CN103003431A

CN103003431A - 蛋白质与核酸递送媒介物、其组成部分及它们的机理

Info

Publication number: CN103003431A
Application number: CN2011800303969A
Authority: CN
Inventors: 维尼加拉·绕
Original assignee: Catholic University of America
Current assignee: Catholic University of America
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-04-08
Also published as: WO2011125054A2; CN103003431B; JP2016093183A; CN103725703B; US9365867B2; US8802418B2; US20110250263A1; WO2011125054A3; JP5863766B2; US20140335158A1; CN103725703A; WO2011125054A4; EP2542681B1; EP2703491A1; US9523101B2; US20130196416A1; JP2013526850A; EP2542681A4; JP6127124B2; EP2703491B1

Abstract

复合病毒由简单蛋白质亚单元通过顺序且不可逆的装配方式装配。在噬菌体中包装基因组过程中，有力的分子马达在空的前头部的入口顶点处装配以启动包装。本发明一方面涉及高度泛宿主性的T4噬菌体包装机器，其将DNA转移至完成的噬菌体头部以及前头部中。单个的马达能够迫使外源DNA以与进入前头部同样的速度进入噬菌体头部，且噬菌体头部经历反复起始，包装多DNA分子进入同一头部。这显示所述噬菌体DNA包装机器具有非凡的构象可塑性，支持DNA进入明显被动衣壳容器，包括高度稳定的病毒壳，直至其装满。该特征允许设计新等级的纳米衣壳递送媒介物。

Description

蛋白质与核酸递送媒介物、其组成部分及它们的机理

相关申请的交叉引用

本申请要求在2010年04月09日提交的、发明名称为“来自噬菌体T4的泛宿主性的DNA包装机器”的美国临时专利申请第61/322,334号的优先权，其全部内容和公开这里并入作为参考。

政府利益声明

由于资金得自美国国家卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)的补贴NIBIB 1R21 EB009869-01和国家科学基金会的补贴MCB-0923873，美国政府享有本发明的权利。

背景

技术领域

本发明大体上涉及蛋白质和核酸递送组分、组合物、递送它们的机制和方法。

背景技术

成熟的衣壳的壳(shell)的包装能力尚未被发现。对改善的基因治疗的媒介物(vehicle)，特别是对能够递送核酸和蛋白质二者的平台，仍有很大需求。突出的问题涉及基因包装的低效率、被递送基因物质的低量、弱的靶向以及组织特异性的缺乏。其他用于核酸和蛋白质递送的方法有很多限制：例如，裸DNA的注射有非常低的表达；电穿孔有伴随其的高的细胞死亡率；许多病毒载体只能携带少量的用于递送的核酸；以及伴随阳离子脂质体递送的可能有计量相关的毒性。有需要开发解决所述问题的平台。

发明内容

根据一个广泛的方面，本发明提供了一种方法，该方法包括以下步骤：(a)附着包装马达至载体(carrier)，以及(b)转移外源物质进入到所述载体的内隔室以因此形成包装机器。

附图说明

并入这里的且是说明书组成部分的后附附图，图解说明本发明的示例性实施方式，并且与上述概括的描述以及以下给出的详细描述一起，用于解释本发明的特征。

图1是显示通过顺序装配和泛宿主装配的DNA包装的示意图。

图2是显示通过氯化铯(CsCl)梯度离心后差速离心的噬菌体头部的隔离的照片。

图3是显示随着通过二乙氨基乙基琼脂糖柱层析(DEAE-Sepharose columnchromatography)部分头部的纯化的峰的曲线图。

图4是显示在不同阶段头部的分离的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE gel)的图像。

图5是用Gp17抗体探测的蛋白质印迹膜的图像。

图6是显示用DNA酶I和/或蛋白酶K处理、并经历琼脂糖凝胶电泳且用赛博绿(cybergreen)染色的噬菌体头部的凝胶图像。

图7是显示在诸如有和没有DNA以及有和没有Gp17的不同条件下包装短DNA片段至噬菌体头部的凝胶图像。

图8是显示在诸如有和没有DNA、有和没有Gp17以及有和没有三磷酸腺苷(ATP)的不同条件下包装短DNA片段至噬菌体头部的凝胶图像。

图9是显示在DNA酶存在下裂解的噬菌体头部的梯度离心后差速离心的图像。

图10是显示在包装反应中使用的颗粒浓度的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGEgel)的图像。

图11是凝胶图像，其中来自所述梯度的充满的头部的带，使用蛋白酶K进行处理，并在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。

图12是凝胶图像，其中来自所述梯度的部分的头部的带，使用蛋白酶K进行处理，并在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。

图13是显示所述用于单分子DNA包装的双光阱装置(dual optical trap setup)的简图。

图14是显示通过前头部的DNA的包装的图。

图15是显示通过部分头部的DNA的包装的图。

图16是显示通过充满的头部的DNA的包装的图。

图17是显示通过充满的头部的DNA的包装的图。

图18是显示通过充满的头部的DNA的包装的图。

图19是显示用包装有Cy3DNA的固定的T4头部的荧光图像量化的示意图像。

图20是显示用包装有Cy5的固定的T4头部的荧光图像量化的示意图像。

图21是显示在单分子荧光检测中包装有Cy3DNA的头部的数量的柱状图。

图22是显示在单分子荧光检测中包装有Cy5DNA的头部的数量的柱状图。

图23显示包装有Cy539-bpDNA的部分头部、前头部、或充满的头部的代表性图像。

图24显示包装有Cy383-bpDNA的部分头部、前头部、或充满的头部的代表性图像。

图25是显示用于部分头部和前头部的单个头部强度(single-head intensity)的标准化柱状图。

图26是显示来自单个固定的包装的头部的、典型的光致褪色步骤的曲线图，所述头部包装有多重Cy5标记的DNA片段。

优选实施方式的详细描述

术语

除非特别说明，术语的意思违背该术语通常使用的意思的地方，申请人意在使用以下提供的术语。

用于本发明的目的，所述术语“噬菌体的组成部分(bacteriophage component)”是指噬菌体以及噬菌体衍生物，包括具有抗原、融合蛋白和其他类型分子附着其上的噬菌体和噬菌体衍生物。例如，所述术语“T4噬菌体组成部分”是指T4噬菌体和T4噬菌体的衍生物。

用于本发明的目的，所述术语“噬菌体衍生物”是指包括噬菌体蛋白质外壳(protein coat)至少一部分的任何结构。噬菌体衍生物的实例是，其中外源DNA被包装在定型的噬菌体基因组(customized bacteriophage derivative)中，在例如Jiang等人“在噬菌体T4衣壳表面上展示形成脑膜炎奈瑟菌PorA肽(Display of aPorA Peptide form Neisseria meningitidis on the Bacteriophage T4 Capsid surface)，”传染与免疫(Infection and Immunity)65：4770-77(1997)、Clark JR和March JB，“噬菌体介导的核酸免疫(Bacteriophage-mediated nucleic acid immunization)”，欧洲微生物学会联合会免疫学与医学微生物学(FEMS Immunology and MedicalMicrobiology)，40，21-26(2004)以及March等人，“使用完整λ颗粒遗传免疫对抗乙型肝炎(Genetic immunisation against hepatitis B using whole bacteriophagelambda particles)，”疫苗(Vaccine)，22，1666-71(2004)”中得到描述，所述文献全部内容和公开这里并入作为参考。噬菌体衍生物的另一个实例是噬菌体衣壳。噬菌体衍生物的再一个实例是噬菌体尾部。在本发明的一种实施方式中，使用Kondabagil等人，“噬菌体T4包装马达的DNA移位ATP酶(The DNA translocatingATPase Of bacteriophage T4 packaging motor)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，363：786-99(2006)中描述的方法可以将外源DNA装载至空T4衣壳中，所述文献全部内容和公开这里并入作为参考。

用于本发明的目的，所述术语“结合(bind)”、所述术语“结合着(binding)”以及所述术语“结合上(bound)”是指任何类型的化学或物理的结合，其包括但不限于共价结合、氢键结合、静电结合、生物栓系(biological tethers)、跨膜附着(transmembrane attachment)、细胞表面附着和表达。

用于本发明的目的，所述术语“生物样品(biological sample)”以及所述术语“生物标本(biological specimen)”是指体外或体内的人、动物、微生物或植物的部分或者全部。所述术语包括但不限于人、动物、微生物或植物来源的物质，诸如人、动物、微生物或植物的组织切片、细胞或组织培养物，人、动物、微生物或植物的细胞悬液或者它们的分离的部分，人或动物活组织检查、血液样品、含有细胞的体液和分泌物。

用于本发明的目的，所述术语“衣壳外壳蛋白(capsid coat protein)”是指以许多拷贝一起来形成病毒的衣壳的壳的蛋白。例如，所述T4噬菌体衣壳由930拷贝的单个主要衣壳蛋白，gp23(46kDa)组成的。所述衣壳还包括55拷贝的另一种次要衣壳蛋白，次要衣壳蛋白gp24(42kDa)位于12个顶点的11个顶点(在一个五邻体(pentamer)的每一个顶点处)。结构研究已经建立，两种附加蛋白，即Hoc(高度抗原性外部衣壳蛋白(Highly antigenic outer capsid protein)，40kDa)和Soc(小外部衣壳蛋白(Small outer capsid protein)，9kDa)，在完成衣壳装配之后被加到所述衣壳上，Hoc每衣壳颗粒存在高达155拷贝，而Soc每衣壳颗粒存在高达810拷贝。所述蛋白质可能被认为是非必需的。在所述二者的基因之一中突变，或者在所述二者的两种基因中都突变，在正常实验条件下，不影响噬菌体产量、噬菌体活力、噬菌体感染性或者噬菌体稳定性。然而Hoc和Soc提供了在极端环境条件下所述衣壳的额外的稳定性。所述T4噬菌体以及其他噬菌体的衣壳外壳蛋白得到了描述，例如在美国专利申请第2005/0226892号中，Rao，发明名称为“包括噬菌体纳米颗粒的方法和组合物(Methods and compositionscomprising bacteriophage nanoparticles)”公开于2005年10月13日，其完整内容和公开这里并入作为参考。

用于本发明的目的，所述术语“衣壳(capsid)”以及所述术语“衣壳的壳(capsidshell)”是指病毒的蛋白质壳，所述病毒包括几个蛋白质结构亚单位。所述衣壳包裹所述病毒的核酸核心。所述术语单数或复数的形式的“原头部(prehead)”、“前头部(prohead)”或“前衣壳(procapsid)”、“部分头部”或“部分充满的头部(partiallyfilled head)”、“充满的头部(full head)”以及“噬菌体头部”，是指病毒衣壳的壳成熟的不同阶段。“原头部(prehead)”是指起始装配的衣壳的壳的精确尺寸(precise dimensions)或者等轴衣壳(isometric capsid)，通常具有单一类型的蛋白质亚单位聚合在蛋白质支架周围。当所述蛋白质支架移除时，在衣壳的壳中产生空的空间，所述结构被称为前头部(prohead)或原衣壳。部分头部、充满的头部以及噬菌体头部都指达到成熟阶段的衣壳，成熟使它们成为与DNA有关的更大、更稳定的颗粒。术语“部分头部”是指成熟的衣壳的壳，其或者只具有DNA的部分包装至其中；或者其可以是指这样的成熟的衣壳的壳，其曾经包装满DNA然后所述DNA从所述壳中释放至只留小部分DNA在原处。所述术语“充满的头部”是指成熟的衣壳的壳，其完全包装满DNA。充满的头部能包装高达噬菌体基因组的105％。其对于T4噬菌体是大约165-170kb。类似地，其他病毒的衣壳也能包装接纳高于它们基因组的容量。所述衣壳可以被膜或可以不被膜。衣壳的成熟过程在像HK97的噬菌体中得到描述，例如作为参考，在Lata等人，“病毒衣壳成熟动力学：过渡中间状态的可视化(Maturation Dynamics of a Viral Capsid：Visualization of Transitional Intermediate States)”，细胞(Cell)，100(2)，253-263(2000)中，和在Gertsman等人，“病毒衣壳成熟中意外的扭转(An unexpectedtwist in viral capsid maturation)”，自然(Nature)，458，646-50(2009)中，以及在像T4的噬菌体中所述衣壳的成熟过程得到描述，在Rao等人，“噬菌体T4头部的结构和装配(Structure and assembly of bacteriophage T4 head)”，病毒学杂志(Viral.J.)7：356(2010)中。

用于本发明的目的，所述术语“载体(carrier)”是指任何支持结构，其引起遗传物质或蛋白质的组成部分的转移。遗产物质包括但不限于DNA、RNA或它们的片段，以及包括氨基酸的蛋白质或多肽，且包括但不限于抗原、抗体、配体、受体或它们的片段。载体包括但不限于运载体(vector)，例如病毒(包括但不限于逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒、假型病毒(pseudotyped viruses)、可复制性病毒(replication competent viruses)、单纯疱疹病毒)、病毒衣壳、脂质体或脂质体囊、阳离子脂质体-DNA复合物(lipoplexes)、聚合复合物(polyplexes)、树枝状大分子(dendrimer)、巨噬细胞、人造染色体、纳米颗粒、聚合物以及还有杂交颗粒其例如包括病毒颗粒(virosome)。载体可以具有多重表面和隔室以及用于附着和存贮的组成部分。这包括但不限于外层表面和内隔室。

用于本发明的目的，所述术语“表位(epitope)”是指由免疫球蛋白的结合位点识别的抗原部分(antigen moiety)的最小部分。

用于本发明的目的，所述术语“外源物质(exogenous material)”是指来自所关注的有机体以外的物质，或者可以是分离自有机体、被控至外部的程度、并且然后重新导入其天然环境或其被分离的环境中的物质。外源物质包括但不限于核酸、蛋白质、聚合化合物(polymeric compound)、微粒物(particulate matter)以及人工合成的物质。例如，“外源核酸”是指任何核酸、DNA或RNA或者它们的片段、单链或者双链，其来自所关注的有机体以外或者分离所述自有机体、得到修饰并且重新导入所述有机体。存在于宿主细胞中的外源DNA可以得自来源有机体、被克隆至运载体并且然后被导入宿主细胞。

用于本发明的目的，所述术语“免疫应答(immune response)”是指动物的免疫系统对抗原或免疫原的特异性应答。免疫应答可以包括抗体的产生和细胞免疫。

用于本发明的目的，所述术语“免疫(immunity)”是指包括人的受试动物对感染的有机体或物质的抗性的状态。将可以理解，感染的有机体或物质得到广泛定义，并且包括寄生物、有毒物质、癌细胞和其他细胞以及细菌和病毒。“治疗有效的免疫过程(Therapeutically Effective Immunization Course)”(参见以下定义)将介绍免疫应答。

用于本发明的目的，所述术语“免疫条件(immunization condition)”是指影响免疫应答的因素，包括免疫原的量和种类或者递送至包括人的受试动物的佐剂、递送的方法、接种的量、接种的间隔时间、受试动物的类型及其状态。“疫苗”是指能够引起免疫的药物配方。

用于本发明的目的，所述术语“免疫剂量(immunization dose)”是指促成免疫应答所需的抗原或免疫原的量。所述量随不同佐剂的存在和有效性而变化。所述量将随所述动物以及所述抗原、免疫原和/或佐剂而变化，但通常将在约0.1μg/ml或者更少到每次接种约100μg之间。所述免疫剂量由本领域技术人员公知的方法很容易确定，例如，如下所述通过进行统计学有效的宿主动物免疫和攻击研究(challenge study)：临床免疫学手册(Manual of Clinical Immunology)，H.R.Rose和H.Friedman，美国微生物学会(American Society for Microbiology)，华盛顿(Washington，D.C)(1980)，其全部内容和公开这里并入作为参考。在某些情况下，几个免疫剂量包括促升剂量可以给药以提供免疫，并且，用于本发明的目的，所述治疗的过程被共同称为“治疗有效的免疫过程”。

用于本发明的目的，所述术语“免疫原(immunogen)”以及所述术语“免疫原性的(immunogenic)”是指能够单独诱导免疫应答的或能够与佐剂联合诱导免疫应答的物质或材料(包括抗原)。天然和合成的物质都可能是免疫原。免疫原通常是蛋白、肽、多糖、核蛋白、脂蛋白、合成多肽、或者连接至蛋白、肽、多糖、核蛋白、脂蛋白或合成多肽的半抗原，或者其他细菌、病毒或原生动物的组分(fraction)。能够理解，“免疫原”或者“免疫原性”的组合物包括除非与佐剂联用否则不能产生免疫应答(或者只产生没有治疗有效性的免疫应答)的物质(例如，小肽)。用于本发明的目的，所述免疫原被称为“佐剂必需”的免疫原。

用于本发明的目的，所述术语“免疫原的量(immunogenic amount)”是指感兴趣抗原制剂的量或者引起动物中临床上可测的保护性应答生物毒素的量。

用于本发明的目的，所述术语“脂质体(liposome)”和所述术语“脂质体囊(liposomal vesicle)”是指包括双分子层膜的囊，例如包括磷脂和胆固醇双分子层的双分子层膜。脂质体还可以包括其他的类固醇成分。例如胆固醇的聚乙二醇衍生物(PEG-cholesterol)、粪甾醇、胆甾烷醇或胆甾烷，以及PC和胆固醇的组合。脂质体还可以包括糖脂(glycolipid)。脂质体的方面在Alving等人的、发明名称为“结合至基底的T4噬菌体(T4 Bacteriophage Bound to a Substrate)”、2008年11月06日公开的美国专利申请第2008/0274533号中得到进一步描述，其全部内容和公开这里并入作为参考。

用于本发明的目的，所述术语“颈部蛋白(neck protein)”以及所述术语“尾部蛋白(tail protein)”是指涉及病毒颗粒(特别是噬菌体)的颈部或尾部的任何部分的装配的蛋白质。有尾的噬菌体属于有尾噬菌体目(order Caudovirales)，并且包括以下三个科：长尾噬菌体科(Siphoviridae)具有长且挠性的尾并构成有尾病毒的大多数。肌尾噬菌体科(Myoviridae)具有长且刚性的尾，并且完全以连接噬菌体附着至细菌宿主的尾鞘为特征。有尾病毒最小的科是短尾噬菌体科(podoviruses)(具有短、足样(leg-like)尾的噬菌体)。例如，在T4噬菌体中，gp10与gp11联合形成所述基片(baseplate)的尾钉(tail pin)。尾钉装配是尾装配的第一步。噬菌体T4的尾部包括可收缩的鞘，包围着刚性的管并且在多蛋白基片中结束，所述噬菌体长和短的尾丝(tail fiber)附着其上。一旦所述头部包装有DNA，所述蛋白gp13、gp14和gp15装配到颈部封住所述包装的头部，在DNA包装之后用gp13蛋白直接与入口蛋白gp20相互作用，并且然后gp14和gp15在gp13平台上装配。在T4噬菌体中颈部和尾部的蛋白可以包括但不限于蛋白gp6、gp25、gp53、gp8、gp10、gp11、gp7、gp29、gp27、gp5、gp28、gp12、gp9、gp48、gp54、gp3、gp18、gp19、gp13、gp14、gp15和gp63。在T4噬菌体中所述颈部和尾部的装配蛋白的方面，在例如Rossmann等人，“噬菌体T4 DNA注射机器(Thebacteriophage T4 DNA injection machine)，”结构生物学新见(Curro Opin.Struct.Biol.).14(2)：171-80(2004)、Kostyuchenko等人，“T4噬菌体基片的三维结构(Three-dimensional structure of bacteriophage T4 baseplate)，”自然结构生物学(Nat.Struct.Biol.)10(9)：688-93(2003)、Tao等人，“有尾细菌病毒的装配以及其基因组释放的三维研究(Assembly of a tailed bacterial virus and its genome release studied inthree dimensions)，”细胞(Cell)95(3)：431-37(1998)中得到进一步描述，其全部内容和公开这里并入作为参考。

用于本发明的目的，所述术语“非天然产生(non-naturally occurring)”或“分离的(isolated)”是指所述感兴趣的组分至少实质上不含至少一种另外的组分，该另外的组分在本质上是与之天然相关的并且在本质上得到发现。

用于本发明的目的，所述术语“包装机器(packaging machine)”是指包括所述隔室、马达和组成成分或者其他任何连接所述马达和所述隔室的附着机制的完整包装单元。例如，所述T4包装机器包括壳(主要由gp23构成的前衣壳)、顶点入口蛋白(vertex portal protein)(十二基数的gp20(dodecameric gp20))以及所述gp17包装马达。所述T4 DNA包装机器在例如，Zhang等人，“来自T4噬菌体的泛宿主DNA包装机器(A promiscuous DNA packaging machine frombacteriophage t4)，”公共科学图书馆生物(PLoS Biol).9(2)：310000592(2011)、以及Rao等人，“T4噬菌体中的DNA包装(DNA Packaging in Bacteriophage T4)，”居里夫人生命科学资料库(Madame Curie Bioscience Database)，兰德斯生物科学(Landes Bioscience)，(2000)中得到进一步描述，其全部内容和公开这里并入作为参考。

用于本发明的目的，所述术语“包装马达(packaging motor)”是指能够使用化学能驱动核酸的机械移位以及包装所述核酸至隔室中的分子马达或分子机器。例如T4噬菌体中的包装马达使用ATP水解的能量转移并包装DNA至所述衣壳的壳。所述包装马达可以为包括一个或多个蛋白亚单位且其具有帮助包装核酸的酶活性的蛋白复合体，其包括但不限于三磷酸腺苷(ATP)酶、核酸酶和移位酶。例如，T4噬菌体包装马达是指大的末端酶蛋白，所述五邻体基因产物(gp)17。所述术语“包装马达(packaging motor)”还可以被认为是包括调节或提高有效马达活力的额外蛋白。例如，所述T4包装马达还可以包括小末端酶蛋白gp16。所述T4 DNA包装马达在例如，作为参考的Sun等人，“T4噬菌体DNA包装马达的结构暗示取决于静电力的机制(The structure of the phage T4 DNA packagingmotor suggests a mechanism dependent on electrostatic forces)，”细胞(Cell)135(7)：1251-62(2008)中得到了进一步描述。

用于本发明的目的，所述术语“肽样(peptide-like)”是指短链的肽以及蛋白、脂蛋白和糖蛋白，但是为了方便还将包括非蛋白的分子，例如，含有氨基酸的分子。在特定的实施方式中，除了其他试剂，所述肽样治疗剂型可以额外包括维生素、类固醇、叠氮胸苷以及游离伯氨喹。肽的一种用途类型是免疫调节剂，例如白细胞介素、集落刺激因子和干扰素。蛋白的另一种用途类型是抗原和免疫原例如用于疫苗。

用于本发明的目的，所述术语“纯化(purified)”是指所述组分属于相对纯的状态——例如只要约90％纯，或者至少约95％纯或者至少约98％纯。

用于本发明的目的，所述术语“病毒颗粒(virus particle)”是指病毒以及病毒样的有机体。

说明书

通过参考以下包括在这里的具体实施方式的详细描述可以更容易理解本发明。虽然本发明已经参考其特定实施方式的具体细节得到描述，但其并不意味着所述细节应该被视为是本发明范围的限定。这里提及的参考文献的全文以及它们之中引用的参考文献，一并全部并入作为参考，包括在2010年04月09日提交的、发明名称为“来自噬菌体T4的泛宿主性的DNA包装机器”的美国临时专利申请第61/322,334号。

噬菌体T4为有尾噬菌体的原型(prototype)，在本行星上丰度最大的有机体，也是最大的真核病毒诸如疱疹病毒。所述病毒编码有力的机器，以紧紧地包装它们的基因组至二十面形状的衣壳“头部”内。凭借位于所述衣壳的顶点之一中的十二基数入口，发生包装入所述衣壳。包装要求一系列的步骤的精确编排：空的前头部的装配、串联体的切割以及所述马达DNA复合体至入口顶点的附着、ATP推动的DNA转移直至所述头部充满、DNA的切割以结束包装、所述马达的脱附、以及通过“颈部”装配而封住所述已包装的头部。顺序的构象变化，特别是在入口中顺序的构象变化，被认为驱动这些转变，这样装配得以定向且不可逆地进行。

在一个实施方式中，本发明利用新发现的事实：所述在病毒衣壳上的T4噬菌体包装机器是高度泛宿主性的，其转移DNA至前头部中，但是还意外地转移DNA至先前充满的病毒头部中。其他研究已显示，在充满的病毒衣壳中，所述入口的结构是根本改变的，并且曾认为在充满的头部中的所述包装机制将是不可逆的。本发明的一个方面涉及显示充满的头部、或清空其大部分已包装的DNA的头部，能够重新装配所述包装机器，并且使用其用任何DNA分子再次装满所述衣壳。

所述结果激发经典的顺序病毒装配模型，暗示了用于适于衣壳容量的病毒基因组进化的解释，并且指出了新纳米衣壳递送系统的途径，其中所述病毒包装机器(入口和马达)能被用于转移DNA以及其他治疗分子进入合成的衣壳。

在一个实施方式中，本发明提供了T4噬菌体组分用作载体以递送感兴趣的核酸和/或蛋白质。

在一个实施方式中，本发明提供了一种包装马达，即T4噬菌体包装马达。

在一个实施方式中，本发明提供了一种T4包装马达，其能与脂质体囊联合以包装核酸进入脂质体囊。

在一个实施方式中，本发明提供了一种包装马达，其能与任何能附着的隔室联合，并包装核酸至所述隔室的满容量能力。

在一个实施方式中，本发明提供了一种多用类型的递送媒介物，其能包装核酸并且附着感兴趣的蛋白。

有尾噬菌体是在自然界是无所不在分布的，并且是在本行星上丰度最大的有机体，正如在Hendrix，“进化：病毒的长久进化影响(Evolution：the long evolutionaryreach of viruses)，”生物学新见(Curr：Biol.)9：R914-R917(1999)中所述。所述这些，特别是T4噬菌体，是阐明在活有机体中DNA凝聚和解聚(DNA condensationand decondensation)的机制的极好模型。所述病毒体包括所述基因组被包装其中的头部、以及将所述基因组递送至所述细菌细胞内的尾部。所述头部被加压至约6兆帕(～6MPa)——相当于香槟酒瓶内部压力的十倍以上——因为包装高度带负电荷的、相对刚性双链DNA(dsDNA)达接近结晶质的密度（～500μg/ml)，进一步在Smith等人，“噬菌体直的phi29入口马达能够对抗巨大内部压力包装DNA(The bacteriophage straight phi29 portal motor can package DNA against a largeinternal force)，”自然(Nature)413：748-52(2001)；以及Lander等人，“传染性P22病毒体的结构显示了满头DNA包装的信号(The structure of an infectiousP22 virion shows the signal for headful DNA packaging)，”科学(Science)312：1791-95(2006)中得到描述。

普通的途径和机制包括在建立dsDNA病毒中，如在Casjens，“dsDNA噬菌体装配中的控制机制(Control mechanisms in dsDNA bacteriophage assembly)，”噬菌体(The Bacteriophages)，第一卷(Volume 1)，Calendar R，编辑，纽约：PlenumPress(出版社)，15-91(1988)、Black等人，“所述T4头的形态发生(Morphogenesisof the T4 head)，”噬菌体T4的分子生物学(Molecular biology of bacteriophage T4)，Karam，编辑，华盛顿：美国微生物学会(American Society for Microbiology)，218-58(1994)以及Mettenleiter等人，“疱疹病毒装配：更新(Herpesvirus assembly：anupdate)，”病毒研究(Virus Res).143：222-234(2009)所述。精确维度(precisedimensions)的衣壳通常用单一类型的蛋白亚单位在蛋白支架周围聚合，而首先得到装配(图1)。锥形的十二基数入口(dodecameric portal)起始装配，并且保留在等轴衣壳(原头部(prehead))的特殊五倍顶点处，以利于全部随后的相互影响(transaction)：DNA进入、尾部附着以及DNA排出(DNA ejection)，如在Simpson等人，“phi29噬菌体DNA包装马达的结构(Structure of the bacteriophage phi29DNA packaging motor)，”自然(Nature)408：745-50(2000)；以及Lebedev等人“通过病毒入口蛋白DNA转移的结构框架(Structural framework for DNAtranslocation via the viral portal protein)，”欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)26：1984-94(2007)中所述。所述支架被移除，在所述衣壳(前头部((prohead)或前衣壳(procapsid))内产生了空的空间用于用衣壳包裹病毒基因组(图1的步骤A)。包装ATP酶的马达，还公知为“末端酶”，识别并切割串联的病毒DNA以及在前头部入口的窄突起末端处对接，将所述DNA末端插入约3.5纳米(～3.5-nm)的入口通道，如Rao等人，“噬菌体DNA包装马达(The bacteriophage DNApackaging motor)，”遗传学年评(Annu.Rev.Genet.)42：647-81(2008)所述。

如此装配的所述包装机器，利用ATP水解的自由能驱动DNA的移位(图1的步骤B)。在充满所述头部(“满头”包装)之后，所述马达切割所述DNA，并且从所述DNA充满的头部游离下来(图1的步骤C)，正如在Alam等人“T4噬菌体的满头包装的核酸酶(The headful packaging nuclease of bacteriophage T4)，”分子微生物学(Mol.Microbiol.).69：1180-90(2008)中所指出的。所述颈部和尾部蛋白在入口装配，完成所述感染性病毒装配(图1的步骤D)，正如在Rao，“病毒DNA门：扣紧和解开所装的病毒基因组(A virus DNA gate：zipping and unzippingthe packed viral genome)，”美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，106：8403-04(2009)；Zheng等人，“在噬菌体p22中入口蛋白的构象转换启动基因组注射(A conformational switch in bacteriophage p22 portal protein primes genomeinjection)，”分子细胞(Mol.Cell).29：376-83(2008)；Bode等人，“在λ噬菌体头部中DNA的顺序排列.I.微球菌核酸酶的生物结果在无尾部的头部中暴露的染色体的部分的攻击(The arrangement of DNA in lambda phage heads.1.Biologicalconsequences of micrococcal nuclease attack on a portion of the chromosome exposedin tailless heads)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).62：493-502(1971)；Lhuillier等人，“噬菌体SPPI头部与尾部的连接的结构反映对于病毒DNA入门的机制(Structure of bacteriophage SPPI head-to-tail connection reveals mechanism for viralDNA gating)，”美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)106：8507-12(2009)；以及Edgar等人，“在突变的感染细胞的提取物中噬菌体T4的形态发生(Morphogenesis of bacteriophage T4 in extracts of mutant-infected cells)，”美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)55：498-505(1966)中所述。

所述噬菌体T4包装马达是至今报道的最快和最有力的。其产生约60皮牛(～60pN)的力，并且以高达每秒约2000碱基对(～2,000bp/s.)的速度包装。所述马达包括大的末端酶蛋白，gp17(70kDa)，以及小的末端酶，gp16(18k Dda)，正如Rao等人，“T4噬菌体的末端酶蛋白gp16和gp17的克隆、过量表达以及纯化。使用纯化的末端酶蛋白的确定的体外DNA包装系统的构建(Cloning，overexpression and purification of the terminase proteins gp16 and gp17 ofbacteriophage T4.Construction of a defined in-vitro DNA packaging system usingpurified terminase proteins)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).200：475-88(1988)中所述。gp17包括对于DNA包装必需的所有酶活性：ATP酶、核酸酶和移位酶，正如在Leffers等人，“与来自噬菌体T4的大包装亚单位gp17相关的ATP酶活性的生物化学表征(Biochemical characterization of an ATPase activity associated withthe large packaging subunit gp 17 from bacteriophage T4)，”生物化学杂志(J.Biol.Chem.)275：37127-136(2000)；Rentas等人，“定义噬菌体T4 DNA包装机器：在大末端酶/包装蛋白gp17中的C末端DNA裂解结构域的证据(Defining thebacteriophage T4 DNA packaging machine：evidence for a C-terminal DNA cleavagedomain in the large terminase/packaging protein gp17)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)334：37-52(2003)；以及Baumann等人，“具有提高的ATP酶活性的大亚单位多体，T4噬菌体gp17末端酶的分离和表征(Isolation and characterization of T4bacteriophage gp 17 terminase，a large subunit multimer with enhanced ATPaseactivity)，”生物化学杂志(J.Biol.Chem.).278：4618-27(2003)中所述。五分子的gp17在入口上装配，形成了具有中心转移通道的五邻体马达，所述通道是与入口通道相连的，正如在Sun等人，“T4噬菌体DNA包装马达的结构暗示了取决于静电力的机制(The structure of the phage T4 DNA packaging motor suggests amechanism dependent on electrostatic forces)，”细胞(Cell)135：1251-1262(2008)中所述。Gp16，公认的11体(11-mer)，调节gp17的活性，但是其在包装机器上的位置是未知的，正如van Duijn，“基于结构生物学的在天然质谱中的现有限制(Current limitations in native mass spectrometry based structural biology)，”美国质谱协会杂志(J.Am.Soc.Mass.Spectrom).21：971-78(2010)；以及Al-Zahrani等人，“T4噬菌体的小末端酶gp16是DNA包装马达的调节子(The small terminase，gp 16，of bacteriophage T4 isa regulator of the DNA packaging motor)，”生物化学杂志(J.Biol.Chem.)284：24490-500(2009)中所述。结构和生物化学的研究暗示，包装由分子马达在松弛和紧张的构象状态之间改变所产生的静电力驱动。

病毒装配的根本特征是“顺序装配(sequential assembly)”，其中，“简单(simple)”组成部分在严格序列中装配以产生具有独特生物学特性的复合体纳米机器。每一个包装步骤产生了新的位点或构象状态，下一个组成部分以敏感的特异性本质上不可逆地结合其上，正如Wood，“作为亚细胞结构装配模型的T4噬菌体形态发生(Bacteriophage T4 morphogenesis as a model for assembly ofsubcellular structure)，”生物学季评(Q.Rev Biol.).55：353-67(1980).中所述。一系列所述的步骤，正如研究T4噬菌体的文件证明，参考King，“T4噬菌体的尾部的装配(Assembly of the tail of bacteriophage T4)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)32：231-62(1968)；以及众多的其他病毒导致复合感染病毒体的快速且高保真度的装配，正如Casjens等人，“双链噬菌体装配中的控制机制(Control mechanisms indsDNA bacteriophage assembly)，”噬菌体(The bacteriophages)，第一卷(Volume1)，Calendar，编辑，纽约：Plenum Press(出版社)，15-91(1988)中所述。在噬菌体T4中，所述方法装配病毒体接近1的理论感染效率。

在噬菌体T4(体内)以及其他噬菌体和双链DNA病毒(例如，疱疹病毒)的头部形态发生中步骤的顺序，如下：(i)在新生(未膨胀(unexpanded))的空前头部上包装马达的装配(图1的步骤A)，(ii)在大约10％至25％的基因组得到包装后衣壳的膨胀(图1的步骤B)，(iii)包装直至所述头部充满，(iv)DNA的切割以及所述马达的解体(图1的步骤C)，以及(v)颈部蛋白的装配以封住所述包装的头部(图1的步骤D)。在入口处的构象变化得到报告以驱动这些循序不可逆的转变(图1；入口在每个阶段经历不同的构象状态)。

本发明有利的方面涉及T4噬菌体基因组包装机器的装配不严格遵循顺序和不可逆的步骤的模式(“马达”指五邻体gp17；而“机器”指完成包装的单元，包括壳(shell)[gp23]、入口和马达)。结果显示，所述T4噬菌体包装机器的装配是高度泛宿主性的，并且对其装配上的头部的类型不区别对待。在本发明的一个实施方式中，所述马达能够移位进入噬菌体头部，或者充满DNA的头部(图1的步骤G)或者曾经充满但又排出DNA的头部(图1的步骤F)。事实上，后者显示比所述前头部大5至10倍的包装效能。这是第一次报道证明完成的病毒的壳能再装配所述包装机器并再包装任何DNA。单分子光镊实验用于显示本发明的另一个实施方式，噬菌体头部上装配的包装机器的包装率与未包装的前头部(packaging

prohead)上装配的机器的包装率类似。单分子荧光检测显示本发明的进一步实施方式，成熟噬菌体头部催化反复包装起始、将多重DNA分子用壳体包裹在同一的头部中。本发明有利的实施方式是噬菌体T4 DNA包装机器具有非凡的构象可塑性，支持基因组移位至被动衣壳容器，不管其成熟阶段。所述特征可以驱动在双链DNA(ds DNA)病毒中测量到的满头的基因组的进化，并且提供本发明进一步的实施方式的途径，例如设计能够将DNA治疗剂和疫苗运输到细胞内的新型纳米装置。

病毒装配中的中心主题是顺序和不可逆装配。一个组成部分的装配产生新的位点或构象状态，其特异于下一个组成部分的装配，如此等等在Casjens等人，“dsDNA噬菌体装配中的控制机制(Control mechanisms in dsDNA bacteriophageassembly)”，噬菌体(The Bacteriophages)，第一卷(Volume 1)，Calendar编辑，纽约：Plenum Press(出版社)，15-91(1988)；以及King，“T4噬菌体尾部的装配(Assembly of the tail of bacteriophage T4)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).32：231-62(1968)中得到进一步描述。如果组成部分丢失，装配进行直至该点并且停止，积聚部分的装配结构以及未装配的下游组成部分，正如在Edgar等人，“在突变的感染细胞的提取物中噬菌体T4的形态发生(Morphogenesis of bacteriophageT4 in extracts of mutant-infected cells)，”美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.).55：498-505(1966)以及Kikuchi等人，“噬菌体T4基片形态形成的一般控制.I.体内和体外的主要前提的顺序装配(Genetic control of bacteriophage T4 baseplatemorphogenesis.I.Sequential assembly of the major precursor，in vivo and in vitro)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).99：645-72(1975)中得到进一步描述的。虽然所述精确的机制仍然难以理解，所述装配的结构既不能自发解装配，也不能与未装配的亚单位平衡，大概因为其锁定在不同的、高能稳定的构象状态。该过程不仅确保了预定顺序的定向装配，而且导致来自在被感染细胞中表观上无序分布(chaoticdistribution)的亚单位的、复合感染病毒体的快速且高保真的构建。

在入口和主要衣壳蛋白中顺序构象的变化，可以驱动从新生的前头部到DNA充满的头部的成熟转变，正如在Casjens等人，“dsDNA噬菌体装配中的控制机制(Control mechanisms in dsDNA bacteriophage assembly)，”噬菌体(TheBacteriophages)，第一卷(Volume 1)，Calendar R，编辑，纽约：Plenum Press(出版社)，15-91(1988)；Black等人，“所述T4头的形态发生(Morphogenesis of theT4 head)，”噬菌体T4的分子生物学(Molecular biology of bacteriophage T4)，Karam，编辑，华盛顿：美国微生物学会(American Society for Microbiology)，218-58(1994)以及Rao，“病毒DNA门：扣紧和解开所装的病毒基因组(A virus DNA gate：zippingand unzipping the packed viral genome)，”美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.).，106：8403-404(2009)中所暗示的。这些包括包装马达的装配、包装起始、前头部膨胀(prohead expansion)、满头包装(headful packaging)、包装终止以及颈部蛋白的装配(图1步骤A至步骤D)。

主要衣壳蛋白gp23在前头部膨胀过程中经历主要构象变化，导致在外部尺寸上大约15％(～15％)的增加以及在内部容积中大约50％(～50％)的增加(gp23是主要衣壳蛋白gp23的裂解形式；裂解发生在从原头部(prehead)向前头部(prohead)的成熟过程中；如图1步骤A所示)。在T4入口gp20中的构象变化已经得到报道，在未膨胀的前头部装配包装马达之后引发所述膨胀，正如在Ray等人，“病毒前头部膨胀和病毒包装的入口控制(Portal control of viral proheadexpansion and DNA packaging)，”病毒学(Virology)391：44-50(1999)中所述。正如在Carrascosa，“噬菌体T4和T2的头部成熟途径.IV.由在基因17中突变产生的T4头部相关颗粒的体外转变至衣壳样结构(Head maturation pathway ofbacteriophages T4 and T2.IV.In vitro transformation of T4 head-related particlesproduced by mutants in gene 17 to capsid-like structures)，”病毒学杂志(J.Virol).26：420-28(1978)中所述，在膨胀转变之后，暴露了针对Soc(小外部衣壳蛋白)的大约870个结合位点和针对Hoc(高度抗原性外部衣壳蛋白)的155个结合位点。

在噬菌体SPP1和P22中，入口构象变体被证明是或者所述头部包装不足(每个头部约95％的基因组)，或者所述头部过度包装(每个头部约105％的基因组)，正如在Orlova等人，“噬菌体SPP1的13重对称入口蛋白的结构(Structure of the13-fold symmetric portal protein of bacteriophage SPP1)，”天然结构生物学(Nat.Struct.Biol.).6：842-846(1999)；以及Casjens等人“噬菌体P22入口蛋白是调整病毒体内DNA包装密度的量规的部分(Bacteriophage P22 portal protein is part ofthe gauge that regulates packing density of intravirion DNA)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).224：1055-74(1992)中所述。在噬菌体P22中，围绕在所述入口的包装的DNA筒(packaged DNA spool)的一段，促成构象变化明显发信号给所述马达，使所述满头终止切割以及从充满DNA的头部的分离。另一入口构象变化引发在颈部蛋白的结合之后的DNA递送。因此，在本发明的时期的本领域理解，所述充满DNA的头部，其在头部充满之后刚刚排出所述包装马达，将没有能力再起始包装；相反，所述头部将引发结合颈部蛋白。申请人第一次证明，所述包装机器装配既不是顺序的也不是不可逆的。正如通过大量且单分子实验所证明的，其可发生在完成的头部，与发生在未包装的

空的(未膨胀或膨胀的)前头部一样高效率。所述泛宿主性的装配显现包装机器的特殊性能，因为所有其他头部装配转变(例如，头部膨胀)是不可逆的并且在经典顺序装配样式(assembly paradigm)之后。无论衣壳成熟状态——未膨胀的、膨胀的、充满DNA的或排出DNA的——所述马达能够移位DNA至衣壳的事实，暗示所述壳(shell)是被动的容器。所述包装过程的主要目的似乎是使基因组进入衣壳容器直至其被充满。

所述包装机器的构象可塑性结构基础是什么？X-射线和冷冻电子显微镜(cryo-electron microscopy)结构显示，尽管缺乏序列相似性，入口的三维结构严格保守，正如在Mettenleiter等人，“疱疹病毒包装：更新(Herpesvirus assembly：anupdate)，”病毒研究(Virus.Res).143：222-34(2009)以及Simpson等人，“phi29噬菌体DNA包装马达的结构(Structure of the bacteriophage phi29 DNA packagingmotor)，”自然(Nature)408：745-50(2000)中所述。锥形的入口由三部分组成：二十面顶点内部的宽的结构域、形成通道的长中心茎部，以及突出所述衣壳外的柄(stalk)。所述通道通过α螺旋自中心以约45°(～45°)角度辐射成线性，但是突出的末端具有α/β结构域通过环连接。在一个模型中，所述入口可以在不同能量相当的构象状态之间摆动，但是在一种结合至gp17、gp13等伙伴分子的状态下变得“冻结”。在另一种模型中，不同的结合位点可以在成熟途径的不同阶段容易接近。在新生的前衣壳中，只有突出的柄能够接近，允许gp17的装配，但是在头部充满之后，已包装DNA的内部压力可能推动所述入口向下，暴露所述茎(stem)的部分，其包含颈部(neck)蛋白的结合位点。颈部蛋白装配移走了所述包装马达，但是在缺乏颈部蛋白时，所述包装马达能够再装配所述入口。

泛宿主性的包装机器可以引导满头基因组的进化，在包括疱疹病毒的双链DNA(dsDNA)噬菌体和病毒中的根本共同特征，正如在Rao等人，“噬菌体DNA包装马达(The bacteriophage DNA packaging motor)，”遗传学年评(Annu.Rev.Genet.)42：647-81(2008)中提到的。装配自古衣壳蛋白的封闭的壳可能先于基因组的进化。能够不加区别的转移DNA分子至衣壳容器的挠性的包装机器，将继续包装直至所述衣壳充满。由于在紧密包装的DNA中存在能量(内部压力)，所述充满的壳能够更有效地递送所述“基因组”进入宿主细胞。最终，该选择性的优点引起感染性衣壳(病毒体)的进化，所述衣壳内部紧密包装有DNA，它们的长度由所述封闭的壳的容量规定。本发明的有利的实施方式为，在或者体外或者体内的条件下，紧密包装DNA以高效递送外生物质进入宿主细胞。

所述包装机器的构象挠性也可以导致在正常感染中感染性病毒体的更有效地产生。低丰度的包装/末端酶蛋白必须与关于转录、复制、重组和修复的多种其他DNA新陈代谢酶竞争DNA底物。所述包装马达有可能过早脱落，或者被所述头部移走，这样将能够重新装配并且重新包装。

在本发明的另一实施方式中，高度稳定的病毒的壳用作包装容器。这是从技术角度的重大的突破，具有广泛含义。首先，现有用在所有体外DNA包装系统中的前头部非常脆弱，并且在T4中所述前头部是未膨胀的、膨胀的、破坏的以及部分Soc/Hoc结合颗粒的异质混合物。在本发明的实施方式中，已经经历过全部成熟转变的头部是同质的，且结构非常稳定，并且被870拷贝的Soc加固，提供了非常高效的系统以包装DNA以及产生包装媒介(packaging intermediates)的高分辨度的重建。本发明的另一实施方式是部分的头部具有比前头部5倍至10倍高的包装效率。在本发明的有利的实施方式中，可能克服一些技术障碍以开发用于诸如疱疹病毒和腺病毒的真核病毒的体外DNA包装系统，通过从所述病毒体中排出已包装的DNA，正如在Newcomb等人，“来自疱疹病毒衣壳的极化的DNA排出(Polarized DNA ejection from the herpesvirus capsid)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).392：885-94(2009)中所述；并且重新包装不同的DNA进入到倒空的头部。在本发明的另一实施方式中，所述有力的包装马达能够用于用衣壳包装外来DNA的大量部分，并且通过在衣壳表面展示特异性配体靶向这些粒子至特定的细胞或组织，正如在Li等人，“T4噬菌体衣壳：用于大分子复合物的有效表面装配的独特平台(Bacteriophage T4 capsid：a unique platform for efficientsurface assembly of macromolecular complexes)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).363：577-88(2006)中所指出的。所述颗粒可以递送多重基因用于基因治疗以及多价DNA疫苗对抗病原体。在本发明的进一步的实施方式中，噬菌体T4的头部具有非常高的容量(约170kb)并且证明在相同的头部包装多重DNA分子的能力，将是特别有吸引力的纳米颗粒。在本发明的另一实施方式中，纳米马达得以设计用于各种生物药物应用。由于所述的壳表现为被动的容器，所述包装机器(入口以及马达)将能被自衣壳剥离，并插入人工的并且更大的壳，例如脂质体或哺乳动物细胞，所述机器将能够做到移位DNA和其他治疗分子至所述隔间内。

T4噬菌体纳米粒子的表面能够或者通过基因工程或者通过直接化学结合被固定，以展示有用的部分，例如抗体或其他识别特异性靶标的蛋白质，并且能够被用作传感器，正如在Archer等人，传感器(Sensors)，9，6298-311(2009)中所述的。在已经得到调查的广泛范围的植物和细菌病毒中，使用噬菌体以及特别是使用T4噬菌体作为纳米物质的兴趣最近有所提高，归因于其挠性、无限制的展示系统。Rao，V.B.包括噬菌体纳米颗粒方法和组合物，已经在美国专利申请第2005/0226892号，Rao，发明名称为“包括噬菌体纳米颗粒的方法和组合物(Methods and compositions comprising bacteriophage nanoparticles)”公开于2005年10月13日；Li等人，“在噬菌体T4上的小外部衣壳蛋白的装配：一种用于在噬菌体衣壳上高密度展示多重大型炭疽毒素和外源蛋白的新型系统(Assembly ofthe small outer capsid protein，Soc，on Bacteriophage T4：A novel system for highdensity display of multiple large anthrax toxins and foreign proteins on phage capsid)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).370，1006-10192007；Wu等人，“具有提高的经典猪瘟病毒免疫原性的T4噬菌体纳米颗粒衣壳表面SOC和HOC双向展示：有力的免疫学途径(Bacteriophage T4 nanoparticle capsid surface SOC and HOCbipartite display with enhanced classical swine fever virus immunogenicity：A powerfulimmunological approach)，”病毒学方法杂志(J.Viral.Meth).139，50-60(2007)中得到描述。

脂质体能够以许多不同的尺寸制备，范围从小的单层囊(SW′s)，其最小的直径是约20纳米(nm)，到特大的单层囊(GUY′s)直径直达几十(tens)皮米(pm)。在中间是多层囊(MLV′s)；即在直径上几百nm的脂质体(1)的首次产生，以及较新的大单层囊(LUV′s)，特征在于高捕获容量，其直径能够被调节(例如100或200nm)并且粒径分布由通过特定膜(2)挤出窄下来。本质上，脂质体是高度多功能的结构，其特性能够通过改变参数的量来调整，所述参数例如大小、层流性(lamellarity)、双分子层的组成、表面电荷以及表面性质；对于化学家而言，(磷)脂类((phospho)lipids)是脂质体的组成成分，其也是用于设计具备新性能类似物和有用的衍生物的大有希望的分子：例如，用于将配体连接至所述囊的表面。由于DNA的聚阴离子性质、阳离子(和中性)脂类通常用于基因递送，而阴离子脂质体的应用已经相当受限于递送其他治疗巨大分子，正如在Mayhew等人，“脂质体的治疗学应用(Therapeutic applications of liposomes)，”脂质体(Liposomes)，Ostro编辑，马塞尔德克(Marcel Dekker)：纽约，289-341(1983)中所提及的。

在本发明的另一实施方式中，包含噬菌体T4病毒或者T4病毒衣壳的载体能够具有在任何组成蛋白亚单位中的变异，其可能导致基因治疗的方法中有利特性。所述突变可以被导入至组成载体蛋白的核酸序列。所述载体还可以被用于递送也已经得到修饰的靶基因或蛋白质。例如，通过产生寿命长并且稳定的核酸，修饰可以解决像基因治疗的寿命短性质(short-lived nature)的问题。当外源物质导入其中时，其他的修饰可以导致来自有机体的免疫应答没有或者降低。此外，修饰可以进行修饰以解决由载体本身能力引起的毒性、免疫和炎症反应以及潜在的疾病。还可以进行修饰以解决多基因紊乱以及减少插入突变肿瘤形成的机会。术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”可互相交换地用于本文指任意长度的氨基酸残疾的聚合物。所述聚合物可以是直链或者分支的，其可以包括修饰的氨基酸或者氨基酸类似物，并且其可以被非氨基酸的化学部分(chemical moieties)中断。所述术语还可以包括已经被天然修饰的氨基酸聚合物，或者被例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化的介入(intervention)修饰的氨基酸聚合物，或者被诸如标签或生物活性组分结合的其他任何处理和修饰的氨基酸聚合物。

本发明还包括其中具有新功能的多肽得到引入的载体。例如，所述新功能可以通过伴随功能性挑选(selection)或筛选(screen)的定向或随机的突变形成而进行。突变形成的方法对于本领域技术人员而言是公知的。正如这里所使用的术语“核苷酸序列(nucleotide sequences)”和“核酸序列(nucleic acid sequences)”指脱氧核糖核苷酸(DNA)或者核糖核苷酸(RNA)序列，包括但不限于信使RNA(mRNA)、DNA/RNA杂交、或合成的核酸。所述核苷酸可以是单链的、或者部分或全部双链的(双链体)。双链体核酸可以是同源双链或异源双链。

本文这里使用的术语“转基因”可以用来指与本发明相关的“重组体”核酸序列。所述术语“重组体”意思是已经“被人”操作处理过并且在自然界不存在的核苷酸序列，或者连接至其他核酸序列或发现与自然界中的排列不同的核苷酸序列。可以理解“被人”操作处理过意思是被某些人工手段操作处理过，所述人工手段包括使用机械、密码子优化、限制酶等。

例如，在一种实施方式中，所述核酸序列可以被突变，这样以来体内所编码的蛋白质的活性得到废除。在另一种实施方式中，所述核酸序列可以被密码子优化：例如，所述密码子可以被优化用于人类使用。在优选实施方式中，本发明的核酸序列既进行了突变异废除所述编码蛋白的正常体内功能，又进行突变使密码子得到优化用于人类使用。

关于密码子优化，与本发明相关的所述核酸分子具有编码本发明抗原的核酸序列，并且能够得到设计，以应用用在受试者基因中的密码子，其中所述抗原得以产生。在优选实施方式中，所用的密码子是“人源化的”密码子，即所述密码子是那些在高表达的人基因中频繁出现的密码子，正如在Andre等人，“具备使用优化密码子的合成gp120序列的DNA免疫接种所引起的增强的免疫应答(Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120sequence with optimized codon usage)，”病毒杂志(J.Viral.)72：1497-1503(1998)中所述。可以使用任何合适的密码子优化方法。本领域技术人员公知所述方法以及所述方法的挑选。此外，有些公司将优化密码子的序列，例如，基因领域(Geneart)及其同名网站。因此用于本发明中的所述核酸序列能够容易地进行密码子优化。

本发明的另一种实施方式还包括编码以下蛋白质的功能和/或等效变体和衍生物的核酸序列以及它们的功能等效片段：构成所述载体的蛋白质、或附着于所述载体的蛋白质、或者将被本发明所述载体递送的蛋白质。例如，在DNA序列中不改变所编码的氨基酸序列的变化，以及那些导致氨基酸残基的保守替换、一个或一些氨基酸的缺失或添加、以及被氨基酸类似物替换的氨基酸残基、是对所编码的多肽的性质没有显著影响的变化。保守的氨基酸替换是：甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸；赖氨酸/精氨酸；以及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。在一种实施方式中，所述变体具有与感兴趣抗原、抗原表位、免疫原、肽或者多肽至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的同源性(homology)或同一性(identity)。

用于本发明的目的，序列的同一性或同源性通过比对时比较所述序列确定，当最小化序列缺口时最大化重叠和同一性。尤其是，序列同一性可以使用众多数学算法的任意之一确定。用于比较两条序列的数学算法的非限定性的实例是，Karlin等人，“用于评估使用总体评分方案的分子序列特性的统计学显著性的方法(Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features byusing general scoring schemes)”美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)87：2264-68(1990)的算法，并在Karlin等人，“对于分子序列中的多重高评分部分的应用和统计(Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecularsequences)，”美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)90：5873-77(1993)中得到改进。

用于比较序列的数学算法的另一个实例是，Myers等人，“在线性空间中最佳校正(Optimal alignments in linear space)，”生命科学中的计算机应用(CABIOS)4：11-17(1988)的算法。所述算法被并入ALIGN程序(2.0版)(ALIGN program(version 2.0))，其是GCG序列比对软件包的部分。当使用所述ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120衡量残基表、缺口长度罚分12以及缺口罚分4。而用于鉴别局部序列相似性和比对区域的另一有用的算法是FASTA算法，正如在Pearson等人，“用于序列比对的改进工具(Improved tools for biologicalsequence comparison)，”美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)85：2444-48(1988)中所述。

有利用于本发明的是WU-BLAST(华盛顿大学BLAST)2.0版软件。用于几种UNIX平台的WU-BLAST 2.0版可执行程序能够在线下载。所述程序基于WU-BLAST 1.4版，其依次基于公开结构域的NCBI-BLAST 1.4版，正如在Altschul等人，“局部比对统计学(Local alignment statistics)，”酶学方法(Methods inEnzymology)，Doolittle ed.，266：460-80(1996)；Altschul等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，215：403-410(1990)；Gish等人，自然遗传学(Nature Genetics)3：266-272(1993)；以及Karlin等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)90：5873-5877(1993)中所述，它们的全部内容和公开这里并入作为参考。

使用标准重组DNA和克隆技术得到多种重组核苷酸序列和与本发明有关的多肽。所述技术是本领域技术人员公知的。参考，例如，Sambrook等人，分子克隆实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版(second edition)，第1、2和3卷(volume 1，2 and 3)(1989)。

在某些实施方式中，与本发明相关的多肽可以用于体外(例如使用无细胞表达系统)和/或用在体外生长的培养的细胞中，以产生所述多肽，其然后可以用于多种应用，例如在蛋白性质的疫苗的生产中。为了应用在需要所述多肽在体内表达的地方，例如当本发明的转基因用在DNA或含有DNA的疫苗、任何允许本发明的多肽表达的运载体中并且对可能使用的体内应用是安全的。

为了与本发明相关的多肽得到表达，所述蛋白质编码序列应当被“可操作的连接(operably linked)”至蛋白质的直接转录和翻译的、调节或核酸控制序列。正如这里所用，当编码序列和核酸控制序列或启动子是以这样的方式共价连接，来在核酸控制序列的影响或控制下安排所述编码序列的表达或转录和/或翻译时，它们被称为“可操作的连接”。所述“核酸控制序列”可以是任何氨基酸元件，例如但不限于启动子、增强子、内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)、内含子，以及其他这里描述的元件，其指导核酸序列或可操作地与其连接的编码序列的表达。

已经得到详细描述的本发明的许多实施例，显然可能不偏离本发明后附权利要求所定义的范围而修饰和变异。而且，应当理解的是，本发明公开中的所有实施例，在详细说明本申请许多实施方式的同时作为非限定性的实施例提供，因此不能认为这样说明限定若干方面。

实施例

通过后续多个实施例使本发明的说明得到增强。

实施例1

噬菌体头部重新装配功能性DNA包装机器和包装DNA。噬菌体T4gp10与gp11联合形成基片的尾钉，正如在Leiman等人，“T4噬菌体的结构和形态发生(Structure and morphogenesis of bacteriophage T4)，”细胞分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.)60：2356-70(2003)中所述。由于所述尾钉的装配是尾部装配的第一步，尾部结构缺少gp10不能装配。蛋白质gp 13、gp 14和gp 15装配入把已包装头部封住的颈部，在DNA包装后用所述gp13蛋白直接相互作用于所述入口蛋白gp20，以及gp14和gp15然后在gp13的平台上装配。10am13am突变体(以及在噬菌体λ和其他噬菌体中类似的突变体)完成了所有包装步骤，包括串联体DNA的切割以及所述包装马达的解体。充满DNA的噬菌体头部在10am13am突变体感染细胞中积累，通过与颈部和尾部蛋白在体外互补，其可以被转换成感染的病毒体。因此，根据广泛公认的顺序装配模型，DNA包装完成之后的所述头部预期具有对于包装马达最小的亲和力，但是对于颈部蛋白具有高亲和力。本发明的新颖方面是首次涉及包装机器不区分“前头部”(图1，步骤A)以及完成或成熟的“噬菌体头部”(图1的步骤F和步骤G)。

所述10am13am的头部通过CsCl密度梯度离心被分离成两种类型(DNA测序显示10am13am噬菌体具有在基因10中的色氨酸残基430和在基因13中的谷氨酰胺残基39处的TAG琥珀型突变)。两条空间上非常接近的低密度的带存在于所述梯度的大约中部，并且高密度的带位于接近所述梯度的底部(图2)。所述两条接近的带，占大约93％的充满的头部，包括同样的头部的种类但是迁移略微不同，可能是因为在较上部的带中的所述头部质地松散与细胞碎片相关(在某些纯化中，只有一条宽的单一的带可见)。关于通过二乙基氨基乙基纤维素(diethylaminoethyl cellulose，DEAE)离子交换色谱的进一步纯化，所述细胞碎片污染物得到了清除，并且所述头部作为单一对称峰洗脱(图3)。在室温下所述头部的类型都对SDS抗性(图4)，这意味着它们如预期处于完全膨胀阶段。琼脂糖电泳显示所述低密度的头部包括大约8-kb的DNA带(图6，泳道5和泳道6)，而高密度的头部包括接近基因组全长的DNA(图6，泳道9和泳道10)。前者被称为“部分的”头部并且后者被称为“充满”的头部。

由于13am突变体积累充满DNA的头部，部分的头部可能通过在纯化过程中，从充满的头部将已包装DNA自发排出而产生。所述充满的头部公知是不稳定的并且自发排出所述DNA除非被颈部蛋白封住。所述排出的DNA可以被缓冲液中的DNA酶I(DNAse I)消化，在所述壳内仅仅留下小的DNA碎片。如图6中所示，与部分的头部相关的DNA在所述头部内部，因为其与所述头部的带(泳道3)迁移，并且对DNA酶I处理具有抗性(泳道4)，并且在用蛋白酶K消化时，所述DNA得到释放，并且迁移到8-kb的位置(泳道5)。有趣的是，所述8-kb的带在几个独立的制备中观察到的是始终一致的，并且是非常紧密的，暗示在大约95％的基因组得到释放之后，在窄窗口内的排出停止。所述DNA可以属于T4基因组的特异性序列，因为其结合至衣壳蛋白，并且不能被排出。为了验证所述假说，通过苯酚和氯仿从部分的头部中提取所述DNA，并且用限制性酶EcoR V(六碱基切割(six-base cutter))或者Taq I(四碱基切割(four-base cutter))消化，它们能切割羟甲基化的和糖基化的T4DNA。如果所述8-kb DNA属于T4基因组的特有的序列，则将产生一系列分离的带。可选地，如果每个8-kb的碎片都属于基因组的不同部分，则所述限制性片段应当不能形成分离的带。结果显示，所述产物作为成片条带(smear)迁移，证明所述保留的DNA不具有特有的序列。这还与以下事实一致，T4基因组的末端是几乎随机的，并且因此不能预期接近衣壳蛋白的基因组的延伸将与在不同颗粒中的DNA相同。

所述充满的头部，其占至多大约7％的充满的头部，具有已包装的基因组相对稳定地保留在所述头部之内，大概因为或者所述入口通道受限，正如在Lander等人，“传染性P22病毒体的结构显示了满头DNA包装的信号(The structure of aninfectious P22 virion shows the signal for headful DNA packaging)，”科学(Science)312：1791-95(2006)中所暗示，或者所述DNA末端与所述入口通道(portal channel)的进口(entrance)并不接近。所述头部在4℃下储存时慢慢释放DNA。

所述部分的头部和充满的头部的包装活性通过体外DNA包装检测来测定，使用17am18amrII空的前头部作为阳性对照。在噬菌体T4中，由包装缺陷的17am突变体感染产生的所述空的前头部，是已膨胀的类型的大部分(参见图4的泳道1和泳道2)，由于膨胀是在体内封闭包装时自发发生的。所得未包装的

空的膨胀前头部，其也包装DNA或者比未膨胀的前头部更好，已经用于在包装检测中作为阳性对照，正如在Rao等人，“噬菌体T4前头部体外DNA包装证据，前头部膨胀与DNA包装不连接(DNA packaging of bacteriophageT4 proheads in vitro.Evidence that prohead expansion is not coupled to DNApackaging)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).185：565-578(1985)；Black等人，“噬菌体T4 DNA包装与复制依赖的晚期转录机器的组成部分机械连接(Mechanistic coupling of bacteriophage T4 DNA packaging to components of thereplication-dependent late transcription machinery)，”生物化学杂志(J.Biol.Chem).281：25635-25643(2006)；以及Kondabagil等人，“噬菌体T4包装马达的DNA移位ATP酶(The DNA translocating ATPase Of bacteriophage T4 packaging motor)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，363：786-99(2006)中所提到的。在大量的包装检测中，部分的头部和充满的头部都有效地包装短DNA片段(50-766碱基对(bp))(图7)。部分头部的包装效率比所述前头部的包装效率高大约6倍，所述前头部是所述DNA体内包装的真实前体(包装效率被定义为每一数量的头部颗粒包装DNA分子的数量)。这可能是因为所述前头部不象成熟的头部，前头部是脆弱的并且由于在体外不规则的膨胀和/或缺乏衣壳装饰蛋白Soc和Hoc的稳定化，可能在纯化过程中已经被损坏，正如在Fokine等人，“T4噬菌体的长球形头部的分子建筑(Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4)，”美国科学院院刊(Proc Natl.Acad.Sci)101：6003-08(2004)中所述提及。部分头部包装的效率比所述充满的头部的包装效率高大约5到10倍(图7，泳道3和泳道6)，其可能是因为大部分充满的头部没有任何空地方留下来容纳额外的DNA。因此，部分的头部，而不是所述充满的头部，包装48.5-kb的噬菌体λDNA(图8，泳道7和泳道15)或者所述T4基因组DNA。为了证实所述部分的头部和充满的头部装配外源添加的包装马达，通过使用多克隆gp17抗体的蛋白质印迹，头部gp-17复合体得到纯化和分析。可以看出，两种类型的头部都装配所述外部添加的gp17(图5)。以上发现通过构建额外的10am 13am噬菌体突变体来再现，其中所述突变体还缺失了hoc或soc，或者两个基因都缺失了。

图1显示了主要衣壳蛋白围绕支架核心装配入原头部(prehead)。所述核心通过蛋白水解被移除，产生空的未膨胀的前头部(A)。所述未膨胀的前头部具有圆形形状，但是在T4噬菌体中其具有有角的几何形状，正如在Steven等人，“病毒衣壳蛋白的构象变化。对于通过soc结合的T4噬菌体衣壳的膨胀、协调性和超级稳定性的蛋白水解的调控热动力学基本理论(Conformational changes of a viralcapsid protein.Thermodynamic rationale for proteolytic regulation of bacteriophage T4capsid expansion，co-operativity，and super-stabilization by soc binding)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.).228：870-84(1992)中所提及的。所述包装马达-DNA复合体进入入口并且起始包装。在大约10-25％的DNA得到包装后，前头部膨胀(B)。在满头包装后，所述马达切断串联体DNA，并且从所述充满DNA的头部解体下来(C)。所述颈部蛋白(gp13、gp14和gp15)装配到入口上以封住所述充满DNA的头部，并提供平台用于尾部装配(D)。入口的各种颜色代表不同的构象状态。在泛宿主的装配中，所述包装马达在通过排除已包装的DNA(E)产生的部分的头部上装配，在充满的头部(G)以及再次充满的具有新的DNA片段的头部上装配(([F]和[G]；在所述充满的头部阶段和部分的头部阶段中，新DNA片段都显示附着于所述马达)。

图2显示所述10am13am的头部，如实施例5中所述，通过差速离心然后CsCl梯度离心得以分离。所述两个空间上接近的带在所述梯度的顶部，其含有部分的头部，所述头部已经排出它们包装的DNA的大部分，保存大约8-kb的碎片。在所述梯度的底部的带含有充满的头部，其中T4基因组是稳定化的。图3显示通过二乙氨基乙基琼脂糖柱层析(DEAE-Sepharose column chromatography)的纯化的部分头部。两条空间上非常接近的头部的带在CsCl梯度顶部得到收集，靠10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH 7.5)、50mM NaCl和5mM MgCl₂得到透析，并通过离子交换色谱(AKTA蛋白纯化系统(AKTA Prime)，GE医疗保健(GE Healthcare))得到纯化。所述柱用50mM Tris-HCl(pH 7.5)和5mM MgCl₂预平衡，并且应用0-300mM NaCl的线性梯度以洗脱结合的头部。峰组分得以收集、通过滤过浓缩，并且储存在4℃下。图4显示，部分的头部和充满的头部完全膨胀。纯化的前头部、部分头部以及充满的头部与十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶加样缓冲液混合，并在室温下(“-”)或在沸腾温度下(“+”)5分钟。所述样品然后通过10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分离，用考马斯蓝R(Coomassie blue R)染色并脱色。注意到所述主要蛋白，gp23*(位置用箭头标记)在室温下的样品中未见到，因为所述膨胀的头部不能解体为gp23*亚单位。图5显示部分头部和充满头部用外源gp17装配。大约5×10¹¹的前头部、部分头部或充满的头部与纯化的gp17-K577(0.3μM；50∶1的gp17分子与gp20亚单位的比例)在室温下于缓冲液中孵育30分钟。所述缓冲液包含50mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl以及5mM MgCl₂。通过在18,000转每分钟(rpm)下离心45分钟沉淀所述头部-gp17复合体，并且所得小球洗涤几次以去除任何未结合的gp17。所述蛋白质被转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，并且使用多克隆gp17抗体进行蛋白质印迹(Western blotting)。通过用全长gp17和绿色荧光蛋白(GFP)-gp17融合蛋白做同样的实验，来验证所述结果。只有gp17-K577(缺失了gp17C末端的33个氨基酸)的数据得以显示，因为gp17-K577是蛋白酶抗性的且作为一条单一的带迁移，与使用全长gp17和GFP-gp17的三条带相反，并且还因为在同样的未知没有背景重叠的带。在充满的头部的泳道中的所述gp17的带很微弱，因为所述这些头部中的一些在此过程中释放了已包装DNA，其导致所述头部在离心和洗涤步骤中的回收率很低。

图6显示部分的头部(泳道3-6)、充满的头部(泳道7-10)或者前头部(泳道12)用DNA酶I处理(37℃，30分钟)和/或用蛋白酶K处理(65℃，30分钟)，如所述附图下面的行中的“+”或“-”所示；以及进行琼脂糖凝胶(0.8％重量/体积(w/v))并用赛博绿(cyber green)染色。分子量标记λHindIII(泳道1)、λDNA(泳道2)和T4 DNA(泳道11)用于测定在所述头部中存在的DNA的大小。部分的头部泳道3-6：泳道3，没有任何处理；泳道4，用DNA酶I处理；泳道5，用蛋白酶K处理；泳道6，用DNA酶I处理且然后用蛋白酶K处理。箭头显示用赛博绿(cyber green)染色的头部的位置，因为它们与约8-kb(～8-kb)的DNA(泳道3)相关。所述8-kb的DNA在所述头部内部，因为其对DNA酶I处理抗性，但是通过蛋白酶K处理释放(泳道5和泳道6)。充满的头部泳道7-10：泳道7，没有任何处理；泳道8，用DNA酶I处理；泳道9，用蛋白酶K处理；泳道10，用DNA酶I处理且然后用蛋白酶K处理。注意到未处理的充满的头部显示除了所述头部的带(箭头)之外，还在孔中显示强烈染色外加成片的带(泳道7)，所述成片的带都通过用DNA酶I消化而去除(泳道8)。这是因为充满的头部的一些在存储过程中排出了已包装的DNA，其与所述头部复合的留下来并保持在孔中。通过用蛋白酶K处理验证，蛋白酶K释放所述DNA以及已包装在内的DNA，产生了单一的带(泳道9)。起初用DNA酶I处理导致外部DNA的消化，随后蛋白酶K的添加消化所述衣壳并释放包装在内的DNA(泳道10)。泳道9和泳道10内的DNA比分离自噬菌体的DNA(泳道11)稍短，大概因为接近入口的以包装的DNA部分DNA酶I的消化容易达到[11]、[13]、[14]。箭头显示用赛博绿(cyber green)染色的头部的位置，因为它们与所述头部内部的DNA相关(泳道7)。所述对照的17am18amrII的前头部是空的并且显示用赛博绿(cybergreen)不着色(泳道12)(图7和图8)。短DNA片段(50-766bp)的包装(图7)或λDNA(48.5kb)(图8)在多种反应条件下，如所述附图下面所示。

实施例2

单一成熟噬菌体头部装配的包装机器在充满所述衣壳。虽然实施例1显示，充满的头部包装DNA，但是可能表明在CsCl梯度离心过程中，所述充满的头部的部分排出DNA，转化它们进入部分的头部。为了说明这个问题，不进行梯度离心制备10am13am的头部。感染的细胞在DNA酶I存在下裂解，并且通过差速离心分离噬菌体的头部。这些头部，其包含部分的头部和充满的头部的混合物，被包装入DNA(50至766bp的梯状片段)，并且然后通过CsCl密度梯度离心分离。这不仅最小化了任何DNA从充满的头部中的排出，而且更重要的是确保了只有包装了DNA部分的充满的头部在CsCl梯度中到达高密度的位置(较低的带)。

所述部分的头部以及充满的头部的带(图9)自CsCl梯度提取，用蛋白酶K处理以释放包装的DNA，并且在4％-20％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。所述样品还在蛋白酶K处理前在SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳以测定头部颗粒的数量(图10)。正如图11所示，以与所述梯度纯化充满的头部在图6、图7和图8所做的同样的效率，所述充满的头部包装所述梯形DNA片段。对照样品中所述头部以同样的方式处理，除了gp17和ATP在包装反应中省略之外，显示无可测的DNA(图11，对比了已包装的泳道1和泳道2以及对照的泳道3和泳道4)。部分的头部正如所期望的，还以与所述梯度纯化的部分的头部的类似的效率包装DNA(图6、图7和图8)。实际上，所述已包装的部分的头部的带显示向下的偏移接近在包装后更高的密度(参见图9中所述包装的左侧梯度管显示，当与右侧对照的梯度的管相比时，加宽的部分的头部的带接近更高密度)。所述实验显示，包装DNA的短的碎片进入充满的头部不存在根本的障碍，通过单分子光镊实验进一步验证所述观察。

图9显示通过在DNA酶I存在下裂解然后差速离心，所述噬菌体的头部分离自10am13am感染的大肠杆菌P301细胞(E.coli P301 cells)(500ml培养物)。所述噬菌体头部的小球包括部分的头部和充满的头部的混合物，在200μl的50mM Tris-HCl(pH 7.5)和5mM MgCl₂中重悬。所述样品被分成两部分，并且大规模包装测试立即进行。所述500-μl包装反应包含100μl的噬菌体头部、4.75μMGFP-gp17、43μg的梯状DNA(50-766bp；NEB)、5％聚乙二醇缓冲液以及1mMATP。Gp17和ATP在对照反应中被省略掉。在室温下孵育30分钟后，40μl(1000单位)的Benzonase核酸酶(Benzonase nuclease)(EMD生命科学(EMDBiosciences))被加入以消化未包装的DNA，并且所述样品是通过CsCl密度梯度离心而分离的。图10显示来自所述梯度的所述部分的头部和充满的头部的样品在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以分析蛋白质和估计用在包装反应中的颗粒的浓度。由于所述充满的头部的浓度与部分的头部的浓度相比非常低(大体上是部分的头部的浓度十分之一)，所述充满的头部通过高速离心浓缩，这样以来对于充满的头部和部分的头部二者每泳道颗粒的数量大致相同(图11和图12)。来自梯度的充满的头部的带(图11)和部分的头部的带(图12)用蛋白酶K(18.5μg；富酶泰斯(Fermentas))处理，并在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上在Tris-硼酸缓冲液(pH8)中电泳，以分析已包装的DNA。

实施例3

单一成熟噬菌体头部装配的包装机器在充满所述衣壳。使用双阱光镊在“力钳(force-clamp)”模式下进行单分子实验。头部-gp17包装复合体在非水解类似物、ATP-γ-S存在下形成，并固定在T4抗体包被的微球上。在一端生物素化的底物DNA分子(10kb)附着到链霉亲和素包被的微球上。所述微球在单独的阱中被捕获，且使进入近接触(near contact)状态并快速分离(图13)。重复这种“钓鱼”的过程，直至形成栓系(tether)，很明显当马达捕获DNA时力增加。然后通过反馈环(feedback loop)施加5pN的持续的力，并且包装得到测量作为栓系长度随时间降低的函数。

所述数据显示所述部分头部装配的包装机器的包装速率(图14)与空的前头部的包装速率类似(图16)(约800至1100碱基/秒(～800-1,100bp/s))。正如先前在Zheng等人，“在噬菌体P22入口蛋白中的构象转换引发基因组的注射(Aconformational switch in bacteriophage p22 portal protein primes genome injection)，”分子细胞学(Mol Cell)29：376-83(2008)中所述，所述包装速率比phi29包装机器的包装速率快大约七倍。所述充满的头部也包装DNA但显示与众不同的特征(图16、图17和图18)。一些头部包装全部的10-kbDNA，并且所述包装的速率与所述部分头部或前头部装配机器的速率类似(图16)。这些头部在储存过程中可能倒空了已包装DNA中的客观部分，为容纳10-kb碎片创造了空间。第二类头部只包装DNA的大约1-3kb的短的碎片，然后停止(stall)，暗示这些头部几乎被充满并且只能够容纳小的碎片(图17)。有趣的是，考虑到这些机器可能包装入几乎充满的头部，这些机器的包装速率仍然非常高。然而，这些机器中的一些不完全停止，而是相反缓慢包装(例如图17中顶部和底部的痕迹(trace))。第三类头部仅形成栓系，没有明显的移位，暗示这些头部可能已经没有空间留下来容纳额外的DNA(图18)。有趣的是，这些机器形成栓系，表示它们成功地起始了包装(很明显力有增加)，但是很长一段时间停留在停止的状态(否则，所述DNA在5pN的力下将快速挣脱)。这些数据证明所述包装机器能够在成熟的噬菌体头部上有效装配，并再次充满所述衣壳，且再次充满的DNA的长度显现不依赖于所述衣壳中可体供空间的量。

图13显示用于单分子DNA包装的双光阱装置。所述T4头部-马达复合体以及10-kbDNA底物被栓系在两个头部之间，每一个容纳在一个光阱中，并且承受如实施例7中所述的5pN的拉力(图14、图15、图16、图17和图18)。包装痕迹(Packaging trace)显示由前头部(图14)、部分的头部(图15)和充满的头部(图16、图17和图18)的所述DNA的包装。“n”代表包装痕迹的数量，质量上显示与一组调查对象(panel)中的包装行为类似。

实施例4

成熟噬菌体头部装配的包装机器经历了多重包装起始。使用大量测试，短的39bp Cy5末端标记的DNA和83bp Cy3末端标记的DNA，被包装入前头部、部分的头部和充满的头部。使用抗噬菌体T4多克隆抗体，所述包装的头部被固定在聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)钝化的石英表面，并且全内反射显微镜方法(total internal reflection microscopy)和单分子检测用于所述荧光颗粒的成像。通过测定来自每样品的至少30个图像的每个面积亮点的平均数，定量“发光”的头部(图19和图21；参见荧光图像的图23和图24)。与大量测验一致，所述亮点(bright spot)的平均数对应包装已标记DNA的部分的头部比空的前头部大约大5倍，比充满的头部大约大10倍(图20和图22)。其中省略gp17的对照实验具有0-2个亮点，暗示任意表面结合物质的非特异性荧光是可以忽略的(所述包装的样品用过量的DNA酶I[10μg/ml]在室温下处理大约20小时，以消化任何未包装或者非特异性结合的DNA)。并且，单独的包装荧光DNA的头部的荧光强度柱状图的分析显示，对于单独的部分的头部样品加权的平均强度为大约5,500单位(任意单位(arbitrary units))，而前头部的所述强度为4000单位，暗示所述部分的头部比前头部包装更多的DNA分子(图25)。通过脱色每个点的荧光信号所需的光致褪色步骤的数量来进行进一步定量(图26)。所述数量显示所述部分的头部包括平均每个头部五至六DNA分子，而所述前头部和充满的头部包括每个头部四DNA分子。因此，所述成熟的噬菌体头部，如原衣壳，能够经历多重包装起始。单分子的数据还暗示在部分的头部、充满的头部以及前头部之间存在的包装效率的很大不同，产生在很大部分的充满的头部和前头部中无力起始包装。对于能够起始DNA包装的头部，包装分子的数量在三种头部中仅存在略微的差别。

图19、图20、图21和图22显示出通过单分子荧光检测的包装的量。图19和图21显示分别包装有Cy3(83-bp)和Cy5(39-bp)DNA的固定的T4头部的荧光图像。四分之一的70μm×35μm图像面积在每种情况下显示(参见图23和图24用于全长荧光图像)。图20和22显示柱状图，该柱状图显示了包装有Cy3或Cy5的DNA的头部的数量。在每种情况下平均了超过30个图像中的所述头部的数量显示荧光。

图23显示了包装有Cy5 39-bp DNA的头部的单分子荧光。包装有Cy539-bpDNA的部分的头部、前头部或充满的头部的代表性图像。图像面积是70μm×35μm。孵育时间、激光强度、成像和分析参数对于所有样品都相同。

图24显示了包装有Cy3 83-bp DNA的头部的单分子荧光。包装有Cy3 83-bpDNA的部分的头部、前头部或充满的头部的代表性图像。图像面积是70μm×35μm。孵育时间、激光强度、成像和分析参数对于所有样品都相同。

图25显示了对于包装有Cy3 83-bp DNA的部分的头部以及前头部的单独头部强度。标准化的柱状图显示对于部分的头部以及前头部的单独头部强度。在每种情况下分析来自超过2000荧光颗粒的强度。部分的头部的强度比前头部的强度更亮。大约46％的成像的部分的头部以及只有大约29％的前头部具有高于5,000的强度，暗示所述部分的头部比前头部包装了更多的寡核苷酸分子。

图26显示单个的已包装头部的光致褪色(photobleaching)。典型的光致褪色步骤来自单个固定的已包装的头部，包装有多重Cy5标记的DNA片段。每个步骤对应一个包装的标记DNA。

实施例5

10am13am头部的纯化。所述噬菌体头部，部分的头部和充满的头部二者都分离自感染有10am13am突变体的大肠埃希杆菌P301细胞(E.coli P301 cells)。前头部分离自感染有17am18amrII突变体的大肠杆菌。根据上述的操作纯化前头部和噬菌体头部。简言之，感染的细胞(500-ml培养物)在40ml Pi-Mg缓冲液(26mM Na₂HPO₄、68mM NaCl、22mM KH₂PO₄、1mM MgSO₄(pH 7.5))中裂解，所述缓冲液含有10μg/ml DNA酶I和氯仿(1毫升)，并在37℃下孵育三十分钟以消化DNA。所得裂解物在4,300g下离心10分钟，并且所述上清液在34,500g下离心45分钟。所述上清液重悬在2.5ml的50mM Tris-HCl(pH 7.5)和5mMMgCl₂中，并且再次经历低速和高速离心。所述头部的小球然后重悬在200μl的Tris-Mg缓冲液中并且通过CsCl密度梯度离心纯化。所述头部的带(图2)得到提取且透析过夜对抗10mM Tris-HCl(pH 7.5)50mM NaCl以及5mM MgCl₂。

收集在顶部的所述两条空间上接近的带，并且通过二乙氨基乙基琼脂糖柱层析(DEAE-Sepharose column)进一步纯化(图3)。浓缩所述峰组分并且在4℃下储存。

实施例6

大量体外DNA包装。体外DNA包装检测通过以上描述的操作进行。所述反应混合物含有纯化的前头部、部分的头部或者充满的头部(0.5-1×10¹⁰颗粒)，纯化的全长gp17(1.5μM)的反应混合物以及DNA(300ng的50到766bp的梯状DNA[新英格兰生物实验室(New England Biolabs)]、100ng的Cy3 83-bp DNA、50ng的Cy5 39-bp DNA或600ng的48.5-kb噬菌体λDNA)。所述λDNA使用缓冲液包装，所述缓冲液含有30mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM NaCl、3mMMgCl₂以及1mMATP。所述Cy3和Cy5 DNA使用上面描述的5％PEG缓冲液包装。包装反应通过添加DNA酶I终止，并且所述壳体化的DNA酶I抗性的DNA通过蛋白酶K处理而释放，并且通过琼脂糖凝胶电泳分析。每一实验包括一个至几个阴性对照缺乏以下重要的包装组分之一：头部、gp17、ATP或DNA。包装效率被定义为在包装反应中使用的每一数量的头部颗粒所包装的DNA分子的数量。

实施例7

单分子光镊包装。制备包装复合体，通过将纯化的头部(4×10⁹颗粒)与纯化的1μM全长gp17以及0.44μM 125-bp dsDNA“启动(priming)”DNA(Z.Z.和V.B.R.，未公开数据)混合并且在10-μl由包装缓冲液(50mM Tris-HCl[pH7.6]、100mM NaCl、和5mM MgCl₂)组成的反应体积中存在1mM ATP-y-S。所述混合物在37℃下孵育30分钟。T4噬菌体抗体包被的聚苯乙烯珠(1.5μl)(直径0.79μm，斯菲尔罗泰克(Spherotech))被加入到上述反应混合物，并在37℃下孵育30分钟。

制备所述DNA珠，通过添加PCR扩增10-kbλDNA在一末端生物素化结合至链霉亲和素包被的珠(直径0.86μm，斯菲尔罗泰克(Spherotech))，并在37℃下孵育30分钟。设置双阱光镊，并按照Bustamante等人，“具有示差检测的高分辨度双阱光镊(High resolution dual trap optical tweezerswith differential detection)，”单分子技术实验手册(Single-molecule techniques：a laboratory manual)，Selvin等人，编辑，伍德伯里，纽约(Woodbury，NY)：冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press).297-324(2007)；以及Chemla等人，“病毒DNA包装马达的力产生机制(Mechanism of force generation ofa viral DNA packaging motor)，”细胞(Cell)122：683-692(2005)中所述进行校准。单分子测量在100赫兹(Hz)下，以“力-反馈(force-feedback)”模式进行，其中允许产生包装对抗5皮牛(pN)的持续力。通过将包括1mM ATP的包装缓冲液注入到流动池(flow cell)内，栓系形成且包装得到起始。为了避免反应性单线态氧类型的发生，使用氧清除系统(100μg/ml葡萄糖氧化酶、20μg/ml过氧化氢酶以及4mg/ml葡萄糖)。DNA的伸直长度(contour length)从测量的所述珠之间的力和延伸计算，使用蠕虫状链模型(the worm-like chain model)假设持续长度(persistence length)53nm，拉伸模量(stretch modulus)1,200pN并且每个碱基距离0.34nm。DNA的包装速度测量自0.1秒的滑动窗(sliding window)下的DNA伸直长度的线性拟合在(10个数据点)。

实施例8

已包装头部的单分子荧光。定量不同头部的包装效率的单分子荧光实验在宽视野棱镜型全内反射显微镜下进行，所述显微镜具有532激光(相干激光公司(Coherent))用于Cy3激发或630激光(迈里斯格瑞特公司(Melles Griot))用于Cy5激发。通过电耦合装置相机(iXon DV 887-BI；安道尔公司(Andor Technology))在100毫秒时间分辨率下成像固定的衣壳。正如在Roy等人，“单分子荧光共振能量转移(FRET)实用指南(A practical guide to single-molecule FRET)，”天然方法(Nat.Methods)5：507-16(2008)中所述，用自编C++程序记录和分析所述图像。

为了最小化非特异性的表面结合，清洁的石英载片和玻璃盖片用PEG和3％的生物素化的PEG(Laysan生物(Laysan Bio))表面钝化[43]。在装配通道之后，加入中性亲和素(NeutrAvidin)(赛默飞科技公司(Thermo Scientific))(0.2mg/ml)，然后与生物素化的蛋白G(罗克兰免疫化学有限公司(Rockland Immunochemicals))在室温下孵育(25nM)30分钟。随后，加入T4噬菌体抗体(15nM)并孵育1小时。具有83-bp Cy3和39bp-Cy5 DNA的包装的头部应用于单独的通道并孵育20分钟。包装反应的混合物用DNA酶I(10μg/ml)在室温下处理大约20小时以消化任何未包装的或者未特异性结合Cy3和Cy5的DNA。所述未结合的包装头部被洗掉，并且固定的衣壳在50mM Tris-Cl缓冲液(pH 8)、5％PEG、5mMMgCl₂、1mM亚精胺(spermidine)、1mM腐胺(putrescene)、60mM NaCl以及氧清除系统(0.8％葡萄糖(dextrose)，0.1mg/ml葡萄糖氧化酶、0.02mg/ml过氧化氢酶以及3mM水溶性维生素E(Trolox))中成像，正如在Rasnik等人“作为布朗棘齿的分支迁移酶(Branch migration enzyme as a Brownian ratchet)，”欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.).27：1727-35(2008)中进一步描述。

本发明已经公开有参考的特定实施方式，很多对所述实施方式的修饰、改变和变化可能不偏离本发明的领域和范围，正如后附权利要求中所定义。因此，其意味着本发明并不限于所述的实施方式，但是其具有通过后附权利要求的语言所定义的整个范围及其等价物。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种方法，该方法包括以下步骤：

（a）附着包装马达至载体，以及

（b）转移外源物质进入到所述载体的内隔室以因此形成包装机器。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体是病毒颗粒。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体是噬菌体组成部分。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体是噬菌体的衍生物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体是T4噬菌体的成熟衣壳的壳。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述成熟衣壳的壳是部分的噬菌体头部或充满的噬菌体头部。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述噬菌体的组成部分由包括在噬菌体的颈部和/或尾部蛋白中的突变的核酸来编码。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述噬菌体的组成部分包括在基因10和/或基因13中的突变。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述在基因10中的突变是在色氨酸430残基位置上编码终止子。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述在基因13中的突变是在谷氨酰胺39残基位置上编码终止子。

11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述噬菌体的组成部分还包括一个或多个编码衣壳的壳蛋白的基因的缺失。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，基因是hoc基因和/或soc基因。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述包装马达包括蛋白复合体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述蛋白复合体包括腺苷三磷酸酶活性。

15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述蛋白复合体包括基因产物（gp）17蛋白质的一个或多个亚单位。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述外源物质是核酸。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述核酸是DNA。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述DNA是单链的或者是双链的。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，肽样组分结合到所述载体的外层表面。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述肽样组分是多肽或其片段。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述多肽或其片段是免疫原性的。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体包括脂质体囊。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述包装马达包括蛋白质复合体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述蛋白复合体包括腺苷三磷酸酶活性。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述蛋白复合体包括gp17蛋白质的一个或多个亚单位。

26.根据权利要求22所述的方法，其中，所述外源物质是核酸。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述核酸是DNA。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述DNA是单链的或者是双链的。

29.根据权利要求22所述的方法，其中，所述外源物质是肽样组分。

30.根据权利要求22所述的方法，其中，所述外源物质是多肽或其片段。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述多肽或其片段是免疫原性的。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述多肽或其片段是抗原。

Claims