CN1297479A - 含有纤维置换蛋白的修饰的腺病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供修饰重组腺病毒载体嗜性的方法,通过基因方法改变腺病毒纤维细胞—结合蛋白,同时保留天然三聚蛋白生物合成的特性。本发明还提供通过用基因方法改变腺病毒纤维细胞—结合蛋白,从而特异性靶向特定细胞类型,以便被被重组腺病毒载体感染的方法。

Description

含有纤维置换蛋白的修饰的腺病毒
发明背景
与相关申请的相互参照
本申请申明，享有于1998年2月17日申请的U.S.临时申请No.60/074,844(现已放弃)的权益。
联邦资助说明
本发明的完成部分使用了国立卫生研究院的联邦资金。因此联邦政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明总的涉及载体生物学和基因治疗领域。更具体地说，本发明涉及含有纤维替代的重组腺病毒载体的产生，该载体可用于细胞特异性靶向并伴随其内源嗜性的消除。
相关领域的描述
腺病毒与真核细胞的相互作用是通过其突出于二十面体壳体的十二个顶点的纤维蛋白结部位中结构域(21-23)的特异性受体的识别。重组腺病毒载体可用于各种基因治疗应用中(21,35,38)。这主要是由于这种载体在体外和体内能实现高水平的基因转移。
重组腺病毒性载体与其它可用系统的区别，在于其独特的完成原位基因递送到各种器官分化的靶细胞的能力(5,6,9,10,12,20,25,27,29,31)。这使得重组腺病毒载体可用于治疗先天遗传病(如囊性纤维化)由此递送的载体可以含在靶器官中(4-13)。另外，腺病毒载体实现原位肿瘤转导的能力，已使人们开发了各种用于局部性疾病治疗的抗癌基因疗法(14-18)。
在静脉注射后，腺病毒载体可以将基因递送到体内各种器官中。在这些例子中，基因转移的频率足够高，在各种小鼠模型中可以纠正遗传性代谢异常。因此，腺病毒载体满足了基因治疗中静脉给药载体的两项要求：即全身稳定性和实现高效转导肌细胞后基因长期表达的能力。
然而腺病毒的缺点是，除了所需靶向的特异性细胞类型外，腺病毒的细胞受体分布广泛。腺病毒载体缺乏嗜性将导致转导效力的降低，而与非靶细胞的结合将减少递送到靶细胞的病毒粒子的数量。另外，这将引起被传递基因的异位表达，具有未知的和可能有害的后果。所以，必需发展一种方法使腺病毒载体的嗜性重新特异性定向到靶细胞并只允需将基因递送到受影响的器官。
为了这一目的，一些研究小组报道了遗传修饰腺病毒纤维蛋白的结区域，并将这种嵌合纤维掺入到病毒粒子中。例如，Stevenson等人(35)和其他人(24)报道成功地生成了Ad5病毒，它包含有Ad5纤维的尾部和轴区域及Ad3的结区域组成的纤维。另外，Michael等人(30)描述了将胃泌素释放肽掺入到重组Ad5纤维的羧基末端。这一发现还被Legrand等人(30a)进一步扩大，他们拯救(rescue)了含有这种纤维的重组腺病毒载体。Wickham等人(41)描述了含有羧基末端聚赖氨酸序列的重组腺病毒的生成。这些研究对这种遗传方法的可行性起了关键作用，但也显示有不少限制因素，包括将破坏纤维蛋白正确折叠的配体的体积大小。
以前本领域缺少有效的手段来产生具有新的靶向和除去了天然嗜性的重组腺病毒载体。本发明完成了本领域这一长期的需求和愿望。
发明概述
本发明描述了下一代的重组的细胞特异性腺病毒载体。更具体地说，对于腺病毒嗜性的修饰包括如下两方面：(1)内源嗜性的去除；和(2)引入新嗜性。为了扩大重组腺病毒在基因治疗中的应用，需要改变腺病毒载体的天然嗜性来实现细胞特异性转导的方法。为了实现这种靶向，可以将配体掺入到腺病毒纤维蛋白中，该蛋白介导了腺病毒与其细胞表面受体的初级结合。如本文所描述的，本发明公开了通过置换腺病毒纤维蛋白创造出一种靶向腺病毒。本发明公开的重组腺病毒载体包括由纤维尾部功能域、细菌嗜菌体T4的纤蛋白(fibritin)基因部分和配体功能域组成的纤维置换或取代蛋白。此重组腺病毒载体可以编码治疗基因，如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，在存在9-(1,3-二羟-2丙氧甲基)鸟嘌呤时，此腺病毒能够介导特异性杀死表达靶受体的细胞。本发明因此提供了通过非腺病毒细胞(天然)受体使重组腺病毒载体重新靶向的证据。
在本发明的一个实施例中，提供了一种具有新的嗜性而无内源病毒嗜性的重组腺病毒载体，其中该腺病毒载体被修饰后产生一种置换的腺病毒纤维蛋白从而修饰了病毒的嗜性，该实施例中被置换的纤维蛋白包含了腺病毒纤维基因(包括尾功能域)的氨基端部分、T4嗜菌体纤维蛋白基因的羧基端部分和配体，其中被置换的腺病毒纤维保留了其三聚化的能力和其天然生物合成的特性，其中的配体选自生理配体，抗一受体抗体和细胞特异性肽，此腺病毒载体还含有治疗基因，其中所述的治疗基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。
本发明的另一个实施例中，提供了在需要杀死肿瘤治疗的个体中杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括：给予所述个体有效量的重组腺病毒载体进行预治疗和给予所述个体9-(1,3-二羟-2丙氧甲基)鸟嘌呤的步骤。
本发明其它的方面、特点和优点可从以下提供的本发明最佳实施例中看出。
附图简要说明
为了使上述的本发明的特征，优点以及发明目的更清楚，在细节上更明白和易接受，附图将对上文中简单归纳的内容和将在实施例中具体化的部分作图解说明。这些图是说明书的一个组成部分。需要指出的是，附图是用来说明本发明的实施例的，不能视为对本发明范围的限制。
图1显示了由纤维-纤蛋白-6-His嵌合体组成的取代纤维的模式。
图2显示了大肠杆菌表达的纤维-纤蛋白-6-His嵌合体蛋白的SDS凝胶电泳图。蛋白在4-10％SDS-PAA凝胶上分离，然后用考马斯亮蓝染色。泳道1，煮沸变性的纤维-纤蛋白-6-His；泳道2，纤维-纤蛋白-6-His天然三聚体；泳道3，蛋白质分子量标准
发明详述
本发明涉及一种腺病毒，该腺病毒通过用一种纤维置换蛋白置换腺病毒的纤维蛋白而被修饰。在一实施例中，该纤维置换蛋白包括：a)包含腺病毒纤维尾功能域的氨基端部分；b)嵌合性纤维置换蛋白；和c)包含靶向配体的羧基端部分。
以下的描述可以让本领域的普通技术人员确定假定的纤维置换蛋白是否具有如本发明的组份和方法中所需要的功能。一般来说，此纤维置换蛋白与腺病毒的五邻体碱基缔合。在结构上，此纤维置换蛋白宜是棒状的三聚体蛋白。这种棒状三聚体蛋白的直径理想的是与野生型腺病毒天然纤维蛋白相当。重要的是，当编码靶向配体的序列掺入到羧基端时，该纤维置换蛋白保持了三聚化(trimerism)。纤维置换蛋白的典型例子是T4细菌嗜菌体纤蛋白。更广泛地讲此纤维置换蛋白可选自三聚结构性蛋白质，三聚病毒蛋白和三聚转录因子。纤维置换蛋白的另一典型例子包括异亮氨酸三聚化基序和人肺表面活性剂D的颈区域肽。更好的是，纤维置换蛋白有卷曲螺旋二级结构。由于多重链间的相互作用，为此二级结构提供了稳定性。
纤维置换蛋白不一定是天然蛋白。事实上，本领域的普通技术人员能够构造出一种人造蛋白。优选的是，这种人造纤维置换蛋白具有卷曲螺旋结构。
本发明腺病毒中的靶向配体选自生理配体，抗受体抗体，细胞特异性肽和单链抗体。在一个实施例中，腺病毒在其基因组中携带治疗基因。这种治疗基因典型例子是单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。
本发明还涉及一种在需要杀死肿瘤治疗的个体中杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括：给予所述个体有效量的本发明重组腺病毒进行预治疗和给予所述个体9-(1,3-二羟-2丙氧甲基)鸟嘌呤的步骤。
先前修饰Ad5纤维所得的结果提示天然纤维蛋白的三聚结构不是足够稳定到能容纳长的插入物而且该分子不能承受大配体的掺入。纤维结看来是保持纤维三聚结构的主要(或唯一)结构成份，而该分子的其余部分只是“被动”地服从由纤维结引发的三聚化过程。为了创造出具有新嗜性而无内源纤维嗜性的重组病毒粒子，我们可以“劈开”腺病毒纤维的功能，这通常可在结区域用两个不同蛋白分子置换该结来完成。可以这样置换掉结：用外源三聚化基序来置换结以维持无结纤维的三聚化，同时在纤维中引入能够将病毒粒子靶向新受体的配体。
由于纤维的作用假定是使细胞结合位点远离病毒粒子表面，故纤维可以用另外的棒状三聚蛋白替换。除了三聚外，该蛋白应具有与腺病毒五邻体碱基缔合和掺入到病毒粒子中的能力。为了防止不相容性问题，可将嵌合蛋白氨基端加入到腺病毒纤维的尾功能域中。另外，假定的纤维置换蛋白应能承受(相关的)相应于靶向配体的大的附加序列掺入到其羧基端。
嗜菌体T4的纤蛋白是形成嗜菌体颗粒“颈部”和“颈须”的蛋白，并且符合了上述讨论的许多标准。纤蛋白486氨基酸序列由如下组成：氨基端区域(47残基)，一个大的中央区域和羧基端区域(29残基)。中央区域有12个长度不同的片段，每个都具有α-螺旋的卷曲螺旋结构。广泛的生物物理和序列分析将纤蛋白模型描述为平行三链的卷曲螺旋型α螺旋。在温度高达65℃时纤蛋白的三聚体也是稳定的。显然，在氨基端缺少残基的纤蛋白和含有氨基端突出的重组纤蛋白都正确装配到三聚体中。纤蛋白的羧基端区域对三聚化是必需的，且纤蛋白的羧基端与Ad5纤维结形成的融合稳定了三聚体。另外，在大肠杆菌中过度表达的重组纤蛋白和其衍生物是可溶的。纤蛋白的另一特征是可屈曲性的，这使它成为纤维置换的有吸引力的候选物。所以，纤蛋白轻易地符合了由纤维性质所确定的长度要求，类似于牛Ad3和CELO病毒的可屈曲纤维。
定义
根据本发明，可采用本领域技能中的常规分子生物学，微生物学，和DNA重组技术。这些技术在文献中有充分说明，如参见Maniatis & Sambrook,Fritsch,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；"DNA Cloning:APractical Approach，"卷Ⅰ和Ⅱ(D.N.Glover ed.1985)；"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait ed.1984)；"Nucleic Acid Hybridization"[B.D.Hames& S.J.Higgins eds.(1985)]；"Transcription and Translation"[B.D.Hames& S.J.Higgins eds.(1984)]；"Animal Cell Culture"[R.I.Freshney,ed.(1986)]；"Immobilized Cells And Enzymes"[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,"A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984)。因此，如果出现于本文下列术语的定义如下。
“DNA分子”指脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶)的聚合形式，以其单链形式或双链螺旋形式。这一术语只指分子的一级和二级结构，不限制它的任何具体三级形式。所以，本术语包括特别是在线型DNA分子(如，限制片段)，病毒，质粒和染色体中发现的双链DNA。这里讨论的结构，按常例给出的只是DNA非转录链的5‘到3’方向的序列(即，具有与mRNA同源序列的链)。
“载体”指一种复制子，如质粒，嗜菌体或粘粒，它们可以结合另一DNA片段，从而产生所结合片段的复制。“复制子”是一种基因元件(如，质粒，染色体，病毒)，其功能为体内DNA复制的自主单元，如能在其自身控制下复制。“复制起点”指参与DNA合成的DNA序列。“表达控制序列”是控制和调节转录和翻译另一DNA序列的DNA序列。编码序列是细胞中当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时，与转录和翻译控制序列操作性连接并在它们的控制下，被翻译成编码序列所编码的蛋白。
通常，采用含有启动子序列的表达载体来促进与宿主连接的插入的DNA片段有效转录和翻译。表达载体通常包括复制起点，启动子，终止子，以及有能力在转化细胞中提供表型选择的特殊基因。被转化的宿主可以按本领域已知的方法发酵和培养，以达到最佳细胞生长。
DNA“编码序列”是当置于适当的调节序列控制下，能体内转录和翻译为多肽的双链DNA序列。编码序列的边界在5‘(氨基)端为起始密码子，在3’(羧基)端为翻译终止子。一个编码序列可以包括，但不限制于，原核序列，真核mRNA的cDNA，真核(如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成的DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止子序列通常位于编码序列的3‘端。“cDNA”指的是拷贝-DNA或互补-DNA，它是mRNA转录物的反转录反应产物。
转录和翻译的控制序列是DNA的调节序列，如启动子，增强子，聚腺苷酸化信号，终止子等，它们提供编码序列在宿主细胞中的表达。“顺式元件”是一种核苷酸序列，也被称为“共有序列”或“基序”，它可与那些能上调和下调特定基因位点表达的蛋白相互作用。“信号序列”也可以包括在编码序列中。这个序列编码位于多肽N-端的一种信号肽，其与宿主细胞联系并且将该多肽引向合适的细胞内位置。已发现信号序列可与许多原核和真核生物的天然蛋白相结合。
“启动子序列”是一种DNA调节区域，能在细胞内结合RNA聚合酶和引发下游(3’向)编码序列的转录。本发明定义，启动子序列其3’端为转录的起始位点并向上游(5’)方向延伸包括最小数量的引发可检测水平(高于背景)的转录所必需的碱基和元件。在启动子序列中，可找到转录起始位点和负责与RNA聚合酶结合的蛋白结合区域(共有序列)。真核启动子经常，但并非总是，含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除了-10和-35共有序列外，还含有SD(Shine-Dalgarno)序列。
术语“寡核苷酸”指的是一种由两个或更多(最好三个以上)脱氧核糖核苷酸组成的分子。它的确切大小由很多因素决定，取决于该寡核苷酸的最终功能和用处。本文用的术语“引物”指一种寡核苷酸，不论是以限制性酶消化的纯化天然寡核苷酸，还是合成产生的寡核苷酸，当其被置于引物延伸产物的合成条件下，如存在核苷酸和诱导剂如DNA多聚酶和适当的温度及pH时，可以作为引发合成的点，而所诱导的引物延伸产物与核苷酸链是互补的。引物可以是单链的也可以是双链的，但必须足够长使能在诱导剂存在时引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡聚核苷酸引物通常包含15-25或更多的核苷酸，虽然它也可以包含更少的核苷酸。
本文所选引物须与特定的靶DNA序列的不同链基本互补。这意味，引物必须与它们各自的链充分的互补性杂交。因此，引物序列无需反映模板的确切序列。例如，一段非互补核苷酸片段可附着于引物的5’端，而引物序列的其余部分与此链互补。另外，只要引物序列和与之杂交的序列足够互补时，非互补碱基或更长的序列可散布在引物中，这样形成了延伸产物合成的模板。
本文所用的术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指能在一特定核苷酸序列上或附近切割双链DNA的酶。
“DNA重组技术”指合并两个异源DNA分子的技术，通常这是体外连接不同生物体DNA的结果。重组DNA分子通常用基因工程实验生成。同义的术语包括“基因拼接”，“分子克隆”和“基因工程”。这些操作的产物是“重组体”或“重组分子”。
当这种DNA被引入到细胞内时，细胞就被外来或异源DNA“转化”或“转染”了。转化DNA可能或没有被整合(共价连接)到细胞的基因组中。例如在原核生物，酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可能被维持在游离型元件如载体或质粒上。对于真核细胞来说，稳定转化的细胞是转化的DNA已整合到染色体中的细胞，这样通过染色体的复制将遗传给子代细胞。这种稳定性的证据是该真核细胞能够建立由含转化DNA的子代细胞群组成的细胞系和克隆。“克隆”是由一个细胞或有丝分裂祖先衍生的一群细胞。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的一个原代细胞的克隆。一种生物，如植物或动物，用外源DNA转化后称为“转基因的”生物。
本文用的术语“宿主”不仅包括原核生物，也包括真核生物如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可以包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.tymphimurium)、灵杆菌(Serratiamarcesens)、和枯草杆菌(Bacillussubtilis)。真核宿主包括酵母如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、哺乳动物细胞和昆虫细胞，以及植物细胞如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Tobaccum nicotiana)。
当确定长度的两个DNA序列中的核苷酸有至少75％(较好的是80％，最好的是90％或95％)是配对的，则这两个DNA序列是“基本同源”的。序列的基本同源可通过用序列数据库的标准软件或Southern杂交实验，例如在为特殊系统所确定的严谨条件下，进行序列比较来鉴定。明确适合的杂交条件在本领域技术人员的能力之内见如Maniatis er al.，同上；DNA Cloning,Vols.Ⅰ&Ⅱ，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
DNA结构中的“异源”区域是在较大的DNA分子中天然不能与该较大DNA分子缔合的一段区域。因此，当该异源区域编码一哺乳动物基因时，该基因往往侧接了在来源生物基因组中不会侧接的哺乳动物基因组的DNA。另一例子为，该编码序列其自身在自然中是没有的(如，cDNA中的基因组编码序列包括内含子，或合成序列中包含了与自然基因不同的密码子)。等位(基因)变异或天然发生的突变并不产生本文所说DNA的异源区域。
另外，本发明还包括纤维或纤蛋白基因的一部分或片段。本文的“片段”或“部分”指一个基因或一个多肽，长度上通常至少10个残基，较好的是至少20个残基，最好的是至少30个残基(如50个)，但必须少于全部完整的序列。这些基因片段可用本领域技术人员所知的方法制得，例如通过天然存在的纤维基因或重组纤维基因或纤蛋白基因的限制性消化，通过用编码纤维或纤蛋白确定片段的载体的DNA重组技术，或通过化学合成来制得。
本文的“嵌合体”或“嵌合的”指具有多种组份的一个转录单元，常常但并非必需来自于不同的生物。本文所用“嵌合的”指串联排列的编码序列(这里通常指编码腺病毒纤维的基因)，其被基因工程改造成拥有各编码序列功能或活力相应区域的蛋白。
嵌合纤维蛋白的“天然生物合成特征”这里指呈现正确的三聚化、与腺病毒粒子衣壳适当缔合、配体结合其目标的能力、等。用本文所述的方法可以评价一种候选嵌合纤维-纤蛋白-配体蛋白片段显示天然生物合成特征的能力。
按照本领域普通技术人员所公知的常规Northern杂交技术，可采用标准Nothern印迹试验来确定细胞或组织中的mRNA的相对量。另外，按照本领域普通技术人员所公知的常规Southern杂交技术，可采用标准Southern印迹试验来确认兴趣基因的存在和拷贝量。Northern印迹和Southern印迹都用到了杂交探针，即放射性标记的cDNA，或至少20(较好的是至少30，更好的是至少50，最好的是至少100)个连续核苷酸长度的寡核苷酸。DNA杂交的探针可以用本领域普通技术人员所公知的许多不同方法中的一种来标记。
这些研究中最常用的标记物是放射性元素、酶、暴露在紫外光下能发荧光的化学剂，等。已知有许多的荧光材料可用于标记。它们包括，如，荧光素、罗丹明、金胺、得克萨斯红(Texas Red)、AMCA蓝和荧光黄。一种特殊的探测物质为山羊中制得的通过异硫氰酸盐与荧光素交联的抗-兔抗体。蛋白质可用放射性元素或酶标记。放射性标记可用目前能得到的计数方法检测。较佳同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
酶标记也同样有用，可用比色、分光光度计、荧光分光光度计、电流计或气体计量技术来测定。通过与桥连分子(如碳二亚胺、二异氰酸盐、戊二醛等)反应使酶与所选择的粒子交联。许多可用于这种方法的酶已经知道并采用了。较佳的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶和过氧化酶及碱性磷酸酶。美国专利NO.3,654,090、3,850,752和4,016,043里还公开了其它的标记物质和方法。
本文所用的术语“纤维基因”和“纤维”指编码腺病毒纤维蛋白的基因。本文所用的“嵌合纤维蛋白”指上述定义的修饰过的纤维基因。
本文所用的术语“生理配体”指细胞表面受体的配体。
本发明涉及一种载体系统，该系统提供高效和特异性靶向的腺病毒载体，用于给药后体内基因递送给上述定义的细胞类型。本发明的重组腺病毒载体中，纤维置换蛋白包含一种纤维-纤蛋白-配体，其用于基因治疗中将腺病毒载体靶向特异性细胞。这可以通过构建含有纤维-纤蛋白-配体嵌合体的腺病毒载体得到实现。这些腺病毒载体能够高效特异性将基因产物递送给表达受体的细胞，这些受体能识别纤维-纤蛋白-配体嵌合体的配体组份。本领域的普通技术人员可以认识到可以开发出各种各样的编码，例如受体的配体或抗体片段的基因，这些配体或抗体片段能特异性识别所靶向的特定细胞类型的独一无二的细胞表面蛋白。
“纤维置换蛋白”是一种替代纤维且具有3种基本特征的蛋白，这些特征为：象纤维一样三聚化，缺乏腺病毒嗜性和具有新的嗜性。
给出以下的实施例目的为说明本发明的各种具体实施方案，对本发明没有任何形式的限制。
实施例1
实验设计
为了证明纤蛋白可用于置换重组Ad5病毒颗粒中的纤维，采用了如下实验策略。首先，设计一种嵌合的纤维-纤蛋白的基因，该基因编码：纤维尾部，纤维轴区域第一和第二基序，以及与纤蛋白一节能融合的纤维结结构域。在该构建物中，纤蛋白编码序列置换了大部分纤维轴编码序列。所以这种重组基因编码的嵌合蛋白类似于Ad5纤维蛋白，其中几乎所有的轴区域均被纤蛋白所置换。
实施例2
含有纤维-纤蛋白蛋白的重组腺病毒载体的构建
为了便于新设计的纤维基因随后转移到Ad5基因组中，将该基因装配入事先制备的纤维穿梭载体pNEB.PK.RGD-4C中。为此，用NaeⅠ和NcoⅠ消化pNEB.PK.RGD-4C，除去大部分纤维轴编码序列(从Gly-76到His-363)。然后，用该载体克隆T4纤蛋白基因的一个片段，该片段编码氨基酸Ser-229到羧基端Ala-487。纤蛋白基因的该片段用引物F1(5’GGG AAC TTG ACC TCA CAGAAC GTT TAT AGT CGT TTA AAT G 3’)(SEP ID No.1)和R1(5’AGG CCA TGG CCAATT TTT GCC GGC GAT AAA AAG GTA G 3’)(SEQ ID No.2)进行PCR扩增。除了纤蛋白序列外，PCR产物在5’端还包括对应于纤维Gly-79到Thr-82的四个密码子，并且在3’端加入了对应于纤维Lys-360到Gly-362的三个密码子。由此，PCR产生的DNA片段用NcoⅠ消化，并与NaeⅠ-NcoⅠ-消化的pNEB.PK.RGD-4C连接，产生pNEB.PK.FFBB。
装配入pNEB.PK.FFBB的基因编码纤维蛋白的氨基端，包括：完整的尾功能域，轴的第一和第二重复序列，以及纤维最后222羧基端氨基酸。羧基端氨基酸包括整个结，大部分重复20和重复22及21。纤维蛋白氨基端和羧基端部分与纤蛋白的羧基端片段相连，从纤蛋白开放读框的Ser-229开始。
为了产生含有纤维-纤蛋白基因的重组腺病毒基因组，质粒pNEB.PK.FFBB用于与PVK50同源重组，产生PVK510。为了回收感兴趣的病毒，用PacⅠ消化PVK510，并用于转染293细胞。新生成的病毒Ad5FFBB含有纤维-纤蛋白。该病毒的产生证明与纤蛋白序列基因融合的纤维蛋白的氨基端部分可以与Ad5五邻体碱基高效的结合，从而形成成熟的病毒颗粒。
实施例3
含有无结纤维-纤蛋白蛋白的重组腺病毒载体的构建
为了证明在无结情况下纤蛋白分子保持整个纤维-纤蛋白嵌合体三聚化结构的能力，用一个短序列置换该嵌合体3’端部分，这个短序列编码两个氨基酸残基的接头和一个6-His尾〔图1〕。将新生成的基因用于在大肠杆菌中指导无结纤维-纤蛋白的表达。首先，将纤维-纤蛋白基因的5’端片段装配到pNEB.PK.FFBB(编码与纤维尾部和轴开始部位融合的纤蛋白序列)，用引物F2(5’CCC CTC ATG AAG CGC GCA AGA CCG TCT GAA GAT ACC 3’)(SEQ IDNo.3)和R2(5’CCC CGG ATC CTG CCG GCG ATA AAA AGG TAG AAA GCA ATA CCC3’)(SEQ ID No.4)进行PCR扩增，用BspHⅠ和BamHⅠ消化，并克隆到细菌表达载体pQE60中，此载体已用NcoⅠ和BamHⅠ消化过，这样产生pQE.FFBB。
实施例4
含有无结纤维-纤蛋白嵌合体重组腺病毒的效力
上述克隆的结果，得到一种重组腺病毒，它含有修饰过的纤维基因，该基因编码纤维-纤蛋白-6His嵌合体。为了证明这种蛋白的三聚结构，从含有pQE.FFBB的大肠杆菌中用Ni-NTA-琼脂糖纯化病毒粒子，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。该分析证明，纤维-纤蛋白嵌合体的确是三聚蛋白(图2)，所以，有力的支持了将纤蛋白用于无结纤维的三聚化的想法。这些结果得到了对嵌合蛋白进行Western印迹分析结果的支持，该分析采用了抗-6-His尾单克隆抗体4-His和抗-纤维单克隆4D2，其可识别位于纤维分子尾部区域的一个表位：这两种单克隆抗体鉴定出在考马斯染色凝胶上识别的条带为纤维-纤蛋白-6-His嵌合体(没有显示数据)。
显然，含有羧基端6-His尾的纤维-纤蛋白嵌合体有效地结合于Ni-NTA-琼脂糖凝胶这一事实表明本文的纤维-纤蛋白嵌合体中6-His尾是可用于结合的。这些结果证明，用靶向配体置换该尾将导致带有嵌合纤维-纤蛋白-配体的重组腺病毒和配体特异性细胞受体之间的有效相互反应。
本领域的普通技术人员都知道，此纤维置换蛋白可以掺入各种靶基序，如靶配体，靶抗体。
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本说明书中提到的任何专利或出版物都表明了本发明所涉及的本领域技术人员的水平。这些专利和出版物与每个独立的出版物相同程度的纳入本文作为参考。
本领域技术人员将易于领会本发明将会很好地被采纳来执行目的、获得所述结果和利益。本发明实施例和所附带的方法、流程、处理、分子和特定的化合物仅是优选实施例的代表，是示范性的，对本发明的范围不起任何限制作用。本领域技术人员从本发明的构思所作的任何改变和其它用途都在权利要求书所界定的范围内。
                    序列表<110>Curiel,David T.
Krasnykh,Victor N.<120>含有纤维置换蛋白的修饰的腺病毒载体<130>D6070PCT<141>1999-02-16<150>US 60/074,844<151>1998-02-17<160>4<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物-结合<223>用于扩增编码氨基酸Ser-229到羧基端Ala-487的T4纤蛋白基因片段的正向引物F1<400>1gggaacttga cctcacagaa cgtttatagt cgtttaaatg          40
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列<220><221>引物-结合<223>用于扩增编码氨基酸Ser-229到羧基端Ala-487的T4纤蛋白基因片段的反向引物R1<400>2aggccatggc caatttttgc cggcgataaa aaggtag      37<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物-结合<223>用来扩增装配入pNEB.PK.FFBB的纤维-纤蛋白基因5’端片段的正向引物F2<400>3cccctcatga agcgcgcaag accgtctgaa gatacc                           36<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物-结合<223>用来扩增装配入pNEB.Pk.FFBB的纤维-纤蛋白基因5’端片段的反向引物R2<400>4ccccggatcc tgccggcgat aaaaaggtag aaagcaatac cc                    42

Claims (16)

1．一种腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒是用纤维置换蛋白置换腺病毒纤维蛋白而被修饰的。
2．如权利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述的纤维置换蛋白包括：
a)含有腺病毒纤维尾部区域的氨基端部分；
b)嵌合的纤维置换蛋白；和
c)含有靶向配体的羧基端部分。
3．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，所述的纤维置换蛋白与腺病毒的五邻体碱基缔合。
4．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，所述的纤维置换蛋白是杆状、三聚蛋白。
5．如权利要求4所述的腺病毒，其特征在于，所述的杆状、三聚蛋白的直径与野生型腺病毒的天然纤维蛋白相当。
6．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，当将编码靶向配体的序列掺入羧基端时，所述的纤维置换蛋白保留了三聚结构。
7．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，所述的纤维置换蛋白是可溶的。
8．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，所述的纤维置换蛋白是T4嗜菌体纤蛋白。
9．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，所述的纤维置换蛋白选自：三聚结构性蛋白，三聚的病毒蛋白和三聚的转录因子。
10．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，所述的纤维置换蛋白是异亮氨酸三聚化基序。
11．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，所述的纤维置换蛋白是人肺表面活性剂D的颈区域肽。
12．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，所述的纤维置换蛋白是带有卷曲螺旋二级结构的人工蛋白，其中所述的二级结构由于多重链间的相互作用是稳定的。
13．如权利要求2所述的腺病毒，其特征在于，所述的靶向配体选自：生理配体，抗受体抗体，细胞特异性肽和单链抗体。
14．如权利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒在其基因组携带治疗基因。
15．如权利要求14所述的腺病毒，其特征在于，所述的治疗基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。
16．一种在需要杀死肿瘤细胞的个体中进行这种处理的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
用有效剂量的权利要求15所述的腺病毒预处理所述的个体；和
将9-(1,3-二羟-2丙氧甲基)鸟嘌呤施予所述个体。
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