JP6373301B2 - バクテリオファージt4 dnaパッケージングマシンを用いた遺伝子およびタンパク質のインビトロおよびインビボ送達 - Google Patents
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Description
米国政府は、国立衛生研究所による助成金の契約第NIAID U01−AI08086号およびAI081726号に従って本発明において権利を有する。
用語の定義が当該用語の一般的に使用される意味から逸脱する場合、特に表示のない限り、出願人は、以下に提供された定義を利用することを意図する。
細胞内への組換え遺伝子およびタンパク質の送達は、分子生物学およびバイオテクノロジーの中核をなす。遺伝子を送達するために多数の方法、少し例を挙げると、エレクトロポレーション(Neumannら、2011年(参考文献1))、ウイルスベクター(Kay、2011年(参考文献2))およびマイクロインジェクション(Demayoら、2012年(参考文献3))が開発されている一方で、タンパク質送達はそれほど一般的ではない(Yanら、2010年;Kaczmarczykら、2011年(参考文献4および参考文献5))。しかしながら、遺伝子およびタンパク質の両方を効率的に送達することができるプラットフォームは現在のところ存在しない。ゲノミクスおよびタンパク質ネットワークデータベースが爆発的に発展する中で、標的細胞内への遺伝子およびタンパク質の送達は、機構を理解するためにも新規な生物医学的療法を探究するためにも不可欠である。例えば、癌やAIDSのような複雑な遺伝性および感染性疾患の将来の治療法は、遺伝子およびタンパク質の適切な組合せでの送達を含み得、これを本明細書中では「プロ遺伝子送達」と言う。
別の実施形態によれば、図3に見られるように、まず、10am13amhoc−soc−変異体を感染させた大腸菌細胞から首部なし頭部を単離した。これらの頭部の大部分、大体90%は、ウイルスゲノムを自発的に放出し、それはDNアーゼIで消化された。空になった頭部は、大体8kbのDNAを内部に保持し、残りの大体162kbの空間が、外来DNAのために利用可能であった。頭部を、CsCl勾配遠心分離およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、gp17と混合して、機能的パッケージングマシンを再構成した。これらのマシンは、バルクおよび単一分子アッセイによって示されるように、頭部を高効率で再充填した。クライオ電子顕微鏡によって、マシンの大部分が能動的にDNAをカプシドで包んでいることが分かった。単一(図4)もしくは複数のプラスミド、大体80kbの長い連結されたDNA(大体170kbまで)または2.3kbの短いPCR増幅されたDNA(図5)が、効率的にパッケージングされた。図5のレーン1に沿って、ルシフェラーゼが矢印512によって示され、eGFPが矢印514によって示されている。レーン2ではコンカテマー化されたDNAが矢印516によって示されており、レーン3のPCR増幅されたルシフェラーゼ発現カセットが矢印518によって示されている。矢印520、矢印522および矢印524は、頭部内に存在する8kbのT4 DNAを示している。図4に示すように、DNAと頭部の比率が大体30:1であったとき、平均して、1頭部あたり10分子までのプラスミドDNAがパッケージングされた。2つ(またはそれ以上)のプラスミドDNAが存在しているときは、その両方がほぼ等しい頻度でパッケージングされた(図5、レーン1)。次いで、Soc融合組換え体およびHoc融合組換え体を反応混合物に加えることによって、外来ペプチド(細胞透過ペプチド;CPP)とタンパク質(β−ガラクトシダーゼ、DEC205mAb、CD40リガンド等)とを、表面に配列した(図6)。図6において、矢印612は、結合したSoc−TおよびSoc−Pを示し、矢印614は、結合したHoc−TおよびHoc−Pを示し、コントロールレーンは、精製された頭部を示す。カプシドに結合したSocおよびHocは、結合部位に対するSocまたはHoc融合タンパク質分子の比率を変えることによって、単純な1次をたどった(図6および図7)。比率が20:1のとき、ほとんど全てのカプシド結合部位が占有された。
本発明の初期実験は、HEK293T細胞内へのルシフェラーゼ遺伝子のT4送達が非常に不十分であることを示した。しかしながら、粒子をCPP−Tat(CPP−T)またはCPP−Antp(CPP−P)で装飾した場合は(図6)、細胞ライセート中の高いルシフェラーゼ活性の出現によって示されるように、送達は効率的であった(図7、図8、図9および図10)。CPPは、付着したカーゴ分子の細胞膜通過を容易にする塩基性アミノ酸に富む、20〜30アミノ酸ペプチドである。TatおよびAntpは、それぞれ、HIV−1トランスアクチベータータンパク質、ショウジョウバエアンテナペディアホメオボックスタンパク質のCPPを言う(Frankelら、1988年(参考文献21);Joliotら、1991年(参考文献22))。ルシフェラーゼ活性は、1細胞あたり105頭部で最大に達した(図7)。活性は、早くも5時間後までに出現し、約16時間後までにピークに達し、少なくとも30時間は持続した。
T4送達が特定の細胞にターゲティングされ得るかどうかをテストするために、抗原提示樹状細胞を選択した。樹状細胞は、ワクチン取込みならびに体液性および細胞性免疫応答の誘導にとって重要である(Steinmanら、2007年(参考文献24))。本発明の開示された実施形態における仮説は、カプシド格子上に樹状細胞特異リガンドをディスプレイすることによって、T4が樹状細胞を捕らえることが可能になり、付着カーゴのエンドサイトーシスおよび送達につながるというものである。この仮説をテストするために、樹状細胞特異的なDEC205レセプター(Bonifazら、2004年(参考文献25);Jiangら、1995年(参考文献26))およびCD40(参考文献27)をそれぞれ認識したCD40リガンド(CD40L)のDEC205mAbをT4頭部にディスプレイした。まず、頭部にルシフェラーゼおよび/またはeGFP遺伝子をパッケージし、Hoc−GG融合タンパク質とDEC205mAbと共にインキュベートした。GG融合物は、ストレプトマイセス由来の、プロテインGの2つの直列に連結した122アミノ酸IgG結合ドメインを含んでおり(Akerstromら、1985年(参考文献28))、これらは、Hocを通じてT4頭部に付着すると、Fc領域を捕らえ、レセプター結合Fab領域が良好に露出した状態で頭部上にDEC205mAbのアレイを形成した(図14および図19)。図14において、Hoc−GG、Soc−GGおよびDEC205mAbバンドに、矢印1412および矢印1414(Hoc−GG)、矢印1416および矢印1418(Soc−GG)、DEC205mAb(1420、1422、1424および1426)が付けられている。これらの粒子は、パッケージングされたルシフェラーゼ遺伝子をマウスDC2.4細胞内に効率的に送達した(Shenら、1997年(参考文献29))が、レセプターを欠いているHep3B細胞のような非特異的細胞内へはそうすることができなかった(図15)。送達効率は、いくつかの独立した実験においてほとんど100%であった(図16)。図16において、1612および1614は、それぞれ、ディスプレイされたDEC205mAbの非存在下でGFP頭部が形質導入されたDC2.4細胞の位相差顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真である。1616および1618は、それぞれ、ディスプレイされたDEC205mAbの存在下でGFP頭部が形質導入されたDC2.4細胞の位相差顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真である。ルシフェラーゼ遺伝子およびeGFP遺伝子の両方が同じ頭部にパッケージングされた場合、HEK293T細胞では、ルシフェラーゼシグナルおよび緑色蛍光シグナルの両方の存在によって示されるように、頭部は両方の遺伝子を100%近い効率で送達したが、コントロール細胞では、そうではなかった。HocのN末端に融合させたディスプレイされたCD40Lを用いても同様の結果が得られた。
別の実施形態において、マウスモデルを用いてインビボT4送達をテストした。4つの群のマウスに、ルシフェラーゼプラスミドがパッケージングされたT4頭部を筋肉内注射した。第1の群には、ディスプレイされたリガンドを含まない頭部を与え、第2、第3および第4の群には、それぞれ、DEC205mAb、CD40LおよびCPP−Tがディスプレイされた頭部を与えた。注射後の異なる時点で、マウスに生物発光基質D−ルシフェリンを注射し、全身を撮像した。予想外に、ディスプレイされたリガンドを含まない頭部を与えた第1の群において強いルシフェラーゼシグナルが観察された(図23)。これらの同じ粒子は、インビトロでは非常に不十分な送達を示していた(図7および図11のパネル1112)。さらに、シグナルは注射から早くも6時間後までに現れており、筋肉細胞がT4ナノ粒子を取り込み、送達されたDNAを注射部位で効率的に発現したことを示唆していた。経時的解析は、標準のルシフェラーゼ発現カセットを用いるとルシフェラーゼシグナルが少なくとも14日間にわたり、カセットにAAV逆方向末端反復配列が隣接している場合は少なくとも30日間にわたることを示した(ITRが送達された遺伝子のDNA複製を開始させる)(Asokanら、2012年(参考文献31))(図24および図25)。他方で、DEC205mAbおよびCD40Lがディスプレイされた粒子は、弱いルシフェラーゼシグナル〜ルシフェラーゼシグナルなしを示し、シグナルは急速に消滅した。16時間後までに注射部位に残っているシグナルはほとんどなくなった(図23、パネル3およびパネル4、パネル5およびパネル6を、パネル1およびパネル2と比較)。これらのデータは、DEC205mAbまたはCD40LがディスプレイされたT4粒子を取り込んだ樹状細胞が体の他の部分、例えばリンパ節および脾臓に移動し、それによってシグナルが生物発光イメージングの感度未満まで希釈されたことを示唆していた(以前の研究において同様の観察がなされた(Yangら、2008年)(参考文献32))。CPPがディスプレイされた群も同様にふるまった(図23、パネル7およびパネル8)が、これが樹状細胞の移動によるものであったのかどうか、かつ/または、他の種類の細胞も関与していたかどうかについては、さらなる調査が必要である。シグナルの欠乏が送達の欠乏ではなく樹状細胞の移動によるものであることをさらに確認するために、リガンドを含まないかまたはディスプレイされたCD40Lを含む頭部を用いて同量のルシフェラーゼDNAをマウスに送達することによって、別のコントロール実験を行った(図26、パネル2)。図26において、パネル1は、同量のpITR-ルシフェラーゼがリガンドで装飾されなかった(レーンI)かまたはCD40で装飾された(レーンII)T4頭部にパッケージングされたものを示す。レーンMは、分子サイズ標準を示す。図26のパネル2において、ディスプレイされたリガンドを含まないT4頭部の注射部位で強いルシフェラーゼシグナルが見られた。図26のパネル3において、樹状細胞特異リガンドCD40LがディスプレイされたT4頭部の注射部位ではシグナルは見られなかった。また、樹状細胞をターゲティングした群は、加えて、強い細胞性免疫応答を惹起した(下記参照)。総合すると、上記のデータは、T4送達がインビボで効率的であり、いずれにせよ送達を筋肉に局在させることができた(シグナルペプチドを付着させることによって体内に分泌させることもできたが)が、その一方で、ターゲティング群においては、遺伝子産物およびそれに由来するペプチドが移動するが、重要なことには、樹状細胞と相互作用するT細胞やB細胞のような細胞に提示されるということを実証している(Steinmanら、2007年)(下記参照)。
理想的なワクチンは、免疫系の体液性(Th2)および細胞性(Th1)両方の腕を刺激する(Rappuoliら、2007年(参考文献33))。ワクチンを両方の形態、つまり抗原および発現可能なDNAとして送達することによって、免疫系をプライムおよびブーストし(「プライムブースト」ワクチン)、Th1およびTh2応答を刺激し得る(Davtyanら、2009年(参考文献34))。このことは、これまでの方法では効果的なワクチンがまだ開発されていないHIV−1、マラリアおよびTBのような複雑な感染病原体と闘うために特に重要であり得る。
上記の一連の実験によって、他にないタイプの遺伝子およびタンパク質送達プラットフォームとしてのファージT4 DNAパッケージングマシンが確立された。よく理解された構造的および機構的特徴(図1)、すなわち、170kbの容量の頭部と、乱雑なパッケージングモーターと、1,025分子の容量の表面格子と、末端が露出したSocタンパク質と、標的細胞を捕らえるための大体180Åの長さのHoc繊維とを有して、T4は、多種多様な用途のためにナノ粒子を遺伝子操作するための多くの選択肢を提供する。たいていの場合特徴が1つであり、容量が限られている既存の系とは異なり、T4の応用例は、遺伝子およびタンパク質の単純なインビトロ送達から、病気を治療するために遺伝子、タンパク質、多量体複合体およびターゲティング分子の組合せを必要とする複雑なインビボ送達にまで及ぶ。これらの広範囲の応用例を実証するために、一連の重要な実験を選択した。データは、T4が、単一または複数の遺伝子を、プラスミド、PCR増幅されたDNAまたはコンカテマー化されたDNAとして効率的に送達したことを示す。同時に、単一または複数のタンパク質が、短いペプチド、完全長のタンパク質または巨大な多量体複合体として送達された。異なる課題を実行するためにナノ粒子の異なる部分を遺伝子操作したが、所望の結果を生み出すために統合した。例えば、一部分(Hoc)を、ナノ粒子に特定の細胞をターゲティングするのに割り当て、その一方で、別の部分(Soc)を、過渡的に新しい機能を発現するように、さらに別の部分(カプシド内部)を、長時間にわたって抗原を過剰発現させるように、設計した。このため、T4は、組換えDNAおよびタンパク質分子の送達のための高度な系を提供する。
(10−アンバー 13−アンバー hoc(高抗原性外部カプシドタンパク質)−del soc(小さい外部カプシドタンパク質)−del 頭部の精製)
10−アンバー13−アンバー.hoc−del.soc−del変異体を標準の遺伝子交雑によって構築した。この変異体を感染させた大腸菌P301(sup−)細胞(500mL)を、10μg/mL DNアーゼIおよびクロロホルム(1mL)を含む40mLのPi−Mgバッファ(26mM Na2HPO4/68mM NaCl/22mM KH2PO4/1mM MgSO4、pH7.5)中で溶解し、37℃で30分間インキュベートした。ライセートを低速(6,000×gで10分間)および高速(35,000×gで45分間)で2回遠心分離し、最終的な頭部ペレットを200μLのTris−Mgバッファ(10mM Tris−HCl、pH7.5/50mM NaCl/5mM MgCl2)中で再懸濁し、CsCl密度勾配遠心分離法によって精製した。5mLの勾配の底から約1/3に沈降した主要頭部バンドを抽出し、Tris−Mgバッファに対して一晩透析した。頭部をDEAEセファロースクロマトグラフィーによってさらに精製した(Neumannら、2011年)。ピーク頭部画分を濃縮し、−80℃で貯蔵した。
(インビトロDNAパッケージング)
インビトロDNAパッケージングアッセイを前述の手順によって行った(Kay、2011年)。反応混合物は、30mM Tris−HCl(pH7.5)、100mM NaCl、3mM MgCl2および1mM ATPを含有するバッファを用いて、精製されたHoc−Soc−頭部[または、記載されている場合は野生型(WT)頭部](大体2×1010粒子)と、精製されたgp17(大体1.5μM)と、DNA(大体300ng)とを含んでいた。DNAは、制限酵素での消化によって生産された線状化された分子であった。例として、eGFP発現カセットを含むMluI−線状化された4.7kb pEGFP−C1プラスミドおよびルシフェラーゼ発現カセットを含むBamHI線状化6.2kb psiCHECK2プラスミドが挙げられる。いくつかの実験においては、発現カセットに対応するPCR増幅した2.3kbのDNAまたは大体80kbの連結されたプラスミドコンカテマーをパッケージング基質として用いた。パッケージングされていないDNAを消化するためにDNアーゼIを添加することによってパッケージング反応を終了させた。カプシドに包まれたDNアーゼI抵抗性DNAをプロテイナーゼKでの処理によって放出させ、アガロースゲル電気泳動によって解析した。パッケージングされたDNAをQuantity Oneソフトウェアによって定量化した。各実験は、必須のパッケージング成分、すなわち、頭部、gp17、ATPまたはDNAのうちの1つが欠如した1〜数個のネガティブコントロールを含んでいた。パッケージング効率とは、パッケージング反応において用いられた頭部粒子の数あたりのパッケージングされたDNA分子の数として定義される。
(インビトロでのHoc−Soc−T4頭部上のディスプレイ)
インビトロでの融合タンパク質のT4カプシド上のディスプレイを、記載のように実行した(Demayoら、2012年;Yanら、2010年)。ルシフェラーゼおよび/またはeGFP DNAを上記のようにパッケージングした後、Hoc−Soc−T4頭部(2〜3×1010粒子)を、同じチューブ内のSocおよび/またはHoc融合タンパク質と共に、Soc融合物については4℃、Hoc融合物については37℃で、30分間インキュベートした。DEC205mAbのディスプレイのために、HocまたはSoc融合GGドメインとmAbとを同時に反応混合物に添加した。カプシド上のそれぞれの結合部位に対する融合タンパク質の比率を調節した。カプシド上の結合部位は、融合タンパク質によって占有され、反応混合物に含まれる1つのタンパク質またはタンパク質の組合せで頭部を装飾している。頭部を34,000×gで45分間遠心沈殿させ、20mM Tris−HCl(pH8.0)および100mM NaClで2回洗浄することによって結合していないタンパク質を除去した。頭部ペレットを、形質導入のためにOpti-MEMで、または、SDS/PAGE解析のためにPBS(pH7.4)で、再懸濁させた。ゲルをクーマシーブルーR250で染色し、タンパク質バンドをレーザーデンシトメトリーによって定量化した。Hoc、Soc、gp23*およびgp18(主な尾鞘タンパク質;70kDa)バンドの密度をレーンごとに別々に測定し、1カプシドあたりの結合HocまたはSoc分子の数を、gp23*の既知のコピー数(1頭部あたり930コピー)またはgp18の既知のコピー数(1ファージあたり138コピー)を用いて算出した。1カプシドあたりの結合Soc分子数(Y)と結合反応における結合していないタンパク質の濃度(X)とを関係付ける飽和結合曲線は、S字状ではなく、隣接するHocまたはSoc結合部位間に協同性がないことを示した。見かけのKd(会合定数)とBmax(1カプシドあたりの結合したSocの最大コピー数)とを、GraphPad PRISM-4ソフトウェアにプログラムされているように、式Y=BmaxX/(Kd+X)を用いて決定した。
(T4頭部のための遺伝子送達)
細胞(HEK293TおよびHep3Bについては1ウェルあたり2×105細胞、DC2.4については1ウェルあたり1.5×105細胞)を24ウェルプレートに播種し、5%(vol/vol)CO2中で37℃で一晩インキュベートした。次いで、培地を500μLのopti-MEM培地と交換し、100μLの遺伝子操作されたT4頭部(HEK293TもしくはHep3B細胞については2×1010頭部またはDC2.4細胞については1.5×1010頭部あるいは図に示された通り)を各ウェルに直接添加した。24時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ発現を標準のプロトコルに従って定量化した。わずか2時間のインキュベーション後に培地を変更した場合は、ルシフェラーゼシグナルの有意な差は観察されなかった。次いで、細胞をPBSで洗浄し、1ウェルあたり160μLの受動溶解バッファを添加して室温で30分間振盪することによって溶解した。各ライセートの20μLアリコートを96ウェルホワイトプレートに移し、100μLのLARIIバッファと混合した。発光シグナルをルミノメーターによって検出した。並行して、β−アクチンを用いたウエスタンブロッティングによって同量の細胞ライセートをβ−アクチンについて解析し、アッセイごとに同数の細胞が取り込まれたことを確認した。
(T4頭部によるタンパク質送達)
β−ガラクトシダーゼSocをHoc−Soc−T4頭部と共に4℃で45分間インキュベートした。Hoc−TまたはHoc−GGおよびDEC205mAbを同じ反応チューブに添加し、さらに45分間、4℃でインキュベートした。頭部を34,000×gで45分間遠心沈殿させ、上記のようにバッファで2回洗浄することによって結合していないタンパク質を除去した。頭部ペレットを、形質導入のためにopti-MEMに、または、β−ガラクトシダーゼ活性の測定のためにPBSに、再懸濁した。後者については、X−Galをチューブに添加し、室温で10分間インキュベートした。上記のように送達を行い、β−ガラクトシダーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ染色キットを用いてX−Galで染色することによって、頭部の添加から3時間後または24時間後に顕微鏡法で可視化した。
(単一分子光ピンセットDNAパッケージング)
光ピンセットパッケージングを用いた単一パッケージングマシンによるパッケージングを前述の手順に従って行った(Kaczmarczykら、2011年;Smithら、2001年)。精製した頭部(4×109粒子)を、パッケージングバッファ(50mM Tris−HCl、pH7.6/100mM NaCl/5mM MgCl2)からなる10μLの反応容量中で、1mM ATP−γ−Sの存在下で、精製したgp17(1μM)および125bpの「プライミング」DNA(0.44μM)と混合した。37℃で30分間インキュベートした後、T4ファージ抗体被覆ポリスチレンビーズ(1.5μL)(直径0.79μm、Spherotech社)を添加した。PCR増幅した10kbの一端をビオチン標識したλDNAを、ストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズ(直径0.86μm、Spherotech社)に添加し、37℃で30分間インキュベートすることによって、DNAビーズを調製した。較正済みのデュアルトラップ光ピンセットを用いて、100Hzで、パッケージングが5pNの一定の力に対して起こるようにした「フォースフィードバック」モードで、計測値を得た。1mM ATPをフローセル内に注入することによって、テザー形成およびパッケージングを開始させた。53nmの持続長、1,200pN/nmの伸長弾性係数および0.34nmの塩基対あたりの距離を仮定したミミズ鎖モデルを用いて、計測された力およびビーズ間の伸びから、DNAの輪郭長を算出した。0.1秒(10データ点)のスライディングウィンドウにわたる輪郭fDNAのリニアフィットからDNAパッケージングの速度を決定した。
(単一分子蛍光DNAパッケージング)
蛍光標識オリゴヌクレオチドの単一分子パッケージングを前述の基本的手順に従って行った(Neumannら、1982年)。個々のT4パッケージングマシンを、PEG表面不動態化カバーガラスに付着させたT4ファージ抗体を通じて固定化した。結合していない頭部を洗い流し、パッケージングバッファ中のATPおよび39bpのCy5 DNAを、[50mM Tris−HClバッファ、pH8.0/5%(wt/vol)PEG/5mM MgCl2/1mM スペルミジン/1mMプトレシン/60mM NaCl、および酸素スカベンジャー系(0.8%デキストロース/0.1mg/mL グルコースオキシダーゼ/0.02mg/mL カタラーゼ、および3mM トロロクス)]に流し込んだ。単一マシンによるCy5 DNAのパッケージングを、CCDカメラによって100ミリ秒の時間分解能で撮像した。
(組換えプラスミドの構築)
細胞透過ペプチド(CPP)組換え遺伝子の全てを、2回のPCRによって増幅した。1回目のPCRは、HocまたはSoc遺伝子を12アミノ酸リンカーおよびCPPの一部を含む配列に融合することによって行った。このPCR産物を、CPP配列の残りと適切な制限部位とを含む末端プライマーを用いる2回目のPCRのためのテンプレートとして用いた。結果として得られた制限酵素部位−CPP−リンカー−Hoc/Soc−制限酵素部位を含む断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、適切な制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したゲル精製pET−28bベクターDNAと連結させた。Hoc融合DNA断片の挿入の結果、ヘキサヒスチジン配列をN末端に含む23アミノ酸ベクター配列とのインフレーム融合が生じた。Soc融合DNA断片の挿入の結果、ヘキサヒスチジン配列をC末端に含む8アミノ酸ベクター配列とのインフレーム融合が生じた。組換え構築物の残り(GGドメイン、β−ガラクトシダーゼ)については、SocおよびHocを個別に適切なプライマーで増幅した。精製したPCR産物を適切な制限酵素で消化した。3つの制限酵素消化断片(Hoc−GGについては、GGドメイン、pET−28bおよびHoc;Soc−GGについては、GGドメイン、pET−28bおよびSoc;βgal−Socについては、β−ガラクトシダーゼ、pET−28bおよびSoc)を一方向性に連結して適切な融合産物を生成した。組換えDNAの挿入の結果、ヘキサヒスチジン配列をN末端に含む23アミノ酸ベクター配列とのインフレーム融合が生じ、Soc融合物の場合には、2つ目のヘキサヒスチジンタグも組換え体のC末端に付加された。連結されたDNAを大腸菌XL10ゴールド細胞に形質転換し、形質転換細胞からアルカリ溶解によってミニプレッププラスミドDNAを調製し、各クローンの配列をDNA塩基配列決定法によって確認した。次いで、組換えタンパク質のIPTG誘導過剰発現のために、組換えDNAを発現株大腸菌RIPLに形質転換した。
(組換えタンパク質の精製)
組換えタンパク質を、以下に説明する基本的プロトコルに従って精製した。組換えクローンを内部に持つBL21(DE3)RIPL細胞を、1mM IPTGで30℃にて2時間誘導した。細胞を、遠心分離(4,000×gで4℃にて15分間)によって回収し、50mLのHisTrap結合バッファ(50mM Tris−HCl、pH8.0/20mM イミダゾール/300mM NaCl)中で再懸濁した。細胞をフレンチプレスを用いて溶解し、Hisタグが付いた融合タンパク質を含む可溶性画分を34,000×gで20分間遠心分離することによって単離した。上清をHisTrapカラムにロードし、バッファを含む50mM イミダゾールで洗浄し、タンパク質を20〜500mMの直線イミダゾール勾配で溶出させた。ピーク画分を濃縮し、20mM Tris−HCl(pH8.0)および100mM NaClを含むバッファ中でHi-Load 16/60 Superdex-200(プレップグレード)ゲルろ過カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ピーク画分を濃縮し、−80℃で貯蔵した。
(DEC205モノクローナル抗体(mAb)の精製)
DEC−205に対してラットIgG2aモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株HB−290をATCCから入手し、5%(vol/vol)CO2中、10%(vol/vol)FBSを補ったRPMI1640で、37℃に増殖させた。mAbは、プロテインGカラム上でアフィニティークロマトグラフィーによって上清から精製した。細胞培地を低速で遠心分離して細胞破片を除去し、上清のバッファ組成物を、タンジェンシャルフローろ過システムを通すことによって20mM リン酸ナトリウム(pH7)に対して調節した。次いで、試料をプロテインGカラムにロードし、mAbを0.1M グリシン−HCl(pH2.8)で溶出させた。溶出液を中和し、mAbの機能を保存するために、mAb画分を80μLの1M(pH9)を含有するチューブに回収した。
(アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター生産)
今回の研究では、8つの異なる天然の血清型からハイブリッドカプシドを作成するためにDNAファミリーシャッフリングによって遺伝子操作されたAAV血清型DJキットを用いた(Fullerら、2007年)。AAV−DJベクターは、天然の血清型と比較して、広範囲の組織および細胞型にわたって、著しく高い感染率を示した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子をAAVベクターにクローニングし、3つのプラスミドを用いたHEK293T細胞への同時トランスフェクションによりルシフェラーゼ−AAVを生産した。トランスフェクションの70時間後に、AAVを回収し、製造業者の説明書に従って精製した。QuickTiterTM AAV定量化キットによってAAV力価を決定した。
(間接免疫蛍光顕微鏡法)
細胞(HEK293Tについては1ウェルあたり4×105細胞、DC2.4については1ウェルあたり3×105細胞)を2チャンバースライドに播種し、5%(vol/vol)CO2インキュベーター内で、37℃で一晩インキュベートした。形質導入から24時間後に、細胞をPBS(pH7.4)で洗浄し、上記のようにβ−ガラクトシダーゼ活性を調べるためにX−Gal染色した。次いで、細胞を4%(vol/vol)パラホルムアルデヒドでさらに固定し、0.1%Surfact-Amps X-100で透過処理した。ヤギ抗ルシフェラーゼ一次抗体(1:1,000希釈)またはマウス抗GFP一次抗体(1:2,000希釈)と共に37℃で1時間インキュベートした後、細胞を、それぞれ、ローダミン標識したウサギ抗ヤギ二次抗体(1:1,000希釈、KPL社)またはFITC標識したウサギ抗マウス二次抗体(1:2,000希釈)で探索した。倒立型AX10 Observer Dl顕微鏡で細胞を撮像し、β−ガラクトシダーゼ活性、eGFP蛍光およびローダミン蛍光を呈する細胞の画像を順次取得し、AxiovisionTMソフトウェアで解析した。
(ELISA)
96ウェルプレートの各ウェルを、コーティングバッファ(0.05M炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム、pH9.6)で希釈した0.1μgのタンパク質で、4℃で一晩被覆した。次いで、プレートをPBS(pH7.4)中の3%(wt/vol)BSAで、37℃で1時間遮断した。等容量の血清試料を希釈バッファ(PBS、pH7.4、1%BSAを含む)で連続的に希釈し、各ウェルに添加した。37℃で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファPBS−T(0.1%ツイーン20を含むPBS、pH7.4)で洗浄した。希釈バッファ中で1:2,000に希釈したヒツジ抗マウスIgG−HRP(Invitrogen社)を二次抗体として用いた。二次抗体と共に37℃で1時間インキュベートした後、TMB Microwell Peroxidase Substrate Systemを用いて発色させ、TMB BlueSTOP(KPL社)溶液を添加することによって反応を停止させた。波長650nmでのOD値をELISAリーダーによって読み取った。
(エリスポット)
合計55匹の5〜6週齢のBalb/cJマウスに、Fl−V DNAおよび/またはタンパク質を含むファージT4頭部粒子を筋肉内経路(i.m.)でワクチン接種した。21日目に、各ワクチン接種群における3匹のマウスから脾臓を摘出し、それぞれのマウスから脾細胞を単離し、群ごとにプールした。脾細胞(1mLあたり106)を3連で平板培養し、5μg/mLのFl−V、組換えマウスIFN−γまたは培地で刺激し、37℃で24時間インキュベートした。マウスIFN−γエリスポットキットを用いて、製造業者の説明書に従って、単一細胞脾臓懸濁液中のIFN−γ発現細胞の相対数を測定した。Immunospot Series 1 Analyzer Elispot Readerは、1ウェルあたりのスポット形成細胞数を定量化する。
(動物のライブイメージング系)
約2〜5×1011の頭部粒子を、各Balb/cJマウスに筋肉内経路(i.m.)で注射した。注射から6時間後、10時間後、16時間後、30時間後、50時間後、14日後および30日後に、マウスに30μgのRediJect D-Luciferin Ultraを腹腔内(i.p.)注射し、5分後に、マウスにイソフルオラン下で軽く麻酔をかけた後、IVIS 200生物発光および蛍光全身イメージングワークステーション(Caliper社)を用いてマウスのインビボイメージングを行った。生物発光スケールは、図に示されるが、放射輝度(radiance intensity)に基づいて段階付られた「強い」(赤色)から「最も強くない」(紫色)にわたっている。
(統計的解析)
結果を平均±SDとして表す。2つの群の間の統計的比較を、スチューデントのt検定によって評価し、多重比較のためにANOVAによって補正した。P<0.05の値であれば統計的有意性を示していると考えた。
以下の参考文献は、上記および/または本発明と共に用いられ得る技術を記載するために言及したものであり、そして以下の参考文献の内容および開示は参照により本明細書中に援用される:
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Claims (15)
- 標的細胞へのDNAのインビトロおよび/またはインビボ送達に使用するための組成物であって、ファージT4 DNAパッケージングマシンを含み、
該ファージT4 DNAパッケージングマシンが、
gp17パッケージングモーターにより結合された首部なしファージT4頭部にパッケージングされた1つまたはそれ以上のDNA分子;および
該首部なしファージT4頭部の表面にディスプレイされた1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質および/または1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質;
を含み、
該1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質が、Hocに融合された細胞ターゲティングリガンドを含み、そして該1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質が、Socに融合された細胞ターゲティングリガンドを含み;そして
該ファージT4 DNAパッケージングマシンが、標的細胞に結合し得る、
組成物。 - 前記1つまたはそれ以上のDNA分子が、2つまたはそれ以上の異なる遺伝子を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記2つまたはそれ以上の異なる遺伝子が、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)の遺伝子である、請求項2に記載の組成物。
- ファージT4 DNAパッケージングマシンを含む産物であって、
gp17パッケージングモーターにより結合された首部なしファージT4頭部にパッケージングされた1つまたはそれ以上のDNA分子と、
該首部なしファージT4頭部の表面にディスプレイされた1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質および/または1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質と、を含み、
該1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質が、Hocに融合された細胞ターゲティングリガンドを含み、そして該1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質が、Socに融合された細胞ターゲティングリガンドを含む、産物。 - 前記1つまたはそれ以上のDNA分子が、1つまたはそれ以上のプラスミド、PCR増幅されたDNAおよび/またはコンカテマー化されたDNAを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質が、Hocに融合された樹状細胞特異的CD40リガンドを含み、そして前記1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質が、Socに融合された樹状細胞特異的CD40リガンドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質が、Hocに融合されたプロテインGのIgG結合ドメインを有するHoc−GG融合タンパク質を含み、そして樹状細胞特異的レセプターモノクローナル抗体が、該Hoc−GG融合タンパク質への結合を介して前記首部なしファージT4頭部の表面にディスプレイされ;そして
前記1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質が、Socに融合されたプロテインGのIgG結合ドメインを有するSoc−GG融合タンパク質を含み、そして樹状細胞特異的レセプターモノクローナル抗体が、該Soc−GG融合タンパク質への結合を介して前記首部なしファージT4頭部の表面にディスプレイされる、
請求項1に記載の組成物。 - 前記1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質がHoc−CPP融合タンパク質を含み、そして前記1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質がSoc−CPP融合タンパク質を含む、請求項1から3および5から7のいずれかに記載の組成物。
- 前記Hoc−CPP融合タンパク質が、Hoc−CPP−Tatおよび/またはHoc−CPP−Antpを含み、そして前記Soc−CPP融合タンパク質が、Soc−CPP−Tatおよび/またはSoc−CPP−Antpを含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質または前記1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質の分子のコピー数と、前記首部なしファージT4頭部の表面上のHocまたはSoc結合部位のそれぞれの総数との比が、調整され得る、請求項1から3および5から9のいずれかに記載の組成物。
- 前記1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質または前記1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質の分子のコピー数と、前記首部なしファージT4頭部の表面上のHocまたはSoc結合部位のそれぞれの総数との比が、20:1である、請求項10に記載の組成物。
- 前記1つまたはそれ以上のDNA分子が、ペスト菌由来の組換えF1−V遺伝子を含む、請求項1から3および5から11のいずれかに記載の組成物。
- 前記1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質が、ペスト菌由来の組換えF1−Vタンパク質に融合されたHocを含み、そして該1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質が、ペスト菌由来の組換えF1−Vタンパク質に融合されたSocを含む、請求項12に記載の組成物。
- 前記1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質が、Hocに融合されたプロテインGのIgG結合ドメインを有するHoc−GG融合タンパク質を含み、そして樹状細胞特異的レセプターモノクローナル抗体が、該Hoc−GG融合タンパク質への結合を介して前記首部なしファージT4頭部の表面にディスプレイされ;そして
前記1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質が、Socに融合されたプロテインGのIgG結合ドメインを有するSoc−GG融合タンパク質を含み、そして樹状細胞特異的レセプターモノクローナル抗体が、該Soc−GG融合タンパク質への結合を介して前記首部なしファージT4頭部の表面にディスプレイされる、
請求項4に記載の産物。 - 前記1つまたはそれ以上のHoc融合タンパク質がHoc−CPP融合タンパク質を含み、そして前記1つまたはそれ以上のSoc融合タンパク質がSoc−CPP融合タンパク質を含む、請求項4に記載の産物。
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