JP2013516169A - 抗血管新生活性を有する組換えアデノウイルス - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図8
Description
(a)本発明の組換えアデノウイルスは、血管新生を抑制するキメラデコイ受容体を発現する。
(b)キメラデコイ受容体を発現する本発明の組換えアデノウイルスは、血管新生を顕著に抑制して、多様な血管新生関連疾患の遺伝子治療剤として利用できる。
(c)特に、本発明の組換えアデノウイルスは、腫瘍崩壊能に優れている。
(d)既存の血管新生関連抗癌剤(例えば、アバスチン)は、細胞増殖抑制効果のみを有しており、癌治療剤としての限界を有しているが、本発明の組換えアデノウイルスは、殺細胞効果を有しており、癌細胞を死滅させることができて、これにより、既存の癌治療剤の限界を克服することができる。
(e)また、既存の血管新生関連抗癌剤は、正常細胞にも作用し、副作用を誘発するが、本発明の組換えアデノウイルスは、癌細胞に特異的に作用し、このような副作用を大きく減らすことができる。
(f)既存のVEGFトラップは、タンパク質製剤であって、生体内において半減期が短い。しかし、本発明の組換えアデノウイルスは、持続的にVEGFトラップを過剰発現するため、このような問題点を解決することができる。
1.対象細胞株及び細胞の培養
実験に使用されたヒト肺癌細胞株であるA549とH460は、ATCC(American Type culture Collection,Manassas,VA,USA)から購入して、HUVEC(Human umbilical vascular endothelial cell)は、Lonza(Basel,スイス)から購入した。アデノウイルスの初期発現遺伝子であるE1部位が宿主遺伝体内に内在されているHEK293細胞株(ATCC)をアデノウイルス産生細胞株として使用した。HUVECを除いた全ての細胞株は、100U/mlペニシリンと100μg/mlストレプトマイシン(Gibco−BRL)を添加した10%牛胎児血清(FBS;Gibco−BRL,Grand Island,NY,USA)を含むDMEM培養液で、5%CO2、37℃で培養した。HUVECは、5%FBSの含まれたEGM−2MV(Lonza,Walkersville,MC,USA)に抗生剤100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco−BRL)を入れて、継代培養5日目〜8日目の細胞で実験を行った。
KH903を発現する組換えアデノウイルスを作製するために、KH903プラスミドであるpKH903(KangHong,Cheng du,中国)をアデノウイルスE1シャトルベクターであるpCA14(Microbix)にEcoRI切断して挿入した後、これを再びBglIIで切断して得られたKH903のDNA断片をBamHIで切断したE3シャトルベクターpSP72ΔE3(本発明者が作製、Cancer Gene Therapy,12:61−71(2005))に挿入した。KH903は、VEGFR−1の第2細胞外ドメイン(配列番号1及び2の配列)、VEGFR−2の第3細胞外ドメイン(配列番号3及び4の配列)及びVEGFR−2の第4細胞外ドメイン(配列番号5及び6の配列)が順次結合して製造されたキメラデコイ受容体に、ヒトIgGのFc領域(配列番号7及び8の配列)が融合されて作られたものである。作製されたpSP72ΔE3/KH903ベクターをXbaIで切断し、pSP72ΔE3/CMVベクター(本発明者が作製、Cancer Gene Therapy,12:61−71(2005))のCMVプロモーターを挿入してpSP72ΔE3−CMV−KH903 E3シャトルベクターを製造した。KH903を発現する複製不能アデノウイルスを作製するために、上記作製されたpSP72ΔE3−CMV−KH903 E3シャトルベクターをPvuIで処理して直鎖化し、E3遺伝子が欠失されて、E1部位にlacZが挿入されており、アデノウイルスタイプ35のファイバーノブ(ノブ)で置換されたpdE1−k35トータルベクター[Ad35ファイバーノブ部分を有したアデノウイルス(Cell Genesys)からPCRで700bpの35ノブ部分を得て、NcoI/MfeIで切断し、予めNcoI/MfeIで切断していたpSK5543(Coxsackie and adenovirus receptor binding ablation reduces adenovirus liver tropism and toxicity,Human Gene Ther 16:248−261(2005))とライゲーションしてpSK5543/35kを作製した。作製されたpSK5543/35kは、SacII/XmnIで切断し、SpeIで切断したdE1/lacZと相同組換えすることでpdE1−k35を作製した]をSpeIで処理して直鎖化した。これらで大腸菌BJ5183(スイスのFribourgh大学のVerca;Heider,H.et al.,Biotechniques,28(2):260−265,268−270(2000))を同時形質転換し、相同組換えにより、lacZ遺伝子とKH903を同時に発現する複製不能アデノウイルスベクターであるpdE1−k35/KH903を作製した。VEGFを効果的に抑制させることのできるVEGFトラップを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスを作製するためには、上記作製されたpSP72ΔE3−CMV−KH903 E3シャトルベクターをPvuIで処理して直鎖化したものと、SpeI処理して直鎖化したpRdBアデノウイルストータルベクター(E1AのRb結合部位が変異して、E1B19kDa遺伝子とE1B55kDa遺伝子が共に欠失された腫瘍崩壊アデノウイルス,参照:大韓民国特許第0746122号)とで、一緒に大腸菌BJ5183を形質転換して、pRdB/KH903腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを作製した。E1AのRb結合部位の変異は、ElA遺伝子配列に位置したRb結合部位をコードするヌクレオチド配列のうち、第45番目のGlu残基がGly残基に置換された変異、及び第121番目〜127番目アミノ酸残基が全てGly残基に置換された変異である。相同組換えされたアデノウイルスベクターをHindIIIで処理して相同組換えの有無を確認した後、確認されたプラスミドを、PacI制限酵素で切断した後、HEK293細胞株を形質転換してアデノウイルスを産生した。対照群として使用されたウイルスは、E1部位の遺伝子が欠失して、その部位にlacZ遺伝子を有するdE1−k35と、同時にE1B19kDaとE1B55kDa遺伝子が全て欠失したRdBである。それぞれのアデノウイルスは、HEK293細胞株で増殖させて、CsCl濃度勾配で濃縮して精製して、限界適正分析(limiting titration assay)及びフォトスペクトロメーターで力価(plaque forming unit; PFU)を算出した。
KH903を発現するアデノウイルスをヒト肺癌細胞株に感染させることで、細胞内でKH903タンパク質が産生されて、細胞培養液に分泌されるかどうかを検証するために、A549細胞に、作製したアデノウイルスであるdE1−k35/KH903を、20MOI、50MOI及び100MOIでそれぞれ処理して、48時間後に細胞培養液と細胞を全て回収し、SDS−PAGE(sodium dodecyl sulfate−poly acrylamide gel electrophoresis)を行った。電気泳動後、ゲルにあるタンパク質をPVDF(polyvinylidene fluoride)膜にエレクトロトランスファーした後、KH903のヒトIgGのFc部位を特異的に認識する抗体を一次抗体(Cell signaling,Danvers,MA,USA)として用いた。HRP(horseradish peroxidase)が結合されたヤギ抗マウスIgGを二次抗体(Cell signaling,Danvers,MA,USA)として反応させた後、LAS4000を用いて、ECL(enhanced chemiluminescence)(Pierce,Rockford,IL,USA)による発色で、膜上のタンパク質と抗体との結合の有無を調べて、各タンパク質の発現を確認した。
腫瘍から分泌されるVEGFを効果的に抑制可能なKH903を発現するアデノウイルスにより、VEGFの発現が減少されるかどうかを検証するために、ELISA(enzyme−linked immunosorbent assay)を行った。まず、VEGFの発現が効果的に抑制されるかを検証するために、肺癌細胞株であるA549、H460、H322(ATCC)、H358(ATCC)及びH1299(ATCC)を6ウェルプレートにそれぞれ3×105細胞/ウェルで播いた後、翌日アデノウイルスを2MOI〜100MOIで感染させて6時間後、5%FBSが含まれたDMEM培地に入れ替えた。ウイルス感染から48時間後に培地を回収するために、培地回収の24時間前にFBSの含まれていないDMEMに入れ替えた。回収された培地は、800×gで遠心して上清を分離した後、このうち、150μgを利用してVEGFのELISA分析を行った。
アデノウイルス感染後のKH903の発現による血管内皮細胞増殖能の抑制を定量化するために、MTT(3−(4,5−dimethylathiazol−2yl)−2,5−diphenyltetrazolium bromide,2mg/ml)分析を行った。HUVECを2%ゼラチンでコートされた48ウェルプレートに播いて、24時間後、30MOIの組換えアデノウイルスで処理した。ウイルス処理前、HUVECは、EBM−2(Lonza,Walkersville,MC,USA)培地で血清飢餓(serum starvation)処理した。ウイルス処理72時間後の細胞の生存率を測定するために、培地を除去した後、MTT溶液を各ウェル当たり150μl入れて、5%CO2の存在下、37℃恒温培養器中で4時間反応した後、上清を除去した。上清の除去されたプレートウェルに1mlのDMSO(dimethyl sulphoxide)を添加して、37℃で10分間反応した後、上清(DMSOで溶出されたもの)の540nmでの吸光度を測定し、細胞の相対的生存率を測定した。
HUVECの走化性を調べるために、6.5mm直径のポリカーボネートろ紙(8μmポアサイズ)のTranswell(Corning Costar,Cambridge,MA,USA)を用いて、内皮細胞の運動性分析を行った。まず、上部チャンバのフィルターを0.1%ゼラチンでコートした。ゼラチンの乾燥後、6時間血清飢餓培地で培養し、血清飢餓処理したHUVECを1×105細胞になるようにカウントし、上部チャンバに入れて、dE1−k35とdE1−k35/KH903アデノウイルスを感染させて、回収した細胞培養液を下部チャンバに入れて、プレートを37℃で3時間30分間インキュベートした。プレートを取り出して、上部チャンバの培地を捨てた後、細胞をメタノ−ルで1分間固定し、H&E染色してスライドを作製した。その後、グループ別に200倍の倍率で8ヶ所の写真を撮って、平均を求め、細胞の運動性を定量化した。
腫瘍が分泌するVEGFを効果的に抑制できるKH903によるVEGFの発現減少により、血管内皮細胞のチューブ形成機能が変化するかどうかを調べるために、HUVECを利用したチューブ形成分析を行った。まず、250μlの増殖因子を減らしたマトリゲル(Collabo−rative Biomedical Products,Bedford,MA,USA)を−20℃に保存しておいた24ウェルプレートに均一にプレート後、37℃で30分間置いて固めた。HUVEC(5回〜7回継代培養)細胞は、6時間、血清飢餓EBM−2(Lonza,Walkersville,MC,USA)培地で培養し、血清飢餓処理した後、トリプシン処理して細胞数を測定した。dE1−k35又はdE1−k35/KH903アデノウイルスでそれぞれ20MOI処理した後、48時間後に回収したA549及びH460細胞培養液を、血清飢餓の前処理をしたHUVEC(1.5×105細胞/ウェル)と混ぜた後、マトリゲルがプレートされた24ウェルプレートに播いて培養した。陽性対照群としては、20ng/mlのVEGFタンパク質を利用した。培養後12時間〜16時間の間に培養液を除去して、PBSで2回洗浄した後、顕微鏡でチューブ形成を観察した。
腫瘍から分泌されるVEGFを効果的に抑制できるKH903による血管形成抑制を観察するために、大動脈輪出芽(aortal ring sprouting)分析を行った。オリエント社(Orient Bio,Korea,Inc.)から購入した6週齢のSprague Dawleyラットから大動脈を分離して、大動脈周辺の繊維脂肪組織を除去した後、1mm厚の輪に薄く切断した。予め冷やしておいた48ウェルプレートにマトリゲルを200μlずつプレートして、大動脈輪をそれぞれのウェルの中のマトリゲルに植えた後、37℃で20分間置いた。マトリゲルが固まった後、チューブ形成分析で使用された細胞培養液250μlをそれぞれのウェルに添加して培養し、毎日顕微鏡で大動脈輪から形成された血管を観察した。陽性対照群として、VEGFタンパク質(20ng/ml)を用いた。培養後、新しく形成された血管は、二重盲分析により、陽性対照群を5点、血管が形成されなかった実験群を0点の点数を付与して分析して、それぞれの実験群に対して12個の大動脈輪を対象に大動脈輪出芽分析を行った。
腫瘍から分泌されるVEGFを減少させるKH903の発現の有無がアデノウイルスの複製にどのような影響を及ぼすか検証するために、細胞変性分析を行った。肺癌細胞株を含むヒト腫瘍細胞株を48ウェルプレートにそれぞれ播いて、24時間後、dE1−k35,dE1−k35/KH903,RdB又はRdB/KH903アデノウイルスを0.1MOI〜10MOIで感染させた。対照群ウイルスとの差が最も顕著な時点で培地を除去し、プレートの底に残っている細胞を0.5%クリスタルバイオレットで固定して染色した後、分析した。
オリエント社から購入した生後6週〜8週程度のヌードマウスの腹部皮下に1×107個のヒト肺癌細胞株、H460を注射した。腫瘍の容積が約70mm3〜100mm3程度になった時、RdB、RdB/KH903アデノウイルスを陰性対照群のPBSと共にそれぞれ2日間隔で3回腫瘍内に直接注射した後、腫瘍の大きさを2日間隔で測定した。腫瘍の容積は、カリパースで腫瘍の短軸と長軸を測定し、下記のような公式で算出した:
腫瘍の容積(mm3)=(短軸(mm))2×長軸(mm)×0.523
6〜8週齢のヌードマウスの腹部皮下に肺癌細胞株であるH460を注射した後、腫瘍の大きさが約100〜120mm3程度になった時、RdB,RdB/KH903アデノウイルス又は陰性対照群のPBSを2日間隔で3回腫瘍内投与した。最後のウイルスを投与した後、10日後頃に腫瘍を摘出して、IHC zinc fixative(Formalin−free)(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA,USA)溶液で固定した後、パラフィンブロックを作製した。作製したパラフィンブロックを4μm厚に切断してスライドを作った後、これをキシレン、100%、95%、80%及び70%エタノ−ル溶液に順に浸してパラフィンを除去してから、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色した。腫瘍が分泌するVEGFと結合してその発現を減少させるKH903により腫瘍組織内血管形成が抑制されるかどうか確認するために、血管内皮細胞特異的抗原であるCD31を特異的に認識できる抗体であるラット抗マウスCD31モノクローナル抗体(MEC13.3;BD Biosciences Pharmingen)を用いて、組織免疫染色を行った。パラフィンが除去された4μm厚の腫瘍組織スライドを3%H2O2溶液で10分間反応して、内因性過酸化酵素の作用を除いた。Protein Block Serum free(DakoCytomation,Carpinteria,CA,USA)で30分間処理して非特異的な抗体反応が起こらないようにした後、CD31抗体を一次抗体としてハイブリダイゼーションを行った。ビオチンの結合されたポリクロ−ナル抗ラットIgG抗体(BD Biosciences Pharmingen)を二次抗体として反応した後、DAB(DakoCytomation,Carpinteria,CA,USA)を利用して、CD31の発現を調べた。
血管内皮細胞特異的抗原であるCD31(platelet endothelial cell adhesion molecule 1)に対する染色を行った腫瘍内血管をまず低倍率で観察し、無作為に写真を取った後、倍率を高めて100倍視野で観察される血管の数を定量した。3枚のスライドからそれぞれ5個の視野を選択し血管数を計測して、平均値を算出し、その値を代表値として使用した。
1.VEGFと特異的に結合するKH903を発現するアデノウイルスの作製及びVEGF発現変化の検証
VEGFに特異的に結合し、腫瘍から分泌するVEGFの発現を抑制するVEGFトラップであるKH903を発現するアデノウイルスdE1−k35/KH903を作製した(図1a)。dE1−k35/KH903アデノウイルスのE3部位に挿入されたKH903が、細胞感染時に実際に細胞から培地に分泌されるか確認するために、感染させた腫瘍細胞と培地を全て回収し、KH903の構造のうち、ヒトIgGのFc部位を検出する抗体を利用してウェスタンブロッティングを行った。結果的に、細胞溶出液ではKH903の産生を確認できる程度の量が観察されたが、培地では、多量のKH903を観察することができた。したがって、KH903は感染された細胞内で産生されて、培地に分泌されることを確認することができた(図1c)。
まず、VEGFを抑制するKH903の発現によるVEGFレベルの変化によるHUVECのVEGF誘導性増殖能に対する影響を確認した。HUVECをマトリゲルコートした48ウェルプレートに2×104細胞/ウェルで播いた後、30MOIのdE1−k35又はdE1−k35/KH903アデノウイルスを感染させて、72時間後、MTT分析を行って、細胞の生存率を測定した。その結果、dE1−k35/KH903を感染させたグル−プが、ウイルスを処理しなかったグループに比べ、生存率が53%減少し、陽性対照群であるdE1−k35を感染させたグループに比べては、30%減少したことを観察した(図3)。
VEGF発現抑制による血管新生能の低下は、腫瘍の成長を抑制すると考えられるので、KH903の抗癌効果を確認するために、KH903を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスであるRdB/KH903と、対照群としての腫瘍崩壊性アデノウイルスであるRdBをそれぞれ作製した。KH903の発現によりアデノウイルスの複製が阻害できるかどうか確認するために、数種類の癌細胞株及び正常細胞株をdE1−k35、dE1−k35/KH903、RdB又はRdB/KH903アデノウイルスに感染させて、ウイルスの複製による細胞の死滅の程度をCPE分析で観察した。陰性対照群であるdE1−k35複製不能アデノウイルスに感染させた細胞においてはアデノウイルスが複製されないため、細胞殺傷効果が現れなかったが、複製可能アデノウイルスであるRdB又はRdB/KH903に感染させ場合は、ウイルスの量が増加するにつれて、細胞殺傷効果も増加した。実験に利用された全ての細胞株において、KH903を発現するアデノウイルスであるRdB/KH903の細胞殺傷能が、対照群ウイルスであるRdBに比べ、優れていることを観察することができた(図7)。
VEGF発現を抑制するKH903を発現するアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果を検証するために、ヒト肺癌細胞株であるH460細胞をヌードマウスの腹部皮下に注射して、形成された腫瘍の容積が約80mm3〜100mm3程度になった時、1×1010vpのRdBとRdB/KH903アデノウイルスを陰性対照群であるPBSと共に2日間隔で3回腫瘍内に投与した後、腫瘍の成長を観察した(図8)。陰性対照群であるPBSを投与したヌードマウスの場合、ウイルスの投与後、23日後頃に既に腫瘍の容積が2170.238±455.1216mm3に急激に成長したが、KH903を発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスであるRdB/KH903を投与した場合は、腫瘍の成長が大きく遅延されることを確認した。即ち、RdBとRdB/KH903アデノウイルスを投与したマウスの場合、それぞれ1181.391±985.9131mm3、及び252.67±103.8464mm3であって、KH903の血管新生の抑制による、抗腫瘍効果を観察することができた。
ヒト肺癌細胞株であるH460をヌードマウスの腹部皮下に注射した後、腫瘍が形成された後、RdBとRdB/KH903アデノウイルスを、PBSを陰性対照群として、1×1010vpで2日間隔で3回腫瘍内注射した。最後の投与の1日後に腫瘍を摘出して、血管内皮細胞特異的抗原であるCD31を、組織免疫染色法で観察した。その結果、陰性対照群であるPBS群に比べ、腫瘍崩壊性アデノウイルスであるRdBを処理した実験群では、腫瘍内血管数が21%減少したことを確認し、RdB/KH903を投与した場合は、血管数が71%抑制されたことを観察することができた(図9)。
血管新生は、既に存在する血管から新しい血管が形成される過程であって、胚発生と、器官の形成及び組織の再生に重要な役割をする。また、血管新生は、初期の腫瘍が成長するための必須条件であって、腫瘍の体積が大きくなるにつれて、腫瘍細胞や浸潤されたマクロファージが様々な血管形成因子を産生して、腫瘍内微細血管を形成させる。このように形成された血管は、腫瘍細胞に養分を供給と同時に、様々な増殖因子を供給し、腫瘍を成長させる。血管新生に関与する種々の増殖因子のうち、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)が腫瘍の成長と転移に大きく関与することが知られている。VEGFは、受容体型チロシンキナーゼ、VEGFR2(KDR)の二量体と結合し、直接血管内皮細胞の分裂を促進する、強力な血管新生因子として作用し、微細血管の透過性を増加させて血漿タンパクが周辺組織に排出され、細胞外基質を修飾して血管形成を容易にする。そのため、癌の成長を防ぐためには、血管新生因子であるVEGFの抑制が極めて重要である。ここ30年間、抗癌治療の標的として、腫瘍内血管形成を抑制することにより腫瘍の成長を抑制する研究が活発になされてきた。しかし、現在利用可能な血管新生抑制剤は、主に単一治療剤として利用されるよりは、併用治療によく利用されており、高額な費用と反復投与による毒性を起こせるという短所がある。本研究では、このような限界を克服するために、水溶性のVEGF特異的デコイ受容体として作用するKH903を腫瘍崩壊性アデノウイルスに発現させることにより、効果的にVEGFを抑制すると同時に、腫瘍崩壊性アデノウイルスを使用することにより、相乗的に抗腫瘍効果を向上させようとした。
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Claims (17)
- (a)アデノウイルスの逆方向反復(inverted terminal repeat;ITR)ヌクレオチド配列と、(b)(i)VEGFR−1(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1)の細胞外ドメインと(ii)VEGFR−2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)の細胞外ドメインとを含むキメラデコイ受容体(chimeric decoy receptor)をコードするヌクレオチド配列と、を含むことを特徴とする血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルス。
- キメラデコイ受容体は、VEGFR−1の第1細胞外ドメイン、第2細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−1の細胞外ドメインと、VEGFR−2の第1細胞外ドメイン、第2細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−2の細胞外ドメインと、を含む請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
- キメラデコイ受容体は、(i)VEGFR−1の第1細胞外ドメインと、VEGFR−2の第2細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−2の細胞外ドメイン、(ii)VEGFR−1の第2細胞外ドメインと、VEGFR−2の第1細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−2の細胞外ドメイン、(iii)VEGFR−1の第3細胞外ドメインと、VEGFR−2の第1細胞外ドメイン、第2細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−2の細胞外ドメイン、(iv)VEGFR−1の第4細胞外ドメインと、VEGFR−2の第1細胞外ドメイン、第2細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−2の細胞外ドメイン、並びに(v)VEGFR−1の第5細胞外ドメインと、VEGFR−2の第1細胞外ドメイン、第2細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−2の細胞外ドメインを含む請求項2に記載の組換えアデノウイルス。
- キメラデコイ受容体は、(i)VEGFR−2の第1細胞外ドメインと、VEGFR−1の第2細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−1の細胞外ドメイン、(ii)VEGFR−2の第2細胞外ドメインと、VEGFR−1の第1細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−1の細胞外ドメイン、(iii)VEGFR−2の第3細胞外ドメインと、VEGFR−1の第1細胞外ドメイン、第2細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−1の細胞外ドメイン、(iv)VEGFR−2の第4細胞外ドメインと、VEGFR−1の第1細胞外ドメイン、第2細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第5細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−1の細胞外ドメイン、並びに(v)VEGFR−2の第5細胞外ドメインと、VEGFR−1の第1細胞外ドメイン、第2細胞外ドメイン、第3細胞外ドメイン、第4細胞外ドメイン、第6細胞外ドメイン及び第7細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも1つのVEGFR−1の細胞外ドメインを含む請求項2に記載の組換えアデノウイルス。
- キメラデコイ受容体は、2個〜4個の細胞外ドメインを含む請求項3に記載の組換えアデノウイルス。
- キメラデコイ受容体は、2個〜4個の細胞外ドメインを含む請求項4に記載の組換えアデノウイルス。
- キメラデコイ受容体は、(i)VEGFR−2の第1細胞外ドメイン、VEGFR−1の第2細胞外ドメイン及びVEGFR−2の第3細胞外ドメイン、(ii)VEGFR−1の第2細胞外ドメイン、VEGFR−2の第3細胞外ドメイン及びVEGFR−2の第4細胞外ドメイン、又は(iii)VEGFR−1の第2細胞外ドメイン、VEGFR−2の第3細胞外ドメイン、VEGFR−2の第4細胞外ドメイン及びVEGFR−2の第5細胞外ドメインを含む請求項5に記載の組換えアデノウイルス。
- キメラデコイ受容体は、(i)VEGFR−1の第2細胞外ドメイン、VEGFR−2の第3細胞外ドメイン及びVEGFR−1の第4細胞外ドメイン、又は(ii)VEGFR−1の第2細胞外ドメイン、VEGFR−2の第3細胞外ドメイン、VEGFR−1の第4細胞外ドメイン及びVEGFR−1の第5細胞外ドメインを含む請求項6に記載の組換えアデノウイルス。
- キメラデコイ受容体は、免疫グロブリンのFc領域と融合されている請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
- 組換えアデノウイルスは、E3遺伝子が欠失したものであり、前記キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、前記E3遺伝子領域に挿入されている請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
- 組換えアデノウイルスは、非活性型E1B19遺伝子、非活性型E1B55遺伝子又は非活性型E1B19/55遺伝子を含む請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
- 組換えアデノウイルスは、活性型のE1A遺伝子を含む請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
- 組換えアデノウイルスは、E1A遺伝子のRb結合部位をコードするヌクレオチド配列のうち、第45番目のGlu残基がGly残基に置換された変異、及び第121番目から第127番目のアミノ酸残基が全てGly残基に置換された変異を有する請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
- (a)請求項1から13のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、(b)薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする抗血管新生組成物。
- 抗血管新生組成物は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロ−ム性動脈硬化プラ−ク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ性関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クロ−ン病、再発狭窄症、アテロ−ム性動脈硬化、腸管接着、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症及び神経退行性疾患のいずれかの予防又は治療のための組成物であることを特徴とする請求項14に記載の抗血管新生組成物。
- (a)請求項1から13のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、(b)薬剤学的に許容される担体とを含む抗血管新生組成物を、これを必要とする対象に投与する工程を有することを特徴とする過多血管新生による疾患の予防又は治療方法。
- 過多血管新生による疾患は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロ−ム性動脈硬化プラ−ク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ性関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クロ−ン病、再発狭窄症、アテロ−ム性動脈硬化、腸管接着、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症及び神経退行性疾患のいずれかである請求項16に記載の方法。
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