KR20010031713A - 맥관형성 및 종양 성장 억제제인 맥관 내피 세포 성장억제제 - Google Patents

맥관형성 및 종양 성장 억제제인 맥관 내피 세포 성장억제제 Download PDF

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리루얀
챠이위판
유궈량
니쟝
립만마크이.
로젠크레이그에이.
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벤슨 로버트 에이치.
휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드
추후보정
조지타운 유니버시티 메디칼 센터
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Abstract

본 발명은 세포 모델에서 맥관형성을 억제하고 동물 모델에서 종양발생을 억제시킬 수 있는 맥관 내피 세포 억제제인 VEGI, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

맥관형성 및 종양 성장 억제제인 맥관 내피 세포 성장 억제제{VEGI, An inhibitor of angiogenesis and tumor growth}
사람이나 동물은 극히 특이하게 제한된 환경에서의 정상적인 생리학적 조건 하에서 특정 조직이나 기관 내로 새로운 맥관을 생성시키는 현상인 맥관형성(angiogenesis)를 겪게 된다. 예를 들면, 맥관형성은 상처 치유, 및 황체, 자궁내막 및 태반의 배아 발육과 형성시 통상 관찰된다. ″자궁내막″이란 용어는 장막강, 임파관 및 맥관을 둘러싸고 있는 평편한 상피 세포 박막을 의미한다. ″항-맥관 생성″ 또는 ″맥관 생성 억제 활성″이란 용어는 일반적으로 맥관형성을 억제시키는 특정 분자의 능력을 의미한다.
조절된 맥관형성과 조절되지 못한 맥관형성 모두는 유사한 방식으로 진행되는 것으로 여겨진다. 기저막으로 둘러싸여진 맥관주위 세포와 내피 세포는 모세혈관을 형성한다. 맥관형성은 내피 세포와 백혈구에 의해 방출된 효소에 의한 기저막의 미란(erosion)으로 시작된다. 이때, 맥관의 구경(lumen)을 둘러싸고 있는 내피 세포가 이러한 기저막을 통하여 돌출된다. 맥관형성 자극기는 이러한 내피 세포가 상기와 같이 미란된 기저막을 통하여 이동하도록 유도한다. 이와 같이 이동하는 세포는 모 맥관의 ″움(sprout)″을 형성시키며, 여기서 내피 세포가 유사분열되어 증식된다. 이러한 내피성 움은 서로 통합하여 새로운 맥관을 생성시키는 모세관 루프를 형성한다.
지속적으로 조절되지 못한 맥관형성은 각종 질환 증세, 종양 전이 및 내피 세포에 의한 비정상적인 성장에서 나타나며 이러한 질환 상태에서 보여지는 병리학적 손상을 뒷받침해준다. 조절되지 못한 맥관형성으로 인해 나타나는 다양한 병리학적 질환 상태를 통틀어서 맥관형성 의존성 또는 맥관형성 관련 질환으로 분류하였다.
종양 성장 동안, 내피 세포가 증식하어 지질 내로 침입하며, 암 세포와 같은 맥관형성 자극인자의 제공원 쪽으로 이동하고, 맥관 주변 세포 및 지질 세포와 상호작용하게 되어, 궁극적으로는 종양 조직을 순환계에 연결시키는 모세 맥관이 형성된다[참조: J. Folkman (1995) Nat. Med. 1:27-31]. 이와 같이 맥관형성을 조절하는 상당히 복잡한 기전이 아직까지 밝혀지진 않았지만, 이러한 진행 과정의 개시 또는 종결은 맥관형성의 포지티브 조절인자와 네가티브 조절인자 간의 균형에서 비롯된 것임은 명백한 일이다. FGF-1[참조: G. Gimenez-Gallego et al. (1985) Science 230:1385], FGF-2[참조: L. Schweigerer et al. (1987) Nature 325:257]와 같은 섬유아세포 성장 인자 계열의 몇몇 구성원; 및 맥관 내피 세포 성장 인자 계열(VEGF)[참조:D. W. Leung et al. (1989) Science 246:1306]의 몇몇 구성원 뿐만 아니라 이들 성장 인자의 수용체[참조: L. W. Burrus and B.B. Olwin (1989) J. Biol. Chem. 264:18647; S. Wennstrome et al. (1991) Growth Factors 4:197; B. Terman et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579; C. de Vries et al. (1992) Science 255:989]를 포함한, 종종 종양 조직에서 현저하게 조절되지 못하는 수 많은 맥관형성 인자가 상기 문헌에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 문헌은 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다.
트롬보스폰딘[참조: D.J. Good et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6624], 안지오스타틴[참조: M.S. O'Reilly et al. (1994) Cell 79:315], 엔도스타틴[참조: M.S. O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277] 및 혈소판 인자-4[참조: E. Maione et al. (1991) Science 247:77]를 포함한 몇몇 맥관형성 억제제가 또한 보고되었다. 정상적인 맥관형성은 요구될 때마다 즉시 활성화되고, 더 이상 필요하지 않으면 신속하게 종결되는 반면, 병리학적 맥관형성은 일단 개시되면 종종 오래 끌게 되어 중단시키기가 어렵다. 이는 정상적인 맥관형성 진행 과정에서 작용하는 네가티브 조절 기전이 병리학적 맥관형성 진행 과정에서는 없거나 생락된다는 것을 지시해준다. 수 많은 전구체로부터 맥관형성 억제제를 방출시키는 단백질 분해 활성이 부분적으로는, 플라스미노겐으로부터의 안지오스타틴의 단백질 분해 활성과 콜라겐 XVIII로부터의 엔도스타틴의 단백질 분해 활성으로 지시된 바와 같이, 맥관형성의 하향-조절에 기인된 것일 수 있다는 사실이 제안되었다[참조: M.S. O'Reilly, (1997) Cell 88:277]. 공지된 많은 맥관형성 조절인자는 다상유전성이며 다른 세포 유형 뿐만 아니라 이러한 조절인자를 생성하는 세포 상에서 작용할 수 있긴 하지만, 내피 세포가 맥관형성 진행 과정을 억제시키거나 성숙한 맥관계의 휴지 상태를 유지시키는 오토크린(autocrine) 인자를 생성시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 맥관형성의 오토크린 조절인자중 어떠한 것도 앞서 기재된 바가 없다. 본원에는 내피 세포에 의해 특이적으로 발현된, 맥관 내피 세포 성장 억제제(VEGI)로 불리우는, 신규한 맥관형성의 오토크린 네가티브 조절인자가 기재되어 있다.
본원에 기재된 단백질이 1994년 11월 7일자로 출원된 EP95903521.3에 처음으로 TNF-감마로서 기재되긴 하였지만, 이러한 단백질의 맥관형성 억제 기능은 상기 특허원에 언급되어 있지 않다. 당해 단백질은 30,000개의 발현된 서열 태그(expressed sequence tag: EST)를 발생시키는 각종 내피 세포로부터 유도된 RNA를 사용하여 8개 cDNA 라이브러리를 작제함으로써 발견되었다. 내피 세포에 독특한 EST를 대상으로 하여, 공지된 단백질 계열, 특히 사이토킨에 대한 서열 상동성에 대해 추가로 특징 확인하였다. EST 한 그룹의 추론된 아미노산 서열은 종양 괴사 인자(TNF)의 컨센서스(consensus) 아미노산 서열을 함유하고 있다. 완전한 길이의 cDNA 클론을 수득하기 위하여, 초기 클론 중의 하나로부터 방사선 표지된 프로브를 사용하여 사람 제대 정맥 내피(HUVE) 세포 라이브러리를 스크리닝한다. 몇몇 포지티브 클론을 분리하여 서열분석한다. 가장 긴 cDNA 클론은 174개 아미노산의 개방 판독 프레임을 암호화하는 4.5킬로염기의 삽입체 및 3' 말단과 5' 말단 모두에 긴 비해독 영역을 함유하고 있다. 예상된 개시 코돈의 인-프레임 정지 코돈 상단은 해독이 추가의 상단으로 진행되지 않았다는 것을 지시해준다. 이러한 신규 단백질은 사람 TNFα, TNFβ 및 Fas 리간드와 20 내지 30% 서열 상동율을 나타낸다. 주형으로서 상기 cDNA 클론을 사용하는 실험관내 전사 및 해독 실험에서, 예상된 개방 판독 프레임과 일치하는 분자량 22kD의 단백질을 생성하였다. 이 단백질을 대상으로 소수성 분석한 결과, 14개의 비-소수성 아미노산의 N-말단 세그먼트 바로 다음에 12개의 아미노산 소수성 영역이 있는 것으로 예상되었다. 이는 TNF와 유사한 유형 II 트랜스멤브레인(transmembrane) 단백질의 구조와 일치한다[참조: B.B. Aggarwal and K. Natarajan (1996) Eur. Cytokine News. 7:93].
각종 직계의 22가지 상이한 유형의 배양 세포로부터의 전체 RNA 제제를 최근 방식으로 노던(Northern) 분석한 결과, 이러한 단백질에 대한 전사체가 내피 세포의 두 라인, 즉 초기 계대접종의 HUVE 세포 및 사람 정맥성 내피 세포에서만 검출될 수 있는 것으로 나타났다. mRNA는 후기 계대접종의 사람 정맥성 내피 세포에서는 검출되지 않았고, 또한 사람 동맥 세포에서도 관찰되지 않았다. 이와는 현저하게 대조적으로, TNF 계열 구성원은 대부분이 면역 세포에서 발현되었다[참조: B.B. Aggarwal and K. Natarajan (1996), 상기 참조]. 예를 들면, TNFα는 대식세포, 단구, 호중구 및 T 세포에 의해 생성되는 반면, TNFβ는 미토겐-자극된 T 임파구 및 백혈구에 의해 주로 생성된다. 유사하게, Fas 및 기타 TNF 계열 구성원, CD27, CD30, CD40, OX40 및 4-1BB에 대한 리간드가 모두 면역 시스템 내의 세포 유형으로 발현된다. 다중 조직 노던 블롯을 사용한 결과, VEGI 전사체가 태반, 폐, 신장, 골격근, 뇌, 간, 흉선, 고환, 난소 및 말초혈 임파구에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 이러한 단백질의 신규한 기능을 확인하여 기재하고 있다. 상기 언급된 단백질의 절단된 형태가 내피 세포 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 단백질은 맥관 내피 세포 성장 억제제(VEGI)로 명명된다. 추정상의 세포외 도메인에 상응하는 39 내지 174번 잔기로 이루어진 절단된 형태의 VEGI를 이. 콜라이(E. coli)에서 발현시키고, 분리한 다음 각종 세포상 검정으로 검사한다. 이와 같이 절단된 형태의 VEGI는 내피 세포의 증식을 특이적으로 억제하고, 시험관내 모델에서 모세혈관-유사 관의 형성을 억제하며, 무흉선 누드 암컷 마우스의 유선 패드에서 사람 유방암 이종이식체의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
〈발명의 요약〉
본 발명은 일반적으로 내피 세포 증식 억제제 및 특히 맥관형성 억제제, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. VEGI의 완전한 뉴클레오티드 서열이 서열 1, 서열 8, 서열 26에 제시되어 있고, 암호화된 아미노산 서열은 서열 2, 서열 9 및 서열 27에 각각 제시되어 있다. 추정상의 세포외 도메인에 상응하는 39 내지 174번 잔기(서열 3)로 이루어진 절단된 형태(truncated form)의 상기 단백질이 내피 세포의 증식을 특이적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다. VEGI는 시험관내 맥관형성 모델에서 모세혈관-유사 관의 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 최종적으로, VEGI가 무흉선 누드 마우스에서 이종이식 종양의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 변형된 형태의 VEGI를 약제학적으로 허용되는 양으로 포함하는 맥관형성 억제제를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 VEGI 기능을 저하시키거나 없애는 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 길항제, 리보자임, 약물 또는 약제를 약제학적으로 허용되는 양으로 포함하는 맥관형성 증진제를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 실질적으로 정제된 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 변형된 형태의 VEGI를 맥관형성 억제에 충분한 용량으로 포함하는 조성물을 사람 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 맥관형성을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 VEGI 기능을 저하시키거나 없애는 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 길항제, 리보자임, 약물 또는 제제를 포함하는 조성물을 사람 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 맥관형성을 증진시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은
(ⅰ) 병리학적 맥관형성을 나타내는 것으로 추정되는 개개인으로부터의 샘플을 본 발명의 VEGI 폴리펩티드에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계; 및
(ⅱ) VEGI와 상기 항체 간에 형성된 복합체의 존재 또는 부재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 특정 샘플 중에서 VEGI 폴리펩티드의 존재 또는 부재 여부를 검출하는 것을 포함하여 병리학적 맥관형성을 진단하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은
(ⅰ) 병리학적 맥관형성을 나타내는 것으로 추정되는 개개인으로부터의 샘플을 VEGI 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA)와 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 및
(ⅱ) VEGI 폴리뉴클레오티드와 이에 특이적인 올리고뉴클레오티드 간에 형성된 이중체(duplex)의 존재 또는 부재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 특정 샘플 중에서 VEGI 폴리뉴클레오티드(바람직하게는 RNA)의 존재 또는 부재 여부를 검출하는 것을 포함하여 병리학적 맥관형성을 진단하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 VEGI의 특정 영역을 특이적으로 증폭시키는, 서열 1, 서열 8 및 서열 26에 도시된 바와 같은 VEGI의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 프라이머를 고안하는 것으로 포함하여, 폴리머라제 쇄 반응을 이용하여 병리학적 맥관형성을 진단하는 방법을 제공한다. 이러한 프라이머는 사용하여 VEGI DNA 또는 VEGI RNA를 증폭시킬 수 있으며, 나중에 후자 RNA를 역전사시킴으로써 이를 상보성 DNA(cDNA)로 전환시킨다. 이와 같이 증폭된 생성물을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 생성시킬 수 있는 표준물과 비교함으로써, PCR 검정을 정량적으로 수행할 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 하이브리드화 검정에 의해 특정 샘플 중에서의 VEGI RNA 또는 DNA의 존재 또는 부재 여부를 검정하는 것을 포함하여, 특정 샘플에서 VEGI 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대하여 조심스럽게 결합되는 항체, VEGI DNA 또는 RNA와 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드, 및/또는 VEGI DNA 또는 RNA 증폭용 PCR 프라이머 및 특정 샘플에서 VEGI의 존재 여부를 검출하는데 사용하기 적합한 보조 시약을 포함하는 진단용 또는 예후용 키트를 제공한다. VEGI는 막 단백질로서 작용할 수 있기 때문에, 천연의 가용성 형태의 막-결합된 VEGI는 이의 길항제로서 작용할 수 있으며, 이러한 가용성 형태를 검출하는 방법이 본 발명의 또 다른 양태에 포함된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 VEGI 발현 또는 기능을 저하시키거나 증가시키는 결과를 가져오는 VEGI 폴리뉴클레오티드에서의 돌연변이 존재 여부를 검출하는 것을 포함하는 진단 검정법을 제공한다. 이러한 검정법로는 간단히 언급해서 하이브리드화 검정, 제한 지도 다형성 검정 및 유전자 서열분석 방법이 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 맥관형성이 억제되기에 유효한 양의 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 다음에 언급되는 질환 치료를 필요로 하는 개개인에게 제공하는 것을 포함하여, 맥관형성이 조절되지 않거나 과도하게 나타나며 이의 억제를 필요로 하는 맥관종, 고형 종양, 백혈병, 전이, 모세관확장증, 건선 공피증, 화농성 육아종, 심근 맥관형성, 플라그 신생혈관화, 관상 측부, 허혈성 지(limb) 맥관형성, 각막성 질환, 피부조홍, 신생혈관성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 수정체 뒤의 섬유증식증, 관절염 및 당뇨병성 신생혈관화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 맥관형성에 의해 매개되는 진행 과정과 질환을 치료하는 방법 및 이를 치료 또는 완화시키기 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 약제학적으로 허용되는 양의 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 길항제, VEGI 폴리뉴클레오티드에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 VEGI 기능을 저하시키거나 없애는 항-VEGI 항체, 제제 또는 약물을 다음에 언급되는 질환의 치료를 필요로 하는 개개인에게 투여하는 것을 포함하여, 맥관형성이 요망되는 퇴화성 반점, 상처 치유, 소화성 궤양, 골절, 해족증, 맥관형성, 조혈, 배란, 월경 및 태반형성 등의 질환을 치료하는 방법 및 이를 치료 또는 완화시키기 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명은 실질적으로 정제된 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 암 성장 억제제 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 특정 샘플 중에서의 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 존재 또는 부재 여부를 검출하거나, 또는 VEGI의 발현 또는 기능을 변형시키는 VEGI 폴리뉴클레오티드에서의 돌연변이를 검출함으로써, 암을 검출 및 예후하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 시험 대상 약물 또는 제제가 VEGI 발현을 상향 조절할 수 있는지를 시험함으로써, 이러한 예상되는 약물 또는 제제를 대상으로 하여 맥관형성 억제 활성을 시험하는 방법을 제공한다. VEGI는 기타 맥관형성 억제제와 마찬가지로, 아마도 세포막으로부터 상기 단백질을 방출시키는 프로테아제에 의해 활성화되기 때문에, 프로테아제 뿐만 아니라 금속 이온과 같이 이러한 활성을 촉진시키는 기타 제제가 VEGI의 발현을 증가시키기 위한 제제로서 유용할 것이다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 시험 대상 약물 또는 제제가 VEGI 발현의 상향 조절에 의해 맥관형성을 억제시킬 수 있는지를 시험함으로써, 예상되는 항종양제 또는 약물을 시험하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 시험 대상 약물 또는 제제가 VEGI 기능(예를 들어, 맥관형성의 억제)을 차단시킬 수 있는지를 시험함으로써, 맥관형성을 증진시키는 예상되는 약물 또는 제제를 시험하는 방법을 제공한다. 이러한 경우, 앞서 언급된 바와 같이 VEGI를 활성화시키는 프로테아제, 또는 금속 이온과 같이 이러한 활성화에 요구되거나 이를 촉진시키는 제제의 억제를 이용하여 VEGI를 하향-조절할 수 있으며, 이로써 맥관형성을 상향조절시킬 수 있다.
도 1은 VEGI 전사체의 노던 블롯팅 분석을 나타낸 것이다. 패널 A, 사람 세포에서의 VEGI 발현: 저캣(Jurkat), 사람 T 세포 백혈병 세포; L923, 사람 배아 신장 세포; HL60, 사람 전골수구성 백혈병; VE, 사람 정맥성 내피 세포(10번째 계대배양); A431, 사람 유표피암; VE-2, 사람 정맥성 내피 세포(20번째 계대배양); 라지(Raji), 사람 부르키트(Burkitt) 임파종; A.E, 사람 동맥성 내피 세포; THP-1, 사람 단구성 백혈병; CCD-29Lu, 사람 폐기종; CAMA1, 유방암; AN3CA, 위궤양; SK.UT.1, 위암; MG63, 골아세포종; HOS, 골아세포종; MCF7, 유방암; OVCAR-3, 난소암; CAOV-3, 난소암; HUVEC, 사람 제대 정맥 내피 세포; AOSMIC, 평활근. 평가된 메세지 크기는 6.5kb이다. 패널 B, 각종 유형의 사람 조직에서의 VEGI 발현: 3가지 별개의 블롯을 수행하였다. 3가지 실험 중 어느 것으로부터의 양성 결과가 제시되어 있다.
도 2는 내피 세포 및 유방암 세포의 증식에 대한 VEGI의 효과를 도시한 것이다. 지시된 바와 같은 수의 세포를 VEGI 농도에 대하여 블롯팅한다. ABAE 세포의 성장은 억제시키지만(흰색 원), MDA-MB231 세포(삼각형) 또는 MDA-MB-435 세포(사각형)는 억제시키지 못하는 것으로 나타났다.
도 3은 콜라겐 겔 상에서 ABAE 세포에 의해 모세혈관-유사 관의 형성을 억제시키는 VEGI의 능력을 도시한 것이다. 칼럼 위에 제시된 p-값(t-시험)은 지시된 바와 같이 각종 농도의 VEGI의 존재하에서 ABAE 세포에 의한 모세혈관-유사 관 형성 정도를, VEGI가 배양 배지에 존재하지 않는 경우와 비교함으로써 수득한다. 모세혈관-유사 구조의 존재비는 측정된 총 면적에 대한 백색 면적의 비율(%)로서 측정한다.
도 4는 VEGI에 의한 무흉선 누드 마우스에서의 사람 유방암 이종이식 종양의 성장 억제를 도시한 것이다. 패널 A: 접종-후 시간(일) 함수로서의 MDA-MB-231 이종이식 종양의 크기(㎟)를 플롯팅한 것이다. 패널 B: 접종-후 시간(일) 함수로서의 DA-MB-435 이종이식 종양의 크기(㎟)를 플롯팅한 것이다. 흰색 동그라미는 벡터-형질감염된 CHO 세포로 공-접종된 것이다. 검은색 원은 분비된 VEGI 형질감염된 CHO 세포로 공-접종된 것이다.
도 5A, 5B 및 5C는 본 발명의 VEGI-알파의 폴리펩티드의 cDNA(서열 8) 및 상응하는 추론된 아미노산 서열(서열 9)를 나타낸 것이다. 초기 27개 아미노산(밑줄쳐져 있음)가 추정상의 리더 서열이다. 아미노산에 대한 표준 대문자 약어가 사용된다. 효능있는 아스파라긴-연결된 글리코실화 부위가 도 5A, 5B 및 5C에서, VEGI-알파 아미노산 서열에서 진한 아스파라긴 부호(N)로 표시되었으며 VEGI-알파 뉴클레오티드 서열에서 상기 아스파라긴 잔기를 암호화하는 첫 번째 뉴클레오티드 위에 진한 파운드 부호(#)로 표시되었다. 효능있는 N-연결된 글리코실화 서열이 VEGI-알파 아미노산 서열 중의 다음 번호의 위치에서 발견되었다: N-29 내지 N-32(N-29, Y-30, T-31, N-32) 및 N-125 내지 D-128(N-125, V-126, S-127, D-128). 효능있는 단백질 키나제 C(PKC) 포스포릴화 부위가 또한 도 5A, 5B 및 5C에서, VEGI-알파 아미노산 서열에서 진한 트레오닌 부호(T)로 표시되었으며 VEGI-알파 뉴클레오티드 서열에서 상기 트레오닌 잔기를 암호화하는 첫 번째 뉴클레오티드 위에 별표(*)로 표시되었다. 효능있는 PKC 포스포릴화 서열이 VEGI-알파 아미노산 서열 중의 다음 위치에서 발견되었다: T-32 내지 K-34(T-32, N-33, K-34) 및 T-50 내지 R-52(T-50, F-51, R-52). 효능있는 카제인 키나제 II(CK2) 포스포릴화 부위가 또한 도 5A, 5B 및 5C에서, VEGI-알파 아미노산 서열에서 진한 세린 또는 트레오닌 부호(S 또는 T)로 표시되었으며 VEGI-알파 뉴클레오티드 서열에서 적당한 세린 또는 트레오닌 잔기를 암호화하는 첫 번째 뉴클레오티드 위에 별표(*)로 표시되었다. 효능있는 CK2 포스포릴화 서열이 VEGI-알파 아미노산 서열 중의 다음 번호의 위치에서 발견되었다: S-83 내지 E-86(S-83, Y-84, P-85, E-86); S-96 내지 E-99(S-96, V-97, C-98, E-99); S-115 내지 E-118(S-115, L-116, Q-117, E-118); S-130 내지 D-133(S-130, L-131, V-132, D-133); 및 T-135 내지 D-138(T-135, K-136, E-137, D-138). 효능있는 미리스틸화 부위가 또한 도 5A, 5B 및 5C에서, VEGI-알파 아미노산 서열에서 이중 밑줄로 표시되었다. 효능있는 미리스틸화 서열이 VEGI-알파 아미노산 서열 중의 다음 번호의 위치에서 발견되었다: G-20 내지 K-25(G-20, L-21, A-22, F-23, T-24, K-25) 및 G-111 내지 L-116(G-111, A-112, M-113, F-114, S-115, L-116).
도 6A 및 6B는 본 발명의 VEGI-베타의 폴리펩티드의 cDNA(서열 26) 및 상응하는 추론된 아미노산 서열(서열 27)를 나타낸 것이다. 아미노산에 대한 표준 대문자 약어가 사용된다. 아미노산 메티오닌-1 내지 트립토판-35가 예상되는 세포내 도메인이다. 아미노산 잔기 알라닌-36 내지 알라닌-61(밑줄쳐져 있음)이 추정상의 트랜스멤브레인 서열이다. 아미노산 잔기 글루타민-62 내지 루이신-251(밑줄쳐져 있음)이 추정상의 트랜스멤브레인 서열이다. 효능있는 아스파라긴-연결된 글리코실화 부위가 도 6A 및 6B에서, VEGI-베타 아미노산 서열에서 진한 아스파라긴 부호(N)로 표시되었으며 VEGI-베타 뉴클레오티드 서열에서 상기 아스파라긴 잔기를 암호화하는 첫 번째 뉴클레오티드 위에 진한 파운드 부호(#)로 표시되었다. 효능있는 N-연결된 글리코실화 서열이 VEGI-베타 아미노산 서열 중의 다음 번호의 위치에서 발견되었다: N-133 내지 N-136(N-133, Y-134, T-135, N-136) 및 N-229 내지 D-232(N-229, V-230, S-231, D-232). 효능있는 단백질 키나제 C(PKC) 포스포릴화 부위가 또한 도 6A 및 6B에서, VEGI-베타 아미노산 서열에서 진한 세린 또는 트레오닌 부호(S 또는 T)로 표시되었으며 VEGI-베타 뉴클레오티드 서열에서 상기 트레오닌 잔기를 암호화하는 첫 번째 뉴클레오티드 위에 별표(*)로 표시되었다. 효능있는 PKC 포스포릴화 서열이 VEGI-베타 아미노산 서열 중의 다음 번호의 위치에서 발견되었다:S-23 내지 R-25(S-23, C-24, R-25); S-32 내지 R-34(S-32, A-33, R-34); T-135 내지 K-137(T-135, N-136, K-137); 및 T-154 내지 R-156(T-154, F-155, R-156). 효능있는 카제인 키나제 II(CK2) 포스포릴화 부위가 또한 도 6A 및 6B에서, VEGI-베타 아미노산 서열에서 진한 세린 또는 트레오닌 부호(S 또는 T)로 표시되었으며 VEGI-베타 뉴클레오티드 서열에서 적당한 세린 또는 트레오닌 잔기를 암호화하는 첫 번째 뉴클레오티드 위에 별표(*)로 표시되었다. 효능있는 CK2 포스포릴화 서열이 VEGI-베타 아미노산 서열 중의 다음 번호의 위치에서 발견되었다: S-8 내지 E-11(S-8, F-9, G-10, E-11); S-187 내지 E-190(S-187, Y-188, P-189, E-190); S-200 내지 E-203(S-200, V-201, C-202, E-203); S-219 내지 E-222(S-219, L-220, Q-221, E-222); S-234 내지 D-237(S-234, L-235, V-236, D-237); 및 T-239 내지 D-242(T-239, K-240, E-241, D-242). 효능있는 미리스틸화 부위가 또한 도 6A 및 6B에서, VEGI-베타 아미노산 서열에서 이중 밑줄로 표시되었다. 효능있는 미리스틸화 서열이 VEGI-베타 아미노산 서열 중의 다음 위치에서 발견되었다: G-6 내지 E-11(G-6, L-7, S-8, F-9, G-10, E-11); G-124 내지 G-129(G-124, L-125, A-126, F-127, T-128, K-129); 및 G-215 내지 L-220(G-215, A-216, M-217, F-218, S-219, L-220).
도 7은 VEGI-알파 아미노산 서열(서열 9)의 분석을 도시한 것이다. 상술된 컴퓨터 프로그램의 생략성 파라미터를 사용하여 예견된 바와 같은, 알파, 베타, 턴 및 코일 영역; 친수성 및 소수성; 양극성 영역; 가요성 영역; 항원성 지수 및 표면 확률이 제시되어 있다. ″항원성 지수 또는 자메슨-볼프 그래프(Jameson-Wolf)″에서, 양성 피크는 VEGI 폴리펩티드의 고도의 항원성 영역, 즉 본 발명의 에피토프-보유 펩티드가 수득될 수 있는 영역의 위치를 지시한다.
본 발명의 단백질의 DNA 서열 및 아미노산 서열이 TNF-감마로서 EP95903521.3에 기재되어 있긴 하지만, 이러한 분자의 신규한 항-맥관형성 활성과 신규한 내피 세포 억제 활성은 기재되어 있지 않다.
따라서, 한 양태에 있어서, 본 발명은 맥관 내피 세포 성장을 억제시키는 VEGI 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 및 이들 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 투여하는 것을 통하여 맥관형성에 의해 매개되거나 이와 관련된 질환 및 진행 과정을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 혈청, 뇨 및 복수를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 체액으로부터 분리할 수 있거나, 또는 화학적 또는 생물학적 방법(예를 들어, 세포 배양, 재조합 유전자 발현)에 의해 합성할 수 있다. 재조합 기술에는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 사용하여 DNA 공급원으로부터 유전자 증폭시키는 기술, 및 역 전사효소/PCR을 사용하여 RNA 공급원으로부터 유전자 증폭시키는 기술이 포함된다. VEGI는 맥관이 맥관화되지 않거나 맥관화된 종양과 같은 조직 내로 성장하는 것을 억제시킨다. 본 발명은 분자량이 대략 22kD인 단백질, 및 내인성 성장 인자의 맥관형성 활성을 극복할 수 있는 글리코실화 형태의 단백질과 같은 후-해독 변형물 또는 절단물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 상기 단백질의 변형된 어떠한 형태를 포함한다. VEGI에 대한 뉴클레오티드 서열은 서열 1, 서열 8 및 서열 26에 제시되어 있고, VEGI에 대한 아미노산 서열은 서열 2, 서열 9 및 서열 27에 각각 제시되어 있다. 활성 형태의 VEGI는 서열 2에 제시된 단백질의 39 내지 174번 아미노산에 걸쳐 있다. 천연 형태의 VEGI는 결정되지 않았다. 생물학적 활성 형태가 이량체, 삼량체 또는 다량체일 수 있다. 본 발명은 또한, 맥관형성의 억제를 가져다 주는 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 내에 함유된 특이적 에피토프 또는 도메인 및 서열의 대립유전자 변이에 관한 것이다. 이들 서열을 사용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 항-VEGI 제제를 고안하거나, 또는 VEGI 기능을 억제시키는 항체를 생성시킬 수 있으며, 이러한 서열 및 제제가 맥관형성-관련 질환의 완화 또는 예방에 유용하다.
사람 VEGI의 서열이 제시되고 기재되긴 하였지만, 사람 VEGI는 소 및 마우스 내피 세포 성장을 억제할 수 있기 때문에, VEGI가 이들 종에서 잘 보존되어 있다는 것을 인지해야 한다. 다른 종으로부터의 VEGI의 서열은 본원에 기재된 서열 및 기능 정보를 이용하여 클로닝할 수 있다. 따라서, 사람 이외의 종으로부터의 VEGI 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드가 또한 본원에 포함된다.
본 발명은 부가적으로, 클로닝된 cDNA(HUVE091)을 서열분석함으로써 결정되는, 도 5A, 5B 및 5C에 제시된 아미노산 서열(서열 9)을 갖는 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 VEGI 폴리펩티드는 사람 VEGI(서열 10), VEGI-베타(서열 11), 사람 림포톡신-베타(서열 12) 및 FAS 리간드(서열 13)과 서열 상동성을 나타낸다. 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능에는 맥관형성의 억제, 항-종양 사이토킨-유사 분자로서, 맥관형성 및/또는 골 및 연골에서 판누스(pannus)를 침입하는 것과 관련된 내피 세포 증식의 억제에 의한 관절염 치료제로서, NF-κB 및 c-Jun 키나제(JNK)의 유도제로서, 세포 유착 유도제로서 및 아포프토시스(apoptosis)의 유도제로서 기능이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열은 1994년 10월 26일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 수탁번호 제75927호로 기탁된 cDNA 클론(HUVE091)을 서열분석함으로써 수득된다. 이와 같이 기탁된 플라스미드는 pBluescript SK(-) 플라스미드(Stratagene, La Jolla, CA)에 함유되어 있다.
본 발명은 또한, 클로닝된 cDNA(HEMCZ56)을 서열분석함으로써 결정되는, 도 6A 및 6B에 제시된 아미노산 서열(서열 27)을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열 26)을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 이러한 VEGI-베타 폴리펩티드는 본원에 기재된 VEGI 폴리펩티드의 스플라이스 변이체이다. 서열 26에 제시된 뉴클레오티드 서열은 1998년 7월 9일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 수탁번호 제203055호로 기탁된 cDNA 클론(HEMCZ56)을 서열분석함으로써 수득된다. 이와 같이 기탁된 플라스미드는 pBluescript SK(-) 플라스미드(Stratagene, La Jolla, CA)에 함유되어 있다.
핵산 분자
핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 ″뉴클레오티드 서열″이란 DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드의 서열, 및 RNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대하여 상응하는 리보뉴클레오티드(A, G, C 및 U)의 서열을 의도하며, 여기서 특정화된 데옥시리보뉴클레오티드 서열 중의 각 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드(T)가 리보뉴클레오티드 우리딘(U)으로 대체된다.
도 5A, 5B 및 5C에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열 8) 또는 도 6A 및 6B에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열 26)과 같은 본원에 제공된 정보를 사용하여, 표준 클로닝 및 스크리닝 과정, 예를 들면, 출발 물질로서 mRNA을 사용하여 cDNA를 클로닝하는 과정을 이용하여 VEGI 또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자(즉, 폴리뉴클레오티드)를 수득할 수 있다. 예를 들면, VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 VEGI를 발현시키는 어떠한 세포 또는 조직 공급원, 예를 들면, 사람 신장 및 제대 정맥 내피 세포로부터 통상적으로 수득할 수 있다. 본 발명의 예로써, 도 5A, 5B 및 5C에 기재된 핵산 분자(서열 8)가 사람 제대 정맥 내피 세포로부터 유도된 cDNA 라이브러리에서 발견되었다. VEGI에 상응하는 cDNA 클론(클론 HUVE091)은 이의 대략 첫 번째 27개 아미노산 잔기가 추정상의 리더 서열이어서 성숙한 단백질이 147개 아미노산을 포함하는 174개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임을 함유하고 있다. 이러한 단백질은 래빗트 TNF-α에 대한 C-말단에서 가장 높은 상동율을 나타내고[참조: Ito, H., et al., DNA 5:157-165 (1986); GeneBank Accession No. M12846; 서열 14] 111개 아미노산 연결물에 대해 38% 동질율과 58% 유사율을 나타낸다. TNF 계열 구성원 전반에 걸쳐 보존된 서열이 또한 VEGI에 보존되어 있다.
VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 유도된 내피 세포 및 휴지기 내피 세포, 제대 정맥, 편도선, 및 몇몇 기타 세포 및 조직 유형으로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 예로써, 도 6A 및 6B에 기재된 핵산 분자(서열 26)가 유도된 내피 세포로부터 유도된 cDNA 라이브러리에서 발견되었다. VEGI-베타에 상응하는 cDNA 클론(HEMCZ56)은 이의 대략 첫 번째 35개 아미노산 잔기가 추정상의 세포내 도메인이고 36 내지 61번 아미노산이 추정상의 트랜스멤브레인 도메인이며 62 내지 251번 아미노산 잔기가 추정상의 세포외 도메인인 251개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임을 함유하고 있다.
이러한 세포외, 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인을 구성하고 있는 아미노산 잔기가 컴퓨터 분석에 의해 예견되었다. 따라서, 당해 분야의 숙련인이 인지하는 바와 같이, 이들 도메인을 구성하고 있는 아미노산 잔기는 각 도메인을 규정하는데 사용되고 있는 기준에 따라서 약간씩(예를 들어, 약 1 내지 약 15개 아미노산 잔기) 다를 수 있다.
본 발명의 국면에 따라서, 도 5A, 5B 및 5C의 추론된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 1994년 10월 26일에 ATCC 수탁번호 제75927호로 기탁된 HUVE091로 명명된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)이 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 국면에 따라서, 도 6A 및 6B의 추론된 아미노산 서열(서열 27)을 갖는 성숙한 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 1998년 7월 9일에 ATCC 수탁번호 제203055호로 기탁된 HEMCZ56으로 명명된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)이 제공된다.
″분리된″ 핵산 분자(들) 또는 폴리뉴클레오티드란 이의 천연 환경으로부터 제거된 분자, 즉 DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들면, 특정 벡터에 함유된 재조합 DNA 분자(폴리뉴클레오티드)는 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 간주된다. 분리된 DNA 분자(폴리뉴클레오티드)의 추가의 예로는 이종 숙주 세포에 보유된 재조합 DNA 분자 또는 용액 중에 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) DNA 분자가 있다. 분리된 RNA 분자(폴리뉴클레오티드)로는 본 발명의 DNA 분자(폴리뉴클레오티드)의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체가 있다. 본 발명에 따르는 추가의 분리된 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드로는 합성적으로 생성된 상기 분자가 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA의 형태로 존재하거나, 또는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한 DNA의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있다. 일본쇄일 경우, 이는 암호화 쇄 또는 비-암호화쇄(안티센스 쇄)일 수 있다.
본 발명의 분리된 핵산 분자에는 서열 8에 기재되어 있고 성숙한 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 26에 기재되어 있고 성숙한 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 성숙한 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 ATCC 수탁번호 제75927호로서 기탁된 클론(HUVE091)에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열, 성숙한 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 ATCC 수탁번호 제203055호로서 기탁된 클론(HEMCZ56)에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 상기 언급된 것과는 상이한 서열을 포함하지만, 유전적 암호의 변성으로 인해 서열 1, 서열 8 및 서열 26의 DNA 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된다. 물론, 이러한 유전적 암호는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 당해 분야의 숙련인이 변성 변이체를 생성시키는 것은 통상적일 것이다.
본 발명은 성숙한 형태의 VEGI 폴리펩티드 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 완전한 VEGI 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 5A, 5B 및 5C(서열 9) 및 서열 2에 제시된 바와 같이, 리더 서열과 성숙한 단백질을 포함하고 있다. 시그날 가설에 따르면, 증대되고 있는 단백질 쇄가 거친 소포체를 가로질러 나가는 것을 개시하게 되면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은, 완전한 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 ″성숙한″ 형태의 단백질을 생성시키는 시그날 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 대부분의 포유류 세포 및 심지어 곤충 세포도 동일한 특이성을 지닌 분비된 단백질을 절단시킨다. 그러나, 몇몇 경우에서는, 분비된 단백질의 절단이 전적으로 균일하지 않고, 이로써 둘 이상의 성숙한 종류의 단백질이 생성된다. 추가로, 분비된 단백질의 절단 특이성이 궁극적으로는 완전한 단백질의 1차 구조에 의해 결정되는 것으로, 즉 이러한 절단 특이성이 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에 본래부터 내재해 있는 것으로 오래전에 공지되었다. 따라서, 본 발명은 ATCC 기탁 제75927호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. ″ATCC 기탁 제75927호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 VEGI 폴리펩티드″란 상기와 같이 기탁된 클론의 사람 DNA 서열에 의해 암호화된 완전한 개방 판독 프레임의 포유류 세포(예를 들어, 다음에 기재되는 바와 같은 COS 세포)에서의 발현에 의해 생성된 VEGI 폴리펩티드의 성숙한 형태(들)를 의미한다.
도 6A 및 6B의 성숙한 폴리펩티드(서열 26)를 암호화하거나, 또는 기탁된 cDNA(HEMCZ56)에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에는 단지 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열; 성숙한 폴리펩티드 및 리더 또는 분비 서열 등의 부가의 암호화 서열, 또는 트랜스멤브레인 서열 또는 프로프로테인 서열; 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열(및 임의의 부가의 암호화 서열) 및 비-암호화 서열, 예를 들면, 상기 성숙한 폴리펩티드의 암호화 서열의 비-암호화 서열 5' 및/또는 3' 또는 인트론이 포함될 수 있다.
본 발명은 또한, 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열이 동일한 판독 프레임에서, 숙주 세포로부터 특정 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보조해주는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 특정 폴리펩티드가 상기 세포로부터 수송되는 것을 조절시키기 위한 분비 서열로서 작용하는 리더 서열과 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프리-단백질이고 성숙한 형태의 폴리펩티드들 형성하기 위해 상기 숙주 세포에 의해 절단된 리더 서열을 가질 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질 플러스 부가의 5' 아미노산 잔기인 프로-단백질을 암호화할 수 있다. 프로-서열을 갖는 성숙한 단백질이 프로-단백질이고 이는 불활성 형태의 단백질이다. 이러한 프로-서열이 절단되면, 활성의 성숙한 단백질이 남게된다.
따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질을 암호화하거나, 프로서열을 갖는 단백질을 암호화하거나, 또는 프로서열과 프리서열(리더 서열) 모두를 갖는 단백질을 암호화할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 동일한 프레임내에서, 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 허용해주는 마커 서열과 융합된 암호화 서열을 가질 수도 있다. 이러한 마커 서열은 세균성 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제를 제공해주는 pQE-9 벡터에 제공된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 예를 들어, 이러한 마커 서열은 포유류 숙주, 예를 들어, COS-7 세포가 사용된 경우에는 혈구응집소(HA)일 수 있다. ″HA″ 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다[참조: Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)].
따라서, 용어 ″폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드″는 상기 폴리펩티드에 대한 암호화 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 부가의 암호화 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
본 발명은 추가로, 도 5A, 5B 및 5C 및 6A 및 6B의 추론된 아미노산 서열(서열 2, 서열 9 및 서열 27)을 갖는 폴리펩티드 및 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편(즉, 부분), 동족체 및 유도체를 암호화하는 앞서 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 천연 대립유전자 변이체이거나 비-천연 변이체일 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열 2 및 서열 9에 제시된 바와 동일한 성숙한 폴리펩티드 또는 기탁된 클론 HUVE091의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 도 1A 및 1B의 폴리펩티드 또는 기탁된 클론 HUVE091의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체에는 결실 변이체, 치환 변이체 및 부가 또는 삽입 변이체가 포함된다.
부가적으로, 본 발명은 서열 27에 제시된 바와 동일한 성숙한 폴리펩티드 또는 기탁된 클론 HEMCZ56의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 ATCC 수탁번호 제203055호의 폴리펩티드 또는 기탁된 클론 HEMCZ56의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체에는 결실 변이체, 치환 변이체 및 부가 또는 삽입 변이체가 포함된다.
앞서 지시된 바와 같이, 당해 폴리뉴클레오티드는 서열 1 및 서열 8에 제시된 암호화 서열 또는 기탁된 클론 HUVE091의 암호화 서열의 천연 대립유전자 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 또 다르게는, 당해 폴리뉴클레오티드는 서열 26에 제시된 암호화 서열 또는 기탁된 클론 HEMCZ56의 암호화 서열의 천연 대립유전자 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 암호화된 폴리펩티드의 기능은 실질적으로 변경시키지 않으면서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 부가될 수 있는 또 다른 형태의 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명은 추가로, 본원에 기재된 분리된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 기탁된 cDNA(HUVE091 및 HEMCZ56)의 뉴크레오티드 서열 또는 도 5A, 5B 및 5C(서열 1 및 서열 8) 및 도 6A 및 6B(서열 26)에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대한 상보 쇄을 갖는 분리된 핵산 분자란, 길이가 15nt 이상, 더욱 바람직하게는 20nt 이상, 더 더욱 바람직하게는 30nt 이상, 더욱 더 바람직하게는 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500nt 이상인 단편을 의미한다. 이들 단편은 본원에 논의된 바와 같이 진단용 프로브 및 프라이머를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 수 많은 용도를 지니고 있다. 물론, 길이가 50 내지 1500nt 보다 큰 단편은, 이러한 단편이 기탁된 cDNA 클론 HUVE091의 뉴클레오티드 서열, 기탁된 cDNA 클론 HEMCZ56의 뉴클레오티드 서열, 서열 8에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 27에 기재된 뉴클레오티드 서열의 전부는 아니지만 대부분에 상응하는 한은, 본 발명에 따라서 또한 유용하다. 길이가 20nt 이상인 단편이란, 기탁된 cDNA 클론(HUVE091 및 HEMCZ56)의 뉴클레오티드 서열, 서열 1, 서열 8 및 서열 26에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열로부터 20개 이상의 연속된 염기를 포함하는 단편을 의미한다.
특정 양태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 작용성 활성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화한다. ″작용성 활성″을 나타내는 폴리펩티드란 완전한 또는 성숙한 VEGI 폴리펩티드와 연관된 하나 이상의 공지된 작용성 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 작용성 활성으로는 생물학적 활성[예를 들면, 맥관형성의 억제, 내피 세포 증식 억제, 세포 유착 유도], 항원성(항-VEGI 및/또는 항-VEGI 베타 항체와 결합(또는 결합을 위해 VEGI 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드와 경쟁)하는 능력), 면역원성(VEGI 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드와 결합되는 항체를 생성시키는 능력), 기타 VEGI 폴리펩티드와 중합체를 형성하는 능력 및 VEGI 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 리간드(예를 들어, DR3)와 결합하는 능력이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 다음의 관련된 cDNA 클론으로부터 결정된 서열 8의 연장성 단편과 관련된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다: HUVE091(서열 15), HMPAP05(서열 16), HSXCA44(서열 17), HEMFG66(서열 18) 및 HELAM93(서열 19).
본 발명은 또한, 다음의 관련된 cDNA 클론으로부터 결정된 서열 26의 연장성 단편과 관련된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다: HUVE091P01(서열 28), HMPTI24R(서열 29), HELAM93R(서열 30) 및 HEMFG66R(서열 31).
특정 양태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 바람직하게는 앞서 열거된 cDNA 클론으로부터 결정된 뉴클레오티드 서열을 배제한, 뉴클레오티드 잔기 1 내지 2442로부터 서열 8의 30개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 50개 이상의 뉴클레오티드의 어떠한 부분도 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 단편의 대표적인 예로는 서열 1의 다음 번호의 뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드 쇄, 또는 기탁된 클론 HUVE091에 함유된 cDNA를 포함하거나 이로 이루어진 단편이 있다: 뉴클레오티드 783-1304, 800-1300, 850-1300, 900-1300, 950-1300, 1000-1300, 1050-1300, 1100-1300, 1150-1300, 1200-1300, 1250-1300, 783-1250, 800-1250, 850-1250, 900-1250, 950-1250, 1000-1250, 1050-1250, 1100-1250, 1150-1250, 1200-1250, 783-1200, 800-1200, 850-1200, 900-1250, 950-1200, 1000-1200, 1050-1200, 1100-1200, 1150-1200, 783-1150, 800-1150, 850-1150, 900-1150, 950-1150, 1000-1150, 1050-1150, 1100-1150, 783-1100, 800-1100, 850-1100, 900-1100, 950-1100, 1000-1100, 1050-1100, 783-1050, 800-1050, 850-1050, 900-1050, 950-1050, 1000-1050, 783-1000, 800-1000, 850-1000, 900-1000, 950-1000, 783-950, 800-950, 850-950, 900-950, 783-900, 800-900 및 850-900.
부가의 특정 양태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 바람직하게는 앞서 열거된 cDNA 클론으로부터 결정된 뉴클레오티드 서열을 배제한, 뉴클레오티드 잔기 1 내지 1116로부터 서열 26의 30개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 50개 이상의 뉴클레오티드의 어떠한 부분도 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 양태는 서열 2의 잔기 번호 1-147(즉 -1 내지 147), 1-147(즉 +1 내지 147), 2-147, 3-147, 4-147, 5-147, 6-147, 7-147, 8-147, 9-147, 10-147, 11-147, 12-147 및 13-147의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.
본 발명의 VEGI-베타 폴리뉴클레오티드 단편의 대표적인 예로는 서열 19의 다음 번호의 뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드 쇄, 또는 기탁된 클론 HEMCZ56에 함유된 cDNA를 포함하거나 이로 이루어진 단편이 있다:
1-1116, 50-1116, 100-1116, 150-1116, 200-1116, 250-1116, 300-1116, 350-1116, 400-1116, 450-1116, 500-1116, 550-1116, 600-1116, 650-1116, 700-1116, 750-1116, 800-1116, 850-1116, 900-1116, 950-1116, 1000-1116, 1050-1116, 1-1100, 50-1100, 100-1100, 150-1100, 200-1100, 250-1100, 300-1100, 350-1100, 400-1100, 450-1100, 500-1100, 550-1100, 600-1100, 650-1100, 700-1100, 750-1100, 800-1100, 850-1100, 900-1100, 950-1100, 1000-1100, 1050-1100, 1-1050, 50-1050, 100-1050, 150-1050, 200-1050, 250-1050, 300-1050, 350-1050, 400-1050, 450-1050, 500-1050, 550-1050, 600-1050, 650-1050, 700-1050, 750-1050, 800-1050, 850-1050, 900-1050, 950-1050, 1000-1050, 1-1000, 50-1000, 100-1000, 150-1000, 200-1000, 250-1000, 300-1000, 350-1000, 400-1000, 450-1000, 500-1000, 550-1000, 600-1000, 650-1000, 700-1000, 750-1000, 800-1000, 850-1000, 900-1000, 950-1000, 1-950, 50-950, 100-950, 150-950, 200-950, 250-950, 300-950, 350-950, 400-950, 450-950, 500-950, 550-950, 660-950, 650-950, 700-950, 750-950, 800-950, 850-950, 900-950, 1-900, 50-900, 100-900, 150-900, 200-900, 250-900, 300-900, 350-900, 400-900, 450-900, 500-900, 550-900, 600-900, 650-900, 700-900, 750-900, 800-900, 850-900, 1-850, 50-850, 100-850, 150-850, 200-850, 250-850, 300-850, 350-850, 400-850, 450-850, 500-850, 550-850, 600-850, 650-850, 700-850, 750-850, 800-850, 1-800, 50-800, 100-800, 150-800, 200-800, 250-800, 300-800, 350-800, 400-800, 450-800, 500-800, 550-800, 600-800, 650-800, 700-800, 750-800, 1-750, 50100-750, 150-750, 200-750, 250-750, 300-750, 350-750, 400-750, 450-750, 550-750, 600-750, 650-750, 700-750, 1-700, 50-700, 100-700, 150-700, 200-700, 250-700, 300-700, 350-700, 400-700, 450-700, 500-700, 550-700, 600-700, 650-700, 1-650, 50-650, 100-650, 150-650, 200-650, 250-650, 300-650, 350-650, 400-650, 450-650, 500-650, 550-650, 600-650, 1-600, 50-600, 100-600, 150-600, 200-600, 250-600, 300-600, 350-600, 400-600, 450-600, 500-600, 550-600, 1-550, 50-550, 100-550, 150-550, 200-550, 250-550, 300-550, 350-550, 400-550, 450-550, 500-550, 1-500, 50-500, 100-500, 150-500, 200-500, 250-500, 300-500, 350-500, 400-500, 450-500, 1-450, 50-450, 100-450, 150-450, 200-450, 250-450, 300-450, 350-450, 400-450, 1-400, 50-400, 100-400, 150-400, 200-400, 250-400, 300-400, 350-400, 1-350, 50-350, 100-350, 150-350, 200-350, 250-350, 300-350, 1-300, 50-300, 100-300, 150-300, 200-300, 250-300, 1-250, 50-250, 100-250, 150-250, 200-250, 1-200, 50-200, 100-200, 150-200, 1-150, 50-150, 100-150, 1-100, 50-100, 및 1-50.
본 발명의 바람직한 핵산 단편에는 또한, 다음 번호의 VEGI 효능있는 아스파라긴-연결된 글리코실화 부위 N29 내지 N32(N-29, Y-30, T-31, N32) 및 N-125 내지 D-128(N-125, V-126, S-127, D-128); 효능있는 단백질 키나제 C(PKC) 포스포릴화 부위 T-32 내지 K-34(T-32, N-33, K-34) 및 T-50 내지 R-52(T-50, F-51, R-52); 효능있는 카제인 키나제 II(CK2) 포스포릴화 부위 S-83 내지 E-86(S-83, Y-84, P-85, E-86); S-96 내지 E-99(S-96, V-97, C-98, E-99); S-115 내지 E-118(S-115, L-116, Q-117, E-118); S-130 내지 D-133(S-130, L-131, V-132, D-133); 및 T-135 내지 D-138(T-135, K-136, E-137, D-138); 및 효능있는 미리스틸화 부위 G-20 내지 K-25(G-20, L-21, A-22, F-23, T-24, K-25) 및 G-111 내지 L-116(G-111, A-112, M-113, F-114, S-115, L-116)의 도메인 중의 하나 이상을 암호화하는 핵산 분자가 포함된다.
이중에서 특히 바람직한 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 VEGI의 구조적 또는 작용성 특질물을 암호화함으로써 성상 확인된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 VEGI의 알파-나선 및 알파-나선 형성 영역(″알파-영역″), 베타-시트 및 베타-시트 형성 영역(″베타 영역″), 턴 및 턴-형성 영역(″턴-영역″), 코일 및 코일-형성 영역(″코일 영역″), 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 양친매성 영역, 베타 양친매성 영역, 표면 형성 영역 및 고 항원 지수 영역(즉, 각각 항원 지수가 1.5 이상인 3개 이상의 연속되는 아미노산 잔기의 항원성 영역을 지님)을 포함하는 아미노산 잔기를 암호화한다. 특정의 바람직한 영역은 도 7에 도시된 것이며 이는 식별된 컴퓨터 프로그램의 생략성 파라미터를 사용하여 서열 9에 제시된 아미노산 서열을 분석함으로써 동정된 상기 언급된 유형의 영역을 포함하지만 이에 제한되지는 않고, 이러한 바람직한 영역에는 높은 항원 지수의 가르니어-롭손(Garnier-Robson) 알파-영역, 베타 영역, 턴-영역 및 코일 영역, 츄-패스만(Chou-Fasman) 알파-영역, 베타-영역 및 코일-영역, 키트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 친수성 영역 및 소수성 영역, 아이젠버그(Eisenberg) 알파- 및 베타-양친매성 영역, 카르플러스-슐츠(Karplus-Schultz) 가요성 영역, 에미니(Emini)-표면 형성 영역 및 제임슨-울프(Jameson-Wolf) 영역이 포함된다.
VEGI에 대해 앞서 기재된 바와 같은 방식으로 VEGI-베타를 나타내는 데이타는 서열 27에 기재된 아미노산 서열을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 그 자체로서, 앞서 열거된 VEGI의 구조적 또는 작용성 특질물 각각(즉, 높은 항원 지수의 가르니어-롭손 알파-영역, 베타 영역, 턴-영역 및 코일 영역, 츄-패스만 알파-영역, 베타-영역 및 코일-영역, 키트-둘리틀 친수성 영역 및 소수성 영역, 아이젠버그 알파- 및 베타-양친매성 영역, 카르플러스-슐츠 가요성 영역, 에미니 표면 형성 영역 및 제임슨-울프 영역)이 VEGI 및 VEGI-베타에도 마찬가지로 또한 적용된다.
이들과 관련하여 특정의 바람직한 영역이 도 7에 도시되어 있긴 하지만, 도 7에 제시된 데이타를 표로 나타내거나 이를 이용하여 확인할 수 있다. 도 7을 만들기 위해 사용된 DNA *STAR 컴퓨터 알고리듬(본래의 생략성 파라미터 상에 제시됨)이 이러한 표 형태 포맷으로 도 7에 데이타를 용이하게 나타낼 것이다. 도 7에서의 데이타에 관한 표 형태의 포맷을 이용하여 바람직한 영역의 특정한 경계를 용이하게 결정할 수 있다.
도 7에 제시된 상기 언급된 바람직한 영역에는 서열 2, 서열 9 및 서열 27에 제시된 아미노산 서열을 분석함으로써 확인된 상기 언급된 유형의 영역이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 도 7에 제시된 바와 같이, 이러한 바람직한 영역에는 가르니어-롭손 알파-영역, 베타 영역, 턴-영역 및 코일 영역, 츄-패스만 알파-영역, 베타-영역 및 코일-영역, 키트-둘리틀 친수성 영역 및 소수성 영역, 아이젠버그 알파- 및 베타-양친매성 영역, 카르플러스-슐츠 가요성 영역, 에미니 표면 형성 영역 및 제임슨-울프 고 항원 지수 영역이 포함된다.
이와 관련하여 상당히 바람직한 단편은 상기 언급된 몇몇(예를 들면, 1, 2, 3 또는 4) 특질물과 같은 몇몇 구조적 특질물을 결합시키는 VEGI 및/또는 VEGI-베타의 영역을 포함하는 것이다.
부가의 바람직한 본 발명의 핵산 단편에는 VEGI 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프-보유 부분을 암호화하는 핵산 분자가 포함된다. 특히, 이러한 본 발명의 핵산 단편에는 서열 9에서 약 Thr-24에서 약 Asn-32까지의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Ile-37에서 약 Ile-45까지의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Met-54에서 약 Arg-62까지의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Gln-63에서 약 Asp-71까지의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Glu-57에서 약 Gly-65까지의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Val-80에서 약 Thr-88까지의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Leu-116에서 약 Val-124까지의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 및 서열 9에서 약 Asp-133에서 약 Phe-141까지의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 포함된다. 이들 폴리펩티드 단편은 상기 도 7에 제시된 바와 같이 제임스-울프 항원 지수의 분석에 의해 VEGI 폴리펩티드의 항원성 에피토프를 보유하는 것으로 결정되었다. 이러한 기타 VEGI의 에피토프-보유 부분을 결정하는 방법이 다음에 상세히 기재되어 있다.
VEGI-베타 단백질의 항원성 에피토프를 보유하는 폴리펩티드 단편은 상기 도 7에 제시된 바와 같이 상기 언급된 제임스-울프 항원 지수 분석을 이용하여 당해 분야의 숙련인에게 용이하게 결정될 수 있다. 이러한 기타 VEGI-베타의 에피토프-보유 부분을 결정하는 방법이 다음에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론, ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론 또는 상기 언급된 VEGI 폴리뉴클레오티드 단편의 폴리뉴클레오티드 서열의 일정 부분과 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. ″엄격한 하이브리드화 조건″이란, 50% 포름아미드, 5x SSC(750mM NaCl, 75mM 삼나트륨 시트레이트), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 변성되고 전단된 살모넬라 정액 DNA 20㎍/ml를 함유하는 용액에서 42℃ 하에 밤새 배양한 다음, 약 65℃에서 0.1x SSC에서 상기 필터를 세척하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 일정 ″부분″에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드란, 참조 폴리뉴클레오티드의 약 15 뉴클레오티드(nt) 이상, 바람직하게는 약 20nt 이상, 더욱 바람직하게는 약 30nt 이상, 가장 바람직하게는 약 30 내지 70nt 또는 80 내지 150nt, 또는 이의 완전한 길이와 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이들은 상기 논의되고 다음에 상세히 기재되는 바와 같이 진단용 프로브 및 프라이머로서 유용하다. 물론, 폴리 A 서열(예를 들면, 서열 1, 서열 8 또는 서열 26에 제시된 VEGI cDNA 의 3' 말단 폴리 트랙)과만 하이브리드화되거나 또는 T(또는 U) 잔기의 상보적 연장물과만 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 일정 부분과 하이브리드화하기 위해 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않을 것인데, 이는 이러한 폴리뉴클레오티드가 폴리(A) 연장물 또는 이의 보체를 함유하는 어떠한 핵산 분자(예를 들면, 실제적으로 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 생성된 모든 이본쇄 cDNA 클론)와도 하이브리드화할 수도 있기 때문이다.
바람직한 양태에 있어서, 본원에 기재된 참조 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 서열 8 및/또는 서열 26에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 상기 기탁물에 함유된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
본 발명은 추가로, VEGI 폴리펩티드의 부분, 동족체 또는 유도체를 암호화하는, 본 발명의 핵산 분자의 변이체에 관한 것이다. 변이체는 천연적으로 생성될 수 있는데, 예를 들면, 천연의 대립유전자 변이체이다. ″대립유전자 변이체″란, 특정 유기체의 염색체 상의 소정의 부위를 점하고 있는 유전자의 몇몇 대체 형태 중의 하나를 의미한다[참조: Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley ＆ Sons, New York (1985)]. 천연이 아닌 변이체는 당해 분야에 공지된 돌연변이 기술을 이용하여 생성시킬 수 있다.
이러한 변이체로는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열(단편을 포함함)의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 부가에 의해 생성된 변이체가 있다. 이러한 치환, 결실 또는 부가는 하나 이상의 뉴클레오티드와 관련이 있을 수 있다. 이 변이체들을 암호화 영역, 비-암호화 영역 또는 둘 다에서 변형시킬 수 있다. 암호화 영역에서의 변형은 보존적이거나 비-보존적인 아미노산 치환, 결실 또는 부가물을 생성시킬 수 있다. 이들 중에서 특히 바람직한 것은 VEGI 폴리펩티드 또는 이의 부분의 성질과 활성을 변형시키지 않는, 무증후성 치환, 부가 및 결실이다. 또한, 이와 관련하여 특히 바람직한 것은 보존적 치환이다.
본 발명의 추가의 양태는 (a) 서열 2 또는 서열 9 중의 완전한 아미노산 서열(즉, 서열 9의 -27번에서부터 147번)을 갖는 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (b) N-말단 메티오닌을 제외한 서열 2 또는 서열 9 중의 완전한 아미노산 서열(즉, 서열 9의 -26번에서부터 147번)을 갖는 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (c) 서열 9의 1번에서부터 147번까지로서 제시된 서열 9 중의 아미노산 서열을 갖는 성숙한 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (d) 서열 9의 1번에서부터 147번까지로서 제시된 서열 2 또는 서열 9 중의 아미노산 서열을 갖는 VEGI 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (e) ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론 HUVE091에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 갖는 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (f) ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론 HUVE091에 의해 암호화된 N-말단 메티오닌을 제외한 완전한 아미노산 서열을 갖는 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (g) ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론 HUVE091에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (h) ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론 HUVE091에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 VEGI 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (i) 본원에 기재된 폴리펩티드 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (j) 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 또는 (i)에서의 어떠한 뉴클레오티드 서열에도 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 또는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에는 또한, 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) 또는 (j)에 기재된 것과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라 상기와 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사율을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.
본 발명의 추가의 양태는 (a) 서열 27 중의 완전한 아미노산 서열(즉, 서열 27의 1번에서부터 251번)을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (b) N-말단 메티오닌을 제외한 서열 27 중의 완전한 아미노산 서열(즉, 서열 27의 2번에서부터 251번)을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (c) 서열 27의 62번에서부터 251번까지로서 제시된 서열 27 중의 아미노산 서열을 갖는 성숙한 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (d) 서열 27의 1번에서부터 35번까지로서 제시된 서열 27 중의 아미노산 서열을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드의 세포내 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (e) 서열 27의 62번에서부터 251번까지로서 제시된 서열 27 중의 아미노산 서열을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (f) ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론 HEMCZ56에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (g) ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론 HEMCZ56에 의해 암호화된 N-말단 메티오닌을 제외한 완전한 아미노산 서열을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (h) ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론 HEMCZ56에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (i) ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론 HEMCZ56에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드의 세포내 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (j) ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론 HEMCZ56에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (k) 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 또는 (i)에서의 어떠한 뉴클레오티드 서열에도 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 또는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에는 또한, 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) 또는 (k)에 기재된 것과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라 상기와 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사율을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.
본 발명의 참조 뉴클레오티드 서열과 예를 들면, 95% 이상의 ″동질율″을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란, 폴리뉴클레오티드 서열이 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100개 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 달리 언급하면, 참조 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 동질율을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서는, 참조 서열 중의 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열 중의 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 뉴클레오티드 수가 참조 서열 내에 삽입될 수 있다. 이러한 참조(의문) 서열은 서열 1, 서열 8 및 서열 26에 기재된 완전한 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재된 바와 같은 단편일 수 있다.
실제적인 사항으로서, 특정한 핵산 분자가, 예를 들어, 서열 8 또는 서열 26에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열과 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 지의 여부는 베스트피트(Bestfit) 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix에 대한 버젼 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 편리하게 결정할 수 있다. 베스트피트는 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소적 상동율 알고리듬을 이용하여 두 서열 간의 가장 유사한 절편을 발견한다. 특정 서열이, 예를 들면, 본 발명에 따르는 참조 서열과 95%의 동질율을 나타내는 지를 결정하기 위해 베스트비트 또는 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 물론, 동질율이 참조 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 대해 산정되고 참조 서열 중의 뉴클레오티드 총 수의 5% 이내의 상동성 갭을 허용하도록 파라미터를 설정한다.
특정한 양태에 있어서, 총체적인 서열 정렬로서 지칭되기도 하는, 참조(의문) 서열(본 발명의 서열)과 대상 서열 간의 동질성 여부는 브루틀래그(Brutlag) 등의 알고리듬을 기준으로 하는 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다[참조: Brutlag et al. (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245]. 동질율(%)을 산정하기 위해 DNA 서열의 FASTDB 정렬에 사용된 바람직한 파라미터는 다음과 같다: 매트릭스=유니터리, k-튜플=4, 미스매치 페널티=1, 조이닝 페널티=30, 무작위 그룹 길이=0, 컷오프 스코어=1, 갭 페널티=5, 갭 사이즈 페널티=0.05, 윈도우 사이즈=500 또는 보다 짧든지 간에 대상 뉴클레오티드 서열의 길이. 이러한 양태에 따르면, 대상 서열이 내부 결실에 의해서가 아니라 5' 또는 3' 결실로 인해 의문 서열보다 더 짧은 경우에는, FASTDB 프로그램이 동질율을 산정할 때 대상 서열의 5' 및 3' 절단을 고려하지 않았다는 사실을 고려하여, 상기 결과를 수동으로 교정해야만 한다. 의문 서열에 비해 5' 또는 3' 말단이 절단된 대상 서열의 경우에는, 매치되지 않고 정렬되지 않은, 대상 서열의 5' 및 3'인 의문 서열의 염기 수를 의문 서열의 총 염기%로서 산정함으로써 동질율을 교정한다. 특정 뉴클레오티드가 매치/정렬되는지의 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이어서, 이러한 비율을 상기 명시된 파라미터를 이용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의해 산정된 동질율(%)로부터 삭감하여 최종 동질율(%) 스코어에 도달하게 한다. 이와 같이 교정된 스코어가 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 의문 서열과 매치/정렬되지 않은, FASTDB 정렬에 의해 나타낸 바와 같은 대상 서열의 5' 및 3' 염기를 벗어난 염기만이 동질율(%) 스코어를 수동으로 조정하기 위해 산정된다. 예를 들면, 90개 염기 대상 서열을 100개 염기 의문 서열에 정렬시켜 동질율(%)을 결정한다. 대상 서열의 5' 말단에서 결실이 발생되므로, FASTDB 정렬이 5' 말단에서의 처음 10개 염기의 매치/정렬을 나타내지 않는다. 쌍을 이루지 않은 10개의 염기는 서열의 10%를 나타내므로(5' 및 3' 말단에서의 염기의 수가 의문 서열에서의 염기의 총 수와 매치되지 않는다) 10%를 FASTDB 프로그램에 의해 산정된 동질율(%) 스코어로부터 삭감한다. 나머지 90개 염기가 완벽하게 매치된 경우에는, 최종 동질율(%)이 90%가 될 것이다. 또 다른 예에서는, 90개 염기 대상 서열을 100개 염기 의문 서열과 비교한다. 이때, 결실은 내부 결실이어서 대상 서열의 5' 또는 3' 상에는 의문 서열과 매치/정렬되지 않은 염기가 존재하지 않는다. 이러한 경우, FASTDB에 의해 산정된 동질율(%)을 수동으로 교정하지 않는다. 다시 한번, 의문 서열과 매치/정렬되지 않은 대상 서열의 5' 및 3' 염기 만이 수동으로 교정된다. 본 발명의 목적상 어떠한 기타 수동 교정도 이루어지지 않는다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 서열 2의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 30개 이상, 바람직하게는 50개 이상의 염기를 갖는 이의 단편과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동질율을 나타내는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 서열 27의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 30개 이상, 바람직하게는 50개 이상의 염기를 갖는 이의 단편과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동질율을 나타내는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드에 관한 것이다.
본원은 이들이 VEGI 작용성 활성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는지의 여부와 상관없이, 서열 1, 서열 8 또는 서열 26에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열과 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 핵산 분자, 또는 기탁된 cDNA 클론의 핵산 서열 또는 이의 단편에 관한 것이다. 그러나, 본 발명의 핵산 분자가 VEGI 작용성 활성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는 것이 바람직하다. ″VEGI 작용성 활성을 지닌 폴리펩티드″란, 특정한 면역검정 및/또는 생물학적 검정으로 측정한 결과, 본 발명의 VEGI 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드(완전한 길이의 단백질 또는 바람직하게는 성숙한 단백질)의 활성과 반드시 동일하지는 않지만, 이러한 활성과 유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면, VEGI 활성은 실시예 6에 상세히 기재된 바와 같은 ABAE 세포의 배양물 내에서 또는 실시예 10에 기재된 바와 같은 융모요막(CAM) 맥관형성 검정, 및 나머지 실시예 및 당해 분야에 기재된 몇몇 부가의 방식으로, 모세혈관-유사 관 구조 형성의 FGF-2-유도된 형성을 억제시키는 VEGI의 상대적인 능력을 결정함으로써 측정할 수 있다.
물론, 유전적 암호의 변성으로 인해, 당해 분야의 숙련인은, 기탁된 cDNA의 핵산 서열 또는 서열 1, 서열 8 또는 서열 26에 기재된 핵산 서열, 또는 이들의 단편과 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 서열을 갖는 다수의 핵산 분자가 ″VEGI 활성을 지닌″ 폴리펩티드를 암호화할 것이라는 사실을 즉시 인식할 것이다. 이들 뉴클레오티드 서열 모두의 변성 변이체가 동일한 폴리펩티드를 암호화하기 때문에, 많은 경우에 있어서, 당해 분야의 숙련인에게는 이 것이 상기 언급된 검정을 수행하지 않은 경우일지라도 명백한 일일 것이다. 변성 변이체가 아닌 이러한 핵산 분자의 경우에는, 상당 수가 VEGI 활성을 지닌 폴리펩티드를 또한 암호화할 것이라는 사실이 당해 분야에서 추가로 인식될 것이다. 이는, 당해 분야의 숙련인은 실질적으로 단백질 기능을 덜 수행하거나 거의 수행하지 않는 아미노산 치환(예를 들어, 하나의 지방족 아미노산을 제2의 지방족 아미노산으로 치환함)을 충분히 인지하고 있기 때문이다. 예를 들면, 표현형적으로 무증후성의 아미노산 치환물을 만드는 방법에 관한 지침이 문헌[참조: Bowie, J.U. et al., ″Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions″, Science 247:1306-1310 (1990)]에 제시되어 있으며, 상기 문헌에서 저자는 상기 단백질이 놀랍게도 아미노산 치환물을 허용하고 있다고 지시하고 있다.
본 발명의 부가의 양태는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환물을 함유하지만, 50개 이하, 바람직하게는 40개 이하, 더욱 바람직하게는 30개 이하, 및 더욱 더 바람직하게는 20개 이하의 보존적 아미노산 치환물, 10 내지 20개, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 3 내지 5개 또는 1 내지 3개의 보존적 아미노산 치환물을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 VEGI 폴리펩타이드(즉, 본원에 기재된 VEGI 폴리펩티드 단편)의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 물론, 보다 바람직하기 위해서는, VEGI 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 보존적 아미노산 치환물을 함유하는 것이 상당히 바람직하다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 이러한 재조합 벡터로 유전공학적으로 처리되거나 본 발명의 폴리펩티드를 생성하도록 공학적으로 처리된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다.
숙주 세포를, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터로 유전공학적으로 처리한다(형질도입, 형질전환 또는 형질감염시킴). 이러한 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등의 형태일 수 있다. 이와 같이 유전공학적으로 처리된 세포를, 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 VEGI 유전자를 증폭시키기에 적당한 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현용으로 선택된 숙주 세포를 이용하여 앞서 사용된 것이며, 이는 당해 분야의 숙련인에게 명백할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 재조합 기술에 의한 폴리펩티드의 생성 방법에 이용할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 당해 폴리뉴클레오티드는 특정 폴리펩티드를 발현시키기 위한 각종 발현 벡터 중의 어느 하나에 포함될 수 있다. 이러한 벡터로는 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 세균성 플라스미드; 파아지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파아지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 백시니아, 아데노바이러스, 가금류 폭스 바이러스 및 슈도라비스와 같은 바이스성 DNA를 포함한다. 그러나, 그 외의 어떠한 벡터라도 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능한 경우에는 사용될 수 있다.
적당한 DNA 서열을 각종 방법에 의해 벡터내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, 이러한 DNA 서열은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위 내로 삽입된다. 이러한 방법 및 기타 방법은 당해 기술 분야의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
발현 벡터 내의 DNA 서열은 적당한 발현 조절 서열(프로모터)에 작동적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시한다. 상기 프로모터의 대표적인 예로서, LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이(E. coli) lac 또는 trp, 파아지 람다 PL 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스 내에서 유전자 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 프로모터를 언급할 수 있다. 또한 발현 벡터는 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결인자를 함유한다. 상기 벡터는 발현을 증폭시키기에 적합한 서열을 포함할 수도 있다.
또한, 발현 벡터는 바람직하게는, 진핵 세포 배양의 경우에는 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이 내에서의 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성과 같은, 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특성을 제공하는 하나 이상의 선별성 마커 유전자를 함유한다.
상기 언급된 바와 같은 적당한 DNA 서열 뿐만 아니라 적당한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 적당한 숙주를 형질전환시킴으로써 상기 숙주가 단백질을 발현할 수 있도록 한다.
적당한 숙주의 대표적인 예로서는, 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)과 같은 세균성 세포; 효모와 같은 진균성 세포; 드로소필라 (Drosophila) S2 및 Sf9와 같은 곤충류 세포; CHO, COS 또는 보웨스 흑색종과 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 식물 세포 등을 언급할 수 있다. 적당한 숙주의 선별은 본 명세서의 교시로부터 당해 기술 분야의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
보다 특히, 본 발명은 앞서 광범위하게 기술된 바와 같은 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 작제물도 포함한다. 이러한 작제물은 본 발명의 서열을 전진 또는 후진 방향으로 삽입시킨 플라스미드 또는 바이러스성 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 상기 양태의 바람직한 국면에서, 작제물은, 예를 들어 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 시판되고 있다. 하기 벡터가 예로써 제공된다. 세균성: pHE4-5(ATCC 수탁 번호 제209311호), pQE70, pQE60, pQE-9(공급원: Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbscks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(공급원: Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(공급원: Pharmacia). 진핵성: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(공급원: Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(공급원: Pharmacia). 그러나, 그 외의 어떠한 플라스미드 또는 벡터도 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용될 수 있다.
프로모터 영역은 CAT(Chloramphenicol transferase(클로람페니콜 트랜스퍼라제)) 벡터 또는 기타 벡터를 선별성 마커와 함께 사용하여 목적하는 어떠한 유전자로부터도 선별할 수 있다. 두가지 적합한 벡터는 PKK232-8 및 PCM7이다. 특정하게 명명된 세균성 프로모터로는 lacⅠ, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P, P 및 trp가 있다. 진핵성 프로모터로는 CMS 이미디어트 얼리(immediate early), HSV 티미딘 키나제, 얼리(early) 및 레이트(late) SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-Ⅰ이 있다. 적당한 벡터 및 프로모터의 선별은 충분히 당해 분야에서 통상적인 기술의 범주 내이다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 언급된 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포, 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포일 수 있거나, 숙주 세포는 세균성 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 작제물의 숙주 세포로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 또는 전기천공(electroporation)에 의해 수행할 수 있다[참조: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Method in Molecular Biology, (1986)].
본원에 논의된 벡터 작제물을 함유하는 숙주 세포를 포괄하는 것 이외에도, 본 발명은 또한, 내인성 유전 물질(예를 들어, VEGI 암호화 서열)을 결실 또는 대체시키고/시키거나 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결되는 유전 물질(예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하도록 유전공학적으로 처리시킨, 내인성 VEGI 폴리뉴클레오티드를 활성화시키고, 변형시키고/시키거나 증폭시키는 척추동물 기원, 특히 포유류 기원의 1차, 2차 및 불멸화 숙주 세포를 포괄한다. 예를 들면, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 이종 조절 영역(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서(enhancer))와 내인성 VEGI 폴리뉴클레오티드 서열을 동종 재조합을 통하여 작동적으로 연결시킬 수 있다[참조: 미국 특허 제5,641,670호(1997. 6. 24.); 국제공개공보 제WO 96/29411호(1996. 9. 26.); 국제공개공보 제WO 94/12650호(1994. 8. 4.); Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); and Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989); 이들 문헌 각각의 기술 내용이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다].
숙주 세포 내의 작제물은 통상적인 방법으로 사용되어 재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 생성물을 제조할 수 있다. 또다른 방법으로는, 본 발명의 폴리펩티드를 통상적인 펩티드 합성기에 의해 합성적으로 제조할 수 있다.
성숙한 단백질은 적합한 프로모터의 조절하에 포유류 세포, 효모, 세균, 또는 기타 세포 내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물로부터 유도된 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조하기 위해 무-세포 해독 시스템을 사용할 수도 있다. 원핵성 및 진핵성 숙주와 함께 사용하기에 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[참조: Sambrook. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에 기술되어 있고, 이의 기술 내용이 본원에 참조로 인용된다.
고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 통상적으로 약 10 내지 300bp이고 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는, DNA의 cis-작용성 요소이다. 복제 기점 bp 100 내지 270의 말단측 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 얼리 프로모터 인핸서, 복제 기점의 말단측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 예로서 포함한다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기점; 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선별성 마커, 예를 들어 이. 콜라이 및 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) TRP1 유전자의 앰피실린 내성 유전자; 및 하단 구조 서열의 전사를 지시하는 고도로 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제, 또는 열 쇼크 단백질 등과 같은 해당촉진성 효소를 암호화하는 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이종 구조 서열은 해독 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게는 해독된 단백질이 페리플라즘성 공간 또는 세포외 매질 내로 분비되도록 지시할 수 있는 리더 서열과 함께 적당한 상에서 어셈블리된다. 임의로, 이러한 이종 구조 서열은 목적하는 특성, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 간소화된 정제를 제공하는 N-말단 동정 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.
세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 목적하는 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열을 적합한 해독 개시 및 종결 시그날과 함께, 작용성 프로모터를 가진 작동성 판독 상 내로 삽입함으로써 작제한다. 상기 벡터는 하나 이상의 표현형 선별성 마커 및 복제 기점을 포함하여 벡터를 유지할 수 있고, 필요한 경우 숙주 내에서 증폭을 제공한다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주 세포로는 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살포넬라 티피무륨, 및 슈도모나스(Pseudomanas) 속, 스트렙토마이세스 속 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 내의 각종 종들이 있지만, 다른 것들을 선택하여 사용할 수도 있다.
대표적이나 이에 제한되지 않는 예로서, 세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 익히 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전적 요소를 포함하는 시판용 플라스미드로부터 유도된 선별성 마커 및 세균성 복제 기점을 포함할 수 있다. 이러한 시판용 벡터로는, 예를 들어 pKK223-3(공급원: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 GEM1(공급원: Promega Biotec, Madison, WI, USA)이 있다. 상기 pBR322 ″중축(backbone)″ 절편을 적당한 프로모터 및 발현될 구조 서열과 합한다.
적합한 숙주 균주를 형질전환시키고 적당한 세포 밀도로 숙주 균주를 성장시킨 다음, 선별된 프로모터를 적합한 방법(예: 온도 변화 또는 화학적 유도)으로 유도시키고 세포들을 추가 기간 동안 배양한다. 세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 수단으로 파쇄한 다음, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 보유한다.
단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는, 당해 기술 분야의 숙련인에게 익히 공지된 방법들인 냉동-해동 순환, 초음파 분해처리, 기계적 파쇄, 또는 세포 용융제의 사용을 포함하는 통상적인 방법에 의해 파쇄시킬 수 있다.
또한, 각종 포유류 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예로는 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23:175(1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 주, 및 적합성 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주가 있다. 포유류 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플리스(splice) 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열 및 5' 플랭킹 비-전사 서열을 포함한다. SV40 스플리스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여, 필요로 하는 비-전사된 유전적 요소를 제공할 수 있다.
사람 VEGI 폴리펩티드를 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그패피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수하고 정제할 수 있다. 단백질 리폴딩(refolding) 단계를, 필요한 경우 성숙한 단백질의 배열을 완성하는데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 생성물이거나, 또는 화학적 합성 과정 또는 원핵 또는 진핵 세포 숙주(예를 들어, 배양물 중의 세균성, 효모, 고등 식물, 곤충류 및 포유류 세포에 의해)로부터 재조합 기술에 의해 제조된 생성물일 수 있다. 재조합 제조 과정에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나 글리코실화 되지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.
몇몇 시스템에서 몇몇 크기의 VEGI 폴리펩티드의 제조를 촉진시키기 위해 15개 이상의 VEGI 발현 작제물이 본원의 발명자들에 의해 만들어졌다. 이들 중에서, 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 4개의 작제물이 만들어졌다. 이러한 완전한 길이의 작제물은 (ⅰ) pQE9TNFg-27/147, (ⅱ) pQE70TNFg, (ⅲ) pC1TNFg 및 (ⅳ) pcDNA3TNFg이다. 열거된 첫 번째 작제물(pQE9TNFg-27/147)의 경우에는, 이러한 작제물을 사용하여, 실시예 1의 방법에 따라서 N-말단 6개 히스티딘 아미노산 태그를 갖는 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드를 제조한다. 히스티딘 태그가 결여된 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드는, 필수적으로 실시예 1에서 수행된 바와 같이 pQE70TNFg 작제물을 사용함으로써 세균에서 생성시킨다. 또한, 히스티딘 태그가 결여된 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드는, 실시예 3의 방법에 따라서 pC1TNFg 또는 pcDNA3TNFg 작제물을 사용함으로써 포유류 세포에서 생성시킨다. 추가로, 성숙한 VEGI 폴리펩티드는 pcDNA3/IL6TNFg-1/149로 명명된 작제물로부터 인터루킨(IL)-6 시그날 펩티드의 지시하에 포유류 세포로부터 생성되고 분비된다.
나머지 VEGI 발현 작제물을 사용하여 세균성, 바쿨로바이러스성 및 포유류 시스템으로부터 각종 VEGI 뮤테인을 발현시킨다. pQE60 세균성 발현 벡터를 사용하여 4개의 N-말단 결실 돌연변이를 발생시킨다. 이들 N-말단 결실 돌연변이 작제물은 (ⅰ) pQE60TNFg-3/147(가능한 성숙한 VEGI 폴리펩티드를 나타냄; 이러한 작제물에 의해 발현된 폴리펩티드는 서열 27의 VEGI-베타의 107 내지 251번 아미노산 잔기와 동일하다); (ⅱ) pQE60TNFg12/147(서열 9의 12 내지 147번 아미노산 잔기 및 서열 27의 116 내지 251번 잔기를 나타냄); (ⅲ) pQE60TNFg22/147(서열 27의 22 내지 147번 아미노산 잔기 및 126 내지 251번 잔기를 나타냄); 및 (ⅳ) pQE60TNFg28/147(서열 27의 28 내지 147번 아미노산 잔기 및 132 내지 251번 잔기를 나타냄)이다. 이들 발현 작제물 각각을 사용하여, 세균성 시스템에서 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드에 대하여 각각 25, 39, 49 및 55 아미노산의 N-말단 결실을 나타내거나, 또는 완전한 길이의 VEGI-베타 폴리펩티드에 대하여 각각 106, 115, 125 및 131 아미노산의 N-말단 결실을 나타내는 VEGI 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
추가의 N-말단 결실 돌연변이 세균성 발현 작제물이 생성되었다. 세균성 발현 벡터 pHE4를 사용하여 pHE4 VEGI T30-L174로 명명된 작제물을 생성시켜, 서열 27의 VEGI-베타 서열 잔기 트레오닌-107 내지 루이신-251의 아미노산 잔기 트레오닌-107 내지 루이신-251에 정확하게 상응하는 서열 9의 잔기 트레오닌-3 내지 루이신-147로서 기재된 VEGI 서열의 아미노산 트레오닌-30 내지 루이신-174를 발현시킨다. 생성된 부가의 세균성 발현 작제물에는 pQE.VEGI.his.T28-L174, pHE4.VEGI.T28-L174, pHE.VEGI.T51-L174 및 pHE4.VEGI.T58-L174가 포함된다. 이들 작제물은 pQE 또는 pHE4 세균성 발현 벡터를 기준으로 한 것이다. 이러한 벡터 명명은 발현 벡터, 유전자명, 및 이러한 작제물에 의해 발현된 아미노산 잔기를 지시한다. 예를 들어, pQE9.VEGI.T28-L174는 pQE 세균성 발현 벡터를 사용하여 VEGI의 아미노산 트레오닌(T)-28 내지 루이신(L)-174를 발현시킨다는 것을 지시해준다.
포유류 시스템으로부터 분비된 성숙한 VEGI 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있는 VEGI 발현 작제물을 생성시킨다. 이러한 작제물은 pC1/IL6TNFg-3/147로 명명되었다. 이는 성숙한 VEGI 서열과 융합된 사람 IL-6 유전자로부터의 시그날 펩티드를 암호화한다. pC4 포유류 발현 벡터의 맥락에서 VEGI의 아미노산 12 내지 149의 아미노 말단(서열 9; 즉, VEGI-베타의 아미노산 116 내지 251(서열 27))과 융합된 CK-b8 시그날 펩티드(1995년 6월 23일자로 출원된 PCT 국제출원 제PCR/US 95/09058호에 기재된 CK-b8 서열의 아미노산 -21 내지 -1)을 함유하는 유사한 작제물을 생성시킨다. 이러한 작제물은 pC4/CK-b8TNFg12/147로 명명되었다. VEGI 카복시 말단에서 사람 IgG Fc 영역과 융합된 VEGI의 아미노산 12 내지 147을 발현하는데 사용될 수 있는, 상기 작제물의 변이체를 생성시킨다. 이러한 융합 단백질은 또한 CK-β8 시그날 펩티드의 지시하에 분비되고 pC4/CK-β8TNFg12/147/Fc로 명명되었다. 상기 융합 분자의 사람 Fc 부분의 서열이 서열 25에 제시되어 있다. 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기타 서열을 사용할 수 있다.
VEGI의 아미노산 -3 내지 147(서열 9; 이는 VEGI-베타의 아미노산 잔기 102 내지 251에 상응한다(서열 27))은 pA2GPTNFg-3/147로 명명된 작제물을 사용하여 바쿨로바이러스 시스템으로부터 발현 및 분비시킬 수 있다. 이러한 발현 작제물은 이의 아미노 말단에서 바쿨로바이러스 GP 시그날 펩티드와 융합된 성숙한 VEGI 암호화 서열을 암호화한다.
2개의 레트로바이러스성 VEGI 발현 작제물을 생성시킨다. 이들 중 첫 번째 것을 pG1SamEN/TNFg-3/149로 명명하였다. 이러한 발현 작제물을 사용하여 포유류 시스템으로부터 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 관련 작제물인 pG1SamEN/CK-β8TNFg-12/149를 생성시키고, 이를 사용하여 CK-β8 시그날 펩티드의 지시하에 포유류 시스템으로부터 성숙한 VEGI 폴리펩티드를 제조 및 분비할 수 있다.
본 발명의 추가의 폴리펩티드에는 상기 언급된 것과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 유사율을 나타내는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한, 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 서열 9의 폴리펩티드와 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 또는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 것을 포함하며, 이에는 또한 30개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 갖는 상기 폴리펩티드의 일정 부분이 포함된다.
상기 언급된 재조합체 또는 융합 단백질의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있고[참조: Maniatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) or DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover ed. (1985), 일반적인 클로닝 방법에 대해서임] 이에는 DNA 단편을 발현시키고 재조합체 또는 융합 단백질을 생성시키는 조건하에서 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 단편을 함유하는 발현 벡터로 안정하게 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 것이 포함된다. 또한, 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 이의 기능을 증가시키거나 이의 국재롸를 특화시키는 기타 폴리펩티드, 예를 들면, 실시예 1 내지 3에 제시된 바와 같은 분비 서열과 융합시킬 수 있다. 상기 재조합체 또는 융합 단백질을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 분리할 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주 세포를 사용하여, VEGI 기능을 억제 또는 활성화시키는 약물 및 제제, 예를 들면, 숙주 단백질 또는 화학적으로 유도된 제제, 또는 VEGI 폴리펩티드의 발현을 하향 조절 또는 변형시키거나 맥관형성을 억제시키는 이의 능력에 영향을 미치기 위해 VEGI 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 기타 단백질의 효능을 분석할 수 있다. 항-VEGI 또는 항-맥관형성 약물 또는 약제의 효능을 시험하는 방법은 예를 들어, VEGI의 내피 세포 성장 억제 활성의 차단일 수 있다. 즉, 이러한 항-VEGI 제제의 존재로 인해, 내피 세포 성장을 억제시키는 VEGI의 능력을 저하시킬 수 있다. 그 결과, 항-VEGI 제제의 부재하에서 관찰된 비교할만한 억제를 달성하기 위해서는 더 많은 VEGI가 요구될 것이다. 또 다른 한편, 항-맥관형성제의 존재는 내피 세포 성장을 억제시키는 VEGI의 능력을 증대시키거나 상승시킬 수 있다. 결과적으로, 상기 제제의 부재하에서 관찰된 유사한 억제를 달성하는데 더 낮은 농도의 VEGI가 요구될 것이다.
폴리펩티드 및 단편
본 발명은 추가로, 서열 2 또는 서열 9의 추론된 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA HUVE091에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 분리된 VEGI 폴리펩티드 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드의 단편, 동족체 및 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 서열 27의 추론된 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA HEMCZ56에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 VEGI-베타 폴리펩티드 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드의 단편, 동족체 및 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되며, 바람직하게는 거의 완전한(예를 들면, 〉90% 순도) 내지 완전한(예를 들면, 〉99% 순도) 상동성의 범위내의 특정 지점까지 정제된다. ″분리된″이란 용어는 상기 물질을 이의 본래의 환경(예를 들어, 천연으로 존재하는 경우에는 천연 환경)으로부터 제거하는 것을 의미한다. 예를 들면, 살아 있는 동물에 존재하는 천연의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리하지 않지만, 천연 시스템 내에 함께 존재하는 물질 중의 몇몇 또는 이들 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 분리한다. 또한, ″분리된 폴리펩티드″란 재조합 숙주 세포로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제시킨 폴리펩티드이다. 예를 들면, 재조합적으로 제조된 버젼의 VEGI 폴리펩티드는 문헌[참조: Smith and Johnson (Gene 67:31-40 (1988)]에 기재된 1-단계 방법에 의해 실질적으로 정제시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 이의 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 분리된 것이다. 본 발명에 따르는 분리된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에는 또한 이와 같이 천연 또는 합성적으로 제조된 분자가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 또한, 단백질 정제 분야에 널리 공지된 방법에서 본 발명의 항-VEGI 항체를 사용하여 천연 또는 재조합 공급원으로부터 정제할 수 있다.
서열 2, 서열 9 또는 서열 27 및 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 지칭할 때, 용어 ″단편″, ″유도체″ 및 ″동족체″는 VEGI 작용성 활성을 보유하는, 즉 서열 2, 서열 9 또는 서열 27에 기재되고/되거나 기탁된 클론(HUVE091 및 HEMCZ56) 중의 하나 또는 둘 다에 의해 암호화된 완전한 길이 및/또는 성숙한 VEGI 폴리펩티드와 연관된 하나 이상의 작용성 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 한 예로서, 목적하는 면역원성 또는 항원성을 지니고 있는 상기 단편, 유도체 또는 동족체를, 예를 들면, 면역화, VEGI 활성 억제 등에 대한 면역검정에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 양태는 서열 2, 서열 9 또는 서열 27에 기재되고/되거나 기탁된 클론(HUVE091 및 HEMCZ56) 중의 하나 또는 둘 다에 의해 암호화된 VEGI 폴리펩티드 서열을 특이적으로 결합시키는 항체에 의해 결합될 수 있는 VEGI 단편에 관한 것이다.
또 다른 예로서, VEGI 생물학적 활성을 지닌 VEGI 단편, 유도체 또는 동족체(예를 들면, 성숙한 VEGI 폴리펩티드 또는 VEGI-베타 폴리펩티드의 세포외 도메인)이 제공된다. 괸심있는 목적하는 VEGI 특성(예를 들면, 세포 증식 억제, 종양 억제, 맥관형성 억제, 맥관형성 및/또는 뼈 및 연골에서의 판누스 침입과 관련된 내피 세포 증식의 억제에 의한 항-관절염, NF-κB 및 c-Jun 키나제(JNK)의 유도제, 세포 유착 유도체 및 유도제 아포프토시스로서의 특성)을 보유하거나 이러한 특성이 결여된 VEGI 단편, 유도체 및 동족체가 상기 특성 각각의 유도체 또는 억제제, 및 이의 생리학적 관련물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 트랜스멤브레인 영역 및 세포내 및 세포외 영역을 갖는 막 결합된 리포터로서 존재할 수 있거나, 또는 당해 폴리펩티드는 트랜스멤브레인 영역이 결여된 가용성 형태로 존재할 수 있다. 이러한 형태의 VEGI의 한 예가 트랜스멤브레인, 세포내 및 세포외 도메인을 함유하는 서열 27에 제시된 VEGI-베타 폴리펩티드 서열이다.
당해 분야에서는 VEGI 폴리펩티드의 몇몇 아미노산 서열이 상기 단백질의 구조 또는 기능에 상당한 영향을 미치지 않으면서 다양할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이러한 서열 상의 차이를 고려할 경우, 활성을 결정하는 단백질 상의 중요한 영역이 존재한다는 것을 기억해야 한다. 따라서, 본 발명에는 추가로, 실재적인 VEGI 폴리펩티드 활성을 나타내거나 본원에 기재된 폴리펩티드 단편과 같은 VEGI의 영역을 포함하는 VEGI 폴리펩티드의 변이체가 포함된다. 이러한 변이체로는 활성에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 당해 분야에 공지된 일반적인 규칙에 따라서 선택된 결실물, 삽입물, 변환물, 반복물 및 유형 치환물이 있다. 예를 들면, 표현형적으로 무증후성의 아미노산 치환물을 만드는 방법에 관한 지침이 문헌[참조: Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990)]에 제시되어 있으며, 상기 문헌에서 저자는 아미노산 서열의 변화 허용을 연구하기 위한 두가지 주요 접근법이 있다고 지시하고 있다. 첫 번째 방법은 돌연변이가 자연적인 선별에 의해 허용되거나 거부되는, 진환 과정에 의거한다. 두 번째 방법은 클로닝된 유전자의 특정 부위에 아미노산 변화를 도입하기 위해 유전공학적 방법을 이용하고 작용성을 유지하는 서열을 동정하기 위해 선별 또는 스크린을 이용한다. 저자가 언급한 바와 같이, 이들 연구 결과, 단백질이 놀랍게도 아미노산 치환물에 내성이 있는 것을 밝혀졌다. 상기 저자는 추가로, 아미노산 변화가 상기 단백질의 특정 위치에서 허용되는 것으로 여겨진다고 지시하고 있다. 예를 들면, 대부분의 감춰진 아미노산 잔기는 비극성 측쇄를 요구하는 반면, 표면 측쇄의 몇몇 양태가 일반적으로 보존된다. 이러한 표현형적으로 무증후성인 기타 치환물이 문헌[Bowie and coworkers(상기 참조)] 및 본원에 인용된 참조문헌에 기재되어 있다. 전형적으로 보존적 치환물로서 간주되는 것은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서 또 다른 것으로의 대체물; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호교환물; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환물; 아미노산 잔기 Asn과 Gln 간의 치환물, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환물; 및 방향족 잔기 Phe, Tyr 간의 대체물이다.
따라서, 서열 9 또는 서열 27의 폴리펩티드, 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 동족체는 다음과 같은 것일 수 있다: (ⅰ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 보존되지 않은 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환된 것이며, 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전적 암호에 의해 암호화된 것이거나 아닐 수 있다; (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것; (ⅲ) 성숙한 형태의 VEGI 폴리펩티드가 또 다른 화합물, 예를 들면, 상기 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위한 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 것; 또는 (ⅳ) 부가의 아미노산이 상기 형태의 폴리펩티드, 예를 들어, IgG Fc 융합 영역 펩티드 또는 리더 또는 분비 서열, 또는 상기 형태의 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제에 이용되는 서열과 융합된 것. 이러한 단편, 유도체 및 동족체는 본원의 교시로부터 당해 분야의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
따라서, 본 발명의 VEGI는 천연 돌연변이 또는 사람에 의한 조작으로부터의, 하나 이상의 아미노산 치환물, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 지시된 바와 같이, 당해 단백질의 폴딩(folding)이나 활성에 상당한 영향을 미치지 않는 보존족 아미노산 치환과 같이 변화가 바람직하다(참조: 표 1).
보존적 아미노산 치환물
방향족소수성극성염기성산성소 페닐알라닌트립토판티로신루이신이소루이신발린글루타민아스파라긴아르기닌라이신히스티딘아스파르트산글루탐산알라닌세린트레오닌메티오닌글리신
본 발명의 양태는 본원에 기재된 VEGI 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지만, 본원에 기재된 VEGI 폴리뉴클레오티드 서열과 비교할 경우에, 1개 이상 50개 이하, 바람직하게는 40개 이하, 더욱 바람직하게는 30개 이하, 더 더욱 바람직하게는 20개 이하의 보존적 아미노산 치환물을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 물론, 바람직한 순서로는, 1개 이상 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 보본적 아미노산 치환물을 함유하는 VEGI 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드가 상당히 바람직하다.
추가의 특정 양태에 있어서, 서열 2, 서열 9 및 서열 27, 기탁된 클론에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열 및/또는 본원에 기재된 모든 폴리펩티드 단편(예를 들면, 세포외 도메인 또는 세포내 도메인) 중에서의 치환물, 부가물 또는 결실물의 수는 75, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 150-50, 100-50, 50-20, 30-20, 20-15, 20-10, 15-10, 10-1, 5-10, 1-5, 1-3 또는 1-2이다.
VEGI 폴리펩티드의 특징을 증진시키거나 변형시키기 위해서, 단백질공학을 이용할 수 있다. 당해 분야의 숙련인에게 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 단일 또는 다수의 아미노산 치환물, 결실물, 부가물 또는 융합 단백질을 포함하는 신규한 돌연변이체 단백질 또는 뮤테인을 생성시킬 수 있다. 이러한 변형된 폴리펩티드는, 예를 들어, 증진된 활성 또는 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 또한, 이들은 보다 높은 수율로 정제할 수 있고 적어도 특정의 정제 및 저장 조건하에서 상응하는 천연 폴리펩티드 보다 우수한 용해도를 나타낸다.
본 발명은 또한, 선택된 숙주 세포에서 발현, 대량 생산 등에 보다 적합한 VEGI 폴리펩티드를 생성하도록 결실되거나, 부가되거나 또는 치환된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 VEGI 유도체 및 동족체를 포괄한다. 예를 들면, 디설파이드 브릿지를 제거하기 위하여 시스테인 잔기를 결실시키거나 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있고; 예를 들어, N-연결된 부위를 하이퍼글리코실화시키는 것으로 공지된 효모 숙주로부터 보다 용이하게 회수 및 정제되는 동종 생성물의 발현을 달성하기 위해 N-연결된 글리코실화 부위를 변형시키거나 제거할 수 있다. 이를 위하여, 본 발명의 VEGI 폴리펩티드에서 글리코실화 인식 서열 중의 어떠한 하나 이상의 서열 상의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치 중의 하나 또는 둘 다에서의 각종 아미노산 치환물, 및/또는 상기 인식 서열 중의 어떠한 하나 이상의 서열의 두 번째 위치에서의 아미노산 결실이 변형된 트리펩티드 서열에서 VEGI 폴리펩티드의 글리코실화를 방지할 것이다[참조: Miyajimo et al., EMBO J 5(6):1193-1197].
기능에 필수적인 본 발명의 VEGI 폴리펩티드 중의 아미노산은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이[참조: Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]에 의해 동정할 수 있다. 후자 방법은 상기 분자의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이어서, 이로써 생성된 돌연변이체 분자를 수용체 결합 또는 시험관내 증식 활성과 같은 생물학적 활성을 대해 시험한다.
특히 관심있는 것은 하전된 아미노산을 응집을 덜 나타내는 것과 같이 고도로 바람직한 개선된 특징을 지니는 단백질을 제조할 수 있는 기타 하전된 또는 중성 아미노산으로 치환한 것이다. 응집은 활성을 저하시킬 뿐만 아니라 약제학적 제제를 제조하는 경우에 문제를 야기시키는데, 이는 응집체가 면역원성일 수 있기 때문이다[참조: Pinckard, et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins, et al., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland, et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)].
VEGI는 TNF-관련 단백질 계의 한 구성원이기 때문에, VEGI의 생물학적 활성을 완전히 제거하기 보다는 조절하기 위해서는, 보존된 TNF-유사 도메인, 즉 서열 9의 위치 17-147 또는 서열 27의 위치 121-125, 더욱 바람직하게는 VEGI-관련 폴리펩티드 계열의 모든 구성원에게서 보존되지 않은 상기 영역 내에서의 잔기에서의 아미노산을 암호화하는 서열에서 부가, 치환 또는 결실이 만들어진다. 또한, 본 발명의 일부를 형성하는 것은 상기 VEGI 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드다.
VEGI 폴리펩티드의 몇몇 아미노산이 TNF-관련 단백질 계열의 공지된 구성원 전반에 걸쳐 고도로 보존되어 있다. 티로신-15(서열 9에서의 번호와 같음), 루이신-35, 글리신-41, 티로신-43, 티로신-46, 글루타민-48, 루이신-90, 루이신-116, 글리신-119, 아스파르트산-120, 페닐알라닌-141, 페닐알라닌-142, 및 루이신-147과 같은 잔기에서 VEGI의 특정 돌연변이를 만듦으로써, 생물학적 활성에 대한 현저한 효과가 관찰되는 것으로 여겨진다. 물론, 이들 동일한 아미노산 잔기가 서열 27에 제시된 VEGI-베타의 상응하는 위치에 존재한다.
본 발명은 또한, 상기 언급된 VEGI 폴리펩티드의 단편을 포괄한다. 본 발명의 폴리펩티드 단편에는 서열 2 및 서열 9에 함유된 아미노산 서열을 포함하거나, 기탁된 클론(HUVE091)에 함유된 cDNA에 의해 암호화되거나, 또는 기탁된 클론에 함유된 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화되는(예를 들어, 엄격한 하이브리드화 조건하에서) 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드, 서열 2, 서열 8 및/또는 서열 26에 기술된 것, 또는 이에 상보적인 쇄가 포함된다.
폴리펩티드 단편은 ″프리-스탠딩(free-standing)″일 수 있거나, 또는 이의 단편이 가장 바람직하게는 단일의 연속된 영역으로서 한 부분 또는 영역을 형성하는 보다 큰 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 단편의 대표적인 예로는, 예를 들면, 서열 9 및/또는 서열 27의 번호 1 내지 20, 21 내지 40, 41 내지 60, 61 내지 83, 84 내지 100, 101 내지 120, 121 내지 140, 141 내지 160, 160 내지 167, 161 내지 174, 161 내지 180, 181 내지 200, 201 내지 220, 221 내지 240, 241 내지 251을 포함하거나 이로 이루어진 단편이 있다. 더우기, 폴리펩티드 단편은 길이가 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150개 이상의 아미노산일 수 있다. 이와 관련하여, ″약″에는 어느 한 말단 또는 양 말단에서 몇몇 아미노산(즉, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산) 정도가 더 크거나 작은 특히 언급된 범위가 포함된다.
기타 양태에 있어서, 본 발명의 단편 또는 폴리펩티드(즉, 본원에 기재된 것)은 길이가 250, 225, 200, 185, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 90, 80, 75, 60, 50, 40, 30 또는 25개 아미노산 잔기 이하이다.
추가의 바람직한 양태는 VEGI의 성숙한 도메인(서열 9의 1 내지 147번 아미노산 잔기), VEGI-베타의 세포내 도메인(서열 27의 1 내지 35번 아미노산 잔기), VEGI-베타의 트랜스멤브레인 도메인(서열 27의 36 내지 61번 아미노산 잔기), 및/또는 VEGI-베타의 세포외 도메인(서열 27의 65 내지 251번 아미노산 잔기)를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드 단편을 포괄한다.
특정 양태에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 단편은 서열 9의 아미노산 잔기 루이신-35 내지 발린-49, 트립토판-104 내지 루이신-116, 글리신-119 내지 세린-127, 라이신-139 내지 루이신-147을 포함하거나 이로 이루어진다. 이들 도메인은 VEGI 계열 구성원 폴리펩티드의 비교로써 동정된 고도의 동질성을 나타내는 영역이다.
이들 중에서 특히 바람직한 본 발명의 단편은 VEGI의 구조적 또는 작용성 특질물에 의해 성상 확인된 단편이다. 이러한 단편에는 VEGI의 알파-나선 및 알파-나선 형성 영역(″알파-영역″), 베타-시트 및 베타-시트 형성 영역(″베타 영역″), 턴 및 턴-형성 영역(″턴-영역″), 코일 및 코일-형성 영역(″코일 영역″), 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 양친매성 영역, 베타 양친매성 영역, 표면 형성 영역 및 고 항원 지수 영역(즉, 제임스-울프 프로그램의 생략성 파라미터를 사용하여 동정된 바와 같이, 항원 지수가 1.5 이상인 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드의 영역)을 포함하는 아미노산 잔기가 포함된다. 특정의 바람직한 영역은 도 7에 도시된 것이며 이에는 도 5A, 5B 및 5C 및 서열 2 및 서열 9에 제시된 아미노산 서열을 분석함으로써 동정된 상기 언급된 유형의 영역을 포함하지만 이에 제한되지는 않고, 이러한 바람직한 영역에는 이들 컴퓨터 프로그램의 생략성 파라미터를 사용하여 예상된 바와 같은, 가르니어-롭손 예상 알파-영역, 베타 영역, 턴-영역 및 코일 영역; 츄-패스만 예상 알파-영역, 베타-영역 및 코일-영역; 키트-둘리틀 예상 친수성 영역 및 소수성 영역; 아이젠버그 알파- 및 베타-양친매성 영역; 에미니-표면 형성 영역; 및 제임슨-울프 고 항원 지수 영역이 포함된다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다.
부가적으로, 본 발명의 동족체에는 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성화되어 활성의 성숙한 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 프로단백질이 포함된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프-보유 부분을 포함하거나 이로 이루어진 VEGI 폴리펩티드(예를 들어, 단편)을 제공한다. 이러한 폴리펩티드 부분의 에피토프는 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. ″면역원성 에피토프″란 완전한 단백질이 면역원인 경우에 항체 반응을 유발시키는 단백질의 특정 부분으로서 정의된다. 또 다른 한편, 항체가 결합될 수 있는 단백질 분자의 특정 영역을 ″항원성 에피토프″로서 정의된다. 단백질의 면역원성 에피토프의 수는 일반적으로, 항원성 에피토프의 수 보다 적다[참조: Geysen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)].
항원성 에피토프를 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드(즉, 항체가 결합될 수 있는 단백질 분자의 특정 영역을 함유하는 것)의 선별에 관해서는, 단백질 서열의 일부를 모사하는 비교적 짧은 합성 펩티드가 통상적으로, 상기 부분적으로 모사된 단백질과 반응하는 항혈청을 유도할 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Sutcliffe, J. G., et al., Science 219:660-666 (1983)]. 단백질-반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩티드가 종종, 특정 단백질의 1차 서열에 나타나며, 일련의 간단하 화학적 규칙에 의해 성상 확인될 수 있으며, 본래의 단백질의 면역우성 영역(즉, 면역원성 에피토프)으로 규정되지 않을 뿐만 아니라 아미노 또는 카복시 말단으로 규정되지도 않는다. 따라서, 본 발명의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합되는, 모노클로날 항체를 포함한 항체를 생성시키기에 유용하다[참조: Wilson, et al., Cell 37:767-778 (1984)].
본 발명의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에 함유된 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 30개 이상의 아미노산을 함유한다. VEGI-특이적 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 비-제한적인 예로는 서열 9에서 약 Thr-24 내지 약 Asn-32의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Ile-37 내지 약 Ile-45의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Met-54 내지 약 Arg-62의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Gln-63 내지 약 Asp-71의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Glu-57 내지 약 Gly-65의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Val-80 내지 약 Thr-88의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 서열 9에서 약 Leu-116 내지 약 Val-124의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 및 서열 9에서 약 Asp-133 내지 약 Phe-141의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드가 있다. 이들 폴리펩티드 단편은 상기 도 7에 제시된 바와 같이 제임스-울프 항원 지수의 분석에 의해 VEGI 폴리펩티드의 항원성 에피토프를 보유하는 것으로 결정되었다.
당해 분야의 숙련인은 생략성 파라미터를 사용하고 앞서 기재된 바와 같이 높은 항원 지수를 갖는 영역을 선별하여, VEGI-베타 폴리펩티드 서열(서열 27)의 DNA*STAR 분석을 통하여 제조된 데이타를 사용함으로써 VEGI-베타에 대한 항원성 영역을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 통상적인 어떠한 수단[참조: Houghten, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985); 및 Houghten 등의 미국 특허 제4,631,211호(1986)]으로도 제조된다.
본 발명의 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라서 항체를 유도하는 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 용도를 지닌다[참조: Sutcliffe et al., 상기 참조; Wilson, et al., 상기 참조; Chow, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; and Bittle, F.J. et al., J Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)]. 본 발명의 면역원성 에피토프-보유 펩티드, 즉 완전한 단백질이 면역원인 경우에 항체 반응을 유도하는 단백질의 부분은 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 동정한다[참조: Geysen, et al. 상기 참조]. 추가로, 게이슨(Geysen)에 허여된 미국 특허 제5,194,392호에는 관심있는 항체의 특정한 파라토프(paratope)(항원 결합 부위)에 상보적인 에피토프의 형태학적 등가물(즉, ″미노토프(minotope)″)인 단량체(아미노산 또는 기타 화합물)의 서열을 검출 또는 결정하는 일반적인 방법이 기재되어 있다. 더욱 일반적으로, 게이슨 등의 미국 특허 제4,433,092호에는 특정한 관심있는 수용체(예: DR3)의 리간드 결합 부위에 상보적인 리간드의 지형적 등가물인 단량체의 서열을 검출 또는 결정하는 방법이 기재되어 있다. 유사하게, 퍼알킬화 올리고펩티드 혼합물에 관한 휴튼(Houghten) 등의 미국 특허 제5,480,971호에는 선형 C1-C7-알킬 퍼알킬화 올리고펩티드 및 이러한 펩티드의 셋트 및 라이브러리 뿐만 아니라 관심있는 수용체 분자와 우선적으로 결합되는 퍼알킬화 올리고펩티드의 서열을 결정하기 위한 상기 올리고펩티드 셋트 및 라이브러리의 사용 방법이 기재되어 있다. 따라서, 본 발명의 에피토프-보유 펩티드의 비-펩티드 동족체가 또한 이들 방법에 의해 통상적으로 만들어질 수 있다.
당해 분야의 숙련인은 본 발명의 VEGI 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 및 상기 언급된 이의 에피토프-보유 단편을 면역글로불린(IgG)의 불변 영역의 일부분과 합하여 키메릭 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이들 융합 단백질은 정제를 촉진시키고 생체내 반감기를 증가시킨다. 이는, 예를 들어, 사람 CD4-폴리펩티드의 첫 번째 두 영역과 포유류 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 각종 영역으로 이루어진 키메릭 단백질에 대해 나타났다[참조: EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)]. IgG 부분으로 인해 디설파이드-연결된 이량체 구조를 지니는 융합 단백질이 단량체성 VEGI 폴리펩티드 또는 단백질 단편 단독 보다 기타 단백질을 결합 및 중화시키는데 더 효과적일 수 있다[참조: Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)]. 한 예로서, 이러한 VEGI-Fc 융합체가 본원에서 기재된 바와 같이 제조된다.
본 발명의 VEGI 폴리펩티드의 단편(즉, 부분)은 완전한 길이의 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 용도를 지닌다.
막 관련된 단백질의 세포외 도메인 또는 분비된 단백질의 성숙한 형태(들)를 포함한 많은 단백질의 경우, 하나 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 상당한 손실 없이도 N-말단이나 C-말단으로부터 결실될 수 있다는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Ron and colleagues, J. Biol. Chem. 268:2984-2988 (1993)]에는 3, 8 또는 27 N-말단 아미노산 잔기가 생략된 경우일 지라도 헤파린 결합 활성을 갖는 변형된 KGF 단백질이 보고되어 있다. 추가로, 몇몇 연구가들은 천연의 TNF-α폴리펩티드와 비교할 때 작용성 활성을 2 내지 3배 증가시킨 2, 4 또는 7개 N-말단 아미노산을 제거시킨 TNF-α뮤테인을 보고하였다[참조: Creasey, A. et al., Cancer Res. 47:145-149 (1987); Sidhu, R.S. and Bollen, A.P. Anticancer Res. 9:1569-1576 (1989); Kamijo, R., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 160:820-827 (1989)]. 추가로, 특정 단백질의 N-말단 또는 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 결실시킴으로써 상기 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능이 변형되거나 상실되는 경우일지라도, 기타 VEGI 작용성 활성은 여전히 보유될 수 있다.
본 경우에 있어서, 본 발명의 단백질이 TNF 폴리펩티드 계열의 구성원이기 때문에, 서열 9의 35번 위치의 루이신 잔기(이는 정확하게 서열 27의 134번 위치의 루이신 잔기에 상응한다)까지의 N-말단 아미노산의 결실은 많은 유형의 조혈 및 내피 세포의 성장 및 분화의 조절과 같은 몇몇 생물학적 활성을 보유할 수 있다. 서열 9에서 루이신-36 잔기(서열 27에서 루이신-135에 상응함)를 포함한 추가의 N-말단 결실을 갖는 폴리펩티드는 이러한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 예상되지 않는데, 이는 TNF-관련 폴리펩티드에서의 상기 잔기가 생물학적 활성에 요구되는 보존된 도메인의 시작부인 것으로 공지되기 때문이다.
그러나, 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드의 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실로 인해 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 기능이 변형되거나 손실되는 경우일지라도, 기타 생물학적 활성은 여전히 보유될 수 있다. 따라서, 상기와 같이 짧아진 폴리펩티드가 완전한 길이 또는 성숙한 형태의 상기 폴리펩티드를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이와 결합되는 능력은 상기 완전한 길이 또는 성숙한 폴리펩티드의 잔기의 일부분이 N-말단으로부터 제거되는 경우에 보유될 것이다. 완전한 폴리펩티드의 N-말단 잔기가 결여된 특정한 폴리펩티드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기재되고 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 35번 위치의 루이신 잔기까지, 서열 9에 기재된 VEGI의 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 9의 잔기 n1-149의 아미노산 서열[여기서, n1은 -27 내지 35의 범위의 정수이고 35는 많은 유형의 조혈 및 내피 세포의 성장 및 분화를 조절하는데 요구되는 것으로 간주된 완전한 VEGI 폴리펩티드(도 9에 제시됨)의 N-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다]을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
특정 양태에 있어서, 본 발명은 다음 잔기 번호의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
-27 내지 147, -26 내지 147, -25 내지 147, -24 내지 147, -23 내지 147, -22 내지 147, -21 내지 147, -20 내지 147, -19 내지 147, -18 내지 147, -17 내지 147, -16 내지 147, -15 내지 147, -14 내지 147, -13 내지 147, -12 내지 147, -11 내지 147, -10 내지 147, -9 내지 147, -8 내지 147, -7 내지 147, -6 내지 147, -5 내지 147, -4 내지 147, -3 내지 147, -2 내지 147, -1 내지 147, 1 내지 147, 2 내지 147, 3 내지 147, 4 내지 147, 5 내지 147, 6 내지 147, 7 내지 147, 8 내지 147, 9 내지 147, 10 내지 147, 11 내지 147, 12 내지 147, 13 내지 147, 14 내지 147, 15 내지 147, 16 내지 147, 17 내지 147, 18 내지 147, 19 내지 147, 20 내지 147, 21 내지 147, 22 내지 147, 23 내지 147, 24 내지 147, 25 내지 147, 26 내지 147, 27 내지 147, 28 내지 147, 29 내지 147, 30 내지 147, 31 내지 147, 32 내지 147, 33 내지 147, 34 내지 147 및 35 내지 147. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다.
따라서, 본 발명은 134번 위치의 루이신 잔기까지, 서열 27에 기재된 VEGI-베타의 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 27의 잔기 n2-251의 아미노산 서열[여기서, n2은 1 내지 134의 범위의 정수이고 134는 VEGI-베타 폴리펩티드의 많은 유형의 조혈 및 내피 세포의 성장 및 분화를 조절하는데 요구되는 것으로 간주된 완전한 VEGI-베타 폴리펩티드(도 27에 제시됨)의 N-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다]을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
특정 양태에 있어서, 본 발명은 다음 잔기 번호의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
서열 27의 1 내지 251, 2 내지 251, 3 내지 251, 4 내지 251, 5 내지 251, 6 내지 251, 7 내지 251, 8 내지 251, 9 내지 251, 10 내지 251, 11 내지 251, 12 내지 251, 13 내지 251, 14 내지 251, 15 내지 251, 16 내지 251, 17 내지 251, 18 내지 251, 19 내지 251, 20 내지 251, 21 내지 251, 22 내지 251, 23 내지 251, 24 내지 251, 25 내지 251, 26 내지 251, 27 내지 251, 28 내지 251, 29 내지 251, 30 내지 251, 31 내지 251, 32 내지 251, 33 내지 251, 34 내지 251, 35 내지 251, 36 내지 251, 37 내지 251, 38 내지 251, 39 내지 251, 40 내지 251, 41 내지 251, 42 내지 251, 43 내지 251, 44 내지 251, 45 내지 251, 46 내지 251, 47 내지 251, 48 내지 251, 49 내지 251, 50 내지 251, 51 내지 251, 52 내지 251, 53 내지 251, 54 내지 251, 55 내지 251, 56 내지 251, 57 내지 251, 58 내지 251, 59 내지 251, 60 내지 251, 61 내지 251, 62 내지 251, 63 내지 251, 64 내지 251, 65 내지 251, 66 내지 251, 67 내지 251, 68 내지 251, 69 내지 251, 70 내지 251, 71 내지 251, 72 내지 251, 73 내지 251, 74 내지 251, 75 내지 251, 76 내지 251, 77 내지 251, 78 내지 251, 79 내지 251, 80 내지 251, 81 내지 251, 82 내지 251, 83 내지 251, 84 내지 251, 85 내지 251, 86 내지 251, 87 내지 251, 88 내지 251, 89 내지 251, 90 내지 251, 91 내지 251, 92 내지 251, 93 내지 251, 94 내지 251, 95 내지 251, 96 내지 251, 97 내지 251, 98 내지 251, 99 내지 251, 100 내지 251, 101 내지 251, 102 내지 251, 103 내지 251, 104 내지 251, 105 내지 251, 106 내지 251, 107 내지 251, 108 내지 251, 109 내지 251, 110 내지 251, 111 내지 251, 112 내지 251, 113 내지 251, 114 내지 251, 115 내지 251, 116 내지 251, 117 내지 251, 118 내지 251, 119 내지 251, 120 내지 251, 121 내지 251, 122 내지 251, 123 내지 251, 124 내지 251, 125 내지 251, 126 내지 251, 127 내지 251, 128 내지 251, 129 내지 251, 130 내지 251, 131 내지 251, 132 내지 251, 133 내지 251 및 134 내지 251. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다.
앞서 언급된 바와 같이, 특정 폴리펩티드의 N-말단으로부터의 하나 이상의아미노산의 결실로 인해 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 기능이 변형되거나 손실되는 경우일지라도, 기타 생물학적 활성은 여전히 보유될 수 있다. 따라서, 상기와 같이 짧아진 폴리펩티드가 완전한 길이 또는 성숙한 형태의 상기 폴리펩티드를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이와 결합되는 능력은 상기 완전한 길이 또는 성숙한 폴리펩티드의 잔기의 일부분이 N-말단으로부터 제거되는 경우에 보유될 것이다. 완전한 단백질의 N-말단 잔기가 결여된 특정한 폴리펩티드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기재되고 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 다수의 결실된 N-말단 아미노산 잔기를 갖는 VEGI 뮤테인이 몇몇 생물학적 또는 면역원성 활성을 보유할 수 있을 것 같지 않다. 사실상, 6개 VEGI 아미노산 잔기와 같이 적은 아미노산으로 구성된 펩티드가 종종 면역 반응을 유발시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열 9의 142번 위치의 페닐알라닌 잔기까지, 서열 9에 기재된 VEGI의 예상된 성숙한 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 9의 잔기 n3-147의 아미노산 서열[여기서, n3은 1 내지 169의 범위의 정수이고 170는 적어도 VEGI 폴리펩티드의 면역원성 활성에 요구되는 것으로 간주된 완전한 VEGI 폴리펩티드의 N-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다]을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
더욱 특히, 본 발명은 도 5A, 5B 및 5C에 제시된 VEGI 서열(도 5A, 5B 및 5C에 제시된 VEGI 아미노산 서열은 서열 9에서의 것과 동일하지만, 번호 매기는 방식은 둘 사이에 상이한데, 이 경우 상기 아미노산 잔기의 번호 매김은 도 5A, 5B 및 5C의 것을 반영하고 있다)의 다음 잔기 번호의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
R-2 내지 L-174; R-3 내지 L-174; F-4 내지 L-174; L-5 내지 L-174; S-6 내지 L-174; K-7 내지 L-174; V-8 내지 L-174; Y-9 내지 L-174; S-10 내지 L-174; F-11 내지 L-174; P-12 내지 L-174; M-13 내지 L-174; R-14 내지 L-174; K-15 내지 L-174; L-16 내지 L-174; I-17 내지 L-174; L-18 내지 L-174; F-19 내지 L-174; L-20 내지 L-174; V-21 내지 L-174; F-22 내지 L-174; P-23 내지 L-174; V-24 내지 L-174; V-25 내지 L-174; R-26 내지 L-174; Q-27 내지 L-174; T-28 내지 L-174; P-29 내지 L-174; T-30 내지 L-174; Q-31 내지 L-174; H-32 내지 L-174; F-33 내지 L-174; K-34 내지 L-174; N-35 내지 L-174; Q-36 내지 L-174; F-37 내지 L-174; P-38 내지 L-174; A-39 내지 L-174; L-40 내지 L-174; H-41 내지 L-174; W-42 내지 L-174; E-43 내지 L-174; H-44 내지 L-174; E-45 내지 L-174; L-46 내지 L-174; G-47 내지 L-174; L-48 내지 L-174; A-49 내지 L-174; F-50 내지 L-174; T-51 내지 L-174; K-52 내지 L-174; N-53 내지 L-174; R-54 내지 L-174; M-55 내지 L-174; N-56 내지 L-174; Y-57 내지 L-174; T-58 내지 L-174; N-59 내지 L-174; K-60 내지 L-174; F-61 내지 L-174; L-62 내지 L-174; L-63 내지 L-174; I-64 내지 L-174; P-65 내지 L-174; E-66 내지 L-174; S-67 내지 L-174; G-68 내지 L-174; D-69 내지 L-174; Y-70 내지 L-174; F-71 내지 L-174; I-72 내지 L-174; Y-73 내지 L-174; S-74 내지 L-174; Q-75 내지 L-174; V-76 내지 L-174; T-77 내지 L-174; F-78 내지 L-174; R-79 내지 L-174; G-80 내지 L-174; M-81 내지 L-174; T-82 내지 L-174; S-83 내지 L-174; E-84 내지 L-174; C-85 내지 L-174; S-86 내지 L-174; E-87 내지 L-174; I-88 내지 L-174; R-89 내지 L-174; Q-90 내지 L-174; A-91 내지 L-174; G-92 내지 L-174; R-93 내지 L-174; P-94 내지 L-174; N-95 내지 L-174; K-96 내지 L-174; P-97 내지 L-174; D-98 내지 L-174; S-99 내지 L-174; I-100 내지 L-174; T-101 내지 L-174; V-102 내지 L-174; V-103 내지 L-174; I-104 내지 L-174; T-105 내지 L-174; K-106 내지 L-174; V-107 내지 L-174; T-108 내지 L-174; D-109 내지 L-174; S-110 내지 L-174; Y-111 내지 L-174; P-112 내지 L-174; E-113 내지 L-174; P-114 내지 L-174; T-115 내지 L-174; Q-116 내지 L-174; L-117 내지 L-174; L-118 내지 L-174; R-119 M지 L-174; G-120 내지 L-174; T-121 내지 L-174; K-122 내지 L-174; S-123 내지 L-174; V-124 내지 L-174; C-125 내지 L-174; E-126 내지 L-174; V-127 내지 L-174; G-128 내지 L-174; S-129 내지 L-174; N-130 내지 L-174; W-131 내지 L-174; F-132 내지 L-174; Q-133 내지 L-174; P-134 내지 L-174; I-135 내지 L-174; Y-136 내지 L-174; L-137 내지 L-174; G-138 내지 L-174; A-139 내지 L-174; M-140 내지 L-174; F-141 내지 L-174; S-142 내지 L-174; L-143 내지 L-174; Q-144 내지 L-174; E-145 내지 L-174; G-146 내지 L-174; D-147 내지 L-174; K-148 내지 L-174; L-149 내지 L-174; M-150 내지 L-174; V-151 내지 L-174; N-152 내지 L-174; V-153 내지 L-174; S-154 내지 L-174; D-155 내지 L-174; I-156 내지 L-174; S-157 내지 L-174; L-158 내지 L-174; V-159 내지 L-174; D-160 내지 L-174; Y-161 내지 L-174; T-162 내지 L-174; K-163 내지 L-174; E-164 내지 L-174; D-165 내지 L-174; K-166 내지 L-174; T-167 내지 L-174; F-168 내지 L-174 및 F-169 내지 L-174. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다.
따라서, 본 발명은 246번 위치의 페닐알라닌 잔기까지, 서열 27에 기재된 VEGI-베타의 예상된 성숙한 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 27의 잔기 n4-251의 아미노산 서열[여기서, n4은 2 내지 246의 범위의 정수이고 247는 적어도 VEGI-베타 단백질의 면역원성 활성에 요구되는 것으로 간주된 완전한 VEGI-베타 폴리펩티드의 N-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다]을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 서열 27에 제시된 VEGI-베타 서열의 다음 잔기 번호의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
A-2 내지 L-251; E-3 내지 L-251; D-4 내지 L-251; L-5 내지 L-251; G-6 내지 L-251; L-7 내지 L-251; S-8 내지 L-251; F-9 내지 L-251; G-10 내지 L-251; E-11 내지 L-251; T-12 내지 L-251; A-13 내지 L-251; S-14 내지 L-251; V-15 내지 L-251; E-16 내지 L-251; M-17 내지 L-251; L-18 내지 L-251; P-19 내지 L-251; E-20 내지 L-251; H-21 내지 L-251; G-22 내지 L-251; S-23 내지 L-251; C-24 내지 L-251; R-25 내지 L-251; P-26 내지 L-251; K-27 내지 L-251; A-28 내지 L-251; R-29 내지 L-251; S-30 내지 L-251; S-31 내지 L-251; S-32 내지 L-251; A-33 내지 L-251; R-34 내지 L-251; W-35 내지 L-251; A-36 내지 L-251; L-37 내지 L-251; T-38 내지 L-251; C-39 내지 L-251; C-40 내지 L-251; L-41 내지 L-251; V-42 내지 L-251; L-43 내지 L-251; L-44 내지 L-251; P-45 내지 L-251; F-46 내지 L-251; L-47 내지 L-251; A-48 내지 L-251; G-49 내지 L-251; L-50 내지 L-251; T-51 내지 L-251; T-52 내지 L-251; Y-53 내지 L-251; L-54 내지 L-251; L-55 내지 L-251; V-56 내지 L-251; S-57 내지 L-251; Q-58 내지 L-251; L-59 내지 L-251; R-60 내지 L-251; A-61 내지 L-251; Q-62 내지 L-251; G-63 내지 L-251; E-64 내지 L-251; A-65 내지 L-251; C-66 내지 L-251; V-67 내지 L-251; Q-68 내지 L-251; F-69 내지 L-251; Q-70 내지 L-251; A-71 내지 L-251; L-72 내지 L-251; K-73 내지 L-251; G-74 내지 L-251; Q-75 내지 L-251; E-76 내지 L-251; F-77 내지 L-251; A-78 내지 L-251; P-79 내지 L-251; S-80 내지 L-251; H-81 내지 L-251; Q-82 내지 L-251; Q-83 내지 L-251; V-84 내지 L-251; Y-85 내지 L-251; A-86 내지 L-251; P-87 내지 L-251; L-88 내지 L-251; R-89 내지 L-251; A-90 내지 L-251; D-91 내지 L-251; G-92 내지 L-251; D-93 내지 L-251; K-94 내지 L-251; P-95 내지 L-251; R-96 내지 L-251; A-97 내지 L-251; H-98 내지 L-251; L-99 내지 L-251; T-100 내지 L-251; V-101 내지 L-251; V-102 내지 L-251; R-103 내지 L-251; Q-104 내지 L-251; T-105 내지 L-251; P-106 내지 L-251; T-107 내지 L-251; Q-108 내지 L-251; H-109 내지 L-251; F-110 내지 L-251; K-111 내지 L-251; N-112 내지 L-251; Q-113 내지 L-251; F-114 내지 L-251; P-115 내지 L-251; A-116 내지 L-251; L-117 내지 L-251; H-118 내지 L-251; W-119 내지 L-251; E-120 내지 L-251; H-121 내지 L-251; E-122 내지 L-251; -123 내지 L-251; G-124 내지 L-251; L-125 내지 L-251; A-126 내지 L-251; F-127 내지 L-251; T-128 내지 L-251; K-129 내지 L-251; N-130 내지 L-251; R-131 내지 L-251; M-132 내지 L-251; N-133 내지 L-251; Y-134 내지 L-251; T-135 내지 L-251; N-136 내지 L-251; K-137 내지 L-251; F-138 내지 L-251; L-139 내지 L-251; L-140 내지 L-251; I-141 내지 L-251; P-142 내지 L-251; E-143 내지 L-251; S-144 내지 L-251; G-145 내지 L-251; D-146 내지 L-251; Y-147 내지 L-251; F-148 내지 L-251; I-149 내지 L-251; Y-150 내지 L-251; S-151 내지 L-251; Q-152 내지 L-251; V-153 내지 L-251; T-154 내지 L-251; F-155 내지 L-251; R-156 내지 L-251; G-157 내지 L-251; M-158 내지 L-251; T-159 내지 L-251; S-160 내지 L-251; E-161 내지 L-251; C-162 내지 L-251; S-163 내지 L-251; E-164 내지 L-251; I-165 내지 L-251; R-166 내지 L-251; Q-167 내지 L-251; A-168 내지 L-251; G-169 내지 L-251; R-170 내지 L-251; P-171 내지 L-251; N-172 내지 L-251; K-173 내지 L-251; P-174 내지 L-251; D-175 내지 L-251; S-176 내지 L-251; I-177 내지 L-251; T-178 내지 L-251; V-179 내지 L-251; V-180 내지 L-251; I-181 내지 L-251; T-182 내지 L-251; K-183 내지 L-251; V-184 내지 L-251; T-185 내지 L-251; D-186 내지 L-251; S-187 내지 L-251; Y-188 내지 L-251; P-189 내지 L-251; E-190 내지 L-251; P-191 내지 L-251; T-192 내지 L-251; Q-193 내지 L-251; L-194 내지 L-251; L-195 내지 L-251; M-196 내지 L-251; G-197 내지 L-251; T-198 내지 L-251; K-199 내지 L-251; S-200 내지 L-251; V-201 내지 L-251; C-202 내지 L-251; E-203 내지 L-251; V-204 내지 L-251; G-205 내지 L-251; S-206 내지 L-251; N-207 내지 L-251; W-208 내지 L-251; F-209 내지 L-251; Q-210 내지 L-251; P-211 내지 L-251; I-212 내지 L-251; Y-213 내지 L-251; L-214 내지 L-251; G-215 내지 L-251; A-216 내지 L-251; M-217 내지 L-251; F-218 내지 L-251; S-219 내지 L-251; L-220 내지 L-251; Q-221 내지 L-251; E-222 내지 L-251; G-223 내지 L-251; D-224 내지 L-251; K-225 내지 L-251; L-226 내지 L-251; M-227 내지 L-251; V-228 내지 L-251; N-229 내지 L-251; V-230 내지 L-251; S-231 내지 L-251; D-232 내지 L-251; I-233 내지 L-251; S-234 내지 L-251; L-235 내지 L-251; V-236 내지 L-251; D-237 내지 L-251; Y-238 내지 L-251; T-239 내지 L-251; K-240 내지 L-251; E-241 내지 L-251; D-242 내지 L-251; K-243 내지 L-251; T-244 내지 L-251; F-245 내지 L-251 및 F-246 내지 L-251. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다.
유사하게, 생물학적 작용성 C-말단 결실 뮤테인의 많은 예가 공지되어 있다. 예를 들면, 인터페론 감마는 상기 단백질의 카복시 말단으로부터 8 내지 10개 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 10배까지 높은 활성을 나타낸다[참조: Dobeli, et al., J. Biotechnology 7:199-216(1988)]. 추가로, 몇몇 연구가들은 2개 아미노산 정도로 적은 아미노산이 C-말단으로부터 제거된, 생물학적으로 불활성인 TNF-α뮤테인을 보고하였다[참조: Carlino, J. A., et al., J. Biol. Chem. 262:958-961 (1987); Creasey, A. A. et al., Cancer Res. 47:145-149 (1987); Sidhu, R.S. and Bollen, A.P. Anticancer Res. 9:1569-1576 (1989); Gase, K. et al., Immunology 71:368-371 (1990)].
본 경우에 있어서, 본 발명의 단백질이 TNF 폴리펩티드 계열의 구성원이기 때문에, 서열 9의 146번 위치의 루이신 잔기(이는 서열 27의 250번 위치의 루이신 잔기에 상응한다)까지의 C-말단 아미노산의 결실은 많은 유형의 조혈 및 내피 세포의 성장 및 분화의 조절과 같은 몇몇 생물학적 활성을 보유할 수 있다. 서열 9의 146번 위치의 루이신 잔기(또는 서열 27의 250번 위치의 루이신 잔기)를 포함한 추가의 C-말단 결실을 갖는 폴리펩티드는 이러한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 예상되지 않는데, 이는 TNF-관련 폴리펩티드에서의 상기 잔기가 생물학적 활성에 요구되는 보존된 도메인의 시작부인 것으로 공지되기 때문이다.
그러나,특정 단백질의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실로 인해 상기 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능이 변형되거나 손실되는 경우일지라도, 기타 생물학적 활성은 여전히 보유될 수 있다. 따라서, 상기와 같이 짧아진 단백질이 완전한 또는 성숙한 형태의 상기 단백질을 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이와 결합되는 능력은 상기 완전한 또는 성숙한 단백질의 잔기의 일부분이 C-말단으로부터 제거되는 경우에 보유될 것이다. 완전한 단백질의 C-말단 잔기가 결여된 특정한 폴리펩티드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기재되고 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정할 수 있다.
부가의 양태에 있어서, 본 발명은 서열 9의 146번 위치의 루이신 잔기까지, 서열 9에 기재된 VEGI 폴리펩티드의 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 9에서 아미노산 서열의 잔기 -27-m1의 아미노산 서열[여기서, m1은 146 내지 147의 범위의 정수이고 146번 잔기는 VEGI 폴리펩티드에 의한 많은 유형의 조혈 및 내피 세포의 성장 및 분화를 조절하는데 요구되는 것으로 간주된 완전한 VEGI 폴리펩티드(도 9에 제시됨)의 C-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다]을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 서열 9의 잔기 27-146 및 -27-147의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.
본 발명은 서열 27의 250번 위치의 루이신 잔기까지, 서열 27에 기재된 VEGI-베타 폴리펩티드의 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 27에서 아미노산 서열의 잔기 1-m2의 아미노산 서열[여기서, m2은 250 내지 251의 범위의 정수이고 249번 잔기는 많은 유형의 조혈 및 내피 세포의 성장 및 분화를 조절하는데 요구되는 것으로 간주된 완전한 VEGI-베타 폴리펩티드(도 27에 제시됨)의 C-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다]을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 서열 27의 잔기 1-250 및 1-251의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.
본 발명은 또한, 서열 9의 잔기 n1-m1[여기서, n 및 m은 상기 정의된 바와 같은 정수이다]을 갖는 것으로서 일반적으로 기재될 수 있는, VEGI-알파의 아미노 말단과 카복시 말단 둘 다로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드 단편을 제공한다. 본 발명은 추가로, 서열 27의 잔기 n2-m2[여기서, n 및 m은 상기 정의된 바와 같은 정수이다]을 갖는 것으로서 일반적으로 기재될 수 있는, VEGI-베타의 아미노 말단과 카복시 말단 둘 다로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다.
앞서 언급된 바와 같이, 특정 폴리펩티드의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실로 인해 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 기능이 변형되거나 손실되는 경우일지라도, 기타 생물학적 활성은 여전히 보유될 수 있다. 따라서, 상기와 같이 짧아진 VEGI 뮤테인이 완전한 길이 또는 성숙한 형태의 상기 폴리펩티드를 인식하는 항체를 유도하고/하거나 이와 결합되는 능력은 상기 완전한 길이 또는 성숙한 폴리펩티드의 잔기의 일부분이 C-말단으로부터 제거되는 경우에 보유될 것이다. 완전한 길이의 폴리펩티드의 C-말단 잔기가 결여된 특정한 폴리펩티드가 이러한 면역학적 활성을 보유하는지의 여부는 본원에 기재되고 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 다수의 결실된 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 VEGI 뮤테인이 몇몇 생물학적 또는 면역원성 활성을 보유할 수 있을 것 같지 않다. 사실상, 6개 정도로 적은 VEGI 아미노산 잔기로 구성된 펩티드가 종종 면역 반응을 유발시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 도 5A, 5B 및 5C에서의 6번(또는 서열 9에서의 -22번) 위치의 세린 잔기까지, 도 5A, 5B 및 5C(또는 서열 9)에 기재된 VEGI의 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 9의 잔기 1-m3의 아미노산 서열[여기서, m3은 6 내지 174의 범위의 정수이고 6은 적어도 VEGI-알파의 면역원성 활성에 요구되는 것으로 간주된 완전한 VEGI 폴리펩티드의 C-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다]을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
더욱 특히, 본 발명은 도 5A, 5B 및 5C에 제시된 VEGI 서열(도 5A, 5B 및 5C에 제시된 VEGI 아미노산 서열은 서열 9에서의 것과 동일하지만, 번호 매기는 방식은 둘 사이에 상이한데, 이 경우 상기 아미노산 잔기의 번호 매김은 도 5A, 5B 및 5C의 것을 반영하고 있다)의 다음 잔기 번호의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
M-1 내지 L-173; M-1 내지 F-172; M-1 내지 A-171; M-1 내지 G-170; M-1 내지 F-169; M-1 내지 F-168; M-1 내지 T-167; M-1 내지 K-166; M-1 내지 D-165; M-1 내지 E-164; M-1 내지 K-163; M-1 내지 T-162; M-1 내지 Y-161; M-1 내지 D-160; M-1 내지 V-159; M-1 내지 L-158; M-1 내지 S-157; M-1 내지 I-156; M-1 내지 D-155; M-1 내지 S-154; M-1 내지 V-153; M-1 내지 N-152; M-1 내지 V-151; M-1 내지 M-150; M-1 내지 L-149; M-1 내지 K-148; M-1 내지 D-147; M-1 내지 G-146; M-1 내지 E-145; M-1 내지 Q-144; M-1 내지 L-143; M-1 내지 S-142; M-1 내지 F-141; M-1 내지 M-140; M-1 내지 A-139; M-1 내지 G-138; M-1 내지 L-137; M-1 내지 Y-136; M-1 내지 I-135; M-1 내지 P-134; M-1 내지 Q-133; M-1 내지 F-132; M-1 내지 W-131; M-1 내지 N-130; M-1 내지 S-129; M-1 내지 G-128; M-1 내지 V-127; M-1 내지 E-126; M-1 내지 C-125; M-1 내지 V-124; M-1 내지 S-123; M-1 내지 K-122; M-1 내지 T-121; M-1 내지 G-120; M-1 내지 M-119; M-1 내지 L-118; M-1 내지 L-117; M-1 내지 Q-116; M-1 내지 T-115; M-1 내지 P-14; M-1 내지 E-113; M-1 내지 P-112; M-1 내지 Y-111; M-1 내지 S-110; M-1 내지 D-109; M-1 내지 T-108; M-1 내지 V-107; M-1 내지 K-106; M-1 내지 T-105; M-1 내지 I-104; M-1 내지 V-103; M-1 내지 V-102; M-1 내지 T-101; M-1 내지 I-100; M-1 내지 S-99; M-1 내지 D-98; M-1 내지 P-97; M-1 내지 K-96; M-1 내지 N-95; M-1 내지 P-94; M-1 내지 R-93; M-1 내지 G-92; M-1 내지 A-91; M-1 내지 Q-90; M-1 내지 R-89; M-1 내지 -88; M-1 내지 E-87; M-1 내지 S-86; M-1 내지 C-85; M-1 내지 E-84; M-1 내지 S-83; M-1 내지 T-82; M-1 내지 M-81; M-1 내지 G-80; M-1 내지 R-79; M-1 내지 F-78; M-1 내지 T-77; M-1 내지 V-76; M-1 내지 Q-75; M-1 내지 S-74; M-1 내지 Y-63; M-1 내지 I-72; M-1 내지 F-71; M-1 내지 Y-70; M-1 내지 D-69; M-1 내지 G-68; M-1 내지 S-67; M-1 내지 E-66; M-1 내지 P-65; M-1 내지 I-64; M-1 내지 L-63; M-1 내지 L-62; M-1 내지 F-61; M-1 내지 K-60; M-1 내지 N-59; M-1 내지 T-58; M-1 내지 Y-57; M-1 내지 N-56; M-1 내지 M-55; M-1 내지 R-54; M-1 내지 N-53; M-1 내지 K-52; M-1 내지 T-51; M-1 내지 F-50; M-1 내지 A-49; M-1 내지 L-48; M-1 내지 G-47; M-1 내지 L-46; M-1 내지 E-45; M-1 내지 H-44; M-1 내지 E-43; M-1 내지 W-42; M-1 내지 H-41; M-1 내지 L-40; M-1 내지 A-39; M-1 내지 P-38; M-1 내지 F-37; M-1 내지 Q-36; M-1 내지 N-35; M-1 내지 K-34; M-1 내지 F-33; M-1 내지 H-32; M-1 내지 Q-31; M-1 내지 T-30; M-1 내지 P-29; M-1 내지 T-28; M-1 내지 Q-27; M-1 내지 R-26; M-1 내지 V-25; M-1 내지 V-24; M-1 내지 P-23; M-1 내지 F-22; M-1 내지 V-21; M-1 내지 L-20; M-1 내지 F-19; M-1 내지 L-18; M-1 내지 I-17; M-1 내지 L-16; M-1 내지 K-15; M-1 내지 R-14; M-1 내지 M-13; M-1 내지 P-12; M-1 내지 F-11; M-1 내지 S-10; M-1 내지 Y-9; M-1 내지 V-8; M-1 내지 K-7 및 M-1 내지 S-6. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 제공된다.
본 발명은 추가로, 서열 9의 잔기 n3-m3[여기서, n3및 m3은 상기 정의된 바와 같은 정수이다]을 갖는 것으로서 일반적으로 기재될 수 있는, VEGI 폴리펩티드의 아미노 말단과 카복시 말단 둘 다로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다.
본 발명은 6번 위치의 글리신 잔기까지, 서열 27에 기재된 VEGI-베타의 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터 결실된 하나 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 서열 27의 잔기 1-m4의 아미노산 서열[여기서, m4은 6 내지 250의 범위의 정수이고 6은 적어도 VEGI-베타 단백질의 면역원성 활성에 요구되는 것으로 간주된 완전한 VEGI-베타 폴리펩티드의 C-말단으로부터의 첫 번째 잔기의 위치이다]을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
더욱 특히, 본 발명은 서열 27에 제시된 VEGI-베타 서열의 다음 잔기 번호의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
M-1 내지 L-250; M-1 내지 F-249; M-1 내지 A-248; M-1 내지 G-247; M-1 내지 F-246; M-1 내지 F-245; M-1 내지 T-244; M-1 내지 K-243; M-1 내지 D-242; M-1 내지 E-241; M-1 내지 K-240; M-1 내지 T-239; M-1 내지 Y-238; M-1 내지 D-237; M-1 내지 V-236; M-1 내지 L-235; M-1 내지 S-234; M-1 내지 I-233; M-1 내지 D-232; M-1 내지 S-231; M-1 내지 V-230; M-1 내지 N-229; M-1 내지 V-228; M-1 내지 M-227; M-1 내지 L-226; M-1 내지 K-225; M-1 내지 D-224; M-1 내지 G-223; M-1 내지 E-222; M-1 내지 Q-221; M-1 내지 L-220; M-1 내지 S-219; M-1 내지 F-218; M-1 내지 M-217; M-1 내지 A-216; M-1 내지 G-215; M-1 내지 L-214; M-1 내지 Y-213; M-1 내지 I-212; M-1 내지 P-21; M-1 내지 Q-210; M-1 내지 F-209; M-1 내지 W-208; M-1 내지 N-2907; M-1 내지 S-206; M-1 내지 G-205; M-1 내지 V-204; M-1 내지 E-203; M-1 내지 C-202; M-1 내지 V-201; M-1 내지 S-200; M-1 내지 K-199; M-1 내지 T-198; M-1 내지 G-197; M-1 내지 M-196; M-1 내지 L-195; M-1 내지 L-184; M-1 내지 Q-183; M-1 내지 T-192; M-1 내지 P-191; M-1 내지 E-190; M-1 내지 P-189; M-1 내지 Y-188; M-1 내지 S-187; M-1 내지 D-186; M-1 내지 T-185; M-1 내지 V-184; M-1 내지 K-183; M-1 내지 T-182; M-1 내지 I-181; M-1 내지 V-180; M-1 내지 V-179; M-1 내지 T-178; M-1 내지 I-177; M-1 내지 S-176; M-1 내지 D-175; M-1 내지 P-174; M-1 내지 K-173; M-1 내지 N-172; M-1 내지 P-171; M-1 내지 R-170; M-1 내지 G-169; M-1 내지 A-168; M-1 내지 Q-167; M-1 내지 R-166; M-1 내지 I-165; M-1 내지 E-164; M-1 내지 S-163; M-1 내지 C-162; M-1 내지 E-161; M-1 내지 S-160; M-1 내지 T-159; M-1 내지 M-158; M-1 내지 G-157; M-1 내지 R-156; M-1 내지 F-155; M-1 내지 T-154; M-1 내지 V-153; M-1 내지 Q-152; M-1 내지 S-151; M-1 내지 Y-150; M-1 내지 I-149; M-1 내지 F-148; M-1 내지 Y-147; M-1 내지 D-146; M-1 내지 G-145; M-1 내지 S-144; M-1 내지 E-143; M-1 내지 P-142; M-1 내지 I-141; M-1 내지 L-140; M-1 내지 L-139; M-1 내지 F-138; M-1 내지 K-137; M-1 내지 N-136; M-1 내지 T-135; M-1 내지 Y-134; M-1 내지 N-133; M-1 내지 M-132; M-1 내지 R-131; M-1 내지 N-130; M-1 내지 K-129; M-1 내지 T-128; M-1 내지 F-127; M-1 내지 A-126; M-1 내지 L-125; M-1 내지 G-124; M-1 내지 L-123; M-1 내지 E-122; M-1 내지 H-121; M-1 내지 E-120; M-1 내지 W-119; M-1 내지 H-118; M-1 내지 L-117; M-1 내지 A-116; M-1 내지 P-115; M-1 내지 F-114; M-1 내지 Q-113; M-1 내지 N-112; M-1 내지 K-111; M-1 내지 F-110; M-1 내지 H-109; M-1 내지 Q-108; M-1 내지 T-107; M-1 내지 P-106; M-1 내지 T-105; M-1 내지 Q-104; M-1 내지 R-103; M-1 내지 V-102; M-1 내지 V-101; M-1 내지 T-100; M-1 내지 L-99; M-1 내지 H-98; M-1 내지 A-97; M-1 내지 R-96; M-1 내지 P-95; M-1 내지 K-94; M-1 내지 D-93; M-1 내지 G-92; M-1 내지 D-91; M-1 내지 A-90; M-1 내지 R-89; M-1 내지 L-88; M-1 내지 P-87; M-1 내지 A-86; M-1 내지 Y-85; M-1 내지 V-84; M-1 내지 Q-83; M-1 내지 Q-82; M-1 내지 H-81; M-1 내지 S-80; M-1 내지 P-79; M-1 내지 A-78; M-1 내지 F-77; M-1 내지 E-76; M-1 내지 Q-75; M-1 내지 G-74; M-1 내지 K-73; M-1 내지 L-72; M-1 내지 A-71; M-1 내지 Q-70; M-1 내지 F-69; M-1 내지 Q-68; M-1 내지 V-67; M-1 내지 C-66; M-1 내지 A-65; M-1 내지 E-64; M-1 내지 G-63; M-1 내지 Q-62; M-1 내지 A-61; M-1 내지 R-60; M-1 내지 L-59; M-1 내지 Q-58; M-1 내지 S-57; M-1 내지 V-56; M-1 내지 L-55; M-1 내지 L-54; M-1 내지 Y-53; M-1 내지 T-52; M-1 내지 T-51; M-1 내지 L-50; M-1 내지 G-49; M-1 내지 A-48; M-1 내지 L-47; M-1 내지 F-46; M-1 내지 P-45; M-1 내지 L-44; M-1 내지 L-43; M-1 내지 V-42; M-1 내지 L-41; M-1 내지 C-40; M-1 내지 C-39; M-1 내지 T-38; M-1 내지 L-37; M-1 내지 A-36; M-1 내지 W-35; M-1 내지 R-34; M-1 내지 A-33; M-1 내지 S-32; M-1 내지 S-31; M-1 내지 S-30; M-1 내지 R-29; M-1 내지 A-28; M-1 내지 K-27; M-1 내지 P-26; M-1 내지 R-25; M-1 내지 C-24; M-1 내지 S-23; M-1 내지 G-22; M-1 내지 H-21; M-1 내지 E-20; M-1 내지 P-19; M-1 내지 L-18; M-1 내지 M-17; M-1 내지 E-16; M-1 내지 V-15; M-1 내지 S-14; M-1 내지 A-13; M-1 내지 T-12; M-1 내지 E-11; M-1 내지 G-10; M-1 내지 F-9; M-1 내지 S-8; M-1 내지 L-7 및 M-1 내지 G-6. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 제공된다.
본 발명은 추가로, 서열 27의 잔기 n4-m4[여기서, n4및 m4은 상기 정의된 바와 같은 정수이다]을 갖는 것으로서 일반적으로 기재될 수 있는, VEGI-베타 폴리펩티드의 아미노 말단과 카복시 말단 둘 다로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다.
본 발명 추가의 양태는 식 mx-nx[여기서, m 및 n은 각각 이들 부호에 대해 상기 명시된 아미노산 잔기 중의 어느 하나에 상응하고 x는 모든 정수를 나타낸다]으로 기재된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드 단편에 관한 것이다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명에 포괄된다.
본 발명의 특정 양태는 ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 VEGI 아미노산 서열의 일정 부분(이러한 부분은 ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터의 1 내지 약 62개 아미노산이 배제된다), 또는 ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터의 약 1개의 아미노산 또는 상기 아미노 말단과 카복시 말단 결실의 모든 조합물로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 상기 결실 돌연변이체 폴리펩티드 형태 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 VEGI-베타 아미노산 서열의 일정 부분(이러한 부분은 ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터의 1 내지 약 134개 아미노산이 배제되거나, 또는 ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터의 수 많은 아미노산(여기서, 아미노산의 수는 1 내지 134의 정수 중에서 선택된다)), 또는 ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열의 카복시 말단으로부터의 약 1개의 아미노산 또는 상기 아미노 말단과 카복시 말단 결실의 모든 조합물로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.
본 발명은 추가로, (a) 서열 9에 제시된 완전한 아미노산 서열(즉, 서열 9의 -27번에서부터 147번)을 갖는 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드의 아미노산 서열; (b) N-말단 메티오닌을 제외한 서열 9에 제시된 완전한 아미노산 서열(즉, 서열 9의 -26번에서부터 147번)을 갖는 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드의 아미노산 서열; (c) 서열 9의 1 내지 147번에 아미노산 서열을 갖는 예상된 성숙한 VEGI 폴리펩티드의 아미노산 서열; (d) ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론 HUVE091에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열; (e) ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론에 의해 암호화된 N-말단 메티오닌을 제외한 완전한 아미노산 서열; 및 (f) ATCC 기탁물 제75927호에 함유된 cDNA 클론 HUVE091에 의해 암호화된 예상된 성숙한 VEGI 폴리펩티드의 완전한 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 VEGI 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드에는 본원에 기재된 바와 같이, 상기 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에 기재된 것과 70% 이상, 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.
본 발명은 추가로, (a) 서열 27에 제시된 완전한 아미노산 서열(즉, 서열 27의 1번에서부터 251번)을 갖는 완전한 길이의 VEGI-베타 폴리펩티드의 아미노산 서열; (b) N-말단 메티오닌을 제외한 서열 27에 제시된 완전한 아미노산 서열(즉, 서열 27의 2번에서부터 251번)을 갖는 완전한 길이의 VEGI-베타 폴리펩티드의 아미노산 서열; (c) 서열 27의 62번에서부터 251번 위치의 아미노산 서열을 갖는 예정된 성숙한 VEGI-베타 폴리펩티드의 아미노산 서열; (d) ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론 HEMCZ56에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열; (e) ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론 HEMCZ56에 의해 암호화된 N-말단 메티오닌을 제외한 완전한 아미노산 서열; 및 (f) ATCC 기탁물 제203055호에 함유된 cDNA 클론 HEMCZ56에 의해 암호화된 예정된 성숙한 VEGI-베타 폴리펩티드를의 완전한 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 VEGI 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드에는 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 상기 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)에 기재된 것과 70% 이상, 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 단편이 포함된다. 특정 양태에 있어서, 이들 폴리펩티드는 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상 및 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 갖는다.
VEGI 폴리펩티드의 참조 아미노산 서열과 예를 들면, 95% 이상의 ″동질율″을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란, 이러한 폴리펩티드의 아미노산 서열이 VEGI 폴리펩티드의 참조 아미노산 서열의 각 100개 아미노산 당 5개 이하의 변형을포함할 수 있다는 것을 제외하고는 상기 참조 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 달리 언급하면, 참조 아미노산 서열과 95% 이상의 동질율을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서는, 참조 서열 중의 아미노산 잔기의 5% 이하가 결실되거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열 중의 총 아미노산 잔기의 5% 이하의 아미노산 수가 참조 서열 내에 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 변형은 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서 일어날 수 있거나 이들 말단 위치 사이 어느 곳에서도 일어날 수 있으며, 참조 서열 내의 잔기들 간에 개별적으로 산재하거나 참조 서열 내에서 하나 이상의 연속된 그룹에 산재된다.
실제적인 사항으로서, 특정한 폴리펩티드가, 예를 들어, 도 5A, 5B 및 5C(서열 9)에 제시된 아미노산 서열, 기탁된 cDNA 클론 HUVE901에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 이의 단편과 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 지의 여부는 베스트피트 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix에 대한 버젼 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 편리하게 결정할 수 있다. 특정 서열이, 예를 들면, 본 발명에 따르는 참조 서열과 95%의 동질율을 나타내는 지를 결정하기 위해 베스트비트 또는 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 물론, 동질율이 참조 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 산정되고 참조 서열 중의 아미노산 잔기 총 수의 5% 이내의 상동성 갭을 허용하도록 파라미터를 설정한다.
특정한 양태에 있어서, 총체적인 서열 정렬로서 지칭되기도 하는, 참조(의문) 서열(본 발명의 서열)과 대상 서열 간의 동질성 여부는 브루틀래그 등의 알고리듬을 기준으로 하는 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다[참조: Brutlag et al. (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245]. FASTDB 아미노산 정렬에 사용된 바람직한 파라미터는 다음과 같다: 매트릭스=PAM, k-튜플=2, 미스매치 페널티=1, 조이닝 페널티=20, 무작위 그룹 길이=0, 컷오프 스코어=1, 윈도우 사이즈=서열 길이, 갭 페널티=5, 갭 사이즈 페널티=0.05, 윈도우 사이즈=500 또는 보다 짧든지 간에 대상 아미노산 서열의 길이. 이러한 양태에 따르면, 대상 서열이 내부 결실에 의해서가 아니라 N- 또는 C-말단 결실로 인해 의문 서열보다 더 짧은 경우에는, FASTDB 프로그램이 총체적인 동질율을 산정할 때, 대상 서열의 N- 및 C-말단 절단을 고려하지 않았다는 사실을 고려하여, 상기 결과를 수동으로 교정해야만 한다. 의문 서열에 비해 N- 또는 C-말단이 절단된 대상 서열의 경우에는, 상응하는 대상 잔기를 갖는 매치되지 않고 정렬되지 않은, 대상 서열의 N- 및 C-말단인 의문 서열의 잔기 수를 의문 서열의 총 염기%로서 산정함으로써 동질율을 교정한다. 특정 잔기가 매치/정렬되는지의 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이어서, 이러한 비율을 상기 명시된 파라미터를 이용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의해 산정된 동질율(%)로부터 삭감하여 최종 동질율(%) 스코어에 도달하게 한다. 이러한 최종 동질율 스코어가 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 의문 서열과 매치/정렬되지 않은, 대상 서열의 N- 및 C-말단에 대한 염기 만이 동질율(%) 스코어를 수동으로 조정하기 위해 산정된다. 즉, 의문 잔기 위치만이 가장 멀리 있는 대상 서열의 N- 및 C-말단 잔기를 벗어나 있다. 예를 들면, 90개 아미노산 대상 서열을 100개 잔기 의문 서열에 정렬시켜 동질율(%)을 결정한다. 대상 서열의 N-말단에서 결실이 발생되므로, FASTDB 정렬이 N-말단에서의 처음 10개 잔기의 매치/정렬을 나타내지 않는다. 쌍을 이루지 않은 10개의 잔기는 서열의 10%를 나타내므로(N- 및 C-말단에서의 잔기의 수가 의문 서열에서의 잔기의 총 수와 매치되지 않는다) 10%를 FASTDB 프로그램에 의해 산정된 동질율(%) 스코어로부터 삭감한다. 나머지 90개 잔기가 완벽하게 매치된 경우에는, 최종 동질율(%)이 90%가 될 것이다. 또 다른 예에서는, 90개 잔기 대상 서열을 100개 잔기 의문 서열과 비교한다. 이때, 결실은 내부 결실이어서 대상 서열의 N- 또는 C-말단 상에는 의문 서열과 매치/정렬되지 않은 잔기가 존재하지 않는다. 이러한 경우, FASTDB에 의해 산정된 동질율(%)을 수동으로 교정하지 않는다. 다시 한번, 의문 서열과 매치/정렬되지 않은, FASTDB 정렬로 나타낸 바와 같이, 대상 서열의 N- 및 C-말단을 벗어난 위치의 잔기만이 수동으로 교정된다. 본 발명의 목적상 어떠한 기타 수동 교정도 이루어지지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드에는 서열 9의 폴리펩티드(특히, 성숙한 폴리펩티드) 뿐만 아니라 서열 9의 폴리펩티드와 70% 이상의 유사율(바람직하게는 70% 이상의 동질율), 바람직하게는 90% 이상의 유사율(바람직하게는 90% 이상의 동질율), 더욱 더 바람직하게는 95% 이상의 유사율(더욱 바람직하게는 95% 이상의 동질율)을 나타내는 폴리펩티드가 포함되며, 또한 일반적으로 30개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 일정 부분이 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드에는 또한, 서열 27의 폴리펩티드(특히, 상기 폴리펩티드의 세포외 도메인) 뿐만 아니라 서열 27의 폴리펩티드와 70% 이상의 유사율(바람직하게는 70% 이상의 동질율), 바람직하게는 90% 이상의 유사율(바람직하게는 90% 이상의 동질율), 더욱 더 바람직하게는 95% 이상의 유사율(더욱 바람직하게는 95% 이상의 동질율)을 나타내는 폴리펩티드가 포함되며, 또한 일반적으로 30개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 일정 부분이 포함된다.
본 발명의 추가의 폴리펩티드에는 본원에 기재된 폴리펩티드와 70% 이상, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 유사율을 나타내는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한, 본원에 기재된 폴리펩티드와 70% 이상, 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 또는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동질율을 나타내는 폴리펩티드을 포함한다. 특정 양태에 있어서, 이러한 폴리펩티드는 30개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 포함한다.
본원에 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 간의 ″유사율″은 한 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환체를 두 번째 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정한다. 두 폴리펩티드에 대한 ″유사율(%)″이란, 베스트피트 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix에 대한 버젼 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 유사율을 결정하기 위한 생략성 셋팅을 사용하여 두 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교함으로써 생성된 유사율 스코어이다. 베스트피트는 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소적 상동율 알고리듬을 이용하여 두 서열 간의 가장 유사한 절편을 발견한다.
본원에 사용된 바와 같이, 서열 2, 서열 9 및 서열 27에서의 아미노산 서열로 ″부터 유도된″ 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 상기 서열에 암호화된 폴리펩티드의 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 2 내지 5개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 8 내지 10개 이상의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 11 내지 15개 이상의 아미노산으로 이루어지거나 상기 서열에 암호화된 폴리펩티드로 면역학적으로 동정 가능한 상기 폴리펩티드의 부분을 지칭한다.
본 발명은 또한, 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드 ,또는 이의 단편, 변이체, 유도체 또는 동족체가 관련되지 않은 단백질과 융합되는 융합 단백질을 포괄한다. 이들 융합 단백질은 본원에 기재된 VEGI 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 기준으로 하여 통상적으로 고안될 수 있다. 예를 들면, 당해 분야의 숙련인이 인지하는 바와 같이, VEGI 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 및 본원에 기재된 이의 단편(에피토프-보유 단편을 포함함)을 면역글로불린(IgG)의 불변 영역의 일부분과 합하여, 키메릭(융합) 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 이들 융합 단백질은 정제를 촉진시키고 생체내에서의 반감기를 증가시킨다. 이는, 예를 들어, 사람 CD4-폴리펩티드의 첫 번째 두 영역과 포유류 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 각종 영역으로 이루어진 키메릭 단백질에 대해 나타났다[참조: EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)]. IgG 부분으로 인해 디설파이드-연결된 이량체 구조를 지니는 융합 단백질이 단량체성 VEGI 폴리펩티드 또는 단백질 단편 단독 보다 기타 분자를 결합 및 중화시키는데 더 효과적일 수 있다[참조: Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)]. 한 예로서, 이러한 VEGI-Fc 융합체가 본원에서 기재된 바와 같이 제조된다. 본 발명에 의해 포괄되는 VEGI 융합 단백질의 부가의 예로는 융합 단백질을 세포 표면 상에 표시시켜 주는 모든 아미노산 서열에 대한 VEGI 폴리펩티드 서열의 융합물; 또는 마커 기능을 제공해주는 효소, 형광성 단백질 또는 발광성 단백질에 대한 융합물이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
작용성 활성
VEGI 폴리펩티드, 및 이의 단편, 변이체 유도체, 및 동족체의 작용성 활성은 각종 방법으로 검정할 수 있다.
예를 들면, 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드와 결합하는 능력 또는 항-VEGI 항체와 결합하기 위해 완전한 길이의 VEGI 폴리펩티드와 경쟁하는 능력에 대해 검정하는 한 양태에서는, 방사선면역검정, ELISA(효소 연결된 면역흡착 검정), ″샌드위치″ 면역검정, 면역방사선측정 검정, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 동일계 반응 면역검정(예를 들어, 콜로이드성 골드, 효소, 또는 방사선동위원소 표지), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 검정(예를 들어, 겔 응집 검정, 혈구응집 반응), 보체 고착 검정, 면역형광성 검정, 단백질 A 검정 및 면역전기영동 검정 등과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 검정 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는 각종 면역검정을 사용할 수 있다. 한 양태에 있어서, 항체 결합은 1차 항체 상의 특정 표지를 검출함으로써 검출한다. 또 다른 양태에 있어서, 상기 1차 항체는 이러한 1차 항체에 대한 2차 항체 또는 시약의 결합을 검출함으로써 검출한다. 추가의 양태에서는, 2차 항체를 표지시킨다. 면역검정에서 결합을 검출하기 위한 많은 방법이 당해 분야에 공지되어 있고 본 발명의 범위내에 속한다.
또 다른 양태에 있어서, TNF-리간드를 동정하는 경우에는, 예를 들어, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 결합을 검정할 수 있다. 또 다른 양태에서는, VEGI가 이의 기질에 대한 결합의 생리학적 상관 관계(시그날 형질도입)을 검정할 수 있다.
또한, 본원에 기재된 검정(실시예 5 내지 8 및 10 참조), 및 당해 분야에 공지된 검정을 통상적으로 적용하여, VEGI 관련된 생물학적 활성(예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 세포 증식, 맥관형성 및 세포 유착을 억제시키거나 증진시킴)을 유도하는 VEGI 폴리펩티드, 및 이의 단편, 변이체 유도체 및 동족체의 능력을 측정할 수 있다.
기타 방법이 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있고 이 또한 본 발명의 범주 내에 속한다.
항체
VEGI의 하나 이상의 에피토프 또는 VEGI의 보존된 변이체의 에피토프, 또는 VEGI의 폴리펩티드 단편을 특이적으로 인식하는 항체가 또한 본 발명에 포괄된다. 따라서, 상기 폴리펩티드, 이들의 단편 또는 기타 유도체, 동족체 또는 이들을 발현하는 세포를 면역원으로서 사용하여 이에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 이들 항체는, 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한, 본 발명은 키메라성, 일본쇄, 및 사람적응화(humanized) 항체 뿐만 아니라 상기 언급된 것의 Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리의 생성물, 항-유전형 항체 및 을 에피토프 결합 단편을 포함할 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 각종 방법을 상기 항체 및 단편을 제조하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는, 상기 폴리펩티드를 동물 내로 직접 주사하거나 상기 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 사람이 아닌 동물에게 투여함으로써 수득할 수 있다. 다음, 상기와 같이 수득된 항체는 상기 폴리펩티드 자체에 결합될 것이다. 이러한 방법으로, 당해 폴리펩티드의 단편만을 암호화하는 서열이라도 완전한 본래의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 이러한 항체는 상기 폴리펩티드를 발현시키는 조직으로부터 상기 폴리펩티드를 분리시키고, 생물학적 샘플에서 VEGI를 검출하는 등의 용도를 지니며, 진단 또는 예후 기술의 일부로서 사용됨으로써 환자를 대상으로 하여 비정상적인 양의 VEGI에 대해 시험할 수 있다. 이러한 항체를 또한, VEGI 생물학적 활성의 억제 방법에 사용할 수도 있다.
항체를 제조하기 위하여, 각종 숙주 동물에게 VEGI 폴리펩티드(이러한 폴리펩티드의 작용성 도메인, 예를 들어, 세포외 도메인에 상응함)를 주사함으로써 상기 동물을 면역시킬 수 있다. 이러한 숙주 동물에는 래빗트, 마우스, 랫트 등이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 프로인트(완전한 및 불완전한), 수산화알루미늄 등의 미네랄 겔, 표면 활성 물질, 예를 들어, 리소레시틴, 다가 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 사람 보조제, 예를 들어, BCG(Bacillus Calmette-Guerin) 및 코리네박테륨 파르븀(Corynebacterium parvum)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 보조제를 사용하여 숙주 종에 따라서 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다. 폴리클로날 항체는 사람적응화 동물의 혈청으로부터 유도된 항체 분자의 이종 집단이다.
특정한 항원에 대한 항체의 동종 집단인 모노클로날 항체는 연속적인 세포주 배양에 의해 생성된 항체를 제공하는 어떠한 기술에 의해서도 수득할 수 있다. 이의 예로는 하이브리도마(hybridoma) 기술[참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497 및 미국 특허 제4,376,110호], 사람 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72 (1983); Cole, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030 (1983)], 및 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Caner Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)]이 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이의 모든 아부류를 포함한 어떠한 면역글로불린 부류일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생성하는 하이브리도마를 시험관내 또는 생체내에서 배양할 수 있다. 생체내에서 고 역가의 mAb를 생성함으로써, 이를 현재 바람직한 생성 방법으로 만든다.
또한, 적당한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적당한 생물학적 활성의 사람 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱(splicing)함으로써 ″키메릭 항체의 생성을 위해 개발된 기술[참조: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)]을 사용할 수 있다. 키메릭 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유도되는 분자, 예를 들어, 쥐의 mAb로부터 유도된 가변 영역 및 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것이다.
사람에게서 항-VEGI의 생체내 용도의 경우에는, ″사람적응화″ 키메릭 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체는 상기 언급된 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 유도된 유전적 작제물을 사용하여 생성시킬 수 있다. 키메릭 항체를 생성하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi, et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호; Taniguchi, et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger, et al., WO 8601533; Robinson, et al., WO 8702671; Boulianne, et al., Nature 312:643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985)].
또 다른 한편, 일본쇄 항체를 생성하는 것으로 기재된 기술[참조: 미국 특허 제4,946,778호; Bird, Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and Ward et al., Nature 334:544-546 (1989)]을 적용하여 VEGI 폴리펩티드에 대한 일본쇄 항체를 생성시킬 수 있다. 일본쇄 항체는 아미노산 브릿지를 통하여 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결함으로써 일본쇄 폴리펩티드를 생성시킴으로써 형성된다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 방법으로 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 이러한 단편에는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편, 및 이러한 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 방법으로는, Fab 발현 라이브러리를 작제하여[참조: Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)] 목적하는 특이성을 지닌 모노클로날 Fab 단편을 신속하고도 용이하게 동정할 수 있다.
VEGI 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여, 당해 분야의 숙련인에게 널리 공지된 기술을 사용하여 ObR을 ″모사하는″ 항-유전형 항체를 생성시킬 수 있다[참조: Greenspan ＆ Bona, FASEB J. 7(5):437-444 (1989); and Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438(1991)]. 예를 들면, VEGI 세포외 도메인과 결합되어 VEGI에 대한 리간드의 결합을 경쟁적으로 억제시키는 항체를 사용하여 VEGI 세포외 도메인을 ″모사″하므로, VEGI 리간드를 결합 및 중화시키는 항-유전형을 생성시킬 수 있다. 이러한 중화성 항-유전형 또는 이러한 항-유전형의 Fab 단편을, VEGI 리간드를 중화시키는 치료 섭생에 사용할 수 있다.
따라서, 앞서 기재된 바와 같이, 당해 분야의 숙련인은 표준 방법을 사용하여, 본 발명의 VEGI 단백질(또는 폴리펩티드)에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 항체 생성 방법 및 물질이 당해 분야에 익히 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Goding, in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Chapter 4, 1986]. 또한, 당해 폴리펩티드를 이의 항원성을 증가시키는 기타 단백질 또는 폴리펩티드와 융합시킴으로써, 보다 높은 역가의 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 단백질 또는 폴리펩티드의 예에는 수산화알루미늄 등의 어떠한 보조제 또는 담체도 포함된다. 이들 항체를 수동 항체 치료법에 사용할 수 있으며, 이러한 치료법에서는 VEGI와 특이적으로 결합되는 항체를 이용하여 재생, 발육, 상처 치유 및 조직 복구 등과 같은 맥관형성-의존적 진행 과정을 조절할 수 있다.
면역 및 순환계-관련 및 기타 의학적 장애
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 동물 또는 사람 환자에게 유효량의 VEGI를 투여함으로써, 상기 환자에게서 맥관형성-관련 질환 증상을 저하시키는 방법에 관한 것이다. 맥관형성이 종양의 생존에 필요하기 때문에, 맥관형성을 억제시키거나 역위시키는 것이 상기 종양을 감소 또는 제거할 수 있다. 환자에게 VEGI를 공급하는 경우, 투여된 제제의 투여량은 환자의 연령, 체중, 신장, 성별, 총체적인 의학적 상태, 병력 등과 같은 요인에 따라서 다양할 것이다. 일반적으로, 약 1pg/kg 내지 10mg/kg(환자 체중)의 범위내인 상기 화합물의 투여량을 수용자에게 공급하는 것이 바람직하지만, 이 보다 적은 양 또는 많은 양을 투여할 수 있다. 본 발명의 방법은 동시에 또는 연장된 시간에 걸쳐, 1회 투여 뿐만 아니라 다수 투여도 고려한다.
당해 VEGI 폴리펩티드는 서열 1에 기재된 본 발명의 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분, 또는 이의 대립유전자 형태를 함유하는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 등의 바이러스성 벡터 또는 플라스미드에 의해 제공될 수 있다. 사용된 벡터는 바람직하게는, VEGI 폴리뉴클레오티드를 특정 세포에게 공급함으로써 이러한 폴리뉴클레오티드가 전사 및 해독되고 VEGI 폴리펩티드가 생성될 수 있도록 한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 또한, DNA, 리포좀 내에 캡슐화된 DNA, 또는 바이러스성 외막 수용체 단백질을 함유하는 프로테오리포좀에 포획된 DNA로서 투여될 수 있다[참조: Kanoda, Y. et al. (1989) Science 243:375]. 또 다른 한편, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 담체와 함께 주사할 수 있다. 담체는 사이토킨, 예를 들면, 인터루킨 2 등의 단백질, 또는 폴리리신 당단백질 담체일 수 있다. 이러한 담체 단백질 및 벡터, 및 이의 사용 방법이 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Ascadi G. et al., Nature 1991, 352:815]. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 흐린 금색 비이드 상으로 피복시킬 수 있으며, 이러한 비이드를, 예를 들어, 유전자 건을 사용하여 피부 내로 도입한다[참조: Ulmer, J. B. et al., Science 1993, 259:1745].
또 다른 한편, 본 발명의 VEGI 폴리펩티드를 당해 분야의 숙련인에게 공지된 제형화 방법을 사용하여 약제학적으로 허용되는 제형에 공급할 수 있다. 이들 제형을 표준 경로로 투여할 수 있다. 일반적으로, 상기 조합물을 국부, 경피, 복강내, 경구, 직장 또는 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하 또는 근육내) 경로로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 VEGI 폴리펩티드를 약물 운반이 요망되거나 이식되는 곳과 인접하여 이식되는 생분해 가능한 중합체 내로 혼입하여 당해 VEGI 폴리펩티드가 전신으로 서서히 방출되도록 할 수 있다. 이러한 생분해 가능한 중합체 및 이의 용도가, 예를 들면, 문헌[참조: Brem et al., J. Neurosurg. 74:441-446 (1991)]에 상세히 기재되어 있다.
당해 VEGI 폴리펩티드 제형에는 경구, 직장, 안과(초자체내 또는 방내 포함), 비내, 국부(볼내 및 설하 포함), 질 또는 비경구(피하, 복강내, 및 경막외) 투여에 적합한 것이 포함된다. 이러한 VEGI 폴리펩티드 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있고 통상적인 약제학적 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술에는 활성 성분과 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)를 연합시키는 단계가 포함된다. 일반적으로, 상기 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세하게 나눠진 고체 담체, 또는 둘 다와 균일하고도 친밀하게 혼합한 다음, 필요한 경우 상기 생성물의 외형을 형성시킴으로써 제조한다.
비경구 투여용으로 적합한 제형에는 산화방지제, 완충제, 및 제형을 의도한 수용자의 혈액에 관하여 등장성이 되도록 하는 용질을 함유하는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용제; 및 현탁화제 및 점증제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁제가 포함된다. 이러한 제형은 단위 용량 또는 다수 용량 용기, 예를 들면, 밀봉 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있으며, 멸균성 액체 담체, 예를 들면, 즉시 사용되느 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조 조건에서 저장할 수 있다. 앞서 기재된 종류의 멸균성 분말, 과립 및 정제로부터, 즉흥적인 주사 용제 및 현탁제를 제조할 수 있다.
바람직한 단위 투여량 제형은 앞서 인용된 바와 같이, 투여된 성분의 1일 용량 또는 단위, 1일 아-용량, 또는 이의 적당한 분획을 함유하는 것이다. 상기 성분, 특히 상기 언급된 성분 이외에, 본 발명의 제형은 문제의 제형 유형과 관련하여 당해 분야에 통상적인 기타 제제를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 특정 환자에게, 병리학적 맥관형성의 증상이 저하되도록 유효량의 VEGI 폴리뉴클레오티드, VEGI 폴리펩티드 또는 이의 동족체, 또는 내인성 또는 외인성 VEGI 폴리뉴클레오티드 또는 내인성 또는 외인성 VEGI 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있는 제제를 투여함으로써, 상기 환자에게서 조절되지 못한 병리학적 맥관형성의 증상을 저하시키는 방법에 관한 것이다. 고려된 질환으로는 맥관종, 모세관확장증 건선 공피증, 화농성 육아종, 심근 맥관형성, 플라그 신생혈관화, 관상 측부, 허혈성 지 맥관형성, 각막성 질환, 피부조홍, 신생맥관 녹내장, 당뇨병성 망막증, 수정체 뒤의 섬유증식증, 관절염 및 당뇨병성 신생혈관화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 질환들은 어떠한 종유의 암이나 종양을 포함하지 않는다.
특정 양태에 있어서, 본 발명의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를, 혈소판 인자-4, 트롬보스폰딘-1, 메탈로프로테아제(TIMP1 및 TIMP2), 프롤락틴(16kDa 단편), 안지오스타틴(플라스미노겐의 38kDa 단편), bFGF 가용성 수용체, 형질전환성 성장 인자 β, 인터페론 알파, 및 태반 증식-관련 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 맥관형성을 음성적으로 조절하는 또 다른 분자의 치료학적 유효량과 합한다.
본 발명의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드로 치료될 수 있는, 신생혈관화와 연관된 안과 질환으로는 신생혈관화 녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막아종, 수정체 뒤의 섬유증식증, 포도막염, 조숙 망막증, 퇴화성 반점, 각막 이식 신생혈관화 뿐만 아니라 기타 눈 염증 질환 및 융모막 또는 홍채 신생혈관화와 연관된 질환이 있지만, 이에 제한되지는 않는다[참조: Waltman, et al., 1978 Am. J. Ophthal. 85:704-710 and Gartner et al., 1978, Surv. Ophthal. 22:291-312].
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 VEGI 폴리뉴클레오티드의 전사를 감소시키거나; 예를 들어, VEGI-특이적 리보자임 또는 VEGI RNA에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 RNA의 양을 감소시키거나; 상기 논의된 바와 같이 VEGI 폴리펩티드를 보유하고/하거나 이를 활성화시킬 수 있는 프로테아제의 억제에 의해 VEGI 폴리펩티드의 생성을 억제시키거나[참조: Kayagaki, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1777-1783; Black et al. (1997) Nature 385:729-733]; VEGI 폴리펩티드의 활성화를 허용하거나 촉진시키는 금속 이온 및/또는 제제를 차단 또는 제거시키거나; VEGI 수용체를 차단함으로써 VEGI 폴리펩티드 기능을 직접적으로 억제시키거나; VEGI 폴리펩티드를 인식하여 이에 결합되는 항체를 사용하거나; 또는 VEGI 폴리펩티드의 기능을 억제시키는 길항제를 사용함으로써 VEGI 폴리펩티드 기능을 저하시킬 수 있는 제제의 유효량을 환자에게 투여함으로써 상기 환자에게서 맥관형성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 리보자임 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 공학적으로 처리하고 운반하는 것은 당해 분야에 공지되어 있고[참조: Usman N., et al. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:527-533 and Ho and Parkinson, (1997) Semin. Oncol. 24:187-202], 예를 들면, 지질과 혼합하거나 바이러스성 또는 플라스미드 벡터를 사용함으로써 포유류 세포 내로 운반할 수 있다. 고려된 질환 및 상태로는 퇴화성 반점, 상처 치유, 소화성 궤양, 골절, 해족증, 맥관형성, 조혈, 배란, 월경 및 태반 형성이 있지만 이에 제한되지는 않는다.
부가의 양태
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 맥관형성 연관된 질환을 진단 또는 예후하기 위하여 특정 샘플 중에서의 VEGI 폴리펩티드의 존재 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다. 당해 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여, 특정 표면(즉, 고체 지지체), 예를 들면, 미세역가판 또는 막(예를 들면, 니트로셀룰로즈 막) 위에 VEGI 폴리펩티드에 특이적인 항체를 도포하고, 이와 같이 도포된 표면을 맥관형성 연관된 질환이 있는 것으로 추정되는 사람으로부터 수득된 혈청, 조직 또는 기타 생물학적 또는 화학적 샘플과 접촉시킴으로써, 진단용 검정을 수행할 수 있다. 샘플 중의 VEGI 폴리펩티드와 이에 특이적인 항체 간에 형성된 복합체의 존재 여부는 당해 분야에 통상적인 공지된 어떠한 방법, 예를 들면, 형광성 항체 분광측정법 또는 비색법으로 검출할 수 있다. 이러한 검출 방법을, 예를 들면, 암 진단 또는 예후에 사용할 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 VEGI 폴리펩티드에 특이적인 항체, 및 당해 분야에 널리 공지되어 있고 혈청, 조직 또는 기타 샘플에서의 VEGI 폴리펩티드의 존재 여부를 검출하는데 사용하기 적합한 보조 시약을 함유하는 진단용 키트에 관한 것이다. 고려된 조직 샘플은 원숭이, 사람 또는 기타 포유류로부터 수득될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 또는 역 전사 PCR(RT-PCR)을 사용하여 VEGI 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용하기 위한 RNA, DNA 또는 기타 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 서열 1, 서열 8 또는 서열 26에 제시된 본 발명의 DNA 서열을 사용하여, VEGI 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 검출하거나 표준물과의 비교에 의해 VEGI 폴리뉴클레오티드의 양을 정량화할 목적으로, PCR의 경우에 VEGI 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 RNA의 역전사로부터 생성된 VEGI cDNA와 특이적으로 결합되는 프라이머를 고안할 수 있다. 이러한 프라이머는 7 내지 40, 바람직하게는 10 내지 15, 가장 바람직하게는 18 내지 25 뉴클레오티드 범위의 어떠한 길이일 수 있다. PCR 또는 RT-PCR 반응에 필수적인 시약 및 컨트롤은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이어서, 이와 같이 증폭된 생성물을 대상으로 하여, 예를 들면, 하이브리드화하거나 하지 않으면서 겔 분별, 방사성화학 및 면역화학 기술에 의해 VEGI 폴리뉴클레오티드 서열의 존재 또는 부재에 대해 분석할 수 있다. 이러한 방법은 PCR 또는 RT-PCR을 수행하는데 충분한 양의 주형 DNA를 생성시키는데 단지 작은 샘플 크기만이 요구되기 때문에 유리하다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 VEGI 폴리뉴클레오티드에 특이적인 PCR 또는 RT-PCR 프라이머, 및 당해 분야에 널리 공지되어 있고 VEGI 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 검출하거나 PCR 또는 RT-PCR을 사용하여 특정 샘플 중에서 VEGI 폴리펩티드를 암호화하는 RNA의 양을 정량화하는데 사용하기 적합한 보조 시약을 함유하는 진단용 키트에 관한 것이다. 고려된 샘플은 사람 또는 기타 포유류로부터 수득될 수 있다.
VEGI를 사람 제대 정맥 내피 세포, 유도된 내피 세포, 매크로파아지, 및 흑질에서 발현시킨다. 수 많은 면역 및 순환계-관련된 장애의 경우, 실질적으로 변화된(증가되거나 감소된) VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 유전자 발현 수준은, ″표준″ VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 유전자 발현 수준, 즉 면역 및 순환계 장애가 없는 개개인으로부터의 면역 및 순환계 조직 또는 체액에서의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 발현 수준에 비해 상기 장애가 있는 개개인으로부터 취한 면역 및 순환계 조직 또는 기타 세포 또는 체액(예를 들면, 혈청, 플라즈마, 뇨, 활액 또는 수액)에서 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 특정 개개인으로부터의 면역 및 순환계 조직 또는 기타 세포 또는 체액에서의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정한 다음, 이와 같이 측정된 유전자 발현 수준을 표준 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 유전자 발현 수준과 비교함으로써, 표준치와 비교된 유전자 발현 수준의 증가 또는 감소 정도가 면역 및 순환계 장애을 지시해 주는, 면역 및 순환계 장애의 진단시 유용한 진단 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 특정 개개인으로부터의 면역 및 순환계 조직 또는 기타 세포 또는 체액에서의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정한 다음, 이와 같이 측정된 유전자 발현 수준을 표준 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 유전자 발현 수준과 비교함으로써, 표준치와 비교된 유전자 발현 수준의 증가 또는 감소 정도가 면역 및 순환계 장애을 지시해 주는, 면역 및 순환계 장애의 진단시 유용한 진단 방법을 제공한다.
면역 및 순환계 장애의 진단이 통상적인 방법에 따라서 이미 수행된 경우, 본 발명은 예후 지시제로서 유용하기 때문에 억제된 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 유전자 발현을 나타내는 환자는 표준 수준 근처 수준에서 유전자를 발현하는 환자에 비해 보다 나쁜 임상적 현상을 겪게 될 것이다.
″VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 검정″한다는 것은, 첫 번째 생물학적 샘플 중에서의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드의 수준 또는 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA의 수준을 직접적으로(예를 들면, 절대적인 폴리펩티드 수준 또는 mRNA 수준을 결정 또는 평가함) 또는 상대적으로(예를 들면, 두 번째 생물학적 샘플 중에서의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 수준 또는 mRNA 수준을 비교함) 정성적 또는 정량적으로 측정 또는 평가하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 첫 번째 생물학적 샘플 중에서 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 수준 또는 mRNA 수준을 측정 또는 평가하고 이를 표준 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 수준 또는 mRNA 수준과 비교하는데, 이러한 표준치는 상기 장애가 없는 개개인으로부터 수득된 두 번째 생물학적 샘플로부터 취한 것이거나 면역 및 순환계 장애가 없는 개개인의 집단으로부터의 수준을 평균냄으로써 결정된 것이다. 당해 분야에 인지되는 바와 같이, 표준 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 수준 또는 mRNA 수준이 일단 공지되면, 이를 비교용 표준치로서 반복적으로 사용할 수 있다.
″생물학적 샘플″이란 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 또는 mRNA를 함유하는, 개개인, 체액, 세포주, 조직 배양물 또는 기타 공급원으로부터 수득된 모든 생물학적 샘플을 의미한다. 지시되는 바와 같이, 생물학적 샘플에는 자유 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 함유하는 체액(예를 들면, 혈청, 혈장, 뇨, 활액 및 수액), 면역 및 순환계 조직, 및 완전하거나 성숙한 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 또는 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 수용체를 발현하는 것으로 밝혀진 기타 조직 공급원이 포함된다. 포유류로부터 생검 및 체액을 수득하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 생물학적 샘플이 mRNA를 포함하는 경우에는, 조직 생검이 바람직한 공급원이다.
전체 세포내 RNA는 문헌[참조: Chomczynski and Sacchi (Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)]에 기재된 1-단계 구아니디늄-티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법과 같은 적합한 기술을 사용하여 생물학적 샘플로부터 분리할 수 있다. 이어서, 적당한 방법을 사용하여 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA의 수준을 검정한다. 이들로는 노던 블롯 분석, S1 뉴클레아제 지도화, 폴리머라제 쇄 반응(PCR), 폴리머라제 쇄 반응과 조합된 역 전사(RT-PCR) 및 리가제 쇄 반응과 조합된 역 전사(RT-LCR)이 있다.
생물학적 샘플 중에서 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 수준을 검정하는 것은 항체를 이용한 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직에서의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 발현은 전통적인 면역조직학적 방법을 사용하여 연구할 수 있다[참조: Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)]. VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 유전자 발현을 검출하는데 유용한 기타 항체-이용 방법으로는 면역검정, 예를 들면, 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사성면역검정(RIA)이 있다. 적합한 항체 검정 표지는 당해 분야에 공지되어 있고 이에는 효소 표지, 예를 들면, 글루코즈 옥시다제, 및 방사성 동위원소, 예를 들면, 요오드(125I,121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(112In) 및 테크네튬(99mTc), 및 형광성 표지, 예를 들면, 플루오레세인 및 로다민, 및 바이오틴이 있다.
개개인으로부터 수득된 생물학적 샘플에서 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드 수준을 검정하는 것 이외에, VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 또한, 영상화함으로써 생체내에서 검출할 수 있다. VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드의 생체내 영상화를 위한 항체 표지 또는 마커에는 X-방사선 사진법, NMR 또는 ESR에 의해 검출 가능한 것이 포함된다. X-방사선 사진법의 경우, 적합한 표지로는 검출 가능한 방사선을 방출하지만 피검자에게 공공연히 해롭지는 않은, 바륨 또는 세슘 등의 방사성 동위원소가 있다. 적합한 NMR 및 ESR용 마커로는 관련된 하이브리도마에 대한 영양분을 표지시킴으로써 항체 내로 혼입시킬 수 있는, 중수소 등의 검출 가능한 특징적 스핀을 갖는 것이 있다.
방사성 동위원소(예를 들면,131I,112In,99mTc), 방사선-불투과 물질 또는 핵자기 공명에 의해 검출 가능한 물질 등의 적당한 검출 가능한 영상화 잔기로 표지시킨 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드-특이적 항체 또는 항체 단편을 면역계 장애에 대해 검사될 포유동물 내로 도입한다(예를 들면, 비경구, 피하 또는 복강내). 피검자의 크기와 사용된 영상화 시스템이 진단 영상을 생성시키는데 필요한 영상화 잔기의 양을 결정할 것이라는 것은 당해 분야에 인지될 것이다. 방사성 동위원소 잔기의 경우, 사람 피검자에 대해서는, 주입된 방사능의 양이 통상적으로99mTc 약 5 내지 200밀리큐리의 범위일 것이다. 이때, 이와 같이 표지된 항체 또는 항체 단편은 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 함유하는 세포 위치에 우선적으로 축적될 것이다. 생체내 종양 영상화가 문헌[참조: Burchiel and coworkers, Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S. W. and Rhodes, B.A., eds., Masson Publishing Inc. (1982)]에 기재되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 비정상적으로 높거나 낮은 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 발현 활성과 연관되는 상태를 진단하는데 유용하다. VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타를 발현시킬 뿐만 아니라 상기 활성이 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타에 의해 조절되는 세포 및 조직이 제공되면, 표준 또는 ″정상적인″ 수준과 비교해서 특정 개개인에게서 실질적으로 변화된(증가 또는 감소됨) VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타의 발현 수준으로 인해, VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타가 발현되고/되거나 활성인 전신 시스템과 관련된 병리학적 상태가 야기된다는 것을 용이하게 인지할 수 있다.
본 발명은 또한, 포유류, 바람직하게는 사람에게서 각종 면역 및 순환계 관련된 장애를 진단 또는 치료하는데 유용하다. 이러한 장애로는 세균, 바이러스 및 기타 기생충에 의한 감염, 면역결핍증, 염증 질환, 임파선증, 자가면역 질환, 그라프 대 숙주 질환, 및 자가면역, 백혈병, 임파종, 면역억제, 면역, 체액성 면역, 염증성 보웰(bowel) 질환, 골수 억제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 면역 및 순환계 세포 기능의 조절 실패가 있다.
VEGI 폴리펩티드는 세포내 NF-κB 및 c-jun N-말단 키나제(JNK)의 활성화를 유도할 수 있기 때문에, 이는 세균, 바이러스 및 기타 기생충에 의한 감염, 면역결핍증, 염증 질환, 임파선증, 자가면역 질환, 그라프 대 숙주 질환, 자가면역, 면역억제, 면역, 염증성 보웰 질환, 골수 억제 및 관련 휴유증과 같은 세포내 및 면역계 장애를 치료학적으로 조절하는데 유용하다.
VEGI-알파 및 VEGI-베타는 TNF 슈퍼계열에 속하기 때문에, 이들은 또한 맥관형성을 조절한다. 또한, VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드는 면역 세포 기능을 억제하기 때문에, 광범위한 소염 활성을 지닐 것이다. VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 항-신생혈관화제로서 이용하여 숙주 방어 세포, 예를 들면, 세포독성 T-세포 및 대식세포의 침입과 활성화를 자극할 수 있다. 당해 분야의 숙련인은 맥관 증식이 요망되지 않는 많은 비-암 징후를 인식할 것이다. VEGI-알파 및 VEGI-베타 폴리펩티드를 사용하여, 내성있는 만성 및 급성 감염, 예를 들면, 미생물성 백혈구의 유인 및 활성화를 통한 미오박테리아성 감염에 대한 숙주 방어를 증진시킬 수 있다. VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 또한 이용하여, T-세포 매개된 자가 면역 질환 치료를 위해 IL-2 생합성의 억제에 의해 T-세포 증식을 억제시킬 수 있다. VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 또한 이용하여, 데브리스 클리닝의 보충과 염증 조직을 촉진하는 연결 조직 모두를 통하여, 상처 치유를 자극할 수 있다. 동일한 방식으로, VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 또한 이용하여, 간 경변, 골관절염 및 폐동맥 섬유증을 포함한 기타 섬유성 장애를 치료할 수 있다. VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드는 또한, 주혈흡충증, 선모충증 및 회충병에서와 같이, 조직을 침입하는 기생충의 유충을 사멸시키는 현저한 기능을 지니고 있는 호산구의 존재를 증대시킨다. VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 또한 이용하여, 예를 들면, 화학요법 이후에, 즉 간 세포 고정화에서 골수로부터의 성숙한 백혈구를 방출시키기 위해 각종 조혈 프로게니터(progenitor) 세포의 활성화 및 분화를 조절함으로써 조혈을 조절할 수 있다. VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 또한 이용하여, 패혈증을 치료할 수 있다.
당해 분야의 숙련인은 본 발명의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드가 TNF 계열의 구성원이기 때문에, 이러한 단백질의 성숙한 분비 형태가 단백질 분해성 절단에 의해 VEGI를 발현시키는 세포로부터 가용성 형태로 방출될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타의 성숙한 형태 또는 가용성 세포외 도메인이 외인성 공급원으로부터 개개인의 세포, 조직 또는 체내로 가해지는 경우, 당해 폴리펩티드는 상기 개개인의 표적 세포에 대해 생리학적 활성을 나타낼 것이다. 또한, 이러한 유형 II 트랜스멤브레인 폴리펩티드를 발현하는 세포를 특정 개개인의 세포, 조직 또는 체내에 가할 수 있으며, 이와 같이 가해진 세포는 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타에 대한 수용체를 발현하는 세포와 결합됨으로써, VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 발현하는 세포가 상기 수용체-보유 표적 세포 상에서 작용(예를 들면, 내피 세포 성장 및 조절)을 나타낼 수 있다.
따라서, 개개인에게서 표준 또는 정상 수준의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 활성을 감소시킴으로써 유발된 질환, 특히 면역 및 순환계 장애가 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드(성숙한 또는 세포외 도메인 폴리펩티드의 형태임)를 투여함으로써 치료될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 활성 수준을 증가시킬 필요가 있는 개개인에게서 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 활성 수준을 증가시키기에 유효한 양의 본 발명의 분리된 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드, 특히 성숙한 형태의 본 발명의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 상기 개개인에게 투여하는 것을 포함하여, VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 활성 수준을 증가시킬 필요가 있는 개개인을 치료하는 방법을 제공한다.
VEGI의 세포 유착 활성을 상처 치유에 이용할 수 있다. VEGI는 VEGE가 상처 치유에 중요한 역할을 한다는 징후인 강력한 내피 세포 증식 효과를 지닌다. 이러한 VEGI의 세포 유착 효과가 또한 상처 치유에 중요한 역할을 한다.
VEGI 폴리펩티드를 또한 이용하여 성장 증진 활성, 예를 들면, 레스테노시스(restenosis)을 요구하는 질환을 치료할 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, VEGI는 내피 세포 성장에 대하여 강력한 증식 효과를 지니고 있는 것으로 나타났다. 따라서, VEGI를 또한 이용하여 조혈과 내피 세포 성장을 조절할 수 있다.
VEGI 폴리펩티드는 T-세포의 활성화를 자극하는 이의 능력을 통하여, 면역 반응에 중요한 매개제이다. 따라서, 이러한 폴리펩티드를 사용하여 각종 기생충, 세균 및 바이러스성 감염에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. VEGI 폴리펩티드는 바이러스-감염된 세포를 용융시키므로, 이를 이용하여 HIV 감염된 세포를 잡을 수 있다.
VEGI 폴리펩티드를 또한 이용하여, T-세포 증식 반응을 증진시킴으로써 유형 I 당뇨병과 같은 자가면역 질환을 치료할 수 있다.
VEGI 활성에 관한 요약
세포주 공급원 및 유형 세포 독성 증식
분화 부착
L929 마우스섬유아세포마우스 + - - -
WEHI 164 섬유육종랫트 신장 +++ - - -
NRK-54E 상피형 + - - -
THP-1 사람단세포백혈병 + - ++ ++
HL-60 사람프로골수구백혈병 - - - ++
라지 사람버킷임파종 - - - -
저켓 사람T-세포임파종 ++ - - -
1차 HUVEC사람 동맥 - ++ - ?
1차 내피 +* ++ - ?
A-431 사람유표피 암 ++ - - -
293 사람배아신장 - ++ - -
주: *고용량에서만 적용됨. ″+″의 수는 활성의 비교 수준을 지시한다.″-″은 시험된 농도 범위에서 활성이 전혀 검출되지 않았다는 것을 지시해준다.
VEGI를 사용하여 내피 세포, 예를 들면, 대동맥 내피 세포의 증식을 억제시킬 수 있다. 10㎍/ml 이하의 농도에서, VEGI는 사람 유방암 세포의 성장에 대한 어떠한 가시적인 효과도 나타내지 않으면서 내피 세포의 성장을 거의 완벽하게 억제시킬 수 있다. 그 결과, VEGI를 사용하여 내피 세포 성장 억제가 유리한 질환 및 장애를 치료할 수 있다.
본 발명의 VEGI 폴리펩티드를 사용하여 시험관내에서 내피 세포에 의해 형성된 모세혈관-유사 관상 구조물의 형성을 저하시켰다. 본 발명의 VEGI 폴리펩티드를 사용하여 FGF-2과 같은 맥관형성 인자에 반응하여 모세혈관-유사 관상 구조물 내로 기관화된 내피 세포의 형성을 억제시킬 수 있다. 더우기, 본 발명의 분리된 VEGI를 사용하여 변형된 치킨 배아 융모요막(CAM)에서 모세혈관 내로의 내피 세포의 기관화 및 성장을 억제시킬 수 있다. 그 결과, 본 발명의 VEGI를 사용하여 시험관내에서 내피 세포로부터 모세혈관 또는 모세혈관-유사 구조물의 형성을 억제할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 사람 질환을 치료 및 진단하기 위한 연구 시약 및 물질로서 이용할 수 있다
본 발명은 VEGI에 대한 수용체의 동정 방법을 제공한다. 이러한 수용체를 암호화하는 유전자를 당해 기술 분야의 숙련인에게 공지된 다수의 방법, 예를 들어 리간드 패닝(panning) 및 FACS 분류에 의해 동정할 수 있다[참조: Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991)]. 바람직하게는, 폴리아데닐화 RNA를 VEGI에 대해 반응성인 세포로부터 제조한 발현 클로닝을 이용하고, 이러한 RNA로부터 창출된 cDNA 라이브러리를 풀(pool)로 분할하고 이를 사용하여 VEGI에 대해 반응성이 없는 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염시킨다. 유리 슬라이드 상에서 성장시킨 형질감염된 세포를 표지된 VEGI에 노출시킨다. VEGI를 부위 특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 요오드화 또는 혼입을 포함하는 각종 방법으로 표지시킬 수 있다. 고정 및 배양한 다음, 슬라이드를 대상으로 자동방사성사진술을 이용하여 분석한다. 양성 풀을 동정하고 서브-풀을 제조하고 반복되는 서브-풀링 및 재스크리닝 방법을 사용하여 재형질감염시켜, 최종적으로 추정상의 수용체를 암호화하는 단일 클론을 수득한다.
수용체 동정에 대한 또 다른 접근법으로서, 표지된 VEGI를 세포막 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 제제와 광친화적으로 연결시킬 수 있다. 가교결합된 물질을 PAGE에 의해 분할하고 X-레이 필름에 노출시킨다. VEGI-수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절단하고, 펩티드 단편으로 분할하고, 단백질 미소서열분석시킨다. 미소서열분석로부터 수득된 아미노산 서열을 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 디자인하는데 사용하여 추정상의 수용체를 암호화하는 유전자를 동정할 수 있다.
VEGI 폴리펩티드 조성물을 제형화하고 개개 환자의 임상 조건(특히, VEGI 폴리펩티드 단독으로 치료한 경우의 부작용), VEGI 폴리펩티드 조성물의 운반 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 전문의에게 공지된 기타 요인들을 고려하여, 우수한 의학적 실시가 지속되는 방식으로 투여한다. 따라서, 본원의 목적을 위한 VEGI 폴리펩티드의 ″유효량″은 이러한 고려 사항에 의해 결정된다.
길항제를 본원에 후술되는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물에 이용될 수 있다.
본 발명의 VEGI 폴리펩티드, 및 효능제 및 길항제를 적합한 약제학적 담체와 조합하여 이용할 수 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 당해 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 배합물이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 당해 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분들로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기에는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규정하는 정부 기관에 의해 작성된 형태의 통지서가 부착되어 있으며, 이러한 통지서는 정부 기관에 의해 사람 투여용으로 제조, 사용 또는 판매 승인된 것을 반영하고 있다. 또한, 본 발명의 약제는 다른 치료학적 화합물과 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물을, 예를 들면, 국부, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비내 또는 피내 경로에 의해 편리한 방식으로 투여할 수 있다. 당해 약제학적 조성물은 특이적 징후를 치료 및/또는 예방하는데 유효한 양으로 투여한다. 일반적으로, 이들은 약 10g/체중 kg 이상의 양으로 투여하며, 대부분의 경우에는, 이들이 1일 약 8mg/체중 kg을 초과하지 않는 양으로 투여될 것이다. 대부분의 경우, 투여량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여, 약 10g/체중 kg 내지 약 1mg/체중 kg이다.
각종 운반 시스템, 예를 들면, 리포좀 내의 캡슐화, 미립자, 미소캡슐, 수용체-매개된 세포이물 흡수 작용이 공지되어 있고 이를 사용하여 본 발명의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 투여할 수 있다[참조: Wu and Wu 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432]. 도입 방법으로는 국부, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 안과 및 경구 경로가 있지만 이에 제한되지는 않는다. 당해 화합물을 편리한 어떠한 경로, 예를 들면, 주입 또는 거환 주사, 상피 또는 점막피부 라이닝(예를 들면, 경구 점막, 직장 및 위장 점막 등)에 의해 투여될 수 있으며 기타 생물학적 활성제와 함께 투여할 수 있다.
특정 양태에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들면, 외상 드레싱과 연계하여 수술시 국소적으로 주입하거나, 주사하거나, 카테터를 통하거나, 좌제를 이용하거나, 또는 이식재, 예를 들면, 섬유의 시알라스틱(sialastic) 막 등의 막을 포함한 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질에 의해 달성될 수 있다.
본원에 논의된 적어도 몇몇 안과 질환을 치료하기 위해 본 발명의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드를 국부 투여용 조성물은 완충 식염수, 광유, 식물성 오일(예를 들면, 옥수수 또는 아라키스 오일), 석유 젤리, 미글리올 182, 알콜 용액, 또는 리포좀 또는 리포좀-유사 생성물 등의 안과적으로 허용되는 부형제 중의 본 발명의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드의 유효량으로 이루어진다. 이들 조성물은 또한, 방부제, 산화방지제, 항생제, 면역억제제, 및 본 발명의 VEGI-알파 및/또는 VEGI-베타 폴리펩티드에 대해 유해한 효과를 나타내지 않는 기타 생물학적 또는 약제학적으로 유효한 제제를 포함할 수 있다.
VEGI 폴리펩티드, 및 폴리펩티드인 효능제 및 길항제는 본 발명에 따라서, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현시킴으로써 사용할 수도 있는데, 이를 종종 ″유전자 치료(gene therapy)″라고 부른다.
따라서, 예를 들어 환자의 세포를 생체 외에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)로 유전공학적으로 조작한 다음, 이와 같이 유전공학적으로 조작된 세포를 상기 폴리펩티드로 치료하고자 하는 환자에게 제공할 수 있다. 상기 방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있고 본원의 교시로부터 명백하다. 예를 들어, 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 입자를 사용함으로써 당해 분야에 공지된 방법으로 조작할 수 있다.
유사하게, 예를 들어 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 폴리펩티드를 생체 내에서 발현시키기 위해 생체 내에서 조작할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 입자를 제조하기 위한 생산자 세포를 생체 내에서 세포를 조작하고 생체 내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 상기 과정에 의해 투여하는 방법 및 기타 방법은 본 발명의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백하여야 한다. 예를 들어, 세포를 조작하기 위한 발현 비히클(vehicle)은 레트로바이러스 이외의 것일 수 있는데, 예를 들어 아데노바이러스를 적합한 운반 비히클과 결합시킨 후에 생체 내에서 세포를 조작하는데 사용할 수 있다.
상기 언급된 레트로바이러스성 플라스미드 벡터가 유도될 수 있는 레트로바이러스로는 몽키 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예를 들면, 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 기본 아페(gibbon ape) 백혈병 바이러스, 사람 면역결핍증 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스가 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에 있어서, 이러한 레트로바이러스성 플라스미드 벡터가 몽키 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유도된 것이다.
상기 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 이용될 수 있는 적합한 벡터로는 레트로바이러스성 LRT; SV40 프로모터; 및 문헌[참조: Miller and colleagues, Biotechniques 7:980:990 (1989)]에 기재된 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 또는 기타 프로모터(예를 들면, 히스톤, pol III 및 b-악틴 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 진핵성 세포내 프로모터 등의 세포내 프로모터)가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이용될 수 있는 기타 바이러스성 프로모터로는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터, 및 B19 파르보바이러스 프로모터가 있지만 이에 제한되지는 않는다. 적합한 프로모터의 선별은 본원에 함유된 교시로부터 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터의 조절하에 있다. 이용될 수 있는 적합한 프로모터로는 아데노바이러스성 메어져 레이트 프로모터 등의 아데노바이러스성 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 등의 이종 프로모터; 호흡기 합포체성 바이러스(RSV) 프로모터; 메탈로티오네인 프로모터인 MMT 프로모터 등의 유도성 프로모터; 열 쇽 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 사람 글로빈 프로모터; 단순 포진 티미딘 키나제 프로모터 등의 바이러스성 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스성 LTR(전술된 변형된 레트로바이러스성 LTR을 포함함); b-악틴 프로모터; 및 사람 성장 호르몬 프로모터가 있지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 프로모터는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 조절하는 본래의 프로모터일 수 있다.
레트로바이러스성 플라스미드 벡터를 이용하여 패키징 세포주를 형질도입하여 생산자 세포주를 형성한다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예로는 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입된 문헌[참조: Miller, Human Gene Therapy 1:5-14 (1990)]에 기재된 바와 같이 PE501, PA317, b-2, b-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, CRE, β-CRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DNA 세포주가 있지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 벡터는 당해 분야에 공지된 모든 수단을 통하여 패키징 세포를 형질도입한다. 이러한 수단으로는 전기영동, 리포좀의 사용, 및 CaPO4침전이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나의 대체 양태에서는, 레트로바이러스성 플라스미드 벡터를 리포좀 내로 캡슐화시키거나, 지질과 커플링시킨 다음, 숙주에게 투여할 수 있다.
생산자 세포주는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스성 벡터 입자를 생성시킨다. 이어서, 이러한 레트로바이러스성 벡터 입자를 이용하여, 진핵 세포를 시험관내 또는 생체내에서 형질도입시킨다. 이와 같이 형질도입된 진핵 세포는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 발현할 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포로는 배아 간 세포, 배아 암종 세포, 및 조혈 간 세포, 간 세포, 섬유아세포, 근원세포, 각질 세포, 내피 세포 및 기관지성 상피 세포가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한, VEGI를 모사하거나(효능제) VIGF의 작용을 방지(길항제)하는 것들을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 예들은 보조 유사분열물질(comitogen) Con A의 존재하에 사람 내피 세포의 증식을 상당히 자극하는 VEGI 폴리펩티드의 능력을 이용한다. 내피 세포를 수득하고 이를 96-웰 평저 배양 플레이트(제조원: Costar, Cambridge, MA)에서, 2g/ml의 Con-A(Calbiochem, La Jolla, CA)의 존재하에서 10% 열-불활성화 태내 송아지 혈청(Hyclone Labs, Logan, UT), 1% L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100g/ml 스트렙토마이신, 0.1% 젠타마이신(Gibco Life Technologies, Grand Island, NY)이 보충된 RPM1 1640에서 배양한다. Con-A 및 스크리닝될 화합물을 가하여 최종 용적이 0.2ml가 되도록 한다. 37℃에서 60시간 후에, 배양물을 1Ci의 [3H]티미딘(5Ci/mmol; 1Ci=37BGq; NEN)으로 12 내지 18시간 동안 펄스하고 유리 섬유 필터(제조원: PhD; Cambridge Technology, Watertown, MA) 상에서 수거한다. 3중 배양물의 평균 [3H]티미딘 혼입(cpm)을 액체 신틸레이션 계수기(제조원: Beckman Instruments, Irvine, CA)를 사용하여 측정한다. 상당한 [3H]티미딘 혼입은 내피 세포 증식의 자극을 나타낸다.
또 다르게는, VEGI 폴리펩티드 및 수용체를 상호작용시킨 후에 공지된 제2의 메신저 시스템의 반응을 측정하고 이를 당해 화합물의 존재 또는 부재하에서 비교한다. 이러한 제2의 메신저 시스템으로는 cAMP 구아닐레이트 사이클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시티드 가수분해가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
길항제에 대해 검정하기 위해서, 상기 언급된 검정을 수행하지만, 이러한 검정에서는 VEGI를 스크리닝할 화합물과 함께 가하고 VEGI 폴리펩티드의 존재하에서 [3H]티미딘 혼입을 억제시키는 상기 화합물의 능력은 상기 화합물이 VEGI에 대한 길항제라는 것을 지시해준다. 또 다르게는, VEGI 길항제는 VEGI 및 효능있는 길항제를 경쟁적 억제 검정에 적당한 조건하에서 막 결합된 VEGI 수용체 또는 재조합 수용체와 결합시킴으로써 검출할 수 있다. VEGI를 방사선 등으로 표지시킬 수 있는데, 이로써 수용체에 결합될 VEGI 분자의 수가 상기 효능있는 길항제의 효능을 결정할 수 있다.
또 다르게는, VEGI 수용체를 발현하는 포유류 세포 또는 막 제제를 상기 화합물의 존재하에서 표지된 VEGI와 함께 배앙한다. 이어서, 이러한 상호작용을 증진시키거나 차단시키는 상기 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
상기 양태의 또 다른 국면에서는, 본 발명은 VEGI 폴리펩티드와 특이적으로 결합되는 수용체 단백질 또는 기타 리간드-결합성 단백질(예를 들면, DR3)을 동정하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 막 또는 이의 제제와 같은 세포내 구획물을, VEGI 폴리펩티드와 결합되는 분자를 발현하는 세포로부터 제조할 수 있다. 상기 제제를 표지된 VEGI 폴리펩티드와 함께 배양하고 수용체 또는 기타 결합성 단백질에 결합된 VEGI 폴리펩티드의 복합체를 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라서 분리 및 성상확인한다. 또 다른 방법으로는, VEGI 폴리펩티드를 고체 지지체에 결합시켜 세포로부터 가용화된 결합성 분자가 칼럼에 결합된 다음 용출되고 통상적인 방법에 따라서 성상 확인될 수 있다.
효능제 또는 길항제에 대한 본 발명의 검정에 있어서, 막 또는 이의 제제와 같은 세포내 구획물은 VEGI와 결합되는 분자, 예를 들면, VEGI에 의해 조절된 시그날링 또는 조절 경로의 분자를 발현하는 세포로부터 제조할 수 있다. 이 제제를 VEGI 효능제 또는 길항제일 수 있는 후보 분자의 부재 또는 존재하에서 표지된 VEGI 폴리펩티드와 함께 배양한다. 상기 결합성 분자와 결합되는 후보 분자의 능력은 상기 표지된 리간드의 결합 감소를 가져다 준다. 호의적으로 결합되는, 즉 VEGI 결합성 분자를 결합시키는 것에 대한 VEGI의 효과를 유도하지 않는 분자가 아마도 가장 우수한 길항제인 것으로 여겨진다. VEGI와 동일하거나 이와 밀접하게 관련된 것과 잘 결합되거나 이의 효과를 유발시키는 분자가 효능제이다.
효능있는 효능제 및 길항제의 VEGI-유사 효과는, 예를 들어, 후보 분자와 세포 또는 적당한 세포 제제와의 상호작용 후에 제2 메신저 시스템의 활성을 결정하고, 이러한 효과를 VEGI 또는 VEGI와 동일한 효과를 유발시키는 분자의 효과와 비교함으로써 결정할 수 있다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 제2 메신저 시스템으로는 AMP 구아닐레이트 사이클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시티드 가수분해 제2 메신저 시스템이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
VEGI 길항제에 대한 검정의 또 다른 예는 VEGI 폴리펩티드 및 효능있는 길항제를 경쟁적 억제 검정에 적당한 조건하에서 막 결합된 VEGI 수용체 분자 또는 재조합 VEGI 수용체 분자와 결합시키는 경쟁적 검정이다. VEGI 폴리펩티드는, 예를 들어, 방사선 등으로 표지시킬 수 있으며, 이로써 수용체 분자와 결합된 VEGI 분자의 수를 결정하여 효능있는 길항제의 효능을 정확하게 평가할 수 있다.
효능있는 길항제로는 본 발명의 폴리펩티드와 결합됨으로써 이의 활성을 억제 또는 소멸시키는, 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드 및 항체가 있다. 효능있는 길항제는 또한, VEGI-유도된 활성을 유도하지 않으면서, 수용체 분자와 같은 결합성 분자 상의 동일한 부위와 결합됨으로써 VEGI가 결합되지 못하에 하여 VEGI의 작용을 억제시키는, 작은 유기 분자, 펩티드, 밀접하게 관련된 단백질과 같은 폴리펩티드 또는 항체일 수 있다.
기타 효능있는 길항제로는 안티센스 분자가 있다. 안티센스 기술을 사용하여 안티센스 DNA 또는 RNA를 통하여 유전자 발현을 조절하거나 삼중-나선 구조 형성을 통하여 유전자 발현을 조절한다. 안티센스 기술은, 예를 들면, 문헌[참조: Okano, J. Neurochem., 56:560(1991); ″Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)]에 기재되어 있다. 삼중 나선 형성은, 예를 들면, 문헌[참조: Lee et al., Nucleic. Acids Research, 6:3073(1979); Cooney et al, Science, 241:456(1988); 및 Dervan et al., Science, 251: 1360(1991)]에 기재되어 있다. 이들 방법 모두는 폴리뉴클레오티드를 상보적 DNA 또는 RNA에 결합시키는 것을 기초로 한다. 예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 암호화 부분을 사용하여 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드를 전사에 관계된 유전자 영역에 상보적이도록 고안함으로써, VEGI의 전사 및 생성을 억제한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드가 생체 내에서 mRNA와 하이브리드화하고 mRNA 분자가 VEGI 폴리펩티드로 해독되는 것을 차단한다. 또한 상기 언급된 올리고뉴클레오티드를 세포로 전달하여, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 VEGI 폴리펩티드의 생성을 억제할 수 있도록 한다.
VEGI 폴리펩티드에 특이적인 항체가, VEGI와 결합하여 이것이 이의 수용체와 결합하지 못하게 함으로써 길항제로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여 모노클로날 항체가 특히 유효하다. 그러나, VEGI 수용체에 특이적인 항체가 이의 수용체와의 상호작용시 VEGI의 효과를 증진시키는 경향이 있는 별개의 세포내 반응을 매개할 수 있다.
효능있는 VEGI 길항제에는 또한, VEGI 수용체와 결합되어 이러한 수용체를 이의 천연 리간드로부터 효과적으로 차단시키기 위한 제2의 메신저 시스템을 전혀 유발시키지 않는 VEGI 돌연변이체가 포함된다. 특이적으로 고안된 올리고뉴클레오티드 및 작은 분자가 또한, VEGI 수용체(예를 들어, DR3)와 결합하여 이 것을 VEGI로부터 차단할 수 있다. 작은 분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 효능있는 VEGI 길항제는 VEGI와 결합되어 이 것이 막 결합된 VEGI 수용체와 상호작용하지 못하도록 하는 가용성 형태의 VEGI 수용체이다. 이러한 방식으로, 상기 수용체는 VEGI에 의해 자극되지 못한다.
또 다른 효능있는 VEGI 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 작제물이다. 안티센스 기술을 사용하여 안티센스 DNA 또는 RNA를 통하여 유전자 발현을 조절하거나 삼중-나선 구조 형성을 통하여 유전자 발현을 조절한다. 이들 방법 모두는 폴리뉴클레오티드를 DNA 또는 RNA에 결합시키는 것을 기초로 한다. 예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 암호화 부분을 사용하여 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드를 전사에 관계된 유전자 영역에 상보적이도록 고안함으로써, VEGI의 전사 및 생성을 억제한다[삼중 나선-Lee et al., Nucleic. Acids Research, 6:3073(1979); Cooney et al, Science, 241:456(1988); 및 Dervan et al., Science, 251: 1360(1991) 참조]. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드가 생체 내에서 mRNA와 하이브리드화하고 mRNA 분자가 VEGI 폴리펩티드로 해독되는 것을 차단한다[안티센스 - Okano, J. Neurochem., 56:560(1991); ″Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)]. 또한 상기 언급된 올리고뉴클레오티드를 세포로 전달하여, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 VEGI 폴리펩티드의 생성을 억제할 수 있도록 한다.
VEGI 길항제를 또한 이용하여 VEGI에 의해 억제되는 지단백 리파제의 전신 결핍증으로부터 발생되는 지질 클리어링 결손인 카헥시를 치료할 수 있다. 이러한 VEGI 길항제를 이용하여 VEGI가 병변 역할을 하는 것으로 보이는 뇌성 말라리아를 치료한다.
VEGI 길항제를 또한 이용하여, VEGI에 의하 그라프트의 존재하에서 면역계의 자극을 억제함으로써 그라프트 거부를 예방할 수 있다.
VEGI 길항제를 또한 이용하여, 골다공증을 치료할 수 있는데, 이는 VEGI가 골 흡수를 유도할 수 있기 때문이다.
VEGI에 대한 길항제를 또한 소염제로서 이용할 수 있는데, 이는 VEGI가 염증성 반응 증가를 매개하기 때문이다.
당해 길항제를 또한 이용하여, 패혈성 쇽으로 지칭되기도 하는 내독성 쇽을 치료할 수 있다. 이러한 위급한 증상은 세균 또는 기타 유형의 감염에 대한 악화된 반응으로부터 비롯된 것이다. 이러한 반응으로 인해, 쇽과 조직 손상을 유발시키는 VEGI의 수준이 증가하게 된다.
또한 본 발명은 각종 조직 내의 VEGI 폴리펩티드의 변형된 수준을 검출하기 위한 진단 검정법에 관한 것인데, 이는 정상적인 대조군 조직 샘플과 비교하여 과다 발현된 단백질로 인해, 뇌성 말라이라 질환 또는 이러한 질환에 걸리기 쉬운지의 여부를 검진할 수 있기 때문이다. 숙주로부터 유도된 샘플 중의 VEGI 폴리펩티드의 수준을 검출하기 위해 사용된 검정법은 당해 기술 분야의 숙련인에게 익히 공지되어 있고 방사성면역검정법, 경쟁적 결합 검정법, 웨스턴 블롯 분석, ELISA 검정법 및 ″샌드위치(sandwich)″ 검정법을 포함한다. ELISA 검정법[참조: Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), Chapter 6, (1991)]은 먼저, VEGI 항원에 특이적인 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 제조하는 것을 포함한다. 또한 리포터 항체를 상기 모노클로날 항체에 대하여 제조한다. 이러한 리포터 항체에 방사능, 형광성, 또는 본 실시예에서는 양고추냉이 퍼옥시다제 효소와 같은 검출가능한 시약을 부착시킨다. 샘플을 숙주로부터 제거시키고 이를, 샘플 중의 단백질과 결합되는 고체 지지체(폴리스티렌 디쉬) 상에서 배양한다. 그 다음, 상기 디쉬 상의 유리 단백질 결합 부위를 BSA와 같은 비특이적 단백질과 함께 배양함으로써 보호한다. 그 다음, 모노클로날 항체를, 이러한 모노클로날 항체가 폴리스티렌 디쉬에 부착된 모든 VEGI 폴리펩티드에 부착되는 시간 동안 상기 디쉬에서 배양한다. 결합되지 않은 모든 모노클로날 항체를 완충액으로 세척하여 제거한다. 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 리포터 항체를 디쉬에 놓아 둠으로써 VEGI에 결합된 모노클로날 항체에 리포터 항체를 결합시킨다. 이어서, 부착되지 않은 리포터 항체를 세척하여 제거한다. 그 다음, 퍼옥시다제 기질을 디쉬에 가하여 소정의 시간 내에 발색된 양은 표준 곡선에 대하여 비교해 볼때, 소정의 환자 샘플 용적 내에 존재하는 VEGI 폴리펩티드의 양을 측정한 값이다.
경쟁적 검정법을 사용할 수 있는데, 여기서는 VEGI 폴리펩티드에 특이적인 항체를 고체 지지체에 부착시키고 표지된 VEGI 및 숙주로부터 유도된 샘플을 상기 고체 지지체 위로 통과시키고 검출된 표지의 양을, 예를 들어 액체 신틸레이션 크로마토그래피에 의해 검출한 다음, 이를 샘플 내의 VEGI의 양과 상관지울 수 있다.
″샌드위치″ 검정법은 ELISA 검정법과 유사하다. ″샌드위치″ 검정법에서는, VEGI를 고체 지지체 위로 통과시켜 고체 지지체에 부착된 항체에 결합시킨다. 이어서, 제2 항체를 VEGI에 결합시킨다. 이어서, 표지되고 제2 항체에 특이적인 제3 항체를 고체 지지체 위로 통과시켜 제2 항체에 결합시킨 다음 양을 정량할 수 있다.
본 발명의 서열은 또한, 염색체 동정에도 유용하다. 상기 서열은 개개의 사람 염색체 상의 특정한 위치에 대해 특이적으로 표적되고 이와 하이브리화할 수 있다. 더욱이, 현재에는 염색체 상의 특정 부위를 동정해야 할 필요가 있다. 염색체 위치를 표식하기 위한, 실제 서열 데이터(반복 다형성)를 기준으로 하는 염색체 표식화 시약을 현재 거의 입수할 수 없다. 본 발명에 따라 염색체에 대한 DNA의 유전자 위치를 나타내는 것(지도화)은 이들 서열을 질환과 관련된 유전자와 상호연관시키는데 있어서 중요한 제1 단계이다.
간략하게 언급하면, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25bp)를 제조함으로써 서열을 염색체에 대해 지도화할 수 있다. 상기 서열의 3' 비해독 영역의 컴퓨터 분석을 사용하여 게놈 DNA 내에 하나 이상의 엑손을 걸치지 않는 프라이머를 신속하게 선별하여, 증폭 과정을 복잡하게 만든다. 다음, 상기 프라이머를 개개의 사람 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 이러한 프라이머에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 하이브리드 만이 증폭된 단편을 생성할 것이다.
체세포 하이브리드의 PCR 지도화는 특정 DNA를 특정 염색체로 분배하기 위한 신속한 방법이다. 본 발명에 있어서 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 서브-국재화(sublocalization)를 특이적 염색체 또는 대형 게놈 클론의 풀로부터의 단편의 패널을 사용하여 유사한 방법으로 성취할 수 있다. 이의 염색체에 대해 지도화하는데 유사하게 사용될 수 있는 다른 지도화 방법으로는 염색체 특이적-cDNA 라이브러리를 작제하기 위한, 동일계 내의 하이브리드화, 표지된 플로우(flow)-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝 및 하이브리드화에 의한 예비선별 방법이 있다.
cDNA 클론을 중기 염색체 확산배양물과 동일계 내에서 형광성 하이브리드화(FISH)시켜 1단계로 정확한 염색체의 위치를 제공할 수 있다. 이러한 기술은 50 또는 60개 염기 정도로 짧은 cDNA로 이용될 수 있다. 상기 기술의 재고를 위해, 문헌[참조: Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조할 수 있다.
서열이 정확한 염색체 위치로 지도화되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치를 유전자 지도 데이터와 상호연관시킬 수 있다. 이러한 데이터는, 예를 들어 문헌[참조: V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man](Johns Hopkins University Welch Medical Library를 통해 온 라인으로 구입할 수 있다)]에서 발견된다. 다음, 동일한 염색체 영역에 지도화시킨 유전자와 질환간의 관계를 결합 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동유전형질)을 통해 동정한다.
다음, 감염자 및 비감염자간의 cDNA 또는 게놈 서열 차이를 결정하는 것이 필요하다. 돌연변이가 몇몇 감염자 또는 모든 감염자에서 관찰되나 정상인에서는 관찰되지 않을 경우, 이러한 돌연변이가 아마도 상기 질환의 유발 원인제일 것이다.
통상적인 물리적 지도화의 분해 및 유전학적 지도화 기술로, 상기 질환과 연관된 염색체 영역으로 정확하게 국재된 cDNA는 50 내지 500가지의 효능있는 유발 원인성 유전자 중의 하나일 수 있다(이는 1 메가염기 지도화 분해능 및 20kb당 하나의 유전자를 취한다).
상기 언급된 기술을 사용하여, VEGI의 염색체 위치는 매우 고 신뢰도로 9q32인 것으로 결정되었다. 앞서의 염색체 지도화 연구를 진행중인 몇몇 결함과 연계하여 염색체 9의 위치를 정하였다.
다음은 본 발명의 실시예이며, 이는 본 발명을 예시하기 위함이지, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다. 본 명세서에 비추어 보면, 청구의 범위 내에서의 수 많은 양태가 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 기술될 것이나; 본 발명이 이들 실시예로 제한되지는 않는 다는 것을 인지해야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 부 또는 양은 중량 기준이다.
하기 실시예의 이해를 용이하게 하기 위해, 종종 나타나는 특정 방법 및/또는 용어에 관해 기술한다.
″플라스미드″는 처음에는 소문자 p로 표기하고/거나 그 다음에는 대문자 및/또는 숫자로 표기한다. 본 발명에서 출발 플라스미드는 제한되지 않은 조건으로 공개적으로 구입할 수 있도록 시판중이거나, 또는 시판용 플라스미드로부터 공개된 방법에 따라 작제할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 것과 동등한 플라스미드는 당해 기술에 공지되어 있고 통상의 숙련인에게 명백할 것이다.
DNA의 ″분해(digestion)″란 DNA의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소로 DNA를 촉매적 절단하는 것을 지칭한다. 본 발명에 사용된 각종 제한 효소는 시판용이고 이의 반응조건, 보조인자 및 기타 필요조건은 통상의 숙련인에게 공지된 바와 같이 사용된다. 분석 목적을 위해서는, 전형적으로 플라스미드 또는 DNA 1㎍을 약 20㎕의 완충액에서 효소 약 2 단위와 함께 사용한다. 플라스미드 작제를 위해 DNA 단편을 분리하고자 하는 경우에는, 전형적으로 DNA 5 내지 50㎍을 효소 20 내지 250 단위를 사용하여 보다 큰 용적으로 분해한다. 특정 제한 효소에 적합한 완충액 및 기질의 양은 제조업자에 의해 명시된다. 37℃에서 약 1시간의 배양 시간이 통상적으로 사용되나, 공급자의 지시에 따라 변화될 수 있다. 분해 후에, 반응물을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 직접 전기영동시켜 목적하는 단편을 분리시킨다.
절단된 단편의 크기 분리를 문헌[참조: Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057]에 기술된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.
″올리고뉴클레오티드″란 화학적으로 합성할 수 있는 일본쇄 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 두 개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 가지지 않으므로 키나제의 존재하에 ATP와 함께 포스페이트를 첨가하지 않을 경우 또 다른 올리고뉴클레오티드에 연결되지 않는다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈포스포릴화되지 않은 단편에 연결될 것이다.
″연결(ligation)″이란 두 개의 이본쇄 핵산 단편간의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 지칭한다[참조: Maniatis, T., et al., Id., p. 146]. 달리 제시되지 않는 한, 공지된 완충액 및 조건을 이용하여, 거의 등몰량의 연결시키고자 하는 DNA 단편 0.5㎍당 T4 DNA 리가제(″리가제″) 10 단위를 사용하여 연결을 수행할 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 형질전환을 문헌[참조: Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52:456-457(1973)]에 기술된 방법과 같이 수행한다.
실시예 1: VEGI 폴리펩티드의 세균성 발현 및 정제
예상된 완전한 길이의 VEGI-알파 폴리펩티드의 N-말단 서열로부터의 38개 아미노산 결실물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 삽입체를 함유하는 발현 벡터를 작제한다. N-말단적으로 결실된 VEGI-알파 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을, VEGI-알파 암호화 서열의 암호화 서열에 특이적인 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 클로닝을 촉진시키기 위해 제한 부위를 발생시키는 부가의 뉴클레오티드를 5' 및 3' 서열에 각각 가한다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Nco I 제한 부위에 이어 암호화 서열의 18개 뉴클레오티드를 함유하는 서열 5'-GCG CCA TGG CTC TGC ACT GGG AAC AT-3'(서열 3)을 갖는다. 3' 프라이머는 HindIII 제한 부위에 이어 암호화 서열의 마지막 15개 뉴클레오티드에 상보적인 18개 뉴클레오티드 및 정지 코돈을 함유하는 서열 5'-CGC AAG CTT CTA TAG TAA GAA GGC TCC-3'(서열 4)를 갖는다. 이와 같이 증폭된 VEGI-알파 DNA 생성물을, 적당한 제한 효소로 분해한 다음 연결시킨 후에 벡터 pQE60(공급원: Qiagen) 내로 클로닝한다. 연결 혼합물을 적격한 이. 콜라이 세포(균주 M15/rep4) 내로 형질전환시킨다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론을 0.4 내지 0.6의 광밀도 600으로 성장시킨다. 그 다음, IPTG(″이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드″)를 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 하여 단백질의 발현을 유도시킨다. 3시간 후, 세포를 수거하고, 봉입체를 파열된 세포로부터 정제하며, 단백질을 상기 봉입체로부터 8M 우레아 내로 가용화시킨다. 이와 같이 가용화된 단백질을 2X 인산염 완충 식염수(PBS)에서 PD-10 칼럼 상으로 통과시킴으로써 우레아를 제거하고, 완충액을 교환시킨 다음 단백질을 재폴딩시킨다. 상기 단백질을 크로마토그래피의 추가의 단계에 의해 정제하여 내독소를 제거한다. 이로써 생성된 VEGI-알파 폴리펩티드 제제는 SDS-PAGE에 의한 순도가 90% 이상이고 〈10EU 내독소/mg을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
또한, 완전한 길이의 VEGI-알파 ORF(ATCC 기탁 제75927호)를 암호화하는 DNA 서열을, VEGI-알파 단백질의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시킨다. VEGI-알파에 상응하는 부가의 뉴클레오티드를 5' 및 3' 서열에 각각 가한다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 13으로 제시되고 Bam HI 제한 효소 부위에 이어 초기 메티오닌 코돈으로부터 출발하여 VEGI-알파 암호화 서열의 첫 번째 24개 뉴클레오티드를 함유하는 서열 5'-GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAA AGT C-3'을 갖는다. 3' 프라이머 서열 5'-CGC GTC TAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAA AGA AGG-3'(서열 14)는 XbaI 부위에 상보적인 서열 및 VEGI-알파의 22개 뉴클레오티드를 함유한다. 상기 제한 효소 부위는 세균성 발현 벡터 pQE-9(공급원: Qiagen) 상의 제한 효소 부위에 상응한다. 이어서, pQE-9를 Bam HI 및 XbaI로 분해한다. 증폭된 서열을 pQE-9에 연결하고 히스티딘 태그와 RBS를 암호화하는 서열을 사용하여 동일 프레임 내에 삽입시킨다. 그 다음, 연결 혼합물을 사용하여 문헌[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]에 기술된 방법에 의해 이. 콜라이 균주[상표명 M15/rep4(공급원: Qiagen)]를 형질전환시킨다. M15/rep4는 lacⅠ 억제제를 발현하고 또는 카나마이신 내성(Kanr)을 부여하는, 플라스미드 pREP4의 다수 복사물을 함유한다. LB 판 상에서 성장하는 이의 능력에 의해 형질전환체를 동정하고 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리시키고 제한 분석에 의해 확인한다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론을 Amp(100ug/ml)과 Kan(25ug/ml) 모두가 보충된 LB 배지 중의 액체 배양물에서 밤새(O/N) 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 1:25 내지 1:250의 비로 대형 배양물에 접종시킨다. 세포를 0.4 내지 0.6의 광밀도 600(OD600)으로 성장시킨다. 그 다음, 이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드(″IPTG″)를 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 한다. IPTG는 lacⅠ 억제제를 불활성화시킴으로써 유도되고, 이로서 유전자 발현 증가를 유발시키는 P/O를 명백하게 한다. 세포를 3 내지 4시간 더 배양한다. 그 다음, 세포를 원심분리시켜 수거한다. 세포 펠릿을 카오트로픽제 6M 구아니딘 HCl(2.5M 이상의 구아니딘 HCl 농도가 보다 높은 순도의 회수된 재조합 단백질을 생성시키는 것으로 실험상 밝혀졌다)에서 가용화시킨다. 정화 후, 가용화된 VEGI-알파 폴리펩티드를, 6-His 태그를 함유하는 단백질에 의해 단단히 결합시켜 주는 조건하에서 닉켈-킬레이트 칼럼상에서 크로마토그래피하여 상기 용액으로부터 정제한다[참조: Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184(1984)]. VEGI-알파 폴리펩티드를 닉켈-킬레이트 칼럼 상에서 두 번째로 수행하여 이를 추가로 정제한다. VEGI-알파 폴리펩티드(90% 순도)를 6몰 구아니딘 HCl(pH 5.0) 중에서 상기 칼럼으로부터 용출시키고 재생시키기 위해서 PBS 완충액에서 투석한다. 이러한 발현 생성물을 SDS-PAGE로 전기영동시킨다.
당해 분야의 숙련인은 pQE-9 이외의 세균성 발현 벡터를 사용하여 VEGI 폴리펩티드를 발현할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 바람직한 세균성 발현 벡터중의 하나가 pHE4-5이다. pHE4-5는 pHE4-5/MPIFD23 플라스미드 DNA(이러한 작제물은 관련없는 ORF를 암호화하는 관련없는 삽입체를 함유한다)로서 수득된다. 이러한 플라스미드 pHE4-5/MPIFD23는 1997년 9월 30일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852)에 기탁되어 있다(ATCC 수탁 번호 제209311호). 관련없는 MPIF ORF 삽입체를 플랭킹하는 Nde I 및 Asp 718 제한 부위를 사용하여, 당해 분야의 숙련인은 pHE4-5/MPIFD23 플라스미드 중의 관련없는 ORF를 본 발명의 VEGI ORF 또는 이의 변이물로 대체하기 위해 현 분자 생물학 기술을 용이하게 이용할 수 있다.
실시예 2: 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용한 VEGI 폴리펩티드의 클로닝 및 발현
완전한 길이의 VEGI-알파 폴리펩티드을 암호화하는 DNA 서열(ATCC 수탁 번호 제75927호)을 상기 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다: 5' 프라이머는 서열 5'-GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAA AGT C-3'(서열 15)을 가지며 BamHⅠ 제한 효소 부위(진하게 표시됨)에 바로 이어 VEGI-알파 암호화 서열의 24개 뉴클레오티드(해독 ″ATG″에 대한 초기 코돈이 밑줄쳐져 있음)를 함유한다. 3' 프라이머는 서열 5'-CGC GTC TAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAA AGA AGG-3'(서열 16)을 가지고 제한 엔도뉴클레아제 XbaⅠ 및 VEGI-알파 암호화 서열의 3' 미해독된 서열에 상보적인 22개 뉴클레오티드를 함유한다. 증폭된 서열을 시판용 키트(상표: ″Geneclean″, 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 이어서, 상기 단편을 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 XbaⅠ로 분해시키고 1% 아가로스 겔상에서 다시 정제한다. 이 단편을 F2로 명명한다.
벡터 pA2(다음에서 논의된 바와 같은 pVL941 벡터의 변형체)를 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하는 VEGI-알파 폴리펩티드의 발현에 사용한다[참조: Summers, M.D. and Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555]. 이러한 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus; AcMNPV)의 강력한 폴리헤드린 프로모터에 이어 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 XbaⅠ에 대한 인식 부위를 함유한다. 원숭이 바이러스(SV) 40의 폴리아데닐화 부위를 효율적인 폴리아데닐화를 위해 사용한다. 재조합 바이러스의 용이한 선별을 위해, 이. 콜라이로부터의 베타-갈락토시다제를 폴리헤드린 프로모터에 이어 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그날과 동일한 방향으로 삽입한다. 폴리헤드린 서열을 공동형질감염된 야생형 바이러스성 DNA의 세포-매개된 동종 재조합을 위하여 바이러스성 서열에 의해 양측에 플랭킹한다. pRG1, pAc373, pVL941 및 pAc1M1과 같은 수 많은 기타 바쿨로바이러스 벡터를 pA2 대신 사용할 수 있다[참조: Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology, 170:31-39].
상기 플라스미드를 제한 효소 BamHⅠ 및 XbaⅠ를 사용하여 분해한 다음, 당해 분야에 공지된 과정에 의해 송아지 장 포스파타제를 사용하여 탈포스포릴화시킨다. 이러한 DNA를 시판용 키트(상표: ″Geneclean″, 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 이러한 벡터 DNA를 V2로 명명한다.
단편 F2와 탈포스포릴화 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다. 그 다음, 이. 콜라이 XL1 블루 세포를 형질전환시킨다. 이와 같이 클론된 단편의 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인한다.
플라스미드 pBacVEGI-알파 5㎍을 리포펙션(lipofection) 방법[참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987)]을 사용하여 시판용의 선형화된 바쿨로바이러스[상표: ″바쿨로골드(BaculoGoldTM)바쿨로바이러스 DNA″, 공급원: Pharmingen, San Diego, CA.] 1.0㎍으로 공동형질감염시킨다.
바쿨로골드 바이러스 DNA 1㎍ 및 플라스미드 pBacVEGI-알파 5㎍을 무혈청 그레이스 배지(공급원: Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) 50㎕를 함유하는 미세역가 플레이트의 멸균 웰에서 혼합한다. 그 후, 리포펙틴 10㎕와 그레이스 배지 90㎕를 가한 후에, 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양한다. 그 다음, 형질감염 혼합물을 무혈청 그레이스 배지 1ml와 함께 35mm 조직 배양 플레이트에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 상기 플레이트를 전후로 진탕하여 새로이 추가된 용액을 혼합한다. 그 다음, 플레이트를 27℃에서 5시간 동안 배양한다. 5시간 후에, 형질감염 용액을 상기 플레이트로부터 제거하고 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1ml을 가한다. 상기 플레이트를 배양기 내에 넣고 4일 동안 27℃에서 계속 배양한다.
4일 후에 상등액을 수집하고 플라크 검정을 상기 섬머즈(Summers)와 스미스(Smith)에 의해 기술된 바와 유사하게 수행한다. 한 변형으로서, 블루 염색된 플라크를 용이하게 분리시키도록 하는 ″블루 갈(Blue Gal)″[Life Technologies Inc., Gaithersburg]이 수반된 아가로스 겔을 사용한다. (″플라크 검정″의 상세한 설명은 공급자(Life Technologies Inc., Gaithersburg)에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 바쿨로바이러스학에 관한 사용자 지침서 제9면 내지 제10면에서 참조할 수 있다).
일련의 희석을 수행한지 4일 후에, 바이러스를 세포에 가하고, 블루 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫 팁으로 골라낸다. 그 다음, 재조합 바이러스를 함유하는 한천을 그레이스 배지 200㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브 내에서 재현탁시킨다. 상기 한천을 단시간의 원심분리에 의해 제거하고 재조합 바쿨로바이러스를 함유하는 상등액을 사용하여 35mm 디쉬에 접종된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후에 상기 배양 디쉬의 상등액을 수거한 다음 4℃에서 저장한다.
Sf9 세포를 10% 열-불활성화된 FBS가 보충된 그레이스 배지 내에서 성장시킨다. 상기 세포를 감염 다중도(multiplicity of infection(MOI)) 2에서 재조합 바쿨로바이러스 V-VEGI-알파로 감염시킨다. 6시간 후에 배지를 제거하고 메티오닌 및 시스테인 부재의 SF900 Ⅱ 배지[Life Technologies Inc., Gaithersburg]로 대체한다. 42시간 후에 [35S]-메티오닌 5μCi 및 [35S]-시스테인 5μCi(공급원: Amersham)를 가한다. 세포를 원심분리에 의해 수거하기 전에 16시간 동안 추가로 배양하고 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자가방사성사진에 의해 가시화시킨다.
실시예 3: 포유류 세포에서의 재조합 VEGI-알파의 발현
중국산 햄스터 난소(CHO) 디하이드로폴레이트 리덕타제-음성(DHFR-) 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 구입한다. pC1 중국산 햄스터 난소 세포 내로 VEGI-알파 cDNA를 클로닝하는 것을 필수적으로 다음과 같이 수행한다. 완전한 길이의 VEGI-알파 폴리펩티드를 암호화하는 사람 cDNA 서열을 VEGI-알파 암호화 서열의 5' 및 3' 말단에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시킨다[5' 프라이머: GCG gga tcc GCC ACC ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GCC TTC GGT CCA GTT GCC TTC TCC CTG GGG CTG CTC CTG GTG TTG CCT GCT GCC TTC CCT GCC CCA GTT GTG AGA C(서열 5)(이는 Bam H1 제한 부위에 이어 ″코작″ 서열(상기 소문자) 및 IL6 암호화 서열의 초기 84개 염기 및 VEGI-알파 암호화 서열의 13개 염기를 함유한다); 3' 프라이머: CGC gga tcc GAT ATT TGC TCT CCT CCT CA(서열 6)(이는 Bam H1 제한 부위에 이어 해독 영역의 17개 뉴클레오티드 및 정지 코돈을 함유한다)]. 이와 같이 증폭된 단편을 겔 정제하고 Bam H1로 분해한다. CHO 세포 발현 벡터(pC1)를 BamH1로 분해한 다음, 아가로즈 겔 정제시킨다. 증폭된 VEGI-알파 암호화 서열을 T4 DNA 리가제를 사용하여 정제된 pC1 벡터에 연결시킨다. HB101 세포를 연속적으로 형질전환시킨다. 양성 클론(pC1VEG)을 PCR 스크리닝/효소 제한에 의해 동정하고 관심있는 DNA 서열을 자동 DNA 서열분석을 이용하여 확인한다. 안정한 CHO 세포 클론의 선별 및 증폭을 문헌[참조: R. Gentz, et al., Eur. L.T. Biochemistry 210, 545 (1992)]에 앞서 기재된 바와 같이 수행한다. CHO 안정한 형질감염체 CHO-VEGI-알파 및 CHO-벡터를 10% FCS를 함유하는 배지인 MEM에서 유지시킨다(투석시킴).
플라스미드 VEGI-알파-HA의 발현을 1) SV40 복제 기점, (2) 앰피실린 내성 유전자, (3) 이. 콜라이 복제 기점, (4) CMV 프로모터에 이어 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 벡터pcDNAⅠ/Amp(Invitrogen)로부터 유도한다. 완전한 VEGI-알파 전구체를 암호화하는 DNA 단편 및 이의 3' 말단에서 프레임 내에 융합된 혈구응집소 항원(HA) 태그를 벡터의 폴리링커 영역 내로 클로닝한다. 따라서, 재조합 단백질 발현을 CMV 프로모터 하에 지시한다. HA 태그는 앞서 기술된 바와 같이 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다[참조: I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37. 767]. 표적 단백질로의 HA 태그의 융합은 HA 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 상기 재조합 단백질을 용이하게 검출하도록 한다.
플라스미드 작제 방법은 하기에 기술한다: VEGI-알파를 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 75927)을, 두 개의 프라이머: 즉, BamHⅠ 부위에 이어 개시 코돈으로부터 출발하는 VEGI-알파 암호화 서열의 24개 뉴클레오티드를 함유하는 5' 프라이머(서열 15); XbaⅠ부위, 해독 정지 코돈, HA 태그 및 VEGI-알파 암호화 서열의 마지막 18개의 뉴클레오티드(정지 코돈을 함유하지 않음)에 상보적인 서열을 함유하는 3' 서열 5'-CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG ATA GTA AGA AGG CTC CAA AG-3'(서열 17)를 사용하여 클로닝된 본래의 EST 상에서 PCR에 의해 작제한다. 따라서, 이러한 PCR 생성물은 BamHⅠ 부위, VEGI-알파 암호화 서열에 이어 프레임 내에 융합된 HA 태그, 이러한 HA 태그 다음의 해독 종결 정지 코돈, 및 XbaⅠ 부위를 함유한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터 pcDNAⅠ/Amp를 BamHⅠ 및 XbaⅠ 제한 효소로 분해하고 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 SURE(공급원: Stratagene Cloning System, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) 내로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 앰피실린 배지 플레이트 상에 도말하고 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 상기 형질전환체로부터 분리시키고 정확한 단편의 존재 여부를 알아보기 위해 제한 분석으로 조사한다. 재조합 VEGI-알파 폴리펩티드를 발현시키기 위해, COS 세포를 DEAE-DEXTRAN 방법에 의해 발현 벡터로 형질감염시킨다[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]. VEGI-알파-HA 단백질의 발현을 방사성표지 및 면역침전법으로 검출한다[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1988)]. 형질감염시킨지 2일 후에 세포를 [35S]-시스테인으로 8시간 동안 표지시킨다. 이어서, 배양 배지를 수집하고 세포를 세정제[RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.1% DOC, 50mM 트리스, pH 7.5)(참조: Wilson, I. et al., Id. 37:767(1984))]로 용융시킨다. 세포 용융물과 배양 배지 모두를 HA 특이적 모노클로날 항체로 침전시킨다. 침전된 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석한다.
실시예 4: 각종 세포 및 세포 유형에서의 VEGI의 발현 패턴
RNA 블롯 분석을 수행하여 사람 조직에서의 VEGI의 발현 수준을 검사한다. RNAzol™ B 시스템(Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033)을 사용하여 총 세포내 RNA 세포를 분리한다. 특정화된 각 사람 조직으로부터 분리된 총 RNA DIR 2㎍을 1% 아가로즈-포름알데히드 겔 상에서 분리하고 나일론 필터 상으로 블롯팅한다[참조: Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)]. VEGI-알파 cDNA 50ng을 사용하여 스트라타젠 프라이머-잇 키트에 따라서 표지화 반응을 수행하여 [32P]-표지된 VEGI-알파 cDNA를 생성시킨다. 이와 같이 표지된 DNA를 셀렉트-G-50 칼럼(5 Prime-3Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303)으로 정제한다. 이어서, 상기 필터를 65℃하에 밤새 0.5M NaPO4, pH 7.4 및 7% SDS에서 1,000,000cpm/ml으로 방사능 표지된 완전한 길이의 VEGI-알파 프로브와 하이브리드화시킨다. 0.5x SSC, 0.1% SDS으로 실온에서 2회 세척하고 60℃에서 2회 세척한 후, X선 필름을 집중화 스크린을 사용하여 -70℃에서 밤새 상기 블롯에 노출시킨다. VEGI-알파에 대한 메시지 RNA는 신장에 풍부하다.
각종 직계의 배양 세포의 22가지 상이한 유형으로부터 총 RNA 제제를 노던 블롯팅 분석함으로써 확인된 바와 같이, VEGI는 내피 세포에서 특이적으로 발현된다(도 1A). VEGI 메시지는 두 유형의 내피 세포, 즉 초기 세대의 HUVE 세포 및 사람 정맥성 내피 세포의 1차 배양물에서만 검출된다. mRNA는 후기 세대의 사람 정맥성 내피 세포에서는 검출되지 않을 뿐만 아니라 사람 동맥 세포에서도 관찰되지 않았다. 이와는 현격히 다르게, TNF 계열 구성원은 면역 세포에서 대부분 발현된다[참조: B.B. Aggarwal and K. Natarajan, 상기 참조]. 예를 들면, TNF-α가 대식세포, 단구, 호중구 및 T 세포에 의해 생성되는 반면, TNF-β는 유사분열물질 자극된 T 임파구 및 백혈구에 의해 우선적으로 생성된다. 유사하게, Fas, CD27, CD30, CD40, OX40 및 4-1BB에 대한 리간드가 모두 면역계 내의 세포 유형에서 발현된다.
다중 조직 노던 블롯을 사용하여, VEGI 전사체를 태반, 폐, 신장, 골격근, 췌장, 비장, 전립선, 소장, 및 결장에서 발현시킨다. 최소량의 VEGI 시그날을 심장, 뇌, 간, 흉선, 고환, 난소 및 말초혈 임파구에서 검출되었다(도 1B). 대부분의 주요 기관에서의 VEGI의 발현은 상기 유전자 생성물이 정상적인 맥관계의 기능에 특정 역할을 할 수 있다는 것을 제안하고 있다.
노던 블롯 분석을 또한 수행하여, HUVEC 세포 배양물의 증식 상태에 대한 VEGI RNA의 상대적인 발현 수준을 결정한다. 이들 실험에서는, HUVEC 세포로부터 분리된 동일한 양의 총 RNA(15㎍)을 전기영동적으로 분리하고 상기 언급된 바와 같이 블롯팅한다. 주입(seeding)한지 1, 2, 3, 4, 6 및 7일 후의 배양물로부터 RNA를 분리한다. VEGI RNA가 새로이 주입된 배양물(1, 2 및 3일)에서 낮은 수준으로만 관찰되었다. 그러나, VEGI RNA의 발현은 컨플루언스(confluence)에 도달하기 시작된 배양물에서 HUVEC 세포로서 나타났다(4, 6 및 7일). 이들 실험은 VEGI 발현이 비- 또는 감소된 증식의 휴면 상태에 도달하기 시작한 배양물 또는 조직에서 세포로서 증가된다는 것을 지시해준다.
실시예 5: ABAE 세포 증식의 VEGI-매개된 억제
세포를 24-웰 플레이트에서 적당한 밀도로 3회 접종한다(ABAE 세포, 8,000세포/웰; MDA-MB-231, 2,000세포/웰; MDA-MB-435, 2,000세포/웰). 이 배양 배지는 1MEM(Gibco) 및 10% FCS를 함유한다. FGF-2(1ng/ml)가 ABAE 세포에 대한 배양 배지에 존재한다. 이 배양물을 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 유지시킨다. 상기 세포를 트립신으로 처리하고, 콜터 계수기를 사용하여 세포의 수를 결정한다. 회수된 ABAE 세포 총 수의 1/5을 사용하여 암 세포와의 비교를 표준화시킨다.
잔기 38-174로 이루어진 추정상의 세포외 도메인에 상응하는 VEGI-알파의 절단된 형태를 이. 콜라이에서 발현시키고; 상기 언급된 바와 같이, 정제한 다음, 각종 세포내 검정으로 검사한다. 이와 같이 절단된 폴리펩티드가 내피 세포의 증식을 특이적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다(도 2). 약 1mg/ml(약 70nM)의 최대 억제 농도치의 절반(IC50)을 사용하여, 10mg/ml에서 다 자란 소의 대동맥 내피(ABAE) 세포의 성장을 거의 완전하게 억제하였다. 재조합 폴리펩티드의 활성을 안지오스타틴, 엔도스타틴, 및 혈소판 인자 4의 활성과 비교한다. 이와는 달리, 상기 폴리펩티드는 유사한 실험 조건하에서 사람 유방암 세포(MDA-MB-231 또는 MDA-MB-435)의 성장을 억제하지 못하였다. VEGI-알파 결실 변이체는 또한, 사람 T-세포 백혈병 세포(jurkat), 사람 부르키트 임파종 세포(Raji), 사람 단구 백혈병 세포(THP-1), 또는 사람 전골수구성 백혈병 세포(HL60)의 증식에 대한 효과를 거의 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다. 이러한 변이체는 별개의 수용체와 결합하는 것으로 여겨지는데, 이는 TNFR1, TNFR2, Fas, DR3, 및 DR4[참조: G.J. Mazzei et al., (1995) J. Biol. Chem. 270:7205]를 포함한, 검사된 TNF-수용체 슈퍼계열의 어떠한 구성원과도 상호반응을 일으키지 않는 것으로 인지되었기 때문이다. TNF-α 및 Fas 리간드를 포함한 몇몇 TNF 계열 구성원이 막-결합된 전구체로부터 메탈로프로테아제에 의해 활성화된 것으로 나타났다[참조: M. Tanaka et al (1991) Nat. Med. 2:317; R.A. Black et al., (1997) Nature 385:729].
실시예 6: 모세혈관-유사 관 형성의 VEGI-매개된 억제
본 검정을 이용하여 다 자란 소의 대동맥 내피(ABAE) 세포의 배양물에서 모세혈관-유사 관상 구조의 FGF-2 유도된 형성을 억제시키는 상기 절단된 VEGI-알파 폴리펩티드의 상대적인 활성을 결정한다. 랫트 꼬리 유형 I 콜라겐(Becton Dickinson Labwares, Bedford, MA) 0.7mg/ml의 0.5ml 냉각 용액을 1x DMEM을 함유하고 NaHCO3로 중성 pH로 조절시킨 각 웰에 가함으로써, 3차원 구조의 콜라겐 겔 플레이트(24웰)를 제조한다. 콜라겐 겔(약 1 내지 2mm 두께)을 형성한 후, ABAE 세포를 5 x 104세포/웰로 접종한다. 이 배양물을, 이 배양물이 컨플루언스에 도달할 때까지 L-글루타민(2mM)이 보충된 10% 송아지 혈청(HyClone, Logan, UT)을 함유하는 DMEM에서 37℃ 하에 흡습된 5% CO2배양기 내에서 유지시킨다. 이어서, 상기 배지를 FGF-2 20ng/ml를 함유하는 신선한 배지로 대체한다. ABAE 배양물에서 모세혈관-유사 관상 구조의 FGF-2-유도된 형성의 억제제로서의 VEGI-알파12-147의 효과를, 상기 배양 배지를 VEGI-알파12-1470.1, 0.3, 1, 3 또는 10㎍/ml로 보충함으로써 분석한다. 이어서, 모든 배양물을 48시간 더 37℃에서 유지시킨 다음, 찬 메탄올(-20℃)로 고정시킴으로써 중지시킨다.
ABAE 세포에 의해 형성된 모세혈관-유사 구조물의 존재비는 하마마쯔(Hamamatsu) C2400 비디오 카메라 및 자이스 악시오숍(Zeiss Axioshop) 현미경이 장착된 코트론(Kotron) IBAS 영상 분석기를 사용하여 분석한다. 이러한 모세혈관-유사 구조물의 존재비는 측정된 총 면적에 대한 빈 면적의 비율(%)로서 측정된다. 대조군으로서, 시험관내 맥관형성을 자극하기 위한 맥관형성 인자 FGF-2에 대한 EC50값은 약 5ng/ml이다. 추가의 대조군으로서, 최대 자극 효과가 FGF-2의 10ng/ml에서 관찰되었다.
실시예 7: 종양 성장의 VEGI-매개된 억제
이종이식 종양 모델을 사용하여, 맥관형성에 대한 VEGI 폴리펩티드의 잠재적 효과에 대한 생체내 분석을 수행한다. 이러한 실험상의 접근법에서는, 백만개의 사람 유방암 세포(MDA-MB-231 또는 MDA-MB-435)를 단독으로, 또는 VEGI-알파 발현성 포유류 발현 벡터로 형질감염된 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 CHO-벡터로만 형질감염된 CHO 세포와 혼합하여, 암컷 누드 마우스의 유지방 패드 내로 주사한다(마우스 당 5 x 106개 세포). 이들 실험에서 발현된 VEGI 폴리펩티드는 N-말단 22개 아미노산을 제외한 서열 2로서 제시된 폴리펩티드로 이루어졌다. 이러한 VEGI 뮤테인의 N-말단 22개 아미노산을 사람 인터루킨-6의 분비성 시그날 펩티드로 대체하였다[참조: Hirano, T., et al., Nature 324:73-76(1986)].
본 실시예에서 관찰된 VEGI 폴리펩티드의 항-맥관형성 활성은 VEGI 폴리펩티드가 종양 성장의 억제를 나타낼 수 있다는 것을 지시해준다. 암컷 무흉선 누즈 마우스의 유지방 패드 내로 이식될 때 고도로 종양발생적인 유방암 세포를 사용하여, 상기 언급된 이종이식 종양 모델을 이용하여 VEGI의 효능있는 항암 활성을 검사한다. 노던 블롯팅 분석에 의해 상기 형질감염체에서의 작제물의 전사를 확인한다. 분비된 형태의 VEGI-알파를 과발현시키는 CHO 세포의 컨디셔닝된 배지를 농축시키고, 부분적으로 정제한 결과, ABAE 세포 성장을 억제할 수 있는 것으로 밝혀진 반면, 상기 벡터-형질감염되거나 완전한 길이의 VEGI 형질감염된 CHO 세포의 것은 어떠한 효과도 나타내지 못하였다(데이타가 제시되지 않음). 사람 유방암 이종이식 모델에서 VEGI-알파의 효능있는 항암 활성을 검사하였다. 가용성 VEGI-알파-형질감염된 CHO 세포 및 사람 유방암 세포(MDA-MB-231 또는 MDA-MB-435)를 유지방 패드 내로 함께 주입하고, 이종이식 종양의 성장을 주사 후 모니터한다.
가용성 VEGI-알파 뮤테인을 과발현하는 CHO 세포는 MDA-MB-231 세포에 의해 형성된 사람 유방암 이종이식 종양의 성장에 대한 현저한 억제 효과를 나타낸 반면(도 4A), 벡터-형질감염된 CHO 세포는 종양 성장에 대한 어떠한 효과도 나타내지 못하였다. 유사하게, 누드 마우스에서의 MDA-MB-435 종양 성장에 관한 상당한 억제가 관찰되었다(도 4B). 어느 한 경우에 있어서, 완전한 길이의 VEGI-알파를 과발현시키는 CHO 세포는 유사한 실험 조건하에서 이종이식 종양의 성장에 대한 효과를 전혀 나타내지 못하였다. 이종이식 모델에서 관찰된 가용성 VEGI의 항-종양 효과는 종양 맥관계의 내피 세포에 대한 항-맥관형성 효과에 기인된 것일 수 있다.
이어서, 사람 유방암 세포 및 VEGI-알파-발현성 CHO 세포 또는 벡터-형질감염된 CHO 세포가 공동주입된 마우스를 랜덤화하고 종양을 매주 2회 측정한다. 캘리퍼를 이용하여 수직 직경을 측정함으로써 종양 크기를 평가하고 이러한 직경 측정치를 두 치수로 증대시킴으로써 산정한다. 종양을 0일에 시작하여 대략 28일에 걸쳐 대략 5일 간격으로 측정한다. 각 경우에 있어서, VEGI-알파 발현성 CHO 세포가 공동 주입된 유방암 세포로부터 발생된 종양이 벡터-단독 CHO 세포로 공동 주입된 유방암 세포로부터 발생된 종양 보다 크기가 상당히 더 작다.
이러한 사실을 근거로 하여, 본 발명자들은 VEGI가 성숙한 맥관계의 유지 또는 맥관형성 과정의 종결에 작용할 수 있는 맥관형성의 내피 세포 특이적 음성 조절제라는 것을 제안하였다. 생리학적 조건하에서의 내피 세포는 휴면 조직이며, 내피 세포의 약 1%가 증식을 진행하고 있다[참조: J. Denckamp(1990) Cancer Metas. Rev. 9:267]. 내피 세포의 휴면 유지에 기초가 되는 기전이 아직까지 명확하지 않다. 자가-제한 기전에 그 자리에서 이루어지는데, 여기서는 내피 세포가 오토크린 경로를 통하여 내피 세포 자체에 대해 작용하는 성장 억제제를 생성시키는 것으로 여겨진다. VEGI가 이러한 중요한 기전에 역할을 할 수 있다.
실시예 8: WEHI 164, ABAE 및 L929 세포 성장을 억제시키고 HL-60 세포에서 세포 유착을 유도시키는 재조합 VEGI-알파의 능력
유착성 표적 세포를 PBS에서 트립신 처리함으로써 컨플루엔트 배양물로부터 제조하고, 비-유착성 표적 세포를 정적 배양물로부터 수거한 다음, 배지로 1회 세척한다. 표적 세포를 10% FCS를 함유하는 배지 중에서 3 x 105세포/ml로 현탁시킨다. 0,1ml 등취량을 일련으로 희석된 세포 시험 샘플(WEHI 164 및 L929)을 함유하는 96웰 평저 미세역가 플레이트 내로 분산시킨다. 배양을 70시간 동안 지속시킨다. TNF-α, TNF-β 및 세균적으로 생성된 VEGI-알파를 0.5㎍/ml 농도로 가한다. 20㎕의 MTS 및 페나진 메토설페이트(PMS) 용액을 각 웰에 가함으로써 수행된 MTS 검정을 사용하여 세포독성 및 증식 활성을 정량화한다. 3시간 동안 배양한 후, ELISA 플레이트 판독기에 의해 492nm에서의 OD를 측정한다. OD492는 상기 웰에서의 생존하는 세포의 수에 비례한다. 세포독성(%)을 다음과 같이 산정한다: 세포독성(%) = (100-OD실험치/OD대조치) X 100. VEGI-알파는 짙은 라운드 세포(사멸된 세포를 지시함)로서 나타난 형태학적 변화를 유도하였다.
서열 2로서 나타낸 완전한 VEGI-알파 아미노산 서열의 아미노산 12-147로 이루어진 VEGI-알파 폴리펩티드의 절단된 형태(VEGI-알파12-147)를 또한 사용하여 내피 세포 성장에 대한 VEGI-알파의 효과를 검사한다. 다 자란 소의 대동맥 내피(ABAE) 세포를 VEGI-알파12-147로 처리하면, 이러한 ABAE 배양물에서 세포의 성장이 거의 완전히 억제되었지만, 유방암 세포주 MDA-MB-435 또는 MDA-MB-231에서의 세포는 아니다. 내피 세포의 성장을 거의 완전히 억제하는 것은 10㎍/ml VEGI-알파39-174)에서 달성되었으며, 이때 50% 최대 억제 농도치(IC50)는 대략 1㎍/ml(대략 70nM)이다.
VEGI-알파의 유착 능력을 시험하기 위하여, HL-60을 사용하고 세포 유착과 세포-세포 접촉을 현미경으로 관찰함으로써 평가하며 두명의 독립적인 연구가에 의해 주관적으로 점수를 매긴다. 이들 실험에서는, VEGI-알파가 세포 유착을 유도하는 것으로 보인다. VEGI-알파로 처리되지 않은 배양물은 배양 디쉬 전반에 걸쳐 확산된 세포를 함유하고 있다. 그러나, VEGI-알파로 처리된 배양물은 명백하게 함께 응집된 세포를 함유하고 있다.
실시예 9: 유전자 치료를 통한 발현
피부 생검 대상체로부터 섬유아세포를 수득한다. 이로써 생성된 조직을 조직-배양 배지에 놓아두고 작은 조각으로 분리시킨다. 이 조직의 작은 조각을 조직 배양 플라스크이 젖은 표면 상에 놓아두고, 대략 10조각을 각 플라스크에 놓아둔다. 이 플라스크를 위 아래로 회전시키고, 단단하게 밀폐시킨 다음 실온에서 밤새 방치시켜 둔다. 실온에서 24시간 후, 플라스크를 역위시키고 조직 조각들은 플라스크의 바닥에 고정시킨 채로 둔다. 이때, 신선한 배지(예를 들면, 10% PBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 한스 F12 배지)를 가한다. 이 배양물을 대략 1주 동안 37℃에서 배양한다. 이때, 신선한 배지를 가하고 연속적으로 매 2 내지 3일마다 변화시킨다. 2주일 동안 더 배양한 후, 섬유아세포 단층이 나타날 것이다. 이러한 단층을 트립신 처리하고 더 큰 플라스크 내로 칭량한다.
몰로니 쥐과 육종 바이러스의 긴 말단 반복물에 의해 플랭킹되는 pMV-7[참조: Kirschmeier, P.T. et al, DNA, 7:219-25 (1988)]을 Eco RI 및 HindIII로 분해하고, 연속적으로 송아지 장 포스파타제로 처리한다. 선형 벡터를 아가로즈 겔 상에서 분획화하고 유리 비이드를 사용하여 정제한다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를, 5' 및 3' 말단 서열에 각각 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. EcoRI 부위를 함유하는 5' 프라이머 및 3' 프라이머는 HindIII 부위를 포함한다. 등량의 몰로니 쥐과 육종 바이러스 선형 증축과 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편을 T4 DNA 리가제의 존재하에서 함께 가한다. 이로써 생성된 혼합물을 두 단편의 연결에 적당한 조건하에서 유지시킨다. 이 연결 혼합물을 사용하여 세균 HB101을 형질전환시킨 다음, 이를, 상기 벡터가 적절하게 삽입된 관심있는 유전자를 갖는지를 확인할 목적으로 한천-함유 카나마이신 상으로 도말한다.
암포트로픽(amphotropic) pA317 또는 GP+am12 패키징 세포를 조직 배양물에서 성장시켜 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 둘벡코 변형된 이글즈 배지(DMEM)에서 밀도를 컨플루언트시킨다. 이어서, 상기 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 상기 배지에 가하고 패키징 세포를 상기 벡터로 형질도입한다. 이때, 상기 패키징 세포는 상기 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생성시킨다(이러한 패키징 세포는 생산자 세포로서 지칭된다).
신선한 배지를 형질도입된 생산자 세포에 가하고, 연속적으로 이 배지를 컨플루언트 생산자 세포의 10cm 플레이트로부터 수거한다. 감염성 바이러스 입자를 함유하는 소모된 배지를 밀리포어 필터를 통하여 여과시켜 탈착된 생산자 세포를 제거한다. 이어서, 이 배지를 사용하여 섬유아세포 세포를 감염시킨다. 배지를 섬유아세포의 서브-컨플루언트 플레이트로부터 제거하고 생산자 세포로부터의 배지로 신속하게 대체한다. 이 배지를 제거하고 신선한 배지로 대체한다. 바이러스의 역가가 높을 경우, 실제적으로 모든 섬유아세포가 감염될 것이며 어떠한 선별도 요구되지 않는다. 이 역가가 매우 낮을 경우에는, neo 또는 his 등의 선별성 마커를 갖는 레트로바이러스성 벡터를 사용하는 것이 필요할 수 있다.
이어서, 유전공학적으로 조작된 섬유아세포를 숙주에 단독으로 주입하거나, 또는 사이토덱스 3 마이크로캐리어 비이드 상에서 컨플루언스로 성장시킨 후에 주입한다. 이때, 이러한 섬유아세포가 단백질 생성물을 생성시킨다.
실시예 10: 치킨 배아 융모요막(CAM) 맥관형성 검정
필수적으로 문헌[참조: Nguyen and colleagues, Microvasc. Res. 47:31-40(1994) and Iruela-Arispe and Dvorak, Thromb. Haemost. 78:672-677(1997)]에 기재된 바와 같이 CAM 검정을 수행한다. 이 방법은 융모요막(CAM) 상에 직접적으로 놓여진 콜라겐 겔 펠릿 내로의 새로운 모세혈관의 성장을 근거로 한 것이다. 맥관형성 인자 FGF-2(100ng) 또는 VEGF(250ng)을 콜라겐 겔 펠릿에 봉입시키고 CAM과 접촉하여 놓아둔다. 닉콘 형광 현미경을 사용함으로써 겔 펠릿을 놓아둔지 24시간 후에 겔 중에서의 맥관형성을 정량화한다. 이 영상을 CCD 소니 카메라를 사용하여 전력 PC 100 AV로 옮긴다. NH 영상 1.61 소프트웨어를 사용하여 형광 세기를 평가한다. 양성 대조군(맥관형성 인자만을 함유함)에 대한 형광 세기를 최대 맥관형성 반응으로서 간주하고, 임의로 100으로 설정한다. 이러한 검정의 다변성으로 인해, 20% 이상의 억제가 유의한 것으로 간주되었다.
FGF-2 또는 VEGI-유도된 맥관형성에 대한 VEGI-알파의 효과에 관한 실험상 결정법으로서, 세균적으로 생성된 VEGI-알파(250ng)을 FGF-2(100ng) 또는 VEGI(250ng)과 혼합하고 콜라겐 겔 펠릿에 봉입시킨다. 이 펠릿을 앞서 기재된 바와 같이 CAM과 접촉하여 둔다. VEGI-알파는 신규의 모세혈관이 콜라겐 겔 내로 성장하는 것을 현저하게 억제하였다.
본 발명의 수 많은 변형 및 변화가 상기 교시 측면에서 가능하므로, 첨부된 청구의 범위내에서, 본 발명은 특별히 언급되지 않는 한 실시될 수 있다.

Claims (33)

  1. (a) 서열 2의 아미노산 1 내지 174번을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열 2의 아미노산 23 내지 174번을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    (c) 서열 2의 아미노산 39 내지 174번을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    (d) 맥관형성 억제 활성을 지닌 (a)의 폴리펩티드의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    (e) 맥관형성 억제 활성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는, 서열 1의 보체와 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드;
    (f) 대립유전자 형태의 (a)의 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및
    (g) (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)의 상보 쇄로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  2. (a) 서열 2의 아미노산 1 내지 174번;
    (b) 서열 2의 아미노산 23 내지 174번;
    (c) 서열 2의 아미노산 39 내지 174번;
    (d) 맥관형성 억제 활성을 지닌 (a)의 아미노산 서열의 단편 및
    (e) 서열 1의 보체와 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 맥관형성 억제 활성을 지니고 있는 폴리펩티드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 분비 시그날을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  4. 세포막으로부터 제2항에 따른 폴리펩티드를 방출시킬 수 있는 프로테아제를 포함하는 맥관형성 억제제.
  5. 약제학적으로 허용되는 희석제 중에 약제학적으로 허용되는 양의 맥관 내피 세포 억제제(VEGI) 기능을 저하시키거나 없애는 항체, 약물 또는 제제를 포함하는 맥관형성 증진제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 약물 또는 제제가 VEGI RNA를 분해시킬 수 있는 리보자임인 맥관형성 증진제.
  7. 제5항에 있어서, 약물 또는 제제가 VEGI 전사 또는 해독을 저하시키거나 없애는 맥관형성 증진제.
  8. 제5항에 있어서, 약물 또는 제제가 안티센스 올리고뉴클레오티드인 맥관형성 증진제.
  9. 맥관형성의 억제에 충분한 투여량의 제1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 조성물을 사람 또는 동물에게 투여함을 포함하는, 맥관형성 억제용 치료 방법.
  10. 제9항에 있어서, 핵산 분자가 유전자 발현을 조절하는 조절 서열과 작동적으로 연결된 VEGI 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 맥관형성 억제용 치료 방법.
  11. 맥관형성을 증진시키기에 충분한 투여량의 제5항에 따른 맥관형성 증진제를 사람 또는 동물에게 투여함을 포함하는, 맥관형성 증진용 치료 방법.
  12. (ⅰ) 병리학적 맥관형성을 지닌 것으로 추정되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제2항에 따른 폴리펩티드를 인식하는 항체와 접촉시키는 단계 및
    (ⅱ) 단계 (i)에서 폴리펩티드와 항체 간에 형성된 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 병리학적 맥관형성의 진단 방법.
  13. 제12항에 따른 샘플 중에서 VEGI 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 사용하기 적합한 보조 시약과 VEGI 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는, 진단 또는 예후용 키트.
  14. (ⅰ) 병리학적 맥관형성을 지닌 것으로 추정되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드와 결합하는 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계 및
    (ⅱ) 단계 (i)에서 올리고뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 간에 형성된 이중체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 병리학적 맥관형성의 진단 방법.
  15. 제14항에 따른 샘플 중에서 VEGI 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 사용하기 적합한 보조 시약과 VEGI RNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 또는 예후용 키트.
  16. 병리학적 맥관형성을 지닌 것으로 추정되는 사람 또는 동물로부터의 샘플 중에서 VEGI 폴리뉴클레오티드의 다형성의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 병리학적 맥관형성의 진단 방법.
  17. 제16항에 있어서, 검출이 서던 하이브리드화(Southern hybridization)에 의해 이루어지는, 병리학적 맥관형성의 진단 방법.
  18. 제16항에 있어서, 검출이 VEGI 폴리뉴클레오티드를 서열분석함으로써 이루어지는, 병리학적 맥관형성의 진단 방법.
  19. 조절되지 못한 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정을 치료 또는 완화시킬 필요가 있는 사람 또는 동물에게, 약제학적으로 허용되는 양의 제1항에 따른 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 조절되지 못한 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정의 치료 또는 완화용 치료 방법.
  20. 제19항에 있어서, 핵산 분자가 유전자 발현을 조절하는 조절 서열과 작동적으로 연결된 VEGI 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조절되지 못한 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정의 치료 또는 완화용 치료 방법.
  21. 억제된 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정을 치료 또는 완화시킬 필요가 있는 사람 또는 동물에게 제5항에 따른 맥관형성 증진제를 투여하는 단계를 포함하는, 억제된 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정의 치료 또는 완화용 치료 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제제가 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 억제된 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정의 치료 또는 완화용 치료 방법.
  23. 제21항에 있어서, 진행 과정이 상처 치유인, 억제된 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정의 치료 또는 완화용 치료 방법.
  24. 제21항에 있어서, 제제가 VEGI RNA에 특이적인 리보자임인, 억제된 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정의 치료 또는 완화용 치료 방법.
  25. (ⅰ) 암을 지니는 것으로 추정되는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 제2항에 따른 폴리펩티드를 인식하는 항체와 접촉시키는 단계 및
    (ⅱ) 단계 (i)에서 폴리펩티드와 항체 간에 형성된 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 암의 검출 또는 예후 방법.
  26. 시험관내 검정에서 제2항에 따른 폴리펩티드의 항-맥관형성 활성을 증가시키는 제제 또는 약물의 능력을 측정하는 단계를 포함하는, 맥관형성 억제 활성에 대해 가능한 제제 또는 약물 시험용 시험관내 방법.
  27. 제26항에 있어서, 약물 또는 제제가 항종양 약물 또는 제제인, 맥관형성 억제 활성에 대한 제제 또는 약물 시험용 시험관내 방법.
  28. 시험관내 검정에서 제2항에 따른 폴리펩티드의 기능을 저하시키거나 없애는 제제 또는 약물의 능력을 측정함을 포함하는, 맥관형성을 증진시키는 상기 제제 또는 약물의 능력 시험용 시험관내 방법.
  29. 맥관형성을 억제하기에 충분한 투여량의 제2항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 사람 또는 동물에게 투여함을 포함하는, 맥관형성 억제용 치료 방법.
  30. 조절되지 못한 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정을 치료 또는 완화시킬 필요가 있는 사람 또는 동물에게, 약제학적으로 허용되는 양의 제2항에 따른 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 조절되지 못한 맥관형성에 의해 매개된 질환 및 진행 과정의 치료 또는 완화용 치료 방법.
  31. 암을 억제하기에 충분한 투여량의 제2항에 따른 핵산 분자를 포함하는 조성물을 사람 또는 동물에게 투여함을 포함하는, 암 치료용 치료 방법.
  32. 암을 억제하기에 충분한 투여량의 제2항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 사람 또는 동물에게 투여함을 포함하는, 암 치료용 치료 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 질환 및 진행 과정이
    (a) 모세관 확장증;
    (b) 건선 공피증;
    (c) 심근 맥관형성;
    (d) 플라그 신생혈관화;
    (e) 허혈성 지 맥관형성;
    (f) 피부 조홍;
    (g) 신생맥관 녹내장;
    (h) 당뇨병성 망막증;
    (i) 수정체 뒤의 섬유증식증;
    (j) 당뇨병성 신생혈관화;
    (k) 신생혈관화 녹내장;
    (l) 수정체 뒤의 섬유증식증;
    (m) 포도막염;
    (n) 조숙 망막증;
    (o) 퇴화성 반점;
    (p) 각막 이식체 신생혈관화;
    (q) 이식체 대 숙주 질환;
    (r) 장 염증 질환;
    (s) 골수억제 및
    (t) 재협착(restenosis)으로 이루어진 그룹 중 하나인 치료 방법.
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