CN115521881A

CN115521881A - 柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒表达系统、该表达系统制备的病毒样颗粒及手足口病疫苗

Info

Publication number: CN115521881A
Application number: CN202210732475.4A
Authority: CN
Inventors: 于佳平; 徐艳冰; 黄钰; 刘靖; 高超; 班靖洋; 姚文荣; 吴双; 陈健平; 洪坤学; 刘勇
Original assignee: Abzymo Biosciences Co ltd; Jiangsu Ruike Biotechnology Co ltd
Current assignee: Abzymo Biosciences Co ltd; Jiangsu Ruike Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2022-12-27
Also published as: CN115521938A; CN115521939A; CN115521921A; CN115518148A

Abstract

本发明提供了一种表达柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒的表达系统，在原有内源表达盒的基础上增加了外源表达盒，通过采用不同的启动子实现两套表达盒表达水平不同，大大提高了对外源蛋白的表达能力，能够同时在一个表达系统内分别表达CA16病毒的P1前体蛋白和3CD蛋白酶、并完成自组装，最终形成均一、稳定的CA16病毒VLPs。该表达系统对于目标外源蛋白的表达能力强、产物纯度高，能够大规模制备免疫原型优异的CA16VLPs，进而可以用于优质的CA16手足口病疫苗的工业化生产；用该病毒样颗粒与其他肠道病毒的免疫原性成分联合制作多价手足口病疫苗，可以针对多种流行毒株提供广谱而全面的保护，从而有效提高对手足口病的预防效果。

Description

柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒表达系统、该表达系统制备的病毒样颗粒及手足口病疫苗

技术领域

本申请属于生物医药工程领域，特别涉及一种柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒的表达系统以及由该表达系统制备的病毒样颗粒和疫苗。

背景技术

人类肠道病毒属于微小RNA病毒科，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和新型肠道病毒，基因组为单股正链RNA，只有一个开放阅读框，编码一个多聚前体蛋白；该多聚蛋白在宿主细胞内水解为3个前体蛋白P1、P2、P3，其中P1为结构蛋白、组成病毒衣壳，P2和P3位非结构蛋白、主要为病毒复制相关的酶类。P2和P3在水解时，先分别水解为2A和2BC、3AB和3CD，再进一步水解成2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D共7个终端成熟蛋白，其中3CD具有蛋白酶活性，能特异性剪切前体蛋白P1为VP0、VP1、VP3，形成五聚体亚单位；VP0在衣壳蛋白组装完成前会结合病毒RNA、将其包入衣壳蛋白内，自身水解成VP2和VP4，最终形成具有感染性的病毒颗粒。因此，在基于基因重组技术制备重组病毒样颗粒(VLPs)时，如何实现3CD蛋白酶与P1前体蛋白的共表达，是实现肠道病毒VLPs高效制备的关键。

手足口病是在5岁以下婴幼儿中流行的一种常见传染病，已被列入丙类传染病的名单中；具体表现为口痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症；个别重症患儿病情发展快，最终导致死亡。目前已知多种肠道病毒可引起手足口病，包括柯萨奇病毒A组4、5、6、9、10、16型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型等。为了预防相关疾病，研制出高效价的相关疫苗是本领域技术人员的重要任务。

病毒样颗粒是无病毒基因组的具有完整立体结构的衣壳蛋白组成的颗粒，既无感染性、又保留了衣壳蛋白上的抗原表位，同时结构稳定，因此相较于传统减毒或灭活疫苗更为安全有效。目前，对于此类需要将两种蛋白进行共表达的情况，有采用单载体共表达的方式，也有分别制备两种重组质粒载体后导入同一宿主内进行表达的方式。但无论哪种方式，最终表达的都只是P1前体蛋白和3CD蛋白酶，即表达的仅仅是过程产物、并不是终产物，不能确定最终能否形成均一、稳定、免疫原性突出且能够实现工业化生产的VLPs，因此无法保证3CD蛋白酶与P1前体蛋白能够实现共表达。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种柯萨奇病毒16型病毒样颗粒的表达系统以及由该表达系统制备的病毒样颗粒和疫苗。

本发明的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种柯萨奇病毒A型重组病毒样颗粒的表达系统，包括宿主细胞以及导入所述宿主细胞内的重组质粒载体，所述重组质粒载体可同时表达柯萨奇病毒16型的P1前体蛋白和3CD蛋白酶，并且所述重组质粒载体对所述P1前体蛋白和所述3CD蛋白酶的表达水平不同。

柯萨奇病毒16型(CA16)在病毒颗粒组装时，其前体蛋白P1需要在3CD蛋白酶的作用下分解，从而组装出柯萨奇病毒16型的VLPs(病毒样颗粒)，因此P1蛋白和3CD蛋白酶必须同时表达，方能实现VLPs的组装。

进一步地，所述重组质粒载体上同时具有用于表达所述P1前体蛋白的初始MOX表达盒以及用于表达所述3CD蛋白酶的外源表达盒，且所述外源表达盒的启动子选自MOX启动子以外的任意一种启动子。

采用上述表达系统，不仅能够实现3CD蛋白酶和P1前体蛋白的共同表达，还能有效实现3CD蛋白酶和P1前体蛋白的高效自组装，从而得到高表达量的VLPs。本发明构建特殊的表达载体(即重组质粒载体)，能够克服表达结果的不确定性，并实现目标蛋白3CD VLPs的高表达量，而且能够获得均一、稳定、免疫原性突出且能够实现工业化生产的CA16 VLPs。

进一步地，所述外源表达盒的启动子为CYC1启动子、GAPDH启动子、TEF1启动子或DAS启动子。

进一步地，所述外源表达盒的启动子为CYC1启动子。

采用上述启动子作为外源启动子，可以使该重组质粒载体更适合柯萨奇病毒16型相关蛋白的表达；优选地，该外源启动子选用CYC1启动子，此时VLP蛋白的表达率显著高于另外几种启动子。

进一步地，所述宿主细胞优选为汉逊酵母，特别是优选为至少一种物质的营养缺陷型，所述重组质粒载体上具有与所述物质相应的至少一种营养缺陷标记。

通过构建营养缺陷型的宿主细胞，可以将得到的表达系统通过相应的营养物质缺失型培养基进行筛选培养，从而得到本申请所需的表达系统。

进一步地，所述物质为尿嘧啶、亮氨酸、甲醇、pep蛋白酶、prc蛋白酶或kex蛋白酶。

进一步地，所述宿主细胞为亮氨酸营养缺陷型，所述重组质粒载体上具有营养缺陷标记Leu2。

经过大量实验的筛选和验证，确认Leu2营养缺陷标记相对更加适合该表达系统，便于进行高效筛选

进一步地，所述重组质粒载体上还具有至少一种报告基因表达盒，优选为Ura3表达盒、Zeocin表达盒、G418表达盒中的任一项。

进一步地，所述重组质粒载体上还具有自主复制序列。

通过对外源启动子进行优化筛选、并引入自主复制序列，可以获得高拷贝、高表达量的菌株，其外源多核苷酸拷贝数达到19个，柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒的表达水平可达到24.4μg/mL以上。

本发明另一方面提供了一种肠道病毒重组病毒样颗粒，该病毒样颗粒具体是由上述的任一种表达系统表达得到的。

本发明第三方面提供了一种预防或治疗手足口病的免疫组合物，该免疫组合物具体包含上述柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒。

采用上述方案得到的免疫组合物中，VLPs的纯度可达到99％，使得用其制成的疫苗具有优异的免疫原性。

进一步地，单次给药剂量的所述免疫组合物中，所述柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒的含量为5～60μg。

具体地，单次给药剂量中CA16 VLP的剂量可以等于或约等于5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg或60μg，或者可以为上述任意两个相邻的数字之间的任何数值。

本发明第四方面提供了一种手足口病疫苗，包含上述免疫组合物。

进一步地，上述疫苗还包含佐剂，所述佐剂包含氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾、钾明矾、3D-MPL、角鲨烯、吐温、生育酚、CpG、poly(I:C)以及QS21中的至少一种。

进一步地，所述佐剂包含氢氧化铝，所述手足口病疫苗中氢氧化铝的用量为1～2mg/ml。

进一步地，所述佐剂包含如下成分：

角鲨烯40～50mg/ml(优选为42.16mg/ml)、α-生育酚40～50mg/ml(优选为47.44mg/ml)、吐温80 15～25mg/ml(优选为19.44mg/ml)。

进一步地，所述佐剂包含如下成分：

角鲨烯35～45mg/ml(优选为39mg/ml)、司盘85 2.5～7.5mg/ml(优选为4.7mg/ml)、吐温80 2.5～7.5mg/ml(优选为4.7mg/ml)。

本发明第五方面提供了上述免疫组合物在制备多价手足口病疫苗中的应用，其中所述免疫组合物与另外一种或多种肠道病毒的免疫原性成分联合使用。

进一步地，所述肠道病毒包括柯萨奇病毒6型、柯萨奇病毒10型或肠道病毒71型中的至少一种，所述免疫原性成分为病毒样颗粒或灭活病毒。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种可以同时表达两种蛋白的表达系统，通过两组表达盒分别表达CA16的P1前体蛋白和3CD蛋白酶，能够同时在一个表达系统内完成P1前体蛋白和3CD蛋白的自组装，最终形成均一、稳定的CA16 VLPs。该表达系统对于目标外源蛋白的表达能力强、产物纯度高，能够大规模制备免疫原性优异的CA16 VLPs，进而可以用于优质的CA16手足口病疫苗的工业化生产；用该病毒样颗粒与其他肠道病毒的免疫原性成分联合制作多价手足口病疫苗，可以针对多种流行毒株提供广谱而全面的保护，从而有效提高对手足口病的预防效果。

附图说明

图1为实施例1中初始质粒载体pHP3.0的谱图；

图2为实施例3中pHP7.0-MOX-MOX的重组质粒载体谱图，其中初始MOX表达盒的启动子为MOX启动子，外源MOX表达盒的启动子为MOX启动子；

图3是实施例3中pHP7.0-MOX-CYC1的重组质粒载体谱图，其中初始MOX表达盒的启动子为MOX启动子，外源MOX表达盒的外源启动子为CYC1启动子；

图4是实施例7中重组CA16的VLP疫苗的Western Blot检测结果；

图5是实施例7中CA16型重组病毒样颗粒的电镜检测图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。需要说明的是，在本申请中，各质粒载体的命名仅为便于表述，无特殊含义。另外，实施例中采用的P1前体蛋白编码基因和3CD蛋白酶编码基因均来源于柯萨奇病毒16型在国内的流行毒株，其中CA16优选为GQ429221.1，其P1蛋白的序列为SEQ ID NO.1，3CD蛋白酶的序列为SEQ ID NO.2。

实施例1构建重组质粒载体

在实施例中，质粒载体由基因序列为SEQ ID No.3的初始质粒载体pHP3.0构建而来，其本身含有Ura3表达盒、Zeocin表达盒、G418表达盒以及一个用于表达外源基因的初始MOX表达盒，其谱图如图1所示。以质粒载体pHP3.0构建重组质粒载体的具体方法如下：

1.合成MOX启动子的引物TT-F-NotI、TT-R和MOX终止子的引物MOX-F、MOX-R-KpnI，各引物的基因序列分别如SEQ ID No.4～7所示；PCR分别扩增两段：外源MOX启动子和外源MOX终止子，再通过PCR将两段连接起来，胶回收后用NotI+KpnI酶切回收。

2.质粒载体pHP4.0的构建：pHP3.0经NotI+KpnI酶切后连接外源MOX表达盒，挑克隆，酶切鉴定正确后获得质粒载体pHP4.0。

3.重组质粒载体的构建

3.1将质粒载体pHP4.0和CA16型P1前体蛋白编码基因(基因序列如SEQ ID No.8所示)均以EcoVI+EcoRV双酶切后经PCR连接，转化后挑取单克隆抗体的菌落并鉴定正确后得到pHP4.0-P1质粒载体；将pHP4.0-P1质粒载体和CA16型3CD蛋白酶编码基因(基因序列如SEQ ID No.9所示)均以SpeI+SalI双酶切后经PCR连接，转化后挑取单克隆抗体的菌落并鉴定正确后得到重组质粒载体pHP4.0-P1-M3CD。此时，该重组质粒载体的外源启动子为MOX启动子。

采用如下步骤对该重组质粒载体进行鉴定：将1μL重组质粒载体导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将感受态细胞冰浴30min后再置于42℃水浴中热击90s，之后在冰浴中静置3min；随后在大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入850±100μL的LB培养基，在37℃、160±10rpm的摇床培养45min，直接取100μL培养液涂平板，并在37℃倒置培养过夜，最后取单克隆抗体的菌落并鉴定正确后即得到上述重组质粒载体。

3.2对重组质粒载体pHP4.0-P1-M3CD进行KpnI+SalI双酶切，以去除外源MOX表达盒内的外源MOX启动子，之后连接CYC1启动子(引物序列如SEQ ID No.10～11所示)，最终实现将表达3CD蛋白酶的1启动子替换为CYC1启动子，即得到重组质粒载体pHP4-P1-C3CD，最后采用步骤3.1中的方法对该重组质粒载体进行鉴定。

实施例2含有自主复制序列的重组质粒载体的构建

将实施例1中得到的重组质粒载体pHP4.0-P1-M3CD和pHP4.0-P1-C3CD分别经NotI+SacI双酶切后与自主复制序列HARS1基因片段((引物序列如SEQ ID No.12～13所示))连接，分别构建获得重组质粒载体pHP5.0-P1-M3CD和pHP5.0-P1-C3CD。

实施例3含有自主复制序列和营养缺陷标记Leu2的重组质粒载体的构建

将实施例2中得到的重组质粒载体pHP5.0-P1-M3CD和pHP5.0-P1-C3CD上分别插入Leu2表达盒(表达盒的酵母亮氨酸启动子基因序列委托北京擎科生物科技有限公司合成)，具体过程如下：

将亮氨酸启动子基因片段经BamHⅠ/BglⅡ双酶切切下，将实施例2得到的重组质粒载体pHP5.0-P1-M3CD和pHP5.0-P1-C3CD分别用BglⅡ酶切，后经CIAP去磷酸化，之后将亮氨酸启动子基因片段与去磷酸化后的上述重组质粒载体连接，分别挑选单克隆抗体的菌落并进行PCR鉴定，测序验证正确即获得重组质粒载体pHP7.0-P1-M3CD和pHP7.0-P1-C3CD，具体谱图如图2～3所示。

实施例4 CA16型病毒样颗粒表达系统的构建及VLP的表达

从ATCC购买汉逊酵母原始菌株ATCC26012，委托北京微生物研究所进行Leu2基因敲除，得到亮氨酸营养缺陷型菌株HP15。将实施例3中得到的重组质粒载体pHP7.0-P1-M3CD和pHP7.0-P1-C3CD分别电转化至HP15汉逊酵母菌株中，获得相应的CA16型病毒样颗粒表达系统。具体方法如下：

1.重组质粒载体pHP7.0的扩大制备

将1μL重组质粒载体pHP7.0加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并冰浴30min。冰浴后将大肠杆菌DH5α感受态细胞置于42℃水浴中热击90s，然后在冰浴中静置3min；随后在大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入850±100μL的LB液体培养基，在37℃160±10rpm的摇床培养45min。然后进一步扩大培养。扩大培养后使用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit试剂盒(购自Omega Bio-Tek公司)提取质粒，并用Bgl II进行单酶切，随后用E.Z.N.A Gel ExtractionKit试剂盒(购自Omega Bio-Tek公司)进行回收后，用50μL预热至55℃的无菌水进行洗脱，通过测定OD_260nm进行DNA定量，并将线性化的片段稀释至100ng/μL，最后保存于-20℃冰箱中，备用。

2.汉逊酵母细胞的处理

挑取HP15汉逊酵母单菌落，接入含5ml的YPD液体培养基的试管中，30℃下培养12h；取菌液5ml转接至200ml的YPD培养基中，30℃培养4～6h，至OD_600nm约为1.3，用200ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(含25mmol/L，pH7.5)重悬菌体，充分混匀，于30℃孵育30min，并置于5000rpm下离心10min，弃去上清、保留沉淀(即菌体)。用预冷的STM溶液(即蔗糖-Tris-MgCl₂溶液)200mL洗菌体，菌体吹吸均匀，于4℃、5000rpm离心3min，弃上清，留沉淀(即菌体)。用冰冷的STM溶液100mL重悬菌体，于4℃5000rpm的条件下离心3min，弃上清，留沉淀(即菌体)。根据菌体量用50-200μL冰冷的STM溶液重悬菌体，并将菌液转移至高压后的离心管中，冰浴，得到待电转化的菌液。

3.电转化导入重组质粒载体pHP7.0

按照重组质粒载体:菌液＝1:2的体积比加入重组质粒载体15μL和菌液30μL，充分吹吸均匀，得到重组质粒载体-菌液混合液，并置于冰浴中待转化。将事先用酒精浸泡、并经紫外照射后于-20℃冷藏的电转杯取出，加入重组质粒载体-菌液混合液。按电压2500V、电阻150Ω、电容50μF的条件对重组质粒载体-菌液混合液进行电击，电击后迅速加入1mL已平衡至室温的YPD溶液，轻轻混匀后转移至EP管中。将电转后的重组质粒载体-菌液混合液于30℃水浴中放置2h，每隔15min轻轻颠倒3次；随后将已孵育2h的重组质粒载体-菌液混合液，在5000rpm的条件下离心10min，弃上清；最后用200μL的YPD溶液重悬菌体，并以100μL/板涂布于含0.5mg/mL Zeocin同时不添加亮氨酸的YPD平板中，于30℃倒置培养3-7天后有单菌落长出，说明重组质粒载体导入成功，得到能克服亮氨酸缺乏而生长的重组汉逊酵母单菌株。

4.重组汉逊酵母菌株的传代和稳定

挑取第3步中长出的重组菌株单菌落，接种于5mL含0.5mg/mL Zeocin的YPD液体培养基中，于30℃、200rpm摇床培养(24-48h)至OD值达50后，以1:1000的含量比例转接于5mL含0.5mg/mL Zeocin的YPD液体培养基中，培养至OD值达50后，再以1:1000的比例转接于5mL含0.5mg/mL Zeocin的YPD液体培养基中，以此类推，连续传10次并进行菌种的保存。保存体系为菌液:60％甘油(v/v)＝1:1，并根据需要量保存菌种，通常为500μL菌液+500μL60％甘油。将传至10次的重组菌株接入5mL不含Zeocin抗性的YPD液体培养基中，于30℃、200rpm摇床培养至OD值达50后，以1:1000的体积比例转接于5mL YPD液体培养基中；以此类推，并在不含Zeocin抗性的YPD液体培养基中连续传5次。将稳定后的菌液涂布含16mg/mL G418的YPD平板，于30℃倒置培养3天。

从含16mg/mL G418的YPD平板中挑取多个重组菌株的单菌落，接入含5mL的YPG液体培养基的试管中，30℃培养24h；将菌液转接于含30mL YPM诱导培养基的100mL三角瓶中，初始密度为OD_600nm＝1，于30℃摇床诱导72h，每隔12h于菌液中加入终浓度为0.5％(v/v，％)的甲醇溶液。

取10mL诱导后的菌液转移至50mL的离心管中，于10000rpm离心10min，弃上清；以50mL的细胞裂解液重悬菌体沉淀，充分混匀后，在超声仪中参照功率20％、超声总时间20min、开2s、关3s的超声破碎程序进行菌体破碎，破碎过程中需保持冰浴；将超声破碎的菌液，于10000rpm离心10min，收集上清后进行检测。

实施例5 CA16型手足口病疫苗的制备

重组疫苗的制备包括利用重组汉逊酵母菌株进行发酵和CA16 VLPs的分离纯化过程，具体包括以下步骤：

(1)重组汉逊酵母表达菌株的发酵

种子培养：将实施例4中获得的重组汉逊酵母菌株(将重组质粒载体pHP7.0-P1-C3CD经电转化至实施例3获得的HP15汉逊酵母菌株后获得)经种子培养，种子培养过程为：

发酵种子液：取1支冻存甘油菌(HP-1#/pRMHP2.1-58hp)，融化后吸取50μL接入5mLYPD培养基中，于30℃、200rpm摇床培养(20-24h)至细菌菌体光密度A_600nm约2-5，检定合格后各吸取1mL接入2瓶500mL YPD培养基中，于30℃、200rpm摇床培养20-24h至细菌菌体光密度A_600nm约为15-20，检定合格后作为发酵种子液待用。

随后将200mL的种子液接种到30L发酵罐内进行发酵培养。发酵初始培养基为复合培养基(具体培养基成分为(wt)：硫酸钾1.21％，七水合硫酸镁0.99％，85％浓磷酸1.78％，氢氧化钾0.28％，蛋白胨0.33％，酵母粉0.67％，甘油0.67％)，温度设定为30℃，pH5.0，控制通风和转速，使溶氧(DO)不低于20％。初始培养基中的碳源耗尽后，开始流加含1.2％(wt，％)的PTM(CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，KI 0.088g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，CoCl₂·6H₂O 0.5g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7H₂O 65.0g/L，H₂SO₄5mL/L，Biotin 0.2g/L)的甘油补料培养基，甘油流加速度与溶氧关联，流加过程中溶氧(DO)不低于20％。待菌体湿重达到150-200g/L后调整pH至6.0。饥饿0.5-1h后开始流加含1.2％(wt，％)的PTM的甲醇进行诱导：诱导过程中控制甲醇浓度不高于15g/L，溶氧(DO)不低于20％，诱导时间为40-50h。

(2)发酵液中CA16 VLPs的纯化

菌体收获：在6000g的离心力下离心25min，弃上清，收获菌体。

重悬菌体：用Q buffer(50mM Tris缓冲液，5％(v/v，％)甘油，2mM EDTA)，pH8.5，调整湿菌重为200g/L，重悬菌体。

高压均质：使用高压均质机，其工作压力为1200bar，进行细胞破碎3-5次。

除细胞碎片：将上述经细胞破碎的菌液以12000r/min的转速离心25min，收集上清，随后将上清过0.45μm滤膜。

超滤：将经0.45μm滤膜处理的滤液使用750K中空纤维超滤，透过通量20LMH，并最终还原至原体积。

阴离子层析：使用Q Sepharose HP填料，用50mM Tris、pH8.5进行柱子平衡，随后加入上述超滤处理后滤液至阴离子层析柱内，随后用1M NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱液后收集UV_280nm处的紫外吸收目的峰。

超滤浓缩：将经过阴离子交换层析后的样品使用300K膜包浓缩10倍，得到浓缩液。

分子筛层析：分子筛层析柱使用的是ephacryl S-300HR填料，以50mM PB(pH6.8-7.2)平衡柱子后，于柱子内加入浓缩液以进行分子筛层析，收集第一个UV_280nm紫外吸收峰。

羟基磷灰石II层析：以50mM PB平衡柱子，将分子筛层析后的样品上样，随后采用500mM PB梯度洗脱，收集UV280nm处的紫外吸收目的峰。

超滤浓缩换液：将经羟基磷灰石II层析后样品，使用300K膜包，透过通量20LMH，用PBS(pH7.4)进行溶液置换，并浓缩至适当体积。

终端除菌：使用0.22μm除菌滤器，终端除菌过滤，获得VLP疫苗原液(内含有CA16型重组病毒样颗粒)。

(3)将含有CA16 VLPs的疫苗原液与氢氧化铝佐剂生理盐水溶液按照CA16VLPs与铝质量为1:10的比例进行吸附配制，即可制得重组CA16的VLP疫苗，并在4℃保存待用。

随后对制备得到的重组CA16的VLP疫苗进行相关检测。

疫苗的检测

(1)Western Blot检测

将实施例8制备得到的重组CA16的VLP疫苗进行HPLC和Western Blot检测，其中的HPLC检测条件为：采用TSKgel G5000PW凝胶柱检测，使用10mM PB作为流动相，流速1mL/min。结果显示保留时间6.9min处有目的峰，实施例8制备得到的重组CA16的VLP疫苗中CA16VLPs的纯度为99％。

对疫苗进行Western Blot印记检测，上样量25μL，一抗采用GeneTex公司目录号GTX132600的抗体，以1:6000的体积比用无菌去离子水稀释；二抗为市售山羊抗兔抗体，以1:1000的体积比用无菌去离子水稀释，采用DAB(二氨基联苯胺)方法进行显色。结果如图4所示，各泳道中均出现清晰的条带。将出现条带的样品送至扬州大学进行电镜检测，结果如图5所示，可以看到20-30nm左右的病毒样颗粒，表明该疫苗中存在CA16的VLP颗粒。

(2)重组CA16的VLP疫苗的免疫原性检测

取50只BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄，购自中国医学科学院实验动物研究所)，每组10只动物，按照间隔14天(0和14天)的免疫程序，经腹腔途径进行免疫。所有小鼠共分5组进行免疫：阴性对照组(0.9wt％氯化钠组)和佐剂对照组以及高、中、低三个疫苗剂量组。其中，阴性对照组为每只小鼠接种0.5mL0.9wt％的氯化钠，佐剂对照组为每只小鼠接种0.5mL氢氧化铝佐剂(500μg/只)，高、中、低疫苗剂量组均含有500μg氢氧化铝佐剂，VLP原液中CA16 VLPs的分别为0.01μg、0.1μg和0.5μg，接种体积为0.5mL。首次免疫后28d采集血液，37℃放置1h，4℃放置0.5h，8000rpm离心10min分离获取血清。

采用ELISA法测定CA16 VLPs免疫小鼠后的血清转阳率，采用市售的ELISA检测试剂盒进行检测。具体步骤为：酶标板贴封板膜，置于37℃隔水式培养箱孵育85-90min。用包被液稀释实施例8制备纯化的CA16 VLPs至1μg/mL，向酶标板每个孔中各加100μL，4℃包被过夜。除去包被液，洗板。每孔加入300μL封闭液(5％脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2h。除去包被液，将稀释好的血清样品加入酶标板内，100μL/孔，平行两孔；空白对照孔加入相同体积样品稀释液，37℃保温1h，除去血清液，洗板。然后向每孔加入用酶标稀释液稀释5000倍的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体100μL，37℃保温0.5小时后除去酶标液，洗板；然后向每孔中加入100μL显色液，室温避光孵育10min，每孔加入50μL终止液终止反应，于酶标450nm测定吸光度值。

Cutoff值为

阴性对照组OD值；疫苗组血清样品OD值大于Cutoff，即表明疫苗组抗体阳转，OD值小于Cutoff值的血清样品判定为阴性。根据检测结果，抗体阳转率如表1所示。三个检测组的阳转率结果如表1所示，CA16 VLPs的剂量在0.01μg、0.1μg和0.5μg时，其阳转率均为100％，该结果表明，本申请制备得到的重组CA16的VLP疫苗具有优异的免疫原性。

表1抗体阳转率计算结果

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 江苏瑞科生物技术股份有限公司

北京安百胜生物科技有限公司

<120> 柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒表达系统、该表达系统制备的病毒样颗粒及手足口病疫苗

<150> CN202210057187.3

<151> 2022-01-19

<150> CN202110707967.3

<151> 2021-06-24

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A)

<400> 1

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Ser Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ala Tyr Ala Ala Ser Ala Gly Arg Gln Asp Met Ser Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Asp Pro Val Met Asp Val Ile His Glu Met

50 55 60

Ala Pro Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Ile Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Phe Thr Leu Asp Thr Lys Ser Trp Ala Lys Asp Ser

130 135 140

Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Val Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Val His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val Leu Gly Thr Ile Ala Gly Gly Thr

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Gly Asn Glu Asn Ser His Pro Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Pro Gly Gln

210 215 220

Val Gly Ala Val Leu Thr His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro

225 230 235 240

Leu Ser Gln Leu Thr Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr

245 250 255

Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Val Pro Tyr Met Asn Thr Val Pro Phe

260 265 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Ile Pro Val

275 280 285

Val Pro Leu Asp Phe Asn Thr Gly Ala Thr Ser Glu Ile Pro Ile Thr

290 295 300

Val Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala

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Val Lys Gln Gly Ile Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe

325 330 335

Leu Thr Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe His

340 345 350

Pro Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Asn Leu Leu Glu

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Ile Cys Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Leu Lys Thr Asn

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Glu Thr Thr Pro Met Gln Arg Leu Cys Phe Pro Val Ser Val Gln Ser

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Lys Thr Gly Glu Leu Cys Ala Ala Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asp

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Gln Trp Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Ala Gly Ser Phe

435 440 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Asn

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Val Pro Ala Asp Arg Ile Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp

465 470 475 480

Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Val Pro Trp Ile Ser

485 490 495

Asn Thr His Tyr Arg Ala His Ala Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Tyr

500 505 510

Thr Thr Gly Ile Ile Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro

515 520 525

Ile Gly Ala Pro Thr Thr Ala Tyr Ile Val Ala Leu Ala Ala Ala Gln

530 535 540

Asp Asn Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Thr Glu Asp Ile Glu Gln

545 550 555 560

Thr Ala Asn Ile Gln Gly Asp Pro Ile Ala Asp Met Ile Asp Gln Thr

565 570 575

Val Asn Asn Gln Val Asn Arg Ser Leu Thr Ala Leu Gln Val Leu Pro

580 585 590

Thr Ala Ala Asn Thr Glu Ala Ser Ser His Arg Leu Gly Thr Gly Val

595 600 605

Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser

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Asp Lys Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn His His Ser Thr

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Gln Glu Thr Ala Ile Gly Asn Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Ser

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Asn Trp Asp Ile Asp Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys

675 680 685

Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Val

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Ala Lys Pro Asn Gly Glu Leu Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Tyr

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Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp

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Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Ile

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Arg Thr Val Gly Thr Glu Lys Ser Pro His Ser Ile Thr Leu Arg Val

805 810 815

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Ile Lys Cys Thr Ser Thr Ser Arg Asp Lys Ile Thr Thr Leu

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<210> 2

<211> 646

<212> PRT

<213> 柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A)

<400> 2

Met Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Ile

1 5 10 15

Arg Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg

20 25 30

Asp Arg Leu Ala Ile Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile

35 40 45

Trp Val Glu His Lys Leu Ile Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val

50 55 60

Asp Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Val Thr Leu Asp Thr

65 70 75 80

Asn Glu Lys Phe Arg Asp Val Thr Lys Phe Ile Pro Glu Thr Ile Thr

85 90 95

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Ser Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys

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Ala Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Ile Ile Gly

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Ile His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys

165 170 175

Arg Gly Tyr Phe Ala Ser Glu Gln Gly Glu Ile Gln Trp Met Lys Ser

180 185 190

Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys

195 200 205

Leu Glu Pro Ser Ala Phe Tyr Asp Val Phe Glu Gly Ser Lys Glu Pro

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Ala Val Leu Thr Ser Lys Asp Pro Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln

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Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly Asn Thr Leu His Glu Pro Asp Glu

245 250 255

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Asp Ile Asn Thr Asn Lys Met Ser Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr

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Ser Ala Leu Gly Val Lys Lys Arg Asp Ile Leu Asp Pro Ile Thr Arg

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Asn Pro Gly Thr Val Thr Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val

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Leu Glu Val Val Leu Arg Glu Ile Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Val Ser

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Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His

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Asn Gly Lys Glu Glu Tyr Glu Lys Phe Val Ser Thr Ile Arg Ser Val

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Asn Trp Leu Glu Leu Phe

645

<210> 3

<211> 4799

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaacagaag gaagaacgaa ggaaggagca cagacagagg aaaacggaag agggaagaaa 60

cagaaagccc agacaaccca acgcacagaa caaaaaccgg aggaaacgaa gaaaacagcg 120

aaagcacaaa aggaacggcg caccaccagc cggcgccaag caaaacagca cgaaaagcaa 180

acaaacgggc caggagcgac caccaaggaa acggagagga agcaaggccc aaaagacaaa 240

aacacaggga cacgacgacc aggagggcac agaagccgca aaggcaaccg ccaagacaaa 300

cccgaagaca gaaaagcgac aggaaacagc aaagcagacc gcggggaaca gaaagcagaa 360

gggcagacaa cgaagcacac ggggggggcc caggagagcg ggaagcaggc ggcagaagaa 420

gaacaaagga accagaggcc gagagcagaa gcagcaaggg ccccacacgg agaaaacaag 480

ggacggacag cgaagagcga caaagagacg gcagccaaag agacaggggg aagagagaag 540

gacgagggaa gacacccggg gggagagaca agggagacgc agggcaacag aagaaccggg 600

agagggccac aggacgacaa agggaagagg acagcaaagg gaagggagca aggagagggg 660

aacgacagaa aagcaggcgg gaagcaagag aagagcggcc agcaaaacaa aaaacgaaaa 720

gaaagcagaa caaaccacaa aagagccaaa aaacagaacc cgggaaccgg cgaagaaaag 780

acaagcggac cagccgcaca acaagccaga caaagaaaaa gaaacaacaa gcgacggaca 840

aaacacggca agaacggcaa gaaaacgacc acaaggaggg ccaccagagc caacaacggg 900

aaacgcgccg aggccgcgaa aaccaacagg agcgaaaggg aaaagggccg cgaaagcggg 960

caacagggcg acaacacgag agggaagccc gagcgccaga ggcgaaacag gcaaaggagc 1020

ggccaagaga cagagagagg cagacaaacg gcgacggaaa gcccccgacc acaagcaacc 1080

gacccgagag caggaccacc acgcgacccc gggaaaacag caccaggaag aagaaaccga 1140

cagggaaaaa ggagcgcggc aggccgcgcc gggcacgacc ggaagccaac agcgacgcga 1200

cgccgccagg cgcaacacga agaaaacggg ggagcgagga gagacgagcg aaggcggccg 1260

gaacaagcgg aaagaaagca aagcgccacc accggacagc gcaccaggga ccacgaaacc 1320

agacgagggg aaaaaaggga gagggacgag cggaacgcag accgaaccag gacgccacca 1380

ggaacgcccg ggagccccaa cagaaacggc caaaaaagga gaaaccgaag aaaaagcagc 1440

agagccgaga gcaagcacgg cccacacaaa cggcaacgaa agaaggagaa aaaaagcaac 1500

aacgcaaaga cgcgccggca aacggcgcca gaaaaaaaca ggcgcagaaa aaagaacccc 1560

agcaccagga gggccgagac cgcggagaac gaccccgacg cggagaacga ccccgagcgc 1620

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agagccggac gcggaacgag ggggccacaa gccggcggcg aggcgcggcg ccgcccgaga 2100

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gcagcggagg gcaggaggcc ggcggcgagc cacaacggac cgccaaccgg acggcgcacc 2520

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caaaaggcca ggaaccgaaa aaggccgcgg cggcgccaag gcccgccccc cgacgagcac 3360

acaaaaacga cgccaagcag aggggcgaaa cccgacagga caaaagaacc aggcgccccc 3420

ggaagccccc ggcgccccgc cgacccgccg caccggaacc gccgcccccc cgggaagcgg 3480

gcgcccaagc cacgcgagga ccagcgggag gcgcgcccaa gcgggcgggc acgaaccccc 3540

cgcagcccga ccgcgcgcca ccggaacacg cgagccaacc cggaagacac gacacgccac 3600

ggcagcagcc acggaacagg aagcagagcg aggagaggcg ggcacagagc gaagggggcc 3660

aacacggcac acagaagaac agaggacgcg ccgcgaagcc agacccggaa aaagagggag 3720

ccgaccggca aacaaaccac cgcggagcgg ggggcaagca gcagaacgcg cagaaaaaaa 3780

ggaccaagaa gaccgaccac ggggcgacgc cagggaacga aaaccacgaa gggaggcaga 3840

gaacaaaaag gaccaccaga ccaaaaaaaa gaagaaacaa caaagaaaga gaaacggcga 3900

ggaccacaac caaaaaagaa aggcaggaag aagaacaaaa aacaagcaag caacaaagaa 3960

acaggcagcc aaggaaacac gaaagcgcga caaaaaagac gaggaacccc aacaaaaaac 4020

agaagccgaa aagagagagg ccggccagcc gccccggcca cgaaggcacg caggccggcc 4080

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ccaggccagg gggccggcac caccggccgg accgcgcgag aacagggcac gcgcccggac 4260

cacaccggcg aagcgcccca cgaagcccgg gagaacccga gccggcggcc agaaccgacc 4320

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agggcaacgc gaggcacccc ccgggcccgc cccgggcacg gagagcagac caacggaac 4799

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaggaaaaaa ggcggccgcc ccgggctgca gatcga 36

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaggtcgac actagtaagg agacgtggaa ggacata 37

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttactagt gtcgaccttt agattgatgt caccaccgtg cac 43

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggggtacca acgatctcct cgagctgct 29

<210> 8

<211> 2611

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaattcaaaa acaaaatggg ctcgcaggtg tctacccaga gatcgggttc tcacgagaac 60

tccaactcgg cctctgaggg atctaccatc aactacacca ccattaacta ctacaaggac 120

gcttacgccg cttctgccgg tagacaggac atgtcccagg acccaaagaa gttcaccgac 180

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gaggccgcta acatcgtgat tgcctacggt gaatggccag agtactgtcc tgacaccgac 360

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gacgctggca tccctctgtc tcagctgacc gtttgcccac accagtggat taacctgaga 780

accaacaact gtgccaccat cattgtgcca tacatgaaca ccgttccttt cgactccgct 840

ctgaaccact gcaactttgg cctgctggtt atcccagtgg ttcctctgga cttcaacacc 900

ggtgctacct cggagatccc aattaccgtg accatcgccc ctatgtgtgc cgagtttgct 960

ggactgagac aggccgttaa gcagggtatt ccaaccgagc tgaagcctgg caccaaccag 1020

ttcctgacca ccgacgacgg agtgtctgct ccaattctgc ctggttttca cccaacccca 1080

cctatccaca ttcctggaga ggttcacaac ctgctggaga tttgcagagt ggagactatt 1140

ctggaggtta acaacctgaa gaccaacgag actaccccaa tgcagagact gtgcttccct 1200

gtgtctgttc agtccaagac cggagagctg tgtgccgctt ttagagccga cccaggaaga 1260

gacggtcctt ggcagtctac catcctgggt cagctgtgta gatactacac ccagtggtct 1320

ggctccctgg aggtgacctt catgtttgct ggttccttca tggccaccgg caagatgctg 1380

attgcctaca ccccacctgg tggcaacgtt cctgctgaca gaatcaccgc catgctgggc 1440

acccacgtga tttgggactt cggactgcag tcgtctgtta ccctggtggt tccatggatc 1500

tccaacaccc actacagagc ccacgccaga gctggttact ttgactacta caccaccggc 1560

atcattacca tctggtatca gaccaactac gtggttccaa tcggcgcccc taccaccgct 1620

tacattgtgg ccctggccgc tgcccaggac aacttcacca tgaagctgtg caaggacacc 1680

gaggacatcg agcagaccgc taacattcag ggcgacccaa tcgccgacat gattgaccag 1740

accgtgaaca accaggttaa cagatcgctg accgctctgc aggtgctgcc taccgctgcc 1800

aacaccgagg cctcctcgca cagactggga accggtgtgg ttccagctct gcaggctgcc 1860

gagactggcg cttcttccaa cgcctcggac aagaacctga tcgagactag atgcgttctg 1920

aaccaccact ctacccagga gactgctatt ggtaacttct tttccagagc cggcctggtg 1980

tcgatcatta ccatgccaac caccggaacc cagaacaccg acggttacgt taactgggac 2040

atcgacctga tgggatacgc ccagctgaga agaaagtgtg agctgttcac ctacatgaga 2100

tttgacgctg agttcacctt tgtggttgcc aagccaaacg gagagctggt gcctcagctg 2160

ctgcagtaca tgtacgttcc acctggcgcc ccaaagccta cctcgagaga ctctttcgct 2220

tggcagaccg ccaccaaccc ttctgtgttt gttaagatga ccgacccacc tgctcaggtg 2280

tccgttccat tcatgtcccc tgcctcggct taccagtggt tctacgacgg ctaccctacc 2340

tttggagagc acctgcaggc caacgacctg gactacggac agtgcccaaa caacatgatg 2400

ggcaccttct cgatcagaac cgtgggcacc gagaagtctc cacactccat taccctgaga 2460

gtgtacatga gaatcaagca cgttagagct tggattccaa gacctctgag aaaccagcca 2520

tacctgttca agaccaaccc taactacaag ggcaacgaca tcaagtgtac ctcgacctct 2580

agagacaaga ttaccaccct gtaatgatat c 2611

<210> 9

<211> 1963

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattcaaaa acaaaatggg accatccctg gacttcgccc tgtcgctgct gagaagaaac 60

attagacagg ttcagaccga ccagggacac tttaccatgc tgggtgtgag agacagactg 120

gccatcctgc caagacactc tcagcctggc aagaccattt gggtggagca caagctgatc 180

accgttctgg acgctgtgga gctggttgac gagcagggcg tgaacctgga gctgaccctg 240

gttaccctgg acaccaacga gaagttcaga gacgttacca agtttattcc tgagactatc 300

accggcgcct ctgacgctac cctggttatc aacaccgagc acatgccatc catgttcgtg 360

cctgttggcg acgtggttca gtacggattt ctgaacctgt ccggcaagcc aacccacaga 420

accatgatgt acaacttccc taccaaggct ggccagtgcg gcggagtggt tacctcggtg 480

ggaaagatca ttggtattca catcggtggc aacggcagac agggattctg tgccggcctg 540

aagagaggat actttgcttc ggagcaggga gagattcagt ggatgaagtc taacaaggag 600

actggcagac tgaacatcaa cggaccaacc agaaccaagc tggagccttc tgccttctac 660

gacgtgtttg agggctcgaa ggagccagct gttctgacct cgaaggaccc tagactggag 720

gtggacttcg agcaggccct gttttccaag tacgttggta acaccctgca cgagccagac 780

gagtacgtga cccaggccgc tctgcactac gctaaccagc tgaagcagct ggacattaac 840

accaacaaga tgtccatgga ggaggcctgc tacggcaccg agtacctgga ggctatcgac 900

ctgcacacct ctgccggtta cccatactcc gctctgggcg tgaagaagag agacattctg 960

gaccctatca ccagagacac caccaagatg aagttctaca tggacaagta cggcctggac 1020

ctgccttact cgacctacgt taaggacgag ctgagatcgc tggacaagat taagaagggc 1080

agatccagac tgatcgaggc ctcgtctctg aacgactcgg tgtacctgag aatgaccttc 1140

ggacacctgt acgagacttt tcacgctaac cctggcaccg tgaccggctc cgctgttgga 1200

tgtaaccctg acgtgttctg gtcgaagctg ccaattctgc tgcctggatc gctgttcgcc 1260

tttgactact ctggttacga cgcttccctg tcgccagttt ggtttagagc cctggaggtg 1320

gttctgagag agatcggcta ctcggaggag gctgtgtctc tgattgaggg aatcaaccac 1380

acccaccacg tgtacagaaa cagaacctac tgcgttctgg gaggtatgcc ttctggttgt 1440

tccggcacct cgattttcaa ctcgatgatc aacaacatca ttatcagaac cctgctgatt 1500

aagaccttta agggtatcga cctggacgag ctgaacatgg tggcctacgg cgacgacgtt 1560

ctggcttctt acccattccc tattgactgc tccgagctgg ccagaaccgg caaggagtac 1620

ggcctgacca tgaccccagc tgacaagtct ccttgtttta acgaggttac ctgggagaac 1680

gccaccttcc tgaagagagg ctttctgcca gaccaccagt tcccttttct gatccaccca 1740

accatgccta tgagagagat tcacgagtcg atcagatgga ccaaggacgc cagaaacacc 1800

caggaccacg tgagatcgct gtgcctgctg gcttggcaca acggaaagga ggagtacgag 1860

aagttcgtgt ctaccattag atccgttcca atcggtagag ccctggctat ccctaacttc 1920

gagaacctga gaagaaactg gctggagctg ttttaatgat atc 1963

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgcgtcgac tattaattta gtgtgtgtat ttg 33

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggggtacca gcgttggtgg atca 24

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagctcagct tctggtaaac gttgtagta 29

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaggaaaaaa gcggccgcca tcgactcccg cgactc 36

Claims

1.一种表达柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒的表达系统，包括宿主细胞以及导入所述宿主细胞内的重组质粒载体，其特征在于，所述重组质粒载体可同时表达柯萨奇病毒16型的P1前体蛋白和3CD蛋白酶，并且所述重组质粒载体对所述P1前体蛋白和所述3CD蛋白酶的表达水平不同。

2.如权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述重组质粒载体上同时具有用于表达所述P1前体蛋白的初始MOX表达盒、以及用于表达所述3CD蛋白酶的外源表达盒，且所述外源表达盒的启动子选自MOX启动子以外的任意一种启动子。

3.如权利要求2所述的表达系统，其特征在于，所述外源表达盒的启动子为CYC1启动子、GAPDH启动子、TEF1启动子或DAS启动子。

4.如权利要求3所述的表达系统，其特征在于，所述外源表达盒的启动子为CYC1启动子。

5.如权利要求2所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞为至少一种物质的营养缺陷型，所述重组质粒载体上具有与所述物质相应的至少一种营养缺陷标记。

6.如权利要求5所述的表达系统，其特征在于，所述物质为尿嘧啶、亮氨酸、甲醇、pep蛋白酶、prc蛋白酶或kex蛋白酶。

7.如权利要求6所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞为亮氨酸营养缺陷型，所述重组质粒载体上具有营养缺陷标记Leu2。

8.如权利要求2所述的表达系统，其特征在于，所述重组质粒载体上还具有至少一种报告基因表达盒。

9.如权利要求7所述的表达系统，其特征在于，所述重组质粒载体上还具有自主复制序列。

10.一种柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由权利要求1～9中任一项所述的表达系统表达得到。

11.一种预防或治疗手足口病的免疫组合物，其特征在于，所述疫苗包含权利要求10所述的柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒。

12.如权利要求11所述的免疫组合物，其特征在于，单次给药剂量的所述免疫组合物中，所述柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒的含量为5～60μg。

13.一种手足口病疫苗，其特征在于，包含权利要求11或12所述的免疫组合物。

14.如权利要求13所述的手足口病疫苗，其特征在于，还包含佐剂，所述佐剂包含氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾、钾明矾、3D-MPL、角鲨烯、吐温、生育酚、CpG、poly(I:C)以及QS21中的至少一种。

15.如权利要求14所述的手足口病疫苗，其特征在于，所述佐剂包含氢氧化铝，所述手足口病疫苗中氢氧化铝的用量为1～2mg/ml。

16.如权利要求14所述的手足口病疫苗，其特征在于，所述佐剂包含如下成分：角鲨烯40～50mg/ml、α-生育酚40～50mg/ml、吐温80 15～25mg/ml。

17.如权利要求14所述的手足口病疫苗，其特征在于，所述佐剂包含如下成分：角鲨烯35～45mg/ml、司盘85 2.5～7.5mg/ml、吐温80 2.5～7.5mg/ml。

18.权利要求11或12所述的免疫组合物在制备多价手足口病疫苗中的应用，其特征在于，所述免疫组合物与另外一种或多种肠道病毒的免疫原性成分联合使用。

19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述肠道病毒包括柯萨奇病毒6型、柯萨奇病毒10型或肠道病毒71型中的至少一种，所述免疫原性成分为病毒样颗粒或灭活病毒。