acordo com os métodos descritos na Secção 5.2.3. Um aspeto da invenção proporciona um método para a seleção de proteínas de fusão mutantes de Fc com uma propriedade desejável de ligação, especificamente a capacidade do mutante de proteína de fusão de Fc se ligar a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que um polipeptídeo comparável compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem que se liga a FcyRIIIA. Numa forma de realização, a invenção proporciona um método para a seleção de proteínas de fusão de mutantes de Fc com uma propriedade de ligação desejável, especificamente, a capacidade da proteína de fusão do mutante de Fc se ligar a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que um polipeptídeo comparável compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, e ainda a capacidade da proteína de fusão do mutante de Fc se ligar FcyRIIB com uma afinidade mais baixa do que um polipeptídeo comparável compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIB. Será apreciado por um perito na arte, que os métodos da invenção podem ser utilizados para identificar e rastrear quaisquer mutações nas regiões de Fc de moléculas, com qualquer característica de ligação desejada.

As células de levedura que exibem as proteínas de fusão mutantes de Fc podem ser rastreadas e caracterizam-se por quaisquer ensaios com base bioquímica ou imunológica conhecidos dos peritos na arte para avaliar as interações de ligação.

De preferência, a fluorescência da célula ativada (FACS), utilizando qualquer uma das técnicas conhecidas para os peritos na arte, é utilizada para o rastreio das proteínas mutantes de fusão Fc apresentadas na superfície da célula de levedura para ligação a FcyRIIIA, de preferência o complexo FcyRIIIA tetramérico, ou opcionalmente FcyRIIB. Classificadores de fluxo encontram-se capazes de examinar rapidamente um grande número de células individuais que contêm inserções de biblioteca (por exemplo, 10-100 milhões de células por hora) (Shapiro et al., Practical Flow Cytometry, 1995). Além disso, os parâmetros específicos utilizados para a optimização incluindo, mas não se limitado à concentração do ligante (isto é, complexo tetramérico FcyRIIIA) , tempo de competição cinética, ou rigor FACS podem ser variados de modo a selecionar as células que exibem proteínas de fusão Fc com propriedades específicas de ligação, por exemplo, uma afinidade mais elevada para com FcyRIIIA em comparação com um polipeptídeo comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Citómetros de fluxo para classificação e análise de células biológicas são bem conhecidos na arte. Os citómetros de fluxo conhecidos são descritos, por exemplo, nas Patentes nos EUA n° 4,347,935; 5,464,581; 5,483,469; 5,602,039; 5,643,796; e 6,211,477. Outros citómetros de fluxo conhecidos são os do sistema FACS Vantage™ fabricado pela Becton Dickinson and Company, e o sistema de COPAS™ fabricado pela Union Biometrica.

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, as células de levedura são analisadas por células ativadas por fluorescência (FACS). Em formas de realização mais preferidas, a análise de FACS das células de levedura, é feita de um modo iterativo, pelo menos duas vezes, pelo menos, três vezes, ou, pelo menos, 5 vezes. Entre cada ronda de seleção, células são induzidas e novamente cultivadas de modo que as regiões de Fc são apresentadas no número máximo de superfícies de células de levedura. Embora não se pretenda estar limitado por um mecanismo de acção particular, este processo iterativo ajuda a enriquecer a população de células com um fenótipo particular, por exemplo, a ligação elevada a FcyRIIIA.

Em formas de realização preferidas, o rastreio de variantes de Fc da invenção compreende um processo de seleção que tem múltiplos ciclos de rastreio, por exemplo, pelo menos dois ciclos de rastreio. Numa forma de realização, o rastreio de variantes de Fc que possuem uma afinidade melhorada para com FcyRIIIA pode compreender os seguintes passos: no primeiro ciclo de rastreio, uma biblioteca de células de levedura, por exemplo, uma biblioteca simples de 107 células é enriquecida por FACS, de preferência de uma maneira interativa, utilizando, por exemplo FcyRIIIA tetramérico marcado para selecionar as variantes Fc que têm uma afinidade melhorada para FcyRIIIA; a região de Fc variante que é selecionada com o fenótipo desejado, por exemplo, aumento da ligação para FcyRIIIA, é então introduzida num anticorpo, por exemplo, um anticorpo 4-4-20, e o anticorpo manipulado é ensaiado utilizando um rastreio secundário, por exemplo, ELISA para a ligação a um FcyR. No segundo ciclo de rastreio, uma única biblioteca de mutação pode ser gerada com base no primeiro rastreio de modo que a região de Fc abriga a variante que apresenta a afinidade melhorada para FcyRIIIA; e enriquecida por FACS utilizando, por exemplo FcyRIIIA monomérico marcado tanto na presença como na ausência de recetor não marcado; e a região de Fc variante é então introduzida num anticorpo, por exemplo, um anticorpo 4-4-20, e o anticorpo manipulado é ensaiado utilizando um rastreio secundário, por exemplo, ELISA para ligação a um FcyR. Em algumas formas de realização, o rastreio secundário pode ainda compreender caracterizar os anticorpos que compreendem variantes de Fc ou ensaio à base de ADCC ou BIAcore utilizando métodos aqui divulgados. A invenção abrange o rastreio FACS da biblioteca de levedura mutante sob condições de equilíbrio ou cinéticas. Quando o rastreio é efetuado em condições de equilíbrio, um excesso da biblioteca de levedura transportando mutantes de Fc é incubado com FcyRIIIA, preferivelmente FcyRIIIA marcado a uma concentração de 5-10 vezes inferior ao Kd, durante pelo menos uma hora para permitir a ligação de mutantes de Fc a FcyRIIIA sob condições de equilíbrio. Quando o rastreio é efetuado sob condições cinéticas, a biblioteca de levedura mutante é incubado com FcyRIIIA marcado; as células são então incubadas com FcyRIIIA equimolar não marcado por um tempo pré-selecionado, ligadas a FcyRIIIA são então monitorizadas.

Um método exemplificativo para analisar as células de levedura que expressam as proteínas de fusão mutantes de Fc com FACS é conter as células com complexo FcyRIIIA-tetramérico que foi marcado com um marcador fluorescente, tal como, PE e um anticorpo anti-Fc, tal como F(ab)2 anti-Fc que foi marcado por fluorescência. As medições de fluorescência de uma biblioteca de levedura produzida de acordo com os métodos da invenção, de preferência envolvem a comparação com os controlos; por exemplo, células de levedura que não possuem as moléculas de codificação de inserção compreendendo uma região de Fc (controlo negativo). O separador de fluxo tem a capacidade não só de medir os sinais de fluorescência em células a uma taxa rápida, mas também de recolher as células que tenham indicado propriedades fluorescentes. Esta característica pode ser empregue numa forma de realização preferida da invenção, para enriquecer a população de biblioteca inicial para células que expressam proteínas de fusão Fc com caracteristicas de ligação específicas, por exemplo, uma afinidade mais elevada para FcyRIIIA em comparação com um polipeptideo comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Numa forma de realização preferida da invenção, as células de levedura são analisadas por FACS e gafe de classificaçãos estabelecidos para selecionar as células que apresentam a maior afinidade para FcyRIIIA em relação à quantidade de expressão Fc na superfície da célula de levedura. De acordo com uma forma de realização preferida, quatro tipos consecutivos são estabelecidos, em que os gates para cada tipo sucessivo são de 5,5%, 1%, 0,2% e 0,1%. É preferível que a biblioteca de exibição de levedura formada de acordo com os métodos da invenção seja sobre-amostrada ao longo de pelo menos 10 vezes para melhorar a probabilidade de se isolar clones raros (por exemplo, analisar ~108 células a partir de uma biblioteca de 107 clones). Em alternativa, 2-5 tipos são estabelecidos para selecionar as células do fenótipo desejado. Os gate de classificaçãos podem ser estabelecidos empiricamente por um perito na arte.

Noutras formas de realização preferidas, as proteínas de fusão de Fc mutante apresentadas na superfície da célula de levedura são rastreadas utilizando ensaios baseados em fase sólida, por exemplo, ensaios utilizando esferas magnéticas, por exemplo, fornecidas por Dynal, de preferência numa forma de alto rendimento para se ligar a um FcyR, por exemplo, FcyRIIIA. Numa forma de realização, os ensaios de esferas magnéticas podem ser utilizados para identificar os mutantes com maior afinidade para FcyRIIIA e/ou de afinidade reduzida para FcyRIIB. Um ensaio exemplificativo para identificar mutantes com melhor afinidade para FcyRIIIA e afinidade reduzida para FcyRIIB pode compreender a seleção de mutantes por uma depleção de fase sólida sequencial utilizando esferas magnéticas revestidas com FcyRIIB seguido de seleção com esferas magnéticas revestidas com FcyRIIIA. Por exemplo, um ensaio pode compreender os seguintes passos: a incubação da biblioteca de células de levedura gerada de acordo com os métodos da invenção com esferas magnéticas revestidas com FcyRIIB; separação das células de levedura ligadas a esferas a partir da fracção não ligada colocando a mistura num campo magnético, removendo as células de levedura não ligadas e colocando-as num meio novo; ligação das células de levedura a esferas revestidas com FcyRIIIA, separando as células de levedura ligadas a esferas a partir da fração não ligada colocando a mistura num campo magnético, removendo as células de levedura não ligadas; remoção das células ligadas em vórtice rigoroso; cultivo das células recuperadas em glucose contendo meio; reindução em meio seletivo contendo galactose. 0 processo de seleção é repetido pelo menos uma vez. Inserções contendo o domínio Fc são então amplificadas utilizando metodologias comuns conhecida na arte, por exemplo, PCR, e introduzidas num anticorpo por métodos já descritos para posterior caracterização.

Numa forma de realização alternativa, um sistema de base não-levedura é utilizado para caracterizar as propriedades de ligação das moléculas da presente invenção. Um sistema exemplificativo para caracterizar as moléculas da invenção compreende um vetor de expressão de mamífero contendo a cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-fluoresceína 4-4-20, em que os ácidos nucleicos que codificam as moléculas da presente invenção com as regiões de Fc variante são clonados. O clone recombinante resultante é expresso numa linha de célula hospedeira de mamífero (isto é, linha de células de rim humano 293H), e a imunoglobulina recombinante resultante é analisada uanto à ligação a FcyR utilizando qualquer ensaio padrão conhecido dos peritos na arte, incluindo mas não se limitando para ELISA e FACS.

As moléculas da presente invenção (por exemplo, anticorpos, proteínas de fusão, moléculas conjugadas) podem ser caracterizadas por uma variedade de maneiras. Em particular, as moléculas da invenção compreendendo regiões de Fc modificadas podem ser testadas quanto à sua capacidade para se ligarem imunoespecificamente a um ligante, por exemplo, complexo tetramérico FcyRIIIA. Tal ensaio pode ser efetuado em solução (e.g., Houghten, Bio/Techniques, 13:412-421, 1992), em esferas (Lam, Nature, 354:82-84, 1991, em chips (Fodor, Nature, 364:555-556, 1993), em bactérias (Patente nos EUA n° 5,223,409), em esporas (Patente nos EUA n° 5,571,698; 5,403,484; e 5, 223,409), em plasmídeos (Cull et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:1865-1869, 1992) ou em fagos (Scott and Smith, Science, 249:386-390, 1990; Devlin, Science, 249:404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378-6382, 1990; e Felici, J. Mol. Biol., 222:301-310, 1991). As moléculas que foram identificadas como se ligando imunoespecificamente a um ligante, por exemplo FcyRIIIA, podem então ser ensaiadas quanto à sua especificidade e afinidade para o ligante.

As moléculas da invenção que foram modificadas para incluir regiões de Fc modificadas (por exemplo, anticorpos terapêuticos) ou foram identificadas no sistema de exibição de levedura como tendo o fenótipo desejado (ver Secção 5.1) podem ser ensaiadas quanto à ligação imunoespecifica a um antigeno (por exemplo, antigeno do cancro e a reatividade cruzada com outros antígenos (por exemplo, FcyR) por qualquer método conhecido na arte. Os imunoensaios que podem ser utilizados para analisar a reatividade cruzada e ligação imunoespecífica incluem, mas não estão limitados a, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos utilizando técnicas tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), imunoensaios de "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação do complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para nomear apenas alguns. Tais ensaios, rotina e são bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Ausubel et al. , eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque) . A afinidade de ligação das moléculas da presente invenção que compreende regiões de Fc modificadas para um ligante, por exemplo, complexo tetramérico FcyR e a taxa de dissociação da interação pode ser determinada por ensaios de ligação competitivos. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de um ligante marcado, tal como FcyR tetramérico (por exemplo, 3H ou 125I) com uma molécula de interesse (por exemplo, as moléculas da presente invenção compreendendo regiões de Fc modificadas) no presença de quantidades crescentes de ligante não marcado, tal como FcyR tetramérico, e a deteção da molécula ligada ao ligante marcado. A afinidade da molécula da presente invenção para o ligante e as taxas de dissociação de ligação podem ser determinadas a partir dos dados de saturação por análise de Scatchard.

Numa forma de realização preferida, a análise cinética BIAcore é usada para determinar a taxa de associação e dissociação de ligação de moléculas da presente invenção a um ligante tal como FcyR. Análise cinética BIAcore consiste em analisar a ligação e dissociação de um ligante a partir de chips com moléculas imobilizadas (por exemplo, moléculas compreendendo regiões de Fc modificadas) na sua superfície. 5.2.6 Sequenciação de mutantes

Qualquer uma de uma variedade de reações de sequenciação conhecidas na arte pode ser utilizada para sequenciar diretamente as moléculas da invenção que compreendem regiões de Fc variantes. Exemplos de reações de sequenciação incluem as que se baseiam em técnicas desenvolvidas por Maxim e Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74:560, 1977) ou Sanger (Proc. Natl. Acad Sei. USA, 74:5463, 1977). Também está contemplado que qualquer um de uma variedade de procedimentos de sequenciação automática pode ser utilizado (Bio/Techniques, 19: 448, 1995), incluindo a sequenciação por espetrometria de massa (ver, por exemplo, Publicação PCT n° WO 94/16101, Cohen et al, Adv. Chromatogr., 36:127-162, 1996, e Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 38:147-159, 1993).

5.2.7 ENSAIOS FUNCIONAIS DE MOLÉCULAS COM Regiões de Fc VARIANTES A invenção abrange a caracterização das moléculas da presente invenção (por exemplo, um anticorpo que compreende uma região de Fc variante identificada pela tecnologia de exibição de levedura descrita supra; ou anticorpos monoclonais terapêuticos manipulados de acordo com os métodos da invenção) utilizando ensaios conhecidos pelos peritos na arte para a identificação da função celular efetora das moléculas. Em particular, a invenção engloba a caracterização de moléculas da presente invenção para a função celular efetora mediada por FcyR. Exemplos de funções efetoras de células que podem ser ensaiadas de acordo com a invenção, incluem, mas não estão limitadas a, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos, fagocitose, opsonização, opsonofagocitose, ligação a Clq, e citotoxicidade mediada por células dependentes de complemento. Qualquer ensaio à base de células ou livre de células conhecido pelos peritos na arte para determinar a atividade da função celular efetora pode ser utilizado (para ensaios com células efetoras, ver Perussia et al. , 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44(10) : 841-8; Lehmann et al., 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2) : 229-42; Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al., 1990 J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al. , 1998, Immunity 8:403-411) .

Numa forma de realização, as moléculas da invenção podem ser ensaiados quanto a fagocitose mediada por FcyR em monócitos humanos. Alternativamente, a fagocitose mediada por FcyR das moléculas da invenção pode ser ensaiada em outros fagócitos, por exemplo, neutrófilos (leucócitos polimorfonucleares; PMN); monócitos do sangue periférico humano, macrófagos derivados de monócitos, os quais podem ser obtidos usando procedimentos padrão conhecidos dos peritos na arte (ver, por exemplo, Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-164) . Numa forma de realização, a função das moléculas da presente invenção é caracterizada pela medição da capacidade de células THP-1 para fagocitar células vermelhas do sangue de ovelhas com fluoresceina IgG-opsonizadas (SRBC) por processos previamente descritos (Tridandapani et al.r 2000, J. Biol. Chem. 275: 20480-7). Por exemplo, um ensaio exemplificativo para medir a fagocitose das moléculas da invenção que compreendem regiões de Fc variantes com afinidades melhoradas para FcyRIIIA, compreende: o tratamento de células THP-1 com uma molécula da invenção, ou com um anticorpo de controlo que não se liga a FcyRIIIA, comparando os níveis de atividade das referidas células, em que a diferença nas atividades das células (por exemplo, atividade de formação de rosetas (o número de células THP-1 que se ligam a SRBC revestido com IgG), a atividade de adesão (o número total de SRBC ligado a células THP-1), e taxa de fagocitose) iria indicar a funcionalidade da molécula da invenção. Pode ser apreciado por um perito na arte que este ensaio exemplificativo pode ser utilizado para avaliar qualquer das moléculas identificadas pelos métodos da invenção.

Um outro exemplo de ensaio para determinar a fagocitose das moléculas da invenção é um ensaio de opsonofagocitose dependente de anticorpo (ADCP), que pode compreender o seguinte: um revestimento de uma biopartícula alvo, tal como FITC marcado com Escherichia coli (Molecular Probes) ou Staphylococcus aureus-FITC com (i) anticorpo 4-4-20 do tipo selvagem, um anticorpo para fluoresceina (Ver Bedzyk et al, 1989, J. Biol. Chem, 264(3): 1565-1569), como o anticorpo de controlo para ADCP dependente de FcyR; ou (ii) anticorpo 4-4-20 portador da mutação D265A que bate a ligação a FcyRIII, como um controlo de fundo para ADCP dependente de FcyR (iii) anticorpo 4-4-20 portador de regiões de Fc variantes identificado pelos métodos da invenção e produzido como exemplificado no Exemplo 6.6; e formação da partícula opsonizado; a adição de qualquer das partículas opsonizadas descritas (i-iii) a células THP-1 efetoras (uma linha celular monocitica, disponível a partir de ATCC) numa relação 60: 1 para permitir a ocorrência de fagocitose mediada por FcyR; de preferência, incubar as células de E. coli-FITC/anticorpo a 37 °C durante 1,5 horas; adição de azul de tripano após incubação (de preferência à temperatura ambiente durante 2-3 min) para as células para extinguir a fluorescência das bactérias que são aderidas ao lado de fora da superfície da célula, sem ser internalizada; transferência das células para um tampão de FACS (por exemplo, 0,1%, BSA em PBS, 0,1%, azida de sódio), a análise da fluorescência das células THPl usando FACS (por exemplo, BD FACS Calibur) . De preferência, as células THP-1, utilizadas no ensaio são analisadas por FACS para a expressão de FcyR na superfície da célula. As células THP-1 expressam tanto CD32A como CD64. CD64 é um FcyR de alta afinidade que está bloqueado para a realização do ensaio ADCP em conformidade com os métodos da invenção. As células THP-1 são de preferência bloqueadas com 100 pg/mL de IgGl solúvel ou 10% de soro humano. Para analisar o grau de ADCP, o gate é de preferência ajustado em células THP-1 e intensidade média de fluorescência é medida. A atividade ADCP para mutantes individuais é calculada e relatada como um valor normalizado para o tipo selvagem chMab 4-4-20 obtido. As partículas opsonizadas são adicionadas a células THP-1 de tal modo que a razão entre as partículas opsonizadas para células THP-1 é de 30: 1 ou 60: 1. Em formas de realização mais preferidas, o ensaio ADCP é realizado com controlos, tais como E. coli-FITC em meio, E. coli-FITC e as células THP-1 (para servir como atividade ADCP independente de FcyR), E. coli- FITC, células THP-1 e anticorpo 4-4-20 de tipo selvagem (para servir como atividade ADCP dependente de FcyR), E. coli-FITC, células THP-1, 4-4-20 D265A (para servir como o controlo de fundo para a atividade ADCP dependente de FcyR).

Numa outra forma de realização, as moléculas da invenção podem ser testadas em termos da atividade de ADCC mediada por FcyR em células efetoras, por exemplo, células assassinas naturais, usando qualquer um dos métodos convencionais conhecidos dos peritos na arte (Ver, por exemplo, Perussia et al, 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92). Um ensaio exemplificativo para a determinação da atividade ADCC das moléculas da presente invenção baseia-se num ensaio de libertação de 51Cr que compreende: células alvo marcadas com [51Cr ] Na2Cr04 (esta molécula permeável de membrana celular é comummente utilizada na marcação, uma vez que se liga a proteínas citoplasmáticas e embora espontaneamente libertada das células com cinética lenta, ela é libertada maciçamente após necrose das células-alvo); opsonização das células-alvo com as moléculas da presente invenção que compreendem regiões de Fc variantes; combinação das células alvo opsonizadas radiomarcadas com células efetoras numa placa de microtitulação a uma razão apropriada de células alvo para células efetoras; incubação da mistura de células durante 16-18 horas a 37 °C; recolha de sobrenadantes; e análise de radioatividade. A citotoxicidade das moléculas da presente invenção pode, então, ser determinada, por exemplo, utilizando a seguinte fórmula: % de lise = (cpm experimental - cpm de vazamento alvo) / (cpm de lise com detergente - cpm de vazamento alvo) x 100%. Alternativamente,% de lise = (ADCC-AICC)/(libertação máxima - libertação espontânea) . A lise específica pode ser calculada usando a fórmula: lise específica =% de lise com as moléculas da invenção -% de lise na ausência das moléculas da invenção. Um gráfico pode ser gerado pela variação tanto da razão alvo:célula efetora ou concentração de anticorpos.

Ainda noutra forma de realização, as moléculas da invenção são caracterizadas por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ver, por exemplo, Ding et al, Immunity, 1998, 8:403-11.

De preferência, as células efetoras utilizadas nos ensaios de ADCC da invenção são células mononucleares do sangue periférico (PBMC), que são de preferência purificadas a partir de sangue humano normal, recorrendo a métodos convencionais conhecidos de um perito na arte, por exemplo, utilizando centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Paque. As células efetoras preferidas para utilização nos métodos da invenção expressam diferentes recetores de ativação de FcyR. A invenção engloba, células efetoras, THP-1, que expressam FcyRI, FcyRIIA e FcyRIIB, derivados macrófagos primários derivados de monócitos do sangue humano inteiro e que expressam tanto FcyRIIIA como FcyRIIB, para determinar se os mutantes de anticorpo Fc mostram um aumento da atividade de ADCC e fagocitose em relação aos anticorpos IgGl do tipo selvagem.

A linha celular de monócitos humanos, THP-1, ativa a fagocitose por meio da expressão do recetor de alta afinidade FcyRI e o recetor de baixa afinidade FcyRIIA (Fleit et al. , 1991, J. Leuk. Biol. 49: 556) . As células THP-1 não expressam constitutivamente FcyRIIA ou FcyRIIB. A estimulação dessas células com citocinas efetua o padrão de expressão de FcR (Pricop et al, 2000 J. Immunol. 166: 531-7) . O crescimento de células THP-1 na presença de IL4 a citocina induz a expressão de FcyRIIB e provoca uma redução na expressão de FcyRIIA e FcyRI. A expressão de FcyRIIB também pode ser aumentada por aumento da densidade celular (Tridandapani et al, 2002, J. Biol Chem. 277: 5082-9) . Em contraste, tem sido relatado que IFNy pode conduzir a expressão de FcyRIIIA (Pearse et al, 1993, PNAS EUA 90: 4314-8). A presença ou ausência dos recetores na superfície das células pode ser determinada por FACS utilizando métodos comuns conhecidos de um perito na arte. A expressão induzida por citoquina de FcyR na superfície celular proporciona um sistema para testar a inibição e activação na presença de FcyRIIB. Se as células THP-1 não forem capazes de expressar o FcyRIIB, a invenção também abrange uma outra linha celular de monócitos humanos, U937. Estas células têm demonstrado diferenciar terminalmente em macrófagos na presença de IFNy e TNF (Koren et al, 1979, Nature 279: 328-331). A morte de células tumorais dependente de FcyR é mediada por células NK e macrófagos em modelos de tumor de ratinho (Clynes et al., 1998, PNAS EUA 95: 652-656) . A invenção abrange a utilização de monócitos elutriados a partir de dadores, tal como células efetoras para analisar a eficiência de mutantes de Fc para desencadear a citotoxicidade celular de células alvo, tanto em ensaios de fagocitose como de ADCC. Padrões de expressão de FcyRI, FcyRIIIA e FcyRIIB são afetados por diferentes condições de crescimento. A expressão de FcyR a partir de monócitos elutriados, congelados monócitos elutriados frescos, monócitos mantidos em 10% de FBS, e monócitos cultivados em FBS + GM-CSF e ou no soro humano pode ser determinada utilizando métodos comuns conhecidos dos peritos na arte. Por exemplo, as células podem ser coradas com anticorpos específicos de FcyR e analisadas por FACS para determinar perfis de FcR. As condições que melhor imitam os macrófagos in vivo da expressão FcyR são então utilizadas para os métodos da invenção.

Em algumas formas de realização, a invenção engloba a utilização de células de ratinho, especialmente quando as células humanas com os perfis FcyR corretos são incapazes de ser obtidas. Em algumas formas de realização, a invenção abrange a linha celular RAW264.7 de macrófagos de ratinho (ATCC), que pode ser transfectada com FcyRIIIA humano e os transfectantes estáveis isolados utilizando métodos conhecidos na arte, ver, por exemplo, Ralph et ai., J. Immunol. 119: 950-4) . Os transfectantes podem ser quantificados para a expressão de FcyRIIIA por análise FACS utilizando experimentação de rotina e altos expressores podem ser utilizados nos ensaios de ADCC da invenção. Em outras formas de realização, a invenção abrange o isolamento de macrófagos peritoneais de baço expressando FcyR humano de ratinhos knockout transgénicos tais como os aqui divulgados.

Os linfócitos podem ser colhidos a partir de sangue periférico de dadores (PBM) utilizando um gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia). Dentro da população de células mononucleares isoladas a maioria da atividade de ADCC ocorre através das células assassinas naturais (NK), contendo FcyRIIIA mas não FcyRIIB na sua superfície. Os resultados obtidos com estas células indicam a eficácia dos mutantes no desencadeamento de ADCC de células NK e estabelecem os reagentes a testar com monócitos elutriados.

As células alvo utilizadas nos ensaios de ADCC da invenção incluem, mas não estão limitadas a, linhas celulares de cancro de mama, por exemplo, SK-BR-3 com o número de acesso ATCC HTB-30 (ver, por exemplo, Tremp et al. , 1976, Cancer Res. 33-41); linfócitos B; células derivadas de linfoma de Burkitts, por exemplo, células Raji com o número de acesso ATCC CCL-86 (ver, por exemplo, Epstein et al, 1965, J. Natl Cancer Inst. 34: 231-240), e células de Daudi com o número de acesso ATCC CCL-213 (ver, por exemplo, Klein et al, 1968, Cancer Res. 28: 1300-10) . As células-alvo devem ser reconhecidas pelo local de ligação ao antígeno da imunoglobulina a ser ensaiada. O ensaio de ADCC é baseado na capacidade de células NK mediarem a morte celular por meio de uma via apoptótica. As células NK medeiam a morte celular, em parte, no reconhecimento de FcyRIIIA de IgG ligada a um antígeno na superfície de uma célula. Os ensaios de ADCC utilizados em conformidade com os métodos da invenção podem ser ensaios de base radioativa ou ensaios de base em fluorescência. O ensaio ADCC utilizado para caracterizar as moléculas da presente invenção compreendendo regiões de Fc variantes compreende a marcação de células alvo, por exemplo, SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji, células Daudi, células alvo opsonizantes com um anticorpo que reconhece um recetor de superfície celular na célula alvo, através do seu local de ligação ao antígeno; a combinação das células alvo opsonizadas marcadas e as células efetoras numa proporção apropriada, que pode ser determinada por experimentação de rotina; colheita das células; deteção da etiqueta no sobrenadante das células alvo lisadas, usando um esquema de deteção adequado, com base na marcação utilizada. As células alvo podem ser marcadas, quer com um marcador radioativo ou um marcador fluorescente, utilizando métodos correntes conhecidos na arte. Por exemplo, os marcadores incluem, mas não estão limitados a [51Cr] Na2CrC>4; e o éster de acetoximetilo do ligante de aumento da fluorescência, 2,2' : 6' ,2"-terpiridina-6-6"dicarboxilato (TDA).

Numa forma de realização preferida especifica, um ensaio fluorimétrico resolvido no tempo é usado para medir a atividade de ADCC contra células alvo que foram marcadas com o éster de acetoximetilo de ligante que aumenta a fluorescência, 2,2': 6' ,2"-terpiridina-6-6"-dicarboxilato (TDA) . Tais ensaios fluorimétricos são conhecidos na arte, por exemplo, ver, Blomberg et al, 1996, Journal of Immunological Methods, 193: 199-206. Resumidamente, as células alvo são marcadas com membrana permeável de diéster acetoximetilo de TDA (bis(acetoximetil)2,2' :6',2"-terpiridina-6-6"-dicarboxilato, (BATDA), que se difunde rapidamente através da membrana celular de células viáveis. Esterases intracelulares cisam os grupos éster e a membrana impermeável regenerada da molécula TDA é aprisionada no interior da célula. Após a incubação de células alvo e efetoras, por exemplo, durante pelo menos duas horas, até 3,5 horas, a 37 °C, sob CO2 a 5%, a TDA libertada das células alvo lisadas é quelada com Eu3+ e a fluorescência dos quelatos de európio-TDA formados é quantificada num fluorómetro resolvido no tempo (por exemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac).

Numa outra forma de realização específica, o ensaio de ADCC usado para caracterizar as moléculas da invenção compreendendo regiões de Fc variantes compreende as seguintes etapas: Preferencialmente 4-5xl06 células alvo (por exemplo, SK-BR-3, MCF-7, 0VCAR3, Raji) são marcadas com bis(acetoximetil)2,2': 6' ,2"-terpiridina-t-6"-dicarboxilato (reagente DELFIA BATDA, Perkin Elmer/Wallac). Para uma eficiência ótima de marcação, o número de células alvo utilizadas no ensaio de ADCC, de preferência não deve exceder 5xl06. 0 reagente BATDA é adicionado às células e a mistura é incubada a 37 °C, de preferência menos de 5% de CO2, durante pelo menos 30 minutos. As células são então lavadas com um tampão fisiológico, por exemplo, PBS com sulfinpirazol a 0,125 mM e meio contendo sulfinpirazol a 0,125 mM. As células alvo marcadas são então opsonizado (revestidas) com uma molécula da invenção compreendendo uma região de Fc variante, isto é, uma imunoglobulina compreendendo uma região de Fc variante da invenção, incluindo, mas não limitado a, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo biespecífico, um anticorpo multi-especifico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico. Em formas de realização preferenciais, a imunoglobulina compreendendo uma região de Fc variante utilizada no ensaio de ADCC é específica para um recetor da superfície celular, um antígeno do tumor, ou um antígeno de cancro. A imunoglobulina em que uma região de Fc variante da invenção, é introduzida pode ligar-se especificamente a qualquer antígeno de cancro ou tumor, tais como aqueles indicados na secção 5.4. Além disso, a imunoglobulina em que uma região de Fc variante da invenção, é introduzida pode ser qualquer anticorpo terapêutico específico para um antígeno de cancro, tais como aqueles indicados na secção 5.4. Em algumas formas de realização, a imunoglobulina compreendendo uma região de Fc variante utilizada no ensaio de ADCC é um anticorpo monoclonal anti-fluoresceina, 4-4-20 (Kranz et al, 1982, J. Biol Chem. 257(12): 6987-6995 ) um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico ratinho-humano 2H7 (Liu et al, 1987, Journal of Immunology, 139: 3521-6); ou um anticorpo humanizado (Ab4D5) contra o recetor do fator 2 de crescimento epidérmico humano (pl85 HER2) (Carter et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89: 4285-9) . As células alvo no ensaio de ADCC são escolhidas de acordo com a imunoglobulina em que uma região de Fc variante da invenção foi introduzida de modo a que a imunoglobulina se liga a um recetor da superfície celular da célula alvo em particular. De preferência, os ensaios de ADCC da invenção são realizados utilizando mais do que um anticorpo manipulado, por exemplo, anti-Her2/neu, 4-4-20, 2B6, Rituxan, e 2H7, portador das variantes de Fc da invenção. Numa forma de realização mais preferida, as variantes de Fc da invenção são introduzidas em pelo menos 3 anticorpos e as suas atividades ADCC são testadas. Apesar de não ser a intenção ficar ligado a um mecanismo específico de ação, o exame de pelo menos 3 anticorpos nestes ensaios funcionais irá diminuir a chance de eliminar uma mutação Fc viável erroneamente.

As células alvo opsonizadas são adicionadas às células efetoras, por exemplo, PBMC, para produzir razões efetor:alvo de aproximadamente 50: 1, 75: 1, ou 100: 1. Numa forma de realização específica, quando a imunoglobulina compreendendo uma região de Fc variante tem o domínio variável de 4-4-20, o efetor: alvo é de 75: 1. As células efetoras e alvo foram incubadas durante pelo menos duas horas, até 3,5 horas, a 37 °C, sob 5% de CO2. Os sobrenadantes das células são recolhidos e adicionados a uma solução de európio ácida (por exemplo, Solução de európio DELFIA, Perkin Elmer/Wallac). A fluorescência dos quelatos de európio-TDA formados é quantificada num fluorómetro resolvido no tempo (por exemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac). Libertação máxima (MR) e libertação espontânea (SR) é determinadas por incubação das células alvo com 1% de TX-100 e apenas meio, respetivamente. A citotoxicidade celular independente do anticorpo (AICC) é medida por incubação de células alvo e efetoras na ausência de anticorpo. Cada ensaio é de preferência realizado em triplicado. A lise específica percentual média é calculada como:

Libertação experimental (ADCC) - AICC)/(MR-SR)xl00 A invenção abrange a caracterização de variantes de Fc, em ambos os ensaios de ADCC dependentes de NK e dependentes de macrófagos. As variantes de Fc da invenção têm fenótipos alterados, tais como uma função efetora alterada, tal como testado num ensaio dependente de NK ou dependente de macrófagos. A invenção abrange ensaios conhecidos na arte e aqui exemplificados, que se ligam a Clq e mediam a citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Para determinar a ligação de Clq, uma ELISA de ligação a Clq pode ser realizada. Um ensaio exemplar pode compreender o seguinte: placas de ensaio podem ser revestidas durante a noite a 4 °C com a variante de polipeptídeo ou polipeptídeo de partida (controlo) em tampão de revestimento. As placas podem então ser lavadas e bloqueadas. Após a lavagem, uma alíquota de Clq humano pode ser adicionada a cada poço e incubada durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois de nova lavagem, 100 pL de um anticorpo conjugado de peroxidase anti-complemento Clq de ovelha pode ser adicionado a cada poço e incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. A placa pode ser novamente lavada com tampão de lavagem e 100 pL de tampão de substrato contendo OPD (dicloridrato de O-fenilenodiamina (Sigma)) pode ser adicionado a cada poço. A reação de oxidação, observada pelo aparecimento de uma cor amarela, pode ser deixada a decorrer durante 30 minutos e ser parada pela adição de 100 pL de 4,5 NH2 S04. A absorvência pode, em seguida, ser lida a (492-405) nm.

Uma variante preferida de acordo com a invenção é aquela que exibe uma significativa redução na ligação a Clq, como detetado e medido neste ensaio ou em ensaios semelhantes. De preferência, a molécula que compreende uma variante de Fc exibe cerca de 50 vezes de redução, cerca de 60 vezes, cerca de 80 vezes, ou cerca de uma redução de 90 vezes na ligação a Clq em comparação com um anticorpo de controlo com uma região de Fc de IgGl não mutada. Na forma de realização mais preferida, a molécula que compreende uma variante Fc não se liga a Clq, ou seja, a variante exibe uma redução de 100 vezes ou mais na ligação a Clq em comparação com o anticorpo de controlo.

Outra variante exemplif icat iva é uma que tem uma melhor afinidade de ligação a Clq humano do que a molécula compreendendo a região de Fc de tipo selvagem. Uma tal molécula pode exibir, por exemplo, cerca de duas vezes ou mais, e preferivelmente cerca de cinco vezes ou mais, a melhoria na ligação a Clq humano em comparação com a molécula progenitora compreendendo a região de Fc de tipo selvagem. Por exemplo, a ligação a Clq humano pode ser cerca de duas vezes a cerca de 500 vezes, e preferivelmente desde cerca de duas vezes ou desde cerca de cinco vezes a cerca de 1000 vezes melhorada em comparação com a molécula compreendendo a região de Fc de tipo selvagem.

Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) pode ser realizado, por exemplo, tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996) . Resumidamente, várias concentrações de molécula que compreende uma região de Fc variante e complemento humano podem ser diluídas com tampão. As células que expressam o antígeno ao qual a molécula que compreende uma região de Fc variante se liga podem ser diluídas para uma densidade de cerca de 1x10® células/mL. Misturas da molécula compreendendo uma região de Fc variante, complemento humano diluído e as células que expressam o antígeno podem ser adicionadas a uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços e deixar-se incubar durante 2 horas a 37 °C e 5% de CO2, para facilitar a lise celular mediada pelo complemento. 50 uL de azul de alamar (Accumed International) podem ser adicionados a cada poço e incubados durante a noite a 37° C. A absorvância é medida utilizando um fluorímetro de 96 poços com excitação a 530 nm e emissão a 590 nm. Os resultados podem ser expressos em unidades de fluorescência relativas (RFU). As concentrações da amostra podem ser calculado a partir de uma curva padrão e a atividade percentual, em comparação com molécula não variante, isto é, uma molécula compreendendo a região de Fc de tipo selvagem, é apresentada para a variante de interesse.

Em algumas formas de realização, uma Fc variante da invenção não ativa o complemento. De preferência a variante não parece ter qualquer atividade de CDC no ensaio de CDC acima. A invenção também se refere a uma variante com maior CDC em comparação com uma molécula parental (uma molécula compreendendo a região de Fc de tipo selvagem), por exemplo, exibindo cerca de duas vezes a cerca de 100 vezes mais melhoria na atividade de CDC in vitro ou in vivo (por exemplo, os valores de CI50 para cada molécula a ser comparada). Ensaios do complemento podem ser realizados com porquinhos-da-índia, coelho ou soro humano. Lise do complemento das células-alvo pode ser detetada por monitorização da libertação de enzimas intracelulares, tais como lactato desidrogenase (LDH), tal como descrito em Korzeniewski et ai., 1983 Immunol. Methods 64(3): 313-20; e ecker et ai., 1988 J. Immunol Methods 115(1) : 61-9; ou a libertação de uma etiqueta intracelular, tais como o európio, o crómio 51 ou o índio 111 em que as células alvo são marcadas, tal como aqui descrito.

5.2.8 OUTROS ENSAIOS

As moléculas da presente invenção compreendendo regiões de Fc variantes também podem ser ensaiadas utilizando quaisquer ensaios com base em ressonância de plasmon de superfície conhecidos na arte para caracterizar os parâmetros cinéticos de ligação de interação Fc-FcyR. Qualquer instrumento SPR comercialmente disponível, incluindo, mas não limitado a, Instrumentos BIAcore, disponíveis a partir de Biacore AB (Uppsala, Suécia); Instrumentos IAsys disponíveis a partir de Affinity Sensores (Franklin, MA.); Sistema IBIS disponível a partir de Windsor Scientific Limited (Berks, Reino Unido), os sistemas de SPR-CELLIA disponíveis a partir de Nippon laser e Electronics Lab (Hokkaido, Japão), e detector de SPR Spreeta disponível da Texas Instruments (Dallas, TX) podem ser utilizados na presente invenção. Para uma revisão da tecnologia baseada em SPR ver Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al. , 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61. Além disso, qualquer um dos instrumentos SPR e métodos baseados em SPR para medir as interações proteína-proteína descritas nas Patentes nos EUA n° 6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 6,268,125 estão contemplados nos métodos da invenção.

Resumidamente, ensaios baseados em SPR envolvem a imobilização de um membro de um par de ligação sobre uma superfície, e o acompanhamento da sua interação com o outro membro do par de ligação em solução em tempo real. SPR é baseado na medição da mudança no índice de refração do solvente, perto da superfície que ocorre após a formação do complexo ou dissociação do mesmo. A superfície sobre a qual ocorre a imobilização é o chip do sensor, o qual está no centro da tecnologia SPR; é constituído por uma superfície de vidro revestida com uma fina camada de ouro e forma a base para uma gama de superfícies especiais concebidas para otimizar a ligação de uma molécula à superfície. Uma variedade de chips sensores está comercialmente disponível, especialmente a partir das empresas enumeradas supra, todos os quais podem ser utilizados nos métodos da invenção. Exemplos de chips sensores incluem os disponíveis a partir de BIAcore AB, Inc., por exemplo, o Sensor Chip CM5, SA, NTA, e HPA. Uma molécula da presente invenção pode ser imobilizada sobre a superfície de um chip sensor utilizando qualquer um dos métodos de imobilização e químicas conhecidos na arte, incluindo mas não se limitando ao acoplamento covalente direto através de grupos amina, acoplamento covalente direto através de grupos sulfidril, ligação biotina a superfície revestida com avidina, acoplamento aldeído a grupos de hidratos de carbono e fixação através da marcação histidina com chips NTA.

Em algumas formas de realização, os parâmetros cinéticos da ligação de moléculas da invenção compreendendo regiões de Fc variantes, por exemplo, imunoglobulinas compreendendo a região de Fc variante, para um FcyR pode ser determinada utilizando um instrumento BIAcore (por exemplo, instrumento BIAcore 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ) . Qualquer FcyR pode ser utilizado para avaliar a interação com as moléculas da presente invenção compreendendo regiões de Fc variantes. Numa forma de realização específica o FcyR é FcyRIIIA, de preferência, um FcyRIIIA monomérico solúvel. Por exemplo, numa forma de realização, o FcyRIIIA monomérico solúvel é a região extracelular de FcyRIIIA ligada à sequência do ligante-AVITAG (ver, Pedido Provisório dos Estados Unidos N 0 60 / 439,498, depositado em 9 de Janeiro 2003 (Rolo n° 11183-004-888) e Pedido Provisório nos EUA n° 60 / 456, 041 depositado em 19 de março de 2003). Numa outra forma de realização específica, o FcyR é FcyRIIB, de preferência, um FcyRIIB dimérico solúvel. Por exemplo, numa forma de realização, a proteína dimérica solúvel FcyRIIB é preparada em conformidade com a metodologia descrita no pedido provisório nos EUA n° 60 / 439,709 depositado em 13 de Janeiro, 2003.

Um ensaio exemplificativo para determinar os parâmetros cinéticos de uma molécula que compreende uma região de Fc variante, em que a molécula é o anticorpo 4-4-20, a um FcyR utilizando um instrumento BIAcore compreende o seguinte: BSA-FITC é imobilizado em uma das quatro células de fluxo de um chip sensor de superfície, de preferência por meio de química de acoplamento de amina de tal modo que cerca de 5000 unidades de resposta (RU) de BSA-FITC são imobilizadas sobre a superfície. Uma vez que uma superfície adequada é preparada, os anticorpos 4-4-20 que transportam as mutações Fc são passados sobre a superfície, de preferência por injeções de um minuto de uma solução de 20 mg/mL a uma taxa de fluxo de 5 pL/mL. O nível de anticorpos 4-4-20 ligados à superfície varia entre 400 e 700 RU. Em seguida, uma série de diluição do recetor (proteína de fusão de FcyRIIB-Fc) em tampão HBS-P (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA a 3 mM, pH 7,5) é injetada sobre a superfície em 100 pL/min de regeneração de Anticorpo entre diferentes diluições de recetor é realizada de preferência por injeções individuais de 5 segundos de NaHCCh a 100 mM pH 9,4; 3M NaCl. Qualquer técnica de regeneração conhecida na arte está contemplada no método da invenção.

Uma vez que um conjunto de dados inteiro é recolhido, as curvas de ligação resultantes são globalmente ajustadas utilizando algoritmos de computador fornecidos pelo fabricante do instrumento SPR, por exemplo, BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ) . Estes algoritmos calculam tanto o valor Kon como K0ff, a partir do qual a constante de ligação de equilíbrio aparente, Kd é deduzida como a razão entre as duas constantes de taxa (isto é, K0ff/K0n) . Tratamentos mais detalhados de como as constantes de taxa individuais são derivadas podem ser encontrados no Manual BIAevaluaion Software (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . A análise dos dados gerados pode ser feita utilizando qualquer método conhecido na arte. Para uma revisão dos diferentes métodos de interpretação dos dados cinéticos gerados ver Myszka, 1997, Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7; Fisher et al. , 1994, Current Opinion in Biotechnology 5: 389-95; O'Shannessy, 1994, Current Opinion in Biotechnology, 5:65— 71; Chaiken et al. , 1992, Analytical Biochemistry, 201: 197-210; Morton et al. , 1995, Analytical Biochemistry 227: 176-85; O'Shannessy et al., 1996, Analytical Biochemistry 236: 275-83

Em formas de realização preferidas, os parâmetros cinéticos determinados utilizando uma análise de SPR, por exemplo, BIAcore, podem ser utilizados como um meaure preditivo de como uma molécula da invenção funcionará num ensaio funcional, por exemplo, ADCC. Um método exemplificativo para a previsão da eficácia de uma molécula da invenção, com base em parâmetros cinéticos obtidos a partir de uma análise de SPR pode compreender o seguinte: a determinação dos valores de K0ff para ligação de uma molécula da invenção a FcyRIIIA e FcyRIIB; plotagem (1) K0ff (peso) / K0ff (mut) para FcyRIIIA; (2) K0ff (mut)/K0ff (peso) para FcyRIIB contra os dados de ADCC. Números mais elevados do que um mostram uma diminuição da taxa de dissociação para FcyRIIIA e um aumento da taxa de dissociação para FcyRIIB relação ao tipo selvagem; e possuem e função ADCC melhorada.

5.3 MÉTODOS DE PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE MOLÉCULAS DA INVENÇÃO 5.3.1 Polinucleotídeos que codificam moléculas da invenção A presente invenção também inclui polinucleotídeos que codificam as moléculas, incluindo os polipeptídeos e anticorpos da presente invenção, identificados pelos métodos da invenção. Os polinucleotídeos que codificam as moléculas da invenção podem ser obtidos, e a sequência de nucleotideos dos polinucleotídeos pode ser determinada, por qualquer método conhecido na arte.

Uma vez que a sequência de nucleotideos das moléculas (por exemplo, anticorpos) identificadas pelos métodos da invenção são determinadas, a sequência de nucleotideos pode ser manipulada através de métodos bem conhecidos na arte, por exemplo, técnicas de ADN recombinante, a mutagénese dirigida, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; e Ausubel et al, eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque), para gerar, por exemplo, os anticorpos com uma sequência de aminoácido diferente, por exemplo, através da geração de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.

Numa forma de realização específica, quando os ácidos nucleicos codificam anticorpos, uma ou mais das CDRs são inseridas dentro de regiões estruturais, utilizando técnicas de ADN recombinante de rotina. As regiões estruturais podem ser de ocorrência natural ou regiões estruturais de consenso, e de preferência regiões estruturais humanas (ver, por exemplo, Chothia et al, 1998, J. Mol Biol. 278: 457-479 f para uma lista de regiões estruturais humanas).

Numa outra forma de realização, bibliotecas humanas ou quaisquer outras bibliotecas disponíveis na técnica, podem ser rastreadas por meio de técnicas convencionais conhecidas na arte, para clonar os ácidos nucleicos que codificam as moléculas da presente invenção.

5.3.2 EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE MOLÉCULAS DA INVENÇÃO

Uma vez que uma sequência de ácidos nucleicos, que codificam moléculas da presente invenção (isto é, anticorpos) tenha sido obtida, o vetor para a produção das moléculas pode ser produzido por tecnologia de ADN recombinante utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Os métodos que são bem conhecidos dos peritos na arte podem ser utilizados para construir vetores de expressão contendo as sequências de codificação para as moléculas da invenção e sinais de controlo de transcrição e translação adequados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinantes in vitro, técnicas de síntese, e recombinação genética in vivo. (Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et ai., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque).

Um vetor de expressão compreendendo a sequência de nucleotídeos de uma molécula identificada pelos métodos da invenção (isto é, um anticorpo) pode ser transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais (por exemplo, eletroporação, transfecção lipossómica, e precipitação com fosfato de cálcio) e as células transfectadas são então cultivadas através de técnicas convencionais para produzir as moléculas da presente invenção. Em formas de realização específicas, a expressão das moléculas da invenção é regulada por um tecido constitutivo, indutível ou um promotor especifico de tecido.

As células hospedeiras utilizadas para expressar as moléculas identificadas pelos métodos da invenção podem ser células bacterianas tais como Escherichia coli, ou, de preferência, células eucarióticas, em particular para a expressão da molécula de imunoglobulina recombinante inteira. Em particular, células de mamíferos, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor tal como o principal elemento intermediário promotor do gene precoce de citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para as imunoglobulinas (Foecking et al., 1998, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).

Uma variedade de sistemas de vetores de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar as moléculas identificadas pelos métodos da invenção. Tais sistemas de expressão de hospedeiros representam veículos através dos quais as sequências de codificação das moléculas da invenção podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeos apropriadas, expressar as moléculas da invenção in situ. Estes incluem, mas não estão limitadas a, microrganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformadas com ADN recombinante de bacteriófago, ADN plasmídico ou vetores de expressão de ADN de cosmídeos contendo as sequências de codificação para as moléculas identificadas pelos métodos da invenção; levedura (por exemplo, Saccharomyces Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinantes contendo as sequências que codificam as moléculas identificadas pelos métodos da invenção; sistemas de células de insetos infetadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo as sequências que codificam as moléculas identificadas pelos métodos da invenção; sistemas de células vegetais infetadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e o vírus do mosaico do tabaco (TMV) ou transformadas com vetores de expressão plasmídicos recombinantes (p.ex., plasmídeo Ti) contendo sequências que codificam as moléculas identificadas pelos métodos da invenção; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3, células linfóticas (ver US 5,807,715), células Per C.6 (as células da retina humanas desenvolvidas pela Crucell) portadores de construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio do adenovirus; o promotor 7,5K do vírus vacínia).

Nos sistemas bacterianos, uma série de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionada dependendo da utilização pretendida para a molécula a ser expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal proteína é para ser produzida, para a produção de composições farmacêuticas de um anticorpo, os vetores que dirigem a expressão de elevados níveis de produtos proteicos de fusão que sejam facilmente purificados pode ser desejável. Tais vetores incluem, mas não estão limitados, ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), no qual a sequência de codificação de anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor em enquadramento com a região de codificação lac Z de modo a que uma proteína de fusão é produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509..); vetores pGEX podem também ser utilizados para expressar polipeptideos estranhos como proteínas de fusão com glutationa-S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas através de adsorção e de ligação a uma matriz de esferas de glutationa-agarose seguido de eluição na presença de gluta-tiona livre. Os vetores pGEX são concebidos para incluir trombina ou locais de clivagem da protease fator Xa de modo que o produto do gene alvo clonado pode ser libertado da porção GST.

Num sistema de inseto, vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é utilizado como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera ftugiperda. A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vírus e é colocada sob controlo de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor da poliedrina).

Em células hospedeiras de mamífero, pode ser utilizado um número de sistemas de expressão baseados em vírus. Nos casos em que um adenovirus é usado como um vetor de expressão, a sequência de codificação de anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controlo adenoviral de transcrição/tradução, por exemplo, o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma de adenovirus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplo, a região EI ou E3) resultará num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de imunoglobulina em hospedeiros infetados (por exemplo, ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81:355-359). Sinais de iniciação específicos também podem ser necessários para a tradução eficiente de sequências que codificam anticorpos inserida. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além disso, o codão de iniciação deve estar em fase com a grelha de leitura da sequência de codificação desejada para assegurar a tradução de toda a inserção. Estes sinais de controlo traducionais exógenos e codões de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos estimuladores da transcrição adequados, terminadores de transcrição, etc. (ver Bittner et ai., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).

Além disso, uma estirpe de células hospedeiras pode ser escolhida a qual modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto do gene na forma específica desejada. Tais modificações (p.ex., glicosilação) e processamento (p.ex., clivagem) de produtos proteicos pode ser importante para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produtos de genes. Linhas celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para assegurar a modificação correta e processamento da proteína estranha expressa. Para este fim, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuam a maquinaria celular para o processamento adequado do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto génico. Tais células hospedeiras de mamífero incluem mas não estão limitadas a CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, TB2, BT20 e T47D, CRL7030 e Hs578Bst.

Para a produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, é preferida a expressão estável. Por exemplo, as linhas celulares que expressam de forma estável um anticorpo da invenção podem ser manipuladas. Em vez de se utilizar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo de expressão adequados (por exemplo, promotor, intensificador, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e um marcador selecionável. No seguimento da introdução do ADN estranho, as células manipuladas podem ser deixadas a crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido e depois são mudadas para um meio seletivo. 0 marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite às células integrarem estavelmente o plasmídeo nos seus cromossomas e crescer para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode vantajosamente ser utilizado para manipular linhas celulares que expressam os anticorpos da invenção. Tais linhas celulares manipuladas podem ser particularmente úteis no rastreio e avaliação de compostos que interagem direta ou indiretamente com os anticorpos da invenção.

Pode ser utilizada uma série de sistemas de seleção, incluindo, mas não limitado ao vírus herpes simplex timidina cinase (Wigler et ai, 1977, Cell. 11: 223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 48: 202), e de adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al, 1980, Cell. 22: 817) os genes podem ser empregues em células tk-, hgprt- ou aprt-, respetivamente. Também a resistência anti-metabolito pode ser utilizada como a base de seleção para os genes seguintes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:357; 0'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 78: 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 78: 2072); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu e Wu, 1991, 3:87-95;

Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; maio de 1993, TIB TECH 11(5) :155-215) . Os métodos geralmente conhecidos na arte da tecnologia do ADN recombinante que podem ser utilizados estão descritos em Ausubel et al. (eds.), 1993, Current

Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1; e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147) .

Os níveis de expressão de um anticorpo da presente invenção podem ser aumentados por amplificação do vetor (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel, The use of vetors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic

Press, Nova Iorque, 1987). Quando um marcador no sistema de vetor que expressa um anticorpo é amplificável, o aumento do nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada com a sequência de nucleotídeos do anticorpo, a produção do anticorpo também irá aumentar (Crouse et ai, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257) . A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão da invenção, o primeiro vetor que codifica um polipeptídeo derivado de cadeia pesada e o segundo vetor que codifica um polipeptídeo derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitam igual expressão dos polipeptídeos das cadeias pesada e leve. Alternativamente, um único vetor pode ser usado que codifica ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre de substâncias tóxicas (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad Sei. EUA 77:2197) . As sequências que codificam as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico.

Uma vez que uma molécula da invenção (ou seja, anticorpos) tenha sido expressa de forma recombinante, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido na arte para a purificação de polipeptídeos ou anticorpos, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca de iões, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico após a Proteína A e cromatografia de dimensionamento em coluna), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de polipeptídeos ou anticorpos. 5.4 Métodos profiláticos e terapêuticos A presente invenção engloba a administração de uma ou mais das moléculas da presente invenção (por exemplo, anticorpos) a um animal, preferivelmente um mamífero, e mais de preferência um ser humano, para prevenir, tratar, ou melhorar um ou mais sintomas associados com uma doença, distúrbio ou infeção. As moléculas da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio em que uma eficácia melhorada da função das células efetoras (por exemplo, ADCC) mediada por FcyR é desejada. As composições da invenção são particularmente úteis para o tratamento ou prevenção de doença neoplásica primária ou metastática (ie, o cancro) e doenças infecciosas. As moléculas da invenção podem ser fornecidas em composições farmaceuticamente aceitáveis, como é conhecido na arte ou como aqui descrito. Conforme detalhado a seguir, as moléculas aqui descritas podem ser utilizadas em métodos de tratamento ou prevenção do cancro (particularmente em imunoterapia passiva), doença autoimune, doenças inflamatórias ou doenças infecciosas.

As moléculas da invenção podem também ser utilizadas com vantagem em combinação com outros agentes terapêuticos conhecidos na arte para o tratamento ou prevenção de um cancro, doença autoimune, doenças inflamatórias ou doenças infecciosas. Numa forma de realização específica, as moléculas da invenção podem ser utilizadas em combinação com anticorpos monoclonais ou quiméricos, linfocinas ou fatores de crescimento hematopoiéticos (tais como, por exemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), que, por exemplo, servem para aumentar o número ou a atividade de células efetoras que interagem com as moléculas e, aumentam a resposta imune. As moléculas da invenção podem também ser utilizadas com vantagem em combinação com um ou mais fármacos utilizados para tratar uma doença, distúrbio ou infeção, tais como, por exemplo agentes anticancro, agentes anti-inflamatórios ou agentes antivirais, por exemplo, conforme detalhado nas secções 5.4.1.2 e 5.4.2.1 abaixo.

5.4.1 CANCROS A invenção abrange a composição para o tratamento ou prevenção de cancro ou de metástases num indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas que compreendem uma região de Fc variante.

As moléculas da presente invenção (isto é, polipeptídeos, anticorpos) que compreendem regiões de Fc variantes podem ser utilizadas para prevenir, inibir ou reduzir o crescimento de tumores primários ou metástases de células cancerígenas. Numa forma de realização, a molécula da presente invenção compreende um Fc variante que se liga a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que um polipeptídeo comparável compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, e/ou a referida região de Fc variante tem uma função efetora aumentada, por exemplo, ADCC, CDC, fagocitose, opsonização, etc. Tais moléculas podem ser utilizadas isoladamente para tratar ou prevenir o cancro. Numa outra forma de realização, a molécula da presente invenção compreende uma região de Fc variante que se liga a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que um polipeptídeo comparável compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, e liga-se ainda a FcyRIIB com uma afinidade mais baixa do que um polipeptídeo comparável compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIB, e/ou a referida região de Fc variante tem uma função efetora aumentada, por exemplo, ADCC, CDC, fagocitose, opsonização, etc. Tais moléculas podem também ser utilizadas isoladamente para tratar ou prevenir o cancro.

Em algumas formas de realização, a invenção abrange composições para o tratamento ou prevenção de cancro num indivíduo com polimorfismos FcyR tais como os que são homozigóticos para os alelos de FcyRIIIA-158v ou FcyRIIIA-158F. Em algumas formas de realização, a invenção abrange anticorpos terapêuticos manipulados, por exemplo, anticorpos monoclonais específicos de tumor de acordo com os métodos da invenção de tal modo que os anticorpos manipulados têm eficácia melhorada nos pacientes homozigóticos para o alelo de baixa afinidade de FcyRIIIA (158F). Noutras formas de realização, a invenção abrange anticorpos terapêuticos manipulados, por exemplo, anticorpos monoclonais específicos de tumor de acordo com os métodos da invenção de tal modo que os anticorpos manipulados têm eficácia melhorada nos pacientes homozigóticos para o alelo de alta afinidade de FcyRIIIA (158V).

Em algumas formas de realização, os anticorpos manipulados da presente invenção são particularmente eficazes no tratamento e/ou prevenção de linfoma não-Hodgkin (NHL). Os anticorpos manipulados da invenção são terapeuticamente mais eficazes do que os regimes terapêuticos atuais para NHL, incluindo mas não se limitando a quimioterapia, imunoterapia usando o mAb anti-CD20, rituximab. A eficácia de anticorpos monoclonais anti-CD20, contudo, depende do polimorfismo de FcyR do indivíduo (Carton et al., 2002 Blood, 99: 754-8; Weng et al., 2003 J Clin Oncol.21 (21) :3940-7) . Estes recetores são expressos na superfície das células efetoras e mediam a ADCC. Alelos de alta afinidade, dos recetores de ativação de baixa afinidade, melhoram a capacidade das células efetoras mediarem ADCC. Os métodos da invenção permitem a manipulação de anticorpos anti-CD20 que albergam mutações Fc para aumentar a sua afinidade para com FcyR em células efetoras, através dos seus domínios de Fc alterados. Os anticorpos manipulados da invenção proporcionam melhores reagentes de imunoterapia para os pacientes independentemente do seu polimorfismo de FcyR.

Um método exemplificativo para a determinação da eficácia dos anticorpos anti-CD20 manipulados num indivíduo pode incluir os seguintes: Os plasmídeos que albergam genes de cadeia pesada quiméricos antÍ-HER2/neu com as mutações de Fc que apresentam substancialmente aumento de morte em ADCC podem ser utilizados como uma estrutura para transferir no domínio variável do gene de cadeia pesada Rituximab. A região variável da variante de Fc antÍ-HER2/neu é substituída pela região variável de rituximab. Os plasmídeos contendo domínios de Fc de tipo selvagem ou uma mutação D265A para abrogar a ligação ao FcR, ou as variantes de Fc anti-CD20 são co-transfectadas transientemente com o gene da cadeia leve Rituximab em células 293H, o meio condicionado e o anticorpo é purificado sobre uma coluna de proteína G, utilizando métodos de rotina.

Os mAbs anti-CD20 que albergam as variantes de Fc são testados por ADCC usando uma linha de células B cultivadas para determinar a capacidade das mutações Fc para aumentar ADCC. ADCC padrão é realizada utilizando os métodos aqui divulgados. Os linfócitos são colhidos a partir de sangue periférico utilizando um gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia) . Células alvo Daudi, uma linha de células B expressando CD20, são carregadas com európio (PerkinElmer) e incubadas com efetores durante 4 horas a 37 °C. Európio libertado é detetado através de um leitor de placas fluorescentes (Wallac). Os dados de ADCC resultantes indicam a eficácia de variantes de Fc para desencadear a citotoxicidade mediada por células NK e estabelecem que variantes de Fc anti-CD20 podem ser testadas com as amostras de pacientes e monócitos elutriados. As variantes de Fc que mostram o maior potencial para aumentar a eficácia do anticorpo anti-CD20 são em seguida testadas num ensaio ADCC usando PBMCs de pacientes. As PBMCs de dadores saudáveis, foram usadas como células efetoras. Ensaios de ADCC in vitro utilizando variantes anti-CD20 e Rituximab são realizados em células de linfoma primário a partir de pacientes com linfoma folicular. 0 polimorfismo específico de FcyR dos doadores é determinado e catalogado utilizando métodos conhecidos na arte. Um ensaio ADCC é realizado pelas células efetoras de pacientes com diferentes genótipos de FcyRIIIA.

De acordo com um aspeto da invenção, as moléculas (por exemplo, anticorpos) da presente invenção compreendendo regiões de Fc variantes aumentam a eficácia da imunoterapia do cancro, aumentando a potência da função efetora do anticorpo em relação a uma molécula contendo a região de Fc de tipo selvagem, por exemplo, ADCC, CDC, fagocitose, opsonização, etc. Numa forma de realização específica, o anticorpo dependente de toxicidade celular e/ou fagocitose de células tumorais é melhorado utilizando as moléculas da presente invenção com regiões de Fc variantes. As moléculas da invenção podem aumentar a eficácia do tratamento do cancro por imunoterapia ao melhorar pelo menos uma função efetora mediada por anticorpos. Numa forma de realização particular, uma molécula da invenção compreendendo uma região de Fc variante aumenta a eficácia do tratamento de imunoterapia através do aumento da cascata dependente do complemento. Numa outra forma de realização da invenção, a molécula da invenção, que compreende uma região de Fc variante aumenta a eficácia do tratamento por imunoterapia aumentando a fagocitose e/ou opsonização das células tumorais alvo. Numa outra forma de realização da invenção, a molécula da invenção, que compreende uma região de Fc variante aumenta a eficácia do tratamento, aumentando a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos ("ADCC") na destruição das células tumorais alvo. A invenção contempla ainda anticorpos terapêuticos de manipulados (por exemplo, anticorpos monoclonais específicos de tumor) para aumentar a eficácia terapêutica do anticorpo terapêutico, por exemplo, através do aumento da função efetora do anticorpo terapêutico (por exemplo, ADCC) . De preferência, o anticorpo terapêutico é um anticorpo citotóxico e/ou opsonizante. Será apreciado por um perito na arte que, uma vez que as moléculas da invenção com propriedades de ligação desejadas (por exemplo, moléculas com regiões de Fc variantes com pelo menos uma modificação de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc variante para com FcyRIIIA em relação a uma molécula comparável, que compreende uma região de Fc de tipo selvagem) tenham sido identificadas (Ver Secção 5.2 e Tabela 8) de acordo com os métodos da invenção, os anticorpos terapêuticos podem ser manipulados utilizando técnicas padrão de ADN recombinante e quaisquer técnicas de mutagénese conhecidas, tal como descritas na secção 5.2.2 para produzir uma terapêutica manipulada que transporta os locais de mutação com as desejadas propriedades de ligação. Qualquer um dos anticorpos terapêuticos listados na Tabela 9, que têm demonstrado utilidade terapêutica no tratamento de cancro, podem ser manipulados de acordo com os métodos da invenção, por exemplo, modificando a região de Fc de modo a ter uma afinidade melhorada para com FcyRIIIA em comparação com um anticorpo terapêutico com uma região de Fc de tipo selvagem, e usados para o tratamento e ou prevenção de um cancro caracterizado por um antígeno de cancro. Outros anticorpos terapêuticos incluem aqueles contra os agentes patogénicos, tais como aqueles contra Streptococcus pneumoniae serótipo 6B, ver, por exemplo, v er Sun et al, 1999, Infection and Immunity, 67(3): 1172-9.

As variantes de Fc da invenção podem ser incorporadas em anticorpos terapêuticos tais como os aqui divulgados, ou outros candidatos clínicos de fusão Fc, ou seja, uma molécula que compreende uma região de Fc que tenha sido aprovada para nós em ensaios clínicos ou qualquer outra molécula que possa beneficiar das variantes de Fc da presente invenção, e suas versões humanizadas, maturadas por afinidade, versões modificadas ou manipuladas das mesmas. A invenção também abrange a manipulação de qualquer outro polipeptídeo que compreenda uma região de Fc que tem uma utilidade terapêutica, incluindo, mas não se limitando a ENBREL, de acordo com os métodos da invenção, a fim de aumentar a eficácia terapêutica de tais polipeptideos, por exemplo, ao melhorar a função efetora do polipeptídeo compreendendo uma região de Fc.

Assim, são aqui descritos métodos de prevenção ou tratamento de cancro caracterizado por um antigeno de cancro, utilizando um anticorpo terapêutico que se liga a um antigeno do cancro e é citotóxico e foi modificado num ou mais locais na região de Fc, de acordo com a invenção, para se ligar a FcyRIIIA e/ou FcyRIIA com uma maior afinidade do que o anticorpo terapêutico mãe e/ou medeia a função efetora (por exemplo, ADCC, fagocitose) de forma mais eficaz. Também são aqui descritos métodos de prevenção ou de tratamento de cancro caracterizado por um antigeno de cancro, utilizando um anticorpo terapêutico que se liga a um antigeno do cancro e é citotóxico, e foi manipulado de acordo com a invenção para se ligar a FcyRIIIA e/ou FcyRIIA com mais afinidade e ligar-se a FcyRIIB com uma menor afinidade do que o anticorpo terapêutico mãe, e/ou medeia a função efetora (por exemplo, ADCC, fagocitose) de forma mais eficaz. Os anticorpos terapêuticos que foram modificados de acordo com a invenção são úteis para a prevenção ou tratamento do cancro, uma vez que possuem uma atividade citotóxica melhorada (por exemplo, atividade de morte de células de tumor melhorada e/ou atividade melhorada, por exemplo, de ADCC ou de CDC).

Os cancros associados a um antigeno de cancro podem ser tratados ou prevenidos pela administração de um anticorpo terapêutico que se liga a um antigeno do cancro e é citotóxico, e foi manipulado de acordo com os métodos da invenção para ter, por exemplo, uma função efetora aumentada. Numa forma de realização particular, os anticorpos terapêuticos manipulados de acordo com os métodos da invenção aumentam o efeito citotóxico mediado por anticorpos do anticorpo dirigido para o antigeno particular do cancro. Por exemplo, mas não a titulo de limitação, os cancros associados com os seguintes antígenos de cancro podem ser tratados ou prevenidos pelos métodos e composições da invenção: KS 1/4 antígeno pan-carcinoma (Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142:32-37; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415), antígeno de carcinoma de ovário (CA125) (Yu et al., 1991, Cancer Res. 51 (2) :48- 475), fosfato de ácido prostático (Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(1):4928), antígeno específico da próstata (Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10 (2) :903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. antigene associado ao melanoma p97 (Estin et ai, 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-44), antígeno de melanoma gp75 (Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med 171(4):1375-1380), antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) (Natali et al., 1987, Cancer 59:55-3; Mittelman et al., 1990, J. Clin. Invest. 86:2136-2144)), antígeno da membrana específica da próstata, antígeno carcinoembrionário (CEA) (Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294), antígeno de mucina epitelial polimórfica, antígeno de glóbulos de gordura do leite humano, antígenos associados a tumor colorretal, tais como: CEA, TAG-72 (Yokata et al. , 1992, Cancer Res. 52:3402- 3408), C017-1A (Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Cancer 53:751-758); GICA 19-9 (Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135), CTA-1 e LEA, antígeno-38.13 do linfoma de Burkitt, CD19 (Ghetie et al, 1994, Blood 83:. 1329-1336 ), antígeno de linfoma B humano CD20(Reff et al, 1994, Blood 83: 435-445), CD33 (Sgouros et al, 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430), antígenos específicos de melanoma tais como gangliósido GD2 (Saleh et al., 1993, J. Immunol., 151, 3390-3398), gangliósido GD3 (Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380), gangliósido GM2 (Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12:1036-1044), gangliósido GM3 (Hoon et al. , 1993, Cancer Res. 53: 5244-5250), tipo de antígeno da superfície celular de transplante específico de tumor (TSTA), tais como os antígenos tumorais induzidos por vuris, incluindo vírus Τ'-antígeno de tumor de ADN e antígenos do envelope de vírus de ARN de tumor, antígeno oncofetal-alfa-fetoproteína, tais como CEA do cólon, antígeno oncofetal do tumor da bexiga (Hellstrom et al, 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188), antígeno de diferenciação, tais como antígeno de carcinoma de pulmão humano L6, L20 (Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3923), antígenos de fibrossarcoma, antígeno-GP37 de leucemia de células T humanas (Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141:1398-1403), neoglicoproteína, esfingolipidos, antígeno do cancro da mama, tais como o EGFR (recetor do fator de crescimento epidérmico) , antígeno HER2 (pl85HER2) , mucina epitelial polimórfica (PEM) (Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359), antígeno do linfócito humano maligno-APO-1(Bernhard et al, 1989, Science 245: 301-304), antígeno de diferenciação (Feizi, 1985, Nature 314: 53-57) como o antígeno I que se encontra em ertrócitos fetais e endoderme primário, I(Ma) encontrado em adencarcinomas gástricos M18 e M39 encontrado no epitélio mamário, SSEA-1 encontrado em células mieloides, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5 e Di56-22 encontrado no cancro colorretal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), C14 encontrado em adenocarcinoma do cólon, F3 encontrado em adenocarcinoma de pulmão, AH6 encontrado em cancro gástrico, hapteno Y, Le^ encontrado em células de carcinoma embrionário, TL5 (grupo sanguíneo A), recetor EGF encontrado em células A431, série Ei (grupo sanguíneo B) encontrado no cancro do pâncreas, FC10.2 encontrado em células de carcinoma embrionário, antígeno do adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado no adenocarcinoma, NS-10 encontrados em adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb) , G49, recetor de EGF (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado em adenocarcinoma do cólon, 19,9 encontrado em cancro de cólon, mucinas de cancro gástrico, T5A7 encontrado em células mieloides, R24 encontrado em melanoma, 4.2, Gd3, Dl.l, OFA-1, Gm2, OFA-2, Gd2 e Ml: 22: 25: 8 encontrado em células de carcinoma embrionário, e SSEA-3 e SSEA-4 encontrado em embriões de estágio celular 4-8. Numa outra forma de realização, o antígeno é um péptido derivado de recetor de células T de um Linfoma de Células T cutâneo (ver, Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62) .

Os cancros e doenças relacionadas que podem ser tratados ou prevenidos por composições da presente invenção incluem, mas não estão limitados aos seguintes: leucemias, incluindo mas não se limitando a, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas, tais como leucemias mieloblásticas, promielocíticas, mielomonocíticas, monocíticas, eritroleucémias e síndrome mielodisplásico, leucemias crónicas, tais como, mas não limitados a, leucemia mieloide crónica (granulocítica) , leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas; policitemia vera; linfomas, tais como, mas não se limitando a doença de Hodgkin, doença de não-Hodgkin; mielomas múltiplos, tais como, mas não limitados a mieloma múltiplo latente, mieloma não secretor, mieloma osteoesclerótico, leucemia de células plasmáticas,plasmocitoma solitário e plasmocitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstrom; gamopatia monoclonal de significado indeterminado; gamopatia monoclonal benigna; doença de cadeia pesada; sarcomas ósseos e dos tecidos conjuntivos, tais como, mas não limitado a sarcomas ósseos, osteossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, tumor de células gigantes malignas, fibrossarcoma dos ossos, cordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tecidos moles, angiossarcoma (hemangiossarcoma), fibrossarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, lipossarcoma, lintangiosarcoma, neurilemoma, rabdomiossarcoma, sarcoma sinovial; tumores cerebrais, incluindo mas não se limitando a, glioma, astrocitoma, glioma do tronco cerebral, ependimoma, oligodendroglioma, tumor não glial, neurinoma acústico, craniofaringioma,meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma cerebral primário; cancro da mama, incluindo, mas não limitado a, adenocarcinoma, carcinoma lobular (pequenas células), carcinoma intraductal, cancro da mama medular, cancro da mama mucinoso, cancro da mama tubular, cancro de mama papilar, doença de Paget e cancro da mama inflamatório; cancro renal, incluindo, mas não limitado a, feocromocitoma e carcinoma adrenocortical; cancro de tiroide, tais como, mas não limitados a cancro da tiroide papilar ou folicular, cancro medular da tiroide e cancro da tiroide anaplásico; cancro do pâncreas, incluindo mas não se limitando a, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina, e tumor carcinoide ou de células das ilhotas; cancros da hipófise, incluindo, mas não limitado a, doença de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia e diabetes insipius; cancros oculares, incluindo mas não se limitando a, melanoma ocular tal como melanoma da iris, melanoma coroidal, e melanoma do corpo ciliar e retinoblastoma; cancros vaginais, incluindo, mas não limitados a, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e melanoma; cancro vulvar, incluindo mas não se limitando a, carcinoma de células escamosas, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de células basais, sarcoma e doença de Paget; cancros cervicais incluindo, mas não limitados a, carcinoma de células escamosas, e adenocarcinoma; cancros do útero, incluindo mas não limitado a, carcinoma endometrial e sarcoma uterino; cancros de ovário, incluindo mas não limitado a, carcinoma epitelial do ovário, tumor limítrofe, tumor de células germinativas, e tumor estromal; cancros esofágicos, incluindo mas não limitados a, cancro escamoso, adenocarcinoma, carcinoma cítico adenoide, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmocitoma, carcinoma verrucoso e carcinoma de células de aveia (células pequenas); cancros do estômago, incluindo mas não se limitando ao adenocarcinoma, fungating (polipoide), ulceroso, distribuição superficial, distribuição difusa, linfoma maligno, lipossarcoma, fibrossarcoma e carcinossarcoma; cancros do cólon; cancros retais; cancros do fígado, incluindo, mas não se limitando a carcinoma hepatocelular e hepatoblastoma, cancros da vesícula biliar, incluindo mas não se limitando a, adenocarcinoma; colangiocarcinomas incluindo mas não se limitando aos papilares, nodulares e difusos; cancros do pulmão, incluindo mas não se limitando a, cancro do pulmão de células não pequenas, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermoide), adenocarcinoma, carcinoma de células grandes e cancro do pulmão de células pequenas; cancros testiculares incluindo mas não se limitando a, tumores germinais, seminoma, anaplásico, clássico (típico), espermatocísticos, não seminoma, carcinoma embrionário, carcinoma teratoma, coriocarcinoma (tumor do saco vitelino), cancros da próstata, incluindo mas não se limitando a, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, e rabdomiossarcoma; cancros penais; cancros orais incluindo, mas não limitados a, carcinoma de células escamosas; cancros basais; cancros das glândulas salivares, incluindo mas não se limitando ao adenocarcinoma, o carcinoma mucoepidermoide, e carcinoma de quistos adenoides; cancros da faringe incluindo, mas não limitado a, cancro de células escamosas e verrucosos; cancros da pele incluindo, mas não limitados a, carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular e melanoma, melanoma de espalhamento superficial, melanoma nodular, melanoma lentigomaligno, melanoma acral lentiginoso; cancros do rim incluindo, mas não limitado a, cancro de células renais, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrossarcoma, cancro das células transicionais (pélvis renal e/ou da uretra); 0 tumor de Wilms; cancros da bexiga incluindo, mas não limitados a, carcinoma de células transicionais, cancro das células escamosas, adenocarcinoma, carcinossarcoma. Além disso, os cancros incluem mixossarcoma, osteossarcoma, endoteliossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar e adenocarcinomas papilares (para uma revisão de tais distúrbios, ver Fishman et al., 1985, Medicine, 2a ed., J.B. Lippincott Co. , Filadélfia e Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., Estados Unidos da América).

Em consequência, as composições da invenção também são úteis no tratamento ou prevenção de uma variedade de cancros ou outras doenças proliferativas anormais, incluindo (mas não se limitando) as seguintes: carcinoma, incluindo o da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estômago, próstata, cérvix, tiroide e pele; incluindo o carcinoma de células escamosas; tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma das células B, linfoma de célula T, linfoma de Burketts; tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, incluindo leucemias mieloides agudas e crónicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, e schwanomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrosafcoma, rabdomiosarcoma, e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma,xenoderma pegmentosum, ceratoactantoma, seminoma, cancro folicular da tiroide e teratocarcinoma. Está também contemplado que os cancros causados por aberrações na apoptose, seriam tratados pelos métodos e composições da invenção. Tais tipos de cancro podem incluir, mas não se limitam a linfomas foliculares, carcinomas com mutações do gene p53, tumores dependentes das hormonas da mama, próstata e ovário, e lesões pré-cancerosas, tais como polipose adenomatosa familiar, e sindromes mielodisplásicos. Em formas de realização especificas, a malignidade ou alterações disproliferativas (tais como metaplasias e displasias) ou desordens hiperproliferativas, são tratadas ou prevenidas pelos métodos e composições da invenção no ovário, bexiga, mama, cólon, pulmão, pele, pâncreas, ou útero. Noutras formas de realização especificas, o sarcoma, melanoma, leucemia são tratados ou prevenidos pelos métodos e composições da invenção.

Numa forma de realização especifica, uma molécula da invenção (por exemplo, um anticorpo compreendendo uma região de Fc variante, ou um anticorpo monoclonal terapêutico manipulado de acordo com os métodos da invenção) inibe ou reduz o crescimento de células de tumor primário ou das metástases cancerosas em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45 %, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, ou pelo menos 10% em relação ao crescimento de tumor primário ou metástases na ausência da referida molécula da invenção.

5.4.1.1 TERAPIA DE COMBINAÇÃO A presente invenção abrange ainda a administração de moléculas da invenção em combinação com outras terapias conhecidas pelos peritos na arte para o tratamento ou prevenção de cancro, incluindo mas não se limitando a, quimioterapias correntes convencionais e experimentais, terapias hormonais, terapias biológicas, imunoterapias, terapias de radiação ou cirurgia. Em alguns exemplos, as moléculas aqui divulgadas podem ser administradas em combinação com uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais agentes anticancro, anticorpos terapêuticos (por exemplo, os anticorpos listados na Tabela 9), ou outros agentes conhecidos pelos peritos na arte para o tratamento e/ou prevenção do cancro (Ver Secção 5.4.1.2).

Em certos exemplos, uma ou mais molécula da invenção é administrada a um mamífero, preferivelmente um ser humano, concomitantemente com um ou mais outros agentes terapêuticos úteis para o tratamento de cancro. O termo"concomitantemente" não se limita à administração de agentes terapêuticos ou profiláticos exatamente ao mesmo tempo, mas em vez disso, entende-se que uma molécula aqui descrita e o outro agente são administrados a um mamífero numa sequência e dentro de um intervalo de tempo tal que a molécula pode atuar em conjunto com o outro agente para proporcionar um maior benefício do que se fossem administrados de outra forma. Por exemplo, cada agente terapêutico ou profilático (por exemplo, de quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal ou terapia biológica) pode ser administrado ao mesmo tempo ou sequencialmente em qualquer ordem a diferentes pontos no tempo; no entanto, se não administrados ao mesmo tempo, devem ser administrados suficientemente próximos no tempo de modo a proporcionar o efeito terapêutico ou profilático desejado. Cada agente terapêutico pode ser administrado separadamente, em qualquer forma apropriada e por qualquer via adequada. Em vários exemplos, os agentes profiláticos ou terapêuticos são administrados com menos de 1 hora de intervalo, a cerca de 1 hora de intervalo, a cerca de 1 hora até cerca de 2horas de intervalo, a cerca de 2 horas até cerca de 3 horas de intervalo, a cerca de 3 horas a cerca de 4 horas de intervalo, a cerca de 4 horas até cerca de 5 horas de intervalo, a cerca de 5 horas a cerca de 6 horas de intervalo, a cerca de 6 horas até cerca de 7 horas de intervalo, a cerca de 7 horas a cerca de 8 horas de intervalo, a cerca de 8 horas a cerca de 9 horas de intervalo, a cerca de 9 horas a cerca de 10 horas de intervalo, a cerca de 10 horas até cerca de 11 horas de intervalo, a cerca de 11 horas a cerca de 12 horas de intervalo, não mais do que 24 horas de intervalo ou não mais do que 48horas de intervalo. Em exemplos preferidos, dois ou mais componentes são administrados dentro da mesma visita do paciente.

Noutros exemplos, os agentes profiláticos ou terapêuticos são administrados a cerca de 2 a 4 dias de intervalo, a cerca de 4 a 6 dias de intervalo, a cerca de 1 semana de intervalo, em cerca de 1 a 2 semanas de intervalo, ou mais de 2 semanas de intervalo. Em exemplos preferidos, os agentes profiláticos ou terapêuticos são administrados num período de tempo em que ambos os agentes estão ainda ativos. Um perito na arte seria capaz de determinar um tal período de tempo pela determinação da semivida dos agentes administrados.

Em determinados exemplos, os agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção são administrados ciclicamente a um indivíduo. A terapia cíclica envolve a administração de um primeiro agente durante um período de tempo, seguida pela administração de um segundo agente e/ou terceiro agente durante um período de tempo e repetindo esta administração sequencial. A terapia cíclica pode reduzir o desenvolvimento de resistência a uma ou mais das terapias, evitar ou reduzir os efeitos secundários de uma das terapias, e/ou melhora a eficácia do tratamento.

Em certos exemplos, os agentes profiláticos ou terapêuticos são administrados num ciclo de menos de 3 semanas, cerca de uma vez a cada duas semanas, cerca de uma vez a cada 10 dias ou uma vez a cada semana. Um ciclo pode compreender a administração de um agente terapêutico ou profilático por infusão ao longo de cerca de 90 minutos em cada ciclo, cerca de 1 hora a cada ciclo, cerca de 45 minutos em cada ciclo. Cada ciclo pode compreender pelo menos 1 semana de repouso, pelo menos 2 semanas de repouso, pelo menos, 3 semanas de repouso. O número de ciclos administrados é de cerca de 1 a cerca de 12 ciclos, mais tipicamente de cerca de 2 a cerca de 10 ciclos, e mais tipicamente de cerca de 2 a cerca de 8 ciclos.

Ainda noutros exemplos, os agentes terapêuticos e profiláticos da invenção são administradas em regimes de dosagem metronómica, quer por infusão continua ou administração frequente sem períodos de repouso prolongados. Tal administração metronómica pode envolver a dosagem em intervalos constantes, sem períodos de descanso. Tipicamente, os agentes terapêuticos, em particular, agentes citotóxicos, são utilizados em doses mais baixas. Tais regimes de dosagem englobam a administração crónica diária de doses relativamente baixas por longos períodos de tempo. Em exemplos preferidos, o uso de doses mais baixas pode minimizar os efeitos secundários tóxicos e eliminar os períodos de repouso. Em certas formas de realização, os agentes terapêuticos e profiláticos são entregues por dose baixa crónica ou infusão contínua variando de cerca de 24 horas a cerca de 2 dias, de cerca de 1 semana a cerca de 2 semanas, a cerca de 3 semanas, a cerca de 1 mês, a cerca de 2 meses, a cerca de 3 meses, a cerca de 4 meses, a cerca de 5 meses, a cerca de 6meses. O agendamento de tais regimes de dose pode ser otimizado pelo oncologista especializado.

Noutros exemplos, os cursos de tratamento são administrados concorrentemente a um mamífero, ou seja, as doses individuais dos agentes terapêuticos são administradas separadamente, mas dentro de um intervalo de tempo tal que as moléculas aqui divulgadas podem trabalhar em conjunto com o outro agente ou agentes. Por exemplo, um componente pode ser administrado uma vez por semana em combinação com os outros componentes que podem ser administrados uma vez a cada duas semanas ou uma vez a cada três semanas. Por outras palavras, os regimes de dosagem para os produtos terapêuticos são executados simultaneamente, mesmo que os agentes terapêuticos não sejam administrados ao mesmo tempo ou dentro da mesma visita do paciente.

Quando usadas em combinação com outros agentes profiláticos e/ou terapêuticos, as moléculas aqui divulgadas e o agente profilático e/ou terapêutico podem atuar aditivamente ou, mais preferivelmente, sinergicamente. Num exemplo, uma molécula da invenção é administrada concomitantemente com um ou mais agentes terapêuticos na mesma composição farmacêutica. Noutro exemplo, uma molécula aqui divulgada é administrada concomitantemente com um ou mais outros agentes terapêuticos, em composições farmacêuticas separadas. Ainda noutro exemplo, uma molécula aqui descrita é administrada antes de ou subsequente à administração de outro agente terapêutico ou profilático. A divulgação contempla a administração de uma molécula aqui divulgada em combinação com outros agentes terapêuticos ou profiláticos pelas mesmas ou diferentes vias de administração, por exemplo, oral e parentérica. Em certos exemplos, quando uma molécula aqui descrita é administrada concorrentemente com outro agente terapêutico ou profilático que produz potencialmente efeitos colaterais adversos, incluindo, mas não limitados a, toxicidade, o agente terapêutico ou profilático pode vantajosamente ser administrado numa dose que caia abaixo do limiar em que o efeito colateral adverso é induzido.

As quantidades de dosagem e as frequências de administração aqui proporcionadas são abrangidas pelos termos terapeuticamente eficaz e profilaticamente eficaz. A dosagem e frequência variarão ainda tipicamente de acordo com fatores específicos para cada paciente, dependendo dos agentes terapêuticos ou profiláticos específicos administrados, da gravidade e o tipo de cancro, a via de administração, bem como a idade, peso corporal, resposta, e historial clínico do paciente. Regimes adequados podem ser selecionados por um perito na arte, considerando tais fatores e seguindo, por exemplo, as dosagens relatadas na literatura e recomendadas no Physician's Desk Reference (56 ed., 2002) .

5.4.1.2 OUTROS AGENTES TERAPÊUTICOS / PROFILÁTICOS

Os métodos aqui divulgados compreendem a administração de uma ou mais moléculas descritas com um ou mais agentes terapêuticos usados para o tratamento e/ ou prevenção do cancro. Inibidores da angiogénese podem ser administrados em combinação com as moléculas descritas. Inibidores de angiogénese, que podem ser utilizados nas composições da invenção incluem, mas não estão limitados a: angiostatina (fragmento de plasminogénio) ; antitrombina antiangiogénica III; angiozima; ABT- 627; Bay 12-9566; BeneFin; bevacizumab; BMS-275291; inibidor derivado de cartilagem (CDI); CAI; Fragmento do complemento CD59; CEP-7055; Col3; Combretastatina A-4; Endostatina (fragmento de colagénio XVIII); Fragmento de fibronectina; Gro-beta; halofuginona; heparinases; fragmento hexassacárido de Heparina; HMV833; Gonadotrofina coriónica humana (hCG); IM-862; Interferão alfa/beta/gama; Proteína induzível por interferão (IP-10); Interleucina-12; Kringle 5 (fragmento do plasminogénio); marimastat; Inibidores de metaloproteinases (TIMPs); 2-Metoxiestradiol; MMI 270 (CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; Nepovastat; NM-3; Panzem; PI-88; Inibidor de ribonuclease da placenta; inibidor do ativador de plasminogénio; Fator-4 de plaquetas (PF4); Prinomastat; fragmento 16kD de prolactina; Proteína relacionada com proliferina (PRP); PTK 787 / ZK 222594; retinoides; Solimastat; esqualamina; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; Tetra-hidrocortisol-S;tetratiomolibdato; talidomida; trombospondina-1 (TSP-1); TNP-470; Fator beta de crescimento transformante (TGF-b); vasculostatina; Vasostatin (fragmento de calreticulina); ZD6126; ZD 6474; inibidores da farnesil transferase (FTI); e bisfosfonatos.

Os agentes anticancro que podem ser utilizados em combinação com as moléculas da invenção nas várias formas de realização da invenção, incluindo composições farmacêuticas e formas de dosagem e kits da invenção, incluem, mas não se limitam a: acivicina; aclarubicina; cloridrato de acodazole; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginase; asperlin; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; cloridrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar de sódio; bropirimina; busulfan; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatina; carmustina; cloridrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucil; cirolemicina; cisplatina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; cloridrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatin; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorrubicina; cloridrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; cloridrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatina; enpromato; epipropidina; cloridrato de epirrubicina; erbulozole; cloridrato de esorubicina; estramustina; fosfato de sódio de estramustina; Etanidazole; etoposido; fosfato de etoposido; etoprina; cloridrato de fadrozole; fazarabina; fenretinide; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracil; flurocitabina; fosquidona; fostriecin de sódio; gemcitabina; cloridrato de gemcitabina; hidroxiureia; cloridrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluindo interleucina II recombinante, ou rIL2), interferão alfa-2a; interferão alfa-2b; interferão alfa-nl; interferão alfa-n3; interferon beta-I a; interferão gama-I b; iproplatina; cloridrato de irinotecano; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolide; cloridrato de liarozole; lometrexol sódico; lomustine; cloridrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; cloridrato mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalano; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sódio; metoprine; meturedepa; mitindomide; mitocarcin; mitocromin; mitogilina; mitomalcin; mitomicina; mitosper; mitotane; cloridrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazole; nogalamicina; ormaplatina; oxisuran; paclitaxel; pegaspargase; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamide; pipobromano; piposulfano; cloridrato piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfimero de sódio; porfiromicina; prednimustina; cloridrato de procarbazina; puromicina; cloridrato de puromicina; pirazofurin; riboprina; rogletimide; safingol; cloridrato de safingol; semustina; simtrazeno; sparfosate de sódio; sparsomicina; cloridrato de espirogermânio; espiromustina; espiroplatina; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan de sódio; tegafur; cloridrato teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; thiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorrelina; cloridrato de tubulozole; mostarda de uracilo; uredepa; vapreotido; verteporfin; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartarato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; Sulfato de vinzolidina; vorozole; zeniplatina; zinostatina; cloridrato de zorubicina. Outros fármacos anti-cancro incluem, mas não estão limitados a: 20-epi-l,25 di-hidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulinico; amrubicin; amsacrina; anagrelideo; anastrozol; andrografolida; inibidores da angiogénese; antagonista D; antagonista G; Antarelix; proteína morfogenética-1 anti-dorsalizante; antiandrogénio, carcinoma da próstata; antiestrogéneo; antineoplaston; oligonucleotideos anti-sentido; glicinato de afidicolina; moduladores do gene da apoptose; reguladores da apoptose; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina-desaminase; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatin 3; azasetron; azatoxin; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR / ABL; benzoclorinas; benzoílestaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilspermina; bisnafide; bistrateno A; bizelesina; breflate; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; canaripox IL-2; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazole; CaRest M3; CARN 700; inibidor derivado da cartilagem; carzelesina; inibidores da caseina-quinase (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; Análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogos da combretastatina; conagenin; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacin A; ciclopentantraquinonas; cicloplatame; cipemicina; ocfosfato de citarabina; fator citolitico; citostatin; dacliximab; decitabina; desidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamide; dexrazoxane; dexverapamil; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorspermina; di-hidro-5-azacitidina; di-hidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebseleno; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristeride; análogo da estramustina; agonistas de estrogénio; antagonistas de estrogénio; etanidazole; fosfato de etoposido; exemestano; fadrozole; fazarabina; fenretinide; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; cloridrato fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecin; fotemustina; texafirina de gadolinio; nitrato de gálio; galocitabina; ganirelix; inibidores de gelatinase; gemcitabina; inibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; bisacetamida de hexametileno; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicin; idoxifeno; idramantona; ilmofosine; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos imunoestimulantes; inibidor do recetor do fator de crescimento fator-1 tipo insulina; agonistas de interferão; interferão; interleucinas; iobenguane; iododoxorubicin; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazole; isohomohalicondrin B; itasetron; jasplaquinolide; kahalalide F; lamellarin- N triacetato; lanreotide; leinamicina; lenograstim; sulfato lentinano; leptolstatin; letrozol; fator de inibição da leucemia; leucócitos interferão alfa; leuprolide + estrogênio + progesterona; leuprorrelina; levamisol; liarozole; análogo de poliamina linear; peptídeo dissacarídeo lipofílico; compostos de platina lipofílicos; lissoclinamida 7; lobaplatina; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecano; lutécio texafirina; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspin; inibidores de matrilisina; inibidores de metaloproteinase de matriz; menogaril; merbarona; meterelin; metioninase; metoclopramida; Inibidor MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN de cadeia dupla incompatível; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafide; fator saporina de crescimento de fibroblastos mitotoxina; mitoxantrona; mofarotene; molgramostim; anticorpo monoclonal, gonadotrofina coriónica humana; monofosforil-lípido A + sk da parede celular de miobactérias; mopidamol; inibidor de gene de resistência a múltiplas drogas; terapia de base 1 supressora de tumores múltiplos; agente anticancerígeno de mostarda; micaperóxido B; extracto de parede celular micobacteriana; miriaporona; N-acetildinalina; Benzamidas N-substituídas; nafarelin; nagrestip; naloxona + pentazocina; napavin; nafterpin; nartograstim; nedaplatina; nemorubicina; ácido neridrónico; endopeptidase neutra; nilutamide; nisamicin; moduladores de óxido nítrico; antioxidante nitróxido; nitrulina; 06-benzilguanina; octreotide; oquicenona; oligonucleotídeos; onapristona; ondansetron; ondansetron; oracin; indutor de citocinas orais; ormaplatina; osaterona; oxaliplatina; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargase; peldesina; polissulfato de pentosano de sódio; pentostatina; pentrozole; perflubron; pertosfamida; álcool perilico; fenazinomicina; fenilacetato; inibidores de fosfatase; picibanil; cloridrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inibidor do ativador do plasminogénio; complexo de platina; compostos de platina; complexo de platina-triamina; porfimero de sódio; portiromicina; prednisona; propil-bis-acridona; prostaglandina J2; inibidores de proteassoma; modulador imune de base A de proteína; inibidor de proteína-quinase C; inibidores da proteína-quinase C, microalgal; inibidores de tirosina-fosfatase de proteína; inibidores de fosforilase de nucleósido purina; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietileno de hemoglobina piridoxilada; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetron; inibidores de ras farnesil-transferase de proteínas; inibidores de ras; inibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; rénio Re 186 etidronato; rizoxina; ribozimas; Retinamida RII; rogletimida; roituquina; romurtide; roquinimex; rubiginona Bl; ruboxilo; safingol; saintopin; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; mimeses de Sdi 1; semustina; inibidor 1 derivado de senescência; oligonucleidos de sentido; inibidores de transdução de sinal; moduladores da transdução do sinal; proteína de ligação ao antígeno de cadeia simples; sizofirano; sobuzoxano; borocaptato de sódio; fenilacetato de sódio; solverol; proteína de ligação a somatomedin; sonermin; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; splenopentin; espongistatina 1; esqualamina; inibidor de células estaminais; inibidores da divisão de células estaminais; estipiamida; inibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista peptidico intestinal vasoativo hiperativo; suradista; suramin; suainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; talimustina; metiodeto de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalan de sódio; tegafur; telurapirilium; inibidores de telomerase; temoporfina; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoietina; mimético de trombopoietina; timalfasina; agonista do recetor de timopoietina; timotrinan; hormona estimuladora da tireoide; etiopurpurina etílica de estanho; tirapazamina; bicloreto de titanoceno; topsentin; toremifeno; fator de células estaminais totipotentes; inibidores de tradução; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorrelina; tropisetron; turosterida; inibidores de tirosina-cinase; tirfostinas; Inibidores de UBC; ubenimex; fator inibidor do crescimento derivado de seio urogenital; antagonistas do recetor de uroquinase; vapreotido; variolina B; sistema de vector, terapia de gene de eritrócitos; velaresol; veramina; verdins; verteporfin; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatina; zilascorb; e zinostatina stimalamer. Fármacos anticancro adicionais preferidos são o 5-fluorouracilo e leucovorina.

Os exemplos de anticorpos terapêuticos que podem ser utilizados nos métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suíça), que é um imunossupressor, anticorpo monoclonal anti-CD25 humanizado, para a prevenção de rejeição de enxertos por insuficiência renal aguda; PANOREX™, que é um anticorpo de IgG2a do antigeno da superfície celular anti-17-IA de murino (Glaxo Wellcome / Centocor) ; BEC2 que é um anticorpo de IgG anti-idiotipo de murino (epitopo GD3) (ImClone System); IMC-C225 que um anticorpo de IgG anti-EGFR quimérico (ImClone System); VITAXIN™, que é um anticorpo de integrina humanizado anti-od/^3 (Applied Molecular Evolution/Medlmmune); SmartM195 é um anticorpo de IgG anti-CD33 humanizado (Protein Design Lab / Kanebo); LYMPHOCIDE™, que é um anticorpo de IgG anti-CD22 humanizado (Immunomedics); ICM3 é um anticorpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 é um anticorpo anti-CD80 primatizado (IDEC Pharm / Mitsubishi); IDEC-131 é um anticorpo humanizado anti-CD40L (IDEC / Eisai); IDEC-151 é um anticorpo anti-CD4 primatizado (IDEC); IDEC-152 é um anticorpo anti-CD23 primatizado (IDEC / Seikagaku); SMART Anti-CD3 é um anticorpo humanizado anti-CD3 de IgG (Protein Design Lab); 5G1.1 é um anticorpo de fator anti-complemento humanizado 5 (C5) (Alexion Pharm); D2E7 é um anticorpo humanizado anti-TNF-α (CAT/BASF); CDP870 é um frgamento anti-TNF-α Fab humanizado (Celltech); IDEC-151 é um anticorpo anti-CD4 de IgGl primatizado (IDEC Pharm / SmithKline Beecham); MDX-CD4 é um anticorpo de IgG humana anti-CD4 (Medarex / Eisai / Genmab); CDP571 é um anticorpo anti-TNF-cflde IgG4 humanizado (Celltech); LDP-02 é um anticorpo humanizado anti-a4p7 (LeukoSite / Genentech); Orthoclone 0KT4A é um anticorpo anti-CD4 de IgG humanizado (Ortho Biotech); ANTOVA™ é um anticorpo de IgG humanizado anti-CD40L (Biogen); ANTEGREN™ é um anticorpo anti-VLA-4 de IgG humanizado (Elan); e CAT-152 é um anticorpo anti-TGF-p2 humano (Cambridge Ab Tech). Outros exemplos de anticorpos terapêuticos que podem ser utilizados de acordo com a invenção são apresentados na Tabela 9.

5.4.2 DOENÇAS AUTOIMUNES E DOENÇAS INFLAMATÓRIAS

As moléculas aqui descritas compreendem uma região de Fc variante, possuindo uma ou mais modificações de aminoácidos numa ou mais regiões, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIB mas diminui a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA. As moléculas com estas características de ligação são úteis na regulação da resposta imunitária, por exemplo, na inibição da resposta imunitária em relação com as doenças autoimunes ou doenças inflamatórias. Embora não se pretenda estar limitado por qualquer mecanismo de ação, as moléculas com uma afinidade melhorada para FcyRIIB e uma afinidade diminuída para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA podem conduzir a amortecimento da resposta de ativação para FcyR e inibição da capacidade de resposta celular.

Uma molécula compreendendo uma região de Fc variante não é uma imunoglobulina, e compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos, modificação essa que aumenta a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIB relativamente a uma molécula compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem. Noutros exemplos, a referida molécula compreende ainda uma ou mais modificações de aminoácidos, modificações essas que diminuem a afinidade da molécula para um FcyR de ativação. Em alguns exemplos, a molécula é uma região de Fc solúvel (isto é, não ligada à membrana). A divulgação contempla outras modificações de aminoácidos no interior da região de Fc solúvel que modulam a sua afinidade para vários recetores de Fc, incluindo os que são conhecidos para um perito na arte tal como aqui descrito. Noutros exemplos, a molécula (por exemplo, a região de Fc compreendendo pelo menos uma ou mais modificações de aminoácidos) é modificada usando técnicas conhecidas de um perito na arte e como aqui descrito para aumentar a meia vida in vivo da região de Fc. Essas moléculas têm utilidade terapêutica no tratamento e/ou prevenção de uma doença autoimune. Embora não se pretenda estar limitado por qualquer mecanismo de ações, tais moléculas com afinidade melhorada para FcyRIIB levarão a um amortecimento dos recetores de ativação e, assim, a um amortecimento da resposta imunitária e têm eficácia terapêutica para o tratamento e/ou prevenção de uma doença autoimune.

As uma ou mais modificações de aminoácidos aqui divulgadas, que aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIB mas diminuem a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA compreendem uma substituição na posição 246 por treonina e na posição 396 por histidina; ou uma substituição na posição 268 por ácido aspártico e na posição 318 por ácido aspártico; ou uma substituição na posição 217 por serina, na posição 378 por valina, e na posição 408 por arginina; ou uma substituição na posição 375 por cisteina e na posição 396 por leucina; ou uma substituição na posição 246 por isolcucina e na posição 334 por asparagina. A uma ou mais modificações de aminoácidos aqui divulgadas, que aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIB mas diminuem a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA compreendem uma substituição na posição 247 por leucina. Noutro exemplo, a uma ou mais modificações de aminoácidos, que aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIB mas diminuem a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA compreendem uma substituição na posição 372 por tirosina. Ainda noutro exemplo, a uma ou mais modificações de aminoácidos, que aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIB mas diminuem a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA compreendem uma substituição na posição 326 por ácido glutâmico. Num exemplo, a uma ou mais modificações de aminoácidos, que aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIB mas diminuem a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA compreendem uma substituição na posição 224 por leucina.

As regiões de Fc variantes que possuem uma afinidade melhorada para FcyRIIB e uma afinidade diminuída para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem, podem ser utilizadas para tratar ou prevenir doenças autoimunes ou doenças inflamatórias. A presente invenção proporciona métodos para prevenir, tratar, ou controlar um ou mais sintomas associados com uma desordem autoimune ou inflamatória num indivíduo, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma ou mais moléculas da presente invenção com as regiões de Fc variantes que possuem uma afinidade melhorada para FcyRIIB e uma afinidade diminuída para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. A divulgação também proporciona métodos para a prevenção, tratamento ou controlo de um ou mais sintomas associados com uma doença inflamatória num indivíduo, que compreende ainda, a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais agentes anti-inflamatórios. A divulgação também fornece métodos para a prevenção, tratamento ou controlo de um ou mais sintomas associados com uma doença autoimune que compreende ainda, a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais agentes imunomoduladores. A Secção 5.4.2.1 fornece exemplos não limitativos de agentes anti-inflamatórios e agentes imunomoduladores.

Exemplos de doenças autoimunes que podem ser tratadas através da administração de moléculas da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome de antifosfolípidos, doença autoimune de Addison, doenças autoimunes da glândula supra-renal, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, ooforite autoimune e orquite, trombocitopenia autoimune, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, doença celíaca-dermatite, fadiga crónica síndrome de disfunção imune (CFIDS), polineuropatia inflamatória desmielinizante crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatrical, síndrome CREST, doença de aglutinina, doença de Crohn, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndroma de Guillain-Barre, tiroidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, trombocitopenia idiopática púrpura (ITP), neuropatia de IgA, artrite juvenil, líquen plano, lupus eritematoso, doença de Ménière, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, diabetes tipo 1 ou mellitus imunomediada, miastenia gravis, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliartrite nodosa, policrondrite, sindromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artrite reumatoide, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjõgren, síndrome de stiff-man, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso, artrite de Takayasu, artrite temporal/ arterite de células gigantes, colite ulcerativa, uveite, vasculites tais como vasculite herpetiforme dermatite, vitiligo e granulomatose de Wegener. Exemplos de doenças inflamatórias incluem, mas não estão limitados a, asma, encefalite, doença inflamatória do intestino, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), doenças alérgicas, choque sético, fibrose pulmonar, espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenciada, artrite, osteólise inflamatória, e inflamação crónica resultante de infeções virais ou bacterianas crónicas. Tal como aqui descrito na Secção 2.2.2, algumas doenças autoimunes estão associadas com uma condição inflamatória. Assim, existe uma sobreposição entre o que é considerado uma doença autoimune e uma doença inflamatória. Portanto, algumas doenças autoimunes podem também ser caracterizadas como doenças inflamatórias. Exemplos de doenças inflamatórias que podem ser prevenidas, tratadas ou controladas de acordo com os métodos divulgados incluem, mas não estão limitados a, asma, encefalite, doença inflamatória do intestino, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), doenças alérgicas, choque sético, fibrose pulmonar, espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenciada, artrite, osteólise inflamatória, e inflamação crónica resultante de infeções virais ou bacterianas crónicas.

As moléculas com regiões de Fc variantes que possuem uma afinidade melhorada para FcyRIIB e uma afinidade diminuída para FcyRIIIA em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem podem também ser usadas para reduzir a inflamação experimentada por animais, particularmente mamíferos, com doenças inflamatórias. Num exemplo especifico, uma molécula reduz a inflamação num animal em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, ou pelo menos 10% relativamente à inflamação num animal, que não é administrado com a referida molécula.

As moléculas com regiões de Fc variantes que possuem uma afinidade melhorada para um FcyRIIB e afinidade reduzida para FcyRIIIA em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem podem também ser utilizadas para prevenir a rejeição de transplantes. A divulgação contempla ainda a manipulação de qualquer anticorpo conhecido na arte para o tratamento e/ou prevenção de doença autoimune ou doença inflamatória, de modo que os anticorpos compreendem uma região de Fc variante compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos, que tenham sido identificadas pelos métodos da invenção como tendo uma afinidade melhorada para FcyRIIB e uma afinidade diminuída para FcyRIIIA em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Um exemplo não limitativo dos anticorpos que são utilizados para o tratamento ou prevenção de doenças inflamatórios que podem ser manipulados de acordo com a invenção está apresentado na Tabela 10A, e um exemplo não limitativo dos anticorpos que são utilizados para o tratamento ou prevenção de doenças autoimune é apresentada na Tabela 10B.

5.4.2.1 AGENTES IMUNOMODULADORES E AGENTES ΑΝΤΙ— INFLAMATÓRIOS A presente divulgação proporciona métodos de tratamento de doenças autoimunes e doenças inflamatórias compreendendo a administração das moléculas com regiões de Fc variantes com uma afinidade aumentada para FcyRIIB e uma afinidade diminuída para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA em conjunto com outros agentes de tratamento. Exemplos de agentes imunomoduladores incluem, mas não estão limitados a, metotrexato, ENBREL, REMIGADE™, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A, e antibióticos macrolidos (por exemplo, FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP), corticosteróides, esteróides, micofenolato de mofetil, rapamicina (sirolimus), mizoribina, desoxiespergualina, brequinar, malononitriloamindes (por exemplo, leflunamide), moduladores de recetores de células T, e moduladores do recetor de citocina.

Os agentes anti-inflamatórios exibiram sucesso no tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes e são agora um tratamento comum e padrão para tais distúrbios. Qualquer agente anti-inflamatório bem conhecido para um perito na arte pode ser utilizado nos métodos da invenção. Exemplos não limitativos de agentes anti-inflamatórios incluem fármacos não-esteroides anti-inflamatórios (NSAIDs), fármacos anti-inflamatórios esteróides, beta-agonistas, agentes anticolingéricos, e metil-xantinas. Exemplos de NSAIDs incluem, mas não estão limitados a, aspirina, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX™), diclofenac (VOLTAREN™), etodolac (LODINE™), fenoprofeno (NALFON™), indometacina (INDOCIN™), lcetoralac (TORADOL™), oxaprozina (DAYPRO™), nabumentona (RELAFEN™), sulindac (CLINORIL™), tolmentin (TOLECTIN™), rofecoxib (VIOXX™) , naproxeno (ALEVE™, NAPROSYN™), cetoprofeno (ACTRON™) e nabumetona (RELAFEN™). Tais NSAIDs funcionam através da inibição de uma enzima ciclooxgenase (por exemplo, COX-1 e/ou COX-2). Exemplos de fármacos anti-inflamatórios esteróides incluem, mas não estão limitados a, glucocorticóides, dexametasona (DECADRON™), cortisona, hidrocortisona, prednisona (DELTASONE™), prednisolona, triamcinolona, azulfidina, e os eicosandides, tais como prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos.

5.4.3 DOENÇAS INFECCIOSAS São aqui divulgados métodos para o tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa num indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma ou mais moléculas da invenção. As doenças infecciosas que podem ser tratadas ou prevenidas pelas moléculas da invenção, são causadas por agentes infecciosos, incluindo mas não se limitando a vírus, bactérias, fungos, protozae e vírus.

As doenças virais que podem ser tratadas ou prevenidas utilizando as moléculas da invenção em conjunto com os métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitadas às causadas por hepatite tipo A, hepatite tipo B, hepatite do tipo C, influenza, varicela, adenovirus, herpes simples tipo I (HSV-I), herpes simples tipo II (HSV-II), peste bovina, rinovirus, ecovírus, rotavirus, vírus respiratório sincicial, vírus do papiloma, vírus papova, citomegalovírus, equinovírus, arbovirus, huntavírus, vírus coxsackie, vírus da papeira, vírus do sarampo, vírus da rubéola, vírus da poliomielite, varíola, vírus de Epstein-Barr, vírus da imunodeficiência humana tipo I (HIV-I), o vírus da imunodeficiência humana tipo II (HIV-II), e agentes de doenças virais, tais como meningite virai, encefalite, dengue ou a varíola.

As doenças bacterianas que podem ser tratadas ou prevenidas utilizando as moléculas da invenção em conjunto com os métodos aqui descritos, que são causadas por bactérias incluem, mas não estão limitadas a, rickéttsia de micobactérias, micoplasma, Neisseria, S. pneumonia, Borrelia burgdorferi (doença de Lyme), Bacillus antracis (antraz), tétano, estreptococos, estafilococos, micobactérias, tétano, pertissus, cólera, peste, difteria, clamidia, S. aureus e legionela.

As doenças por protozoários que podem ser tratadas ou prevenidas utilizando as moléculas da invenção em conjunto com os métodos aqui descritos, que são causadas por protozoários incluem, mas não estão limitadas a, Leishmania, kokzidioa, Trypanosoma ou malária.

As doenças parasitárias que podem ser tratadas ou prevenidas utilizando as moléculas da invenção em conjunto com os métodos aqui descritos, que são causadas por parasitas incluem, mas não estão limitadas a, clamidia e Rickéttsia.

De acordo com um aspeto da invenção, as moléculas da invenção compreendendo regiões de Fc variantes têm uma função efetora do anticorpo aumentada para um agente infeccioso, por exemplo, uma proteina patogénica, em relação a uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem. Exemplos de agentes infecciosos incluem, mas não estão limitados a bactérias (por exemplo, Esclaerichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecials, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans, e Pseudomonas aeruginosa) , um agente patogénico (por exemplo, B-linfotrópico papovavirus (LPV); Bordatella pertussis; virus da doença de Boma (BDV); coronavirus bovino; vírus

Coriomeningite; virus da dengue, um vírus E. coli; Ébola; Echovirus 1; Echovirus-11 (EV); endotoxina (LPS); bactérias entéricas; vírus órfão entérico; enterovirus; vírus da leucemia felina; vírus da doença de pé e boca; vírus da leucemia do macaco Gibbon (GALV); bactérias Gram-negativas; Helicobacter pylori; vírus da hepatite B (VHB); vírus Herpes Simples; HIV-1; citomegalovirus humano; coronavirus humano; Influenza A, B e C; Legionela; Leishmania mexicana; Listeria monocitogenes; vírus do sarampo; meningocócicas; Morbillivirus; vírus da hepatite de rato; vírus da leucemia murina; murino vírus herpes gama; retrovirus murino; coronavirus murino; vírus da hepatite do ratinho; Micobactéria avium-M; Neisseria gonorrhoeae; Vírus da doença de Newcastle; Parvovirus B 19; Plasmodium falciparum; Pox Virus; Pseudomonas; Rotavirus; Samonella typhiurium; Shigella; estreptococos; vírus linfotrópico 1 das células T; Virus vaccinia).

Numa forma de realização específica, as moléculas da invenção aumentam a eficácia do tratamento de uma doença infecciosa, aumentando a fagocitose e/ou opsonização do agente infeccioso que causa a doença infecciosa. Numa outra forma de realização específica, as moléculas da invenção aumentam a eficácia do tratamento de uma doença infecciosa, melhorando a ADCC das células infetadas que causam a doença infecciosa.

Em algumas formas de realização, as moléculas da invenção podem ser administradas em combinação com uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, conhecidos dos peritos na arte para o tratamento e/ou prevenção de uma doença infecciosa. A invenção contempla a utilização das moléculas da presente invenção em combinação com antibióticos conhecidos dos peritos na arte para o tratamento e ou prevenção de uma doença infecciosa. Os antibióticos que podem ser utilizados em combinação com as moléculas da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, macrólidos (por exemplo, tobramicina (Tobi®)), uma cefalosporina (por exemplo, cefalexina (Keflex®), cefradina (Velosef®), cefuroxima (Ceftin®), cefprozil (Cefzil®), cefaclor (Ceclor®), cefixima (Suprax®) ou cefadroxil (Duricef®)), uma claritromicina (por exemplo, claritromicina (Biaxin®)), uma eritromicina (por exemplo, eritromicina (EMycin ®)), uma penicilina (por exemplo, penicilina V (V-Cillin K® ou Pen Vee K®)) ou uma quinolona (por exemplo, a ofloxacina (Floxin®), a ciprofloxacina (Cipro®) ou norfloxacina (Noroxin®)), antibióticos aminoglicosideos (por exemplo, apramicina, arbelcacin, bambermicinas, Butirosina, dibelcacin, neomicina, neomicina, undecilenato, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina, e espectinomicina), antibióticos anfenicol (por exemplo, azidamfenicol, cloranfenicol, florfenicol, tianfenicol), e antibióticos de ansamicina (eg, rifamide e rifampicina), carbacefemas (por exemplo, loracarbef), carbapenens (por exemplo, Biapenem e imipenem), cefalosporinas (e.g., cefaclor, cefadroxil, cefamandole, cefatrizina, cefazedona, cefozopran, cefpimizole, cefpiramida e cefpirome), cefamicinas (eg, cefbuperazona, cefmetazole, e cefminox), monobactamas (por exemplo, aztreonam, carumonam, e tigemonam), oxacefemas (por exemplo, flomoxef, e moxalactama), penicilinas (por exemplo, amdinocillin, amdinocillin pivoxil, amoxicilina, bacampicilina, ácido benzilpenicilínico, benzilpenicilina de sódio, epicilina, fenbenicillin, floxacillin, penamccillin, iodidrato de penetamato, obenetamina penicilina, penicilina 0, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina, e phencihicillin de potássio), as lincosamidas (por exemplo, clindamicina, lincomicina e), amfomicinas, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (por exemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina, e demeclociclina), 2,4-diaminopirimidinas (por exemplo, brodimoprim), nitrofuranos (por exemplo, furaltadona, cloreto e furazolium), quinolonas e análogos (por exemplo, cinoxacina" clinafloxacina, flumequina, e grepagloxacina), sulfonamidas (por exemplo, acetil suitametoxipirazina, benzilsulfamida, noprilsulfamida, fthalilsulfacetamida, suitacrisoidina, e sulfacitina), sulfonas (por exemplo, diatimosulfona, glucosulfona de sódio, e solasulfona), cicloserina, mupirocina e tuberina.

As moléculas aqui divulgadas podem ser administradas em combinação com uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais agentes antifúngicos. Os agentes antifúngicos que podem ser utilizados em combinação com as moléculas da presente invenção incluem, mas não estão limitados a anfotericina B, itraconazol, cetoconazol, fluconazol, intratecal, flucitosina, miconazol, butoconazole, clotrimazole, nistatina, terconazol, tioconazol, ciclopirox, econazole, haloprogrin, naftifina, terbinafina, undecilanato e griseofuldin.

As moléculas aqui divulgadas podem ser administradas em combinação com uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais agentes antivirais. Agentes antivirais úteis que podem ser utilizados em combinação com as moléculas da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, inibidores da protease, inibidores da transcriptase reversa de nucledsidos, inibidores de transcriptase reversa de não-nucleósidos e análogos de nucledsidos. Exemplos de agentes antivirais incluem, mas não se limitam a zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, e ribavirina, bem como foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, ritonavir, os interferões alfa; adefovir, clevadina, entecavir, pleconaril.

5.5 TERAPIA DE VACINAS A invenção abrange ainda a utilização de uma composição da invenção para induzir uma resposta imunitária contra um agente imunogénico ou antigénico, incluindo mas não se limitando a antigenos de cancro e antigenos de doenças infecciosas (exemplos dos quais são divulgados infra) . As composições de vacina da invenção compreendem um ou mais agentes antigénicos ou imunogénicos para os quais uma resposta imunitária é desejada, em que o um ou mais agentes antigénicos ou imunogénicos é revestido com um anticorpo variante da invenção que tem uma afinidade melhorada para FcyRIIIA. Embora não se pretenda estar limitado por um mecanismo de ação particular, o revestimento de um agente antigénico ou imunogénico com um anticorpo variante da invenção que tem uma afinidade melhorada para FcyRIIIA, melhora a resposta imunitária ao agente antigénico ou imunogénico desejado através da indução humoral e respostas mediadas por células. As composições de vacina da invenção são particularmente eficazes na indução de uma resposta imunitária, de preferência uma resposta imunitária protetora contra o agente antigénico ou imunogénico.

Em algumas formas de realização, o agente antigénico ou imunogénico nas composições de vacina da invenção compreendem um vírus contra o qual uma resposta imunitária é desejada. Os vírus podem ser recombinantes ou quiméricos, e são de preferência atenuados. A produção de vírus recombinantes, quiméricos, e atenuados pode ser realizada utilizando métodos padrão conhecidos dos peritos na arte. A presente invenção abrange uma vacina virai recombinante viva ou uma vacina virai recombinante inativada a ser formulada em conformidade com a invenção. Uma vacina viva pode ser preferida porque a multiplicação no hospedeiro leva a um estímulo prolongado de tipo e magnitude semelhante à que ocorre em infeções naturais e, por conseguinte, confere uma imunidade substancial de longa duração. A produção de tais formulações de vacina de vírus recombinante viva pode ser realizada utilizando métodos convencionais envolvendo a propagação do vírus em cultura celular ou no alantoide do embrião de galinha seguido por purificação.

Numa forma de realização especifica, o vírus recombinante é não patogénico para o indivíduo ao qual é administrado. A este respeito, o uso de vírus geneticamente modificados para fins de vacina pode requerer a presença de características de atenuação nestas estirpes. A introdução de mutações adequadas (por exemplo, deleções) nos moldes utilizados para transfecção pode proporcionar os novos vírus com caracteristicas de atenuação. Por exemplo, as mutações de sentido trocado específicas que estão associadas com sensibilidade à temperatura ou adaptação a frio podem ser feitas em mutações de deleção. Estas mutações deveriam ser mais estáveis do que as mutações pontuais associadas com mutantes frios ou sensíveis à temperatura e as frequências de reversão devem ser extremamente baixas. Tecnologias de ADN recombinante para a manipulação de vírus recombinantes são conhecidas na arte e englobadas na presente invenção. Por exemplo, técnicas para a modificação de vírus de ARN de cadeia negativa são conhecidas na arte, ver, por exemplo, Patente nos EUA n° 5,166,057.

Em alternativa, os vírus quiméricos com características "suicidas" podem ser construídos para utilização nas formulações de vacina intradérmicas da invenção. Tais vírus passariam por apenas uma ou algumas rodadas de replicação dentro do hospedeiro. Quando utilizado como uma vacina, o vírus recombinante passaria por ciclo (s) de replicação limitado(s) e induziria um nível suficiente da resposta imune, mas não iria mais longe no hospedeiro humano e causar uma doença. Alternativamente, o vírus inativado (morto) pode ser formulado de acordo com a invenção. Formulações de vacinas inativadas podem ser preparadas utilizando técnicas convencionais para "matar" os vírus quiméricos. As vacinas inativadas estão "mortas" no sentido em que a sua infetividade foi destruída. Idealmente, a infetividade do vírus é destruída sem afetar a sua imunogenicidade. De modo a preparar vacinas inativadas, o vírus quimérico pode ser cultivado em cultura celular ou no alantoide de embrião de galinha, purificado por ultracentrifugação zonal, inativado por formaldeído ou β-propiolactona, e reunidas.

Em certas formas de realização, epítopos completamente estranhos, incluindo antígenos derivados de outros agentes patogénicos virais ou não virais podem ser manipulados no vírus para utilização nas formulações de vacina intradérmica da invenção. Por exemplo, os antígenos de vírus não relacionados, tais como HIV (gpl60, gpl20, gp41), antígenos de parasitas (por exemplo, malária) , antígenos bacterianos ou fúngicos ou antígenos tumorais podem ser manipulados para a estirpe atenuada.

Quase qualquer sequência do gene heterólogo pode ser construída no vírus quimérico da invenção para utilização em formulações de vacinas intradérmicas. De preferência, as sequências de genes heterólogos são porções e peptídeos que atuam como modificadores da resposta biológica. De um modo preferido, epitopos que induzem uma resposta imunitária protetora para qualquer de uma variedade de agentes patogénicos, ou antígenos que se ligam a anticorpos neutralizantes podem ser expressos por, ou como parte dos vírus quiméricos. Por exemplo, sequências de genes heterólogos que podem ser construídas nos vírus quiméricos da invenção incluem, mas não estão limitadas a, influenza e parainfluenza de hemaglutinina neuraminidase e glicoproteínas de fusão tais como os genes HN e F de PIV3 humano. Ainda noutra forma de realização, as sequências de genes heterólogos que podem ser manipuladas para os vírus quiméricos incluem as que codificam proteínas com atividades de imunomodulação. Exemplos de proteínas de imunomodulação incluem, mas não estão limitadas a, citoquinas, interferão tipo 1, interferão gama, fatores de estimulação de colónias, interleucina -1, -2, -4, -5, -6, -12, e antagonistas destes agentes.

Ainda em outras formas de realização, a invenção abrange células ou vírus patogénicos, de preferência vírus atenuados, que expressam a variante de anticorpo na sua superfície.

Em formas de realização alternativas, as composições de vacina da invenção compreendem um polipeptídeo de fusão em que um agente imunogénico ou antigénico está operacionalmente ligado a um anticorpo variante da invenção que tem uma afinidade melhorada para FcyRIIIA. A manipulação de polipeptídeos de fusão para utilização nas composições de vacina da invenção é realizada usando métodos de tecnologia de ADN recombinante de rotina e está dentro do nível de perícia vulgar. A invenção abrange ainda métodos para induzir tolerância num indivíduo por administração de uma composição da invenção. De preferência, uma composição adequada para a indução de tolerância num indivíduo, compreende um agente antigénico ou imunogénico revestido com um anticorpo variante da invenção, em que a variante de anticorpo tem uma maior afinidade para FcyRIIB. Apesar de não ser a intenção ficar ligado a um mecanismo de ação particular, essas composições são eficazes na indução de tolerância pela ativação da via inibitória mediada por FcyRIIB.

5.6 COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO A invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo as moléculas da invenção (ou seja, anticorpos, polipeptídeos) que compreendem regiões de Fc variantes. São aqui divulgados métodos de tratamento, profilaxia e melhoria de um ou mais sintomas associados com uma doença, distúrbio ou infeção por administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão ou uma molécula conjugada da invenção, ou uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de fusão ou uma molécula conjugada da invenção. Num aspeto preferido, um anticorpo, uma proteína de fusão, ou uma molécula conjugada, está substancialmente purificada (isto é, substancialmente livre de substâncias que limitam o seu efeito ou produzem efeitos secundários indesejáveis). Num exemplo específico, o indivíduo é um animal, de preferência um mamífero tal como um não primata (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, cães, gatos, ratos, etc.) e um primata (por exemplo, macacos, tais como, um macaco cynomolgous e um ser humano). Numa forma de realização preferida, o indivíduo é um ser humano. Ainda noutro exemplo preferido, o anticorpo da presente invenção é da mesma espécie que o indivíduo. Vários sistemas de libertação são conhecidos e podem ser utilizados para administrar uma composição compreendendo as moléculas da invenção (isto é, anticorpos, polipeptídeos), compreendendo regiões variantes de Fc, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartícuias, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o anticorpo ou proteína de fusão, endocitose mediada pelo recetor (Ver, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), a construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retroviral ou outro, etc. Os métodos de administração de uma molécula incluem, mas não estão limitados à administração parentérica (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea e intravenosa), epidural, e mucosal (por exemplo, intranasal e oral). Num exemplo específico, as moléculas são administradas por via intramuscular, por via intravenosa, ou por via subcutânea. As composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administrados conjuntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistémica ou local. Além disso, a administração pulmonar também pode ser empregue, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e a formulação com um agente de formação de aerossóis. Ver, por exemplo, as Patentes nos EUA n° 6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; e 4,880,078; e Publicações de PCT n° WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; e WO 99/66903. A invenção também prevê que as moléculas da presente invenção (isto é, anticorpos, polipeptideos) que compreendem as regiões de Fc variantes, sejam embaladas num recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade de anticorpo. Numa forma de realização, as moléculas da invenção são fornecidas como um pó liofilizado seco esterilizado ou concentrado isento de água numa embalagem hermeticamente fechada, e podem ser reconstituídas, por exemplo, com água ou solução salina até à concentração apropriada para administração a um indivíduo. De preferência, as moléculas da invenção são fornecidas como um pó seco liofilizado estéril numa embalagem hermeticamente fechada, a uma unidade de dosagem de pelo menos 5 mg, mais preferencialmente pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg ou pelo menos 75 mg. As moléculas liofilizadas da invenção devem ser armazenadas a entre 2 e 8 °C na sua embalagem original e as moléculas devem ser administradas dentro de 12 horas, preferivelmente dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas, ou dentro de 1 hora depois de serem reconstituídas. Numa forma de realização alternativa, as moléculas da invenção são fornecidas na forma líquida num recipiente hermeticamente fechado, indicando a quantidade e a concentração da molécula, proteína de fusão, ou molécula conjugada. De preferência, a forma líquida das moléculas da invenção é fornecida numa embalagem hermeticamente fechada, pelo menos, 1 mg/mL, mais preferencialmente pelo menos 2,5 mg/mL, pelo menos 5 mg/mL, pelo menos 8 mg/mL, pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 15 mg/kg, pelo menos, 25 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 150 mg/mL, pelo menos 200 mg/mL das moléculas. A quantidade da composição da invenção que será eficaz no tratamento, prevenção ou melhoria de um ou mais sintomas associados com um distúrbio pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. A dose exata a ser utilizada na formulação também dependerá da via de administração, e da gravidade da condição, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e das circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de ensaio em modelo in vitro ou animal.

Para os anticorpos abrangidos pela presente invenção, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal do paciente. Preferivelmente, a dosagem administrada a um paciente está entre 0,0001 mg/kg e 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 5 mg/kg, 0,0001 e 2 mg/kg, 0,0001 e 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,25 mg/kg, 0,0001 e 0,15 mg/kg, 0,0001 e 0,10 mg/kg, 0,001 e 0,5 mg/kg, 0,01 e 0,25 mg/kg ou 0,01 e 0,10 mg/kg de peso corporal do paciente. Geralmente, os anticorpos humanos apresentam uma semivida mais longa no corpo humano do que os anticorpos de outras espécies, devido à resposta imunitária aos polipeptideos estranhos. Assim, doses mais baixas dos anticorpos humanos e uma administração menos frequente são muitas vezes possíveis. Além disso, a dosagem e frequência de administração dos anticorpos da invenção ou seus fragmentos podem ser reduzidas, aumentando a absorção e penetração no tecido dos anticorpos por meio de modificações, tais como, por exemplo, lipidação.

Numa forma de realização, a dosagem das moléculas da presente invenção administrada a um paciente é de 0,01 mg a 1000 mg/dia, quando usada como terapia de agente único. Numa outra forma de realização as moléculas da invenção são usadas em combinação com outras composições terapêuticas e a dosagem administrada a um paciente é menor do que quando as referidas moléculas são utilizadas como um agente único de terapia.

Num exemplo específico, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da invenção localmente à área com necessidade de tratamento; isto pode ser conseguido, por exemplo, e não como forma de limitação, por infusão local, por injeção, ou por meio de um implante, sendo o referido implante de um material poroso, não-poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas elásticas, ou fibras. De um modo preferido, aquando da administração de uma molécula da invenção, deve ser tomado cuidado para utilizar materiais aos quais a molécula não se absorva.

Numa outra forma de realização, as composições podem ser entregues numa vesícula, em particular um lipossoma (Ver Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al, in

Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova iorque, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327; ver geralmente ibid.).

Ainda noutro exemplo, as composições podem ser entregues num sistema de libertação controlada ou de libertação sustentada. Qualquer técnica conhecida para um perito na arte pode ser utilizada para a produção de formulações de libertação controlada compreendendo uma ou mais moléculas da presente invenção. Ver, por exemplo, Patente nos EUA n° 4,526,938; Publicação de PCT WO 91/05548; Publicação de PCT WO 96/20698; Ning et al.r 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. , 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. , 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; e Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760. Num exemplo, uma bomba pode ser utilizada num sistema de libertação controlada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al. , 1980, Surgery 88:507; e Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574) . Noutro exemplo, materiais poliméricos podem ser usados para alcançar uma libertação controlada dos anticorpos (ver, por exemplo, Medicai Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and

Performance, Smolen and Ball (eds.) , Wiley, Nova iorque (1984); Ranger e Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver também Levy et al. , 1985, Science 228:190; During et al. , 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al. , 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); Patente nos EUA n° 5,679,377; Patente nos EUA n° 5,916,597; Patente nos EUA n° 5,912,015; Patente nos EUA n° 5,989,463; Patente nos EUA n° 5, 128,326; Publicação de PCT n° WO 99/15154; e Publicação de PCT n° . WO 99/20253) . Exemplos de polímeros utilizados em formulações de libertação sustentada incluem, mas não estão limitados a poli(2-hidroxi etil metacrilato), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli (etilene-co-vinil acetato), poli (ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianidras, poli(N-vinil pirrolidona), poli(álcool vinílico), poliacrilamida, poli (etilenoglicol), polilactidos (PLA), poli(lactido-co-glicólidos) (PLGA), e poliortoésteres. Em ainda outro exemplo, um sistema de libertação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo terapêutico (por exemplo, os pulmões), requerendo assim apenas uma fração da dose sistémica (ver, por exemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)) . Noutro exemplo, composições poliméricas úteis como implantes de libertação controlada são utilizadas de acordo com Dunn et al. (Ver U.S. 5, 945, 155) . Este método particular baseia-se no efeito terapêutico da libertação controlada in situ do material bioativo a partir do sistema polimérico. O implante pode ocorrer, geralmente, em qualquer lugar dentro do corpo do paciente em necessidade de tratamento terapêutico. Noutro exemplo, um sistema de libertação sustentada não-polimérico é utilizado, pelo qual um implante não polimérico no corpo do indivíduo é utilizado como um sistema de entrega de fármacos. Após a implantação no corpo, o solvente orgânico do implante irá dissipar-se, dispersar-se ou libertar-se a partir da composição para o liquido de tecido circundante, e o material não polimérico vai gradualmente coagular ou precipitar-se para formar uma matriz sólida microporosa (ver US 5,888,533).

Os sistemas de libertação controlada são discutidos na revisão por Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Qualquer técnica conhecida do perito na arte pode ser utilizada para a produção de formulações de libertação sustentada compreendendo um ou mais agentes terapêuticos da invenção. Ver, por exemplo, Patente nos EUA n° 4,526,938; Publicação Internacional WO 91/05548 e WO 96/20698; Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. 24:853-854; e Lam et al., 1997, Proc. Int'1. Symp. Control Rei. Bioact. Mater. 24:759-760.

Num exemplo especifico em que a composição da presente invenção é um ácido nucleico que codifica um anticorpo, o ácido nucleico pode ser administrado In vivo para promover a expressão do seu anticorpo codificado, construindo-o como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico apropriado e administrando-o para que se torne intracelular, por exemplo, por utilização de um vetor retroviral (ver Patente nos EUA n° 4,980,286), ou por injeção direta, ou pelo uso de bombardeamento com microparticulas (por exemplo, uma pistola de genes; Biolistic, Dupont), ou de revestimento com lipidos ou recetores da superfície celular ou agentes de transfecção, ou administrando-o por ligação a um péptido semelhante a homeobox que é conhecido por entrar no núcleo (Ver, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88: 1864-1868), etc. Em alternativa, um ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado no ADN da célula hospedeira para a expressão por recombinação homóloga.

Para os anticorpos, a dose terapeuticamente ou profilaticamente eficaz administrada a um indivíduo é tipicamente de 0,1 mg/kg a 200 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Preferivelmente, a dosagem administrada a um indivíduo é entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg de peso corporal do indivíduo e mais preferivelmente a dosagem administrada a um indivíduo é de entre 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo. A dosagem e frequência de administração dos anticorpos da invenção podem ser reduzidas também por reforçar a absorção e penetração no tecido (por exemplo, para o pulmão) dos anticorpos ou proteínas de fusão por meio de modificações, tais como, por exemplo, lipidação. O tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de moléculas da presente invenção pode incluir um tratamento único ou, preferencialmente, pode incluir uma série de tratamentos. Num exemplo preferido, um indivíduo é tratado com moléculas da invenção na gama de entre cerca de 0,1 a 30 mg/kg de peso corporal, uma vez por semana durante entre cerca de 1 a 10 semanas, preferivelmente entre 2 a 8 semanas, mais preferencialmente entre cerca de 3 a 7 semanas, e ainda mais preferencialmente durante cerca de 4, 5, ou 6 semanas. Noutros exemplos, as composições farmacêuticas da invenção são administradas uma vez por dia, duas vezes por dia, ou três vezes por dia. Noutras formas de realização, as composições farmacêuticas são administradas uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez de seis em seis semanas, uma vez a cada dois meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano. Será também apreciado que a dosagem eficaz das moléculas utilizadas para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo do curso de um tratamento em particular.

5.6.1 COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

As composições da invenção incluem composições de fármacos a granel, úteis na produção de composições farmacêuticas (composições, por exemplo, impuras ou não estéreis), e composições farmacêuticas (isto é, composições que são adequadas para administração a um indivíduo ou paciente), que podem ser usadas na preparação de formas de dosagem unitária. Tais composições compreendem uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de um agente profilático e/ou agente terapêutico aqui descrito ou uma combinação desses agentes e um veículo farmaceuticamente aceitável. De preferência, as composições da invenção compreendem uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização particular, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas da invenção que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante se liga a FcyRIIIA e/ou FcyRIIA com uma maior afinidade do que uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA e/ou a referida região de Fc variante medeia uma função efetora, pelo menos, 2 vezes mais eficazmente do que uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa outra forma de realização, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas da invenção que compreendem uma região de Fc variante, em que a referida região de Fc variante se liga a FcyRIIIA com uma maior afinidade do que uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIIA, e a referida região de Fc variante se liga a FcyRIIB com uma afinidade mais baixa do que uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem se liga a FcyRIIB, e/ou a referida região de Fc variante medeia uma função efetora, pelo menos, 2 vezes mais eficazmente do que uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa outra forma de realização, as referidas composições farmacêuticas compreendem ainda um ou mais agentes anticancro. A invenção também abrange composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo terapêutico (por exemplo, anticorpo monoclonal específico do tumor) que é especifico para um antígeno particular de cancro, que compreende uma ou mais modificações de aminoácidos na região de Fc, tal como determinado de acordo com a presente invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização específica, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou de um governo estatal ou listado na Farmacopeia dos EUA ou noutra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais, e mais particularmente em humanos. 0 termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente ou veículo com o qual a terapêutica é administrada. Estes veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de origem em petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo. A água é o veiculo preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. As soluções salina e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem também ser empregues como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes molhantes ou emulsionantes, ou agentes tamponantes de pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada e afins.

Geralmente, os ingredientes das composições da invenção são fornecidos separadamente ou misturados numa forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água num recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição é para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água estéril de grau farmacêutico ou soro fisiológico. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

As composições da invenção podem ser formuladas como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam aos formados com aniões tais como os derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc, e os formados com catiões, tais como os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

5.6.2 TERAPIA GENÉTICA

Num exemplo específico, os ácidos nucleicos que compreendem as sequências que codificam as moléculas da invenção, são administrados para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas associados com uma doença, distúrbio ou infeção, por meio de terapia genética. A terapia genética refere-se a terapia realizada pela administração a um indivíduo de um ácido nucleico expresso ou expressável. Os ácidos nucleicos produzem os seus anticorpos codificados ou proteína de fusão que medeiam um efeito terapêutico ou profilático.

Qualquer um dos métodos disponíveis para a terapia genética na arte pode ser utilizado. Exemplos de métodos estão descritos abaixo.

Para revisões gerais dos métodos de terapia génica, ver Goldspiel et al. , 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu e

Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-5996; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; maio de 1993, TIBTECH 11(5): 155-215. Os métodos geralmente conhecidos na arte da tecnologia do ADN recombinante que podem ser utilizados estão descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1993); e Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nova Iorque (1990) .

Num aspeto preferido, uma composição da invenção compreende ácidos nucleicos que codificam um anticorpo, os referidos ácidos nucleicos fazendo parte de um vetor de expressão que expressa o anticorpo num hospedeiro adequado. Em particular, tais ácidos nucleicos possuem promotores, de preferência, os promotores heterólogos, operacionalmente ligados à região de codificação de anticorpo, sendo o referido promotor indutível ou constitutivo, e, opcionalmente, específico do tecido. Numa outra forma de realização particular, as moléculas de ácido nucleico são usadas em que as sequências que codificam o anticorpo e quaisquer outras sequências desejadas são flanqueadas por regiões que promovem a recombinação homóloga num local desejado no genoma, proporcionando assim a expressão intracromossómica do anticorpo que codifica ácidos nucleicos (Roller e Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86:8932-8935; e Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438) .

Num outro aspeto preferido, uma composição da invenção compreende ácidos nucleicos que codificam uma proteína de fusão, os referidos ácidos nucleicos fazendo parte de um vetor de expressão que expressa a proteína de fusão num hospedeiro adequado. Em particular, tais ácidos nucleicos possuem promotores, de um modo preferido, promotores heterólogos ligados operacionalmente à região codificante de uma proteína de fusão, sendo o referido promotor indutivel ou constitutivo, e, opcionalmente, específico do tecido. Numa outra forma de realização particular, as moléculas de ácido nucleico são usadas em que a sequência de codificação da proteína de fusão e quaisquer outras sequências desejadas são flanqueadas por regiões que promovem a recombinação homóloga num local desejado no genoma, proporcionando assim a expressão intracromossómica da proteína de fusão. A entrega dos ácidos nucleicos, num indivíduo pode ser direta, caso em que o indivíduo está diretamente exposto ao ácido nucleico ou vetores de transporte de ácido nucleico, ou indiretamente, caso em que, as células são primeiramente transformadas com os ácidos nucleicos in vitro, em seguida transplantadas para o indivíduo. Estas duas abordagens são conhecidas, respetivamente, como terapia génica in vivo ou ex vivo.

Num exemplo específico, as sequências de ácido nucleico são administradas diretamente in vivo, onde são expressas para produzir o produto codificado. Isto pode ser conseguido por qualquer um dos vários métodos conhecidos na arte, por exemplo, através da sua construção como parte de um vetor de expressão de ácidos nucleicos apropriado e administrando-o para que se tornem intracelulares, por exemplo, por infeção com vetores com defeito, ou retrovirais atenuados ou outros vetores virais (ver Patente nos EUA n° 4,980,286), ou por injeção direta de ADN nu, ou pelo uso de bombardeamento com micropartícuias (por exemplo, uma pistola de genes; Biolistic, Dupont), ou revestimento com lípidos ou recetores da superfície celular ou agentes de transfecção, encapsulação em lipossomas, microparticulas, ou microcápsulas, ou administrando-os em ligação com um péptido que é conhecido por entrar no núcleo, pela sua administração em ligação com um ligante indivíduo a endocitose mediada por recetor (Ver, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432) (que pode ser utilizado para atingir tipos celulares expressando especificamente os recetores), etc. Noutro exemplo, os complexos de ligante de ácidos nucleicos podem ser formados, em que o ligante compreende um péptido virai fusogénico para interromper endossomas, permitindo que o ácido nucleico evite a degradação lisossomal. Ainda noutro exemplo, o ácido nucleico pode ser alvo in vivo para a absorção celular e expressão específica, visando um recetor específico (Ver, por exemplo, publicações de PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; W093/14188; WO 93/20221). Alternativamente, o ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado no ADN da célula hospedeira para expressão, através de recombinação homóloga (Roller e Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86:8932-8935; e Zijlstra et ai., 1989, Nature 342:435-438) .

Numa forma de realização específica, os vetores virais que contêm sequências de ácidos nucleicos que codificam uma molécula da invenção (por exemplo, um anticorpo ou uma proteína de fusão) são usados. Por exemplo, um vetor retroviral pode ser utilizado (Veja-se Miller et ai, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Estes vetores retrovirais contêm os componentes necessários para o acondicionamento correto do genoma virai e integração no ADN da célula hospedeira. As sequências de ácidos nucleicos que codificam o anticorpo ou uma proteína de fusão para ser utilizado em terapia genética são clonados num ou mais vetores, o que facilita o fornecimento da sequência de nucleotideos num indivíduo. Mais detalhes sobre vetores retrovirais podem ser encontrados em Boesen et al, (1994, Biotherapy 6: 291-302), que descreve a utilização de um vector retroviral para entregar o gene mdr 1 para as células estaminais hematopoiéticas, a fim de tornar as células estaminais mais resistentes à quimioterapia. Outras referências que ilustram o uso de vetores retrovirais em terapia genética são: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Klein et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons e Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; e Grossman e Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devei. 3:110-114.

Os adenovirus são outros vetores virais que podem ser utilizados em terapia genética. Os adenovirus são veículos especialmente atraentes de libertação de genes para os epitélios das vias respiratórias. Os adenovirus infetam naturalmente o epitélio respiratório onde causam uma doença moderada. Outros alvos para os sistemas de administração à base de adenovirus são o fígado, o sistema nervoso central, as células endoteliais, e músculo. Os adenovirus têm a vantagem de ser capazes de infetar células que não se dividem. Kozarsky and Wilson (Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503, 1993, apresentam uma revisão da terapia genética baseada em adenovirus. Bout et al., (Human Gene Therapy, 5:3-10, 1994) demonstraram o uso dos vetores de adenovirus para transferência de genes para o epitélio respiratório de macacos rhesus. Outros exemplos do uso de adenovirus em terapia genética podem ser encontrados em Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234; Publicação de PCT n° W094/12649; e Wang et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783. Numa forma de realização preferida, os vetores de adenovirus são utilizados. 0 virus adeno-associado (AAV) também foi proposto para utilização na terapia genética (ver, por exemplo, Walsh et al, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 e Patente nos EUA n° 5,436,146).

Uma outra abordagem para a terapia genética envolve a transferência de um gene para as células em cultura de tecido por métodos tais como eletroporação, lipofeção, transfecção mediada por fosfato de cálcio, ou infeção virai. Geralmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador selecionável para as células. As células são então colocadas sob a seleção para isolar as células que captaram e expressam o gene transferido. Essas células são depois entregues a um indivíduo.

Nesta forma de realização, o ácido nucleico é introduzido numa célula, antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal introdução pode ser efetuada por qualquer método conhecido na arte, incluindo, mas não limitado a, transfecção, eletroporação, microinjeção, infeção com um vetor virai ou bacteriófago, que contém as sequências de ácido nucleico, fusão celular, transferência de genes mediada por cromossomas, transferência de genes medida por microcélulas, fusão de esferoplastos, etc. Várias técnicas são conhecidas na arte para a introdução de genes estranhos em células (Ver, por exemplo, Loeffler e Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618, Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; e Clin. Pharma. Ther. 29: 69-92, 1985) e podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, desde que as funções fisiológicas e de desenvolvimento necessárias das células recetoras não sejam interrompidas. A técnica deve proporcionar uma transferência estável do ácido nucleico à célula, de modo que o ácido nucleico possa ser expresso pela célula e, de preferência ser hereditário e expressável por sua descendência da célula.

As células recombinantes resultantes podem ser entregues a um paciente através de vários métodos conhecidos na arte. As células do sangue recombinantes (por exemplo, as células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas) são de preferência administradas por via intravenosa. A quantidade de células previstas para utilização depende do efeito desejado, do estado do paciente, etc., e pode ser determinada por um perito na arte.

As células em que um ácido nucleico pode ser introduzido para fins de terapia genética englobam qualquer tipo de célula desejado disponível, e incluem, mas não estão limitadas a, células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células do sangue, tais como os linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células estaminais ou progenitoras, em particular células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas, por exemplo, tal como obtido a partir de medula óssea, sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, etc.

Numa forma de realização preferida, a célula utilizada para a terapia genética é autóloga para o indivíduo.

Numa forma de realização em que as células recombinantes são utilizadas na terapia genética, sequências de ácidos nucleicos que codificam um anticorpo ou uma proteína de fusão são introduzidas nas células de modo a que sejam expressáveis pelas células ou sua descendência, e as células recombinantes são então administradas in vivo para o efeito terapêutico. Numa forma de realização especifica, células estaminais ou progenitoras são utilizadas. Quaisquer células estaminais e/ou progenitoras que possam ser isoladas e mantidas in vitro podem potencialmente ser utilizadas de acordo com esta forma de realização da presente invenção (Ver, por exemplo, a Publicação de PCT WO 94/08598; Stemple and Anderson, 1992, Cell 7 1:973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229; e Pittelkow e Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771) .

Numa forma de realização específica, o ácido nucleico a ser introduzido para fins de terapia genética compreende um promotor indutível operativamente ligado à região codificadora, de tal modo que a expressão do ácido nucleico é controlável através do controlo da presença ou ausência do indutor apropriado de transcrição.

5.6.3 KITS É aqui revelado um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com as moléculas da presente invenção (ou seja, os anticorpos, os polipeptídeos compreendendo as regiões de Fc variantes) . Além disso, um ou mais outros agentes terapêuticos ou profiláticos úteis para o tratamento de uma doença, também podem ser incluídos no pacote ou kit farmacêutico. É aqui revelado um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmente associado com tal (tais) recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda para administração humana. São aqui divulgados kits que podem ser utilizados nos métodos acima. Numa forma de realização, um kit compreende uma ou mais moléculas da presente invenção. Noutro exemplo, um kit compreende ainda um ou mais outros agentes terapêuticos ou profiláticos úteis para o tratamento de cancro, num ou mais recipientes. Noutro exemplo, um kit compreende ainda um ou mais anticorpos citotóxicos que se ligam a um ou mais antigenos de cancro associados ao cancro. Em certos exemplos, o outro agente profilático ou terapêutico é um agente quimioterapêutico. Em outras formas de realização, o agente terapêutico ou profilático é um agente terapêutico hormonal ou biológico.

5.7 CARACTERIZAÇÃO E DEMONSTRAÇÃO DE UTILIDADE TERAPÊUTICA Vários aspetos das composições farmacêuticas, ou agentes terapêuticos ou profiláticos da invenção são de preferência testados in vitro, num sistema de cultura de células, e num organismo de modelo animal, tal como um sistema de modelo animal roedor, para a atividade terapêutica desejada antes do uso em seres humanos. Por exemplo, os ensaios que podem ser utilizados para determinar se a administração de uma composição farmacêutica especifica é desejada, incluem ensaios de cultura de células em que uma amostra de tecido do paciente é cultivada em cultura, e exposta a, ou de outra forma em contacto, com uma composição farmacêutica da invenção, e o efeito de tal composição sobre a amostra de tecido é observado. A amostra de tecido pode ser obtida por biópsia do paciente. Este ensaio permite a identificação da(s) molécula(s) profiláctica ou terapêutica terapeuticamente mais eficaz(es) para cada paciente individual. Em várias formas de realização especificas, os ensaios in vitro podem ser realizados com células representativas de tipos celulares envolvidos numa doença autoimune ou inflamatória (por exemplo, células T) , para determinar se uma composição farmacêutica da invenção tem um efeito desejado sobre tais tipos de células.

As combinações de agentes profiláticos e/ou terapêuticos podem ser testadas em sistemas adequados de modelos de animais antes do uso em seres humanos. Tais sistemas de modelo animal incluem, mas não estão limitados a, ratos, ratinhos, frangos, vacas, macacos, porcos, cães, coelhos, etc. Qualquer sistema animal bem conhecido na arte pode ser utilizado. Numa forma de realização especifica da invenção, as combinações de agentes profiláticos e/ou terapêuticos são testadas num sistema de modelo de ratinho. Tais sistemas de modelo são amplamente utilizados e bem conhecidos do perito na arte. Os agentes profiláticos e/ou terapêuticos podem ser administrados repetidamente. Vários aspetos do procedimento podem variar. Os referidos aspetos incluem o regime temporal da administração dos agentes profiláticos e/ou terapêuticos, e se tais agentes forem administrados separadamente ou como uma mistura.

Os modelos animais preferidos para utilização nos métodos da invenção são, por exemplo, os ratinhos transgénicos que expressam FcyRs humanos sobre as células efetoras de ratinho, por exemplo, qualquer modelo de ratinho descrito no documento US 5,877,396 (que é aqui incorporado por referência na sua totalidade) pode ser utilizado na presente invenção. Os ratinhos transgénicos para o uso nos métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a, ratinhos portadores de FcyRIIIA humano; ratinhos portadores de FcyRIIA humano; ratinhos portadores de FcyRIIB humano e FcyRIIIA humano; ratinhos portadores de FcyRIIB humano e FcyRIIA humano.

De preferência, as mutações que mostram os níveis mais elevados de atividade nos ensaios funcionais descritos acima serão testadas para utilização em estudos de modelos de animais antes do uso em seres humanos. Anticorpos que albergam os mutantes de Fc identificados usando os métodos da presente invenção e testados em ensaios de ADCC, incluindo ch4D5 e ch520C9, dois anticorpos anti-Erb-B2 e chCC49, um anticorpo anti-TAG72, são preferidos para utilização em modelos animais uma vez que eles têm sido utilizado anteriormente no modelo de xenoenxerto de ratinho (Hudsiak et al.r 1989, Mol. Cell Biol. 9: 1165-72; Lewis et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-63; Bergman et al., 2001 Clin. Cancer Res. 7: 2050-6; Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 1387-93). Quantidades suficientes de anticorpos podem ser preparadas para utilização em modelos animais utilizando os métodos descritos supra, por exemplo, utilizando sistemas de expressão de mamíferos e métodos de purificação de IgG aqui revelados e exemplificados. Uma experiência típica requer, pelo menos, cerca de 5,4 mg de anticorpo mutante. Este cálculo é baseado na média das quantidades de anticorpos do tipo selvagem necessários para proteger 8-10 30 g de ratos após uma dose de carga de 4 pg/g e uma dose semanal de manutenção, 2 pg/g, durante dez semanas. A invenção abrange linhas de células de tumor como uma fonte para os tumores de xenoenxerto, tais como SK-BR- 3, BT474 e células HT29 que são derivadas de pacientes com adenocarcinoma da mama. Estas células têm tanto Erb-B2 como os recetores de prolactina na sua superfície. As células SK-BR-3 têm sido utilizadas com sucesso tanto em ADCC como em modelos de xenoenxerto de tumor. Noutros ensaios, podem ser usadas células 0VCAR3 derivadas de um adenocarcinoma de ovário humano. Estas células expressam o antígeno TAG72 na superfície da célula e podem ser usadas em conjunto com o anticorpo chCC49. 0 uso de diferentes anticorpos e múltiplos modelos de tumor vai contornar a perda de quaisquer mutações específicas devido a uma incompatibilidade do mutante de Fc específica do anticorpo.

Modelos de xenotransplante de ratinho podem ser utilizados para o estudo da eficácia de anticorpos de ratinho produzidos contra um alvo específico do tumor com base na afinidade e especificidade das regiões CDR da molécula de anticorpo e capacidade da região de Fc do anticorpo para induzir uma resposta imune (Wu et al., 2001, Trends Cell Biol. 11: S2-9). Ratinhos transgénicos que expressam FcyRs humanos em células efetoras de ratinho são únicos e são modelos animais sob medida para testar a eficácia das interações Fc-FcyR humano. Pares de FcyRIIIA, FcyRIIIB e FcyRIIA de linhas de ratinhos transgénicos geradas no laboratório do Dr. Jeffrey Ravetch (Através de um acordo de licenciamento com a Rockefeller U. e Sloan Kettering Cancer Center) podem ser utilizados, tais como os listados na Tabela 11 abaixo.

De preferência mutantes de Fc mostrando tanto aumento da ligação a FcyRIIIA como redução da ligação a FcyRIIB, aumentam a atividade em ensaios de ADCC e fagocitose e são testados em experiências em modelos animais. As experiências com modelos animais examinam o aumento da eficácia de anticorpos portadores de mutantes de Fc em FcyRIIIA transgénico, ratinhos knockout nus mCD16A em comparação com um controlo que foi administrado com o anticorpo nativo. Preferencialmente, grupos de 8-10 ratinhos são examinados usando um protocolo padrão. Uma experiência em modelo animal exemplificativa pode compreender os seguintes passos: num modelo de cancro da mama, ~2 x 106 de células SK-BR-3 são injetadas subcutaneamente no dia 1 com 0,1 mL de PBS misturado com Matrigel (Becton Dickinson). Inicialmente, um anticorpo de tipo selvagem quimérico e isotipo de controlo são administrados para estabelecer uma curva para a dose terapêutica predeterminada, a injeção intravenosa de 4D5 no dia 1 com uma dose inicial de 4 pg/g, seguida de injeções semanais de 2 pg/g. O volume do tumor é monitorizado durante 6-8 semanas para medir o progresso da doença. O volume do tumor deve aumentar linearmente com o tempo em animais injetados com o controlo de isotipo. Em contraste, muito pouco crescimento do tumor deve ocorrer no grupo injetado com 4D5. Os resultados do estudo de dose padrão são usados para definir um limite superior para experiências testando os mutantes de Fc. Estes estudos são feitos com doses subterapêuticas do mutante de Fc contendo anticorpos. Uma dose de um décimo foi utilizada em modelos de xenoenxerto em experiências feitas em ratinhos knockout FcyRIIB, ver Clynes et al. , 2000, Nat. Med. 6: 443-6, com um bloco resultante do crescimento de células tumorais. Uma vez que os mutantes da invenção apresentam de preferência um aumento na ativação de FcyRIIIA e redução na ligação a FcyRIIB, os mutantes são examinados num décimo da dose terapêutica. O exame do tamanho do tumor a intervalos diferentes indica a eficácia dos anticorpos na dose mais baixa. A análise estatística dos dados utilizando o teste t fornece uma maneira de determinar se os dados são significativos. Os mutantes de Fc que mostram um aumento da eficácia são testados em doses mais baixas de forma incremental para determinar a menor dose possível como uma medida da sua eficácia. A atividade anti-inflamatória das terapias de combinação da invenção pode ser determinada utilizando vários modelos animais experimentais de artrite inflamatória conhecida na arte e descrita em Crofford L.J. e Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al. (eds.), Capítulo 30 (Lee e Febiger, 1993). Modelos animais experimentais e espontâneos de artrite inflamatória e doenças reumáticas autoimunes podem também ser utilizados para avaliar a atividade anti-inflamatória das terapias de combinação da invenção. A seguir, alguns ensaios são fornecidos como exemplos, e não por limitação.

Os modelos animais de princípio para a artrite ou doença inflamatória conhecidos na técnica e amplamente utilizados incluem: modelos de ratinho com artrite induzida por adjuvante, modelos de ratinho e rato com artrite induzida por colagénio e modelos de rato, coelho e hamster com artrite induzida por antigeno, todos descritos em Crofford L.J. e Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al. {eds.), Capitulo 30 (Lee e Febiger, 1993), aqui incorporado a titulo de referência na sua totalidade. A atividade anti-inflamatória das terapias de combinação da invenção pode ser avaliada utilizando um modelo de ratinho com artrite induzida por carragenina. A artrite induzida por carragenina também tem sido usada em coelhos, cães e porcos em estudos de artrite crónica ou inflamação. A avaliação quantitativa histomorfométrica é utilizada para determinar a eficácia terapêutica. Os métodos para a utilização de um tal modelo de artrite induzida por carragenina são descritos em Hansra P. et al., "Carrageenan-Induced Arthritis in the Rat," Inflammation, 24(2) : 141-155, (2000) . Também utilizados são os modelos animais de inflamação induzida por zymosan como conhecido e descrito na técnica. A atividade anti-inflamatória das terapias de combinação da invenção pode também ser avaliada medindo a inibição do edema da pata induzido por carragenina no rato, utilizando uma modificação do método descrito em Winter C. A. et al., "Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs" Proc. Soc. Exp. Biol Med. Ill, 544-547, (1962) . Este ensaio tem sido utilizado como um rastreio primário In vivo para a atividade anti-inflamatória da maior parte dos NSAIDs e é considerado preditivo de eficácia humana. A atividade anti-inflamatória do ensaio de agentes profiláticos ou terapêuticos é expressa como a percentagem de inibição do aumento no peso da pata posterior do grupo de ensaio relativamente ao grupo de controlo com veiculo doseados.

Além disso, os modelos animais para a doença inflamatória do intestino podem também ser utilizados para avaliar a eficácia das terapias de combinação da invenção (Kim et al. , 1992, Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537; Strober, 1985, Dig. Dis. Sei. 30(12 Supl):3S-10S). A colite ulcerativa e doença de Crohn são doenças inflamatórias do intestino humano que podem ser induzidas em animais. Polissacáridos sulfatados, incluindo, mas não se limitando a amilopectina, carragenina, sulfato de amilopectina e sulfato de dextrano ou irritantes químicos, incluindo mas não se limitando a ácido trinitrobenzenossulfónico (TNBS) e ácido acético podem ser administrados a animais por via oral para induzir doenças inflamatórias do intestino.

Os modelos animais de doenças autoimunes podem também ser utilizados para avaliar a eficácia das terapias de combinação da invenção. Os modelos animais de doenças autoimunes, tais como a diabetes do tipo 1, autoimunidade da tiroide, lúpus sistémico eruthematosus, e glomerulonefrite e têm sido desenvolvidos (Flanders et al., 1999, Autoimmunity 29:235-246; Krogh et al., 1999, Biochimie 81:511-515; Foster, 1999, Semin. Nephrol. 19:12-24) .

Além disso, quaisquer ensaios conhecidos pelos peritos na arte podem ser usado para avaliar a utilidade profilática e/ou terapêutica das terapias combinatórias aqui divulgadas para doenças autoimunes e/ou doenças inflamatórias. A toxicidade e eficácia dos agentes profiláticos e/ou terapêuticos da presente invenção pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para a determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de doses entre os efeitos tóxico e terapêutico é o indice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Os agentes profiláticos e/ou terapêuticos que exibem índices terapêuticos grandes são preferidos. Embora agentes profiláticos e/ou terapêuticos que exibem efeitos adversos tóxicos possam ser utilizados, deve ser tomado cuidado para conceber um sistema de distribuição que tenha como alvo esses agentes para o local do tecido afetado de forma a minimizar o dano potencial a células não infetadas e, desse modo, reduzir os efeitos secundários.

Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura celular e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem dos agentes profiláticos e/ou terapêuticos para utilização em seres humanos. A dosagem de tais agentes situa-se preferencialmente dentro de uma gama de concentrações em circulação que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer agente usado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura celular. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma gama de concentração no plasma em circulação que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto teste que atinge uma inibição semi-máxima de sintomas), tal como determinado em cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência. A atividade anticancro das terapias utilizadas de acordo com a presente invenção também pode ser determinada utilizando vários modelos animais experimentais para o estudo de cancro, como o modelo de ratinho SCID ou ratinhos transgénicos ou ratinhos nus ou com xenotransplantes humanos, modelos animais, tais como hamsters, coelhos, etc. conhecidos na arte e descritos em Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd); e Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher), aqui incorporados por referência na sua totalidade.

Os modelos animais preferidos para determinar a eficácia terapêutica das moléculas da invenção são modelos de xenoenxerto de ratinho. As linhas celulares de tumores que podem ser utilizadas como uma fonte para os tumores de xenoenxerto incluem, mas não estão limitadas a, células SKBR3 e MCF7, que podem ser derivadas de pacientes com adenocarcinoma da mama. Estas células têm tanto erbB2 como os recetores de prolactina. As células SKBR3 têm sido utilizadas como rotina na técnica como modelos de xenoenxerto de tumor e de ADCC. Alternativamente, as células 0VCAR3 derivadas de um adenocarcinoma de ovário humano podem ser usadas como uma fonte para os tumores de xenoenxerto.

Os protocolos e as composições da invenção são de preferência testados in vitro, e, em seguida, in vivo, para a atividade terapêutica ou profilática desejada, antes do uso em seres humanos. Os agentes terapêuticos e métodos podem ser rastreados utilizando células de um tumor ou linha de células malignas. Muitos ensaios padrão na arte podem ser usados para avaliar essa sobrevivência e/ou crescimento; por exemplo, a proliferação de células pode ser testada medindo a incorporação de 3H-timidina, pela contagem direta de células, por deteção de alterações na atividade transcricional de genes conhecidos tais como os proto-oncogenes (por exemplo, fos, myc) ou marcadores do ciclo celular; a viabilidade celular pode ser avaliada pela coloração com azul tripano, a diferenciação pode ser avaliada visualmente com base em alterações na morfologia, diminuição do crescimento e/ou a formação de colónias em ágar mole ou formação de rede tubular na membrana basal tridimensional ou na elaboração da matriz extracelular, etc.

Os compostos para utilização na terapia podem ser ensaiados em sistemas de modelos animais adequados, antes do teste em humanos, incluindo, mas não se limitando a, ratos, ratinhos, galinhas, vacas, macacos, coelhos, hamsters, etc., por exemplo, os modelos animais descritos acima. Os compostos podem então ser utilizados nos ensaios clínicos apropriados.

Além disso, quaisquer ensaios conhecidos pelos peritos na arte podem ser usados para avaliar a utilidade profilática e/ou terapêutica das terapias combinatórias aqui divulgadas para o tratamento ou prevenção de cancro, doenças inflamatórias, ou doenças autoimunes.

6. EXEMPLOS

Utilizando um sistema de exibição de levedura, regiões de Fc de cadeia pesada de mutantes de IgGl humana foram rastreados quanto à afinidade modificada para diferentes recetores de Fc. Em particular, uma biblioteca de Fc mutante foi gerado por PCR propensa a erros (Genemorph, Stratagene), e, em seguida, as proteínas mutantes de Fc foram fundidas com a proteína de parede celular Aga2p, o que permitiu que a proteína de fusão fosse secretada extracelularmente e exibida na parede da célula de levedura.

As formas solúveis dos recetores humanos (FcyRIIIA e FcyRIIB) foram clonadas. A deteção dos domínios Fc de IgGl na superfície da célula de levedura, contudo, é impedida devido à baixa afinidade de FcyR para com o seu ligante. A fim de contornar esta limitação, complexos tetraméricos de FcyR solúvel foram formados utilizando uma sequência AVITAG que poderia ser enzimaticamente biotinilada e subsequentemente feita reagir com estreptavidina conjugada com ficoeritrina (SA-PE; Molecular Probes) para formar complexos de FcyR tetramérico solúvel. Ensaios de ELISA confirmaram que os complexos tetraméricos de FcyR solúvel tinham uma avidez mais elevada para a IgGl humana relativamente ao FcyR monomérico. Proteínas de fusão de Fc sobre a superfície da célula de levedura também se ligaram aos complexos tetraméricos de FcyR solúvel como avaliado por análise FAGS. 0 diferencial de ligação das proteínas de fusão de Fc expressas na superfície de células de levedura para complexos tetraméricos de FcyR solúvel foi monitorizado por uma análise de FACS. As proteínas de fusão de Fc com afinidades alteradas para um ou mais complexos tetraméricos de FcyR solúvel foram, assim, identificadas e foram, em seguida, incorporadas numa imunoglobulina completa e expressas em células de mamífero. 0 produto expresso de mamíferos foi utilizado em ensaios ELISA para confirmar os resultados obtidos no sistema de exibição de superfície de levedura. Finalmente, as regiões de Fc mutantes foram sequenciadas para confirmar o(s) resíduo(s) alterado(s). 6.1 CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE FCyRIIIA Materiais e Métodos

0 FcyRIIB e FcyRIIIA solúveis foram clonados como se segue. Os clones de ADNc para os genes humanos de FcyR (FcyRIIB e FcyRIIIA) foram obtidos (oferta de Ravetch lab.). A região solúvel do gene FcyRIIIA (aminoácidos 7-203) foi amplificada por PCR (Tabela 12), digerida com BamHI/HindIII e ligada ao vetor pET25 (Novagen). Este vetor foi digerido com Sall/Notl, e um fragmento de 370 foi isolado em gel. O vetor hu3A, (oferta de J. Ravetch) foi digerido com BamHI/Sall, e um fragmento de 270 contendo a extremidade N-terminal de FcRyIIIA foi isolado. Ambos os fragmentos foram coligados em pcDNA3.1, cortados com BamH/Notl para criar pcDNA3-FcYRgIIIA (aminoácidos 1-203) . A região do FcRyIIB solúvel (aminoácidos 33-180) foi amplificada por PCR (Tabela 12), digerida com BglII/HindIII e ligada em pET25b(+) (Novagen). Este vetor foi digerido com BamHl/Notl, e um fragmento de 140 bp foi isolado em gel. O vetor huRIIbl (oferta de J. Ravetch) foi digerido com BamHI/EcoRI, e um fragmento de 440 bp pelo N-terminal de FcRyIIB foi isolado. Ambos os fragmentos foram coligados em pcDNA3.1, cortados com BamHl/Notl para criar pcDNA3-FcYRglIB (aminoácidos 1-180). Os clones recombinantes foram transfectados em células 293H, os sobrenadantes foram recolhidos a partir de culturas de células, e as proteínas FcyR (rFcYR) recombinantes solúveis foram purificadas em coluna de IgG-Sefarose.

RESULTADOS O FcyRIIIA solúvel recombinante (r-FcyRIIIA) e o FcyRIIB solúvel recombinante (rFcyRIIB) foram purificados até à homogeneidade

Após a expressão e purificação das proteínas recombinantes FcyR solúveis em coluna de sefarose de uma IgG, a pureza e o peso molecular aparente das proteínas recetoras solúveis purificadas recombinantes foram determinados por SDS-PAGE. Como mostrado na FIG. 3, o rFcYRIIIA solúvel (FIG. 3, Linha 1) tinha o peso molecular aparente previsto de ~35KDa e o rFcYRIIB solúvel (Fig. 3, linha 4) tinha o peso molecular aparente previsto de ~20KDa. Como mostrado na FIG. 3, o rFcYRIIIA solúvel migra como uma banda "difusa", que foi atribuída ao elevado grau de glicosilação normalmente encontrado no FcyRIIIA (Jefferis et ai., 1995 Immunol Lett. 44, 111-117).

6.1.1 CARACTERIZAÇÃO DE FCTRIIIA RECOMBINANTE PURIFICADO SOLÚVEL

Materiais e Métodos

FcyRIIIA solúvel purificado, o qual foi obtido tal como descrito acima, foi analisado quanto a ligação direta contra IgG monomérica humana ou agregada usando um ensaio ELISA. A placa é revestida com 10 ng de rFcYRIIIA solúvel durante a noite em 1 X PBS. Subsequentemente ao revestimento, a placa é lavada três vezes em IX PBS / 0,1% Tween 20. A IgG humana, quer IgG biotinilada monomérica ou IgG biotinilada agregada, é adicionada aos poços a uma concentração que varia de 0,03 mg / mL até 2 mg / mL, e deixou-se ligar ao rFcYRIIIA solúvel. A reação é realizada durante uma hora a 37 °C. A placa é lavada de novo três

vezes com IX PBST/0,1% de Tween 20. A ligação da IgG humana a rFcYRIIIA solúvel é detetada com estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano por monitorização da absorvância a 650 nm. A absorvância a 650 nm é proporcional à IgG agregada ligada.

Numa experiência de ensaio ELISA de bloqueio, a capacidade de um anticorpo monoclonal FcyRIIIA, 3G8, um anticorpo de ratinho antí-FcyRIIIA (Pharmingen), para bloquear a ligação do recetor ao agregado de IgG é monitorizado. As condições de lavagem e de incubação foram as mesmas como descrito acima, exceto que, antes da adição de IgG, um excesso molar de 5 vezes de 3G8 foi adicionado e deixado a incubar durante 30 minutos a 37 °C.

RESULTADOS O FcyRIIIA solúvel recombinante purificado liga-se a IgG agregada especificamente. A ligação direta de FcyRIIIA solúvel recombinante purificado a IgG agregada e monomérica foi testada utilizando um ensaio ELISA (FIG. 4). A uma concentração de

IgG de 2 pg/mL, uma ligação forte à IgG agregada foi observada. No entanto, a uma concentração semelhante, não foi detetada ligação à IgG monomérica. A ligação à IgG agregada foi bloqueada por 3G8, um anticorpo monoclonal antí-FcyRIIIA de ratinho que bloqueia o local de ligação ao ligante, indicando que a ligação à IgG agregada é através do local de ligação normal do ligante de FcyRIIIA (FIG. 4). rFcyRIIB solúvel também foi caracterizado e demonstrou ligar-se a IgG com características semelhantes às do rFcYRIIIA solúvel (dados não mostrados). 6.2 FORMAÇÃO de COMPLEXOS tetraméricos de FcyR solúvel

Materiais e Métodos

Construção de plasmídeos para a expressão de FcRylIIA solúvel e FcRylIB fundido com o péptido AVITAG Para gerar complexos tetraméricos de FcyR solúvel, a região solúvel do gene FcRgIIIA humano (aminoácidos 7-203) foi amplificada por PCR (Tabela 12), digerido com BamHI/HindIII e ligado ao pET25b(+) (Novagen). Este vetor foi digerido com Sall/Notl, e um fragmento de 370 pb foi isolado por eletroforese em gel de agarose. O vetor hu3A (oferta de J. Ravetch) foi digerido com BamHI/Sall, e um fragmento de 270 pb contendo a extremidade N-terminal de FcRyIIIA foi isolado. Ambos os fragmentos foram coligados em pcDNA3.1 (Invitrogen), que tinha sido digerido com BamHI/Notl para criar pcDNA3-FcRgIIIA (aminoácidos 1- 203). A região do FcRyIIB solúvel (aminoácidos 33-180) foi amplificada por PCR (Tabela I), digerida com BglII/HindIII e ligada em pET25b(+) (Novagen). Este vetor foi digerido com BamHI/Notl, e um fragmento de 140 pb foi isolado por eletroforese em gel de agarose. O vetor huRIIbi (oferta de J. Ravetch) foi digerido com BamHI/EcoRI, e um 440 fragmento pelo N-terminal de FcRyIIB foi isolado. Ambos os fragmentos foram coligados em pcDNA3.1, o qual tinha sido digerido com BamHI/Notl para criar pcDNA3-FcRYlIB (aminoácidos 1-180). Subsequentemente, a sequência de ligante AVITAG foi fundida com o terminal C tanto de FcyRIIIA como de FcyRIIB. Para gerar as construções de ligante avitag de FcyRIIIA e de ligante avitag de FcyRIIB, os pcDNA3.1 de FcyRIIIA e FcyRIIB foram digeridos com Not I e Xbal (ambos cortados na sequência do vetor) e um oligonucleotideo de cadeia dupla com par de base 86 que consiste em local Notl na extremidade 5' e Xbal na extremidade 3', foi ligado no vetor. Este fragmento de 86 pb foi gerado por emparelhamento dos dois oligonucleotideos de complemento inverso 5' fosforilados (mostrados na Tabela 12 como os iniciadores do ligante avitag 5' e 3' ) com os locais de restrições para Notl e Xbal já preconcebidos. Volumes iguais de cada iniciador a 100 ng por ui foram misturados e o ADN aquecido a 90 °C durante 15 minutos e arrefeceu-se à temperatura ambiente durante uma hora para recozimento. Isto criou um fragmento de ADN de cadeia dupla preparado para ser ligado às construções pcDNA3.1 de FcyRIIIA e FcyRIIB digeridas com as respetivas enzimas. Portanto, o ligante AVITAG de pcDNA3.1-FcRyIIIA e ligante AVITAG pcDNA3.1-FcRyIIB foram construídos.

Biotinilação por BirA

Os recetores de Fc Solúveis (FcyR) fundidos com a sequência de 15 amino ácidos AVITAG (Avidity, CO) (Schatz PJ, 1993, Biotechology, 11: 1138-1143) na extremidade C-terminal da proteína clonada em pcDNA3.1 foram produzidos por transfecção transitória de células 293H utilizando reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA). Os sobrenadantes foram recolhidos a partir das culturas e proteínas FcR solúveis foram purificadas por passagem dos sobrenadantes sobre uma coluna de IgG sefarose. A concentração da proteína de fusão solúvel FcR AVITAG foi quantificada por absorvância a 280 nm. O AVITAG presente nas proteínas solúveis FcR foi biotinilado de acordo com o protocolo do fabricante (Avidity, CO) com a enzima de E. coli BirA, uma biotina ligase. Uma diluição final a 1:100 de um cocktail de inibidores de protease (catálogo Sigma # P8849) e 1 mg/mL de concentração final de Leupeptina (Sigma L-8511) foram adicionados à mistura para evitar a degradação das proteínas. A reação BirA foi incubada à temperatura ambiente durante a noite, após o que a solução foi concentrada utilizando um dispositivo de ultrafiltração de 10K Biomax (Millipore) por centrifugação a 3500 rpm a 4 °C. A proteína foi carregada numa coluna FPLC Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) em Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), 50 mM de NaCl para separar o FcyR solúvel marcado a partir da biotina livre.

Determinação do grau de biotinilação por ensaio de desvio de estreptavidina

Cerca de 80-85% da proteína foi biotinilado pela enzima BirA (Avidity, CO) . O ensaio de desvio de estreptavidina foi usado para determinar o grau da biotinilação da proteína. A proteína biotinilada foi incubada com estreptavidina (MW 60.000 Daltons) em diferentes proporções. A proteína não biotinilada sozinha e a estreptavidina sozinha são incluídas como controlos para determinar a extensão da biotinilação. A incubação é levada a cabo em gelo durante 2 horas ou durante a noite a 4 °C. As amostras são analisadas em 4-12% de SDS-PAGE de Bis-Tris (Invitrogen, CA) com agente redutor e sem ebulição das amostras. A proteína biotinilada ligada à estreptavidina migra como uma banda de peso molecular elevado. O grau de biotinilação é estimado pela quantidade de proteína monomérica deixada na amostra. A ausência de espécies de baixo peso molecular monomérico e a presença de um complexo com peso molecular superior à estreptavidina sozinha indica um elevado grau de biotinilação.

FORMAÇÃO DE COMPLEXOS TETRAMÉRICOS DE FcyR A formação de complexos tetraméricos de FcyR foi realizada de acordo com as metodologias previamente estabelecidas para tetrameros MHC de classe I (Ver Busch, DH et al, 1998 Immunity 8: 353-362; Altman, JD et al, 1996, Science 274: 94-96). A concentração do FcyR monomérico biotinilado foi calculada com base na absorvância a 280 nm. Uma molécula de estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) (Molecular Probes, OR) tem a capacidade de se ligar a 4 moléculas de biotina. Uma proporção de 5:1 molar de FcyR biotinilado monomérica para SA-PE (5X FcyR monomérico biotinilado: IX SA-PE) foi utilizada para garantir um excesso de proteína biotinilada. O peso molecular calculado de SA-PE é de 300.000 Daltons, por conseguinte, 303 mL de uma solução de 1 mg/de estreptavidina-PE tem 1 nmole de SA-PE, que foi adicionado a 5 nmol de proteína. A formação eficiente de proteína tetramérica requer que SA-PE seja adicionado em incrementos passo a passo. Metade da quantidade de SA-PE foi adicionada à partida e a restante quantidade de SA-PE foi adicionada em pequenas alíquotas a cada 20-30 minutos, a 4 °C no escuro. Os intervalos para a adição da restante quantidade de SA-PE são flexíveis. Após a adição de SA-PE estar completa, a solução foi concentrada e carregada numa coluna de exclusão por tamanhos FPLC como acima em solução salina tamponada com fosfato, a pH 7,4. A fração que eluiu no volume vazio com um peso molecular maior do que SA-PE sozinho foi recolhida. Os inibidores de protease foram repostos para evitar a degradação de proteínas. A solução foi concentrada e inibidores de protease adicionais foram adicionados ao complexo final para armazenamento. A concentração final do complexo solúvel tetramérico de FcyR foi calculada com base na concentração de partida da proteína monomérica biotinilada. Por exemplo, se 500 pg de proteína biotinilada forem usados para fazer o complexo tetramérico e os tetrâmeros finais concentrados estiverem num volume de 500 pL, a concentração é estimada como sendo aproximadamente de 1 mg/mL (As perdas durante a concentração não são tidas em conta visto ser difícil determinar com precisão a quantidade perdida durante cada passo da formação de tetrâmeros. Também não é possível tomar uma absorvância a 280 nm para medir a concentração devido à interferência da PE) . Complexos solúveis tetraméricos de FcyR foram dispensados em pequenas alíquotas a -80 °C para armazenamento a longo prazo com os inibidores da protease. Azida de sódio não foi adicionada a estas preparações visto os tetrâmeros terem sido usados para o rastreio de uma biblioteca de exibição de levedura. Por descongelamento de uma alíquota, os tetrâmeros foram armazenados a 4 0 C durante até 1 semana.

Ensaio ELISA para caracterizar Complexos tetraméricos de FcyR

Um ensaio ELISA foi utilizado para caracterizar os complexos tetraméricos de FcyR. Uma placa de 96 poços Maxisorb F (Nunc) foi revestida com 25 ng de IgG humana em tampão PBS, e incubada durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas com PBS/0,5% BSA/0,1% de Tween 20 (tampão de lavagem e diluente) antes da adição da combinação de tetrâmeros de FcyRIIIA e anticorpos de teste para determinar o bloqueio com 3G8, um anticorpo de ratinho anti-humano FcyRIIIA como descrito abaixo: O passo de bloqueio foi realizado como se segue: tetrâmeros de FcyRIIIA solúvel numa solução fixa de 0,5 mg/mL de concentração final foram pré-incubados com anticorpos durante 1 h à temperatura ambiente em tampão, a PBS/0,5% BSA/0,1% de Tween 20. As concentrações finais dos anticorpos variaram entre 60 mg/mL a 0,25 mg/mL. 3G8 é um anticorpo de ratinho anti-humano de FcyRIIIA, e para a finalidade desta experiência, uma versão quimérica foi usada, isto é, a região variável do anticorpo é um anticorpo de ratinho anti-humano de FcyRIIIA e a região constante das cadeias pesada e leve é da região da IgGl humana. Um 4.4.20. D265A quimérico foi também utilizado nesta experiência, que é um anticorpo anti-fluoresceina, de modo a que a região de Fc contém uma mutação na posição 265, onde um ácido aspártico é substituído por alanina na IgGl humana, o que resulta numa ligação reduzida para FcyR. Este anticorpo foi caracterizado anteriormente (Ver Clynes et ai, 2000, Nat. Med. 6: 443-446; Shields et al.r 2001, J. Biol. Chem., 276: 6591-6604). Este anticorpo foi utilizado como controlo negativo do isotipo.

Os anticorpos foram deixados a ligar-se a tetrâmeros de FcyRIIIA, por pré-incubação durante 1 hora à temperatura ambiente. A mistura foi então adicionada à IgG sobre a placa lavada e incubada durante uma hora adicional à temperatura ambiente. A placa foi lavada com tampão e DJ130c (um anticorpo de ratinho anti-humano FcyRIIIA disponível a partir de DAKO, Dinamarca; o seu epitopo é distinto do do anticorpo 3G8) a 1:5000 de diluição foi adicionada e deixou-se incubar durante 1 h à temperatura ambiente, a fim de detetar os tetrâmeros de FcyRIIIA ligados. Os anticorpos não ligados foram lavados com tampão e o DJ130c ligado foi detetado com anticorpo de cabra anti-ratinho com peroxidase (Jackson laboratórios). Este reagente não irá detetar o Fc humano. Após lavagem do anticorpo não ligado conjugado com peroxidase, o substrato, reagente TMB (BioFX), foi adicionado para detetar o grau de bloqueio com 3G8 versus o controlo de isotipo e a cor desenvolvida foi lida a 650 nm.

Para a ligação direta de FcyRIIIA tetramérico solúvel a IgG por ELISA, placas Maxisorb foram revestidas com 25 ng de IgG tal como descrito acima. Os FcyRIIIA tetraméricos solúveis foram adicionados a partir de 20 mg/mL a 0,1 mg/mL e os FcyRIIIA tetraméricos solúveis monoméricos biotinilados foram adicionados em concentrações variando de 20 mg/mL a 0,16 mg/mL. A deteção foi a mesma que acima com DJ130c, seguido de anticorpo de cabra anti-ratinho-peroxidase. A cor desenvolvida com o reagente TMB e a placa foi lida a 650 nm.

RESULTADOS O complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel liga-se à IgG humana monomérica, através do seu local de ligação ligado normal

As proteínas de fusão solúveis FcyRIIIA-AVITAG foram geradas, isoladas, e analisadas como descrito na secção Materiais e Métodos utilizando um ensaio ELISA e demonstraram ter propriedades similares às da proteína solúvel não-AVITAG de FcyRIIIA (dados não mostrados). As proteínas de fusão foram biotiniladas, e os complexos tetraméricos foram gerados como descrito acima.

O complexo tetramérico de FcyR solúvel foi então avaliado quanto à ligação do seu ligante, IgG humana monomérica, utilizando um ensaio ELISA. A análise por ELISA mostrou que os complexos tetraméricos de FcyR solúvel se ligam a IgG monomérica humana especificamente. Como mostrado na FIG. 5A, a ligação de FcyRIIIA solúvel tetramérico a IgG monomérica humana é bloqueada por 3G8, um anticorpo FcyIIIA monoclonal de ratinho anti-humano, como monitorizado pela absorvância a 650 nm. Por outro lado, o anticorpo monoclonal 4-4-20 portador da mutação D265A não foi capaz de bloquear a ligação de FcyRIIIA solúvel tetramérico a IgG monomérica humana (Fig. 5A) . Esta experiência confirma, assim, que a ligação do complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel ocorre através do local de ligação do ligante nativo. O complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel liga-se a IgG monomérica humana com uma avidez maior do que o FcyRIIIA monomérico solúvel A ligação direta de FcyRIIIA solúvel tetramérico a IgG humana agregada foi avaliada utilizando um ensaio ELISA e foi comparada à ligação direta do FcyRIIIA monomérico solúvel a IgG monomérica humana. Como mostrado na FIG. 5B, o FcyRIIIA solúvel tetramérico liga-se a IgG humana com uma avidez mais elevada (8-10 vezes) do que o recetor solúvel monomérico, tal como monitorizado por absorvância a 450 nm. A ligação do complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel também foi testada usando esferas magnéticas revestidas com fragmento de Fc purificado com IgGl (FIG. 5) . O complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel liga-se às esferas revestidas com Fc de IgGl, sob condições em que a ligação do monómero não é detetada. A especificidade da ligação foi demonstrada por pré-incubação do complexo recetor, com um anticorpo monoclonal antí-FcyRIIIA, LNK16, que bloqueia a ligação de Fc. Este ensaio confirma ainda que o complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel se liga a IgG monomérica através do seu local de ligação ao ligante normal, e a avidez do recetor é aumentada devido a vários locais de ligação no interior do complexo. 6.3 CONSTRUÇÃO DE ESTIRPE DE LEVEDURA PARA A EXIBIÇÃO DOS DOMÍNIOS DO MUTANTE IgGl Fc

Materiais e Métodos 0 vetor pYDl (Invitrogen) é derivado diretamente a partir de um vetor de levedura de replicação, pCT302 (Shusta, et ai, 2000 Nat Biotechnol 18: 754-759, que tem sido utilizado com sucesso para exibir os recetores de células T e um número de scFvs. Este plasmideo é centromérico e abriga o gene TRP1 que permite um número de cópias relativamente constantes de 1-2 plasmídeos por célula numa estirpe de levedura trpl. A clonagem direcional no poliligante coloca o gene de interesse sob o controlo do promotor GAL1 e em grelha com AGA2 . A fusão do domínio Fc de IgG para a levedura Aga2p resulta na secreção extracelular da proteína de fusão Fc-Aga2 e subsequente exibição da proteína Fc na parede da célula através de ligações dissulfureto para a proteína de levedura Aga lp, que é uma proteína integrante da parede celular. A fim de otimizar os níveis de exibição, diferentes fragmentos da cadeia pesada de IgGl foram amplificados por PCR e clonados em pYDl. Especificamente, a região de Fc da cadeia pesada de IgGl (alotipo IGlm(a); aminoácidos 206-447) foi amplificada por PCR (Tabela 1) a partir do clone IMAGE 182740, digerido com EcoRI/Sall e ligado ao vetor de pYDl (Invitrogen). O clone inicial de IMAGE continha uma eliminação de um único nucleotídeo na posição 319 que foi corrigida por mutagénese in vitro dirigida para construir pPYD-GIF206 (Quickchange, Stratagene). 0 fragmento de CH1-CH3 (aminoácidos 118-447) foi amplificado a partir do clone da cadeia pesada do MAb B6.2 no vetor pCINEO utilizando um oligo 5' (mcr025;chi(f)) e um 3'oligo (H021) (ver Tabela 8). 0 fragmento foi digerido com BamHI/Notl e ligado no vetor pYDl para construir pYD-CHl. A FIG. A FIG. 7, mostra uma representação esquemática das construções. A construção CH1-CH3 contém o domínio CHI, para além dos domínios flexíveis CH2-CH3 da cadeia pesada, GIF206 contém 6 resíduos de aminoácidos a montante da porção flexível e GIF227 começa na região flexível num local de clivagem proteolítica endógena (Jendeberg et al., 1997 J. Immunol. Meth. 201: 25-34).

6.4 IMUNOLOCALIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE DOMÍNIOS Fc NA PAREDE CELULAR DE LEVEDURA

Materiais e Métodos

As construções contendo as proteínas de fusão Aga2p-Fc e um vetor de controlo, pYDI, sem qualquer inserção, foram transformadas na estirpe de levedura EBY100 (Invitrogen), MATa ura3-52 trpl leu2Al his3A200pep4::HIS3 prblAl.6 R canl GAL::GAL-AGA1, utilizando um protocolo padrão de transformação de levedura de acetato de lítio (Gietz et al, 1992, Nucleic Acids Res. 20: 1425). Subsequentemente, prototrofos de triptofano foram selecionados em meios definidos. A amplificação de populações de células independentes e indução de Agalp e as proteínas de fusão Aga2p-Fc foram conseguidas por crescimento em glicose, seguido de crescimento em meios contendo galactose como fonte de carbono primária durante 24-48 horas a 20 °C. O crescimento em galactose induz a expressão das proteínas de fusão Aga2-Fc através do promotor GAL1, o que leva subsequentemente à exibição das proteínas de fusão de Fc na superfície da célula de levedura.

RESULTADOS

Análise FACS de Proteínas de Fusão de Fc A expressão de proteínas de fusão de Fc na superfície da célula de levedura foi analisada por coloração imunológica utilizando um anticorpo policlonal conjugado com PE F(ab)2 de cabra anti-humano FcyR e HP6017 (Sigma) (Jackson Immununoresearch Laboratories, Inc.). A microscopia de fluorescência mostra a coloração periférica para as três proteínas de fusão Fc. A estirpe de controlo portadora do vetor sozinho, mostra pouca ou nenhuma coloração (dados não mostrados). A análise FACS foi utilizada para quantificar a coloração (fig. 8). A estirpe de levedura contendo a fusão CH1-CH3 demonstrou a maior percentagem de células coradas com ambos os anticorpos (Fig. 8B e F). A construção GIF227 mostrou a maior intensidade média de fluorescência (Fig. 8, painéis C e G).

Caracterização da ligação de proteínas de fusão de Fc expressas na superfície de células de levedura 0 contexto natural das proteínas Fc e FcyR coloca o recetor na superfície da célula e o Fc como o ligante solúvel; No entanto, a superfície de levedura Fc inverte a geometria da interação natural. A deteção das proteínas de IgGl Fc sobre a superfície da parede da célula de levedura é complicada tanto pela baixa afinidade do FcyR para o seu ligante como pela geometria inversa inerente ao sistema de exibição. Embora o último ponto não possa ser alterado, a avidez do ligante foi melhorada, como explicado acima, formando complexos solúveis tetraméricos de FcyR, o que permite a deteção da ligação FcyR às proteínas de fusão de Fc expressas na parede da célula de levedura de superfície.

Para caracterizar a ligação de complexos tetraméricos de FcyR solúveis à área de superfície exposta de proteínas de fusão de Fc, as células de levedura que expressam diferentes construções Fc foram incubadas com o complexo tetramérico de rFcYRIIIA solúvel e analisadas por FACS. As células de levedura abrigando pYD-CHl, exibindo a construção de tipo selvagem CH1-CH3 foram ligadas pelo complexo tetramérico de rFcYRIIIA solúvel, como comprovados por análise FACS. As estirpes GIF206 e GIF227, no entanto, mostraram pouca ou nenhuma ligação ao complexo tetramérico de rFcYRIIIA solúvel como mostrado por análise FACS (dados não apresentados).

As mutações na região de Fc, que bloqueiam a ligação aos FcyRs foram identificadas (Shields et al, 2001; J. Biol.Chem. 276: 6591-6604). Uma destas mutações, D265A, foi incorporada no pYD-CHl e este mutante foi expresso na superfície da célula de levedura. Estas células foram incubadas com o complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel usando uma elevada concentração de ligante (0,15 mM de Fc; 7,5 mM de D265A) análise de FACS indicou que complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel se ligou ao Fc de tipo selvagem (Fig. 9A) , mas o complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel não se ligou ao mutante D265A-FC, indicando que FcyR está a interagir com o local normal de ligação FcR na região flexível inferior-CH2 (Fig. 9B).

Os anticorpos contra o local de ligação do ligante FcyRIIIA bloquearam a ligação do complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel para a proteína tipo selvagem Fc exibida na superfície da parede da célula de levedura, tal como analisado por FACS (Fig. 10). A ligação do complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel foi bloqueada pelo anticorpo 3G8, bem como pelo anticorpo LNK16, outro anticorpo monoclonal anti-FcyRIIIA (Advanced immunolofical) (Tam et al. , 1996 J. Immunol 157:, 1576-1581. ) e que não foi bloqueada por um controlo do isotipo irrelevante. Portanto, a ligação do complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel às proteínas Fc apresentadas na superfície da célula de levedura ocorre através do local de ligação do ligante normal. A ligação limitada do complexo tetramérico FcyRIIIA indica que uma subpopulação de células tem um Fc corretamente dobrado que é acessível ao FcyR. Há numerosas razões para que apenas uma subpopulação de células possa ser capaz de se ligar ao ligante, por exemplo, eles podem estar em diferentes fases do ciclo de célula ou as proteínas de fusão podem não ter sido exportadas. A fim de determinar a constante de dissociação da ligação do tetrâmero de FcyRIIIA às proteínas de fusão de Fc na superfície da célula de levedura, a ligação de uma série de complexos tetraméricos de FcyRIIIA foi analisada utilizando FACS. O complexo tetramérico de FcyRIIIA foi titulado em concentrações de 1,4 μΜ a 0,0006 μΜ. Utilizando a intensidade média de fluorescência como uma medida de afinidade de ligação e a análise de regressão não linear, o valor de Kd foi determinada como sendo de 0, 006 μΜ ( + /-0,001) (dados não mostrados). 6.5 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA DE Mutantes de Fc

Uma biblioteca de mutantes de Fc foi construída utilizando iniciadores que flanqueiam o fragmento Fc da construção Fc-CH1 construir e PCR propensa a erros (Genemorph,

Stratagene). A inserção CH1-CH3 no vetor pYD-CHI foi amplificada pela técnica de PCR mutagénica (Genemorph,

Stratagene). Cinco reações foram realizadas usando o pYD a montante e iniciadores PYD a jusante (Invitrogen). 0 fragmento amplificado resultante foi digerido com XHOI/BamHI e ligado no pYDl. A reação de ligação foi então transformada em células XL10 ultracompetentes (Stratagene), o que resultou em ~ 1 xlO6 transf ormantes, com 80% dos transformantes contendo as inserções. A análise de sequência de 28 plasmideos aleatórios a partir da biblioteca indicou uma frequência de mutação ~2-3 mutações/kb com uma quebra de 40% das alterações de nucleotideos conservadas e 60% das mutações resultam em alterações de aminoácidos. A biblioteca foi transformada na estirpe de levedura EBY100, MATaQura3-52 top 1 leu2Al his3A200 pep4::HIS3 prblAl.6R can I GAL GAL-AGA 1::URA3 para uma elevada eficiência, ~3,3 xlO5 transformantes/ug, em 30 reações de transformação independentes para criar um total de ~107 transformantes de levedura (Gietz et al, 1992, Nucleic Acids Res. 20: 1425) . A biblioteca foi reunida e amplificada pelo crescimento em glicose. 6.6 SELEÇÃO E ANÁLISE DE Mutantes de Fc

Materiais e Métodos

Ensaio ELISA para o rastreio de mutantes de Fc As placas de ELISA (Nunc F96 MaxiSorp Immunoplate) foram revestidas com 50 mL/poço de 0,5 mg/mL de BSA-FITC em tampão de carbonato a 4 °C, e deixou-se incubar durante a noite. As placas foram lavadas com IX PBS/0,1% Tween 20 (PBST) 3 vezes. 200 mL/poço de PBST/0,5% de BSA foram adicionados e as placas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas mais três vezes com PBST. 50 mL/poço em 1: 4 de anticorpo 4-4-20 diluído (cerca de 3 mg/mL o que levaria a uma concentração final de 0,7-0,8 mg/poço) de tipo selvagem ou contendo um mutante de Fc, foi adicionado a partir de meio condicional em PBST/0,5% de BSA e deixou-se incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBST três vezes. O FcyRIIIA purificado monomérico biotinilado a 3 mg/mL (em PBST/0,5% de BSA) foi adicionado (50 pL/poço) às placas e deixado a incubar durante 1,5 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBST três vezes. 50 mL/poço de uma diluição a 1: 5000 de estreptavidina-HRP (Pharmacia, RPN 123v) em PBST/0,5% de BSA foram adicionados e as placas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBST três vezes. 80 mL/poço de reagente TMB (BioFX) foram então adicionados às placas, e deixados a incubar durante 10-15 minutos à temperatura ambiente num local escuro. As reacções foram finalmente paradas por adição de 40 mL/poço de solução de paragem (ácido sulfúrico a 0,18 M). As placas foram em seguida monitorizadas quanto à absorvância a 450 nm. Após o primeiro rastreio, os candidatos de interesse foram também confirmados por titulação em série de mutantes 4-4-20-Fc no ensaio ELISA de base imuno-complexa. Algumas modificações foram feitas neste ELISA. Para revestimento das placas, 2 mg/mL de BSA-FITC foram utilizados. Com base em resultados de quantificação de IgG, 4-4-20Fc diluído (tipo selvagem ou mutantes) a partir de meio condicionado foi adicionado a uma concentração final de 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,063, e 0 mg/mL em PBST-/0,5% de BSA.

Rastreio FACS para as proteínas Fc exibidas na superfície celular

As células foram cultivadas em, pelo menos, 10 mL de HSM-Trp-Ura pH 5,5 com glicose durante 16-24 horas ou até o valor de Οϋεοο ser superior a 2,0. As células foram centrifugadas a -2000 rpm durante 5 minutos. As células foram ressuspensas num volume igual de HSM-Trp-Ura, pH 7,0 com a galactose. Num balão de 125 mL, 36 mL de meio de galactose foi adicionado, e inoculado com 9 mL de cultura, que foi incubada a 20 °C com agitação durante 24-48 horas. O crescimento foi monitorizado por medição de Οϋδοο em intervalos de 8-16 h. As células foram colhidas em 2K rpm durante 5 minutos, e ressuspensas num volume igual de PBS 1 X, pH 7,4.

Rastreio de equilíbrio: Uma quantidade apropriada de células foi incubada, mantendo um excesso de ligante. Por exemplo, é preferível iniciar com um número de células necessário para assegurar uma cobertura de 10 vezes da biblioteca. Para a primeira classificação com uma biblioteca contendo 107 transformantes, 108 células deveriam ser utilizadas. Na verdade, é melhor começar com 109 células para compensar a perda durante o protocolo de coloração. A incubação foi feita tipicamente num tubo de 1,5 mL em volumes de 20-100 mL de 1 hora a 4 °C no escuro num agitador rotativo (tampão de incubação: PBS 1 X, pH 7,4; 1 mg/mL de BSA) . As células foram lavadas uma vez em 500 mL de tampão de incubação e centrifugadas a 4K rpm durante 2,5 minutos. As células foram ressuspensas em tampão de incubação a 100 mL e incubou-se com o segundo reagente de coloração. Para Fc-CH1, um F(ab)2 de cabra anti-hFc F(ab)2- FITC (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.) pode ser utilizado para corar para expressão de CHI. A coloração foi realizada com 1 mL durante 30 minutos. As células foram lavadas, adicionalmente, em 500 mL de tampão de incubação e centrifugadas a 4K rpm durante 2,5 minutos, ressuspensas em 1 mL IX PBS a 1 mg/mL de BSA e analisadas por FACS.

Gates de classificação de rastreios de equilíbrio típicos e o número de células recolhidas são mostrados na Tabela 13.

Após as 3a e 4a classificações, as células foram colocadas diretamente em placas-Trp-ura para identificar mutantes individuais. Isso normalmente recuperou -200-400 colónias por placa. Após a colheita, as células foram colocadas em 10 mL de meio de glicose num tubo cónico de 50 mL e cultivadas a 30 °C. Todo o procedimento foi repetido de forma iterativa.

RESULTADOS

Análise FACS de Mutantes de Fc

Após a indução em meio de galactose, as células foram colhidas e co-coradas com complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel marcado com PE e F(ab2) de ratinho anti-Fc humano-FI TC (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.) . As células foram analisadas por FACS e gates de classificação foram utilizados para selecionar as células que apresentavam a maior afinidade para o complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel em relação à quantidade de expressão de Fc na superfície da célula (FIG. 11) . Por exemplo, uma célula contendo um Fc mutante que se liga melhor ao complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel pode expressar menos proteínas de fusão Fc menos na superfície da célula de levedura, e esta célula estará no canto inferior esquerdo do gate de classificação.

Quatro classificações consecutivas foram feitas para enriquecer os mutantes que apresentavam a maior afinidade para o complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel. Os gates para cada classificação sucessiva foram de 5,5%, 1%, 0,2% e 0,1%. Após a última classificação, as células foram semeados em meios seletivos e as colónias individuais foram isoladas. Cada colónia individual representava uma população clonal de células albergando um único mutante de Fc dentro da proteína de fusão Fc-Aga2. Inicialmente 32 colónias independentes foram colhidas e testadas por FACS quanto à ligação ao complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel (FIG. 12). Dezoito mutantes mostraram um aumento de intensidade de ligação, conforme medido pela percentagem de células ligadas pelo complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel e a intensidade média de fluorescência das células ligadas.

As mutações que mostram um aumento na ligação ao FcyRIIIA também foram testadas quanto à ligação ao complexo tetramérico de FcyRIIB solúvel (FIG. 12) . A maioria das mutações que levaram a um aumento na ligação ao complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel também resultou na deteção de coloração do complexo tetramérico de FcyRIIB (FIG. 12) . Com base em ambos os dados físicos e genéticos anteriores, espera-se que algumas mutações que aumentam a ligação ao FcyRIIIA também aumentem a ligação ao FcyRIIB (Shields et al., 2001, J Biol.Chem. 276: 6591-6604; Sondermann et al., 2000, Nature 406: 267-273).

Análise de mutantes num 4-4-20 MAb produzido numa linha celular humana. O isolamento e análise de mutações no sistema de levedura permite a rápida identificação de novos alelos mutantes. A utilização de um sistema heterólogo para isolar mutações poderia resultar na identificação de mutações que aumentam a ligação através de uma alteração que resulta na alteração ou enrolamento incorreto na glicosilação que é específica para leveduras. Para analisar as mutações de Fc numa molécula de imunoglobulina que é produzida em células humanas, os mutantes foram subclonados num vetor de expressão de mamífero, contendo a cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-fluoresceina, 4-4-20 (Kranz et al., 1982 J.Biol.Chem, 257(12): 6987-6995). As cadeias pesadas do mutante 4-4-20 foram transientemente co-expressas com os clones de cadeia leve em linha de células de rim humano (293H). Os sobrenadantes foram recolhidos e analisados por ELISA (Fig. 13).

De acordo com o ensaio ELISA, a maioria dos mutantes que foram identificados como possuindo uma afinidade melhorada para o complexo FcyRIIIA monomérico solúvel, na análise de FACS secundária, também mostrou um aumento na ligação ao complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel quando presente na região de Fc do anticorpo 4-4-20 monoclonal produzido na linha celular humana (Fig. 13A). Dois mutantes, número 16 e Número 19, no entanto, mostraram uma diminuição na ligação ao complexo monomérico de FcyRIIIA solúvel. A Tabela 14 resume as mutações que foram identificadas e as suas características de ligação correspondentes FcyRIIIA e FcyRIIB, tal como determinado por ensaios baseados em exibição de levedura e de ELISA. Na Tabela 14, os símbolos representam o seguinte: · corresponde a um aumento de 1 vez na afinidade; + Corresponde a um aumento de 50% na afinidade; - Corresponde a uma diminuição de 1 vez na afinidade; -► corresponde a nenhuma alteração na afinidade em comparação com uma molécula comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem.

A análise da ligação ao complexo tetramérico de FcyRIIB solúvel mostra que 7 dos 8 mutantes que mostravam um aumento de ligação ao complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel também tinham um aumento da ligação ao complexo tetramérico de FcyRIIB solúvel (FIG. 13B) . Um mutante, número 8, mostrou uma diminuição na ligação ao complexo tetramérico de FcyRIIB solúvel. Três dos mutantes não mostram nenhuma diferença na ligação, quer ao complexo tetramérico de FcyRIIIA solúvel ou ao complexo tetramérico de FcyRIIB solúvel, possivelmente devido a mutações que resultam em alterações específicas de levedura. 6.7 ENSAIO ADCC DE Mutantes de Fc

Preparação de células efetoras: células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram purificadas por Ficoll-Paque (Pharmacia, 17-1440-02) centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll-Paque a partir de sangue periférico humano normal (Biowhittaker/Poietics, 1 W-406). O sangue foi enviado no mesmo dia à temperatura ambiente, e diluído 1:1 em PBS e glucose (1 g/lL) e em camada sobre Ficoll em tubos cónicos de 15 mL (3 mL de Ficoll; 4 mL de PBS/sangue) ou tubos cónicos de 50 mL (15 mL: Ficoll; 20 mL PBS/sangue) . A centrifugação foi efetuada a 1500 rpm (400 rcf) durante 40 minutos à temperatura ambiente. A camada de PBMC foi removida (aproximadamente 4-6 mL do tubo de 50 mL) e diluída a 1:10 em PBS (que não contém Ca2+ ou Mg2+) num tubo cónico de 50 mL e centrifugou-se durante um período adicional de 10 minutos a 1200 rpm (250 rcf) à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e os peletes foram ressuspensos em 10-12 mL de PBS (o qual não contém Ca2+ ou Mg2+) , transferido para tubos cónicos de 15 mL e centrifugou-se durante mais 10 minutos a 1200 rpm à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e os peletes foram ressuspensos num volume mínimo (1-2 mL) de meio (meio de Isocove (IMDM) + 10% de soro fetal bovino (FBS), 4 mM de Gin, penicilina/estreptomicina (P/S)). O PBMC ressuspenso foi diluído para o volume apropriado para o ensaio de ADCC; duas diluições foram realizadas numa placa de 96 poços de ELISA (Nunc F96 MaxiSorp Immunoplate). O rendimento de PBMC foi de aproximadamente 3-5x10 células por 40-50 mL de sangue total.

Preparação de células alvo: As células alvo utilizadas no ensaio foram células SK-BR-3 (número de acesso ATCC HTB-30; Trempe et al, 1976, Cancer Res. 33-41), Raji (número de acesso ATCC CCL-86 ; Epstein et al, 1965, J. Natl Cancer Inst. 34: 231-40), ou células de Daudi (número de acesso ATCC CCL-213; Klein et al, 1968, Cancer Res. 28: 1300-1310) (ressuspensas em 0,5 mL de meio IMDM) e foram marcadas com quelato de európio bis(acetoximetil) 2,2":6',2"terpiridina 6, 6' dicarboxilato (reagente BATDA; Perkin Elmer reagente DELFIA; C136-100). As células K562 (número de acesso ATCC CCL-243) foram utilizadas como células de controlo para a atividade NK. As células de Daudi e Raji foram centrifugadas; as células SK-BR-3 foram tratadas com tripsina durante 2-5 minutos a 37 °C, 5% de CO2 e o meio foi neutralizado antes de serem centrifugadas a 200-350 G. O número de células alvo utilizadas nos ensaios foi de cerca de 4 -5xl06 células e não ultrapassou 5xl06 uma vez que a eficiência de marcação foi melhor com apenas 2xl06 células. Uma vez que as células foram centrifugadas, o meio foi aspirado para 0,5 mL em tubos de 15 mL Falcon. 2,5 pL de reagente BATDA foi adicionado e a mistura foi incubada a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes em 10 mL de PBS e 0,125 mM de sulfinpirazole ("SP"; Sigma S-9509); e duas vezes em 10 mL de meio de ensaio (meio de células + sulfinpirazole a 0,125 mM) . As células foram ressuspensas em 1 mL de meio de ensaio, contadas e diluídas.

Quando as células SK-BR-3 foram utilizadas como células alvo após a primeira lavagem com PBS/SP, o PBS/SP foi aspirado e 500 pg/mL de FITC foi adicionado (PIERCE 461110) em meio IMDM contendo SP, Gin, e P/S e incubadas durante 30 minutos a 37 °C, 5% de CO2. As células foram lavadas duas vezes com meio de ensaio; ressuspensas em 1 mL de meio de ensaio, contadas e diluídas.

Opsonização do Anticorpo: Uma vez que as células alvo foram preparadas como descrito acima, foram opsonizadas com os anticorpos apropriados. No caso de variantes de Fc, 50 pL de lxlO5 células/mL foram adicionados a uma concentração 2x de anticorpo portador da variante de Fc. As concentrações finais foram as seguintes: Ch-4-4-20 concentração final foi de 0,5-1 pg/mL; e ch4D5 concentração final foi de 30 ng/mL-1 ng/mL.

As células alvo opsonizadas foram adicionadas às células efetoras para produzir uma razão efetor: alvo de 75: 1 no caso dos anticorpos 4-4-20 com variantes de Fc. No caso dos anticorpos Ch4D5 com variantes de Fc, a razão efetor: alvo de 50: 1 foi conseguida, ou de 75:1. Gradiente PBMC eficaz para o ensaio varia de 100:1 a 1:1. A libertação espontânea (SR) foi medida pela adição de 100 pL de meio de ensaio para as células; libertação máxima (MR) foi medida pela adição de 4% de TX-100. As células foram centrifugadas a 200 rpm numa centrífuga Beckman durante 1 minuto à temperatura ambiente a 57 G. As células foram incubadas durante 3-3,5 horas a 37° C, 5% de CO2. Após a incubação, as células foram centrifugadas a 1000 rpm numa centrífuga de Beckman (cerca de 220xg) durante cinco minutos a 10 °C. 20 pL de sobrenadante foi recolhido; 200 pL de solução de Eu foi adicionado e a mistura foi agitada durante 15 minutos à temperatura ambiente a 120 rpm num agitador rotativo. A fluorescência foi quantificada num fluorímetro resolvido no tempo (Victor 1420, Perkin Elmer).

RESULTADOS

Como descrito acima, as regiões de Fc variantes foram subclonadas num vetor de expressão de mamífero, contendo a cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-fluoresceína, 4-4-20 (Kranz et ai., 1982 J. Biol, 257 (12) : 6987-6995) . As cadeias pesadas da variante 4-4-20 foram transientemente co-expressas com os clones de cadeia leve em linha de células de rim humano (293H). Os sobrenadantes foram recolhidos e analisados utilizando o ensaio de ADCC. A FIG. 14 mostra que a atividade de ADCC dos mutantes é dependente da concentração. Tal como resumido na Tabela 8, cinco imunoglobulinas com regiões de Fc variantes tinham uma atividade ADCC aumentada comparativamente com o tipo selvagem ch 4-4-20. Os cinco mutantes foram como se segue: MGFc-27 (G316D, A378V, D399E); MGFc-31 (P247L, N421K); MGFc-10 (K288N, A330S, P396L); MGFc-28 (N315I, V379M, T394M); MGFc-29 (F243I, V379L, G420V).

Imunoglobulinas adicionais 4-4-20 com regiões de Fc variantes foram testadas quanto à sua atividade de ADCC em relação a uma imunoglobulina 4-4-20 com uma região de Fc de tipo selvagem. Estes resultados estão resumidos na Tabela 15 .

Os ensaios de ADCC foram também realizados utilizando o mesmo protocolo que foi previamente descrito para o anticorpo 4-4-20, no entanto, as regiões de Fc variantes foram clonadas num anticorpo humanizado (Ab4D5) que é específico para o recetor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2/neu). Neste caso, células SK-BR-3 foram utilizadas como células alvo que foram opsonizadas com um anticorpo HER2/neu carregando uma região de Fc variante. HER2/neu é expresso endogenamente pelas células SK-BR-3 e, portanto, está presente na superfície destas células. A FIG. 15 mostra a atividade de ADCC de anticorpos HER2/neu que transportam regiões de Fc variantes. A Tabela 16 resume os resultados de atividade de ADCC dos mutantes, no âmbito do anticorpo HER2/neu. A normalização foi realizada por comparação da concentração do mutante com o anticorpo do tipo selvagem para um valor específico de percentagem de lise celular.

Como mostrado na FIG. 15A, os mutantes MGFc-5 (V379M), MGFc-9 (P243I, V379L), MGFc-10 (K288N, A330S, P396L), MGFc-13 (K334E, T359N, T366S), e MGFc-27 (G316D, A378V, D399E) que foram clonados no anticorpo antÍ-HER2/neu humanizado exibiram uma % de lise especifica superior de células SK-BR-3 relativamente ao anticorpo selvagem.

6.8 ANÁLISE DOS PARÂMETROS CINÉTICOS DE Mutantes de Fc

Os parâmetros cinéticos da ligação de anticorpos ch4-4-20 albergando mutantes de Fc de FcyRIIIA e FcyRIIB foram analisados utilizando um ensaio BIAcore (BIAcore instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ) . O FcyRIIIA utilizado neste ensaio foi uma proteína monomérica solúvel, a região extracelular de FcyRIIIA ligada à sequência ligante-AVITAG como descrito na Secção 6.2 supra. O FcyRIIB utilizado neste ensaio foi uma proteína dimérica solúvel preparada de acordo com a metodologia descrita no Pedido Provisório US N° 60/439,709 depositado em 13 de janeiro de 2003, que é aqui incorporado a título de referência. Resumidamente, o FcyRIIB utilizado foi o domínio extracelular de FcyRIIB fundido com o domínio flexível CH2-CH3 de IgG2 humana. BSA-FITC (36 pg/mL em 10 mM de tampão de acetato a pH 5,0) foi imobilizado numa das quatro células de fluxo (célula de fluxo 2) de uma superfície do chip sensor através de química de acoplamento de amina (por modificação de grupos carboximet ilo com mistura de NHS / EDC) de tal modo que cerca de 5000 unidades de resposta (RU) de BSA-FITC foram imobilizadas sobre a superfície. Após isso, os ésteres ativos que não reagiram foram "destapados" com uma injeção de 1M Et-NH2. Uma vez que uma superfície adequada foi preparada, anticorpos ch 4-4-20 que transportam as mutações Fc foram passados sobre a superfície por injeções de um minuto de uma solução de 20 anticorpos pg/mL a uma taxa de fluxo de 5 pL/mL. O nível de anticorpos ch-4-4-20 ligados à superfície variou entre 400 e 700 RUs. Em seguida, uma série de diluição do recetor (proteína de fusão de Fc FcyRIIIA e FcyRIIB) em tampão HBS-P (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,005% de tensioativo P20, 3 mM de EDTA, pH 7,4) foi injetada sobre a superfície a 100 pL/min de regeneração de Anticorpo entre diferentes diluições do recetor foi realizada por injeções individuais de 5 segundos de 100 mM de NaHCOs, pH 9,4; 3M de NaCl.

As mesmas diluições do recetor também foram injetadas sobre uma superfície de BSA-FITC sem qualquer anticorpo ch-4-4-20 no início e no final do ensaio, tal como injeções de referência.

Uma vez que um conjunto de dados inteiro é recolhido, as curvas de ligação resultantes são globalmente ajustadas utilizando algoritmos de computador fornecidos pelo fabricante, BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ). Estes algoritmos calculam tanto o valor Kon como K0ff, a partir do qual a constante de ligação de equilíbrio aparente, Kd é deduzida como a razão entre as duas constantes de taxa (isto é, Koff/Kon) . Tratamentos mais detalhados de como as constantes de taxa individuais são derivadas podem ser encontrados no Manual BIAevaluaion Software (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ) .

As curvas de ligação para duas concentrações diferentes (200 nm e 800 nm para FcyRIIIA e 200 nM e 400 nM para a proteína de fusão FcyRIIB) foram alinhadas e as respostas ajustadas ao mesmo nível de anticorpos capturados, e as curvas de referência foram subtraídas a partir das curvas experimentais. As fases de associação e de dissociação foram ajustadas separadamente. A constante da taxa de dissociação foi obtida para o intervalo de 32-34 seg da fase de dissociação; o ajuste da fase de associação foi obtido por um modelo de Langmuir 1:1 e o ajuste de base foi selecionado com base em Rmax e critérios chi2.

RESULTADOS A FIG. 16 mostra a captura de anticorpos ch 4-4-20 com regiões de Fc mutantes no chip sensor de BSA-FTIC imobilizado. 6 pL de anticorpos, a uma concentração de cerca de 20 pg/mL foram injetados a 5 pL / min sobre a superfície de BSA-FITC. A FIG. A Fig. 17 é um sensograma de ligação em tempo real de FcyRIIIA a anticorpos ch-4-4-20 transportando regiões de Fc variantes. A ligação de FcyRIIIA foi analisada a 200 nM de concentração e as respostas de sinal de ressonância foram normalizadas ao nível da resposta obtida para o tipo selvagem do anticorpo ch-4-4-20. Os parâmetros cinéticos para a ligação de FcyRIIIA a anticorpos ch4-4-20-ch foram obtidos através do ajuste dos dados obtidos em duas concentrações diferentes de FcyRIIIA, 200 e 800 nM (Fig. 18) . A linha contínua representa o ajuste de associação que foi obtido com base nos valores de K0ff calculados para as curvas de dissociação no intervalo de 32-34 segundos. K0ff e Kd representam a média calculada a partir das duas concentrações diferentes de FcyRIIIA utilizadas. A FIG. 19 é um sensograma de tempo real da ligação da proteína de fusão FcyRIIB-Fc de anticorpos ch-4-4-20 transportando regiões de Fc variantes. A ligação da proteína de fusão de FcyRIIB-Fc foi analisada a 200 nM de concentração e as respostas de sinal de ressonância foram normalizadas ao nível da resposta obtida para o tipo selvagem do anticorpo ch-4-4-20. Os parâmetros cinéticos para a ligação da proteína de fusão de FcyRIIB-Fc a anticorpos ch4-4-20-ch foram obtidos através do ajuste dos dados obtidos em duas concentrações diferentes da proteína de fusão de FcyRIIB-Fc, 200 e 800 nM (Fig. 20). A linha contínua representa o ajuste de associação que foi obtido com base nos valores de K0ff calculados para as curvas de dissociação no intervalo de 32-34 segundos. KQff e

Kd representam a média calculada a partir das duas concentrações diferentes de proteína de fusão de FcyRIIB-Fc utilizadas.

Os parâmetros cinéticos (Kon e K0ff) que foram determinados a partir da análise BIAcore correlacionaram-se com a característica de ligação dos mutantes, tal como determinado por um ensaio de ELISA e a atividade funcional dos mutantes, tal como determinado num ensaio de ADCC. Especif icamente, como pode ser visto na Tabela 17, os mutantes que tinham uma atividade ADCC aumentada em relação à proteína do tipo selvagem, e tinham uma ligação aumentada a FcyRIIIA como determinado por um ensaio ELISA mostraram um K0ff melhorado para FcyRIIIA (isto é, um K0ff inferior) . Portanto, um valor mais baixo de K0ff para FcyRIIIA para um mutante de proteínas Fc em relação a uma proteína do tipo selvagem pode ser suscetível de ter uma função ADCC reforçada. Por outro lado, como pode ser visto na Tabela 18, os mutantes que tinham uma atividade ADCC aumentada em relação à proteína do tipo selvagem, e tinham uma ligação reduzida para a proteína de fusão Fc-FcyRIIB como determinado por um ensaio ELISA mostraram um K0ff superior para a proteína de fusão FcyRIIB Fc.

Assim, os valores de K0ff para FcyRIIIA e FcyRIIB podem ser utilizados como medidas de previsão de como um mutante irá comportar-se num ensaio funcional, tal como um ensaio de ADCC. Na verdade, os rácios de valores K0ff para FcyRIIIA e proteína de fusão FcyRIIB-Fc dos mutantes para a proteína do tipo selvagem, foram comparados com os dados de ADCC (FIG 21) . Especif icamente, no caso de valores de K0ff para FcyRIIIA, o rácio de K0ff (em peso) / K0ff (mutante) foi representado graficamente contra os dados de ADCC; e no caso de valores de K0ff para FcyRIIB, o rácio de K0ff (mut)/K0ff (em peso) foi representado graficamente contra os dados de ADCC. Números mais elevados do que um (1) apresentam uma taxa de dissociação diminuída para FcyRIIIA e um aumento da taxa de dissociação para FcyRIIB -Fc em relação ao tipo selvagem. Os mutantes que se inserem no quadro indicado têm uma menor taxa de dissociação para ligação a FcyRIIIA, e uma taxa de dissociação maior para ligação a FcyRIIB-Fc, e possuem uma função ADCC reforçada.

Os mutantes em realce não se ajustam ao grupo por ELISA ou dados ADCC.

6.9 RASTREIO DE Mutantes de Fc USANDO CICLOS MÚLTIPLOS DE ENRIQUECIMENTO USANDO UM ENSAIO DE FASE SÓLIDA

Os seguintes rastreios de mutantes tiveram o objetivo de identificar conjuntos adicionais de mutantes que demonstram uma melhor ligação para FcyRIIIA e reduzida ligação a FcyRIIB. Rastreio secundário de variantes de Fc selecionadas foi realizado por ELISA, seguido de testes quanto a ADCC no sistema de 4-4-20. Os mutantes foram então selecionados com base principalmente na sua capacidade de mediar ADCC através de 4-4-20 usando células SK-BR3 revestidos por Fluoresceina como alvos e isolado de PBMC de dadores humanos como a população de células efetoras. Os mutantes de Fc que mostraram um aumento relativo na ADCC, por exemplo, um aumento por um fator de 2, foram clonados em que antÍ-HER2/neu ou anti-CD20 chAbs e testados num ensaio ADCC usando as células de tumor adequadas como alvos. Os mutantes também foram analisados por BIAcore e o seu valor relativo de K0ff foi determinado.

Rastreio 1: depleção de fase sólida sequencial e seleção usando esferas magnéticas revestidas com FcyRIIB seguido pela seleção com esferas magnéticas revestidas com FcyRIIIA. 0 objetivo deste rastreio foi a identificação de mutantes de Fc que ou já não se ligam a FcyRIIB ou mostram reduzida ligação a FcyRIIB. Um excesso de 10 vezes da biblioteca simples (~107 células) foi incubado com esferas magnéticas ("My One", Dynal) revestidas com FcyRIIB. A levedura ligada a esferas foi separada da fração não ligada ao colocar o tubo contendo a mistura num campo magnético. As células de levedura que não estavam ligadas às esferas foram removidas e colocadas em meio fresco. Elas foram em seguida ligadas a esferas que estavam revestidas com FcyRIIIA. As leveduras ligadas a esferas foram separadas da fração não ligada colocando o tubo contendo a mistura num campo magnético. A levedura não ligada foi removida e as células ligadas foram removidas por agitação em vórtex vigorosa. As células recuperadas foram novamente cultivadas em glicose contendo meio e reinduzidas em meio seletivo, contendo galactose. O processo de seleção foi repetido. A cultura final foi então usada para a colheita de ADN. As inserções contendo o domínio Fc foram amplificadas por PCR e clonadas em 4-4-20. Aproximadamente 90 mutantes de Fc foram rastreados por ELISA 4-4-20 e ensaios de ADCC e os mutantes positivos resultantes são mostrados na Tabela 19.

Rastreios 2 & 3: Mutantes selecionados por FACS, rastreio de equilíbrio e cinética: 0 primeiro rastreio de biblioteca identificou uma mutação na posição 396, alterando o aminoácido de prolina para leucina (P396L). Esta variante de Fc mostrou um aumento da ligação tanto a FcyRIIIA como a FcyRIIB. A segunda biblioteca foi construída utilizando P396L como uma linha de base. A mutagénese por PCR foi usada para gerar mutantes ~107 mutantes, cada um dos quais continha a mutação de P396L e continha alterações de nucleotídeos adicionais. A biblioteca P396L foi rastreada utilizando dois conjuntos de condições.

Um rastreio de equilíbrio foi realizado utilizando ligante avitag biotinilado de FcyRIIIA como um monómero, utilizando métodos já descritos. Um excesso de aproximadamente 10 vezes da biblioteca (108 células) foi incubado em 0,5 mL de cerca de 7 nM de FcyRIIIA durante 1 h. A mistura foi classificada por FACS, selecionando-se os melhores 1,2% de ligantes. As células de levedura selecionadas foram cultivadas em meio seletivo contendo glicose e foram reinduzidas em meio seletivo contendo galactose. O rastreio de equilíbrio foi repetido uma segunda vez e o gate de classificação foi definido para recolher os melhores 0,2% de ligantes. As células de levedura selecionadas foram então cultivadas sob condições seletivas em glicose. Esta cultura foi então utilizada para a colheita de ADN. As inserções contendo o domínio Fc foram amplificadas por PCR e clonadas na sequência de nucleotídeos que codifica o domínio variável de 4-4-20 usando métodos já descritos. Aproximadamente 90 mutantes de Fc foram rastreados por ELISA 4-4-20 e ADCC e os mutantes positivos resultantes são mostrados na Tabela 20.

Um rastreio cinético também foi implementado para identificar mutantes com K0ff melhorado na ligação a FcyRIIIA. Condições foram estabelecidas para rastrear a biblioteca P396L utilizando uma estirpe com a variante de Fc P396L exibida na superfície de levedura. Resumidamente as células cultivadas sob condições de indução foram incubadas com 0,1 μΜ de monómero de ligante avitag de FcyRIIIA biotinilado durante 1 h. As células foram lavadas para remover o ligante marcado. As células marcadas foram então incubadas por diferentes vezes com 0,1 μΜ de monómero de ligante avitag de FcyRIIIA não marcado, foram lavadas e depois coradas com SA:PE para análise FACS (FIG. 22) . As células foram também coradas com anticorpo de cabra anti-Fc humano para mostrar que a exibição de Fc foi mantida durante a experiência.

Com base no estudo de competição foi determinado que uma incubação de 1 minuto resultava na perda de cerca de 50% de coloração de células. Este ponto de tempo foi escolhido para o rastreio cinético utilizando a biblioteca P396L. Um excesso de aproximadamente 10 vezes de biblioteca (108 células) foi incubado com 0,1 μΜ de monómero de ligante avitag de FcyRIIIA biotinilado num volume de 0,5 mL. As células foram lavadas e depois incubadas durante 1 minuto com o ligante não marcado. Subsequentemente, as células foram lavadas e marcadas com SA:PE. A mistura foi classificada por FACS, selecionando os melhores 0,3% de ligantes. As células de levedura selecionadas foram cultivadas em meio seletivo contendo glicose e reinduzidas em meio seletivo contendo galactose. O rastreio cinético foi repetido uma segunda vez e o gate de classificação foi definido para recolher os melhores 0,2% de ligantes. A biblioteca P396L não selecionada foi comparada com as células de levedura selecionadas quanto à ligação melhorada por FACS (FIG. 23). Os histogramas mostram a percentagem de células que são contidas tanto com FcyRIIIA/ΡΕ como com o anticorpo de cabra anti-Fc humano/FITC (parte superior direita).

As células de levedura selecionadas a partir da segunda classificação foram então cultivadas sob condições seletivas em glicose. Esta cultura foi então utilizada para a colheita de ADN. As inserções contendo o domínio Fc foram amplificadas por PCR e clonadas na sequência de nucleotídeos que codifica o domínio variável de 4-4-20 usando métodos acima descritos. Aproximadamente 90 mutantes de Fc foram rastreados por ELISA 4-4-20 e ADCC e os mutantes positivos resultantes são mostrados na Tabela 21.

Rastreios 4 e 5: Combinação do passo de depleção de FcyRIIB de Fase Sólida com Seleção de FcyRIIIA por classificação de FACS, utilizando o alelo FcyRIIIA 158v A análise de variantes de Fc do Rastreio 1 mostrou que as mutações, que foram selecionadas a partir do rastreio secundário, melhoraram a ligação a FcyRIIIA e FcyRIIB. Portanto, os dados sugerem que a depleção sequencial e seleção usando esferas magnéticas (fase sólida), nas condições estabelecidas não selecionou de forma eficiente para uma ligação a FcyRIIIA e FcyRIIB diferencial. Por conseguinte, a fim de rastrear de forma mais eficaz os mutantes que se ligam a FcyRIIIA, ao mesmo tempo tendo reduzida ou nenhuma ligação a FcyRIIB, o passo de depleção de FcyRIIB fase sólida foi combinado com seleção de FcyRIIIA por classificação FACS. Esta combinação identificou variantes de Fc que se ligam a FcyRIIIA com maior ou igual afinidade do Fc de tipo selvagem.

Um excesso de 10 vezes da biblioteca simples (~107) foi incubado com esferas magnéticas revestidas com FcyRIIB. A levedura ligada a esferas foi separada da fração não ligada ao colocar o tubo contendo a mistura num campo magnético.

As células de levedura que não estavam ligadas às esferas foram removidas e colocadas em meio fresco e subsequentemente reinduzidas em meios contendo galactose. A depleção de FcyRIIB por esferas magnéticas foi repetida 5 vezes. A população de levedura resultante foi analisada e verificou-se que apresenta mais de 50% das células coradas com cabra anti-Fc humana e uma percentagem muito pequena de células coradas com FcyRIIIA. Estas células foram depois selecionadas duas vezes por uma classificação de FACS utilizando 0,1 μΜ de ligante avitag de FcyRIIIA biotinilado (dados não mostrados). O FcyRIIIA foi o alotipo 158V. As células de levedura foram analisadas tanto quanto a ligação a FcyRIIIA como a FcyRIIB depois de cada classificação e comparadas com a ligação pelo domínio Fc de tipo selvagem (FIGs. 24 A-B).

As células de levedura selecionadas a partir da segunda classificação foram então cultivadas sob condições seletivas em glicose. Esta cultura foi então utilizada para a colheita de ADN. As inserções contendo o domínio Fc foram amplificadas por PCR e clonadas na sequência de nucleotídeos que codifica o domínio variável de 4-4-20. Aproximadamente 90 mutantes de Fc foram rastreados por ELISA 4-4-20 e ADCC e os mutantes positivos resultantes são mostrados na Tabela 22 (mutantes 61-66).

Tabela 22: Mutantes selecionados por depleção de esferas magnéticas usando esferas revestidas com CD32B e seleção

Rastreio de mutantes de Fc utilizando o alelo 158F de FcyRIIIA: existem dois alelos diferentes de recetor FcyRIIIA que têm diferentes afinidades de ligação para o domínio Fc de IgGl (Koene et ai, 1997, Blood 90: 1109-1114; Wu et ai, 1997, J. Clin Invest. 100: 1059-1070) . O alelo 158F liga-se ao domínio Fc com uma constante de ligação 5-10 vezes mais baixa do que o alelo 158V. Anteriormente todos os rastreios de Fc usando a exibição de levedura foram feitos utilizando o alelo 158V de ligação elevada como ligante. Nesta experiência, os mutantes de Fc foram selecionados a partir da população de leveduras empobrecida com FcyRIIB usando o monómero de ligante avitag de FcyRIIIA 158F biotinilado como ligante. O gate de classificação foi criado para selecionar os melhores 0,25 por cento de ligantes FcyRIIIA 158F. A população enriquecida resultante foi analisada por FACS (FIG. 24B) . Os clones individuais foram então isolados e a sua ligação aos diferentes FcyRs foi analisada por FACS (FIG. 24B) . A análise de clones individuais a partir da população resultou na identificação de um único mutante abrigando 5 mutações de MgFc67 (V284M, S298N, K334E, R355W, R416S), que tinha uma ligação aumentada a FcyRIIIA e uma ligação reduzida a FcyRIIB.

Rastreio Secundário de Mutantes por um ensaio ADCC para os rastreios 1, 2 e 3:

Os mutantes que foram selecionados nos rastreios acima foram então analisados usando um ensaio ADCC padrão para determinar as taxas relativas de lise mediada pelo ch4-4-20 que alberga os mutantes de Fc. Os anticorpos ch4-4-20 que transportam as variantes de Fc foram construídos usando métodos já descritos acima. As células SK-BR3 foram usadas como alvos e células efetoras foram PBMC que foram isoladas a partir de doadores utilizando um gradiente de Ficoll, tal como foi acima descrito (secção 6.7) . Os resultados da atividade de ADCC para os mutantes estão resumidos na Tabela 23.

Como pode ser visto na Tabela 23, os mutantes isolados utilizando os rastreios primário e secundário acima com base na depleção de FcyRIIB e seleção de FcyRIIIA mostraram uma atividade de ADCC aumentada relativamente ao tipo selvagem.

Os mutantes 37, 38, 39, 41, 43 foram analisados por meio de 0,5 pg/mL de ch4-4-20. Todos os outros anticorpos foram testados a 1 pg/mL. Todas as taxas foram normalizadas para ch4-4-20 do tipo selvagem (IgGl).

Os mutantes foram adicionalmente clonados na cadeia pesada do anticorpo anti-tumor monoclonal 4D5 (anti-HER2/neu) e anticorpo monoclonal anti-CD20 2H7, substituindo o domínio de Fc destes anticorpos monoclonais. Estes anticorpos monoclonais quiméricos foram expressos e purificados e testados num ensaio ADCC usando métodos padrão, por transfecção transiente em células 293H e purificação sobre coluna de proteína G. Os anticorpos quiméricos 4D5 foram testados num ensaio ADCC usando células SK-BR3 como alvos (FIG. 25), enquanto que os anticorpos quiméricos 2H7 foram testados num ensaio ADCC utilizando células Daudi como alvos (FIG. 2 6).

Rastreio secundário de Mutantes via BIAcore: os mutantes que foram selecionados nos rastreios acima foram então analisados por BIAcore para determinar os parâmetros cinéticos para ligação a FcyRIIIA (158V) e FcyRIIB. 0 método utilizado foi semelhante ao que se descreve na Secção 6.8, supra.

Os dados exibidos são valores K0ff em relação a taxas de dissociação do tipo selvagem, conforme determinado a partir de experiências com os mutantes de Fc no anticorpo monoclonal ch4-4-20. Números relativos maiores que um indicam uma diminuição na taxa de K0ff. Números inferiores um indicam um aumento na taxa de dissociação.

Os mutantes que mostraram uma diminuição nas taxas de dissociação para FcyRIIIA foram MgFc38 (K392, P396L),

MgFc43(Y319F, P352L, P396L), MgFc42 (D221E, D270E, V308A, Q311H, P396L, G402D), MgFc43b (K288R, T307A, K344E, P396L), MgFc4 4 (K334N, P396L), MgFc46 (P217S, P396L), MgFc49 (K261N, K210M, P396L). Os mutantes que mostraram uma diminuição nas taxas de dissociação para FcyRIIB foram MgFc3 8(K3 92, P396L), MgFc39 (E293V, Q295E, A327T) , MgFc43 (K288R, T307A, K344E, P396L), MgFc44 (K334N, P396L). Os dados Biacore estão resumidos na Tabela 24.

6.10 ENSAIOS ADCC MEDIADOS POR PBMC Materiais e métodos

As variantes de Fc que apresentam ligação melhorada para FcyRIIIA foram testadas por ADCC à base de PBMC utilizando uma razão de 60:1 de efetor:alvo: Dois sistemas de modelo de tumor diferentes foram usados como alvos, SK-BR3 (anti-HER2/neu) e Daudi (anti-CD20). A percentagem de lise especifica foi quantificada para cada mutante. A análise de regressão linear foi utilizada para traçar os dados que definem a percentagem de lise máxima em 100%. A ADCC é ativada em células efetoras do sistema imunológico através de uma via de transdução de sinal que é desencadeada por uma interação entre FcyR de baixa afinidade e um complexo imune. As populações de células efetoras foram obtidas a partir de sangue primário, ou de macrófagos derivados de monócitos ativados (MDM). As células alvo foram carregadas com európio e incubadas com MAb quimérico e subsequentemente incubadas com as populações de células efetoras. 0 európio funciona da mesma maneira que 51Cr, mas é não radioativo e o európio libertado é detetado num leitor de placa fluorescente. Os linfócitos colhidos a partir de sangue periférico de dadores (PBM) utilizando um gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia) contêm principalmente células assassinas naturais (NK) . A maioria da atividade de ADCC irá ocorrer através da NK contendo FcyRIIIA mas não FcyRIIB na sua superfície.

As experiências foram realizadas utilizando duas populações de células alvo diferentes, SK-RB-3 e Daudi, que expressam HER2/neu e CD20, respetivamente. Ensaios de ADCC foram preparados utilizando Ch4-4-20/FITC revestido por SK-BR-3, Ch4D5/SKBR3, e Rituxan/Daudi (dados não mostrados). Os MAbs quiméricos foram modificados utilizando mutações Fc identificadas. Mutantes de Fc foram clonados em Ch4D5. 0 Ab purificado foi utilizado para opsonizar células SK-BR-3 ou Daudi. Mutantes de Fc foram clonados em Ch4D5. RESULTADOS. Os mutantes de Fc mostraram uma atividade melhorada de ADCC mediada por PBMC em células SK BR3 (FIG. 29) . 0 gráfico mostra a análise de regressão linear de um ensaio de ADCC padrão. 0 anticorpo foi titulado durante 3 ciclos usando uma proporção de efetor para alvo de 75:1. % de lise = (libertação Experimental - SR)/(MR-SR) * 100.

Os mutantes de Fc mostraram uma melhor atividade de ADCC mediada por PBMC em células Daudi (FIG. 30). 6.11 ENSAIOS DE ADCC BASEADOS EM MACRÓFAGOS DERIVADOS DE MONÓCITOS (MDM) A morte de células tumorais dependente de FcyR é mediada por células NK e macrófagos em modelos de tumor de ratinho (Clynes et al, 1998, PNAS EUA, 95: 652-6) . Os monócitos elutriados a partir de dadores foram utilizados como células efetoras para analisar a eficiência dos mutantes de Fc para desencadear a citotoxicidade das células de células alvo em ensaios de ADCC. Padrões de expressão de FcyRI, FcyR3A e FcyR2B são afetados por diferentes condições de crescimento. A expressão de FcyR a partir de monócitos congelados em cultura em meios contendo diferentes combinações de citoquinas e de soro humano foi analisada por FACS utilizando MAbs específicos de FcR. (FIG. 31). As células em cultura foram coradas com anticorpos específicos de FcyR e analisadas por FACS para determinar perfis de MDM de FcyR. As condições que melhor imitam a expressão de macrófagos em FcyR in vivo, isto é, que mostraram a maior fração de células que expressam CD 16 e CD32B foram usadas num ensaio ADCC à base de macrófagos derivados de monócitos (MDM). Para a experiência na FIG. 31, monócitos elutriados congelados foram cultivados durante 8 dias em DMEM e FBS a 20% contendo M-CSF (condição 1) ou GM-CSF (condição 2) . Para a experiência na FIG. 32, monócitos elutriados congelados foram cultivados durante 2 dias em DMEM e FBS a 20% contendo GM-CSF, IL-2 e IFNy antes do ensaio de ADCC. Condições isentas de soro também foram desenvolvidas, que permitem níveis elevados de expressão de CD16 e CD32B (dados não mostrados). Resumidamente, os monócitos purificados foram cultivados durante 6-8 dias em Macrófago-SFM (Invitrogen) contendo GM-CSF, M-CSF, IL-6, IL-10 e IL-1β. Embora a incidência de células CD32B+/CD16+ nestas culturas seja mais elevada utilizando uma mistura de citocinas, as combinações de duas de mais citocinas também irá aumentar a expressão de FcyR (M-CSF/IL-6, M-CSF/IL-10; ou M-CSF/IL-Ιβ. Para os ensaios de ADCC, IFNy é acrescentado nas 24-48 horas finais. A ADCC à base de MDM necessitou de tempos de incubação de >16 horas para observar a morte celular alvo. As células alvo foram carregadas com índio-111, que é mantido para incubações longas dentro das células alvo. A libertação de índio foi quantificada utilizando um contador gama. Todos os outros reagentes, Abs e células alvo, foram semelhantes aos do ensaio ADCC baseado em PBMC. A atividade ADCC devido a FcyRI pode ser eficientemente bloqueada utilizando o anticorpo bloqueador anti-FcRI (M21, Ancell). As condições de ensaio diferem ligeiramente do ensaio baseado em PBMC. 20:1 efetor para alvo; 18-14 horas de incubação a 37 °C.

Os mutantes de Fc que apresentam ADCC melhoradas de PBMC, ligação aumentada a FcyRIIIA, ou ligação reduzida a FcyRIIB foram testados (FIG. 32).

6.12 EFEITO DE Fc MUTANTES NA ATIVIDADE DE COMPLEMENTO

Os mutantes de Fc foram inicialmente identificados com base na sua ligação aumentada a FcyRIIIA. Estes mutantes foram subsequentemente validados em termos de melhoria da afinidade para todos os recetores de baixa afinidade e, em muitos casos melhoraram a atividade de ADCC mediada por PBMC. A citotoxicidade mediada por anticorpo in vivo pode ocorrer por meio de vários mecanismos. Além da ADCC, outros mecanismos possíveis incluem citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e a apoptose. A ligação de Clq à região de Fc de uma imunoglobulina inicia em cascata resultando em lise de células por CDC. A interação entre a Clq e o Fc tem sido estudada numa série de mutantes de Fc. Os resultados destas experiências indicam que a Clq e FcR de baixa afinidade ligam-se a regiões de sobreposição do Fc, no entanto, os resíduos de contacto exatos no interior do Fc variam.

Os mutantes que mostraram ADCC melhorada no ensaio baseado em PBMC foram examinados em termos do seu efeito na CDC. Os anticorpos foram analisados no Ch-mAb anti-CD20, 2H7. Detetamos CDC melhorada para cada mutante ch-mAb testado. Curiosamente, apesar de estes mutantes terem sido selecionados devido à ADCC melhorada, eles também mostram CDC melhorada. MATERIAIS E MÉTODOS. 0 ensaio de CDC foi utilizado para testar os mutantes de Fc utilizando células anti-CD20 e Daudi como alvos. Soro de porquinho-da-índia foi usado como a fonte de complemento (US Biological). 0 ensaio de CDC foi semelhante à ADCC baseada em PBMC. As células alvo foram carregadas com európio e opsonizadas com ChMAb. No entanto, o complemento soro de porquinho-da-índia, foi adicionado em vez de células efetoras. A FIG. 33 mostra um fluxograma do ensaio. ChMab Anti-CD20 superior a 3 ordens de grandeza foi titulado. A % De lise foi calculada. As células Daudi, (3 x 106) foram marcadas com reagente BADTA. 1 x 104 células foram aliquotadas em poços de uma placa de 96 poços. Os anticorpos foram titulados nos poços utilizando três diluições. A reação de opsonização foi deixada prosseguir durante 30-40 minutos a 37 °C em 5% de CO2. Soro de porquinho-da-índia foi adicionado a uma concentração final de 20%. A reação foi deixada prosseguir durante 3,5 horas a 37 °C em 5% de CO2. Subsequentemente, 100 uls de meio das células foi adicionado à reação e as células foram centrifugadas. Para a deteção de 20 uls do sobrenadante, foram adicionados 200 uls da solução de Európio e as placas foram lidas no Victor2 (Wallac). RESULTADOS: Todos os mutantes que demonstram uma melhor ligação a FcR de ativação ou Clq foram colocados no ensaio de CDC (FIG. 34 . ) . Os mutantes de Fc que apresentaram ligação melhorada a FcyRIIIA também mostraram atividade melhorada do complemento. Cada um dos mutantes mostra atividade melhorada do complemento em relação ao tipo selvagem. Os mutantes testados são mutantes duplos. Em cada caso, uma das mutações presentes é P396L.

Para determinar se o aumento em CDC estava correlacionado com o aumento da ligação de Clq a IgGl, a ligação de Fc entre as duas proteínas foi medida em tempo real utilizando ressonância de plasmon de superfície. A fim de examinar a ligação entre a Clq e um Fc de IgGl, as variantes de Fc foram clonadas num anti-CD32B ch-mAb, 2B6. Isso permitiu-nos capturar os anticorpos em peso e mutantes para a lâmina de vidro via proteína CD32B solúvel (FIG. 36A) . Três dos quatro mutantes testados em CDC foram também examinados no Biacore. Todos os 3 mostraram valores bastante melhorados de Koff em comparação com o Fc de tipo selvagem (FIG. 36B) . O formato Biacore para a ligação de Clq a mutantes de 2B6 demonstrou maior ligação de mutantes com mutação de P396L (FIG. 37). A mutação D270E pode reduzir a ligação de Clq em diferente grau. Um resumo da análise da cinética de ligação FcyR e Clq está representada na tabela 25 abaixo.

6.13 CONCEPÇÃO DE VARIANTES Fc COM LIGAÇÃO REDUZIDA A FCyRIIB

Com base numa seleção de mutantes de Fc que reduzem a ligação a FcyRIIB e aumentam a ligação a FcyRIIA 131H, um número de mutações, nomeadamente D270E foram identificadas. Cada mutação foi testada individualmente para se ligar aos recetores de baixa afinidade de Fc e suas variantes alélicas. D270E tinha as caracteristicas de ligação que sugeriam que iria especificamente reduzir a ligação a FcyRIIB. D270E foi testado em combinação com mutações que foram identificadas anteriormente com base na ligação melhorada a todos os FcRs. RESULTADOS. Como mostrado nas Tabelas 26 e 27 e FIGs. 38 e 39, a adição da mutação D270E aumenta a ligação a FcyRIIIA e FcyRIIA H131 e reduz a ligação a FcyRIIB. A FIG. 40 mostra o gráfico de dados MDM ADCC contra o valor K0ff como determinado para a ligação CD32A H131H para mutantes selecionados.

6,14 ANÁLISE DE PARÂMETROS DE CINÉTICOS Mutantes de Fc

Os parâmetros cinéticos de ligação de anticorpos 4D5 quiméricos portadores de mutantes de Fc aos dois alotipos de FcyRIIIA, FcyRIIA 131H e FcyRIIB foram analisados por BIAcore utilizando um método semelhante ao descrito na Secção 6.8 supra. Os dois alotipos de FcyRIIIA, FcyRIIIA 158V e FcyRIIIA 158F, são descritos em maior detalhe na Secção 6.9 supra.

Materiais e métodos

Ambos os alotipos de FcyRIIIA utilizados neste ensaio foram as proteínas monoméricas solúveis, a região extracelular de FcyRIIIA ligada à sequência de ligante-AVITAG como descrito na Secção 6.2. 0 FcyRIIB e FcyRIIA utilizados neste ensaio eram proteínas diméricas solúveis, isto é, o domínio extracelular de FcyRIIB ou FcyRIIA fundido com o domínio flexível CH2-CH3 de IgG2 humana, tal como descrito na Secção 6.8 supra.

Detalhes da metodologia e análise BIAcore são encontrados na Secção 6.8. Neste ensaio, as regiões de Fc variantes foram clonadas num anticorpo quimérico 4D5, que é específico para o recetor do fator 2 do crescimento epidérmico humano (HER2/neu). 0 antígeno, HER2/neu, foi imobilizado sobre uma das células de fluxo do chip sensor. Os anticorpos 4D5 quiméricos que transportavam as mutações Fc foram então passados sobre a superfície por injeções de 3 minutos de uma solução 300 de nM a uma taxa de fluxo de 5 pL/min. Em seguida, uma série de diluição do recetor em tampão HBS-P (HEPES a 10 mM, NaCl 150 a mM, 0,005% de tensioativo P20, 3 mM de EDTA, pH 7,4) foi injetada sobre a superfície a 100 pL/min.

Curvas de ligação para duas concentrações diferentes do recetor (400 nM e 800 nM para FcyRIIIA V158 e FcyRIIIA 158F; 100 nM e 200 nM para FcyRIIA e FcyRIIB) foram alinhadas e as respostas ajustadas para os mesmos níveis de anticorpos capturados, e as curvas de referência foram subtraídas das curvas experimentais. As fases de associação e de dissociação foram ajustadas separadamente.

Resultados A ligação de FcyRIIIA, alotipo 158 V e 158F, FcyRIIB e FcyRIIA 131H foi analisada e as respostas de ressonância foram normalizadas ao nível da resposta obtida para um anticorpo guimérico 4D5 do tipo selvagem. Os parâmetros cinéticos para a ligação dos FcyRs ao anticorpo quimérico 4D5 foram obtidos ajustando os dados a duas concentrações diferentes de FcyR: 400 nM e 800 nM para FcyRIIIA V158 e

FcyRIIIA 158F; 100 nM e 200 nM para FcyRIIA e FcyRIIB. A Tabela 28 apresenta a taxa de dissociação para cada um dos quatro recetores analisados em associação com as regiões de Fc de variantes indicadas.

A Tabela 29 apresenta os resultados de um estudo duplicado em que os valores de K0ff dos anticorpos 4D5 quiméricos foram calculados em relação às taxas de dissociação do tipo selvagem. Números relativos maiores que um indicam uma diminuição na taxa de K0ff. Números menores que um indicam um aumento na taxa KQff.

6.15 ENSAIO DE ADCC Mutantes de Fc

As mutações Fc identificadas no Exemplo 6.14 como compreendendo maior afinidade para FcyIIIA e/ou FcyIIA foram analisadas quanto à sua atividade de ADCC relativa.

Materiais e métodos

Os detalhes sobre os ensaios ADCC são encontrados na Secção 6.7. Neste ensaio, as células de carcinoma do cólon HT29 (n° de Acesso ATCC HTB-38) carregadas com índio-111 foram usadas como alvos e células efetoras foram PBMC que foram isoladas a partir de doadores utilizando um gradiente de Ficoll. As células alvo foram opsonizadas com anticorpos 4D5 quiméricos que compreendem as regiões de Fc variantes em concentrações finais de 2-5000 ng/mL. As células alvo opsonizadas foram então adicionadas às células efetoras para produzir uma razão efetor:alvo de 50:1 e incubadas durante 18 horas a 37 °C, 5% de CO2. Após a incubação, as células foram centrifugadas a ~220xg durante cinco minutos a 10 °C. O nível de índio-111 no sobrenadante foi gravado por um contador gama.

Resultados

Os anticorpos quiméricos 4D5 que compreendem regiões de Fc variantes MGFc88 (F243L, R292P, Y300L, V305I, P396L), MGFc88A (F243L, R292P, Y300L, P396L) e MGFcl55 (F243L, R292P, Y300L) foram selecionados com base numa maior afinidade para FcyRIIIA e/ou FcylIA e testados quanto à sua atividade de ADCC. As FIGS. 41A e B mostram que as variantes Fc testadas apresentam uma melhor atividade de ADCC em relação ao anticorpo de tipo selvagem em concentrações de opsonização acima de 20 ng/mL de um modo dependente da concentração. Os dados indicam que os mutantes de Fc identificados como compreendendo uma afinidade aumentada para FcyRIIIA são também prováveis de exibir atividade de ADCC melhorada.

6.16 CONTROLO DO CRESCIMENTO TUMORAL MEDIADO PELO Mutante de Fc NUM MODELO DE TUMOR IN VIVO

As mutações Fc identificadas como compreendendo afinidade reforçada para FcyIIIA e/ou FcylIA foram ainda analisadas quanto à eficácia relativa de controlo do tumor utilizando um sistema modelo de tumor in vivo.

Materiais e métodos

Os anticorpos portadores de mutantes de Fc foram testados quanto à atividade anti-tumor num sistema de xenoenxerto de murinos. Balbc/ratinhos nus são injetados por via subcutânea com 5xl06 células Daudi e, posteriormente, monitorizados por sinais gerais de doença, por exemplo, ganho/perda de peso e atividade de aliciamento. Sem tratamento, este sistema modelo resulta em 100% de mortalidade, com um tempo médio de sobrevivência de cerca de 2 semanas após a inoculação de células tumorais. O tratamento consiste em doses de anticorpo de tipo selvagem ou de anticorpo compreendendo uma região de Fc variante administrada em intervalos semanais. Animais administrados apenas com tampão nos mesmos intervalos serviram de controlo. 0 peso do tumor é calculado com base no volume estimado do tumor subcutâneo de acordo com a fórmula (comprimento2 X largura)/2.

Resultados

Em intervalos semanais, os ratinhos inoculados com células Daudi receberam 2B6 humanizado do tipo selvagem ("h2B6"), 2B6 humanizado compreendendo o mutante de FcMG0088 (F243L, R292P, Y300L, V305I P396L) ("h2B6 0088") ou tampão sozinho. O anticorpo h2B6 de tipo selvagem e mutante de Fc apresentou níveis semelhantes de supressão do tumor no esquema de dose mais elevada testado, doses semanais de 25 pg (FIGs. 42A e B). No entanto, foram observadas diferenças significativas na eficácia de anticorpos quando foram reduzidas as doses. Uma redução de 100 e 10 vezes nas dosagens de h2B6 de tipo selvagem não proporcionou grande controlo do tumor do que a administração de tampão isolado (FIG. 42 A). Em contraste, h2B6 0088 conferiu uma proteção significativa em doses semanais de 2,5 pg e, pelo menos, uma proteção limitada em doses semanais de 0,25 pg (FIG. 42 B) . A proteção conferida até mesmo pela dose mais baixa de anticorpo mutante de Fc foi confirmada em comparações de sobrevivência. Às 11 semanas, 4 em 7 ratinhos permaneceram vivos no grupo tratado com 0,25 pg de doses de h2B6 0088 em comparação com apenas 1 em 7 no grupo tratado com a mesma dose de h2B6 de tipo selvagem (FIGs. 43A e B).

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Macrogenics, Inc. <120> Identificação e manipulação de anticorpos com regiões de Fc variantes e métodos de utilização dos mesmos <130> 11183-055-228 <140> 60/707,419 <141> 2005-08-10 <160> 30 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

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Lisboa,

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um polipeptídeo compreendendo uma região de Fc variante de IgGl, em que a referida região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácidos em relação a uma região de Fc de IgGl de tipo selvagem, de tal modo que: (I) a referida região de Fc variante do referido polipeptideo se liga: (A) a FcyRIIIA com uma maior afinidade, e (B) a FcyRIIB com afinidade de ligação equivalente ou alterada; em que as referidas afinidades de ligação maiores, equivalentes ou alteradas são em relação às afinidades de ligação exibidas por tal polipeptideo ao referido FcyR se compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem; e (II) em que a referida pelo menos uma modificação de aminoácidos compreende uma substituição na posição 243 por leucina, na posição 292 por prolina, na posição 300 por leucina, na posição 305 por isoleucina e na posição 396 por leucina; em que as posições são numeradas de acordo com o indice EU como em Rabat.
2. O polipeptideo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polipeptideo é um anticorpo, ou um fragmento de um anticorpo, que contém a referida região de Fc variante.
3. O anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
4. 0 anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado.
5. 0 anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo compreende um dominio variável que se liga a CD16A ou CD32B.
6. 0 anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo é o anticorpo 2B6 produzido pelo hibridoma com a designação de depósito de patente PTA-4591.
7. 0 anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo é uma versão humanizada do anticorpo 2B6 produzido pelo hibridoma com a designação de depósito de patente PTA-4591 .
8. 0 anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo inibe competitivamente a ligação do anticorpo 2B6 produzido pelo hibridoma com a designação de depósito de patente PTA-4591 a CD32B.
9. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotideos que codifica o polipeptideo de acordo com a reivindicação 1.
10. Um vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9.
11. 0 vetor de acordo com a reivindicação 10 que é um vetor de expressão.
12. Uma célula hospedeira isolada compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11.
13. Um método para produzir de forma recombinante o polipeptideo de acordo com a reivindicação 1, o referido método compreendendo: (i) a cultura num meio de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica o referido polipeptideo sob condições adequadas para a expressão do referido polipeptideo; e (i i) a recuperação do referido polipeptideo a partir do referido meio.
14. O anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo ou o referido fragmento, adicionalmente se liga especificamente a um antigeno de cancro ou um antigeno de um agente infeccioso.
15. O anticorpo, ou seu fragmento, de acordo com a reivindicação 14, em que o referido anticorpo terapêutico faz a mediação a citotoxicidade melhorada mediada por células dependentes de anticorpo em relação a um anticorpo terapêutico comparável que compreende uma região de Fc de tipo selvagem.
16. 0 anticorpo, ou seu fragmento, de acordo com a reivindicação 14, em que o referido anticorpo terapêutico é trastuzumab, rituximab, IC14, edrecolomab, CMI-225, a versão humanizada do anticorpo monoclonal LM609, Campath 1H/LDP-03, epratuzumab, ou ibritumomab tiuxetan.
17. 0 anticorpo, ou seu fragmento, de acordo com a reivindicação 14, em que o referido antigeno do cancro é MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-acetilglicosaminil- transferase, pl5, beta-catenina, MUM-1, CDK4, HER-2/neu, virus do papiloma humano E6, virus do papiloma humano E7, ou MUC-1.
18. A utilização do anticorpo, ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 14 na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro num paciente com um cancro caracterizado pelo referido antigeno de cancro.
19. A utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o referido antigeno do cancro é MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-acetilglicosaminil-transferase, pl5, beta-catenina, MUM-1, CDK4, HER-2/neu, vírus do papiloma humano E6, vírus do papiloma humano E7, ou MUC-1.
20. A utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o referido antigeno de cancro é um antigeno de carcinoma da mama, do ovário, da próstata, do colo do útero, ou pancreático.
21. A utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o referido medicamento compreende adicionalmente uma composição quimioterapêutica, radioterapêutica, terapêutica hormonal, ou imunoterapêutica.
22. A utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o referido paciente é um ser humano.
23. Uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
24. Uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de acordo com a reivindicação 2, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
25. Uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou seu fragmento de acordo com a reivindicação 3, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
26. Uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
27. A composição de acordo com a reivindicação 26, compreendendo ainda um ou mais agentes anticancro adicionais.
28. As composições de acordo com a reivindicação 27, em que o referido um ou mais agentes anticancro é um agente quimioterapêutico, um agente terapêutico de radiação, um agente terapêutico hormonal, ou um agente imunoterapêutico.
29. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotideos que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a reivindicação 2.
30. Um vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29.
31. 0 vetor de acordo com a reivindicação 30 que é um vetor de expressão.
32. Uma célula hospedeira isolada compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29.
33. Um método para produzir de forma recombinante o anticorpo de acordo com a reivindicação 2, o referido método compreendendo: (i) a cultura num meio de uma célula hospedeira compreendendo (a) um ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotideos que codifica a cadeia leve do referido anticorpo; e (b) um ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotideos que codifica a cadeia pesada do referido anticorpo, sob condições adequadas para a expressão do referido anticorpo; e (ii) a recuperação do referido anticorpo do referido meio.
34. A utilização do polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, num medicamento para o tratamento ou controlo do cancro num paciente com um cancro caracterizado por um antigeno do cancro, em que o referido polipeptídeo se liga ao referido antigeno de cancro.
35. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo tem uma atividade de ADCC aumentada em relação à atividade de ADCC do referido anticorpo se compreendendo uma região de Fc de tipo selvagem.
36. 0 polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida região de Fc variante compreende ainda uma ou mais das modificações de aminoácidos listadas nas Tabelas 5, 6, 7, ou 8. Lisboa,