CN1397641A - 表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内增殖的病毒及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一类高效表达肿瘤血管生成抑制因子的肿瘤细胞特异性增殖的病毒及其构建方法。该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，通过将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列插入肿瘤细胞内增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域，随着病毒在肿瘤细胞内复制，使编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加，从而在肿瘤细胞高效表达血管生成抑制因子，抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移。同时该病毒能在而且基本上限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。

Description

表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内增殖的病毒及其构建方法
本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，及其构建和增殖的方法。
恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该肿瘤标记是否严格限制于肿瘤细胞内。
近几年来，关于肿瘤新生血管研究取得很大进展，Folkkman的研究小组提出了在肿瘤发生和发展过程中的“血管生成开关机制”，揭示了肿瘤微血管形成的分子机制。当肿瘤的半径＜2mm时，它主要依靠扩散在细胞周围的营养物质和氧气生存。随着瘤体的增大，肿瘤本身或宿主组织将建立起新生血管网以供给瘤体营养。肿瘤新生血管网的形成取决于肿瘤周围的微环境中诱导与抑制新生血管形成的因子相互作用结果，在肿瘤的发生及转移灶形成过程中，诱导及促进新生血管形成的因子如成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板来源的内皮生长因子(PDEGF)、白细胞介素-8(IL-8)、纤溶酶原激活因子(PA)及基质金属蛋白酶(MMP)等占主导地位，而抑制新生血管形成的因子如内皮抑素(endostatin)、血管生成抑制(angiostatin)、血管内皮细胞生长抑制因子(vascularendothelial cell growth inhibitor，简写为VEGI)、胶原蛋白XV的C-末端片段的内皮抑素等基因等处于劣势。从而导致肿瘤新生血管的形成，新生血管输送肿瘤细胞快速增殖所需的营养，也使肿瘤细胞的远距离转移得已实现。抑制肿瘤新生血管的形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，从而导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，肿瘤明显萎缩乃至完全消褪。同时抑制肿瘤新生血管的形成，也达到阻断肿瘤转移的通路的目的。目前已有多种阻断肿瘤新生血管生成抑制因子进入临床试验。
肿瘤特异性增殖的病毒的根据肿瘤细胞与正常细胞某些生物学特性的差异，经过改造的病毒只能特异性地在肿瘤细胞内增殖、裂解肿瘤细胞，然后释放出病毒颗粒，再次感染其它肿瘤细胞，再次增殖、裂解，如此产生放大效应，由于病毒能够弥散到全身各个组织及脏器，因而能感染所有肿瘤细胞，从而杀灭局部及转移的肿瘤，而不影响正常细胞。
但迄今为止，尚未见到应用肿瘤特异性增殖的病毒系统高效表达血管生成抑制因子的报告。
本发明的目的在于提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其构建方法。
本发明的目的在于提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的复合物。
本发明的目的在于研究上述能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的应用。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域，该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，通过病毒在肿瘤细胞内复制增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加，从而血管生成抑制因子基因表达量增加，该肿瘤细胞内特异性增殖的病毒可以是以下任何一种：(1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；(2)病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；(3)蛋白功能缺失重组后能在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒。
上述重组病毒可以是腺病毒、单纯疱疹病毒等，编码血管生成抑制因子的核苷酸序列可以是编码内皮抑素的核苷酸序列、编码血管生成抑素的核苷酸序列等。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的构建方法，(1)将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列直接插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域；(2)病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；顺式作用元件可以是下述任何一种：(a).甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子；(b).癌胚抗原(CEA)增强子及启动子；(c).酪氨酸酶增强子及启动子；(d).ErbB2增强子及启动子；(e).ErbB3增强子及启动子；(f).ErbB4增强子及启动子；(g).DF3乳腺癌相关抗原(MUC1)增强子；(h).前列腺素特异性抗原增强子及启动子；(i).腺血管舒缓素增强子及启动子；(j).EB病毒爱泼斯坦氏-巴尔氏病毒(Epstein-Barr virus，按常规简称为EB病毒)中的Orip；(k).EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(按常规简称为FR)；(1)EB病毒BamHI C-启动子；(m).EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子；(n).EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子；(3)蛋白功能缺失重组后能在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，蛋白功能缺失可以是下述任何一种：腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失，单纯疱疹病ICP6蛋白功能缺失，单纯疱疹病ICP34.5蛋白功能缺失。
病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制，而在正常细胞不增殖及复制，主要通过以下方法实现：
(1)选择性对病毒增殖必需基因的控制：基因转录激活的调节受反式作用因子(如转录因子)与顺式作用元件相互作用的影响。当缺乏或出现某些转录因子会影响基因的转录水平。本发明应用肿瘤组织特异性激活顺式作用元件(包括启动子或增强子)控制目的基因，使该目的基因特异性在肿瘤细胞内表达，而在正常的细胞内不表达或低水平表达。应用控制肿瘤组织特异性启动子或增强子病毒增殖及复制的必需基因，从而使病毒增殖必需基因只能在肿瘤的细胞中表达，导致病毒只能在肿瘤的细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖。
本发明采用细胞专一的反应元件是由肿瘤细胞特异性激活顺式作用元件组成，其顺式作用元件可以是下述任何一种：
甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子为肝癌细胞特异性激活增强子及启动子。
癌胚抗原(CEA)增强子及启动子为胃癌及结肠癌细胞特异性激活增强子及启动子。
酪氨酸酶增强子及启动子为黑色素瘤细胞特异性激活增强子及启动子。
ErbB2增强子及启动子为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。
ErbB3增强子及启动子为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。
ErbB4增强子及启动子为乳腺癌及胃癌细胞特异性激活增强子及启动子。
DF3乳腺癌相关抗原(MUC1)增强子为乳腺癌细胞特异性激活增强子及启动子。
前列腺素特异性抗原增强子及启动子，该前列腺素特异性抗原增强子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-5322～nt-3739，启动子位于前列腺素特异性抗原起始转录位点的nt-540～nt+12，该增强子与启动子特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。
腺血管舒缓素增强子及启动子特异性激活于前列腺细胞及前列腺癌细胞。
爱泼斯坦氏-巴尔氏病毒(Epstein-Barr virus，按常规简称为EB病毒)中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子、在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。
本发明提出的在于提供一类能特异性杀灭肿瘤细胞的增殖型重组病毒，它至少有一个病毒增殖所必需的基因的肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件制。它由在病毒增殖必需基因的转录起始位点与编码起始位点之间区域插入某种顺式作用元件而构成。该顺式作用元件特异性在肿瘤细胞内激活，产生转录活性，而在正常细胞内不激活，不能产生转录活性。该顺式作用元件可以是下述顺序之一：甲胎蛋白(AFP)增强子及启动子，癌胚抗原(CEA)增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原(MUC1)增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子、EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子、在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件。上述病毒增殖所必需的为病毒早期表达基因，如单纯疱疹病毒早早期表达基因ICP4。
本发明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因：E1A、E1B、E2、E4。
(2).病毒在正常细胞复制必需而在肿瘤细胞中非必需的基因编码的蛋白功能选择性地缺失：正常细胞与肿瘤存在着某些基因表达上的差异，某些病毒在正常细胞内复制所必需的基因，在肿瘤细胞内并不需要，因此，去除这些基因编码的蛋白功能有望使在肿瘤细胞内特异性复制，而不能在正常细胞中复制。
病毒蛋白功能缺失可以是以下任何一种：腺病毒E1B 55kDa的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1B 55kDa蛋白质功能异常。腺病毒E1B 19kDa的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1B 19kDa蛋白质功能异常。腺病毒E1A的基因点突变、缺失突变、插入突变导致E1A蛋白质功能异常。单纯疱疹病毒ICP6基因点突变、缺失突变、插入突变导致ICP6的蛋白质功能异常。单纯疱疹病毒ICP34.5基因点突变、缺失突变、插入突变导致ICP34.5的蛋白质功能异常。
(3).依赖于肿瘤细胞某个信号转导途径异常而产生的病毒复制，呼吸道肠道过滤性病毒(Reovirus)感染后其早期病毒基因转录可激活双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)，而该激酶可抑制该病毒的其它基因的转录，从而使病毒不能有效复制，而当细胞中Ras处于激活状态则可抑制该激酶，从而使该病毒活跃复制。Ras基因是一个癌基因，当它被不正常激活时，即可能发生癌变。呼吸道肠道过滤性病毒复制及增殖依赖于Ras异常激活的信号途径，即在Ras高表达的肿瘤细胞内复制及增殖。
(4).选择性进入肿瘤细胞：改变它们表面的结合蛋白可使其与某些特定的肿瘤组织结合，从而使病毒只能感染特定的肿瘤组织。目前这方面改造主要集中于腺病毒外壳蛋白--纤维蛋白(Fiber)、五邻体(penton)及六邻体蛋白(hexon)，尤其在纤维蛋白中头部HI环中或C末端最常见，包括插入肿瘤膜表面具有高亲和力的某种配体、短肽及抗体Fab区域。
本发明提供一类的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码胶原蛋白XV的C-末端片段的内皮抑素的核苷酸序列。通常的内皮抑素是一个胶原蛋白XVIII的20KDa的C-末端片段，它能特异性地抑制血管内皮细胞增殖作用，而不影响其它细胞。Folkman等的实验结果表明内皮抑素对肿瘤诱导的血管生成具有强烈的抑制活性，从而抑制肿瘤的形成与转移，而且反复应用内皮抑素无抗药性产生，即使数百倍治疗剂量也无明显毒性。胶原蛋白XV的C-末端片段的内皮抑素与胶原蛋白XVIII的C-末端片段的内皮抑素一样，具有抑制新生血管的形成，由于胶原蛋白XV的C-末端片段的内皮抑素位于胶原蛋白XV的C-末端片段，故无分泌性信号肽。在基因治疗时需要加入分泌型信号肽，M-成瘤蛋白信号肽及免疫球蛋白K链信号肽均为强分泌型信号肽，在内皮抑素加入M-成瘤蛋白信号肽或免疫球蛋白K链信号肽可将内皮抑素分泌至细胞外。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码的核苷酸序列为编码干扰素诱生蛋白10的核苷酸序列。干扰素诱生蛋白10(interferon induced protein 10，简称为IP10)是趋化因子家族成员，IP10主要由单核细胞产生，部分由T细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生。IP-10对淋巴细胞如T细胞、单核细胞及NK细胞具有趋化功能。它能增强抗肿瘤免疫反应。IP10通过抑制内皮细胞分化而抑制肿瘤新生血管的生成，从而抑制肿瘤的形成。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码干扰素-γ诱生的单核因子(the monokine-induced by interferon-γ，简称为Mig)的核苷酸序列。Mig是由单核细胞产生的趋化因子，它对激活T细胞具有趋化作用，同时它具有强力抑制肿瘤新生血管形成。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管内皮生成抑制因子的核苷酸序列为编码血管可溶性内皮生长因子受体1(soluble fms-like tyrosinekinase I receptor，简称为sFLT-1)的核苷酸序列。fms-liketyrosine kinase I receptor(简称为FLT-1)是一个膜结合型血管内皮生长因子受体1。sFLT-1包留于N-末端7个免疫球蛋白样决定簇的细胞外部分，去除了膜结合区域。它能与血管内皮生长因子(简称为VEGF)结合，阻断VEGF的活性。同时，sFLT-1也可与FLT-1的膜外区形成二聚体，阻断VEGF的活性，从而抑制肿瘤新生血管的生成。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码可溶性血管生长因子受体2(soluble kinase insert domain receptor，简称为sFLK-1或sKDR)的核苷酸序列。kinase insert domainreceptor(简称为FLK-1)是一个膜结合型血管内皮生长因子受体2。sFLK-1包留于N-末端7个免疫球蛋白样决定簇中细胞外部人分，去除了膜结合区域。它能与血管内皮生长因子(简称为VEGF)结合，阻断VEGF的活性。同时，sFLK-1也可与FLK-1的膜外区形成二聚体，阻断VEGF的活性，从而抑制肿瘤新生血管的生成。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血管内皮细胞生长抑制因子(vascular endothelial cell growthinhibitor，简称为VEGI)的核苷酸序列。VEGI是肿瘤坏死因子超基因家族成员之一，它抑制内皮细胞生长，从而抑制肿瘤新生血管的形成。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码抗凝血酶III的核苷酸序列。抗凝血酶III具有抑制肿瘤新生血管的形成的作用。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码尿激酶N末端片段(简称为ATF)的核苷酸序列。ATF是尿激酶的氨酸末端片断。尿激酶通过与其受体结合诱导细胞的迁移和对细胞间质的蛋白分解作用，从而它在肿瘤侵润及转移中起重要作用。ATF通过与尿激酶受体的结合，阻断尿激酶的活性，从而抑制细胞的迁移，抑制肿瘤新生血管的形成。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列中含有编码分泌型信号肽核苷酸序列。该分泌型信号肽可以是下述中的任何一种：血管生成抑制因子自身信号肽，M-成瘤蛋白信号肽，免疫球蛋白K链信号肽。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其编码血管生成抑制因子的核苷酸序列受启动子控制。该启动子可以为以下启动子之一：猴病毒40(Simian virus40，按常规简称为SV40)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，按常规简称为RSV)LTR启动子及人巨细胞病毒(按常规简称为HCMV)IE启动子等。
本发明在上述这种修饰病毒基因组中非增殖必需区域插入编码血管生成抑制因子的核苷酸序列，本发明所述的编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为胶原蛋白XV的C-末端片段的内皮抑素、干扰素诱生蛋白10、干扰素-γ诱生的单核因子、可溶性血管生长因子受体1、可溶性血管生长因子受体2、血管内皮细胞生长抑制因子、抗凝血酶III及尿激酶N末端片段基因。随着病毒在肿瘤细胞内复制，使编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加，使肿瘤细胞高效表达血管生成抑制因子，从而抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移。同时，这种修饰后的病毒载体可被用于在某些细胞混合物中杀灭某种特殊靶细胞，通过给予修饰后的病毒能选择性地在该种靶细胞中增殖，从而使这种靶细胞被增殖的病毒选择性的杀灭；在体外培养或在动物体内通过将修饰后的病毒与细胞复合物混合，病毒只能在靶细胞增殖，也就是说除了靶细胞，其它细胞不能被这种病毒杀死。由于病毒在靶细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中的该靶细胞被杀灭，一旦靶细胞被破坏，病毒不能够再增殖。
本发明提出的高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒与化学治疗药物(如顺铂、5-氟脲嘧啶丝裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、单克隆抗体一起可以组成复合物，其作为抗肿瘤药物效果更好。与X-线联合应用可产生更为有效的抗肿瘤效应。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，用于抑制肿瘤细胞的生长。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，用于体外感染肿瘤细胞，病毒在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加及血管生成抑制因子表达量增加。
本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，可用于体内选择性地在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加及其表达量增加，抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移。同时该病毒能在而且仅限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。
本发明具有如下有益效果
1.本发明提供一类治疗肿瘤的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，动物实验证明，这种重组病毒可用于治疗肿瘤。
2.本发明提供一类高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的构建方法。该方法通常易行可用于构建高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒。
3.本发明提供一种在体内及体外杀灭肿瘤细胞、而不影响正常细胞，并在体内及体外肿瘤细胞内高效表达血管生成抑制因子，与化学抗肿瘤药物结合，更有效地杀灭肿瘤细胞，达到高效低毒应用于治疗肿瘤的目的。
人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本发明以腺病毒C亚属中的5型(Ad5)作为例证对本发明加以进一步具体说明，本发明构建手段均是现有技术人员能够实现。
例一、携带人干扰素诱生蛋白10及人可溶性血管生长因子受体1的E1区缺失的腺载体的构建
pCA13及pCA14载体购于加拿大Microbix BiosystemInc.(Toronto)，pCA13及pCA14含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信号。人干扰素诱生蛋白10(hIP10)及人可溶性血管生长因子受体-1(hsFLT-1)基因购于美国InvivoGen公司，人干扰素诱生蛋白10(hIP10)基因来源于美国InvivoGen公司质粒pBLAST hIP10v.11及人可溶性血管生长因子受体1(hsFLT-1)来源于美国InvivoGen公司质粒pBLAST49-hFLTls7v20。
将pBLAST hIP10v.11质粒用SgrAI+Nhe I双酶切，得含人干扰素诱生蛋白10(hIP10)基因的318bp片段，将其定向插入pUC19质粒(购于美国ATCC公司)的Xma I及Xba I位点，命名为pUC19-hIP10。应用EcoR I+Sal I双酶切pUC19-hIP10，获得含有人IP10基因的332bp片段，将其定向插入pCA14质粒EcoR I+Sal I酶切位点中，命名pCA14-hIP10。
应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增人可溶性血管生长因子受体1(hsFLT-1)基因，以质粒pBLAST49-hFLTls7 v20为模板进行PCR，
引物1(含EcoR I酶切位点5’-hsFLT-1引物)：CCG GAA TTC ACC ATGGTC AGC TAC TGG GAC
引物2(含BamH I酶切位点3’-hsFLT-1引物)：AAT GGA TCC CTA CACAGA GCC CTT CTG GTT C
Primer1与primer2进行PCR扩增，回收2240bp片段，应用EcoRI+BamH I酶切，将该基因插入pUC19载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果表明人hsFLT-1基因正确，命名为pUC19-hsFLT-1。应用EcoR I+BamH I双酶切，获得含有mIFN-γ基因的2230bp片段，将其定向插入pCA13质粒EcoR I+BamH I酶切位点中，命名pCA13-hsFLT-1。例二、腺病毒Elb 55Kda蛋白基因部分缺失及在缺失区插入终止密码子载体的构建
pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。应用内切酶Bgl II将该载体在3329bp中切开，然后用内切酶Hind III再作部分酶切，回收9372bp DNA片段，应用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段对3’凹端补平，即为pXC.1载体中缺失2809bp-3329bp区域(具体方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)。
合成两个DNA寡核苷酸片段做一个连接头，其DNA寡核苷酸序列为
primer3  TAATGAGTAACTAA
primer4 TTAGTTACTCATTA
将两个DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃变性5分钟，然后缓慢降温复性，复性后应用T4噬菌体多核苷酸激酸进行磷酸化。将该磷酸化后的连接头与缺失2809-3329bp区域的pXC.1载体片段进行连接，命名为pXC-del Elb(方法参见分子克隆实验指南，科学出版社1992出版)。在插入连接头两端附近位置中合成引物，分别为
primer 5 CTG GCC AAT ACC AAC CTT A
primer 6 ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC
对pXC-del Elb进行聚合酶链式反应(PCR)进行体外扩增(方法参见分子克隆实验指南，科学出版社1992出版)，其PCR产物进行测序。结果显示：CTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTAATGAGTAACTAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCGGTAAACTATTAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGAGGAGCTGAGGCCCGATCACTTGGTGCTGGCCTGCACCCGCGCTGAGTTTGGCTCTAGCGATGAAGATACAGATTGAGGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATAT，这表明pXC-del Elb为pXC.1载体中缺失了2809-3329区域并在该区域中插入TAATGAGTAACTAA，并在两个终止密码子后保留了Bgl II酶切位点。例三、携带人干扰素诱生蛋白10及人可溶性血管生长因子受体1的的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒载体的构建
应用Bgl II分别酶切pCA14-hIP10及pCA13-hsFLT-1，分别回收904bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人干扰素诱生蛋白10及SV40poly A加尾信号)及2799bp((人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、可溶性血管生长因子受体11及SV40poly A加尾信号)，将其插入pXC-del Elb Bgl II酶切位点。
应用PCR技术分别验证其插入的正方向：其Bgl II上游引物primer5：CTG GCC AAT ACC AAC CTT A，分别与携带人干扰素诱生蛋白10(hIP10)及人可溶性血管生长因子受体1(hsFLT-1)3’-primer进行扩增
引物7(3’-hIP10引物)：TTA AGG AGA TCT TTT AGA CC
引物8(3’-hsFLT-1引物)：CTA CAC AGA GCC CTT CTG GTT C
其PCR扩增长度分别为796bp及2691bp。表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子+人干扰素诱生蛋白10+SV40 poly A加尾信号及人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子+人可溶性血管生长因子受体1+SV40poly A加尾信号正向插入pXC-del Elb Bgl II酶切位点，分别命名为pXC-del Elb-hIP10及pXC-del Elb-hsFLT-1。例四、携带人干扰素诱生蛋白10及人可溶性血管生长因子受体1的的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒的重组
El转化人胚胎肾细胞株293细胞株购于加拿大MicrobixBiosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒El区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pXC-del Elb-hIP10及pXC-del Elb-hsFLT-1分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3或pBHG10通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。pBHG10及pBHGE3购于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，pBHG10含有5型腺病毒右臂，但缺失E3区；pBHGE3含有5型腺病毒右臂，含有E3区。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，该腺病毒命名为CNHK200-hIP10及CNHK200-hsFLT-1，具体方法参见Gene Transfer and Expression Protocols，Murray EJ主编，Humana Press 1991出版。
病毒的产生及基因组结构
重组腺病毒方法参见例一内容。其名称见下
病毒            名称         含Ad5左臂质粒   含Ad5右臂质粒Ad5-delElb-                     PXC-delElb-
            CNHK200-hIP10                        PBHGE3hIP10                            hIP10Ad5-del Elb-                    PXC-del Elb-
            CNHK200-hsFLT-1                      PBHGl0hsFLT-1                         hsFLT-1
腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主编，Humana Press 1991出版)。Ad5-del Elb-hIP10(CNHK200-hIP10)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(Elb55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后Bgl II酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人IP10及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
Ad5-del Elb-bsFLT-1(CNHK200-hsFLT-1)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(Elb 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，并在终止密码子后Bgl II酶切位点中正向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人sFLT-1及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。例五、携带人干扰素诱生蛋白10及人可溶性血管生长因子受体1的的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒的腺病毒体外肿瘤细胞复制、增殖并高效表达人干扰素诱生蛋白10及人可溶性血管生长因子受体1，并在体外特异性杀灭肿瘤细胞
将CNHK200-hIP10及CNHK200-hsFLT-1分别感染肝癌细胞株Hep3B、293及正常人成纤维细胞，细胞按2×105/孔接种6孔板，分别感染重组腺病毒CNHK200-hIFN-α、CNHK200-mIFN-α、CNHK200-hIFN-β、CNHK200-mIFN-β、CNHK200-hIFN-γ、CNHK-mIFN-γ及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小时后应用293细胞株测定其病毒滴度，具体方法参见前述文献2，结果为：
                                   正常成纤维细
               293       Hep3B
                                        胞野生型5型腺病毒    1×105   7×104       5×104CNHK200-hIP10      1×105   5×104       2×10CNHK200-hsFLT-1    1×105   3×104       1.5×10
将肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒CNHK200-hIP10及CNHK200-hsFLT-1，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Blood mini kit(德国QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。应用Nhe I和Xho I双酶切，用0.8％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P标记人5型腺病毒1178bp BstXI加Xho I片段(位于腺病毒nt4611-5789)，进行souther blot杂交，以pXC.1作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHK200-hIP10及CNHK200-hsFLT-1在肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为3×104、2×104及＜10、＜10。
将上述CNHK200-hIP10及CNHK200-hsFLT-1提取的DNA分别应用Bgl II酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人干扰素诱生蛋白10(hIP10)及人可溶性血管生长因子受体1(hsFLT-1)的cDNA片段作为探针，进行souther blot杂交，以pCA14-hIP10或pCA13-hsFLT-1作为病毒拷贝数对照(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，CNHK200-hIP10及CNHK200-hsFLT-1在肝癌细胞株Hep3B及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为3×104、2×104及、＜10。例七、携带CNHK200-hIP10及CNHK200-hsFLT-1的Elb 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒载体在裸鼠体内治疗移植肿瘤的任用。
将4-5周龄的SCID小鼠皮下接种肝癌细胞株Hep 3B细胞1×107，两周后给予1×109pfu CNHK200-hIP10及CNHK200-hsFLT-1或用相同剂量的对照腺病毒Ad5-Lac Z，其未治疗组及对照腺病毒治疗组4周后肿瘤体增加4倍以上，而治疗组则肿瘤明显缩小，部分肿瘤完全消失。

Claims (27)

1.一种能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域，该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，通过病毒在肿瘤细胞内复制增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加，从而血管生成抑制因子基因表达量增加，该肿瘤细胞内特异性增殖的病毒可以是以下任何一种：
(1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；
(2)病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；
(3)蛋白功能缺失重组后能在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒。
2.根据权利要求1所述能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的构建方法，其特征在于：
(1)将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列直接插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域；
(2)病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；顺式作用元件可以是下述任何一种：(a).甲胎蛋白增强子及启动子；(b).癌胚抗原增强子及启动子；(c).酪氨酸酶增强子及启动子；(d).ErbB2增强子及启动子；(e).ErbB3增强子及启动子；(f).ErbB4增强子及启动子；(g).DF3乳腺癌相关抗原增强子；(h).前列腺素特异性抗原增强子及启动子；(i).腺血管舒缓素增强子及启动子；(j).EB病毒中的Orip；(k).EB病毒Orip中的FR增强子；(1).EB病毒BamHI C-启动子；(m).EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子；(n).EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子；
(3)蛋白功能缺失重组后能在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒；蛋白功能缺失可以是下述任何一种：腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失，单纯疱疹病毒ICP6蛋白功能缺失，单纯疱疹病毒ICP34.5蛋白功能缺失。
3.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于它由要病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域插入某种肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件构成，该种顺式作用元件可以是下述任何一种：甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增强子，EB病毒BamHI C-启动子，EB病毒中的Orip联合EB病毒BamHI C-启动子，EB病毒Orip中的FR联合单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本启动子或SV40基本启动子，在EB病毒感染或潜伏感染细胞中特异性激活的顺式作用元件，病毒增殖必需基因为病毒早期基因。
4.根据权利要求3所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，该腺病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因：E1A、E1B、E2、E4。
5.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒时，该腺病毒E1B55Kda通过基因点突变、缺失突变及插入突变导致E1B55Kda蛋白功能缺失。
6.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒时，该腺病毒E1B19Kda通过基因点突变、缺失突变及插入突变导致E1B19Kda蛋白功能缺失。
7.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒时，该腺病毒E1A通过基因点突变、缺失突变及插入突变导致E1A蛋白功能缺失。
8.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是单纯疱疹病毒时，该单纯疱疹病中ICP6基因点突变、缺失突变及插入突变导致ICP6蛋白功能缺失。
9.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是单纯疱疹病毒时，该单纯疱疹病毒中双拷贝ICP34.5基因点突变、缺失突变及插入突变导致ICP34.5蛋白功能缺失。
10.根据权利要1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码胶原蛋白XV的C-末端片段的内皮抑素的核苷酸序列。
11.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码干扰素诱生蛋白10的核苷酸序列。
12.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码干扰素-γ诱生的单核因子的核苷酸序列。
13.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码可溶性血管内皮生长因子受体1的核苷酸序列。
14.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码可溶性血管内皮生长因子受体2的核苷酸序列。
15.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码血管内皮细胞生长抑制因子的核苷酸序列。
16.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码抗凝血酶III的核苷酸序列。
17.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列为编码尿激酶N末端片段的核苷酸序列。
18.一种能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于编码血管生成抑制因子的核苷酸序列中含有编码分泌型信号肽核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述分泌型信号肽，其特征在于该分泌型信号肽可以是下述中的一种：血管生成抑制因子自身信号肽，M-成瘤蛋白信号肽，免疫球蛋白K链信号肽。
20.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于所述编码血管生成抑制因子的核苷酸序列受启动子控制。
21.根据权利要求20所述的启动子，其特征在于所述启动子为SV40启动子。
22.根据权利要求20所述的启动子，其特征在于所述启动子为RSVLTR启动子。
23.根据权利要求20所述的启动子，其特征在于所述启动子为人巨细胞病毒IE启动子。
24.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于该病毒与化学抗肿瘤药物组成复合物。
25.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于将该重组病毒用于抑制肿瘤细胞的生长
26.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的应用，其特征在于将该重组病毒用于体外感染肿瘤细胞，病毒在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加及血管生成抑制因子表达量增加。
27.根据权利要求1所述的能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，其特征在于将该重组病毒用于体内选择性地在肿瘤细胞内复制及增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加及其表达量增加，抑制肿瘤血管的形成，抑制肿瘤形成、生长及转移，同时该病毒能在而且基本上限于肿瘤细胞内增殖，也能特异性直接杀灭肿瘤细胞。
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