CN116083467A - 一种减毒沙门菌和噬菌体p22双载体、构建方法及其应用 - Google Patents

一种减毒沙门菌和噬菌体p22双载体、构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116083467A
CN116083467A CN202211302651.7A CN202211302651A CN116083467A CN 116083467 A CN116083467 A CN 116083467A CN 202211302651 A CN202211302651 A CN 202211302651A CN 116083467 A CN116083467 A CN 116083467A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
attenuated salmonella
pya
capsid
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211302651.7A
Other languages
English (en)
Inventor
刘青
孔庆科
张锐
陈瑾
陈信
唐子芸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Weina Biotechnology Co ltd
Southwest University
Original Assignee
Chongqing Weina Biotechnology Co ltd
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Weina Biotechnology Co ltd, Southwest University filed Critical Chongqing Weina Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211302651.7A priority Critical patent/CN116083467A/zh
Publication of CN116083467A publication Critical patent/CN116083467A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)

Abstract

本发明属于纳米药物领域，具体涉及一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体及其应用，本发明的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体的构建方法包括以下步骤：将形成噬菌体P22衣壳的基因通过质粒载体在减毒沙门菌中进行蛋白表达。本发明的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体可以用于递送异源抗原(如本申请中的PspA)，能激发机体产生强烈的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应，具有显著的免疫保护效果。

Description

一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体、构建方法及其应用
技术领域
本发明属于纳米药物领域，具体涉及一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体及其应用。
背景技术
噬菌体P22，属于短尾噬菌体科，基因组为双链DNA。其衣壳是由420个CP组装成的二十面体结构，并需要100～330个SP辅助。研究发现，CP和SP异源性表达后，可以组装成直径约50nm的笼状颗粒结构。与化学合成的纳米材料相比，这种蛋白笼结构的纳米材料具有更显著的优势，它们可以通过生物表达系统快速进行大批量生产，其蛋白组成完全清晰、固定。P22衣壳的形成只需要基因5和基因8两种基因的参与，可在内部和外部携带抗原，自组装后的抗原呈多价显示，更有利于诱导B细胞聚集，促进B细胞转化成熟，刺激更强的免疫应答。除此之外，与传统的基于基因工程的病毒载体相比，基于蛋白质的纳米颗粒不含遗传物质，具有更高的安全性。
以噬菌体P22衣壳为纳米容器，递送抗原蛋白，可适用于针对快速出现的病原体疫苗的生产。Dustin等将流感病毒的NP封装进噬菌体P22衣壳的内部，生产针对流感的疫苗。结果发现，该疫苗对100倍致死剂量的流感病毒提供多重保护。Benjamin等将RSV的基质蛋白(M)和基质蛋白2(M2)封装进P22衣壳中，在小鼠鼻内给药后，颗粒刺激CD8+T细胞对两种抗原的记忆反应。此外，疫苗接种引发T细胞群在组织中浸润。随后进行RSV的攻毒，P22-M/M2处理的小鼠的肺病毒滴度显著降低。这表明P22衣壳在引导针对多种包膜病毒抗原的免疫反应中的效用，证明该技术在促进同时针对多个靶标的免疫方面具有一定潜力。Li等将卵清蛋白(OVA)的B、T表位肽作为模型抗原，分别与P22衣壳蛋白的C端融合，使其展示在衣壳表面，形成P22-OVAB纳米颗粒和P22-OVAT纳米颗粒疫苗。P22-OVAB纳米颗粒可诱导小鼠产生针对肽抗原的高效价抗体，P22-OVAT纳米颗粒能诱导高效的抗原交叉递呈反应，并激活T表位特异性CTL免疫反应。在肿瘤模型中，免疫后的小鼠的肿瘤增长速度明显减缓。
以Dec作为媒介将病原性抗原连接P22衣壳外部的研究较少。Benjamin等尝试使用来自噬菌体L的三聚体修饰蛋白(Dec)作为P22噬菌体展示复杂蛋白的工具。为了检测Dec表达大多聚体蛋白的可能性，他们从小鼠胸腺cDNA源克隆了鼠CD40L(112～260AA)的148个AA可溶区，并与Dec蛋白的C末端融合形成Dec-CD40L融合构建体。结果发现以Dec作为展示工具，P22递送的CD40L能够正确进行蛋白折叠，对B淋巴细胞具有很高的亲和力。
沙门菌是一种兼性胞内寄生菌，能引起黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答，易于接种，是递送重组蛋白疫苗的一种理想载体。减毒沙门菌作为载体递呈外源性抗原具有的优点有：①减毒沙门菌既可携带原核表达质粒也可携带真核表达质粒；②减毒沙门菌可入侵至淋巴系统，运送抗原效率高，能更有效地激发体液免疫和细胞免疫；③接种简便，通过自然感染途径(如口服或滴鼻)，即可激发黏膜免疫反应，阻止病原在黏膜表面定居和繁殖；④减毒沙门菌具有免疫佐剂作用。近年来研究最多的是沙门菌LPS，LPS的刺激可以增强DC捕获和加工MHC I类抗原的能力，有利于将重组沙门菌表达的抗原快速呈递给B、T细胞；⑤免疫具有持续性和多联性，减毒沙门菌作为载体侵入宿主体内后，在一段时间内有限增殖，其表达的异源蛋白可对宿主产生持续刺激，可长期激发机体产生免疫反应。并且可以将多种抗原克隆到同一个质粒上进行表达，进行联合免疫。⑥重组减毒沙门菌疫苗制备简单，易于储存和运输，且不需要纯化抗原，因此疫苗的成本相对较低。
减毒沙门菌作为活菌载体表达布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12，具有高度免疫原性，Amal等将L7/L12连接bla信号肽，克隆到Ptrc启动子的质粒上转入减毒沙门菌中表达抗原，构建疫苗株。在动物单次免疫后发现，疫苗株成功激发了布鲁氏菌抗原特异性体液和细胞免疫反应，攻毒后，小鼠脾脏、肝脏等组织中布鲁氏菌的定殖显著减少，使被免疫小鼠免受布鲁氏菌的侵染。减毒沙门菌在细菌类传染病的预防中起到很显著的作用，Pei等将使用减毒沙门菌递送病毒性抗原发现，也同样能产生显著的保护效果。spiR基因是沙门菌SPI-2基因表达的必须基因，该研究将SL7207基础上将spiR基因缺失，构建新的减毒沙门菌SL368，用于高致病性H5N1流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的表达和递送。结果表明，以减毒沙门菌为基础的口服疫苗在小鼠中诱导了大量HA特异性IgG、IgA以及IFN-γ的产生，小鼠产生了显著的抗H5N1免疫保护效果，对H1N1也产生了较好的交叉免疫保护效果。类似的一系列研究为使用减毒沙门菌作为载体研制口服活疫苗提供了设计思路和应用价值。
肺炎链球菌(S.pneumoniae)是一种条件性致病的胞外菌，革兰阳性球菌，兼性厌氧，主要通过飞沫传播并定殖于人上呼吸道器官的黏膜表面。1881年，G.M.Sternberg和Louis Pasteu在肺炎病人的痰液中分离获得。PspA是与肺炎球菌表面脂磷壁酸中的胆碱残基和细胞壁磷壁酸产生非共价结合的表面蛋白，能与抗体作用。PspA在各种血清型的肺炎链球菌细胞壁表面均存在，是肺炎链球菌毒性所必需的。它能与先天免疫分子乳铁蛋白结合，从而增强肺炎链球菌在机体的毒性。还可以抑制补体在细菌表面的沉积，促进细菌在机体内的繁殖。该蛋白的N端卷曲区域在小鼠体内可引发抗体介导的保护性免疫反应，使小鼠免受肺炎链球菌的感染。已经有研究证明，肺炎链球菌无论是在机体的鼻咽部定殖，还是侵袭性感染，PspA激发机体的免疫保护效果十分明显，是蛋白免疫类疫苗的较优选择。PspA也多被用来作为模式抗原进行新型疫苗载体的评估，如基于体内调控细菌Ⅵ型分泌蛋白的减毒沙门氏菌裂解系统的评估；双质粒系统在减毒沙门菌中递送异源性抗原的评估；使用沙门菌OMVs递送异源性抗原的评估等。
随着重组减毒沙门菌疫苗(RASV)的研究越来越深入，减毒沙门菌在机体内的附着机制愈加清楚，当其穿越机体屏障进入肠道组织后，能够进行有限的复制并侵入淋巴组织，诱发机体产生强烈且持续的免疫反应。RASV已经发展成为了一种高效递送异源性抗原的平台，能刺激机体产生较强的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应。噬菌体P22衣壳的内部和外部均具有一定的异源抗原装载能力，装载后形成的衣壳颗粒为纳米级别，形态均一，能同时装载多个抗原分子，能够诱发机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫。本发明将P22衣壳相关基因克隆到质粒载体中，转入到减毒沙门菌中进行衣壳结构的组装。分别借助SP141-303或Dec将肺炎链球菌的PspA抗原装载在衣壳的内部或外部，通过体内体外试验评估以噬菌体P22衣壳为抗原载体的减毒沙门活疫苗的免疫效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体、构建方法及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：将形成噬菌体P22衣壳的基因通过质粒载体在减毒沙门菌中进行蛋白表达。
进一步的，所述噬菌体P22衣壳的基因包括：基因5和基因8。
进一步的，所述减毒沙门菌包括减毒沙门菌χ9241。
本发明还提供一种上述的构建方法构建得到的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体。
本发明还提供一种上述的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体在递送异源抗原的应用。
进一步的，所述减毒沙门菌和噬菌体P22双载体递送异源抗原的方法包括：将所述异源抗原的基因装载在噬菌体P22衣壳的基因上，再通过质粒载体在减毒沙门菌中进行蛋白表达。
进一步的，将所述异源抗原的基因装载在噬菌体P22衣壳的基因上的方法包括：将所述异源抗原通过柔性短肽与噬菌体P22的SP141-303的N端融合，与CP在减毒沙门菌中共同表达；或将所述异源抗原与噬菌体P22的Dec的C端融合，与CP、SP141-303在减毒沙门菌中共同表达。
进一步的，所述异源抗原包括：PspA。PspA是与肺炎球菌表面脂磷壁酸中的胆碱残基和细胞壁磷壁酸产生非共价结合的表面蛋白，能与抗体作用。
本发明的有益效果是：
1.噬菌体P22衣壳通过高拷贝质粒载体能够在减毒沙门菌χ9241中高效组装形成纳米颗粒。
2.在减毒沙门菌χ9241中，噬菌体P22衣壳的内部和外部均具有携带蛋白的能力。
3.噬菌体P22衣壳内部封装模式抗原PspA，通过减毒沙门菌χ9241递送到小鼠体内，能激发机体产生强烈的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应，具有显著的免疫保护效果。
附图说明
图1为合成P22衣壳的质粒构建模型图；
图2粒度分析仪测定的P22衣壳的粒径；
图3为噬菌体P22衣壳电镜照片；
图4为P22衣壳封装荧光蛋白的表达质粒的构建模型图；
图5为P22衣壳-superGFP的电镜照片；
图6P22衣壳外部展示荧光蛋白的表达质粒的构建模型图；
图7为外部展示mCherry荧光蛋白的P22衣壳的粒径；
图8为外部展示荧光蛋白mCherry的P22衣壳的电镜照片；
图9为ELISA检测小鼠体内抗体水平；图中，A：小鼠阴道分泌物中anti-PspA IgA抗体浓度；B：小鼠血清中anti-PspA IgG抗体浓度；C：小鼠血清中anti-PspA IgG1抗体浓度；D：小鼠血清中anti-PspA IgG2a抗体浓度。数据分别从两个独立试验中总结(n＝8)；One-way ANOVA；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图10为野生型强毒株攻毒后的免疫保护实验。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
一、实验条件
本发明所用到的菌株和质粒如下表：
本发明使用的引物如下表：
本发明使用的试剂：
胰蛋白胨、NaCl、酵母提取物、琼脂粉来自英国Oxoid公司，无菌脱纤维羊血来自广州鸿泉生物科技有限公司，Tris、甘氨酸、SDS、阿拉伯糖、卡那霉素、蔗糖、阿拉伯糖、EDTA、NaOH、APS、TEMED、β-巯基乙醇、溴酚蓝、甘油、冰醋酸、无水乙醇、甲醇、BSA、异丙醇来自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA MakerⅢ、细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒来自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTAR Max DNAPolymerase来自Takara宝生物工程(大连)有限公司，BlasTaq 2×PCR MasterMix来自镇江爱必梦生物科技有限公司，DAP、PNPP、Gelatin来自Sigma，DNaseI、RNaseA来自NEB(北京)有限公司，HCl、氯仿来自重庆川东化工(集团)有限公司，Na2HPO4-12H2O、NaH2PO4、KH2PO4、KCl、吐温20来自成都市科龙化工试剂厂，酚(pH＝8.0)、酚-氯仿-异丙醇(25∶24∶1)来自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，鼠抗His tag单克隆抗体来自Bioworld生物科技有限公司，30％聚丙烯酰胺、1mol/L Tris-HCl(pH＝8.8)、1mol/L Tris-HCl(pH＝6.8)、ECL化学发光显色液、考马斯亮蓝来自Biosharp，彩虹245广谱蛋白Marker、BCA蛋白浓度测定试剂盒来自上海雅酶生物科技有限公司，PVDF膜来自美国Millipore公司，HRP标记山羊抗鼠/兔IgG(H+L)来自北京博奥森生物技术有限公司，Todd-Hewitt肉汤来自山东拓普生物工程有限公司，TEMED来自湖北佰智昂生物化工有限公司，ELISA检测相关抗体和标准品来自SouthernBiotech，OptiPrepTM来自Axis-shield公司
本发明使用的培养基、溶液：
LB培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g
固体LB培养基：按LB培养基配方称取试剂，加入15g琼脂粉，加入ddH2O溶解后，再加入ddH2O定容至1000mL，调节pH值至7.4。121℃下灭菌15min后，冷却至约55℃，倒于无菌平板。
液体LB培养基：按LB培养基配方称取试剂，溶于ddH2O后，再加入ddH2O定容至1000mL，调节pH值至7.4。121℃下灭菌15min，常温保存。
SOC培养基的配制：酵母提取物0.5g、胰蛋白胨2g、NaCl 0.0585g、MgSO4 0.246g、MgCl2 0.203g、KCl 0.0186g,称取各试剂，溶于ddH2O，定容至250mL，高压蒸汽灭菌(121℃，15min)，后加入过滤除菌后终浓度为20mmol/L的葡萄糖，4℃保存备用。
DAP溶液的配制：称取1g的DAP试剂溶于100mLddH2O中，使用0.2μm滤膜除菌后，-20℃保存备用。
SDS-PAGE电泳相关试剂、缓冲液的配制：a.5×SDS-PAGE上样缓冲液：1mol/LTris-HCl(pH＝6.8)2.0mL，SDS0.8g，β-巯基乙醇2.0mL，溴酚蓝40mg，甘油4.0mL，加入ddH2O溶解，然后定容至20mL，4℃保存。
b.5×Tris-Glycine buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)：Tris15.1 g，Glycine94 g，SDS5 g，加入ddH2O溶解，然后定容至1000mL，室温保存。
c.10％(W/V)SDS：称取10gSDS，溶于100mLddH2O中，常温储存。
d.10％(W/V)APS：称取10gAPS，溶于100mLddH2O中，4℃储存。
SDS-PAGE凝胶的配制(以一块胶的量为例)
SDS-PAGE胶
按上述配方先配制分离胶，快速将其加入到玻璃固定槽中，再加入无水乙醇压平液面，待凝固后倒掉无水乙醇，再加满5％浓缩胶，插入梳子，凝固后再进行使用。
考马斯亮蓝染色液的配制：考马斯亮蓝1g，异丙醇250mL，冰乙酸100mL，ddH2O定容至1000mL。
考马斯亮蓝脱色液的配制：按比例冰乙酸∶乙醇∶ddH2O＝1∶2∶3进行配制，室温保存备用。
PBS的配制：NaCl 8g、KCl 0.2g、NaH2PO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.24g，取相应的试剂，加入至800mLddH2O中使其完全溶解，定容至1L，调节pH值至7.4。
PBS-T的配制：按上述配方先配制1000mLPBS溶液，按0.05％比例加入吐温20，混匀，4℃保存备用。
电转缓冲液的配制：Tris 242g，冰醋酸57.1mL，0.5mol/L Na2EDTA·2H2O(pH＝8.0)100mL，ddH2O定容至1000mL。
琼脂糖凝胶：称取琼脂糖1.0g，加入100mL 0.5×TAE电泳缓冲液，加热溶解后加入5μL GoldView核酸染色剂，混匀后倒入制胶板配制成1％的琼脂糖凝胶。
50mmol/L磷酸盐缓冲液(100mmol/L NaCl)(100mL)：称取Na2HPO4 1.56g，NaH2PO4·12H2O0.1g，NaCl 0.585g，加入适量ddH2O使其完全溶解后，定容至100mL，调pH值至7.6。
50mmol/L磷酸盐缓冲液(25mmol/LNaCl)(100mL)：称取Na2HPO4 1.1g，NaH2PO4·12H2O0.3 g，NaCl0.15 g，加入适量ddH2O使其完全溶解后，定容至100mL，调pH值至7.0。
THB-Y培养基的配制：THB 15g，酵母提取物25g，加少量ddH2O溶解，再定容至500mL。121℃高压灭菌15min。常温储存备用。
血平板的配制：称取脑心浸液琼脂培养基26g，加入ddH2O至500mL，121℃高压灭菌15min，冷却至约40℃，以5％的比例加入25mL的绵羊血，混匀后倒入无菌培养板中。
PBS-G溶液的配制(500mL)：向500mLPBS缓冲液中加入0.05gGelatin，121℃灭菌15min，常温保存。
镍柱纯化蛋白相关缓冲液的配制：Binding buffer的配制NaCl 29.22g，NaH2PO4·12H2O3.12g，Na2HPO4 7.16g，加入适量ddH2O将上述试剂充分溶解，再加ddH2O定容至1000mL，调节pH值至7.4，放4℃保存备用。
Washing bufferⅠ的配制：NaCl 29.22g，NaH2PO4·12H2O 3.12g，Na2HPO4 7.16g，咪唑1.70g，加入适量ddH2O将上述试剂充分溶解，再加ddH2O定容至1000mL，调节pH值至7.4，放4℃保存备用。
Washing bufferⅡ的配制：NaCl 29.22g，NaH2PO4·12H2O 3.12g，Na2HPO4 7.16g，咪唑3.40g，加入适量ddH2O将上述试剂充分溶解，再加ddH2O定容至1000mL，调节pH值至7.4，放4℃保存备用。
Washing bufferⅢ的配制：NaCl 29.22g，NaH2PO4·12H2O 3.12g，Na2HPO4 7.16g，咪唑6.80g，加入适量ddH2O将上述试剂充分溶解，再加ddH2O定容至1000mL，调节pH值至7.4，放4℃保存备用。
Washing bufferⅣ的配制：NaCl 29.22g，NaH2PO4·12H2O 3.12g，Na2HPO4 7.16g，咪唑17.0g，加入适量ddH2O将上述试剂充分溶解，再加ddH2O定容至1000mL，调节pH值至7.4，放4℃保存备用。
Washing bufferⅤ的配制：NaCl 29.22g，NaH2PO4·12H2O 3.12g，Na2HPO4 7.16g，咪唑34.0g，加入适量ddH2O将上述试剂充分溶解，再加ddH2O定容至1000mL，调节pH值至7.4，放4℃保存备用。
TBS-T的配制：Tris 6.05g，NaCl 9.00g，吐温20 500μL加入适量ddH2O将上述试剂充分溶解，再加ddH2O定容至1000mL，调节pH值至7.4，4℃保存备用。
包被液(碳酸盐缓冲液)：Na2CO3 0.75g，NaHCO3 1.46g，加入适量ddH2O将上述试剂充分溶解，再加ddH2O定容至500mL，调节pH值至9.6，室温保存备用。
实验动物：7周龄雌性BALB/c小鼠60只。
二、噬菌体P22衣壳在沙门菌中的组装
2.1合成P22衣壳的质粒构建
本发明选用三种载体对P22衣壳的组装蛋白进行表达，载体均由Ptrc启动子，asd，复制子及终止子组成，低拷贝质粒载体(pYA3337)的复制子为pSC101，中拷贝质粒载体(pYA3332)的复制子为p15Aori，高拷贝质粒载体(pYA3342)的复制子为pBRori(如图1)。Ptrc启动子在沙门菌中转录活性不受影响，可以组成型表达蛋白。表达出的P22衣壳可以借鉴病毒纯化方式利用密度梯度离心进行纯化。
(1)噬菌体P22基因组的提取
a.从-80℃将UK-1菌株取出，取少量菌划线在LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑单克隆接种在5mLLB液体培养基中，37℃，180r/min摇菌至OD≈0.5，1∶1000加入噬菌体P22，待菌液澄清后加入1mL氯仿摇菌30min，使细菌未裂解的细胞全部裂解，得到噬菌体悬液。将溶液在4℃，5000r/min离心15min，除去细菌碎片，将上清液经0.22μm滤膜除菌，转移至无菌的离心管中。
b.加入DNase I和RNase A(1μg/mL)清除宿主菌残留的核酸，37℃静置作用1h。
c.加入0.5mol/L的EDTA(0.02mol/L)，37℃孵育20min。
d.冷却至室温，加入蛋白酶K(50μg/mL)，SDS(0.5％)，翻转数次混匀，56℃孵育2h。
e.冷却至室温，加入等体积苯酚(pH＝8.0)，抽提，5000r/min离心10min，收集上清。
f.加入等体积的苯酚-氯仿-异丙醇(25∶24∶1)，混匀，12000r/min离心10min，收集水相。
g.加入等体积的氯仿再抽提一次亲水相。
h.回收水相，加入3mol/L醋酸钠(pH＝5.2)至终浓度为0.3mol/L。再加入2倍体积无水乙醇沉淀核酸，混匀，-40℃冷冻1h。
i.4℃，12000g离心10min，去上清。
j.取1mL75％乙醇洗涤1次，4℃，12000g离心15min，室温晾干，加入50μLddH2O溶解，-20℃保存。
(2)质粒的提取
将保存有质粒pYA3332、pYA3337、pYA3342的大肠杆菌从菌种库复苏，过夜摇菌培养，使用质粒抽提试剂盒提出质粒，做扩增载体的模板，-20℃保存。
(3)目的片段及载体片段的扩增
PCR所需的引物、模板以及扩增产物如表PCR所需引物、模板及PCR产物所示，PCR反应体系及反应程序如表PCR反应体系(50μL)和表PCR反应程序所示。
PCR所需引物、模板及PCR产物
PCR反应体系(50μL)
PCR反应程序
上述PCR产物经电泳鉴定和预期大小一致后，使用胶回收试剂盒对目的片段进行纯化回收。回收产物使用核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，并保存至-20℃。
(4)环式PCR法连接目的片段与载体片段
将目的片段与载体片段以摩尔比1∶1～2∶1比例混合于PCR管，反应体系与程序如表环式PCR反应体系(20μL)、环式PCR反应程序所示。
环式PCR反应体系(20μL)
环式PCR反应程序
(5)电转感受态细胞的制备
a.将χ6097菌株从-80℃菌种库取出，接种到LB(加DAP)平板上复苏，挑取单克隆接种于5mL液体LB(加DAP)中过夜培养。
b.按照1∶50的比例接种到300mL新鲜的液体LB(加DAP)中，恒温摇床中震荡培养(37℃，180r/min)至OD600≈0.8，放到4℃静置预冷。
c.将灭菌ddH2O、灭菌的10％甘油水放于冰上静置30min。
d.将菌液分装在50mL离心管中。
e.将离心管置于预冷到4℃的离心机中，5000r/min离心10min，弃去上清后用40mL预冷的灭菌ddH2O重悬菌体，5000r/min离心10min。
f.弃上清，再用40mL预冷的10％无菌甘油重悬菌体，5000r/min离心10min。
g.弃上清，加入预冷的10％无菌甘油重悬菌体，将所有菌体收集至一只离心管中，5000r/min离心10min。
h.离心后，弃去上清，加入1mL预冷的10％无菌甘油重悬菌体，然后分装于0.5mL无菌离心管(每管70μL)，保存于-80℃冰箱备用。
(6)连接产物的电击转化
a.将感受态细胞和连接产物置于冰上解冻。
b.吸取2μL连接产物加入70μL感受态细胞中，吹吸混匀。同时设置对照组，吸取2μL无菌水加入50μL感受态细胞中。
c.将混匀好的感受态细胞加入预冷的电击杯中，将电击杯轻敲桌面，使液面平齐赶出气泡。
d.电转仪程序设定为2.5kv，脉冲5ms电击。
e.电击完成后迅速取出电击杯，并加入200μL无菌的42℃预热的SOC培养基，吹吸混匀后，吸取100μL菌液涂布于LB固体培养基平板上，倒置放于37℃培养箱过夜培养。
(7)转化子的鉴定
次日，在平板上的一定的区域内用无菌牙签挑取8个单菌落，使用引物Ptrc-F/T1T2-R进行菌落PCR鉴定，并同时划线扩大培养该单菌落。菌落PCR反应体系见表菌落PCR反应体系(10μL)，菌落PCR反应程序见表菌落PCR反应程序。
菌落PCR反应体系(10μL)
菌落PCR反应程序
PCR产物经电泳鉴定后，将符合预期大小的阳性克隆进行保存，并抽提阳性克隆质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序比对，测序引物为Ptrc-F和T1T2-R。将构建成功的质粒分别命名为：“pYA3337-P22”、“pYA3332-P22”、“pYA3342-P22”。
(8)质粒的转化
将上述测序正确的质粒电转入χ9241中，操作同步骤(6)。
2.2P22衣壳亚基在减毒沙门菌χ9241中的表达
SP141-303和CP受到Ptrc启动子的调控，而Ptrc会受到χ9241菌株中araCpBADlacI模块的调控，Ptrc启动子在不加入阿拉伯糖的LB培养基中能够正常转录并表达SP141-303和CP。
(1)SDS-PAGE凝胶电泳
处理样品：分别将菌株χ9241(pYA3337-P22)，χ9241(pYA3332-P22)，χ9241(pYA3342-P22)接种到LB液体培养基，菌株χ9241(阴性对照)接种到LB液体培养基(加DAP)中过夜培养。各取1mL过夜培养的菌液，12000r/min离心1min，弃去上清，向菌体中加入100μL1×SDS-PAGE上样缓冲液重悬菌体后，100℃金属浴15min。放置常温后，12000r/min离心10min。
安装电泳设备，加入电泳缓冲液，依次向凝胶的梳孔中加入5μL蛋白预染Marker及10μL处理后的样品的上清液。先80V电泳30min，再120V电泳至上样缓冲液到达凝胶底部，停止电泳。
(2)考马斯亮蓝染色
电泳完成后取出凝胶，去除浓缩胶，保留分离胶。倒入考马斯亮蓝染液没过胶，过夜染色。再使用脱色液脱色至凝胶上蛋白条带清晰，背景干净透明。
(3)Westernblot实验步骤
a.SDS-PAGE电泳完成后取出凝胶，去除浓缩胶，保留分离胶。将胶放入4℃预冷的电转缓冲液中。将大小合适的PVDF膜先用甲醇激活15s，再将膜、海绵、双层滤纸以及凝胶分别浸泡于电转缓冲液中。
b.按照正极(白色)/海绵/滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸/海绵/负极(黑色)的顺序固定“三明治”夹子。
c.将固定好的“三明治”夹子放入电泳槽中，加电转缓冲液没过夹子，然后将电泳槽放于冰水混合物中，100V电转100min。
d.转膜结束后，将PVDF膜取出，放入配好的5％脱脂牛奶封闭液中，孵育2h。
e.倒掉封闭液，用PBS-T将膜清洗5～10min。加入PBS-T稀释的一抗(His鼠源单抗1∶8000稀释)，室温孵育2h或者4℃过夜孵育，孵育结束后，PBS-T洗涤3次，每次5～10min。
f.加入PBS-T稀释的酶标二抗(HRP标记山羊抗鼠IgG酶标二抗1∶20000稀释)。室温孵育1h。孵育结束后，用PBS-T洗涤3次，每次5～10min。
g.将ECL化学发光显色液A液和B液1∶1混匀，均匀滴加到PVDF膜正面，在化学发光成像仪观察结果。
Western blot结果显示，His抗体能够和菌株χ9241(pYA3337-P22)、χ9241(pYA3332-P22)以及χ9241(pYA3342-P22)的蛋白进行特异性结合，这表明菌株χ9241(pYA3337-P22)、χ9241(pYA3332-P22)以及χ9241(pYA3342-P22)菌株都能够正确表达CP。但菌株χ9241(pYA3342-P22)的表达效果最好。
2.3衣壳的纯化及验证
(1)P22衣壳的纯化
a.分别将菌株χ9241(pYA3332-P22)、χ9241(pYA3337-P22)、χ9241(pYA3342-P22)从菌种库复苏，挑单克隆接种到5mLLB液体培养基中，37℃，180r/min过夜培养。将菌液1:50接种至100mLLB培养基中扩大培养，37℃，180r/min培养至约OD600≈1.0。
b.将菌液分装至50mL离心管，4℃，3700r/min，离心15min。弃掉上清，加入5mL磷酸盐缓冲液(100mmol/L NaCl)重悬菌体，-20℃冷冻过夜。
c.室温解冻菌液，加入溶菌酶和RNase A，冰上孵育30min。使用超声破碎仪将菌液破碎至澄清透亮状态。
d.4℃，12000r/min离心45min，弃去沉淀。
e.重复步骤d。
f.将得到的上清液与35％蔗糖(W/V)缓冲液以3∶1的体积比加入离心管，48000r/min，离心50min。
g.弃上清，使用磷酸盐缓冲液(25mmol/L NaCl)将沉淀重悬。
h.将得到的重悬液放入离心机，17000g离心20min，弃去沉淀，保留上清液。
i.将不同浓度的碘克沙醇溶液(10％、20％、30％、40％)由低到高分别向离心管中加入800μL，形成密度梯度，缓慢将上清液加在最上层。40000r/min离心6h。
j.将形成蛋白条带吸出，处理样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色验证蛋白条带。
k.将确定的蛋白溶液放入磷酸盐缓冲液，4℃过夜透析，然后吸出，-20℃保存。
透析后的蛋白液纯度较高，该蛋白结构由两部分组成，大小分别为47.6kDa和20kDa，与CP和SP141-303的理论预估值相符。由此可以得出结论，菌χ9241(pYA3332-P22)和χ9241(pYA3337-P22)中的P22衣壳组装量较少，χ9241(pYA3342-P22)中的P22衣壳组装量较多。
(2)粒径的测定
将纯化的P22衣壳溶液使用PBS缓冲液103倍稀释后，取1mL放入Zetasizer Nano粒度分析仪中测量粒径大小。
如图2所示，该溶液中衣壳的大小均一，粒径大小为50nm。
(3)形态结构的观察
将纯化后的P22衣壳送至科学指南针公司(成都)进行TEM高分辨成像分析。
具体步骤：
电镜标本的制备：将镀碳支持膜铜网放在封口膜上，取10μL纯化的蛋白样品滴在支持膜上，沉淀10min，用带尖的滤纸从边缘部分吸去多余的液体，再滴一滴醋酸双氧铀染液，染色90s，用带尖的滤纸从边缘部分吸去多余的染液，将支持膜放在滤纸上干燥3h后，在TEM下观察并拍照。
TEM观察发现，有颗粒结构形成，且大小形态均一，直径约为50nm(图3)。由此可以看出，将SP141-303和CP对应基因序列连接在pYA3342质粒载体上，在减毒沙门菌χ9241能正确表达，且能组装形成衣壳颗粒。
噬菌体P22衣壳的形成与基因8和基因5有关，基因8编码的SP只有少部分是P22衣壳形成所必须的。研究表明，SP的第141至303个AA，对P22衣壳的形成起着决定性作用。现已有研究是将表达噬菌体P22衣壳相关蛋白的质粒转入大肠杆菌中，通过IPTG低温诱导，使其表达组装形成大量的衣壳颗粒，然后纯化衣壳作为后续研究。本研究将编码SP141-303的部分基因8和基因5连接在低拷贝(pYA3337)、中拷贝(pYA3332)和高拷贝(pYA3342)的三种质粒载体上，转入减毒沙门菌发现，在减毒沙门菌χ9241中P22衣壳相关蛋白都能正确表达，且能自组装形成衣壳结构，其中菌株χ9241(pYA3342-P22)的表达组装量最多。这是由于菌株χ9241(pYA3342-P22)具有高拷贝的复制子，能大量表达CP和SP141-303。这也反映出CP和SP141-303在减毒沙门菌中具有自组装能力，且效率较高。后续试验将在高拷贝质粒pYA3342-P22的基础上展开研究。
三、噬菌体P22衣壳装载异源报告蛋白的研究
3.1合成内部装载荧光蛋白P22衣壳的质粒构建
P22衣壳的形成过程中，SP141-303会进入衣壳内部，起到重要的辅助作用。若将一个蛋白或多肽结构与SP141-303的N端融合表达，理论上该结构会随SP141-303一同进入衣壳的内部，且不影响衣壳结构的组装。在SP141-303的N端通过柔性连接短肽(thrombin site，序列为ctggtgccgcgcggcagc)分别和荧光蛋白superGFP、mCherry连接。
(1)质粒的提取
分别将保存有质粒KX011467(superGFP)、4088-mCherry的大肠杆菌从菌种库复苏，挑取单克隆接种5mL LB液体培养基中过夜培养，使用质粒抽提试剂盒提取质粒，做目的片段扩增模板，-20℃保存。
(2)目的片段及载体片段的扩增
PCR所需的引物、模板以及扩增产物见表PCR所需引物、模板及PCR产物。
PCR所需引物、模板及PCR产物
PCR产物经电泳鉴定和预期大小一致后，使用胶回收试剂盒对目的片段进行纯化回收。回收产物使用核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，并保存至-20℃。
(3)环式PCR连接目的片段与载体片段
将目的片段与载体片段以摩尔比1∶1～2∶1比例混合于PCR管。
(4)连接产物的转化
将得到的连接产物同第3章3.2.1步骤电转化入χ6097感受态细胞中。
(5)转化子的鉴定
次日，在平板上的一定的区域内用无菌牙签挑取8个单菌落，使用鉴定引物3342-Ptrc-F/8-J-R进行菌落PCR鉴定，并同时划线扩大培养单菌落。
PCR产物经电泳鉴定后，将符合预期大小的阳性克隆进行保存，并抽提阳性克隆质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将阳性克隆中的质粒提出，测序比对无误，将测序正确的质粒分别命名为“pYA3342-P22-superGFP”、“pYA3342-P22-mCherry”。
(6)质粒的转化
将上述测序正确的质粒电转入χ9241感受态细胞中。
3.2内部携带荧光蛋白的P22衣壳在减毒沙门菌χ9241中的组装和纯化验证
分别复苏菌χ9241(pYA3342-P22-superGFP)、χ9241(pYA3342-P22-mCherry)、χ9241(pYA3342-P22)、χ9241，挑取单克隆菌落到5mL液体培养基中，37℃，180r/min过夜培养。处理样品后进行SDS-PAGE凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色和Western blot验证蛋白的表达情况。再分别纯化及验证内部携带荧光蛋白superGFP、mCherry的P22衣壳。
考马斯亮蓝染色结果表明与对照χ9241(pYA3342-P22)和χ9241相比，χ9241(pYA3342-P22-mCherry)成功表达大小为47.4kDa的SP141-303-mCherry和大小为47.6kDa的CP；χ9241(pYA3342-P22-superGFP)成功表达大小为46.3kDa的SP141-303-superGFP和大小为47.6kDa的CP。
菌χ9241(pYA3342-P22-superGFP)和χ9241(pYA3342-P22-mCherry)破碎离心后的上清液显示出鲜艳的荧光绿色和荧光红色，判定蛋白的正确表达。
取少量纯化的P22-superGFP衣壳，处理后经TEM观察发现，有颗粒结构形成，且大小形态均一，直径约为50nm(5)。
3.3合成外部展示荧光蛋白的P22衣壳的质粒构建
噬菌体P22衣壳外部缺乏源于自身的天然修饰蛋白，经研究发现，噬箘体L与噬菌体P22结构高度相似，其衣壳外部的三聚体修饰蛋白(Dec)的N端区域能与P22衣壳发生高度亲和性结合。关于Dec融合外源蛋白展示在P22衣壳表面的研究较少，本章研究将荧光蛋白mCherry融合在Dec的C端，与CP、SP141-303共同表达，从而验证P22衣壳通过Dec展示异源蛋白的能力。
(1)目的片段及载体片段的扩增
PCR所需的引物、模板以及扩增产物见表PCR所需引物、模板及PCR产物。
PCR所需引物、模板及PCR产物
将PCR产物经电泳鉴定和预期大小一致后，使用胶回收试剂盒对目的片段进行纯化回收。回收产物使用核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，并保存至-20℃。
(2)环式PCR连接目的片段与载体片段
将目的片段与载体片段以摩尔比1∶1～2∶1比例混合于PCR管，反应体系与程序如表环式PCR反应体系(20μL)、环式PCR反应程序所示。
环式PCR反应体系(20μL)
环式PCR反应程序
(3)连接产物的转化
将得到的连接产物进行电转化。
(4)转化子的鉴定
次日，在平板上的一定的区域内用无菌牙签挑取8个单菌落，使用鉴定引物3342-Ptrc-F/8-J-R进行菌落PCR鉴定，并同时划线扩大培养单菌落。
PCR产物经电泳鉴定后，将符合预期大小的阳性克隆进行保存，并抽提阳性克隆质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序比对，测序引物为3342-Ptrc-F和8-J-R。将阳性克隆中的质粒提出，测序比对无误，将该质粒命名为：“pYA3342-Dec-mCherry-P22”。
(5)质粒的转化
将上述测序正确的质粒电转入χ9241中。
3.4外部展示荧光蛋白的P22衣壳在减毒沙门菌χ9241中的装载与纯化验证
分别复苏菌χ9241(pYA3342-Dec-mCherry-P22)、χ9241(pYA3342-P22)、χ9241，挑单克隆到5mL培养基中，37℃，180r/min过夜培养。处理样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色和Western blot验证蛋白的表达情况。
经SDS-PAGE凝胶电泳，与对照菌χ9241(pYA3342-P22)和χ9241相比，菌χ9241(pYA3342-Dec-mCherry-P22)成功表达了蛋白大小为41.6kDa的Dec-mCherry、大小为47.6kDa的CP和大小为20kDa的SP141-303。
将χ9241(pYA3342-Dec-mCherry-P22)破碎离心后，上清液荧光红色，判定蛋白的正确表达。
将纯化的P22-Dec-mCherry衣壳进行粒径的测定，如图7所示，测得结果为68.1nm
取少量纯化的P22-Dec-mCherry衣壳，处理后经透射电镜观察发现，有颗粒结构形成，且大小形态均一，直径约为68nm(图8)。
四、减毒沙门菌递送基于噬菌体P22衣壳为载体的肺炎链球菌PspA抗原的研究
4.1P22衣壳装载PspA抗原的质粒构建
(1)质粒的提取
将保存有质粒pYA4088的大肠杆菌从菌种库复苏，挑取单克隆菌落接种在5mL LB液体培养基中过夜培养，使用质粒抽提试剂盒提出质粒，作为扩增目的片段的模板，-20℃保存。
(2)目的片段及载体片段的扩增
PCR所需的引物、模板以及扩增产物见表PCR所需引物、模板及PCR产物
PCR所需引物、模板及PCR产物
PCR产物经电泳鉴定和预期大小一致后，使用胶回收试剂盒对目的片段进行纯化回收。回收产物使用核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，并保存至-20℃。
(3)环式PCR连接目的片段与载体片段
将目的片段与载体片段以摩尔比1∶1～2∶1比例混合于PCR管，反应体系与程序如表环式PCR反应体系(20μL)、环式PCR反应程序。
环式PCR反应体系(20μL)
环式PCR反应程序
(4)连接产物的转化
将得到的连接产物进行电转化。
(5)转化子的鉴定
次日，在平板上的一定的区域内用无菌牙签挑取8个单菌落，使用引物3342-Ptrc-F/8-J-R进行菌落PCR鉴定，并同时划线扩大培养单菌落。
PCR产物经电泳鉴定后，将符合预期大小的阳性克隆进行保存，并抽提阳性克隆质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序引物为3342-Ptrc-F和8-J-R。测序比对无误，将质粒命名为：“pYA3342-P22-PspA”、“pYA3342-Dec-PspA-P22”。
(6)质粒的转化
将上述测序正确的质粒电转入χ9241中。
4.2衣壳装载PspA抗原的亚基在减毒沙门菌χ9241的表达
分别复苏菌χ9241(pYA3342-P22-PspA)、χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)、χ9241(pYA3342-P22)、χ9241(pYA4088)、χ9241，挑单克隆到5mL培养基中，37℃，180r/min过夜培养。处理样品、SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色。
经SDS-PAGE凝胶电泳，与对照χ9241(pYA3342-P22)及χ9241相比，χ9241(pYA3342-P22-PspA)表达了大小为47.6kDa的CP，大小为51.3kDa的SP141-303-PspA；χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)表达了大小为47.6kDa的CP，大小为49.2kDa的Dec-PspA，大小为20kDa的SP141-303。
Western blot验证蛋白的表达情况：
a.SDS-PAGE凝胶电泳完成后取出凝胶，去除浓缩胶，保留分离胶，将分离胶放入4℃预冷的电转缓冲液中。将大小合适的PVDF膜先用甲醇激活15s，再将膜、海绵、双层滤纸以及凝胶分别浸泡于电转缓冲液中。
b.按照正极(白色)/海绵/滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸/海绵/负极(黑色)的顺序固定“三明治”夹子。
c.将固定好的“三明治”夹子放入电泳槽中，加电转缓冲液没过夹子，然后将电泳槽放于冰水混合物中，100V电转100min。
d.转膜结束后，将PVDF膜取出，放入配好的5％脱脂牛奶封闭液中，孵育2h。
e.倒掉封闭液，用PBS-T将膜清洗5～10min。加入PBS-T稀释的一抗(His兔源单抗1∶8000稀释，再按1∶5000加入实验室自制的PspA兔源多克隆抗体混合稀释)，室温孵育2h或者4℃过夜孵育，孵育结束后用PBS-T洗涤3次，每次5～10min。
f.加入PBS-T稀释的酶标二抗(HRP标记山羊抗兔IgG酶标二抗1∶20000稀释)。室温孵育1h。孵育结束后，用PBS-T洗涤3次，每次5～10min。
g.将ECL化学发光显色液A液和B液1∶1混匀，均匀滴加到PVDF膜正面，在化学发光成像仪观察结果。
在CP的C端连接了6×His标签，同时使用的PspA和His抗体与χ9241(pYA3342-P22-PspA)、χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)和χ9241(pYA3342-P22)表达的蛋白能发生特异性结合，且大小符合理论值，说明χ9241(pYA3342-P22-PspA)正确表达出了CP和SP141-303-PspA，χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)正确表达出了CP、Dec-PspA和SP141-303。
4.3PspA蛋白的表达与纯化
(1)将菌种库中的BL21(DE3)(pUAB055)菌株划线在固体LB(Amp+)培养基上进行复苏，挑取单克隆接种到5mL 液体LB(Amp+)培养基中，37℃，180r/min过夜培养，第2d按1:50的比例吸取菌液转移到300mL新鲜的液体LB(Amp+)培养基中，37℃，180r/min培养至OD600≈0.4。
(2)向菌液中加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，16℃，180r/min过夜诱导。将得到的菌液分装在50mL离心管中，5000r/min离心15min，去除上清，收集菌体。
(3)向菌体中加入40mL Binding buffer进行重悬，然后使用超声波细胞粉碎机破碎菌体(工作参数：工作6s，间歇9s)，直至菌液澄清透亮。4℃，12000g离心20min，收集上清(上清表达)。
(4)启用新开封的镍亲和层析柱，先用5倍柱体积的ddH2O润洗镍柱，然后再用5倍柱体积的Binding buffer平衡镍柱。
(5)先取少量上清液缓慢加入镍柱，使目的蛋白与镍充分结合，收集流穿液。
(6)分别用5～10倍柱体积含50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L咪唑的Washing buffer(即bufferⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)洗涤柱体，按照1mL/min的流速缓慢进行洗脱，收集各浓度的洗脱液。
(7)取流穿液、各浓度的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色以确定最适的洗脱浓度。
(8)确定最适洗脱浓度后，先使用5倍柱体积的ddH2O缓慢洗涤镍柱，在加入5倍柱体积的Binding buffer重新平衡镍柱。将大量上清液缓慢加入镍柱，用5倍体积最适洗脱浓度的Washing buffer对目的蛋白进行洗脱，收集洗脱的溶液。
(9)收集完成后，用1mol/L咪唑的Washing buffer以5倍柱体积的量洗涤柱体，洗脱残余蛋白。再用5倍柱体积Binding buffer淋洗柱子，最后用25％乙醇保存柱子，放于4℃。得到的蛋白样品暂保存于4℃。
在用浓度为50mmol/L和100mmol/L咪唑洗脱时，目的蛋白含量最高，能够将大部分目的蛋白洗脱，且纯度较高，200mmol/L咪唑洗脱液洗脱了极少量的目的蛋白，500mmol/L咪唑的洗脱液已经没有蛋白被洗脱。收集50mmol/L和100mmol/L咪唑洗脱液，进行蛋白透析。
4.4PspA纯化蛋白的透析
a.将透析袋裁剪成合适的长度，将透析袋放入含有2％NaHCO3和1mmol/L EDTA的缓冲液(pH＝8.0)中，煮沸15min，以去除残留的金属离子，然后用ddH2O清洗透析袋。再放入1mmol/L EDTA的缓冲液(pH＝8.0)中煮沸15min，再次用ddH2O清洗透析袋。将彻底清洗后的透析袋置于25％的乙醇溶液中，于4℃保存备用。
b.取出已处理好的透析袋，用ddH2O清洗干净。注入ddH2O用夹子夹住两端，检查气密性是否良好，弃去ddH2O将纯化的PspA蛋白注入透析袋中，用夹子夹紧两端，放入1LPBS缓冲液中，放至磁力搅拌器上，4℃，100r/min进行透析，每隔3h更换一次PBS，透析2～3次，收集透析后的蛋白。
c.取出少量透析后的蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白浓度的测定，然后将蛋白放于-40℃保存。
4.5肺炎链球菌D39LD50的测定
(1)将7周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组5只，在动物房中饲养7d以适应环境。
(2)将肺炎链球菌D39接种于血平板培养基复苏，挑取单克隆接种于5mLTHB-Y液体培养基，37℃过夜培养。次日，按照1∶50的比例扩大培养至50mLTHB-Y液体培养基中，37℃，180r/min培养至OD600≈0.9时，取1mL菌液到9mL无菌PBS中，依次进行10倍比稀释。在10-5～10-8梯度分别取100μL，进行菌落计数，重复3次。测得OD600≈0.9时对应的菌量为1.5×108CFU/mL。
(3)重新摇菌，按照步骤(2)的实验流程对菌液进行倍比稀释至10-4～10-7四个梯度，分别取100μL对小鼠进行腹腔注射，攻毒后两周内每天检查小鼠的死亡情况，做好记录。
(4)使用SPSS软件进行数据分析，计算出D39的LD50值。SPSS软件计算D39的LD50值为2.99×102CFU。
D39的半数致死量
4.6口服免疫试验
将7周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组8只，在动物房中饲养7d以适应环境。
复苏疫苗菌株χ9241(pYA3342-P22-PspA)、χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)，阳性对照菌株χ9241(pYA4088)，阴性对照菌株χ9241(pYA3342-P22)，再分别接种至5mL液体LB培养基中过夜培养。次日，将菌液按照1∶50的比例扩大到100mL新鲜的LB培养基中培养至OD600≈0.9。分别取50mL菌液5000r/min，25℃离心15min，弃上清。加入少量无菌PBS-G溶液重悬菌体，再定容至1mL，使菌量达到1×109CFU/20μL。
分别按表免疫分组进行免疫。初次免疫14d后，通过眼眶采取小鼠的血液样品，37℃放置2h，4000r/min离心10min，保留血清。同时采集小鼠的阴道分泌物(120μL PBS冲洗)。间隔7d，再次按照相同的剂量进行加强免疫。第二次免疫14d后，再次通过小鼠眼眶采取血液样品，37℃放置2h，并离心保留血清，同时采集小鼠的阴道分泌物。收集完的样品保存于-80℃备用。
免疫分组
首免和二免后14d采集小鼠的阴道分泌物和血清样品，检测小鼠体内针对异源性抗原PspA产生的抗体水平，结果如图9所示。免疫过程中，各组小鼠健康状态良好，均无死亡发生。
(1)图9A和B分别反映了各免疫组小鼠体内针对PspA的IgA抗体水平IgG抗体水平。PBS组均未产生PspA特异性抗体。一免后，各组小鼠体内的IgA水平都较低，χ9241(pYA3342-P22-PspA)组小鼠体内的IgA水平显著高于χ9241(pYA4088)组(p<0.05)，χ9241(pYA3342-P22-PspA)组小鼠体内的IgA水平与χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)组无显著性差异(p>0.05)，χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)组小鼠体内的IgA水平与χ9241(pYA4088)组无显著性差异(p>0.05)；二次加强免疫后，试验组小鼠体内IgA水平明显提高。χ9241(pYA3342-P22-PspA)组产生的IgA水平显著高于χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)和χ9241(pYA4088)组(p<0.05)，χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)组产生的IgA水平与χ9241(pYA4088)组无显著性差异(p>0.05)。综上结果说明，相比于χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)和χ9241(pYA4088)组，χ9241(pYA3342-P22-PspA)组能诱发产生更好的黏膜免疫反应。
如图9B所示，一免后，各组小鼠体内产生的IgG水平相对而言较低，χ9241(pYA3342-P22-PspA)组小鼠体内的IgG水平极显著高于χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)和χ9241(pYA4088)组(p<0.001)，χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)组小鼠体内的IgG水平显著高于χ9241(pYA4088)组(p<0.05)；二次加强免疫后，试验组小鼠体内IgG水平明显提高，χ9241(pYA3342-P22-PspA)产生的IgG水平极显著高于χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)和χ9241(pYA4088)(p<0.001)，χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)产生的IgG水平与χ9241(pYA4088)无显著性差异(p>0.05)。综上结果说明，相比于χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)和χ9241(pYA4088)，χ9241(pYA3342-P22-PspA)组能诱导小鼠针对抗原蛋白PspA产生更高水平的IgG抗体。
(2)通过进一步检测小鼠血清中IgG亚型IgG1和IgG2a的水平，确定小鼠体内针对PspA抗原的免疫类型，如图9C和D所示，PBS组均未产生PspA特异性抗体。Th1辅助细胞介导细胞免疫反应并促进抗体向IgG2a类型转换，Th2辅助细胞参与B细胞诱导的体液免疫反应并促进抗体向IgG1类型转换。二次加强免疫后，χ9241(pYA3342-P22-PspA)组产生的IgG1和IgG2a水平均极显著高于其他组(p<0.001)，χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)组产生的IgG1水平极显著高于χ9241(pYA4088)和阴性对照组(p<0.001)，产生IgG2a水平与χ9241(pYA4088)和阴性对照组无显著性差异(p>0.05)。综上结果说明，χ9241(pYA3342-P22-PspA)组针对抗原蛋白PspA产生的抗体反应类型以复合型反应为主，而χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)组比阳性对照菌株诱导宿主产生更强的体液免疫反应。
4.7小鼠抗体水平检测
使用ELISA试验检测小鼠阴道分泌物和血清中产生的针对肺炎链球菌PspA蛋白的抗体。
a.将纯化的PspA蛋白和标椎抗原使用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)稀释至1μg/mL，按照每孔100μL(每孔100ng蛋白)加入到96孔酶标板，4℃过夜孵育。
b.第2d，倒去包被液，每孔加入200μL TBS-T洗3次，每次5min，将板拍干净。每孔加入200μL封闭液，37℃封闭1h。
c.倒去封闭液，每孔加入200μL TBS-T洗3次，每次5min，将板拍干净。使用TBS-T将标准品一抗稀释至1μg/mL，再进行2倍比稀释，将阴道分泌物按照1∶10的比例稀释，一免血清样品按照1∶100稀释，二免血清样品按照1∶5000稀释。各吸取100μL相应的稀释样品加入到对应的孔中，37℃孵育1h。
d.倒去稀释样品液，每孔加入200μL TBS-T洗3次，每次5min，将板拍干净。向阴道分泌物的酶标板每孔中加入100μL 1∶5000稀释的羊抗鼠IgA(生物素标记)二抗；向相应血清样品板中对应的加入100μL 1∶5000稀释的羊抗鼠IgG，IgG1或者IgG2a(生物素标记)二抗，37℃孵育1h。
e.倒去二抗，每孔加入200μL TBS-T洗3次，每次5min，将板拍干净。向每孔加入100μL 1∶3000稀释的Streptavidin-AP，37℃孵育1h。
f.倒去Streptavidin-AP，每孔加入200μL TBS-T洗3次，每次5min，将板拍干净。使用包被液将PNPP溶解并稀释至1mg/mL，每孔加入100μL，室温避光孵育20～25min，加入50μL3mol/LNaOH终止液。酶标板在酶标仪OD405处读取数据。
g.根据标准样品作出标准曲线，将测量样品的OD405值代入，算出对应的浓度值。
4.8小鼠免疫保护水平的检测
第二次加强免疫后21d对小鼠腹腔注射10LD50的野生毒株D39，观察14d，统计小鼠的存活率。
发现PBS和χ9241(pYA3342-P22)组作为阴性对照组迅速发生死亡，χ9241(pYA4088)组作为阳性对照组的保护率为25％，疫苗组χ9241(pYA3342-Dec-PspA-P22)和χ9241(pYA3342-P22-PspA)组的保护率分别为50％和75％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：将形成噬菌体P22衣壳的基因通过质粒载体在减毒沙门菌中进行蛋白表达。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述噬菌体P22衣壳的基因包括：基因5和基因8。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述减毒沙门菌包括减毒沙门菌χ9241。
4.权利要求1-3任一项所述的构建方法构建得到的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体。
5.权利要求4所述的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体在递送异源抗原的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述减毒沙门菌和噬菌体P22双载体递送异源抗原的方法包括：将所述异源抗原的基因装载在噬菌体P22衣壳的基因上，再通过质粒载体在减毒沙门菌中进行蛋白表达。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述异源抗原的基因装载在噬菌体P22衣壳的基因上的方法包括：将所述异源抗原通过柔性短肽与噬菌体P22的SP141-303的N端融合，与CP在减毒沙门菌中共同表达；或将所述异源抗原与噬菌体P22的Dec的C端融合，与CP、SP141-303在减毒沙门菌中共同表达。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述异源抗原包括：PspA。
CN202211302651.7A 2022-10-24 2022-10-24 一种减毒沙门菌和噬菌体p22双载体、构建方法及其应用 Pending CN116083467A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211302651.7A CN116083467A (zh) 2022-10-24 2022-10-24 一种减毒沙门菌和噬菌体p22双载体、构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211302651.7A CN116083467A (zh) 2022-10-24 2022-10-24 一种减毒沙门菌和噬菌体p22双载体、构建方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116083467A true CN116083467A (zh) 2023-05-09

Family

ID=86198052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211302651.7A Pending CN116083467A (zh) 2022-10-24 2022-10-24 一种减毒沙门菌和噬菌体p22双载体、构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116083467A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6373301B2 (ja) バクテリオファージｔ４ ｄｎａパッケージングマシンを用いた遺伝子およびタンパク質のインビトロおよびインビボ送達
CN109303916B (zh) 焦亡相关蛋白gsdmd在制备菌蜕疫苗中的应用
WO2022087856A1 (zh) 一种减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用
WO2022087854A1 (zh) 一种减毒沙门氏菌分泌表达ntd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用
CN112625095A (zh) 一种猪轮状病毒重组蛋白以及表达该蛋白的重组腺病毒和应用
CN111548395A (zh) 一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒及其应用
CN103305542A (zh) 一种重组噬菌体双表达载体及应用
CN114478715B (zh) 一种减毒沙门氏菌分泌表达s2结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗递呈系统及其应用
CN111607605B (zh) 一种多价表位和亚单位疫苗的构建方法
ES2684556T3 (es) Vacunas de mannheimia haemolytica atenuadas y procedimientos de fabricación y uso
CN105154377B (zh) 重组鸡白痢沙门菌、制备方法及应用
CN117070432A (zh) 融合表达猪源树突状细胞靶向肽和pedv中和抗原表位的重组乳酸杆菌及其应用
US11767356B1 (en) Canine parvovirus nanobody CPV-VHH-E3 and application thereof
CN116083467A (zh) 一种减毒沙门菌和噬菌体p22双载体、构建方法及其应用
CN113248577B (zh) 一种以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗及其制备方法
CN115521881A (zh) 柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒表达系统、该表达系统制备的病毒样颗粒及手足口病疫苗
WO2022087855A1 (zh) 一种基于减毒沙门氏菌可控分泌表达的新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
CN104651316B (zh) 一种重组猪圆环病毒病毒样颗粒及其制备方法
CN109295014B (zh) 一种非典型猪瘟病毒e2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和应用
CN112442131B (zh) 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的传染性法氏囊病疫苗和应用
Wang et al. Protection against genotype VII Newcastle disease virus challenge by a minicircle DNA vaccine coexpressing F protein and chicken IL-18 adjuvant
CN108715607B (zh) 重组霍乱毒素b亚基蛋白、pedv灭活疫苗及制备与应用
CN114632148A (zh) 病原样抗原疫苗及其制备方法
CN114805599B (zh) 一种基于ADDomer嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及应用
CN114456240B (zh) 一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination