JP2020005600A - 新規組換えバクテリオファージ - Google Patents

Abstract

【課題】標識タンパク質である蛍光タンパク質の遺伝子または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子が、Ｔ７ファージのゲノムに発現可能に挿入された組換えＴ７ファージを提供することを課題とする。【解決手段】Ｔ７ファージのｇｐ１７遺伝子領域に、蛍光タンパク質の遺伝子または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を発現可能に挿入して、蛍光タンパク質または呈色反応を触媒する酵素を一定の数で安定に発現する組換えＴ７ファージを作成する。【選択図】図５

Description

本発明は、バクテリオファージＴ７の組換えバクテリオファージに関する。

バクテリオファージＴ７(Ｔ７ファージ)は、ポドウイルス科に属するエンベロープを持たないＤＮＡウイルスで、正２０面体のカプシドの内部に、直鎖状の二本鎖ＤＮＡをゲノムとして持つファージである。宿主細胞の大腸菌に感染してファージＤＮＡを宿主中で複製、増殖させて多数のファージ粒子を形成し、宿主の細胞膜を破り溶菌する。ゲノムは１９８３年に解読されており、約４０ｋｂｐの核酸配列からなり、５５の遺伝子を含む。

大腸菌に感染するファージは、ファージディスプレイ法に利用されており、ファージの表面にファージのコートタンパク質と融合した外来タンパク質、ペプチドを、他の分子と相互作用できる形で提示することができるため、機能モチーフの探索のための最も有力な方法の一つとなっている。しかし、機能モチーフのスクリーニング過程におけるファージの検出工程に、ＥＬＩＳＡなどの煩雑な方法を用いるため、スクリーニングに莫大な手間と時間を要するという欠点がある。

最近、ファージのイメージングのために、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質を用いて、Ｔ７ファージ(非特許文献１、２)、Ｔ４ファージ(非特許文献３)、またはラムダファージ(非特許文献４)を可視化して検出する報告がなされている。しかし、ファージに発現させる蛍光タンパク質の数が１〜３個と極めて少ないため、蛍光強度が弱く、また、ファージ当たりの蛍光タンパク質の数が制御できないため一定でなく、蛍光強度を指標にした正確なスクリーニングや検出をすることができない。

非特許文献１および２には、ＧＦＰ−キャプシド融合タンパク質を発現するヘルパープラスミドを、大腸菌内で発現させてファージに補うこと、あるいは、ファージゲノムのキャプシドタンパクのプロモーター活性を極めて減弱させたＴ７ファージに、ＧＦＰ−キャプシド融合タンパク質遺伝子を組み込んだ上で、野生型キャプシドタンパクをヘルパープラスミドにより大腸菌内で過剰に発現させてファージに補うことにより、いずれの場合も、Ｔ７ファージ１分子あたりＧＦＰタンパク質を１個〜３個含むＴ７ファージが得られたことが報告されている。しかし、この蛍光は極めて弱いものであり、また、発現させるＧＦＰの数を制御できないため、ファージによってＧＦＰの数が一定しておらず、蛍光強度を指標にしたスクリーニングを行うことができない。

非特許文献３には、Ｔ４ファージキャプシドのアクセサリータンパクＨｏｃにＧＦＰを融合させたタンパクを、ヘルパープラスミドを用いた大腸菌による過剰発現でＴ４ファージに付加することにより、蛍光ファージにしたことが記載されているが、ファージに結合しなかった遊離のＨｏｃ−ＧＦＰタンパク質をＦＰＬＣで分離する必要があり、しかも、得られた蛍光Ｔ４ファージは、ＧＦＰのついていないＴ４ファージに比べ、１.１倍程度の蛍光強度しか有さない。
非特許文献４には、λファージのネック部分にＧＦＰタンパクが取り込まれるように設計することが記載されているが、ファージに発現させる蛍光タンパク質の数が少なく、ファージ当たりの蛍光タンパク質の数が制御不能である点で変わらない。

さらに、非特許文献１〜３に記載されたファージは、蛍光タンパク質をキャプシドに融合させているために、ファージディスプレイ法に使用した場合に、蛍光タンパク質が、提示するタンパク質と立体障害を起こすという欠点がある。同様に、特許文献１に記載のルシフェラーゼ酵素遺伝子をキャプシド表面に発現させる組換えバクテリオファージにおいても、このような立体障害を起こす可能性がある。

特表２０１７−５１１７０２号公報

Protein Eng. Des. Sel. (2008) Vol.21, No.7, p.413-424 Nucleic Acids Res.(2006) Vol.34, No.20 e137 Bacteriophage (2014) Landes Bioscience Vol.4, e28364-1-6 Appl. Microbiol. Biotechnol. (2014) Vol.98, p.2853-2866

本発明は、Ｔ７ファージを十分に可視化することのできる強度で、活性を有する蛍光タンパク質を発現することができ、あるいは、Ｔ７ファージを可視化できる、活性を有する呈色反応を触媒する酵素を発現することのできる、ファージディスプレイ法に好適に使用できる組換えＴ７ファージを提供することをその課題とする。
また、本発明は、そのような組換えＴ７ファージをファージディスプレイ法に使用する方法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、標識タンパク質である蛍光タンパク質の遺伝子または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を、Ｔ７ファージの特定の遺伝子領域に発現可能に挿入することにより、Ｔ７ファージが宿主に感染しその複製中に、蛍光タンパク質または呈色反応を触媒する酵素が正しく折り畳まれ、活性を有する立体構造でファージタンパク質の一部として発現されることを見出し、本発明の完成に至った。この組換えＴ７ファージは、このように異種遺伝子を発現できるだけでなく、溶菌後感染性ウイルスとして新たな宿主に感染することができる。

すなわち、本発明は、以下の(１)〜(６)の組換えバクテリオファージＴ７に関する。
（１）組換えバクテリオファージＴ７であって、バクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１７遺伝子領域に、標識タンパク質の遺伝子が発現可能に挿入されていることを特徴とする、組換えバクテリオファージＴ７。
（２）前記標識タンパク質が、蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素である、上記(１)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
（３）前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)であり、前記呈色反応を触媒する酵素が、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼのいずれか一つである、上記(２)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
（４）前記標識タンパク質の遺伝子が、ｇｐ１７遺伝子コード領域末端近傍に挿入されている、上記(１)ないし(２)のいずれかに記載の組換えバクテリオファージＴ７。
（５）前記ｇｐ１７遺伝子コード領域末端近傍が、３´末端領域である、上記(４)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
（６）組換えバクテリオファージＴ７が、宿主細胞に感染後の細胞質におけるファージ複製の間に、前記蛍光タンパク質の遺伝子または発光または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を発現して、活性を有する蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素生成物を生じる、上記(２)に記載の組換えバクテリオファージＴ７。

また、本発明は、以下の(７)の組換えバクテリオファージＴ７をファージディスプレイに使用する方法に関する。
（７）組換えバクテリオファージＴ７であって、バクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１７遺伝子領域に、標識タンパク質の遺伝子が発現可能に挿入されている組換えバクテリオファージＴ７を、ファージディスプレイに使用する方法。

従来法では、１ファージ分子あたりの発現される蛍光タンパク質が１〜３個までと少ないが、本発明の組換えファージでは、従来法に比べ１オーダー上の多数の蛍光タンパク質が発現するため、蛍光強度に各段の差がある。
また、従来法では、ファージ分子あたりの蛍光タンパク質の数を制御することができず、ファージにより蛍光タンパクの数が異なり、蛍光強度が一定ではないが、本発明の組換えファージには、すべてのファージに必ず同じ数の蛍光タンパク質が発現するため、正確な一定の蛍光強度によるスクリーニングを実現できる。

さらに、蛍光タンパク質をファージにヘルパープラスミドを用いた大腸菌による過剰発現による補充の必要がないので、スクリーニングにおけるパニングの過程で、選択したファージを複製・増殖するラウンドごとに、未結合の蛍光タンパク質と目的の蛍光を発するファージとを毎回分離する手間もかからず、また、選択増幅したすべてのファージに蛍光タンパク質が間違いなく結合しているかを、ラウンドのたびに検証する必要がない。
また、本発明の組換えファージをファージディスプレイに使用する場合に、ライブラリ部分のランダムペプチドを発現するキャプシド部分とは異なる構造部分に蛍光タンパク質が発現することから、ターゲットに対する結合の立体障害を生じることなく、ファージディスプレイ法で重要な要素であるターゲットとの結合に対しても見逃しが起きないという優れた効果を奏する。

制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩによるＴ７ファージゲノムＤＮＡの切断部位を示す。 制限酵素で切断後のＤＮＡフラグメントのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。 ＧＳスペーサーとｓｆＧＦＰ遺伝子を含む２.９ｋｂフラグメントの調製方法を示す。 ２.９ｋｂフラグメントのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。 組換えＴ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰのゲノムの概略を示す。 組換えＴ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰを感染させた大腸菌のプラークの実体蛍光顕微鏡写真を示す。 第２世代の組み換えファージのｇｐ１７−ｓｆＧＦＰのウエスタンブロットを示す。

バクテリオファージＴ７(Ｔ７ファージ)は、二本鎖直鎖状のゲノムＤＮＡを持つ溶菌性のファージであり、大腸菌表面にあるＬＰＳに結合して、大腸菌内へＤＮＡを注入して感染する。ゲノムＤＮＡを格納するファージの頭部は、４１５個のＧ１０タンパク質の会合により形成され、その下に尾部が付加されている。

ゲノムＤＮＡは、約４０ｋｂｐの核酸配列からなり５５の遺伝子を含み、必須遺伝子には整数の番号が付けられている。ｇｐ１はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で、感染初期に大腸菌由来ＲＮＡポリメラーゼによって転写された後、それ以降のウイルス遺伝子の転写を行い、ｇｐ５はＤＮＡポリメラーゼ遺伝子でＤＮＡの複製を行う。ｇｐ１０は頭部キャプシドの主成分である外郭を構成する遺伝子であり、ｇｐ１７は尾部の付け根から伸びる尾部繊維タンパク質遺伝子で、尾部繊維タンパク質は３分子で一本の繊維を形成し、この繊維が６本伸びて尾部の脚を形成する。

本発明において、「バクテリオファージ」もしくは「ファージ」とは、それらを複製する手段として、天然において細菌を使用するように進化したウイルスである。ファージは、このことを、ファージ自体を細菌に付着させ、そのＤＮＡをその細菌の中に注入し、上記ファージを数百倍もしくはさらには数千倍も複製するようにその細菌を誘導することによって行う。これをファージ増幅ともいう。

本発明において、「バクテリオファージＴ７」とは、天然のバクテリオファージＴ７と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％の相同性を有するゲノムを有し、かつ上記ファージ増幅を行い、最終的に細菌の細胞壁を破り(溶菌)、細胞外に放出されるバクテリオファージをいう。
また、「組換え」とは、他の方法では見いだされない遺伝的物質を一緒にするための遺伝的な改変をいう。

本発明の組換えファージに導入される標識タンパク質の遺伝子としては、基質が必要ない点で蛍光タンパク質の遺伝子が好ましい。蛍光タンパク質としては、市販されている緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、黄色蛍光タンパク質(ＹＦＰ)、またはシアン蛍光タンパク質(ＣＦＰ)の遺伝子を用いることができ、これらのタンパク質の修飾型のすべてのｖａｒｉａｎｔのいずれの遺伝子も用いることができる。

また、発光または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を用いることができ、たとえば、ルシフェラーゼ(Ｌｕｃ)、β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)、β−ガラクトシダーゼ(Ｇａｌ)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)等の市販されている遺伝子が挙げられる。

また、蛍光・発光タンパク質や蛍光色素に対して結合性を有するペプチドをコードするＤＮＡを用いることができ、それ以外にも、ビオチン化タグ配列ペプチド(大腸菌のビオチンライゲースＢｉｒＡのアクセプターペプチド)、あるいは各種タグ配列(ＨＡ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ等)も用いることができる。

本発明において、「ｇｐ１７遺伝子領域に、標識タンパク質の遺伝子が発現可能に挿入されている」とは、ｇｐ１７遺伝子の発現産物である尾部繊維タンパク質と蛍光タンパク質等が融合タンパク質として発現される状態を意味する。ｇｐ１７遺伝子は、尾部の付け根から伸びる尾部繊維タンパク質遺伝子であり、３分子で一本の繊維を形成する。Ｔ７ファージはその繊維からなる脚を６本有するため、ｇｐ１７遺伝子領域に蛍光タンパク質等の遺伝子を発現可能に挿入することにより、３×６＝１８の１８個の蛍光タンパク質、酵素、タグ配列等が脚表面に発現した尾部を有する組換えファージを作成することができる。

蛍光タンパク質等の遺伝子が挿入されるｇｐ１７遺伝子領域は、蛍光タンパク質等の遺伝子の発現が、ｇｐ１７遺伝子のプロモーターまたは調節領域により機能的に制御され、かつ、ｇｐ１７遺伝子が機能的に発現可能な領域であればいかなる領域であってもよい。ｇｐ１７遺伝子の機能が欠失しにくいｇｐ１７遺伝子のコード領域の末端近傍や、ｇｐ１７遺伝子のコード領域の５´末端または３´末端が好ましい。

ｇｐ１７遺伝子と蛍光タンパク質等の遺伝子は、同じプロモーターまたは調節領域が、両遺伝子を制御できるように連結される必要があり、スペーサー配列またはリンカー配列を介して連結してもよい。ｇｐ１７遺伝子と蛍光タンパク質等の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含む融合タンパク質が発現するように、インフレームで連結させることにより、一旦プロモーターで転写が始まると、コード領域を通って終止コドンまで転写が続く。ｇｐ１７遺伝子および蛍光タンパク質等の遺伝子は、５´→３´方向に存在する。

蛍光タンパク質等の異種遺伝子をファージゲノムの特定の領域に挿入する遺伝子組換え操作方法は、当業者に周知であり、相同組み換えやゲノム編集技術を用いることができる。組換え操作の方法の原則は、たとえばＰＣＲ増幅によって、組み込むべき断片及び２つの組換えアームを含むＤＮＡ断片を作製することである。これらのアームは、挿入する遺伝子に隣接した領域に相同である。これらのＤＮＡ断片は、相同なアームを含んだプライマーを用いたＰＣＲによって、数十塩基配列のヌクレオチドから作り出すことも可能である。

本発明では、Ｔ７ゲノムの全長ＤＮＡ中での切断部位がそれぞれ１か所である２つの制限酵素の制限部位が、Ｔ７ゲノムのｇｐ１７遺伝子の３´末端近傍のコード領域中と３´末端下流領域に存在するため、それらの制限酵素部位を利用して、ｇｐ１７遺伝子コード領域の３´末端にＧＦＰ遺伝子を導入することができる。

後述する実施例では、Ｔ７ファージとして、野生型のＴ７ファージ(４０ｋｂ)のキャプシドタンパク質のＣ末端に任意のペプチドを融合タンパク質として発現させることのできる改変体である、Ｔ７ Ｓｅｌｅｃｔ ４１５−１ｂ(Merk Millipore社製)を用いた。キャプシドタンパク質の発現に関わるＤＮＡ部分以外は、Ｔ７ Ｓｅｌｅｃｔ ４１５−１ｂのＤＮＡは、野生型Ｔ７ゲノムＤＮＡと同じである。
ＳｆｉＩ−ＰｍｌＩ間のみならず、ｇｐ１７遺伝子を含んだ前後のゲノムはすべて保存されているので、本発明の組換えＴ７ファージの作成方法は、野生型Ｔ７を含めたすべてのＴ７改変体ファージ(Ｔ７ Ｓｅｌｅｃｔ ４１５−１ｂ，１０−３ｂ，１−１ｂ，１−２ａ，１−２ｂ，１−２ｃ：Merk Millipore社製)に適用することができる。

最初に、Ｔ７ファージのゲノムＤＮＡを制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩにより切断し、得られた切断断片である３３.３ｋｂ、２.１ｋｂ、１.９ｋｂの３本のＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分離して、３３.３ｋｂと１.９ｋｂのそれぞれのＤＮＡ断片のサイズのバンドのＤＮＡを溶出させてそれぞれ精製する。各精製ＤＮＡフラグメントは、アガロース電気泳動で精製をさらに確認する。

次いで、Ｔ７ゲノムのｇｐ１７配列内のＳｆｉＩ制限部位からｇｐ１７下流にあるＰｍｌＩ制限部位までの上記２.１ｋｂのＤＮＡ断片において、ｇｐ１７コード領域の３´末端にＧＳスペーサー配列をコードする遺伝子を介してＧＦＰ遺伝子が連結されている約２.９ｋｂのフラグメントを、以下のオーバーラップ伸長ＰＣＲ法を用いて作製する。

このフラグメントを作製するために、まず２.９ｋｂを約１ｋｂずつの３本のフラグメント(以下、それぞれＡ、Ｂ、Ｃという。)に分けて、それぞれ化学合成により作製する。Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれの５´末端と３´末端に、３０ｂｐのオーバーラップ配列を付加する。フラグメントＡとＢのオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、ＰＣＲ産物Ａ＋Ｂが作製され、このＡ＋Ｂ産物とフラグメントＣとのオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、ＰＣＲ産物Ａ＋Ｂ＋Ｃという目的の２.９ｋｂ産物を得る。各ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分離して、該当するバンドを切り取り、精製した２.９ｋｂフラグメントの５´末端と３´末端を、制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩで消化する。

次に、Ｔ７ファージのゲノムＤＮＡを制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩにより切断して得られ、精製しておいた３３.３ｋｂと１.９ｋｂの２つのフラグメントと、オーバーラップ伸長ＰＣＲ産物である精製した２.９ｋｂフラグメントの合計３本のフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応により連結する。このライゲーション反応産物とＴ７ファージ抽出物とを混合してパッケージング反応を行い、組換えＴ７ファージを作成して大腸菌に感染させる。

感染させた大腸菌をＬＢプレートに蒔いて、出現するプラークが蛍光を発することにより、蛍光タンパク質が正確に折り畳まれて発現する組換えＴ７ファージを得られることを確認する。そして、この蛍光を発する組換えＴ７ファージの感染性を、さらに大腸菌に感染させて液体培地中で増殖させ、溶菌を確認してから溶菌物を遠心して、上清中のファージ液が蛍光を発することにより確認する。

本発明の組換えＴ７ファージは、１ファージ分子あたり１８個の蛍光タンパク質が発現するため、蛍光強度が強く、しかもすべてのファージに必ず同じ数の蛍光タンパク質が発現するため、正確な一定の蛍光強度によるスクリーニングを実現できる。

本発明の組換えＴ７ファージは、当技術分野において周知の選択またはスクリーニングのためのポリペプチドファージディスプレイに、使用することができる。本発明の組換えＴ７ファージは、ある特定の細胞タイプのｃＤＮＡライブラリに由来するポリペプチドを、ファージ粒子の集団(またはライブラリ)として提示するのに使用することができる。それぞれのファージ粒子は、ｃＤＮＡライブラリに１つのクローンによりコードされるポリペプチドを提示する。次いでファージ粒子は、関心対象の分子であるターゲットとの親和性相互作用に基づいて選択することができる。

本発明の組換えＴ７ファージは、ライブラリ部分のランダムペプチドを発現する頭部キャプシド部分とは異なる尾部部分に、蛍光タンパク質が発現することから、ターゲットに対する結合の立体障害を生じることなく、ファージディスプレイ法で重要な要素であるターゲットとの結合の見逃しが起きない。

以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。

Ｔ７ Ｓｅｌｅｃｔ ４１５−１ｂ ＤＮＡを制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩ(New England Biolab社製)で切断して、３３.３ｋｂ、２.１ｋｂ、１.９ｋｂの３本のＤＮＡ断片を得た。概略を図１に示す。この３本のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し(結果を図２に示す。)、電気泳動後、ゲルから各フラグメントのそれぞれのバンドを切り出し、以下のように精製した。

３３.３ｋｂフラグメントは、ＧｅＢＡｆｌｅｘ−ｔｕｂｅ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ(MW:3500、WACO社製)を用いて、切り出したゲル片から電気泳動による溶出(１００Ｖ，２ｈ，４℃)を行い、回収した溶出液からエタノール沈殿により３３.３ｋｂＤＮＡを得た。１.９ｋｂフラグメントは、ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(QIAGEN社製)を用いて通常の方法で溶出精製した。得られた各精製ＤＮＡフラグメントの純度をアガロース電気泳動で確認した。

Ｔ７ゲノムのＴａｉｌ ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ(ｇｐ１７)の３´末端に、ＧＳスペーサー配列(ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ)を介してｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰを連結した融合タンパクＴａｉｌ ｆｉｂｅｒ−ｓｆＧＦＰ(ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰ)の遺伝子を設計した。Ｇｐ１７配列内のＳｆｉＩサイトからｇｐ１７下流Ｔ７ゲノム上のＰｍｌＩサイトまでの約２.９ｋｂフラグメント(中ほどにＧＳスペーサーおよびｓｆＧＦＰ遺伝子を含む)を、以下のオーバーラップ伸長ＰＣＲを行うことにより調製した。この調製方法を図３に示す。

２.９ｋｂを約１ｋｂずつの３本のフラグメント(Ａ、Ｂ、Ｃ)に分けて設計し、それぞれ５´および３´末端に３０ｂｐのオーバーラップ配列を配置して、Ａ、Ｂ、Ｃの３本のＤＮＡフラグメントを化学合成によって調製した。フラグメントＡとＢのオーバーラップ伸長ＰＣＲ産物Ａ＋Ｂ(５´Ｐｒｉｍｅｒ GTAGGTCAGGCCGTTGTGG(配列番号１)、３´Ｐｒｉｍｅｒ TAATCCTATCAGTGCTCCCTTCC(配列番号２))と、フラグメントＣを用いてさらにオーバーラップ伸長ＰＣＲ(５´Ｐｒｉｍｅｒ GTAGGTCAGGCCGTTGTGG(配列番号１)、３´Ｐｒｉｍｅｒ GTTCTCTTCACGTGTCCTTGGGTACAG(配列番号３))を行い、目的の２.９ｋｂ産物を得た。各ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動を行って該当するバンドを切り出し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて溶出精製した。精製した２.９ｋｂフラグメントの５´および３´末端を制限酵素ＳｆｉＩおよびＰｍｌＩにて消化し、再度アガロースゲル電気泳動を行って(結果を図４に示す。)、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて溶出精製した。

実施例１で精製したＴ７ゲノムＤＮＡのＳｆｉＩおよびＰｍｌＩ切断産物である３３.３ｋｂ、１.９ｋｂの２本のフラグメントと、オーバーラップ伸長ＰＣＲ産物である２・９ｋｂフラグメントの、合計３本のフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ(Ligation High Ver.2,TOYOBO社製)を用いて ライゲーション反応により連結した。ライゲーション反応産物の概略を図５に示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ７ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ(Merk Millipore社製)を用いて、ライゲーション反応産物とＴ７ファージ抽出物とのパッケージング反応を行い(室温２時間)、対数増殖期に達した大腸菌 ＢＬ２１(Merk Millipore社製)に感染させた。

感染させたＢＬ２１をＴＯＰ ａｇａｒｏｓｅと混和してＬＢプレートに蒔き、出現したプラークが蛍光を発することを、実体顕微鏡による蛍光観察で、肉眼で観察して確認した。この実体顕微鏡写真を図６に示す。採取したプラークをファージ抽出緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ ＭｇＳＯ_４，ｐＨ８.０)とインキュベート(４℃、３ｈ)し、少量のクロロホルムと転倒混和後、遠心(３,０００×ｇ，５分)して上清を採取し、ファージ抽出液を得た。抽出したファージ液の蛍光を実体顕微鏡下でさらに確認後、抽出したファージＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い(５‘Ｐｒｉｍｅｒ TCAGATAACAACAATGACTGTACCTTCCAC(配列番号４)、３‘Ｐｒｉｍｅｒ TCTTCACGTGTCCTTGGGTACAGAGC(配列番号５))、ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰが予想する分子量および単一バンドであること確認し、ＧＳスペーサーおよびｓｆＧＦＰ配列がＴ７ゲノムＤＮＡｇｐ１７の３´末端に挿入されていることを確認した。

次に、得られたファージのゲノムＤＮＡの塩基配列解析を行い、Ｔ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰファージが生成されたことを塩基配列レベルで確認した。このＴ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰファージを第１世代とし、さらに大腸菌ＢＬ２１に感染させて液体培地(Ｌ−Ｂｒｏｔｈ)中で増殖させて、溶菌を確認したのち遠心(８,０００×ｇ，１０分)し、上清を採取することによりＴ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰファージを得た(第２世代)。得られたＴ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰファージ液の蛍光を実体蛍光顕微鏡下で確認し、上記第１世代同様、これを鋳型にしてＰＣＲを行い、ｇｐ１７−ｓｆＧＦに該当する単一バンドを確認後、さらにゲノムＤＮＡの塩基配列解析を行って、世代を経たファージ増殖後もＴ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰが、ゲノム上の設計通りの位置に継代されていることを確認した。

上記のように、作成したファージにｓｆＧＦＰの蛍光が認められることから、ｓｆＧＦＰは正しくフォールディングされてファージに組み込まれていることが予想された。また、上記のシークエンス解析によって、ｓｆＧＦＰはｇｐ１７にインフレームで組み込まれていることが判明した。そこで、タンパク質レベルで設計どおりに翻訳されているかどうかを以下のように調べた。作成したｇｐ１７−ｓｆＧＦＰファージをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより抗ＧＦＰ抗体で検出し、検出されるバンドの分子量が、ｇｐ１７タンパク質＋ＧＳスペーサー＋ｓｆＧＦＰの総和分子量の約９０ｋＤａ付近に認められるかどうかを調べた。

コントロールサンプルとして、ｇｐ１７−ＧＳスペーサー−ｓｆＧＦＰタンパク質のみを大腸菌で作らせ、蛍光を発することを確認したのち、上記Ｔ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰファージと同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットして抗ＧＦＰ抗体で検出した。結果は、大腸菌で作成したｇｐ１７−ＧＳスペーサー−ｓｆＧＦＰタンパク質と、Ｔ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰファージとで同じ約９０ｋＤａ付近に抗ＧＦＰ抗体で認識されるバンドが検出された(図７)。このことから、上記ＧＦＰの蛍光を発するＴ７ｇｐ１７−ｓｆＧＦＰファージは、塩基配列レベルおよびタンパク質レベル双方において、設計どおりに構築されていること、そして実際に強い蛍光を認めることから、ｓｆＧＦＰは正しくフォールディングされてＴ７ファージの尾部繊維タンパク質に組み込まれていることが確認された。

本発明の組換えバクテリオファージＴ７は、ファージ分子あたりの発現する標識タンパク質である蛍光タンパク質の数が一定であり、数も多くて蛍光強度が高いので、正確な一定の蛍光強度によるスクリーニングを実現することができる。
また、本発明の組換えファージをファージディスプレイに使用する場合に、ライブラリ部分のランダムペプチドを発現するキャプシド部分とは異なる構造部分に蛍光タンパク質等が発現することから、ターゲットに対する結合の立体障害を生じることなく、ファージディスプレイ法で重要な要素であるターゲットとの結合の見逃しが起きないという優れた効果を有する。

本発明の蛍光ファージは、自身の放つ蛍光によってリアルタイム検出ができるので、従来法のＥＬＩＳＡなどを用いた間接的で時間と手間のかかるファージ検出法を省略できるのみならず、先行研究のように蛍光タンパク質をヘルパープラスミドを用いた大腸菌による過剰発現でファージに付加しないので、スクリーニングにおけるパニングの過程で、選択したファージを複製・増幅するラウンドごとに、未結合蛍光タンパク質と目的の蛍光を発するファージとを分離する手間もかからない。選択増幅したすべてのファージに蛍光タンパク質が間違いなく結合しているかを、ラウンドのたびに検証する必要がなく、一定強度のファージの極めて迅速かつ正確な選択増幅によるスクリーニングを実現できる。

さらに、非特許文献２では、蛍光タンパク質とＴ７キャプシドタンパク質の融合タンパク質をヘルパープラスミドを用いて大腸菌による過剰発現でファージに付加しているが、この方法では、野生型のＴ７キャプシドタンパク質をさらに大過剰に同時に発現させることがファージ生成に必須であり、このことにより、実際は全ファージの一部にしか蛍光タンパク質が入らない(６％〜１６％)。すなわち、この方法を用いると、スクリーニングにより選択して得た陽性ファージ群を次のスクリーニングのラウンドのために複製・増幅しても、全ファージの一部(６％〜１６％)にしか蛍光が入らず、残りの大部分(８４％〜９４％)は選択済みの陽性ファージ集団であるにも関わらず、蛍光の無いファージである。選択したファージは、元々ランダムペプチドライブラリから選択したヘテロな配列のファージ集団なので、この蛍光が入らなかった８４％〜９４％のファージ群の中に、最も目標とする配列を持つファージが含まれてしまう可能性は極めて高く、蛍光タンパク質を大腸菌による過剰発現で付加する方法では、目標とするペプチド配列を持つファージを見逃す可能性が高い。

しかも、６％〜１６％の蛍光が入ったファージ群でも、有する蛍光タンパク質は１ファージ当たり１個から最大３個相当なので、前述のように蛍光そのものが弱く強度が一定していないので、スクリーニングには適さない。本発明では、スクリーニングで選択したファージは、選択と増幅のラウンドを重ねてもすべてのファージに蛍光が入った状態で増幅され、陽性ファージの取りこぼしがない。すべてが一定数１８個の蛍光タンパク質を有し、極めて高度の蛍光強度を有することからも、スクリーニングに極めて有用である。

Claims (7)

1. 組換えバクテリオファージＴ７であって、バクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１７遺伝子領域に、標識タンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入されていることを特徴とする、組換えバクテリオファージＴ７。
2. 前記標識タンパク質が、蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素である、請求項１に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
3. 前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)であり、前記発光または呈色反応を触媒する酵素が、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼのいずれか一つである、請求項２に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
4. 前記標識タンパク質の遺伝子が、ｇｐ１７遺伝子コード領域末端近傍に挿入されている、請求項１ないし３のいずれかに記載の組換えバクテリオファージＴ７。
5. 前記ｇｐ１７遺伝子コード領域末端近傍が、３´末端領域である、請求項４に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
6. 組換えバクテリオファージＴ７が、宿主細胞に感染後の細胞質におけるファージ複製の間に、前記蛍光タンパク質の遺伝子または発光または呈色反応を触媒する酵素の遺伝子を発現して、活性を有する蛍光タンパク質または発光または呈色反応を触媒する酵素生成物を生じる、請求項２に記載の組換えバクテリオファージＴ７。
7. 組換えバクテリオファージＴ７であって、バクテリオファージＴ７のゲノムのｇｐ１７遺伝子領域に、標識タンパク質の遺伝子が発現可能に挿入されている組換えバクテリオファージＴ７を、ファージディスプレイに使用する方法。
   
   

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