KR20210131310A - 아넬로좀 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20210131310A
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anellosome
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에리카 가브리엘 웨인스테인
아바크 카흐베지안
시몬 델라그레이브
네이선 로렌스 요즈비악
케빈 제임스 레보
페르난도 마틴 디아즈
다난제이 마닉랄 나완다르
라이언 디. 테드스톤
제러드 데이비드 피츠
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플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크.
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Abstract

본 발명은 일반적으로 아넬로좀 및 그의 조성물 및 용도에 관한 것이다.

Description

아넬로좀 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 12일자 출원된 미국 가출원 제62/778,841호 및 2018년 12월 12일자 출원된 제62/778,866호의 이익을 주장한다. 전술된 출원의 내용은 그들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2019년 12월 9일자 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 V2057-7005WO_SL.txt이며, 825,796 바이트 크기이다.
환자에게 치료적 유전 물질을 운반하기 위한 적합한 벡터를 개발하는 것이 계속 필요하다.
본 개시내용은 예를 들어, 진핵 세포(예를 들어, 인간 세포 또는 인간 조직)에 유전 물질을 운반하기 위한, 이펙터, 예를 들어, 페이로드를 운반하기 위한, 또는 치료제 또는 치료적 이펙터를 운반하기 위한 운반 비히클로서 사용될 수 있는 아넬로좀(anellosome), 예를 들어, 합성 아넬로좀을 제공한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀(예를 들어, 입자, 예를 들어, 바이러스 입자, 예를 들어, 아넬로바이러스 입자)은 유전 요소를 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포) 내로 도입할 수 있는 단백질성 외부(예를 들어, 아넬로바이러스 캡시드 단백질, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부)에 캡슐화된 유전 요소(예를 들어, 치료적 DNA 서열을 포함하는 유전 요소)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 아넬로바이러스 ORF1 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 알파토르크바이러스(alphatorquevirus), 베타토르크바이러스(Betatorquevirus) 또는 감마토르크바이러스(Gammatorquevirus)의 ORF1 핵산, 예를 들어, 알파토르크바이러스 클레이드 1, 알파토르크바이러스 클레이드 2, 알파토르크바이러스 클레이드 3, 알파토르크바이러스 클레이드 4, 알파토르크바이러스 클레이드 5, 알파토르크바이러스 클레이드 6 또는 알파토르크바이러스 클레이드 7의 ORF1)에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부를 포함하는 입자이다. 본 개시내용의 아넬로좀의 유전 요소는 전형적으로 환형 및/또는 단일-가닥 DNA 분자(예를 들어, 환형 및 단일 가닥)이며, 일반적으로, 이를 둘러싸는 단백질성 외부 또는 이에 부착된 폴리펩티드에 결합하는 단백질 결합 서열을 포함하며, 이는 단백질성 외부 내의 유전 요소의 봉입 및/또는 단백질성 외부 내에서 다른 핵산에 비한 유전 요소의 농축을 용이하게 할 수 있다. 일부 예에서, 유전 요소는 환형 또는 선형이다. 일부 예에서, 유전 요소는 예를 들어, 세포 내에서 발현될 수 있는 이펙터(예를 들어, 핵산 이펙터, 예컨대 비-코딩 RNA 또는 폴리펩티드 이펙터, 예를 들어, 단백질)를 포함하거나, 이를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 치료제 또는 치료적 이펙터이다. 일부 예에서, 이펙터는 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 또는 표적 세포에 대하여 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터이다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 야생형 아넬로바이러스 또는 표적 세포에 대하여 외인성이다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 세포와 접촉시키고, 이펙터를 인코딩하는 유전 요소를 세포 내로 도입하여, 이펙터가 세포에 의해 제조되거나 발현되게 함으로써 이펙터를 세포 내로 운반할 수 있다. 특정 예에서, 이펙터는 내인성 이펙터이다(예를 들어, 표적 세포에 대하여 내인성이지만, 예를 들어, 아넬로좀에 의해 증가된 양으로 제공된다). 다른 예에서, 이펙터는 외인성 이펙터이다. 이펙터는 일부 예에서, 세포의 기능을 조절하거나, 세포 내의 표적 분자의 활성 또는 수준을 조절할 수 있다. 예를 들어, 이펙터는 (예를 들어, 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이) 세포 내의 표적 단백질의 수준을 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 아넬로좀은 (예를 들어, 실시예 19 및 28에 기재된 바와 같이) 생체 내에서 이펙터, 예를 들어, 외인성 단백질을 운반하고 발현할 수 있다. 아넬로좀은 예를 들어, 유전 물질을 표적 세포, 조직 또는 대상체에 운반하거나; 이펙터를 표적 세포, 조직 또는 대상체에 운반하거나; 또는 예를 들어, 원하는 세포, 조직 또는 대상체에 대하여 치료제로서 작동할 수 있는 이펙터를 운반함으로써 질병 및 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 합성 아넬로좀을 제공한다. 합성 아넬로좀은 야생형 바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스)에 비한 적어도 하나의 구조적 차이, 예를 들어, 야생형 바이러스에 비한 결실, 삽입, 치환, 변형(예를 들어, 효소적 변형)을 갖는다. 일반적으로, 합성 아넬로좀은 단백질성 외부 내에 봉입된 외인성 유전 요소를 포함하며, 이는 유전 요소 또는 그 내에 인코딩된 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)(예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 이펙터)를 진핵(예를 들어, 인간) 세포 내로 운반하기 위해 사용될 수 있다. 실시형태들에서, 아넬로좀은 검출 가능하고/가능하거나 원하지 않는 면역 또는 염증 반응을 야기하지 않으며, 예를 들어, 염증의 분자 마커(들), 예를 들어, TNF-알파, IL-6, IL-12, IFN, 및 B-세포 반응, 예를 들어, 반응성 또는 중화 항체의 1%, 5%, 10%, 15% 초과의 증가를 야기하지 않으며, 예를 들어, 아넬로좀은 표적 세포, 조직 또는 대상체에 대하여 실질적으로 비-면역원성일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 서열, 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열, 예를 들어, 패키징 신호)을 포함하는 유전 요소; 및 (ii) 단백질성 외부를 포함하는 아넬로좀을 특징으로 하며; 유전 요소는 단백질성 외부(예를 들어, 캡시드) 내에 봉입되며; 아넬로좀은 유전 요소를 진핵(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간) 세포 내로 운반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단일-가닥 및/또는 환형 DNA이다. 대안적으로 또는 조합하여, 유전 요소는 하기의 특성 중 1개, 2개, 3개 또는 전부를 갖는다: 환형이고/환형이거나, 단일-가닥이고/단일-가닥이거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.0001%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 세포의 게놈 내로 통합되고/통합되거나, 게놈당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30 카피 미만으로 표적 세포의 게놈 내로 통합됨. 일부 실시형태에서, 통합 빈도는 문헌[Wang et al. (2004, Gene Therapy 11: 711-721), 본원에 그의 전체가 참조로 포함됨]에 기재된 바와 같이 결정된다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입된다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 야생형 아넬로바이러스의 서열(예를 들어, 야생형 토르크 테노 바이러스(TTV), 토르크 테노 미니 바이러스(TTMV) 또는 TTMDV 서열, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 서열)에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열(예를 들어, 300 내지 4000개 뉴클레오티드, 예를 들어, 300 내지 3500개 뉴클레오티드, 300 내지 3000개 뉴클레오티드, 300 내지 2500개 뉴클레오티드, 300 내지 2000개 뉴클레오티드, 300 내지 1500개 뉴클레오티드의 핵산 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 야생형 아넬로바이러스의 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 서열)에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열(예를 들어, 적어도 300개 뉴클레오티드, 500개 뉴클레오티드, 1000개 뉴클레오티드, 1500개 뉴클레오티드, 2000개 뉴클레오티드, 2500개 뉴클레오티드, 3000개 뉴클레오티드 또는 그 이상의 핵산 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서의 발현을 위하여 코돈-최적화된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열 내의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 코돈은 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서의 발현을 위하여 코돈-최적화된다.
일 양태에서, 본 발명은 캡시드에 결합하는 단백질 결합 서열 및 치료적 이펙터를 인코딩하는 (아넬로바이러스에 대한) 이종 서열을 포함하는 유전 요소를 캡슐화하는 아넬로바이러스 캡시드(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF, 예를 들어, ORF1, 폴리펩티드를 포함하는 캡시드)를 포함하는 (인간 세포에 대한) 감염성 입자를 특징으로 한다. 실시형태들에서, 입자는 유전 요소를 포유동물, 예를 들어, 인간, 세포 내로 운반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 야생형 아넬로바이러스에 대하여 약 6% 미만(예를 들어, 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5% 미만 또는 그 이하)의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 야생형 아넬로바이러스에 대하여 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5% 또는 6% 이하의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 야생형 아넬로바이러스에 대하여 적어도 약 2% 내지 적어도 약 5.5%(예를 들어, 2 내지 5%, 3% 내지 5%, 4% 내지 5%)의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2000, 3000, 4000, 4500 또는 5000개 초과의 비-바이러스 서열(예를 들어, 비 아넬로바이러스 게놈 서열)의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2000 내지 5000개, 2500 내지 4500개, 3000 내지 4500개, 2500 내지 4500개, 3500 또는 4000개, 4500개(예를 들어, 약 3000 내지 4500개) 초과의 비-바이러스 서열(예를 들어, 비 아넬로바이러스 게놈 서열)의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단일-가닥, 환형 DNA이다. 대안적으로, 또는 조합하여, 유전 요소는 하기의 특성 중 1개, 2개 또는 3개를 갖는다: 환형이거나, 단일 가닥이거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 세포의 게놈 내로 통합되거나, 게놈당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30 카피 미만으로 표적 세포의 게놈 내로 통합되거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.0001%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 통합됨. 일부 실시형태에서, 통합 빈도는 문헌[Wang et al. (2004, Gene Therapy 11: 711-721), 본원에 그의 전체가 참조로 포함됨]에 기재된 바와 같이 결정된다.
또한, 아넬로바이러스에 기초한 바이러스 벡터 및 바이러스 입자가 본원에 기재되며, 이는 제제(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터, 예를 들어, 치료적 이펙터)를 세포(예를 들어, 치료적으로 처치할 대상체 내의 세포)에 운반하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스는 제제, 예컨대 본원에 기재된 이펙터를 표적 세포, 예를 들어, 치료적으로 또는 예방적으로 처치할 대상체 내의 표적 세포로 도입하기 위한 유효한 운반 비히클로서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하기를 (예를 들어, 연속하여) 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 합성 폴리펩티드, 예를 들어, ORF1 분자)를 특징으로 한다:
(i) 아르기닌-풍부 영역, 예를 들어, 본원에 기재된 아르기닌-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 적어도 60%, 70% 또는 80%의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌, 라이신 또는 그의 조합)를 포함하는 적어도 약 40개의 아미노산의 서열을 포함하는 제1 영역,
(ii) 젤리-롤(jelly-roll) 도메인, 예를 들어, 본원에 기재된 젤리-롤 영역 서열에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 적어도 6개의 베타 가닥을 포함하는 서열을 포함하는 제2 영역,
(iii) 본원에 기재된 N22 도메인 서열에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제3 영역,
(iv) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 C-말단 도메인(CTD) 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제4 영역, 및
(v) 선택적으로 폴리펩티드는 본원에 기재된 야생형 아넬로바이러스 ORF1 단백질에 대하여 100%, 99%, 98%, 95%, 90%, 85%, 80% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가짐.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 ORF1 분자의 하위서열(예를 들어, 아르기닌(Arg)-풍부 도메인, 젤리-롤 도메인, 초가변 영역(HVR), N22 도메인 또는 C-말단 도메인(CTD))에 대하여 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 일 실시형태에서, (i), (ii), (iii) 및 (iv) 영역의 아미노산 서열은 그들의 각각의 기준서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가지며, 폴리펩티드는 본원에 기재된 야생형 아넬로바이러스 ORF1 단백질에 대하여 100%, 99%, 98%, 95%, 90%, 85%, 80% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 분자), 및 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는 복합체를 특징으로 한다.
본 개시내용은 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소를 포함하는 핵산 분자 또는 본원에 기재된 바와 같은 단백질성 외부 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자)를 추가로 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소, 및 (b) 본원에 기재된 바와 같은 단백질성 외부 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 이펙터, 예를 들어, 페이로드를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소, 및 외부 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는 단리된 핵산 분자를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 외부 단백질 결합 서열은 본원에 개시된 바와 같은, 아넬로바이러스의 5'UTR 서열에 대하여 적어도 75%(적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 100%) 동일한 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 단일-가닥 DNA이고/단일-가닥 DNA이거나, 환형이고/환형이거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 통합되고/통합되거나, 게놈당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30 카피 미만으로 표적 세포의 게놈 내로 통합되거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 통합된다. 일부 실시형태에서, 통합 빈도는 문헌[Wang et al. (2004, Gene Therapy 11: 711-721), 본원에 그의 전체가 참조로 포함됨]에 기재된 바와 같이 결정된다. 실시형태들에서, 이펙터는 TTV로부터 기원하지 않으며, SV40-miR-S1이 아니다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 TTMV-LY2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 실시형태들에서, 프로모터 요소는 진핵(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간) 세포에서 이펙터의 발현을 지시할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 환형이다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 선형이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 핵산 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 염기 변형, 당 변형 또는 백본 변형)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 ORF1 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 ORF2 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF2 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 ORF3 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF3 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 (i) 프로모터 요소 및 이펙터, 예를 들어, 외인성 또는 내인성 이펙터를 인코딩하는 서열; (ii) 야생형 아넬로바이러스 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 적어도 72개의 인접 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100 또는 150개 뉴클레오티드); 또는 야생형 아넬로바이러스 서열에 대하여 적어도 72%(예를 들어, 적어도 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 적어도 100개(예를 들어, 적어도 300, 500, 1000, 1500개)의 인접 뉴클레오티드; 및 (iii) 단백질 결합 서열, 예를 들어, 외부 단백질 결합 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 포함하는 유전 요소를 특징으로 하며, 핵산 구축물은 단일-가닥 DNA이며; 핵산 구축물은 환형이고/환형이거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 통합되고/통합되거나, 게놈당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30 카피 미만으로 표적 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시형태에서, 이펙터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 외인성 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 유전 요소는 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 환형이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 선형이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 염기 변형, 당 변형 또는 백본 변형)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 ORF1 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 ORF2 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF2 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 ORF3 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF3 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 숙주 세포 또는 헬퍼 세포를 특징으로 한다: (a) ORF1 분자, ORF2 분자 또는 ORF3 분자 중 하나 이상을 인코딩하는 서열(예를 들어, 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 폴리펩티드를 인코딩하는 서열)을 포함하는 핵산으로서, 핵산이 플라스미드이거나, 바이러스 핵산이거나, 헬퍼 세포 염색체 내로 통합되는 핵산; 및 (b) 유전 요소로서, 유전 요소가 (i) 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소 및 (ii) (a)의 폴리펩티드에 결합하는 단백질 결합 서열을 포함하며, 선택적으로, 유전 요소가 ORF1 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 단백질)를 인코딩하지 않는 유전 요소. 예를 들어, 숙주 세포 또는 헬퍼 세포는 (a) 및 (b)를 시스(동일한 핵산 분자의 두 부분) 또는 트랜스(상이한 핵산 분자의 각각의 부분)로 포함한다. 실시형태들에서, (b)의 유전 요소는 환형, 단일-가닥 DNA이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 제조(manufacturing) 세포주이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포 또는 헬퍼 세포는 부착성이거나, 현탁액 중에 존재하거나, 둘 모두이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포 또는 헬퍼 세포는 마이크로캐리어에서 성장된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포 또는 헬퍼 세포는 cGMP 제조 실무와 양립 가능하다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포 또는 헬퍼 세포는 세포 성장을 촉진시키기에 적합한 배지 중에 성장된다. 특정 실시형태에서, 일단 숙주 세포 또는 헬퍼 세포가 (예를 들어, 적절한 세포 밀도로) 충분히 성장하면, 배지를 숙주 세포 또는 헬퍼 세포에 의한 아넬로좀의 생성에 적합한 배지로 교체할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀(예를 들어, 합성 아넬로좀)을 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 실시형태들에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 실시형태들에서, 약제학적 조성물은 표적 대상체 킬로그램당 약 105 내지 1014개의 게놈 당량의 아넬로좀을 포함하는 단위 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 허용 가능한 기간 및 온도에 걸쳐 안정할 것이고/것이거나 요망되는 투여 경로 및/또는 투여 경로가 필요로 할 임의의 디바이스, 예를 들어, 니들(needle) 또는 주사기와 양립 가능할 것이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 단회 용량 또는 다회 용량으로서의 투여를 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 투여 장소에서, 예를 들어, 의료 전문가(healthcare professional)에 의해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 (예를 들어, 부피당 게놈의 수에 의해 정의된 바와 같은) 요망되는 농도의 아넬로좀 게놈 또는 게놈 당량을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서의 질병 또는 장애의 치료 방법을 특징으로 하며, 당해 방법은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 세포, 조직 또는 대상체에 운반하는 방법을 특징으로 하며, 당해 방법은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 아넬로좀은 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 페이로드는 핵산이다. 실시형태들에서, 페이로드는 폴리펩티드이다.
일 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀을 예를 들어, 생체 내에서 또는 생체 외에서, 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포로의 아넬로좀의 운반 방법을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 제조 방법을 특징으로 한다. 당해 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 숙주 세포를 제공하는 단계로서:
(i) 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 유전 요소의 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 분자, 및
(ii) 제1 핵산, 또는 예를 들어, 표 16의 어느 하나에 열거된 것과 같은, ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
b) 숙주 세포를 아넬로좀을 제조하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계.
일부 실시형태에서, 당해 방법은 단계 (a) 이전에, 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산 분자는 제1 핵산 분자 이전에, 이와 동시에, 또는 이후에 숙주 세포 내로 도입된다. 다른 실시형태에서, 제2 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산 분자는 헬퍼(예를 들어, 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스의 게놈)이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 아넬로좀 조성물의 제조 방법을 특징으로 한다:
a) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 하나 이상의 구성성분(예를 들어, 모든 구성성분)을 포함하는, 예를 들어, 발현하는 숙주 세포를 제공하는 단계. 예를 들어, 숙주 세포는 (a) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산으로서, 핵산이 플라스미드이거나, 바이러스 핵산이거나, 헬퍼 세포 염색체 내로 통합되는 핵산; 및 (b) 유전 요소로서, 유전 요소가 (i) 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소, 및 (i) (a)의 폴리펩티드에 결합하는 단백질 결합 서열(예를 들어, 패키징 서열)을 포함하는 유전 요소를 포함하며, 숙주 세포 또는 헬퍼 세포는 (a) 및 (b)를 시스로 또는 트랜스로 포함한다. 실시형태들에서, (b)의 유전 요소는 환형, 단일-가닥 DNA이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 제조 세포주이다;
b) 숙주 세포를 숙주 세포로부터 아넬로좀의 제제를 생성하기에 적합한 조건 하에서 배양함으로써, 아넬로좀의 제제를 제조하는 단계로서, 제제의 아넬로좀이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 유전 요소를 캡슐화하는 (예를 들어, ORF1 분자를 포함하는) 단백질성 외부를 포함하는 단계; 및
선택적으로, c) 아넬로좀의 제제를 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계.
일부 실시형태에서, 아넬로좀의 구성성분은 생성 시에 (예를 들어, 일시적 트랜스펙션에 의해) 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 아넬로좀의 구성성분을 안정하게 발현한다(예를 들어, 아넬로좀의 구성성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 예를 들어, 안정한 트랜스펙션에 의해 숙주 세포 또는 그의 자손 내로 도입된다).
일부 실시형태에서, 당해 방법은 하나 이상의 정제 단계(예를 들어, 침강, 크로마토그래피 및/또는 한외여과에 의한 정제)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 정제 단계는 제제로부터 혈청, 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질, 유전 요소가 결여된 입자 및/또는 페놀 레드(phenol red) 중 하나 이상을 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생성된 제제 또는 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 허용 가능한 기간 및 온도에 걸쳐 안정할 것이고/것이거나 요망되는 투여 경로 및/또는 투여 경로가 필요로 할 임의의 디바이스, 예를 들어, 니들 또는 주사기와 양립 가능할 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 a) 복수의 본원에 기재된 아넬로좀 또는 본원에 기재된 아넬로좀의 제제를 제공하는 단계; 및 b) 아넬로좀 또는 그의 제제를 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하는 아넬로좀 조성물의 제조 방법을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 아넬로좀을 포함하는 숙주 세포, 예를 들어, 제1 숙주 세포 또는 생성자 세포(예를 들어, 도 12에 나타낸 바와 같음), 예를 들어, 제1 숙주 세포의 집단의 제조 방법을 특징으로 하며, 당해 방법은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 유전 요소를 숙주 세포에 도입하는 단계 및 숙주 세포를 아넬로좀의 생성에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함한다. 실시형태들에서, 당해 방법은 헬퍼, 예를 들어, 헬퍼 바이러스를 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 실시형태들에서, 도입하는 단계는 아넬로좀을 이용한 숙주 세포의 트랜스펙션(예를 들어, 화학적 트랜스펙션) 또는 전기천공법을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀을 포함하는 숙주 세포, 예를 들어, 제1 숙주 세포 또는 생성자 세포(예를 들어, 도 12에 나타낸 바와 같음)를 제공하는 단계 및 숙주 세포로부터 아넬로좀을 정제하는 단계를 포함하는 아넬로좀의 제조 방법을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 제공하는 단계 이전에, 숙주 세포를 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀과 접촉시키는 단계 및 숙주 세포를 아넬로좀의 생성에 적합한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함한다. 실시형태들에서, 숙주 세포는 상기 숙주 세포의 제조 방법에 기재된 제1 숙주 세포 또는 생성자 세포이다. 실시형태들에서, 숙주 세포로부터 아넬로좀을 정제하는 단계는 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 당해 방법은 제1 숙주 세포 또는 생성자 세포에 의해 생성되는 아넬로좀을 제2 숙주 세포, 예를 들어, 허용 세포(예를 들어, 도 12에 나타낸 바와 같음), 예를 들어, 제2 숙주 세포의 집단과 접촉시키는 제2 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 제2 숙주 세포를 아넬로좀의 생성에 적합한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 제2 숙주 세포로부터 아넬로좀을 정제함으로써, 예를 들어, 아넬로좀 씨드 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 실시형태들에서, 제1 숙주 세포의 집단으로부터보다 제2 숙주 세포의 집단으로부터 적어도 약 2 내지 100배 더 많은 아넬로좀이 생성된다. 실시형태들에서, 제2 숙주 세포로부터 아넬로좀을 정제하는 단계는 제2 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 제2 숙주 세포에 의해 생성되는 아넬로좀을 제3 숙주 세포, 예를 들어, 허용 세포(예를 들어, 도 12에 나타낸 바와 같음), 예를 들어, 제3 숙주 세포의 집단과 접촉시키는 제2 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 제3 숙주 세포를 아넬로좀의 생성에 적합한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 제3 숙주 세포로부터 아넬로좀을 정제함으로써, 예를 들어, 아넬로좀 스톡(stock) 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 실시형태들에서, 제3 숙주 세포로부터 아넬로좀을 정제하는 단계는 제3 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함한다. 실시형태들에서, 제2 숙주 세포의 집단으로부터보다 제3 숙주 세포의 집단으로부터 적어도 약 2 내지 100배 더 많은 아넬로좀이 생성된다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 세포 성장을 촉진시키기에 적합한 배지에서 성장된다. 특정 실시형태에서, 일단 숙주 세포가 (예를 들어, 적절한 세포 밀도로) 충분하게 성장되면, 배지를 숙주 세포에 의한 아넬로좀의 생성에 적합한 배지로 교체할 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포에 의해 생성되는 아넬로좀은 제2 숙주 세포와의 접촉 이전에 (예를 들어, 숙주 세포를 용해시킴으로써) 숙주 세포로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포에 의해 생성되는 아넬로좀은 사이의 정제 단계 없이 제2 숙주 세포와 접촉된다.
일 양태에서, 본 발명은 약제학적 아넬로좀 제제의 제조 방법을 특징으로 한다. 당해 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀 제제를 제조하는 단계, (b) 제제(예를 들어, 약제학적 아넬로좀 제제, 아넬로좀 씨드 집단 또는 아넬로좀 스톡 집단)를 하나 이상의 약제학적 품질 관리 파라미터, 예를 들어, 아이덴티티, 순도, 역가, 효력(예를 들어, 아넬로좀 입자당 게놈 당량) 및/또는 예를 들어, 아넬로좀에 포함되는 유전 요소로부터의 핵산 서열에 대하여 평가하는 단계, 및 (c) 평가가 사전결정된 기준을 만족시키는, 예를 들어, 약제학적 규격을 만족시키는 약제학적 이용을 위한 제제를 제형화하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아이덴티티를 평가하는 것은 아넬로좀의 유전 요소의 서열, 예를 들어, 이펙터를 인코딩하는 서열을 평가하는 것(예를 들어, 확인하는 것)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 순도를 평가하는 것은 불순물, 예를 들어, 마이코플라스마, 내독소, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 동물-유래 과정 불순물(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 제제(RCA), 예를 들어, 복제-적격 바이러스 또는 원치 않는 아넬로좀(예를 들어, 요망되는 아넬로좀, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 합성 아넬로좀 이외의 아넬로좀), 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래성 물질(adventitious agent) 및 응집물의 양을 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 역가를 평가하는 것은 (예를 들어, HPLC에 의해 평가되는 바와 같은) 제제 내의 기능성 대 비-기능성(예를 들어, 감염성 대 비-감염성) 아넬로좀의 비를 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효력을 평가하는 것은 제제에서 검출 가능한 아넬로좀 기능(예를 들어, 그 내에 인코딩된 이펙터의 발현 및/또는 기능 또는 게놈 당량)의 수준을 평가하는 것을 포함한다.
실시형태들에서, 제형화된 제제는 병원체, 숙주 세포 오염물질 또는 불순물이 실질적으로 없거나; 사전결정된 비-감염성 입자의 수준 또는 사전결정된 입자:감염성 유닛의 비(예를 들어, 300:1 미만, 200:1 미만, 100:1 미만 또는 50:1 미만)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중 아넬로좀이 단일의 뱃치(batch)에서 생성될 수 있다. 실시형태들에서, 뱃치에서 생성되는 아넬로좀의 수준이 (예를 들어, 개별적으로 또는 함께) 평가될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다:
(i) 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀의 유전 요소의 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 분자, 및
(ii) 선택적으로, 표 16 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 분자.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 아넬로좀 및 헬퍼 바이러스를 포함하는 반응 혼합물을 특징으로 하며, 헬퍼 바이러스는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 외부 단백질(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열에 결합할 수 있는 외부 단백질 및 선택적으로 지질 외피)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 복제 단백질(예를 들어, 중합효소)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀(예를 들어, 합성 아넬로좀)은 단리되며, 예를 들어, 숙주 세포로부터 단리되고/단리되거나 용액(예를 들어, 상청액) 중 다른 구성요소로부터 단리된다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀(예를 들어, 합성 아넬로좀)은 예를 들어, 용액(예를 들어, 상청액)으로부터 정제된다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 용액 중 다른 구성요소에 비하여 용액 중에서 농축된다.
전술된 아넬로좀, 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일부 실시형태에서, 아넬로좀을 제공하는 것은 아넬로좀을 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 아넬로좀-생성 세포를 포함하는 조성물로부터 분리하는 것(예를 들어, 수집하는 것)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 아넬로좀을 제공하는 것은 아넬로좀 또는 그의 제제를 예를 들어, 제3자로부터 수득하는 것을 포함한다.
아넬로좀, 아넬로벡터, 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일부 실시형태에서, 유전 요소는 예를 들어, 실시예 9에 기재된 방법에 따라 확인되는 바와 같은, 아넬로좀 게놈을 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로좀 게놈은 TTV-tth8 핵산 서열의 뉴클레오티드 3436 내지 3707의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 결실을 갖는, TTV-tth8 핵산 서열, 예를 들어, 표 5에 나타낸 TTV-tth8 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로좀 게놈은 TTMV-LY2 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 1371, 1432 내지 2210, 574 내지 2210 및/또는 2610 내지 2809의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 결실을 갖는 TTMV-LY2 핵산 서열, 예를 들어, 표 15에 나타낸 TTMV-LY2 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로좀 게놈은 자가-복제할 수 있고/있거나 자가-증폭할 수 있는 아넬로좀 게놈이다. 실시형태들에서, 아넬로좀 게놈은 자가-복제할 수 없고/없거나 자가-증폭할 수 없다. 실시형태들에서, 아넬로좀 게놈은 예를 들어, 헬퍼, 예를 들어, 헬퍼 바이러스의 존재 하에 트랜스로 복제할 수 있고/있거나 증폭할 수 있다.
아넬로좀, 아넬로벡터, 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 추가의 특징은 하기 열거된 실시형태 중 하나 이상을 포함한다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시형태의 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 하기 열거된 실시형태에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
열거된 실시형태
1000. 폴리펩티드, 예를 들어, ORF1 분자로서:
(a) 본원에 기재된 아르기닌-풍부 영역 서열(예를 들어, MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVR(SEQ ID NO: 216) 또는 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRVRRRRRWRRGRRKTRTYRRRRRFRRRGRK(SEQ ID NO: 186) 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같음)에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 적어도 60%, 70% 또는 80%의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌, 라이신 또는 그의 조합)를 포함하는 적어도 약 40개 아미노산의 서열을 포함하는 제1 영역;
(b) 본원에 기재된 젤리-롤 영역 서열(예를 들어, PTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNT(SEQ ID NO: 217) 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같음)에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 적어도 6개(예를 들어, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개) 베타 가닥을 포함하는 서열을 포함하는 제2 영역;
(c) 본원에 기재된 N22 도메인 서열(예를 들어, TMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFK(SEQ ID NO: 219) 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같음)에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제3 영역; 및
(d) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 C-말단 도메인(CTD) 서열(예를 들어, WGGSPPKAINVENPAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ(SEQ ID NO: 220) 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같음)에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제4 영역 중 하나 이상을 포함하며;
ORF1 분자가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 ORF1 단백질에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 화학적 또는 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, HVR, N22 또는 CTD 중 하나 이상)의 결실을 포함하는, 폴리펩티드, 예를 들어, ORF1 분자.
1000A. (a), (b), (c) 및 (d)의 영역의 아미노산 서열이 그들의 각각의 기준서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 실시형태 1000의 폴리펩티드.
1001. 폴리펩티드가 하기를 포함하는, 실시형태 1000의 폴리펩티드:
(i) 제1 영역 및 제2 영역;
(ii) 제1 영역 및 제3 영역;
(iii) 제1 영역 및 제4 영역;
(iv) 제2 영역 및 제3 영역;
(v) 제2 영역 및 제4 영역;
(vi) 제3 영역 및 제4 영역;
(vii) 제1 영역, 제2 영역 및 제3 영역;
(viii) 제1 영역, 제2 영역 및 제4 영역;
(ix) 제1 영역, 제3 영역 및 제4 영역; 또는
(x) 제2 영역, 제3 영역 및 제4 영역.
1002. 폴리펩티드, 예를 들어, ORF1 분자로서:
(a) 본원에 기재된 아르기닌-풍부 영역 서열(예를 들어, MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVR(SEQ ID NO: 216) 또는 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRVRRRRRWRRGRRKTRTYRRRRRFRRRGRK(SEQ ID NO: 186) 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같음)에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 적어도 60%, 70% 또는 80%의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌, 라이신 또는 그의 조합)를 포함하는 적어도 약 40개 아미노산의 서열을 포함하는 제1 영역;
(b) 본원에 기재된 젤리-롤 영역 서열(예를 들어, PTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNT(SEQ ID NO: 217) 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같음)에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 적어도 6개의 베타 가닥을 포함하는 서열을 포함하는 제2 영역;
(c) 본원에 기재된 N22 도메인 서열(예를 들어, TMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFK(SEQ ID NO: 219) 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같음)에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제3 영역; 및
(d) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 C-말단 도메인(CTD) 서열(예를 들어, WGGSPPKAINVENPAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ(SEQ ID NO: 220) 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같음)에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제4 영역 중 하나 이상을 포함하며;
ORF1 분자가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 ORF1 단백질에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 화학적 또는 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, HVR, N22 또는 CTD 중 하나 이상)의 결실을 포함하는, 폴리펩티드, 예를 들어, ORF1 분자.
1002A. (a), (b), (c) 및 (d) 영역의 아미노산 서열이 그들의 각각의 기준서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 실시형태 1002에 따른 폴리펩티드.
1003. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서,
제1 영역이 표 16에 열거된 ORF1 서열의 아미노산 1 내지 38에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나;
제2 영역이 표 16에 열거된 ORF1 서열의 아미노산 39 내지 246에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나;
제3 영역이 표 16에 열거된 ORF1 서열의 아미노산 375 내지 537에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나;
제4 영역이 표 16에 열거된 ORF1 서열의 아미노산 538 내지 666에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
1003A. 제1, 제2, 제3 및 제4 영역의 아미노산 서열이 그들의 각각의 기준서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 실시형태 1003에 따른 폴리펩티드.
1004. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서,
제1 영역이 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나;
제2 영역이 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 젤리-롤 영역 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나;
제3 영역이 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 N22 도메인 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나;
제4 영역이 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 CTD 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
1004A. 제1, 제2, 제3 및 제4 영역의 아미노산 서열이 그들의 각각의 기준 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 실시형태 1004에 따른 폴리펩티드.
1005. 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 순서로, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역 및 제4 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1006. 적어도 하나의 차이가 야생형 ORF1 단백질의 아르기닌-풍부 영역에 비한 제1 영역 내의 적어도 하나의 차이를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1007. 제1 영역은 폴리펩티드 또는 제1 영역을 배제한 그의 부분이 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스의 ORF1 단백질 유래의 아르기닌-풍부 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1008. 제1 영역은 폴리펩티드가 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스 유래의 아르기닌-풍부 영역에 대하여 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1009. 제1 영역이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 또는 제1 영역과 동일한 아미노산 길이를 갖는 그의 부분에 대하여 15% 미만(예를 들어, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만)의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1010. 제1 영역이 DNA 결합 활성 및/또는 핵 국소화 활성을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1011. 제1 영역이 DNA-결합 영역 및/또는 핵 국소화 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1012. 적어도 하나의 차이가 야생형 ORF1 단백질의 젤리-롤 영역에 비한 제2 영역 내의 적어도 하나의 차이를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1013. 제2 영역은 폴리펩티드 또는 제2 영역을 배제한 그의 부분이 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스의 ORF1 단백질 유래의 젤리-롤 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1014. 제2 영역은 폴리펩티드가 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스 유래의 젤리-롤 영역에 대하여 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1015. 제2 영역이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 또는 제2 영역과 동일한 아미노산 길이를 갖는 그의 부분에 대하여 15% 미만(예를 들어, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만)의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1016. 적어도 하나의 차이가 야생형 ORF1 단백질의 N22 도메인에 비한 제3 영역 내의 적어도 하나의 차이를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1017. 제3 영역은 폴리펩티드 또는 제3 영역을 배제한 그의 부분이 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스의 ORF1 단백질 유래의 N22 도메인을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1018. 제3 영역은 폴리펩티드가 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스 유래의 N22 영역에 대하여 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1019. 제3 영역이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 또는 제3 영역과 동일한 아미노산 길이를 갖는 그의 부분에 대하여 15% 미만(예를 들어, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만)의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1020. 적어도 하나의 차이가 야생형 ORF1 단백질의 CTD 도메인에 비한 제4 영역 내의 적어도 하나의 차이를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1021. 제4 영역은 폴리펩티드 또는 제4 영역을 배제한 그의 부분이 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스의 ORF1 단백질 유래의 CTD 도메인을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1022. 제4 영역은 폴리펩티드가 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스 유래의 CTD 영역에 대하여 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1023. 제4 영역이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 또는 제4 영역과 동일한 아미노산 길이를 갖는 그의 부분에 대하여 15% 미만(예를 들어, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만)의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1024. 아미노산 서열, 예를 들어, 초가변 영역(HVR) 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 분자의 HVR 서열)을 추가로 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드로서, 아미노산 서열이 적어도 약 55개(예를 들어, 적어도 약 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 65개)의 아미노산(예를 들어, 약 45 내지 160개, 50 내지 160개, 55 내지 160개, 60 내지 160개, 45 내지 150개, 50 내지 150개, 55 내지 150개, 60 내지 150개, 45 내지 140개, 50 내지 140개, 55 내지 140개 또는 60 내지 140개의 아미노산)을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1025. HVR 서열이 제2 영역과 제3 영역 사이에 위치한, 실시형태 1024의 폴리펩티드.
1026. HVR 서열은 ORF1 단백질이 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스 유래의 HVR에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 1024 또는 1025의 폴리펩티드.
1027. HVR 서열이 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역 및/또는 제4 영역 중 하나 이상에 비하여 이종인, 실시형태 1024 내지 1026 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1028. 적어도 하나의 차이가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 게놈 유래의) 야생형 ORF1 단백질의 HVR의 서열에 비한 HVR 서열 내의 적어도 하나의 차이를 포함하는, 실시형태 1024 내지 1027 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1029. HVR 서열은 폴리펩티드 또는 HVR 서열을 배제한 그의 부분이 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스의 ORF1 단백질 유래의 HVR을 포함하는, 실시형태 1024 내지 1028 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1030. HVR 서열은 폴리펩티드가 가장 큰 서열 동일성을 갖는 야생형 아넬로바이러스 이외의 아넬로바이러스 유래의 HVR에 대하여 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 1024 내지 1029 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1031. HVR이 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 HVR 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 1024 내지 1030 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1032. HVR 서열이 표 16에 열거된 ORF1 서열의 아미노산 247 내지 374에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 포함하는, 실시형태 1024 내지 1031 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1033. 이종 폴리펩티드, 예를 들어, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역 및/또는 제4 영역 중 하나 이상에 비하여 이종이고/이종이거나, 폴리펩티드를 포함하는 아넬로좀에 비하여 외인성인 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1034. 폴리펩티드는 아넬로바이러스 HVR 서열이 결여된, 실시형태 1033의 폴리펩티드.
1035. 이종 폴리펩티드가 아넬로좀의 외부에 존재하는, 실시형태 1033의 폴리펩티드.
1036. 이종 폴리펩티드가 아넬로좀의 내부에 존재하는, 실시형태 1033의 폴리펩티드.
1037. 이종 폴리펩티드가 아넬로좀 또는 야생형 아넬로바이러스에 대하여 외인성인 작용기를 갖는, 실시형태 1033 내지 1036 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1038. 이종 폴리펩티드가 약 140개 또는 그 미만의 아미노산(예를 들어, 100, 110, 120, 125, 130, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 145, 150, 155 또는 160개 또는 그 미만의 아미노산)으로 이루어진, 실시형태 1033 내지 1037 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1039. 이종 폴리펩티드의 크기가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로바이러스의 야생형 HVR 영역에 비하여 50 내지 150%인, 실시형태 1033 내지 1038 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1039A. 이종 폴리펩티드가 제2 영역과 제3 영역 사이에 위치한, 실시형태 1033 내지 1039 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1040. 제1 영역과 제2 영역 사이의 하나 이상의 아미노산, 제2 영역과 제3 영역 사이의 하나 이상의 아미노산 및/또는 제3 영역과 제4 영역 사이의 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1041. 제1 영역에 비하여 N-말단에 위치한 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1042. 제4 영역에 비하여 C-말단에 위치한 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1043. 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열의 상응하는 하위서열에 대하여 100% 서열 동일성을 갖는 적어도 4개(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30개)의 인접 아미노산의 복수의 하위서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1044. 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열의 상응하는 하위서열에 대하여 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 10개(예를 들어, 10, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50개)의 인접 아미노산의 복수의 하위서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1045. 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열의 상응하는 하위서열에 대하여 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개(예를 들어, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개)의 인접 아미노산의 복수의 하위서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1046. 복수의 하위서열이 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역 및/또는 제4 영역 내에 위치한, 실시형태 1043 내지 1045 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1047. 제1 영역이 적어도 약 40개 아미노산(예를 들어, 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 아미노산, 예를 들어, 약 40 내지 100, 40 내지 90, 40 내지 80, 40 내지 70, 50 내지 100, 50 내지 70, 60 내지 100, 60 내지 90, 60 내지 80 또는 60 내지 70개 아미노산)을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1048. 제1 영역이 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌, 라이신 또는 그의 조합)를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1049. 제1 영역이 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)의 아르기닌 잔기를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1050. 폴리펩티드가 추가의 카피의 폴리펩티드와 동종다량체를 형성하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1051. 제1 영역이 추가의 카피의 폴리펩티드 상의 상응하는 제1 영역에 결합하는, 실시형태 1050의 폴리펩티드.
1052. 동종다량체가 예를 들어, 핵산, 예를 들어, 유전 요소 또는 아넬로바이러스 게놈 또는 그의 부분을 캡슐화하는 캡시드를 형성하는, 실시형태 1050의 폴리펩티드.
1053. 폴리펩티드가 캡시드 단백질이거나, 캡시드의 부분을 형성할 수 있는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1054. 폴리펩티드가 복제효소 활성을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1055. 폴리펩티드가 핵산(예를 들어, DNA)에 결합하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
1056. 복합체로서:
(a) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 및
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는, 복합체.
1057. 복합체로서:
(a) ORF1 분자, 및
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하며;
ORF1 분자가 유전 요소에 결합되고(예를 들어, 이에 비-공유적으로 결합되고),
ORF1 분자, 유전 요소, 또는 ORF1 분자 및 유전 요소 둘 모두가 각각 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 ORF1 단백질, 야생형 아넬로바이러스 게놈, 또는 야생형 ORF1 단백질 및 야생형 아넬로바이러스 게놈 둘 모두에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 화학적 또는 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, HVR, N22 또는 CTD 중 하나 이상) 또는 게놈 영역(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하는, 복합체.
1058. 복합체가 시험관 내에 존재하며, 예를 들어, 복합체가 실질적으로 무세포 조성물 내에 존재하는, 실시형태 1056 또는 1057의 복합체.
1059. 복합체가 세포, 예를 들어, 숙주 세포, 예를 들어, 헬퍼 세포, 예를 들어, 세포의 핵 내에 존재하는, 실시형태 1056 내지 1058 중 어느 한 실시형태의 복합체.
1060. ORF1 분자가 단백질성 외부의 부분인, 실시형태 1056 내지 1059 중 어느 한 실시형태의 복합체.
1061. 유전 요소가 복제를 겪는 중인, 실시형태 1056 내지 1060 중 어느 한 실시형태의 복합체.
1062. 복합체가 아넬로좀 내에 존재하는, 실시형태 1056 내지 1061 중 어느 한 실시형태의 복합체.
1063. 유전 요소가 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 실시형태 1056 내지 1062 중 어느 한 실시형태의 복합체.
1064. 유전 요소가 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 실시형태 1056 내지 1063 중 어느 한 실시형태의 복합체.
1065. 유전 요소가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 GC-풍부 영역을 포함하는, 실시형태 1056 내지 1064 중 어느 한 실시형태의 복합체.
1066. GC-풍부 영역이 하기 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 실시형태 1065의 복합체:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열.
1067. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드 또는 복합체;
(c) 이펙터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소를 포함하는 유전 요소를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되는, 아넬로좀.
1068. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) 유전 요소로서:
(i) 이펙터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소, 및
(ii) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되는, 아넬로좀.
1069. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) ORF1 분자 또는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산;
(c) 이펙터를 인코딩하는 이종 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소를 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되는, 아넬로좀.
1070. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) ORF1 분자 또는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산;
(c) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 하기의 핵산 서열:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 영역을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되며; 선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 아넬로좀.
1071. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) ORF1 분자 또는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산;
(c) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 적어도 70%(예를 들어, 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%)의 GC 함량을 갖는 적어도 20개(예를 들어, 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개)의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 아넬로좀.
1072. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) ORF1 분자 또는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산으로서,
(i) ORF1 분자의 아미노산의 적어도 30%(예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% 이상)가 β-가닥의 부분이고;
(ii) ORF1 분자의 2차 구조가 적어도 3개(예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 β-가닥을 포함하고;
(iii) ORF1 분자의 2차 구조가 적어도 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1의 β-가닥 대 α-나선의 비를 포함하는 ORF1 분자 또는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산; 및
(c) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 아넬로좀.
1073. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) ORF1 분자 또는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산;
(c) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하며;
유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 아넬로좀.
1074. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 하기의 핵산 서열:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 영역을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 아넬로좀.
1075. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 아넬로좀.
1076. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 핵산 서열: CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160)에 대하여 적어도 95%(예를 들어, 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 영역(예를 들어, 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열에 비하여 3'에 위치한, 예를 들어, 패키징 영역)을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되는, 아넬로좀.
1076A. 아넬로좀으로서:
(i) 프로모터 요소 및 치료적 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소로서, 유전 요소가 본원에 기재된(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 유래의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 유전 요소; 및/또는
(ii) 본원에 기재된(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스의 ORF1 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며,
선택적으로, 아넬로좀이 유전 요소를 포유동물 세포 내로 운반할 수 있는, 아넬로좀.
1076B. 아넬로좀으로서:
(I) (a) 프로모터 요소 및 (b) 외인성 이펙터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열로서, 핵산 서열은 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열; 및 (c) 하기:
(c)(i) SEQ ID NO: 54의 뉴클레오티드 323 내지 393의 핵산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일한 핵산 서열;
(c)(ii) SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119 중 어느 하나의 핵산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일한 핵산 서열; 또는
(c)(iii) SEQ ID NO: 61의 뉴클레오티드 117 내지 187의 핵산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일한 핵산 서열 중 하나를 포함하는 5' UTR 도메인을 포함하는 유전 요소;
(II) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부
를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
합성 아넬로좀이 유전 요소를 포유동물, 예를 들어, 인간 세포 내로 운반할 수 있는, 아넬로좀.
1077. 단백질성 외부가 ORF1 분자를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1078. 단백질성 외부 내의 적어도 60%(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 단백질이 ORF1 분자를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1079. 단백질성 외부 내의 1% 이하(예를 들어, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하)의 단백질이 ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3 분자를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1080. ORF1 분자가 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5, 1 내지 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된, 또는 이에 열거된 서열에 의해 인코딩되는 ORF1 단백질에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1081. ORF1 분자가 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1082. 유전 요소가 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1083. 유전 요소가 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1084. 유전 요소가 적어도 80%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1085. 유전 요소가 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1086. 유전 요소가 적어도 80%의 GC 함량을 갖는 적어도 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1087. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는(예를 들어, 1개 또는 2개 이상의 핵산 분자를 포함하는) 단리된 핵산 조성물로서;
선택적으로, 단리된 핵산 조성물이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 추가로 포함하며;
선택적으로, 핵산 분자가
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실; 및/또는
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 단리된 핵산 조성물.
1088. (예를 들어, 1개, 2개 이상의 핵산 분자를 포함하는) 단리된 핵산 조성물로서, 단리된 핵산 조성물이 ORF1 분자를 인코딩하는 유전 요소를 포함하며;
(i) ORF1 분자의 아미노산의 적어도 30%(예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% 이상)가 β-시트의 부분이고;
(ii) ORF1 분자의 2차 구조가 적어도 3개(예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 β-시트를 포함하고;
(iii) ORF1 분자의 2차 구조가 적어도 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1의 β-시트 대 α-나선의 비를 포함하며,
유전 요소가 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열 및 단백질 결합 서열을 포함하며;
유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
선택적으로, 핵산 분자가
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실; 및/또는
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 단리된 핵산 조성물.
1089. (예를 들어, 1개, 2개 이상의 핵산 분자를 포함하는) 단리된 핵산 조성물로서:
(a) ORF1 분자를 인코딩하는 유전 요소;
(b) 핵산 서열:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드; 및
(c) (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
선택적으로, 핵산 분자가
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실; 및/또는
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 단리된 핵산 조성물.
1090. (예를 들어, 1개, 2개 이상의 핵산 분자를 포함하는) 단리된 핵산 조성물로서, 단리된 핵산 조성물이:
(a) ORF1 분자를 인코딩하는 유전 요소;
(b) 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며;
단리된 핵산 조성물이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
선택적으로, 핵산 분자가
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실; 및/또는
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 단리된 핵산 조성물.
1090A. (예를 들어, 1개, 2개 이상의 핵산 분자를 포함하는) 단리된 핵산 조성물로서, 단리된 핵산 조성물이 본원에 기재된(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 유래의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는, 단리된 핵산 조성물.
1091. (a) 및 (b)가 동일한 핵산의 부분인, 실시형태 1089 내지 1090 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1092. (a) 및 (b)가 상이한 핵산의 부분인, 실시형태 1089 내지 1091 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1093. 유전 요소가 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물: 본원에 기재된(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 유래의 TATA 박스, 개시인자 요소, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR 보존된 도메인, ORF1-인코딩 서열, ORF1/1-인코딩 서열, ORF1/2-인코딩 서열, ORF2-인코딩 서열, ORF2/2-인코딩 서열, ORF2/3-인코딩 서열, ORF2/3t-인코딩 서열, 3개의 오픈-리딩 프레임 영역, 폴리(A) 신호 및/또는 GC-풍부 영역, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열.
1094. 유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 게놈 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1095. 적어도 하나의 추가의 카피의 아넬로바이러스 게놈 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열(예를 들어, 총 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 카피)을 추가로 포함하는, 실시형태 1094의 단리된 핵산 조성물.
1096. 적어도 하나의 추가의 카피의 유전 요소(예를 들어, 총 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 카피)를 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1097. 핵산 서열:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드; 및
(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하는 (예를 들어, 1개, 2개 이상의 핵산 분자를 포함하는) 단리된 핵산 조성물로서,
선택적으로, 핵산 분자가
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실; 및/또는
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 단리된 핵산 조성물.
1098. (예를 들어, 1개, 2개 이상의 핵산 분자를 포함하는) 단리된 핵산 조성물로서, 단리된 핵산 조성물이 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하며;
단리된 핵산 조성물이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
선택적으로, 핵산 분자가
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실; 및/또는
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않는, 단리된 핵산 조성물.
1099. ORF1 분자가 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1100. 적어도 80%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1101. 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1102. 적어도 80%의 GC 함량을 갖는 적어도 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1103. 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열, 및/또는 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열) 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1104. 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열의 적어도 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500개의 연속 뉴클레오티드 또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1105. 하기 핵산 서열에 대하여 적어도 95%(예를 들어, 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터):
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172).
1106. 단리된 핵산 분자가 환형인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 조성물.
1107. 단리된 세포로서:
(a) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산으로서, 핵산이 플라스미드이거나, 바이러스 핵산이거나, 세포 염색체 내로 통합되는 핵산, 및
(b) 유전 요소로서, 유전 요소가 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하며, 선택적으로, 유전 요소가 ORF1 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 단백질)를 인코딩하지 않는 유전 요소를 포함하는, 단리된 세포.
1108. 단리된 세포, 예를 들어, 숙주 세포로서:
(a) ORF1 분자를 인코딩하는 핵산으로서, 핵산이 플라스미드이거나, 바이러스 핵산이거나, 세포 염색체 내로 통합되는 핵산, 및
(b) 유전 요소로서, 유전 요소가 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는, 단리된 세포, 예를 들어, 숙주 세포.
1109. 단리된 세포, 예를 들어, 숙주 세포로서:
(a) ORF1 분자를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 핵산이 플라스미드이거나, 바이러스 핵산이거나, 세포 염색체 내로 통합됨), 및
(b) ORF1 분자를 인코딩하지 않는 유전 요소로서, 유전 요소가 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는, 단리된 세포, 예를 들어, 숙주 세포.
1109A. 단리된 세포, 예를 들어, 숙주 세포로서:
(i) 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀의 유전 요소(예를 들어, ORF1 분자를 인코딩하지 않는 유전 요소)의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 제1 핵산 분자), 및
(ii) 선택적으로, 예를 들어, 표 16 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 분자, 예를 들어, 제2 핵산 분자를 포함하는, 단리된 세포, 예를 들어, 숙주 세포.
1110. ORF1 분자를 인코딩하지 않는 유전 요소가 ORF1 분자의 단편, 예를 들어, 캡시드를 형성하지 않는 단편, 예를 들어, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 20 또는 10개 미만의 뉴클레오티드의 단편을 인코딩하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 세포.
1111. ORF1 분자를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 핵산이 플라스미드이거나, 바이러스 핵산이거나, 세포 염색체 내로 통합됨)을 포함하는 단리된 세포, 예를 들어, 숙주 세포로서, 단리된 세포가 ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3 분자 중 하나 이상을 포함하지 않는, 단리된 세포, 예를 들어, 숙주 세포.
1112. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 핵산 조성물을 포함하는, 단리된 세포, 예를 들어, 숙주 세포.
1113. ORF1 분자를 인코딩하는 헬퍼 핵산(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 핵산)으로서, 단리된 세포가 ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3 분자 중 하나 이상을 포함하지 않는, 헬퍼 핵산.
1114. 조성물로서:
(a) 본원에 기재된 단리된 세포, 및
(b) 본원에 기재된 아넬로좀을 포함하는, 조성물.
1115. 조성물로서:
(a) ORF1 분자를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 핵산이 플라스미드이거나, 바이러스 핵산이거나, 세포 염색체 내로 통합됨)을 포함하는 세포, 및
(b) ORF1 분자를 인코딩하지 않는 (예를 들어, 세포 내측 또는 세포 외측의, 예를 들어, 세포 배양 배지 내의) 유전 요소로서, 유전 요소가 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는, 조성물.
1116. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀 또는 단리된 핵산 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
1117. ORF1 분자의 제조 방법으로서, 방법이
(a) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 본원에 기재된 숙주 세포)를 제공하는 단계, 및
(b) 숙주 세포를 세포가 폴리펩티드를 생성하도록 허용하는 조건 하에서 유지하는 단계를 포함하며;
이렇게 함으로써, ORF1 분자를 제조하는, 방법.
1118. ORF1 분자의 제조 방법으로서, 방법이
(a) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 핵산 조성물을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 본원에 기재된 숙주 세포)를 제공하는 단계, 및
(b) 숙주 세포를 세포가 폴리펩티드를 생성하도록 허용하는 조건 하에서 유지하는 단계를 포함하며;
이렇게 함으로써 ORF1 분자를 제조하는, 방법.
1119. 숙주 세포가 헬퍼 세포인, 실시형태 1117 또는 1118의 방법.
1120. 헬퍼 세포가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 아넬로바이러스의 하나 이상의 추가의 ORF(예를 들어, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3 중 하나 이상)를 인코딩하는 하나 이상의 추가의 핵산을 포함하는, 실시형태 1119의 방법.
1121. 핵산이 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는, 실시형태 1117 내지 1120 중 어느 한 실시형태의 방법.
1122. 숙주 세포가 숙주 세포 당 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000 또는 1,000,000개 카피(예를 들어, 적어도 약 60개 카피)의 폴리펩티드를 생성하는, 실시형태 1117 내지 1121 중 어느 한 실시형태의 방법.
1123. 숙주 세포가 숙주 세포에 의해 생성되는 아넬로좀 당 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 10,000 또는 100,000개 카피(예를 들어, 적어도 약 60개 카피)의 폴리펩티드를 생성하는, 실시형태 1117 내지 1122 중 어느 한 실시형태의 방법.
1124. 방법이 복수의 숙주 세포를 제공하는 단계 및 숙주 세포를 세포당 적어도 1000개 카피의 폴리펩티드의 생성을 가능하게 하는 조건 하에서 유지하는 단계를 포함하는, 실시형태 1117 내지 1123 중 어느 한 실시형태의 방법.
1125. 복수의 숙주 세포가 적어도 약 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 9x108, 1x109, 1x1010, 1x1011 또는 1x1012개 카피의 폴리펩티드를 생성하는, 실시형태 1124의 방법.
1126. 아넬로좀 조성물의 제조 방법으로서, 방법이
(a) 헬퍼 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 헬퍼 세포를 제공하는 단계;
(b) 유전 요소를 세포가 아넬로좀을 생성하도록 허용하는 조건 하에서 헬퍼 세포 내로 도입하는 단계, 및
(c) 아넬로좀을 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하며;
이렇게 함으로써 아넬로좀 조성물을 제조하는, 방법.
1127. 아넬로좀 조성물의 제조 방법으로서, 방법이
(a) 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 헬퍼 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계;
(c) 유전 요소를 세포가 아넬로좀을 생성하도록 허용하는 조건 하에서, (예를 들어, (b) 이전에, 이후에 또는 이와 동시에) 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및
(d) 아넬로좀을 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하며;
이렇게 함으로써 아넬로좀 조성물을 제조하는, 방법.
1128. 아넬로좀 조성물의 제조 방법으로서, 방법이
(a) ORF1 분자를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 핵산이 플라스미드이거나, 바이러스 핵산이거나, 헬퍼 세포 염색체 내로 통합됨)을 포함하는 헬퍼 세포를 제공하는 단계;
(b) 유전 요소를 세포가 아넬로좀을 생성하도록 허용하는 조건 하에서 헬퍼 세포 내로 도입하는 단계로서, 유전 요소가 ORF1 분자를 인코딩하지 않으며, 유전 요소가 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 단계; 및
(c) 아넬로좀을 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하며;
이렇게 함으로써 아넬로좀 조성물을 제조하는, 방법.
1129. 아넬로좀 조성물의 제조 방법으로서, 방법이
(a) 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) ORF1 분자를 인코딩하는 헬퍼 핵산(예를 들어, 핵산이 플라스미드이거나, 바이러스 핵산임)을 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및
(c) 유전 요소를 세포가 아넬로좀을 생성하도록 허용하는 조건 하에서, (예를 들어, (b) 이전에, 이후에 또는 이와 동시에) 숙주 세포 내로 도입하는 단계로서, 유전 요소가 ORF1 분자를 인코딩하지 않으며, 유전 요소가 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 단계를 포함하며,
이렇게 함으로써 아넬로좀을 제조하는, 방법.
1130. 아넬로좀을 헬퍼 세포 또는 숙주 세포로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
1131. 헬퍼 세포를 제공하는 단계가 헬퍼 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 예를 들어, 헬퍼 핵산이 ORF1 분자를 인코딩하는(예를 들어, 핵산이 플라스미드이거나 바이러스 핵산임), 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
1132. 헬퍼 세포가 ORF1 분자를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
1133. 핵산이 하기 중 하나 이상을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법: 본원에 기재된(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 유래의 TATA 박스, 개시인자 요소, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR 보존된 도메인, ORF1-인코딩 서열, ORF1/1-인코딩 서열, ORF1/2-인코딩 서열, ORF2-인코딩 서열, ORF2/2-인코딩 서열, ORF2/3-인코딩 서열, ORF2/3t-인코딩 서열, 3개의 오픈-리딩 프레임 영역, 폴리(A) 신호 및/또는 GC-풍부 영역, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열.
1134. 핵산이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 게놈 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
1135. 핵산이 적어도 하나의 추가의 카피의 아넬로바이러스 게놈 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열(예를 들어, 총 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 카피)을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
1136. 숙주 세포 또는 헬퍼 세포가 적어도 하나의 추가의 카피의 핵산(예를 들어, 총 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 카피)을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
1137. 핵산이 환형인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
1137A. 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 제조 방법으로서:
a) 숙주 세포를 제공하는 단계로서:
(i) 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 유전 요소의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자, 예를 들어, 제1 핵산 분자, 및
(ii) 예를 들어, 표 16 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 분자, 예를 들어, 제2 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
b) 숙주 세포를 아넬로좀을 제조하기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
1137B. 단계 (a) 이전에, 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 실시형태 1137A의 방법.
1137C. 제2 핵산 분자가 제1 핵산 분자 이전에, 이와 동시에, 또는 이후에 숙주 세포 내로 도입되는, 실시형태 1137A 또는 1137B의 방법.
1137D. 제2 핵산 분자가 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는, 실시형태 1137C의 방법.
1137E. 제2 핵산 분자가 헬퍼(예를 들어, 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스의 게놈)인, 실시형태 1137C의 방법.
1137F. 제1 핵산이 하기 중 하나 이상을 포함하는, 실시형태 1137A 내지 1137E 중 어느 한 실시형태의 방법: 본원에 기재된(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 유래의 TATA 박스, 개시인자 요소, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR 보존된 도메인 및/또는 GC-풍부 영역, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열.
1138. 아넬로좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체로의 이펙터의 운반 방법으로서, 상기 아넬로좀이:
(a) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 핵산 서열:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 영역을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않고,
이렇게 함으로써 이펙터를 대상체에 운반하는, 방법.
1139. 아넬로좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체로의 이펙터의 운반 방법으로서, 상기 아넬로좀이:
(a) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는 아넬로좀을 대상체에게 투여함으로써 이펙터를 대상체에 운반하는 단계를 포함하는, 대상체로의 이펙터의 운반 방법으로서,
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않고,
이렇게 함으로써 이펙터를 대상체에 운반하는, 방법.
1140. 아넬로좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체로의 이펙터의 운반 방법으로서, 상기 아넬로좀이:
(a) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않고,
이렇게 함으로써 이펙터를 대상체에 운반하는, 방법.
1141. 아넬로좀과 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 세포로의 이펙터의 운반 방법으로서, 상기 아넬로좀이:
(a) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 핵산 서열:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 영역을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않고,
이렇게 함으로써 이펙터를 표적 세포에 운반하는, 방법.
1142. 아넬로좀과 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 세포로의 이펙터의 운반 방법으로서, 상기 아넬로좀이:
(a) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는 아넬로좀을 대상체에게 투여함으로써 이펙터를 대상체에 운반하는 단계를 포함하는, 대상체로의 이펙터의 운반 방법으로서,
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않고,
이렇게 함으로써 이펙터를 표적 세포에 운반하는, 방법.
1143. 아넬로좀과 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 세포로의 이펙터의 운반 방법으로서, 상기 아넬로좀이:
(a) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않고,
이렇게 함으로써 이펙터를 표적 세포에 운반하는, 방법.
1143A. 아넬로좀과 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 세포로의 이펙터의 운반 방법으로서, 상기 아넬로좀이:
(i) 프로모터 요소 및 치료적 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소로서, 유전 요소가 본원에 기재된(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 유래의 5' UTR 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 유전 요소; 및/또는
(ii) 본원에 기재된(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스의 ORF1 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부
를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
선택적으로, 유전 요소가:
(i) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 3436 내지 3607의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(ii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 뉴클레오티드 1432 내지 2210의 결실을 포함하지 않고/않거나;
(iii) 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열에 비하여 적어도 101개 뉴클레오티드의 결실을 포함하지 않고,
이렇게 함으로써 이펙터를 표적 세포에 운반하는, 방법.
1144. 유전 요소가 NCBI 수탁 번호 A7XCE8.1의 아미노산 서열을 인코딩하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1145. ORF1 분자가 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 ORF1 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1146. ORF1 분자의 적어도 30%(예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% 이상)의 아미노산이 β-시트의 부분인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1147. ORF1 분자의 2차 구조가 적어도 3개(예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 β-시트를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1148. ORF1 분자의 2차 구조가 적어도 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1의 β-시트 대 α-나선의 비를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1149. ORF1 분자가 (예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 아르기닌-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는) 아르기닌-풍부 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1150. 아르기닌-풍부 영역이 적어도 40%(예를 들어, 적어도 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 아르기닌 잔기를 포함하는 적어도 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45 또는 50개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 실시형태 1149의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1151. 아르기닌-풍부 영역이 ORF1 분자의 N-말단 또는 C-말단에 위치하는, 실시형태 1149 또는 1150의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1152. 아르기닌-풍부 영역이 아미노산 서열 TVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(SEQ ID NO: 808), RRRYARPYRRRHIRRYRRRRRHFRRRR(SEQ ID NO: 809), MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVR(SEQ ID NO: 216) 또는 MAWGWWKRRRRWWFRKRWTRGRLRRRWPRSARRRPRRRRVRRRRRWRRGRRKTRTYRRRRRFRRRGRK(SEQ ID NO: 186)에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는, 실시형태 1149 내지 1151 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1153. 아르기닌-풍부 영역이 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 아르기닌-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는, 실시형태 1149 내지 1152 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1154. ORF1 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 ORF1 분자의 젤리-롤 도메인, 예를 들어, 아미노산 서열 PTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNT(SEQ ID NO: 217)를 갖는 젤리-롤 도메인 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 젤리-롤 도메인 서열의 아미노산 서열에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 젤리-롤 도메인을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1155. ORF1 분자가 본원에 기재된 ORF1 분자의 N22 도메인, 예를 들어, 아미노산 서열 TMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFK(SEQ ID NO: 219)를 갖는 N22 도메인 또는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 N22 도메인 서열의 아미노산 서열에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 N22 도메인을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1156. ORF1 분자가 세포의 핵에 국소화되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1157. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열의 약 500, 1000, 1100, 1200, 1210 또는 1219개의 연속 뉴클레오티드에 비하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이하의 서열 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1158. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 알파토르크바이러스(예를 들어, 클레이드 1, 2 또는 3 알파토르크바이러스) 게놈 서열의 약 500, 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3450, 3460, 3470, 3480, 3490, 3500, 3510, 3520, 3530, 3540, 3550, 3560, 3570 또는 3580개의 연속 뉴클레오티드에 비하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이하의 서열 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1159. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 베타토르크바이러스 게놈 서열의 약 500, 1000, 1100, 1200, 1210 또는 1219개의 연속 뉴클레오티드에 비하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이하의 서열 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1160. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 감마토르크바이러스 게놈 서열의 약 500, 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3120, 3130, 3140, 3141 또는 3142개의 연속 뉴클레오티드에 비하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이하의 서열 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1161. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 알파토르크바이러스(예를 들어, 클레이드 1, 2 또는 3 알파토르크바이러스) 게놈 서열의 적어도 약 500, 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3450, 3460, 3470, 3480, 3490, 3500, 3510, 3520, 3530, 3540, 3550, 3560, 3570 또는 3580개의 연속 뉴클레오티드(예를 들어, 약 500 내지 3580개, 1000 내지 3580개, 1500 내지 3580개, 2000 내지 3580개 또는 3000 내지 3580개의 연속 뉴클레오티드)에 비하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1162. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 베타토르크바이러스 게놈 서열의 적어도 약 500, 1000, 1100, 1200, 1210 또는 1219개의 연속 뉴클레오티드(예를 들어, 약 500 내지 1000개, 500 내지 1100개, 500 내지 1200개, 500 내지 1219개, 1000 내지 1100개, 1000 내지 1200개 또는 1000 내지 1219개의 연속 뉴클레오티드)에 비하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1163. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 감마토르크바이러스 게놈 서열의 적어도 약 500, 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3120, 3130, 3140, 3141 또는 3142개의 연속 뉴클레오티드(예를 들어, 약 500 내지 3142개, 1000 내지 3142개, 1500 내지 3142개, 2000 내지 3142개 또는 2500 내지 3142개의 연속 뉴클레오티드)에 비하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1164. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTMV-LY2 게놈 서열의 약 500, 1000, 1100, 1200, 1210 또는 1219개의 연속 뉴클레오티드에 비하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하의 서열 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1165. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 TTV-tth8 게놈 서열의 약 500, 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3550, 3560, 3570, 3580 또는 3581개의 연속 뉴클레오티드에 비하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이하의 서열 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1166. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 적어도 1578, 1579, 1580, 1590, 1600, 1650, 1700, 1750 또는 2000개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1167. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 1 내지 99개, 1 내지 90개, 1 내지 80개, 1 내지 70개, 1 내지 60개, 1 내지 50개, 10 내지 99개, 10 내지 90개, 10 내지 80개, 10 내지 70개, 10 내지 60개, 10 내지 50개, 20 내지 99개, 20 내지 90개, 20 내지 80개, 20 내지 70개, 20 내지 60개, 20 내지 50개, 30 내지 99개, 30 내지 90개, 30 내지 80개, 30 내지 70개, 30 내지 60개, 30 내지 50개, 40 내지 99개, 40 내지 90개, 40 내지 80개, 40 내지 70개, 40 내지 60개 또는 40 내지 50개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1168. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 100개의 뉴클레오티드 결실, 172개의 뉴클레오티드 결실 또는 1577개의 뉴클레오티드 결실을 갖지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1169. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 3개 이상의 결실을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1170. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 하기 핵산 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172).
1171. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 하기 핵산 서열에 대하여 적어도 95%(예를 들어, 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172).
1172. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 핵산 서열 CCGCCATCTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGG(SEQ ID NO: 161)에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1173. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 핵산 서열 CTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGGACAATTTCTTCCGGGTCAAAGGTTACAGCCGCCATGTTAAAACACGTGACGTATGACGTCACGGCCGCCATTTTGTGACACAAGATGGCCGACTTCCTTCC(SEQ ID NO: 162)에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1174. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 적어도 80%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1175. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1176. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 적어도 80%의 GC 함량을 갖는 적어도 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1177. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로바이러스, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1178. 프로모터 요소, 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열 또는 단백질 결합 서열이 각각 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5 또는 1 내지 18 중 어느 하나의 아넬로바이러스의 프로모터 요소, 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열 또는 단백질 결합 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1179. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열에 비하여 3'에 위치한 패키징 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1180. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열에 비하여 5'에 위치한 패키징 영역을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1181. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 본원에 기재된 아넬로바이러스의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3의 아미노산 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아넬로바이러스 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1182. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 단일-가닥 DNA를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1183. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 환형이고/환형이거나, 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 진핵 세포의 게놈 내로 통합되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1184. 유전 요소 또는 단리된 핵산이 야생형 아넬로바이러스 서열(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 토르크 테노 바이러스(TTV), 토르크 테노 미니 바이러스(TTMV) 또는 TTMDV 서열, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 서열) 또는 이로부터의 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 그의 부분에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1185. 단백질 결합 서열이 표 20에 나타낸 컨센서스 5' UTR 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1186. 단백질 결합 서열이 표 21에 나타낸 컨센서스 GC-풍부 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1187. 단백질 결합 서열이 표 38에 나타낸 5' UTR 서열 및 표 39에 나타낸 GC-풍부 서열에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1188. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나의 핵산 서열의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1189. 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17의 핵산 서열의 아넬로바이러스 GC-풍부 영역에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1190. 프로모터 요소가 RNA 중합효소 II-의존성 프로모터, RNA 중합효소 III-의존성 프로모터, PGK 프로모터, CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, SV40 프로모터, CAGG 프로모터 또는 UBC 프로모터, TTV 바이러스 프로모터, 조직 특이적, U6(pollIII), 활성화제 단백질(TetR-VP16, Gal4-VP16, dCas9-VP16 등)에 대한 상류 DNA 결합 부위를 갖는 최소 CMV 프로모터를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1191. 이펙터가 치료제, 예를 들어, 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 치료적 핵산을 인코딩하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1192. 이펙터가 조절 핵산, 예를 들어, miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA; 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드, 천연-생물활성 펩티드 유래의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항미생물 펩티드, 포어-형성 펩티드, 바이사이클릭 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 소분자, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 사멸 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제(intercalating agent), 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드, 항체, 수용체, 또는 CRISPR 시스템 또는 성분을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1193. 아넬로좀이 자가 복제 가능한, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
1194. 발현 벡터가 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 파지 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자.
1195. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 또는 아넬로좀을 포함하는 단리된 세포.
1196. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로바이러스, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스의 ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3을 추가로 포함하는, 실시형태 195의 단리된 세포.
1197. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 단리된 세포 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체로의 이펙터의 운반 방법으로서, 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 이펙터를 인코딩하며, 이펙터가 대상체에서 발현되는, 방법.
1198. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 단리된 세포 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질병 또는 장애의 치료 방법으로서, 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 치료제를 인코딩하며, 치료제가 대상체에서 발현되는, 방법.
1199. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 단리된 세포 또는 조성물을 세포 또는 세포의 집단에 도입하는 단계를 포함하는 생체 외의 세포 또는 세포의 집단(예를 들어, 대상체로부터 수득되는 세포 또는 세포의 집단)으로의 이펙터의 운반 방법으로서; 유전 요소 또는 단리된 핵산 분자가 이펙터를 인코딩하며, 이펙터가 세포 또는 세포의 집단에서 발현되는, 방법.
1200. 유전 요소가 단일-가닥 DNA이며, 하기의 특성 중 하나 또는 둘 모두를 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀: 환형임 및/또는 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 진핵 세포의 게놈 내로 통합됨.
1201. 유전 요소가 야생형 아넬로바이러스 서열(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 토르크 테노 바이러스(TTV), 토르크 테노 미니 바이러스(TTMV) 또는 TTMDV 서열, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 서열)에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1202. 단백질 결합 서열이 표 38에 나타낸 컨센서스 5' UTR 서열에 대하여 또는 표 39에 나타낸 컨센서스 GC-풍부 서열, 또는 표 38에 나타낸 컨센서스 5' UTR 서열 및 표 39에 나타낸 컨센서스 GC-풍부 서열 둘 모두에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1203. 프로모터 요소가 RNA 중합효소 II-의존성 프로모터, RNA 중합효소 III-의존성 프로모터, PGK 프로모터, CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, SV40 프로모터, CAGG 프로모터 또는 UBC 프로모터, TTV 바이러스 프로모터, 조직 특이적, U6(pollIII), 활성화제 단백질(TetR-VP16, Gal4-VP16, dCas9-VP16 등)에 대한 상류 DNA 결합 부위를 갖는 최소 CMV 프로모터를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1204. 프로모터 요소가 TATA 박스를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1205. 프로모터 요소가 야생형 아넬로바이러스, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 6, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 서열에 대하여 내인성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1206. 프로모터 요소가 야생형 아넬로바이러스, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 6, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 서열에 대하여 외인성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1207. 이펙터가 치료제, 예를 들어, 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 치료적 핵산을 인코딩하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1208. 이펙터가 조절 핵산, 예를 들어, miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA; 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드, 천연-생물활성 펩티드 유래의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항미생물 펩티드, 포어-형성 펩티드, 바이사이클릭 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 소분자, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 사멸 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제, 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드, 항체, 수용체, 또는 CRISPR 시스템 또는 성분을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1209. 이펙터가 miRNA를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1210. 이펙터, 예를 들어, miRNA가 숙주 유전자를 표적화하고, 예를 들어, 유전자의 발현을 조절하고, 예를 들어, 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1211. 이펙터가 miRNA를 포함하며, 숙주 유전자의 발현을 감소시키는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1212. 이펙터가 약 20 내지 200개, 30 내지 180개, 40 내지 160개, 50 내지 140개 또는 60 내지 120개 뉴클레오티드 길이의 핵산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1213. 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열이 약 20 내지 200개, 30 내지 180개, 40 내지 160개, 50 내지 140개 또는 60 내지 120개 뉴클레오티드 길이인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1214. 이펙터를 인코딩하는 서열이 적어도 약 100개 뉴클레오티드의 크기를 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1215. 이펙터를 인코딩하는 서열이 약 100 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 크기를 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1216. 이펙터를 인코딩하는 서열이 약 100 내지 200개, 200 내지 300개, 300 내지 400개, 400 내지 500개, 500 내지 600개, 600 내지 700개, 700 내지 800개, 800 내지 900개, 900 내지 1000개, 1000 내지 1500개 또는 1500 내지 2000개 뉴클레오티드의 크기를 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1217. 이펙터를 인코딩하는 서열이 (예를 들어, ORF1 유전자좌의 C-말단에서) ORF1 유전자좌, miRNA 유전자좌, TATA 박스의 상류 5' 비코딩 영역, 5' UTR, 폴리-A 영역의 하류 3' 비코딩 영역, 또는 유전 요소의 GC-풍부 영역의 상류 비코딩 영역 중 하나 이상에, 또는 그 내에 또는 그에 인접하게(예를 들어, 이에 대하여 5' 또는 3'에) 위치하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1218. 이펙터를 인코딩하는 서열이 폴리-A 영역과 유전 요소의 GC-풍부 영역 사이에 위치하는, 실시형태 1217의 아넬로좀.
1219. 단백질 결합 서열이 야생형 아넬로바이러스, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 6, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 서열의 5' UTR 보존된 도메인 또는 GC-풍부 도메인에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1220. 유전 요소, 예를 들어, 유전 요소의 단백질 결합 서열이 하기에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀:
(i) 표 38에 나타낸 컨센서스 5' UTR 핵산 서열;
(ii) 표 38에 나타낸 예시적인 TTV 5' UTR 핵산 서열;
(iii) 표 38에 나타낸 TTV-CT30F 5' UTR 핵산 서열;
(iv) 표 38에 나타낸 TTV-HD23a 5' UTR 핵산 서열;
(v) 표 38에 나타낸 TTV-JA20 5' UTR 핵산 서열;
(vi) 표 38에 나타낸 TTV-TJN02 5' UTR 핵산 서열;
(vii) 표 38에 나타낸 TTV-tth8 5' UTR 핵산 서열;
(viii) 표 39에 나타낸 컨센서스 GC-풍부 영역;
(ix) 표 39에 나타낸 예시적인 TTV GC-풍부 영역;
(x) 표 39에 나타낸 TTV-CT30F GC-풍부 영역;
(xi) 표 39에 나타낸 TTV-JA20 GC-풍부 영역;
(xii) 표 39에 나타낸 TTV-TJN02 GC-풍부 영역;
(xiii) 표 39에 나타낸 TTV-HD23a GC-풍부 영역; 또는
(xiv) 표 39에 나타낸 TTV-tth8 GC-풍부 영역.
1221. 단백질성 외부가 단백질 결합 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 외부 단백질을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1222. 단백질성 외부가 하기 중 하나 이상을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀: 하나 이상의 글리코실화된 단백질, 친수성 DNA-결합 영역, 트레오닌-풍부 영역, 글루타민-풍부 영역, N-말단 폴리아르기닌 서열, 가변 영역, C-말단 폴리글루타민/글루탐산염 서열 및 하나 이상의 이황화 가교.
1223. 단백질성 외부가 하기의 특징 중 하나 이상을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀: 정20면체 대칭, 하나 이상의 숙주 세포 분자와 상호작용하는 분자를 인식하고/인식하거나 이에 결합하여, 숙주 세포로의 유입을 매개함, 지질 분자가 결여됨, 탄수화물이 결여됨, pH 및 온도 안정성임, 세제 저항성임 및 숙주에서 실질적으로 비-면역원성이거나 실질적으로 비-병원성임.
1224. 단백질성 외부가 하나 이상의 기능, 예를 들어, 종 및/또는 조직 및/또는 세포 선택성, 유전 요소 결합 및/또는 패키징, 면역 회피(실질적인 비-면역원성 및/또는 관용), 약동학, 엔도시토시스 및/또는 세포 부착, 핵 유입, 세포내 조절 및 국소화, 엑소시토시스 조절, 증식 및 핵산 보호를 제공하는 적어도 하나의 작용성 도메인을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1225. 이펙터를 배제한 유전 요소의 부분이 약 2.5 내지 5 kb(예를 들어, 약 2.8 내지 4kb, 약 2.8 내지 3.2kb, 약 3.6 내지 3.9kb 또는 약 2.8 내지 2.9kb), 약 5kb 미만(예를 들어, 약 2.9kb, 3.2 kb, 3.6kb, 3.9kb 또는 4kb 미만) 또는 적어도 100개 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 1kb)의 조합된 크기를 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1226. 유전 요소가 단일-가닥인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1227. 유전 요소가 환형인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1228. 유전 요소가 DNA인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1229. 유전 요소가 음성 가닥 DNA인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1230. 유전 요소가 에피솜을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1231. 아넬로좀이 중량 기준으로 10%, 5%, 2% 또는 1% 미만의 지질 함량을 갖는, 예를 들어, 지질 이중층을 포함하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1232. 아넬로좀이 외부 지질 이중층을 포함하는 바이러스 입자, 예를 들어, 레트로바이러스에 비하여 세제(예를 들어, 연성 세제, 예를 들어, 담즙염, 예를 들어, 데옥시콜산나트륨)에 의한 분해에 대하여 저항성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1233. 아넬로좀의 적어도 약 50%(예를 들어, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%)가 37℃에서 30분 동안의 세제(예를 들어, 중량 기준 0.5%의 세제)와의 인큐베이션 후에 분해되지 않는, 실시형태 1232의 아넬로좀.
1234. 유전 요소가 야생형 아넬로바이러스 서열, 예를 들어, 야생형 TTV 서열 또는 야생형 TTMV 서열에 비하여 적어도 하나의 요소, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 요소의 결실을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1235. 유전 요소가 하기에 상응하는 핵산 서열을 포함하는 결실을 포함하는, 실시형태 1234의 아넬로좀:
(i) TTV-tth8 서열, 예를 들어, 표 5에 나타낸 핵산 서열의 뉴클레오티드 3436 내지 3607;
(ii) TTMV-LY2 서열, 예를 들어, 표 15에 나타낸 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 1371 및/또는 뉴클레오티드 1432 내지 2210;
(iii) TTMV-LY2 서열, 예를 들어, 표 15에 나타낸 핵산 서열의 뉴클레오티드 1372 내지 1431; 또는
(iv) TTMV-LY2 서열, 예를 들어, 표 15에 나타낸 핵산 서열의 뉴클레오티드 2610 내지 2809.
1236. 유전 요소가 야생형 아넬로바이러스 서열, 예를 들어, 야생형 토르크 테노 바이러스(TTV), 토르크 테노 미니 바이러스(TTMV) 또는 TTMDV 서열, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 것과 같은 서열의 적어도 72개 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 73, 74, 75개 등, 선택적으로 게놈의 전장 미만의 뉴클레오티드)를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1237. 유전 요소가 하기의 서열 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀: 하나 이상의 miRNA를 인코딩하는 서열, 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열, 외인성 유전자를 인코딩하는 서열, 치료제를 인코딩하는 서열, 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 내인성 유전자를 표적화하는 하나 이상의 조절 서열(siRNA, lncRNA, shRNA)을 인코딩하는 서열, 치료적 mRNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열 및 세포용해/세포독성 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열.
1238. 아넬로좀이 제2 유전 요소, 예를 들어, 단백질성 외부 내에 봉입된 제2 유전 요소를 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1239. 제2 유전 요소가 단백질 결합 서열, 예를 들어, 외부 단백질 결합 서열, 예를 들어, 패키징 신호, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 5' UTR 보존된 도메인 또는 GC-풍부 영역을 포함하는, 실시형태 1238의 아넬로좀.
1240. 아넬로좀이 박테리아 세포를 검출 가능하게 감염시키지 않는, 예를 들어, 1%, 0.5%, 0.1% 또는 0.01% 미만의 박테리아 세포를 감염시키는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1241. 아넬로좀이 예를 들어, 시험관 내에서 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, 면역 세포, 간 세포, 상피 세포를 감염시킬 수 있는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1242. 유전 요소가 세포에 유입되는 아넬로좀의 10%, 8%, 6%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1% 미만의 빈도로 통합되며, 예를 들어, 아넬로좀이 비-통합성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1243. 유전 요소가 예를 들어, 정량적 PCR 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 세포당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 102, 2 x 102, 5 x 102, 103, 2 x 103, 5 x 103 또는 104 게놈 당량의 유전 요소를 (예를 들어, 회전환 복제에 의해) 복제할 수 있는, 예를 들어, 생성할 수 있는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1244. 유전 요소가 예를 들어, 정량적 PCR 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 세포로의 유전 요소의 운반 이전에 아넬로좀에 존재하였던 것보다, 세포에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 102, 2 x 102, 5 x 102, 103, 2 x 103, 5 x 103 또는 104 더 많은 게놈 당량의 유전 요소를 (예를 들어, 회전환 복제에 의해) 복제할 수 있는, 예를 들어, 생성할 수 있는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1244A. 단백질성 외부가 유전 요소에 비하여 시스로 및/또는 트랜스로 제공되는 실시형태 1243 또는 1244의 아넬로좀.
1244B. 세포 내의 헬퍼 핵산(예를 들어, 헬퍼 바이러스)이 단백질성 외부 또는 그의 부분(예를 들어, ORF1 분자)을 인코딩하는 실시형태 1243 내지 1244A 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1244C. 하나 이상의 복제 인자(예를 들어, 복제효소)가 유전 요소에 비하여 시스로 및/또는 트랜스로 제공되는 실시형태 1243 내지 1244B 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1244D. 세포 내의 헬퍼 핵산(예를 들어, 헬퍼 바이러스)이 하나 이상의 복제 인자를 인코딩하는 실시형태 1244C의 아넬로좀.
1245. 유전 요소가 복제할 수 없는, 예를 들어, 유전 요소가 복제 원점에서 변경되거나, 복제 원점이 결여된, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1246. 유전 요소가 자가-복제할 수 없는, 예를 들어, 숙주 세포 게놈 내로의 통합 없이 복제될 수 없는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1247. 아넬로좀이 실질적으로 비-병원성이며, 예를 들어, 대상체에서 검출 가능한 유해 증상(예를 들어, 아넬로좀에 노출되지 않은 대상체에 비하여, 예를 들어, 상승된 세포 사멸 또는 독성)을 유도하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1248. 아넬로좀이 실질적으로 비-면역원성이며, 예를 들어, 실시예 4에 기재된 방법에 따라 검출되는 바와 같이, 예를 들어, 검출 가능하고/가능하거나 원치 않는 면역 반응을 유도하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1249. 실질적으로 비-면역원성인 아넬로좀이 면역 반응이 결여된 기준 대상체에서의 효능의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%인 효능을 대상체에서 갖는, 실시형태 1248의 아넬로좀.
1250. 면역 반응이 아넬로좀 또는 그의 부분 또는 그의 핵산에 의해 인코딩되는 생성물에 특이적인 항체; 아넬로좀 또는 아넬로좀을 포함하는 세포에 대한 세포 반응(예를 들어, 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포- 또는 NK 세포) 반응); 또는 아넬로좀 또는 아넬로좀을 포함하는 세포의 대식구 포획(engulfment) 중 하나 이상을 포함하는, 실시형태 1248 또는 1249의 아넬로좀.
1251. 아넬로좀이 AAV보다 면역원성이 더 적거나, 예를 들어, 본원에 기재된 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 비슷한 양의 AAV에 대하여 검출되는 것 미만의 면역 반응을 유도하거나, 본원에 기재된 검정에 의해 측정되는 바와 같이 70% 미만의 항체 보유율(예를 들어, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만의 항체 보유율)을 유도하거나, 실질적으로 비-면역원성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1252. 적어도 1000개의 아넬로좀의 집단이 적어도 약 100개 카피(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 카피)의 유전 요소를 하나 이상의 진핵 세포 내로 운반할 수 있는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1253. 아넬로좀의 집단(예를 들어, 세포당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 게놈 당량의 유전 요소)이 유전 요소를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상의 진핵 세포의 집단 내로 운반할 수 있으며, 예를 들어, 실시예 22에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 진핵 세포가 HEK293T 세포인 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1254. 아넬로좀의 집단(예를 들어, 세포당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 게놈 당량의 유전 요소)이 세포당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 8,000, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107 이상의 카피의 유전 요소를 진핵 세포의 집단에 운반할 수 있으며, 예를 들어, 실시예 22에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 진핵 세포가 HEK293T 세포인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1255. 아넬로좀의 집단(예를 들어, 세포당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 게놈 당량의 유전 요소)이 세포당 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 1000, 1000 내지 104, 1 x 104 내지 1 x 105, 1 x 104 내지 1 x 106, 1 x 104 내지 1 x 107, 1 x 105 내지 1 x 106, 1 x 105 내지 1 x 107 또는 1 x 106 내지 1 x 107 카피의 유전 요소를 진핵 세포의 집단에 운반할 수 있으며, 예를 들어, 실시예 22에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 진핵 세포가 HEK293T 세포인 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1256. 아넬로좀이 적어도 2회의 계대 후에 존재하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1257. 아넬로좀이 적어도 2회의 계대를 포함하는 과정에 의해 생성되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1258. 아넬로좀이 이펙터를 요망되는 세포 유형, 조직 또는 기관(예를 들어, 골수, 혈액, 심장, GI, 피부, 망막 내의 광수용기, 상피 내벽 또는 췌장)에 선택적으로 운반하는 또는 그 내에 더 높은 수준으로 존재하는(예를 들어, 그 내에 우선적으로 축적되는) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1259. 진핵 세포가 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포인 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1260. 아넬로좀 또는 그의 카피가 세포 내로의 운반 24시간(예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 30일 또는 1개월) 후에 세포에서 검출 가능한, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1261. 아넬로좀이 예를 들어, 감염성 검정, 예를 들어, 실시예 7에 따른 검정을 사용하여, 감염 3 내지 4일 후에, 예를 들어, 세포를 감염시키기 위해 사용되는 아넬로좀의 양에 비하여, 적어도 약 108배(예를 들어, 약 105배, 106배, 107배, 108배, 109배 또는 1010배)의 게놈 당량/㎖로 세포 펠렛 및 상청액에서 생성되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
1262. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀을 포함하는 조성물.
1263. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
1264. 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀을 포함하는, 실시형태 1262 또는 1263의 조성물 또는 약제학적 조성물.
1265. 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 합성 아넬로좀을 포함하는, 실시형태 1262 내지 1264 중 어느 한 실시형태의 조성물 또는 약제학적 조성물.
1266. 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는, 실시형태 1262 내지 1265 중 어느 한 실시형태의 조성물 또는 약제학적 조성물:
a) 약제학적 조성물이 약제학적 또는 우수 제조 기준(GMP) 표준을 충족함;
b) 약제학적 조성물이 우수 제조 기준(GMP)에 따라 제조됨;
c) 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 병원체 수준을 가짐, 예를 들어, 실질적으로 병원체가 없음;
d) 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 오염물질 수준을 가짐, 예를 들어, 실질적으로 오염물질이 없음;
e) 약제학적 조성물이 사전결정된 비-감염성 입자의 수준 또는 사전결정된 입자:감염성 유닛의 비(예를 들어, 300:1 미만, 200:1 이하, 100:1 이하 또는 50:1 미만)를 가짐, 또는
f) 약제학적 조성물이 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 낮은 면역원성을 갖거나, 실질적으로 비-면역원성임.
1267. 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 오염물질 수준을 갖는, 예를 들어, 실질적으로 오염물질이 없는, 실시형태 1262 내지 1266 중 어느 한 실시형태의 조성물 또는 약제학적 조성물.
1268. 오염물질이 마이코플라스마, 내독소, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 동물-유래 과정 불순물(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 작용제(RCA), 예를 들어, 복제-적격 바이러스 또는 원치 않는 아넬로좀(예를 들어, 요망되는 아넬로좀, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 합성 아넬로좀 이외의 아넬로좀), 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래 작용제 및 응집물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시형태 1267의 조성물 또는 약제학적 조성물.
1269. 오염물질이 숙주 세포 DNA이며, 임계값 양이 약제학적 조성물 용량당 약 10 ng의 숙주 세포 DNA인, 실시형태 1268의 조성물 또는 약제학적 조성물.
1270. 약제학적 조성물이 중량 기준 10% 미만(예를 들어, 약 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만)의 오염물질을 포함하는, 실시형태 1262 내지 1269 중 어느 한 실시형태의 조성물 또는 약제학적 조성물.
1271. 대상체에서 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 질병 또는 장애를 치료하기 위한 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도.
1272. 대상체에서 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 질병 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 조성물 또는 약제학적 조성물.
1273. 대상체에서의 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 질병 또는 장애의 치료 방법으로서, 상기 방법이 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀(예를 들어, 합성 아넬로좀) 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
1274. 대상체에서의 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 생물학적 기능의 조절, 예를 들어, 향상 또는 저해 방법으로서, 상기 방법이 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀(예를 들어, 합성 아넬로좀) 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
1275. 아넬로좀이 외인성 이펙터를 포함하지 않는, 실시형태 1273 내지 1274 중 어느 한 실시형태의 방법.
1276. 아넬로좀이 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스를 포함하는 실시형태 1273 내지 1275 중 어느 한 실시형태의 방법.
1277. 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 투여가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상의 대상체 내의 표적 세포의 집단 내로의 유전 요소의 운반을 초래하는, 실시형태 1273 내지 1276 중 어느 한 실시형태의 방법.
1278. 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 투여가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상의 대상체 내의 표적 세포의 집단 내로의 이펙터의 운반을 초래하는, 실시형태 1273 내지 1277 중 어느 한 실시형태의 방법.
1279. 표적 세포가 예를 들어, 시험관 내의 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, 면역 세포, 간 세포, 폐 상피 세포를 포함하는, 실시형태 1277 또는 1278의 방법.
1280. 표적 세포가 간 또는 폐에 존재하는, 실시형태 1277 내지 1279 중 어느 한 실시형태의 방법.
1281. 유전 요소가 운반되는 표적 세포가 각각 적어도 10, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 50,000, 100,000개 이상의 카피의 유전 요소를 제공받는, 실시형태 1277 내지 1280 중 어느 한 실시형태의 방법.
1282. 이펙터가 miRNA를 포함하며, miRNA가 예를 들어, 아넬로좀이 운반되는 세포 또는 세포의 집단 내에서 표적 단백질 또는 RNA의 수준을 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 감소시키는, 실시형태 1273 내지 1281 중 어느 한 실시형태의 방법.
1283. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀을 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포로의 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 운반 방법.
1284. 헬퍼 바이러스를 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 실시형태 1283의 방법으로서, 헬퍼 바이러스가 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 외부 단백질, 예를 들어, 외부 단백질 결합 서열에 결합할 수 있는 외부 단백질 및 선택적으로, 지질 외피를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
1285. 아넬로좀을 세포와 접촉시키는 단계 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 헬퍼 바이러스를 세포와 접촉시키는, 실시형태 1284의 방법.
1286. 헬퍼 폴리뉴클레오티드를 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 실시형태 1283의 방법.
1287. 헬퍼 폴리뉴클레오티드가 외부 단백질, 예를 들어, 외부 단백질 결합 서열에 결합할 수 있는 외부 단백질 및 지질 외피를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 실시형태 1286의 방법.
1288. 헬퍼 폴리뉴클레오티드가 RNA(예를 들어, mRNA), DNA, 플라스미드, 바이러스 폴리뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합인, 실시형태 1286의 방법.
1289. 아넬로좀을 세포와 접촉시키는 단계 이전에, 그와 동시에 또는 그 이후에 헬퍼 폴리뉴클레오티드를 세포와 접촉시키는, 실시형태 1286 내지 1288 중 어느 한 실시형태의 방법.
1290. 헬퍼 단백질(예를 들어, 성장 인자)을 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 실시형태 1283 내지 1289 중 어느 한 실시형태의 방법.
1291. 헬퍼 단백질이 바이러스 복제 단백질 또는 캡시드 단백질을 포함하는, 실시형태 1290의 방법.
1292. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀을 포함하는 숙주 세포.
1293. 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 페이로드)를 인코딩하는 서열 및 외부 단백질 결합 서열을 포함하는 핵산 분자로서,
핵산 분자가 단일-가닥 DNA이며, 핵산 분자가 환형이고/환형이거나 세포에 유입되는 핵산 분자의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 통합되며;
이펙터가 TTV로부터 기원하지 않으며, SV40-miR-S1이 아니며;
핵산 분자가 TTMV-LY의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않으며;
프로모터 요소가 진핵 세포에서 이펙터의 발현을 지시할 수 있는, 핵산 분자.
1294. 유전 요소로서:
(i) 프로모터 요소 및 이펙터, 예를 들어, 페이로드를 인코딩하는 서열로서, 선택적으로 이펙터가 야생형 아넬로바이러스 서열에 비하여 외인성인 서열;
(ii) 야생형 아넬로바이러스 서열에 대하여 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 적어도 72개의 인접 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100 또는 150개의 뉴클레오티드); 또는 야생형 아넬로바이러스 서열에 대하여 적어도 72%(예를 들어, 적어도 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 적어도 100개의 인접 뉴클레오티드; 및
(iii) 단백질 결합 서열, 예를 들어, 외부 단백질 결합 서열을 포함하며;
핵산 구축물이 단일-가닥 DNA이며;
핵산 구축물이 환형이고/환형이거나 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 통합되는, 유전 요소.
1295. 아넬로좀 조성물의 제조 방법으로서:
a) 아넬로좀, 예를 들어, 본원에 기재된 합성 아넬로좀의 구성성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 예를 들어, 아넬로좀이 단백질성 외부 및 유전 요소, 예를 들어, 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 서열 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열, 예를 들어, 패키징 신호)을 포함하는 유전 요소를 포함하는 단계;
b) 숙주 세포로부터 아넬로좀을 생성함으로써, 아넬로좀을 제조하는 단계; 및
c) 아넬로좀을 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
1296. 합성 아넬로좀 조성물의 제조 방법으로서:
a) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 따른 복수의 아넬로좀, 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공하는 단계;
b) 선택적으로, 다음 중 하나 이상에 대하여 복수의 아넬로좀, 조성물 또는 약제학적 조성물을 평가하는 단계: 본원에 기재된 오염물질, 광학 밀도 측정치(예를 들어, OD 260), (예를 들어, HPLC에 의한) 입자 개수, 감염성(예를 들어, 형광 및/또는 ELISA에 의해 결정되는 바와 같은, 예를 들어, 입자:감염성 유닛 비); 및
c) 예를 들어, (b)의 파라미터 중 하나 이상이 특정 임계값을 만족한다면, 복수의 아넬로좀을 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
1297. 아넬로좀 조성물이 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015개의 아넬로좀을 포함하거나, 아넬로좀 조성물이 ㎖당 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015개의 아넬로좀 게놈을 포함하는, 실시형태 1296의 방법.
1298. 아넬로좀 조성물이 적어도 10 ㎖, 20 ㎖, 50 ㎖, 100 ㎖, 200 ㎖, 500 ㎖, 1 ℓ, 2 ℓ, 5 ℓ, 10 ℓ, 20 ℓ 또는 50 ℓ를 포함하는, 실시형태 1296 또는 1297의 방법.
1299. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 및 헬퍼 바이러스를 포함하는 반응 혼합물로서, 헬퍼 바이러스가 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 외부 단백질, 예를 들어, 외부 단백질 결합 서열에 결합할 수 있는 외부 단백질 및 선택적으로 지질 외피를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 반응 혼합물.
1300. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 및 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나의 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3, ORF1, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는, 반응 혼합물.
1301. 제2 핵산 서열이 유전 요소의 일부인, 실시형태 1300의 반응 혼합물.
1302. 제2 핵산 서열이 유전 요소의 일부가 아니며, 예를 들어, 제2 핵산 서열이 헬퍼 세포 또는 헬퍼 바이러스에 의해 포함되는, 실시형태 1301의 반응 혼합물.
1303. 합성 아넬로좀으로서:
(i) 비-병원성 외부 단백질을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 이펙터, 예를 들어, 조절 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소; 및
예를 들어, 유전 요소와 회합된, 예를 들어, 이를 둘러싸거나 봉입하는 단백질성 외부를 포함하는, 합성 아넬로좀.
1304. 약제학적 조성물로서
a) 아넬로좀으로서:
(i) 비-병원성 외부 단백질을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 이펙터, 예를 들어, 조절 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소; 및
유전 요소와 회합된, 예를 들어, 이를 둘러싸거나 봉입하는 단백질성 외부를 포함하는 아넬로좀; 및
b) 약제학적 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
1305. 약제학적 조성물로서
a) 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 아넬로좀(예를 들어, 본원에 기재된 합성 아넬로좀)으로서:
(i) 비-병원성 외부 단백질을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 이펙터, 예를 들어, 조절 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소; 및
예를 들어, 유전 요소와 회합된, 예를 들어, 이를 둘러싸거나 봉입하는 단백질성 외부를 포함하는 아넬로좀;
b) 약제학적 부형제, 및 선택적으로,
c) 사전-결정된 양보다 더 적은 마이코플라스마, 내독소, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 동물-유래 과정 불순물(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 작용제(RCA), 예를 들어, 복제-적격 바이러스 또는 원치 않는 아넬로좀, 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래 작용제, 내인성 작용제 및/또는 응집물을 포함하는, 약제학적 조성물.
1306. 하기의 특징 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물: 유전 요소가 단일-가닥 DNA임; 유전 요소가 환형임; 아넬로좀이 비-통합성임; 아넬로좀이 아넬로바이러스 또는 기타 비-병원성 바이러스에 기초한 서열, 구조 및/또는 기능을 가짐; 및 아넬로좀이 비-병원성임.
1307. 단백질성 외부가 비-병원성 외부 단백질을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1308. 단백질성 외부가 하기 중 하나 이상을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물: 하나 이상의 글리코실화된 단백질, 친수성 DNA-결합 영역, 아르기닌-풍부 영역, 트레오닌-풍부 영역, 글루타민-풍부 영역, N-말단 폴리아르기닌 서열, 가변 영역, C-말단 폴리글루타민/글루탐산염 서열 및 하나 이상의 이황화 가교.
1309. 단백질성 외부가 하기의 특징 중 하나 이상을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물: 정20면체 대칭, 하나 이상의 숙주 세포 분자와 상호작용하는 분자를 인식하고/인식하거나 이에 결합하여, 숙주 세포로의 유입을 매개함, 지질 분자가 결여됨, 탄수화물이 결여됨, 하나 이상의 요망되는 탄수화물(예를 들어, 글리코실화)을 포함함, pH 및 온도 안정성임, 세제 저항성임 및 숙주에서 비-면역원성이거나 비-병원성임.
1310. 비-병원성 외부 단백질을 인코딩하는 서열이 표 19에 열거된 하나 이상의 서열 또는 그의 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1311. 비-병원성 외부 단백질이 하나 이상의 기능, 예를 들어, 종 및/또는 조직 및/또는 세포 향성, 바이러스 게놈 결합 및/또는 패키징, 면역 회피(비-면역원성 및/또는 관용), 약동학, 엔도시토시스 및/또는 세포 부착, 핵 유입, 세포내 조절 및 국소화, 엑소시토시스 조절, 증식 및 핵산 보호를 제공하는 적어도 하나의 작용성 도메인을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1312. 이펙터가 조절 핵산, 예를 들어, miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA; 치료제, 예를 들어 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드 치료제, 천연-생물활성 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항-미생물 펩티드, 포어-형성 펩티드, 바이사이클릭 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드 및 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 소분자, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 사멸 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제, 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드 또는 수용체, 및 CRISPR 시스템 또는 구성성분을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1313. 이펙터가 표 40에 열거된 miRNA 서열 중 하나 이상에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1314. 이펙터, 예를 들어, miRNA가 숙주 유전자를 표적화하는, 예를 들어, 유전자의 발현을 조절하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1315. miRNA가 표 40에 열거된 miRNA 서열 중 하나 이상에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1316. 유전 요소가 하기의 서열 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물: 하나 이상의 miRNA를 인코딩하는 서열, 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열, 외인성 유전자를 인코딩하는 서열, 치료제를 인코딩하는 서열, 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 내인성 유전자를 표적화하는 하나 이상의 조절 서열(siRNA, lncRNA, shRNA)을 인코딩하는 서열, 치료적 mRNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열 및 세포용해/세포독성 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열.
1317. 유전 요소가 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물: 숙주 세포의 게놈과 비-통합성임, 에피솜 핵산임, 단일 가닥 DNA임, 약 1 내지 10 kb임, 세포의 핵 내에 존재함, 내인성 단백질에 의해 결합될 수 있음, 및 숙주 유전자를 표적화하는 마이크로RNA를 생성함.
1318. 유전 요소가 적어도 하나의 바이러스 서열, 또는 표 23에 열거된 하나 이상의 서열 또는 그의 단편(예를 들어, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3 분자를 인코딩하는 단편, 및/또는 TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상을 포함하는 단편)에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1319. 바이러스 서열이 단일 가닥 DNA 바이러스(예를 들어, 아넬로바이러스, 비드나바이러스(Bidnavirus), 써코바이러스, 제미니바이러스(Geminivirus), 게노모바이러스(Genomovirus), 이노바이러스(Inovirus), 마이크로바이러스(Microvirus), 나노바이러스(Nanovirus), 파보바이러스(Parvovirus) 및 스피라바이러스(Spiravirus)), 이중 가닥 DNA 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스(Adenovirus), 암풀라바이러스(Ampullavirus), 아스코바이러스(Ascovirus), 아스파바이러스(Asfarvirus), 배큘로바이러스(Baculovirus), 푸셀로바이러스(Fusellovirus), 글로불로바이러스(Globulovirus), 구타바이러스(Guttavirus), 하이트로사바이러스(Hytrosavirus), 헤르페스바이러스(Herpesvirus), 이리도바이러스(Iridovirus), 리포트릭스바이러스(Lipothrixvirus), 니마바이러스(Nimavirus) 및 폭스바이러스(Poxvirus)), RNA 바이러스(예를 들어, 알파바이러스(Alphavirus), 푸로바이러스(Furovirus), 간염 바이러스, 호르데이바이러스(Hordeivirus), 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 트리코르나바이러스(Tricornavirus), 루비바이러스(Rubivirus), 비르나바이러스(Birnavirus), 시스토바이러스(Cystovirus), 파르티티바이러스(Partitivirus) 및 레오바이러스(Reovirus)) 중 적어도 하나로부터의 것인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1320. 바이러스 서열이 하나 이상의 비-아넬로바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 백시니아 바이러스, SV40, 파필로마 바이러스, RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티 바이러스, 단일-가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 간염 바이러스, 또는 이중-가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 로타바이러스로부터의 것인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1321. 단백질 결합 서열이 단백질성 외부의 아르기닌-풍부 영역과 상호작용하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1322. 아넬로좀이 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 복제 가능한, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1323. 아넬로좀이 숙주 세포에서 비-병원성이고/이거나 비-통합성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1324. 아넬로좀이 숙주에서 비-면역원성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1325. 아넬로좀이 숙주 또는 숙주 세포에서 하나 이상의 바이러스 특성, 예를 들어, 선택성, 예를 들어, 감염성, 예를 들어, 면역억제/활성화를 저해/향상시키는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1326. 아넬로좀이 (예를 들어, 표현형, 바이러스 수준, 유전자 발현, 기타 바이러스와의 경쟁, 병태 등을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상) 조절하기에 충분한 양으로 존재하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 조성물.
1327. 적어도 하나의 바이러스 또는 바이러스의 게놈을 포함하는 벡터, 예를 들어, 아넬로좀의 변이체, 예를 들어, 편리공생/고유 바이러스를 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 조성물.
1328. 이종 모이어티, 적어도 하나의 소분자, 항체, 폴리펩티드, 핵산, 표적화제, 영상화제, 나노입자 및 그의 조합을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 조성물.
1329. (i) 비-병원성 외부 단백질을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 이펙터, 예를 들어, 조절 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는 벡터.
1330. 유전 요소가 숙주 세포의 게놈과 통합되지 못하는 상기 실시형태의 벡터.
1331. 유전 요소가 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 복제 가능한, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 벡터.
1332. 예를 들어 유전자, 예를 들어, 인간 유전자의 발현을 조절하기 위해 선택되는 외인성 핵산 서열을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 벡터.
1333. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 벡터 및 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
1334. 벡터가 숙주 세포에서 비-병원성이고/이거나 비-통합성인, 상기 실시형태의 조성물.
1335. 벡터가 숙주에서 비-면역원성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 조성물.
1336. 벡터가 (표현형, 바이러스 수준, 유전자 발현, 기타 바이러스와의 경쟁, 병태 등을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상) 조절하기에 충분한 양으로 존재하는, 상기 실시형태의 조성물.
1337. 적어도 하나의 바이러스 또는 바이러스의 게놈을 포함하는 벡터, 예를 들어, 아넬로좀의 변이체, 편리공생/고유 바이러스, 헬퍼 바이러스, 비-아넬로바이러스를 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 조성물.
1338. 이종 모이어티, 적어도 하나의 소분자, 항체, 폴리펩티드, 핵산, 표적화제, 영상화제, 나노입자 및 그의 조합을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 조성물.
1339. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀의 생성, 증량 및 수집 방법.
1340. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 벡터의 설계 및 제조 방법.
1341. 유효량의 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 조성물을 대상체에게 투여하는 방법.
1342. 표적 세포, 조직 또는 대상체로의 핵산 또는 단백질 페이로드의 운반 방법으로서, 상기 방법이 표적 세포, 조직 또는 대상체를 (a) 바이러스로부터 유래되는 제1 DNA 서열로서, 표적 세포, 조직 또는 대상체를 감염시킬 수 있는 입자의 생성을 가능하게 하기에 충분한 제1 DNA 서열, 및 (a) 핵산 또는 단백질 페이로드를 인코딩하는 제2 DNA 서열을 포함하는 핵산 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 개선이 하기를 포함하는 방법:
제1 DNA 서열이 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 상응하는 서열에 대하여 적어도 80%(적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%) 서열 동일성을 갖는 적어도 500(적어도 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1500, 1600, 1800, 2000)개의 뉴클레오티드를 포함함, 또는
제1 DNA 서열이 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10에 열거된 ORF에 대하여 적어도 80%(적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩함, 또는
제1 DNA 서열이 표 19에 열거된 컨센서스 서열에 대하여 적어도 90%(적어도 95%, 97%, 99%, 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함함.
1343. 표적 세포, 조직 또는 대상체로의 핵산 또는 단백질 이펙터의 운반 방법으로서, 표적 세포, 조직 또는 대상체를 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 (a) 바이러스로부터 유래된 제1 DNA 서열로서, 표적 세포, 조직 또는 대상체를 감염시킬 수 있는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀의 생성을 가능하게 하기에 충분한 제1 DNA 서열 및 (a) 핵산 또는 단백질 이펙터를 인코딩하는 제2 DNA 서열을 포함하는 핵산 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
1344. 야생형 아넬로바이러스 ORF1, ORF2 또는 ORF3 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 분자.
1345. 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 실시형태 1344의 코돈-최적화된 핵산 분자.
1346. 약제학적 조성물로서:
(a) 아넬로좀, 예를 들어, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 및
(b) 소낭, 지질 나노입자(LNP), 적혈구, 엑소좀(예를 들어, 포유동물 또는 식물 엑소좀) 또는 푸소좀(fusosome)으로부터 선택되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
2001. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열)을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가 적어도:
(i) 표 A1에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 72.2%(예를 들어, 적어도 72.2, 72.3, 72.4, 72.5, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 표 A3에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 68.4%(예를 들어, 적어도 68.4, 68.5, 68.6, 68.7, 68.8, 68.9, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 표 A5에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 81.7%(예를 들어, 적어도 81.7, 81.8, 81.9, 82, 83, 84, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 표 A7에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 92.6%(예를 들어, 적어도 92.6, 92.7, 92.8, 92.9, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 표 A9에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 65%(예를 들어, 적어도 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(vi) 표 A11에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 65%(예를 들어, 적어도 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 포함하는 유전 요소;
선택적으로, 유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되는, 아넬로좀.
2002. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열)을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가:
(i) 표 A1에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 또는 1017개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(ii) 표 A3에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 11160, 1170, 1171, 1172, 1173 또는 1174개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(iii) 표 A5에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 671 또는 672개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(iv) 표 A7에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 260, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279 또는 280개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(v) 표 A9에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실; 또는
(vi) 표 A11에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실을 포함하며;
선택적으로, 유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되는, 아넬로좀.
2002. 아넬로좀으로서:
(a) 단백질성 외부;
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열)을 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소가:
(i) 표 B1에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 또는 1017개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(ii) 표 B2에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 11160, 1170, 1171, 1172, 1173 또는 1174개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(iii) 표 B3에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 671 또는 672개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(iv) 표 B4에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 260, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279 또는 280개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실; 또는
(v) 표 B5에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실을 포함하며;
선택적으로, 유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반하도록 구성되는, 아넬로좀.
2003. 유전 요소가 야생형 아넬로바이러스 서열(예를 들어, 야생형 토르크 테노 바이러스(TTV), 토르크 테노 미니 바이러스(TTMV) 또는 TTMDV 서열, 예를 들어, 표 B1 내지 B5, A1, A3, A5, A7, A9, A11, 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13 중 어느 하나에 열거된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 서열)에 비하여 자연 발생 서열이 아닌(예를 들어, 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하는), 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
2004. 아넬로바이러스 ORF1 분자의 아미노산 서열(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
2005. 단백질성 외부가 폴리펩티드를 포함하는 실시형태 2004의 아넬로좀.
2006. 단백질성 외부 내의 적어도 60%(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 단백질이 폴리펩티드를 포함하는 실시형태 2005의 아넬로좀.
2007. 단백질성 외부 내의 적어도 60%(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 단백질이 ORF1 분자를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
2008. 아넬로바이러스 ORF1 분자의 아미노산 서열(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 (예를 들어, 유전 요소 내의) 핵산 분자를 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
2009. 유전 요소가 하기 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 영역을 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열.
2010. 유전 요소가 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 각각 표 38 또는 39에 열거된 바와 같은) 5' UTR 영역 및/또는 GC-풍부 영역을 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀.
2011. 하기 유전 요소를 포함하는 단리된 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터)로서,
(i) 표 A1에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 72.2%(예를 들어, 적어도 72.2, 72.3, 72.4, 72.5, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 표 A3에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 68.4%(예를 들어, 적어도 68.4, 68.5, 68.6, 68.7, 68.8, 68.9, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 표 A5에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 81.7%(예를 들어, 적어도 81.7, 81.8, 81.9, 82, 83, 84, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 표 A7에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 92.6%(예를 들어, 적어도 92.6, 92.7, 92.8, 92.9, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 표 A9에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 65%(예를 들어, 적어도 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(vi) 표 A11에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 대한 적어도 65%(예를 들어, 적어도 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 포함하는 유전 요소;
선택적으로, 유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하는 단리된 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터).
2012. 하기 유전 요소를 포함하는 단리된 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터)로서,
(i) 표 A1에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 또는 1017개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(ii) 표 A3에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 11160, 1170, 1171, 1172, 1173 또는 1174개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(iii) 표 A5에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 671 또는 672개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(iv) 표 A7에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 260, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279 또는 280개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(v) 표 A9에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실; 또는
(vi) 표 A11에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 유전 요소;
선택적으로, 유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하는 단리된 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터).
2012A. 하기 유전 요소를 포함하는 단리된 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터)로서,
(i) 표 B1에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 또는 1017개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(ii) 표 B2에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1110, 1120, 1130, 1140, 1150, 11160, 1170, 1171, 1172, 1173 또는 1174개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(iii) 표 B3에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 671 또는 672개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실;
(iv) 표 B4에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 260, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279 또는 280개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실; 또는
(v) 표 B5에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 서열에 비한, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이하의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 유전 요소;
선택적으로, 유전 요소가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 게놈 서열에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하는 단리된 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터).
2013. 유전 요소가 야생형 아넬로바이러스 서열(예를 들어, 야생형 토르크 테노 바이러스(TTV), 토르크 테노 미니 바이러스(TTMV) 또는 TTMDV 서열, 예를 들어, 표 B1 내지 B5, A1, A3, A5, A7, A9, A11, 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13 중 어느 하나에 열거된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 서열)에 비하여 자연 발생 서열이 아닌(예를 들어, 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, TATA 박스, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR, 오픈 리딩 프레임(ORF), 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함하는), 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자.
2014. 단리된 핵산 분자가 ORF1 분자(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1 분자 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드)를 인코딩하는 유전 요소를 포함하며,
(i) ORF1 분자의 아미노산의 적어도 30%(예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% 이상)가 β-시트의 부분이고;
(ii) ORF1 분자의 2차 구조가 적어도 3개(예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 β-시트를 포함하고;
(iii) ORF1 분자의 2차 구조가 적어도 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1의 β-시트 대 α-나선의 비를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자.
2015. 하기 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열.
2016. 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자.
2017. 유전 요소가 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자: 본원에 기재된(예를 들어, 표 B1 내지 B5, A1, A3, A5, A7, A9 또는 A11 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 유래의 TATA 박스, 개시인자 요소, 캡 부위, 전사 시작 부위, 5' UTR 보존된 도메인, ORF1-인코딩 서열, ORF1/1-인코딩 서열, ORF1/2-인코딩 서열, ORF2-인코딩 서열, ORF2/2-인코딩 서열, ORF2/3-인코딩 서열, ORF2/3t-인코딩 서열, 3개의 오픈-리딩 프레임 영역, 폴리(A) 신호 및/또는 GC-풍부 영역, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열.
2018. 유전 요소가 적어도 1 또는 2개 카피(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 카피)의 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 B1 내지 B5, A1, A3, A5, A7, A9, A11, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 게놈 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자.
2019. 적어도 하나의 추가의 카피의 유전 요소(예를 들어, 총 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 카피)를 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자.
2020. 단리된 핵산 분자가 환형인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자.
2021. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산을 포함하는 (예를 들어, 1개, 2개 이상의 핵산 분자를 포함하는) 단리된 핵산 조성물.
2022. 유전 요소가 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열) 및/또는 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열)을 추가로 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산.
2022A. 유전 요소가 ORF1의 초가변 도메인(HVD) 내의 삽입 또는 치환을 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 단리된 핵산 분자.
2023. 유전 요소가 예를 들어, 표 B1 내지 B5, A1, A3, A5, A7, A9 또는 A11 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은, TATA 박스, 개시인자 부위, 5' UTR 보존된 도메인, ORF1, ORF2, ORF2 하류 서열, ORF2, ORF3, 및/또는 GC-풍부 영역, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열 중 하나 이상을 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산 분자.
2024. 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 (예를 들어, 단백질성 외부 내에) 포함하거나 또는 인코딩하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2025. 유전 요소가 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2026. 유전 요소가 적어도 80%의 GC 함량을 갖는 적어도 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 실시형태 2025의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2027. 유전 요소가 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 80.6%의 GC 함량을 갖는 적어도 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 실시형태 2025의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2028. 유전 요소가 적어도 80%의 GC 함량을 갖는 적어도 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 실시형태 2025의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2029. 유전 요소가 하기 핵산 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 영역(예를 들어, 패키징 영역)을 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172);
또는 이에 대하여 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열.
2030. 패키징 영역이 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열에 비하여 3'에 위치한 실시형태 2029의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2031. 폴리펩티드로서:
(a) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 분자(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)의 아르기닌-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 영역;
(b) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 분자(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)의 젤리-롤 영역 서열에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 영역;
(c) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 분자(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)의 N22 도메인 서열에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제3 영역; 및/또는
(d) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 분자(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)의 아넬로바이러스 ORF1 C-말단 도메인(CTD) 서열에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제4 영역 중 하나 이상을 포함하며,
ORF1 분자가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 ORF1 단백질에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 화학적 또는 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, HVR, N22 또는 CTD 중 하나 이상)의 결실을 포함하는, 폴리펩티드.
2031A. 실시형태 2031의 폴리펩티드로서:
(a) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 분자(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)의 아르기닌-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 영역;
(b) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 분자(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)의 젤리-롤 영역 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 영역;
(c) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 분자(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)의 N22 도메인 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제3 영역; 및/또는
(d) 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 분자(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)의 아넬로바이러스 ORF1 C-말단 도메인(CTD) 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제4 영역 중 하나 이상을 포함하며,
ORF1 분자가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 ORF1 단백질에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경), 예를 들어, 삽입, 치환, 화학적 또는 효소적 변형 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, HVR, N22 또는 CTD 중 하나 이상)의 결실을 포함하는, 폴리펩티드.
2032. 폴리펩티드가 하기를 포함하는 실시형태 2031의 폴리펩티드:
(i) 제1 영역 및 제2 영역;
(ii) 제1 영역 및 제3 영역;
(iii) 제1 영역 및 제4 영역;
(iv) 제2 영역 및 제3 영역;
(v) 제2 영역 및 제4 영역;
(vi) 제3 영역 및 제4 영역;
(vii) 제1 영역, 제2 영역 및 제3 영역;
(viii) 제1 영역, 제2 영역 및 제4 영역;
(ix) 제1 영역, 제3 영역 및 제4 영역; 또는
(x) 제2 영역, 제3 영역 및 제4 영역.
2033. 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 순서로, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역 및 제4 영역을 포함하는, 실시형태 2031 또는 2032의 폴리펩티드.
2034. 아미노산 서열, 예를 들어, 초가변 영역(HVR) 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 분자의 HVR 서열)을 추가로 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드로서, 아미노산 서열이 적어도 약 55개(예를 들어, 적어도 약 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 65개)의 아미노산(예를 들어, 약 45 내지 160개, 50 내지 160개, 55 내지 160개, 60 내지 160개, 45 내지 150개, 50 내지 150개, 55 내지 150개, 60 내지 150개, 45 내지 140개, 50 내지 140개, 55 내지 140개 또는 60 내지 140개의 아미노산)을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
2035. HVR이 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 분자의 아넬로바이러스 ORF1 HVR 서열(예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열)에 대하여 적어도 30%(예를 들어, 적어도 약 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 2034의 폴리펩티드.
2036. HVR 서열이 제2 영역과 제3 영역 사이에 위치한, 실시형태 2034 또는 2035의 폴리펩티드.
2037. HVR이 본원에 기재된 바와 같은 HVR의 하나 이상의 특징을 포함하는, 실시형태 2034 내지 2036 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
2038. 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3의, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 폴리펩티드가 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3 서열에 비한 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이 또는 화학적 변형), 예를 들어, 컨쥬게이션, 부가, 삽입, 치환 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인의 결실을 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
2039. 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3의, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
2040. 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나의 ORF1, ORF2, ORF2 또는 ORF3으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 98%이지만, 99% 이하인 서열 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
2041. 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3으로부터 선택되는 아미노산 서열에 비하여 적어도 1개의, 그러나, 2, 5, 10, 20, 50 또는 100개 이하의 아미노산 차이, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실을 갖는, 폴리펩티드.
2042. 폴리펩티드가 단리된 폴리펩티드인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드.
2043. 복합체로서:
(a) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 및
(b) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열), 및 단백질 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는, 복합체.
2044. 복합체가 본원에 기재된 바와 같은 복합체의 하나 이상의 특징을 포함하는, 실시형태 2043의 복합체.
2045. 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3 분자로부터 선택되는, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열 및 이종 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
2046. 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나의 ORF1 분자로부터 선택되는, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열 및 이종 모이어티를 포함하는, 융합 단백질.
2047. 이종 모이어티가 표적화 모이어티를 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 융합 단백질.
2048. 제1 아미노산 서열이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 및/또는 ORF3 서열에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이 또는 화학적 변형), 예를 들어, 컨쥬게이션, 부가, 삽입, 치환 및/또는 결실, 예를 들어, 도메인의 결실을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 융합 단백질.
2049. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 단리된 핵산, 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는, 숙주 세포.
2050. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 및 헬퍼 바이러스를 포함하는 반응 혼합물로서, 헬퍼 바이러스가 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 외부 단백질, 예를 들어, 외부 단백질 결합 서열에 결합하는 외부 단백질 및 선택적으로, 지질 외피를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 반응 혼합물.
2051. 대상체에서의 질병 또는 장애의 치료 방법으로서, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 단리된 핵산 분자, 융합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
2052. 질병 또는 장애가 면역 장애, 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양) 및 위장 장애로부터 선택되는, 실시형태 2051의 방법.
2053. 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위한 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 단리된 핵산, 융합 단백질 또는 폴리펩티드의 용도.
2054. 질병 또는 장애가 면역 장애, 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암) 및 위장 장애로부터 선택되는, 실시형태 2053의 용도.
2055. 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 단리된 핵산, 조성물 또는 약제학적 조성물.
2055A. 의약으로서 사용하기 위한, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 단리된 핵산, 조성물 또는 약제학적 조성물.
2056. 대상체에서의 생물학적 기능의 조절, 예를 들어, 저해하거나 또는 향상시키는 방법으로서, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 단리된 핵산, 융합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
2057. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀, 단리된 핵산, 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포로의 아넬로좀의 운반 방법.
2058. 헬퍼 바이러스를 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 실시형태 2057의 방법으로서, 헬퍼 바이러스가 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 외부 단백질, 예를 들어, 외부 단백질 결합 서열에 결합하는 외부 단백질 및 선택적으로 지질 외피를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
2059. 헬퍼 바이러스를 아넬로좀과 세포의 접촉 이전에, 이와 동시에 또는 이후에, 세포와 접촉시키는, 실시형태 2058의 방법.
2060. 헬퍼 폴리뉴클레오티드를 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 실시형태 2057의 방법.
2061. 헬퍼 폴리뉴클레오티드가 외부 단백질, 예를 들어, 외부 단백질 결합 서열에 결합하는 외부 단백질 및 지질 외피를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 실시형태 2060의 방법.
2062. 헬퍼 폴리뉴클레오티드가 RNA(예를 들어, mRNA), DNA, 플라스미드, 바이러스 폴리뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합인, 실시형태 2060의 방법.
2063. 헬퍼 폴리뉴클레오티드를 아넬로좀과 세포의 접촉 이전에, 이와 동시에 또는 이후에 세포와 접촉시키는, 실시형태 2060 내지 2062 중 어느 한 실시형태의 방법.
2064. 헬퍼 단백질과 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 실시형태 2057 내지 2063 중 어느 한 실시형태의 방법.
2065. 헬퍼 단백질이 바이러스 복제 단백질 또는 캡시드 단백질을 포함하는, 실시형태 2064의 방법.
2066. 표적 세포, 조직 또는 대상체로의 핵산 또는 단백질 이펙터의 운반 방법으로서, 방법이 표적 세포, 조직 또는 대상체를 (a) 바이러스로부터 유래된 제1 DNA 서열로서, 표적 세포, 조직 또는 대상체를 감염시킬 수 있는 입자의 생성을 가능하게 하기에 충분한 제1 DNA 서열 및 (a) 핵산 또는 단백질 이펙터를 인코딩하는 제2 DNA 서열을 포함하는 핵산 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 개선이 하기를 포함하는, 방법:
제1 DNA 서열이 표 B1 내지 B5, A1, A3, A5, A7, A9 또는 A11 중 어느 하나에 열거된 상응하는 서열에 대하여 적어도 80% (적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%) 서열 동일성을 갖는 적어도 500개(적어도 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1500, 1600, 1800, 2000개)의 뉴클레오티드를 포함함, 또는
제1 DNA 서열이 (예를 들어, 표 C1 내지 C5, A2, A4, A6, A8, A10 또는 A12 중 어느 하나에 열거된) 아넬로바이러스 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3, 및/또는 ORF3 분자에 대하여 적어도 80%(적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩함.
2067. 아넬로좀 조성물의 제조 방법으로서:
a) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀의 구성성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 아넬로좀이 단백질성 외부 및 유전 요소, 예를 들어, 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 서열 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열, 예를 들어, 패키징 신호)을 포함하는 유전 요소를 포함하는 단계;
b) 아넬로좀을 숙주 세포로부터 생성함으로써, 아넬로좀을 제조하는 단계; 및
c) 아넬로좀을 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하며,
선택적으로, 하나 이상의 핵산 분자가 헬퍼 단백질을 인코딩하는, 방법.
2068. 아넬로좀 조성물의 제조 방법으로서:
a) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 따른 복수의 아넬로좀을 제공하는 단계;
b) 선택적으로 복수의 아넬로좀을 본원에 기재된 오염물질, 광학 밀도 측정치(예를 들어, OD 260), (예를 들어, HPLC에 의한) 입자 개수, 감염성(예를 들어, 입자:감염성 유닛 비) 중 하나 이상에 대하여 평가하는 단계; 및
c) 예를 들어, (b)의 파라미터 중 하나 이상이 특정 임계값을 만족하면, 복수의 아넬로좀을 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
2069. 아넬로좀 조성물이 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015개의 아넬로좀을 포함하는, 실시형태 2068의 방법.
2070. 아넬로좀 조성물이 적어도 10 ㎖, 20 ㎖, 50 ㎖, 100 ㎖, 200 ㎖, 500 ㎖, 1 ℓ, 2 ℓ, 5 ℓ, 10 ℓ, 20 ℓ 또는 50 ℓ를 포함하는 실시형태 2068 또는 2069의 방법.
2071. 유전 요소가 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 복제하도록 구성되는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2072. 유전 요소가 예를 들어, 유전자, 예를 들어, 인간 유전자의 발현을 조절하도록 선택된 외인성 핵산 서열을 추가로 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2073. 적어도 60%(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)의 단백질 결합 서열이 G 또는 C로 이루어진 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2074. 유전 요소가 적어도 70%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 또는 약 70 내지 100%, 75 내지 95%, 80 내지 95%, 85 내지 95% 또는 85 내지 90%의 위치에서 G 또는 C로 이루어진 적어도 80, 90, 100, 110, 120, 130 또는 140개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2075. 단백질 결합 서열이 단백질성 외부의 아르기닌-풍부 영역에 결합하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2076. 단백질성 외부가 단백질 결합 서열에 특이적으로 결합하는 외부 단백질을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2077. 이펙터를 배제한 유전 요소의 부분이 약 2.5 내지 5 kb(예를 들어, 약 2.8 내지 4kb, 약 2.8 내지 3.2kb, 약 3.6 내지 3.9kb 또는 약 2.8 내지 2.9kb), 약 5kb 미만(예를 들어, 약 2.9kb, 3.2 kb, 3.6kb, 3.9kb 또는 4kb 미만) 또는 적어도 100개 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 1kb)의 조합된 크기를 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2078. 유전 요소가 단일-가닥인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2079. 유전 요소가 환형인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2080. 유전 요소가 DNA인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2081. 유전 요소가 음성 가닥 DNA인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2082. 유전 요소가 에피솜을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2083. 아넬로좀이 다른 기관 또는 조직에 비해 요망되는 기관 또는 조직에서 더 높은 수준으로 존재하는(예를 들어, 우선적으로 그 내에 축적되는), 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2084. 진핵 세포가 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산.
2085. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산을 포함하는 조성물.
2086. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀 또는 단리된 핵산, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
2087. 약제학적 조성물로서
a) 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀;
b) 약제학적 부형제, 및 선택적으로,
c) 사전결정된 양 미만의 마이코플라스마, 내독소, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 동물-유래 과정 불순물(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 작용제(RCA), 예를 들어, 복제-적격 바이러스 또는 원치 않는 아넬로좀, 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래 작용제 및/또는 응집물을 포함하는 약제학적 조성물.
2088. 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀을 포함하는 실시형태 2085 또는 2086의 조성물 또는 약제학적 조성물.
2089. 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 아넬로좀을 포함하는 실시형태 2085 내지 2088 중 어느 한 실시형태의 조성물 또는 약제학적 조성물.
2090. 약제학적 조성물로서
a) 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 아넬로좀;
b) 약제학적 부형제, 및 선택적으로,
c) 사전결정된 양 미만의 마이코플라스마, 내독소, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 동물-유래 과정 불순물(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 작용제(RCA), 예를 들어, 복제-적격 바이러스 또는 원치 않는 아넬로좀, 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래 작용제 및/또는 응집물을 포함하는 약제학적 조성물.
2091. 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는 실시형태 2085 내지 2090 중 어느 한 실시형태의 조성물 또는 약제학적 조성물:
a) 약제학적 조성물이 약제학적 또는 우수 제조 기준(GMP) 표준을 충족함;
b) 약제학적 조성물이 우수 제조 기준(GMP)에 따라 제조됨;
c) 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 병원체 수준을 가짐, 예를 들어, 실질적으로 병원체가 없음;
d) 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 오염물질 수준을 가짐, 예를 들어, 실질적으로 오염물질이 없음;
e) 약제학적 조성물이 사전결정된 비-감염성 입자의 수준 또는 사전결정된 입자:감염성 유닛의 비(예를 들어, 300:1 미만, 200:1 이하, 100:1 이하 또는 50:1 미만)를 가짐, 또는
f) 약제학적 조성물이 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 낮은 면역원성을 갖거나, 실질적으로 비-면역원성임.
2092. 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 오염물질 수준을 갖는, 예를 들어, 실질적으로 오염물질이 없는, 실시형태 2085 내지 2091 중 어느 한 실시형태의 조성물 또는 약제학적 조성물.
2093. 오염물질이 마이코플라스마, 내독소, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 동물-유래 과정 불순물(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 작용제(RCA), 예를 들어, 복제-적격 바이러스 또는 원치 않는 아넬로좀(예를 들어, 요망되는 아넬로좀, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 합성 아넬로좀 이외의 아넬로좀), 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래 작용제 및 응집물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시형태 92의 조성물 또는 약제학적 조성물.
2094. 오염물질이 숙주 세포 DNA이며, 임계값 양이 약제학적 조성물 용량당 약 500 ng의 숙주 세포 DNA인, 실시형태 2093의 조성물 또는 약제학적 조성물.
2095. 약제학적 조성물이 중량 기준 10% 미만(예를 들어, 약 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만)의 오염물질을 포함하는, 실시형태 2085 내지 2094 중 어느 한 실시형태의 조성물 또는 약제학적 조성물.
2096. 아넬로좀이 외인성 이펙터를 포함하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
2097. 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 투여가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상의 대상체 내의 표적 세포의 집단 내로의 유전 요소의 운반을 초래하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
2098. 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 투여가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상의 대상체 내의 표적 세포의 집단 내로의 외인성 이펙터의 운반을 초래하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
2099. 표적 세포가 예를 들어, 시험관 내의 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, 면역 세포, 간 세포, 폐 상피 세포를 포함하는, 실시형태 2097 또는 2098의 방법.
2100. 표적 세포가 간 또는 폐에 존재하는, 실시형태 2097 내지 2099 중 어느 한 실시형태의 방법.
2101. 유전 요소가 운반되는 표적 세포가 각각 적어도 10, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 50,000, 100,000개 이상의 카피의 유전 요소를 제공받는, 실시형태 2097 내지 2100 중 어느 한 실시형태의 방법.
2102. 이펙터가 miRNA를 포함하며, 선택적으로, miRNA가 예를 들어, 아넬로좀이 운반되는 세포 또는 세포의 집단 내에서 표적 단백질 또는 RNA의 수준을 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 감소시키는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 방법.
2103. 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 5' UTR)가 단백질성 외부(예를 들어, 단백질성 외부 내의 ORF1 분자)에 물리적으로 회합된(예를 들어, 결합된), 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2104. 단백질성 외부 내에 봉입된 유전 요소가 예를 들어, 문헌[Martin et al. (2013, Hum. Gene Ther. Methods 24(4): 253-269; 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)]에 기재된 방법에 따라 결정되는 바와 같이, 엔도뉴클레아제 분해에 대하여 저항성이며; 선택적으로, 사용되는 DNase의 양이 약 60 U/㎖ 또는 약 300 U인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2105. 유전 요소가 적어도 80%의 위치에서 G 또는 C로 이루어진 적어도 100개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2106. 유전 요소가 환형, 단일 가닥 DNA인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2107. 유전 요소가 하나 이상의 박테리아 플라스미드 요소(예를 들어, 박테리아 복제 원점 또는 선택 가능한 마커, 예를 들어, 박테리아 내성 유전자)를 포함하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2108. 유전 요소가 포유동물 세포에 유입되는 아넬로좀의 1% 미만의 빈도로 통합되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2109. 프로모터 요소가 야생형 아넬로바이러스에 대하여 외인성 또는 내인성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2110. 외인성 이펙터가 치료적 외인성 이펙터, 예를 들어, 치료적 펩티드, 치료적 폴리펩티드 또는 치료적 핵산(예를 들어, miRNA)인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2111. 적어도 1000개(예를 들어, 적어도 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 20,000, 50,000, 75,000, 100,000, 200,000, 500,000, 1,000,000개 이상)의 아넬로좀의 집단이 적어도 100개(예를 들어, 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 50,000, 100,000개 이상)의 카피의 유전 요소를 하나 이상의 포유동물 세포 내로 운반하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2112. 아넬로좀이 아넬로바이러스 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1, ORF1/1 또는 ORF1/2(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2113. 유전 요소가 아넬로바이러스 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2114. 아넬로좀이 복제 인자 및 캡시드 단백질 중 하나 또는 둘 모두를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않거나, 아넬로좀이 복제 결함인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2115. 아넬로좀이 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포와 접촉되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2116. 아넬로좀이 아넬로바이러스 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2117. 유전 요소가 (예를 들어, 세포, 예를 들어, 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, HEK293T 또는 A549 세포에서) 회전환 복제에 의해 증폭되어, 예를 들어, 적어도 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 518 또는 1024개의 카피를 생성할 수 있는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2118. 유전 요소가 이중-가닥 환형 DNA 분자로부터 생성되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2119. 이중-가닥 환형 DNA 분자가 시험관 내 환화에 의해 생성되는, 실시형태 2118의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2118. 유전 요소가 유전 요소의 2개 카피의 핵산 서열을 포함하는 DNA 분자로부터 생성되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2119. 유전 요소의 2개 카피의 핵산 서열이 DNA 분자 내에 탠덤으로 배열되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법.
2120. 아넬로좀 유전 요소(예를 들어, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 유전 요소)의 5' UTR을 포함하는 2개 카피의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
2121. 프로모터 요소; 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열; 표 B1 내지 B5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 5' UTR 서열 또는 이에 대하여 적어도 85%(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 표 B1 내지 B5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 GC-풍부 영역 또는 이에 대하여 적어도 85%(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
2122. 핵산 분자가 단일-가닥 또는 이중 가닥인, 실시형태 2121의 핵산 분자.
2123. 핵산 분자가 환형인, 실시형태 2121의 핵산 분자.
2124. 유전 요소가 하기 핵산 서열을 포함하는 5' UTR을 포함하는 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 폴리펩티드, 복합체, 아넬로좀, 단리된 핵산, 세포, 조성물 또는 방법:
CGGGAGCCX1CGAGGTGAGTGAAACCACCGAGGTCTAGGGGCAATTCGGGCTAGGGCAGTCTAGCGGAACGGG, X1 는 C 또는 부재임,
또는 이에 대하여 적어도 95% 동일한 핵산 서열.
3001. 합성 아넬로좀으로서:
(I) 유전 요소로서:
(a) 프로모터 요소,
(b) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결되는 핵산 서열, 및
(c) SEQ ID NO: 878의 뉴클레오티드 185 내지 255의 핵산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR을 포함하는 유전 요소; 및
(ii) SEQ ID NO: 921 또는 927의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부
를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
상기 합성 아넬로좀이 상기 유전 요소를 인간 세포 내로 운반할 수 있는, 합성 아넬로좀.
3002. 유전 요소가 SEQ ID NO: 878의 뉴클레오티드 185 내지 255의 아넬로바이러스 5’ UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대하여 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 실시형태 3001의 합성 아넬로좀.
3003. 유전 요소가 SEQ ID NO: 886의 뉴클레오티드 185 내지 254의 아넬로바이러스 5’ UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대하여 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3004. ORF1 분자가 SEQ ID NO: 878의 뉴클레오티드 512 내지 2545에 의해 인코딩되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3005. ORF1 분자가 SEQ ID NO: 886의 뉴클레오티드 501 내지 2489에 의해 인코딩되는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3006. 유전 요소가 하기의 핵산 서열:
(i) SEQ ID NO: 878의 뉴클레오티드 3141 내지 3264, 또는
(i) SEQ ID NO: 886의 뉴클레오티드 3076 내지 3176;
또는 이에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3007. ORF1 분자가 표 D2 또는 표 D4에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, 초가변 도메인, N22 도메인 및/또는 C-말단 도메인의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3008. ORF1가 하기 아미노산 서열:
(i) SEQ ID NO: 883, 또는
(ii) SEQ ID NO: 891;
또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3009. 표 C1 또는 표 C2에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3010. 유전 요소가 표 C1 또는 표 C2에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3011. 합성 아넬로좀이 표 C1 또는 표 C2에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3012. 유전 요소가 표 C1 또는 표 C2에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3013. 합성 아넬로좀으로서:
(I) 유전 요소로서:
(a) 프로모터 요소,
(b) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결되는 핵산 서열, 및
(c) SEQ ID NO: 894의 뉴클레오티드 178 내지 248의 핵산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소; 및
(ii) SEQ ID NO: 933의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부
를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
상기 합성 아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있는, 합성 아넬로좀.
3014. 합성 아넬로좀으로서:
(I) 유전 요소로서:
(a) 프로모터 요소,
(b) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결되는 핵산 서열, 및
(c) SEQ ID NO: 903의 뉴클레오티드 176 내지 246의 핵산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소; 및
(ii) SEQ ID NO: 939의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부
를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
상기 합성 아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있는, 합성 아넬로좀.
3015. 합성 아넬로좀으로서:
(I) 유전 요소로서:
(a) 프로모터 요소,
(b) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결되는 핵산 서열, 및
(c) SEQ ID NO: 911의 뉴클레오티드 170 내지 240의 핵산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소; 및
(ii) SEQ ID NO: 945의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부
를 포함하며;
유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
상기 합성 아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있는, 합성 아넬로좀.
3016. ORF1 분자가 SEQ ID NO: 894의 뉴클레오티드 572 내지 2758에 의해 인코딩되는, 실시형태 3013의 합성 아넬로좀.
3017. ORF1 분자가 SEQ ID NO: 903의 뉴클레오티드 581 내지 2884에 의해 인코딩되는, 실시형태 3014의 합성 아넬로좀.
3018. ORF1 분자가 SEQ ID NO: 911의 뉴클레오티드 614 내지 2911에 의해 인코딩되는, 클라이스 3015의 합성 아넬로좀.
3019. 유전 요소가 하기 핵산 서열:
(i) SEQ ID NO: 894의 뉴클레오티드 3555 내지 3696,
(ii) SEQ ID NO: 903의 뉴클레오티드 3720 내지 3828; 또는
(iii) SEQ ID NO: 911의 뉴클레오티드 3716 내지 3815;
또는 이에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 실시형태 3013 내지 3018 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3020. ORF1 분자가 표 D6에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, 초가변 도메인, N22 도메인 및/또는 C-말단 도메인의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 3013의 합성 아넬로좀.
3021. ORF1 분자가 표 D8에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, 초가변 도메인, N22 도메인 및/또는 C-말단 도메인의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 3014의 합성 아넬로좀.
3022. ORF1 분자가 표 D10에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, 초가변 도메인, N22 도메인 및/또는 C-말단 도메인의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 3015의 합성 아넬로좀.
3023. ORF1 분자가 SEQ ID NO: 900의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 3013의 합성 아넬로좀.
3024. ORF1 분자가 SEQ ID NO: 908의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 3014의 합성 아넬로좀.
3025. ORF1 분자가 SEQ ID NO: 916의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 실시형태 3015의 합성 아넬로좀.
3026. 표 C3에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 실시형태 3013의 합성 아넬로좀.
3027. 표 C4에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 실시형태 3014의 합성 아넬로좀.
3028. 표 C5에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 실시형태 3015의 합성 아넬로좀.
3029. 유전 요소가 표 C3에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 실시형태 3013의 합성 아넬로좀.
3030. 유전 요소가 표 C4에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 실시형태 3014의 합성 아넬로좀.
3031. 유전 요소가 표 C5에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 실시형태 3015의 합성 아넬로좀.
3032. 유전 요소가 표 C3에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 실시형태 3013의 합성 아넬로좀.
3033. 유전 요소가 표 C4에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 실시형태 3014의 합성 아넬로좀.
3034. 유전 요소가 표 C5에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 실시형태 3015의 합성 아넬로좀.
3035. 유전 요소가 표 C3에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 실시형태 3013의 합성 아넬로좀.
3036. 유전 요소가 표 C4에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 실시형태 3014의 합성 아넬로좀.
3037. 유전 요소가 표 C5에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 실시형태 3015의 합성 아넬로좀.
3038. 합성 아넬로좀이 표 C3 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하지 않는, 실시형태 3013 내지 3037 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3039. 유전 요소가 표 C3 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하지 않는, 실시형태 3013 내지 3038 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3040. ORF1 분자가 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N을 포함하며, Xn이 각각 독립적으로 임의의 n개 아미노산의 인접 서열인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3041. ORF1 분자가 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N에 측접하는 제1 베타 가닥 및 제2 베타 가닥을 추가로 포함하며, 예를 들어, 상기 제1 베타 가닥이 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N의 티로신(Y) 잔기를 포함하고/포함하거나, 상기 제2 베타 가닥이 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N의 제2 아스파라긴(N) 잔기(N에서 C로)를 포함하는, 실시형태 3040의 합성 아넬로좀.
3042. ORF1 분자가 N-말단에서 C-말단 방향의 순서로, 제1 베타 가닥, 제2 베타 가닥, 제1 알파 나선, 제3 베타 가닥, 제4 베타 가닥, 제5 베타 가닥, 제2 알파 나선, 제6 베타 가닥, 제7 베타 가닥, 제8 베타 가닥 및 제9 베타 가닥을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3043. 유전 요소가 숙주 세포에서 회전환 복제에 의해 증폭되어, 예를 들어, 적어도 8개 카피를 생성할 수 있는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3044. 유전 요소가 단일-가닥인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3045. 유전 요소가 환형인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3046. 유전 요소가 DNA인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3047. 유전 요소가 음성 가닥 DNA인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3048. 유전 요소가 세포에 유입되는 아넬로좀의 10%, 8%, 6%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1% 미만의 빈도로 통합되며, 예를 들어, 합성 아넬로좀이 비-통합성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3049. 유전 요소가 표 16-1에 나타낸 컨센서스 5' UTR 핵산 서열의 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3050. 유전 요소가 표 16-2에 나타낸 컨센서스 GC-풍부 영역의 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3051. 유전 요소가 적어도 70%(예를 들어, 약 70 내지 100%, 75 내지 95%, 80 내지 95%, 85 내지 95% 또는 85 내지 90%)의 위치에서 G 또는 C로 이루어진 적어도 100개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3052. 유전 요소가 SEQ ID NO: 120의 핵산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3053. 유전 요소가 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 1 내지 393의 아넬로바이러스 5’ UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열 및 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2868 내지 2929의 아넬로바이러스 GC-풍부 영역에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3054. 유전 요소가 표 11의 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 75% 동일성을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3055. 프로모터 요소가 야생형 아넬로바이러스에 대하여 외인성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3056. 프로모터 요소가 야생형 아넬로바이러스에 대하여 내인성인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3057. 외인성 이펙터가 치료제, 예를 들어, 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 치료적 핵산을 인코딩하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3058. 외인성 이펙터가 조절 핵산, 예를 들어, miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA; 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드, 천연-생물활성 펩티드 유래의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항미생물 펩티드, 포어-형성 펩티드, 바이사이클릭 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 소분자, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 사멸 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제, 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드, 항체, 수용체, 또는 CRISPR 시스템 또는 성분을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3059. 외인성 이펙터가 miRNA를 포함하며, 숙주 유전자의 발현을 감소시키는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3060. 외인성 이펙터가 약 20 내지 200, 30 내지 180, 40 내지 160, 50 내지 140, 60 내지 120, 200 내지 2000, 200 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 1500 또는 1500 내지 2000개 뉴클레오티드 길이의 핵산 서열을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3061. 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열이 약 20 내지 200, 30 내지 180, 40 내지 160, 50 내지 140, 60 내지 120, 200 내지 2000, 200 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 1500 또는 1500 내지 2000개 뉴클레오티드 길이인, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3062. (예를 들어, 단백질성 외부에) 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3063. 유전 요소가 약 1.5 내지 2.0, 2.0 내지 2.5, 2.5 내지 3.0, 3.0 내지 3.5, 3.1 내지 3.6, 3.2 내지 3.7, 3.3 내지 3.8, 3.4 내지 3.9, 3.5 내지 4.0, 4.0 내지 4.5 또는 4.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3064. 합성 아넬로좀이 인간 세포, 예를 들어, 면역 세포, 간 세포 또는 폐 상피 세포를 감염시킬 수 있는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3065. 예를 들어, 실시예 4에 기재된 방법에 따라 검출되는 바와 같이, 실질적으로 비-면역원성인, 예를 들어, 검출 가능한 및/또는 원치 않는 면역 반응을 유도하지 않는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3066. 실질적으로 비-면역원성인 아넬로좀이 상기 대상체에서, 면역 반응이 결여된 기준 대상체에서의 효능의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%인 효능을 갖는, 실시형태 3065의 합성 아넬로좀.
3067. 적어도 1000개의 아넬로좀의 집단이 적어도 약 100개 카피(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 카피)의 유전 요소를 하나 이상의 인간 세포 내로 운반할 수 있는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3068. (예를 들어, 단백질성 외부에) 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3, ORF1, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀.
3069. 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
3070. 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 합성 아넬로좀을 포함하는 실시형태 3069의 약제학적 조성물.
3071. 약제학적 조성물이 사전결정된 입자:감염성 유닛의 비(예를 들어, 300:1 미만, 200:1 미만, 100:1 미만 또는 50:1 미만)를 갖는 실시형태 3069 또는 3070의 약제학적 조성물.
3072. 하기 중 하나 이상(예를 들어, 그 전부)을 인코딩하는 핵산 분자:
(i) ORF1 분자, 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 것, 또는 표 B1 내지 표 B5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 핵산 서열의 ORF1 영역을 포함하는 것;
(ii) ORF2 분자, 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 것, 또는 표 B1 내지 표 B5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 핵산 서열의 ORF2 영역을 포함하는 것; 및/또는
(iii) ORF3 분자, 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 것, 또는 표 B1 내지 표 B5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 핵산 서열의 ORF3 영역을 포함하는 것.
3073. 핵산 분자가 플라스미드, 바이러스 게놈 또는 (예를 들어, 시험관 내 환화에 의해 생성되는) 이중-가닥 환형 DNA인, 실시형태 3072의 핵산 분자.
3074. 반응 혼합물로서:
(i) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀의 유전 요소의 서열을 포함하는 제1 핵산(예를 들어, 이중-가닥 또는 단일-가닥 환형 DNA), 및
(ii) 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는, 반응 혼합물.
3075. 제1 핵산 및 제2 핵산이 동일한 핵산 분자에 존재하는, 실시형태 3074의 반응 혼합물.
3076. 제1 핵산 및 제2 핵산이 상이한 핵산 분자인, 실시형태 3074의 반응 혼합물.
3077. 제1 핵산 및 제2 핵산이 상이한 핵산 분자이며, 제2 핵산이 이중-가닥 환형 DNA로서 제공되는, 실시형태 3074의 반응 혼합물.
3078. 제1 핵산 및 제2 핵산이 상이한 핵산 분자이며, 제1 및 제2 핵산이 이중-가닥 환형 DNA로서 제공되는 실시형태 3074의 반응 혼합물.
3079. 제2 핵산 서열이 헬퍼 세포 또는 헬퍼 바이러스에 의해 포함되는, 실시형태 3076의 반응 혼합물.
3080. 합성 아넬로좀의 제조 방법으로서, 상기 방법이
a) 숙주 세포를 제공하는 단계로서:
(i) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀의 유전 요소의 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 분자, 및
(ii) 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
b) 숙주 세포를 상기 합성 아넬로좀을 제조하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계를 포함하며,
이렇게 함으로써, 합성 아넬로좀을 제조하는, 방법.
3081. 단계 (a) 이전에, 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 실시형태 3080의 방법.
3082. 제2 핵산 분자가 제1 핵산 분자 이전에, 이와 동시에, 또는 이후에 숙주 세포 내로 도입되는, 실시형태 3081의 방법.
3083. 제2 핵산 분자가 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는, 실시형태 3080 또는 3081 중 어느 한 실시형태의 방법.
3084. 제2 핵산 분자가 헬퍼(예를 들어, 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스의 게놈)인, 실시형태 3080 내지 3083 중 어느 한 실시형태의 방법.
3085. 제2 핵산 분자가 아미노산 서열 [W/F]X7HX3CX1CX5H를 포함하는 ORF2 분자를 인코딩하며, Xn이 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열인, 실시형태 3080 내지 3084 중 어느 한 실시형태의 방법.
3086. 합성 아넬로좀 제제의 제조 방법으로서, 상기 방법이
a) 실시형태 3001 내지 3068 중 어느 한 실시형태에 따른 복수의 합성 아넬로좀, 실시형태 3069 내지 3071 중 어느 한 실시형태의 약제학적 조성물 또는 실시형태 3074 내지 3079 중 어느 한 실시형태의 반응 혼합물을 제공하는 단계;
b) 선택적으로 상기 복수의 것을 본원에 기재된 오염물질, 광학 밀도 측정치(예를 들어, OD 260), (예를 들어, HPLC에 의한) 입자 개수, 감염성(예를 들어, 입자:감염성 유닛 비) 중 하나 이상에 대하여 평가하는 단계; 및
c) 예를 들어, (b)의 파라미터 중 하나 이상이 특정 임계값을 만족한다면, 복수의 합성 아넬로좀을 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
3087. 숙주 세포로서:
(i) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀의 유전 요소의 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 분자, 및
(ii) 선택적으로, 표 C1 내지 표 C5중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 분자를 포함하는, 숙주 세포.
3088. 포유동물 세포로의 외인성 이펙터(예를 들어, 치료적 외인성 이펙터)의 운반 방법으로서:
(a) 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀을 제공하는 단계; 및
(b) 포유동물 세포를 합성 아넬로좀과 접촉시키는 단계를 포함하며;
합성 아넬로좀이 유전 요소를 포유동물 세포 내로 운반할 수 있으며;
선택적으로, 숙주 세포에서 유전 요소를 단백질성 외부 내에 봉입하기에 적합한 조건 하에서, 유전 요소를 숙주 세포 내로 도입함으로써 합성 아넬로좀이 생성되며;
이렇게 함으로써 치료적 외인성 이펙터를 포유동물 세포에 운반하는, 방법.
3089. 유전 요소를 숙주 세포에 운반하기 위한, 실시형태 3001 내지 3068 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀 또는 실시형태 3069 내지 3071 중 어느 한 실시형태의 약제학적 조성물의 용도.
3090. 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위한, 실시형태 3001 내지 3068 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀 또는 실시형태 3069 내지 3071 중 어느 한 실시형태의 약제학적 조성물의 용도.
3091. 질병 또는 장애가 면역 장애, 인터페론병증(interferonopathy)(예를 들어, I형 인터페론병증), 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암) 및 위장 장애로부터 선택되는, 실시형태 3090의 용도.
3092. 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 실시형태 3001 내지 3068 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀 또는 실시형태 3069 내지 3071 중 어느 한 실시형태의 약제학적 조성물.
3093. 대상체에서의 질병 또는 장애의 치료 방법으로서, 상기 방법이 실시형태 3001 내지 3068 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀 또는 실시형태 3069 내지 3071 중 어느 한 실시형태의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 질병 또는 장애가 면역 장애, 인터페론병증(예를 들어, I형 인터페론병증), 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암) 및 위장 장애로부터 선택되는 방법.
3094. 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 실시형태 3001 내지 3068 중 어느 한 실시형태의 합성 아넬로좀 또는 실시형태 3069 내지 3071 중 어느 한 실시형태의 약제학적 조성물의 용도로서, 선택적으로, 상기 질병 또는 장애가 면역 장애, 인터페론병증(예를 들어, I형 인터페론병증), 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암) 및 위장 장애로부터 선택되는, 용도.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점이 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그들 전문이 참조로 포함된다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것일 뿐이며, 제한하려는 것이 아니다.
본 발명의 실시형태의 하기의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독하는 경우 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 예시의 목적을 위하여, 본원에 예시된 실시형태가 도면에 나타나 있다. 그러나, 본 발명이 도면에 나타낸 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 특허 또는 출원 파일은 유색으로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 요청 및 필요한 비용의 지불 시에 특허청에 의해 유색 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 카피가 제공될 것이다.
도 1a는 캡시드 단백질 서열의 아미노산 영역의 서열 유사성 백분율을 보여주는 도면이다.
도 1b는 캡시드 단백질 서열의 서열 유사성 백분율을 보여주는 도면이다.
도 2는 아넬로좀의 일 실시형태를 보여주는 도면이다.
도 3은 TTMiniV의 LY1 주("아넬로좀 1")를 인코딩하는 카나마이신 벡터의 개략도를 도시한 것이다.
도 4는 TTMiniV의 LY2 주("아넬로좀 2")를 인코딩하는 카나마이신 벡터의 개략도를 도시한 것이다.
도 5는 293T 및 A549 세포에서의 합성 아넬로좀의 트랜스펙션 효율을 도시한 것이다.
도 6a 및 도 6b는 합성 아넬로좀에 의한 293T 세포의 성공적인 감염을 예시한 정량적 PCR 결과를 도시한 것이다.
도 7a 및 도 7b는 합성 아넬로좀에 의한 A549 세포의 성공적인 감염을 예시한 정량적 PCR 결과를 도시한 것이다.
도 8a 및 도 8b는 합성 아넬로좀에 의한 Raji 세포의 성공적인 감염을 예시한 정량적 PCR 결과를 도시한 것이다.
도 9a 및 도 9b는 합성 아넬로좀에 의한 Jurkat 세포의 성공적인 감염을 예시한 정량적 PCR 결과를 도시한 것이다.
도 10a 및 도 10b는 합성 아넬로좀에 의한 Chang 세포의 성공적인 감염을 예시한 정량적 PCR 결과를 도시한 것이다.
도 11a 및 도 11b는 TTMV-LY2Δ574-1371,Δ1432-2210,2610::nLuc로 트랜스펙션되거나 감염된 세포로부터의 루시퍼라제 발현을 보여주는 일련의 그래프이다. 감염된 세포에서 발광이 관찰되었으며, 이는 성공적인 복제 및 패키징을 나타낸다.
도 11c는 알파토르크바이러스(Alphatorquevirus)(토르크 테노 바이러스; TTV)의 계통수를 도시한 다이어그램이며, 클레이드가 강조표시되어 있다. 적어도 100개의 아넬로바이러스 주가 표시되어 있다. 몇몇의 클레이드로부터의 예시적인 서열은 본원에, 예를 들어, 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5, 및 1 내지 18에 제공되어 있다.
도 12는 아넬로좀(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 복제-적격 또는 복제-결핍 아넬로좀)의 생성에 대한 예시적인 작업흐름을 보여주는 개략도이다.
도 13은 TTV 및 TTMV 게놈 당량의 정량화를 위해 설계된 프라이머 세트에 대한 프라이머 특이성을 보여주는 그래프이다. SYBR 그린(green) 화학에 기초한 정량적 PCR은 각각의 게놈을 인코딩하는 플라스미드 상에서, 표기된 바와 같은 TTMV 또는 TTV 특이적 프라이머 세트를 사용한 증폭 생성물의 각각에 대한 뚜렷한 하나의 피크를 보여준다.
도 14는 qPCR에 의한 TTV 게놈 당량의 정량화에서 PCR 효율을 보여주는 일련의 그래프이다. 2가지 상이한 상용 qPCR 마스터 믹스와 함께 증가하는 농도의 프라이머 및 고정된 농도의 가수분해 프로브(250 nM)를 사용하였다. 90 내지 110%의 효율이 정량화 동안 최소의 오차 전파를 초래하였다.
도 15는 게놈 당량 농도의 7 log10에 걸친 TTMV(표적 1) 또는 TTV(표적 2)의 선형 증폭에 대한 예시적인 증폭 플롯을 보여주는 그래프이다. 게놈 당량을 높은 PCR 효율 및 직선성(R2 TTMV: 0.996; R2 TTV: 0.997)으로 7개의 10배 희석에 걸쳐 정량화하였다.
도 16a 및 도 16b는 아넬로좀 스톡 내의 TTMV 게놈 당량의 정량화를 보여주는 일련의 그래프이다. (도 16a) 각각 1:10 희석되고, 2벌로 시행된 2개의 스톡의 증폭 플롯. (도 16b) 본원에 직선 범위의 맥락으로 나타난, 도 16a에 나타낸 바와 같은 동일한 2개의 시료. 2가지 대표적인 시료에서 상한 및 하한이 나타나 있다. PCR 효율: 99.58%, R2: 0988.
도 17은 표기된 플라스미드로 트랜스펙션된 HEK293T 세포에서의 miR-625 발현의 배수 변화를 보여주는 그래프이다.
도 18은 각각의 알파토르크바이러스 클레이드로부터의 대표적인 서열의 정렬에 대한 쌍별 동일성을 보여주는 다이어그램이다. TTV-CT30F, TTV-P13-1, TTV-tth8, TTV-HD20a, TTV-16, TTV-TJN02 및 TTV-HD16d에 대한 DNA 서열을 정렬하였다. 50-bp 슬라이딩 윈도우(sliding window)에 걸친 쌍별 동일성 백분율이 정렬의 길이에 따라 나타나 있다. 위의 괄호는 비-코딩 및 코딩 영역을 나타내며, 쌍별 동일성이 나타나 있다. 괄호 아래는 높은 또는 낮은 서열 보존의 영역을 나타낸다.
도 19는 7가지 알파토르크바이러스 클레이드에 걸친 추정 단백질에 대한 아미노산 정렬에 대한 쌍별 동일성을 보여주는 다이어그램이다. TTV-CT30F, TTV-P13-1, TTV-tth8, TTV-HD20a, TTV-16, TTV-TJN02 및 TTV-HD16d로부터의 추정 단백질에 대한 아미노산 서열을 정렬하였다. 15-aa 슬라이딩 윈도우에 걸친 쌍별 동일성 백분율은 각각의 정렬의 길이에 따라 나타나 있다. 오픈 리딩 프레임 DNA 서열 및 단백질 아미노산 서열 둘 모두에 대한 쌍별 동일성이 나타나 있다. (*) TTV-CT30F, TTV-tth8, TTV-16 및 TTV-TJN02에 대하여 추정 ORF2t/3 아미노산 서열을 정렬하였다.
도 20은 5' UTR 내의 도메인이 7가지 알파토르크바이러스 클레이드에 걸쳐 고도로 보존되는 것을 보여주는 다이어그램이다(출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 810 내지 817). 각각의 대표적인 알파토르크바이러스에 대한 71-bp 5'UTR 보존된 도메인 서열을 정렬하였다. 서열은 7가지 클레이드 간에 95.2% 쌍별 동일성을 갖는다.
도 21은 7가지 알파토르크바이러스 클레이드로부터의 GC-풍부 도메인의 정렬을 보여주는 다이어그램이다. 각각의 아넬로바이러스는 70% 초과의 GC 함량을 갖는 ORF의 하류 영역을 갖는다. TTV-CT30F, TTV-P13-1, TTV-tth8, TTV-HD20a, TTV-16, TTV-TJN02 및 TTV-HD16d로부터의 GC-풍부 영역의 정렬이 나타나 있다. 영역은 길이가 다양하지만, 그들이 정렬되는 영역에서, 그들은 75.4%의 쌍별 동일성을 갖는다.
도 22는 n-myc 상호작용 단백질(NMI)을 표적화하는 miRNA를 인코딩하는 아넬로좀을 이용한 Raji B 세포의 감염을 보여주는 다이어그램이다. NMI miRNA-인코딩 아넬로좀을 이용한 Raji B 세포(화살표) 또는 대조군 세포의 감염 후에 검출되는 아넬로좀의 게놈 당량의 정량화가 나타나 있다.
도 23은 n-myc 상호작용 단백질(NMI)을 표적화하는 miRNA를 인코딩하는 아넬로좀을 이용한 Raji B 세포의 감염을 보여주는 다이어그램이다. 웨스턴 블롯은 NMI에 대한 miRNA를 인코딩하는 아넬로좀이 Raji B 세포에서 NMI 단백질 발현을 감소시킨 한편, miRNA가 결여된 아넬로좀으로 감염된 Raji B 세포는 대조군과 유사한 NMI 단백질 발현을 보였음을 나타낸다.
도 24는 내인성 miRNA-인코딩 서열을 포함하는 아넬로좀 및 내인성 miRNA-인코딩 서열이 결실된 상응하는 아넬로좀을 이용한 감염 후에 숙주 세포에서 생성되는 아넬로좀 입자의 정량화를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 25a 내지 도 25c는 나노-루시퍼라제에 융합된 TTMV-LY2로부터의 ORF의 세포내 국소화를 보여주는 일련의 다이어그램이다. (도 25a) Vero 세포에서, ORF2(윗줄)는 세포질에 국소화하는 것으로 나타난 한편, ORF1/1(아랫줄)은 핵에 국소화하는 것으로 나타났다. (도 25b) HEK293 세포에서, ORF2(윗줄)는 세포질에 국소화하는 것으로 나타난 한편, ORF1/1(아랫줄)은 핵에 국소화하는 것으로 나타났다. (도 25c) 세포 내의 ORF1/2 및 ORF2/2에 대한 국소화 패턴.
도 26은 TTV-tth8의 3' 비-코딩 영역(NCR) 내의 순차적인 결실 대조군을 보여주는 일련의 다이어그램이다. 윗줄은 야생형 TTV-tth8 아넬로바이러스의 구조를 보여준다. 두번째 줄은 3' NCR의 GC-풍부 영역 내의 36개 뉴클레오티드의 결실을 갖는 TTV-tth8을 보여준다(Δ36nt(GC)). 세번째 줄은 총 78개 뉴클레오티드의 결실을 초래하는, 36개 뉴클레오티드 결실 및 miRNA 서열의 추가의 결실을 갖는 TTV-tth8을 보여준다(Δ36nt(GC) ΔmiR). 네번째 줄은 36개 뉴클레오티드 결실 영역 및 miRNA 서열 둘 모두를 포함하는 3' NCR로부터 171개 뉴클레오티드의 결실을 갖는 TTV-tth8을 보여준다(Δ3' NCR).
도 27a 내지 도 27d는 TTV-tth8의 3' NCR 내의 순차적 결실이 아넬로바이러스 ORF 전사물 수준에 유의미한 영향을 갖는 것을 보여주는 일련의 다이어그램이다. 제2일에서의 ORF1 및 ORF2(도 27a), 제2일에서의 ORF1/1 및 ORF2/2(도 27b), 제2일에서의 ORF1/2 및 ORF2/3(도 27c) 및 제2일에서의 ORF2t3(도 27d)의 발현이 나타나 있다.
도 28a 내지 도 28b는 나노-루시퍼라제를 발현하는 아넬로좀을 생성하기 위해 사용되는 구축물(도 28a) 및 세포를 트랜스펙션시키기 위해 사용되는 일련의 아넬로좀/플라스미드 조합(도 28b)을 보여주는 일련의 다이어그램이다.
도 29a 내지 도 29c는 아넬로좀으로 감염된 마우스에서의 나노-루시퍼라제 발현을 보여주는 일련의 다이어그램이다. (도 29a) 주사 후 제0일 내지 제9일에 마우스에서의 나노-루시퍼라제 발현. (도 29b) 표기된 바와 같은, 다양한 아넬로좀/플라스미드 구축물 조합이 주사된 마우스에서의 나노-루시퍼라제 발현. (도 29c) 주사 후에 마우스에서 검출되는 나노-루시퍼라제 발광의 정량화. 군 A에는 TTMV-LY2 벡터 ± 나노-루시퍼라제를 제공하였다. 군 B에는 나노-루시퍼라제 단백질 및 TTMV-LY2 ORF를 제공하였다.
도 29da 및 도 29db는 7가지 상이한 알파토르크바이러스 클레이드로부터의 대표적인 아넬로의 게놈 조직의 개략도이다. TTV-CT30F, TTV-P13-1, TTV-tth8, TTV-HD20a, TTV-16, TTV-TJN02 및 TTV-HD16d에 대한 서열을 정렬하였으며, 주요 영역은 주석이 달려있다. 추정 오픈 리딩 프레임(ORF)은 연회색으로 나타나 있으며, TATA 박스는 진회색으로 나타나 있으며, (예를 들어, 표기된 바와 같은) 개시인자 요소, 5'UTR 보존된 도메인 및 GC-풍부 영역을 포함하는 주요한 추정 조절 영역은 중간 회색으로 나타나 있다.
도 30은 아넬로바이러스 pre-miRNA의 내인성 표적을 결정하기 위한 예시적인 작업흐름을 보여주는 개략도이다.
도 31a 및 도 31b는 탠덤 아넬로바이러스 플라스미드가 아넬로바이러스 또는 아넬로좀 생성을 증가시킬 수 있는 것을 보여주는 일련의 다이어그램이다. (도 31a) 예시적인 탠덤 아넬로바이러스 플라스미드에 대한 플라스미드 맵. (도 31b) 탠덤 아넬로바이러스 플라스미드를 이용한 HEK293T 세포의 트랜스펙션은 단일-카피 보유 플라스미드에 비하여 4배의 바이러스 게놈의 수의 생성을 초래하였다.
도 31c는 TTMV-LY2 플라스미드 pVL46-063 및 pVL46-240의 환화를 보여주는 겔 전기영동 이미지이다.
도 31d는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정되는 바와 같은, 선형 및 환형 TTMV-LY2 구축물에 대한 카피 수를 보여주는 크로마토그램이다.
도 32는 9가지 아넬로바이러스 게놈 서열로부터의 36-뉴클레오티드 GC-풍부 영역 및 그에 기초한 컨센서스 서열의 정렬을 보여주는 다이어그램이다(각각 출현 순서로, SEQ ID NO: 818 내지 827).
도 33은 아넬로바이러스 주 LY2 및 CBD203으로부터의 ORF1 구조를 보여주는 일련의 다이어그램이다. 추정 도메인이 표지되어 있다: 표기된 바와 같이, 아르기닌-풍부 영역(arg-rich), 젤리-롤 도메인을 포함하는 코어 영역, 초가변 영역(HVR), N22 영역 및 C-말단 도메인(CTD).
도 34는 베타토르크바이러스 주 CBS203으로부터의 ORF1 구조를 보여주는 다이어그램이다. 110개의 베타토르크바이러스의 세트 간에 높은 유사성을 보이는 잔기가 나타나 있다. 평가되는 모든 주 간에, 60 내지 79.9% 유사성의 잔기; 80 내지 99.9% 유사성의 잔기 및 100% 유사성의 잔기가 나타나 있다.
도 35는 진회색(100%), 중간 회색(80 내지 99.9%), 연회색(60 내지 80%)으로 강조표시된 높은 유사성 점수를 갖는 잔기를 갖는 알파토르크바이러스의 258개의 서열의 정렬로부터의 컨센서스 서열(SEQ ID NO: 828)을 보여주는 다이어그램이다. 추정 도메인이 네모 안에 나타나 있다. 동일성 백분율은 또한, 컨센서스 서열 아래에 박스 그래프에 의해 나타나 있으며, 중간 회색 박스는 100% 동일성을 나타내며, 연회색 박스는 30 내지 99% 동일성을 나타내며, 진회색 박스는 30% 미만의 동일성을 나타낸다.
도 36은 아넬로바이러스 ORF1 분자의 도메인 및 상이한 아넬로바이러스로부터의 초가변 도메인으로 대체될 초가변 영역을 보여주는 개략도이다.
도 37은 ORF1의 도메인 및 비-아넬로바이러스 공급원 유래의 관심 단백질 또는 펩티드(POI)로 대체될 초가변 영역을 보여주는 개략도이다.
도 38은 아넬로바이러스 게놈에 기초한 예시적인 아넬로좀 유전 요소의 설계를 보여주는 일련의 다이어그램이다. 단백질-코딩 영역을 아넬로바이러스 게놈(좌측)으로부터 결실시켜, 바이러스 프로모터, 5'UTR 보존된 도메인(5CD) 및 GC-풍부 영역을 포함하는 아넬로바이러스 비-코딩 영역(NCR)을 남긴다. 페이로드 DNA를 단백질-코딩 유전자좌에서 비-코딩 영역 내에 삽입하였다(우측). 생성된 아넬로좀은 페이로드 DNA(오픈 리딩 프레임, 유전자, 비-코딩 RNA 등 포함) 및 필수 아넬로바이러스 시스 복제 및 패키징 요소를 보유하였지만, 복제 및 패키징에 필수적인 단백질 요소가 결여되었다.
도 39는 외인성 인간 면역어드헤신(immunoadhesin)을 인코딩하는 유전 요소를 포함하는 아넬로좀이 인간 폐-유래 세포주 EKVX를 성공적으로 형질도입시켰음을 보여주는 막대 그래프이다.
도 40은 인간 에리트로포이에틴(hEpo)을 인코딩하는 서열을 함유하도록 조작된, tth8 또는 LY2에 기초한 아넬로좀이 기능적 전이유전자를 포유동물 세포에 운반할 수 있었음을 보여주는 그래프이다.
도 41a 및 도 41b는 마우스에게 투여되는 조작된 아넬로좀이 정맥내 주사 후 제7일에 검출 가능하였음을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 42는 hGH mRNA가 hGH를 인코딩하는 조작된 아넬로좀의 정맥내 투여 후 제7일에 전혈의 세포 분획에서 검출되었음을 보여주는 그래프이다.
도 43a 내지 도 43d는 아넬로바이러스 ORF2 내의 고도로 보존된 모티프를 예시한 일련의 다이어그램이다. 도 43은 SEQ ID NO: 949를 개시한다.
도 44a 및 도 44b는 인간 조직 내의 전장 ORF1 mRNA 발현의 증거를 보여주는 일련의 다이어그램이다.
도 45는 플라스미드 내의 TTV-tth8 게놈에 비하여 시험관 내 환화된(IVC) TTV-tth8 게놈(IVC TTV-tth8)이 HEK293T 세포에서 예상되는 밀도로 TTV-tth8 게놈 카피를 제공하는 능력을 보여주는 그래프이다.
도 46은 시험관 내 환화된(IVC) LY2 게놈(WT LY2 IVC) 및 플라스미드 내의 야생형 LY2 게놈(WT LY2 플라스미드)이 Jurkat 세포에서 예상되는 밀도로 LY2 게놈 카피를 제공하는 능력을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 47은 알파토르크바이러스, 베타토르크바이러스 및 감마토르크바이러스로부터의 아넬로바이러스 ORF1 단백질의 젤리 롤 도메인의 2차 구조의 정렬을 보여주는 다이어그램이다(SEQ ID NO: 950 내지 975). 이들 2차 구조 요소는 고도로 보존된다.
도 48은 N22 도메인에 위치한 ORF1 모티프의 보존된 서열 및 2차 구조를 보여주는 다이어그램이다(각각 출현 순서로, SEQ ID NO: 976 내지 1000 및 851). 인간 TTV ORF1의 보존된 YNPXXDXGXXN(SEQ ID NO: 829) 모티프는 보존된 2차 구조를 갖는다. 특히, 모티프 내의 티로신은 베타 가닥을 파단하고, 제2 베타 가닥은 모티프의 말단 아스파라긴에서 시작한다.
정의
본 발명은 특정 실시형태에 대해 그리고 특정 도면을 참조하여 설명될 것이지만 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 청구범위에 의해서만 한정된다. 이하에 기재된 용어는 일반적으로 다르게 지시되지 않는 한 그들의 일반적인 의미로 이해될 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 청구범위에서 "포함하다"라는 용어가 사용되는 경우, 이는 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, "로 이루어지다"라는 용어는 "구성된다"라는 용어의 바람직한 실시형태인 것으로 간주된다. 이하에서 그룹이 적어도 특정 개수의 실시형태를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이것은 또한 바람직하게는 이들 실시형태만으로 이루어지는 그룹을 개시하는 것으로 이해될 것이다.
단수 명사를 언급할 때, 부정 관사 또는 정관사, 예를 들어, 하나의("a", "an") 또는 상기("the")가 사용되는 경우, 이것은 그 밖의 어떤 것이 특별히 언급되지 않는 한, 그 명사의 복수형을 포함한다.
용어 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 표기된 치료, 조절 등의 목적에 적합한 화합물, 조성물, 생성물 등 그 자체를 지칭함을 이해할 것이다. 용어 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 추가로 일 실시형태로서, 이러한 화합물, 조성물, 생성물 등이 치료, 조절 등에 사용하기 위한 것임을 개시한다.
용어 "...에 사용하기 위한 화합물, 조성물, 생성물 등", "...를 위한 의약, 약제학적 조성물, 수의학적 조성물, 진단적 조성물 등의 제조에서의 화합물, 조성물, 생성물 등의 용도", 또는 "의약으로서 사용하기 위한 화합물, 조성물, 생성물 등..."은 이러한 화합물, 조성물, 생성물 등이 인간 또는 동물 신체에서 실시될 수 있는 치료적 방법에 사용될 것임을 나타낸다. 그들은 치료 방법 등에 관한 실시형태 및 청구범위의 동등한 개시로서 간주된다. 따라서, 실시형태 또는 청구범위가 "질병을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물을 치료하는 데 사용하기 위한 화합물"을 지칭한다면, 이것은 또한 "질병을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 화합물의 용도" 또는 "질병을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물로의 화합물의 투여에 의한 치료 방법"의 개시인 것으로 간주된다. 용어 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 표기된 치료, 조절 등의 목적에 적합한 화합물, 조성물, 생성물 등 그 자체를 지칭함을 이해할 것이다.
기간, 값, 수 등의 하기의 예가 괄호 안에 제공된다면, 이것은 괄호 안에 언급된 예가 실시형태를 구성할 수 있다는 표시로서 이해해야 한다. 예를 들어, "실시형태들에서, 핵산 분자가 표 1의 아넬로바이러스 ORF1-인코딩 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 571 내지 2613)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다"고 언급된다면, 일부 실시형태는 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 571 내지 2613에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아넬로좀"은 단백질성 외부 내에 봉입된 유전 요소, 예를 들어, 에피솜, 예를 들어, 환형 DNA를 포함하는 비히클을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "합성 아넬로좀"은 일반적으로, 자연 발생이 아닌, 예를 들어, 야생형 바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스)에 비하여 상이한 서열을 갖는 아넬로좀을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 합성 아넬로좀은 엔지니어링되거나 또는 재조합이며, 예를 들어, 야생형 바이러스 게놈(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 게놈)에 비하여 차이 또는 변형을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부 내의 봉입은 단백질성 외부에 의한 100% 커버리지, 및 100% 미만, 예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 그 미만의 커버리지를 포함한다. 유전 요소가 예를 들어, 숙주 세포로의 유입 이전에 단백질성 외부에 보유되는 한, 예를 들어, (예를 들어, 단백질성 외부를 물, 이온, 펩티드 또는 소분자에 대해 투과 가능하게 만드는) 갭 또는 불연속부가 단백질성 외부에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 정제되며, 예를 들어, 아넬로좀은 그의 원래의 공급원으로부터 분리되고/분리되거나 다른 성분이 실질적으로 없다(50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과).
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아넬로벡터"는 단백질성 외부(예를 들어, 캡시드) 내로의 패키징을 가능하게 하도록 아넬로바이러스 게놈 서열 또는 그의 인접 부분으로부터 유래되거나 이에 대하여 고도로 유사한(예를 들어, 이와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 충분한 핵산 서열을 포함하며, 이종 서열을 추가로 포함하는 벡터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 바이러스 벡터 또는 네이키드(naked) 핵산이다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 고유 아넬로바이러스 서열 또는 이에 대하여 고도로 유사한(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 서열의 적어도 약 50, 60, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000 또는 3500개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로바이러스 ORF1, ORF2 또는 ORF3 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 서열은 다중 클로닝 부위를 포함하거나, 이종 프로모터를 포함하거나, 치료적 단백질에 대한 코딩 영역을 포함하거나, 치료적 핵산을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 야생형 아넬로바이러스 캡시드이다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 본원에 기재된 유전 요소를 포함하며, 예를 들어, 프로모터, 치료적 이펙터를 인코딩하는 서열 및 캡시드 결합 서열을 포함하는 유전 요소를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 분자"는 단백질, 예를 들어, 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편을 지칭한다. 용어 "항체 분자"는 전장 항체 및 항체 단편(예를 들어, scFv)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이며, 예를 들어, 항체 분자는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 복수의 것들 중 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지며, 복수의 것들 중 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 실시형태들에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체 분자는 일반적으로 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열에 의해 특성화된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "인코딩"하는 핵산은 아미노산 서열 또는 기능적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 비-코딩 RNA, 예를 들어, siRNA 또는 miRNA)를 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "외인성" 작용제(예를 들어, 이펙터, 핵산(예를 들어, RNA), 유전자, 페이로드, 단백질)는 상응하는 야생형 바이러스, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스에 의해 포함되지 않거나, 그에 의해 인코딩되지 않는 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 외인성 작용제, 예컨대, 자연 발생 단백질 또는 핵산에 비하여 (예를 들어, 삽입, 결실 또는 치환에 의해) 변경된 서열을 갖는 단백질 또는 핵산은 자연적으로 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 작용제는 숙주 세포에서 자연적으로 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 작용제는 숙주 세포에서 자연적으로 존재하지만, 바이러스에 대하여 외인성이다. 일부 실시형태에서, 외인성 작용제는 숙주 세포에서 자연적으로 존재하지만, 요망되는 수준으로 또는 요망되는 시간에 존재하지 않는다.
또 다른 작용제 또는 요소(예를 들어, 이펙터, 핵산 서열, 아미노산 서열)에 관하여 본원에 사용되는 바와 같은, "이종" 작용제 또는 요소(예를 들어, 이펙터, 핵산 서열, 아미노산 서열)는 천연적으로, 예를 들어, 야생형 바이러스, 예를 들어, 아넬로바이러스에서 함께 관찰되지 않는 작용제 또는 요소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이종 핵산 서열은 천연 발생 핵산 서열(예를 들어, 아넬로바이러스에서 천연적으로 발생하는 서열)과 동일한 핵산에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 작용제 또는 요소는 아넬로좀의 다른(예를 들어, 나머지) 요소가 기반으로 하는 아넬로바이러스에 비하여 외인성이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전 요소"는 일반적으로 아넬로좀 내의 핵산 서열을 지칭한다. 유전 요소가 네이키드 DNA로서 생성되고, 선택적으로 추가로 단백질성 외부 내로 어셈블될 수 있는 것이 이해된다. 또한, 아넬로좀은 그의 유전 요소를 세포 내로 삽입하여, 유전 요소가 세포 내에 존재하게 하고, 단백질성 외부가 반드시 세포에 유입되는 것은 아니라는 점이 이해된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "ORF1 분자"는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질) 또는 그의 기능적 단편의 활성 및/또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. ORF1 분자는 일부 예에서, 하기 중 하나 이상(예를 들어, 이 중 1, 2, 3 또는 4개)을 포함할 수 있다: 적어도 60%의 염기성 잔기(예를 들어, 적어도 60%의 아르기닌 잔기)를 포함하는 제1 영역, 적어도 약 6개의 베타 가닥(예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 베타 가닥)을 포함하는 제2 영역, 아넬로바이러스 N22 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 N22 도메인)의 구조 또는 활성을 포함하는 제3 영역 및/또는 아넬로바이러스 C-말단 도메인(CTD)(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 CTD)의 구조 또는 활성을 포함하는 제4 영역. 일부 예에서, ORF1 분자는 N-말단에서 C-말단 순서로, 제1, 제2, 제3 및 제4 영역을 포함한다. 일부 예에서, 아넬로좀은 N-말단에서 C-말단 순서로, 제1, 제2, 제3 및 제4 영역을 포함하는 ORF1 분자를 포함한다. ORF1 분자는 일부 예에서, (예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. ORF1 분자는 일부 예에서, 이종 서열, 예를 들어, 초가변 영역(HVR), 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 HVR을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은, "아넬로바이러스 ORF1 단백질"은 아넬로바이러스 게놈(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 게놈)에 의해 인코딩된 ORF1 단백질, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 또는 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1 유전자에 의해 인코딩되는 ORF1 단백질을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "ORF2 분자"는 아넬로바이러스 ORF2 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF2 단백질)의 활성 및/또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "아넬로바이러스 ORF2 단백질"은 아넬로바이러스 게놈(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 게놈)에 의해 인코딩된 ORF2 단백질, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 또는 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF2 유전자에 의해 인코딩된 바와 같은 ORF2 단백질을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질성 외부"는 주로(예를 들어, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과) 단백질인 외부 구성성분을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 핵산"은 발현 생성물을 인코딩하는 DNA 서열의 발현, 예를 들어, 전사 및/또는 번역을 변경시키는 핵산 서열을 지칭한다. 실시형태들에서, 발현 생성물은 RNA 또는 단백질을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 서열"은 표적 유전자 생성물의 전사를 변경시키는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조절 서열은 프로모터 또는 인핸서이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "복제 단백질"은 감염, 바이러스 게놈 복제/발현, 바이러스 단백질 합성 및/또는 바이러스 구성성분의 어셈블리 동안 사용되는 단백질, 예를 들어, 바이러스 단백질을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 비-병원성인" 유기체, 입자 또는 성분은 예를 들어, 숙주 유기체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에서 검출 가능한 질병 또는 병원성 질환을 야기하거나 유도하지 않는 유기체, 입자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 바이러스 또는 아넬로좀) 또는 그의 성분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체로의 아넬로좀의 투여는 치료 기준의 일부로서 허용되는 부차 반응 또는 부작용을 초래할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "비-병원성"은 숙주 유기체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에서 검출 가능한 질병 또는 병원성 질환을 야기하거나 유도하지 않는 유기체 또는 그의 성분을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 비-통합성인" 유전 요소는 숙주 세포(예를 들어, 진핵 세포) 또는 유기체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간) 내로 유입되는 유전 요소 중 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5% 또는 1% 미만이 게놈 내로 통합되는 유전 요소, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 바이러스 또는 아넬로좀 내의 유전 요소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 예를 들어, 숙주 세포의 게놈 내로 검출 가능하게 통합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 게놈 내로의 유전 요소의 통합은 본원에 기재된 바와 같은 기법, 예를 들어, 핵산 서열결정, PCR 검출 및/또는 핵산 혼성화를 사용하여 검출될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 비-면역원성인" 유기체, 입자 또는 성분은 예를 들어, 숙주 조직 또는 유기체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서 요망되지 않는 또는 비표적화된 면역 반응을 야기하거나 유도하지 않는 유기체, 입자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 바이러스 또는 아넬로좀) 또는 그의 성분을 지칭한다. 실시형태들에서, 실질적으로 비-면역원성인 유기체, 입자 또는 성분은 검출 가능한 면역 반응을 생성하지 않는다. 실시형태들에서, 실질적으로 비-면역원성인 아넬로좀은 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나, 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질에 대하여 검출 가능한 면역 반응을 생성하지 않는다. 실시형태들에서, 면역 반응(예를 들어, 요망되지 않는 또는 비표적화된 면역 반응)은 예를 들어, 문헌[Tsuda et al., 1999; J. Virol. Methods 77: 199-206](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV 항체 검출 방법 및/또는 문헌[Kakkola et al., 2008; Virology 382: 182-189](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV IgG 수준의 결정 방법에 따라 대상체에서 항체 존재 또는 수준(예를 들어, 항-아넬로좀 항체의 존재 또는 수준, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀에 대한 항체의 존재 또는 수준)을 검정함으로써 검출된다. 아넬로바이러스 또는 그에 기초한 아넬로좀에 대한 항체는 또한 항-바이러스 항체를 검출하기 위한 해당 분야의 방법, 예를 들어, 문헌[Calcedo et al., 2013; Front. Immunol. 4(341): 1-7](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 예를 들어, 항-AAV 항체의 검출 방법에 의해 검출될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "하위서열"은 각각 더 큰 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 포함되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 예에서, 하위서열은 더 큰 서열의 도메인 또는 기능적 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하위서열은 더 큰 서열로부터 단리되는 경우, 더 큰 서열의 나머지와 함께 존재할 때 하위서열에 의해 형성되는 2차 및/또는 3차 구조와 유사한 2차 및/또는 3차 구조를 형성할 수 있는 더 큰 서열의 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하위서열은 또 다른 서열(예를 들어, 외인성 서열 또는 더 큰 서열의 나머지에 대하여 이종인 서열을 포함하는 하위서열, 예를 들어, 상이한 아넬로바이러스 유래의 상응하는 하위서열)에 의해 대체될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료", "치료하는" 및 그의 동족어는 질병, 병리학적 질환 또는 장애를 개선하거나, 개량하거나, 안정화시키거나, 예방하거나 치유하기 위한 의도를 갖는 대상체의 의학적 관리를 지칭한다. 이러한 용어는 적극 치료(질병, 병리학적 질환 또는 장애를 개선하고자 하는 치료), 원인 치료(관련 질병, 병리학적 질환 또는 장애의 원인을 대상으로 하는 치료), 완화 치료(증상의 경감을 위해 설계된 치료), 예방적 치료(관련 질병, 병리학적 질환 또는 장애의 예방, 최소화, 또는 이의 발생을 부분적으로 또는 완전히 억제하고자 하는 치료); 및 보완 치료(또 다른 치료법을 보완하기 위해 사용되는 치료)를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "바이러스체"는 특정 환경, 예를 들어, 신체의 부분 내의, 예를 들어, 유기체 내의, 예를 들어, 세포 내의, 예를 들어, 조직 내의 바이러스를 지칭한다.
본 발명은 일반적으로 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 아넬로좀, 아넬로좀을 포함하는 조성물, 및 아넬로좀의 제조 또는 이용 방법을 제공한다. 아넬로좀은 일반적으로 예를 들어, 치료제를 진핵 세포로 운반하기 위한 운반 비히클로서 유용하다. 일반적으로, 아넬로좀은 단백질성 외부 내에 봉입된 (예를 들어, 이펙터, 예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터를 인코딩하는) 핵산 서열을 포함하는 유전 요소를 포함할 것이다. 아넬로좀은 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 아넬로바이러스 서열에 비한 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 영역 또는 도메인)의 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 아넬로좀은 예를 들어, 세포를 포함하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위하여, 유전 요소 또는 그 내에 인코딩된 이펙터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 이펙터)를 진핵 세포 내로 운반하기 위한 실질적으로 비-면역원성인 비히클로서 사용될 수 있다.
목차
I. 아넬로좀
A. 아넬로바이러스
B. ORF1 분자
C. ORF2 분자
D. 유전 요소
E. 단백질 결합 서열
F. 5' UTR 영역
G. GC-풍부 영역
H. 이펙터
I. 단백질성 외부
II. 벡터
III. 조성물
IV. 숙주 세포
V. 이용 방법
VI. 생성 방법
VII. 투여/운반
I. 아넬로좀
일부 양태에서, 본원에 기재된 본 발명은 아넬로좀을 이용 및 제조하는 조성물 및 방법, 아넬로좀 제제 및 치료적 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스, 예를 들어, 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5, 1 내지 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 아넬로바이러스) 또는 그의 단편 또는 부분, 또는 다른 실질적으로 비병원성인 바이러스, 예를 들어, 상리공생 바이러스(symbiotic virus), 편리공생 바이러스(commensal virus), 고유 바이러스에 기초한 서열, 구조 및/또는 기능을 갖는다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스-기반의 아넬로좀은 아넬로바이러스에 대하여 외인성인 적어도 하나의 요소, 예를 들어, 외인성 이펙터 또는 아넬로좀의 유전 요소 내에 배치된 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스-기반의 아넬로좀은 아넬로바이러스 유래의 또 다른 요소에 대하여 이종인 적어도 하나의 요소, 예를 들어, 또 다른 연결된 핵산 서열, 예컨대 프로모터 요소에 대하여 이종인 이펙터-인코딩 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 유전 요소의 나머지 및/또는 단백질성 외부에 비하여 이종인 적어도 하나의 요소(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 이펙터를 인코딩하는 외인성 요소)를 포함하는 유전 요소(예를 들어, 환형 DNA, 예를 들어, 단일 가닥 DNA)를 포함한다. 아넬로좀은 페이로드를 위한 숙주, 예를 들어, 인간 내로의 운반 비히클(예를 들어, 실질적으로 비병원성 운반 비히클)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 복제 가능하다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서 실질적으로 비병원성 및/또는 실질적으로 비통합성이다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 포유동물, 예를 들어, 인간에서 실질적으로 비-면역원성이다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 복제-결핍이다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 복제-적격이다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 본원에 그의 전체가 참조로 포함되는 PCT 출원 제PCT/US2018/037379호에 기재된 바와 같은, 큐론 또는 그의 구성성분(예를 들어, 이펙터를 인코딩하는 서열, 및/또는 단백질성 외부를 포함하는, 예를 들어, 유전 요소)을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어, 페이로드)를 인코딩하는 서열 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열, 예를 들어, 패키징 신호)을 포함하는 유전 요소로서, 유전 요소가 단일-가닥 DNA이며, 하기의 특성 중 하나 또는 둘 모두를 갖는 유전 요소: 환형이고/환형이거나 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 진핵 세포의 게놈 내로 통합됨; 및 (ii) 단백질성 외부를 포함하는 아넬로좀을 포함하며; 유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입되며; 아넬로좀은 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있다.
본원에 기재된 아넬로좀의 일부 실시형태에서, 유전 요소는 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 통합된다. 일부 실시형태에서, 대상체에 투여되는 복수의 아넬로좀으로부터 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 미만의 유전 요소는 대상체 내의 하나 이상의 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 것이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀의 집단의 유전 요소는 유사한 AAV 바이러스의 집단의 것보다 더 낮은 빈도로, 예를 들어, 유사한 AAV 바이러스의 집단보다 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상 더 낮은 빈도로 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어, 페이로드)를 인코딩하는 서열, 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열)을 포함하는 유전 요소로서, 유전 요소가 야생형 아넬로바이러스 서열(예를 들어, 야생형 토르크 테노 바이러스(TTV), 토르크 테노 미니 바이러스(TTMV) 또는 TTMDV 서열, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 서열)에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 유전 요소; 및 (ii) 단백질성 외부를 포함하는 아넬로좀을 포함하며; 유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입되며; 아넬로좀은 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은
a) (i) 외부 단백질(예를 들어, 비-병원성 외부 단백질)을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 이펙터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소; 및
b) 유전 요소와 회합된, 예를 들어, 이를 둘러싸거나 봉입하는 단백질성 외부를 포함하는 아넬로좀을 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 비-외피, 환형, 단일-가닥 DNA 바이러스로부터의(또는 이와 70% 초과, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100%의 상동성을 갖는) 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 동물 환형 단일-가닥 DNA 바이러스는 일반적으로 진핵 비-식물 숙주를 감염시키고, 환형 게놈을 갖는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 바이러스의 하위군을 지칭한다. 따라서, 동물 환형 ssDNA 바이러스는 원핵생물을 감염시키는 ssDNA 바이러스(즉, 마이크로바이러스과 및 이노바이러스과) 및 식물을 감염시키는 ssDNA 바이러스(즉, 제미니바이러스과 및 나노바이러스과)와 구별 가능하다. 그들은 또한 비-식물 진핵생물을 감염시키는 선형 ssDNA 바이러스(즉, 파보바이러스과)와 구별 가능하다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 숙주 세포 기능을 예를 들어, 일시적으로 또는 장기간 조절한다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 안정하게 변경되며, 예컨대 조절은 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일 이상 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 일시적으로 변경되며, 예를 들어, 예컨대 조절은 약 30분 이하 내지 약 7일 또는 약 1시간 이하, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 프로모터 요소를 포함한다. 실시형태들에서, 프로모터 요소는 RNA 중합효소 II-의존성 프로모터, RNA 중합효소 III-의존성 프로모터, PGK 프로모터, CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, SV40 프로모터, CAGG 프로모터 또는 UBC 프로모터, TTV 바이러스 프로모터, 조직 특이적, U6(pollIII), 활성화 단백질(TetR-VP16, Gal4-VP16, dCas9-VP16 등)에 대한 상류 DNA 결합 부위가 있는 최소 CMV 프로모터로부터 선택된다. 실시형태들에서, 프로모터 요소는 TATA 박스를 포함한다. 실시형태들에서, 프로모터 요소는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스에 대하여 내인성이다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 하기의 특징 중 하나 이상을 포함한다: 단일-가닥, 환형, 음성 가닥 및/또는 DNA. 실시형태들에서, 유전 요소는 에피솜을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이펙터를 배제한 유전 요소의 부분은 약 2.5 내지 5 kb(예를 들어, 약 2.8 내지 4kb, 약 2.8 내지 3.2kb, 약 3.6 내지 3.9kb 또는 약 2.8 내지 2.9kb), 약 5kb 미만(예를 들어, 약 2.9kb, 3.2 kb, 3.6kb, 3.9kb 또는 4kb 미만) 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 1kb)의 조합된 크기를 갖는다.
본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀, 아넬로좀을 포함하는 조성물, 이러한 아넬로좀의 사용 방법 등은 일부 예에서 부분적으로, 상이한 이펙터, 예를 들어, (예를 들어, IFN 또는 miR-625에 대한) miRNA, shRNA 등 및 단백질 결합 서열, 예를 들어, 캡시드 단백질, 예컨대 Q99153에 결합하는 DNA 서열을 단백질성 외부, 예를 들어, 문헌[Arch Virol (2007) 152: 1961-1975]에 개시된 캡시드와 조합하여, 이어서 이펙터를 세포(예를 들어, 동물 세포, 예를 들어, 인간 세포 또는 비-인간 동물 세포, 예컨대 돼지 또는 마우스 세포)로 운반하는 데 사용될 수 있는 아넬로좀을 생성하는 방법을 예시하는 실시예에 기초한다. 실시형태들에서, 이펙터는 인터페론과 같은 인자의 발현을 침묵화시킬 수 있다. 실시예에는 이펙터를 예를 들어, 아넬로바이러스로부터 유래된 서열 내로 삽입함으로써 아넬로좀이 제조될 수 있는 방법이 추가로 기재된다. 이들 실시예에 기초하여 이하의 설명은 실시예에서 고려되는 특정 발견 및 조합의 다양한 변형을 고려한다. 예를 들어, 당업자는 특정 miRNA가 단지 이펙터의 예로서 사용되며, 다른 이펙터가 예를 들어, 다른 조절 핵산 또는 치료적 펩티드일 수 있음을 실시예로부터 이해할 것이다. 유사하게, 실시예에 사용되는 특정 캡시드는 하기 기재되는 실질적으로 비-병원성인 단백질에 의해 대체될 수 있다. 실시예에 기재된 특정 아넬로바이러스 서열은 또한 하기 기재되는 아넬로바이러스 서열에 의해 대체될 수 있다. 이들 고려사항은 단백질 결합 서열, 조절 서열, 예컨대 프로모터 등에 유사하게 적용된다. 그와 독립적으로, 당업자는 특히 실시예와 밀접하게 관련이 있는 실시형태를 고려할 것이다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀 또는 아넬로좀에 포함되는 유전 요소는 세포(예를 들어, 인간 세포) 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 일단 아넬로좀 또는 유전 요소가 세포 내로 도입되면, 예를 들어, 아넬로좀의 유전 요소에 의해 인코딩되는 이펙터(예를 들어, RNA, 예를 들어, miRNA)는 세포(예를 들어, 인간 세포)에서 발현된다. 실시형태들에서, 세포 내로의 아넬로좀 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 예를 들어, 세포에 의한 표적 분자의 발현 수준을 변경시킴으로써 세포에서 표적 분자(예를 들어, 표적 핵산, 예를 들어, RNA 또는 표적 폴리펩티드)의 수준을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 실시형태들에서, 아넬로좀 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포에 의해 생성되는 인터페론의 수준을 감소시킨다. 실시형태들에서, 세포 내로의 아넬로좀 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포의 기능을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 실시형태들에서, 세포 내로의 아넬로좀 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포의 생존력을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 실시형태들에서, 세포 내로의 아넬로좀 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포(예를 들어, 암 세포)의 생존력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아넬로좀(예를 들어, 합성 아넬로좀)은 70% 미만의 항체 출현율(예를 들어, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만의 항체 출현율)을 유도한다. 실시형태들에서, 항체 출현율은 해당 분야에 공지된 방법에 따라 결정된다. 실시형태들에서, 항체 출현율은 예를 들어, 문헌[Tsuda et al., 1999; J. Virol. Methods 77: 199-206](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV 항체 검출 방법 및/또는 문헌[Kakkola et al., 2008; Virology 382: 182-189](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV IgG 혈청학적 출현율의 결정 방법에 따라 생물학적 시료에서 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 또는 그에 기초한 아넬로좀에 대한 항체를 검출함으로써 결정된다. 아넬로바이러스 또는 그에 기초한 아넬로좀에 대한 항체는 또한 항-바이러스 항체를 검출하기 위한 해당 분야의 방법, 예를 들어, 문헌[Calcedo et al., 2013; Front. Immunol. 4(341): 1-7](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 예를 들어, 항-AAV 항체의 검출 방법에 의해 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 복제 결핍, 복제 결함 또는 복제 비적격 유전 요소는 유전 요소의 복제에 필요한 필수 기구 또는 구성성분의 전부를 인코딩하지 않는다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 유전 요소는 복제 인자를 인코딩하지 않는다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 유전 요소는 하나 이상의 ORF(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, 및/또는 ORF2t/3)를 인코딩하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소에 의해 인코딩되지 않는 기구 또는 구성성분은 (예를 들어, 헬퍼, 예를 들어, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드를 사용하여, 또는 숙주 세포에 의해 포함되는, 예를 들어, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 핵산에 인코딩되어) 트랜스로 제공되어, 예를 들어, 유전 요소가 트랜스로 제공되는 기구 또는 구성성분의 존재 하에 복제를 겪을 수 있게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 패키징 결핍, 패키징 결함 또는 패키징 비적격 유전 요소는 단백질성 외부(예를 들어, 단백질성 외부는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 또는 그의 부분을 포함함) 내에 패키징될 수 없다. 일부 실시형태에서, 패키징 결핍 유전 요소는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스에 비하여 10% 미만(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01% 또는 0.001% 미만)의 효율로 단백질성 외부 내로 패키징된다. 일부 실시형태에서, 패키징 결함 유전 요소는 심지어 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3)의 존재 하에서도 단백질성 외부 내에 패키징될 수 없다. 일부 실시형태에서, 패키징 결핍 유전 요소는 심지어 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3)의 존재 하에서도, (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스에 비하여 10% 미만(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01% 또는 0.001% 미만)의 효율로 단백질성 외부 내로 패키징된다.
일부 실시형태에서, 패키징 적격 유전 요소는 단백질성 외부(예를 들어, 단백질성 외부는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 또는 그의 부분을 포함함) 내로 패키징될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패키징 적격 유전 요소는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스에 비하여 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 이상)의 효율로 단백질성 외부 내에 패키징된다. 일부 실시형태에서, 패키징 적격 유전 요소는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3)의 존재 하에서, 단백질성 외부 내로 패키징될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패키징 적격 유전 요소는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3)의 존재 하에서, (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스에 비하여 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 이상)의 효율로 단백질성 외부 내로 패키징된다.
아넬로바이러스
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀은 아넬로바이러스로부터 유래된 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 아넬로바이러스에 비하여 외인성인 하나 이상의 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 아넬로바이러스에 비하여 내인성인 하나 이상의 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 아넬로좀 내의 하나 이상의 다른 서열 또는 발현 생성물에 비하여 이종인 하나 이상의 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 아넬로바이러스는 일반적으로 음의 극성을 갖는 단일-가닥 환형 DNA 게놈을 갖는다. 아넬로바이러스는 일반적으로 임의의 인간 질병과 연관된 바 없다. 그러나, 아넬로바이러스 감염을 인간 질병과 연관시키려는 시도는 대조군 코호트 집단(들)에서의 무증상 아넬로바이러스 바이러스혈증의 높은 유병률, 아넬로바이러스 과 내의 현저한 게놈 다양성, 종래에 시험관 내에서 작용제를 전파할 수 없음, 아넬로바이러스 질병의 동물 모델(들)의 결여에 의해 혼동되었다(문헌[Yzebe et al., Panminerva Med. (2002) 44:167-177]; 문헌[Biagini, P., Vet. Microbiol. (2004) 98:95-101]).
아넬로바이러스는 일반적으로 구비강 또는 배변-구강 감염, 모에서 유아로의 전염 및/또는 자궁 내의 전염에 의해 전염된다(문헌[Gerner et al., Ped. Infect. Dis. J. (2000) 19:1074-1077]). 감염된 사람은 일부 예에서, 장기의(수개월 내지 수년) 아넬로바이러스 바이러스혈증이라는 특징이 나타날 수 있다. 인간은 한가지 초과의 유전자군 또는 바이러스주로 동시-감염될 수 있다(문헌[Saback, et al., Scad. J. Infect. Dis. (2001) 33:121-125]). 이들 유전자군이 감염된 인간 내에서 재조합될 수 있다는 제안이 존재한다(문헌[Rey et al., Infect. (2003) 31:226-233]). 이중 가닥 아이소폼(복제성) 중간체는 몇몇의 조직, 예컨대 간, 말초 혈액 단핵 세포 및 골수에서 관찰된 바 있다(문헌[Kikuchi et al., J. Med. Virol. (2000) 61:165-170]; 문헌[Okamoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2002) 270:657-662]; 문헌[Rodriguez-lnigo et al., Am. J. Pathol. (2000) 156:1227-1234]).
일부 실시형태에서, 유전 요소는 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, 또는 본원에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어, 아넬로바이러스 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 서열 또는 그의 단편에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로좀은 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로좀은 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀은 본원에 기재된 아넬로바이러스(예를 들어, 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5 또는 1 내지 18 중 어느 하나에 주석이 달리거나, 그에 열거된 서열에 의해 인코딩되는 바와 같은 아넬로바이러스 서열) 중 어느 하나의 TATA 박스, 캡 부위, 개시인자 요소, 전사 시작 부위, 5' UTR 보존된 도메인, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3, 3개의 오픈-리딩 프레임 영역, 폴리(A) 신호, GC-풍부 영역 중 하나 이상 또는 그의 임의의 조합에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열, 예를 들어, 본원에 기재된 아넬로바이러스(예를 들어, 표 A1 내지 A12 또는 1 내지 18 중 어느 하나에 주석이 달리거나, 그에 열거된 서열에 의해 인코딩되는 바와 같은 아넬로바이러스 서열) 중 어느 하나의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 아넬로바이러스 ORF1 또는 ORF2 단백질(예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 ORF1 또는 ORF2 아미노산 서열, 또는 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 핵산 서열에 의해 인코딩되는 ORF1 또는 ORF2 아미노산 서열)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 ORF1 아미노산 서열 또는 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 핵산 서열에 의해 인코딩되는 ORF1 아미노산 서열)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2326 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2552 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 703)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2326 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 465 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 77 내지 81)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 95 내지 110)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 105)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 165 내지 235)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2535 내지 2746)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2953 내지 2958)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3620 내지 3648)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 2887)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 724 및/또는 2414 내지 2887)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 724 및/또는 2643 내지 2849)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 342 내지 728)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 342 내지 724 및/또는 2414 내지 2849)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 342 내지 724 및/또는 2643 내지 3057)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 87 내지 91)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 105 내지 120)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 115)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 175 내지 245)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2626 내지 2846)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A3의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3052 내지 3058)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 556 내지 2904)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 556 내지 687 및/또는 2422 내지 2904)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 556 내지 687 및/또는 2564 내지 2878)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 305 내지 691)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 305 내지 687 및/또는 2422 내지 2878)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 305 내지 687 및/또는 2564 내지 3317)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 305 내지 360 및/또는 2564 내지 3317)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 50 내지 55)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 68 내지 83)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 78)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 138 내지 208)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2626 내지 2846)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A5의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3316 내지 3319)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 589 내지 2889)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 589 내지 711 및/또는 2362 내지 2889)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 589 내지 711 및/또는 2555 내지 2863)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 353 내지 715)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 353 내지 711 및/또는 2362 내지 2863)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 353 내지 711 및/또는 2555 내지 3065)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 353 내지 432 및/또는 2555 내지 3065)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 86 내지 90)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 104 내지 119)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 114)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 174 내지 244)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2555 내지 2863)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3062 내지 3066)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A7의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3720 내지 3742)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 511 내지 2793)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 511 내지 711 및/또는 2326 내지 2793)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 511 내지 711 및/또는 2525 내지 2767)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 272 내지 637)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 272 내지 633 및/또는 2326 내지 2767)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 272 내지 633 및/또는 2525 내지 2984)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 272 내지 633 및/또는 2525 내지 2984)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 12 내지 17)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 30 내지 45)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 40)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 100 내지 171)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2525 내지 2767)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A9의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2981 내지 2985)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 704 내지 3001)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 704 내지 826 및/또는 2534 내지 3001)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 704 내지 826 및/또는 2721 내지 2975)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 465 내지 830)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 465 내지 826 및/또는 2534 내지 2975)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 465 내지 826 및/또는 2721 내지 3192)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 465 내지 595 및/또는 2721 내지 3192)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 206 내지 210)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 224 내지 239)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 234)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 294 내지 364)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2721 내지 2975)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3189 내지 3193)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A11의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3844 내지 3895)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2326 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2552 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 703)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2326 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 465 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 77 내지 81)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 95 내지 110)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 105)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 165 내지 235)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2535 내지 2746)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2953 내지 2958)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3620 내지 3648)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2326 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2552 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 703)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2326 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 465 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 77 내지 81)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 95 내지 110)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 105)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 165 내지 235)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2535 내지 2746)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2953 내지 2958)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B2의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3620 내지 3648)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2326 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2552 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 703)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2326 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 465 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 77 내지 81)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 95 내지 110)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 105)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 165 내지 235)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2535 내지 2746)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2953 내지 2958)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B3의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3620 내지 3648)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2326 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2552 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 703)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2326 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 465 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 77 내지 81)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 95 내지 110)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 105)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 165 내지 235)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2535 내지 2746)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2953 내지 2958)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B4의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3620 내지 3648)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2326 내지 2775)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 699 및/또는 2552 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 703)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2326 내지 2759)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 699 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 465 및/또는 2552 내지 2957)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 77 내지 81)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 95 내지 110)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 105)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 165 내지 235)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2535 내지 2746)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2953 내지 2958)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B5의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3620 내지 3648)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 571 내지 2613)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 571 내지 587 및/또는 2137 내지 2613)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 571 내지 687 및/또는 2339 내지 2659)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 299 내지 691)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 299 내지 687 및/또는 2137 내지 2659)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 299 내지 687 및/또는 2339 내지 2831)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 299 내지 348 및/또는 2339 내지 2831)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 84 내지 90)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 캡 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 107 내지 114)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 114)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 177 내지 247)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2325 내지 2610)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2813 내지 2818)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3415 내지 3570)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 729 내지 2972)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 729 내지 908 및/또는 2490 내지 2972)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 729 내지 908 및/또는 2725 내지 3039)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 412 내지 912)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 412 내지 908 및/또는 2490 내지 3039)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 412 내지 908 및/또는 2725 내지 3208)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 112 내지 119)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 128 내지 148)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 148)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 204 내지 273)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2699 내지 2969)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3220 내지 3225)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 3의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3302 내지 3541)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 2830)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 715 및/또는 2363 내지 2830)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 715 및/또는 2565 내지 2789)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 336 내지 719)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 336 내지 715 및/또는 2363 내지 2789)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 336 내지 715 및/또는 2565 내지 3015)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 336 내지 388 및/또는 2565 내지 3015)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 83 내지 88)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 캡 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 104 내지 111)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 111)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2551 내지 2786)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3011 내지 3016)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 5의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3632 내지 3753)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 586 내지 2928)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 586 내지 717 및/또는 2446 내지 2928)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 586 내지 717 및/또는 2675 내지 2902)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 721)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 717 및/또는 2446 내지 2902)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 335 내지 717 및/또는 2675 내지 3109)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 82 내지 87)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 95 내지 115)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 115)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 238)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2640 내지 2899)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3106 내지 3114)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 7의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3768 내지 3878)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 588 내지 2873)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 588 내지 722 및/또는 2412 내지 2873)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 588 내지 722 및/또는 2638 내지 2847)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 331 내지 726)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 331 내지 722 및/또는 2412 내지 2847)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 331 내지 722 및/또는 2638 내지 3058)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 331 내지 380 및/또는 2638 내지 3058)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 82 내지 86)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 100 내지 115)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 115)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2699 내지 2969)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3220 내지 3225)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 9의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3302 내지 3541)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 2839)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 727 및/또는 2381 내지 2839)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 727 및/또는 2619 내지 2813)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 357 내지 731)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 357 내지 727 및/또는 2381 내지 2813)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 357 내지 727 및/또는 2619 내지 3021)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 357 내지 406 및/또는 2619 내지 3021)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 89 내지 90)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 캡 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 107 내지 114)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 114)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 174 내지 244)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2596 내지 2810)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3017 내지 3022)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 11의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3691 내지 3794)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 2896)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 724 및/또는 2411 내지 2896)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 724 및/또는 2646 내지 2870)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 357 내지 728)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 357 내지 724 및/또는 2411 내지 2870)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 357 내지 724 및/또는 2646 내지 3081)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 82 내지 86)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 개시인자 요소 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 94 내지 115)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 115)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2629 내지 2867)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3076 내지 3086)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 13의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3759 내지 3866)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 612 내지 2612)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 612 내지 719 및/또는 2274 내지 2612)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 612 내지 719 및/또는 2449 내지 2589)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 424 내지 723)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 424 내지 719 및/또는 2274 내지 2589)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 424 내지 719 및/또는 2449 내지 2812)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 237 내지 243)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 캡 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 260 내지 267)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 267)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 323 내지 393)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2441 내지 2586)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2808 내지 2813)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 15의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2868 내지 2929)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 ORF1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 432 내지 2453)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 432 내지 584 및/또는 1977 내지 2453)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 432 내지 584 및/또는 2197 내지 2388)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 283 내지 588)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 283 내지 584 및/또는 1977 내지 2388)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 283 내지 584 및/또는 2197 내지 2614)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 21 내지 25)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 캡 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 42 내지 49)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 49)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 117 내지 187)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 3개의 오픈-리딩 프레임 영역 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2186 내지 2385)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2676 내지 2681)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 17의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3054 내지 3172)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A2의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A2의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A2의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A2의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A2의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A2의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A2의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A4의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A4의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A4의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A4의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A4의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A4의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A6의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A6의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A6의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A6의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A6의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A6의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A6의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A8의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A8의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A8의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A8의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A8의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A8의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A8의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A10의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A10의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A10의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A10의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A10의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A10의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A10의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A12의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A12의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A12의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A12의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A12의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A12의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A12의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C2의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C2의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C2의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C2의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C2의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C2의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C2의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C3의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C3의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C3의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C3의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C3의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C3의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C3의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C4의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C4의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C4의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C4의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C4의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C4의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C4의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C5의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C5의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C5의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C5의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C5의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C5의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C5의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 2의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 2의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 2의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 2의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 2의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 2의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 2의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 4의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 4의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 4의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 4의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 4의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 4의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 6의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 6의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 6의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 6의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 6의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 6의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 6의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 8의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 8의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 8의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 8의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 8의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 8의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 10의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 10의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 10의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 10의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 10의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 10의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 10의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 12의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 12의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 12의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 12의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 12의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 12의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 12의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 14의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 14의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 14의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 14의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 14의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 14의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 16의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 16의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 16의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 16의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 16의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 16의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 18의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 18의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 18의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 18의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 18의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 18의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A2의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A2의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A2의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A2의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A2의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A2의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A2의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 574 내지 2775의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A2의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A4의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A4의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A4의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A4의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A4의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A4의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 2887의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A4의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A6의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A6의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A6의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A6의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A6의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A6의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A6의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 556 내지 2904의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A6의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A8의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A8의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A8의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A8의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A8의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A8의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A8의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 589 내지 2889의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A8의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A10의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A10의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A10의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A10의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A10의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A10의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A10의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 511 내지 2793의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A10의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A12의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A12의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A12의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A12의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A12의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A12의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 A12의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 704 내지 3001의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 A12의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C1의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 512 내지 2545의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C2의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C2의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C2의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C2의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C2의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C2의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C2의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C2의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 501 내지 2489의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 C2의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C3의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C3의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C3의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C3의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C3의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C3의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C3의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C3의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 572 내지 2758의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 C3의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C4의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C4의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C4의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C4의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C4의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C4의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C4의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C4의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 581 내지 2884의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 C4의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C5의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C5의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C5의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C5의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C5의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C5의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C5의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 C5의 아넬로바이러스 TAIP 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 614 내지 2911의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 C5의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 2의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 2의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 2의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 2의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 2의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 2의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 2의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 571 내지 2613의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 2의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 4의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 4의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 4의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 4의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 4의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 4의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 729 내지 2972의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 4의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 6의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 6의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 6의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 6의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 6의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 6의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 6의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 2830의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 6의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 8의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 8의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 8의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 8의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 8의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 8의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 586 내지 2928의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 8의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 10의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 10의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 10의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 10의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 10의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 10의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 10의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 588 내지 2873의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 10의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 12의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 12의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 12의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 12의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 12의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 12의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 12의 아넬로바이러스 ORF2t/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 2839의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 12의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 14의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 14의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 14의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 14의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 14의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 14의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 599 내지 2896의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 14의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 16의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 16의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 16의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 16의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 16의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 16의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 612 내지 2612의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 16의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 18의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 18의 아넬로바이러스 ORF1/1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 18의 아넬로바이러스 ORF1/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 18의 아넬로바이러스 ORF2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 18의 아넬로바이러스 ORF2/2 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 표 18의 아넬로바이러스 ORF2/3 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 432 내지 2453의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 아넬로좀에 포함되는) ORF1 분자는 표 18의 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 번역후 가공된(예를 들어, 단백질 가수분해적으로 가공된) 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 2의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 4의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 6의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 8의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 10의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 12의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 14의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 16의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 18의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A2의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A4의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A6의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A8의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A10의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A12의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 C2의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 C3의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 C4의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 C5의 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩되는 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 1에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 3에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 5에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 7에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 9에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 11에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 13에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 15에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 17에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A1에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A3에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A5에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A7에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A9에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 A11에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 B1에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 B2에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 B3에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 B4에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표 B5에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 표 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3 서열) 또는 이에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[표 A1] 신규한 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ))
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
[표 A2] 신규한 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 6)
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
[표 A3] 신규한 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ))
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
[표 A4] 신규한 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 6)
Figure pct00010
Figure pct00011
[표 A5] 신규한 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ))
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
[표 A6] 신규한 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 4)
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
[표 A7] 신규한 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ))
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
[표 A8] 신규한 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 4)
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
[표 A9] 신규한 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ))
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
[표 A10] 신규한 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 5)
Figure pct00027
Figure pct00028
[표 A11] 신규한 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ))
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
[표 A12] 신규한 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 5)
Figure pct00033
Figure pct00034
[표 1] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 1)
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
[표 2] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 1)
Figure pct00038
Figure pct00039
[표 3] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 2)
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
[표 4] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 2)
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
[표 5] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 3)
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
[표 6] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 3)
Figure pct00049
Figure pct00050
[표 7] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 4)
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
[표 8] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 4)
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
[표 9] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 5)
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
[표 10] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 5)
Figure pct00060
Figure pct00061
[표 11] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 6)
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
[표 12] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 6)
Figure pct00065
Figure pct00066
[표 13] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 7)
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
[표 14] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 7)
Figure pct00070
Figure pct00071
[표 15] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(베타토르크바이러스( Betatorquevirus ))
Figure pct00072
Figure pct00073
[표 16] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(베타토르크바이러스( Betatorquevirus ))
Figure pct00074
[표 17] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
[표 18] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00078
Figure pct00079
[표 B1] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
[표 C1] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00083
Figure pct00084
[표 B2] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00085
Figure pct00086
[표 C2] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00087
Figure pct00088
[표 B3] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ) - 클레이드 1
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
[표 C3] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ) 클레이드 1
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
[표 B4] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus )) 클레이드 3
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
[표 C4] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ) - 클레이드 3
Figure pct00098
Figure pct00099
[표 B5] 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus )) 클레이드 7
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
[표 C5] 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus )) 클레이드 7
Figure pct00103
Figure pct00104
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 본원에 그의 전체가 참조로 포함되는 PCT 출원 제PCT/US2018/037379호에 열거된 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 PCR 출원 제PCT/US2018/037379호에 열거된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 실시예 9에 기재된 방법에 따라 확인된 바와 같은 아넬로바이러스 게놈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 실시예 13에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 서열 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 표 19에 나타낸 바와 같은 컨센서스 아넬로바이러스 모티프를 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 표 19에 나타낸 바와 같은 컨센서스 아넬로바이러스 ORF1 모티프를 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 표 19에 나타낸 바와 같은 컨센서스 아넬로바이러스 ORF1/1 모티프를 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 표 19에 나타낸 바와 같은 컨센서스 아넬로바이러스 ORF1/2 모티프를 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 표 19에 나타낸 바와 같은 컨센서스 아넬로바이러스 ORF2/2 모티프를 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 표 19에 나타낸 바와 같은 컨센서스 아넬로바이러스 ORF2/3 모티프를 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 표 19에 나타낸 바와 같은 컨센서스 아넬로바이러스 ORF2t/3 모티프를 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 19에 나타낸 바와 같은 X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 표 19에 나타낸 바와 같은 Z는 글루탐산 또는 글루타민을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 표 19에 나타낸 바와 같은 B는 아스파르트산 또는 아스파라긴을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 표 19에 나타낸 바와 같은 J는 류신 또는 이소류신을 나타낸다.
[표 19] 아넬로바이러스의 오픈 리딩 프레임(ORF) 내의 컨센서스 모티프
Figure pct00105
Figure pct00106
ORF1 분자
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 ORF1 분자 및/또는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일반적으로, ORF1 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질)의 구조적 특징 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질)에 비하여 절단(truncation)을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 또는 700개 아미노산에 의해 절단된다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 알파토르크바이러스, 베타토르크바이러스 또는 감마토르크바이러스 ORF1 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. ORF1 분자는 일반적으로, 핵산 분자, 예컨대 DNA(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 유전 요소)에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 세포의 핵에 국소화된다. 특정 실시형태에서, ORF1 분자는 세포의 핵소체에 국소화된다.
이론에 결부시키고자 하지 않고, ORF1 분자는 다른 ORF1 분자에 결합하여, 예를 들어, (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 단백질성 외부를 형성할 수 있을 수 있다. 이러한 ORF1 분자는 캡시드를 형성하는 능력을 갖는 것으로서 설명될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 캡슐화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 ORF1 분자는 다량체를 형성하여, 예를 들어, 단백질성 외부를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다량체는 동종다량체일 수 있다. 다른 실시형태에서, 다량체는 (예를 들어, 복수의 별개의 ORF1 분자를 포함하는) 이종다량체일 수 있다. 또한, ORF1 분자가 복제효소 활성을 가질 수 있는 것이 고려된다.
ORF1 분자는 일부 실시형태에서, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 아르기닌 풍부 영역, 예를 들어, 적어도 60%의 염기성 잔기(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 염기성 잔기; 예를 들어, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 70% 내지 90% 또는 70 내지 80%의 염기성 잔기)를 갖는 영역을 포함하는 제1 영역, 및 젤리-롤 도메인, 예를 들어, 적어도 6개의 베타 가닥(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 베타 가닥)을 포함하는 제2 영역.
아르기닌-풍부 영역
아르기닌 풍부 영역은 본원에 기재된 아르기닌-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖거나, 적어도 60%, 70% 또는 80%의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌, 라이신 또는 그의 조합)를 포함하는 적어도 약 40개 아미노산의 서열을 갖는다.
젤리 롤 도메인
젤리-롤 도메인 또는 영역은 하기의 특징 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개)을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 더 큰 폴리펩티드에 포함된 도메인 또는 영역)를 포함한다(예를 들어, 이로 이루어진다):
(i) 젤리-롤 도메인의 적어도 30%(예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% 이상)의 아미노산이 하나 이상의 β-시트의 부분임;
(ii) 젤리-롤 도메인의 2차 구조는 적어도 4개(예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함함; 및/또는
(iii) 젤리-롤 도메인의 3차 구조는 적어도 2개(예를 들어, 적어도 2, 3 또는 4개)의 β-시트를 포함함; 및/또는
(iv) 젤리-롤 도메인은 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1의 β-시트 대 α-나선의 비를 포함함.
특정 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 2개의 β-시트를 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 약 8개(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 8개의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 7개의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 6개의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 5개의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 4개의 β-가닥을 포함한다.
일부 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 제2 β-시트에 대한 역평행 배향의 제1 β-시트를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 β-시트는 약 4개(예를 들어, 3, 4, 5 또는 6개)의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제2 β-시트는 약 4개(예를 들어, 3, 4, 5 또는 6개)의 β-가닥을 포함한다. 실시형태들에서, 제1 및 제2 β-시트는 총 약 8개(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함한다.
특정 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 캡시드 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ORF1 분자)의 구성성분이다. 특정 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 자가-어셈블리 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 젤리-롤 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 젤리-롤 도메인을 포함하는 또 다른 카피의 폴리펩티드에 결합한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 젤리-롤 도메인은 제2 카피의 폴리펩티드의 젤리-롤 도메인에 결합한다.
ORF1 분자는 또한, 아넬로바이러스 N22 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 N22 도메인)의 구조 또는 활성을 포함하는 제3 영역, 및/또는 아넬로바이러스 C-말단 도메인(CTD)(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 CTD)의 구조 또는 활성을 포함하는 제4 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 N-말단에서 C-말단 순서로, 제1, 제2, 제3 및 제4 영역을 포함한다.
ORF1 분자는 일부 실시형태에서, 초가변 영역(HVR), 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 HVR을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, HVR은 제2 영역과 제3 영역 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, HVR은 적어도 약 55개(예를 들어, 적어도 약 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 65개)의 아미노산(예를 들어, 약 45 내지 160, 50 내지 160, 55 내지 160, 60 내지 160, 45 내지 150, 50 내지 150, 55 내지 150, 60 내지 150, 45 내지 140, 50 내지 140, 55 내지 140 또는 60 내지 140개의 아미노산)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 영역은 핵산 분자(예를 들어, DNA)에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기성 잔기는 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 영역은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아르기닌 잔기(예를 들어, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 70% 내지 90% 또는 70 내지 80%의 아르기닌 잔기)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 영역은 약 30 내지 120개의 아미노산(예를 들어, 약 40 내지 120, 40 내지 100, 40 내지 90, 40 내지 80, 40 내지 70, 50 내지 100, 50 내지 90, 50 내지 80, 50 내지 70, 60 내지 100, 60 내지 90 또는 60 내지 80개의 아미노산)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 영역은 바이러스 ORF1 아르기닌-풍부 영역(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 아르기닌-풍부 영역)의 구조 또는 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 영역은 핵 국소화 신호를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 영역은 젤리-롤 도메인, 예를 들어, 바이러스 ORF1 젤리-롤 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 젤리-롤 도메인)의 구조 또는 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 영역은 또 다른 ORF1 분자의 제2 영역에 결합하여, 예를 들어, 단백질성 외부(예를 들어, 캡시드) 또는 그의 부분을 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제4 영역은 단백질성 외부(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1 분자의 다량체를 포함하는 단백질성 외부)의 표면 상에 노출된다.
일부 실시형태에서, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 및/또는 HVR은 각각 4개 미만(예를 들어, 0, 1, 2 또는 3개)의 베타 시트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역, 및/또는 HVR 중 하나 이상은 이종 아미노산 서열(예를 들어, 이종 ORF1 분자로부터의 상응하는 영역)에 의해 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 아미노산 서열은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 요망되는 작용성을 갖는다.
일부 실시형태에서, ORF1 분자는 (예를 들어, 도 34에 나타낸 바와 같이) 복수의 보존된 모티프(예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 아미노산을 포함하는 모티프)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 보존된 모티프는 하나 이상의 야생형 아넬로바이러스 클레이드(예를 들어, 알파토르크바이러스, 클레이드 1; 알파토르크바이러스, 클레이드 2; 알파토르크바이러스, 클레이드 3; 알파토르크바이러스, 클레이드 4; 알파토르크바이러스, 클레이드 5; 알파토르크바이러스, 클레이드 6; 알파토르크바이러스, 클레이드 7; 베타토르크바이러스; 및/또는 감마토르크바이러스)의 ORF1 단백질에 대하여 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 보일 수 있다. 실시형태들에서, 보존된 모티프는 각각 1 내지 1000개(예를 들어, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 10 내지 15, 10 내지 20, 15 내지 20, 5 내지 50, 5 내지 100, 10 내지 50, 10 내지 100, 10 내지 1000, 50 내지 100, 50 내지 1000 또는 100 내지 1000개)의 아미노산의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 보존된 모티프는 약 2 내지 4%(예를 들어, 약 1 내지 8%, 1 내지 6%, 1 내지 5%, 1 내지 4%, 2 내지 8%, 2 내지 6%, 2 내지 5% 또는 2 내지 4%)의 ORF1 분자의 서열로 이루어지며, 각각은 야생형 아넬로바이러스 클레이드의 ORF1 단백질 내의 상응하는 모티프에 대하여 100% 서열 동일성을 보인다. 특정 실시형태에서, 보존된 모티프는 약 5 내지 10%(예를 들어, 약 1 내지 20%, 1 내지 10%, 5 내지 20% 또는 5 내지 10%)의 ORF1 분자의 서열로 이루어지며, 각각은 야생형 아넬로바이러스 클레이드의 ORF1 단백질 내의 상응하는 모티프에 대하여 80% 서열 동일성을 보인다. 특정 실시형태에서, 보존된 모티프는 약 10 내지 50%(예를 들어, 약 10 내지 20%, 10 내지 30%, 10 내지 40%, 10 내지 50%, 20 내지 40%, 20 내지 50% 또는 30 내지 50%)의 ORF1 분자의 서열로 이루어지며, 각각은 야생형 아넬로바이러스 클레이드의 ORF1 단백질 내의 상응하는 모티프에 대하여 60% 서열 동일성을 보인다. 일부 실시형태에서, 보존된 모티프는 표 19에 열거된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, ORF1 분자는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은), 야생형 ORF1 단백질에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경)를 포함한다.
N22 도메인 내의 보존된 ORF1 모티프
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 분자)는 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829)을 포함하며, Xn은 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열이다. 예를 들어, X2는 임의의 2개의 아미노산의 인접 서열을 나타낸다. 일부 실시형태에서, YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829)은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, ORF1 분자의 N22 도메인 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829)을 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 서열)을 포함하며, Xn은 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 분자)는 예를 들어, N22 도메인 내의, 예를 들어, YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프의 부분을 포함하고/포함하거나 이에 측접하는 보존된 2차 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 보존된 2차 구조는 제1 베타 가닥 및/또는 제2 베타 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 베타 가닥은 약 5 내지 6개(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 베타 가닥은 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프의 N-종말단에 티로신(Y) 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프는 랜덤 코일(예를 들어, 약 8 내지 9개 아미노산의 랜덤 코일)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 베타 가닥은 약 7 내지 8개(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 베타 가닥은 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프의 C-종말단에 아스파라긴(N) 잔기를 포함한다.
예시적인 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프-측접 2차 구조는 실시예 47 및 도 48에 설명되어 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 도 48에 나타낸 2차 구조 요소(예를 들어, 베타 가닥)의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 전부)을 포함하는 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프에 측접하는, 도 48에 나타낸 2차 구조 요소(예를 들어, 베타 가닥) 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 전부)을 포함하는 영역을 포함한다.
ORF1 젤리-롤 도메인 내의 보존된 2차 구조 모티프
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 분자)는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 아넬로바이러스 ORF1 단백질에 의해 포함되는 하나 이상의 2차 구조 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 아넬로바이러스 ORF1 단백질의 젤리-롤 도메인에 의해 포함되는 하나 이상의 2차 구조 요소를 포함한다. 일반적으로, ORF1 젤리-롤 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향의 순서로, 제1 베타 가닥, 제2 베타 가닥, 제1 알파 나선, 제3 베타 가닥, 제4 베타 가닥, 제5 베타 가닥, 제2 알파 나선, 제6 베타 가닥, 제7 베타 가닥, 제8 베타 가닥 및 제9 베타 가닥을 포함하는 2차 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 N-말단에서 C-말단 방향의 순서로, 제1 베타 가닥, 제2 베타 가닥, 제1 알파 나선, 제3 베타 가닥, 제4 베타 가닥, 제5 베타 가닥, 제2 알파 나선, 제6 베타 가닥, 제7 베타 가닥, 제8 베타 가닥 및/또는 제9 베타 가닥을 포함하는 2차 구조를 포함한다.
일부 실시형태에서, 보존된 2차 구조 요소(즉, 베타 가닥 및/또는 알파 나선)의 쌍은 예를 들어, 랜덤 코일 서열, 베타 가닥 또는 알파 나선 또는 그의 조합을 포함하는 개재 아미노산 서열에 의해 분리된다. 보존된 2차 구조 요소 사이의 개재 아미노산 서열은 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 하나 이상의 추가의 베타 가닥 및/또는 알파 나선을 (예를 들어, 젤리-롤 도메인 내에) 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연속 베타 가닥 또는 연속 알파 나선이 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 베타 가닥 및 제2 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제3 베타 가닥 및 제4 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제4 베타 가닥 및 제5 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제6 베타 가닥 및 제7 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제7 베타 가닥 및 제8 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제8 베타 가닥 및 제9 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다.
일부 실시형태에서, 제1 베타 가닥은 약 5 내지 7개(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 베타 가닥은 약 15 내지 16개(예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 알파 나선은 약 15 내지 17개(예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제3 베타 가닥은 약 3 내지 4개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제4 베타 가닥은 약 10 내지 11개(예를 들어, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제5 베타 가닥은 약 6 내지 7개(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 알파 나선은 약 8 내지 14개(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 알파 나선은 (예를 들어, 랜덤 코일 서열에 의해 분리된) 2개의 더 작은 알파 나선으로 파단될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 더 작은 알파 나선의 각각은 약 4 내지 6개(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제6 베타 가닥은 약 4 내지 5개(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제7 베타 가닥은 약 5 내지 6개(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제8 베타 가닥은 약 7 내지 9개(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제9 베타 가닥은 약 5 내지 7개(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산 길이이다.
예시적인 젤리-롤 도메인 2차 구조는 실시예 47 및 도 47에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 도 47에 나타낸 젤리-롤 도메인 2차 구조 중 임의의 것의 2차 구조 요소(예를 들어, 베타 가닥 및/또는 알파 나선)의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 전부)을 포함하는 영역을 포함한다.
예시적인 ORF1 서열
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 분자)는 예를 들어, 표 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 예를 들어, 표 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아넬로좀은 예를 들어, 표 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 유전 요소)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 (예를 들어, 표 20 내지 37 또는 D1 내지 D10 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 아르기닌(Arg)-풍부 도메인, 젤리-롤 도메인, 초가변 영역(HVR), N22 도메인 또는 C-말단 도메인(CTD) 또는 이에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 상이한 아넬로바이러스로부터의 복수의 하위서열(예를 들어, 표 20 내지 37 또는 D1 내지 D10에 열거된 알파토르크바이러스 클레이드 1-7 하위서열로부터 선택되는 ORF1 하위서열의 임의의 조합)을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인, 젤리-롤 도메인, N22 도메인 및 CTD, 및 또 다른 아넬로바이러스로부터의 HVR 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 젤리-롤 도메인, HVR, N22 도메인 및 CTD 및 또 다른 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인, HVR, N22 도메인 및 CTD 및 또 다른 아넬로바이러스로부터의 젤리-롤 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인, 젤리-롤 도메인, HVR 및 CTD 및 또 다른 아넬로바이러스로부터의 N22 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인, 젤리-롤 도메인, HVR 및 N22 도메인 및 또 다른 아넬로바이러스로부터의 CTD 중 하나 이상을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 20의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 20의 아미노산 1 내지 66)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 21의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 20의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 20의 아미노산 67 내지 277)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 21의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 20의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 20의 아미노산 278 내지 347)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 21의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 20의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 20의 아미노산 348 내지 513)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 21의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 20의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 20의 아미노산 513 내지 680)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 21의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 22의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 22의 아미노산 1 내지 69)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 23의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 22의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 22의 아미노산 70 내지 279)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 23의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 22의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 22의 아미노산 280 내지 411)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 23의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 22의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 22의 아미노산 412 내지 578)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 23의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 22의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 22의 아미노산 579 내지 747)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 23의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 24의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 24의 아미노산 1 내지 68)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 25의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 24의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 24의 아미노산 69 내지 280)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 25의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 24의 HVR 아미노산 서열(예를 들어 표 24의 아미노산 281 내지 413)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 25의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 24의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 24의 아미노산 414 내지 479)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 25의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 24의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 24의 아미노산 580 내지 743)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 25의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 26의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(예를 들어, 표 26의 아미노산 1 내지 74)을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 27의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 26의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 26의 아미노산 75 내지 284)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 27의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 26의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 26의 아미노산 285 내지 445)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 27의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 26의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 26의 아미노산 446 내지 611)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 27의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 26의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 26의 아미노산 612 내지 780)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 27의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 28의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 28의 아미노산 1 내지 75)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 29의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 28의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 28의 아미노산 75 내지 284)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 29의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 28의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 28의 아미노산 285 내지 432)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 29의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 28의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 28의 아미노산 433 내지 599)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 29의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 28의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 28의 아미노산 600 내지 780)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 29의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 30의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 30의 아미노산 1 내지 77)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 31의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 30의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 30의 아미노산 78 내지 286)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 31의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 30의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 30의 아미노산 287 내지 416)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 31의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 30의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 30의 아미노산 417 내지 585)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 31의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 30의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 30의 아미노산 586 내지 746)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 31의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 32의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 32의 아미노산 1 내지 74)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 33의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 32의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 32의 아미노산 75 내지 286)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 33의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 32의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 32의 아미노산 287 내지 428)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 33의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 32의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 32의 아미노산 429 내지 595)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 33의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 32의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 32의 아미노산 596 내지 765)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 33의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 34의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 34의 아미노산 1 내지 38)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 35의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 34의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 34의 아미노산 39 내지 246)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 35의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 34의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 34의 아미노산 247 내지 374)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 35의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 34의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 34의 아미노산 375 내지 537)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 35의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 34의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 34의 아미노산 538 내지 666)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 35의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 36의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 36의 아미노산 1 내지 57)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 37의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 36의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 36의 아미노산 58 내지 259)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 37의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 36의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 36의 아미노산 260 내지 351)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 37의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 36의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 36의 아미노산 352 내지 510)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 37의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 36의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 36의 아미노산 511 내지 673)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 37의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D1의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D1의 아미노산 1 내지 66)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D2의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D1의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D1의 아미노산 67 내지 277)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D2의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D1의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 D1의 아미노산 278 내지 347)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D2의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D1의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 D1의 아미노산 348 내지 513)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D2의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D1의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 D1의 아미노산 513 내지 680)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D2의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D3의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D3의 아미노산 1 내지 66)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D4의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D3의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D3의 아미노산 67 내지 277)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D4의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D3의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 D3의 아미노산 278 내지 347)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D4의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D3의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 D3의 아미노산 348 내지 513)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D4의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D3의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 D3의 아미노산 513 내지 680)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D4의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D5의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D5의 아미노산 1 내지 66)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D6의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D5의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D5의 아미노산 67 내지 277)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D6의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D5의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 D5의 아미노산 278 내지 347)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D6의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D5의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 D5의 아미노산 348 내지 513)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D6의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D5의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 D5의 아미노산 513 내지 680)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D6의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D7의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D7의 아미노산 1 내지 57)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D8의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D7의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D7의 아미노산 58 내지 259)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D8의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D7의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 D7의 아미노산 260 내지 351)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D8의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D7의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 D7의 아미노산 352 내지 510)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D8의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D7의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 D7의 아미노산 511 내지 673)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D8의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D9의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D9의 아미노산 1 내지 57)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D10의 Arg-풍부 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D9의 젤리-롤 영역 아미노산 서열(예를 들어, 표 D9의 아미노산 58 내지 259)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D10의 젤리-롤 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D9의 HVR 아미노산 서열(예를 들어, 표 D9의 아미노산 260 내지 351)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D10의 HVR 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D9의 N22 도메인 아미노산 서열(예를 들어, 표 D9의 아미노산 352 내지 510)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D10의 N22 도메인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D9의 CTD 아미노산 서열(예를 들어, 표 D9의 아미노산 511 내지 673)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 표 D10의 CTD 영역 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[표 20] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 1)
Figure pct00107
[표 21] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 1)
Figure pct00108
[표 22] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 2)
Figure pct00109
[표 23] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 2)
Figure pct00110
[표 24] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 3)
Figure pct00111
[표 25] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 3)
Figure pct00112
[표 26] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 4)
Figure pct00113
[표 27] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 4)
Figure pct00114
[표 28] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 5)
Figure pct00115
[표 29] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 5)
Figure pct00116
[표 30] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 6)
Figure pct00117
[표 31] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 6)
Figure pct00118
[표 32] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 7)
Figure pct00119
[표 33] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus ), 클레이드 7)
Figure pct00120
[표 34] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(베타토르크바이러스( Betatorquevirus ))
Figure pct00121
[표 35] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(베타토르크바이러스( Betatorquevirus ))
Figure pct00122
[표 36] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00123
[표 37] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00124
[표 D1] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00125
[표 D2] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00126
[표 D3] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00127
[표 D4] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(감마토르크바이러스( Gammatorquevirus ))
Figure pct00128
[표 D5] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus )) 클레이드 1
Figure pct00129
[표 D6] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus )) 클레이드 1
Figure pct00130
[표 D7] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus )) - 클레이드 3
Figure pct00131
[표 D8] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus )) - 클레이드 3
Figure pct00132
[표 D9] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus )) - 클레이드 7
Figure pct00133
[표 D10] 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스( Alphatorquevirus )) - 클레이드 7
Figure pct00134
컨센서스 ORF1 도메인 서열
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, ORF1 분자는 젤리-롤 도메인, N22 도메인, 및/또는 C-말단 도메인(CTD) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 37A 내지 37C 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) 젤리-롤 도메인 컨센서스 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, N22 도메인은 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 37A 내지 37C 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) N22 도메인 컨센서스 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CTD 도메인은 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 37A 내지 37C 중 어느 하나에 열거된 바와 같은) CTD 도메인 컨센서스 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 37A 내지 37C 중 어느 하나에 형식 "(Xa-b)"로 열거된 아미노산은 인접 아미노산의 연속물을 포함하며, 여기서, 연속물은 적어도 a개 및 최대 b개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 연속물에서 모든 아미노산은 동일하다. 다른 실시형태에서, 연속물은 적어도 2개(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개)의 상이한 아미노산을 포함한다.
[표 37A] 알파토르크바이러스 ORF1 도메인 공통 서열
Figure pct00135
[표 37B] 베타토르크바이러스 ORF1 도메인 공통 서열
Figure pct00136
[표 37C] 감마토르크바이러스 ORF1 도메인 공통 서열
Figure pct00137
일부 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 표 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, D2, D4, D6, D8, D10 또는 37A 내지 37C 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 젤리-롤 도메인 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, N22 도메인은 표 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, D2, D4, D6, D8, D10 또는 37A 내지 37C 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 N22 도메인 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CTD 도메인은 표 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, D2, D4, D6, D8, D10 또는 37A 내지 37C 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 CTD 도메인 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
ORF2 분자
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 ORF2 분자 및/또는 ORF2 분자를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일반적으로, ORF2 분자는 아넬로바이러스 ORF2 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF2 단백질)의 구조적 특징 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 아넬로바이러스 ORF2 단백질 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, ORF2 분자는 알파토르크바이러스, 베타토르크바이러스 또는 감마토르크바이러스 ORF2 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자(예를 들어, 알파토르크바이러스 ORF2 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 ORF2 분자)는 250개 이하의 아미노산(예를 들어, 약 150 내지 200개의 아미노산)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자(예를 들어, 베타토르크바이러스 ORF2 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 ORF2 분자)는 약 50 내지 150개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자(예를 들어, 감마토르크바이러스 ORF2 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 ORF2 분자)는 약 100 내지 200개의 아미노산(예를 들어, 약 100 내지 150개의 아미노산)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자는 나선-회전-나선 모티프(예를 들어, 회전 영역에 측접하는 2개의 알파 나선을 포함하는 나선-회전-나선 모티프)를 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자는 TTV 분리주 TA278 또는 TTV 분리주 SANBAN의 ORF2 단백질의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자는 단백질 포스파타제 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은) 야생형 ORF2 단백질에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경)를 포함한다.
보존된 ORF2 모티프
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, ORF2 분자)는 아미노산 서열 [W/F]X7HX3CX1CX5H(SEQ ID NO: 949)를 포함하며, 여기서, Xn은 임의의 N개의 아미노산의 인접 서열이다. 실시형태들에서, X7은 임의의 7개의 아미노산의 인접 서열을 나타낸다. 실시형태들에서, X3은 임의의 3개의 아미노산의 인접 서열을 나타낸다. 실시형태들에서, X1은 임의의 단일의 아미노산을 나타낸다. 실시형태들에서, X5는 임의의 5개의 아미노산의 인접 서열을 나타낸다. 일부 실시형태에서, [W/F]는 트립토판 또는 페닐알라닌 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, [W/F]X7HX3CX1CX5H(SEQ ID NO: 949)는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ORF2 분자의 N22 도메인 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 아미노산 서열 [W/F]X7HX3CX1CX5H(SEQ ID NO: 949)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF2 분자를 인코딩하는 핵산 서열)을 포함하며, 여기서, Xn은 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열이다.
유전 요소
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는다: 숙주 세포의 게놈과 실질적으로 비-통합성임, 에피솜 핵산임, 단일 가닥 DNA임, 환형임, 약 1 내지 10 kb임, 세포의 핵 내에 존재함, 내인성 단백질에 의해 결합될 수 있음, 이펙터, 예컨대 숙주 또는 표적 세포의 유전자, 활성 또는 기능을 표적화하는 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들어, RNA, iRNA, 마이크로RNA)를 생성함. 일 실시형태에서, 유전 요소는 실질적으로 비-통합성 DNA이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 패키징 신호, 예를 들어, 캡시드 단백질에 결합하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 패키징 또는 캡시드-결합 서열의 외측에서, 유전 요소는 야생형 아넬로바이러스 핵산 서열에 대하여 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 미만의 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로바이러스 핵산 서열에 대하여 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 패키징 또는 캡시드-결합 서열의 외측에서, 유전 요소는 아넬로바이러스 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 500 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 또는 100개 미만의 인접 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 실시형태에서, 유전 요소는 프로모터 서열, 치료적 이펙터 및 캡시드 결합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 환형, 단일 가닥 DNA이다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 기재된 바와 같은) 아넬로바이러스 핵산 서열 또는 그의 단편에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖거나, (예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나에 기재된 바와 같은) 아넬로바이러스 아미노산 서열 또는 그의 단편에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어, 페이로드), 예를 들어, 폴리펩티드 이펙터(예를 들어, 단백질) 또는 핵산 이펙터(예를 들어, 비-코딩 RNA, 예를 들어, miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA)를 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 20kb 미만(예를 들어, 약 19kb, 18kb, 17kb, 16kb, 15kb, 14kb, 13kb, 12kb, 11kb, 10kb, 9kb, 8kb, 7kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb 또는 그 미만)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 독립적으로 또는 부가적으로 1000b 초과(예를 들어, 적어도 약 1.1kb, 1.2kb, 1.3kb, 1.4kb, 1.5kb, 1.6kb, 1.7kb, 1.8kb, 1.9kb, 2kb, 2.1kb, 2.2kb, 2.3kb, 2.4kb, 2.5kb, 2.6kb, 2.7kb, 2.8kb, 2.9kb, 3kb, 3.1kb, 3.2kb, 3.3kb, 3.4kb, 3.5kb, 3.6kb, 3.7kb, 3.8kb, 3.9kb, 4kb, 4.1kb, 4.2kb, 4.3kb, 4.4kb, 4.5kb, 4.6kb, 4.7kb, 4.8kb, 4.9kb, 5kb 또는 그 초과)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2.5 내지 4.6, 2.8 내지 4.0, 3.0 내지 3.8 또는 3.2 내지 3.7 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 1.5 내지 2.0, 1.5 내지 2.5, 1.5 내지 3.0, 1.5 내지 3.5, 1.5 내지 3.8, 1.5 내지 3.9, 1.5 내지 4.0, 1.5 내지 4.5 또는 1.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2.0 내지 2.5, 2.0 내지 3.0, 2.0 내지 3.5, 2.0 내지 3.8, 2.0 내지 3.9, 2.0 내지 4.0, 2.0 내지 4.5 또는 2.0 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2.5 내지 3.0, 2.5 내지 3.5, 2.5 내지 3.8, 2.5 내지 3.9, 2.5 내지 4.0, 2.5 내지 4.5 또는 2.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 3.0 내지 5.0, 3.5 내지 5.0, 4.0 내지 5.0 또는 4.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 1.5 내지 2.0, 2.0 내지 2.5, 2.5 내지 3.0, 3.0 내지 3.5, 3.1 내지 3.6, 3.2 내지 3.7, 3.3 내지 3.8, 3.4 내지 3.9, 3.5 내지 4.0, 4.0 내지 4.5 또는 4.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에 기재된 특징, 예를 들어, 실질적으로 비-병원성인 단백질을 인코딩하는 서열, 단백질 결합 서열, 조절 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 서열, 하나 이상의 조절 서열, 복제 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 서열 및 기타 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 비-병원성인 단백질은 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, 또는 본원에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소를 (예를 들어, 시험관 내 환화에 의해 생성되는) 이중-가닥 환형 DNA로부터 생성하였다. 일부 실시형태에서, 유전 요소를 이중-가닥 환형 DNA로부터 회전환 복제에 의해 생성하였다. 실시형태들에서, 회전환 복제는 세포(예를 들어, 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포, 예를 들어, HEK293T 세포, A549 세포 또는 Jurkat 세포)에서 발생한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 세포에서 회전환 복제에 의해 지수적으로 복제될 수 있다. 실시형태들에서, 유전 요소는 세포에서 회전환 복제에 의해 선형적으로 복제될 수 있다. 실시형태들에서, 이중-가닥 환형 DNA 또는 유전 요소는 세포에서 회전환 복제에 의해 원래의 양의 적어도 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 518, 1024배 이상을 제공할 수 있다. 실시형태들에서, 이중-가닥 환형 DNA를 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 세포 내로 도입하였다.
일부 실시형태에서, 이중-가닥 환형 DNA 및/또는 유전 요소는 하나 이상의 박테리아 플라스미드 요소(예를 들어, 박테리아 복제 원점 또는 선택 가능한 마커, 예를 들어, 박테리아 내성 유전자)를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 환형 DNA 및/또는 유전 요소는 박테리아 플라스미드 백본을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명은 (i) 실질적으로 비-병원성인 외부 단백질, (ii) 유전 요소를 실질적으로 비-병원성인 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열 및 (iii) 조절 핵산을 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 유전 요소는 고유 바이러스 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 고유 아넬로바이러스 서열)에 대한 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
단백질 결합 서열
많은 바이러스에 의해 사용되는 전략은 바이러스 캡시드 단백질이 그의 게놈 내의 특정 단백질 결합 서열을 인식하는 것이다. 예를 들어, 비세그먼트화된 게놈을 갖는 바이러스, 예컨대 효모의 L-A 바이러스에서, 게놈의 5' 말단에 이차 구조(스템-루프) 및 특정 서열이 존재하며, 이는 둘 모두 바이러스 캡시드 단백질에 결합하는 데 사용된다. 그러나, 세그먼트화된 게놈을 갖는 바이러스, 예컨대 레오바이러스과, 오르쏘믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)(인플루엔자), 부니아바이러스(Bunyaviruse) 및 아레나바이러스(Arenaviruse)는 게놈 세그먼트의 각각을 패키징할 필요가 있다. 일부 바이러스는 세그먼트의 상보성 영역을 사용하여, 바이러스가 각각의 게놈 분자 중 하나를 포함시키는 것을 보조한다. 다른 바이러스는 상이한 세그먼트의 각각에 대하여 특이적인 결합 부위를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Curr Opin Struct Biol. 2010 Feb; 20(1): 114-120]; 및 문헌[Journal of Virology (2003), 77(24), 13036-13041]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 실질적으로 비-병원성인 단백질에 결합하는 단백질 결합 서열을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 단백질성 외부로의 유전 요소의 패키징을 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 실질적으로 비-병원성인 단백질의 아르기닌-풍부 영역에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 실시예 8에 기재된 바와 같은 단백질 결합 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 (예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은) 아넬로바이러스 서열의 5' UTR 보존된 도메인 또는 GC-풍부 도메인에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단백질 결합 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 A1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 165 내지 235)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 A1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3620 내지 3648)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 A3의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 175 내지 245)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 A5의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 138 내지 208)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 A7의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 174 내지 244)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 A7의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3720 내지 3742)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 A9의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 100 내지 171)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 A11의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 294 내지 364)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 A1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3844 내지 3895)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 177 내지 247)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3415 내지 3570)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 3의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 204 내지 273)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 3의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3302 내지 3541)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 5의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 5의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3632 내지 3753)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 7의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 238)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 7의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3768 내지 3878)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 9의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 9의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3302 내지 3541)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 11의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 174 내지 244)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 11의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3691 내지 3794)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 13의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 13의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3759 내지 3866)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 15의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 323 내지 393)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 15의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2868 내지 2929)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 17의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 117 내지 187)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 17의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3054 내지 3172)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 185 내지 255)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3141 내지 3264)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B2의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 185 내지 254)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B2의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3076 내지 3176)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B3의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 178 내지 248)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B3의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3555 내지 3696)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B4의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 176 내지 246)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B4의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3720 내지 3828)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B5의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 표 B5의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3716 내지 3815)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
5' UTR 영역
일부 실시형태에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38 및/또는 도 20에 나타낸 핵산 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 컨센서스 5' UTR 서열의 핵산 서열을 포함하며, X1, X2, X3, X4 및 X5는 각각 독립적으로, 임의의 뉴클레오티드이며, 예를 들어, X1 = G 또는 T이며, X2 = C 또는 A이며, X3 = G 또는 A이며, X4 = T 또는 C이며, X5 = A, C 또는 T이다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 컨센서스 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 예시적인 TTV 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-CT30F 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-HD23a 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-JA20 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-TJN02 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-tth8 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 컨센서스 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 1 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 2 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 3 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 4 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 5 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 6 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 7 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소는 표 A1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 165 내지 235)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 A3의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 175 내지 245)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 A5의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 138 내지 208)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 A7의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 174 내지 244)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 A9의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 100 내지 171)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 A11의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 294 내지 364)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소는 표 1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 177 내지 247)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 3의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 204 내지 273)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 5의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 7의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 238)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 9의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 11의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 174 내지 244)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 13의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 15의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 323 내지 393)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 17의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 117 내지 187)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소는 표 B1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 185 내지 255)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 B2의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 185 내지 254)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 B3의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 178 내지 248)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 B4의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 176 내지 246)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 B5의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 170 내지 240)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[표 38] 아넬로바이러스로부터의 예시적인 5’ UTR 서열
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
GC-풍부 영역
일부 실시형태에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39 및/또는 도 20 및 32 중 어느 하나에 나타낸 핵산 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 GC-풍부 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 바와 같은 36-뉴클레오티드 GC-풍부 서열(예를 들어, 36-뉴클레오티드 컨센서스 GC-풍부 영역 서열 1, 36-뉴클레오티드 컨센서스 GC-풍부 영역 서열 2, TTV 클레이드 1 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 분리주 GH1 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 sle1932 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 4 ctdc002 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 5 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 6 36-뉴클레오티드 영역 또는 TTV 클레이드 7 36-뉴클레오티드 영역)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 바와 같은 36-뉴클레오티드 GC-풍부 서열(예를 들어, 36-뉴클레오티드 컨센서스 GC-풍부 영역 서열 1, 36-뉴클레오티드 컨센서스 GC-풍부 영역 서열 2, TTV 클레이드 1 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 분리주 GH1 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 sle1932 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 4 ctdc002 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 5 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 6 36-뉴클레오티드 영역 또는 TTV 클레이드 7 36-뉴클레오티드 영역)의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 예를 들어, 표 39에 열거된 바와 같은, 예를 들어, TTV-CT30F, TTV-P13-1, TTV-tth8, TTV-HD20a, TTV-16, TTV-TJN02 또는 TTV-HD16d로부터 선택되는 알파토르크바이러스 GC-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 예를 들어, 표 39에 열거된 바와 같은, 예를 들어, TTV-CT30F, TTV-P13-1, TTV-tth8, TTV-HD20a, TTV-16, TTV-TJN02 또는 TTV-HD16d로부터 선택되는 알파토르크바이러스 GC-풍부 영역 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 104, 105, 108, 110, 111, 115, 120, 122, 130, 140, 145, 150, 155 또는 156개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 36-뉴클레오티드 GC-풍부 서열은 하기로부터 선택된다:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172).
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 핵산 서열 CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160)를 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 컨센서스 GC-풍부 서열의 핵산 서열을 포함하며, X1, X4, X5, X6, X7, X12, X13, X14, X15, X20, X21, X22, X26, X29, X30 및 X33은 각각 독립적으로 임의의 뉴클레오티드이며, X2, X3, X8, X9, X10, X11, X16, X17, X18, X19, X23, X24, X25, X27, X28, X31, X32 및 X34는 각각 독립적으로 부재이거나, 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, X1 내지 X34 중 하나 이상(예를 들어, 이들 전부)는 각각 독립적으로 표 39에 특정된 뉴클레오티드(또는 부재)이다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 예시적인 TTV GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 3)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-CT30F GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3, 단편 4, 단편 5, 단편 6, 단편 7, 단편 8 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 7)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-HD23a GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3, 단편 4, 단편 5, 단편 6 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 6)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-JA20 GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 및 2)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-TJN02 GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3, 단편 4, 단편 5, 단편 6, 단편 7, 단편 8 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 8)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-tth8 GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3, 단편 4, 단편 5, 단편 6, 단편 7, 단편 8, 단편 9 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 6)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 단편 7에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 단편 8에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 단편 9에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[표 39] 아넬로바이러스로부터의 예시적인 GC-풍부 서열
Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
실시형태들에서, 유전 요소는 표 A1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3620 내지 3648)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 A7의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3720 내지 3742)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 A1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 A11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3844 내지 3895)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소는 표 1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3415 내지 3570)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 3의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3302 내지 3541)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 5의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3632 내지 3753)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 7의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 7의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3768 내지 3878)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 9의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 9의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3302 내지 3541)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 11의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3691 내지 3794)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 13의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 13의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3759 내지 3866)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 15의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 15의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2868 내지 2929)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 17의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 17의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3054 내지 3172)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소는 표 B1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3141 내지 3264)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 B2의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B2의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3076 내지 3176)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 B3의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B3의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3555 내지 3696)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 B4의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B4의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3720 내지 3828)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 표 B5의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 B5의 핵산 서열의 뉴클레오티드 3716 내지 3815)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
이펙터
일부 실시형태에서, 유전 요소는 기능적 이펙터, 예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어, 치료적 폴리펩티드 또는 핵산, 예를 들어, 세포독성 또는 세포용해 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기능적 핵산은 비-코딩 RNA이다. 일부 실시형태에서, 기능적 핵산은 코딩 RNA이다. 이펙터는 생물학적 활성을 조절할 수 있으며, 예를 들어, 효소 활성, 유전자 발현, 세포 신호전달 및 세포 또는 기관 기능을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 이펙터 활성은 또한 조절 단백질에 결합하여, 조절제의 활성, 예컨대 전사 또는 번역을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 이펙터 활성은 또한, 활성화제 또는 저해제 기능을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터는 효소에서 증가된 기질 친화성을 촉발시킴으로써 효소 활성을 유도할 수 있으며, 예를 들어, 프룩토스 2,6-비스포스페이트는 포스포프룩토키나제 1을 활성화시키고, 인슐린에 반응하여 당분해 속도를 증가시킨다. 또 다른 예에서, 이펙터는 수용체로의 기질 결합을 저해하고, 그의 활성화를 저해할 수 있으며, 예를 들어, 날트렉손(naltrexone) 및 날록손(naloxone)은 활성화시키지 않고 오피오이드 수용체에 결합하며, 오피오이드에 결합하는 수용체의 능력을 차단한다. 이펙터 활성은 또한, 단백질 안정성/분해 및/또는 전사물 안정성/분해를 조절하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 분해를 위해 폴리펩티드 보조-인자, 유비퀴틴에 의해 단백질 상에 표적화되어, 분해를 위해 그들을 표시할 수 있다. 또 다른 예에서, 이펙터는 효소의 활성 부위를 차단함으로써 효소 활성을 저해하며, 예를 들어, 메토트렉세이트는 천연 기질보다 1000배 더 단단하게 다이하이드로폴레이트 환원효소에 결합하고, 뉴클레오티드 염기 합성을 저해하는, 효소 다이하이드로폴레이트 환원효소에 대한 보조효소인 테트라하이드로폴레이트의 구조적 유사체이다.
일부 실시형태에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 유전 요소의 부분이며, 예를 들어, 그것은 실시예 10, 12 또는 22에 기재된 바와 같이 삽입 부위에서 삽입될 수 있다. 실시형태들에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 비코딩 영역, 예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 3'에, 그리고 유전 요소의 GC-풍부 영역의 5'에 배치된 비코딩 영역에서, TATA 박스의 상류의 5' 비코딩 영역 내에서, 5' UTR 내에서, 폴리-A 신호의 하류 또는 GC-풍부 영역의 상류의 3' 비코딩 영역에서 유전 요소 내로 삽입된다. 실시형태들에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 TTV-tth8 플라스미드의 뉴클레오티드 약 3588에서, 또는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 TTMV-LY2 플라스미드의 뉴클레오티드 약 2843에서 유전 요소 내로 삽입된다. 실시형태들에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 TTV-tth8 플라스미드의 뉴클레오티드 336 내지 3015에 또는 그 내에, 또는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 TTV-LY2 플라스미드의 뉴클레오티드 242 내지 2812에 또는 그 내에 유전 요소 내로 삽입된다. 일부 실시형태에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ORF, 예를 들어, 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5 또는 1 내지 18 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 및/또는 ORF2t/3)의 부분 또는 전부를 대체한다.
일부 실시형태에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 100 내지 2000개, 100 내지 1000개, 100 내지 500개, 100 내지 200개, 200 내지 2000개, 200 내지 1000개, 200 내지 500개, 500 내지 1000, 500 내지 2000 또는 1000 내지 2000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 예를 들어, 실시예 11에 기재된 바와 같이 핵산 또는 단백질 페이로드이다.
조절 핵산
일부 실시형태에서, 이펙터는 조절 핵산이다. 조절 핵산은 내인성 유전자 및/또는 외인성 유전자의 발현을 변경시킨다. 일 실시형태에서, 조절 핵산은 숙주 유전자를 표적화한다. 조절 핵산은 내인성 유전자(예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA)에 혼성화되는 핵산, 외인성 핵산, 예컨대 바이러스 DNA 또는 RNA에 혼성화하는 핵산, RNA에 혼성화하는 핵산, 유전자 전사를 간섭하는 핵산, RNA 번역을 간섭하는 핵산, RNA를 안정화시키거나, 예컨대 분해에 대한 표적화를 통하여 RNA를 불안정화시키는 핵산, 및 DNA 또는 RNA 결합 인자를 조절하는 핵산을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 실시형태들에서, 조절 핵산은 miRNA를 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 조절 핵산은 전형적으로 5 내지 500개의 염기쌍(특정 RNA 구조에 따라, 예를 들어, miRNA 5 내지 30 bp, lncRNA 200 내지 500 bp)을 함유하는 RNA 또는 RNA-유사 구조를 포함하며, 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열 또는 세포 내의 발현된 표적 유전자를 인코딩하는 서열과 동일하거나(또는 상보성이거나) 거의 동일한(또는 실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절 핵산은 핵산 서열, 예를 들어, 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 표적화 모이어티는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. gRNA 짧은 합성 RNA는 불완전한 이펙터 모이어티로의 결합에 필요한 "스캐폴드" 서열 및 게놈 표적에 대한 사용자-정의된 약 20개 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성될 수 있다. 실시에서, 가이드 RNA 서열은 일반적으로 17 내지 24개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖도록 설계되고 표적화된 핵산 서열에 대하여 상보성이다. 커스텀 gRNA 생성자 및 알고리즘은 효율적인 가이드 RNA의 설계에 사용하기 위하여 상업적으로 이용 가능하다. 유전자 편집은 또한, 자연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하고 tracrRNA(뉴클레아제에 결합) 및 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집에 대해 표적화된 서열로 가이드함) 둘 모두를 함유하는 엔지니어링된(합성) 단일 RNA 분자인, 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA")를 사용하여 달성되었다. 화학적으로 변형된 sgRNA는 또한, 게놈 편집에서 효율적인 것으로 입증되었으며; 예를 들어, 문헌[Hendel et al. (2015) Nature Biotechnol., 985 - 991]을 참조한다.
조절 핵산은 특정 DNA 서열(예를 들어, 프로모터, 유전자의 인핸서, 침묵자 또는 억제자에 인접하거나 그 내의 서열)을 인식하는 gRNA를 포함한다.
특정 조절 핵산은 RNA 간섭(RNAi)의 생물학적 과정을 통하여 유전자 발현을 저해할 수 있다. RNAi 분자는 전형적으로 15 내지 50개의 염기쌍(예컨대 약 18 내지 25개의 염기쌍)을 함유하고, 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열과 동일하거나(상보성이거나) 또는 거의 동일한(실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 갖는 RNA 또는 RNA-유사 구조를 포함한다. RNAi 분자는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 메로듀플렉스(meroduplex) 및 다이서(dicer) 기질(미국 특허 제8,084,599호, 제8,349,809호 및 제8,513,207호)을 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
긴 비-코딩 RNA(lncRNA)는 100개 초과의 뉴클레오티드의 비-단백질 코딩 전사물로서 정의된다. 이러한 다소 임의의 제한은 lncRNA를 소형 조절 RNA, 예컨대 마이크로RNA(miRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA) 및 다른 짧은 RNA로부터 구별한다. 일반적으로, 대다수(약 78%)의 lncRNA는 조직-특이적인 것으로 특성화된다. 근처의 단백질-코딩 유전자에 대하여 반대 방향으로 전사되는(포유동물 게놈 내에 총 lncRNA의 유의미한 비율 약 20%를 포함하는) 분지 lncRNA는 아마도 근처의 유전자의 전사를 조절할 수 있다.
유전 요소는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA)의 전부 또는 그의 단편에 실질적으로 상보성이거나, 완전히 상보성인 서열을 갖는 조절 핵산을 인코딩할 수 있다. 조절 핵산은 인트론과 엑손 사이의 경계에서의 서열에 상보성이어서, 특정 유전자의 새로 생성된 핵 RNA 전사물이 전사를 위해 mRNA로 성숙되는 것을 방지할 수 있다. 특정 유전자에 상보성인 조절 핵산은 당해 유전자에 대한 mRNA와 혼성화하고, 그의 번역을 방지할 수 있다. 안티센스 조절 핵산은 DNA, RNA 또는 그의 유도체 또는 혼성물일 수 있다.
관심 전사물에 혼성화하는 조절 핵산의 길이는 5 내지 30개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 30개의 뉴클레오티드 또는 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사물에 대한 조절 핵산의 동일성의 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%여야 한다.
유전 요소는 조절 핵산, 예를 들어, 표적 유전자의 약 5 내지 약 25개의 인접 뉴클레오티드와 동일한 마이크로 RNA(miRNA) 분자를 인코딩할 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA 서열은 mRNA를 표적화하며, 다이뉴클레오티드 AA로 시작하며, 약 30 내지 70%(약 30 내지 60%, 약 40 내지 60% 또는 약 45% 내지 55%)의 GC-함량을 포함하며, 예를 들어, 표준 BLAST 검색에 의해 결정시, 그것이 도입될 포유동물의 게놈 내의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열에 대하여 높은 동일성 백분율을 갖지 않는다.
일부 실시형태에서, 조절 핵산은 적어도 하나의 miRNA, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개 이상이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성의 miRNA를 인코딩하는 서열 또는 본원에, 예를 들어, 표 40에 기재된 서열에 상보성인 서열을 포함한다.
[표 40] 조절 핵산의 예, 예를 들어, miRNA.
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Figure pct00149
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siRNA 및 shRNA는 내인성 마이크로RNA(miRNA) 유전자의 가공 경로 내의 중간체와 유사하다(문헌[Bartel, Cell 116:281-297, 2004]). 일부 실시형태에서, siRNA는 miRNA로서 기능할 수 있으며, 그 역도 그러하다(문헌[Zeng et al., Mol Cell 9:1327-1333, 2002]; 문헌[Doench et al., Genes Dev 17:438-442, 2003]). siRNA와 같이 마이크로RNA는 RISC를 사용하여, 표적 유전자를 하향조절하지만, siRNA와 달리, 대부분의 동물 miRNA는 mRNA를 절단하지 않는다. 대신에, miRNA는 번역 억제 또는 폴리A 제거 및 mRNA 분해를 통해 단백질 출력물을 감소시킨다(문헌[Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4034-4039, 2006]). 공지된 miRNA 결합 부위는 mRNA 3' UTR 내에 존재하며; miRNA는 miRNA의 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 2 내지 8에 대하여 거의 완벽하게 상보성을 갖는 부위를 표적화하는 것으로 보인다(문헌[Rajewsky, Nat Genet 38 Suppl:S8-13, 2006]; 문헌[Lim et al., Nature 433:769-773, 2005]). 이러한 영역은 씨드 영역으로 공지되어 있다. siRNA 및 miRNA가 상호 교환 가능하기 때문에, 외인성 siRNA는 siRNA에 대하여 씨드 상보성을 갖는 mRNA를 하향조절한다(문헌[Birmingham et al., Nat Methods 3:199-204, 2006]). 3' UTR 내의 다수의 표적 부위는 더 강한 하향조절을 제공한다(문헌[Doench et al., Genes Dev 17:438-442, 2003]).
공지된 miRNA 서열의 목록은 특히 Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 및 European Molecule Biology Laboratory와 같은 연구 기관에 의해 유지되는 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 또한, 알려진 효과적인 siRNA 서열 및 동족(cognate) 결합 부위는 관련 문헌에서 잘 나타나 있다. RNAi 분자는 해당 분야에 알려진 기술에 의해 쉽게 설계되고 생성된다. 또한, 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 찾는 기회를 증가시키는 컴퓨터 기반 도구가 존재한다(문헌[Lagana et al., Methods Mol. Bio., 2015, 1269:393-412]).
조절 핵산은 유전자에 의해 인코딩되는 RNA의 발현을 조절할 수 있다. 다수의 유전자가 서로 어느 정도의 서열 상동성을 공유할 수 있기 때문에, 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 충분한 서열 상동성을 갖는 유전자의 부류를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 상이한 유전자 표적 간에 공유되는 또는 특정 유전자 표적에 특유한 서열에 상보성을 갖는 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 몇몇의 유전자 간에 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존된 영역을 표적화하여, 그에 의해, 유전자 과 내의 몇몇의 유전자(예를 들어, 상이한 유전자 아이소폼, 슬라이스 변이체, 돌연변이 유전자 등)를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 단일 유전자의 특정 RNA 서열에 특유한 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 조절 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본원의 다른 곳에 기재된 gRNA는 유전자 편집을 위한 CRISPR 시스템의 부분으로서 사용된다. 유전자 편집의 목적을 위하여, 아넬로좀은 요망되는 표적 DNA 서열에 상응하는 하나의 또는 다수의 가이드 RNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Cong et al. (2013) Science, 339:819-823]; 문헌[Ran et al. (2013) Nature Protocols, 8:2281 - 2308]을 참조한다. 적어도 약 16 또는 17개 뉴클레오티드의 gRNA 서열은 일반적으로 Cas9-매개된 DNA 절단이 발생하게 하며; Cpf1에 있어서, 적어도 약 16개 뉴클레오티드의 gRNA 서열이 검출 가능한 DNA 절단을 달성하는 데 필요하다.
치료적 펩티드 또는 폴리펩티드
일부 실시형태에서, 유전 요소는 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단백질, 예를 들어, 치료적 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 치료적 단백질의 일부 예는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 전사 인자, 수용체(예를 들어, 막 수용체), 리간드, 막 수송체, 분비된 단백질, 펩티드, 운반 단백질, 구조 단백질, 뉴클레아제 또는 그의 성분을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 펩티드, 예를 들어, 치료적 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 펩티드는 약 5 내지 약 500개 아미노산, 약 15 내지 약 400개 아미노산, 약 20 내지 약 325개 아미노산, 약 25 내지 약 250개 아미노산, 약 50 내지 약 200개 아미노산 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 갖는다. 펩티드의 일부 예는 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드 치료제, 천연적인 생물활성 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항-미생물 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 및 분해 또는 자가-파괴 펩티드들을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 본 발명에 유용한 펩티드는 또한, 항원-결합 펩티드, 예를 들어, 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디(예를 들어, 문헌[Steeland et al. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113] 참조)를 포함한다. 이러한 항원 결합 펩티드는 시토졸 항원, 핵 항원 또는 소기관-내 항원에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 작은 펩티드, 펩티드모방체(예를 들어, 펩토이드(peptoid)), 아미노산 및 아미노산 유사체를 인코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 치료제는 일반적으로 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 2,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 다른 약제학적으로 허용되는 형태를 갖는다. 이러한 치료제는 신경전달물질, 호르몬, 약물, 독소, 바이러스 또는 미생물 입자, 합성 분자 및 그의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로좀은 특정 위치, 조직 또는 세포를 표적화할 수 있는 리간드에 연결된 폴리펩티드를 포함한다.
조절 서열
일부 실시형태에서, 유전 요소는 이펙터를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 발현 생성물을 인코딩하는 DNA 서열에 인접하여 위치한 DNA 서열을 포함한다. 프로모터는 인접 DNA 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않는 경우 발현되는 생성물의 양에 비하여 DNA 서열로부터 발현되는 생성물의 양을 증가시킨다. 하나의 유기체로부터의 프로모터를 사용하여 또 다른 유기체로부터 기원한 DNA 서열로부터의 생성물 발현을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 척추동물 프로모터는 척추동물에서 해파리 GFP의 발현을 위해 사용될 수 있다. 또한, 하나의 프로모터 요소는 텐덤으로 부착된 다수의 DNA 서열에 대하여 발현되는 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 하나의 프로모터 요소는 하나 이상의 생성물의 발현을 향상시킬 수 있다. 다수의 프로모터 요소는 당업자에게 널리 알려져 있다.
일 실시형태에서, 높은 수준의 구성적 발현이 요망된다. 이러한 프로모터의 예는 제한 없이, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터/인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 조기 프로모터/인핸서(예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 유도성 프로모터가 요망될 수 있다. 유도성 프로모터는 제한 없이, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088호); 테트라사이클린-억제성 시스템(문헌[Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]); 테트라사이클린-유도성 시스템(문헌[Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)]; 또한, 문헌[Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)] 참조); RU486-유도성 시스템(문헌[Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)] 및 문헌[Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]); 및 라파마이신-유도성 시스템(문헌[Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]; 문헌[Rivera et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)])을 포함하여, 외인적으로 공급되는 화합물에 의해 시스로 또는 트랜스로 조절되는 것들이다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성 단계에 의해 또는 오직 복제하는 세포에서만 조절되는 것들이다.
일부 실시형태에서, 관심 유전자 또는 핵산 서열에 대한 고유 프로모터가 사용된다. 유전자 또는 핵산 서열의 발현이 고유 발현을 모방하는 것이 요망되는 경우에 고유 프로모터가 사용될 수 있다. 유전자 또는 다른 핵산 서열의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에, 고유 프로모터가 사용될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 다른 고유 발현 제어 요소, 예컨대, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작(Kozak) 컨센서스 서열도 또한 고유 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자를 포함한다. 예를 들어, 골격근에서의 발현이 요망되는 경우, 근육에서 활성인 프로모터가 사용될 수 있다. 이들은 골격 α-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제를 인코딩하는 유전자로부터의 프로모터 및 자연-발생 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 합성 근육 프로모터를 포함한다. 문헌[Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)]을 참조한다. 특히 간 알부민, 문헌[Miyatake et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997)]; B형 간염 바이러스 코어 프로모터, 문헌[Sandig et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996)]; 알파-태아단백질(AFP), 문헌[Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)], 골(오스테오칼신(osteocalcin), 문헌[Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)]; 골 시알로단백질(sialoprotein), 문헌[Chen et al., J. Bone Miner. Res. 11:654-64 (1996)]), 림프구(CD2, 문헌[Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)]; 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 a 쇄), 뉴런(뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 문헌[Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)]; 신경필라멘트 경쇄 유전자, 문헌[Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)]; 뉴런-특이적 vgf 유전자, 문헌[Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)]을 위한 조직-특이적인 프로모터의 예가 알려져 있다.
유전 요소는 인핸서, 예를 들어, 유전자를 인코딩하는 DNA 서열에 인접하여 위치한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하거나, 코딩 DNA 서열(예를 들어, 생성물 또는 생성물들로 전사 또는 번역되는 DNA 서열)의 하류에 또는 그 내에 위치할 수 있다. 그러므로, 인핸서 요소는 생성물을 인코딩하는 DNA 서열의 100개 염기쌍, 200개 염기쌍 또는 300개 이상의 염기쌍 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 DNA 서열로부터 발현되는 재조합 생성물의 양을 프로모터 요소에 의해 제공되는 증가된 발현을 초과하여 증가시킬 수 있다. 다중의 인핸서 요소는 당업자에게 용이하게 이용 가능하다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에 기재된 발현 생성물을 인코딩하는 서열을 플랭킹하는 하나 이상의 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에 기재된 발현 생성물을 인코딩하는 서열을 플랭킹하는 하나 이상의 긴 말단 반복부(LTR)를 포함한다. 사용될 수 있는 프로모터 서열의 예는 시미안 바이러스 40(SV40) 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스테인-바 바이러스 즉시 조기 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
복제 단백질
일부 실시형태에서, 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀의 유전 요소는 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 회전환 복제 방법에 의해 복제할 수 있으며, 예를 들어, 선도 가닥 및 지연 가닥의 합성은 분리된다. 이러한 실시형태에서, 아넬로좀은 3가지의 추가의 요소를 포함한다: i) 개시 단백질을 인코딩하는 유전자, ii) 이중 가닥 원점, 및 iii) 단일 가닥 원점. 복제 단백질을 포함하는 회전환 복제(RCR) 단백질 복합체는 선도 가닥에 결합하며, 복제 원점을 불안정화시킨다. RCR 복합체는 게놈을 절단하여, 유리 3'OH 말단을 생성한다. 세포 DNA 중합효소는 유리 3'OH 말단으로부터 바이러스 DNA 복제를 개시한다. 게놈이 복제된 후에, RCR 복합체는 루프를 공유적으로 폐쇄시킨다. 이는 양성 환형 단일-가닥 모 DNA 분자 및 음성 모체 가닥 및 새로 합성된 양성 가닥으로 구성된 환형 이중-가닥 DNA 분자의 방출을 야기한다. 단일-가닥 DNA 분자는 캡시드화되거나 제2차의 복제에 수반될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Virology Journal 2009, 6:60 doi:10.1186/1743-422X-6-60]을 참조한다.
유전 요소는 중합효소, 예를 들어, RNA 중합효소 또는 DNA 중합효소를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
기타 서열
일부 실시형태에서, 유전 요소는 생성물(예를 들어, 리보자임, 단백질을 인코딩하는 치료적 mRNA, 외인성 유전자)을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 아넬로좀의 종 및/또는 조직 및/또는 세포 향성(예를 들어, 캡시드 단백질 서열), 감염성(예를 들어, 캡시드 단백질 서열), 면역억제/활성화(예를 들어, 조절 핵산), 바이러스 게놈 결합 및/또는 패키징, 면역 회피(비-면역원성 및/또는 관용), 약동학, 엔도시토시스 및/또는 세포 부착, 핵 유입, 세포내 조절 및 국소화, 엑소시토시스 조절, 증식 및 숙주 또는 숙주 세포에서의 아넬로좀의 핵산 보호에 영향을 미치는 하나 이상의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA, RNA 또는 인공 핵산을 포함하는 다른 서열을 포함할 수 있다. 다른 서열은 게놈 DNA, cDNA, 또는 tRNA, mRNA, rRNA, miRNA, gRNA, siRNA 또는 다른 RNAi 분자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 유전 요소는 조절 핵산과 동일한 유전자 발현 생성물의 상이한 유전자좌를 표적화하기 위하여 siRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 요소는 조절 핵산과 상이한 유전자 발현 생성물을 표적화하기 위하여 siRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 하기의 서열 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 하나 이상의 miRNA를 인코딩하는 서열, 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열, 외인성 유전자를 인코딩하는 서열, 치료제를 인코딩하는 서열, 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 내인성 유전자를 표적화하는 하나 이상의 조절 서열(siRNA, lncRNA, shRNA)을 인코딩하는 서열, 및 치료적 mRNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열.
다른 서열은 약 2 내지 약 5000개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 250개의 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 350개의 뉴클레오티드, 약 300 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 1000 내지 약 2000개의 뉴클레오티드, 약 2000 내지 약 3000개의 뉴클레오티드, 약 3000 내지 약 4000개의 뉴클레오티드, 약 4000 내지 약 5000개의 뉴클레오티드 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다.
인코딩된 유전자
예를 들어, 유전 요소는 신호전달 생화학 경로와 연관된 유전자, 예를 들어, 신호전달 생화학 경로-연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예에는 질병 연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. "질병-연관" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 비 질병 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여, 질병-이환된 조직으로부터 유래된 세포에서 전사 또는 번역 생성물을 비정상적인 수준 또는 비정상적인 형태로 제공하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며; 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며, 여기서, 변경된 발현은 질병의 발생 및/또는 진행과 상호연관된다. 질병-연관 유전자는 또한, 질병의 병인의 직접적인 원인이 되거나, 질병의 병인을 담당하는 유전자(들)와 연관 불균형인 돌연변이(들) 또는 유전적 변이를 지니는 유전자를 지칭한다.
질병-연관 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 맥쿠식-나탄스(McKusick-Nathans) 유전 의학 기관, 존스 홉킨스 대학(미국 메릴랜드주 볼티모어) 및 국립 생명과학 정보 센터, 국립 의학 도서관(미국 메릴랜드주 베데스다)로부터 이용 가능하다. 질병-연관 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 본원에 그들 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제8,697,359호의 표 A 및 B에 열거되어 있다. 질병 특이적 정보는 맥쿠식-나탄스 유전 의학 기관, 존스 홉킨스 대학(미국 메릴랜드주 볼티모어) 및 국립 생명과학 정보 센터, 국립 의학 도서관(미국 메릴랜드주 베데스다)로부터 이용 가능하다. 신호전달 생화학 경로-연관 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 본원에 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제8,697,359호의 표 A 내지 C에 열거되어 있다.
또한, 유전 요소는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 표적화 모이어티를 인코딩할 수 있다. 이는 예를 들어, 당, 당지질 또는 단백질, 예컨대 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 표적화 모이어티의 추가의 생성 방법을 안다.
바이러스 서열
일부 실시형태에서, 유전 요소는 적어도 하나의 바이러스 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열은 단일 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어, 아넬로바이러스, 비드나바이러스, 써코바이러스, 제미니바이러스, 게노모바이러스, 이노바이러스, 마이크로바이러스, 나노바이러스, 파보바이러스 및 스피라바이러스로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 서열은 이중 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 암풀라바이러스, 아스코바이러스, 아스파바이러스, 배큘로바이러스, 푸셀로바이러스, 글로불로바이러스, 구타바이러스, 하이트로사바이러스, 헤르페스바이러스, 이리도바이러스, 리포트릭스바이러스, 니마바이러스 및 폭스바이러스로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 서열은 RNA 바이러스, 예를 들어, 알파바이러스, 푸로바이러스, 간염 바이러스, 호르데이바이러스, 토바모바이러스, 토브라바이러스, 트리코르나바이러스, 루비바이러스, 비르나바이러스, 시스토바이러스, 파르티티바이러스 및 레오바이러스로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 비-병원성 바이러스, 예를 들어, 상리공생 바이러스, 예를 들어, 편리공생 바이러스, 예를 들어, 고유 바이러스, 예를 들어, 아넬로바이러스로부터의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 명명법의 최근의 변화는 인간 세포를 감염시킬 수 있는 3가지 아넬로바이러스를 알파토르크바이러스(TT), 베타토르크바이러스(TTM) 및 감마토르크바이러스(TTMD) 속의 아넬로바이러스과의 바이러스로 분류하였다. 현재까지, 아넬로바이러스는 임의의 인간 질병과 연관된 바 없다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 토르크 테노 바이러스(TT), 환형 음성-센스 게놈을 갖는 비-외피, 단일-가닥 DNA 바이러스에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 SEN 바이러스, 센티넬(Sentinel) 바이러스, TTV-유사 미니 바이러스 및 TT 바이러스에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. TT 바이러스 유전형 6, TT 바이러스 군, TTV-유사 바이러스 DXL1 및 TTV-유사 바이러스 DXL2를 포함하는 상이한 유형의 TT 바이러스가 기재된 바 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 더 작은 바이러스, 토르크 테노-유사 미니 바이러스(TTM) 또는 토르크 테노-유사 미디 바이러스(TTMD)로 지칭되는 TTV와 TTMV 사이의 게놈 크기를 갖는 제3 바이러스에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에, 예를 들어, 표 19에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 비-병원성 바이러스로부터의 하나 이상의 서열 또는 서열의 단편을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에, 예를 들어, 표 41에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 실질적으로 비-병원성인 바이러스로부터의 하나 이상의 서열 또는 서열의 단편을 포함할 수 있다.
[표 41] 아넬로바이러스 및 그들의 서열의 예. 수탁 번호 및 관련 서열 정보는 2018년 12월 11일자 언급된 바와 같이 www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ 에서 수득될 수 있다.
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일부 실시형태에서, 유전 요소는 하나 이상의 비-아넬로바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 백시니아 바이러스, SV40, 파필로마 바이러스, RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티 바이러스, 단일-가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 간염 바이러스, 또는 이중-가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 로타바이러스로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레트로바이러스가 결함이 있기 때문에, 감염성 입자를 생성하도록 지원이 제공될 수 있다. 이러한 지원은 예를 들어, LTR 내의 조절 서열의 제어 하에 레트로바이러스의 구조적 유전자의 전부를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 헬퍼 세포주를 사용함으로써 제공될 수 있다. 본원에 기재된 아넬로좀을 복제하는 데 적합한 세포주는 해당 분야에 공지된 세포주, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있는 A549 세포를 포함한다. 상기 유전 요소는 선택 가능한 마커를 인코딩하는 유전자를 추가로 함유하여, 요망되는 유전 요소가 확인되게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 서열이 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하게 유지되거나, 또는 다르게 본 발명을 실시하는 데 유용하다면, 인코딩된 폴리펩티드에 아미노산 차이를 초래하는 비-침묵 돌연변이, 예를 들어, 염기 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 이와 관련하여, 일반적으로 전체 단백질 기능을 불활성화시키지 않는 것으로 인식되는 특정 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다: 예컨대 양으로 하전된 아미노산(및 그의 역)에 관하여, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 음으로 하전된 아미노산(및 그의 역)에 관하여, 아스파르트산 및 글루탐산; 및 특정 군의 중성으로 하전된 아미노산(및 모든 경우에, 또한 그의 역)에 관하여, (1) 알라닌 및 세린, (2) 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘, (3) 시스테인 및 세린, (4) 글리신 및 프롤린, (5) 이소류신, 류신 및 발린, (6) 메티오닌, 류신 및 이소류신, (7) 페닐알라닌, 메티오닌, 류신 및 티로신, (8) 세린 및 트레오닌, (9) 트립토판 및 티로신, (10) 및 예를 들어, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌. 아미노산은 물리적 특성 및 이차 및 삼차 단백질 구조에 대한 기여에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산의 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로의 치환으로서 해당 분야에 인식된다.
동일한 또는 특정 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 동일성(예를 들어, 비교 윈도우 또는 표기된 영역에 걸쳐 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬되는 경우, 특정 영역에 걸쳐 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성)은 하기 기재된 디폴트 파라미터와 함께 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 수동의 정렬 및 육안의 검사(예를 들어, NCBI 웹 사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 등 참조)에 의해 측정될 수 있다. 동일성은 또한 시험 서열의 상보물을 지칭할 수 있거나 이에 적용될 수 있다. 동일성은 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열 및 치환을 갖는 서열을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 알고리즘은 갭 등을 설명한다. 동일성은 적어도 약 10개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 15개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 20개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 30개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 35개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 40개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 45개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 50개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이 이상인 영역에 걸쳐 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에 기재된, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 41 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 75% 뉴클레오티드 서열 동일성, 적어도 약 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 유전 암호가 축퇴성이기 때문에, 상동성 뉴클레오티드 서열은 임의의 수의 침묵 염기 변경, 즉, 그럼에도 불구하고 동일한 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
유전자 편집 성분
아넬로좀의 유전 요소는 유전자 편집 시스템의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 유전자 편집 시스템은 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR) 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성화제-유사 이펙터-기반의 뉴클레아제(TALEN)를 포함한다. ZFN, TALEN 및 CRISPR-기반의 방법은 예를 들어, 문헌[Gaj et al. Trends Biotechnol. 31.7(2013):397-405]에 기재되어 있으며; 유전자 편집의 CRISPR 방법은 예를 들어, 문헌[Guan et al., Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: Pre-clinical progress in animal model. DNA Repair 2016 Oct;46:1-8. doi: 10.1016/j.dnarep.2016.07.004]; 문헌[Zheng et al., Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques, Vol. 57, No. 3, September 2014, pp. 115-124]에 기재되어 있다.
CRISPR 시스템은 원래 박테리아 및 조류에서 관찰되는 적응 방어 시스템이다. CRISPR 시스템은 CRISPR-회합 또는 "Cas" 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)로 명명되는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 사용하여, 외래 DNA를 절단한다. 전형적인 CRISPR/Cas 시스템에서, 엔도뉴클레아제는 단일- 또는 이중-가닥 DNA 서열을 표적화하는 서열-특이적 비-코딩 "가이드 RNA"에 의해 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열-편집될 게놈 내의 부위)에 지향된다. CRISPR 시스템의 3가지 부류(I 내지 III)가 확인된 바 있다. 부류 II CRISPR 시스템은 (다수의 Cas 단백질보다는) 단일의 Cas 엔도뉴클레아제를 사용한다. 하나의 부류 II CRISPR 시스템은 II형 Cas 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9, CRISPR RNA("crRNA") 및 트랜스-활성화 crRNA("tracrRNA")를 포함한다. crRNA는 "가이드 RNA", 전형적으로 표적 DNA 서열에 상응하는 약 20-뉴클레오티드 RNA 서열을 함유한다. crRNA는 또한, tracrRNA에 결합하여, RNase III에 의해 절단되는 부분 이중-가닥 구조를 형성하여, crRNA/tracrRNA 혼성물을 초래하는 영역을 함유한다. 이어서, crRNA/tracrRNA 혼성물은 Cas9 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 서열을 인식하고 절단하게 한다. 표적 DNA 서열은 일반적으로 주어진 Cas 엔도뉴클레아제에 특이적인 "프로토스페이서 인접 모티프"("PAM")에 인접해야 하지만; PAM 서열은 주어진 게놈의 도처에서 나타난다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 CRISPR 엔도뉴클레아제에 대한 유전자를 포함한다. 예를 들어, 다양한 원핵생물 종으로부터 확인되는 일부 CRISPR 엔도뉴클레아제는 독특한 PAM 서열 요건을 가지며; PAM 서열의 예는 5'-NGG(스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)), 5'-NNAGAA(스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CRISPR1), 5'-NGGNG(스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR3) 및 5'-NNNGATT(네이세리아 메닌지디티스(Neisseria meningiditis))를 포함한다. 일부 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제는 G-풍부 PAM 부위, 예를 들어, 5'-NGG와 회합되며, PAM 부위(이로부터 5')로부터 3개 뉴클레오티드 상류의 위치에서 표적 DNA의 블런트-말단 절단을 수행한다. 또 다른 부류 II CRISPR 시스템은 Cas9보다 더 작은 V형 엔도뉴클레아제 Cpf1을 포함하며; 예에는 AsCpf1(아시드아미노코커스(Acidaminococcus) 종 유래) 및 LbCpf1(라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 종 유래)이 포함된다. Cpf1 엔도뉴클레아제는 T-풍부 PAM 부위, 예를 들어, 5'-TTN과 회합된다. 또한, Cpf1은 5'-CTA PAM 모티프를 인식할 수 있다. Cpf1은 4- 또는 5-뉴클레오티드 5' 오버행을 갖는 오프셋 또는 스태거형 이중-가닥 파단부를 도입함으로써, 예를 들어, 코딩 가닥 상의 PAM 부위(그로부터 3')로부터 18개 뉴클레오티드 하류, 및 상보성 가닥 상의 PAM 부위로부터 23개 뉴클레오티드 하류에 위치한 5-뉴클레오티드 오프셋 또는 스태거형 절단으로 표적 DNA를 절단함으로써 표적 DNA를 절단하며; 이러한 오프셋 절단으로부터 초래되는 5-뉴클레오티드 오버행은 상동성 재조합에 의한 DNA 삽입에 의해 블런트-말단 절단된 DNA에서의 삽입에 의한 것보다 더욱 정밀한 게놈 편집을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell, 163:759 - 771]을 참조한다.
다양한 CRISPR 회합(Cas) 유전자가 아넬로좀 내에 포함될 수 있다. 유전자의 구체적인 예는 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cpf1, C2C1 또는 C2C3을 포함하는 부류 II 시스템으로부터의 Cas 단백질을 인코딩하는 것들이다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 Cas 단백질, 예를 들어, 다양한 원핵생물 종 중 임의의 것으로부터의 것일 수 있는 Cas9 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 특정 Cas 단백질, 예를 들어, 특정 프로토스페이서-인접 모티프(PAM) 서열을 인식하도록 선택되는 특정 Cas9 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 세포, 접합체, 배아 또는 동물 내로 도입되어, 예를 들어, 동일한, 유사한 또는 상이한 PAM 모티프를 포함하는 부위의 인식 및 변형을 가능하게 할 수 있는 2가지 이상의 상이한 Cas 단백질 또는 2가지 이상의 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 불활성화된 뉴클레아제를 갖는 변형된 Cas 단백질, 예를 들어, 뉴클레아제-결함 Cas9를 인코딩하는 유전자를 포함한다.
야생형 Cas9 단백질이 gRNA에 의해 표적화된 특정 DNA 서열에서 이중-가닥 파단부(DSB)를 생성하는 한편, 변형된 기능을 갖는 수많은 CRISPR 엔도뉴클레아제가 알려져 있으며, 예를 들어, "닉카제" 버전의 Cas9는 오직 단일-가닥 파단만을 생성하며; 촉매적으로 비활성인 Cas9("dCas9")는 표적 DNA를 절단하지 않는다. dCas9를 인코딩하는 유전자를 이펙터 도메인을 인코딩하는 유전자와 융합시켜, 표적 유전자의 발현을 억제(CRISPRi)하거나 활성화(CRISPRa)시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자는 전사 침묵화제(예를 들어, KRAB 도메인) 또는 전사 활성화제(예를 들어, dCas9-VP64 융합물)를 갖는 Cas9 융합물을 인코딩할 수 있다. 2개의 gRNA에 상동성인 표적 서열에 DSB를 생성하기 위하여, FokI 뉴클레아제에 융합된 촉매적 비활성 Cas9(dCas9)("dCas9-FokI")를 인코딩하는 유전자가 포함될 수 있다. 예를 들어, 애드진 레포지터리(Addgene repository)(Addgene, 75 Sidney St., Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/)에 개시되고, 그로부터 공개적으로 이용 가능한 수많은 CRISPR/Cas9 플라스미드를 참조한다. 각각 개별 가이드 RNA에 의해 유도되는, 2개의 개별 이중-가닥 파단을 도입하는 "이중 닉카제" Cas9는 더욱 정확한 게놈 편집을 달성하는 것으로 문헌[Ran et al. (2013) Cell, 154:1380 - 1389]에 기재되어 있다.
진핵생물의 유전자를 편집하기 위한 CRISPR 기술은 미국 특허 출원 공개 제2016/0138008A1호 및 제US2015/0344912A1호에, 그리고 미국 특허 제8,697,359호, 제8,771,945호, 제8,945,839호, 제8,999,641호, 제8,993,233호, 제8,895,308호, 제8,865,406호, 제8,889,418호, 제8,871,445호, 제8,889,356호, 제8,932,814호, 제8,795,965호 및 제8,906,616호에 개시되어 있다. Cpf1 엔도뉴클레아제 및 상응하는 가이드 RNA 및 PAM 부위는 미국 특허 출원 공개 제2016/0208243 A1호에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 본원에 기재된 폴리펩티드, 예를 들어, 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9, 예를 들어, 야생형 Cas9, 닉카제 Cas9(예를 들어, Cas9 D10A), 데드(dead) Cas9(dCas9), eSpCas9, Cpf1, C2C1 또는 C2C3, 및 gRNA를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 뉴클레아제 및 gRNA(들)를 인코딩하는 유전자의 선택은 표적화된 돌연변이가 뉴클레오티드의 결실인지, 치환인지 또는 부가인지, 예를 들어, 표적화된 서열에 대한 뉴클레오티드의 결실인지, 치환인지 또는 부가인지에 의해 결정된다. (하나 이상의) 이펙터 도메인(예를 들어, VP64)의 전부 또는 그의 일부(예를 들어, 그의 생물학적 활성 부분)와 테더링된 촉매적 비활성 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데드 Cas9(dCas9, 예를 들어, D10A; H840A)를 인코딩하는 유전자는 하나 이상의 표적 핵산 서열의 활성 및/또는 발현을 조절할 수 있는 키메라 단백질을 생성한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "이펙터 도메인의 생물학적 활성 부분"은 이펙터 도메인(예를 들어, "최소" 또는 "코어" 도메인)의 기능을 (예를 들어, 완전하게, 부분적으로 또는 최소로) 유지하는 부분이다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 본원에 기재된 방법에서 유용한 키메라 단백질을 생성하기 위하여 하나 이상의 이펙터 도메인의 전부 또는 일부와 dCas9의 융합물을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 dCas9-메틸라제 융합물을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 다른 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 내인성 유전자를 표적화하기 위하여 부위-특이적 gRNA와 함께 dCas9-효소 융합물을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 양태에서, 아넬로좀은 dCas9와 융합된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 이펙터 도메인(모든 또는 생물학적 활성 부분)을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
단백질성 외부
일부 실시형태에서, 아넬로좀, 예를 들어, 합성 아넬로좀은 유전 요소를 봉입하는 단백질성 외부를 포함한다. 단백질성 외부는 포유동물에서 원치 않는 면역 반응을 유도하지 못하는 실질적으로 비-병원성인 외부 단백질을 포함할 수 있다. 아넬로좀의 단백질성 외부는 전형적으로 단백질성 외부를 구성하는 정20면체 형성으로 자가-어셈블될 수 있는 실질적으로 비-병원성인 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질성 외부 단백질은 아넬로좀의 유전 요소의 서열에 의해 인코딩된다(예를 들어, 유전 요소와 시스로 존재한다). 다른 실시형태에서, 단백질성 외부 단백질은 아넬로좀의 유전 요소로부터 분리된 핵산에 의해 인코딩된다(예를 들어, 유전 요소와 트랜스로 존재한다).
일부 실시형태에서, 단백질, 예를 들어, 실질적으로 비-병원성인 단백질 및/또는 단백질성 외부 단백질은 하나 이상의 글리코실화된 아미노산, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질, 예를 들어, 실질적으로 비-병원성인 단백질 및/또는 단백질성 외부 단백질은 적어도 하나의 친수성 DNA-결합 영역, 아르기닌-풍부 영역, 트레오닌-풍부 영역, 글루타민-풍부 영역, N-말단 폴리아르기닌 서열, 가변 영역, C-말단 폴리글루타민/글루탐산염 서열 및 하나 이상의 이황화 가교를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질은 캡시드 단백질이며, 예를 들어, 본원에 기재된 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 표 1 내지 18, A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5, D1 내지 D10 또는 20 내지 37 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 서열 또는 캡시드 단백질 서열 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단백질 또는 캡시드 단백질의 기능적 단편은 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5, D1 내지 D10 또는 20 내지 37 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 캡시드 서열 또는 캡시드 단백질 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 캡시드 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 캡시드 서열 또는 캡시드 단백질 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 캡시드 단백질 또는 캡시드 단백질의 기능적 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 캡시드 단백질 또는 캡시드 단백질의 기능적 단편, 또는 본원에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나의 아넬로바이러스 캡시드 서열 또는 캡시드 단백질 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 캡시드 단백질 또는 캡시드 단백질의 기능적 단편, 또는 본원에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나의 아넬로바이러스 캡시드 서열 또는 캡시드 단백질 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 본원에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나에 열거되거나, 도 1에 나타낸 바와 같은 아넬로바이러스 아미노산 서열의 위치 약 1 내지 위치 약 150(예를 들어, 또는 각각의 범위 내의 아미노산의 임의의 하위집단, 예를 들어, 위치 약 20 내지 위치 약 35, 위치 약 25 내지 위치 약 30, 위치 약 26 내지 약 30), 위치 약 150 내지 위치 약 390(예를 들어, 또는 각각의 범위 내의 아미노산의 임의의 하위집단, 예를 들어, 위치 약 200 내지 위치 약 380, 위치 약 205 내지 위치 약 375, 위치 약 205 내지 약 371), 약 390 내지 위치 약 525, 위치 약 525 내지 위치 약 850(예를 들어, 또는 각각의 범위 내의 아미노산의 임의의 하위집단, 예를 들어, 위치 약 530 내지 위치 약 840, 위치 약 545 내지 위치 약 830, 위치 약 550 내지 약 820), 약 850 내지 위치 약 950(예를 들어, 또는 각각의 범위 내의 아미노산의 임의의 하위집단, 예를 들어, 위치 약 860 내지 위치 약 940, 위치 약 870 내지 위치 약 930, 위치 약 880 내지 약 923)을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, 또는 본원에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나에 열거되거나, 도 1에 나타낸 바와 같은 아넬로바이러스 아미노산 서열의 위치 약 1 내지 위치 약 150 (예를 들어, 또는 본원에 기재된 바와 같은 각각의 범위 내의 아미노산의 임의의 하위집단), 위치 약 150 내지 위치 약 390, 위치 약 390 내지 위치 약 525, 위치 약 525 내지 위치 약 850, 위치 약 850 내지 위치 약 950에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질은 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편 또는 본원에 기재된 아미노산 서열 또는 아미노산의 범위 중 어느 하나, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나에 열거되거나 도 1에 나타낸 바와 같은 아넬로바이러스 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 더 낮은 서열 동일성을 갖는 아미노산의 범위는 본원에 기재된 특성 중 하나 이상 및 세포/조직/종 특이성(예를 들어, 향성)의 차이를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 단백질성 외부 내에 지질이 결여된다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀에는 지질 이중층, 예를 들어, 바이러스 외피가 결여된다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀의 내부는 단백질성 외부에 의해 완전히 덮인다(예를 들어, 100% 커버리지). 일부 실시형태에서, 아넬로좀의 내부는 단백질성 외부에 의해 100% 미만, 예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 이하의 커버리지로 덮인다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 유전 요소가 아넬로좀에 보유되는 한, 예를 들어, 물, 이온, 펩티드 또는 소분자에 대한 투과 가능성을 허용하는 갭 또는 불연속부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 숙주 세포 내로의 유전 요소의 유입을 매개하기 위하여 숙주 세포를 특이적으로 인식하고/인식하거나 이에 결합하는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 상보성 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 하나 이상의 글리코실화된 단백질, 친수성 DNA-결합 영역, 아르기닌-풍부 영역, 트레오닌-풍부 영역, 글루타민-풍부 영역, N-말단 폴리아르기닌 서열, 가변 영역, C-말단 폴리글루타민/글루탐산염 서열 및 하나 이상의 이황화 가교. 예를 들어, 단백질성 외부는 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF1에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 하기의 특징 중 하나 이상을 포함한다: 정20면체 대칭, 하나 이상의 숙주 세포 분자와 상호작용하는 분자를 인식하고/인식하거나 이에 결합하여, 숙주 세포로의 유입을 매개함, 지질 분자가 결여됨, 탄수화물이 결여됨, pH 및 온도 안정성임, 세제 저항성임 및 숙주에서 실질적으로 비-면역원성이거나 실질적으로 비-병원성임.
II. 벡터
본원에 기재된 유전 요소는 벡터에 포함될 수 있다. 적합한 벡터 및 그들의 제조 및 그들의 이용 방법은 종래 기술에 널리 알려져 있다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 비-병원성 외부 단백질을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 조절 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소를 포함하는 벡터를 포함한다.
유전 요소 또는 유전 요소 내의 임의의 서열은 임의의 적합한 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 다양한 재조합 방법, 예를 들어, 바이러스 서열을 갖는 세포로부터 라이브러리의 스크리닝, 이를 포함하는 것으로 알려져 있는 벡터로부터 서열의 유도, 또는 표준 기법을 사용한 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터의 직접적인 단리가 해당 분야에 알려져 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 유전 요소의 일부 또는 전부는 클로닝보다는 합성에 의해 생성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 조절 요소, 표적 유전자에 상동성인 핵산 서열, 및 생존 가능한 세포 내에서 및/또는 세포내 분자가 표적 세포 내에 존재하는 경우 리포터 분자의 발현을 야기하기 위한 다양한 리포터 구축물을 포함한다.
잠재적으로 트랜스펙션된 세포를 확인하고, 조절 서열의 기능을 평가하기 위한 리포터 유전자가 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수여자 유기체 또는 조직에 존재하거나 그에 의해 발현되지 않고, 발현이 다소 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어, 효소 활성에 의해 나타나는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수여자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 널리 알려져 있으며, 공지된 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 가장 높은 리포터 유전자의 발현 수준을 보이는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구축물은 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-유도 전사를 조절하는 능력에 대하여 작용제를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 실질적으로 비-병원성이고/이거나 숙주 세포 내에 실질적으로 비-통합되거나, 숙주에서 실질적으로 비-면역원성이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 표현형, 바이러스 수준, 유전자 발현, 다른 바이러스와의 경쟁, 병태 등 중 하나 이상을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 조절하기에 충분한 양으로 존재한다.
III. 조성물
본원에 기재된 아넬로좀 또는 벡터는 또한 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 약제학적 부형제와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015개의 아넬로좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 105 내지 1015, 105 내지 1010 또는 1010 내지 1015개의 아넬로좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 108(예를 들어, 약 105, 106, 107, 108, 109 또는 1010) 게놈 당량/㎖의 아넬로좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 실시예 18의 방법에 따라 결정시, 105 내지 1010, 106 내지 1010, 107 내지 1010, 108 내지 1010, 109 내지 1010, 105 내지 106, 105 내지 107, 105 내지 108, 105 내지 109, 105 내지 1011, 105 내지 1012, 105 내지 1013, 105 내지 1014, 105 내지 1015 또는 1010 내지 1015 게놈 당량/㎖의 아넬로좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 세포당 아넬로좀에 포함되는 적어도 1, 2, 5 또는 10, 100, 500, 1000, 2000, 5000, 8,000, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107개 이상의 카피의 유전 요소를 진핵 세포의 집단에 운반하기에 충분한 아넬로좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 세포당 아넬로좀에 포함되는 적어도 약 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 또는 107 또는 약 1 x 104 내지 1 x 105, 1 x 104 내지 1 x 106, 1 x 104 내지 1 x 107, 1 x 105 내지 1 x 106, 1 x 105 내지 1 x 107 또는 1 x 106 내지 1 x 107개 카피의 유전 요소를 진핵 세포의 집단에 운반하기에 충분한 아넬로좀을 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는다: 약제학적 조성물이 약제학적 또는 우수 제조 기준(GMP) 표준을 충족하거나; 약제학적 조성물을 우수 제조 기준(GMP)에 따라 제조하거나; 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 병원체 수준을 갖거나, 예를 들어, 실질적으로 병원체가 없거나; 약제학적 조성물이 사전결정된 기준 값 미만의 오염물질 수준을 갖거나, 예를 들어, 실질적으로 오염물질이 없거나; 또는 약제학적 조성물이 낮은 면역원성을 갖거나, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 실질적으로 비-면역원성임.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 임계값 미만의 양의 하나 이상의 오염물질을 포함한다. 약제학적 조성물에서 바람직하게는 배제되거나 최소화되는 예시적인 오염물질은 제한 없이, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 동물-유래 성분(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 바이러스, 비-감염성 입자, 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래 작용제 및 응집물을 포함한다. 실시형태들에서, 오염물질은 숙주 세포 DNA이다. 실시형태들에서, 조성물은 용량당 약 10 ng 미만의 숙주 세포 DNA를 포함한다. 실시형태들에서, 조성물 중 숙주 세포 DNA의 수준은 여과 및/또는 숙주 세포 DNA의 효소적 분해에 의해 감소된다. 실시형태들에서, 약제학적 조성물은 중량 기준 10% 미만(예를 들어, 약 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만)의 오염물질로 이루어진다.
일 양태에서, 본원에 기재된 본 발명은 하기를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다:
a) (i) 비-병원성 외부 단백질을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합하는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 조절 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소; 및 유전 요소와 회합된, 예를 들어, 이를 봉입하거나 둘러싸는 단백질성 외부를 포함하는 아넬로좀; 및
b) 약제학적 부형제.
소낭
일부 실시형태에서, 조성물은 운반체 성분, 예를 들어, 마이크로입자, 리포좀, 소낭 또는 엑소좀을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일- 또는 다중라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외부 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구형 소낭 구조를 포함한다. 리포좀은 음이온성, 중성 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 일반적으로 생체적합성, 비독성이며, 친수성 및 친지성 약물 분자 둘 모두를 운반하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고(cargo)를 보호하고, 생물학적 막을 가로질러 그들의 로드를 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위하여 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
소낭은 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만; 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 흔히 사용된다. 소낭은 제한 없이, DOTMA, DOTAP, DOTIM, DDAB를 단독으로 또는 콜레스테롤과 함께 포함하여, DOTMA 및 콜레스테롤, DOTAP 및 콜레스테롤, DOTIM 및 콜레스테롤, 및 DDAB 및 콜레스테롤을 제공할 수 있다. 다중라멜라 소낭 지질의 제조 방법은 해당 분야에 알려져 있다(예를 들어, 다중라멜라 소낭 지질 제제에 관한 교시가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,693,086호 참조). 지질 필름이 수용액과 혼합되는 경우 소낭 형성은 자발적일 수 있지만, 이는 또한 균질화기, 초음파처리기, 또는 압출 장치를 사용함으로써 진탕 형태로 힘을 가함으로써 더 신속히 처리될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 압출된 지질은 압출된 지질 제제에 관한 교시가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기재된 바와 같이 감소하는 크기의 필터를 통해 압출시킴으로써 제조될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 첨가제를 소낭에 첨가하여, 그들의 구조 및/또는 특성을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 콜레스테롤 또는 스핑고미엘린을 혼합물에 첨가하여, 구조의 안정화 및 내부 카고의 누출의 방지를 도울 수 있다. 추가로, 소낭은 수소화된 난(egg) 포스파티딜콜린 또는 난 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 디세틸 포스페이트로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 검토를 위하여 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 또한, 소낭은 합성 동안 또는 그 후에 수여자 세포 상의 반응성 기에 상보성인 반응성 기를 포함하도록 표면 변형될 수 있다. 이러한 반응성 기는 제한 없이, 말레이미드 기를 포함한다. 일 예로서, 소낭은 말레이미드 컨쥬게이트된 인지질, 예컨대 제한 없이 DSPE-MaL-PEG2000을 포함하도록 합성될 수 있다.
소낭 형성은 주로 천연 인지질 및 지질, 예컨대 1,2-다이스테아로릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핑고미엘린, 난 포스파티딜콜린 및 모노시알로강글리오시드로 구성될 수 있다. 인지질만으로 제조된 제형은 혈장에서 덜 안정하다. 그러나, 콜레스테롤을 사용한 지질 막의 조작은 캡슐화된 카고의 신속한 방출을 감소시키거나, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)은 안정성을 증가시킨다(예를 들어, 검토를 위하여 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
실시형태들에서, 지질은 지질 마이크로입자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 지질은 DLin-KC2-DMA4, C12-200 및 공지질 디스테로일포스파티딜 콜린을 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 콜레스테롤 및 PEG-DMG는 자발적 소낭 형성 절차를 사용하여 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3] 참조). 성분 몰비는 약 50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA 또는 C12-200/디스테로일포스파티딜 콜린/콜레스테롤/PEG-DMG)일 수 있다. 테크미라(Tekmira)는 모두가 본 발명에 사용될 수 있고/있거나 조정될 수 있는 지질 마이크로입자 및 지질 마이크로입자 제형의 다양한 양태에 관한, 미국 및 해외에서의 대략 95개의 특허 패밀리의 포트폴리오를 갖는다(예를 들어, 미국 특허 제7,982,027호; 제7,799,565호; 제8,058,069호; 제8,283,333호; 제7,901,708호; 제7,745,651호; 제7,803,397호; 제8,101,741호; 제8,188,263호; 제7,915,399호; 제8,236,943호 및 제7,838,658호 및 유럽 특허 제1766035호; 제1519714호; 제1781593호 및 제1664316호 참조).
일부 실시형태에서, 마이크로입자는 무작위 방식으로 배열된 하나 이상의 고형화된 폴리머(들)를 포함한다. 마이크로입자는 생분해성일 수 있다. 생분해성 마이크로입자는 예를 들어, 제한 없이, 용매 증발, 핫 멜트 마이크로캡슐화, 용매 제거 및 분무 건조를 포함하는 해당 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 마이크로입자를 합성하기 위한 예시적인 방법은 문헌[Bershteyn et al., Soft Matter 4:1787-1787, 2008] 및 US 2008/0014144 A1호에 기재되어 있으며, 마이크로입자 합성에 관한 그의 구체적인 교시는 본원에 참조로 포함된다.
생분해성 마이크로입자를 형성하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 합성 폴리머는 제한 없이, 지방족 폴리에스테르, 폴리 (락트산)(PLA), 폴리 (글리콜산)(PGA), 락트산 및 글리콜산의 코폴리머(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 다가무수물(polyanhydride), 폴리(오르쏘)에스테르, 폴리우레탄, 폴리(부티르산), 폴리(발레르산) 및 폴리(락티드-코-카프로락톤) 및 천연 폴리머, 예컨대 알부민, 알긴산염 및 덱스트란 및 셀룰로스를 포함하는 기타 다당류, 콜라겐, 예컨대, 예를 들어, 알킬, 알킬렌과 같은 화학 기의 치환, 부가, 하이드록실화, 산화 및 당업자에 의해 일상적으로 이루어지는 기타 변형을 포함하는 그의 화학적 유도체, 알부민 및 기타 친수성 단백질, 제인 및 기타 프롤라민 및 소수성 단백질, 그의 코폴리머 및 혼합물을 포함한다. 일반적으로, 이들 물질은 효소적 가수분해 또는 물로의 노출에 의해, 표면 또는 벌크 침식에 의해 분해된다.
마이크로입자의 직경은 0.1 내지 1000 마이크로미터(㎛) 범위이다. 일부 실시형태에서, 그들의 직경은 크기가 1 내지 750 ㎛, 또는 50 내지 500 ㎛, 또는 100 내지 250 ㎛의 범위이다. 일부 실시형태에서, 그들의 직경은 크기가 50 내지 1000 ㎛, 50 내지 750 ㎛, 50 내지 500 ㎛, 또는 50 내지 250 ㎛의 범위이다. 일부 실시형태에서, 그들의 직경은 크기가 .05 내지 1000 ㎛, 10 내지 1000 ㎛, 100 내지 1000 ㎛, 또는 500 내지 1000 ㎛의 범위이다. 일부 실시형태에서, 그들의 직경은 약 0.5 ㎛, 약 10 ㎛, 약 50 ㎛, 약 100 ㎛, 약 200 ㎛, 약 300 ㎛, 약 350 ㎛, 약 400 ㎛, 약 450 ㎛, 약 500 ㎛, 약 550 ㎛, 약 600 ㎛, 약 650 ㎛, 약 700 ㎛, 약 750 ㎛, 약 800 ㎛, 약 850 ㎛, 약 900 ㎛, 약 950 ㎛ 또는 약 1000 ㎛이다. 마이크로입자 직경의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 언급된 절대값의 +/-5%를 의미한다.
일부 실시형태에서, 리간드는 입자의 표면 상에 존재하고, 부착될 리간드 상에 존재하는 작용성 화학 기(카복실산, 알데히드, 아민, 술프하이드릴 및 하이드록실)를 통해 마이크로입자의 표면에 컨쥬게이트된다. 작용성은 예를 들어, 마이크로입자의 에멀젼 제조 동안 작용성 화학 기를 갖는 안정화제의 혼입에 의해 마이크로입자 내로 도입될 수 있다.
작용성 기를 마이크로입자에 도입하는 또 다른 예는 입자 제조 후 동안, 입자 및 리간드를 동종- 또는 이종 이작용성 가교결합제와 직접 가교결합시킴으로써 이루어진다. 이러한 절차는 적합한 화학물질 및 소정의 부류의 가교결합제(하기에 더욱 상세히 논의된 바와 같은 CDI, EDAC, 글루타르알데히드 등) 또는 제조 후에 입자 표면의 화학적 변형을 통해 리간드를 입자 표면에 커플링시키는 임의의 다른 가교결합제를 사용할 수 있다. 이는 또한 양친매성 분자, 예컨대 지방산, 지질 또는 기능적 안정화제가 입자 표면에 수동으로 흡수되고 부착되어, 그에 의해 리간드로의 테더링을 위한 작용성 말단 기를 도입할 수 있는 과정을 포함한다.
일부 실시형태에서, 마이크로입자는 그들의 외부 표면 상에 하나 이상의 표적화 기를 포함하도록 합성하여, 특정 세포 또는 조직 유형(예를 들어, 심근세포)을 표적화할 수 있다. 이들 표적화 기는 제한 없이, 수용체, 리간드, 항체 등을 포함한다. 이들 표적화 기는 세포의 표면 상의 그들의 파트너와 결합한다. 일부 실시형태에서, 마이크로입자는 세포 표면을 포함하는 지질 이중층 내로 통합될 것이며, 미토콘드리아는 세포로 운반된다.
마이크로입자는 또한, 그들의 최외각 표면 상에 지질 이중층을 포함할 수 있다. 이러한 이중층은 동일하거나 상이한 유형의 하나 이상의 지질로 구성될 수 있다. 예는 인지질, 예컨대 포스포콜린 및 포스포이노시톨을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 구체적인 예는 제한 없이, DMPC, DOPC, DSPC 및 다양한 다른 지질, 예컨대 리포좀에 대하여 본원에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 담체는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 나노입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 소낭 또는 마이크로입자는 진단제로 작용화된다. 진단제의 예는 양전자 방사 단층촬영(PET), 컴퓨터 보조 단층촬영(CAT), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영, x-선, 형광투시법 및 자기 공명 영상화(MRI)에 사용되는 상업적으로 이용 가능한 영상화제; 및 조영제를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. MRI에서 조영제로서 사용하기에 적합한 물질의 예는 가돌리늄 킬레이트, 및 철, 마그네슘, 망간, 구리 및 크롬을 포함한다.
담체
본원에 기재된 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 담체를 포함하고/포함하거나, 이와 함께 제형화되고/제형화되거나, 이 내에서 운반될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 아넬로좀, 아넬로바이러스, 아넬로벡터 또는 유전 요소)을 포함하는(예를 들어, 캡슐화하는) 담체(예를 들어, 소낭, 리포좀, 지질 나노입자, 엑소좀, 적혈구, 엑소좀(예를 들어, 포유동물 또는 식물 엑소좀), 푸소좀)를 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 시스템은 리포좀 또는 다른 유사한 소낭 내에 제형화될 수 있다. 일반적으로, 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일- 또는 다중라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외부 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구형 소낭 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 일반적으로 하기의 특징 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 갖는다: 생체적합성, 비독성, 친수성 및 친지성 약물 분자 둘 모두를 운반할 수 있음, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고(cargo)를 보호할 수 있음 및 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 수송할 수 있음(예를 들어, 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679]; 및 문헌[Zylberberg & Matosevic. 2016. Drug Delivery, 23:9, 3319-3329, doi: 10.1080/10717544.2016.1177136] 참조).
소낭은 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만; 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 흔히 사용된다. 다중라멜라 소낭 지질의 제조 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,693,086호를 참조하며, 다중라멜라 소낭 지질 제제에 관한 이의 교시는 본원에 참조로 포함된다). 소낭 형성은 지질막을 수성 용액과 혼합하는 경우에 자발적일 수 있지만, 그것은 균질화기, 초음파기 또는 압출 장치를 사용함으로써 진탕 형태의 힘을 인가함으로써 촉진될 수도 있다(예를 들어, 검토를 위하여 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 압출된 지질은 예를 들어, 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기재된 바와 같이, 감소하는 크기의 필터를 통한 압출에 의해 제조될 수 있다.
지질 나노입자(LNP)는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 위한 생체적합성 및 생분해성 운반 시스템을 제공하는 담체의 또 다른 예이다. 예를 들어, 문헌[Gordillo-Galeano et al. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. Volume 133, December 2018, Pages 285-308]을 참조한다. 나노구조화된 지질 담체(NLC)는 변형된 고체 지질 나노입자(SLN)의 특징을 보유하고, 약물 안정성 및 로딩 능력을 개선시키고, 약물 누출을 방지하는 변형된 고체 지질 나노입자(SLN)이다. 폴리머 나노입자(PNP)는 약물 운반의 중요한 구성성분이다. 이들 나노입자는 특정 표적으로의 약물 운반을 효율적으로 유도하고, 약물 안정성 및 제어된 약물 방출을 개선시킬 수 있다. 리포좀과 폴리머를 조합한 새로운 유형의 담체인, 지질-중합체 나노입자(PLN)도 또한 사용될 수 있다. 이들 나노입자는 PNP와 리포좀의 보완적인 이점을 보유한다. PLN는 코어(core)-쉘(shell) 구조로 구성된다; 폴리머 코어는 안정한 구조를 제공하며, 인지질 쉘(shell)은 우수한 생체적합성을 제공한다. 이와 같이, 2가지 구성성분은 약물 캡슐화 효율을 증가시키고, 표면 변형을 용이하게 하고, 수용성 약물의 누출을 방지한다. 검토를 위하여, 예를 들어, 문헌[Li et al. 2017, Nanomaterials 7, 122; doi:10.3390/nano7060122]을 참조한다.
엑소좀도 또한, 본원에 기재된 조성물 및 시스템을 위한 약물 운반 비히클로서 사용될 수 있다. 검토를 위하여, 문헌[Ha et al. July 2016. Acta Pharmaceutica Sinica B. Volume 6, Issue 4, Pages 287-296; doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001]을 참조한다.
생체 외 분화된 적혈구도 또한, 본원에 기재된 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO2015073587호; WO2017123646호; WO2017123644호; WO2018102740호; WO2016183482호; WO2015153102호; WO2018151829호; WO2018009838호; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]; 미국 특허 제9,644,180호; 문헌[Huang et al. 2017. Nature Communications 8: 423]; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]을 참조한다.
예를 들어, WO2018208728호에 기재된 바와 같은 푸소좀 조성물도 또한 본원에 기재된 조성물을 운반하기 위한 담체로서 사용될 수 있다.
막 투과성 폴리펩티드
일부 실시형태에서, 조성물은 세포 내로 또는 막, 예를 들어, 세포 또는 핵 막을 가로질러 성분을 운반하도록 막 투과성 폴리펩티드(MPP)를 추가로 포함한다. 막을 가로질러 물질의 수송을 용이하게 할 수 있는 막 투과성 폴리펩티드는 세포-투과 펩티드(CPP)(예를 들어, 미국 특허 제8,603,966호 참조), 식물 세포내 운반을 위한 융합 펩티드(예를 들어, 문헌[Ng et al., PLoS One, 2016, 11:e0154081] 참조), 단백질 변환 도메인, 트로얀(Trojan) 펩티드, 및 막 전위 신호(MTS)(예를 들어, 문헌[Tung et al., Advanced Drug Delivery Reviews 55:281-294 (2003)] 참조)를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 일부 MPP는 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산, 예컨대 아르기닌이 풍부하다.
막 투과성 폴리펩티드는 전신 투여 시에 생체 내에서 다중의 조직의 세포 내에서, 성분의 막 투과를 유도하고, 거대분자 전위를 가능하게 하는 능력을 갖는다. 막 투과성 폴리펩티드는 또한, 적절한 조건 하에서 세포와 접촉되는 경우, 외부 환경으로부터 세포질, 세포소기관, 예컨대 미토콘드리아 또는 세포의 핵을 포함하는 세포내 환경에, 수동 확산으로 달성될 것보다 유의미하게 더 큰 양으로 통과하는 펩티드를 지칭할 수 있다.
막을 가로질러 수송되는 성분은 막 투과성 폴리펩티드와 가역적으로 또는 비가역적으로 연결될 수 있다. 링커는 화학적 결합, 예를 들어, 하나 이상의 공유 결합 또는 비-공유 결합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 이러한 링커는 2 내지 30개 아미노산 이상일 수 있다. 링커는 유연성, 강성 또는 절단 가능한 링커를 포함한다.
조합
일 양태에서, 본원에 기재된 아넬로좀 또는 아넬로좀을 포함하는 조성물은 또한, 하나 이상의 이종성 모이어티를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본원에 기재된 아넬로좀 또는 아넬로좀을 포함하는 조성물은 또한, 융합물 내에 하나 이상의 이종성 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 모이어티는 유전 요소와 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 모이어티는 아넬로좀의 일부로서 단백질성 외부에 봉입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 모이어티는 아넬로좀과 함께 투여될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 아넬로좀 및 이종성 모이어티 중 어느 하나를 포함하는 세포 또는 조직을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 아넬로좀 및 이종성 모이어티를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이종성 모이어티는 바이러스(예를 들어, 이펙터(예를 들어, 약물, 소분자)), 표적화제(예를 들어, DNA 표적화제, 항체, 수용체 리간드), 태그(예를 들어, 형광단, 감광성 작용제, 예컨대 킬러레드(KillerRed)) 또는 본원에 기재된 편집 또는 표적화 모이어티일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 막 전위 폴리펩티드는 하나 이상의 이종성 모이어티에 연결된다. 일 실시형태에서, 이종성 모이어티는 소분자(예를 들어, 펩티드 모방체 또는 2000 달톤 미만의 분자량을 갖는 작은 유기 분자), 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편), 나노입자, 압타머 또는 약리학적 작용제(pharmacoagent)이다.
바이러스
일부 실시형태에서, 조성물은 이종성 모이어티로서 바이러스, 예를 들어, 단일 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어, 아넬로바이러스, 비드나바이러스, 써코바이러스, 제미니바이러스, 게노모바이러스, 이노바이러스, 마이크로바이러스, 나노바이러스, 파보바이러스 및 스피라바이러스를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 이중 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 암풀라바이러스, 아스코바이러스, 아스파바이러스, 배큘로바이러스, 푸셀로바이러스, 글로불로바이러스, 구타바이러스, 하이트로사바이러스, 헤르페스바이러스, 이리도바이러스, 리포트릭스바이러스, 니마바이러스 및 폭스바이러스를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 RNA 바이러스, 예를 들어, 알파바이러스, 푸로바이러스, 간염 바이러스, 호르데이바이러스, 토바모바이러스, 토브라바이러스, 트리코르나바이러스, 루비바이러스, 비르나바이러스, 시스토바이러스, 파르티티바이러스 및 레오바이러스를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 이종성 모이어티로서 바이러스와 함께 투여된다.
일부 실시형태에서, 이종성 모이어티는 비-병원성, 예를 들어, 상리공생, 편리공생, 고유 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-병원성 바이러스는 하나 이상의 아넬로바이러스, 예를 들어, 알파토르크바이러스(TT), 베타토르크바이러스(TTM) 및 감마토르크바이러스(TTMD)이다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스는 토르크 테노 바이러스(TT), SEN 바이러스, 센티넬 바이러스, TTV-유사 미니 바이러스, TT 바이러스, TT 바이러스 유전형 6, TT 바이러스 군, TTV-유사 바이러스 DXL1, TTV-유사 바이러스 DXL2, 토르크 테노-유사 미니 바이러스(TTM) 또는 토르크 테노-유사 미디 바이러스(TTMD)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-병원성 바이러스는 본원에 기재된, 예를 들어, 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 41 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이종성 모이어티는 대상체에서 결여된 것으로 확인된 하나 이상의 바이러스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 디스비로시스를 갖는 것으로 확인된 대상체에는 대상체에서 불균형인 아넬로좀 및 하나 이상의 바이러스 성분 또는 바이러스를 포함하는, 또는 기준 값, 예를 들어, 건강한 대상체와 상이한 비를 갖는 조성물이 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이종성 모이어티는 하나 이상의 비-아넬로바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 백시니아 바이러스, SV40, 파필로마 바이러스, RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티 바이러스, 단일-가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 간염 바이러스 또는 이중-가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 로타바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀 또는 바이러스는 결함이 있거나, 감염성 입자를 생성하기 위하여 지원을 필요로 한다. 이러한 지원은 예를 들어, LTR 내의 조절 서열의 제어 하에 복제 결함 아넬로좀 또는 바이러스의 구조적 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 그의 전부)를 인코딩하는, 핵산, 예를 들어, 게놈 내로 통합되는 플라스미드 또는 DNA를 함유하는 헬퍼 세포주를 사용함으로써 제공될 수 있다. 본원에 기재된 아넬로좀을 복제하는 데 적합한 세포주는 해당 분야에 공지된 세포주, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있는 A549 세포를 포함한다.
표적화 모이어티
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로좀은 표적화 모이어티, 예를 들어, 표적 세포 상에 존재하는 관심 분자에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 관심 분자 또는 세포의 특정 기능을 조절하거나, 특정 분자(예를 들어, 효소, 단백질 또는 핵산), 예를 들어, 경로 내의 관심 분자의 하류의 특정 분자를 조절하거나, 표적에 특이적으로 결합하여, 아넬로좀 또는 유전 요소를 국소화시킬 수 있다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 특정 관심 분자와 상호작용하여 그의 기능을 증가시키거나, 감소시키거나, 또는 다르게 조절하는 치료제를 포함할 수 있다.
태그화 또는 모니터링 모이어티
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로좀은 태그를 추가로 포함하여, 본원에 기재된 아넬로좀 또는 유전 요소를 표지하거나 모니터링할 수 있다. 태그화 또는 모니터링 모이어티는 화학적 작용제 또는 효소적 절단, 예컨대 단백질 분해 또는 인테인 스플라이싱에 의해 제거할 수 있다. 친화성 태그는 친화성 기법을 사용하여 태그화된 폴리펩티드를 정제하는 데 유용할 수 있다. 일부 예에는 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 폴리(His) 태그가 포함된다. 가용화 태그는 샤페론-결함 종, 예컨대 에스케리키아 콜라이(E. coli)에서 발현되는 재조합 단백질이 단백질에서 적절하게 폴딩되는 것을 지원하는 것을 돕고, 그들이 침전하지 못하게 하는 데 유용할 수 있다. 일부 예는 티오레독신(TRX) 및 폴리(NANP)를 포함한다. 태그화 또는 모니터링 모이어티는 감광성 태그, 예를 들어, 형광을 포함할 수 있다. 형광 태그는 시각화에 유용하다. GFP 및 그의 변이체는 형광 태그로서 흔히 사용되는 몇몇의 예이다. 단백질 태그는 특정 효소적 변형(예컨대, 비오틴 리가제에 의한 비오티닐화) 또는 화학적 변형(예컨대 형광 영상화를 위한 FlAsH-EDT2와의 반응)이 일어나게 할 수 있다. 종종 태그화 또는 모니터링 모이어티를 조합하여, 단백질을 다수의 다른 성분과 연결시킨다. 태그화 또는 모니터링 모이어티는 또한 특정 단백질분해 또는 효소적 절단에 의해(예를 들어, TEV 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa 또는 엔테로펩티다제에 의해) 제거될 수 있다.
나노입자
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로좀은 나노입자를 추가로 포함할 수 있다. 나노입자는 약 1 내지 약 1000 나노미터, 약 1 내지 약 500 나노미터 크기, 약 1 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 75 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 및 그 사이의 임의의 범위의 크기를 갖는 무기 물질을 포함한다. 나노입자는 일반적으로, 나노규모 크기의 복합 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 전형적으로 구형이지만, 나노입자 조성에 따라 상이한 형태가 가능하다. 나노입자의 외부 환경과 접촉하는 나노입자의 부분은 일반적으로 나노입자의 표면으로서 확인된다. 본원에 기재된 나노입자에서, 크기 제한은 2차원으로 제한될 수 있으며, 이에 따라, 나노입자는 약 1 내지 약 1000 nm의 직경을 갖는 복합 구조를 포함하게 되며, 여기서 특정 직경은 나노입자 조성물 및 실험 설계에 따라 의도된 나노입자의 용도에 좌우된다. 예를 들어, 치료적 응용에 사용되는 나노입자는 전형적으로 약 200 nm 이하의 크기를 갖는다.
나노입자의 바람직한 추가의 특성, 예컨대 표면 전하 및 입체적 안정화는 또한, 특정 관심 응용을 고려하여 달라질 수 있다. 임상적 응용, 예컨대 암 치료에 바람직할 수 있는 예시적인 특성은 그의 전문이 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌[Davis et al, Nature 2008 vol. 7, pages 771-782]; 문헌[Duncan, Nature 2006 vol. 6, pages 688-701]; 및 문헌[Allen, Nature 2002 vol. 2 pages 750-763]에 기재되어 있다. 추가의 특성은 본 개시내용의 판독 시에 당업자에 의해 확인 가능하다. 나노입자 치수 및 특성은 해당 분야에 공지된 기법에 의해 검출될 수 있다. 입자 치수를 검출하기 위한 예시적인 기법은 동적 광 산란(DLS) 및 다양한 현미경관찰, 예컨대 투과 전자 현미경관찰(TEM) 및 원자력 현미경관찰(AFM)을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 입자 형태를 검출하기 위한 예시적인 기법은 TEM 및 AFM을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 나노입자의 표면 전하를 검출하기 위한 예시적인 기법은 제타 전위 방법을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 다른 화학적 특성을 검출하는 데 적합한 추가의 기법은 1H, 11B 및 13C 및 19F NMR, UV/Vis 및 적외선/라만 분광학 및 형광 분광학(나노입자가 형광 표지와 조합하여 사용되는 경우) 및 당업자에 의해 확인 가능한 추가의 기법을 포함한다.
소분자
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로좀은 소분자를 추가로 포함할 수 있다. 소분자 모이어티는 작은 펩티드, 펩티드 모방체(예를 들어, 펩토이드), 아미노산, 아미노산 유사체, 합성 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 일반적으로 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 및 무기 화합물(이종유기 및 유기금속 화합물 포함), 예를 들어, 몰당 약 2,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 예를 들어, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 예를 들어, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 다른 약제학적으로 허용되는 형태를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 소분자는 신경전달물질, 호르몬, 약물, 독소, 바이러스 또는 미생물 입자, 합성 분자, 및 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
적합한 소분자의 예는 모두 본원에 참조로 포함되는 문헌["The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition]의 다음과 같은 섹션에 기재된 것들을 포함한다: 시냅스 및 신경이펙터 연결 부위에서 작용하는 약물; 중추신경계에서 작용하는 약물; 오타코이드: 염증의 약물 요법; 물, 염 및 이온; 신장 기능 및 전해질 대사에 영향을 미치는 약물; 심혈관 약물; 위장 기능에 영향을 미치는 약물; 자궁 운동에 영향을 미치는 약물; 기생충 감염의 화학요법; 미생물 질병의 화학요법; 신생물 질병의 화학요법; 면역억제를 위해 사용되는 약물; 혈액-형성 기관에 작용하는 약물; 호르몬 및 호르몬 길항제; 비타민, 피부과학 및 독성학. 소분자의 일부 예는 프리온 약물, 예컨대 타크롤리무스, 유비퀴틴 리가제 또는 HECT 리가제 저해제, 예컨대 헤클린(heclin), 히스톤 변형 약물, 예컨대 부티르산나트륨, 효소적 저해제, 예컨대 5-아자-시티딘, 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신, 베타-락탐, 예컨대 페니실린, 항-박테리아제, 화학요법제, 항-바이러스제, 다른 유기체로부터의 조절제, 예컨대 VP64, 및 불충분한 생체 이용 가능성을 갖는 약물, 예컨대 결함이 있는 약동학을 갖는 화학치료제를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 소분자는 후성적 변형제, 예를 들어 문헌[de Groote et al. Nuc. Acids Res. (2012):1-18]에 기재된 것들이다. 예시적인 소분자 후성적 변형제는 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Lu et al. J. Biomolecular Screening 17.5(2012):555-71], 예를 들어, 표 1 또는 2에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 후성적 변형제는 보리노스타트(vorinostat) 또는 로미뎁신(romidepsin)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 후성적 변형제는 부류 I, II, III 및/또는 IV 히스톤 데아세틸라제(HDAC)의 저해제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 후성적 변형제는 SirTI의 활성화제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 후성적 변형제는 가르시놀(Garcinol), Lys-CoA, C646, (+)-JQI, I-BET, BICI, MS120, DZNep, UNC0321, EPZ004777, AZ505, AMI-I, 피라졸 아미드 7b, 벤조[d]이미다졸 17b, 아실화된 답손 유도체(예를 들어, PRMTI), 메틸스타트(methylstat), 4,4'-디카복시-2,2'-비피리딘, SID 85736331, 하이드록사메이트 유사체 8, 타닐사이프로미(tanylcypromie), 비스구아니딘 및 비구아니드 폴리아민 유사체, UNC669, 비다자(Vidaza), 데시타빈(decitabine), 소듐 페닐 부티레이트(SDB), 리포산(LA), 케르세틴(quercetin), 발프로산, 하이드랄라진(hydralazine), 박트림(bactrim), 녹차 추출물(예를 들어, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)), 커큐민, 술포르판(sulforphane) 및/또는 알리신(allicin)/디알릴 디술피드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 후성적 변형제는 DNA 메틸화를 저해하며, 예를 들어, DNA 메틸트랜스퍼라제의 저해제이다(예를 들어, 5-아자시티딘이고/이거나 데시타빈이다). 일부 실시형태에서, 후성적 변형제는 히스톤 변형, 예를 들어, 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화, 히스톤 수모화(sumoylation) 및/또는 히스톤 인산화를 변형시킨다. 일부 실시형태에서, 후성적 변형제는 히스톤 데아세틸라제의 저해제이다(예를 들어, 보리노스타트 및/또는 트리코스타틴 A이다).
일부 실시형태에서, 소분자는 약제학적 활성 작용제이다. 일 실시형태에서, 소분자는 대사 활성 또는 성분의 저해제이다. 유용한 부류의 약제학적 활성 작용제는 항생제, 항-염증 약물, 혈관신생 또는 혈관작용제, 성장 인자 및 화학치료제(항-신생물)제(예를 들어, 종양 억제제)를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 범주 및 예로부터의 또는 문헌[(Orme-Johnson 2007, Methods Cell Biol. 2007;80:813-26)]으로부터의 분자 중 하나 또는 조합이 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 항생제, 항-염증 약물, 혈관신생 또는 혈관작용제, 성장 인자 또는 화학치료제를 포함하는 조성물을 포함한다.
펩티드 또는 단백질
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로좀은 펩티드 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 펩티드 모이어티는 펩티드 리간드 또는 항체 단편(예를 들어, 수용체, 예컨대 세포외 수용체에 결합하는 항체 단편), 신경펩티드, 호르몬 펩티드, 펩티드 약물, 독성 펩티드, 바이러스 또는 미생물 펩티드, 합성 펩티드 및 효능제 또는 길항제 펩티드를 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
펩티드 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있다. 펩티드는 약 5 내지 약 200개의 아미노산, 약 15 내지 약 150개의 아미노산, 약 20 내지 약 125개의 아미노산, 약 25 내지 약 100개의 아미노산 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 갖는다.
펩티드의 일부 예는 형광 태그 또는 마커, 항원, 항체, 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체, 리간드 및 수용체, 예컨대 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), GLP-2 수용체 2, 콜레시스토키닌(cholecystokinin) B(CCKB) 및 소마토스타틴 수용체, 펩티드 치료제, 예컨대 특정 세포 표면 수용체, 예컨대 G 단백질-커플링된 수용체(GPCR) 또는 이온 채널에 결합되는 것들, 천연적으로 생물활성인 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 항-미생물 펩티드, 포어-형성 펩티드, 종양 표적화 또는 세포독성 펩티드, 및 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 예컨대 아폽토시스-유도 펩티드 신호 또는 감광제 펩티드를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 본 발명에서 유용한 펩티드는 또한 작은 항원-결합 펩티드, 예를 들어, 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디를 포함한다(예를 들어, 문헌[Steeland et al. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113] 참조). 이러한 작은 항원 결합 펩티드는 사이토졸 항원, 핵 항원, 세포소기관-내 항원에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로좀은 특정 위치, 조직 또는 세포를 표적화할 수 있는 리간드에 연결된 폴리펩티드를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 압타머
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로좀은 올리고뉴클레오티드 압타머를 추가로 포함할 수 있다. 압타머 모이어티는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 압타머이다. 올리고뉴클레오티드 압타머는 단백질 및 펩티드를 포함하는 사전-선택된 표적에 높은 친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 단일-가닥 DNA 또는 RNA(ssDNA 또는 ssRNA) 분자이다.
올리고뉴클레오티드 압타머는 다양한 분자 표적, 예컨대 소분자, 단백질, 핵산 및 심지어 세포, 조직 및 유기체에 결합하도록 반복된 회차의 시험관 내 선택 또는 동등하게, SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 계통 진화)를 통해 엔지니어링될 수 있는 핵산 종이다. 압타머는 차별적인 분자 인식을 제공하며, 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 또한, 압타머는 바람직한 저장 특성을 갖고, 치료적 응용에서 면역원성을 거의 유도하지 않거나, 전혀 유도하지 않을 수 있다.
DNA 및 RNA 압타머는 둘 모두 다양한 표적에 대하여 강력한 결합 친화성을 보여줄 수 있다. 예를 들어, DNA 및 RNA 압타머는 t 라이소자임, 트롬빈, 인간 면역결핍 바이러스 트랜스-작용 반응성 요소(HIV TAR),(en.wikipedia.org/wiki/Aptamer - cite_note-10 참조), 헤민(hemin), 인터페론 γ, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 전립선 특이적 항원(PSA), 도파민 및 비-정규 종양유전자, 열 충격 인자 1(HSF1)을 위하여 선택된다.
펩티드 압타머
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로좀은 펩티드 압타머를 추가로 포함할 수 있다. 펩티드 압타머는 낮은 분자량, 12 내지 14 kDa을 갖는 펩티드를 포함하는 하나의(또는 그 이상의) 짧은 가변 펩티드 도메인을 갖는다. 펩티드 압타머는 세포에 특이적으로 결합하고, 세포 내측의 단백질-단백질 상호작용을 간섭하도록 설계될 수 있다.
펩티드 압타머는 특이적 표적 분자에 결합하도록 선택되거나 엔지니어링된 인공 단백질이다. 이들 단백질은 가변 서열의 하나 이상의 펩티드 루프를 포함한다. 이들은 전형적으로 조합 라이브러리로부터 단리되며, 종종 유도된 돌연변이 또는 가변 영역 돌연변이유발 및 선택의 회차에 의해 후속적으로 개선된다. 생체 내에서, 펩티드 압타머는 세포 단백질 표적에 결합할 수 있고, 그들의 표적화된 분자와 다른 단백질의 정상적인 단백질 상호작용의 간섭을 포함하는 생물학적 효과를 발휘할 수 있다. 특히, 전사 인자 결합 도메인에 부착된 가변 펩티드 압타머 루프는 전사 인자 활성화 도메인에 부착된 표적 단백질에 대해 스크리닝한다. 이러한 선택 전략을 통해 펩티드 압타머의 표적으로의 펩티드 압타머의 생체 내 결합은 하류 효모 마커 유전자의 발현으로서 검출된다. 이러한 실험은 표현형을 유발하기 위해 압타머에 의해 결합되는 특정 단백질 및 압타머가 파괴하는 단백질 상호작용을 확인한다. 또한, 적절한 기능적 모이어티로 유도체화된 펩티드 압타머는 그들의 표적 단백질의 특정 번역-후 변형을 유발할 수 있거나, 표적의 하위세포 국소화를 변경시킬 수 있다.
펩티드 압타머는 또한 시험관 내에서 표적을 인식할 수 있다. 그들은 바이오센서에서 항체 대신에 이용되며, 비활성 및 활성 단백질 형태 둘 모두를 함유하는 집단으로부터 단백질의 활성 아이소폼을 검출하기 위해 이용된다. 펩티드 압타머 "헤드"가 독특한 서열의 이중-가닥 DNA "테일(tail)"에 공유적으로 연결된 태드폴(tadpole)로서 알려져 있는 유도체는 (예를 들어, 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응을 사용하여) 그들의 DNA 테일의 PCR에 의해 혼합물 중 드문 표적 분자의 정량화를 가능하게 한다.
펩티드 압타머 선택은 상이한 시스템을 사용하여 이루어질 수 있지만, 현재 효모 2-하이브리드 시스템이 가장 많이 사용된다. 펩티드 압타머는 또한 파지 디스플레이 또는 다른 표면 디스플레이 기술, 예컨대 mRNA 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 박테리아 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 구축된 조합 펩티드 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 이들 실험 절차는 또한 바이오패닝(biopanning)으로서 알려져 있다. 바이오패닝으로부터 수득되는 펩티드 중에, 미모토프(mimotope)는 펩티드 압타머의 한 종류로서 간주될 수 있다. 조합 펩티드 라이브러리로부터 패닝된 모든 펩티드는 명칭 MimoDB를 갖는 특수 데이터에 저장되어 있다.
IV. 숙주
본 발명은 추가로 본원에 기재된 아넬로좀을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 숙주 또는 숙주 세포는 식물, 곤충, 박테리아, 진균, 척추동물, 포유동물(예를 들어, 인간) 또는 다른 유기체 또는 세포이다. 특정 실시형태에서, 본원에 확인된 바와 같이, 다양한 상이한 숙주 세포를 감염시키는 아넬로좀이 제공된다. 표적 숙주 세포는 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 기원의 세포를 포함한다. 표적 숙주 세포는 예를 들어, 상피 세포, 근육 세포, 백혈구 세포(예를 들어, 림프구), 신장 조직 세포, 폐 조직 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 숙주에서 실질적으로 비-면역원성이다. 아넬로좀 또는 유전 요소는 숙주의 면역계에 의해 요망되지 않는 상당한 반응을 생성하지 않는다. 일부 면역 반응은 체액성 면역 반응(예를 들어, 항원-특이적 항체의 생성) 및 세포-매개의 면역 반응(예를 들어, 림프구 증식)을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 숙주 또는 숙주 세포는 아넬로좀과 접촉된다(예를 들어, 이로 감염된다). 일부 실시형태에서, 숙주는 포유동물, 예컨대 인간이다. 숙주 내의 아넬로좀의 양은 투여 후 임의의 시간에 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양물 중 아넬로좀 성장의 시간 경과가 결정된다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀은 유전 가능하다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 유체 및/또는 세포 중에서, 모체에서 유아에게 연속적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, 원래의 숙주 세포로부터의 딸 세포는 아넬로좀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 모체는 아넬로좀을 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 유아에게, 또는 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 전달 효율로 숙주 세포로부터 딸 세포로 전달한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포 내의 아넬로좀은 감수분열 동안 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 전달 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포 내의 아넬로좀은 유사분열 동안 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 전달 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포 내의 아넬로좀은 약 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 99% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 전달 효율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀, 예를 들어, 아넬로좀은 숙주 세포 내에서 복제한다. 일 실시형태에서, 아넬로좀은 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 복제할 수 있다. 다른 실시형태에서, 아넬로좀은 복제 결핍 또는 복제 비적격이다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀이 숙주 세포에서 복제되지만, 아넬로좀은 숙주의 게놈 내로, 예를 들어, 숙주의 염색체와 통합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀과 숙주의 염색체와의 재조합 빈도는 무시할 수 있는 정도이다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 숙주의 염색체와 예를 들어, 약 1.0 cM/Mb, 0.9 cM/Mb, 0.8 cM/Mb, 0.7 cM/Mb, 0.6 cM/Mb, 0.5 cM/Mb, 0.4 cM/Mb, 0.3 cM/Mb, 0.2 cM/Mb, 0.1 cM/Mb 미만의 재조합 빈도를 갖는다.
V. 이용 방법
본원에 기재된 아넬로좀 및 아넬로좀을 포함하는 조성물은 예를 들어, 질병, 장애 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 포유동물 대상체, 예를 들어, 인간 대상체)에서의 질병, 장애 또는 질환의 치료 방법에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 약제학적 조성물의 투여는 예를 들어, 비경구(정맥내, 종양내, 복강내, 근육내, 강내 및 피하 포함) 투여로 이루어질 수 있다. 아넬로좀은 단독으로 또는 약제학적 조성물로서 제형화되어 투여될 수 있다.
아넬로좀은 단위-용량 조성물, 예컨대 단위 용량 비경구 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 혼합에 의해 제조되며, 비경구 투여를 위하여 적합하게 조정될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 주사 및 주입 용액 또는 현탁액 또는 좌제 또는 에어로졸의 형태로 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀 또는 이를 포함하는 조성물의 투여는 아넬로좀에 의해 포함되는 유전 요소가 예를 들어, 대상체 내의 표적 세포로 운반되게 할 수 있다.
예를 들어, 이펙터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 포함하는 본원에 기재된 아넬로좀 또는 그의 조성물을 사용하여 이펙터를 세포, 조직 또는 대상체에 운반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀 또는 그의 조성물을 사용하여, 이펙터를 골수, 혈액, 심장, GI 또는 피부에 운반한다. 본원에 기재된 아넬로좀 조성물의 투여에 의한 이펙터의 운반은 세포, 조직 또는 대상체에서 비코딩 RNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 조절할 수 있다(예를 들어, 증가 또는 감소시킬 수 있다). 이러한 방식으로의 발현 수준의 조절은 이펙터가 운반되는 세포에서 기능적 활성의 변경을 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절된 기능적 활성은 성질이 효소적, 구조적 또는 조절적일 수 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀 또는 그의 카피는 세포로의 운반 후 24시간(예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 30일 또는 1개월)에 세포에서 검출 가능하다. 실시형태들에서, 아넬로좀 또는 그의 조성물은 표적 세포 상에서 효과를 매개하며, 효과는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 2, 3 또는 4주 또는 1, 2, 3, 6 또는 12개월 동안 지속된다. (예를 들어, 아넬로좀 또는 그의 조성물이 외인성 단백질을 인코딩하는 유전 요소를 포함하는) 일부 실시형태에서, 효과는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 2, 3 또는 4주 또는 1, 2, 3, 6 또는 12개월 미만 동안 지속된다.
본원에 기재된 아넬로좀 또는 아넬로좀을 포함하는 조성물로 치료될 수 있는 질병, 장애 및 질환의 예는 제한 없이, 면역 장애, 인터페론병증(예를 들어, I형 인터페론병증), 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암, 비-소세포 폐암, 예를 들어, mIR-625, 예를 들어, 카스파제-3에 반응성인 유전자를 발현하는 종양) 및 위장 장애를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 아넬로좀이 접촉되는 세포 내에서 활성 또는 기능을 조절한다(예를 들어, 증가 또는 감소시킨다). 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 아넬로좀이 접촉되는 세포에서 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질)의 수준 또는 활성을 조절한다(예를 들어, 증가 또는 감소시킨다). 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 아넬로좀이 접촉되는 세포, 예를 들어, 암 세포의 생존력을 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 아넬로좀이 접촉되는 세포, 예를 들어, 암 세포의 생존력을 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상 감소시키는 이펙터, 예를 들어, miRNA, 예를 들어, miR-625를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 카스파제-3 활성을 증가시킴으로써 아넬로좀이 접촉되는 세포, 예를 들어, 암 세포의 아폽토시스를 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 예를 들어, 카스파제-3 활성을 증가시킴으로써, 아넬로좀이 접촉되는 세포, 예를 들어, 암 세포의 아폽토시스를 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상 증가시키는 이펙터, 예를 들어, miRNA, 예를 들어, miR-625를 포함한다.
VI. 생성 방법
유전 요소의 생성
아넬로좀의 유전 요소의 제조 방법은 예를 들어, 문헌[Khudyakov & Fields, Artificial DNA: Methods and Applications, CRC Press (2002)]; 문헌[Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications, (First Edition), Academic Press (2013)]; 및 문헌[Egli & Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (First Edition), Wiley-VCH (2012)]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 컴퓨터-보조 설계 도구를 사용하여 설계될 수 있다. 아넬로좀은 합성하기에 더욱 용이한 더 작은 중첩하는 조각(예를 들어, 약 100 bp 내지 약 10 kb 범위의 세그먼트, 또는 개별 ORF)으로 나뉠 수 있다. 이들 DNA 세그먼트는 하나의 세트의 중첩하는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드로부터 합성된다. 그 후 생성되는 중첩 신톤(synthon)은 더 큰 조각의 DNA, 예를 들어, 아넬로좀으로 어셈블된다. 세그먼트 또는 ORF는 아넬로좀, 예를 들어, 5' 및 3' 말단에서 시험관 내 재조합 또는 특유한 제한 부위 내로 어셈블되어, 라이게이션을 가능하게 할 수 있다.
유전 요소는 대안적으로 아넬로좀을 올리고-길이 단편으로 분석하는 설계 알고리즘으로 합성하여, 서열 공간의 복잡성을 고려하는 합성을 위한 최적의 설계 조건을 생성할 수 있다. 이어서 올리고는 반도체-기반의 고밀도 칩 상에서 화학적으로 합성되며, 칩마다 200,000개 초과의 개별 올리고가 합성된다. 올리고를 어셈블리 기법, 예를 들어, BioFab®으로 어셈블하여, 더 작은 올리고로부터 더 긴 DNA 세그먼트를 구축한다. 이것은 병렬 방식으로 행해지며, 그래서 수백 내지 수천개의 합성 DNA 세그먼트가 한번에 구축된다.
각각의 유전 요소 또는 유전 요소의 세그먼트는 서열이 입증될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 또는 DNA의 고-처리량 서열결정은 AnyDot.칩(제노복스(Genovoxx), 독일)을 사용하여 일어날 수 있으며, 이는 생물학적 과정(예를 들어, miRNA 발현 또는 대립형질 가변성(SNP 검출))의 모니터링을 가능하게 한다. 특히, AnyDot-칩은 뉴클레오티드 형광 신호 검출의 10x 내지 50x 향상을 가능하게 한다. AnyDot.칩 및 이들의 이용 방법은 부분적으로 국제 공개 출원 WO 02088382호, WO 03020968호, WO 0303 1947호, WO 2005044836호, PCTEP 05105657호, PCMEP 05105655호; 및 독일 특허 출원 DE 101 49 786호, DE 102 14 395호, DE 103 56 837호, DE 10 2004 009 704호, DE 10 2004 025 696호, DE 10 2004 025 746호, DE 10 2004 025 694호, DE 10 2004 025 695호, DE 10 2004 025 744호, DE 10 2004 025 745호 및 DE 10 2005 012 301호에 기재되어 있다.
다른 고-처리량 서열결정 시스템은 문헌[Venter, J., et al. Science 16 Feb. 2001]; 문헌[Adams, M. et al, Science 24 Mar. 2000]; 및 문헌[M. J, Levene, et al. Science 299:682-686, January 2003]; 및 미국 공개 출원 제20030044781호 및 제2006/0078937호에 개시된 것들을 포함한다. 전체적으로 이러한 시스템은 핵산 분자에서 측정되는 중합 반응을 통해 염기를 일시적으로 첨가함으로써 복수의 염기를 갖는 표적 핵산 분자를 서열결정하는 것을 포함하며, 즉, 서열결정될 주형 핵산 분자 상의 핵산 중합 효소의 활성이 실시간으로 추적된다. 이어서, 염기 첨가의 서열에서 각 단계에서 핵산 중합 효소의 촉매 활성에 의해 표적 핵산의 성장하는 상보성 가닥 내로 어떤 염기가 혼입되는 지를 확인함으로써 서열을 추론할 수 있다. 표적 핵산 분자 복합체 상의 중합효소는 표적 핵산 분자를 따라 이동하고 활성 부위에서 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장시키기에 적합한 위치에서 제공된다. 복수의 표지된 유형의 뉴클레오티드 유사체가 활성 부위에 근접하여 제공되며, 각각의 구별 가능한 유형의 뉴클레오티드 유사체는 표적 핵산 서열에서 상이한 뉴클레오티드에 상보성이다. 성장하는 핵산 가닥은 중합효소를 사용하여 활성 부위에서 핵산 가닥에 뉴클레오티드 유사체를 부가함으로써 연장되며, 여기서 첨가되는 뉴클레오티드 유사체는 활성 부위에서의 표적 핵산의 뉴클레오티드에 상보성이다. 중합 단계의 결과로서 올리고뉴클레오티드 프라이머에 부가된 뉴클레오티드 유사체가 확인된다. 표지된 뉴클레오티드 유사체를 제공하고, 성장하는 핵산 가닥을 중합하고, 부가된 뉴클레오티드 유사체를 확인하는 단계를 반복하여, 핵산 가닥이 추가로 연장되고 표적 핵산의 서열이 결정되게 한다.
일부 실시형태에서, 샷건(shotgun) 서열결정이 수행된다. 샷건 서열결정에서, DNA는 수많은 작은 세그먼트로 무작위로 분해되며, 이를 사슬 종결 방법을 사용하여 서열결정하여, 판독물(read)을 수득한다. 표적 DNA에 대한 다수의 중첩 판독물은 수회차의 이러한 단편화 및 서열결정을 수행함으로써 수득된다. 이어서, 컴퓨터 프로그램은 상이한 판독물의 중첩 말단을 이용하여, 그들을 연속 서열로 어셈블시킨다.
일부 실시형태에서, 복제 또는 패키징을 위한 인자는 유전 요소에 비하여 시스로 또는 트랜스로 공급될 수 있다. 예를 들어, 유전 요소는 시스로 공급되는 경우, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복제 및/또는 패키징 신호는 예를 들어, 증폭 및/또는 캡슐화를 유도하기 위하여 유전 요소 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이것은 둘 모두 (예를 들어, 이펙터를 게놈 내의 특정 부위 내로 삽입하거나, 바이러스 ORF를 이펙터로 대체하여) 아넬로좀 게놈의 더 큰 영역의 맥락에서 행해진다.
또 다른 예에서, 유전 요소는 트랜스로 공급되는 경우, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로바이러스 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자가 결여될 수 있으며; 이 단백질 또는 단백질들은 예를 들어, 또 다른 핵산, 예를 들어, 헬퍼 핵산에 의해 공급될 수 있다. 일부 실시형태에서, 최소 시스 신호(예를 들어, 5' UTR 및/또는 GC-풍부 영역)가 유전 요소 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 복제 또는 패키징 인자(예를 들어, 복제효소 및/또는 캡시드 단백질)를 인코딩하지 않는다. 이러한 인자는 일부 실시형태에서, 하나 이상의 헬퍼 핵산(예를 들어, 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 헬퍼 바이러스 핵산, 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 핵산)에 의해 공급될 수 있다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 핵산은 증폭 및/또는 패키징을 유도하기에 충분한 단백질 및/또는 RNA를 발현하지만, 그들 자체의 패키징 신호가 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 및 헬퍼 핵산은 (예를 들어, 동시에 또는 개별적으로) 숙주 세포 내로 도입되어, 유전 요소의 증폭 및/또는 패키징을 초래하지만, 헬퍼 핵산의 증폭 및/또는 패키징을 초래하지 않는다.
시험관 내 환화
일부 예에서, 단백질성 외부 내로 패키징될 유전 요소는 단일 가닥 환형 DNA이다. 유전 요소는 일부 예에서, 단일 가닥 환형 DNA 이외의 형태로 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 유전 요소는 이중-가닥 환형 DNA로서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이어서, 이중-가닥 환형 DNA는 숙주 세포(예를 들어, 회전환 복제에 적합한 효소, 예를 들어, 아넬로바이러스 Rep 단백질, 예를 들어, 열거된 효소에 관하여 본원에 참조로 포함되는 문헌[Wawrzyniak et al. 2017, Front. Microbiol. 8: 2353]에 기재된 바와 같은 Rep68/78, Rep60, RepA, RepB, Pre, MobM, TraX, TrwC, Mob02281, Mob02282, NikB, ORF50240, NikK, TecH, OrfJ 또는 TraI을 포함하는 숙주 세포)에서 단일-가닥 환형 DNA로 전환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 환형 DNA는 예를 들어, 실시예 35에 기재된 바와 같이, 시험관 내 환화에 의해 생성된다. 일반적으로, 시험관 내 환화된 DNA 구축물은 패키징될 유전 요소의 서열을 포함하는 플라스미드를 유전 요소 서열이 선형 DNA 분자로서 절개되도록 분해함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 생성된 선형 DNA를 예를 들어, DNA 리가제를 사용하여 라이게이션하여, 이중-가닥 환형 DNA를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 시험관 내 환화에 의해 생성되는 이중-가닥 환형 DNA는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 회전환 복제를 겪을 수 있다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 시험관 내 환화가 추가의 변형 없이 회전환 복제를 겪을 수 있는 이중-가닥 DNA 구축물을 초래함으로써, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 아넬로좀 내로 패키징되기에 적합한 크기의 단일-가닥 환형 DNA를 생성할 수 있는 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 DNA 구축물은 플라스미드(예를 들어, 박테리아 플라스미드)보다 더 작다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 DNA 구축물은 플라스미드(예를 들어, 박테리아 플라스미드)로부터 절제된 다음, 예를 들어, 시험관 내 환화에 의해 환화된다.
아넬로좀의 생성
본원에 기재된 바와 같이 제조된 유전 요소 및 유전 요소를 포함하는 벡터는 적절한 숙주 세포에서 아넬로좀을 발현시키기 위하여 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 및 유전 요소를 포함하는 벡터를 적절한 숙주 세포에서 트랜스펙션시키고, 생성되는 RNA는 아넬로좀 유전자 생성물, 예를 들어, 비-병원성 단백질 및 단백질 결합 서열의 발현을 높은 수준으로 유도할 수 있다. 높은 수준의 발현을 제공하는 숙주 세포 시스템은 바이러스 기능을 제공하는 연속 세포주, 예컨대 각각 APV 또는 MPV로 중복감염된 세포주, APV 또는 MPV 기능을 보완하도록 엔지니어링되는 세포주 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 실시예 1, 2, 5, 6 또는 15 내지 17 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 생성된다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 시험관 내에서 연속 동물 세포주에서 배양된다. 본 발명의 일 실시형태에 따라, 세포주는 돼지 세포주를 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 예상되는 세포주는 불멸화된 돼지 세포주, 예컨대 비제한적으로 돼지 신장 상피 세포주 PK-15 및 SK, 단일골수성(monomyeloid) 세포주 3D4/31 및 정소 세포주 ST를 포함한다. 또한, 다른 포유동물 세포주, 예컨대 CHO 세포(중국 햄스터 난소), MARC-145, MDBK, RK-13, EEL이 포함된다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 방법의 특정 실시형태는 상피 세포주, 즉, 상피 계통의 세포의 세포주인 동물 세포주를 이용한다. 아넬로좀을 이용한 감염에 감수성인 세포주는 인간 또는 영장류 기원의 세포주, 예컨대 인간 또는 영장류 신장 암종 세포주를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소 및 유전 요소를 포함하는 벡터를 바이러스 중합효소 단백질을 발현하는 세포주 내로 트랜스펙션시켜, 아넬로좀의 발현을 달성한다. 이를 위하여, 아넬로좀 중합효소 단백질을 발현하는 형질전환된 세포주는 적절한 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 숙주 세포는 다른 바이러스 기능 또는 추가의 기능을 제공하도록 유사하게 엔지니어링될 수 있다.
본원에 개시된 아넬로좀을 제조하기 위하여, 본원에 개시된 유전 요소 또는 유전 요소를 포함하는 벡터를 사용하여, 세포를 트랜스펙션시켜, 복제 및 생성에 필요한 아넬로좀 단백질 및 기능을 제공할 수 있다. 대안적으로, 세포를 본원에 개시된 유전 요소 또는 유전 요소를 포함하는 벡터에 의한 트랜스펙션 이전에, 그 동안에 또는 그 이후에 헬퍼 바이러스로 트랜스펙션시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 바이러스는 불완전한 바이러스 입자의 생성을 보완하는 데 유용할 수 있다. 헬퍼 바이러스는 조건적 성장 결함, 예컨대 숙주 범위 제한 또는 온도 민감성을 가질 수 있으며, 이는 트랜스펙션 바이러스의 이후의 선택을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 바이러스는 아넬로좀의 발현을 달성하기 위하여 숙주 세포에 의해 사용되는 하나 이상의 복제 단백질을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 바이러스 단백질, 예컨대 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 바이러스는 항바이러스 감수성을 포함한다.
본원에 개시된 유전 요소 또는 유전 요소를 포함하는 벡터는 예를 들어, 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제4,650,764호; 미국 특허 제5,166,057호; 미국 특허 제5,854,037호; 유럽 특허 공개 제EP 0702085A1호; 미국 특허 출원 제09/152,845호; 국제 특허 공개 PCT WO97/12032호; WO96/34625호; 유럽 특허 공개 EP-A780475호; WO 99/02657호; WO 98/53078호; WO 98/02530호; WO 99/15672호; WO 98/13501호; WO 97/06270호; 및 EPO 780 47SA1호에 기재된 바와 같이, 해당 분야에 알려져 있는 임의의 수의 기법에 의해 아넬로좀 입자로 복제되고 생성될 수 있다.
본 발명에 따른 아넬로좀-함유 세포 배양물의 생성은 상이한 규모로, 예컨대 플라스크, 롤러 보틀(roller bottle) 또는 생물반응기에서 수행될 수 있다. 감염될 세포의 배양을 위해 사용되는 배지는 당업자에게 알려져 있으며, 일반적으로 세포 생존성에 필요한 표준 영양물질을 포함할 수 있으며, 또한 세포 유형에 따라 추가의 영양물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 배지는 단백질-부재 및/또는 혈청-부재일 수 있다. 세포 유형에 따라, 세포는 현탁액 중에서 또는 기판 상에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 성장을 위하여, 그리고 아넬로좀의 생성을 위하여 상이한 배지가 사용된다.
아넬로좀의 정제 및 단리는 바이러스 생성에서 당업자에게 알려져 있는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Rinaldi, et al., DNA Vaccines: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), 3rd ed. 2014, Humana Press]에 기재되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀의 시험관 내 복제 및 증식을 위한 방법을 포함하며, 이는 하기의 단계를 포함할 수 있다: (a) 선형화된 유전 요소를 아넬로좀 감염에 감수성인 세포주 내로 트랜스펙션시키는 단계; (b) 세포를 수집하고, 유전 요소의 존재를 나타내는 세포를 단리하는 단계; (c) 단계 (b)에서 수득되는 세포를 실험 조건 및 유전자 발현에 따라, 적어도 3일, 예컨대 적어도 1주 이상 동안 배양하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 세포를 수집하는 단계.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 높은 세포 밀도로 성장된 숙주 세포주로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 약제학적 부형제를 사용한 제형화 이전에, 생물물리학적 특성에 기초한 용질의 분리, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 또는 접선 유동 여과에 의해 수집되고/수집되거나 정제될 수 있다.
VII. 투여/운반
조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀을 포함하는 약제학적 조성물)은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질, 예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 활성 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균 및/또는 발열원-부재일 수 있다. 약제의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려사항은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005](본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
본원에 제공되는 약제학적 조성물의 설명이 주로 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 임의의 다른 동물로의, 예를 들어, 비-인간 동물, 예를 들어, 비-인간 포유동물로의 투여에 적합하다는 것을 당업자라면 이해할 것이다. 조성물이 다양한 동물로의 투여에 적합하게 만들기 위해 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물을 변형하는 것이 충분히 이해되며, 숙련된 수의학 약리학자는 존재한다면, 단지 일상적인 실험을 사용하여 이러한 변형을 설계하고/설계하거나 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 기타 영장류; 포유동물, 예컨대 상업적으로 관련된 포유동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 랫트; 및/또는 조류, 예컨대 상업적으로 관련된 조류, 예컨대 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 알려져 있거나, 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분이 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합되게 한 다음, 필요하면 그리고/또는 바람직하면, 생성물을 나누고/나누거나, 성형하고/성형하거나 패키징하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체로 아넬로좀을 운반하는 방법을 특징으로 한다. 당해 방법은 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여된 아넬로좀은 대상체에서 복제한다(예를 들어, 대상체의 바이러스체의 일부가 된다).
약제학적 조성물은 야생형 또는 고유 바이러스 요소 및/또는 변형된 바이러스 요소를 포함할 수 있다. 아넬로좀은 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5 또는 1 내지 18 중 어느 하나의 서열(예를 들어, 핵산 서열 또는 그의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 서열 또는 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5 또는 1 내지 18 중 어느 하나의 서열에 상보성인 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 아넬로좀은 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 41 중 어느 하나의 서열의 하나 이상에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 아넬로좀은 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 아넬로좀은 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 아넬로좀은 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 41 중 어느 하나의 서열 또는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 서열 또는 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 41 중 어느 하나의 서열에 상보성인 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 내인성 유전자 및 단백질 발현을 기준, 예를 들어, 건강한 대조군에 비하여 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 증가(자극)시키기에 충분하다. 특정 실시형태에서, 아넬로좀은 내인성 유전자 및 단백질 발현을 기준, 예를 들어, 건강한 대조군에 비하여 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 감소(저해)시키기에 충분하다.
일부 실시형태에서, 아넬로좀은 숙주 또는 숙주 세포에서 하나 이상의 바이러스 특성, 예를 들어, 향성, 감염성, 면역억제/활성화를 기준, 예를 들어, 건강한 대조군에 비하여 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 저해/향상시킨다.
일부 실시형태에서, 바이러스 유전 정보에서 표현되지 않는 하나 이상의 바이러스 주를 추가로 포함하는 약제학적 조성물이 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아넬로좀을 포함하는 약제학적 조성물은 바이러스 감염을 조절하기에 충분한 용량 및 시간으로 투여된다. 바이러스 감염의 일부 비제한적인 예는 아데노-연관 바이러스, 아이치(Aichi) 바이러스, 호주 박쥐 리사 바이러스(lyssavirus), BK 폴리오마바이러스(polyomavirus), 반나 바이러스(Banna virus), 바르마 포레스트(Barmah forest) 바이러스, 부니아무에라(Bunyamwera) 바이러스, 부니아바이러스 라 크로세(Bunyavirus La Crosse), 부니아바이러스 스노우슈 하레(Bunyavirus snowshoe hare), 세르코피테신 헤르페스바이러스(Cercopithecine herpesvirus), 찬디푸라 바이러스(Chandipura virus), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 코사바이러스(Cosavirus) A, 우두 바이러스, 콕사키바이러스(Coxsackievirus), 크리민-콩고 출혈성 열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 뎅기(Dengue) 바이러스, 도리(Dhori) 바이러스, 더그비(Dugbe) 바이러스, 두벤하게(Duvenhage) 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 에볼라바이러스, 에코바이러스(Echovirus), 뇌심근염(Encephalomyocarditis) 바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 유럽 박쥐 리사바이러스, GB 바이러스 C/G형 간염 바이러스, 한탄(Hantaan) 바이러스, 헨드라(Hendra) 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 간염 델타 바이러스, 마두 바이러스, 인간 아데노바이러스, 인간 아스트로바이러스, 인간 코로나바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 엔테로바이러스 68, 인간 엔테로바이러스 70, 인간 헤르페스바이러스 1, 인간 헤르페스바이러스 2, 인간 헤르페스바이러스 6, 인간 헤르페스바이러스 7, 인간 헤르페스바이러스 8, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 파필로마바이러스 1, 인간 파필로마바이러스 2, 인간 파필로마바이러스 16, 인간 파필로마바이러스 18, 인간 파라인플루엔자, 인간 파보바이러스 B19, 인간 호흡기 융합 바이러스, 인간 리노바이러스, 인간 SARS 코로나바이러스, 인간 스푸마레트로바이러스(spumaretrovirus), 인간 T-림포트로픽 바이러스, 인간 토로바이러스(torovirus), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 이스파한(Isfahan) 바이러스, JC 폴리오마바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 주닌 아레나바이러스(Junin arenavirus), KI 폴리오마바이러스, 쿤진(Kunjin) 바이러스, 라고스(Lagos) 박쥐 바이러스, 레이크 빅토리아 마르부르그바이러스(Lake Victoria marburgvirus), 란가트(Langat) 바이러스, 라사(Lassa) 바이러스, 로즈데일(Lordsdale) 바이러스, 라우핑 일(Louping ill) 바이러스, 림프구 맥락수막염 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 마이아로(Mayaro) 바이러스, MERS 코로나바이러스, 홍역 바이러스, 멘고(Mengo) 뇌심근염 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마바이러스(Merkel cell polyomavirus), 모콜라(Mokola) 바이러스, 전염성 연속종 바이러스, 원두 바이러스, 볼거리 바이러스, 무레이 밸리(Murray valley) 뇌염 바이러스, 뉴욕 바이러스, 니파(Nipah) 바이러스, 노르워크(Norwalk) 바이러스, 오뇽-뇽(O'nyong-nyong) 바이러스, 올프(Orf) 바이러스, 오로퓨스(Oropouche) 바이러스, 피친데(Pichinde) 바이러스, 폴리오바이러스, 푼타 토로 플레보바이러스(Punta toro phlebovirus), 푸말라(Puumala) 바이러스, 광견병 바이러스, 리프트계곡열 바이러스, 로사바이러스(Rosavirus) A, 로스 강(Ross river) 바이러스, 로타바이러스 A, 로타바이러스 B, 로타바이러스 C, 풍진 바이러스, 사기야마(Sagiyama) 바이러스, 살리바이러스(Salivirus) A, 모래파리 열 시실리안(Sandfly fever sicilian) 바이러스, 삿포로(Sapporo) 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스, 서울(Seoul) 바이러스, 유인원 포미(Simian foamy) 바이러스, 유인원 바이러스 5, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 사우샘프턴(Southampton) 바이러스, 세인트 루이스 뇌염(St. louis encephalitis) 바이러스, 틱-본 포와산(Tick-borne powassan) 바이러스, 토르크 테노 바이러스, 토스카나(Toscana) 바이러스, 우우쿠니에미(Uukuniemi) 바이러스, 백시니아 바이러스, 바리셀라-조스터(Varicella-zoster) 바이러스, 바리올라(Variola) 바이러스, 베네주엘란(Venezuelan) 말 뇌염 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, WU 폴리오마바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 야바(Yaba) 원숭이 종양 바이러스, 야바-유사 질병 바이러스, 황열 바이러스 및 지카 바이러스를 포함한다. 특정 실시형태에서, 아넬로좀은 대상체에 이미 존재하는 바이러스를 예를 들어, 기준에 비하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 능가하고/능가하거나 대체하기에 충분하다. 특정 실시형태에서, 아넬로좀은 만성 또는 급성 바이러스 감염과 경쟁하기에 충분하다. 특정 실시형태에서, 아넬로좀은 바이러스 감염으로부터 보호하기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 바이러스전(provirotic)). 일부 실시형태에서, 아넬로좀은 (예를 들어, 표현형, 바이러스 수준, 유전자 발현, 다른 바이러스와의 경쟁, 병태 등을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상) 조절하기에 충분한 양으로 존재한다.
본원에 언급된 모든 참고문헌 및 간행물은 본원에 참조로 포함된다.
하기의 실시예는 본 발명의 일부 실시형태를 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범주를 제한하고자 하지 않으며; 당업자에게 알려져 있는 다른 절차, 방법 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있다는 것이 그들의 예시적인 성질에 의해 이해될 것이다.
실시예
목차
실시예 1: 아넬로좀의 제조: 인터페론(IFN) 발현을 저해하는 합성 아넬로좀의 설계 및 합성
실시예 2: 아넬로좀(아넬로좀 A 및/또는 B)의 대규모 생성: 아넬로좀의 생성 및 증량
실시예 3: 시험관 내에서의 아넬로좀(아넬로좀 A)의 영향: 세포 감염 후의 아넬로좀의 발현 및 이펙터 기능, 예를 들어, miRNA의 발현의 시험관 내 평가
실시예 4: 아넬로좀(아넬로좀 A)의 면역학적 효과: 투여 이후 아넬로좀의 생체 내 이펙터 기능, 예를 들어, miRNA의 발현
실시예 5: 합성 아넬로좀의 제조: 합성 아넬로좀의 시험관 내 생성
실시예 6: 아넬로좀의 어셈블리 및 감염: 실시예 5에 기재된 바와 같은 합성 DNA 서열을 사용한 감염성 아넬로좀의 시험관 내 생성
실시예 7: 아넬로좀의 선택성: 시험관 내에서 생성되는 합성 아넬로좀은 다양한 조직 기원의 세포주를 감염시킨다
실시예 8: 단백질 결합 서열의 확인 및 이용: 아넬로바이러스 게놈 내의 추정 단백질-결합 부위
실시예 9: 아넬로바이러스 게놈
실시예 10: 아넬로바이러스 게놈 내로의 다양한 길이의 뉴클레오티드 삽입: 아넬로바이러스 게놈 내로의 다양한 길이의 DNA 서열의 부가
실시예 11: 운반할 예시적인 카고: 아넬로좀 내의 예시적인 핵산 및 단백질 페이로드의 부류
실시예 12: 예시적인 페이로드 통합 유전자좌
실시예 13: 아넬로바이러스 및 그의 보존된 영역의 정의된 범주
실시예 14: 복제-결핍 아넬로좀 및 헬퍼 바이러스
실시예 15: 복제-적격 아넬로좀의 제조 과정
실시예 16: 복제-결핍 아넬로좀의 제조 과정: 복제-결핍 아넬로좀의 회수 및 생성 규모 확대
실시예 17: 현탁 세포를 사용한 아넬로좀의 생성: 현탁액 중 세포 내의 아넬로좀의 생성
실시예 18: qPCR에 의한 아넬로좀 게놈 당량의 정량화: 아넬로좀을 정량화하기 위한 가수분해 프로브-기반의 정량적 PCR 검정의 개발
실시예 19: 마우스에서 외인성 단백질을 발현하기 위한 아넬로좀의 이용: 생체 내에서 기능적 모델 단백질을 발현하기 위한 아넬로좀의 이용
실시예 20: 아넬로좀 DNA가 숙주 게놈 내에 통합되는지 여부를 결정하기 위한 게놈 정렬
실시예 21: 숙주 게놈 내로의 아넬로좀 통합의 평가
실시예 22: 외인성 마이크로RNA 서열을 발현하는 아넬로좀의 기능적 효과: 기능적 핵산 이펙터를 발현하기 위한 아넬로좀의 이용
실시예 23: 외인성 비-코딩 RNA를 발현하기 위한 아넬로좀의 제조 및 생성: 외인성 소형 비-코딩 RNA를 발현하기 위한 아넬로좀의 이용
실시예 24: 아넬로바이러스 클레이드에서의 보존: 알파토르크바이러스 속 내의 7개의 클레이드의 확인
실시예 25: 아넬로좀으로부터 내인성 miRNA의 발현 및 내인성 miRNA의 결실
실시예 26: 아넬로바이러스 ORF의 국소화
실시예 27: 아넬로좀 개발에 필요한 영역의 특성화
실시예 28: 생체 내에서의 외인성 단백질의 아넬로좀 운반: 본 실시예는 투여 후의 아넬로좀의 생체 내 이펙터 기능(예를 들어, 단백질의 발현)을 보여준다.
실시예 29: 아넬로바이러스에서의 전구체 miRNA(pre-mIR)의 확인: 다양한 아넬로바이러스에 의해 인코딩되는 신규한 전구체 miRNA를 확인하기 위한 컴퓨터 기반 및 실험적 접근법
실시예 30: 아넬로바이러스 pre-miR의 내인성 표적의 결정: 다양한 아넬로바이러스의 주에 의해 인코딩되는 pre-miR의 내인성 표적 및 잠재적으로 치료적으로 관련이 있는 표적 경로를 결정하기 위한 분석
실시예 31: 고유 아넬로바이러스 pre-miR를 인코딩하는 아넬로좀의 제조: 고유 아넬로바이러스 pre-miR를 발현하는 아넬로좀의 복제 또는 비-복제 형태 중 어느 하나를 패키징하기 위한 과정
실시예 32: 시험관 내 세포 배양 모델에서의 아넬로바이러스 pre-miR 종양 억제제의 이용: 예를 들어, 실시예 29에 기재된 바와 같은, 분석으로부터 종양 억제제로서 확인된 후보 pre-miR의 표현형 영향
실시예 33: 생체 내에서 종양 억제제로서의 아넬로바이러스 pre-miR의 이용: 실시예 32에 기재된 바와 같은, 시험관 내 분석으로부터 암 세포주 및 종양 억제성 아넬로바이러스 pre-miR의 종양 억제 효과를 확인하기 위한 생체 내 실험
실시예 34: 아넬로바이러스 게놈의 탠덤 카피
실시예 35: 시험관 내 환화된 아넬로바이러스 게놈: 최소 비-바이러스 DNA와 함께, 환형, 이중 가닥 아넬로바이러스 게놈 DNA를 포함하는 구축물
실시예 36: ORF1의 모델링 및 보존된 잔기 및 도메인의 확인: 베타토르크바이러스의 ORF1 단백질의 모델링 및 추정 도메인 정의
실시예 37: 상이한 토르크 테노 바이러스 주로부터의 초가변 도메인을 갖는 키메라 ORF1을 함유하는 아넬로좀의 생성
실시예 38: 초가변 도메인 대신에 비-TTV 단백질/펩티드를 함유하는 키메라 ORF1의 생성
실시예 39: DNA 페이로드를 갖는 아넬로좀의 설계
실시예 40: 아넬로좀-인코딩 항체 전이유전자의 형질도입
실시예 41: tth8 및 LY2에 기초한 아넬로좀은 각각 EPO 유전자를 폐암 세포 내에 성공적으로 형질도입시켰다
실시예 42: 치료적 전이유전자를 갖는 아넬로좀은 정맥내(i.v.) 투여 후에 생체 내에서 검출될 수 있다
실시예 43: 아넬로바이러스 내의 코딩 서열 크기 분포
실시예 44: ORF2를 특성화하기 위한 고도로 보존된 모티프
실시예 45: 인간 내의 전장 아넬로바이러스 ORF1 mRNA에 대한 증거
실시예 46: 시험관 내에서 아넬로좀을 생성하기 위한 투입 물질로서 시험관 내 환화된 게놈
실시예 47: 아넬로바이러스 ORF1 내의 보존된 2차 구조 모티프의 확인
실시예 1: 아넬로좀의 제조
본 실시예에는 인터페론(IFN) 발현을 저해하는 합성 아넬로좀의 설계 및 합성이 기재되어 있다.
아넬로좀(아넬로좀 A)은 1) 비-병원성 패키징 봉입물을 인코딩하는 캡시드 유전자에 대한 DNA 서열(문헌[Arch Virol (2007) 152: 1961-1975]), 수탁 번호: A7XCE8.1(ORF11_TTW3); 2) 숙주 유전자(예를 들어, IFN)를 표적화하는 마이크로RNA를 코딩하는 DNA 서열(문헌[PLOS Pathogen (2013), 9(12), e1003818]), 수탁 번호: AJ620231.1; 및 3) 캡시드 단백질 내의 특정 영역(예를 들어, 수탁 번호: Q99153.1을 갖는 캡시드의 특정 영역)에 결합하는 DNA 서열(문헌[Journal of Virology (2003), 77(24), 13036-13041])로 시작하여 설계된다.
이러한 서열에, 1 kb의 비-코딩 DNA 서열을 부가한다(아넬로좀 B). 설계된 아넬로좀(도 2)은 3 kb(전체 크기)로 화학적으로 합성되고, 이를 서열 확인한다.
아넬로좀 서열을 제조처에 의해 권고되는 바와 같이 JetPEI 시약(폴리플러스(PolyPlus)-트랜스펙션, 프랑스 일키르히 소재)을 사용하여 인간 배아 신장 293T 세포(12-웰 플레이트 상에서 105개 세포당 1 ㎎) 내로 트랜스펙션시킨다. 단독의 벡터, 또는 JetPEI 단독으로 트랜스펙션된 세포를 사용한 대조군 트랜스펙션을 포함시키고, GFP를 인코딩하는 리포터 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션 효율을 최적화시킨다. 대조군 트랜스펙션의 형광을 측정하여, 적절하게 트랜스펙션된 세포를 보장한다. 트랜스펙션된 배양물을 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 하룻밤 인큐베이션시킨다.
18시간 후에, 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 신선한 배지를 첨가한다. 상청액을 하기와 같은 아넬로좀의 초원심분리 및 수거를 위해 수집한다. 배지를 30분 동안 4,000 x g에 이어서 15분 동안 8,000 x g에서의 원심분리에 의하여 투명하게 하여, 세포 및 세포 데브리스를 제거한다. 그 다음, 상청액을 0.45-㎛-포어-크기 필터를 통해 여과한다. 아넬로좀을 5% 수크로스 쿠션(5 ㎖)을 통해 27,000 rpm에서 1시간 동안 펠렛화시키고, 1x 인산염-완충 염수(PBS) + 0.1% 바시트라신(bacitracin) 중에 원래의 부피의 1/100으로 재현탁화시킨다. 농축된 아넬로좀을 24,000 rpm에서 2시간 동안 20 내지 35% 수크로스 단계 기울기를 통해 원심분리한다. 기울기 연결층에서의 아넬로좀 밴드를 수집한다. 그 다음, 아넬로좀을 1x PBS로 희석하고, 27,000 rpm에서 1시간 동안 펠렛화시킨다. 아넬로좀 펠렛을 1x PBS 중에 재현탁화시키고, 20 내지 35% 연속 수크로스 기울기를 통해 추가로 정제한다.
실시예 2: 아넬로좀(아넬로좀 A 및/또는 B)의 대규모 생성
본 실시예에는 아넬로좀의 생성 및 증식이 기재된다.
실시예 1에 기재된 바와 같은 정제된 아넬로좀을 현탁액 중에 성장하는 생성자 A549 세포가 있는 스피너(spinner) 플라스크에서 대규모 증폭을 위해 제조한다. A549 세포를 F12K 배지, 10% 우태아혈청, 2 mM 글루타민 및 항생제에서 유지한다. A549 세포를 106개의 아넬로좀 로드에서 아넬로좀으로 감염시켜, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안의 인큐베이션 후에 약 1x107개의 아넬로좀 입자를 생성한다. 그 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 신선한 배지와 함께 6시간 동안 인큐베이션시킨다.
아넬로좀 정제를 위하여, 염화세슘 기울기에 기초한 2개의 초원심분리 단계에 이어서 하기와 같은 투석을 수행하였다(문헌[Bio-Protocol (2012) Bio101: e201]). 세포를 원심분리(10분 동안 6000 x g)에 의해 제거하고, 상청액을 0.8에 이어서 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한다. 여액을 필터 막(100,000 mw)을 통과시킴으로써 8 ㎖의 부피로 농축시킨다. 잔류물을 황산세슘 용액 내로 로딩하고, 247,000 x g에서 20시간 동안 원심분리한다. 아넬로좀 밴드를 제거하고, 14,000 mw 컷오프 투석 튜빙에 배치하고, 투석한다. 추가의 농축이 요망된다면, 수행될 수 있다.
실시예 3: 시험관 내에서의 아넬로좀(아넬로좀 A)의 영향
본 실시예에는 세포 감염 후의 아넬로좀의 발현 및 이펙터 기능, 예를 들어, miRNA의 발현의 시험관 내 평가가 기재된다.
실시예 1에 기재된 바와 같은 정제된 아넬로좀의 영향은 내인성 유전자 조절(예를 들어, IFN 신호전달)을 통해 시험관 내에서 평가한다. HEK293T 세포를 이중 루시퍼라제 플라스미드(인터페론-자극된 반응 요소(ISRE) 기반의 프로모터를 갖는 반딧불이 루시퍼라제 및 구성적 프로모터를 갖는 트랜스펙션 대조군 레닐라 루시퍼라제): 루시퍼라제 리포터 믹스(1:4 비의 pcDNA3.1dsRluc 대 pISRE-Luc(클론테크(Clonetech)))(문헌[J Virol (2008), 82: 9823-9828])로 동시-트랜스펙션시킨다.
아넬로좀을 6-웰 플레이트에 씨딩된 HEK293T 세포에 대하여 107의 감염 다중도로 투여한다(2개의 세트의 3벌-3개의 대조군 웰 및 아넬로좀 A가 있는 3개의 실험 웰).
48시간 후에, 배지를 100 u/㎖의 범용 I형 인터페론(PBL, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)이 존재하거나 부재하는 새로운 배지로 교체한다. IFN 처리 16시간 후에, 이중-루시퍼라제 검정(문헌[J Virol (2008), 82: 9823-9828])을 수행하여, IFN 신호전달을 결정한다. 트랜스펙션 차이에 대하여 관리하기 위하여 반딧불이 루시퍼라제를 레닐라 루시퍼라제 발현에 대하여 정규화시킨다. 비교 가능한 실험 웰을 대조군 웰로 나누어, ISRE ffLuc 리포터의 배수 유도를 계산하고, 각 조건의 유도를 음성 대조군에 비하여 비교한다.
일 실시형태에서, 대조군에 비하여 아넬로좀 처리군에서의 감소된 루시퍼라제 신호는 아넬로좀이 세포에서 IFN 생성을 감소시키는 것을 나타낼 것이다.
실시예 4: 아넬로좀(아넬로좀 A)의 면역학적 효과
본 실시예에는 투여 후의 아넬로좀의 생체 내 이펙터 기능, 예를 들어, miRNA의 발현이 기재되어 있다.
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 제조된, 정제된 아넬로좀을 킬로그램당 1014의 게놈 당량에서 시작하여, 킬로그램당 0의 게놈 당량까지 100배 희석을 사용하여 다양한 용량으로 건강한 돼지에게 정맥내 투여한다. 면역 관용에 대한 영향을 평가하기 위하여, 돼지에게 상기 특정된 투여량의 아넬로좀 또는 비히클 대조군 PBS를 3일 동안 매일 주사하고, 3일 후에 희생시킨다.
비장, 골수 및 림프절을 수집한다. 단일 세포 현탁액을 각각의 조직으로부터 제조하고, MHC-II, CD11c 및 세포내 IFN에 대한 세포외 마커로 염색한다. MHC+, CD11c+, IFN+ 항원 제시 세포를 각각의 조직으로부터 유세포분석을 통해 분석하며, 예를 들어, 상기 언급된 마커 중 주어진 하나에 대하여 양성인 세포는, 마커의 발현이 결여되지만 다르게는 세포의 검정 집단과 유사한 음성 대조군 집단에서 동일한 조건 하에서 세포의 99%보다 더 높은 형광을 나타내는 세포이다.
일 실시형태에서, 대조군에 비하여 아넬로좀 처리군에서의 감소된 수의 IFN+ 세포는 아넬로좀이 투여 후에 세포에서 IFN 생성을 감소시키는 것을 나타낼 것이다.
실시예 5: 합성 아넬로좀의 제조.
본 실시예에는 합성 아넬로좀의 시험관 내 생성이 입증되어 있다.
EcoRV 제한 효소 부위 사이의 TTMiniV의 LY1 및 LY2 주로부터의 DNA 서열(문헌[Eur Respir J. 2013 Aug;42(2):470-9])을 카나마이신 벡터(인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies)) 내로 클로닝하였다. TTMiniV의 LY1 및 LY2 주로부터의 DNA 서열을 포함하는 아넬로좀은 실시예 6 및 7, 및 도 6a 내지 도 10b에 각각 아넬로좀 1(아넬로 1) 및 아넬로좀 2(아넬로 2)로 지칭된다. 클로닝된 구축물을 10-베타 컴피턴트 에스케리키아 콜라이(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs Inc.)) 내로 형질전환시킨 후, 제조처의 프로토콜에 따라 플라스미드 정제(퀴아젠(Qiagen))하였다.
DNA 구축물(도 3 및 도 4)을 37℃에서 6시간 동안 EcoRV 제한 분해(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)로 선형화시켜, TTMiniV 게놈을 함유하고, 박테리아 백본 요소(예컨대, 복제 원점 및 선택 가능한 마커)를 배제한 이중-가닥 선형 DNA 단편을 제공하였다. 이에 이어서, 아가로스 겔 전기영동, TTMiniV 게놈 단편(2.9 킬로베이스 쌍)에 대한 정확한 크기의 DNA 밴드의 절제 및 제조업체의 프로토콜에 따른 겔 추출 키트(퀴아젠)를 사용한 절제된 아가로스 밴드로부터의 DNA의 겔 정제를 행하였다.
실시예 6: 아넬로좀의 어셈블리 및 감염
본 실시예에서는 실시예 5에 기재된 바와 같은 합성 DNA 서열을 사용한 감염성 아넬로좀의 성공적인 시험관 내 생성이 입증된다.
이중-가닥 선형화된 겔-정제된 아넬로바이러스 게놈 DNA(실시예 5에서 수득됨)를 지질 트랜스펙션 시약(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))을 사용하여, 온전한 플라스미드에서 또는 선형화된 형태에서, HEK293T 세포(인간 배아 신장 세포주) 또는 A549 세포(인간 폐 암종 세포주) 중 어느 하나로 트랜스펙션시켰다. T25 플라스크 내의 70% 컨플루언트 세포의 트랜스펙션을 위하여 6 ㎍의 플라스미드 또는 1.5 ㎍의 선형화된 아넬로바이러스 게놈 DNA를 사용하였다. 아넬로좀에 포함된 바이러스 서열이 결여된 빈 벡터 백본을 음성 대조군으로서 사용하였다. 트랜스펙션 후 6시간에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 신선한 성장 배지에서 성장하게 하였다. 인간 Ef1alpha 프로모터에 이어서 YFP 유전자를 인코딩하는 DNA 서열을 IDT로부터 합성하였다. 이러한 DNA 서열을 클로닝 벡터(써모 피셔 사이언티픽) 내로 블런트 말단 라이게이션시켰다. 생성된 벡터를 트랜스펙션 효율을 평가하기 위한 대조군으로서 사용하였다. YFP를 트랜스펙션 72시간 후에 세포 영상화 시스템(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 검출하였다. HEK293T 및 A549 세포의 트랜스펙션 효율은 각각 85% 및 40%로 계산되었다(도 5).
아넬로좀으로 트랜스펙션된 293T 및 A549 세포의 상청액을 트랜스펙션 후 96시간에 수집하였다. 수집된 상청액을 2000 rpm에서 4℃에서 10분 동안 회전 침강시켜, 임의의 세포 데브리스를 제거하였다. 수집된 상청액의 각각을 사용하여 24 웰 플레이트 내의 웰에서 70% 컨플루언트인 새로운 293T 및 A549 세포를 각각 감염시켰다. 37℃ 및 5% 이산화탄소에서의 24시간의 인큐베이션 후에 상청액을 세척해낸 후, 2회의 PBS의 세척 및 신선한 성장 배지로 대체를 행하였다. 이들 세포를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 또 다시 48시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 게놈 DNA 추출을 위하여 세포를 개별적으로 수집하였다. 각각의 시료로부터의 게놈 DNA를 제조처의 프로토콜에 따라 게놈 DNA 추출 키트(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 수집하였다.
시험관 내 생성된 아넬로좀에 의한 293T 및 A549 세포의 성공적인 감염을 확인하기 위하여, 본원에 기재된 바와 같이 수집된 100 ng의 게놈 DNA를 사용하여, LY2 특이적 서열 또는 베타-토르크바이러스에 대하여 특이적인 프라이머를 사용한 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 수행하였다. 제조처의 프로토콜에 따라 SYBR 그린 시약(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 qPCR을 수행하였다. GAPDH의 게놈 DNA 서열에 대하여 특이적인 프라이머에 대한 qPCR을 정규화를 위해 사용하였다. 사용되는 모든 프라이머에 대한 서열은 표 42에 열거되어 있다.
[표 42]
Figure pct00164
도 6a, 도 6b, 도 7a 및 도 7b에 도시된 qPCR 결과에 나타난 바와 같이, 시험관 내에서 그리고 본 실시예에 기재된 바와 같이 생성된 아넬로좀은 감염성이었다.
실시예 7: 아넬로좀의 선택성
본 실시예에서는 시험관 내에서 생성된 합성 아넬로좀이 다양한 조직 기원의 세포주를 감염시키는 능력이 입증된다.
감염성 TTMiniV 아넬로좀(실시예 5에 기재됨)을 갖는 상청액을 24 웰 플레이트의 웰 내에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 70% 컨플루언트 293T, A549, Jurkat(급성 T 세포 백혈병 세포주), Raji(버킷 림프종 B 세포주) 및 Chang 세포주와 인큐베이션시켰다. 세포를 감염 24시간 후에 PBS로 2회 세척한 후, 신선한 성장 배지로 교체하였다. 그 다음, 세포를 다시 또 다른 48시간 동안 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션시킨 후, 게놈 DNA 추출을 위한 수집을 행하였다. 각각의 시료로부터의 게놈 DNA를 제조처의 프로토콜에 따라 게놈 DNA 추출 키트(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 수집하였다.
이전의 실시예에서 생성된 아넬로좀에 의한 이들 세포주의 성공적인 감염을 확인하기 위하여, 본원에 기재된 바와 같이 수집된 100 ng의 게놈 DNA를 사용하여, LY2 특이적 서열 또는 베타-토르크바이러스에 대하여 특이적인 프라이머를 사용한 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 수행하였다. 제조처의 프로토콜에 따라 SYBR 그린 시약(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 qPCR을 수행하였다. GAPDH의 게놈 DNA 서열에 대하여 특이적인 프라이머에 대한 qPCR을 정규화를 위해 사용하였다. 사용되는 모든 프라이머에 대한 서열은 표 42에 열거되어 있다.
도 6a 내지 도 10b에 도시된 qPCR 결과에 나타나 있는 바와 같이, 시험관 내에서 생성되는 아넬로좀은 감염성일 뿐만 아니라, 그들은 상피 세포, 폐 조직 세포, 간 세포, 암종 세포, 림프구, 림프모구, T 세포, B 세포 및 신장 세포의 예들을 비롯한 다양한 세포주를 감염시킬 수 있었다. 또한, 합성 아넬로좀이 HepG2 세포(간 세포주)를 감염시켜, 대조군에 비하여 100배 초과의 증가를 초래할 수 있는 것이 관찰되었다.
실시예 8: 단백질 결합 서열의 확인 및 이용
본 실시예에는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 아넬로좀에서의 이펙터의 증폭 및 패키징에 사용될 수 있는 아넬로바이러스 게놈 내의 추정 단백질-결합 부위가 기재되어 있다. 일부 예에서, 단백질-결합 부위는 외부 단백질, 예컨대 캡시드 단백질에 결합할 수 있다.
아넬로바이러스 게놈 내의 2개의 보존된 도메인은 추정된 복제 원점이다: 5' UTR 보존된 도메인(5CD) 및 GC-풍부 도메인(GCR)(문헌[de Villiers et al., Journal of Virology 2011]; 문헌[Okamoto et al., Virology 1999]). 일 예에서, 이들 서열이 DNA 복제 부위로서 작용하는지, 캡시드 패키징 신호로서 작용하는지를 확인하기 위하여, TTMV-LY2를 지니는 플라스미드에서 각 영역의 결실을 만들었다. A539 세포를 pTTMV-LY2Δ5CD 또는 pTTMV-LY2ΔGCR로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션된 세포를 4일 동안 인큐베이션시킨 다음, 바이러스를 상청액 및 세포 펠렛으로부터 단리한다. A549 세포를 바이러스로 감염시키고, 4일 후에, 바이러스를 상청액 및 감염된 세포 펠렛으로부터 단리한다. qPCR을 수행하여, 시료로부터 바이러스 게놈을 정량화시킨다. 복제 원점의 파괴는 바이러스 복제효소가 바이러스 DNA를 복제하는 것을 방지하고, 야생형 바이러스에 비하여 트랜스펙션된 세포 펠렛으로부터 단리된 바이러스 게놈을 감소시킨다. 소량의 바이러스가 여전히 패키징되며, 트랜스펙션된 상청액 및 감염된 세포 펠렛에서 관찰될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패키징 신호의 파괴는 바이러스 DNA가 캡시드 단백질에 의해 캡슐화되는 것을 방지한다. 따라서, 실시형태들에서, 트랜스펙션된 세포에서 바이러스 게놈의 증폭이 여전히 존재할 것이지만, 상청액 또는 감염된 세포 펠렛에서 바이러스 게놈이 관찰되지 않는다.
추가의 예에서, DNA 내의 추가의 복제 또는 패키징 신호를 특성화하기 위하여, 전체 TTMV-LY2 게놈에 걸쳐 일련의 결실을 사용한다. 서열의 길이를 따라 100bp의 결실을 단계적으로 만들었다. TTMV-LY2 결실을 지니는 플라스미드를 A549 내로 트랜스펙션시키고, 상기 기재된 바와 같이 시험한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 증폭 또는 패키징을 파괴시키는 결실은 잠재적인 시스-조절 도메인을 함유할 것이다.
복제 및 패키징 신호를 (예를 들어, 아넬로좀 내의 유전 요소 내의) 이펙터-인코딩 DNA 서열 내로 혼입하여, 증폭 및 캡슐화를 유도할 수 있다. 이것은 더 큰 아넬로좀 게놈의 영역(즉, 게놈 내의 특정 부위 내로 이펙터를 삽입하거나, 바이러스 ORF를 이펙터로 대체하는 등)의 맥락에서 또는 최소 시스 신호를 이펙터 DNA 내로 혼입시킴으로써 행해진다. 아넬로좀이 트랜스 복제 또는 패키징 인자(예를 들어, 복제효소 및 캡시드 단백질 등)가 결여된 경우에, 트랜스 인자는 헬퍼 유전자에 의해 공급된다. 헬퍼 유전자는 증폭 및 패키징을 유도하기에 충분한 단백질 및 RNA의 전부를 발현하지만, 그들 자체의 패키징 신호가 결여되어 있다. 아넬로좀 DNA를 헬퍼 유전자와 동시-트랜스펙션시켜, 이펙터의 증폭 및 패키징을 초래하지만, 헬퍼 유전자의 증폭 및 패키징은 초래하지 않는다.
실시예 9: 아넬로바이러스 게놈
본 실시예에는 아넬로바이러스 게놈 내의 결실이 기재되어 있다.
ORF의 하류, 그러나 GC-풍부 영역의 상류에서, TTV-tth8의 비-코딩 영역(NCR)에 172-뉴클레오티드(nt) 결실을 만들었다(nt 3436 내지 3607). 무작위 56-nt 서열(TTTGTGACACAAGATGGCCGACTTCCTTCCTCTTTAGTCTTCCCCAAAGAAGACAA(SEQ ID NO: 696))을 상기 결실 내로 삽입하였다. pTTV-tth8(3436-3707::56nt), 변경된 TTV-tth8을 갖는 DNA 플라스미드를 생성하였다. 2 ㎍의 이중-가닥 환형 플라스미드 또는 이중-가닥 SmaI 선형화된 DNA(박테리아 백본 요소로부터 분리된 TTV-tth8 게놈 단편 제공)를 2벌로, 리포펙타민 2000을 사용하여 6 cm 플레이트 내에 60% 컨플루언시의 HEK293 또는 A549 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 바이러스를 트랜스펙션 96시간 후에 액체 질소와 37℃ 수조 사이를 3회 교대하는 동결 해동에 의해 세포 펠렛 및 상청액으로부터 단리하였다. 상청액으로부터의 바이러스를 사용하여, 세포(HEK293으로부터 단리된 바이러스에 의해 감염되는 HEK293 세포, 및 A549로부터 단리된 바이러스에 의해 감염되는 A549 세포)를 재감염시켰다. 감염 72시간 후에, 바이러스를 동결 해동에 의해 세포 펠렛 및 상청액으로부터 단리하였다. 모든 시료에서 qPCR을 수행하였다. 하기 표 43에 나타낸 바와 같이, TTV-tth8이 감염된 세포의 세포 펠렛 및 상청액 둘 모두에서 관찰되었으며, 이는 pTTV-tth8(3436-3707::56nt)에 의한 성공적인 바이러스 생성을 나타낸다. 따라서, TTV-tth8은 뉴클레오티드 3436 내지 3707의 결실을 용인할 수 있다.
[표 43] HEK293 및 A549에서의 TTV-tth8(3436-3707::56nt) 감염은 바이러스 증폭을 초래한다. 플라스미드 또는 바이러스를 첨가하지 않은 음성 대조군 세포에 비한 2벌 실험으로부터의 평균 게놈 당량.
Figure pct00165
뉴클레오티드 574 내지 1371 및 1432 내지 2210(1577 bp 결실)을 결실시키고, ORF1의 C-말단에(야생형 TTMV-LY2에서 nt 2609 후에) 513 bp NanoLuc(nLuc) 리포터 ORF를 삽입하여, 엔지니어링된 버전의 TTMV-LY2를 어셈블시켰다. 엔지니어링된 TTMV-LY2에 대한 DNA 서열을 지니는 플라스미드(pVL46-015B)를 A549 세포 내로 트랜스펙션시킨 다음, 바이러스를 단리하고, 실시예 17에 기재된 바와 같이 새로운 A549 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. nLuc 발광을 감염된 세포의 세포 펠렛 및 상청액에서 검출하였으며, 이는 바이러스 복제를 나타낸다(도 11a 및 도 11b). 이는 TTMV-LY2가 ORF 영역 내의 적어도 1577 bp 결실을 용인할 수 있음을 나타낸다.
바이러스 게놈을 추가로 특성화하기 위하여, TTMV-LY2 DNA 내에 일련의 결실을 만든다. 뉴클레오티드 574 내지 1371 및 1432 내지 2210의 결실을 갖고, nLuc 삽입을 갖지 않는 TTMV-LY2를 만들고, 이전에 기재된 바와 같이 바이러스 복제에 대하여 시험한다. TTMV-LY2Δ574-1371,Δ1432-2210에 대하여 추가의 결실을 만든다. 뉴클레오티드 1372 내지 1431을 결실시켜, TTMV-LY2Δ574-2210을 생성한다. 추가로, ORF1의 하류 ORF3 서열을 결실시킨다(Δ2610-2809). 마지막으로, 비-코딩 영역 내의 결실을 시험하기 위하여, NCR에 걸쳐 순차적으로 일련의 100 bp 결실을 만들었다. 모든 결실 돌연변이체를 이전에 기재된 바와 같이 바이러스 복제에 대하여 시험한다. 성공적인 바이러스 생성을 초래하는 결실(결실된 영역이 바이러스 복제에 필수가 아님을 나타냄)을 조합하여, 더 많이 결실된 뉴클레오티드를 갖는 TTMV-LY2의 변이체를 제조한다. 헬퍼를 사용하여 증폭될 수 있는 바이러스 게놈을 확인하기 위하여, 바이러스 복제가 파괴된 결실 돌연변이체의 각각을 트랜스 복제 및 패키징 요소를 지니는 헬퍼 유전자와 함께 시험한다. 복제 요소의 트랜스 발현에 의해 구제되는 결실은, 헬퍼 유전자가 개별 공급원으로부터 제공되는 경우 바이러스 형성의 차단 없이 결실될 수 있는 바이러스 게놈의 영역을 나타낸다.
실시예 10: 아넬로바이러스 게놈 내로의 다양한 길이의 뉴클레오티드 삽입
본 실시예에는 아넬로바이러스 게놈 내로의 다양한 길이의 DNA 서열의 삽입이 기재되어 있으며, 이는 일부 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
DNA 서열을 TTV-tth8(유전자은행(GenBank) 수탁 번호 AJ620231.1) 및 TTMV-LY2(유전자은행 수탁 번호 JX134045.1)를 지니는 플라스미드 내로 클로닝한다. 오픈 리딩 프레임의 3' 및 GC-풍부 영역의 5' 비코딩 영역(NCR): TTV-tth8 내의 뉴클레오티드 3588 또는 TTMV-LY2 내의 뉴클레오티드 2843 이후에 삽입을 만든다.
하기의 길이의 무작위화된 DNA 서열을 TTV-tth8 및 TTMV-LY2의 NCR 내로 삽입한다: 100개 염기쌍(bp), 200 bp, 500 bp, 1000 bp 및 2000 bp. 각각의 바이러스 게놈의 상대적 GC-함량과 일치하도록 이들 서열을 설계한다: TTV-tth8 내로의 삽입을 위하여 대략 50% GC 및 TTMV-LY2에 대하여 대략 38% GC. 또한, 몇몇의 트랜스 유전자를 NCR 내로 삽입한다. 이들은 U6 프로모터(351 bp)에 의해 유도되는 miRNA(예를 들어, FF4 miRNA) 및 구성적 hEF1a 프로모터(2509 bp)에 의해 유도되는 EGFP를 포함한다.
다양한 크기의 DNA 삽입물을 지니는 TTV-tth8 및 TTMV-LY2 변이체를 이전에 기재된 바와 같이, HEK293 및 A549를 포함하는 포유동물 세포주 내로 트랜스펙션시킨다. 바이러스를 상청액 또는 세포 펠렛으로부터 단리한다. 단리된 바이러스를 사용하여 추가의 세포를 감염시킨다. 감염된 세포로부터의 바이러스의 생성을 정량적 PCR에 의해 모니터링한다. 일부 실시형태에서, 바이러스의 성공적인 생성은 삽입의 관용성을 나타낼 것이다.
실시예 11: 운반될 예시적인 카고
본 실시예에는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 아넬로좀, 예를 들어, 아넬로바이러스에 기초한 아넬로좀으로 운반될 수 있는 예시적인 부류의 핵산 및 단백질 페이로드가 기재된다.
페이로드의 일 예는 단백질 발현을 위한 mRNA이다. 관심 코딩 서열은 공급원 바이러스(예를 들어, 아넬로바이러스)에 고유한 바이러스 프로모터로부터 또는 트랜스 유전자의 일부로서 페이로드와 함께 도입된 프로모터로부터 전사된다. 대안적으로, mRNA는 바이러스 mRNA의 오픈 리딩 프레임 내에 인코딩되어, 바이러스 단백질과 관심 단백질 간의 융합을 초래한다. 절단 도메인, 예를 들어, 2A 펩티드 또는 프로테이나제 표적 부위를 사용하여 요망되는 경우 바이러스 단백질로부터 관심 단백질을 분리할 수 있다.
비-코딩 RNA(ncRNA)는 페이로드의 또 다른 예이다. 이들 RNA는 일반적으로 RNA 중합효소 III 프로모터, 예컨대 U6 또는 VA를 사용하여 전사된다. 대안적으로, ncRNA는 RNA 중합효소 II, 예컨대 고유 바이러스 프로모터 또는 조절 가능한 합성 프로모터를 사용하여 전사된다. RNA 중합효소 II 프로모터로부터 발현되는 경우, ncRNA는 mRNA 엑손, 인트론의 부분으로서 또는 폴리-A 신호의 하류에서 전사되는 가외의 RNA로서 인코딩된다. ncRNA는 종종 더 큰 RNA 분자의 부분으로서 인코딩되거나 리보자임 또는 엔도리보뉴클레아제를 사용하여 떨어져 절단된다. 아넬로좀의 게놈에서 카고로서 인코딩될 수 있는 ncRNA는 마이크로-RNA(miRNA), 작은-간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 안티센스 RNA, miRNA 스폰지(sponge), 긴-비코딩 RNA(lncRNA) 및 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다.
DNA는 RNA 전사를 필요로 하지 않고, 기능적 요소로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA는 상동성 재조합을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 단백질-결합 DNA 서열을 사용하여 (예를 들어, 아넬로좀의 단백질성 외부에서) 캡시드 내로의 관심 단백질의 패키징을 유도할 수 있다. 상동성 재조합을 위하여, 인간 게놈 DNA에 대한 상동성 영역을 상동성 아암으로서 작용하도록 벡터 DNA 내로 인코딩한다. 재조합은 표적화된 엔도뉴클레아제(예컨대 gRNA와 함께 Cas9 또는 아연-핑거 뉴클레아제)에 의해 유도될 수 있으며, 이는 벡터로부터 또는 개별 공급원으로부터 발현될 수 있다. 세포 내측에서, 단일-가닥 DNA 게놈은 이중-가닥 DNA로 전환되며, 이는 이어서 게놈 DNA 파단 부위에서 상동성 재조합을 위한 주형으로서 작용한다. 관심 단백질을 동원하기 위하여, 단백질-결합 서열이 아넬로좀 DNA에 인코딩될 수 있다. 관심 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 단백질(예컨대 Gal4)에 융합되는 관심 단백질은 아넬로좀 DNA에 결합한다. 아넬로좀 DNA가 캡시드 단백질에 의해 캡슐화되는 경우, DNA-결합 단백질도 또한 캡슐화되며, 아넬로좀과 함께 세포에 운반될 수 있다.
실시예 12: 예시적인 페이로드 통합 유전자좌
본 실시예에는 핵산 페이로드가 삽입될 수 있는 TTV-tth8(유전자은행 수탁 번호 AJ620231.1) 및 TTMV-LY2(유전자은행 수탁 번호 JX134045)의 게놈 내의 예시적인 유전자좌가 기재된다.
TTV-tth8(뉴클레오티드 336 내지 3015) 및 TTMV-LY2(뉴클레오티드 424 내지 2812)의 오픈 리딩 프레임(ORF) 영역 내로의 삽입을 위하여 몇몇의 전략이 사용될 수 있다. 일 예에서, 바이러스 단백질을 태그화시키거나, 융합 단백질을 생성하기 위하여, 페이로드가 특정 관심 ORF 내에 프레임 내 삽입된다. 대안적으로, ORF 영역의 일부 또는 전부가 결실되며, 이는 바이러스 단백질 기능을 파괴하거나, 파괴하지 않을 수 있다. 이어서, 페이로드는 결실된 영역 내로 삽입된다. 추가로, TTV-tth8(뉴클레오티드 716 내지 2362) 또는 TTMV-LY2(뉴클레오티드 724 내지 2273)의 ORF1 내의 초-가변 도메인(HVD)이 삽입 부위로서 사용될 수 있다. 일부 예에서, HVD 내의 삽입 또는 뉴클레오티드 대체는 더욱 용인될 수 있고/있거나 바이러스 기능을 더 낮은 정도로 파괴할 수 있다.
대안적으로, TTV-tth8 또는 TTMV-LY2의 비-코딩 영역(NCR)과 유사한 벡터의 영역 내로 페이로드 삽입을 만든다. 특히, TATA 박스의 상류 5' NCR 내, 5' 비번역 영역(UTR) 내, 폴리-A 신호의 하류 및 GC-풍부 영역의 상류 3' NCR 내에 삽입을 만든다. 추가로, TTV-tth8의 miRNA 영역(뉴클레오티드 3429 내지 3506) 내로 삽입을 만든다. 5' NCR 영역을 위하여, TATA 박스의 상류(TTV-tth8 내의 뉴클레오티드 1 내지 82, 및 TTMV-LY2 내의 뉴클레오티드 1 내지 236)에 삽입을 만든다. 일부 실시형태에서, 트랜스 유전자를 역 배향으로 삽입하여, 프로모터 간섭을 감소시킨다. 5' UTR에 있어서, 전사 시작 부위(TTV-tth8 내의 뉴클레오티드 111, 및 TTMV-LY2 내의 뉴클레오티드 267)의 하류 및 ORF2 시작 코돈(TTV-tth8 내의 뉴클레오티드 336 및 TTMV-LY2 내의 뉴클레오티드 421)의 상류에 삽입을 만든다. 5' UTR 삽입은 5' UTR 내에 뉴클레오티드를 부가하거나 대체한다. 3' NCR 삽입은 실시예 10에 기재된 바와 같이 GC-풍부 영역의 상류에서, 특히, TTV-tth8 내의 뉴클레오티드 3588 또는 TTMV-LY2 내의 뉴클레오티드 2843 이후에서 이루어진다. TTV-tth8의 miRNA는 대안적인 천연 또는 합성 miRNA 헤어핀에 의해 대체된다.
실시예 13: 아넬로바이러스의 정의된 범주 및 그의 보존된 영역
3가지 속의 아넬로바이러스가 인간에 존재한다: 알파토르크바이러스(토르크 테노 바이러스, TTV), 베타토르크바이러스(토르크 테노 미디 바이러스, TTMDV) 및 감마토르크바이러스(토르크 테노 미니 바이러스, TTMV). 알파토르크바이러스는 적어도 5개(예를 들어, 7개)의 널리-뒷받침되는 계통발생 클레이드를 포함한다(도 11c). 이들 아넬로바이러스 중 임의의 것이 본원에 기재된 아넬로좀을 생성하기 위한 공급원 바이러스(예를 들어, 바이러스 DNA 서열의 공급원)로서 사용될 수 있는 것이 고려된다.
이들 서열 중 특히, 5' UTR 도메인(약 75% 보존) 및 GC-풍부 도메인(100개 초과의 염기쌍, 70% 초과의 GC-함량, 약 70% 보존)에서 가장 높은 보존이 관찰된다. 추가로, 서열 내의 초가변 도메인(HVD)은 매우 낮은 보존(약 30% 보존)을 갖는다. 모든 아넬로바이러스는 또한 3개의 리딩 프레임 모두가 개방된 영역을 함유한다. 일부 예에서, 5' UTR 또는 GC-풍부 영역은 복제 원점으로서 기능할 수 있다.
또한, 보존된 영역으로 주석이 달린 TTV 클레이드의, 및 TTMDV 및 TTMV의 각각으로부터의 대표적인 바이러스의 예시적인 서열이 본원에 제공된다(예를 들어, 표 A1 내지 A12, B1 내지 B5, C1 내지 C5 또는 1 내지 18 참조).
실시예 14: 복제-결핍 아넬로좀 및 헬퍼 바이러스
아넬로좀의 복제 및 패키징을 위하여, 일부 요소가 트랜스로 제공될 수 있다. 이들은 DNA 복제 또는 패키징을 유도하거나 지원하는 단백질 또는 비-코딩 RNA를 포함한다. 트랜스 요소는 일부 예에서, 아넬로좀에 대한 대안적인 공급원, 예컨대 헬퍼 바이러스, 플라스미드 또는 세포 게놈으로부터 제공될 수 있다.
다른 요소는 전형적으로 시스로 제공된다. 이들 요소는 예를 들어, 복제 원점(예를 들어, 아넬로좀 DNA의 증폭을 가능하게 함) 또는 패키징 신호(예를 들어, 캡시드 내로 게놈을 로딩하기 위하여 단백질에 결합함)로서 작용하는 아넬로좀 DNA 내의 서열 또는 구조일 수 있다. 일반적으로, 복제 결핍 바이러스 또는 아넬로좀은 이들 요소 중 하나 이상을 소실하여, 심지어 다른 요소가 트랜스로 제공될지라도, DNA가 감염성 비리온 또는 아넬로좀으로 패키징될 수 없게 할 것이다.
복제 결핍 바이러스는 예를 들어, 동일한 세포에서 아넬로좀(예를 들어, 복제-결핍 또는 패키징-결핍 아넬로좀)의 복제를 제어하기 위한 헬퍼 바이러스로서 유용할 수 있다. 일부 예에서, 헬퍼 바이러스는 시스 복제 또는 패키징 요소가 결여되지만, 트랜스 요소, 예컨대 단백질 및 비-코딩 RNA를 발현할 것이다. 일반적으로, 치료적 아넬로좀은 이들 트랜스 요소의 일부 또는 전부가 결여될 것이며, 이에 따라, 그의 자체가 복제할 수 없을 것이지만, 시스 요소를 보유할 것이다. 세포 내로 동시-트랜스펙션/감염되는 경우, 복제-결핍 헬퍼 바이러스는 아넬로좀의 증폭 및 패키징을 유도할 것이다. 이에 따라, 수집된, 패키징된 입자는 헬퍼 바이러스 오염 없이, 단지 치료적 아넬로좀만으로 구성될 것이다.
복제 결핍 아넬로좀을 개발하기 위하여, 아넬로바이러스의 비-코딩 영역 내의 보존된 요소를 제거할 것이다. 특히, 보존된 5' UTR 도메인 및 GC-풍부 도메인의 결실을 개별적으로, 그리고 함께 시험할 것이다. 두 요소는 모두 바이러스 복제 또는 패키징에 중요한 것으로 고려된다. 또한, 전체 비-코딩 영역에 걸쳐 일련의 결실을 수행하여, 이전에 공지되지 않은 관심 영역을 확인할 것이다.
복제 요소의 성공적인 결실은 예를 들어, qPCR에 의해 측정시, 세포 내에서 아넬로좀 DNA 증폭의 감소를 초래할 것이지만, 예를 들어, qPCR, 웨스턴 블롯, 형광 검정 또는 발광 검정 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있는 감염된 세포에서의 검정에 의해 모니터링시, 일부 감염성 아넬로좀 생성을 뒷받침할 것이다. 패키징 요소의 성공적인 결실은 아넬로좀 DNA 증폭을 파괴하지 않을 것이며, 그래서, qPCR에 의해 트랜스펙션된 세포에서 아넬로좀 DNA의 증가가 관찰될 것이다. 그러나, 아넬로좀 게놈은 캡슐화되지 않을 것이며, 그래서 감염성 아넬로좀 생성이 관찰되지 않을 것이다.
실시예 15: 복제-적격 아넬로좀의 제조 과정
본 실시예에는 복제-적격 아넬로좀의 회수 및 이의 생성의 대량화 방법이 기재되어 있다. 아넬로좀은 그들의 게놈 내에 세포에서 복제하는 데 필요한, 모든 요구되는 유전 요소 및 ORF를 인코딩하는 경우에 복제 적격하다. 이들 아넬로좀은 그들의 복제에 결함이 없기 때문에, 트랜스로 제공되는 보완 활성을 필요로 하지 않는다. 그러나, 그들은 헬퍼 활성, 예컨대 전사의 인핸서(예를 들어, 부티르산나트륨) 또는 바이러스 전사 인자(예를 들어, 아데노바이러스 E1, E2 E4, VA; HSV Vp16 및 즉시 조기 단백질)를 필요로 할 것이다.
이러한 실시예에서, 선형 또는 환형 형태로 합성 아넬로좀의 완전한 서열을 인코딩하는 이중-가닥 DNA는 화학적 트랜스펙션에 의해 T75 플라스크 내의 5E+05개의 부착 포유동물 세포 내로 또는 전기천공법에 의해 현탁액 중 5E+05개의 세포 내로 도입된다. 최적의 기간 후에(예를 들어, 트랜스펙션 3 내지 7일 후에), 세포를 상청액 배지 내로 스크랩핑하여, 세포 및 상청액을 수집한다. 연성 세제, 예를 들어, 담즙염을 0.5%의 최종 농도로 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 칼슘 및 마그네슘 클로라이드를 각각 0.5 mM 및 2.5 mM의 최종 농도로 첨가한다. 엔도뉴클레아제(예를 들어, DNAse I, 벤조나제)를 첨가하고, 25 내지 37℃에서 0.5 내지 4시간 동안 인큐베이션시킨다. 아넬로좀 현탁액을 1000 x g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리한다. 투명해진 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 동결보호 완충액(안정화 완충액으로도 공지되어 있음)으로 1:1 희석하고, 요망되는 경우 -80℃에 보관한다. 이는 아넬로좀의 계대 0(P0)을 생성한다. 세제의 농도를 배양된 세포에서 사용될 안전한 한계 미만이 되게 하기 위하여, 이러한 접종물을 아넬로좀 역가에 따라 무혈청 배지(SFM)에 적어도 100배 이상 희석한다.
T225 플라스크 내의 신선한 단층의 포유동물 세포에 배양물 표면을 덮기에 충분한 최소 부피를 오버레이하고, 부드럽게 로킹(rocking)시키면서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 90분 동안 인큐베이션시킨다. 이러한 단계를 위해 사용되는 포유동물 세포는 P0 회수를 위해 사용된 것과 동일한 유형의 세포이거나, 그렇지 않을 수 있다. 이러한 인큐베이션 후에, 접종물을 40 ㎖의 무혈청, 동물 기원-부재의 배양 배지로 대체하였다. 세포를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 3 내지 7일 동안 인큐베이션시킨다. 이전에 사용된 동일한 연성 세제 10X 용액 4 ㎖을 첨가하여, 0.5%의 최종 세제 농도를 달성한 다음, 혼합물을 부드럽게 교반하면서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 엔도뉴클레아제를 첨가하고, 25 내지 37℃에서 0.5 내지 4시간 동안 인큐베이션시킨다. 그 다음, 배지를 수집하고, 1000 x g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리한다. 투명해진 상청액을 40 ㎖의 안정화 완충제와 혼합하고, -80℃에서 보관한다. 이는 씨드 스톡을 또는 아넬로좀의 계대 1(P1)을 생성한다.
스톡의 역가에 따라, 그를 SFM 중에 100배 이상 희석하고, 필요한 크기의 다층 플라스크 상에서 성장한 세포에 첨가한다. 더 작은 규모에서 감염 다중도(MOI) 및 인큐베이션 시간을 최적화시켜, 최대 아넬로좀 생성을 보장한다. 그 다음, 수집 후에, 아넬로좀을 필요한 대로 정제하고 농축시킬 수 있다. 예를 들어, 본 실시예에 기재된 바와 같은 작업흐름을 보여주는 개략도는 도 12에 제공되어 있다.
실시예 16: 복제-결핍 아넬로좀의 제조 과정
본 실시예에는 복제-결핍 아넬로좀의 회수 및 이의 생성의 대량화 방법이 기재되어 있다.
아넬로좀은 복제에 수반되는 하나 이상의 ORF(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 및/또는 ORF2t/3)의 결실에 의해 복제-결핍이 될 수 있다. 복제-결핍 아넬로좀은 보완하는 세포주에서 성장할 수 있다. 이러한 세포주는 본질적으로 아넬로좀 성장을 촉진시키지만, 아넬로좀의 게놈에서 소실되거나 비작용성인 구성성분을 발현한다.
일 예에서, 아넬로좀 증량에 수반되는 임의의 ORF(들)의 서열(들)을, 선택 마커를 인코딩하는 안정한 세포주의 생성에 적합한 렌티바이러스 발현 시스템 내로 클로닝하고, 렌티바이러스 벡터를 본원에 기재된 바와 같이 생성한다. 아넬로좀 증량을 지원할 수 있는 포유동물 세포주를 이러한 렌티바이러스 벡터로 감염시키고, 클로닝된 ORF가 안정적으로 통합된 세포 집단을 선택하는 선택 마커(예를 들어, 푸로마이신 또는 임의의 다른 항생제)에 의해 선택압으로 처리한다. 이러한 세포주가 특성화되고, 엔지니어링된 아넬로좀에서 결함을 보완하고, 이에 따라 이러한 아넬로좀의 성장 및 증식을 지원하는 것으로 증명되면, 그것을 증량시키고, 저온 보관에 저장한다. 이들 세포의 증량 및 유지 동안, 선택 항생제를 배양 배지에 첨가하여 선택압을 유지한다. 아넬로좀이 이들 세포 내로 도입되면, 선택 항생제를 보류할 수 있다.
일단 이러한 세포주가 확립되면, 복제-결핍 아넬로좀의 성장 및 생성을 예를 들어, 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행한다.
실시예 17: 현탁 세포를 사용한 아넬로좀의 생성
본 실시예에는 현탁액 중의 세포에서의 아넬로좀의 생성이 기재되어 있다.
본 실시예에서, 현탁액 조건에서 성장하는 것으로 조정된 A549 또는 293T 생성자 세포주를 웨이브(WAVE) 생물반응기 백에서, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 동물 성분-부재 및 항생제-부재 현탁액 배지(써모 피셔 사이언티픽) 중에 성장시킨다. 1 x 106개의 생존 가능한 세포/㎖로 씨딩한 이들 세포를 현재의 우수 제조 기준(cGMP) 하에 리포펙타민 2000(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여, (예를 들어, 실시예 16에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 복제-결핍 아넬로좀의 경우에) 아넬로좀을 패키징하는 데 적합하거나 필요한 임의의 보완 플라스미드와 함께 아넬로좀 서열을 포함하는 플라스미드로 트랜스펙션시킨다. 보완 플라스미드는 일부 예에서 아넬로좀 게놈(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 바이러스 게놈, 예를 들어, 아넬로바이러스 게놈에 기초한 아넬로좀 게놈)으로부터 결실되지만, 아넬로좀의 복제 및 패키징에 유용하거나 필요한 바이러스 단백질을 인코딩할 수 있다. 트랜스펙션된 세포를 웨이브 생물반응기 백에서 성장시키고, 상청액을 하기의 시점에 수집한다: 트랜스펙션 48, 72 및 96시간 후. 상청액을 원심분리를 사용하여 각 시료에 대한 세포 펠렛으로부터 분리한다. 이어서, 패키징된 아넬로좀 입자를 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수집된 상청액 및 용해된 세포 펠렛으로부터 정제한다.
아넬로좀의 정제된 제제에서 게놈 당량을 예를 들어, 실시예 18에 기재된 바와 같이, 바이러스 게놈 추출 키트(퀴아젠)에 이어서, 아넬로좀 DNA 서열에 대하여 표적화된 프라이머 및 프로브를 사용한 qPCR을 사용하여 아넬로좀 게놈을 수집하기 위하여, 작은 정제된 제제의 분취액을 사용함으로써 결정할 수 있다.
정제된 제제의 연속 희석물을 제조하여, 새로운 A549 세포를 감염시킴으로써 정제된 제제 내의 아넬로좀의 감염성을 정량화할 수 있다. 이들 세포를 트랜스펙션 72시간 후에 수집한 후에, 아넬로좀 DNA 서열에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 게놈 DNA에서 qPCR 검정을 행하였다.
실시예 18: qPCR에 의한 아넬로좀 게놈 당량의 정량화
본 실시예에는 아넬로좀을 정량화하기 위한 가수분해 프로브-기반의 정량적 PCR 검정의 개발이 입증되어 있다. 프라이머 및 프로브의 세트를 최종 사용자 최적화와 함께 소프트웨어 지니어스(Geneious)를 사용하여 TTV(수탁 번호 AJ620231.1) 및 TTMV(수탁 번호 JX134045.1)의 선택된 게놈 서열에 기초하여 설계하였다. 프라이머 서열은 하기 표 44에 나타나 있다.
[표 44] 정량적 PCR에 의해 TTMV 및 TTV 게놈 등가물을 정량화하기 위해 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머 및 가수분해 프로브의 서열
Figure pct00166
개발 과정의 제1 단계로서, SYBR-그린 화학물질을 갖는 TTV 및 TTMV 프라이머를 사용하여 qPCR을 시행하여, 프라이머 특이성에 대하여 점검한다. 도 13은 각각의 프라이머 쌍에 대한 하나의 별개의 증폭 피크를 보여준다.
5' 말단에서 형광단 6FAM, 및 3' 말단에서 마이너 홈 결합, 비-형광 소광제(MGBNFQ)로 표지된 가수분해 프로브를 주문하였다. 그 다음, 새로운 프라이머 및 프로브의 PCR 효율을 증가하는 농도의 프라이머 및 표준 곡선의 성분으로서 정제된 플라스미드 DNA를 사용하여 2가지 상이한 상업적 마스터 믹스를 사용하여 평가하였다. 상이한 프라이머-프로브의 세트에 대한 표적 서열을 함유하는 정제된 플라스미드를 사용함으로써 표준 곡선을 설정하였다. 7가지의 10배 단계 희석을 수행하여, 20 ㎕ 반응당 15개 카피의 정량화의 하한 및 7 log에 걸친 선형 범위를 달성하였다. 마스터 믹스 #2는 정량적 PCR을 위하여 허용되는 값인 90 내지 110%의 PCR 효율을 생성할 수 있었다(도 14). qPCR을 위한 모든 프라이머를 IDT로부터 주문하였다. 형광단 6FAM 및 마이너 홈 결합, 비-형광 소광제(MGBNFQ)에 컨쥬게이트되는 가수분해 프로브 및 qPCR 마스터 믹스를 써모 피셔로부터 수득하였다. 예시적인 증폭 플롯은 도 15에 나타나 있다.
이들 프라이머-프로브 세트 및 시약을 사용하여, 아넬로좀 스톡 중 게놈 당량(GEq)/㎖을 정량화하였다. 선형 범위는 20 ㎕ 반응당 1.5E+07 내지 15 GEq였으며, 이어서 이를 사용하여, 도 16a 및 도 16b에 나타낸 바와 같이, GEq/㎖을 계산하였다. 선형 범위보다 더 높은 농도를 갖는 시료는 필요한 대로 희석될 수 있다.
실시예 19: 마우스에서 외인성 단백질을 발현하기 위한 아넬로좀의 이용
본 실시예에는 토르크 테노 미니 바이러스(TTMV) 게놈이 마우스에서 반딧불이 루시퍼라제 단백질을 발현하도록 엔지니어링된 아넬로좀의 이용이 기재된다.
반딧불이-루시퍼라제 유전자를 인코딩하는 엔지니어링된 TTMV의 DNA 서열을 인코딩하는 플라스미드를 화학적 트랜스펙션에 의해 A549 세포(인간 폐 암종 세포주) 내로 도입한다. 18 ㎍의 플라스미드 DNA를 10 cm 조직 배양 플레이트에서 70% 컨플루언트 세포의 트랜스펙션을 위해 사용한다. TTMV 서열이 결여된 빈 벡터 백본을 음성 대조군으로서 사용한다. 트랜스펙션 5시간 후에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 신선한 성장 배지에서 성장하게 한다.
트랜스펙션된 A549 세포를 그들의 상청액과 함께, 트랜스펙션 96시간 후에 수집한다. 수집된 물질을 37℃에서 1시간 동안 0.5% 데옥시콜레이트(부피 중 중량)로 처리한 후에, 엔도뉴클레아제로 처리한다. 아넬로좀 입자를 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 이러한 용해물로부터 정제한다. 아넬로좀 농도를 결정하기 위하여, 아넬로좀 스톡의 시료를 바이러스 DNA 정제 키트를 통해 시행하고, ㎖당 게놈 당량을 아넬로좀 DNA 서열에 대하여 표적화된 프라이머 및 프로브를 사용한 qPCR에 의해 측정한다.
1x 인산염-완충 염수 중 소정의 용량-범위의 게놈 당량의 아넬로좀을 8 내지 10주령 마우스에서 다양한 주사 경로(예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내)를 통해 수행한다. 배측 및 등측 생물발광 영상화를 주사 후 3, 7, 10 및 15일에 각 동물에서 수행한다. 제조처의 프로토콜에 따라, 루시퍼라제 기질(퍼킨-엘머)을 표기된 시점에 각 동물에 복강내로 첨가한 후 생체내 영상화에 의해 영상화를 수행한다.
실시예 20: 아넬로좀 DNA가 숙주 게놈 내로 통합되는지 여부를 결정하기 위한 게놈 정렬
본 실시예에는 토르크 테노 바이러스(TTV)가 인간 게놈 내로 통합되는지 여부를 시험함으로써, 아넬로좀 DNA가 숙주 게놈 내로 통합될 수 있는지를 결정하기 위해 수행되는 컴퓨터 분석이 기재된다.
5개의 예시적인 알파토르크바이러스 클레이드의 각각으로부터의 하나의 대표적인 TTV 서열의 완전한 게놈을 서열 간의 국소 유사성의 영역을 찾는 기본 국소 정렬 검색 툴(Basic Local Alignment Search Tool; BLAST)을 사용하여 인간 게놈 서열에 대하여 정렬하였다. 표 45에 나타낸 대표적인 TTV 서열을 분석하였다:
[표 45] 대표적인 TTV 서열
Figure pct00167
정렬된 TTV 중 어느 것으로부터의 서열도 인간 게놈과 임의의 유의미한 유사성을 갖는 것으로 밝혀지지 않았으며, 이는 TTV가 인간 게놈 내로 통합되지 않았음을 나타낸다.
실시예 21: 숙주 게놈 내로의 아넬로좀 통합의 평가
본 실시예에서, A549 세포(인간 폐 암종 세포주) 및 HEK293T 세포(인간 배아 신장 세포주)를 5, 10, 30 또는 50의 MOI에서 아넬로좀 입자 또는 AAV 입자 중 어느 하나로 감염시킨다. 세포를 감염 5일 후에 PBS로 세척하고, 신선한 성장 배지로 교체한다. 그 다음, 세포가 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 성장하게 한다. 세포를 감염 5일 후에 수집하고, 그들을 게놈 DNA 추출 키트(퀴아젠)를 사용하여 처리하여 게놈 DNA를 수집한다. 또한, 게놈 DNA를 비감염된 세포(음성 대조군)로부터 수집한다. 전체-게놈 서열결정 라이브러리를 제조처의 프로토콜에 따라 넥스테라 DNA 라이브러리 제조 키트(일루미나)를 사용하여, 이들 수집된 DNA에 대하여 제조한다. DNA 라이브러리를 제조처의 프로토콜에 따라 NextSeq 550 시스템(일루미나)을 사용하여 서열결정한다. 서열결정 데이터를 참조 게놈으로 어셈블시키고, 아넬로좀 또는 AAV 게놈과 숙주 게놈 간의 접합부를 찾기 위해 분석한다. 접합부가 검출되는 경우에, 그들을 원래의 게놈 DNA 시료에서 확인한 후, PCR에 의해 라이브러리를 서열결정한다. 접합부를 함유하는 그 주변의 영역을 증폭시키기 위하여 프라이머를 설계한다. 숙주 게놈 내로의 아넬로좀의 통합의 빈도는 qPCR에 의해 (통합 사전을 나타내는) 접합부의 수 및 시료 내의 총 아넬로좀 카피의 수를 정량화함으로써 결정된다. 이러한 비를 AAV와 비교할 수 있다.
실시예 22: 외인성 마이크로RNA 서열을 발현하는 아넬로좀의 기능적 효과
본 실시예는 고유 프로모터를 사용한 아넬로좀 게놈으로부터의 외인성 miRNA(miR-625)의 성공적인 발현을 보여준다.
500 ng의 하기의 플라스미드 DNA를 24 웰 플레이트 내의 60% 컨플루언트 HEK293T 세포의 웰 내로 트랜스펙션시켰다:
i) 빈 플라스미드 백본
ii) 내인성 miRNA가 낙아웃된(KO) TTV-tth8 게놈을 함유하는 플라스미드
iii) 내인성 miRNA가 비-표적화 스크램블 miRNA로 대체된 TTV-tth8
iv) 내인성 miRNA 서열이 miR-625를 인코딩하는 miRNA로 대체된 TTV-tth8
트랜스펙션 72시간 후에, 전체 miRNA를 퀴아젠 miRNeasy 키트를 사용하여 트랜스펙션된 세포로부터 수집한 후, miRNA 스크립트(Script) RT II 키트를 사용하여 역전사를 행하였다. 정량적 PCR을 miRNA-625 또는 RNU6 소형 RNA를 특이적으로 검출할 프라이머를 사용하여 역 전사된 DNA 상에서 수행하였다. RNU6 소형 RNA를 하우스키핑(housekeeping) 유전자로서 사용하였으며, 데이터는 빈 벡터에 비한 배수 변화로서 도 17에 플롯팅되어 있다. 도 17에 나타낸 바와 같이, miR-625 아넬로좀은 miR-625 발현의 대략 100-배 증가를 초래한 한편, 빈 벡터, miR-낙아웃(KO) 및 스크램블드 miR에 대하여 신호가 검출되지 않았다.
실시예 23: 외인성 비-코딩 RNA를 발현하기 위한 아넬로좀의 제조 및 생성
본 실시예에는 외인성 소형 비-코딩 RNA를 발현하기 위한 아넬로좀의 합성 및 생성이 기재된다.
TTV의 tth8 주로부터 DNA 서열(문헌[Jelcic et al, Journal of Virology, 2004])을 합성하고, 박테리아 복제 원점 및 박테리아 항생제 내성 유전자를 함유하는 벡터 내로 클로닝한다. 이러한 벡터에서, TTV miRNA 헤어핀을 인코딩하는 DNA 서열을 외인성 소형 비-코딩 RNA, 예컨대 miRNA 또는 shRNA를 인코딩하는 DNA 서열로 대체한다. 그 다음, 엔지니어링된 구축물을 전기-적격 박테리아로 형질전환시킨 후, 제조처의 프로토콜에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 단리를 행하였다.
외인성 소형 비-코딩 RNA를 인코딩하는 아넬로좀 DNA를 진핵 생성자 세포주 내로 트랜스펙션시켜, 아넬로좀 입자를 생성한다. 아넬로좀 입자를 함유하는 트랜스펙션된 세포의 상청액을 트랜스펙션 후 상이한 시점에 수집한다. 여과된 상청액으로부터의 또는 정제 이후의 아넬로좀 입자를 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 하류 응용에 사용한다.
실시예 24: 아넬로바이러스 클레이드에서의 보존
본 실시예에는 알파토르크바이러스 속 내의 7개의 클레이드의 확인이 기재된다. 이들 클레이드 간의 대표적인 서열은 서열에 걸쳐 54.7% 쌍별 동일성을 보였다(도 18). 쌍별 동일성은 오픈 리딩 프레임에서 가장 낮았으며(약 48.8%), 비-코딩 영역에서 더 높았다(5' NCR에서 69.1%, 3' NCR에서 74.6%)(도 18). 이는 비-코딩 영역 내의 DNA 서열 또는 구조가 바이러스 복제에서 중요한 역할을 수행하는 것을 뒷받침한다.
알파토르크바이러스에서 추정 단백질의 아미노산 서열도 또한 비교하였다. DNA 서열은 대략 47 내지 50% 쌍별 동일성을 보이는 한편, 아미노산 서열은 대략 32 내지 38% 쌍별 동일성을 보였다(도 19). 흥미롭게도, 알파토르크바이러스 클레이드로부터의 대표적인 서열은 생체 내에서 성공적으로 복제할 수 있으며, 인간 집단에서 관찰된다. 이는 아넬로바이러스 단백질에 대한 아미노산 서열이 기능성, 예컨대 복제 및 패키징을 유지하면서 광범위하게 달라질 수 있는 것을 뒷받침한다.
아넬로바이러스는 비-코딩 영역 내에 높은 국소 보존 영역을 갖는 것으로 관찰되었다. 프로모터의 하류 영역에서, 71-bp 5' UTR 보존된 도메인은 7개의 알파토르크바이러스 클레이드에 걸쳐 95.2% 쌍별 동일성을 나타내었다(도 20). 알파토르크바이러스의 3' 비-코딩 영역 내의 오픈 리딩 프레임의 하류에서, 대표적인 서열 간에 상당한 쌍별 동일성을 갖는 영역이 존재하였다. 이 3' 보존된 비-코딩 영역의 3' 말단 근처에, 고도로 보존된 서열이 존재한다. 아넬로바이러스는 또한, 70% 초과의 GC 함량을 갖는 GC-풍부 영역을 포함하며, 이는 그들이 정렬되는 영역에서 75.4% 쌍별 동일성을 나타내었다(도 21).
실시예 25: 아넬로좀으로부터 내인성 miRNA의 발현 및 내인성 miRNA의 결실
일 예에서, TTV-tth8 게놈을 실시예 27에 기재된 바와 같은 GC-풍부 영역 내의 결실을 사용하여 변형시킨 변형된 TTV-tth8 게놈을 포함하는 아넬로좀을 사용하여 배양 중 Raji B 세포를 감염시켰다. 이들 아넬로좀은 n-myc 상호작용 단백질(NMI)을 인코딩하는 mRNA를 표적화하는 miRNA인 TTV-tth8 아넬로바이러스의 내인성 페이로드를 인코딩하는 서열을 포함하였으며, 아넬로바이러스 게놈을 포함하는 플라스미드를 숙주 세포 내로 도입함으로써 생성하였다. NMI는 JAK/STAT 경로의 하류에서 작동하여, 인터페론-자극된 유전자, 증식 및 성장 유전자, 및 염증 반응의 매개자를 포함하는 다양한 세포내 신호의 전사를 조절한다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 바이러스 게놈이 표적 Raji B 세포에서 검출되었다. 대조군 세포에 비하여 표적 Raji B 세포에서 NMI의 성공적인 낙다운이 또한 관찰되었다(도 23). NMI에 대한 miRNA를 포함하는 아넬로좀은 대조군 세포에 비하여 NMI 단백질 수준의 75% 초과의 감소를 유도하였다. 본 실시예는 고유 아넬로바이러스 miRNA를 갖는 아넬로좀이 숙주 세포에서 표적 분자를 낙 다운시킬 수 있는 것을 보여준다.
또 다른 예에서, 아넬로바이러스-기반의 아넬로좀의 내인성 miRNA를 결실시켰다. 그 다음, 생성된 아넬로좀(Δ miR)을 숙주 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 그 다음, Δ miR 아넬로좀 유전 요소의 게놈 당량을 내인성 miRNA를 보유하는 상응하는 아넬로좀의 것과 비교하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 내인성 miRNA가 결실된 아넬로좀 게놈은 내인성 miRNA가 여전히 존재하는 아넬로좀 게놈에 대하여 관찰되는 것과 유사한 수준으로 세포에서 검출되었다. 이러한 실시예는 아넬로바이러스-기반의 아넬로좀의 내인성 miRNA가 완전히 돌연변이되거나 결실될 수 있으며, 아넬로좀 게놈이 표적 세포에서 여전히 검출될 수 있는 것을 보여준다.
실시예 26: 아넬로바이러스 ORF의 국소화
본 실시예에는 아넬로바이러스의 다양한 추정 ORF의 신규한 기능성이 기재된다. 본 실시예에서, 각각의 ORF의 N-말단에서 태깅된 단백질(즉, 나노루시퍼라제)의 하류에 추정 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열을 설계하였다. 각각의 ORF-nLuc 플라스미드를 화학적 트랜스펙션에 의해 12-웰 플레이트 내의 5E+05개의 부착성 세포(Vero 또는 HEK293T) 내로, 또는 전기천공법에 의해 현탁액 중 5E+05개의 세포 내로 도입하였다. 최적의 기간 후(예를 들어, 트랜스펙션 후 제3일 내지 제7일)에, 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드(써모피셔 cat# 28908)를 사용하여 고정하고, 0.5% 트리톤 X-100을 사용하여 투과화시키고, 토끼 폴리클로널 항 nLuc 항체(프로메가 코포레이션(Promega Corp.)으로부터 무상 제공)에 이어서, 염소 항-토끼 Alexa488(써모피셔 cat# A-11008) 컨쥬게이트된 2차 항체를 사용하여 nLuc에 대하여 염색하였다. 핵을 DAPI(써모피셔 Cat# D3571)를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포를 태깅된 단백질 세포 국소화에 대하여 20X 대물렌즈 및 흑백 악시오캠(Axiocam) 506 카메라를 갖는 자이스(Zeiss) 악시오베르트(AxioVert) A1 상에서 가시화시켰다.
도 25a 및 도 25b에 나타낸 바와 같이, ORF2는 세포질에 국소화되는 것으로 관찰되었으며, ORF1/1은 Vero 세포 및 HEK293 세포 둘 모두에서 핵에 국소화되는 것으로 관찰되었다. 도 25c는 ORF1/2 및 ORF2/2에 대한 국소화를 보여준다.
실시예 27: 아넬로좀 개발에 필요한 영역의 특성화
본 실시예에는 바이러스 복제 및 아넬로좀 생성에 충분한 게놈의 부분을 특성화하는 것을 돕기 위한 아넬로바이러스 게놈 내의 결실이 설명된다. ORF의 TTV-tth8 하류의 비-코딩 영역(NCR)(뉴클레오티드 3016 내지 3753) 내에 일련의 결실을 만들었다. 36-뉴클레오티드(nt) 서열(CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160))을 GC 영역으로부터 결실시켰다(Δ36nt(GC)로 표시). 추가로, 78-nt pre-마이크로RNA 서열(CCGCCATCTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGG(SEQ ID NO: 161))을 3' NCR로부터 결실시켰다(Δ36nt(GC) ΔmiR로 표시). 그리고 마지막으로, Δ36nt(GC)의 3'NCR 내의 추가의 171개 뉴클레오티드를 결실시키고(CTTAAGTAGTTGAGGCGGACGGTGGCGTGAGTTCAAAGGTCACCATCAGCCACACCTACTCAAAATGGTGGACAATTTCTTCCGGGTCAAAGGTTACAGCCGCCATGTTAAAACACGTGACGTATGACGTCACGGCCGCCATTTTGTGACACAAGATGGCCGACTTCCTTCC(SEQ ID NO: 162)), Δ3'NCR로 표시하였다(도 26). 각각 상기 기재된 환형 pTTV-tth8(WT), pTTV-tth8(Δ36nt(GC)), pTTV-tth8(Δ36nt(GC) ΔmiR), 변경된 3'NCR TTV-tth8을 갖는 pTTV-tth8(Δ3'NCR) DNA 플라스미드 2 ㎍을 3벌로, 리포펙타민 2000을 사용하여 12-웰 플레이트 내의 60% 컨플루언시의 HEK293 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 후에, 세포 펠렛을 수집하고, 용해시켜, mRNA 전사물을 단리하고(RNeasy, 퀴아젠 cat# 74104), cDNA로 전환시켰다(하이-캐퍼서티(High-Capacity) cDNA 역 전사 키트, 써모피셔, cat# 4368814). qPCR을 모든 시료 상에서 수행하여, 각각의 결실을 갖는 바이러스 전사물 발현을 측정하고, GAPDH의 내부 대조군 mRNA에 대하여 정규화시켰다.
도 27a 내지 도 27d에 나타낸 바와 같이, 결실 돌연변이체 3개 모두는 시험관 내에서 바이러스 전사물 발현을 유의미하게 저해하였다. 따라서, TTV-tth8의 3' NCR은 전이유전자의 발현을 위한 아넬로좀 생성에 필요하다.
TTV 주 tth8, 진뱅크 수탁 번호 AJ620231.1을 전장-게놈 서열로서 기탁하였다. 그러나, GC-풍부 영역 내에서, 총칭 N으로서 주석이 달린 36개 뉴클레오티드의 스트레치가 존재한다. 이 영역은 TTV 주 간에 고도로 보존되며, 이에 따라, 이들 바이러스의 생물학에 중요할 수 있다. 수백개의 TTV 주의 DNA 서열을 컴퓨터로 정렬하고, 이를 사용하여 그들 36개 뉴클레오티드에 대한 강력한 컨센서스 서열을 생성하였다(CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160)). 따라서, 본원에서 "야생형" 서열로서 지칭되는 TTV-tth8 게놈 서열은 공개적으로 이용 가능한 TTV-tth8 서열에서 열거된 36개 N의 스트레치 대신에 이 컨센서스 서열을 삽입하였다.
실시예 28: 생체 내에서 외인성 단백질의 아넬로좀 운반
본 실시예는 투여 후의 아넬로좀의 생체 내 이펙터 기능(예를 들어, 단백질의 발현)을 보여준다.
나노-루시퍼라제(nLuc)를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 아넬로좀(도 28a 및 도 28b)을 제조하였다. 약술하여, TTMV-LY2 비-코딩 영역 및 nLuc 발현 카세트를 갖는 이중-가닥 DNA 플라스미드를 트랜스 복제 및 패키징 인자로서 작용하도록 전장 TTMV-LY2 게놈을 인코딩하는 이중-가닥 DNA 플라스미드와 함께, HEK293T 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 세포를 인큐베이션시켜, 아넬로좀 생성을 가능하게 하였으며, 아넬로좀 물질을 수집하고, 뉴클레아제 처리, 한외여과/정용여과 및 무균 여과를 통해 농축시켰다. 추가의 HEK293T 세포를 "비-바이러스" 음성 대조군으로서 작용하도록 nLuc 발현 카세트 및 TTMV-LY2 ORF 트랜스펙션 카세트를 갖지만, 복제 및 패키징에 필수적인 비-코딩 도메인이 결여된 비-복제성 DNA 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 비-바이러스 시료를 아넬로좀 물질과 동일한 프로토콜에 따라 제조하였다.
아넬로좀 제제를 3마리 건강한 마우스의 코호트에 근육내로 투여하고, 9일의 경과에 걸쳐 IVIS 루미나(Lumina) 영상화(브루커(Bruker))에 의해 모니터링하였다(도 29a). 비-바이러스 대조군으로서, 비-복제성 제제를 추가 3마리의 마우스에 투여하였다(도 29b). 25 ㎕의 아넬로좀 또는 비-바이러스 제제의 주사를 제0일에, 왼쪽 뒷다리에 투여하고, 제4일에 오른쪽 뒷다리에 재-투여하였다(도 29a 및 도 29b에서 화살표 참조). 제9일의 IVIS 영상화 후에, 더 많은 nLuc 발광 신호의 발생이 비-바이러스 제제(도 29b)보다 아넬로좀 제제(도 29a)를 주사한 마우스에서 관찰되었으며, 이는 생체 내 아넬로좀 형질도입 후의 트랜스 유전자 발현과 일치한다.
실시예 29: 아넬로바이러스 내의 전구체 miRNA(pre-mIR)의 확인
본 실시예에는 다양한 아넬로바이러스에 의해 인코딩되는 신규한 전구체 miRNA를 확인하기 위한 다양한 컴퓨터 기반 및 실험적 접근법이 기재된다.
컴퓨터 기반 방법
아넬로바이러스 주는 뉴클레오티드 서열의 수준에서 서로 매우 다양하다. 그러나, 아넬로바이러스 주, 특히 동일한 클레이트 내의 것은 다양한 구성성분, 예컨대 프로모터, GC 풍부 영역, 비-코딩 영역 및 코딩 영역의 게놈 조직의 면에서 서로 유의미한 유사성을 보일 수 있다(예를 들어, 도 29da 및 도 29db 참조). pre-miR 서열이 이미 실험적으로 입증된 아넬로바이러스 주와 정렬시킴으로써 (pre-miR 서열이 알려져 있지 않은) 다양한 아넬로바이러스 주의 pre-miR 서열을 예측하는 방법이 본원에 기재된다.
요약하여, 세포주 및 다양한 인간 시료 유래의 소형 RNA에 대한 다양한 공개적으로 이용 가능한 소형 RNA 서열결정 데이터 세트를 마이닝하여, 다양한 아넬로바이러스의 주에 의해 인코딩되는 신규한 pre-miR 서열을 발견한다. 구조 예측 또는 기계-학습 분류, 예컨대 mFold 프로그램, miRANDA 알고리즘, miRScan, miRanalyzer, miRDeep(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1559940/, https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2015.00007/full)에 기초한 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 툴 및 알고리즘을 사용하여, 다양한 아넬로에 의해 인코딩되는 신규한 miRNA를 예측한다. 이어서, 특정 miRNA 서열에 대하여 설계된 프로브를 사용한 노던 블롯 및/또는 miRNA에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-qPCR을 사용하여, 신규한 miRNA의 발현을 확인하고, 입증하고, 정량화한다.
실험적 방법
일 예에서, 고 처리량 소형 RNA 서열결정을 아넬로로 감염시킨 인간 조직 또는 혈액 시료 상에서 수행하여, 신규한 아넬로바이러스-인코딩된 pre-miRNA를 발견한다. 이를 수행하기 위하여, RNA를 균질화된 인간 조직 시료 또는 인간 혈액 시료로부터 수집한다. 소형 RNA 라이브러리를 제조하고, 일루미나(Illumina) 키트 및 서열결정 플랫폼을 사용하여 서열결정한다. 서열결정 판독물을 저장하고, 정렬하고, 베이스스페이스(BaseSpace) 서열 허브(Hub)(일루미나) 상에서 분석한다.
제2의 예에서, 고 처리량 소형 RNA 서열결정을 하기의 조건으로 처리된 다양한 세포주에서 수행하여, 아넬로바이러스에 의해 인코딩되는 신규한 pre-miRNA를 발견한다: (a) 자연 발생 아넬로바이러스로 감염된 세포주, 시험관 내에서 합성된 아넬로바이러스 게놈으로 트랜스펙션된 세포주 및 (c) 합성 게놈을 사용하여 시험관 내에서 패키징된 아넬로바이러스로 감염된 세포주. 특정 miRNA 서열에 대하여 설계된 프로브를 사용한 노던 블롯 및/또는 miRNA에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-qPCR을 사용하여, 신규한 miRNA의 발현을 확인하고, 입증하고, 정량화한다.
실시예 30: 아넬로바이러스 pre-miR의 내인성 표적의 결정
본 실시예에는 내인성 표적 및 다양한 아넬로바이러스의 주에 의해 인코딩되는 pre-miR의 치료적으로 관련될 가능성이 있는 표적 경로를 결정하기 위한 분석이 기재된다.
다양한 아넬로바이러스에 의해 인코딩되는 컴퓨터로 예측된 및/또는 실험적으로 입증된 개별 pre-miRNA 서열을 U6 프로모터에 의해 유도되는 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝한다. U6 프로모터에 의해 유도되는 비-표적화 스크램블 miRNA 서열을 또한, 유사한 방식으로 클로닝하고, 이를 대조군으로서 사용한다. 패키징되는 경우, 그의 게놈이 (i) U6 프로모터에 의해 유도되는 pre-miRNA 서열, (ii) SV40 프로모터에 의해 유도되는 푸로마이신 내성 유전자 및 (iii) CMV 프로모터에 의해 유도되는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 함유하도록, 렌티바이러스 플라스미드를 클로닝한다. 이들 렌티바이러스 플라스미드의 각각을 개별적으로 바이러스를 패키징하기 위하여 렌티바이러스 헬퍼 플라스미드와 함께 HEK-293T 세포 내로 동시-트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션 6시간 후에, 트랜스펙션된 세포의 배지를 흡인하고, PBS로 1회 세척하고, 신선한 배지로 교체한다. 렌티바이러스를 함유하는 이 배지를 트랜스펙션 72시간 후에 수집한다. 배지를 0.4 ㎛ 필터를 통해 여과하여 임의의 세포를 제거한 다음, 이를 사용하여, 관심 세포 유형, 예컨대 HeLa, Raji 및 THP1을 3벌로 감염시킨다. 통합된 렌티바이러스 게놈을 함유하는 세포를 푸로마이신을 사용한 처리에 의해 선택하며, 이는 감염 3일 후에 개시한다. RNA를 RNA 추출 키트(퀴아젠)를 사용하여 안정하게 선택된 세포주로부터 수집한 후, 역 전사효소 키트(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 cDNA로의 역 전사를 행한다. cDNA 시료를 처리하여, 인덱싱된 짧은-판독물 라이브러리를 생성한다. 특유하게 인덱싱된 짧은 판독물 라이브러리를 일루미나 서열결정 플랫폼을 사용하여 서열로 다중화시켜, 시료당 약 2000만개의 판독물을 생성한다. 서열결정 판독물을 저장하고, 정렬하고, 베이스스페이서 서열 허브(일루미나)를 사용하여 분석한다. 스크램블드 pre-miR을 발현하는 세포주에 비하여 후보 pre-miR을 발현하는 세포주에서의 유전자의 발현을 비교함으로써 각각의 개별 후보 pre-miR의 표적을 결정한다. 인제이뉴티 경로(Ingenuity Pathway) 분석을 수행하여, pre-miRNa가 특정 경로, 특히 치료적으로 관련이 있는 경로를 표적화하는지 여부를 시험한다. 본 실시예에 기재된 작업흐름의 개략도는 도 30에 나타나 있다.
실시예 31: 고유 아넬로바이러스 pre-miR을 인코딩하는 아넬로좀의 제조
본 실시예에는 고유 아넬로바이러스 pre-miR를 발현하는 복제성 또는 비-복제성 형태의 아넬로좀을 패키징하는 과정이 기재된다.
하기의 구성성분을 함유하는 비-복제성 형태의 아넬로좀의 게놈을 합성한다: (i) 복제 원점, (ii) 아넬로바이러스 pre-miRNA를 인코딩하는 서열, (iii) pre-miRNA의 발현을 유도하는 RNA 중합효소 III, 예컨대 U6 또는 H1 및 (iv) 패키징 신호. 이 게놈을 바이러스 패키징에 필요한 단백질의 전부를 안정하게 발현하는 헬퍼 세포주 내로 트랜스펙션시킴으로써 패키징한다. 트랜스펙션된 세포를 트랜스펙션 7일 후에 수집하고, 본원에 기재된 바와 같이, 아넬로좀 제제를 제조하기 위하여 처리한다. 아넬로좀 제제의 게놈 당량 역가를 본원에 기재된 바와 같이, qPCR을 수행함으로써 결정한다. 이어서, 적절한 용량의 아넬로좀 제제를 하류 응용을 위하여 사용한다.
복제성 형태의 아넬로좀의 게놈을 예를 들어, pre-miRNA 서열의 발현을 외인성 프로모터, 예컨대 U6 또는 조직 특이적 프로모터를 사용하여 조작한 것을 제외하고, 고유 아넬로바이러스를 생성함으로써 합성할 수 있다. 게놈을 HEK-293T 세포 내로 트랜스펙션시킴으로써 패키징한다. 트랜스펙션된 세포를 트랜스펙션 7일 후에 수집하고, 본원에 기재된 바와 같이, 아넬로좀 제제를 제조하기 위하여 처리한다. 아넬로좀 제제의 게놈 당량 역가를 본원에 기재된 바와 같이, qPCR을 수행함으로써 결정한다. 적절한 용량의 아넬로좀 제제를 하류 응용을 위하여 사용한다.
실시예 32: 시험관 내 세포 배양 모델에서의 아넬로바이러스 pre-miR 종양 억제제의 이용
본 실시예에는 예를 들어, 실시예 29에 기재된 바와 같이, 분석으로부터 종양 억제성인 것으로 확인된 후보 pre-miR의 표현형 효과를 확인하기 위한 연구가 기재된다.
종양 억제 효과를 갖는 후보 pre-miRNA를 실시예 29에 기재된 바와 같은 분석에 기초하여 확인한다. 이들 후보 pre-miRNA 및 스크램블드 pre-miRNA를 인코딩하는 복제성 형태의 아넬로좀의 아넬로좀 제제를 실시예 31에 기재된 바와 같이 제조한다. NCI-60 암 세포주 패널 유래의 암 세포주를 96 웰 플레이트에 플레이팅한다. 30% 컨플루언트 시에, 이들 세포주를 세포당 5 게놈 당량의 투여량으로 후보 pre-miR 또는 스크램블드 pre-miR을 포함하는 아넬로좀으로 처리한다. 아넬로좀-함유 배지를 감염 5시간 후에 흡인한 후, PBS로 2회 세척하고, 신선한 배지로 교체하였다. 알라마 블루(Alamar blue) 검정을 처리 3일 후에 처리된 세포에서 수행하여, pre-miR 중 어떤 것이 암 세포주의 증식을 저해하는지를 결정한다.
실시예 33: 생체 내에서 종양 억제제로서의 아넬로바이러스 pre-miR의 이용
본 실시예에는 실시예 32에 기재된 바와 같은, 시험관 내 분석으로부터 암 세포주 및 최종선발 후보 종양 억제성 아넬로바이러스 pre-miR에 대한 종양 억제 효과를 확인하기 위한 생체 내 실험이 기재된다.
실시예 32에 기재된 분석으로부터 최종선발된 암 세포주를 매트리겔과 함께, 무흉선 마우스의 옆구리 내에 피하 주사함으로써 이종이식편을 생성한다. 일단 이종이식편 종양이 촉진 가능하게 되면, 종양 억제성 pre-miRNA 또는 스크램블 pre-miRNA를 인코딩하는 3 x 106 게놈 당량의 아넬로좀의 국소 종양 주사를 수행한다. 종양 성장에 대한 아넬로좀 주사의 영향을 3주 동안 일상적인 종양 성장 측정에 의해, 실험의 마지막에 이종이식편 종양의 종양 중량 측정에 의해, 그리고 BrdU 혼입 검정에 의해 결정한다.
실시예 34: 아넬로바이러스 게놈의 탠덤 카피
본 실시예에는 상류 게놈의 GC-풍부 영역이 하류 게놈의 5' 영역 근처에 존재하도록 탠덤으로 배열된, 2개 카피의 단일의 아넬로바이러스 게놈을 갖는 플라스미드-기반의 발현 벡터가 기재된다(도 31a).
아넬로바이러스는 회전환을 통해 복제하며, 복제효소(Rep) 단백질은 복제 원점에서 게놈에 결합하고, 환 둘레에서 DNA 합성을 개시한다. 아넬로바이러스 게놈이 플라스미드 백본 내에 함유되기 위하여, 이는 고유 바이러스 게놈보다 더 긴 전장 플라스미드의 복제, 또는 최소 백본과 함께 게놈을 포함하는 더 작은 환을 초래하는 플라스미드의 재조합을 필요로 한다. 따라서, 플라스미드로부터의 바이러스의 복제는 비효율적일 수 있다. 바이러스 게놈 복제 효율을 개선시키기 위하여, 플라스미드를 TTV-tth8 및 TTMV-LY2의 탠덤 카피를 사용하여 엔지니어링하였다. 이들 플라스미드는 아넬로바이러스 게놈의 모든 가능한 환형 순열을 제시하였다: Rep 단백질이 결합하는 곳과 관계없이, 상류 복제 원점으로부터 하류 원점까지 바이러스 게놈의 복제를 유도할 수 있을 것이다. 유사한 전략을 사용하여, 돼지 아넬로바이러스를 생성한 바 있다(문헌[Huang et al., 2012, Journal of Virology 86 (11) 6042-6054]).
게놈의 카피를 플라스미드 백본 내로 순차적으로 클로닝하여, 2개의 서열 사이에 12 bp의 비-바이러스 DNA를 남김으로써 탠덤 TTV-tth8을 어셈블하였다. 야생형, 및 GC-풍부 영역으로부터 36개 염기쌍이 소실된 TTV-tth8(Δ36GC)(즉, 본원에 기재된 36-뉴클레오티드 GC-풍부 서열을 포함하도록 엔지니어링된 TTV-tth8 게놈)을 포함하여, 몇몇의 TTV-tth8 변이체를 탠덤 플라스미드 내에 어셈블하였다. 탠덤 TTMV-LY2를 골든-게이트(Golden-gate) 어셈블리를 통해 어셈블시켜, 2개 카피의 게놈을 백본 내에 동시에 혼입시키고, 게놈 사이에 추가의 뉴클레오티드를 남기지 않았다.
탠덤 카피의 TTV-tth8(Δ36GC)을 갖는 플라스미드를 HEK239T 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 세포를 5일 동안 인큐베이션시킨 다음, 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 용해시키고, 뉴클레아제로 처리하여, 바이러스 캡시드에 의해 보호되지 않는 DNA를 분해하였다. 그 다음, qPCR을 TTV-tth8 게놈 서열 및 플라스미드 백본에 대하여 택맨(Taqman) 프로브를 사용하여 수행하였다. TTV-tth8 게놈 카피를 백본 카피로 정규화시켰다. 도 31b에 나타낸 바와 같이, 탠덤 TTV-tth8은 단일-카피 보유 플라스미드보다 4배 더 많은 수의 바이러스 게놈을 생성하였다. 배가된 TTV-tth8 게놈 서열의 수를 고려하는 경우, 탠덤 플라스미드는 트랜스펙션된 카피당 2배 더 많은 새로 합성된 게놈 카피를 생성하였다. 이들 데이터는 탠덤 아넬로바이러스 게놈의 엔지니어링이 바이러스 게놈 복제를 증가시킬 수 있으며, 아넬로바이러스 생성을 증가시키기 위한 전략으로서 사용될 수 있음을 보여주었다.
실시예 35: 시험관 내 환화된 아넬로바이러스 게놈
본 실시예에는 최소 비-바이러스 DNA와 함께 환형, 이중 가닥 아넬로바이러스 게놈 DNA를 포함하는 구축물이 기재된다. 이들 환형 바이러스 게놈은 야생형 아넬로바이러스 복제 동안 관찰되는 이중-가닥 DNA 중간체와 더욱 근접하게 일치한다. 이러한 환형, 이중 가닥 아넬로바이러스 게놈 DNA가 최소 비-바이러스 DNA와 함께 세포 내로 도입되는 경우, 회전환 복제를 겪어, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소를 생성할 수 있다.
일 예에서, TTV-tth8 변이체 및 TTMV-LY2를 보유하는 플라스미드를 게놈 DNA에 측접하는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 사용하여 분해하였다. 이어서, 생성되는 선형화된 게놈을 라이게이션시켜, 환형 DNA를 형성하였다. 이들 라이게이션 반응을 다양한 DNA 농도를 사용하여 행하여, 분자내 라이게이션을 최적화시켰다. 라이게이션된 환을 포유동물 세포 내에 바로 트랜스펙션시키거나, 플라스미드 백본을 절단하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 및 선형 DNA를 분해하기 위한 엑소뉴클레아제를 사용한 분해에 의해 추가로 처리하여, 비-환형 게놈 DNA를 제거하였다. TTV-tth8에 있어서, XmaI 엔도뉴클레아제를 사용하여, DNA를 선형화시켰으며; 라이게이션된 환은 GC-풍부 영역과 5' 비-코딩 영역 사이에 53 bp의 비-바이러스 DNA를 함유하였다. TTMV-LY2에 있어서, IIS형 제한 효소 Esp3I을 사용하여, 비-바이러스 DNA를 갖지 않는 바이러스 게놈 DNA 환을 제공하였다. 이 프로토콜을 이전에 공개된 TTV-tth8의 환화로부터 조정하였다(문헌[Kincaid et al., 2013, PLoS Pathogens 9(12): e1003818]). 아넬로바이러스 생성의 개선을 입증하기 위하여, 환화된 TTV-tth8 및 TTMV-LY2를 HEK293T 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 7일의 인큐베이션 후에, 세포를 용해시키고, qPCR을 수행하여, 환화된 및 플라스미드-기반의 아넬로바이러스 게놈 간에 아넬로바이러스 게놈의 수준을 비교하였다. 증가된 아넬로바이러스 게놈의 수준은 바이러스 DNA의 환화가 아넬로바이러스 생성을 증가시키기 위한 유용한 전략인 것을 보여준다.
또 다른 예에서, TTMV-LY2 플라스미드(pVL46-240) 및 TTMV-LY2-nLuc를 각각 Esp3I 또는 EcoRV-HF를 사용하여 선형화시켰다. 분해된 플라스미드를 1% 아가로스 겔 상에 정제한 후에, 전기용리 또는 퀴아젠 컬럼 정제 및 T4 DNA 리가제를 사용한 라이게이션을 행하였다. 환화된 DNA를 트랜스펙션 전에 100 kDa UF/DF 멤브레인 상에서 농축시켰다. 환화를 도 31c에 나타낸 바와 같이, 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 리포펙타민 2000을 사용한 리포펙션 1일 전에, T-225 플라스크에, 3 x 104개 세포/㎠의 HEK293T를 씨딩하였다. 9 마이크로그램의 환화된 TTMV-LY2 DNA 및 50 ㎍의 환화된 TTMV-LY2-nLuc를 플라스크 씨딩 1일 후에 동시-트랜스펙션시켰다. 비교로서, 추가의 T-225 플라스크에, 50 ㎍의 선형화된 TTMV-LY2 및 50 ㎍의 선형화된 TTMV-LY2-nLuc를 동시-트랜스펙션시켰다.
아넬로좀 생성을 트리톤 X-100 수집 완충제 중에서의 세포 수집 이전에 8일 동안 진행하였다. 일반적으로, 아넬로좀을 예를 들어, 숙주 세포의 용해, 용해물의 정화, 여과 및 크로마토그래피에 의해 농축시킬 수 있다. 본 실시예에서, 수집된 세포를 염화나트륨 조정 및 1.2 ㎛/ 0.45 ㎛ 정상 유동 여과 전에 뉴클레아제 처리하였다. 정화된 수집액을 농축시키고, 750 kDa MWCO mPES 중공사막 상에서 PBS로 완충제 교환하였다. TFF 투석유물을 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과한 후에, PBS 중에 사전-평형화된 세파크릴(Sephacryl) S-500 HR SEC 컬럼 상에 로딩하였다. 아넬로좀을 30 cm/hr로 SEC 컬럼에서 처리하였다. 개별 분획을 수집하고, 도 31d에 나타낸 바와 같이, 바이러스 게놈 카피수 및 전이유전자 카피수에 대하여 qPCR에 의해 검정하였다. 바이러스 게놈 및 전이유전자 카피는 SEC 크로마토그램의 공극 부피인 분획 7에서 시작하여 관찰되었다. 잔류 플라스미드 피크는 분획 15에서 관찰되었다. TTMV-LY2 게놈 및 TTMV-LY2-nLuc 전이유전자에 대한 카피수는 분획 7 내지 분획 10에서 nLuc 전이유전자를 함유하는 팩킹된 아넬로좀을 나타내는 환화된 투입 DNA를 사용하여 생성된 아넬로좀에 대하여 우수하게 일치하였다. SEC 분획을 풀링하고, 100 kDa MWCO PVDF 멤브레인을 사용하여 농축시킨 다음, 생체 내 투여 이전에 0.2 ㎛ 여과하였다.
투입 아넬로좀 DNA의 환화는 선형화된 아넬로좀 DNA와 비교하는 경우, 정제 과정을 통한 뉴클레아제 보호된 게놈의 회수 백분율의 3배 증가를 초래하였으며, 이는 표 46에 나타낸 바와 같은 환화된 투입 아넬로좀 DNA를 사용하여 개선된 제조 효율을 나타낸다.
[표 46] 정제 과정 수율
Figure pct00168
실시예 36: ORF1의 모델링 및 보존된 잔기 및 도메인의 확인
본 실시예에는 베타토르크바이러스의 ORF1 단백질의 인 실리코 모델링 및 구조적 모티프 및 아미노산 보존/유사성에 기초한 추정 도메인의 정의가 기재된다.
ORF1 단백질은 PSIpred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)를 사용한 2차 구조 예측에서 베타-시트의 높은 존재 및 아르기닌-풍부 영역의 존재에 기초하여 아넬로바이러스의 주요 캡시드 단백질인 것으로 예측된다. RaptorX(http://raptorx.uchicago.edu/)를 8가지 베타토르크바이러스의 서열에 대한 구조 예측 및 접촉 예측을 위해 사용하였다. 베타토르크바이러스 ORF1 서열이 알파토르크바이러스(약 750개 아미노산)보다 더 짧고(약 650개 아미노산), 더 적은 영역이 비구조화되는 것으로 예측되기 때문에, 베타토르크바이러스 ORF1 서열을 사용하였다. 예측된 구조 중 5개가 유사성의 요소를 함유하였으며, 이를 사용하여 ORF1의 추정 도메인을 확인하였다(도 33). ORF1을 5개 영역 - 아르기닌-풍부 영역, 추정 코어(젤리-롤 도메인), 초가변 영역, N22 영역 및 C-말단 도메인으로 나누었다.
베타토르크바이러스 주 CBS203의 구조적 모델을 사용하여 베타토르크바이러스 과 간에 일부 보존을 갖는 잔기/구조적 영역을 나타내었다. 보존된 잔기를 분석하기 위하여, 110개의 베타토르크바이러스 ORF1 서열을 ClustalW 정렬 알고리즘을 사용하여 지니어스(Geneious)에서 정렬하였다. 이어서, 잔기를 1의 임계값과 함께 BLOSUM62 매트릭스를 사용하여 동일성 및 유사성 백분율에 의하여 보존에 대하여 평가하였다. 정렬에서 모든 주의 60% 초과의 유사성을 갖는 잔기를 구조 모델 상에 강조표시하였다(도 34). 총, 26개의 잔기(약 4%)는 정렬된 서열과 100%의 아미노산 유사성을 가졌다. 80% 및 60% 컷-오프는 각각 총 잔기의 23.7% 및 36.7%를 함유하였다.
유사한 정렬 알고리즘 및 유사성 결정을 258개의 알파토르크바이러스의 주 상에서 행하였다. 유사성 및 동일성을 정렬로부터 컨센서스 서열에 나타내었으며, 추정 도메인을 베타토르크바이러스와의 일차 서열 정렬에 기초하여 지정하였다(도 35). 알파토르크바이러스는 100% 유사한 29개의 잔기(3.9%)를 가졌으며, 이는 베타토르크바이러스의 관찰과 매우 일치한다. 흥미로운 점은, 알파토르크바이러스가 베타토르크바이러스와 비교하는 경우, 적어도 80%(잔기의 30.9%) 또는 60%(잔기의 42.9%) 유사성으로, 더 높은 잔기의 백분율을 갖는다는 점이다.
실시예 37: 상이한 토르크 테노 바이러스 주로부터의 초가변 도메인을 갖는 키메라 ORF1을 함유하는 아넬로좀의 생성
본 실시예에는 하나의 TTV 주의 ORF1 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, N22 및 C-말단 도메인 및 상이한 TTV 주의 ORF1 단백질로부터의 초가변 도메인을 함유하는 키메라 아넬로좀을 생성하기 위한 ORF1의 초가변 영역의 도메인 스와핑이 기재된다.
베타토르크바이러스의 전장 게놈 LY2 주를 포유동물 세포에서의 발현을 위하여 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 이 게놈을 돌연변이시켜, LY2의 초가변 도메인을 제거하고, 그것을 먼 관계의 베타토르크바이러스의 초가변 도메인으로 대체하였다(도 36). 이어서, 스와핑된 초가변 도메인을 갖는 LY2 게놈을 함유하는 플라스미드(pTTMV-LY2-HVRa-z)를 이전에 공개된 방법(문헌[Kincaid et al., PLoS Pathogens 2013])을 사용하여 선형화시키고 환화시킨다. HEK293T 세포를 환화된 게놈으로 트랜스펙션시키고, 5 내지 7일 동안 인큐베이션시켜, 아넬로좀 생성을 가능하게 한다. 인큐베이션 기간 후에, 아넬로좀을 구배 초원심분리에 의해 트랜스펙션된 세포의 상청액 및 세포 펠렛으로부터 정제한다.
키메라 아넬로좀이 여전히 감염성인지를 결정하기 위하여, 단리된 바이러스 입자를 비감염된 세포에 첨가한다. 세포를 5 내지 7일 동안 인큐베이션시켜, 바이러스 복제를 가능하게 한다. 인큐베이션 후에, 감염을 확립하기 위한 키메라 아넬로좀의 능력은 면역형광, 웨스턴 블롯 및 qPCR에 의해 모니터링될 것이다. 키메라 바이러스의 구조적 온전성을 음성 염색 및 초저온-전자 현미경법에 의해 평가한다. 키메라 아넬로좀을 추가로 생체 내에서 세포를 감염시키는 능력에 대하여 시험할 수 있다. 초가변 도메인 스와핑을 통하여 기능적 키메라 아넬로좀을 생성하는 능력의 확립은 향성을 변경시키고, 면역 검출을 잠재적으로 회피하기 위한 바이러스의 엔지니어링을 가능하게 할 수 있었다.
실시예 38: 초가변 도메인 대신에 비-TTV 단백질/펩티드를 함유하는 키메라 ORF1의 생성
본 실시예에는 하나의 TTV 주의 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, N22 및 C-말단 도메인, 및 초가변 도메인 대신에 비-TTV 단백질/펩티드를 함유하는 키메라 ORF1 단백질을 생성하기 위하여, ORF1의 초가변 영역을 다른 관심 단백질 또는 펩티드로 대체하는 것이 기재된다.
실시예 B에 나타낸 바와 같이, LY2의 초가변 도메인을 게놈으로부터 결실시키고, 관심 단백질 또는 펩티드를 이 영역 내로 삽입할 수 있다(도 37). 이 영역 내로 도입될 수 있는 서열의 유형의 예는 친화성 태그, 항체의 단일 쇄 가변 영역(scFv) 및 항원 펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 플라스미드(pTTMV-LY2-ΔHVR-POI) 내의 돌연변이된 게놈을 실시예 B에 기재된 바와 같이 선형화시키고 환화시킨다. 환화된 게놈을 HEK293T 세포 내로 트랜스펙션시키고, 5 내지 7일 동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후에, POI를 함유하는 키메라 아넬로좀을 적절한 경우 초원심분리 및/또는 친화성 크로마토그래피를 통해 상청액 및 세포 펠렛으로부터 정제한다.
POI를 함유하는 기능적 키메라 아넬로좀을 생성하기 위한 능력을 다양한 기법을 사용하여 평가한다. 먼저, 정제된 바이러스를 비감염된 세포에 첨가하여, 키메라 아넬로좀이 페이로드를 복제하고/복제하거나 페이로드를 나이브 세포에 운반할 수 있는지를 결정한다. 추가로, 키메라 아넬로좀의 구조적 온전성을 전자 현미경법을 사용하여 평가한다. 시험관 내에서 기능성인 키메라 아넬로좀에 있어서, 생체 내에서의 페이로드의 복제/운반 능력도 또한 평가한다.
실시예 39: 페이로드를 보유하는 아넬로좀의 설계
본 실시예에는 트랜스 유전자를 보유하는 예시적인 아넬로좀 유전 요소의 설계가 기재된다. 유전 요소는 예를 들어, 단백질 또는 비-코딩 RNA-발현 유전자를 포함할 수 있는 비-아넬로바이러스 페이로드와 함께 아넬로바이러스과의 구성원으로부터의 필수 시스 복제 및 패키징 도메인으로 구성된다. 아넬로좀은 복제 및 패키징에 필수적인 트랜스 단백질 요소가 결여되며, 회전환 복제 및 캡슐화를 위하여 다른 공급원(예를 들어, 헬퍼, 예를 들어, 복제성 바이러스, 발현 플라스미드 또는 게놈 통합물)에 의해 제공되는 단백질을 필요로 한다.
하나의 실시예의 세트에서, 전체 단백질-코딩 DNA 서열을 제1 시작 코돈으로부터 마지막 정지 코돈까지 결실시켰다(도 38). TTV-tth8에 있어서, ORF2 시작 코돈으로부터 ORF3 정지 코돈까지 뉴클레오티드 336 내지 3015를 결실시켰다. TTMV-LY2에 있어서, ORF2 시작 코돈부터 ORF3 정지 코돈까지 424 내지 2813을 결실시켰다. 생성된 DNA는 바이러스 프로모터, 5' UTR 보존된 도메인, 3' UTR(일부 아넬로바이러스 주, 예컨대 TTV-tth8에서 miRNA를 인코딩함) 및 GC-풍부 영역을 포함하는 바이러스 비-코딩 영역(NCR)을 보유하였다. 아넬로좀 NCR은 바이러스 복제 원점 및 캡시드 결합 도메인을 포함하는 필수 시스 도메인을 보유하였다. 그러나, 아넬로바이러스 단백질-코딩 오픈 리딩 프레임이 결여되어, 아넬로좀은 DNA 복제 및 캡슐화에 필요한 필수 단백질 요소를 발현할 수 없었으며, 이에 따라 이들 요소가 트랜스로 제공되지 않는 한, 증폭되거나 패키징되지 않을 것이다.
단백질-인코딩 서열, 전체 트랜스 유전자(비-아넬로바이러스 프로모터 서열 포함) 및 비-코딩 RNA 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는 페이로드 DNA를 결실된 아넬로바이러스 오픈 리딩 프레임의 부위 내로의 삽입에 의해 아넬로좀 유전 요소 내에 혼입시켰다(도 38). 단백질-코딩 서열로부터의 발현은 예를 들어, 고유 바이러스 프로모터 또는 트랜스 유전자로서 혼입된 합성 프로모터에 의해 유도될 수 있다.
(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 복제-결핍 또는 비적격 아넬로좀 유전 요소는 바이러스 복제 및/또는 캡시드 인자를 위한 단백질-코딩 서열이 결여될 수 있다. 따라서, 세포를 본 실시예에 기재된 아넬로좀 DNA 및 바이러스-단백질-인코딩 DNA로 동시-트랜스펙션시킴으로써 패키징된 아넬로좀을 생성하였다. 바이러스 단백질을 복제-적격 야생형 바이러스 게놈, 바이러스 프로모터의 제어 하에 바이러스 단백질을 보유하는 비-복제성 플라스미드 또는 강력한 구성성 프로모터의 제어 하에 바이러스 단백질을 보유하는 플라스미드로부터 발현시켰다.
실시예 40: 아넬로좀-인코딩 전이유전자의 형질도입
본 실시예에서, 아넬로좀 LY2-면역어드헤신(IA)을 폐 시료로부터 단리된 아넬로바이러스 LY2를 사용하여 제조한 다음, 인간 면역어드헤신을 운반하도록 조작한다. LY2 비-코딩 영역(5’ UTR, GC-풍부 영역) 및 IA-인코딩 카세트를 포함하지만 아넬로바이러스 ORF를 포함하지 않았던 이중-가닥 환형 LY2-IA 아넬로좀 DNA를 (예를 들어, 실시예 39에 기재된 바와 같이) 설계한 다음, 본원에 기재된 바와 같이, 시험관 내 환화에 의해 생성하였다. 아넬로바이러스 ORF를 개별 시험관 내 환화된 DNA에서 트랜스로 제공하였다. 둘 모두의 DNA를 2개의 생물학적 반복검증에서 HEK293T 세포 내로 동시-트랜스펙션시켰다(도 39에 “A” 및 “B”로 나타냄). 음성 대조군(모의 트랜스펙션) 및 양성 대조군(플라스미드 내의 IA 발현 카세트)의 각각의 2개의 생물학적 반복검증을 또한 시험하였다. 폐-유래된 인간 세포주 EKVX 및 A549 내로의 아넬로좀 제제의 형질도입은, ELISA에 의한 분비된 면역어드헤신의 검출을 초래하였다(도 39; 우측의 막대 그래프 참조). 더욱이, LY2-IA 형질도입된 EKVX 세포의 면역형광 분석에 의해, 면역어드헤신의 발현에 대하여 양성인 세포가 드러났다.
실시예 41: tth8 및 LY2에 기초한 아넬로좀은 각각 EPO 유전자를 폐암 세포 내에 성공적으로 형질도입시켰다
본 실시예에서, 비-소세포 폐암 세포주(EKVX)를 에리트로포이에틴 유전자(EPO)를 보유하는 2가지 상이한 아넬로좀을 사용하여 형질도입시켰다. 아넬로좀을 본원에 기재된 바와 같이, 시험관 내 환화에 의해 생성하였으며, 이는 LY2 또는 tth8 백본 중 어느 하나에 기초한 2가지 유형의 아넬로좀을 포함하였다(예를 들어, 각각 표 15 및 16 또는 표 5 및 6에 기재된 바와 같음). LY2-EPO 및 tth8-EPO 아넬로좀은 각각 예를 들어, 실시예 39에 기재된 바와 같이, 각각 LY2 또는 tth8 게놈의 EPO-인코딩 카세트 및 비-코딩 영역(5' UTR, GC-풍부 영역)을 포함하지만, 아넬로바이러스 ORF를 포함하지 않는 유전 요소를 포함하였다. 세포에 정제된 아넬로좀 또는 양성 대조군(고 용량 또는 아넬로좀과 동일한 용량의 AAV2-EPO)을 접종하고, 7일 동안 인큐베이션시켰다. 아넬로바이러스 ORF를 개별 시험관 내 환화된 DNA에 트랜스로 제공하였다. 배양 상청액을 접종 후 3일, 5.5일 및 7일에 시료 추출하고, 상용의 ELISA 키트를 사용하여 검정하여, EPO를 검출하였다. LY2-EPO 및 tth8-EPO 아넬로좀은 둘 모두 세포를 성공적으로 형질도입시켰으며, 이는 미처리(음성) 대조군 세포에 비하여 유의미하게 더 높은 EPO 역가를 보였다(모든 시점에 P < 0.013)(도 40).
실시예 42: 치료적 전이유전자를 갖는 아넬로좀은 정맥내(i.v.) 투여 후에 생체 내에서 검출될 수 있다
본 실시예에서, 인간 성장 호르몬(hGH)을 인코딩하는 아넬로좀은 정맥내(i.v.) 투여 후에 생체 내에서 검출되었다. LY2 백본에 기초한, 및 외인성 hGH(LY2-hGH)를 인코딩하는 복제-결핍 아넬로좀을 본원에 기재된 바와 같은 시험관 내 환화에 의해 생성하였다. LY2-hGH 아넬로좀의 유전 요소는 예를 들어, 실시예 39에 기재된 바와 같이, LY2 비-코딩 영역(5' UTR, GC-풍부 영역) 및 hGH-인코딩 카세트를 포함하였지만, 아넬로바이러스 ORF를 포함하지 않았다. LY2-hGH 아넬로좀을 마우스에 정맥내 투여하였다. 아넬로바이러스 ORF를 개별 시험관 내 환화된 DNA에서 트랜스로 제공하였다. 요약하여, 아넬로좀(LY2-hGH) 또는 PBS를 제0일에 정맥내 주사하였다(n=4 마우스/그룹). 아넬로좀을 마우스당 4.66E+07개의 아넬로좀 게놈으로 독립적인 동물 그룹에 투여하였다.
제1의 예에서, 아넬로좀 바이러스 게놈 DNA 카피를 검출하였다. 제7일에, 혈액 및 혈장을 수집하고, qPCR에 의해 hGH DNA 앰플리콘에 대하여 분석하였다. LY2-hGH 아넬로좀은 생체 내에서 감염 7일 후에 전혈의 세포 분획에 존재하였다(도 41a). 추가로, 혈장 중 아넬로좀의 부재는 이들 아넬로좀이 생체 내에서 복제될 수 없음을 입증한다(도 41b).
제2의 예에서, hGH mRNA 전사물을 생체 내 형질도입 후에 검출하였다. 제7일에, 혈액을 수집하고, qRT-PCR에 의해 hGH mRNA 전사물 앰플리콘에 대하여 분석하였다. GAPDH를 대조군 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. hGH mRNA 전사물을 전혈의 세포 분획에서 측정하였다. 아넬로좀-인코딩된 전이유전자로부터의 mRNA를 생체 내에서 검출하였다(도 42).
실시예 43: 아넬로바이러스 내의 코딩 서열 크기 분포
모든 아넬로바이러스의 코딩 서열(CDS) 길이를 내부적으로 확인된 대규모 야생형 주의 카탈로그를 사용하여 평가하였다. 아넬로바이러스의 CDS 길이를 플롯팅하여, 3가지 인간 아넬로바이러스 속(알파토르크바이러스, 알파; 베타토르크바이러스, 베타; 및 감마토르크바이러스, 감마) 간에 바이러스 주를 비교하고, 공개적으로 이용 가능한 게놈 서열 길이를 본 발명자들에 의해 내부적으로(사내에서) 어셈블된 것들과 비교하였다. 모든 아넬로바이러스의 평균 CDS 길이는 약 2100개 뉴클레오티드이다. 알파토르크바이러스 속의 TTV는 베타토르크바이러스 및 감마토르크바이러스 속(각각 TTV minis 및 TTV midis)으로부터의 아넬로바이러스보다 더 컸다. 구체적으로, 평균 2237개 뉴클레오티드의 CDS가 알파토르크바이러스 TTV에서 관찰되었으며, 1800 내지 2541개 뉴클레오티드의 범위를 가졌다. 평균 2011개 뉴클레오티드의 CDS 길이가 베타토르크바이러스에 대하여 관찰되었으며, 1803 내지 2229개 뉴클레오티드의 범위를 가졌다. 평균 2012개 뉴클레오티드의 CDS 길이가 감마토르크바이러스에 대하여 관찰되었으며, 1812 내지 2379개 뉴클레오티드의 범위를 가졌다.
실시예 44: ORF2를 특성화하기 위한 고도로 보존된 모티프
도 43a에서 예시적인 게놈에 나타낸 바와 같이, 아넬로바이러스 ORF2는 가능한 포스파타제 활성을 갖는 비-구조적 단백질을 인코딩하고, 바이러스 복제 및 숙주 면역성의 조절에서 역할을 수행할 것으로 예상된다. 대규모 바이러스 서열 보관소를 보존된 ORF2 아미노산 모티프의 존재에 대하여 시험하였다(도 43b). 이어서, 이 모티프를 사용하여, 사 내(in-house) 및 공개 서열 간에 1,000개가 넘는 아넬로바이러스 ORF2 서열을 확인하였다. 이 ORF2 모티프는 방대한 인간 아넬로바이러스 주, 및 시험된 모든 비-인간 아넬로바이러스(설치류, 돼지 및 영장류 아넬로바이러스, 및 닭 빈혈 바이러스)의 카탈로그에 걸쳐 보존되어 유지되는 것이 관찰되었으며, 이는 ORF2 모티프가 현재까지 확인된 가장 고도로 보존된 아넬로바이러스 모티프가 되게 한다. ORF2 구조적 모델링도 수행하였으며, 이에 의해, ORF2 모티프 내의 보존된 잔기가 나선-회전-나선 구조에서 유지되는 것이 드러났으며, 배향은 가능한 금속 결합 도메인을 시사한다(도 43c). 흥미롭게도, ORF2에 비하여 ORF1의 계통수(도 43d)는 알파토르크바이러스, 베타토르크바이러스 및 감마토르크바이러스에 의한 유사한 속-수준 파단을 보였으며, 이는 ORF2가 속-특이적인 것을 나타낸다.
실시예 45: 인간 내의 전장 아넬로바이러스 ORF1 mRNA에 대한 증거
아넬로바이러스는 시험관 내에서 적어도 3가지의 대안적으로 스플라이싱된 mRNA를 발현하며, 이 중 가장 긴 것(약 2.2kb)은 전장 ORF1을 인코딩하는 것으로 예측된다. 본 실시예에서, ORF1 mRNA 전사를 생체 내에서 평가하였다.
이를 행하기 위하여, GTEx(유전형-조직 발현) 프로젝트로부터 공개적으로 이용 가능한 RNA Seq 조직 데이터를 시험하였다. 목적은 바이러스 전사물을 범주화하기에 충분한 아넬로바이러스 RNA 판독물을 함유하는 인간 조직 시료를 확인하는 것이었다. 아넬로바이러스 RNA 판독물을 갖는 104개의 조직 시료를 확인하였으며(모든 조직의 2.4%, 혈액 시료의 19%); 이들 시료 중 7개가 20개 초과의 아넬로바이러스 RNA 판독물을 가졌으며, 이는 바이러스 전사체 분석을 가능하게 한다. 이들 7개의 아넬로바이러스-양성 시료 중 3개는 일치되는 WGS 데이터도 또한 가졌으며, 이로부터 정밀한 판독물 맵핑을 위하여 상응하는 아넬로바이러스 DNA 게놈을 어셈블시킬 수 있다(도 44a). 상응하는 바이러스 참조 게놈의 부재 하에, 아넬로바이러스 다양성은 정보를 제공하는 RNA 판독물 맵핑을 막는다. ORF1 영역에 맵핑되는 RNA 판독물이 3명의 공여자에서 검출되었다(2개의 혈액 시료 및 1개의 폐 조직 시료). 1개의 공여자 혈액 시료에서, 전장 ORF1 영역을 포괄하는 아넬로바이러스 RNA 판독물을 확인하였다(도 44b, 회색 막대는 판독물 쌍을 나타낸다). 이것은 RNA Seq 데이터를 사용하여 생체 내에서 전장 아넬로바이러스 전사물을 처음으로 확인한 것이다.
실시예 46: 시험관 내에서 아넬로좀을 생성하기 위한 투입 물질로서 시험관 내 환화된 게놈
본 실시예는 본원에 기재된 바와 같은 아넬로좀 유전 요소에 대한 공급원 물질로서, 시험관 내 환화된(IVC) 이중 가닥 아넬로바이러스 DNA가 예상되는 밀도의 패키징된 아넬로좀 게놈을 제공하는 데 플라스미드 내의 아넬로바이러스 게놈 DNA보다 더욱 강력한 것을 보여준다.
T75 플라스크 내의 1.2E+07개의 HEK293T 세포(인간 배아 신장 세포주)를 11.25 ㎍의 (i) 시험관 내 환화된 이중 가닥 TTV-tth8 게놈(IVC TTV-tth8), (ii) 플라스미드 백본 내의 TTV-tth8 게놈 또는 (iii) TTV-tth8의 ORF1 서열만을 함유하는 플라스미드(비-복제성 TTV-tth8) 중 어느 하나로 트랜스펙션시켰다. 세포를 트랜스펙션 7일 후에 수집하고, 0.1% 트리톤으로 용해시키고, ㎖당 100 유닛의 벤조나제로 처리하였다. 용해물을 염화세슘 밀도 분석을 위해 사용하였으며; 염화세슘 선형 기울기의 각각의 분획에 대하여 밀도를 측정하였으며, TTV-tth8 카피 정량화를 수행하였다. 도 45에 나타낸 바와 같이, IVC TTV-tth8은 예상되는 1.33의 밀도에서, TTV-tth8 플라스미드에 비하여 현저하게 더 많은 바이러스 게놈 카피를 제공하였다.
1E+07개의 Jurkat 세포(인간 T 림프구 세포주)를 플라스미드 내의 시험관 내의 환화된 LY2 게놈(LY2 IVC) 또는 LY2 게놈 중 어느 하나를 사용하여 뉴클레오펙션시켰다. 세포를 트랜스펙션 4일 후에 수집하고, 0.5% 트리톤 및 300 mM 염화나트륨을 함유하는 완충제를 사용하여 용해시킨 후, 2회의 즉각적인 동결-해동을 행하였다. 용해물을 100 유닛/㎖의 벤조나제를 사용하여 처리한 후, 염화세슘 밀도 분석을 행하였다. 밀도 측정 및 LY2 게놈 정량화를 염화세슘 선형 기울기의 각각의 분획 상에서 수행하였다. 도 46에 나타낸 바와 같이, Jurkat 세포 내의 시험관 내 환화된 LY2 게놈의 트랜스펙션은 도 46에서 검출 가능한 피크를 보이지 않았던 LY2 게놈을 함유하는 플라스미드의 트랜스펙션에 비하여, 예상되는 밀도에서 날카로운 피크를 야기하였다.
실시예 47: 아넬로바이러스 ORF1 내의 보존된 2차 구조 모티프의 확인
본 실시예에서, 컴퓨터 모델링을 사용하여, 아넬로바이러스 ORF1 단백질의 2차 구조 내의 보존된 모티프를 확인하였다. 2차 구조 예측을 프로그램 JPred를 사용하여 단일의 주 상에서 행하였다.
일반적으로, 인간 TTV의 젤리-롤 도메인은 대략 200개 아미노산 (AA) ± 3개 AA 길이이다. 예시적인 젤리-롤 도메인의 2차 구조는 5 내지 7개 AA의 베타 가닥으로 시작하여, 3 내지 5개 AA 랜덤 코일, 15 내지 16개 AA 베타 가닥, 26 내지 28개 AA 랜덤 코일, 15 내지 17개 AA 알파 나선, 2개 AA 랜덤 코일, 3 내지 4개 AA 베타 가닥, 8개 AA 랜덤 코일, 10 내지 11개 AA 베타 가닥, 5 내지 6개 AA 랜덤 코일, 6 내지 7개 AA 베타 가닥, 8 내지 14개 AA 랜덤 코일, 8 내지 14개 AA 알파-나선(일부 경우에, 2개의 더 작은 나선으로 파단될 수 있음), 3 내지 4개 AA 랜덤 코일, 4 내지 5개 AA 베타 가닥, 10개 AA 랜덤 코일, 5 내지 6개 AA 베타 가닥, 20 내지 21개 AA 랜덤 코일, 7 내지 9개 AA 베타 가닥, 14 내지 16개 AA 랜덤 코일, 5 내지 7개 AA 베타 가닥으로 이어진다. 알파토르크바이러스, 베타토르크바이러스 및 감마토르크바이러스 클레이드로부터의 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 2차 구조의 정렬은 도 47에 나타나 있다.
ORF1의 N22 도메인 내의 YNPX2DXGX2N (SEQ ID NO: 829) 모티프의 2차 구조는 또한, 그 주변에 보존된 2차 구조를 갖는다. 대부분의 모티프는 모티프의 위치 1의 티로신(Y) 뒤에서 파단되는 5 내지 6개 AA 베타 가닥으로 시작하여, 7 내지 8개 AA의 또 다른 베타 가닥이 기원하는 지점인 말단 아스파라긴(N)까지 8 내지 9개 AA 랜덤 코일로 정렬된다. 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 N22 모티프 서열의 정렬은 도 48에 나타나 있다. 모티프 내의 티로신은 베타 가닥을 파단시키고, 제2 베타 가닥은 모티프의 말단 아스파라긴에서 시작한다.
SEQUENCE LISTING <110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS V, INC. <120> ANELLOSOMES AND METHODS OF USE <130> V2057-7005WO <140> <141> <150> 62/778,841 <151> 2018-12-12 <150> 62/778,866 <151> 2018-12-12 <160> 1000 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3570 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 1 attttgtgca gcccgccaat tctcgttcaa acaggccaat caggaggctc tacgtacact 60 tcctggggtg tgtcttcgaa gagtatataa gcagaggcgg tgacgaatgg tagagttttt 120 cctggcccgt ccgcggcgag agcgcgagcg gagcgagcga tcgagcgtcc cgtgggcggg 180 tgccgtaggt gagtttacac accgcagtca aggggcaatt cgggctcggg actggccggg 240 ctatgggcaa gattcttaaa aaattccccc gatccctctg tcgccaggac ataaaaacat 300 gccgtggaga ccgccggtgc atagtgtcca ggggcgagag gatcagtggt tcgcgagctt 360 ttttcacggc cacgcttcat tttgcggttg cggtgacgct gttggccatc ttaatagcat 420 tgctcctcgc tttcctcgcg ccggtccacc aaggccccct ccggggctag agcagcctaa 480 ccccccgcag cagggcccgg ccgggcccgg agggccgccc gccatcttgg cgctgccggc 540 tccgcccgcg gagcctgacg acccgcagcc acggcgtggt ggtggggacg gtggcgccgc 600 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16 tgctacgtca ctaacccacg tgtcctctac aggccaatcg cagtctatgt cgtgcacttc 60 ctgggcatgg tctacataat tatataaatg cttgcacttc cgaatggctg agtttttgct 120 gcccgtccgc ggagaggagc cacggcaggg gatccgaacg tcctgagggc gggtgccgga 180 ggtgagttta cacaccgaag tcaaggggca attcgggctc aggactggcc gggctttggg 240 caaggctctt aaaaatgcac ttttctcgaa taagcagaaa gaaaaggaaa gtgctactgc 300 tttgcgtgcc agcagctaag aaaaaaccaa ctgctatgag cttctggaaa cctccggtac 360 acaatgtcac ggggatccaa cgcatgtggt atgagtcctt tcaccgtggc cacgcttctt 420 tttgtggttg tgggaatcct atacttcaca ttactgcact tgctgaaaca tatggccatc 480 caacaggccc gagaccttct gggccaccgg gagtagaccc caacccccac atccgtagag 540 ccaggcctgc cccggccgct ccggagccct cacaggttga ttcgagacca gccctgacat 600 ggcatgggga tggtggaagc gacggaggcg ctggtggttc cggaagcggt ggacccgtgg 660 cagacttcgc agacgatggc ctcgatcagc tcgtcgccgc cctagacgac gaagagtaag 720 gaggcgcaga cggtggagga gggggagacg aaaaacaagg acttacagac gcaggagacg 780 ctttagacgc aggggacgaa aagcaaaact tataataaaa ctgtggcaac ctgcagtaat 840 taaaagatgc agaataaagg gatacatacc actgattata agtgggaacg gtacctttgc 900 cacaaacttt accagtcaca taaatgacag aataatgaaa ggccccttcg ggggaggaca 960 cagcactatg aggttcagcc tctacatttt gtttgaggag cacctcagac acatgaactt 1020 ctggaccaga agcaacgata acctagagct aaccagatac ttgggggctt cagtaaaaat 1080 atacaggcac ccagaccaag actttatagt aatatacaac agaagaaccc ctctaggagg 1140 caacatctac acagcaccct ctctacaccc aggcaatgcc attttagcaa aacacaaaat 1200 attagtacca agtttacaga caagaccaaa gggtagaaaa gcaattagac taagaatagc 1260 accccccaca ctctttacag acaagtggta ctttcaaaag gacatagccg acctcaccct 1320 tttcaacatc atggcagttg aggctgactt gcggtttccg ttctgctcac cacaaactga 1380 caacacttgc atcagcttcc aggtccttag ttccgtttac aacaactacc tcagtattaa 1440 tacctttaat aatgacaact cagactcaaa gttaaaagaa tttttaaata aagcatttcc 1500 aacaacaggc acaaaaggaa caagtttaaa tgcactaaat acatttagaa cagaaggatg 1560 cataagtcac ccacaactaa aaaaaccaaa cccacaaata aacaaaccat tagagtcaca 1620 atactttgca cctttagatg ccctctgggg agaccccata tactataatg atctaaatga 1680 aaacaaaagt ttgaacgata tcattgagaa aatactaata aaaaacatga ttacatacca 1740 tgcaaaacta agagaatttc caaattcata ccaaggaaac aaggcctttt gccacctaac 1800 aggcatatac agcccaccat acctaaacca aggcagaata tctccagaaa tatttggact 1860 gtacacagaa ataatttaca acccttacac agacaaagga actggaaaca aagtatggat 1920 ggacccacta actaaagaga acaacatata taaagaagga cagagcaaat gcctactgac 1980 tgacatgccc ctatggactt tactttttgg atatacagac tggtgtaaaa aggacactaa 2040 taactgggac ttaccactaa actacagact agtactaata tgcccttata cctttccaaa 2100 attgtacaat gaaaaagtaa aagactatgg gtacatcccg tactcctaca aattcggagc 2160 gggtcagatg ccagacggca gcaactacat accctttcag tttagagcaa agtggtaccc 2220 cacagtacta caccagcaac aggtaatgga ggacataagc aggagcgggc cctttgcacc 2280 taaggtagaa aaaccaagca ctcagctggt aatgaagtac tgttttaact ttaactgggg 2340 cggtaaccct atcattgaac agattgttaa agaccccagc ttccagccca cctatgaaat 2400 acccggtacc ggtaacatcc ctagaagaat acaagtcatc gacccgcggg tcctgggacc 2460 gcactactcg ttccggtcat gggacatgcg cagacacaca tttagcagag caagtattaa 2520 gagagtgtca 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tcgggctcgt ttttaggcct tccggactac aaaaatcgcc attttggtga 3420 cgtcacggcc gccatcttaa gtagttgagg cggacggtgg cgtgagttca aaggtcacca 3480 tcagccacac ctactcaaaa tggtggacaa tttcttccgg gtcaaaggtt acagccgcca 3540 tgttaaaaca cgtgacgtat gacgtcacgg ccgccatttt gtgacacaag atggccgact 3600 tccttcctct ttttcaaaaa aaagcggaag tgccgccgcg gcggcggggg gcggcgcgct 3660 gcgcgcgccg cccagtaggg ggagccatgc gccccccccc gcgcatgcgc ggggcccccc 3720 cccgcggggg gctccgcccc ccggcccccc ccg 3753 <210> 17 <211> 127 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 17 Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 1 5 10 15 Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 20 25 30 Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 35 40 45 Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 50 55 60 His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 65 70 75 80 Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 85 90 95 Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly 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ccgggcaccc 540 cgcagataag gagagccagg cctagtcccg ccgcaccaga gcagcccgct gccctaccat 600 ggcatgggga tggtggagat ggcggcgccg ctggcccgcc agacgctgga ggagacgccg 660 tcgccggcgc cccgtacgga gaacaagagc tcgccgacct gctcgacgct atagaagacg 720 acgaacagta agaaccaggc gaaggcggtg ggggcgcaga cggtacagac ggggctggag 780 acgcaggact tatgtgagaa aggggcgaca cagaaaaaag aaaaagagac tgatactgag 840 acagtggcaa ccagccacaa gacgcagatg taccataact gggtacctgc ccatagtgtt 900 ctgcggccac actaggggca ataaaaacta tgcactacac tctgacgact acacccccca 960 aggacaacca tttggagggg ctctaagcac tacctcattc tctttaaaag tactatttga 1020 ccagcatcag agaggactaa acaagtggtc ttttccaaac gaccaactag acctcgccag 1080 atatagaggc tgcaaattta tattttatag aacaaaacaa actgactggg tgggccagta 1140 tgacatatca gaaccctaca agctagacaa atacagctgc cccaactatc accctggaaa 1200 catgattaag gcaaagcaca aatttttaat accaagctat gacactaatc ctagaggcag 1260 acaaaaaatt atagttaaaa ttcccccccc agacctcttt gtagacaagt ggtacactca 1320 agaggatctg tgttccgtta atcttgtgtc acttgcggtt tctgcggctt cctttctcca 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780 acgaaagaga cgttataggg gtcgccgctt taaaaagaaa ctagtactga ctcagtggca 840 ccctaatacc atgagacgct gcttaatcaa gggcatagtc cccctggtaa tatgcggcca 900 caccaggtgg aactacaact acgccctcca tagcaaggac tacacagagg agggtcgcta 960 ccctcacggg ggggccctca gcaccactac gtggtccctt aaggtgctgt atgacgagca 1020 cctcaaacac cacgacttct ggggctatcc caacaaccag ctagacctgg ccaggtacaa 1080 gggggccaag ttcaccttct acagacacaa aaagactgac tttataatat tctttaacag 1140 aaagcctccc tttaagctaa acaagtacag ctgtgcctcc tatcacccag gcatgctgat 1200 gcagcagaga cacaagatcc tgctacccag ctacgaaact aaacccaagg gcaggccaaa 1260 gataacagtt agaataaagc cccccactct gttagaggac aagtggtaca cccagcagga 1320 cctgtgcgac gttaacctgt tgcaacttgt ggtcactgcg gctgactttc gacatccact 1380 ctgctcacca caaacgaaca ctccaaccac aaccttccag gtgttgaaag acatctatta 1440 tgacactatg agcatatctg aacccacaga ctcctacact agtgttaaca ataaaagtac 1500 aacacaaact tttactaact actcaaacac cttagaaaac attctgtaca cacgagcctc 1560 ctactggaac tcgttccacg ccactgaata cctaaacccc aacatcatat acaaaaacgg 1620 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 128 gccgcg 6 <210> 129 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 129 ttcgcgcgcc gcccaccagg gggtg 25 <210> 130 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 130 ctgcg 5 <210> 131 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 131 cgcccccccc cgcgcat 17 <210> 132 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 132 gcgcggggcc ccccccc 17 <210> 133 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 133 gggggggctc cgcccccccg gccccccccc gtgctaaacc caccgcgcat 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Synthetic oligonucleotide" <400> 138 cccccccccc cgcgcat 17 <210> 139 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 139 gcacgggtcc ccccccccac ggggggctcc g 31 <210> 140 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 140 ccccccggcc ccccccc 17 <210> 141 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 141 ccgtcggcgg gggggccgcg cgctgcgcgc gcggcccccg ggggaggcac agcctccccc 60 ccccgcgcgc atgcgcgcgg gtcccccccc ctccgggggg ctccgccccc cggccccccc 120 c 121 <210> 142 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 142 ccgtcggcgg gggggccgcg cgctgcgcgc gcggccc 37 <210> 143 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial 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primer" <400> 692 gctcccactc ctgatttctg 20 <210> 693 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 693 ccttgactac ggtggtttca c 21 <210> 694 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 694 tgcaggcatt cgagggcttg tt 22 <210> 695 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 695 tttaaccccc tagtcccagg 20 <210> 696 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 696 tttgtgacac aagatggccg acttccttcc tctttagtct tccccaaaga agacaa 56 <210> 697 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 697 gaagcccacc aaaagcaatt 20 <210> 698 <211> 21 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 803 gccgccgcgg cggcgggggg cggcgcgctg cgcgcgccgc ccagtagggg gagccatgcg 60 cccccccccg cgcatgcgcg gggccccccc ccgcgggggg ctccgccccc cggccccccc 120 cg 122 <210> 804 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 804 cggcccagcg gcggcgcgcg cgcttcgcgc gcgcgccggg gggctccgcc cccccccgcg 60 catgcgcggg gccccccccc gcggggggct ccgccccccg gtcccccccc g 111 <210> 805 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 805 cggccgtgcg gcggcgcgcg cgcttcgcgc gcgcgccggg ggctgccgcc cccccccgcg 60 catgcgcgcg gggccccccc ccgcgggggg ctccgccccc cggccccccc ccccg 115 <210> 806 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 806 cggcggcggc gcgcgcgcta 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sequence " <400> 814 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggaggccg 60 ggccatggg 69 <210> 815 <211> 71 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Alphatorquevirus clade sequence " <400> 815 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggccccgg g 71 <210> 816 <211> 71 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Alphatorquevirus clade sequence " <400> 816 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggctatgg g 71 <210> 817 <211> 71 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Alphatorquevirus clade sequence " <400> 817 cgggtgccga aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggctatgg g 71 <210> 818 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 818 gcgctkcgcg cgcgcgccgg ggggctgcgc cccccc 36 <210> 819 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (170)..(170) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (246)..(246) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (276)..(276) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (360)..(360) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (370)..(370) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (434)..(434) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (682)..(682) <223> Any amino acid <400> 828 Met Ala Trp Gly Trp Trp Arg Arg Arg Arg Met Ala Trp Arg Arg Trp 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Pro Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg 35 40 45 Arg Arg Gly Arg Trp Arg Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg 50 55 60 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Val Leu Thr Gln Trp Gln 65 70 75 80 Pro Asn Thr Val Arg Arg Cys Tyr Ile Arg Arg Gly Tyr 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tggcaggcat tacagaaaga aaagggcgct 300 gccactgtgt gctgtgcgat caacaaagaa ggcttgcaaa ctactaatag taatgtggac 360 cccacctcgc aatgaccaac agtaccttaa ctggcaatgg tactcaagta tacttagctc 420 ccacgctgct atgtgcgggt gtcccgacgt tgttgctcat tttaatcatc ttgcttctgt 480 gcttcgcgcc ccgcaaaatc cacccccacc cggtccccag cgaaacctgc ccctccgacg 540 gctgccggct ctcccggctg cgccagaggc gcccggagat agagcaccat ggcctatggc 600 tggtggcgcc ggaggagaag acggtggcgc aggtggagac gcagaccatg gaggcgccgc 660 tggaggacca gaagacgcag acctgttaga cgccgtggcc gccgcagaaa cgtaaggaga 720 cgccgcagag gagggaggtg gaggaggagg tacaggagat ggaaaagaaa gggcagacgc 780 agaaaaaaag ctaaaataat aataagacaa tggcaaccta actacagaag gagatgtaac 840 atagtaggct atattcctgt actgatatgt ggcgaaaata ctgtcagcag aaactatgcc 900 acacactcag acgatactaa ctacccagga ccctttgggg ggggtatgac tacagacaaa 960 tttaccttaa gaattctgta tgacgagtac aaaaggttta tgaactattg gacagcatct 1020 aatgaagacc tagacctctg tagatatcta ggagtaaacc tgtacttttt tagacaccca 1080 gaagtagact ttattataaa aataaatacc atgccccctt ttctagacac agaactaaca 1140 gctcctagca tacacccagg aatgctagcc ttagacaaaa gagcaagatg gatacctagc 1200 ttaaaatcta gaccaggaaa aaaacactat attaaaataa gagtaggggc gcctaaaatg 1260 ttcacagata aatggtaccc ccaaacagat ctttgtgaca tggtgctgct aactgtctat 1320 gcaaccgcag cggatatgca atatccgttc ggctcaccac taactgactc tgtggttgtg 1380 aacttccagg ttctgcaatc catgtatgat gaaaccatta gcatattacc agatcaaaag 1440 gagaaaagaa taacgctgct cactagtata gccttttata acaccacaca aactatagcc 1500 caattaaagc catttataga tgcaggcaat atgacttcaa ctacaacagc aacaacatgg 1560 ggatcataca taaacacaac caaatttaat acagcagcca ctacaacata cacataccca 1620 ggcagtacta caactacagt aactatgtta acttgtaatg actcctggta cagaggaaca 1680 gtatataacg accaaattaa aaatttacca aaggaagcag ctcaattata cttaaaagca 1740 acaaaaacct tactaggaaa caccttcaca aatgacgacc acacactaga ataccatgga 1800 ggactgtaca gctcaatttg gctgtccccc ggcagatctt actttgaaac accaggagca 1860 tacacagaca taaaatacaa cccatttaca gacagaggag aaggaaacat gctatggata 1920 gactggctaa gcaaaaaaaa tatgaactat gacaaactac 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tccaaaaaat ccaacaaaat 2820 caagatatca accctacctt gttaccaagg gggggggatc tagcatcctt atttcaaata 2880 gcaccataaa catgtttgga gaccccaaac cttacaaccc ttccagtaat gactggaaag 2940 aggagtatga ggcctgtaga atatgggaca gacccccaag aggcaatcta agagacaccc 3000 ccttttaccc ctgggccccc aaagaaaacc agtaccgtgt aaactttaaa cttggatttc 3060 aataaagcta ggccgtggga ctttcacttg tcggtgtctg cttataaaag taaccaagca 3120 ctccgagcga agcgaggagt gcgacccttg ggggctcaac gacttcggag ccgcgcgtta 3180 agccttcggc tgcgcgcggc acctcagacc cccgctcgtg ctgacacgct tgcgcgtgtc 3240 agaccacttc gggctcgcgg gggtcgggaa atttattaaa cagactccga gttgccattg 3300 gacacagtag tctatgaaca gcaacgaaag tgagtggggc cagacttcgc cataaggcct 3360 ttatcttctt gccatttgtc agtatagagg gtcgccatag gcttcggtct ccattttaac 3420 ctgtaaaaac taccaaaatg gccgttccag tgacgtgaca gccgccattt taagtagctg 3480 acgtcaagga ttgacgtaaa ggttaaaggt catcctcggc ggaagctaca caaaatggtg 3540 gacaacatct tccgggtcaa aggtcgtgca cacgtcaaaa gtcacgtggt ggggacccgc 3600 tgtaacccgg aagtaggccc cgtcacgtga tttgtcacgt gtgtacacgt cacagccgcc 3660 attttgtttt acaaaatggc tgacttcctt cctctttttt gaaaaaaggc gccaaaaaag 3720 gctccgcccc ccggcccccc cc 3742 <210> 855 <211> 120 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 855 Met Trp Thr Pro Pro Arg Asn Asp Gln Gln Tyr Leu Asn Trp Gln Trp 1 5 10 15 Tyr Ser Ser Ile Leu Ser Ser His Ala Ala Met Cys Gly Cys Pro Asp 20 25 30 Val Val Ala His Phe Asn His Leu Ala Ser Val Leu Arg Ala Pro Gln 35 40 45 Asn Pro Pro Pro Pro Gly Pro Gln Arg Asn Leu Pro Leu Arg Arg Leu 50 55 60 Pro Ala Leu Pro Ala Ala Pro Glu Ala Pro Gly Asp Arg Ala Pro Trp 65 70 75 80 Pro Met Ala Gly Gly Ala Gly Gly Glu Asp Gly Gly Ala Gly Gly Asp 85 90 95 Ala Asp His Gly Gly Ala Ala Gly Gly Pro Glu Asp Ala Asp Leu Leu 100 105 110 Asp Ala Val Ala Ala Ala Glu Thr 115 120 <210> 856 <211> 286 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 856 Met Trp Thr Pro Pro Arg Asn Asp Gln Gln Tyr Leu Asn Trp Gln Trp 1 5 10 15 Tyr Ser Ser Ile Leu Ser Ser His Ala Ala Met Cys Gly Cys Pro Asp 20 25 30 Val Val Ala His Phe Asn His Leu Ala Ser 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tgcacatact atcaaacaac acaagtactg gcacagctat ctcctgcctt 1560 tcaacctgct atgaaaccta ctactacaca atcagcagct acagcgacaa cactaggaaa 1620 ctatgtacca gagttaaagt acaacaatgg ctcttttcac acaggacaaa acgcagtatt 1680 cggcatgtgc tcatacaaac caacagacag cataatgaca aaagctaatg gctggttttg 1740 gcaaaaccta atggtagaca acaacctaca tagttcttat ggcaaggcaa cattagaatg 1800 catggagtat cacacaggca tatacagctc tatatttcta agtccacaaa gatctttaga 1860 attcccagca gcataccaag acgttacata caaccctaac tgtgatagag cagttggaaa 1920 cgtagtttgg tttcagtaca gcactaaaat ggatacaaat tttgatgaaa caaaatgtaa 1980 atgtgtcctt aaaaacattc cactgtgggc ggccttcaat ggctactcag actttataat 2040 gcaagaactc agcataagta cagaaatcca caactttggc atagtgtgct ttcagtgccc 2100 gtacactttt cccccctgtt tcaataaaaa caaaccccta aaggggtacg tgttctatga 2160 caccaccttt ggtaatggaa aaatgccaga cggatcgggg cacgtaccca tctactggca 2220 gcagagatgg tggatcagac tagccttcca ggtccaggtc atgcatgact ttgtactaac 2280 aggccccttt agctacaaag atgacctagc aaacaccaca ctcacagcca gatacaaatt 2340 taaattcaaa 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Ile Asp Phe Val Ile Val Tyr Glu Arg Gln Pro Pro Phe Glu 100 105 110 Ile Asp Lys Leu Thr Tyr Met Lys Tyr His Pro Tyr Met Leu Leu Gln 115 120 125 Arg Lys His Lys Ile Ile Leu Pro Ser Gln Thr Thr Asn Pro Arg Gly 130 135 140 Lys Leu Lys Lys Lys Lys Thr Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser 145 150 155 160 Lys Trp Phe Phe Gln Gln Gln Phe Ala Lys Tyr Asp Leu Leu Leu Ile 165 170 175 Ala Ala Ala Ala Cys Ser Leu Arg Tyr Pro Arg Ile Gly Cys Cys Asn 180 185 190 Glu Asn Arg Met Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Asn Thr 195 200 <210> 974 <211> 204 <212> PRT <213> Torque teno midi virus <400> 974 Lys Ile Thr Ile Lys Gln Trp Gln Pro Asp Ser Val Lys Lys Cys Lys 1 5 10 15 Ile Lys Gly Tyr Ser Thr Leu Val Met Gly Ala Gln Gly Lys Gln Tyr 20 25 30 Asn Cys Tyr Thr Asn Gln Ala Ser Asp Tyr Val Gln Pro Lys Ala Pro 35 40 45 Gln Gly Gly Gly Phe Gly Cys Glu Val Phe Asn Leu Lys Trp Leu Tyr 50 55 60 Gln Glu Tyr Thr Ala His Arg Asn Ile Trp Thr Lys Thr Asn Glu Tyr 65 70 75 80 Thr Asp Leu Cys Arg Tyr Thr Gly Ala Gln Ile Ile Leu Tyr Arg His 85 90 95 Pro Asp Val Asp Phe Ile Val Ser Trp Asp Asn Gln Pro Pro Phe Leu 100 105 110 Leu Asn Lys Tyr Thr Tyr Pro Glu Leu Gln Pro Gln Asn Leu Leu Leu 115 120 125 Ala Arg Arg Lys Arg Ile Ile Leu Ser Gln Lys Ser Asn Pro Lys Gly 130 135 140 Lys Leu Arg Ile Lys Leu Arg Ile Pro Pro Pro Lys Gln Met Ile Thr 145 150 155 160 Lys Trp Phe Phe Gln Arg Asp Phe Cys Asp Val Asn Leu Phe Lys Leu 165 170 175 Cys Ala Ser Ala Ala Ser Phe Arg Tyr Pro Gly Ile Ser His Gly Ala 180 185 190 Gln Ser Thr Ile Phe Ser Ala Tyr Ala Leu Asn Thr 195 200 <210> 975 <211> 204 <212> PRT <213> Torque teno midi virus <400> 975 Phe Leu Lys Leu Val Gln Trp Gln Pro Asp Arg Ile Arg Lys Cys Thr 1 5 10 15 Ile Lys Gly Arg Gly Thr Leu Val Met Gly Ala His Gly Arg Gln Met 20 25 30 Ile Cys Phe Thr Asn Val Lys Asp Arg Leu Thr Pro Ser Arg Ala Pro 35 40 45 Ala Gly Gly Gly Phe Gly Val Glu Arg Ile Thr Leu Ala His Leu Tyr 50 55 60 Glu Glu Trp Lys Ala Arg Asn Asn Val Trp Thr Ala Thr Asn Glu Asn 65 70 75 80 Thr Asp Leu Gly Arg Tyr Thr Gly Cys Lys Ile Ser Phe Tyr Arg His 85 90 95 Leu Asp Thr Asp Phe Ile Ile Lys Tyr Ser Arg Asn Pro Pro Phe Asn 100 105 110 Leu Glu Lys Tyr Ser Tyr Met Tyr Met Gln Pro Gln Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Gly Lys His Lys Arg Ile Leu Leu Ser Lys Lys Thr Asn Pro Lys Gly 130 135 140 Lys Leu Lys Thr Thr Leu Lys Ile Gly Pro Pro Lys Leu Leu Thr Asn 145 150 155 160 Lys Trp Leu Leu Gln Ser Glu Leu Ala Lys Gln Asp Leu Val Glu Ile 165 170 175 Ser Ala Ala Ala Ala Ser Phe Thr Tyr Pro Thr Ile Gly Cys Cys Asn 180 185 190 Glu Asn Arg Ile Leu Asn Leu Tyr Ser Ile Asn Thr 195 200 <210> 976 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 976 Pro Tyr Thr Asp Ile Thr Tyr Asn Pro Phe Ser Asp Arg Gly Glu Gly 1 5 10 15 Asn Met Leu Trp Ile Asp Trp Leu 20 <210> 977 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 977 Ala Tyr Thr Asp Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Thr Asp Arg Gly Glu Gly 1 5 10 15 Asn Met Leu Trp Ile Asp Trp Leu 20 <210> 978 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 978 Ala Tyr Ser Asp Ile Ile Tyr Asn Pro Leu Thr Asp Lys Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Ile Ile Trp Ile Asp Tyr Leu 20 <210> 979 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 979 Ala Tyr Thr Asp Val Ile Tyr Asn Pro Phe Thr Asp Lys Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Met Val Trp Ile Asp Tyr Leu 20 <210> 980 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 980 Ala Tyr Gln Asp Ile Ile Tyr Asn Pro Phe Thr Asp Lys Gly Ile Gly 1 5 10 15 Asn Ile Val Trp Ile Asp Trp Leu 20 <210> 981 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 981 Pro Tyr Thr His Val Arg Tyr Asn Pro Leu Val Asp Lys Gly Phe Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Tyr Ile Gln Trp Cys 20 <210> 982 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 982 Pro Tyr Thr His Val Arg Tyr Asn Pro Leu Val Asp Lys Gly Phe Gly 1 5 10 15 Asn Arg Ile Tyr Ile Gln Trp Cys 20 <210> 983 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 983 Ala Tyr Thr Glu Val Ser Tyr Asn Pro Trp Thr Asp Glu Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Val Val Cys Leu Gln Tyr Leu 20 <210> 984 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 984 Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro Tyr Thr Asp Lys Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu 20 <210> 985 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 985 Ala Tyr Gln Asp Val Thr Tyr Asn Pro Asn Cys Asp Arg Ala Val Gly 1 5 10 15 Asn Val Val Trp Phe Gln Tyr Ser 20 <210> 986 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 986 Ala Tyr Gln Asp Val Thr Tyr Asn Pro Asn Cys Asp Arg Gly Val Asn 1 5 10 15 Asn Arg Val Trp Val Gln Pro Leu 20 <210> 987 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 987 Ala Tyr Gln Asp Val Thr Tyr Asn Pro Leu Met Asp Lys Gly Val Gly 1 5 10 15 Asn His Ile Trp Phe Gln Tyr Asn 20 <210> 988 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 988 Ala Tyr Val Asp Thr Thr Tyr Asn Pro Leu Met Asp Lys Gly Lys Gly 1 5 10 15 Asn Lys Ile Trp Phe Gln Tyr Leu 20 <210> 989 <211> 24 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 989 Ala Tyr Arg Asp Ile Val Tyr Asn Pro Phe Leu Asp Lys Ala Gln Gly 1 5 10 15 Asn Met Val Trp Phe Gln Tyr His 20 <210> 990 <211> 21 <212> PRT <213> Torque teno mini virus <400> 990 Glu Cys Arg Tyr Asn Pro Phe Asn Asp Lys Ser Thr Gly Asn Asn Thr 1 5 10 15 Phe Phe Val Ser Asn 20 <210> 991 <211> 21 <212> PRT <213> Anelloviridae sp. <400> 991 Glu Cys Arg Tyr Asn Pro Leu Ala Asp Lys Gly Lys Gly Asn Lys Ile 1 5 10 15 Tyr Leu Ile Ser Ile 20 <210> 992 <211> 21 <212> PRT <213> Torque teno mini virus <400> 992 Thr Cys Arg Tyr Asn Pro Leu Lys Asp Thr Gly Glu Gly Asn Gln Val 1 5 10 15 Phe Phe Lys Ser Thr 20 <210> 993 <211> 21 <212> PRT <213> Torque teno mini virus <400> 993 Thr Ile Arg Tyr Ser Pro Asn Arg Asp Thr Gly Glu Asn Asn Ile Cys 1 5 10 15 Tyr Phe Lys Pro Ile 20 <210> 994 <211> 21 <212> PRT <213> Torque teno mini virus <400> 994 Thr Thr Arg Tyr Asn Pro Asn Arg Asp Glu Gly Ile Gln Asn Glu Met 1 5 10 15 Tyr Leu Val Asn Val 20 <210> 995 <211> 21 <212> PRT <213> TTV-like mini virus <400> 995 Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp Thr Gln Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Leu Ser Asn 20 <210> 996 <211> 21 <212> PRT <213> Torque teno mini virus <400> 996 Asp Ile Arg Tyr Ala Pro Asp Arg Asp Thr Gly Val Gly Asn Lys Val 1 5 10 15 Tyr Leu Lys Ser Val 20 <210> 997 <211> 20 <212> PRT <213> Torque teno midi virus <400> 997 Cys Arg Tyr Asn Pro Ala Ile Asp Thr Gly Lys Gly Asn Thr Ile Trp 1 5 10 15 Leu His Ser Asn 20 <210> 998 <211> 20 <212> PRT <213> Torque teno midi virus <400> 998 Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp Asn Gly Asp Gly Asn Met Ile Tyr 1 5 10 15 Leu Val Ser Thr 20 <210> 999 <211> 20 <212> PRT <213> Torque teno midi virus <400> 999 Gly Arg Tyr Asn Pro Ala Ile Asp Asp Gly Lys Gly Asn Lys Ile Tyr 1 5 10 15 Leu Gln Thr Ile 20 <210> 1000 <211> 20 <212> PRT <213> Torque teno midi virus <400> 1000 Leu Arg Tyr Asn Pro His Glu Asp Thr Gly His Gly Asn Glu Ile Tyr 1 5 10 15 Leu Thr Ser Thr 20

Claims (94)

  1. 합성 아넬로좀으로서:
    (I) 유전 요소로서:
    (a) 프로모터 요소,
    (b) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결되는 핵산 서열, 및
    (c) SEQ ID NO: 878의 뉴클레오티드 185 내지 255의 핵산 서열 또는 이에 대하여 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5’ UTR을 포함하는 유전 요소; 및
    (ii) SEQ ID NO: 921 또는 927의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부
    를 포함하며;
    유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
    상기 합성 아넬로좀이 상기 유전 요소를 인간 세포 내로 운반할 수 있는, 합성 아넬로좀.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전 요소가 SEQ ID NO: 878의 뉴클레오티드 185 내지 255의 아넬로바이러스 5’ UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대하여 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전 요소가 SEQ ID NO: 886의 뉴클레오티드 185 내지 254의 아넬로바이러스 5’ UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대하여 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 SEQ ID NO: 878의 뉴클레오티드 512 내지 2545에 의해 인코딩되는, 합성 아넬로좀.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 SEQ ID NO: 886의 뉴클레오티드 501 내지 2489에 의해 인코딩되는, 합성 아넬로좀.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 하기 핵산 서열:
    (i) SEQ ID NO: 878의 뉴클레오티드 3141 내지 3264, 또는
    (i) SEQ ID NO: 886의 뉴클레오티드 3076 내지 3176;
    또는 이에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 표 D2 또는 표 D4에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, 초가변 도메인, N22 도메인 및/또는 C-말단 도메인의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ORF1가 하기 아미노산 서열:
    (i) SEQ ID NO: 883, 또는
    (ii) SEQ ID NO: 891;
    또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표 C1 또는 표 C2에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 합성 아넬로좀.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C1 또는 표 C2에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 아넬로좀이 표 C1 또는 표 C2에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하지 않는, 합성 아넬로좀.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C1 또는 표 C2에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하지 않는, 합성 아넬로좀.
  13. 합성 아넬로좀으로서:
    (I) 유전 요소로서:
    (a) 프로모터 요소,
    (b) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결되는 핵산 서열, 및
    (c) SEQ ID NO: 894의 뉴클레오티드 178 내지 248의 핵산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소; 및
    (ii) SEQ ID NO: 933의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부
    를 포함하며;
    유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
    상기 합성 아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있는, 합성 아넬로좀.
  14. 합성 아넬로좀으로서:
    (I) 유전 요소로서:
    (a) 프로모터 요소,
    (b) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결되는 핵산 서열, 및
    (c) SEQ ID NO: 903의 뉴클레오티드 176 내지 246의 핵산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소; 및
    (ii) SEQ ID NO: 939의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부
    를 포함하며;
    유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
    상기 합성 아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있는, 합성 아넬로좀.
  15. 합성 아넬로좀으로서:
    (I) 유전 요소로서:
    (a) 프로모터 요소,
    (b) 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결되는 핵산 서열, 및
    (c) SEQ ID NO: 911의 뉴클레오티드 170 내지 240의 핵산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 유전 요소; 및
    (ii) SEQ ID NO: 945의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부
    를 포함하며;
    유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입되며;
    상기 합성 아넬로좀이 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있는, 합성 아넬로좀.
  16. 제13항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 SEQ ID NO: 894의 뉴클레오티드 572 내지 2758에 의해 인코딩되는, 합성 아넬로좀.
  17. 제14항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 SEQ ID NO: 903의 뉴클레오티드 581 내지 2884에 의해 인코딩되는, 합성 아넬로좀.
  18. 제15항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 SEQ ID NO: 911의 뉴클레오티드 614 내지 2911에 의해 인코딩되는, 합성 아넬로좀.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 하기 핵산 서열:
    (i) SEQ ID NO: 894의 뉴클레오티드 3555 내지 3696,
    (ii) SEQ ID NO: 903의 뉴클레오티드 3720 내지 3828; 또는
    (iii) SEQ ID NO: 911의 뉴클레오티드 3716 내지 3815;
    또는 이에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  20. 제13항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 표 D6에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, 초가변 도메인, N22 도메인 및/또는 C-말단 도메인의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  21. 제14항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 표 D8에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, 초가변 도메인, N22 도메인 및/또는 C-말단 도메인의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  22. 제15항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 표 D10에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 도메인, 초가변 도메인, N22 도메인 및/또는 C-말단 도메인의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  23. 제13항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 SEQ ID NO: 900의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  24. 제14항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 SEQ ID NO: 908의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  25. 제15항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 SEQ ID NO: 916의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  26. 제13항에 있어서, 표 C3에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 합성 아넬로좀.
  27. 제14항에 있어서, 표 C4에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 합성 아넬로좀.
  28. 제15항에 있어서, 표 C5에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 합성 아넬로좀.
  29. 제13항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C3에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  30. 제14항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C4에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  31. 제15항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C5에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  32. 제13항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C3에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  33. 제14항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C4에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  34. 제15항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C5에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  35. 제13항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C3에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  36. 제14항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C4에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  37. 제15항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C5에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 합성 아넬로좀.
  38. 제13항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 아넬로좀이 표 C3 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하지 않는, 합성 아넬로좀.
  39. 제13항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 C3 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, TAIP, ORF1/1 또는 ORF1/2의 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하지 않는, 합성 아넬로좀.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N을 포함하며, Xn이 각각 독립적으로 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열인, 합성 아넬로좀.
  41. 제40항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N에 측접하는 제1 베타 가닥 및 제2 베타 가닥을 추가로 포함하며, 예를 들어, 상기 제1 베타 가닥이 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N의 티로신(Y) 잔기를 포함하고/포함하거나, 상기 제2 베타 가닥이 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N의 제2 아스파라긴(N) 잔기(N에서 C로)를 포함하는, 합성 아넬로좀.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ORF1 분자가 N-말단에서 C-말단 방향의 순서로, 제1 베타 가닥, 제2 베타 가닥, 제1 알파 나선, 제3 베타 가닥, 제4 베타 가닥, 제5 베타 가닥, 제2 알파 나선, 제6 베타 가닥, 제7 베타 가닥, 제8 베타 가닥 및 제9 베타 가닥을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 숙주 세포에서 회전환 복제에 의해 증폭되어, 예를 들어, 적어도 8개 카피를 생성할 수 있는, 합성 아넬로좀.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 단일-가닥인, 합성 아넬로좀.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 환형인, 합성 아넬로좀.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 DNA인, 합성 아넬로좀.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 음성 가닥 DNA인, 합성 아넬로좀.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 세포에 유입되는 아넬로좀의 10%, 8%, 6%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1% 미만의 빈도로 통합되며, 예를 들어, 합성 아넬로좀이 비-통합성인, 합성 아넬로좀.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 16-1에 나타낸 컨센서스 5’ UTR 핵산 서열의 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 16-2에 나타낸 컨센서스 GC-풍부 영역의 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 적어도 100개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함하며, 이는 적어도 70%(예를 들어, 약 70 내지 100%, 75 내지 95%, 80 내지 95%, 85 내지 95% 또는 85 내지 90%)의 위치에서 G 또는 C로 이루어진, 합성 아넬로좀.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 SEQ ID NO: 120의 핵산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 1 내지 393의 아넬로바이러스 5’ UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열 및 표 11의 핵산 서열의 뉴클레오티드 2868 내지 2929의 아넬로바이러스 GC-풍부 영역에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 표 11의 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 75% 동일성을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 요소가 야생형 아넬로바이러스에 대하여 외인성인, 합성 아넬로좀.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 요소가 야생형 아넬로바이러스에 대하여 내인성인, 합성 아넬로좀.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 이펙터가 치료제, 예를 들어, 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 치료적 핵산을 인코딩하는 합성 아넬로좀.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 이펙터가 조절 핵산, 예를 들어, miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA; 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드, 천연-생물활성 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항-미생물 펩티드, 포어(pore)-형성 펩티드, 바이사이클릭 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 소분자, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 사멸 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제(intercalating agent), 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드, 항체, 수용체, 또는 CRISPR 시스템 또는 성분을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 이펙터가 miRNA를 포함하며, 숙주 유전자의 발현을 감소시키는, 합성 아넬로좀.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 이펙터가 약 20 내지 200, 30 내지 180, 40 내지 160, 50 내지 140, 60 내지 120, 200 내지 2000, 200 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 1500 또는 1500 내지 2000개 뉴클레오티드 길이의 핵산 서열을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열이 약 20 내지 200, 30 내지 180, 40 내지 160, 50 내지 140, 60 내지 120, 200 내지 2000, 200 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 1500 또는 1500 내지 2000개 뉴클레오티드 길이인, 합성 아넬로좀.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, (예를 들어, 단백질성 외부에) 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 요소가 약 1.5 내지 2.0, 2.0 내지 2.5, 2.5 내지 3.0, 3.0 내지 3.5, 3.1 내지 3.6, 3.2 내지 3.7, 3.3 내지 3.8, 3.4 내지 3.9, 3.5 내지 4.0, 4.0 내지 4.5 또는 4.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는, 합성 아넬로좀.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 아넬로좀이 인간 세포, 예를 들어, 면역 세포, 간 세포 또는 폐 상피 세포를 감염시킬 수 있는, 합성 아넬로좀.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어, 실시예 4에 기재된 방법에 따라 검출되는 바와 같이, 실질적으로 비-면역원성인, 예를 들어, 검출 가능한 및/또는 원하지 않는 면역 반응을 유도하지 않는, 합성 아넬로좀.
  66. 제65항에 있어서, 실질적으로 비-면역원성인 아넬로좀이 면역 반응이 결여된 기준 대상체에서의 효능의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%인 효능을 대상체에서 갖는, 합성 아넬로좀.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1000개의 아넬로좀의 집단이 적어도 약 100개 카피(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 카피)의 유전 요소를 하나 이상의 인간 세포 내로 운반할 수 있는, 합성 아넬로좀.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, (예를 들어, 단백질성 외부에) 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3, ORF1, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, 합성 아넬로좀.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 합성 아넬로좀을 포함하는, 약제학적 조성물.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 사전결정된 입자:감염성 유닛의 비(예를 들어, 300:1 미만, 200:1 미만, 100:1 미만 또는 50:1 미만)를 갖는, 약제학적 조성물.
  72. 하기 중 하나 이상(예를 들어, 그 전부)을 인코딩하는 핵산 분자:
    (i) ORF1 분자, 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 것, 또는 표 B1 내지 표 B5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 핵산 서열의 ORF1 영역을 포함하는 것;
    (ii) ORF2 분자, 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 것, 또는 표 B1 내지 표 B5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 핵산 서열의 ORF2 영역을 포함하는 것; 및/또는
    (iii) ORF3 분자, 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 것, 또는 표 B1 내지 표 B5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 핵산 서열의 ORF3 영역을 포함하는 것.
  73. 제72항에 있어서, 상기 핵산 분자가 플라스미드, 바이러스 게놈 또는 (예를 들어, 시험관 내 환화에 의해 생성되는) 이중-가닥 환형 DNA인, 핵산 분자.
  74. 반응 혼합물로서:
    (i) 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀의 유전 요소의 서열을 포함하는 제1 핵산(예를 들어, 이중-가닥 또는 단일-가닥 환형 DNA), 및
    (ii) 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는, 반응 혼합물.
  75. 제74항에 있어서, 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산이 동일한 핵산 분자에 존재하는, 반응 혼합물.
  76. 제74항에 있어서, 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산이 상이한 핵산 분자인, 반응 혼합물.
  77. 제74항에 있어서, 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산이 상이한 핵산 분자이며, 상기 제2 핵산이 이중-가닥 환형 DNA로서 제공되는, 반응 혼합물.
  78. 제74항에 있어서, 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산이 상이한 핵산 분자이며, 상기 제1 및 제2 핵산이 이중-가닥 환형 DNA로서 제공되는, 반응 혼합물.
  79. 제76항에 있어서, 상기 제2 핵산 서열이 헬퍼 세포 또는 헬퍼 바이러스에 의해 포함되는, 반응 혼합물.
  80. 합성 아넬로좀의 제조 방법으로서, 상기 방법이
    a) 숙주 세포를 제공하는 단계로서:
    (i) 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀의 유전 요소의 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 분자, 및
    (ii) 예를 들어, 표 C1 내지 표 C5 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
    b) 숙주 세포를 상기 합성 아넬로좀을 제조하기에 적합한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계를 포함하며,
    이렇게 함으로써 합성 아넬로좀을 제조하는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 단계 (a) 이전에, 상기 제1 핵산 분자 및/또는 제2 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 제2 핵산 분자가 상기 제1 핵산 분자 이전에, 이와 동시에, 또는 그 이후에 숙주 세포 내로 도입되는, 방법.
  83. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 제2 핵산 분자가 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는, 방법.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 핵산 분자가 헬퍼(예를 들어, 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스의 게놈)인, 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 핵산 분자가 아미노산 서열 [W/F]X7HX3CX1CX5H를 포함하는 ORF2 분자를 인코딩하며, Xn이 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열인, 방법.
  86. 합성 아넬로좀 제제의 제조 방법으로서, 상기 방법이
    c) 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 따른 복수의 합성 아넬로좀, 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물 또는 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항의 반응 혼합물을 제공하는 단계;
    d) 선택적으로 복수의 아넬로좀을 본원에 기재된 오염물질, 광학 밀도 측정치(예를 들어, OD 260), (예를 들어, HPLC에 의한) 입자 개수, 감염성(예를 들어, 입자:감염성 유닛 비) 중 하나 이상에 대하여 평가하는 단계; 및
    c) 예를 들어, (b)의 파라미터 중 하나 이상이 특정 임계값을 만족한다면, 복수의 합성 아넬로좀을 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
  87. 숙주 세포로서:
    (i) 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀의 유전 요소의 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 분자, 및
    (ii) 선택적으로, 표 C1 내지 표 C5중 어느 하나에 열거된 바와 같은 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 분자를 포함하는, 숙주 세포.
  88. 포유동물 세포로의 외인성 이펙터(예를 들어, 치료적 외인성 이펙터)의 운반 방법으로서:
    (a) 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀을 제공하는 단계; 및
    (b) 포유동물 세포를 합성 아넬로좀과 접촉시키는 단계를 포함하며;
    합성 아넬로좀이 유전 요소를 포유동물 세포 내로 운반할 수 있으며;
    선택적으로, 숙주 세포에서 유전 요소를 단백질성 외부 내에 봉입하기에 적합한 조건 하에서, 유전 요소를 숙주 세포 내로 도입함으로써 합성 아넬로좀이 생성되며;
    이렇게 함으로써 치료적 외인성 이펙터를 포유동물 세포에 운반하는, 방법.
  89. 상기 유전 요소를 숙주 세포에 운반하기 위한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀 또는 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
  90. 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위한 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀 또는 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
  91. 제90항에 있어서, 상기 질병 또는 장애가 면역 장애, 인터페론병증(interferonopathy)(예를 들어, I형 인터페론병증), 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암) 및 위장 장애로부터 선택되는 용도.
  92. 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀 또는 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  93. 대상체에서의 질병 또는 장애의 치료 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀 또는 제69항 또는 제71항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 질병 또는 장애가 면역 장애, 인터페론병증(예를 들어, I형 인터페론병증), 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암) 및 위장 장애로부터 선택되는 방법.
  94. 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 합성 아넬로좀 또는 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도로서, 선택적으로, 상기 질병 또는 장애가 면역 장애, 인터페론병증(예를 들어, I형 인터페론병증), 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암) 및 위장 장애로부터 선택되는, 용도.
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