CN114540393B - 一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用，属于病毒样颗粒制备技术领域。本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒以pSMA质粒作为基础载体，插入优化好的Cap全长基因，所述优化好的Cap全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明克服了现有真核表达系统及传统原核表达系统的不足，使利用原核表达系统可溶性表达猪圆环病毒3型完整Cap蛋白并成功实现病毒样颗粒的制备方法成为可能，且得到的病毒样颗粒免疫原性高，成本低。

Description

一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及病毒样颗粒制备技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为单股环状DNA病毒，属于圆环病毒科(Anelloviridae)圆环病毒属(Cyclovirus)，是迄今为止发现的最小的动物病毒之一。猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)作为其中的一员，形态大小及基因组结构等都与PCV1及PCV2相似，病毒粒子呈二十面体结构，无囊膜，直径为17～20nm，为单股环状DNA，全长2000bp，包含3个主要的开放阅读框(openreading frame，ORF)，其中ORF2全长645bp，编码PCV 3型的主要抗原衣壳蛋白(Cap蛋白)。相关研究表明，PCV 3型与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性仅为30％，差异性非常大。而Cap蛋白作为PCV诱导动物机体产生特异性免疫应答的主要蛋白，因此推测PCV3与PCV2不具有交叉免疫保护的特性。PCV3于2016年首次在美国发现，而后中国、韩国、德国等国家也相继报道了PCV3的流行。研究表明，PCV3对各个年龄段的猪均有致病性，临床症状主要表现为皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍以及仔猪的先天性震颤、心脏疾病及多系统炎症等。并且PCV3单独感染即可引起较为明显的临床症状，说明其具有较高的致病性，给养殖业带来了一定的经济损失。作为一种新型病毒，目前尚未有分离纯化PCV3的相关报道，因此传统的灭活疫苗防控思路受到限制。目前已有报道PCV3可在真核细胞中形成病毒样颗粒，但由于真核表达系统费用较高且表达量低，很难应用于临床。因此利用原核表达系统开发一种安全、高效且低成本的PCV3病毒样颗粒制备方法具有重要的现实意义。

病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)是由病毒的一个或多个结构蛋白组装而成的空心蛋白颗粒，由于不具有病毒的遗传物质，因此没有感染性。且病毒样颗粒具有与天然病毒相似的形态结构，因此其作用于机体后能够因其机体产生类似于天然病毒感染的免疫应答反应。因其具有良好的免疫原性、较高的安全性以及较低的成本等特点，目前已成为人或动物病毒预防的安全高效候选疫苗之一，在各种疾病预防与治疗中发挥了巨大潜力。

目前已有利用真核细胞表达系统制备PCV3病毒样颗粒的案例，但是利用真核表达系统制备病毒样颗粒存在方法复杂，成本高等缺点。相关研究发现，PCV3的Cap蛋白N端的前36个aa是潜在的核定位区域，由于含有较多的精氨酸，蛋白疏水性较强，易导致全长Cap基因在原核表达系统中以包涵体形式表达。为了克服包涵体的形成，有案例利用原核表达系统表达去除了核定位氨基酸的Cap蛋白截短体的方法，这一方法虽然实现了Cap蛋白的可溶性表达，但是其制备的Cap蛋白截短体存在免疫原性差等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用。本发明克服了现有真核表达系统及传统原核表达系统的不足，使利用原核表达系统可溶性表达猪圆环病毒3型完整Cap蛋白并成功实现病毒样颗粒制备的方法成为可能，且得到的病毒样颗粒免疫原性高，成本低。

本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒以pSMA质粒作为基础载体，插入优化好的Cap全长基因，所述优化好的Cap全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌通过将上述技术方案所述重组质粒转化到大肠杆菌BL21中构建得到。

本发明还提供了基于上述技术方案所述重组菌的Cap重组蛋白的生产方法，包括以下步骤：将重组菌接种至基础培养基中，在37℃，溶氧30％条件下进行培养，当菌液OD₆₀₀值为7～10时，使用N源补料培养基进行补料，补料速度为4.5～5.5ml/L/h，继续培养，当菌液OD₆₀₀值达到40以上时，调整N源补料培养基的补料速度为2.0～3.0ml/L/h，在16℃，溶氧30％条件下培养1h，加入终浓度为0.45～0.6mmol/L的IPTG，诱导培养16h，收集菌泥，提取蛋白，得到Cap重组蛋白。

优选的是，所述基础培养基包括以下组分：蛋白胨20g/ml、酵母粉10g/ml、甘油体积百分含量0.25％、硫酸铵1.2g/ml、L-盐酸精氨酸0.3g/ml、L-天冬氨酸0.25g/ml、L-胱氨酸二盐酸盐0.45g/ml、L-盐酸组氨酸0.5g/ml、L-亮氨酸0.3g/ml、L-异亮氨酸0.7g/ml、磷酸氢二钠2.8g/ml、甘氨酸2g/ml、L-盐酸赖氨酸0.1g/ml、L-甲硫氨酸0.1g/ml、L-苯丙氨酸0.2g/ml、L-脯氨酸0.1g/ml、L-丝氨酸0.5g/ml、L-苏氨酸0.3g/ml、L-色氨酸0.3g/ml、L-酪氨酸0.1g/ml、L-缬氨酸0.1g/ml、L-谷氨酸0.1g/ml、L-半胱氨酸0.1g/ml、硫酸锌2.8g/ml、硫酸铜1.5g/ml、硝酸铁3.5g/ml、硫酸镍1g/ml、柠檬酸5g/ml、氯化镁6.5g/ml、磷酸二氢钾3g/ml、氯化钙1.5g/ml、葡萄糖1g/ml、蔗糖1g/ml、乳糖1g/ml、生物素1.5g/ml、胆碱0.5g/ml、叶酸1.3g/ml、肌醇0.7g/ml、烟酰胺0.6g/ml、维生素B12 2g/ml、氯化钾3.6g/ml和氯化钠20g/ml；所述N源补料培养基包括以下组分：酵母粉120g/ml、蛋白胨225g/ml、甘油体积百分含量2.5％、磷酸二氢钾4.5g/ml、磷酸氢二钠5.6g/ml、氯化钙3g/ml、生物素3.6g/ml、氯化钾6.3g/ml、氯化钠50g/ml、L-盐酸精氨酸0.3g/ml、L-天冬氨酸0.25g/ml、L-胱氨酸二盐酸盐0.45g/ml、L-盐酸组氨酸0.5g/ml、L-亮氨酸0.3g/ml、L-异亮氨酸0.7g/ml、磷酸氢二钠2.8g/ml、甘氨酸2g/ml、L-盐酸赖氨酸0.1g/ml、L-甲硫氨酸0.1g/ml、L-苯丙氨酸0.2g/ml、L-脯氨酸0.1g/ml、L-丝氨酸0.5g/ml、L-苏氨酸0.3g/ml、L-色氨酸0.3g/ml、L-酪氨酸0.1g/ml、L-缬氨酸0.1g/ml、L-谷氨酸0.1g/ml、L-半胱氨酸0.1g/ml。

优选的是，所述生产的过程中，使用C源补料培养基控制pH值为7.0；所述C源补料培养基包括以下组分：甘油体积百分含量50％、硫酸铵10g/ml、甘氨酸0.5g/ml、氯化钙0.5g/ml和氯化钠1g/ml。

本发明还提供了一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒，所述猪圆环病毒3型病毒样颗粒经上述技术方案所述重组菌表达的Cap重组蛋白或上述技术方案所述生产方法得到的Cap重组蛋白组装得到。

本发明还提供了上述技术方案所述猪圆环病毒3型病毒样颗粒的构建方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述重组菌表达的Cap重组蛋白或上述技术方案所述生产方法得到的Cap重组蛋白进行纯化，得到纯化好的Cap重组蛋白，将纯化好的Cap重组蛋白与SUMO酶进行混合，透析和酶切组装，得到猪圆环病毒3型病毒样颗粒。

优选的是，所述透析和酶切组装包括以下步骤：将纯化好的Cap重组蛋白与SUMO酶置于透析袋中，将透析袋置于酶切缓冲液中，搅拌过夜；所述酶切缓冲液包括500mM NaCl和50mM Tris-HCl，pH 8.0。

本发明还提供了上述技术方案所述重组质粒或上述技术方案所述重组菌或上述技术方案所述猪圆环病毒3型病毒样颗粒在制备猪圆环病毒3型病毒的防控产品中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述重组质粒或上述技术方案所述重组菌或上述技术方案所述猪圆环病毒3型病毒样颗粒在制备抗猪圆环病毒3型病毒抗体中的应用。

本发明提供了一种重组质粒。本发明所述重组质粒在原核表达系统中能够实现猪圆环病毒3型病毒Cap全长蛋白的表达，得到猪圆环病毒3型病毒样颗粒。本发明所述重组质粒获得的猪圆环病毒3型病毒样颗粒制备成本低，可实现猪圆环病毒3型病毒样颗粒的大规模生产，免疫原性高，可作为有效抗原用于开发预防猪圆环病毒3型病毒的防控产品，能够有效诱导动物机体产生特异性抗体。

附图说明

图1为本发明提供的猪圆环病毒3型Cap蛋白的SDS-PAGE分析结果图；其中，M：蛋白质分子质量标准；1：纯化的His-SUMO-Cap蛋白(≈39KD)；2：切除His-SUMO标签后的Cap蛋白(≈26KD)；

图2为本发明提供的猪圆环病毒3型Cap蛋白的Western-blot检测结果图；其中，M：蛋白质分子质量标准；1：纯化的His-SUMO-Cap蛋白；2：切除His-SUMO标签后的Cap蛋白；

图3为本发明提供的猪圆环病毒3型VLPs透射电镜结果图；

图4为本发明提供的猪圆环病毒3型Cap蛋白表达菌发酵生长曲线图；

图5为本发明提供的猪圆环病毒3型病毒样颗粒疫苗抗体检测水平结果图；

图6为本发明提供的不同培养基的对比结果图；

图7为本发明提供的N源补料培养基的补料速率对比结果图；

图8为本发明提供的不同IPTG浓度对比结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒以pSMA质粒作为基础载体，插入优化好的Cap全长基因，所述优化好的Cap全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：atgagacacagagctatattcagaagaagaccccgcccaaggagacgacgacgccacagaaggcgctatgccagaagacgactattcattaggaggcccacagctggcacatactacacaaagaaatactccacaatgaacgtcatatccgttggaacccctcagaataacaagccctggcacgccaaccacttcattacccgcctaaacgaatgggaaactgcaattacctttgaatattataagatactaaaaatgaaagttacactcagccctgtaatttctccggctcagcaaacaaaaactatgttcgggcacacagccatagatctagacggcgcctggaccacaaacacttggctccaagacgacccttatgcggaaagttccactcgtaaagttatgacttctaaaaaaaaacacagccgttacttcacccccaaaccacttctggcgggaactaccagcgctcacccaggacaaagcctcttctttttctccagacccaccccatggctcaacacatatgaccccaccgttcaatggggagcactgctttggagcatttatgtcccggaaaaaactggaatgacagacttctacggcaccaaagaagtttggattcgttacaagtccgttctctaa。本发明所述重组质粒能够实现在原核表达系统中猪圆环病毒3型病毒Cap全长蛋白的可溶性表达，组装成的猪圆环病毒3型病毒样颗粒免疫原性高，为猪圆环病毒3型的防控储备了良好的候选疫苗技术。本发明对所述重组质粒的构建方法没有特殊限定，采用常规重组质粒构建方法即可。在本发明中，所述pSMA质粒为授权号为CN 101914501 B的专利中公开的pSMA质粒。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌通过将上述技术方案所述重组质粒转化到大肠杆菌BL21中构建得到。本发明对所述重组菌的构建方法没有特殊限定，采用常规重组菌构建方法进行构建即可。

本发明还提供了基于上述技术方案所述重组菌的Cap重组蛋白的生产方法，包括以下步骤：

将重组菌接种至基础培养基中，在37℃，溶氧30％条件下进行培养，当菌液OD₆₀₀值为7～10时，使用N源补料培养基进行补料，补料速度为4.5～5.5ml/L/h，继续培养，当菌液OD₆₀₀值达到40以上时，调整N源补料培养基的补料速度为2.0～3.0ml/L/h，在16℃，溶氧30％条件下培养1h，加入0.45～0.6mmol/L的IPTG，诱导培养16h，收集菌泥，提取蛋白，得到Cap重组蛋白。

在本发明中，蛋白胨20g/ml、酵母粉10g/ml、甘油体积百分含量0.25％、硫酸铵1.2g/ml、L-盐酸精氨酸0.3g/ml、L-天冬氨酸0.25g/ml、L-胱氨酸二盐酸盐0.45g/ml、L-盐酸组氨酸0.5g/ml、L-亮氨酸0.3g/ml、L-异亮氨酸0.7g/ml、磷酸氢二钠2.8g/ml、甘氨酸2g/ml、L-盐酸赖氨酸0.1g/ml、L-甲硫氨酸0.1g/ml、L-苯丙氨酸0.2g/ml、L-脯氨酸0.1g/ml、L-丝氨酸0.5g/ml、L-苏氨酸0.3g/ml、L-色氨酸0.3g/ml、L-酪氨酸0.1g/ml、L-缬氨酸0.1g/ml、L-谷氨酸0.1g/ml、L-半胱氨酸0.1g/ml、硫酸锌2.8g/ml、硫酸铜1.5g/ml、硝酸铁3.5g/ml、硫酸镍1g/ml、柠檬酸5g/ml、氯化镁6.5g/ml、磷酸二氢钾3g/ml、氯化钙1.5g/ml、葡萄糖1g/ml、蔗糖1g/ml、乳糖1g/ml、生物素1.5g/ml、胆碱0.5g/ml、叶酸1.3g/ml、肌醇0.7g/ml、烟酰胺0.6g/ml、维生素B12 2g/ml、氯化钾3.6g/ml和氯化钠20g/ml。本发明的基础培养基包含了菌体生长的基本营养物质，可以有效保证菌体前期的快速生长，为菌体的后期生长和高密度发酵奠定良好的基础。

在本发明中，所述N源补料培养基优选包括以下组分：酵母粉120g/ml、蛋白胨225g/ml、甘油体积百分含量2.5％、磷酸二氢钾4.5g/ml、磷酸氢二钠5.6g/ml、氯化钙3g/ml、生物素3.6g/ml、氯化钾6.3g/ml、氯化钠50g/ml、L-盐酸精氨酸0.3g/ml、L-天冬氨酸0.25g/ml、L-胱氨酸二盐酸盐0.45g/ml、L-盐酸组氨酸0.5g/ml、L-亮氨酸0.3g/ml、L-异亮氨酸0.7g/ml、磷酸氢二钠2.8g/ml、甘氨酸2g/ml、L-盐酸赖氨酸0.1g/ml、L-甲硫氨酸0.1g/ml、L-苯丙氨酸0.2g/ml、L-脯氨酸0.1g/ml、L-丝氨酸0.5g/ml、L-苏氨酸0.3g/ml、L-色氨酸0.3g/ml、L-酪氨酸0.1g/ml、L-缬氨酸0.1g/ml、L-谷氨酸0.1g/ml、L-半胱氨酸0.1g/ml。本发明基础培养基的成分无法保障菌体进入对数生长期后快速生长对营养物质的大量需求，本发明增加了N源补料培养基，该培养基不仅可以提供充足的营养物质保障菌体在对数生长期的快速生长，而且可以有效维持培养基中的C/N比例平衡，最大量减少有毒副产物的积累，从而进一步利于菌体的生长。

在本发明中，所述生产的过程中，优选使用C源补料培养基控制pH值为6.9～7.1，更优选为7.0；所述C源补料培养基优选包括以下组分：甘油体积百分含量50％、硫酸铵10g/ml、甘氨酸0.5g/ml、氯化钙0.5g/ml和氯化钠1g/ml。

在本发明中，所述基础培养基、C源补料培养基和N源补料培养基在使用前，优选分别按体积比(0.1％)加入消泡剂204(Sigma-Aldrich)，pH调为6.9～7.1，更优选7.0，116℃高压灭菌15min，然后降温至37℃待用。116℃高压灭菌15min既可以有效实现对培养基的灭菌处理，也可以减少对培养基营养物质的损失。

将重组菌接种至基础培养基中，在37℃，溶氧30％条件下进行培养。在本发明中，所述重组菌接种时，重组菌与基础培养基的体积比优选为1：30。在本发明中，接种后，优选按1:1000的体积比加入氨苄青霉素，所述氨苄青霉素的质量浓度优选为50ng/ml。在本发明中，所述培养优选使用C源补料培养基调控pH为6.9～7.1，更优选为7.0。

当菌液OD₆₀₀值为7～10时，使用N源补料培养基进行补料，补料速度为4.5～5.5ml/L/h，继续培养。在本发明中，所述补料速度优选为5ml/L/h。在本发明中，所述继续培养的温度优选仍为37℃，溶氧率优选为30％。在本发明中，所述继续培养优选使用C源补料培养基调控pH为6.9～7.1，更优选为7.0。本发明N源补料培养基的添加时间的设置，有利于菌体的生长速度。

当菌液OD₆₀₀值达到40以上时，调整N源补料培养基的补料速度为2.0～3.0ml/L/h，在16℃，溶氧30％条件下培养1h。在本发明中，所述补料速度优选为2.5ml/L/h。在本发明中，所述培养优选使用C源补料培养基调控pH为6.9～7.1，更优选为7.0。

上述两个步骤中的N源补料速率的设置，不仅可以提供充足的营养物质，而且可以减少副产物的产生，利于菌体的快速生长。本发明选择菌液OD₆₀₀值为7～10时开始加N源补料培养基，如果N源补料加的时间过早一方面导致N源过多，产生更多的副产物，另一方面形成浪费；如果过迟，会因使处于快速生长期的菌体由于缺少充足的营养物质而影响其菌体生长速率和菌体状态，从而导致最终的发酵结果。本发明选择菌液OD₆₀₀值达到40以上时开始降温诱导培养，能够保证菌体数量和蛋白表达量的最大化。

培养1h后，本发明加入终浓度为0.45～0.6mmol/L的IPTG，诱导培养，收集菌泥，提取蛋白，得到Cap重组蛋白。在本发明中，所述IPTG的终浓度优选为0.5mmol/L。在本发明中，所述诱导培养的温度优选为16℃，溶氧率优选为30％。在本发明中，所述诱导培养优选使用C源补料培养基调控pH为6.9～7.1，更优选为7.0。在本发明中，所述诱导培养过程中，N源补料培养基补料的速度优选仍控制在2.0～3.0ml/L/h，更优选2.5ml/L/h。在本发明中，所述诱导表达的时间优选为16h。本发明IPTG浓度的设置既可以诱导菌体最大量表达蛋白，又可保证菌体正常生长。本发明所述Cap重组蛋白容易形成包涵体，本发明将诱导温度设置为16℃度能够减少包涵体的形成，并保持菌体的生长，获得最多的可溶性蛋白量。

本发明通过在不同培养阶段设置不同的N源补料培养基的补加速度，能够使C/N比达到一个平衡点，从而减少副产物的积累，提高菌体生长速率，降低菌体死亡率。

本发明利用大肠杆菌成功实现了全长的猪圆环病毒3型的Cap蛋白的可溶性表达，既解决了真核表达系统操作复杂、成本高不利于推广的问题，也突破了为了克服包涵体的形成只能表达去除了核定位氨基酸的Cap蛋白截短体的方法，去除核定位氨基酸序列这一方法虽然可实现Cap蛋白的可溶性表达，但是其制备的Cap蛋白截短体存在免疫原性差等缺点。

本发明还提供了一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒，所述猪圆环病毒3型病毒样颗粒经上述技术方案所述重组菌表达的Cap重组蛋白或上述技术方案所述生产方法得到的Cap重组蛋白组装得到。本发明利用原核表达系统可溶性表达和组装得到猪圆环病毒3型的病毒样颗粒，免疫原性高。

本发明还提供了上述技术方案所述猪圆环病毒3型病毒样颗粒的构建方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述重组菌表达的Cap重组蛋白或上述技术方案所述生产方法得到的Cap重组蛋白进行纯化，得到纯化好的Cap重组蛋白，将纯化好的Cap重组蛋白与SUMO酶进行混合，透析和酶切组装，得到猪圆环病毒3型病毒样颗粒。在本发明中，纯化好的Cap重组蛋白与SUMO酶混合的质量比优选为50:1。

在本发明中，所述透析和酶切组装包括以下步骤：将纯化好的Cap重组蛋白与SUMO酶置于透析袋中，将透析袋置于酶切缓冲液中，搅拌过夜；所述酶切缓冲液包括500mM NaCl和50mM Tris-HCl，pH 8.0。

本发明还提供了上述技术方案所述重组质粒或上述技术方案所述重组菌或上述技术方案所述猪圆环病毒3型病毒样颗粒在制备预防猪圆环病毒3型病毒的防控产品中的应用。在本发明中，所述预防猪圆环病毒3型病毒的防控产品优选包括猪圆环病毒3型病毒疫苗。

本发明还提供了上述技术方案所述重组质粒或上述技术方案所述重组菌或上述技术方案所述猪圆环病毒3型病毒样颗粒在制备抗猪圆环病毒3型病毒抗体中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.猪圆环病毒3型及结构蛋白基因Cap密码子优化及合成

基于已公布的猪圆环病毒3型毒株(GenBabnk登录号：NC_031753.1)结构蛋白基因Capsid序列，根据大肠杆菌密码子偏嗜性，对猪圆环病毒3型Cap基因进行优化并合成，优化后的猪圆环病毒3型Cap基因序列如SEQ ID No.1所示。

2.猪圆环病毒3型结构蛋白重组表达载体构建

(1)片段及载体的酶切

参照内切酶说明书，将合成的Cap基因和pSMA载体(含SUMO-His标签)进行酶切，反应体系如下：DNA片段(Cap)20μl或载体30μl加入50μl酶切反应体系中，内含内切酶buffer和内切酶BsmB I和BamH I各5μl，用去离子水补加至50μl。37℃酶切4h，琼脂糖凝胶电泳确认。

(2)酶切产物胶回收

用凝胶成像系统观察酶切产物电泳结果并切取目的片段，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的片段的回收及纯化。具体操作步骤如下：

在紫外灯下切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，100mg凝胶视为100μl体积。加入3倍体积溶液GSB，于55℃水浴6-10min，间断混合，确保胶块完全融化，当胶块完全融化后观察溶液颜色，若颜色为紫色，加入3M醋酸钠(pH 5.2)，调整颜色和GSB颜色相同。待融化后的凝胶溶液降至室温，将其加入吸附柱，静置1min，10000×g离心1min，弃流出液。加入650μl溶液WB，10000×g离心1min，弃流出液。再10000×g离心1～2min，去除残留的WB液。将吸附柱置于干净的离心管，开盖静置1min，使残留乙醇挥发干净。在柱中央加入30～50μl去离子水，室温静置1min。之后10000×g离心1min，洗脱DNA，并置于-20℃保存。

(3)连接反应

按照载体和回收片段摩尔比将两种产物进行连接。反应体系为：目的片段2μl、pSMA载体1μl、T4 DNA连接酶1μl(1U/μl)，10×T4 DNA连接缓冲液1μl，补充超纯水至总体积10μl，混匀后4℃过夜连接或16℃连接反应4h。

(4)转化TOP10克隆菌

取连接产物5μl加入100μl TOP10感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，加入37℃预热后的LB液体培养基800μl，于37℃、200rpm培养1h，将培养物均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃静置培养约16h。

(5)重组质粒鉴定

用无菌牙签挑取LB平皿上大小均匀的菌落接于LB液体培养基中，37℃、200rpm培养16h。将不同编号过夜培养后的菌液接种于10μl PCR缓冲液体系中，利用全菌PCR法进行鉴定。将PCR反应鉴定为阳性的菌液，利用小量质粒提取试剂盒提取质粒，并进行酶切鉴定。酶切体系如下：BsmB I和BamH I各5μl，10×H Buffer，DNA4μl，超纯水4.5μl，37℃酶切1h。酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳分析，命名阳性质粒为pSMA-Cap。

3.重组Cap蛋白的原核表达及鉴定

(1)重组Cap蛋白的表达

将pSMA-Cap转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，利用含氨苄青霉素的平板筛选阳性克隆。挑选阳性克隆菌于含50ng/ml氨苄青霉素的5ml的LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养。将上述菌液以1:100接种于1L LB培养基，1:1000加入氨苄青霉素，于37℃、220rpm培养至菌液的OD₆₀₀值为0.8左右，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.05mM，20℃诱导表达过夜，随后以5000rpm、30min离心收集菌体沉淀。

(2)重组Cap蛋白的纯化

用10～20ml冰浴处理的缓冲液A(500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20mM Imidazole、1mM DTT，pH＝8.0)重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞(超声时间3s，间隔时间3s，共7min，功率350W)。在4℃下，将超声裂解菌液12000r/min离心30min，取上清。将上清转移至预装有BufferA平衡的镍亲和层析树脂的层析柱中，使上清与Ni-NTAResins混匀，室温结合1h左右，用10倍树脂体积的BufferA和5％的BufferB(500mM NaCl、20mM Tris-HCl、500mMImidazole、1mM DTT，pH＝8.0)洗去非特异性结合的杂蛋白，用BufferB洗脱目的蛋白，每次1ml，反复洗脱6～7次。将以上样品进行SDS-PAGE电泳，结果显示获得了预期大小的蛋白(≈39KD)(图1)。

(3)Western blotting实验

将洗脱下来的VP2重组蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，利用湿转将重组蛋白电转移至聚偏氟乙烯杂交膜(PVDF膜)，用封闭液(PBST，5％脱脂奶粉，pH7.0)37℃封闭1h，用PBST1:5000稀释猪圆环病毒3型兔抗高免血清，4℃过夜，充分洗涤后，用PBST 1:2000稀释辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗，在37℃条件充分作用1h，PBST充分洗涤；之后利用显影仪进行显影。可见其条带与预期大小相符，说明获得的蛋白能够与猪圆环病毒3型兔抗高免血清特异性反应(图2)。

4.猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备及鉴定

将纯化好的Cap重组蛋白按质量比50:1加入SUMO酶，将其置于透析袋中，并置于500ml酶切缓冲液(500mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0)中缓慢匀速搅拌、4℃过夜透析进行酶切组装，组装效果通过常规透射电子显微镜观察，具体方法为，将10μl样品加到300目的铜网上，室温吸附2～3min，用滤纸吸干铜网，3％的磷钨酸染色，用日立H-7100FA透射电镜进行观察，结果显示所得的病毒样颗粒与猪圆环病毒3型相似，为直径为10～20nm的球形结构(图3)。

5.重组Cap蛋白原核表达系统的发酵工艺优化

为了实现大规模制备猪圆环病毒3型病毒样颗粒，本发明在通过摸索猪圆环病毒3型重组Cap蛋白的大肠杆菌发酵工艺，优化其发酵参数，成功实现了重组Cap蛋白表达菌的大规模发酵(菌生长曲线见图4)，为下一步的推广应用奠定了基础。具体的发酵培养方法包括以下步骤：

(1)基础培养基、补料培养基(包括C源补料培养基和N源补料培养基)分别按体积比(0.1％)加入消泡剂204(Sigma-Aldrich)，pH调为7.0，116℃高压灭菌15min，然后降温至37℃待用；

(2)将表达菌种按1:30体积比接种入基础培养基中，并按1:1000的体积比加入氨苄青霉素(浓度为50ng/ml)，然后在培养温度为37℃，溶氧率为30％条件下培养5h，使用C源补料培养基调控pH为7.0，进行扩菌培养；

(3)当菌液OD₆₀₀为7～10时，开始使用N源补料培养基进行补料，补料速度为20％(5.0ml/L/h)，在培养温度为37℃，溶氧率为30％，使用C源补料培养基调控pH为7.0，继续培养；

(4)当菌液OD₆₀₀达到40以上时，开始降温至16℃，溶氧率为30％，使用C源补料培养基调控pH为7.0，N源补料培养基补料速度为10％(2.5ml/L/h)继续培养1h；

(5)向菌液中加入诱导剂IPTG(终浓度为0.5mM/L)，在温度为16℃，溶氧率为30％，使用C源补料培养基调控pH为7.0，N源补料培养基补料速度为10％(2.5ml/L/h)，诱导表达16h；

(6)发酵结束，将菌液经4500rpm/min离心30min收集菌泥，-20℃保存备用。

(7)利用缓冲液A(500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20mM Imidazole、1mM DTT，pH＝8.0)重悬菌泥，加入溶菌酶(1mg/mL)反应30min，然后利用高压破碎仪裂解菌体，重复裂解3次，使菌体成透明状即可；超声裂解菌液12000r/min离心30min，取上清；利用英赛斯蛋白纯化仪将上清转移至预装有BufferA平衡的镍亲和层析树脂的层析柱中，使上清与Ni-NTAResins混匀，然后分别用5％和20％的Buffer B(500mM NaCl、20mM Tris-HCl、500mMImidazole、1mM DTT，pH＝8.0)洗去非特异性结合的杂蛋白，最后用BufferB洗脱得到目的蛋白。

利用本发明发酵工艺可以使菌体生长OD值到达65左右，菌泥收获量可以达到131.5g/L，蛋白表达量可以达到7.6mg/g菌泥，每升发酵液可以收获蛋白量可达到851.96mg。

(8)将纯化好的Cap重组蛋白按质量比50:1加入SUMO酶，将其置于透析袋中，并置于500ml酶切缓冲液(500mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH8.0)中缓慢匀速搅拌、4℃过夜透析进行酶切组装，组装效果通过常规透射电子显微镜观察。

基础培养基配方如表1所示：

表1基础培养基配方

C源补料培养基(g/L)：甘油500ml，硫酸铵10，甘氨酸0.5，氯化钙0.5，氯化钠1；

N源补料培养基(g/L)：酵母粉120，蛋白胨225，甘油2.5％，磷酸二氢钾4.5，磷酸氢二钠5.6，氯化钙3，生物素3.6，氯化钾6.3，氯化钠50，氨基酸成分参见基础培养基配方。

6.猪圆环病毒3型病毒样颗粒疫苗的动物免疫实验

(1)疫苗制备：将第5部分大规模制备的猪圆环病毒3型病毒样颗粒和赛比克公司201佐剂按体积1:1的比例乳化制备成苗，经检验合格后于4℃保存。

(2)动物免疫实验：

将10头3周龄双阴性(抗原、抗体)的仔猪随机分为2组，对照组5头，免疫组5头。各组均采用颈部肌肉注射的方式免疫，共免疫一次。对照组：每头免疫2ml灭菌后的PBS。免疫组：每头免疫2ml的猪圆环病毒3型VLP苗(VLP终浓度为100μg/ml)。免疫后前4周每周采血，4周后每2周采血，共采8次，然后利用ELISA方法检测抗体水平(图5)。结果显示：猪圆环病毒3型VLP疫苗可有效诱导免疫仔猪产生针对猪圆环病毒3型的抗特异性体。

本发明通过对猪圆环病毒3型Cap全长基因进行优化，之后将优化好的Cap基因插入到载体pSMA中得到重组pSMA-Cap质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21株得到重组菌，经IPTG诱导表达得到重组蛋白，再将重组蛋白纯化后进行体外组装，得到猪圆环病毒3型病毒样颗粒。

以上实验结果充分证明了本技术利用大肠杆菌表达系统成功实现了猪圆环病毒3型完整Cap蛋白的可溶性表达，而且组装成的病毒样颗粒具有良好的免疫原性(本发明制备的PCV3病毒样颗粒疫苗只需要免疫一次((VLP终浓度为100μg/ml))，2周后抗体滴度即可达到1：125，4周后就能达到1：384，且可维持高水平的抗体滴度到12周，充分证明了组装成的PCV3病毒样颗粒具有良好的免疫原性)，为猪圆环病毒3型的防控储备了良好的候选疫苗技术，也为其他在原核表达系统无法实现可溶性病毒蛋白表达的技术提供了理论参考。

对比例1

不同培养基的对比

同时利用本发明使用的培养基(基础培养基+补料培养基)与LB培养基对表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的大肠杆菌进行发酵，结果如图6显示，本发明所使用的培养基可以使菌种生长更快进入对数期，而且菌液的OD₆₀₀值可以达到65，明显高于LB培养基。

LB培养基发酵方法具体如下：按体积比(0.1％)加入消泡剂204(Sigma-Aldrich)，pH调为7.0，116℃高压灭菌30min，然后降温至37℃待用。将重组菌按1：30体积比接种至基础培养基中，按1:1000的体积比加入氨苄青霉素(50ng/ml)，在37℃，溶氧30％条件下进行培养。使用稀盐酸调控pH为7.0。使用葡萄糖500g/l进行补料，速率为5.0ml/L/h，培养10～12h后，在16℃，溶氧30％条件下加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，诱导培养16h。

对比例2

N源补料培养基的补料速率对比

利用本发明使用的培养基，发酵表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的大肠杆菌，于发酵5h(OD＝7～10)时开始使用N源补料培养基进行补料，在其他条件不变的情况下，设置不同的N源补料培养基的补料速率，结果如图7所示，发酵阶段的补料速率为20％(5.0ml/L/h)、诱导阶段的补料速率为10％(2.5ml/L/h)时，菌体的生长速度最快，OD₆₀₀＝65和蛋白表达量(0.851g/L)都达到最大值。发酵过程中C/N源比例的对菌体的生长速度和蛋白表达量具有很大的影响，N源过高会产生过多的副产物从而影响菌体的正常生长，合理的补料速率配比既有助于菌体的快速生长，又可降低发酵成本。

对比例3

不同IPTG浓度对比

利用本发明使用的培养基发酵表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的大肠杆菌，于发酵液OD₆₀₀达到40以上时，加入不同浓度的诱导剂——IPTG，诱导蛋白表达，结果如图8所示，在IPTG＝0.5mM/L时，菌体生长速率最快，可达到OD₆₀₀＝65，蛋白表达量(1.05g/L)也达到最高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagacaca gagctatatt cagaagaaga ccccgcccaa ggagacgacg acgccacaga 60

aggcgctatg ccagaagacg actattcatt aggaggccca cagctggcac atactacaca 120

aagaaatact ccacaatgaa cgtcatatcc gttggaaccc ctcagaataa caagccctgg 180

cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac gaatgggaaa ctgcaattac ctttgaatat 240

tataagatac taaaaatgaa agttacactc agccctgtaa tttctccggc tcagcaaaca 300

aaaactatgt tcgggcacac agccatagat ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg 360

ctccaagacg acccttatgc ggaaagttcc actcgtaaag ttatgacttc taaaaaaaaa 420

cacagccgtt acttcacccc caaaccactt ctggcgggaa ctaccagcgc tcacccagga 480

caaagcctct tctttttctc cagacccacc ccatggctca acacatatga ccccaccgtt 540

caatggggag cactgctttg gagcatttat gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc 600

tacggcacca aagaagtttg gattcgttac aagtccgttc tctaa 645

Claims (3)

1.一种猪圆环病毒3型完整Cap蛋白在原核表达系统中可溶性表达的生产方法，包括以下步骤：将重组菌接种至基础培养基中，在37℃，溶氧30%条件下进行培养，当菌液OD₆₀₀值为7~10时，使用N源补料培养基进行补料，补料速度为4.5~5.5 ml/L/h，继续培养，当菌液OD₆₀₀值达到40以上时，调整N源补料培养基的补料速度为2.0~3.0 ml/L/h，在16℃，溶氧30%条件下培养1h，加入终浓度为0.45~0.6 mmol/L的IPTG，诱导培养16 h，收集菌泥，提取蛋白，得到Cap重组蛋白；

所述重组菌通过将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中构建得到；所述重组质粒以pSMA质粒作为基础载体，插入优化好的Cap全长基因，所述优化好的Cap全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述基础培养基包括以下组分：蛋白胨20 g/ml、酵母粉10 g/ml、甘油体积百分含量0.25%、硫酸铵1.2 g/ml、L-盐酸精氨酸0.3 g/ml、L-天冬氨酸0.25 g/ml、L-胱氨酸二盐酸盐0.45 g/ml、L-盐酸组氨酸0.5 g/ml、L-亮氨酸0.3 g/ml、L-异亮氨酸0.7 g/ml、磷酸氢二钠2.8 g/ml、甘氨酸2 g/ml、L-盐酸赖氨酸0.1 g/ml、L-甲硫氨酸0.1 g/ml、L-苯丙氨酸0.2g/ml、L-脯氨酸0.1 g/ml、L-丝氨酸0.5 g/ml、L-苏氨酸0.3 g/ml、L-色氨酸0.3 g/ml、L-酪氨酸0.1 g/ml、L-缬氨酸0.1 g/ml、L-谷氨酸0.1 g/ml、L-半胱氨酸0.1 g/ml、硫酸锌2.8g/ml、硫酸铜1.5 g/ml、硝酸铁3.5 g/ml、硫酸镍1 g/ml、柠檬酸5 g/ml、氯化镁6.5 g/ml、磷酸二氢钾3 g/ml、氯化钙1.5 g/ml、葡萄糖1 g/ml、蔗糖1 g/ml、乳糖1 g/ml、生物素1.5g/ml、胆碱0.5 g/ml、叶酸1.3 g/ml、肌醇0.7 g/ml、烟酰胺0.6 g/ml、维生素B12 2 g/ml、氯化钾3.6 g/ml和氯化钠20 g/ml；所述N源补料培养基包括以下组分：酵母粉120 g/ml、蛋白胨225 g/ml、甘油体积百分含量2.5%、磷酸二氢钾4.5 g/ml、磷酸氢二钠5.6 g/ml、氯化钙3 g/ml、生物素3.6 g/ml、氯化钾6.3 g/ml、氯化钠50 g/ml、L-盐酸精氨酸0.3 g/ml、L-天冬氨酸0.25 g/ml、L-胱氨酸二盐酸盐0.45 g/ml、L-盐酸组氨酸0.5 g/ml、L-亮氨酸0.3g/ml、L-异亮氨酸0.7 g/ml、磷酸氢二钠2.8 g/ml、甘氨酸2 g/ml、L-盐酸赖氨酸0.1 g/ml、L-甲硫氨酸0.1 g/ml、L-苯丙氨酸0.2 g/ml、L-脯氨酸0.1 g/ml、L-丝氨酸0.5 g/ml、L-苏氨酸0.3 g/ml、L-色氨酸0.3 g/ml、L-酪氨酸0.1 g/ml、L-缬氨酸0.1 g/ml、L-谷氨酸0.1g/ml、L-半胱氨酸0.1 g/ml；

所述生产的过程中，使用C源补料培养基控制pH值为7.0；所述C源补料培养基包括以下组分：甘油体积百分含量50%、硫酸铵10 g/ml、甘氨酸0.5 g/ml、氯化钙0.5 g/ml和氯化钠1g/ml。

2.权利要求1所述生产方法制备得到的猪圆环病毒3型完整Cap蛋白组装得到的猪圆环病毒3型病毒样颗粒在制备猪圆环病毒3型病毒的防控产品中的应用。

3.权利要求1所述生产方法制备得到的猪圆环病毒3型完整Cap蛋白组装得到的猪圆环病毒3型病毒样颗粒在制备抗猪圆环病毒3型病毒抗体中的应用。