WO2021140615A1 - 新規組換えバクテリオファージ - Google Patents

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哲朗 近藤
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Definitions

  • Phage that infects E. coli is used in the phage display method, and functions because foreign proteins and peptides fused with the coat protein of the phage can be presented on the surface of the phage in a form that can interact with other molecules. It has become one of the most powerful methods for exploring motifs. However, since a complicated method such as ELISA is used in the phage detection step in the functional motif screening process, there is a drawback that the screening requires enormous labor and time.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 T7 phages (Non-Patent Documents 1 and 2), T4 phages (Non-Patent Documents 3), or lambda phage (Non-Patent Documents 4) have been visualized using fluorescent proteins such as GFP. There is a report to detect it. However, since the number of fluorescent proteins expressed on the phage is extremely small, 1 to 3, the fluorescence intensity is weak, and the number of fluorescent proteins per phage cannot be controlled, so that it is not constant and is accurate using the fluorescence intensity as an index. Cannot be screened or detected.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 have a fluorescent protein fused to a capsid, there is a drawback that the fluorescent protein causes steric damage to the presented protein when used in the phage display method. There is. Similarly, a recombinant bacteriophage expressing the luciferase enzyme gene described in Patent Document 1 on the surface of a capsid may cause such steric hindrance.
  • the present inventor inserts a gene for a fluorescent protein, which is a labeling protein, or a gene for an enzyme that catalyzes a coloring reaction into a specific gene region of a T7 phage so as to be expressible.
  • a fluorescent protein which is a labeling protein
  • a gene for an enzyme that catalyzes a coloring reaction into a specific gene region of a T7 phage so as to be expressible.
  • the fluorescent protein is green fluorescent protein (GFP), and the enzyme that catalyzes the coloring reaction is one of luciferase, ⁇ -glucuronidase (GUS), ⁇ -galactosidase, and horseradish peroxidase.
  • GFP green fluorescent protein
  • the present invention also relates to a method using the random peptide phage library of recombinant bacteriophage T7 described in (8) below or the random peptide phage library of (9) and (10) below.
  • a random peptide is placed in the gp10 gene region of the genome of recombinant bacteriophage T7 in which the gene of the labeled protein is expressively inserted into the gp17 gene region of the genome of bacteriophage T7.
  • the number of fluorescent proteins expressed per phage molecule is as small as 1 to 3, but in the recombinant phage of the present invention, a large number of fluorescent proteins expressed by one order higher than in the conventional method are expressed, so that fluorescence is achieved. There is a difference in strength at each stage. Further, in the conventional method, the number of fluorescent proteins per phage molecule cannot be controlled, the number of fluorescent proteins differs depending on the phage, and the fluorescence intensity is not constant. Since the same number of fluorescent proteins are always expressed in the phage, screening with an accurate constant fluorescence intensity can be realized.
  • the unbound fluorescent protein is added to each round in which the selected phage is replicated and proliferated during the panning process in the screening. There is no need to separate the phages that emit the desired fluorescence each time, and it is not necessary to verify that the fluorescent protein is definitely bound to all the selectively amplified phages in each round.
  • the fluorescent protein is expressed in a structural portion different from the capsid moiety expressing the random peptide in the library portion, which causes a steric disorder of binding to the target. It has an excellent effect that it does not overlook the binding to the target, which is an important element in the phage display method.
  • FIG. 3 shows a solid fluorescence micrograph of a plaque of Escherichia coli infected with recombinant T7gp17-sfGFP.
  • Bacteriophage T7 is a lytic phage having double-stranded linear genomic DNA, binds to LPS on the surface of Escherichia coli, and injects DNA into Escherichia coli to infect.
  • the head of the phage that stores the genomic DNA is formed by the association of 415 G10 proteins, and the tail is added below it.
  • bacteriophage or "phage” is a virus that has evolved to use bacteria in nature as a means of replicating them.
  • the phage attaches the phage itself to the bacterium, injects its DNA into the bacterium, and induces the bacterium to replicate hundreds or even thousands of times the phage. Do. This is also called phage amplification.
  • genes of enzymes that catalyze luminescence or color reaction can be used, for example, luciferase (Luc), ⁇ -glucuronidase (GUS), ⁇ -galactosidase (Gal), horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase ( Examples include commercially available genes such as AP).
  • DNA encoding a peptide having a binding property to a fluorescent / photoprotein or a fluorescent dye can be used.
  • a biotinylated tag sequence peptide acceptor peptide of Escherichia coli biotin-ligase BirA
  • various tag sequences HA, myc, FLAG, His tag, etc.
  • the gp17 gene region into which a gene such as fluorescent protein is inserted is a region in which the expression of the gene such as fluorescent protein is functionally regulated by the promoter or regulatory region of the gp17 gene and the gp17 gene can be functionally expressed. Any area may be used as long as it is present. It is preferably in the coding region or in the transcription region near the end of the coding region of the gp17 gene, in which the function of the gp17 gene is less likely to be deleted, and more preferably at the 5'end or 3'end of the coding region of the gp17 gene.
  • the gp17 gene and a gene such as a fluorescent protein need to be linked so that the same promoter or regulatory region can control both genes, and may be linked via a spacer sequence or a linker sequence.
  • a fusion protein containing an amino acid sequence encoded by a gene such as gp17 gene and a fluorescent protein is expressed, once transcription is started by the promoter, transcription is performed through the coding region to the stop codon.
  • Genes such as gp17 gene and fluorescent protein exist in the 5' ⁇ 3'direction.
  • a gene recombination operation method for inserting a heterologous gene such as a fluorescent protein into a specific region of the phage genome is well known to those skilled in the art, and homologous recombination and genome editing techniques can be used.
  • the principle of the method of recombination operation is to prepare a DNA fragment containing a fragment to be incorporated and two recombination arms, for example by PCR amplification. These arms are homologous to the region adjacent to the gene to be inserted.
  • These DNA fragments can also be produced from nucleotides having a sequence of several tens of bases by PCR using primers containing homologous arms.
  • the recombinant T7 phage of the present invention can be used to prepare a phage display library for selection or screening well known in the art.
  • a nucleic acid molecule encoding a peptide having a random sequence is inserted into the gp10 gene region of the bacteriophage T7 genome in a state where the random peptide and capsid protein are expressed as a fusion protein, and the recombinant bacteriophage T7 is randomly expressed.
  • Each phage particle presents one polypeptide, and then the phage particle is selected based on its affinity interaction with the target, which is the molecule of interest.
  • Expression can be peptide is one per phage, but be used because it is possible to prepare the phage at a concentration of 10 12 / ml or more, the phage population that expressed various types of peptides as a library it can.
  • GTAGGTCAGGCCGTTGTGG SEQ ID NO: 1
  • 3'Primer GTTCTCTTCACGTGTCCTTGGGTACAG SEQ ID NO: 3
  • Each PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis to cut out the corresponding band, and was eluted and purified using Gel Extension Kit.
  • the 5'and 3'ends of the purified 2.9 kb fragment were digested with restriction enzymes SfiI and PmlI, subjected to agarose gel electrophoresis again (results are shown in FIG. 4), and eluted and purified using Gel Extension Kit. did.
  • the infected BL21 was mixed with TOP agarose and sown on an LB plate, and it was confirmed by visual observation with a stereomicroscope that the plaques that appeared fluoresce. This stereomicrograph is shown in FIG.
  • the collected plaque is incubated with a phage extraction buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 6 mM sulfonyl 4 , pH 8.0) (4 ° C., 3 hours), mixed with a small amount of chloroform by inversion, and then centrifuged (3,000 ⁇ g). , 5 minutes), and the supernatant was collected to obtain a phage extract.
  • T7gp17-sfGFP phage genomic DNA was extracted by 2% SDS treatment, and the supernatant was centrifuged at 16,500 ⁇ g.
  • T7gp17-sfGFP phage genomic DNA (38.1 kb) was purified using QIAGEN).
  • the obtained phage genomic DNA was precipitated with ethanol and then digested with EcoRI and HindIII to obtain 21.5 kbp and 16.6 kbp fragments, subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis and purified using QIAGEN GEL EXTRATION KIT. (Fig. 8).
  • the 5'and 3'ends of this PCR product were digested with EcoRI and HindIII and then purified by 2% agarose electrophoresis and QIAGEN GEL EXTRATION KIT.
  • the obtained insert DNA and 21.5 kbp And 16.6 kbp phage genomic DNA was subjected to a ligation reaction with T4 ligation, the ligation product was mixed with T7 Packing Exects (Merck Millipore), and an In vitro packing reaction was carried out.
  • the packing product was infected with Escherichia coli BL21.
  • T7gp17-sfGFP random peptide library (T7-sfGFP ⁇ 12) was dropped onto the nasal mucosa of anesthetized mice, and after a certain period of time, the brain was removed, homogenized and infected with Escherichia coli BL21, and spread on an LB plate (150 mm). After amplification (37 ° C., 2.5 hours), phage was recovered from the plaque. Using this phage, the process proceeded to the next round, and the same amount of phage as in Round 1 was dropped onto the nasal mucosa of the mouse, and the same operation as described above was repeated 4 times. As the round progressed, the “output / input” ratio of the recovered phage increased about 900-fold (Fig. 12).
  • Non-Patent Document 2 a fusion protein of fluorescent protein and T7 capsid protein is added to phage by overexpression by Escherichia coli using a helper plasmid, but in this method, wild-type T7 capsid protein is further excessively excessive. Simultaneous expression in E. coli is essential for phage production, which actually results in only a portion of all phages containing the fluorescent protein (6% -16%). That is, using this method, even if the positive phage group selected by screening is replicated and amplified for the next screening round, only a part (6% to 16%) of all phages are fluorescent.

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Abstract

標識タンパク質である蛍光タンパク質の遺伝子または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子が、Ｔ７ファージのゲノムに発現可能に挿入された組換えＴ７ファージ、組換えＴ７ファージのランダムペプチドファージライブラリー、およびその使用方法を提供することを課題とする。 Ｔ７ファージのｇｐ１７遺伝子領域に、蛍光タンパク質の遺伝子または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を発現可能に挿入して、蛍光タンパク質または呈色反応を触媒する酵素を一定の数で安定に尾部に発現する組換えＴ７ファージを作成する。この組換えＴ７ファージのランダムペプチドファージライブラリーは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏでのスクリーニングに使用可能である。

Description

新規組換えバクテリオファージ
　本発明は、バクテリオファージＴ７の組換えバクテリオファージに関する。
　バクテリオファージＴ７(Ｔ７ファージ)は、ポドウイルス科に属するエンベロープを持たないＤＮＡウイルスで、正２０面体のカプシドの内部に、直鎖状の二本鎖ＤＮＡをゲノムとして持つファージである。宿主細胞の大腸菌に感染してファージＤＮＡを宿主中で複製、増殖させて多数のファージ粒子を形成し、宿主の細胞膜を破り溶菌する。ゲノムは１９８３年に解読されており、約４０ｋｂｐの核酸配列からなり、５５の遺伝子を含む。
　大腸菌に感染するファージは、ファージディスプレイ法に利用されており、ファージの表面にファージのコートタンパク質と融合した外来タンパク質、ペプチドを、他の分子と相互作用できる形で提示することができるため、機能モチーフの探索のための最も有力な方法の一つとなっている。しかし、機能モチーフのスクリーニング過程におけるファージの検出工程に、ＥＬＩＳＡなどの煩雑な方法を用いるため、スクリーニングに莫大な手間と時間を要するという欠点がある。
　最近、ファージのイメージングのために、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質を用いて、Ｔ７ファージ(非特許文献１、２)、Ｔ４ファージ(非特許文献３)、またはラムダファージ(非特許文献４)を可視化して検出する報告がなされている。しかし、ファージに発現させる蛍光タンパク質の数が１～３個と極めて少ないため、蛍光強度が弱く、また、ファージ当たりの蛍光タンパク質の数が制御できないため一定でなく、蛍光強度を指標にした正確なスクリーニングや検出をすることができない。
　非特許文献１および２には、ＧＦＰ－キャプシド融合タンパク質を発現するヘルパープラスミドを、大腸菌内で発現させてファージに補うこと、あるいは、ファージゲノムのキャプシドタンパクのプロモーター活性を極めて減弱させたＴ７ファージに、ＧＦＰ－キャプシド融合タンパク質遺伝子を組み込んだ上で、野生型キャプシドタンパクをヘルパープラスミドにより大腸菌内で過剰に発現させてファージに補うことにより、いずれの場合も、Ｔ７ファージ１分子あたりＧＦＰタンパク質を１個～３個含むＴ７ファージが得られたことが報告されている。しかし、この蛍光は極めて弱いものであり、また、発現させるＧＦＰの数を制御できないため、ファージによってＧＦＰの数が一定しておらず、蛍光強度を指標にしたスクリーニングを行うことができない。
　非特許文献３には、Ｔ４ファージキャプシドのアクセサリータンパクＨｏｃにＧＦＰを融合させたタンパクを、ヘルパープラスミドを用いた大腸菌による過剰発現でＴ４ファージに付加することにより、蛍光ファージにしたことが記載されているが、ファージに結合しなかった遊離のＨｏｃ－ＧＦＰタンパク質をＦＰＬＣで分離する必要があり、しかも、得られた蛍光Ｔ４ファージは、ＧＦＰのついていないＴ４ファージに比べ、１.１倍程度の蛍光強度しか有さない。
　非特許文献４には、λファージのネック部分にＧＦＰタンパクが取り込まれるように設計することが記載されているが、ファージに発現させる蛍光タンパク質の数が少なく、ファージ当たりの蛍光タンパク質の数が制御不能である点で変わらない。
　さらに、非特許文献１～３に記載されたファージは、蛍光タンパク質をキャプシドに融合させているために、ファージディスプレイ法に使用した場合に、蛍光タンパク質が、提示するタンパク質と立体障害を起こすという欠点がある。同様に、特許文献１に記載のルシフェラーゼ酵素遺伝子をキャプシド表面に発現させる組換えバクテリオファージにおいても、このような立体障害を起こす可能性がある。
特表２０１７－５１１７０２号公報
Protein Eng. Des. Sel. (2008) Vol.21,No.7, p.413-424 Nucleic Acids Res.(2006)Vol.34, No.20 e137 Bacteriophage (2014)Landes Bioscience Vol.4, e28364-1-6 Appl. Microbiol. Biotechnol. (2014)Vol.98, p.2853-2866
　本発明は、Ｔ７ファージを十分に可視化することのできる強度で、活性を有する蛍光タンパク質を発現することができ、あるいは、Ｔ７ファージを可視化できる、活性を有する呈色反応を触媒する酵素を発現することのできる、ファージディスプレイ法に好適に使用できる組換えＴ７ファージを提供することをその課題とする。
　また、本発明は、そのような組換えＴ７ファージをファージディスプレイ法に使用する方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、標識タンパク質である蛍光タンパク質の遺伝子または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を、Ｔ７ファージの特定の遺伝子領域に発現可能に挿入することにより、Ｔ７ファージが宿主に感染しその複製中に、蛍光タンパク質または呈色反応を触媒する酵素が正しく折り畳まれ、活性を有する立体構造でファージタンパク質の一部として発現されることを見出し、本発明の完成に至った。この組換えＴ７ファージは、このように異種遺伝子を発現できるだけでなく、溶菌後感染性ウイルスとして新たな宿主に感染することができる。
　すなわち、本発明は、以下の(１)～(７)の組換えバクテリオファージＴ７に関する。
（１）組換えバクテリオファージＴ７であって、バクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１７遺伝子領域に、標識タンパク質の遺伝子が発現可能に挿入されていることを特徴とする、組換えバクテリオファージＴ７。
（２）前記標識タンパク質が、蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素である、上記(１)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
（３）前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)であり、前記呈色反応を触媒する酵素が、ルシフェラーゼ、β－グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼのいずれか一つである、上記(２)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
（４）前記標識タンパク質の遺伝子が、ｇｐ１７遺伝子コード領域末端近傍に挿入されている、上記(１)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
（５）前記ｇｐ１７遺伝子コード領域末端近傍が、３´末端領域である、上記(４)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
（６）組換えバクテリオファージＴ７が、宿主細胞に感染後の細胞質におけるファージ複製の間に、前記蛍光タンパク質の遺伝子または発光または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を発現して、活性を有する蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素生成物を生じる、上記(２)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
（７）前記蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素が、バクテリオファージＴ７の尾部に発現する、上記(６)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
　また、本発明は、以下(８)の組換えバクテリオファージＴ７のランダムペプチドファージライブラリー、または(９)、(１０)のランダムペプチドファージライブラリーを使用する方法に関する。
（８）組換えバクテリオファージＴ７であって、バクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１７遺伝子領域に標識タンパク質の遺伝子が発現可能に挿入されている組換えバクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１０遺伝子領域に、ランダムペプチドをコードする核酸分子を挿入した、組換えバクテリオファージＴ７のランダムペプチドファージライブラリー。
（９）上記（８）に記載の組換えバクテリオファージＴ７のランダムペプチドファージライブラリーを使用するｉｎ　ｖｉｔｒｏスクリーニング方法。
（１０）上記（８）に記載の組換えバクテリオファージＴ７のランダムペプチドファージライブラリーを使用するｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニング方法。
　従来法では、１ファージ分子あたりの発現される蛍光タンパク質が１～３個までと少ないが、本発明の組換えファージでは、従来法に比べ１オーダー上の多数の蛍光タンパク質が発現するため、蛍光強度に各段の差がある。
　また、従来法では、ファージ分子あたりの蛍光タンパク質の数を制御することができず、ファージにより蛍光タンパクの数が異なり、蛍光強度が一定ではないが、本発明の組換えファージには、すべてのファージに必ず同じ数の蛍光タンパク質が発現するため、正確な一定の蛍光強度によるスクリーニングを実現できる。
　さらに、ファージにヘルパープラスミドを用いて大腸菌で蛍光タンパク質を過剰発現させて補充する必要がないので、スクリーニングにおけるパニングの過程で、選択したファージを複製・増殖するラウンドごとに、未結合の蛍光タンパク質と目的の蛍光を発するファージとを毎回分離する手間もかからず、また、選択増幅したすべてのファージに蛍光タンパク質が間違いなく結合しているかを、ラウンドのたびに検証する必要がない。
　また、本発明の組換えファージをファージディスプレイに使用する場合に、ライブラリー部分のランダムペプチドを発現するキャプシド部分とは異なる構造部分に蛍光タンパク質が発現することから、ターゲットに対する結合の立体障害を生じることなく、ファージディスプレイ法で重要な要素であるターゲットとの結合に対しても見逃しが起きないという優れた効果を奏する。
制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩによるＴ７ファージゲノムＤＮＡの切断部位を示す。 制限酵素で切断後のＤＮＡフラグメントのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。 ＧＳスペーサーとｓｆＧＦＰ遺伝子を含む２.９ｋｂフラグメントの調製方法を示す。 ２.９ｋｂフラグメントのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。 組換えＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰのゲノムの概略を示す。 組換えＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰを感染させた大腸菌のプラークの実体蛍光顕微鏡写真を示す。 第２世代の組み換えファージのｇｐ１７－ｓｆＧＦＰのウエスタンブロットを示す。 Ｔ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージゲノム全長ＤＮＡと、制限酵素で切断後のＤＮＡフラグメントのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。 動物細胞発現用プラスミドベクターによるｍＬＤＬＲｅｘｔ－ｍｙｃの発現を示す抗ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット。 実施例５におけるラウンド１→３でのＬＤＬＲｅｘｔ結合性を示すファージの占める割合の変化を示す。 実施例５におけるラウンド３のファージが、ｍＬＤＬＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞に特異的に結合することを示す、蛍光顕微鏡写真。(ａ、ＧＦＰシグナル（緑）；ｂ、ｍＣｈｅｒｒｙシグナル(赤)；ｃ、ａとｂの重ね合わせ) 実施例６におけるラウンド１→４でのマウス脳への侵入機能を示すファージの占める割合の変化を示す。 実施例６でのファージの有するペプチドを末端ＴＡＭＲＡ化し、マウスの鼻粘膜に滴下し一定時間後、頭蓋骨を落射型蛍光実体顕微鏡により観察した写真を示す。 図１３の頭蓋骨の凍結切片のＴＡＭＲＡシグナルを、落射型蛍光顕微鏡により観察した写真を示す。スケールバー：50μm。
　バクテリオファージＴ７(Ｔ７ファージ)は、二本鎖直鎖状のゲノムＤＮＡを持つ溶菌性のファージであり、大腸菌表面にあるＬＰＳに結合して、大腸菌内へＤＮＡを注入して感染する。ゲノムＤＮＡを格納するファージの頭部は、４１５個のＧ１０タンパク質の会合により形成され、その下に尾部が付加されている。
　ゲノムＤＮＡは、約４０ｋｂｐの核酸配列からなり５５の遺伝子を含み、必須遺伝子には整数の番号が付けられている。ｇｐ１はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で、感染初期に大腸菌由来ＲＮＡポリメラーゼによって転写された後、それ以降のウイルス遺伝子の転写を行い、ｇｐ５はＤＮＡポリメラーゼ遺伝子でＤＮＡの複製を行う。ｇｐ１０は頭部キャプシドの主成分である外郭を構成する遺伝子であり、ｇｐ１７は尾部の付け根から伸びる尾部繊維タンパク質遺伝子で、尾部繊維タンパク質は３分子で一本の繊維を形成し、この繊維が６本伸びて尾部の脚を形成する。
　本発明において、「バクテリオファージ」もしくは「ファージ」とは、それらを複製する手段として、天然において細菌を使用するように進化したウイルスである。ファージは、このことを、ファージ自体を細菌に付着させ、そのＤＮＡをその細菌の中に注入し、上記ファージを数百倍もしくはさらには数千倍も複製するようにその細菌を誘導することによって行う。これをファージ増幅ともいう。
　本発明において、「バクテリオファージＴ７」とは、天然のバクテリオファージＴ７と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％の相同性を有するゲノムを有し、かつ上記ファージ増幅を行い、最終的に細菌の細胞壁を破り(溶菌)、細胞外に放出されるバクテリオファージをいう。
　また、「組換え」とは、他の方法では見いだされない遺伝的物質を一緒にするための遺伝的な改変をいう。
　本発明の組換えファージに導入される標識タンパク質の遺伝子としては、基質が必要ない点で蛍光タンパク質の遺伝子が好ましい。蛍光タンパク質としては、市販されている緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、黄色蛍光タンパク質(ＹＦＰ)、またはシアン蛍光タンパク質(ＣＦＰ)の遺伝子を用いることができ、これらのタンパク質の修飾型のすべてのｖａｒｉａｎｔのいずれの遺伝子も用いることができる。
　また、発光または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を用いることができ、たとえば、ルシフェラーゼ(Ｌｕｃ)、β－グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)、β－ガラクトシダーゼ(Ｇａｌ)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)等の市販されている遺伝子が挙げられる。
　また、蛍光・発光タンパク質や蛍光色素に対して結合性を有するペプチドをコードするＤＮＡを用いることができ、それ以外にも、ビオチン化タグ配列ペプチド(大腸菌のビオチンライゲースＢｉｒＡのアクセプターペプチド)、あるいは各種タグ配列(ＨＡ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ等)も用いることができる。
　本発明において、「ｇｐ１７遺伝子領域に、標識タンパク質の遺伝子が発現可能に挿入されている」とは、両遺伝子が発現する際に、ｇｐ１７遺伝子の発現産物である尾部繊維タンパク質と蛍光タンパク質等とが融合タンパク質として発現される状態で、ｇｐ１７遺伝子領域に標識タンパク質の遺伝子が挿入されている状態を意味する。ｇｐ１７遺伝子は、尾部の付け根から伸びる尾部繊維タンパク質遺伝子であり、３分子で一本の繊維を形成する。Ｔ７ファージはその繊維からなる脚を６本有するため、ｇｐ１７遺伝子領域に蛍光タンパク質等の遺伝子を発現可能に挿入することにより、３×６＝１８の１８個の蛍光タンパク質、酵素、タグ配列等が脚表面に発現した尾部を有する組換えファージを作成することができる。
　蛍光タンパク質等の遺伝子が挿入されるｇｐ１７遺伝子領域は、蛍光タンパク質等の遺伝子の発現が、ｇｐ１７遺伝子のプロモーターまたは調節領域により機能的に制御され、かつ、ｇｐ１７遺伝子が機能的に発現可能な領域であればいかなる領域であってもよい。ｇｐ１７遺伝子の機能が欠失しにくいｇｐ１７遺伝子のコード領域の末端近傍のコード領域内または転写領域内が好ましく、ｇｐ１７遺伝子のコード領域の５´末端または３´末端がより好ましい。
　ｇｐ１７遺伝子と蛍光タンパク質等の遺伝子は、同じプロモーターまたは調節領域が、両遺伝子を制御できるように連結される必要があり、スペーサー配列またはリンカー配列を介して連結してもよい。ｇｐ１７遺伝子と蛍光タンパク質等の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含む融合タンパク質が発現するように、インフレームで連結させることにより、一旦プロモーターで転写が始まると、コード領域を通って終止コドンまで転写が続く。ｇｐ１７遺伝子および蛍光タンパク質等の遺伝子は、５´→３´方向に存在する。
　蛍光タンパク質等の異種遺伝子をファージゲノムの特定の領域に挿入する遺伝子組換え操作方法は、当業者に周知であり、相同組み換えやゲノム編集技術を用いることができる。組換え操作の方法の原則は、たとえばＰＣＲ増幅によって、組み込むべき断片及び２つの組換えアームを含むＤＮＡ断片を作製することである。これらのアームは、挿入する遺伝子に隣接した領域に相同である。これらのＤＮＡ断片は、相同なアームを含んだプライマーを用いたＰＣＲによって、数十塩基配列のヌクレオチドから作り出すことも可能である。
　本発明では、Ｔ７ゲノムの全長ＤＮＡ中での切断部位がそれぞれ１か所である２つの制限酵素の制限部位が、Ｔ７ゲノムのｇｐ１７遺伝子の３´末端近傍のコード領域中と３´末端下流領域に存在するため、それらの制限酵素部位を利用して、ｇｐ１７遺伝子コード領域の３´末端にＧＦＰ遺伝子を導入することができる。
　後述する実施例では、Ｔ７ファージとして、野生型のＴ７ファージ(４０ｋｂ)のキャプシドタンパク質のＣ末端に任意のペプチドを融合タンパク質として発現させることのできる改変体である、Ｔ７　Ｓｅｌｅｃｔ　４１５－１ｂ(Merk Millipore社製)を用いる。キャプシドタンパク質の発現に関わるＤＮＡ部分以外は、Ｔ７　Ｓｅｌｅｃｔ　４１５－１ｂのＤＮＡは、野生型Ｔ７ゲノムＤＮＡと同じである。
　ＳｆｉＩ－ＰｍｌＩ間のみならず、ｇｐ１７遺伝子を含んだ前後のゲノムはすべて保存されているので、本発明の組換えＴ７ファージの作成方法は、野生型Ｔ７を含めたすべてのＴ７改変体ファージ(Ｔ７　Ｓｅｌｅｃｔ　４１５－１ｂ，１０－３ｂ，１－１ｂ，１－２ａ，１－２ｂ，１－２ｃ：Merk Millipore社製)に適用することができる。
　最初に、Ｔ７ファージのゲノムＤＮＡを制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩにより切断し、得られた切断断片である３３.３ｋｂ、２.１ｋｂ、１.９ｋｂの３本のＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分離して、３３.３ｋｂと１.９ｋｂのそれぞれのＤＮＡ断片のサイズのバンドのＤＮＡを溶出させてそれぞれ精製する。各精製ＤＮＡフラグメントは、アガロース電気泳動で精製をさらに確認する。
　次いで、Ｔ７ゲノムのｇｐ１７配列内のＳｆｉＩ制限部位からｇｐ１７下流にあるＰｍｌＩ制限部位までの上記２.１ｋｂのＤＮＡ断片において、ｇｐ１７コード領域の３´末端にＧＳスペーサー配列をコードする遺伝子を介してＧＦＰ遺伝子が連結されている約２.９ｋｂのフラグメントを、以下のオーバーラップ伸長ＰＣＲ法を用いて作製する。
　このフラグメントを作製するために、まず２.９ｋｂを約１ｋｂずつの３本のフラグメント(以下、それぞれＡ、Ｂ、Ｃという。)に分けて、それぞれ化学合成により作製する。Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれの５´末端と３´末端に、３０ｂｐのオーバーラップ配列を付加する。フラグメントＡとＢのオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、ＰＣＲ産物Ａ＋Ｂが作製され、このＡ＋Ｂ産物とフラグメントＣとのオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、ＰＣＲ産物Ａ＋Ｂ＋Ｃという目的の２.９ｋｂ産物を得る。各ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分離して、該当するバンドを切り取り、精製した２.９ｋｂフラグメントの５´末端と３´末端を、制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩで消化する。
　次に、Ｔ７ファージのゲノムＤＮＡを制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩにより切断して得られ、精製しておいた３３.３ｋｂと１.９ｋｂの２つのフラグメントと、オーバーラップ伸長ＰＣＲ産物である精製した２.９ｋｂフラグメントの合計３本のフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応により連結する。このライゲーション反応産物とＴ７ファージ抽出物とを混合してパッケージング反応を行い、組換えＴ７ファージを作成して大腸菌に感染させる。
　感染させた大腸菌をＬＢプレートに蒔いて、出現するプラークが蛍光を発することにより、蛍光タンパク質が正確に折り畳まれて発現する組換えＴ７ファージを得られることを確認する。そして、この蛍光を発する組換えＴ７ファージの感染性を、さらに大腸菌に感染させて液体培地中で増殖させ、溶菌を確認してから溶菌物を遠心して、上清中のファージ液が蛍光を発することにより確認する。
　本発明の組換えＴ７ファージは、１ファージ分子あたり１８個の蛍光タンパク質が発現するため、蛍光強度が強く、しかもすべてのファージに必ず同じ数の蛍光タンパク質が発現するため、正確な一定の蛍光強度によるスクリーニングを実現できる。
　本発明の組換えＴ７ファージは、当技術分野において周知の選択またはスクリーニングのためのファージディスプレイライブラリーの作製に使用することができる。ランダムな配列を有するペプチドをコードする核酸分子を、バクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１０遺伝子領域に、ランダムペプチドとキャプシドタンパク質とが融合タンパク質として発現される状態で挿入して、組換えバクテリオファージＴ７のランダムペプチドファージライブラリーを作成する。それぞれのファージ粒子は１つポリペプチドを提示し、次いでファージ粒子は、関心対象の分子であるターゲットとの親和性相互作用に基づいて選択する。発現できるペプチドは１ファージ当たり１種類であるが、１０１２個／ｍｌ以上の濃度でファージを調製することが可能であるため、さまざまな種類のペプチドを発現したファージ集団をライブラリーとして用いることができる。
　本発明のファージディスプライブラリーを構成するファージは、蛍光を発するため、ファージライブラリーのｉｎ　ｖｉｔｒｏスクリーニングだけでなく、ｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニングの解析工程も可視化でき、一定強度のファージの極めて迅速かつ正確な選択増幅によるスクリーニングを実現できることが特徴である。
　本発明の組換えＴ７ファージは、ライブラリー部分のランダムペプチドを発現する頭部キャプシド部分とは異なる尾部部分に、蛍光タンパク質が発現することから、ターゲットに対する結合の立体障害を生じることなく、ファージディスプレイ法で重要な要素であるターゲットとの結合の見逃しが起きないという顕著な効果を有する。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
　Ｔ７　Ｓｅｌｅｃｔ　４１５－１ｂ　ＤＮＡを制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩ(New England Biolab社製)で切断して、３３.３ｋｂ、２.１ｋｂ、１.９ｋｂの３本のＤＮＡ断片を得た。概略を図１に示す。この３本のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し(結果を図２に示す。)、電気泳動後、ゲルから各フラグメントのそれぞれのバンドを切り出し、以下のように精製した。
　３３.３ｋｂフラグメントは、ＧｅＢＡｆｌｅｘ－ｔｕｂｅ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｋｉｔ(MW:3500、WACO社製)を用いて、切り出したゲル片から電気泳動による溶出(１００Ｖ，２ｈ，４℃)を行い、回収した溶出液からエタノール沈殿により３３.３ｋｂＤＮＡを得た。１.９ｋｂフラグメントは、ＱＩＡＧＥＮ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ(QIAGEN社製)を用いて通常の方法で溶出精製した。得られた各精製ＤＮＡフラグメントの純度をアガロース電気泳動で確認した。
　Ｔ７ゲノムのＴａｉｌ　ｆｉｂｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ(ｇｐ１７)の３´末端に、ＧＳスペーサー配列(GGGGSGGGGSGGGGS)を介してｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰを連結した融合タンパクＴａｉｌ　ｆｉｂｅｒ－ｓｆＧＦＰ(ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰ)の遺伝子を設計した。Ｇｐ１７配列内のＳｆｉＩサイトからｇｐ１７下流Ｔ７ゲノム上のＰｍｌＩサイトまでの約２.９ｋｂフラグメント(中ほどにＧＳスペーサーおよびｓｆＧＦＰ遺伝子を含む)を、以下のオーバーラップ伸長ＰＣＲを行うことにより調製した。この調製方法を図３に示す。
　２.９ｋｂを約１ｋｂずつの３本のフラグメント(Ａ、Ｂ、Ｃ)に分けて設計し、それぞれ５´および３´末端に３０ｂｐのオーバーラップ配列を配置して、Ａ、Ｂ、Ｃの３本のＤＮＡフラグメントを化学合成によって調製した。フラグメントＡとＢのオーバーラップ伸長ＰＣＲ産物Ａ＋Ｂ(５´Ｐｒｉｍｅｒ　GTAGGTCAGGCCGTTGTGG(配列番号１))、(３´Ｐｒｉｍｅｒ　TAATCCTATCAGTGCTCCCTTCC(配列番号２))と、フラグメントＣを用いてさらにオーバーラップ伸長ＰＣＲ(５´Ｐｒｉｍｅｒ　GTAGGTCAGGCCGTTGTGG(配列番号１))、(３´Ｐｒｉｍｅｒ　GTTCTCTTCACGTGTCCTTGGGTACAG(配列番号３))を行い、目的の２.９ｋｂ産物を得た。各ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動を行って該当するバンドを切り出し、Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて溶出精製した。精製した２.９ｋｂフラグメントの５´および３´末端を制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩにて消化し、再度アガロースゲル電気泳動を行って(結果を図４に示す。)、Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて溶出精製した。
　実施例１で精製したＴ７ゲノムＤＮＡのＳｆｉＩおよびＰｍｌＩ切断産物である３３.３ｋｂ、１.９ｋｂの２本のフラグメントと、オーバーラップ伸長ＰＣＲ産物である２・９ｋｂフラグメントの、合計３本のフラグメントを、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ(Ligation High Ver.2,TOYOBO社製)を用いて ライゲーション反応により連結した。ライゲーション反応産物の概略を図５に示す。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｔ７　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｋｉｔ(Merk Millipore社製)を用いて、ライゲーション反応産物とＴ７ファージ抽出物とのパッケージング反応を行い(室温２時間)、対数増殖期に達した大腸菌 ＢＬ２１(Merk Millipore社製)に感染させた。
　感染させたＢＬ２１をＴＯＰ　ａｇａｒｏｓｅと混和してＬＢプレートに蒔き、出現したプラークが蛍光を発することを、実体顕微鏡による蛍光観察で、肉眼で観察して確認した。この実体顕微鏡写真を図６に示す。採取したプラークをファージ抽出緩衝液(２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，６ｍＭ　ＭｇＳＯ４，ｐＨ８.０)とインキュベート(４℃、３ｈ)し、少量のクロロホルムと転倒混和後、遠心(３,０００×ｇ，５分)して上清を採取し、ファージ抽出液を得た。抽出したファージ液の蛍光を実体顕微鏡下でさらに確認後、抽出したファージＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い(５‘Ｐｒｉｍｅｒ　TCAGATAACAACAATGACTGTACCTTCCAC(配列番号４))、(３‘Ｐｒｉｍｅｒ　TCTTCACGTGTCCTTGGGTACAGAGC(配列番号５))、ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰが予想する分子量および単一バンドであること確認し、ＧＳスペーサーおよびｓｆＧＦＰ配列がＴ７ゲノムＤＮＡｇｐ１７の３´末端に挿入されていることを確認した。
　次に、得られたファージのゲノムＤＮＡの塩基配列解析を行い、Ｔ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージが生成されたことを塩基配列レベルで確認した。このＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージを第１世代とし、さらに大腸菌ＢＬ２１に感染させて液体培地(Ｌ－Ｂｒｏｔｈ)中で増殖させて、溶菌を確認したのち遠心(８,０００×ｇ，１０分)し、上清を採取することによりＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージを得た(第２世代)。得られたＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージ液の蛍光を実体蛍光顕微鏡下で確認し、上記第１世代同様、これを鋳型にしてＰＣＲを行い、ｇｐ１７－ｓｆＧＦに該当する単一バンドを確認後、さらにゲノムＤＮＡの塩基配列解析を行って、世代を経たファージ増殖後もＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰが、ゲノム上の設計通りの位置に継代されていることを確認した。
　上記のように、作成したファージにｓｆＧＦＰの蛍光が認められることから、ｓｆＧＦＰは正しくフォールディングされてファージに組み込まれていることが予想された。また、上記のシークエンス解析によって、ｓｆＧＦＰはｇｐ１７にインフレームで組み込まれていることが判明した。そこで、タンパク質レベルで設計どおりに翻訳されているかどうかを以下のように調べた。作成したｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージをＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより抗ＧＦＰ抗体で検出し、検出されるバンドの分子量が、ｇｐ１７タンパク質＋ＧＳスペーサー＋ｓｆＧＦＰの総和分子量の約９０ｋＤａ付近に認められるかどうかを調べた。
　コントロールサンプルとして、ｇｐ１７－ＧＳスペーサー－ｓｆＧＦＰタンパク質のみを大腸菌で作らせ、蛍光を発することを確認したのち、上記Ｔ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージと同様に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットして抗ＧＦＰ抗体で検出した。結果は、大腸菌で作成したｇｐ１７－ＧＳスペーサー－ｓｆＧＦＰタンパク質と、Ｔ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージとで同じ約９０ｋＤａ付近に抗ＧＦＰ抗体で認識されるバンドが検出された(図７)。このことから、上記ＧＦＰの蛍光を発するＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージは、塩基配列レベルおよびタンパク質レベル双方において、設計どおりに構築されていること、そして実際に強い蛍光を認めることから、ｓｆＧＦＰは正しくフォールディングされてＴ７ファージの尾部繊維タンパク質に組み込まれていることが確認された。
[組換えファージのファージライブラリーの作製]
　実施例３で作製したＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージを、ＰＥＧ沈殿により濃縮した後２％ＳＤＳ処理によりファージゲノムＤＮＡを抽出し、１６，５００×ｇで遠心した上清から、ＱＩＡＧＥＮ　Ｇｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ　２０/Ｇ(ＱＩＡＧＥＮ社)を用いてＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰファージゲノムＤＮＡ(３８．１ｋｂ)を精製した。得られたファージゲノムＤＮＡをエタノール沈殿後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、２１．５ｋｂｐおよび１６．６ｋｂｐの断片を得、０．８％アガロースゲル電気泳動を行って、ＱＩＡＧＥＮ　ＧＥＬ　ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ　ＫＩＴを用いて精製した（図８）。
　ファージライブラリーのランダムペプチド(１２アミノ酸残基)に該当する配列とスペーサー配列および６×Ｈｉｓタグ配列、ＦＬＡＧタグ配列を含む１５０ｂｐのＤＮＡ配列(GGCGGCGGTGGTCATCACCATCACCATCATGGCGGTGGGTCGGGTGGCGGGTCTGGTGGCGGGTCAGGCGGTGGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGTGGCGGTGGCGGGGACTACAAAGACGATGACGACAAG(配列番号６))を合成し、これをテンプレートとしてＥｃｏＲＩ配列を含む(５′プライマー　TATGAATTCGGGCGGCGGTGGTCATCACCATCAC((配列番号７))およびＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む(３′プライマー　GCGAAGCTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTC(配列番号８))を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物として、ファージゲノムＤＮＡに挿入するインサートＤＮＡを得た。このＰＣＲ産物の５′および３′末端をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、２％アガロース電気泳動およびＱＩＡＧＥＮ　ＧＥＬ　ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ　ＫＩＴにより精製した。得られたインサートＤＮＡと、２１．５ｋｂｐおよび１６．６ｋｂｐのファージゲノムＤＮＡをＴ４ライゲースによりライゲーション反応を行い、ライゲーション産物をＴ７　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔｓ（メルクミリポア社）と混合して、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ反応を行った。Ｐａｃｋａｇｉｎｇ産物を大腸菌ＢＬ２１に感染させて、ＬＢプレート(１５０ｍｍ)に蒔いて増幅させ(３７℃、２．５時間)、増幅したファージを、１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび６ｍＭ　ＭｇＳＯ４を含む緩衝液でプラークから回収し、遠心した上清を回収して、Ｔ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰランダムペプチドライブラリー(Ｔ７－ｓｆＧＦＰ×１２)を得た。
[ランダムペプチドファージライブラリーを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏスクリーニング]
　動物細胞発現用プラスミドベクターｐＣＡＧＥＮ(Ａｄｄｇｅｎｅ社)のマルチクローニングサイトに、マウスＬＤＬ受容体(ｍＬＤＬＲ)の細胞外領域(ｅｘｔ)(ｍＬＤＬＲｅｘｔ)とその３’末端にｍｙｃタグ配列を連結させた断片(ｍＬＤＬＲｅｘｔ－ｍｙｃ)を挿入した動物細胞発現ベクタ―を作成した。これをＨＥＫ２９３－Ｔ細胞にトランスフェクションし、４８時間後に培養上清にｍＬＤＬＲｅｘｔ－ｍｙｃが分泌されていることを、抗ｍｙｃ抗体(マウスＩｇＧ)を用いてウエスタンブロットにて確認した(図９)。この培養上清から、抗ｍｙｃ抗体(マウスＩｇＧ)および抗マウスＩｇＧ－磁気ビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　Ｓｈｅｅｐ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、ベリタス社)を用いて、免疫沈降法によりｍＬＤＬＲｅｘｔ－ｍｙｃ－磁気ビーズを作成した。これをリガンドとして、上記ランダムペプチドライブラリー(Ｔ７－ｓｆＧＦＰ×１２)と４℃、１時間インキュベートし、緩衝液で洗浄したのちに、ｍＬＤＬＲｅｘｔ－ｍｙｃ－磁気ビーズに結合したファージプールを得、１％ＳＤＳで溶出して、ＬＤＬ受容体細胞外領域(ＬＤＬＲｅｘｔ)に結合性を示すファージの１次プールとした(ラウンド１)。
　これを大腸菌ＢＬ２１に感染させて増幅し、ラウンド１のインプットと同じ量のファージを次のラウンド２のスクリーニングのインプットとして用い、上記同様の操作を続けて、合計３回のバイオパニングを実施した。ラウンドを進めるにつれて回収されるファージの「アウトプット／インプット」の比が上昇し、最終的には、ＬＤＬＲｅｘｔ結合性を示すファージの占める割合がラウンド１の１０００倍以上に上昇した(図１０)。
　得られたラウンド３のファージをＰＥＧ沈殿により濃縮し、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞培養液(ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ)に懸濁し、マウスＬＤＬ受容体(細胞内Ｃ末端にｍＣｈｅｒｒｙを連結)を発現させたＨＥＫ２９３－Ｔ細胞の培養上清に添加した。室温で１０－１５分のインキュベーション後、蛍光顕微鏡で観察すると、ファージはｍＬＤＬＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞に特異的に結合することが確認された(図１１)。図１１中、ａ、ＧＦＰシグナル(緑)；ｂ、ｍＣｈｅｒｒｙシグナル(赤)；ｃ、ａとｂの重ね合わせ。
　以上、図１０および図１１の結果は、本発明により創出した新規蛍光ファージＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰは、（１）これを用いてランダムペプチド蛍光ファージライブラリーの作製が可能であること、（２）目的とする機能ペプチド配列を有する蛍光ファージが標的へ結合する様子を、ライブイメージングすることが可能であることを示す。
　このように、本発明のファージの放つ蛍光を検知することにより、受容体などの標的に結合性を示す機能ペプチド配列を持つファージをリアルタイムで追尾しながら、バイオパニングを迅速に遂行することができ、目的とする機能ペプチドの創出を、従来のファージを用いたスクリーニング・バイオパニングに比べて、極めて高速に創出することが可能となることを示すものである。
[ランダムペプチドファージライブラリーを用いたｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニング]
　Ｔ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰランダムペプチドライブラリー(Ｔ７－ｓｆＧＦＰ×１２)を、麻酔したマウス鼻粘膜に滴下し、一定時間後に脳を摘出し、ホモジナイズして大腸菌ＢＬ２１に感染させ、ＬＢプレート(１５０ｍｍ)にまいて増幅(３７℃、２．５時間)後、プラークからファージを回収した。このファージを用いて次のラウンドへ進み、ラウンド１と等量のファージをマウス鼻粘膜に滴下し、上記同様の操作を４回繰り返した。ラウンドを進めるにつれて回収されるファージの「アウトプット／インプット」の比が約９００倍上昇した(図１２)。
　ラウンド４で得られたファージから任意に約１００クローンを選択し、ファージＤＮＡのランダムペプチド部分に該当する塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ(ThermoFisher社)を用いて解析した。得られた塩基配列のうち、出現頻度の極めて高い塩基配列を持つファージクローン群から１つを選んで(クローンＡ)、ペプチド該当部分の１２アミノ酸残基のペプチドを化学合成し、Ｎ末端にＴＡＭＲＡ蛍光標識を行った。
　上記の末端ＴＡＭＲＡ化したペプチドをＰＢＳに溶解し麻酔下のマウスの鼻粘膜に滴下(１ｍＭ、５μＬ)、１～２時間後に４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を用いて灌流固定を行った。断頭後に頭皮を除去して落射型蛍光実体顕微鏡(OLYMPUS SZX16)下、低倍率でＴＡＭＲＡシグナルの観察を頭蓋骨の上から行った。ＴＡＭＲＡシグナルは嗅球付近に強いシグナルを骨の外から検出できた(図１３)。
　上記観察後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ溶液(ｐＨ８．０)を用いて脱カルシウム処理(４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ×７ｄａｙｓ)を行い，３０％スクロース・リン酸緩衝液に置換後、頭骨ごと凍結切片(５０μｍ　ｔｈｉｃｋ、矢状断)を作製して落射型蛍光顕微鏡(OLYMPUS
BX53)を用いてＴＡＭＲＡシグナルの観察を行った。結果を図１４に示す。鼻粘膜から嗅上皮および呼吸上皮の神経細胞内(図１４(ａ)(ｂ))に侵入した機能ペプチドの強いシグナルを検出した。
　以上、実施例５および６の結果は、本発明にて創出した新規蛍光ファージＴ７ｇｐ１７－ｓｆＧＦＰ、およびこれを用いて作成したランダムペプチド蛍光ファージライブラリーがｉｎ　ｖｉｔｒｏだけでなくｉｎ　ｖｉｖｏにおいてもスクリーニングやバイオパニングに応用が可能であることを示しており、生体反応を利用した機能ペプチド配列スクリーニングを、ｉｎ　ｖｉｖｏでファージの蛍光をリアルタイムに追尾しながら極めて迅速に遂行することが可能になることを示すものである。
　本発明の組換えバクテリオファージＴ７は、ファージ分子あたりの発現する標識タンパク質である蛍光タンパク質の数が一定であり、数も多くて蛍光強度が高いので、正確な一定の蛍光強度によるスクリーニングを実現することができる。
　また、本発明の組換えファージをファージディスプレイに使用する場合に、ライブラリー部分のランダムペプチドを発現するキャプシド部分とは異なる構造部分に蛍光タンパク質等が発現することから、ターゲットに対する結合の立体障害を生じることなく、ファージディスプレイ法で重要な要素であるターゲットとの結合の見逃しが起きないという優れた効果を有する。
　本発明の蛍光ファージは、自身の放つ蛍光によってリアルタイム検出ができるので、従来法のＥＬＩＳＡなどを用いた間接的で時間と手間のかかるファージ検出法を省略できるのみならず、先行研究のように蛍光タンパク質をヘルパープラスミドを用いた大腸菌による過剰発現でファージに付加しないので、スクリーニングにおけるパニングの過程で、選択したファージを複製・増幅するラウンドごとに、未結合蛍光タンパク質と目的の蛍光を発するファージとを分離する手間もかからない。選択増幅したすべてのファージに蛍光タンパク質が間違いなく結合しているかを、ラウンドのたびに検証する必要がなく、一定強度のファージの極めて迅速かつ正確な選択増幅によるスクリーニングを実現できる。
　さらに、非特許文献２では、蛍光タンパク質とＴ７キャプシドタンパク質の融合タンパク質をヘルパープラスミドを用いて大腸菌による過剰発現でファージに付加しているが、この方法では、野生型のＴ７キャプシドタンパク質をさらに大過剰に同時に発現させることがファージ生成に必須であり、このことにより、実際は全ファージの一部にしか蛍光タンパク質が入らない(６％～１６％)。すなわち、この方法を用いると、スクリーニングにより選択して得た陽性ファージ群を次のスクリーニングのラウンドのために複製・増幅しても、全ファージの一部(６％～１６％)にしか蛍光が入らず、残りの大部分(８４％～９４％)は選択済みの陽性ファージ集団であるにも関わらず、蛍光の無いファージである。選択したファージは、元々ランダムペプチドライブラリーから選択したヘテロな配列のファージ集団なので、この蛍光が入らなかった８４％～９４％のファージ群の中に、最も目標とする配列を持つファージが含まれてしまう可能性は極めて高く、蛍光タンパク質を大腸菌による過剰発現で付加する方法では、目標とするペプチド配列を持つファージを見逃す可能性が高い。
　しかも、６％～１６％の蛍光が入ったファージ群でも、有する蛍光タンパク質は１ファージ当たり１個から最大３個相当なので、前述のように蛍光そのものが弱く強度が一定していないので、スクリーニングには適さない。本発明では、スクリーニングで選択したファージは、選択と増幅のラウンドを重ねてもすべてのファージに蛍光が入った状態で増幅され、陽性ファージの取りこぼしがない。すべてが一定数１８個の蛍光タンパク質を有し、極めて高度の蛍光強度を有することからも、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ　ｖｉｖｏでのスクリーニングに極めて有用なものである。
 

Claims (10)

  1. 　組換えバクテリオファージＴ７であって、バクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１７遺伝子領域に、標識タンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入されていることを特徴とする、組換えバクテリオファージＴ７。
  2. 　前記標識タンパク質が、蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素である、請求項１に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
  3. 　前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、前記発光または呈色反応を触媒する酵素が、ルシフェラーゼ、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼのいずれか一つである、請求項２に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
  4. 　前記標識タンパク質の遺伝子が、ｇｐ１７遺伝子コード領域末端近傍に挿入されている、請求項１に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
  5. 　前記ｇｐ１７遺伝子コード領域末端近傍が、３´末端領域である、請求項４に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
  6. 　組換えバクテリオファージＴ７が、宿主細胞に感染後の細胞質におけるファージ複製の間に、前記蛍光タンパク質の遺伝子または発光または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を発現して、活性を有する蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素生成物を生じる、請求項２に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
  7. 　前記蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素が、バクテリオファージＴ７の尾部に発現する、請求項６に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
  8. 　組換えバクテリオファージＴ７であって、バクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１７遺伝子領域に標識タンパク質の遺伝子が発現可能に挿入されている組換えバクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１０遺伝子領域に、ランダムペプチドをコードする核酸分子を挿入した、組換えバクテリオファージＴ７のランダムペプチドファージライブラリー。
  9. 　請求項８に記載の組換えバクテリオファージＴ７のランダムペプチドファージライブラリーを使用するｉｎ　ｖｉｔｒｏスクリーニング方法。
  10. 　請求項８に記載の組換えバクテリオファージＴ７のランダムペプチドファージライブラリーを使用するｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニング方法。
     
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