KR20010074429A - 섬유 교체 단백질을 함유하는 변형된 아데노바이러스 - Google Patents

섬유 교체 단백질을 함유하는 변형된 아데노바이러스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연 삼량체 단백질 생합성 특성을 유지하면서, 아데노바이러스 섬유 세포-결합 단백질을 변형시키는 유전적 방법을 사용하여 재조합 아데노바이러스 벡터의 향성을 변형시키는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 아데노바이러스 섬유 세포-결합 단백질을 변형시키는 유전적 방법을 사용하여 재조합 아데노바이러스 벡터로 감염시키기 위한 특정 세포 유형을 특이적으로 표적화하는 방법을 제공한다.

Description

섬유 교체 단백질을 함유하는 변형된 아데노바이러스 {Modified adenovirus containing a fiber replacement protein}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 1998년 2월 17일자로 출원되어 현재 포기된 미국 가출원 제60/074,844호의 잇점을 청구한다.
연방 기금 관련
본 발명은 부분적으로 국립보건기구(NIH)로부터의 연방 기금을 사용하여 지원되었다. 따라서, 연방 정부는 본 발명에 대해서 일정한 권리를 갖는다.
아데노바이러스는 20면체 캡시드의 12개 꼭지점 각각으로부터 돌출된 섬유 단백질(21 내지 23)의 돌출부에서 특정 수용체 인식 도메인에 의해 진핵 세포와 상호작용한다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 수 많은 유전자 요법 적용에서 사용된다(21, 35, 38). 이러한 사실은 상기 벡터 방법을 사용하여 시험관내 및 생체내 모두에서 높은 수준으로 달성할 수 있는 유전자 전달로부터 주로 유추되었다.
재조합 아데노바이러스 벡터는 다양한 기관 내용물에서 분화된 표적 세포로 원 위치 유전자 전달을 달성하는 독특한 능력으로 인해 기타 시스템과는 구별된다 (5, 6, 9, 10, 12, 20, 25, 27, 29, 31). 이는 재조합 아데노바이러스 벡터를 낭포성 섬유증 같은 선천성 유전자 질환을 치료하는 방법으로서 사용하는 것을 가능하게 하는 반면, 전달된 벡터는 표적 기관내에 함유될 수 있다(4 내지 13). 또한, 원 위치 종양 형질도입을 달성하는 아데노바이러스 벡터의 능력은 위치이동 질환에 대한 다양한 항암 유전자 요법 방법의 개발을 가능하게 한다(14 내지 18).
아데노바이러스 벡터는 정맥내 주사 후 다양한 기관으로 생체내 유전자 전달을 달성할 수 있다. 이러한 경우에, 유전자 전달 빈도는 다양한 쥐 모델에서 선천성 대사 이상을 바로잡을 만큼 충분히 높다. 따라서, 아데노바이러스 벡터는 유전자 요법을 위해 정맥내 투여된 벡터의 두 가지 필수조건을 충족시킨다: 전신계 안정성 및 근육 세포의 높은 효율의 형질도입 후 장기간 유전자 발현을 달성하는 능력.
그러나, 아데노바이러스는 아데노바이러스 세포성 수용체의 광범위한 분포로 특정 세포 유형의 표적화를 불가능하게 한다는 단점이 있다. 아데노바이러스 벡터의 향성의 이러한 결핍은 형질도입의 효율을 감소시키게 되는데, 이는 표적 세포로 전달을 위한 유용한 바이러스 입자의 수가 비표적화 세포에 의한 격리에 의해 감소되기 때문이다. 추가로, 이는 공지되지 않고 아미도 불리한 결과와 함께, 전달된 유전자의 비정상적인 장소에서의 발현을 가능하게 한다. 따라서, 아데노바이러스 벡터의 향성을 표적 세포로 특이적으로 재지시하고 병에 걸린 기관으로만 유전자 전달을 가능하게 하는 방법을 개발되어야만 한다.
이러한 목적을 위해서, 일부 그룹들은 아데노바이러스 섬유 단백질의 돌출 도메인에 대한 유전자 변형 및 상기 키메라 섬유의 비리온내로의 도입을 보고하고있다. 예를 들면, 문헌[Stevenson et al.(35) and others(24)]은 각각 Ad5 섬유의 꼬리 및 샤프트 도메인 및 Ad3의 돌출 도메인으로 이루어진 섬유를 함유하는 Ad5 비리온의 성공적인 생성을 보고하였다. 또한 문헌[Michael et al.(30)]은 가스트린-방출 펩타이드의 재조합 Ad5 섬유의 카복실 말단으로의 도입을 입증하였다. 이러한 발견은 상기 섬유들을 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 분리를 달성한 문헌[Legrand et al.(30a)]에 의해 확장되었다. 문헌[Wickham et al.(41)]은 카복실 말단의 폴리라이신 서열을 갖는 섬유를 함유하는 재조합 바이러스의 제조를 기술하였다. 상기 연구들은 상기 유전적 방법에 대한 근본적인 실현가능성 논쟁을 종식시켰을 뿐만 아니라, 섬유 단백질의 바른 폴딩(folding)을 방해할 수 있는, 리간드의 크기를 포함하는 많은 제한 인자들을 입증하였다.
선행 기술은 신규한 표적화 및 천연 향성의 제거를 혼합하여 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 효과적인 방법이 결핍하여 불완전하다. 본 발명은 당해분야에서 이러한 오래동안 지속되어진 요구 및 희망을 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 차세대 재조합 세포-특이적인 아데노바이러스 벡터를 기술한다. 보다 특히, 본 명세서는 아데노바이러스 향성의 변형에서 고려하는 두 가지 양태가 존재함을 기술한다: (1) 내인성 향성의 제거; 및 (2) 신규한 향성의 도입. 재조합 아데노바이러스를 유전자 요법 적용에서의 사용으로 확장시키기 위해서, 세포-특이적인 형질도입을 달성시키기 위해서 천연 벡터 향성을 변형시키는 방법이 필요하다. 상기 표적화를 달성하기 위해서, 리간드를 아데노바이러스 섬유 단백질내로 도입시킬 수 있으며, 섬유 단백질은 아데노바이러스가 이의 새포 표면 수용체로의 주요한 결합을 중개한다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 본 발명은 아데노바이러스 섬유 단백질의 교체에 의해 야기된 표적화된 아데노바이러스의 개발을 기술한다. 본 발명은 섬유 꼬리 도메인, 박테리오파아지 T4로부터의 피브리틴 유전자의 일부 및 리간드 도메인으로 이루어진 섬유 교체 또는 치환 단백질을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 기술한다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 또한 간시클로비어(ganciclovir)의 존재하에서 치료 유전자, 즉, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자를 암호화할 수 있고, 상기 아데노바이러스는 표적화된 수용체를 발현하는 세포의 특이적인 파괴를 중개할 수 있다. 따라서, 본 발명은 비-아데노바이러스성 세포 수용체를 통한 재조합 아데노바이러스 벡터의 재표적화를 입증한다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 내인성 바이러스 향성은 결핍되지만 신규한 향성을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터가 제공되며, 이때 상기 아데노바이러스 벡터는 바이러스 향성을 변형시키기 위해서 아데노바이러스성 섬유 교체 단백질을 생산하도록 변형되며, 교체된 섬유 유전자는 꼬리 도메인, T4 박테리오파아지 피브리틴 유전자의 카복시 말단 부분 및 리간드를 포함하며, 교체된 아데노바이러스 섬유는 삼량체화하는 이의 능력을 유지하며 이의 천연 생합성 특성을 유지하며, 리간드는 생리학적 리간드, 항-수용체 항체 및 세포-특이적인 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 추가로 상기 아데노바이러스 벡터는 치료 유전자를 함유하며, 이때 상기 치료 유전자는 단순 포진 바이러스-티미딘 키나제 유전자이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 유효량의 재조합 아데노바이러스 벡터로 개체를 예비 처리하고 간시클로비어를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체에서 종양 세포를 파괴하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태 및 추가의 양태, 특징 및 장점들은 확인 목적을 위해서 제시된 본 발명의 목하 바람직한 양태들의 하기 기술로부터 명백할 것이다.
본 발명은 일반적으로 벡터 생물학 및 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 내인성 향성(tropism)의 부수적인 제거와 함께 세포-특이적인 표적화를 위한 섬유 교체를 사용한 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조에 관한 것이다.
명백하게 될 다른 요지 뿐만 아니라 본 발명의 상기 인용된 특징, 장점 및 목적이 달성되고 상세히 이해될 수 있기 위해서, 상기 간략하게 요약된 본 발명의 보다 특정한 기술들은 첨부된 도면에서 예시되는 이의 특정 양태를 참조할 수 있다. 상기 도면은 본 명세서의 일부를 구성한다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 예시하는 것이므로 상기 양태의 범위를 제한하는 것으로 고려되지 않아야 함을 주지해야 한다.
도 1은 섬유-피브리틴-6-히스티딘 키메라로 이루어진 교체 섬유의 도면이다.
도 2는 이. 콜라이에서 발현되는 섬유-피브리틴-6-히스티딘 키메라 단백질의 SDS 겔 전기영동을 나타낸다. 단백질은 4 내지 10% SDS-PAA 겔에서 분리된 후 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색되었다. 레인 1은 가열에 의해 변성된 섬유-피브리틴-6-히스티딘이며; 레인 2는 섬유-피브리틴-6-히스티딘 천연 삼량체이며; 레인 3은 단백질 분자량 표준이다.
본 발명은 섬유 교체 단백질로 아데노바이러스 섬유 단백질을 교체함으로써 변형시킨 아데노바이러스에 대한 것이다. 바람직한 양태에서, 섬유 교체 단백질은 a) 아데노바이러스 섬유 꼬리 도메인을 포함하는 아미노-말단 부분; b) 키메라 섬유 교체 단백질; 및 c) 표적화 리간드를 포함하는 카복실-말단 부분을 포함한다.
하기 기술은 당해 분야의 통상적인 숙련자가 잠재적인 섬유 교체 단백질이 본 발명의 조성물 및 방법에서 희망되는 바와 같이 작용할 수 있는지를 결정하는 것을 가능하게 할 것이다. 일반적으로, 섬유 교체 단백질은 아데노바이러스의 펜톤 기부(penton base)와 결합한다. 구조적으로, 섬유 교체 단백질은 바람직하게는 간상형, 삼량체성 단백질이다. 상기 간상형, 삼량체성 단백질의 직경은 야생형 아데노바이러스의 천연 섬유 단백질과 유사한 것이 바람직하다. 표적화 리간드를 암호화하는 서열이 카복시-말단에 도입되는 경우, 섬유 교체 단백질이 삼량체성을 유지하는 것이 중요하다. 바람직한 양태에서, 섬유 교체 단백질의 대표적인 예는 T4 박테리오파아지 피브리틴 단백질이다. 보다 일반적으로, 섬유 교체 단백질은 삼량체성 구조 단백질, 삼량체성 바이러스 단백질 및 삼량체성 전사 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택할 수 있다. 섬유 교체 단백질의 기타 대표적인 예는 이소루이신 삼량체화 모티프 및 사람 폐 계면활성제 D로부터의 넥 영역 펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 섬유 교체 단백질은 꼬인 코일 2차 구조를 갖는다. 2차 구조는 다수의 내부 쇄 상호작용으로 인해 안정성을 제공한다.
섬유 교체 단백질은 천연 단백질이 아니어야 한다. 사실, 당해 분야의 통상적인 숙련자는 인공 단백질을 작제할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 인공 섬유 교체 단백질은 꼬인 코일 2차 구조를 가질 것이다.
본 발명의 아데노바이러스에서, 표적화 리간드는 생리학적 리간드, 항-수용체 항체, 세포-특이적인 펩타이드 및 일본쇄 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 가지 양태에서, 상기 아데노바이러스는 이의 게놈내에 치료 유전자를 갖는다. 치료 유전자의 대표적인 예는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자가 있다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 아데노바이러스를 사용하여 개체를 예비 처리하고 간시클로비어를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 개체에서 종양 세포를 파괴하는 방법에 관한 것이다.
Ad5 섬유를 변형시킴으로써 수득된 이전의 결과들은 천연 섬유 단백질의 삼량체 구조는 긴 삽입체를 수용할 만큼 충분히 안정적이지 못하며 상기 분자는 커다란 리간드의 도입을 허용하지 못할 것이라는 것을 제시한다. 돌출부는 섬유의 삼량체 구조를 유지하는 섬유의 주요한(또는 유일한) 구조적 성분인 반면, 분자의 나머지 부분은 '수동적으로' 돌출부에 의해 개시된 삼량체화 과정에 따르는 것으로 보인다. 내인성 섬유 향성이 결핍되고 신규한 향성을 소유하는 재조합 비리온을 제조하기 위해서, 돌출부를 교체하는 두 개의 상이한 단백질 잔기 사이에서 돌출부 도메인에 의해 정상적으로 수행되는 아데노바이러스 섬유의 작용을 '분리'시킬 수 있다. 이는 돌출부를 외부 삼량체화 모티브로 교체시켜 돌출부 없이 섬유의 삼량체화를 유지시키고, 비리온을 신규한 수용체에 표적화시킬 수 있는 리간드의 섬유 내로 동시에 도입시킴으로써 달성할 수 있다.
상기 섬유의 역할은 아마도 세포-결합 부위를 비리온의 표면으로부터 분리시키는 것이기 때문에, 상기 섬유는 또 다른 간상형 삼량체 단백질로 교체시킬 수 있다. 삼량체화에 부가하여, 상기 단백질은 아데노바이러스의 펜톤 기부와 결합하는 능력을 가지고 비리온 내부로 도입되어야 한다. 비양립성의 문제를 예방하기 위해서, 키메라 단백질의 아미노-말단은 아데노바이러스 섬유의 꼬리 도메인내로 도입시킬 수 있다. 추가로, 잠재적인 섬유 교체 단백질은 이의 카복실 말단으로의 리간드 표적화에 상응하는 (상대적으로) 커다란 부가적인 서열의 도입을 허용해야만 한다.
T4 박테리오파아지의 피브리틴은 상기 파아지 입자의 "목 부위(collar)" 및 "수염부(whiskers)"를 형성하며 상기 논의된 수 많은 기준에 부합하는 단백질이다. 피브리틴의 386개 아미노산 서열은 아미노-말단 도메인(47개 잔기), 커다란 중심도메인 및 카복시-말단 도메인(29개 잔기)로 이루어진다. 중심 도메인은 다양한 길이의 12개 단편을 가지며, 각각은 α- 나선 꼬인 코일 구조를 갖는다. 광범위한 생물 물리학적 분석 및 서열 분석은 피브리틴을 평행 삼중쇄형 α-나선 꼬인 코일로서 모델링하였다. 피브리틴의 삼량체는 65℃까지의 온도에서 안정하다. 유의하게는, 아미노-말단에서 잔기가 결핍된 피브리틴 및 아미노-말단 확장부를 함유하는 재조합 피브리틴 모두는 정확하게 삼량체로 조립된다. 피브리틴의 카복시-말단 도메인은 삼량체화에 필요하며 Ad5 섬유 돌출부와의 피브리틴의 카복시-말단 융합은 안정한 삼량체를 형성시킨다. 또한, 이. 콜라이에서 과발현되는 경우, 재조합 피브리틴 및 이의 유도체는 안정하다. 섬유 교체를 위한 매력적인 후보로서의 피브리틴의 또 다른 특징은 유연성이 있다는 사실이다. 따라서, 상기 섬유의 특성에 의해 확립된 길이 필요조건은 소의 Ad3 및 CELO 바이러스의 유연한 섬유와 마찬가지로, 용이하게 피브리틴에 의해 부합될 수 있다.
정의
본 발명에 따라서, 당해 분야의 기술내에서 통상적인 분자생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 상기 기술들은 문헌들에서 충분히 설명되어 있다. 문헌 참조[예를 들면, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach." Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)]. 따라서, 본원에 나타나는 경우, 하기 용어들은 하기 설정된 정의를 갖는다.
"DNA 분자"는 일본쇄 형태 또는 이본쇄 나선 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신)의 중합체 형태를 나타낸다. 상기 용어는 단지 상기 분자의 1차 및 2차 구조만을 나타내며, 이를 임의의 3차 형태로만 제한하지는 않는다. 따라서, 상기 용어는 선형 DNA 분자(예를 들면, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 그 자체로 발견되는 이본쇄 DNA를 포함한다. 정상적인 협정에 따라 본원에서 구조를 논의함에서 있어서, 서열은 비전사된 DNA 쇄(즉, mRNA와 상동성인 서열을 갖는 쇄)를 따라 5'에서 3' 방향으로만 나타낸다.
"벡터"는 또 다른 DNA 분절이 이에 결합되어 결합된 분절의 복제를 야기할 수 있는, 플라스미드, 파아지 또는 코스미드 같은 레플리콘(replicon)이다. "레플리콘"은 생체내에서 DNA복제의 자율 단위로서(즉, 자신의 조절하에서 복제를 할 수 있는) 작용하는 임의의 유전적 요소(예를 들면, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다. "복제 오리진"은 DNA 합성에 참여하는 DNA 서열을 의미한다. "발현 조절 서열"은 또 다른 DNA 서열의 전사 및 해독을 조절하고 통제하는 DNA 서열이다. 암호화 서열은 RNA 폴리머라제가 암호화 서열을 mRNA(이는 이후에 암호화 서열에 의해 암호화되는 단백질로 해독된다)로 전사시키는 경우, 세포내에서 전사적 및 해독적 조절 서열의 "조절하에서" "작동적으로 결합된다".
일반적으로, 삽입된 DNA 단편의 효과적인 전사 및 해독을 촉진하는 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터를 숙주와 연계하여 사용한다. 발현 벡터는 전형적으로 복제 오리진, 프로모터(들), 종결 인자(들) 뿐만 아니라 형질전환된 세포내에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 특정 유전자들을 함유한다. 형질전환된 숙주를 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 발효시키고 배양하여 최적 세포 성장을 달성할 수 있다.
DNA "암호화 서열"은 적합한 조절 서열의 조절하에 위치하는 경우, 생체내에서 폴리펩타이드로 전사되어 폴리펩타이드로 해독되는 이본쇄 DNA 서열이다. 암호화 서열의 한계는 5'(아미노) 말단에서 개시 코돈 및 3'(카복실) 말단에서 해독 종결 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열은 원핵세포의 서열, 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 진핵(예를 들면, 포유류) DNA로부터의 게놈성 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 폴리아데닐화 시그날 및 전사 종결 서열은 일반적으로 암호화 서열의 3'쪽에 위치할 것이다. "cDNA"는 카피-DNA 또는 상보성-DNA로서 정의되며, mRNA 전사체로부터의 역전사 반응의 생성물이다.
전사 및 해독 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그날, 종결 인자 같은 DNA 조절 서열이며, 이는 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 위해 제공된다. "시스-인자"는 특정 유전자 좌위의 발현을 증가 또는 감소 조절할 수 있는 다른 단백질과 상호작용하는, 또한 "컨센서스 서열" 또는 "모티프"라고 불리는 뉴클레오타이드 서열이다. "시그날 서열"도 또한 암호화 서열과 함께 포함될 수 있다. 상기 서열은 폴리펩타이드의 N-말단의 시그날 펩타이드를 암호화하며, 이는숙주 세포와 정보를 주고 받아 적합한 세포 위치로 폴리펩타이드를 지시한다. 시그날 서열은 원핵 생물 및 진핵 생물의 다양한 천연 단백질와 결합하는 것으로 확인할 수 있다.
"프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제와 결합하여 암호화 서열을 하류(3' 방향)로 전사를 개시하도록 할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 정의하기 위해서, 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 결합되며 바탕값 이상으로 검출할 수 있는 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소수의 염기 또는 인자를 포함하도록 상류(5' 방향)로 신장된다. 프로모터 서열내에서는 전사 개시 부위 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합에 관여하는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)이 확인될 것이다. 항상 그렇지는 않지만 진핵 세포 프로모터는 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 함유한다. 원핵 세포의 프로모터는 -10 및 -35 컨센서스 서열에 부가하여, 샤인-달가르노 서열을 함유한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는 2개 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드, 바람직하게는 3개 이상을 포함하는 분자로서 정의된다. 이의 정확한 크기는 상기 올리고뉴클레오타이드의 작용 및 용도에 의존하는 수 많은 인자들에 따른다. 본원에서 사용되는 용어 "프라이머"는 정제된 제한단편으로서 천연적으로 생성하거나 합성적으로 생성시킨 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 이는 핵산 쇄에 상보적인 프라이머 신장 생성물의 합성이 유도되는 조건, 즉 적합한 온도 및 pH에서 뉴클레오타이드, 및 DNA 폴리머라제 같은 유도제의 존재하에 놓이는 경우, 합성의 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머는 일본쇄이거나 이본쇄일 수 있으며 유도제의 존재하에바람직한 신장 생성물의 합성을 개시할 만큼 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 방법을 위한 용도를 포함하는 수 많은 인자에 의존할 것이다. 예를 들면, 진단 적용을 위해서는, 표적 서열의 복잡성에 따라서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 이보다 더 적은 뉴클레오타이드를 함유할 수도 있지만, 전형적으로 15 내지 25개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 함유한다.
본원의 프라이머는 특정 표적 DNA 서열의 상이한 쇄에 "실질적으로" 상보적이 되도록 선택된다. 이는 프라이머가 이들 각각의 쇄와 하이브리화하도록 충분히 상보적이어야 한다는 것을 의미한다. 따라서, 프라이머 서열은 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들면, 비-상보적인 뉴클레오타이드 단편은 쇄에 상보적인 프라이머 서열의 나머지 부분과 함께 프라이머의 5' 말단에 결합할 수 있다. 대안적으로, 프라이머 서열이 이와 함께 하이브리드화하여 이로 인해 신장 생성물의 합성을 위한 주형을 형성하는 서열과 충분히 상보성을 갖는 한, 비-상보적인 염기 또는 보다 긴 서열이 프라이머내에 산재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"는 특정 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 인접부에서 이본쇄 DNA를 절단하는 효소를 의미한다.
"재조합 DNA 기술"은 일반적으로 상이한 유기체로부터의 DNA의 시험관내 결합의 결과로서, 두 개의 이형적인 DNA 분자를 통합시키는 기술을 의미한다. 재조합 DNA 분자는 흔히 유전공학 실험에 의해 생성된다. 동의어로는 "유전자 스플라이싱", "분자적 클로닝" 및 "유전공학"을 포함한다. 이러한 조작의 생성물은 "재조합" 또는 "재조합 분자"를 초래한다.
DNA가 세포내부로 도입되는 경우, 세포는 외인성 또는 외래 DNA로 "형질전환"되거나 "형질감염"된다. 형질전환하는 DNA는 세포의 게놈내로 통합되거나(공유 결합되거나) 되지 않을 수 있다. 예를 들면, 원핵 생물, 효모 및 포유 세포에서, 형질전환하는 DNA는 벡터 또는 플라스미드 같은 에피솜성 인자 상에서 유지될 수 있다. 진핵 세포와 관련하여, 안정하게 형질전환된 세포는 형질전환하는 DNA가 염색체내로 통합되어 염색체 복제를 통해 자손 세포로 유전되는 세포이다. 상기 안정성은 형질전환하는 DNA를 함유하는 자손 세포의 집단으로 이루어지는 세포주 또는 클론을 확립하는 진핵 세포의 능력으로 입증된다. "클론"은 유사 분열에 의해 단일 세포 또는 조상 세포로부터 유도되는 세포의 집단이다. "세포주"는 수 많은 세대 동안 시험관내에서 안정한 성장을 할 수 있는 1차 세포의 클론이다. 외인성 DNA로 형질전환시킨 식물 또는 동물 같은 유기체는 "형질전환된"이라고 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주"는 원핵 생물 뿐만 아니라 효모, 식물 및 동물 세포 같은 진핵 세포를 포함함을 의미한다. 원핵 생물 숙주는 이. 콜라이, 에스. 팀피무리움(S. tymphimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 바실러스 서브틸리스(basillus subtilis)를 포함할 수 있다. 진핵생물 숙주는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 같은 효모, 동물 세포 및 곤충 세포 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis) 및 토바쿰 니코티아나(Tobaccum nicotiana) 같은 식물 세포를 포함한다.
두 개의 DNA 서열이 한정된 길이의 DNA 서열상에서 뉴클레오타이드의 약 75% 이상(바람직하게는 약 80% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 90% 또는 95% 이상)이 일치하는 경우 "실질적으로 상동성"이다. 실질적으로 상동성인 서열은 예를 들면, 특정 시스템을 위해 정의된 바와 같은 엄격한 조건하에서, 서열 데이터 뱅크 또는 서던 하이브리드화 시험에서 유용한 표준 소프트웨어를 사용하여 상기 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 적합한 하이브리드화 조건을 정의하는 것은 당해 분야의 기술 범위내이다. 문헌 참조[예를 들면, Maniatis et al., 상기; DNA Cloning, Vols. I & II, 상기; Nucleic Acid Hybridization, 상기].
DNA 작제물의 "이형적인" 영역은 천연에서 큰 분자와 결합하여 확인되지 않는 큰 DNA 분자내에의 DNA의 확인할 수 있는 분절이다. 따라서, 이형적인 영역이 포유동물 유전자를 암호화하는 경우, 상기 유전자는 일반적으로 공급원 유기체의 게놈에서 포유 동물의 게놈성 DNA에 인접하지 않는 DNA에 의해 인접하게 된다. 또 다른 예에서, 암호화 서열은 암호화 서열 그 자체가 천연에서 발견되지 않는(예를 들면, 게놈성 암호화 영역이 인트론을 함유하는 cDNA, 또는 천연 유전자와는 상이한 코돈을 갖는 합성 서열) 작제물이다. 대립형질성 변이 또는 천연 발생적인 돌연변이 사건은 본원에서 정의된 바와 같은 DNA의 이형적인 영역의 원인은 아니다.
또한, 본 발명은 섬유 또는 피브리틴 유전자의 일부 또는 단편을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 또는 폴리펩타이드에 적용되는 바와 같이 "단편" 또는 "부분"은 길이에 있어서 통상적으로 10개 이상의 잔기, 보다 전형적으로는 20개 이상의 잔기, 및 바람직하게는 30개 이상(예를 들면, 50개)의 잔기일 수 있으나, 온전한 전체 서열 보다는 작다. 상기 유전자의 단편은 예를 들면, 천연 발생적이거나 재조합 섬유 또는 피브리틴 유전자의 제한 절단에 의해, 섬유 또는 피브리틴 유전자의 정의된 단편을 암호화하는 벡터를 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 화학적인 합성에 의해 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 방법으로 생성시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "키메라" 또는 "키메라의"는 필수적이진 않지만 종종 상이한 유기체로부터의 다수 성분들을 포함하는 단일 전사 단위를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "키메라의"는 개별적인 암호화 서열의 작용 또는 활성에 상응하는 영역을 포함하는 단백질을 형성시키도록 유전자적으로 조작한 나란히 배열된 암호화 서열(본원의 경우, 일반적으로 아데노바이러스 섬유 유전자를 암호화하는 서열)을 의미하는 것으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 키메라 섬유 단백질의 "천연 생합성 특성"은 정확한 삼량체화, 아데노바이러스 캡시드와의 적합한 결합, 리간드의 이의 표적에 결합하는 능력 등을 나타내는 것으로 정의된다. 후보 키메라 섬유-피브리틴-리간드 단백질 단편이 "천연 생합성 특성"을 나타내는 능력은 본원에 기술된 방법으로 평가할 수 있다.
표준 노던 블롯 분석법을 사용하여 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 공지된 통상적인 노던 하이브리드화 기술에 따라서 세포 또는 조직에서 mRNA의 상대적인 양을 확인할 수 있다. 대안적으로, 표준 서던 블롯 분석법을 사용하여 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 공지된 통상적인 서던 하이브리드화 기술에 따라서 관심있는 유전자의 존재 및 복사체 수를 확인할 수 있다. 상기 노던 블롯 및 서던 블롯 모두는 하이브리드화 프로브, 예를 들면, 20개 이상(바람직하게는 30개 이상, 보다 바람직하게는 50개 이상, 및 가장 바람직하게는 약 100개의 연속적인 뉴클레오타이드)의 방사성 표지된 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. DNA 하이브리드화 프로브는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 수 많은 상이한 방법 중 하나로 표지할 수 있다.
상기 연구에서 가장 흔히 사용되는 표지에는 방사성 인자, 효소, 자외선 노출시 형광을 내는 화학물질 및 다른 것들이 있다. 수 많은 형광 물질이 공지되어 있으며 표지로서 사용할 수 있다. 이들은 예를 들면, 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드(Texas Red), AMCA 블루 및 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow)를 포함한다. 특정 검출 물질은 염소에서 제조된 항-래빗 항체이며 이소티오시아네이트를 통해 플루오레세인과 접합한다. 단백질을 또한 방사성 인자 또는 효소를 사용하여 표지할 수 있다. 방사성 표지는 현재 유용한 계수 방법 중 하나로 검출할 수 있다. 바람직한 방사성 동위원소는3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co.58Co,59Fe,90Y,125I,131I, 및186Re로부터 선택할 수 있다.
효소 표지도 마찬가지로 유용하며, 현재 사용되는 비색계, 분광광도계, 형광분광광도계, 전류계 또는 가스계량 기술 중 하나로 검출할 수 있다. 효소는 카보디이미드, 디이소시아네이트, 글루타르알데하이드 등과 같은 결합 분자와의 반응에의해 선택된 입자에 결합시킨다. 상기 방법에서 사용할 수 있는 수 많은 효소가공지되어 있으며 사용할 수 있다. 퍼옥시다제, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 유레아제, 글루코오스 옥시다제 + 퍼옥시다제 및 알칼리 포스파타제가 바람직하다. 문헌[미국 특허 제3,654,090호, 제3,850,752호 및 제4,016,043호]은 교체 표지 물질 및 방법의 기술에 대한 예로서 인용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "섬유 유전자" 및 "섬유"는 아데노바이러스 섬유 단백질을 암호화하는 유전자를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "키메라 섬유 단백질"은 상기 정의된 바와 같이 변형된 섬유 유전자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생리학적 리간드"는 세포 표면 수용체의 리간드를 의미한다.
본 발명은 투여 후 예비 결정된 세포 유형에 생체내 유전자 전달을 목적으로 아데노바이러스 벡터의 고효율 및 특이적인 표적화 모두를 제공하는 벡터 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터에 있어서, 섬유-피브리틴-리간드를 포함하는 섬유 교체 단백질을 유전자 요법을 위해서 특정 세포로의 아데노바이러스 벡터의 표적화에 사용할 수 있다. 이는 섬유-피브리틴-리간드 키메라를 함유하는 아데노바이러스 벡터의 작제에 의해 달성된다. 상기 아데노바이러스 벡터는 유전자 생성물을 고효율 및 특이적으로, 섬유-피브리틴-리간드 키메라의 리간드 성분을 인식하는 수용체를 발현하는 세포로 전달할 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련자는 예를 들면, 특정 세포 유형 특유의 세포 표면 단백질을 표적으로서 특이적으로 인식하는 수용체 리간드 또는 항체 단편을 암호화하는 광범위하게 다양한 유전자를 이용할 수 있음을 인식할 것이다.
"섬유 교체 단백질"은 섬유를 교체하고 3가지 필수적인 특징(섬유 같은 삼량체화, 아데노바이러스 향성 결핍 및 신규한 향성)을 제공하는 단백질이다.
다음 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위해 제시되며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
실험 디자인
피브리틴을 재조합 Ad5 비리온에서 섬유를 교체하는데 사용할 수 있음을 입증하기 위해서, 하기 실험 전략을 사용한다. 우선, 섬유 꼬리, 섬유 샤프트 도메인의 제1 및 제2 모티프 뿐만 아니라 피브리틴 단백질의 분절과 융합된 섬유 돌출부 도메인을 암호화하는 키메라 섬유-피브리틴 유전자를 디자인한다. 상기 작제물에서, 피브리틴 암호화 서열은 섬유 샤프트 암호화 서열의 대부분을 교체한다. 따라서, 상기 재조합 유전자에 의해서 암호화되는 키메라 단백질은 거의 모든 샤프트 도메인이 피브리틴으로 교체된 Ad5 섬유 단백질과 유사할 것이다.
실시예 2
섬유-피브리틴 단백질을 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 작제
신규하게 디자인된 섬유 유전자를 Ad5 게놈내로의 후속적인 전달을 촉진시키기 위해서, 상기 유전자를 사전에 작제한 섬유 셔틀 벡터 pNEB.PK.RGD-4C내로 결합시킨다. 이를 위해서, pNEB.PK.RGD-4C를 NaeI 및 NcoI으로 절단하여 Gly-76에서 개시하여 His-363까지의 섬유 샤프트 암호화 서열의 대부분을 결실시킨다. 이후, 상기 벡터를 사용하여 아미노산 Ser-229 내지 카복실 말단의 Ala-487까지를 암호화하는 T4 피브리틴 유전자의 분절을 클로닝한다. 상기 피브리틴 유전자의 분절을 프라이머 F1(5' GGG AAC TTG ACC TCA CAG AAC GTT TAT AGT CGT TTA AAT G 3')(서열 1) 및 R1(5' AGG CCA TGG CCA ATT TTT GCC GGC GAT AAA AAG GTA G 3')(서열 2)을 사용하여 PCR 증폭시킨다. 피브리틴 서열에 부가하여, PCR 생성물은 또한 5' 말단에서 섬유 Gly-79 내지 Thr-82에 상응하는 4개의 코돈을 함유하는 반면, 3' 말단에서는, 섬유의 Lys-360 내지 Gly-362에 상응하는 3개의 코돈이 부가된다. 따라서, PCR-생성된 DNA 단편을 NcoI으로 절단하고 NaeI-NcoI-절단된 pNEB.PK.RGD-4C와 결합시켜 pNEB.PK.FFBB를 생성시킨다.
pNEB.PK.FFBB내에 조립된 상기 유전자는 완전한 꼬리 도메인, 샤프트의 제1 및 제2 반복체(및 제3 반복체의 작은 부분)를 포함하는 아미노 말단 부분 뿐만 아니라 섬유의 마지막 222개 카복실 말단 아미노산을 암호화한다. 카복실 말단 아미노산은 전체 돌출부, 반복체 20의 대부분 및 반복체 22 및 21을 포함한다. 섬유 단백질의 아미노 말단 및 카복실 말단 부분은 피브리틴 개방 판독 프레임의 Ser-229로부터 개시하여, 피브리틴의 카복실 말단 분절에 의해 결합된다.
섬유-피브리틴 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스 게놈을 생성시키기위해서, 플라스미드 pNEB.PK.FFBB를 사용하여 pVK50과 상동 재조합하여 pVK51을 생성시킨다. 관심있는 바이러스를 회수하여 위해서, pVK51을 PacI으로 절단하고 293 세포를 형질감염시키는데 사용한다. 신규하게 생성된 바이러스, Ad5FFBB는 섬유-피브리틴 단백질을 함유한다. 상기 바이러스의 생성은 피브리틴 서열과 유전자 융합된 섬유 단백질의 아미노 말단 부분이 효과적으로 Ad5 펜톤 기부와 결합하여 성숙한 비리온을 형성함을 입증한다.
실시예 3
돌출부없는 섬유-피브리틴 단백질을 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 작제
돌출부의 부재하에서 전체 섬유-피브리틴 키메라의 삼량체적 구조를 유지하는 피브리틴 분자의 능력을 입증하기 위해서, 키메라의 3' 말단 부분을 두 개의 아미노산 잔기 링커 및 6-His 태그를 암호화하는 짧은 서열로 교체한다(도 1). 신규하게 생성된 유전자를 사용하여 이. 콜라이에서 돌출부없는 섬유-피브리틴의 발현을 지시한다. 우선, 이전에 pNEB.PK.FFBB(섬유 꼬리 및 샤프트의 시작부와 융합된 피브리틴 서열을 암호화함)에서 결합시킨 섬유-피브리틴 유전자의 5'-말단 분절을 프라이머 F2(5' CCC CTC ATG AAG CGC GCA AGA CCG TCT GAA GAT ACC 3')(서열 3) 및 R2(5' CCC CGG ATC CTG CCG GCG ATA AAA AGG TAG AAA GCA ATA CCC 3')(서열 4)를 사용하여 PCR 증폭시키고, BspHI 및 BamHI으로 절단한 후 NcoI 및 BamHI으로 절단시킨 세균 발현 벡터 pQE60내로 클로닝하여 pQE.FFBB를 생성시킨다.
실시예 4
돌출부없는 섬유-피브리틴 키메라를 함유하는 재조합 아데노바이러스의 효능
상기 클로닝의 결과로서, 섬유-피브리틴-6His 키메라를 암호화하는 변형된 섬유 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스를 수득한다. 상기 단백질의 삼량체 구조를 확인하기 위해서, pQE.FFBB를 갖는 이. 콜라이 세포로부터 NTA-아가로오스를 사용하여 비리온을 정제한 후 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한다. 상기 분석은 진정으로, 섬유-피브리틴 키메라가 삼량체 단백질(도 2)이며, 따라서, 돌출부없는 섬유의 삼량체화를 위한 피브리틴 단백질의 용도에 대한 견해를 강력하게 지지하는 것으로 입증된다. 상기 결과는 섬유 분자의 꼬리 도메인내에 위치하는 에피토프를 인식하는 항-6-His 태그 모노클로날 항체 테트라-His 및 항-섬유 모노클로날 4D2를 사용한 키메라 단백질의 웨스턴 블롯 분석에 의해 뒷받침되며, 모노클로날 항체 둘 모두는 쿠마시 염색된 겔에서 나타나는 밴드가 섬유-피브리틴-6-His 키메라임을 확인시켜 준다(데이터 미첨부).
유의하게, 카복시 말단 6-His 태그를 함유하는 섬유-피브리틴 키메라가 Ni-NTA-아가로오스에 효과적으로 결합한다는 사실은 6-His 태그가 섬유-피브리틴 키메라의 내용물에서 결합에 유용하다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 상기 태그를 표적화된 리간드와 교체하면 키메라 섬유-피브리틴-리간드를 갖는 재조합 아데노바이러스와 리간드-특이적인 세포성 수옹체 사이에 효과적인 상호작용을 야기시킨다는 것을 입증한다.
당해 분야의 통상적인 숙련자에게 숙지된 바와 같이, 섬유 교체 단백질은 다양한 표적화 모티프, 예를 들면, 표적화 리간드, 표적화 항체의 도입을 가능하게 할 것이다.
하기 참조 문헌이 본원에서 인용된다:
본 명세서에서 언급되는 모든 특허 및 문헌들은 본 발명이 속한 분야의 숙련자의 수준에 대한 지표이다. 상기 특허 및 문헌들은 각각의 문헌들이 구체적으로 참조로서 인용되는 것과 같은 정도로 참조 문헌으로서 본원에서 인용된다.
당해 분야의 숙련자는 본 발명이 목표를 수행하고 상기 언급된 목적 및 장점, 뿐만 아니라 이에 내재된 목적 및 장점을 수득하기 위해 잘 적용되어 있음을 용이하게 이해할 것이다. 방법, 과정, 처리, 분자 및 본원에 기술된 특정 화합물과 함께 본 실시예는 바람직한 양태의 대표적 예이고, 예시적이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 특허청구 범위의 범위에 의해 제한되는 바와 같이 본 발명의 취지내에 포함되는 이의 변형 및 다른 용도는 당해 분야의 숙련자에는 가능할 것이다.

Claims (16)

  1. 섬유 교체 단백질로 아데노바이러스 섬유 단백질을 교체함으로써 변형시킨 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 섬유 교체 단백질이 a) 아데노바이러스 섬유 꼬리 도메인을 포함하는 아미노-말단 부분; b) 키메라 섬유 교체 단백질; 및 c) 표적화 리간드를 포함하는 카복시-말단 부분을 포함하는 아데노바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 섬유 교체 단백질이 아데노바이러스의 펜톤 기부와 결합하는 아데노바이러스.
  4. 제2항에 있어서, 섬유 교체 단백질이 간상형, 삼량체 단백질인 아데노바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 간상형, 삼량체 단백질이 야생형 아데노바이러스의 천연 섬유 단백질과 유사한 직경을 갖는 아데노바이러스.
  6. 제2항에 있어서, 표적화 리간드를 암호화하는 서열이 카복시-말단에 도입되는 경우, 섬유 교체 단백질이 삼량체를 유지하는 아데노바이러스.
  7. 제2항에 있어서, 섬유 교체 단백질이 가용성인 아데노바이러스.
  8. 제2항에 있어서, 섬유 교체 단백질이 T4 박테리오파아지 피브리틴 단백질인 아데노바이러스.
  9. 제2항에 있어서, 섬유 교체 단백질이 삼량체 구조 단백질, 삼량체 바이러스 단백질 및 삼량체 전사 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아데노바이러스.
  10. 제2항에 있어서, 섬유 교체 단백질이 이소루이신 삼량체 모티프인 아데노바이러스.
  11. 제2항에 있어서, 섬유 교체 단백질이 사람 폐 계면활성제 D로부터의 넥 영역 펩타이드인 아데노바이러스.
  12. 제2항에 있어서, 섬유 교체 단백질이 다수의 쇄간 상호작용으로 인해 안정한 꼬인 코일 2차 구조를 갖는 합성 단백질인 아데노바이러스.
  13. 제2항에 있어서, 표적화 리간드가 생리학적 리간드, 항-수용체 항체, 세포-특이적 펩타이드 및 일본쇄 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아데노바이러스.
  14. 제1항에 있어서, 이의 게놈내에 치료 유전자를 갖는 아데노바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 치료 유전자가 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자인 아데노바이러스.
  16. 개체에 유효량의 제15항의 아데노바이러스를 예비 처리하는 단계; 및 간시클로비어(ganciclovir)를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체에서 종양 세포를 파괴하는 방법.
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