JP2016093183A - タンパク質および核酸送達媒体、その成分および機構 - Google Patents
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Abstract
【課題】核酸およびタンパク質の送達のためのプラットフォームを提供すること。【解決手段】（ａ）パッケージングモーターをキャリアに付着させる工程、および（ｂ）外来物質を該キャリアの内部コンパートメント内に転移させ、それによってパッケージングマシンを形成させる工程を含み、ペプチド様成分が該キャリアの外表面に結合される、方法が開示される。【選択図】図１
Description
この出願は、「バクテリオファージＴ４からの乱雑なＤＮＡパッケージングマシン」の名称で、２０１０年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／３２２，３３４号の優先権の利益を請求し、その全体について参照により本明細書中に援用されている。
米国政府は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の助成金ＮＩＢＩＢ １Ｒ２１ ＥＢ００９８６９−０１および国立科学財団の助成金ＭＣＢ−０９２３８７３から得られた資金に従い、本発明にて権利を有する。
（本発明の分野）
本発明は、概して、タンパク質および核酸送達成分、組成物、機構ならびにその送達の方法に関する。
本発明は、概して、タンパク質および核酸送達成分、組成物、機構ならびにその送達の方法に関する。
（関連技術）
成熟キャプシド殻のパッケージング能力は見出されていない。遺伝子治療の改善された媒体に関して、特に核酸およびタンパク質の両方を送達することができるプラットフォームに関して望まれるまだ多くのことがある。顕著な問題は、遺伝子パッケージングが非効率であり、送達される核酸物質が少量であり、ターゲッティングが不十分であり、そして組織特異性がないことに関する。核酸およびタンパク質の送達に用いられている他の方法は多くの制限を有する：例えば、裸のＤＮＡの注入は、非常に低い発現を有する；電気穿孔法は、それに付随する高い割合の細胞死を有する；多くのウイルスベクターは、送達のために少量の核酸を運ぶことのみができる；そして、カチオンリポソーム送達に付随する投与量に関連した毒性があり得る。これらの問題を取り扱うプラットフォームが、開発される必要がある。
成熟キャプシド殻のパッケージング能力は見出されていない。遺伝子治療の改善された媒体に関して、特に核酸およびタンパク質の両方を送達することができるプラットフォームに関して望まれるまだ多くのことがある。顕著な問題は、遺伝子パッケージングが非効率であり、送達される核酸物質が少量であり、ターゲッティングが不十分であり、そして組織特異性がないことに関する。核酸およびタンパク質の送達に用いられている他の方法は多くの制限を有する：例えば、裸のＤＮＡの注入は、非常に低い発現を有する；電気穿孔法は、それに付随する高い割合の細胞死を有する；多くのウイルスベクターは、送達のために少量の核酸を運ぶことのみができる；そして、カチオンリポソーム送達に付随する投与量に関連した毒性があり得る。これらの問題を取り扱うプラットフォームが、開発される必要がある。
１つの広い局面に従って、本発明は、以下の工程：（ａ）パッケージングモーターをキャリアに付着させる工程、および（ｂ）外来物質をキャリアの内部コンパートメント内に移し、それによってパッケージングマシンを形成させる工程を含む方法を提供する。
本明細書中に援用されそして本明細書の一部を構成する付随的な図面は、本発明の典型的な実施形態を示し、上に挙げた一般的な記載および下に挙げる詳細な説明とともに、本発明の特徴を説明することに供する。
（専門用語）
用語の意味が当該用語の一般的に使用される意味から逸脱する場合、特に表示のない限り、出願人は、以下に提供された専門用語を使用することを意図する。
用語の意味が当該用語の一般的に使用される意味から逸脱する場合、特に表示のない限り、出願人は、以下に提供された専門用語を使用することを意図する。
本発明の目的のために、用語「バクテリオファージ成分」はバクテリオファージおよびバクテリオファージ派生体を言い、それらに付着された抗原、融合タンパク質および他のタイプの分子を有するバクテリオファージおよびバクテリオファージ派生体を含む。例えば、用語「Ｔ４バクテリオファージ成分」は、Ｔ４バクテリオファージおよびＴ４バクテリオファージ派生体を言う。
本発明の目的のために、用語「バクテリオファージ派生体」は、バクテリオファージのタンパク質コートの少なくとも一部を含むいずれもの構造を言う。バクテリオファージ派生体の１つの例は、外来ＤＮＡが、カスタマイズされたバクテリオファージのゲノム内にパッケージングされる場合を言い、例えば、Jiangら、「Display of a PorA Peptide form Neisseria meningitidis on the Bacteriophage T4 Capsid surface」、Infection and Immunity 65:4770-77 (1997)、Clark JRおよびMarch JBの「Bacteriophage-mediated nucleic acid immunization」、FEMS Immunology and Medical Microbiology, 40, 21-26 (2004)およびMarchら、「Genetic immunisation against hepatitis B using whole bacteriophage lambda particles」、Vaccine, 22, 1666-71 (2004)（それらの全体の内容および開示は、参照により本明細書中に援用されている）に記載されている。バクテリオファージ派生体の例はバクテリオファージキャプシドである。バクテリオファージ派生体の別の例はバクテリオファージ尾部である。本発明の１つの実施形態では、Kondabagilら、「The DNA translocating ATPase Of bacteriophage T4 packaging motor」、J. Mol. Biol., 363: 786-99 (2006)（その全体の内容および開示は、参照により本明細書中に援用されている）に記載された方法を使用して外来ＤＮＡが空のＴ４キャプシド内に充填され得る。
本発明の目的のために、用語「結合」、用語「結合する」および用語「結合された」は、化学的および物理的結合のいずれものタイプを言い、そしてこれらは、限定されないが、共有結合、水素結合、静電結合、生物学的テザー、膜貫通付着、細胞表面付着および発現が挙げられる。
本発明の目的のために、用語「生物学的試料」および用語「生物学的標本」は、インビトロまたはインビボでのヒト、動物、微生物または植物の一部または全部のいずれかを言う。その用語には、限定されないが、ヒト、動物、微生物または植物の組織片、細胞または組織培養物、ヒト、動物、微生物または植物細胞の懸濁液またはその単離物、ヒトまたは動物の生検、血液試料、細胞含有流体および分泌物のような、ヒト、動物、微生物または植物由来の物質が挙げられる。
本発明の目的のために、用語「キャプシドコートタンパク質」は、多コピーで会合しウイルスのキャプシド殻を形成するタンパク質を言う。例えば、Ｔ４バクテリオファージキャプシドは、単一の主要キャプシドタンパク質ｇｐ２３（４６ｋＤａ）の９３０コピーによって構成される。キャプシドは、微量キャプシドタンパク質ｇｐ２４（４２ｋＤａ）の１２の頂点（各頂点あたり１つの５量体）のうち１１に位置するもう１つの微量キャプシドタンパク質の５５コピーからもまたなる。構造学的研究は、２つのさらなるタンパク質、すなわちＨｏｃ（高抗原性外部キャプシドタンパク質、４０ｋＤａ）およびＳｏｃ（小外部キャプシドタンパク質、９ｋＤａ）が、キャプシドアセンブリの完成後にキャプシド上に加えられ、Ｈｏｃがキャプシド粒子あたり１５５コピーまで存在するのに対し、Ｓｏｃはキャプシド粒子あたり８１０コピーまで存在することを確立してきた。これらのタンパク質は、非必須と考えられ得る。遺伝子のいずれか、または両方の遺伝子における変異は、通常の実験条件下、ファージ生産、ファージ生存率、ファージ感染性、またはファージ安定性に影響しない。しかしながら、ＨｏｃおよびＳｏｃは、極度な環境条件下、さらなる安定性をキャプシドに提供する。Ｔ４バクテリオファージおよび他のファージのキャプシドコートタンパク質は、例えば、「バクテリオファージナノ粒子を含む方法および組成物」との名称で２００５年１０月１３日に発行されたＲａｏの米国特許出願第２００５／０２２６８９２号公報（その全体の内容および開示は、参照により本明細書中に援用されている）に記載されている。
本発明の目的のために、用語「キャプシド」および用語「キャプシド殻」は、いくつかのタンパク質の構造サブユニットを含むウイルスのタンパク質殻を言う。キャプシドはウイルスの核酸コアを封入する。単数形または複数形の用語「プレヘッド」、「プロヘッド」または「プロキャプシド」、「不完全頭部」または「不完全に充填された頭部」、「完全頭部」および「ファージ頭部」は、ウイルスキャプシド殻の成熟の異なる段階を言う。「プレヘッド」は、会合当初の正確な大きさのキャプシド殻または等尺性キャプシドを言い、多くの場合、単一タイプのタンパク質サブユニットがタンパク質スカフォールドの周りで重合している。タンパク質スカフォールドが取り除かれるときに、キャプシド殻の内部に空間を作り、その構造は、プロヘッドまたはプロキャプシドと言われる。不完全頭部、完全頭部およびファージ頭部は全て成熟の段階に達したキャプシドを言い、この段階では、それらはＤＮＡと会合したより大きく安定した粒子になる。用語「不完全頭部」は、一部のＤＮＡのみがその中にパッケージされた成熟キャプシド殻を言うか、または一旦ＤＮＡが完全に充填された後、ＤＮＡが殻から放出され、少量のみのＤＮＡを後に残す成熟キャプシド殻も言い得る。用語「完全頭部」は、ＤＮＡが完全に充填された成熟キャプシド殻を言う。完全頭部はバクテリオファージゲノムの１０５％までと充填し得る。これは、Ｔ４バクテリオファージに関して、約１６５〜１７０ｋｂである。同様に、他のウイルスのキャプシドもまた、それらのゲノム量より多くを収容するようにパッケージされ得る。キャプシドは、封入されてもされないものでもあり得る。ＨＫ９７のようなバクテリオファージ内のキャプシドの成熟プロセスは、参照により、例えば、Lataら、「Maturation Dynamics of a Viral Capsid: Visualization of Transitional Intermediate States」、Cell. 100(2), 253-263 (2000)ならびにGertsmanら、「An unexpected twist in viral capsid maturation」、Nature, 458, 646-50 (2009)、およびＴ４のようなバクテリオファージ関して、Raoら、「Structure and assembly of bacteriophage T4 head」、Virol. J. 7:356 (2010)に記載されている。
本発明の目的のために、用語「キャリア」は、遺伝物質またはタンパク質の成分の転移をもたらす任意の支持構造をも言う。遺伝物質としては、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのフラグメントが挙げられ、そしてタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸を含み、そして、限定されないが、抗原、抗体、リガンド、レセプターまたはそれらのフラグメントが挙げられる。キャリアとしては、限定されないが、ウイルス（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、シュードタイプウイルス、複製コンピテントウイルス、単純ヘルペスウイルスが例として挙げられるがこれらに限定されない）、ウイルスキャプシド、リポソームまたはリポソーム小胞、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マクロファージ、人工染色体、ナノ粒子、ポリマーおよびハイブリッド粒子（この例にはビロソームを含む）のようなベクターが挙げられる。キャリアは、成分の付着および貯蔵のための複数の表面およびコンパートメントを有し得る。これらは、限定されないが、外部表面および内部コンパートメントを含む。
本発明の目的のために、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンの結合部位によって認識し得る抗原部分の最小部分を言う。
本発明の目的のために、用語「外来物質」は、関心のある生物外で生じる物質、または生物から単離され、外部にて任意の程度に操作され、そして次いでその自然環境またはそれが単離された環境内に再導入され得る物質を言う。外来物質としては、限定されないが、核酸、タンパク質、ポリマー化合物、微粒子状物質および人工的に合成された物質が挙げられる。例えば、「外来核酸」は、関心のある生物外で生じ、または生物から単離され、改変され、生物内に再導入された、任意の核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらのフラグメント（一本または二本鎖のいずれか）を言う。宿主細胞内に存在する外来ＤＮＡは、起源生物に由来し、ベクター内でクローン化され、そして次いで宿主細胞内に導入され得る。
本発明の目的のために、用語「免疫応答」は、抗原または免疫原に対する動物の免疫系の特定の応答を言う。免疫応答は、抗体の生産および細胞性免疫を含み得る。
本発明の目的のために、用語「免疫」は、感染生物または物質に対する、ヒトを含む被験動物の抵抗の状態を言う。感染生物または物質は広く定義され、そして寄生生物、毒性物質、癌細胞および他の細胞、ならびに細菌およびウイルスを含むと理解され得る。「治療上有効な免疫化過程」（定義に関しては以下を参照）は免疫応答を生じさせ得る。
本発明の目的のために、用語「免疫化条件」は免疫応答に影響する因子を言い、ヒトを含む被験動物に送達される免疫原またはアジュバントの量および種類、送達の方法、接種の数、接種の間隔、被験動物の種類およびその体調を含む。「ワクチン」は、免疫を惹起し得る医薬製剤を言う。
本発明の目的のために、用語「免疫化用量」は、免疫応答を促進するために必要な抗原または免疫原の量を言う。この量は、種々のアジュバントの存在および有効性で変動し得る。この量は、動物および抗原、免疫原および／またはアジュバントで変動され得るが、一般的に一接種あたり約０．１μｇ／ｍｌ以下と約１００μｇとの間であり得る。免疫化用量は、以下に記載の通り、統計的に有効な宿主動物免疫化およびチャレンジ研究を行うことによるような、当業者に周知な方法によって容易に決定される（例えば、Manual of Clinical Immunology、H. R. RoseおよびH. Friedman、American Society for Microbiology、ワシントンＤ．Ｃ．（１９８０年）（その全体の内容および開示は、参照により本明細書中に援用されている））。いくつかの場合では、免疫を提供するためにブースター投与量を含むいくつかの免疫化用量が投与され得、そして、本発明の目的のために、そのような治療の過程は、集約して「治療上有効な免疫化過程」と言われる。
本発明の目的のために、用語「免疫原」および用語「免疫原性」は、単独でまたはアジュバントと一緒に免疫応答を惹起し得る物質また材料（抗原を含む）を言う。天然および合成物質の両方は免疫原であり得る。免疫原は一般的に、タンパク質、ペプチド、多糖類、核タンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチド、あるいはタンパク質、ペプチド、多糖類、核タンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチドに結合したハプテンあるいは他の細菌、ウイルスまたは原生動物画分である。「免疫原」または「免疫原性」である組成物は、アジュバントを付随しなければ免疫応答を生じない（または治療上効果のない免疫応答のみ引き起こす）物質（例えば、小ペプチド）を含むことが理解され得る。本発明の目的のために、そのような免疫原は「アジュバント必須」免疫原と言われる。
本発明の目的のために、用語「免疫原性量」は、動物にて臨床的に検出可能な防御応答を惹起する、目的の抗原調製物の量または生物毒素の量である。
本発明の目的のために、用語「リポソーム」および用語「リポソーム小胞」は、リン脂質およびコレステロール二重層からなる二重膜のような二重膜からなる小胞を言う。リポソームは、コレステロールのポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧコレステロール）、コプロスタノール、コレスタノール、またはコレスタン、ならびにＰＣおよびコレステロールの組合せのような他のステロイド成分もまた含み得る。リポソームは糖脂質もまた含み得る。リポソームの局面は、「物質に結合されたＴ４バクテリオファージ」との名称で２００８年１１月６日に発行されたAlvingらの米国特許出願第２００８／０２７４５３３号公報（その全体の内容および開示は、参照により本明細書中に援用されている）にさらに記載されている。
本発明の目的のために、用語「首部タンパク質」および用語「尾部タンパク質」は、ウイルス粒子、特にバクテリオファージの首部または尾部のいずれかの部分のアセンブリに関与するタンパク質を言う。尾状バクテリオファージはカウドウイルス目に属し、３つのファミリーを含む：サイフォウイルス科は、長い可撓性の尾部を有し、そして尾状ウイルスの大部分を構成する。ミオウイルス科は、長い剛性の尾部を有し、そして細菌宿主へのファージ付着の際に収縮する尾部シースによって完全に特徴付けられる。尾状ウイルスの最小ファミリーはポドウイルス（短い足のような尾部を持つファージ）である。例えば、Ｔ４バクテリオファージでは、ｇｐ１０は、ｇｐ１１と会合して基盤の尾部ピンを形成する。尾部ピンアセンブリは、尾部アセンブリの第１段階である。バクテリオファージＴ４の尾部は、剛性のチューブを囲み、そして多タンパク質基盤内で終結する収縮性シースからなり、そこへファージの長いおよび短い尾部繊維が付着される。一旦頭部がＤＮＡでパッケージされると、タンパク質ｇｐ１３、ｇｐ１４およびｇｐ１５は、首部に会合して、パッケージされた頭部をシールし、ｇｐ１３タンパク質はＤＮＡパッケージング後、ポータルタンパク質ｇｐ２０と直接相互作用し、そして次いでｇｐ１３プラットフォーム上でｇｐ１４およびｇｐ１５が会合する。Ｔ４バクテリオファージ内の首部および尾部タンパク質は、限定されないが、タンパク質ｇｐ６、ｇｐ２５、ｇｐ５３、ｇｐ８、ｇｐ１０、ｇｐ１１、ｇｐ７、ｇｐ２９、ｇｐ２７、ｇｐ５、ｇｐ２８、ｇｐ１２、ｇｐ９、ｇｐ４８、ｇｐ５４、ｇｐ３、ｇｐ１８、ｇｐ１９、ｇｐ１３、ｇｐ１４、ｇｐ１５およびｇｐ６３が挙げられ得る。Ｔ４バクテリオファージおよび他のウイルス内の首部および尾部アセンブリタンパク質の局面は、例えば、以下にさらに記載されている（Rossmannら、「The bacteriophage T4 DNA injection machine」、Curr. Opin. Struct. Biol. 14(2):171-80 (2004)、Kostyuchenkoら、「Three-dimensional structure of bacteriophage T4 baseplate」、Nat. Struct. Biol. 10(9):688-93 (2003)、Taoら、「Assembly of a tailed bacterial virus and its genome release studied in three dimensions」、Cell 95(3): 431-37(1998)（それらの全体の内容および開示は、参照により本明細書中に援用されている））。
本発明の目的のために、用語「天然に生じるものではない」または「単離された」は、目的の成分が自然界で天然に付随し、そして自然界で見られるような少なくとも１つの他の成分を少なくとも本質的に含まないことを言う。
本発明の目的のために、用語「パッケージングマシン」は、コンパートメント、モーター、およびモーターをコンパートメントへ連結する成分または任意の他の付着機構を含む、完全なパッケージング単位を言う。例えば、Ｔ４パッケージングマシンは殻（主にｇｐ２３からなるプロキャプシド）、頂点ポータルタンパク質（１２量体ｇｐ２０）およびｇｐ１７パッケージングモーターを含む。Ｔ４ＤＮＡパッケージングマシンは、例えば、以下にさらに記載されている（Zhangら、「A promiscuous DNA packaging machine from bacteriophage t4」、PLoS Biol. 9(2):310000592 (2011)、および、Raoら、「DNA Packaging in Bacteriophage T4」、Madame Curie Bioscience Database, Landes Bioscience, (2000)、（それらの全体の内容および開示は、参照により本明細書中に援用されている））。
本発明の目的のために、用語「パッケージングモーター」は、化学エネルギーを使用し、核酸の機械的な転移を進めそして核酸をコンパートメント内にパッケージし得る分子モーターまたは分子マシンを言う。例えば、Ｔ４バクテリオファージ内のパッケージングモーターは、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを使用し、ＤＮＡをキャプシド殻内に転移させそしてパッケージする。パッケージングモーターは、１つ以上のタンパク質サブユニットを含むタンパク質複合体であり得、そして核酸をパッケージすることを助ける酵素活性を有し、それは、限定されないが、ＡＴＰアーゼ、ヌクレアーゼ、およびトランスロカーゼが挙げられる。例えば、Ｔ４バクテリオファージパッケージングモーターは、巨大なターミナーゼタンパク質、５量体遺伝子産物（ｇｐ）１７を言う。用語「パッケージングモーター」はまた、実際のモーターの活性を制御するかまたは高めるさらなるタンパク質を包含することもまた考えられ得る。例えば、Ｔ４パッケージングモーターは、小さいターミナーゼタンパク質ｇｐ１６もまた含み得る。Ｔ４ＤＮＡパッケージングモーターは、Sunら、「The structure of the phage T4 DNA packaging motor suggests a mechanism dependent on electrostatic forces」、Cell 135(7):1251-62 (2008)に、参照によりさらに記載されている。
本発明の目的のために、用語「ペプチド様」は、短鎖ペプチド、ならびにタンパク質、リポタンパク質および糖タンパク質を言うが、便宜上、非タンパク質性分子、例えばアミノ酸含有分子もまた含み得る。ある実施形態では、ペプチド様治療剤は、他の薬剤に加えて、ビタミン、ステロイド、アジドチミジン、および遊離プリマキンをさらに含み得る。１つの有用なペプチド類は、インターロイキン、コロニー刺激因子およびインターフェロンのような免疫調整剤である。別の有用なクラスのタンパク質は、ワクチンに使用されるような抗原および免疫原である。
本発明の目的のために、用語「精製された」は、成分が比較的純粋な状態にあること、例えば、少なくとも約９０％の純度、または少なくとも約９５％の純度または少なくとも約９８％の純度を言う。
本発明の目的のために、用語「ウイルス粒子」は、ウイルスおよびウイルス様生物を言う。
（説明）
本発明は、本明細書中に含まれる以下の具体的な実施形態の詳細な記載を参照することによって、より容易に理解され得る。本発明は、そのある実施形態の具体的な詳細に関して記載されているけれども、そのような詳細は本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではないと意図される。「バクテリオファージＴ４からの乱雑なＤＮＡパッケージングマシン」との名称で２０１０年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／３２２，３３４号を含む、本明細書中にて述べられた参考文献およびそれらの中で引用された参考文献の全文は、参照により、それらの全体が本明細書中に援用されている。
本発明は、本明細書中に含まれる以下の具体的な実施形態の詳細な記載を参照することによって、より容易に理解され得る。本発明は、そのある実施形態の具体的な詳細に関して記載されているけれども、そのような詳細は本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではないと意図される。「バクテリオファージＴ４からの乱雑なＤＮＡパッケージングマシン」との名称で２０１０年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／３２２，３３４号を含む、本明細書中にて述べられた参考文献およびそれらの中で引用された参考文献の全文は、参照により、それらの全体が本明細書中に援用されている。
ファージＴ４は、尾状のバクテリオファージ（この惑星で最も豊富な生物である）ならびにヘルペスウイルスのような巨大な真核性ウイルスのプロトタイプである。これらのウイルスは、正二十面体形状キャプシド「頭部」の中にそれらのゲノムを密にパッケージする強力なマシンをコードする。キャプシド内へのパッケージングは、キャプシドの頂点の１つに局在化される１２量体のポータルを経て生じる。パッケージングは、一連の工程：空のプロヘッドのアセンブリ、コンカテマー切断およびモーター−ＤＮＡ複合体のポータル頂点への付着、頭部が完全充填までのＡＴＰ消費型ＤＮＡ転移、パッケージングを終了するためのＤＮＡ切断、モーターの脱離、および「首部」アセンブリによるパッケージされた頭部のシールの正確な統合を必要とする。連続的な立体構造変化（特にポータル内）は、アセンブリが一方向性かつ不可逆的に進むようにこれらの移行を進めると考えられる。
１つの実施形態では、本発明は、種々のキャプシド上のＴ４ファージパッケージングマシンが非常に乱雑で、プロヘッド内にＤＮＡを転移させるが、予想外に、以前に充填したウイルス頭部内へもまた転移させるという新規の発見された事実を利用する。他の研究は、充填したウイルスキャプシド内にてポータルの構造が根本的に変えられることを示したので、完全頭部上のパッケージング機構は不可逆的であり得ると考えられた。本発明の１つの局面は、完全頭部、またはそれらのパッケージされたＤＮＡのほとんどが空にされた頭部が、パッケージングマシンを再会合し、それを使用してＤＮＡ分子をキャプシドに再び充填し得ることを示すことに関する。
これらの結果は、従来の連続的ウイルスアセンブリモデルに疑念を抱かせ、キャプシド容量に適合するウイルスゲノムの進化に関する説明を示唆し、そしてウイルスパッケージングマシン（ポータルおよびモーター）が、ＤＮＡおよび他の治療上の分子を合成キャプシド内へ転移させるために使用され得る新規ナノキャプシド送達システムへの方向性を示す。
１つの実施形態では、本発明は、目的の核酸および／またはタンパク質を送達するキャリアとして使用されるＴ４バクテリオファージ成分を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、Ｔ４バクテリオファージパッケージングモーターであるパッケージングモーターを提供する。
１つの実施形態では、本発明は、リポソーム小胞と会合し、核酸をリポソーム小胞内にパッケージし得るＴ４パッケージングモーターを提供する。
１つの実施形態では、本発明は、いずれものコンパートメントと会合し、核酸をコンパートメントへ付着させ、そしての全容積までパッケージすることが可能なパッケージングモーターを提供する。
１つの実施形態では、本発明は、核酸がパッケージされ、そして目的のタンパク質に付着され得る多用途タイプの送達媒体である。
尾状バクテリオファージは、天然に広範に分布し、そして、この惑星上で最も豊富な生物である（Hendrix、「Evolution: the long evolutionary reach of viruses」、Curr. Biol. 9: R914-R917 (1999)にて言及される）。これら、特に、バクテリオファージＴ４は、生存する生物内のＤＮＡ凝集および脱凝集の機構を解明するための優れたモデルである。ウイルス粒子は、ゲノムがパッケージされる頭部、およびゲノムを細菌細胞に送達する尾部からなる。結晶濃度（約５００μｇ／ｍｌ）近くまで非常に負に荷電された比較的剛性の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のパッケージングのために、頭部は、約６ＭＰa（シャンパンの瓶中の気圧の１０倍より多く相当）まで加圧される（Smithら、「The bacteriophage straight phi29 portal motor can package DNA against a large internal force」、Nature 413: 748-52 (2001)；およびLanderら、「The structure of an infectious P22 virion shows the signal for headful DNA packaging」、Science 312: 1791-95 (2006)にてさらに記載されている）。
ｄｓＤＮＡウイルスの構築の際に共通の経路および機構が関与する（Casjens、「Control mechanisms in dsDNA bacteriophage assembly」、The Bacteriophages, Volume 1, Calendar R, 編, New York: Plenum Press, 15-91 (1988)、Blackら、「Morphogenesis of the T4 head」、Molecular biology of bacteriophage T4, Karam, 編, Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 218-58 (1994)、およびMettenleiterら、「Herpesvirus assembly: an update」、Virus Res. 143: 222-234 (2009)にて記載される）。正確な大きさのキャプシドがまず会合され、しばしば、単一タイプのタンパク質サブユニットがタンパク質スカフォールドの周囲で重合する（図１）。円錐形状の１２量体ポータルは、アセンブリを開始し、そして等尺性キャプシド（プレヘッド）の特有の５つの頂点にとどまり、全ての後のトランザクション：ＤＮＡ侵入、尾部付着、およびＤＮＡ放出を促進する（Simpsonら、「Structure of the bacteriophage phi29 DNA packaging motor」、Nature 408: 745-50 (2000)；およびLebedevら、「Structural framework for DNA translocation via the viral portal protein」、EMBO J. 26: 1984−94 (2007)にて言及される）。スカフォールドが取り除かれ、ウイルスゲノムをキャプシド形成するために、キャプシド（プロヘッドまたはプロキャプシド）内に空間を作る（図１の工程Ａ）。「ターミナーゼ」としてもまた知られているパッケージングＡＴＰアーゼモーターは、コンカテマーウイルスＤＮＡを認識および切断し、そして、プロヘッドポータルの狭い突出末端でドッキングし、ＤＮＡ末端を約３．５ｎｍポータルチャンネル内に挿入する（Raoら、「The bacteriophage DNA packaging motor」、Annu. Rev. Genet. 42: 647-81 (2008)に記載される）。
このように会合したパッケージングマシンは、ＡＴＰ加水分解の遊離エネルギーを利用してＤＮＡ転移を進める（図１の工程Ｂ）。頭部を充填（「ヘッドフル」パッケージング）した後、モーターはＤＮＡを切断し、そしてＤＮＡ充填頭部から解離する（図１の工程Ｃ）（Alamら、「The headful packaging nuclease of bacteriophage T4」、Mol. Microbiol. 69: 1180-90 (2008)に言及される）。首部および尾部タンパク質はポータル上に会合し、感染性ウイルスアセンブリを完成する（図１の工程Ｄ）（Rao、「A virus DNA gate: zipping and unzipping the packed viral genome」、Proc. Natl. Acad. Sci., 106: 8403-04 (2009)；Zhengら、「A conformational switch in bacteriophage p22 portal protein primes genome injection」、Mol. Cell. 29: 376-83 (2008)；Bodeら、「The arrangement of DNA in lambda phage heads. I. Biological consequences of micrococcal nuclease attack on a portion of the chromosome exposed in tailless heads,」、J. Mol. Biol. 62: 493-502 (1971)；Lhuillierら、「Structure of bacteriophage SPP1 head-to-tail connection reveals mechanism for viral DNA gating」、Proc. Natl. Acad. Sci. 106: 8507-12 (2009)；およびEdgarら、「Morphogenesis of bacteriophage T4 in extracts of mutant-infected cells」、Proc. Natl. Acad. Sci. 55: 498-505 (1966)に言及される）。
ファージＴ４パッケージングモーターは、現在までの報告で最も速くかつ最も強力である。それは、約６０ｐＮの力を生み出しそして約２，０００ｂｐ／ｓまでの速度でパッケージする。モーターは、巨大なターミナーゼタンパク質、ｇｐ１７（７０ｋＤａ）および小さいターミナーゼタンパク質、ｇｐ１６（１８ｋＤａ）で構成される（Raoら、「Cloning, overexpression and purification of the terminase proteins gp16 and gp17 of bacteriophage T4. Construction of a defined in-vitro DNA packaging system using purified terminase proteins」、J. Mol. Biol. 200: 475-88 (1988)に記載される）。ｇｐ１７は、ＤＮＡパッケージングに必要な全ての酵素活性：ＡＴＰアーゼ、ヌクレアーゼおよびトランスロカーゼを含む（Leffersら、「Biochemical characterization of an ATPase activity associated with the large packaging subunit gp17 from bacteriophage T4」、J. Biol. Chem. 275: 37127-136(2000)；Rentasら、「Defining the bacteriophage T4 DNA packaging machine: evidence for a C-terminal DNA cleavage domain in the large terminase／packaging protein gp17」、J. Mol. Biol. 334: 37-52 (2003)；およびBaumannら、「Isolation and characterization of T4 bacteriophage gp17 terminase, a large subunit multimer with enhanced ATPase activity」、J. Biol. Chem. 278: 4618-27 (2003)に記載される）。５分子のｇｐ１７が、ポータル上に会合し、ポータルチャンネルと連続的な中心転移チャンネルとともに５量体モーターを形成する（Sunら、「The structure of the phage T4 DNA packaging motor suggests a mechanism dependent on electrostatic forces」、Cell 135: 1251-1262 (2008)に記載される）。推定上１１ｍｅｒのＧｐ１６は、ｇｐ１７の活性を制御するが、パッケージングマシン上のその配置は知られていない（van Duijn、「Current limitations in native mass spectrometry based structural biology」、J .Am . Soc. Mass. Spectrom. 21: 971-78 (2010)；および Al-Zahraniら、「The small terminase, gp16, of bacteriophage T4 is a regulator of the DNA packaging motor」、J. Biol Chem 284: 24490-500 (2009)に記載される）。構造的および生化学的研究は、パッケージングが、緩和および緊張の立体構造状態間で変わるモーターによって生み出される静電力によって進められることを示唆する。
ウイルスアセンブリの基本的特性は「連続的アセンブリ」であり、「単純な」成分が厳格な順序で会合し、独特の生物特性を備えた複雑なナノマシンを生じる。各アセンブリ工程は、新しい部位または立体構造状態を生じさせ、そこへ、次の成分が精巧な特異性にて、本質的に不可逆的に結合する（Wood、「Bacteriophage T4 morphogenesis as a model for assembly of subcellular structure」、Q. Rev Biol. 55: 353-67 (1980)に記載される）。一連のそのような工程は、ファージＴ４（King、「Assembly of the tail of bacteriophage T4」、J. Mol. Biol. 32: 231-62 (1968)に言及される）および多数の他のウイルスの研究によって記述されるように複雑な感染性ウイルス粒子の迅速かつ高忠実性のアセンブリに導く（Casjensら、「Control mechanisms in dsDNA bacteriophage assembly」、The bacteriophages, Volume 1, Calendar, 編, New York: Plenum Press, 15-91 (1988)に記載される）。ファージＴ４では、このプロセスは、１の理論感染効率に近づくウイルス粒子を会合する。
他のファージおよびｄｓＤＮＡウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）と同様に、ファージＴ４の頭部形態形成（インビボ）における工程の順序は以下の通りである：（ｉ）初期の（非拡張の）空のプロヘッド上でのパッケージングモーターのアセンブリ（図１の工程Ａ）、（ｉｉ）約１０％〜２５％のゲノムがパッケージされた後のキャプシドの拡張（図１の工程Ｂ）、（ｉｉｉ）頭部が完全充填されるまでのパッケージング、（ｉｖ）ＤＮＡの切断およびモーターの離脱（図１の工程Ｃ）、および（ｖ）パッケージされた頭部をシールする首部タンパク質のアセンブリ（図１の工程Ｄ）。ポータルでの立体構造変化は、これらの連続的不可逆的移行を進めると報告されている（図１；ポータルは、各段階にて異なる立体構造状態を経る）。
本発明の有利な局面は、連続的かつ不可逆的工程のパラダイムに厳格に固執していない、ファージＴ４ゲノムパッケージングマシンのアセンブリに関する（「モーター」は５量体ｇｐ１７を言う；一方で「マシン」は、殻［ｇｐ２３］、ポータル、およびモーターを含む完全なパッケージング単位を言う）。結果は、ファージＴ４パッケージングマシンのアセンブリが、非常に乱雑であり、そして、それが会合する頭部のタイプに関して識別しないことを示す。本発明の１つの実施形態では、モーターは、ＤＮＡを完全充填した頭部（ＤＮＡ完全頭部）（図１の工程Ｇ）または一旦完全充填したがＤＮＡを放出した頭部（図１の工程Ｆ）のいずれのファージ頭部内にも転移することができる。実際に、後者は、プロヘッドよりも５から１０倍大きなパッケージング効率を示す。これは、完成されたウイルス殻がパッケージングマシンを再会合し、そして任意のＤＮＡを再パッケージし得ることを示す最初の報告である。単一分子の光ピンセット器具は、ファージ頭部会合パッケージングマシンのパッケージング速度が、未パッケージングのプロヘッド上に会合されたマシンのそれと同様であるという本発明の別の実施形態を示すために使用される。単一分子蛍光測定は、成熟ファージ頭部が、反復のパッケージング開始を触媒し、同じ頭部内に複数のＤＮＡ分子をキャプシド形成するという本発明のさらなる実施形態を示す。本発明の有利な実施形態は、ファージＴ４ＤＮＡパッケージングマシンが異常な立体構造可塑性を有し、その成熟段階に関わらず、受動キャプシド容器内へのゲノム転移を進めることである。これらの特徴は、ｄｓＤＮＡウイルスでヘッドフル測定ゲノムの進化を進めたものであり得、そして、ＤＮＡ治療薬およびワクチンを細胞内に輸送可能な設計が新規のナノデバイスのような本発明のさらなる実施形態への手段を提供し得る。
ウイルスアセンブリの中心テーマの１つは、連続的かつ不可逆的アセンブリである。１つの成分のアセンブリは、次の成分などのアセンブリに特異的な新規の部位または立体構造状態を生じる（Casjensら、「Control mechanisms in dsDNA bacteriophage assembly」、The bacteriophages, Volume 1, Calendar, 編, New York: Plenum Press, 15-91 (1988)；そしてKing、「Assembly of the tail of bacteriophage T4」、J. Mol. Biol. 32: 231-62 (1968)にさらに記載される）。もし成分が欠損したら、アセンブリは、その点まで続行したら機能停止し、不完全に会合された構造および会合されなかった下流成分を蓄積する（Edgarら、「Morphogenesis of bacteriophage T4 in extracts of mutant-infected cells」、Proc. Natl. Acad. Sci. 55: 498-505 (1966)および、Kikuchiら、「Genetic control of bacteriophage T4 baseplate morphogenesis. I. Sequential assembly of the major precursor, in vivo and in vitro」、J. Mol. Biol. 99: 645-72 (1975)にさらに記載される）。正確な機構はまだ十分に理解されていないけれども、会合された構造は自発的に分解せず、それは非会合サブユニットと均衡でもなく、おそらくそれは異なるエネルギー安定な立体構造状態でロックされるためである。このプロセスは、所定の順序の方向のアセンブリを保証するだけではなく、また感染細胞においてサブユニットの明らかに無秩序な分散から複雑な感染性ウイルス粒子の迅速かつ高忠実性の構築に導く。
ポータルおよび主要キャプシドタンパク質における連続的な立体構造変化は、初期のプロヘッドからＤＮＡ完全頭部への成熟移行を進め得る（Casjensら、「Control mechanisms in dsDNA bacteriophage assembly」、The bacteriophages, Volume 1, Calendar, 編. New York: Plenum Press. 15-91 (1988)；Blackら、「Morphogenesis of the T4 head」、Molecular biology of bacteriophage T4, In: Karam, 編, Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 218-58 (1994)；およびRao、「A virus DNA gate: zipping and unzipping the packed viral genome」、Proc. Natl. Acad. Sci. 106: 8403-404 (2009)に示唆される）。これらは、パッケージングモーターのアセンブリ、パッケージング開始、プロヘッド拡張、ヘッドフルパッケージング、パッケージング終結、および首部タンパク質のアセンブリを含む（図１、工程ＡからＤ）。
主要キャプシドタンパク質ｇｐ２３は、プロヘッド拡張の間、主要な立体構造変化を受け、外部大きさにて約１５％の増加および内部容量にて約５０％の増加に至る（ｇｐ２３は、主要キャプシドタンパク質ｇｐ２３の切断型である；切断は、プレヘッドのプロヘッドへの成熟の間に起こる；図１、工程Ａに示される）。Ｔ４ポータルｇｐ２０における立体構造変化が、非拡張プロヘッド上のパッケージングモーターのアセンブリ後にこの拡張を引き起こすことが報告された（Rayら、「Portal control of viral prohead expansion and DNA packaging」、Virology 391: 44-50 (1999)に言及される）。Ｓｏｃ（小外部キャプシドタンパク質）に関する約８７０の結合部位およびＨｏｃ（高抗原性の外部キャプシドタンパク質）に関する１５５の結合部位が、拡張移行後に曝露される（Carrascosa、「Head maturation pathway of bacteriophages T4 and T2. IV. In vitro transformation of T4 head-related particles produced by mutants in gene 17 to capsid-like structures」、J. Virol. 26: 420-28 (1978)に記載される）。
ファージＳＰＰ１およびＰ２２で、ポータル立体構造改変体が頭部をアンダーパッケージ（頭部あたり約９５％のゲノム）またはオーバーパッケージ（頭部あたり約１０５％のゲノム）することが示された（Orlovaら、「Structure of the 13-fold symmetric portal protein of bacteriophage SPP1」、Nat. Struct. Biol. 6: 842-846 (1999)；およびCasjensら、「Bacteriophage P22 portal protein is part of the gauge that regulates packing density of intravirion DNA」、J. Mol. Biol. 224: 1055-74 (1992)に言及される）。ファージＰ２２では、１片のパッケージされたＤＮＡがポータルの周りに巻きつき、立体構造変化を推し進め、ヘッドフル終結を切断させそしてＤＮＡ完全頭部から離れるようにモーターに合図をすることが明らかである。もう１つのポータル立体構造変化は、首部タンパク質の結合後にＤＮＡ送達を刺激する。このように、本発明時の技術分野にて理解されたように、頭部の充填後にパッケージングモーターをまさに放出したＤＮＡ充填頭部は、パッケージングを再開する能力を有し得ない；かわりに、これらは首部タンパク質に結合するよう刺激され得る。出願人は、初めて、パッケージングマシンアセンブリが連続的でも不可逆的でもないことを示す。バルクおよび単一分子の試験によって示されるように、それは完成された頭部上で、未パッケージングの空の（非拡張または拡張）プロヘッド上と同程度に効率的に起こり得る。全ての他の頭部アセンブリ移行（例えば、頭部拡張）は不可逆的であり、そして従来の連続的アセンブリパラダイムに従うため、そのような乱雑なアセンブリは、パッケージングマシンの特有の特性であるようである。成熟状態（非拡張、拡張、ＤＮＡ完全充填、またはＤＮＡが放出された）に関わらず、モーターが、ＤＮＡをキャプシド内に転移させることができるという事実は、殻がそのように受動的容器であるということを示唆する。パッケージングプロセスの主な目的は、完全充填されるまでゲノムをキャプシド容器内に推し進めることのようである。
パッケージングマシンの立体構造可塑性に関する構造的な根拠は何であるか？Ｘ線および低温電子顕微鏡構造は、ポータルの三次元構造が、配列類似性を欠くにも関わらず、厳格に保存されていることを示す（Mettenleiterら、「Herpesvirus assembly: an update」、Virus. Res. 143: 222-34 (2009)およびSimpsonら、「Structure of the bacteriophage phi29 DNA packaging motor」、Nature 408: 745-750 (2000)に記載される）。円錐形状のポータルは３つの部分からなる：正十二面体の頂点内にある広範なドメイン、チャンネルを形成する長い中心基部、およびキャプシドの外へ突出する軸。チャンネルは、約４５°の角度で中心から放射されるα−へリックスによって一列に並べられる一方で、突出する末端は、ループによって連結されたα／βドメインを有する。１つのモデルでは、ポータルは、異なったエネルギー的に等価の立体構造状態の間を振動し得るが、パートナー分子、ｇｐ１７、ｇｐ１３などに結合する際に一つの状態で「凍結」する。別のモデルでは、異なった結合部位が、成熟経路の異なった段階で接近可能であり得る。初期のプロキャプシドでは、突出する軸のみが接近し得、ｇｐ１７のアセンブリを可能にするが、頭部充填後、パッケージされたＤＮＡの内圧は、ポータルを押し下げ、首部タンパク質に関する結合部位を含む基部の部分を曝露する。首部タンパク質アセンブリは、パッケージングモーターを置換するが、首部タンパク質の不在では、パッケージングモーターはポータルに再会合し得る。
乱雑なパッケージングマシンは、ヘッドフルゲノムの進化に導き得ており、これはｄｓＤＮＡファージおよびウイルス（ヘルペスウイルスを含む）間で基本的に共通な特徴である（Raoら、「The bacteriophage DNA packaging motor」、Annu. Rev. Genet. 42: 647-81 (2008)に言及される）。古代キャプシドタンパク質から会合された閉殻は、おそらくゲノム進化に先立つ。ＤＮＡ分子をキャプシド容器内へ無差別に転移し得る可撓性パッケージングマシンは、キャプシドが完全充填されるまでパッケージングし続け得る。充填された殻は、密にパックされたＤＮＡ内に存在するエネルギー（内圧）によって、より効率的に「ゲノム」を宿主細胞へ送達し得る。最終的に、この選択的な利点は、内部がＤＮＡで密にパックされた感染性キャプシド（ウイルス粒子）の進化に導き、それらの長さは、閉殻の内部容量によって決定される。本発明の有利な実施形態は、インビトロまたはインビボ条件のいずれの下でも、効率的に外来物質を宿主細胞内に送達するために、密にＤＮＡをパッケージすることである。
パッケージングマシンの立体構造可撓性はまた、通常の感染にて感染性ウイルスのより効率的な生産に導き得る。低含量のパッケージング／ターミナーゼタンパク質は、転写、複製、組換え、および修復に関与する種々の他のＤＮＡ代謝酵素とＤＮＡ基質について競合しているに違いない。パッケージングモーターが成熟前に落ちるかまたは頭部から外れたとしても、それは再会合してパッケージングを再び始め得る。
本発明の別の実施形態では、高い安定性のウイルス殻がパッケージングコンテナとして使用される。これは、技術的見地から重大な進歩であり、そして広い意味を有する。第一に、全てのインビトロＤＮＡパッケージングシステムに現在使用されるプロヘッドは、非常に脆く、そしてＴ４では、プロヘッドは、非拡張粒子、拡張粒子、損傷粒子、および部分的にＳｏｃ／Ｈｏｃ結合した粒子の異質混合物である。本発明の実施形態では、全ての成熟移行を受けている頭部は同質かつ構造的に非常に安定であり、そして８７０コピーのＳｏｃで補強されており、ＤＮＡをパッケージしそしてパッケージング中間体の高分解能再会合を生じるのに非常に効率的なシステムを提供する。本発明の別の実施態様は、不完全頭部が、プロヘッドよりも５から１０倍大きいパッケージング効率を有することである。本発明の有利な実施形態では、パッケージされたＤＮＡをウイルス粒子から放出すること（Newcombら、「Polarized DNA ejection from the herpesvirus capsid」、J. Mol. Biol. 392: 885-94 (2009)に記載される）、および空になった頭部内に異なるＤＮＡを再パッケージングすることによって、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスのような真核性ウイルスに関するインビトロＤＮＡパッケージングシステムの開発に対する技術的障害のいくつかを克服することが可能である。本発明の別の実施形態では、強力なパッケージングモーターが使用され得、多くの外来ＤＮＡをキャプシド形成し、そしてキャプシド表面に特定のリガンドを提示することによってこれらの粒子を特定の細胞または組織へターゲティングする（Liら、「Bacteriophage T4 capsid: a unique platform for efficient surface assembly of macromolecular complexes」、J. Mol. Biol. 363: 577-88 (2006)に言及される）。そのような粒子は、遺伝子治療用の多重遺伝子ならびに病原体に対する多価ＤＮＡワクチンを送達し得る。本発明のさらなる実施形態では、ファージＴ４頭部は、非常に高い容量（約１７０ｋｂ）を有し、そして同じ頭部内で複数のＤＮＡ分子をパッケージする能力を示し、特に魅力的なナノ粒子であり得る。本発明の別の実施形態では、ナノモーターは、種々の生物医学的な適用のために設計される。殻は受動容器であるようなので、パッケージングマシン（ポータルおよびモーター）は、キャプシドから剥がれて人工のよりずっと大きい殻（例えば、リポソームまたは哺乳類細胞）内に挿入され得、そして、マシンは、ＤＮＡおよび他の治療分子をこれらのコンパートメント内に転移させるようになされ得る。
バクテリオファージＴ４ナノ粒子の表面は、特定の標的を認識する抗体または他のタンパク質のような機能的部分を提示するように、遺伝子工学または直接的化学結合のいずれかを通じて改変され得、そしてセンサーとして使用され得る（Archerら、Sensors, 9, 6298-311(2009)にさらに記載される）。調査されている植物および細菌ウイルスの広い範囲で、ナノ材料としての用途ファージおよび特にバクテリオファージＴ４における関心が、以下に記載されるようなその可撓性の非制限の提示系ＲａｏＶ．Ｂ．バクテリオファージナノ粒子を含む方法および組成物のために、最近高まっている（「バクテリオファージナノ粒子を含む方法および組成物」との名称によるＲａｏの２００５年１０月１３日に公開された米国特許出願第２００５／０２２６８９２号公報；Liら、「Assembly of the small outer capsid protein, Soc, on Bacteriophage T4: A novel system for high density display of multiple large anthrax toxins and foreign proteins on phage capsid」、J. Mol. Biol. 370, 1006-1019 2007；Wuら、「Bacteriophage T4 nanoparticle capsid surface SOC and HOC bipartite display with enhanced classical swine fever virus immunogenicity: A powerful immunological approach」、J. Virol. Meth. 139, 50-60 (2007)）。
リポソームは多くの異なる大きさで調製され得、最小直径約２０ｎｍの小さな単ラメラ小胞（ＳＷ）から、直径数十ｐｍまでの巨大な単ラメラ小胞（ＧＵＶ）まで及ぶ。それらの間に、多ラメラ小胞（ＭＬＶ）；すなわち、直径数百ｎｍのリポソームの第１世代（１）、および高い捕獲容量によって特徴づけられる、より最新の大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）であり、その直径は調整され得（例えば１００または２００ｎｍ）そしてサイズ分布は特定の膜を通じて押し出すことによって狭められる（２）がある。本質的に、リポソームは高可変性の構造であり、その特性は、大きさ、ラメラ構造、２重層の組成、表面電荷および表面特性のような多くのパラメーターの変化によって調整され得る；化学者にとって、リポソームの構成要素である(リン)脂質はまた、新しい特性が付与されたアナログおよび例えば、小胞の表面にリガンドをカップリングするために、有用である派生体を設計するための魅力のある分子である。ＤＮＡのポリアニオンの性質のために、カチオン（および中性の）脂質が、遺伝子送達に典型的に使用され、一方でアニオンリポソームの使用は、他の治療マクロ分子の送達にかなり制限されている（Mayhewら、「Therapeutic applications of liposomes」、Liposomes, Ostro, 編, Marcel Dekker: New York, 289-341 (1983)に言及される）。
本発明の他の実施形態では、バクテリオファージＴ４ウイルスまたはＴ４ウイルスキャプシドを包含するキャリアは、遺伝子治療の方法にて有利な特性になり得る構成タンパク質サブユニットのいずれかにおいて変異を有し得る。変異は、構成キャリアタンパク質の核酸配列に導入され得る。キャリアはまた、これもまた改変されている標的遺伝子またはタンパク質を送達するために使用され得る。例えば、改変は、長命かつ安定な核酸を生成することによって、遺伝子治療の短命の性質のような問題に対処し得る。別の改変は、外来物質が導入された場合、生物からの免疫応答をなしにするかあるいは減少し得る。さらに、改変は、キャリア自体の毒性、免疫および炎症性応答、ならびに潜在的な疾患誘発能に対処するためになされ得る。改変はまた、多重遺伝子障害に対処し、かつ挿入変異による腫瘍形成の可能性を減らすためになされ得る。用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「アミノ酸配列」は、本明細書内で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを言う。ポリマーは、直鎖状または分岐状であり得、それは、改変されたアミノ酸またはアミノ酸のアナログを含み得、そしてそれはアミノ酸以外の化学的な部分によって割り込まれ得る。これらの用語はまた、天然にまたは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは、標識または生活性成分との結合のような任意の他の操作または改変によって改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。
本発明はまた、新規の機能を有するポリペプチドが導入されるキャリアを包含する。例えば、新規の機能は、機能的選択またはスクリーンを伴って定方向またはランダムな変異誘発を介して発生し得る。変異誘発の方法は当業者に周知である。本明細書中で使用されるように、用語「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列を言い、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または合成核酸を含む。核酸は、一本鎖、あるいは部分的または完全な二本鎖（二重鎖）であり得る。二重鎖核酸はホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖であり得る。
本明細書中で使用されるように、用語「導入遺伝子」は、本発明と関連し得る「組換え」ヌクレオチド配列を言うために使用され得る。用語「組換え」は、「人為で」操作されたヌクレオチド配列および天然に生じない、あるいは別のヌクレオチド配列に連結したまたは天然では異なる配置でみられるヌクレオチド配列を意味する。「人為で」操作されるとは、何らかの人工的手段により操作されることを意味し、機器の使用による、コドン最適化、制限酵素などが挙げられる。
例えば、１つの実施形態では、ヌクレオチド配列は、コードされたタンパク質の活性がインビボにて抑制されるように変異され得る。別の実施形態では、ヌクレオチド配列はコドン最適化され得る：例えば、コドンはヒトへの使用のために最適化され得る。好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、コードされたタンパク質の通常のインビボでの機能を抑制するように変異されかつヒトへの使用のためにコドン最適化される。
コドン最適化に関しては、本発明と関連した核酸分子は、本発明の抗原をコードするヌクレオチド配列を有し、そして抗原が生産される被検体の遺伝子で使用されるコドンを適用するように設計され得る。好ましい実施形態では、使用されるコドンは、「ヒト化」コドン、すなわち高発現ヒト遺伝子に頻繁に現れるもの（Andreら、「Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage」、J. Virol. 72:1497-1503 (1998)に記載される）である。コドン最適化の任意の好適な方法が使用され得る。そのような方法、およびそのような方法の選択は当業者に周知である。さらに、Ｇｅｎｅａｒｔおよびその同名のウェブサイトのような、配列のコドンを最適化し得る数社の企業がある。このように、本発明に利用されるヌクレオチド配列は容易にコドン最適化され得る。
本発明の別の実施形態はまた、本発明のキャリアを構成するタンパク質あるいはキャリアに付着されているまたはキャリアによって送達されているタンパク質の機能的および／または等価な改変体および誘導体ならびにそれらの機能的に等価なフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、コードされたアミノ酸配列を変化させないＤＮＡ配列内の変化、ならびにアミノ酸残基の保存的置換、１または数個のアミノ酸の欠失または付加、およびアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換を生じるそれらは、コードされたポリペプチドの特性に大きく影響し得ないものである。保存的なアミノ酸置換は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。１つの実施形態では、改変体は、目的の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチドまたはポリペプチドに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性または同一性を有する。
本発明の目的のために、配列同一性または相同性は、配列のギャップを最小限にする一方で、重複および同一性を最大限にするように並べられた場合に、配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、多くの数学的アルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。２つの配列の比較のために使用された数学的アルゴリズムの限定しない例は、Karlinら、「Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes」、Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264-68 (1990)のアルゴリズムであり、Karlinら、「Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences」、Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5873-77 (1993)にて修正される。
配列の比較のために使用された数学的アルゴリズムの別の例は、Myersら、「Optimal alignments in linear space」、CABIOS 4: 11−17 (1988)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの部分であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティが使用され得る。局所的な配列類似性およびアライメントの範囲を特定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡアルゴリズムである（Pearsonら、「Improved tools for biological sequence comparison」、Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-48 (1988)に記載される）。
本発明に従った使用のために、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（ワシントン大学ＢＬＡＳＴ）バージョン２．０ソフトウェアが有利である。いくつかのＵＮＩＸ基盤に関するＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン２．０実行可能プログラムが、オンラインからダウンロードされ得る。このプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づき、それは順にパブリックドメインＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づく（Altschulら、「Local alignment statistics」、Methods in Enzymology, Doolittle, 編, 266: 460-80 (1996)；Altschulら、J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)；Gishら、Nature Genetics 3: 266-272 (1993)；およびKarlinら、Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5873-5877 (1993)に記載され、その全体について参照により本明細書中に援用されている）。
本発明と関連した種々の組換えヌクレオチド配列およびポリヌクレオチドは、標準の組換えＤＮＡおよびクローニング技術を使用して作られる。そのような技術は当業者に周知である。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, volume 1、2および3(1989)を参照。
ある実施形態では、本発明と関連したポリペプチドは、タンパク質性ワクチンの生産のような種々の適用のために次いで使用され得るポリペプチドを生産するために、インビトロ（無細胞発現系を用いるような）および／またはインビトロで生育された培養細胞内で使用され得る。ポリペプチドがインビボで発現されることが望まれる適用のために、例えば、本発明の導入遺伝子がＤＮＡまたはＤＮＡ含有ワクチンに使用されるとき、本発明のポリペプチドの発現を可能としそしてインビボでの使用に安全である任意のベクターが使用され得る。
本発明と関連したポリペプチドが発現されるために、タンパク質コーディング配列は、タンパク質の転写および翻訳を指示する調節または核酸制御配列に「作動可能に連結」されるべきである。本明細書にて使用されるように、コーディング配列および核酸制御配列またはプロモーターは、コーディング配列の発現または転写および／または翻訳を核酸制御配列の影響または制御下に置くように、それらが共有結合されている場合、「作動可能に連結」されると言われる。「核酸制御配列」は、任意の核酸制御要素であり得、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、ＩＲＥＳ、イントロン、およびそれらに作動可能に連結されている核酸配列またはコーディング配列の発現を指示する本明細書に記載された他の要素などが挙げられる。
本発明の多くの実施形態を詳細に記載したが、添付された特許請求の範囲にて定義される本発明の範囲から外れない改変および変形が可能であることは明らかである。さらに、本開示の全ての実施例は、本発明の多くの実施形態を例示する一方、制限されない実施例として供され、そしてそれゆえそのように説明される種々の局面を制限するものとして取り扱われるものでないと認識されるべきである。
本発明の記載は、次の種々の実施例によって補強される。
（実施例１）
ファージの頭部は、機能的ＤＮＡパッケージングマシンを再会合させ、ＤＮＡをパッケージする。Leimanら、「Structure and morphogenesis of bacteriophage T4」、Cell. Mol. Life Sci. 60: 2356-70 (2003)に記載のように、ファージＴ４のｇｐ１０はｇｐ１１と会合してプラットフォームの尾部ピンを形成する。尾部ピンアセンブリは尾部アセンブリの第１段階であるため、ｇｐ１０が存在しないと尾構造は会合しない。タンパク質ｇｐ１３、ｇｐ１４およびｇｐ１５は首部に会合し、パッケージされた頭部を封鎖し、ｇｐ１３タンパク質は、ＤＮＡパッケージング後にポータルタンパク質ｇｐ２０と直接相互作用し、次いで、ｇｐ１４とｇｐ１５とがｇｐ１３のプラットフォーム上で会合する。１０ａｍ１３ａｍ変異体（ならびにファージλおよび他のファージにおける類似変異体）は、コンカテマーＤＮＡの切断およびパッケージングモーターの解離を含むパッケージング工程のすべてを完了させる。ＤＮＡ完全ファージ頭部は、１０ａｍ１３ａｍ変異体が感染した細胞に蓄積し、首部および尾部のタンパク質とのインビトロ相補によって感染性ウイルス粒子に変換され得る。このため、よく受け入れられている逐次会合モデルによれば、ＤＮＡパッケージングの完了後の頭部は、パッケージングモーターに対して最も小さいが首部タンパク質に対して高い親和性を有すると期待される。本発明の新しい局面は、パッケージングマシンが「プロヘッド」（図１、工程Ａ）と完成または成熟した「ファージ頭部」（図１の工程ＦおよびＧ）とを区別しないことを初めて示したことに関する。
ファージの頭部は、機能的ＤＮＡパッケージングマシンを再会合させ、ＤＮＡをパッケージする。Leimanら、「Structure and morphogenesis of bacteriophage T4」、Cell. Mol. Life Sci. 60: 2356-70 (2003)に記載のように、ファージＴ４のｇｐ１０はｇｐ１１と会合してプラットフォームの尾部ピンを形成する。尾部ピンアセンブリは尾部アセンブリの第１段階であるため、ｇｐ１０が存在しないと尾構造は会合しない。タンパク質ｇｐ１３、ｇｐ１４およびｇｐ１５は首部に会合し、パッケージされた頭部を封鎖し、ｇｐ１３タンパク質は、ＤＮＡパッケージング後にポータルタンパク質ｇｐ２０と直接相互作用し、次いで、ｇｐ１４とｇｐ１５とがｇｐ１３のプラットフォーム上で会合する。１０ａｍ１３ａｍ変異体（ならびにファージλおよび他のファージにおける類似変異体）は、コンカテマーＤＮＡの切断およびパッケージングモーターの解離を含むパッケージング工程のすべてを完了させる。ＤＮＡ完全ファージ頭部は、１０ａｍ１３ａｍ変異体が感染した細胞に蓄積し、首部および尾部のタンパク質とのインビトロ相補によって感染性ウイルス粒子に変換され得る。このため、よく受け入れられている逐次会合モデルによれば、ＤＮＡパッケージングの完了後の頭部は、パッケージングモーターに対して最も小さいが首部タンパク質に対して高い親和性を有すると期待される。本発明の新しい局面は、パッケージングマシンが「プロヘッド」（図１、工程Ａ）と完成または成熟した「ファージ頭部」（図１の工程ＦおよびＧ）とを区別しないことを初めて示したことに関する。
１０ａｍ１３ａｍ頭部は、ＣｓＣｌ密度勾配遠心によって２つの主要種に分離される（ＤＮＡシーケンシングは、１０ａｍ１３ａｍファージが遺伝子１０のＴｒｐ４３０および遺伝子１３のＧｌｎ３９の残基にＴＡＧアンバー変異を有することを示す）。２つの非常に近接した位置の低密度バンドが勾配のおよそ中央に存在し、そして高密度バンドが勾配の底近くに位置している（図２）。２つの近接したバンドは、すべての頭部の約９３％を占め、同一の頭部種を含むが、わずかに相違して移動する。おそらく、上のバンドの頭部が細胞の破片と緩く会合しているからである（いくつかの精製では、幅の広い単一のバンドのみが見られる）。ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）イオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製では、細胞の破片の混入物が除去され、頭部は単一の対称ピークとして溶出する（図３）。両頭部種とも室温にてＳＤＳに耐性である（図４）。これは、それらが期待通り、十分拡張した状態にあることを意味する。アガロースゲル電気泳動は、低密度頭部が約８ｋｂのＤＮＡバンドを含む（図６、レーン５および６）一方、高密度頭部はゲノムの長さに近いＤＮＡを含む（図６、レーン９および１０）。前者は「不完全」頭部と称し、後者は「完全」頭部と称する。
１３ａｍ変異体はＤＮＡ完全頭部を蓄積するから、不完全頭部は、精製手順の間に、完全頭部からのパッケージされたＤＮＡの自然放出によって起こったようである。完全頭部は、不安定であること、および首部タンパク質によって封鎖されない限りＤＮＡを自然放出することが知られている。放出されたＤＮＡは、バッファ中に存在するＤＮアーゼＩによって消化され得、少量のＤＮＡのみを殻の内側に残す。図６に見られるように、不完全頭部と会合するＤＮＡは、頭部の内側にあった。それが頭部のバンドと同時に移動し（レーン３）、ＤＮアーゼＩ処理に耐性である（レーン４）が、プロテイナーゼＫによる消化ではＤＮＡが放出され、８ｋｂの位置に移動する（レーン５）からである。この８ｋｂのバンドがいくつかの独立の調製物に一貫して観察され、非常にコンパクトであることは興味深く、約９５％のゲノムが放出された後の狭いウインドウ以内に放出が停止することを示唆する。このＤＮＡは、キャプシドタンパク質に結合して放出されないから、Ｔ４ゲノムの特定の配列に属し得る。この仮説を試すために、ＤＮＡを不完全頭部からフェノールおよびクロロホルムによって抽出し、ヒドロキシメチル化されグリコシル化されたＴ４ＤＮＡを切断し得る制限酵素ＥｃｏＲＶ（６塩基カッター）またはＴａｑＩ（４塩基カッター）で消化する。８ｋｂのＤＮＡがＴ４ゲノムの特異な配列に属する場合、一連の不連続のバンドが生じるはずである。あるいは、各８ｋｂの断片がゲノムの異なる部分に属する場合、制限酵素断片は不連続のバンドを形成しないはずである。結果は、生産物がスメアとして移動することを示し、保持されたＤＮＡが独特の配列を有さないことを証明する。これは、Ｔ４ゲノムの末端がほとんどランダムであるという事実とも一致し、このため、キャプシドタンパク質の近傍のゲノムの伸長部は、異なる粒子内の同じＤＮＡのものではないと予想される。
完全頭部は、すべての頭部の約７％までを占め、パッケージされたゲノムを頭部の内側に比較的安定に保持しており、これはおそらく、ポータルチャンネルが押圧される（Landerら、「The structure of an infectious P22 virion shows the signal for headful DNA packaging」、Science 312: 1791-95 (2006)に示唆される）か、またはＤＮＡの末端がポータルチャンネルの入り口近傍にないかのいずれかであるからである。これらの頭部は４℃の保存では、ゆっくりＤＮＡを放出する。
不完全頭部および完全頭部のパッケージング活性は、１７ａｍ１８ａｍｒＩＩの空のプロヘッドを陽性コントロールとして用いて、インビトロＤＮＡパッケージングアッセイによって決定される。ファージＴ４では、パッケージングがインビボで阻害された場合に拡張が自然発生することから、パッケージング欠損の１７ａｍ変異体の感染によって生産される空のプロヘッドが拡張型の大部分である（図４のレーン１および２を参照）。生じる未パッケージングの空の拡張プロヘッドは、非拡張プロヘッドと同様またはよりよくＤＮＡをパッケージし、パッケージングアッセイで陽性コントロールとして用いられてきた（Raoら、「DNA packaging of bacteriophage T4 proheads in vitro. Evidence that prohead expansion is not coupled to DNA packaging」、J. Mol. Biol. 185: 565-578 (1985)；Blackら、「Mechanistic coupling of bacteriophage T4 DNA packaging to components of the replication-dependent late transcription machinery」、J. Biol. Chem. 281: 25635-25643 (2006)、およびKondabagilら、「The DNA translocating ATPase of bacteriophage T4 packaging motor」、J. Mol. Biol. 363: 786-99 (2006)で言及される）。バルクパッケージングアッセイでは、不完全頭部および完全頭部の両方とも短いＤＮＡフラグメント（５０〜７６６ｂｐ）を効率よく入れる（図７）。不完全頭部のパッケージング効率は、インビボのＤＮＡパッケージングの真の前駆体であるプロヘッドよりも約６倍高い（パッケージング効率は頭部粒子の数あたりパッケージされたＤＮＡ分子の数として定義される）。これは、プロヘッドが、成熟した頭部と異なり、壊れやすく、インビトロの不規則な拡張および／または安定化キャプシド装飾タンパク質ＳｏｃおよびＨｏｃの欠如により、精製の間に損傷を受け得たからであり得る（Fokineら、「Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4」、Proc Natl. Acad. Sci. 101: 6003-08 (2004)に言及される）。不完全頭部パッケージングの効率は、完全頭部よりも約５〜１０倍高く（図７、レーン３および６）、これは、おそらく完全頭部の大部分が、追加ＤＮＡを収容するために残された空の空間を有し得ないからである。したがって、完全頭部でなく不完全頭部が４８．５ｋｂのファージλＤＮＡ（図８、レーン７および１５）またはＴ４ゲノムＤＮＡをパッケージした。部分および完全頭部が外から追加されたパッケージングモーターを再会合させることを確認するために、頭部−ｇｐ１７複合体を精製し、ポリクローナルｇｐ１７抗体を用いてウェスタンブロッティングによって分析する。両方の型の頭部ともが外から追加されたｇｐ１７を再会合することが見られる（図５）。上記発見は、ｈｏｃまたはｓｏｃのいずれかまたは両方の遺伝子もまた削除されている追加の１０ａｍ１３ａｍファージ変異体を構築することによって再現される。
図１は、主要なキャプシドタンパク質が足場コアのまわりでプレヘッドに会合することを示す。コアはタンパク質分解によって除去され、空の非拡張プロヘッドを生産する（Ａ）。非拡張プロヘッドは通常丸い形状を有するが、ファージＴ４では角のある形状を有する（Stevenら、「Conformational changes of a viral capsid protein. Thermodynamic rationale for proteolytic regulation of bacteriophage T4 capsid expansion, co-operativity, and super-stabilization by soc binding」、J. Mol. Biol. 228: 870-84 (1992)に言及される）。パッケージングモーター−ＤＮＡ複合体はポータルでドッキングし、パッケージングを開始させる。プロヘッドは約１０％〜２５％のＤＮＡがパッケージングされると拡張する（Ｂ）。ヘッドフルパッケージングの後、モーターはコンカテマーＤＮＡを切断し、ＤＮＡ完全頭部から解離する（Ｃ）。首部タンパク質（ｇｐ１３、ｇｐ１４、およびｇｐ１５）はポータル上で会合し、ＤＮＡ完全頭部を封鎖し、尾アセンブルのプラットフォームを提供する（Ｄ）。ポータルの種々の色は異なる立体構造の状態を表す。乱雑な会合では、パッケージングモーターはパッケージングされたＤＮＡの放出によって生産された不完全頭部（Ｅ）または完全頭部（Ｇ）上で会合し、頭部にＤＮＡの新しいフラグメントを再充填する（［Ｆ］および［Ｇ］；新しいＤＮＡフラグメントは完全および不完全頭部の両方の段階でモーターに付着して示される）。
図２は、実施例５に記載のように、分画遠心と続くＣｓＣｌ勾配遠心によって単離された１０ａｍ１３ａｍの頭部を示す。勾配の上部の２つの近接した位置のバンドは、約８ｋｂの断片を除いてパッケージングされたＤＮＡのほとんどを放出した不完全頭部を含んでいた。勾配の底のバンドは、パッケージされたＴ４ゲノムが安定化されている完全頭部を含んでいた。図３は、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィーによる不完全頭部の精製を示す。ＣｓＣｌ勾配の上部の２つの近接した位置の頭部のバンドを集め、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２に対して透析し、イオン交換クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製する。カラムは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５ｍＭ ＭｇＣｌ２で前平衡化し、０−３００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配を適用し、結合した頭部を溶出する。ピーク画分を集め、濾過によって濃縮し、４℃にて保存する。図４は、完全に拡張した不完全および完全頭部を示す。精製したプロヘッド、不完全頭部、および完全頭部をＳＤＳゲル充填バッファと混合し、室温（「−」）または沸点（「＋」）にて５分間維持する。次いで、試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーブルーＲで染色し、脱色する。なお、拡張頭部はｇｐ２３＊サブユニットに解離し得ないから、主要キャプシドタンパク質のｇｐ２３＊（矢印でマークした位置）は室温の試料では見られなかった。図５は、外来ｇｐ１７と再会合した不完全および完全頭部を示す。約５×１０１１のプロヘッド、不完全頭部、または完全頭部を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むバッファ中で、精製したｇｐ１７−Ｋ５７７（０．３μＭ；５０：１の比のｇｐ１７分子：ｇｐ２０サブユニット）とともに室温にて３０分間インキュベートする。頭部−ｇｐ１７複合体を１８，０００ｒｐｍ、４５分間の遠心分離によって沈殿させ、沈殿を数回洗浄し、結合していないｇｐ１７を除去する。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ポリクローナルｇｐ１７抗体を用いてウェスタンブロッティングを行う。結果は、完全長ｇｐ１７およびＧＦＰ−ｇｐ１７融合タンパク質で同じ実験を行うことによって確認する。ｇｐ１７−Ｋ５７７（ｇｐ１７のＣ末端の３３アミノ酸が削除されている）はプロテアーゼに耐性であり、完全長ｇｐ１７およびＧＦＰ−ｇｐ１７では３つのバンドであるのと反対に単一のバンドとして移動し、同じ位置にバックグランドの重なるバンドもないから、ｇｐ１７−Ｋ５７７のデータのみ示す。完全頭部のレーン（レーン４）のｇｐ１７のバンドはかすかであり、これは、これらの頭部のいくつかが、操作の間に、パッケージされたＤＮＡを放出し、このため、遠心分離および洗浄工程の間に頭部の回収を不充分なものとしたからである。
図６は、不完全頭部（レーン３〜６）、完全頭部（レーン７〜１０）、またはプロヘッド（レーン１２）を図の下に「＋」または「−」の列によって示すようにＤＮアーゼＩ（３７℃、３０分）および／またはプロテイナーゼＫ（６５℃、３０分）で処理し、アガロースゲル（０．８％ｗ／ｖ）電気泳動に供し、サイバーグリーンで染色することを示す。分子サイズマーカーλＨｉｎｄＩＩＩ（レーン１）、λＤＮＡ（レーン２）、およびＴ４ＤＮＡ（レーン１１）を、頭部に存在するＤＮＡのサイズを決定するために用いる。不完全頭部レーン３〜６：レーン３、非処理；レーン４、ＤＮアーゼＩで処理；レーン５、プロテイナーゼＫで処理；レーン６、まずＤＮアーゼＩで処理し、次いでプロテイナーゼＫで処理。矢印はサイバーグリーンで染色された頭部の位置を示し、それらは約８ｋｂのＤＮＡと会合する（レーン３）からである。８ｋｂのＤＮＡは、ＤＮアーゼＩの処理に耐性であるが（レーン４）、プロテイナーゼＫの処理により放出する（レーン５および６）ため、頭部の内側にある。完全頭部のレーン７〜１０：レーン７、非処理；レーン８、ＤＮアーゼＩで処理；レーン９、プロテイナーゼＫで処理；レーン１０、まずＤＮアーゼＩで処理し、次いでプロテイナーゼＫで処理。なお、非処理完全頭部は、頭部のバンド（矢印）に加えて、ウェル中で強く染色されたバンドとスメアを示し（レーン７）、そのどちらも、ＤＮアーゼＩでの消化により除去される（レーン８）。これは完全頭部のいくつかが、パッケージされたＤＮＡを保存の間に押し出し、このＤＮＡが、頭部と複合体を形成したままでウェル中に保持されたからである。これはプロテイナーゼＫでの処理によって確認され、この処理はこのＤＮＡおよび内側にパッケージングされたＤＮＡを放出し、単一バンドを生成する（レーン９）。まずＤＮアーゼＩで処理することにより外側のＤＮＡを消化し、続いてプロテイナーゼＫを添加することによりキャプシドを消化し、内側にパッケージングされたＤＮＡを放出する（レーン１０）。レーン９および１０のＤＮＡはファージから単離されたＤＮＡよりわずかに短く（レーン１１）、これはおそらくポータル付近のパッケージングされたＤＮＡのセグメントがＤＮアーゼＩの消化に接近接近可能であったからである［１１］、［１３］、［１４］。矢印はサイバーグリーンで染色された頭部の位置を示し、それらが頭部の内側のＤＮＡと会合する（レーン７）からである。コントロールの１７ａｍ１８ａｍｒＩＩのプロヘッドは空であり、サイバーグリーンでの染色を示さなかった（レーン１２）（図７および８）。図の下に示すような種々の反応条件下の短いＤＮＡフラグメント（５０〜７６６ｂｐ）（図７）またはλＤＮＡ（４８．５ｋｂ）（図８）のパッケージング。
（実施例２）
単一の成熟ファージ頭部会合パッケージングマシンはキャプシドを再充填する。実施例１は完全頭部がＤＮＡをパッケージすることを示すけれども、ＣｓＣｌ勾配遠心の間に、完全頭部の一部がＤＮＡを放出し、それらを不完全頭部に変換させたことが議論され得る。この問題に取り組むために、ＣｓＣｌ勾配遠心なしに１０ａｍ１３ａｍ頭部を調製する。感染された細胞をＤＮアーゼＩの存在下で溶菌し、そして分画遠心によってファージ頭部を単離する。不完全頭部および完全頭部の混合物を含むこれらの頭部をＤＮＡ（５０〜７６６ｂｐラダーフラグメント）でパッケージし、次いでそれらをＣｓＣｌ密度勾配遠心によって分離する。これは、完全頭部からのＤＮＡの放出を最小限にするだけでなく、より重要には、ＣｓＣｌ勾配内の高密度位置（低バンド）へのＤＮＡ沈殿物をパッケージするのが完全頭部のみであることを確保する。
単一の成熟ファージ頭部会合パッケージングマシンはキャプシドを再充填する。実施例１は完全頭部がＤＮＡをパッケージすることを示すけれども、ＣｓＣｌ勾配遠心の間に、完全頭部の一部がＤＮＡを放出し、それらを不完全頭部に変換させたことが議論され得る。この問題に取り組むために、ＣｓＣｌ勾配遠心なしに１０ａｍ１３ａｍ頭部を調製する。感染された細胞をＤＮアーゼＩの存在下で溶菌し、そして分画遠心によってファージ頭部を単離する。不完全頭部および完全頭部の混合物を含むこれらの頭部をＤＮＡ（５０〜７６６ｂｐラダーフラグメント）でパッケージし、次いでそれらをＣｓＣｌ密度勾配遠心によって分離する。これは、完全頭部からのＤＮＡの放出を最小限にするだけでなく、より重要には、ＣｓＣｌ勾配内の高密度位置（低バンド）へのＤＮＡ沈殿物をパッケージするのが完全頭部のみであることを確保する。
不完全および完全頭部のバンド（図９）をＣｓＣｌ勾配から抽出し、プロテイナーゼＫで処理してパッケージされたＤＮＡを放出し、そして４％〜２０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。試料はまた、プロテイナーゼＫ処理に先立ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、頭部粒子の数を決定する（図１０）。図１１に示すように、この完全頭部は、図６、７および８にて示す勾配精製された完全頭部のように、ラダーＤＮＡフラグメントを同様の効率でパッケージする。パッケージング反応でｇｐ１７およびＡＴＰを省いた以外は同様に頭部を処理したコントロール試料は、検出可能なＤＮＡを示さなかった（図１１、パッケージされたレーン１および２をコントロールレーン３および４と比較する）。予想通り、この不完全頭部もまた、勾配精製した不完全頭部（図６、７および８）のように同様の効率でＤＮＡをパッケージする。実際に、パッケージされた不完全頭部のバンドは、パッケージング後の高密度の方への下流のシフトを示す（図９の左のパッケージされた勾配チューブが右のコントロール勾配チューブと比較したときに高密度の方へ不完全頭部のバンドが広がっていることを示していることを参照）。これらの実験は、ＤＮＡの短い断片を完全頭部内にパッケージするのに根本的障害がないことを示し、所見は単一分子光ピンセット実験によって更に確かめられる。
図９は、ＤＮアーゼＩの存在下での溶菌と続く分画遠心によって、ファージ頭部を１０ａｍ１３ａｍ感染Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ３０１細胞（５００ｍｌ培養）から単離することを示す。不完全頭部および完全頭部の混合物を含むファージ頭部ペレットを、２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５ｍＭ ＭｇＣｌ２に再懸濁する。試料を二等分し、その直後により大きなスケールのパッケージングアッセイを実施する。５００μｌパッケージング反応は、ファージ頭部１００μｌ、４．７５μＭ ＧＦＰ−ｇｐ１７、ラダーＤＮＡ（５０〜７６６ｂｐ；ＮＥＢ）４３μｇ、５％ ＰＥＧバッファ、および１ｍＭ ＡＴＰを含む。コントロール反応では、ｇｐ１７およびＡＴＰを省略する。室温にて３０分のインキュベーション後、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）４０μｌ（１，０００ユニット）を添加して未パッケージのＤＮＡを消化させ、そしてＣｓＣｌ密度勾配遠心によって試料を分離する。図１０は、勾配からの不完全および完全頭部試料を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、タンパク質を解析およびパッケージング反応に使用した粒子の濃度を見積もることを示す。完全頭部の濃度は、不完全頭部のそれと比較して非常に低い（大体、不完全頭部の１０分の１）ので、レーンあたりの粒子の数が完全頭部および不完全頭部の両方についてほぼ同じであるように、高速遠心によって完全頭部を濃縮する（図１１および１２）。勾配からの完全頭部（図１１）および不完全頭部（図１２）のバンドをプロテイナーゼＫ（１８．５μｇ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で処理し、Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩バッファ（ｐＨ８）の４％〜２０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、パッケージされたＤＮＡを解析する。
（実施例３）
単一の成熟ファージ頭部会合パッケージングマシンはキャプシドを再充填する。「フォースクランプ」様式にて、デュアルトラップ光ピンセットを使用して単一分子実験を実施する。非加水分解性アナログ、ＡＴＰ−γ−Ｓの存在下にて頭部−ｇｐ１７パッケージング複合体を形成させ、Ｔ４抗体被覆した微粒子上に固定化する。一端にビオチン標識した基質ＤＮＡ分子（１０ｋｂ）を、ストレプトアビジン被覆微粒子に付着させる。微粒子を別々のトラップに捕捉し、そして近い接触をもたらした後、素早く離す（図１３）。この「フィッシング」手順を、テザーを形成するまで繰り返す。モーターがＤＮＡを捕捉するときは、力の上昇により明らかである。次いで、フィードバックループによって５ｐＮの一定の力を付与し、時間に応じたテザー長の減少としてパッケージングを測定する。
単一の成熟ファージ頭部会合パッケージングマシンはキャプシドを再充填する。「フォースクランプ」様式にて、デュアルトラップ光ピンセットを使用して単一分子実験を実施する。非加水分解性アナログ、ＡＴＰ−γ−Ｓの存在下にて頭部−ｇｐ１７パッケージング複合体を形成させ、Ｔ４抗体被覆した微粒子上に固定化する。一端にビオチン標識した基質ＤＮＡ分子（１０ｋｂ）を、ストレプトアビジン被覆微粒子に付着させる。微粒子を別々のトラップに捕捉し、そして近い接触をもたらした後、素早く離す（図１３）。この「フィッシング」手順を、テザーを形成するまで繰り返す。モーターがＤＮＡを捕捉するときは、力の上昇により明らかである。次いで、フィードバックループによって５ｐＮの一定の力を付与し、時間に応じたテザー長の減少としてパッケージングを測定する。
データは、不完全頭部会合パッケージングマシンのパッケージング速度（図１４）が空のプロヘッドのそれら（図１６）と同様であることを示す（約８００〜１，１００ｂｐ／ｓ）。Zhengら、「A conformational switch in bacteriophage p22 portal protein primes genome injection」、Mol Cell 29: 376-83 (2008)にて以前に記載されたように、これらの速度は、ｐｈｉ２９パッケージングマシンのそれらよりも約７倍速い。完全頭部もまたＤＮＡをパッケージしたが独特の特徴を示す（図１６、１７および１８）。頭部のいくつかは、完全な１０ｋｂのＤＮＡをパッケージし、パッケージング速度は、不完全頭部またはプロヘッド会合マシンのそれらと同様である（図１６）。これらの頭部はおそらく保存の間にパッケージされたＤＮＡのかなりの部分を空にし、１０ｋｂ断片を収容する空間を作る。頭部の第２のクラスは約１〜３ｋｂのＤＮＡの短い断片のみパッケージした後停止し、これらの頭部がほぼ完全充填であり得、小さな断片のみを収容し得ることを示す（図１７）。興味深いことに、これらのマシンのパッケージング速度はなお非常に高く、これらのマシンはおそらくほぼ完全に頭部内にパッケージングしたと考えられる。しかしながら、これらのマシンのいくつかは、完全に止まらなかったが、代わりにゆっくりとパッケージした（例えば、図１７の最上部と最下部の痕跡）。頭部の第３のクラスは単にテザーを形成し、明らかな転移はなく、これらの頭部が、さらなるＤＮＡを収容するために残された空間を有し得たものではないことを示唆する（図１８）。これらのマシンがテザーを形成することは興味深く、それらがパッケージングをうまく開始した（力の上昇によって明らかなように）が、長期間停止した状態のままにある（そうでなければ、ＤＮＡは５ｐＮの力の下で急速に滑り落ち得る）ことが示される。これらのデータは、パッケージングマシンが、成熟ファージ頭部上に効率的に会合し、キャプシドを再充填し得ること、および再充填されたＤＮＡの長さは、キャプシド内の利用可能なスペース量に依存していると思われることを示す。
図１３は、単一分子ＤＮＡパッケージングに関するデュアル光学トラップ機構を示す。実施例７に記載するように、Ｔ４頭部−モーター複合体および１０ｋｂＤＮＡ基質を２つのビーズ間でテザー化し、各々を光学トラップ内に保持させ、そして５ｐＮ力下に保持する（図１４、１５、１６、１７および１８）。プロヘッド（図１４）、不完全頭部（図１５）、および完全頭部（図１６、１７および１８）によるＤＮＡのパッケージングを示すパッケージング痕跡。「ｎ」は、そのパネル内での同様のパッケージング行動を定性的に示すパッケージング痕跡の数を表す。
（実施例４）
成熟ファージ頭部会合パッケージングマシンは、複数のパッケージングの開始を起こす。短い３９ｂｐ Ｃｙ５末標識および８３ｂｐ Ｃｙ３末標識ＤＮＡを、バルクアッセイを使用して、プロヘッド、不完全頭部、および完全頭部内にパッケージさせる。パッケージされた頭部を、抗ファージＴ４ポリクローナル抗体を使用してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）不動態化クオーツ表面上に固定化し、そして全反射顕微鏡および単一分子検出を使用して蛍光粒子を画像化する。試料あたり少なくとも３０画像面積あたりの輝点の平均数を決定することによって、「光を放つ」頭部を数値化する（図１９および２１；蛍光画像に関する図２３および２４を参照）。バルクアッセイと一貫して、標識ＤＮＡをパッケージする不完全頭部に相当する輝点の平均数は、空のプロヘッドよりも約５倍大きく、そして完全頭部よりも約１０倍大きい（図２０および２２）。ｇｐ１７を省略したコントロール実験は、０〜２の輝点を有した。これは、表面結合物質の非特異的蛍光が無視し得る程度であることを示す（パッケージされた試料を、室温にて約２０時間、過剰なＤＮアーゼＩ［１０μｇ／ｍｌ］で処理し、未パッケージのまたは非特異的に結合されたＤＮＡを消化させた。さらに、蛍光ＤＮＡをパッケージする個々の頭部の蛍光強度ヒストグラムの解析は、個々の不完全頭部試料に関する加重平均強度がおよそ５，５００ユニット（任意ユニット）であり、一方で、プロヘッドに関しては４，０００ユニットであることを示し、不完全頭部はプロヘッドよりも多くのＤＮＡをパッケージすることを示唆する（図２５）。これを、各スポットの蛍光シグナルを退色させるために必要な光退色工程の数によってさらに数量化する（図２６）。これらのデータは、不完全頭部が、頭部あたり平均して５つから６つのＤＮＡ分子を含むのに対して、プロヘッドおよび完全頭部は、頭部あたり４つのＤＮＡ分子を含むことを示す。このため、プロキャプシドのような成熟ファージ頭部は、複数のパッケージングの開始を起こし得る。単一分子データはまた、不完全頭部、完全頭部およびプロヘッド間のパッケージング効率の差異が大きいことは、完全頭部およびプロヘッドの大部分においてパッケージングを開始することができないことから生じることを示唆する。ＤＮＡパッケージングを開始することが出来る頭部については、パッケージされた分子の数は３種間で僅かに異なるのみである。
成熟ファージ頭部会合パッケージングマシンは、複数のパッケージングの開始を起こす。短い３９ｂｐ Ｃｙ５末標識および８３ｂｐ Ｃｙ３末標識ＤＮＡを、バルクアッセイを使用して、プロヘッド、不完全頭部、および完全頭部内にパッケージさせる。パッケージされた頭部を、抗ファージＴ４ポリクローナル抗体を使用してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）不動態化クオーツ表面上に固定化し、そして全反射顕微鏡および単一分子検出を使用して蛍光粒子を画像化する。試料あたり少なくとも３０画像面積あたりの輝点の平均数を決定することによって、「光を放つ」頭部を数値化する（図１９および２１；蛍光画像に関する図２３および２４を参照）。バルクアッセイと一貫して、標識ＤＮＡをパッケージする不完全頭部に相当する輝点の平均数は、空のプロヘッドよりも約５倍大きく、そして完全頭部よりも約１０倍大きい（図２０および２２）。ｇｐ１７を省略したコントロール実験は、０〜２の輝点を有した。これは、表面結合物質の非特異的蛍光が無視し得る程度であることを示す（パッケージされた試料を、室温にて約２０時間、過剰なＤＮアーゼＩ［１０μｇ／ｍｌ］で処理し、未パッケージのまたは非特異的に結合されたＤＮＡを消化させた。さらに、蛍光ＤＮＡをパッケージする個々の頭部の蛍光強度ヒストグラムの解析は、個々の不完全頭部試料に関する加重平均強度がおよそ５，５００ユニット（任意ユニット）であり、一方で、プロヘッドに関しては４，０００ユニットであることを示し、不完全頭部はプロヘッドよりも多くのＤＮＡをパッケージすることを示唆する（図２５）。これを、各スポットの蛍光シグナルを退色させるために必要な光退色工程の数によってさらに数量化する（図２６）。これらのデータは、不完全頭部が、頭部あたり平均して５つから６つのＤＮＡ分子を含むのに対して、プロヘッドおよび完全頭部は、頭部あたり４つのＤＮＡ分子を含むことを示す。このため、プロキャプシドのような成熟ファージ頭部は、複数のパッケージングの開始を起こし得る。単一分子データはまた、不完全頭部、完全頭部およびプロヘッド間のパッケージング効率の差異が大きいことは、完全頭部およびプロヘッドの大部分においてパッケージングを開始することができないことから生じることを示唆する。ＤＮＡパッケージングを開始することが出来る頭部については、パッケージされた分子の数は３種間で僅かに異なるのみである。
図１９、２０、２１および２２は、単一分子蛍光アッセイによるパッケージングの数値化を示す。図１９および２１は、Ｃｙ３（８３ｂｐ）およびＣｙ５（３９ｂｐ）ＤＮＡそれぞれでパッケージした固定化Ｔ４頭部の蛍光画像を示す。７０μｍ×３５μｍの画像面積の４分の１を場合ごとに示す（完全なサイズの蛍光画像に関しては図２３および２４を参照）。図２０および２２は、Ｃｙ３およびＣｙ５のＤＮＡでパッケージした頭部の数を示すヒストグラムを示す。３０より多くの画像にて蛍光を示す頭部の数を場合ごとに平均化する。
図２３は、Ｃｙ５ ３９ｂｐＤＮＡでパッケージした頭部の単一分子蛍光を示す。Ｃｙ５ ３９ｂｐＤＮＡでパッケージした不完全頭部、プロヘッド、または完全頭部の典型的な画像。画像面積は７０μｍ×３５μｍである。インキュベーション時間、レーザー強度、画像化、および解析パラメーターは全ての試料で同じである。
図２４は、Ｃｙ３ ８３ｂｐＤＮＡでパッケージした頭部の単一分子蛍光を示す。Ｃｙ３ ８３ｂｐＤＮＡでパッケージした不完全頭部、プロヘッド、または完全頭部の典型的な画像。画像面積は７０μｍ×３５μｍである。インキュベーション時間、レーザー強度、画像化、および解析パラメーターは全ての試料で同じである。
図２５は、Ｃｙ３ ８３ｂｐＤＮＡでパッケージした不完全頭部およびプロヘッドに関する単一頭部強度を示す。不完全頭部およびプロヘッドに関する単一頭部強度を示す正規化ヒストグラム。２，０００より多くの蛍光粒子からの強度を場合ごとに解析した。不完全頭部の強度はプロヘッドのそれより明るかった。約４６％の画像化された不完全頭部および約２９％のみのプロヘッドが５，０００より高い強度を有し、不完全頭部がプロヘッドよりもより多くのオリゴヌクレオチド分子をパッケージすることを示す。
図２６は、単一パッケージ頭部の光退色を示す。複数のＣｙ５標識ＤＮＡフラグメントでパッケージした単一の固定化したパッケージ頭部からの典型的な光退色工程。各工程は１つのパッケージされた標識ＤＮＡに相当する。
（実施例５）
１０ａｍ１３ａｍ頭部の精製。ファージ頭部（不完全頭部および完全頭部の両方）を、１０ａｍ１３ａｍ変異体を感染させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐ３０１から単離する。プロヘッドを、１７ａｍ１８ａｍｒＩＩ変異体を感染させたＥ．ｃｏｌｉから単離する。上記手順に従って、プロヘッドおよびファージ頭部を精製する。簡潔には、感染細胞（５００ｍｌ培養物）を、１０μｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩおよびクロロホルム（１ｍｌ）を含む４０ｍｌのＰｉ−Ｍｇバッファ（２６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６８ｍＭ ＮａＣｌ、２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＭｇＳＯ４（ｐＨ７．５））にて溶菌させ、そして３７℃にて３０分間インキュベートし、ＤＮＡを消化させる。溶菌液を４，３００ｇにて１０分間遠心し、そして上清を３４，５００ｇにて４５分間遠心する。上清を２．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５ｍＭ ＭｇＣｌ２に再懸濁し、そして低および高速遠心に再度供する。次に頭部ペレットを２００μｌのＴｒｉｓ−Ｍｇバッファにて再懸濁し、そしてＣｓＣｌ密度勾配遠心によって精製する。頭部バンド（図２）を抽出し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２に対して一晩透析する。上部の２つの近接した位置のバンドを集め、そしてＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーによってさらに精製する（図３）。ピーク画分を濃縮し、そして４℃で保存する。
１０ａｍ１３ａｍ頭部の精製。ファージ頭部（不完全頭部および完全頭部の両方）を、１０ａｍ１３ａｍ変異体を感染させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐ３０１から単離する。プロヘッドを、１７ａｍ１８ａｍｒＩＩ変異体を感染させたＥ．ｃｏｌｉから単離する。上記手順に従って、プロヘッドおよびファージ頭部を精製する。簡潔には、感染細胞（５００ｍｌ培養物）を、１０μｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩおよびクロロホルム（１ｍｌ）を含む４０ｍｌのＰｉ−Ｍｇバッファ（２６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６８ｍＭ ＮａＣｌ、２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＭｇＳＯ４（ｐＨ７．５））にて溶菌させ、そして３７℃にて３０分間インキュベートし、ＤＮＡを消化させる。溶菌液を４，３００ｇにて１０分間遠心し、そして上清を３４，５００ｇにて４５分間遠心する。上清を２．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５ｍＭ ＭｇＣｌ２に再懸濁し、そして低および高速遠心に再度供する。次に頭部ペレットを２００μｌのＴｒｉｓ−Ｍｇバッファにて再懸濁し、そしてＣｓＣｌ密度勾配遠心によって精製する。頭部バンド（図２）を抽出し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２に対して一晩透析する。上部の２つの近接した位置のバンドを集め、そしてＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーによってさらに精製する（図３）。ピーク画分を濃縮し、そして４℃で保存する。
（実施例６）
バルクインビトロＤＮＡパッケージング。上記手順によってインビトロＤＮＡパッケージングアッセイを実施する。反応混合物は精製したプロヘッド、不完全頭部、または完全頭部（０．５〜１×１０１０粒子）、精製した全長ｇｐ１７（１．５μＭ）、およびＤＮＡ（５０〜７６６ｂｐラダーＤＮＡ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ］３００ｎｇ、Ｃｙ３ ８３ｂｐ ＤＮＡ１００ｎｇ、Ｃｙ５ ３９ｂｐ ＤＮＡ５０ｎｇ、または４８．５ｋｂファージλＤＮＡ６００ｎｇ）を含む。３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ ＡＴＰを含むバッファを使用して、λＤＮＡをパッケージする。上記のように、５％ＰＥＧバッファを使用してＣｙ３およびＣｙ５ ＤＮＡをパッケージする。ＤＮアーゼＩの添加によってパッケージング反応を停止させ、そしてプロテイナーゼＫでの処理によってキャプシド化したＤＮアーゼＩ耐性ＤＮＡを放出させ、そしてアガロースゲル電気泳動によって解析する。各実験は、必須のパッケージング成分：頭部、ｇｐ１７、ＡＴＰ、またはＤＮＡの１つを欠く１から数個のネガティブコントロールを含んだ。パッケージング効率を、パッケージング反応に使用する頭部粒子の数当たりのパッケージしたＤＮＡ分子の数として定義する。
バルクインビトロＤＮＡパッケージング。上記手順によってインビトロＤＮＡパッケージングアッセイを実施する。反応混合物は精製したプロヘッド、不完全頭部、または完全頭部（０．５〜１×１０１０粒子）、精製した全長ｇｐ１７（１．５μＭ）、およびＤＮＡ（５０〜７６６ｂｐラダーＤＮＡ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ］３００ｎｇ、Ｃｙ３ ８３ｂｐ ＤＮＡ１００ｎｇ、Ｃｙ５ ３９ｂｐ ＤＮＡ５０ｎｇ、または４８．５ｋｂファージλＤＮＡ６００ｎｇ）を含む。３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ ＡＴＰを含むバッファを使用して、λＤＮＡをパッケージする。上記のように、５％ＰＥＧバッファを使用してＣｙ３およびＣｙ５ ＤＮＡをパッケージする。ＤＮアーゼＩの添加によってパッケージング反応を停止させ、そしてプロテイナーゼＫでの処理によってキャプシド化したＤＮアーゼＩ耐性ＤＮＡを放出させ、そしてアガロースゲル電気泳動によって解析する。各実験は、必須のパッケージング成分：頭部、ｇｐ１７、ＡＴＰ、またはＤＮＡの１つを欠く１から数個のネガティブコントロールを含んだ。パッケージング効率を、パッケージング反応に使用する頭部粒子の数当たりのパッケージしたＤＮＡ分子の数として定義する。
（実施例７）
単一分子の光ピンセットパッケージング。精製した頭部（４×１０９粒子）を、パッケージングバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２）からなる１０μｌ反応容量内の１ｍＭ ＡＴＰ−γ−Ｓ存在下で精製した１μＭの完全長ｇｐ１７および０．４４μＭの１２５ｂｐ ｄｓＤＮＡ「開始」ＤＮＡ（Ｚ．Ｚ．およびＶ．Ｂ．Ｒ．、非公開データ）と混合することによって、パッケージング複合体を調製する。混合物を３７℃にて３０分間インキュベートする。Ｔ４ファージ抗体被覆ポリスチレンビーズ（１．５μｌ）（直径０．７９μｍ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）を上記反応混合物に添加し、３７℃にて３０分間インキュベートする。
単一分子の光ピンセットパッケージング。精製した頭部（４×１０９粒子）を、パッケージングバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２）からなる１０μｌ反応容量内の１ｍＭ ＡＴＰ−γ−Ｓ存在下で精製した１μＭの完全長ｇｐ１７および０．４４μＭの１２５ｂｐ ｄｓＤＮＡ「開始」ＤＮＡ（Ｚ．Ｚ．およびＶ．Ｂ．Ｒ．、非公開データ）と混合することによって、パッケージング複合体を調製する。混合物を３７℃にて３０分間インキュベートする。Ｔ４ファージ抗体被覆ポリスチレンビーズ（１．５μｌ）（直径０．７９μｍ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）を上記反応混合物に添加し、３７℃にて３０分間インキュベートする。
ＰＣＲ増幅された１０ｋｂの一端をビオチン標識したλＤＮＡを、ストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズ（直径０．８６μｍ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）に添加することによってＤＮＡビーズを調製し、そして３７℃にて３０分間インキュベートする。デュアルトラップ光ピンセットをセットし、そしてキャリブレートする（Bustamanteら、「High resolution dual trap optical tweezers with differential detection」、Single-molecule technique：a laboratory manual, Selvinら編, Woodbury, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 297-324 (2007)；およびChemlaら、「Mechanism of force generation of a viral DNA packaging motor」、Cell 122: 683-692 (2005)に記載される）。パッケージングが５ｐＮの一定の力に対して起こることを可能にする「フォースフィードバック」様式で、１００Ｈｚにて単一分子測定を行う。１ｍＭ ＡＴＰ含有パッケージングバッファをフローセル内に注入することによって、テザー形成およびパッケージングを開始させる。反応性一重項酸素種の形成を妨げるために、酸素スカベンジングシステムを使用する（１００μｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、２０μｇ／ｍｌカタラーゼ、および４ｍｇ／ｍｌグルコース）。５３ｎｍの持続長、１，２００ｐＮの伸張弾性係数および０．３４ｎｍの塩基対あたりの距離と仮定するミミズ状鎖モデルを用いて、測定力およびビーズ間の伸長からＤＮＡの輪郭長を算出する。０．１ｓ（１０データ点）のスライディングウィンドウにわたるＤＮＡの輪郭長のリニアフィットからＤＮＡパッケージングの速度を決定する。
（実施例８）
パッケージされた頭部の単一分子蛍光。Ｃｙ３励起用に５３２レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）またはＣｙ５励起用に６３０レーザー（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ）を用いた広角プリズム式全反射顕微鏡上で、異なる頭部のパッケージング効率を数量化するための単一分子蛍光実験を実施する。電荷結合素子カメラ（ｉＸｏｎ ＤＶ ８８７−ＢＩ；Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって、１００ｍｓの時間分解能にて固定化されたキャプシドを映す。画像を記録および解析するために、自家製のＣ＋＋プログラムを使用する（Royら、「A practical guide to single-molecule FRET」、Nat. Methods 5: 507-16 (2008)に記載される）。
パッケージされた頭部の単一分子蛍光。Ｃｙ３励起用に５３２レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）またはＣｙ５励起用に６３０レーザー（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ）を用いた広角プリズム式全反射顕微鏡上で、異なる頭部のパッケージング効率を数量化するための単一分子蛍光実験を実施する。電荷結合素子カメラ（ｉＸｏｎ ＤＶ ８８７−ＢＩ；Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって、１００ｍｓの時間分解能にて固定化されたキャプシドを映す。画像を記録および解析するために、自家製のＣ＋＋プログラムを使用する（Royら、「A practical guide to single-molecule FRET」、Nat. Methods 5: 507-16 (2008)に記載される）。
非特異的表面結合を最小限にするために、清潔な石英スライドおよびガラスカバースリップを、ＰＥＧおよび３％ビオチン標識ＰＥＧ（Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ）で表面不動態化させる［４３］。チャンネルを会合した後、ＮｅｕｔｒｏＡｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し（０．２ｍｇ／ｍｌ）、次いでビオチン標識タンパク質Ｇ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（２５ｎＭ）と室温にて３０分間インキュベーションする。その後、Ｔ４ファージ抗体（１５ｎＭ）を添加し、そして１時間インキュベートする。８３ｂｐ Ｃｙ３および３９ｂｐ Ｃｙ５ ＤＮＡでパッケージされた頭部を別々のチャンネルに付与し、そして２０分間インキュベートする。パッケージング反応混合物をＤＮアーゼＩ（１０μｇ／ｍｌ）で室温にて約２０時間処理し、未パッケージのまたは非特異的に結合したＣｙ３およびＣｙ５ ＤＮＡを消化する。非結合パッケージ頭部を洗い流し、そして固定化されたキャプシドを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファ（ｐＨ８）、５％ＰＥＧ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ スペルミジン、１ｍＭ プトレシン、６０ｍＭ ＮａＣｌ、および酸素スカベンジャーシステム（０．８％ デキストロース、０．１ｍｇ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ、０．０２ｍｇ／ｍｌ カタラーゼ、および３ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ）内で映し出す（Rasnikら、「Branch migration enzyme as a Brownian ratchet」、EMBO J. 27: 1727-35 (2008)にさらに記載される）。
本発明を特定の実施形態を参照して開示する一方、記載の実施形態に対する多くの改変、変化および変更は、添付の請求の範囲に規定されるように、本発明の領域および範囲から逸脱することなく可能である。したがって、本発明は記載の実施形態に限定されず、以下の請求の範囲の文言およびその等価物により規定される全ての範囲を有することが意図される。
Claims (3)
- 以下の工程：
（ａ）パッケージングモーターをキャリアに付着させる工程、および
（ｂ）外来物質を該キャリアの内部コンパートメント内に転移させ、それによってパッケージングマシンを形成させる工程
を含み、
ペプチド様成分が該キャリアの外表面に結合される、方法。 - ペプチド様成分がポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたはフラグメントが免疫原性である、請求項２に記載の方法。
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