CN104419714A - 抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因，所述基因的序列是序列表中SEQ ID NO.1。该基因表达的融合蛋白可以应用在制备治疗肿瘤药物领域中。利用VEGFR中能与VEGF结合的关键部位构建融合蛋白，以此来中和人体内VEGF，亲和力高且不会产生人抗鼠抗体反应。在该融合蛋白的末端添加免疫球蛋白IgG1的Fc基因片段，使该融合蛋白在体内二聚化，不仅可以提高该融合蛋白的稳定性和半衰期，还具有与免疫球蛋白相似的药代动力学等特征。此外，本发明还涉及一种用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法及应用。

Description

抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及融合蛋白技术领域，尤其是涉及一种用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因及其构建方法和应用。

背景技术

1971年Judah folkman提出了肿瘤的生长依赖于血管新生的理论。目前的研究证实肿瘤血管新生对于肿瘤生长具有非常重要的作用，在没有血液供应时，由于缺乏氧气和营养物质等，实体瘤大多只能生长到1-2mm。当促血管新生因子的作用超过抑制血管新生因子的作用就会诱导周围成熟的血管新生出新的血管，向肿瘤浸润生长，最终渗透进肿瘤，使肿瘤开始无限制的生长和转移。其中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种具有很强的促进血管生长作用的关键细胞因子，是诱导血管生成的主要调节因素。VEGF可以使血管通透性增加，使管内纤维蛋白原等血浆蛋白外渗，为血管新生提供必要的基质，促进血管的形成；VEGF能够刺激内皮细胞的增殖，促进血管的形成，为肿瘤提供充足的养分；诱导血管内皮细胞产生间质胶原酶和纤溶酶原激活物，为肿瘤浸润和转移提供便利条件。因此阻断VEGF在肿瘤血管新生治疗中具有重要作用。

VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PlGF)。其中VEGF-A在正常人和动物的组织中表达较少，在有新生血管生成的组织细胞中有高表达，特别在肿瘤中有高表达。

VEGF是通过与其内皮细胞膜上的受体VEGFR结合而发挥作用，VEGFR有三种：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)及VEGFR-3(Flt-4)。VEGFR是一类酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，它由7个类Ig结构域组成的胞外区、一个跨膜结构区和胞质内酪氨酸激酶结构区组成。VEGFR的胞外段是与VEGF结合的区域，两者结合后VEGFR构象发生变化，导致受体二聚化，其胞内段酪氨酸位点发生自磷酸化，激活下游的信号传导通路。

传统的常用抗VEGF及其受体的单克隆抗体来封闭VEGF，阻断VEGF诱发的内皮细胞信号传导，抑制血管的形成。但传统的用于治疗的抗体主要为人源化的单克隆抗体，还残留有鼠源成分，病人容易产生人抗鼠抗体反应，且人源性抗体的亲和力相对较低。

发明内容

基于此，有必要提供一种表达的蛋白亲和力相对较高且不会产生人抗鼠抗体反应的用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因及其构建方法和应用。

一种用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因，所述基因的序列是序列表中SEQ ID NO.1。

一种含有上述基因的重组表达载体。

一种由上述用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因表达的融合蛋白。

上述表达的融合蛋白可以应用在制备治疗肿瘤药物领域中。

一种用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法，包括如下步骤：

以人的单链cDNA为模板分别PCR扩增人血管内皮生长因子1的D2区域基因及人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因，并以人的IgG1的重链恒定区为模板PCR扩增人IgG1Fc基因片段，其中，用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列包括序列表中SEQ ID NO.2的基因序列、下游引物序列包括序列表中SEQ ID NO.3的基因序列，用于扩增所述人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因的上游引物序列包括序列表中的SEQ ID NO.4的基因序列、下游引物序列包括序列表中SEQ ID NO.5的基因序列，用于扩增人IgG1Fc基因片段的上游引物序列包括序列表中的SEQ ID NO.6的基因序列、下游引物序列包括序列表中SEQ ID NO.7的基因序列；

使用重叠PCR扩增技术扩增上述扩增得到的人血管内皮生长因子1的D2区域基因与人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因，得到人血管内皮生长因子1D2区域与人血管内皮生长因子2D3-D4区域连接的基因，其中，用于本步骤重叠PCR扩增的上游引物序列为用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列，下游引物序列为用于扩增所述人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因的下游引物序列；

使用重叠PCR技术扩增所述人血管内皮生长因子1D2区域与人血管内皮生长因子2D3-D4区域连接的基因及上述扩增得到的人IgG1Fc基因片段，得到所述用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因，其中，用于本步骤重叠PCR扩增的上游引物序列为用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列，下游引物序列为用于扩增人IgG1Fc基因片段的下游引物序列。

在其中一个实施例中，所述用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列还包括第一限制性内切酶的酶切位点序列。

在其中一个实施例中，所述第一限制性内切酶的酶切位点序列为EcoR I的酶切位点序列。

在其中一个实施例中，所述用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列是序列表中的SEQ ID NO.8的基因序列。

在其中一个实施例中，所述用于扩增人IgG1Fc基因片段的下游引物序列还包括第二限制性内切酶的酶切位点序列。

在其中一个实施例中，所述第二限制性内切酶的酶切位点序列为Not I的酶切位点序列。

在其中一个实施例中，所述用于扩增人IgG1Fc基因片段的下游引物序列是序列表中的SEQ ID NO.9的基因序列。

血管内皮生长因子受体（VEGFR）对血管内皮生长因子（VEGF）具有天然的高亲和力，因此利用VEGFR中能与VEGF结合的关键部位构建融合蛋白，以此来中和人体内VEGF，亲和力高且不会产生人抗鼠抗体反应。此外，在该融合蛋白的末端添加免疫球蛋白IgG1的Fc基因片段，使该融合蛋白在体内二聚化，不仅可以提高该融合蛋白的稳定性和半衰期，还具有与免疫球蛋白相似的药代动力学等特征。

附图说明

图1为PCR扩增的VEGFR-1D2区域基因、VEGFR-2D3-D4区域基因以及人IgG1Fc基因片段的电泳结果图，其中M代表Marker，第1和第2泳道是VEGFR-1D2区域基因，第3和第4泳道是VEGFR-2D3-D4区域基因，第5泳道是人IgG1Fc基因片段；

图2为重叠PCR扩增的VEGFR1-2全长基因的电泳结果图，其中M代表Marker，第1和第2泳道是VEGFR1-2全长基因；

图3为重叠PCR扩增的VEGFR1-2-Fc全长基因的电泳结果图，其中M代表Marker，第1和第2泳道是VEGFR1-2-Fc全长基因；

图4为pMD18T-VEGFR1-2-Fc双酶切后的电泳结果图，其中M代表Marker，第1、第2泳道及第3泳道双酶切结果。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因及其构建方法和应用作进一步详细的说明。

本实施方式的用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因序列是序列表中SEQ ID NO.1。该基因包括依次连接的人血管内皮生长因子1的D2区域基因（以下简称为VEGFR-1D2区域）、第一连接序列（以下简称为Linker1）、人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因（以下简称为VEGFR-2D3-D4区域基因）、第二连接序列（以下简称为Linker2）以及人IgG1的Fc基因片段（以下简称为Fc区域基因）。其中，VEGFR-1D2区域的基因序列为序列表中的SEQ ID NO.10。Linker1的基因序列为序列表中的SEQ ID NO.11。VEGFR-2D3-D4区域的基因序列为序列表中的SEQ ID NO.12。Linker2的基因序列为序列表中的SEQ IDNO.13。Fc区域的基因序列为序列表中的SEQ ID NO.14。

该基因表达的融合蛋白具有能与VEGF结合的关键部位，可以用来中和人体内的VEGF，亲和力高且不会产生人抗鼠抗体反应。此外，在该融合蛋白的末端添加免疫球蛋白IgG1的Fc基因片段，使该融合蛋白在体内二聚化，不仅可以提高该融合蛋白的稳定性和半衰期，还具有与免疫球蛋白相似的药代动力学等特征。因此，该基因表达的融合蛋白可以应用在制备治疗肿瘤药物领域中。

本实施方式还提供了一种用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法，包括如下步骤：

步骤一：以人的单链cDNA为模板分别PCR扩增人血管内皮生长因子1的D2区域基因（SEQ ID NO.10）及人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因（SEQID NO.12），并以人的IgG1的重链恒定区为模板PCR扩增人IgG1Fc基因片段（SEQ ID NO.14）。

其中，用于扩增人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物（以下简称为VR1上游引物）序列包括序列表中SEQ ID NO.2的基因序列、下游引物（以下简称为VR1下游引物）序列包括序列表中SEQ ID NO.3的基因序列。在其他实施方式中，该VR1上游引物序列还可以包括第一限制性内切酶的酶切位点序列，如EcoR I酶切位点、Kpn I酶切位点或EcoR I酶切位点等。在一个具体的实施方式中，该VR1上游引物序列可以是序列表中的SEQ ID NO.8的基因序列，其包括一个EcoR I的酶切位点“gaattc”。

用于扩增人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因的上游引物（以下简称为VR2上游引物）序列包括序列表中的SEQ ID NO.4的基因序列、下游引物（以下简称为VR2下游引物）序列包括序列表中SEQ ID NO.5的基因序列。

用于扩增人IgG1Fc基因片段的上游引物（以下简称为Fc上游引物）序列包括序列表中的SEQ ID NO.6的基因序列、下游引物（以下简称为Fc下游引物）序列包括序列表中SEQ ID NO.7的基因序列。在其他实施方式中，该Fc下游引物序列还可以包括第二限制性内切酶的酶切位点序列，如Not I酶切位点、Kpn I酶切位点或EcoR I酶切位点等，该酶切位点一般选择不同于第一限制性内切酶的酶切位点。在一个具体的实施例中，该Fc下游引物序列可以是序列表中的SEQID NO.9的基因序列，其包括一个Not I酶切位点序列“gcggccgc”。

步骤二：使用重叠PCR扩增技术扩增上述扩增得到的人血管内皮生长因子1的D2区域基因与人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因，得到人血管内皮生长因子1D2区域与人血管内皮生长因子2D3-D4区域连接的基因（以下简称为VEGFR1-2全长基因）。

其中，用于本步骤重叠PCR扩增的上游引物序列为VR1上游引物序列，下游引物序列为用于VR2下游引物序列。

步骤三：使用重叠PCR技术扩增人血管内皮生长因子1D2区域与人血管内皮生长因子2D3-D4区域连接的基因及上述扩增得到的人IgG1Fc基因片段，得到用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因。

其中，用于本步骤重叠PCR扩增的上游引物序列为用于扩增人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列，下游引物序列为用于扩增人IgG1Fc基因片段的下游引物序列。

以下为具体实施例部分：

1.以人的单链cDNA为模板，分别PCR扩增VEGFR-1D2区域基因、VEGFR-2D3-D4区域基因以及人IgG1Fc基因片段，扩增体系分别如下表1、表2和表3：

表1VEGFR-1D2区域基因的PCR反应体系

表2VEGFR-2D3-4区域基因的PCR反应体系

表3人IgG1Fc基因片段的PCR反应体系

PCR扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。取5μL反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，鉴定正确后，胶回收PCR产物。

2.通过重叠PCR技术构建VEGFR1-2全长基因，反应条件如下表4：

表4

PCR扩增程序：94℃，5min，{94℃，30s→50℃，30s→72℃，1min}×7→72℃，5min，7个循环之后，加入下表5中的25μL包含引物的混合物，再按照如下扩增程序扩增：PCR扩增程序：94℃，5min，{94℃，30s→52℃，30s→72℃，1min}×30→72℃，5min。取5μL反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示。鉴定正确后，胶回收PCR产物。

表5

3.通过重叠PCR构建VEGFR1-2-Fc全长基因（即用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因），反应条件如下表6：

表6

PCR扩增程序：94℃，5min，{94℃，30s→50℃，30s→72℃，1min}×7→72℃，5min，7个循环之后，加入下表7中的25μL包含引物的混合物，再按照如下PCR扩增程序扩增：94℃，5min，{94℃，30s→52℃，30s→72℃，1min}×30→72℃，5min。取5μL反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图3所示。鉴定正确后，胶回收PCR产物。

表7

4.将扩增得到的VEGFR1-2-Fc全长基因片段同pMD18-T载体进行连接，25℃连接5h，得到连接产物pMD18-T-VEGFR1-2-Fc载体，连接反应体系如下表8：

表8连接体系

5.连接产物转化DH5α感受态细胞：

1)于30μL DH5α感受态细胞中加入2μL上述连接产物，轻轻旋动以混匀，于冰中放置30min；

2)42℃水浴热激90s；

3)迅速将管转移到冰浴中放置2min；

4)每管加入1mL LB培养基，于37℃，160rpm振荡培养1h；

5)取100μL涂布到含有氨苄西林（Ampicillin，简称Amp）的LB琼脂平板培养基上，将平板置于37℃放置1h后倒置平皿，于37℃培养过夜。

6)克隆载体利用试剂盒小量提取后进行酶切验证，酶切体系如下表9：

表9

7)37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如表4所示，并将鉴定的阳性克隆送至上海生工测序，测得的序列如序列表中的SEQ IDNO.1所示。

8)将构建正确的VEGFR1-2-Fc全长基因连接至表达载体pcDNA3.1,连接反应体系如下表10：

表10

将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB固体平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒并酶切鉴定，酶切体系如下表11：

表11

37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

9)将构建正确的表达载体瞬转至CHO进行瞬时表达，以快速获取少量蛋白，并对目的蛋白的量进行ELISA法确定。

10)间接ELISA法检验所表达的VEGFR1-2-Fc能有效结合VEGF。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的序列是序列表中SEQ ID NO.1。

2.一种含有如权利要求1所述的基因的重组表达载体。

3.一种由权利要求1所述的用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因表达的融合蛋白。

4.如权利要求3所述的融合蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用。

5.一种用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

以人的单链cDNA为模板分别PCR扩增人血管内皮生长因子1的D2区域基因及人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因，并以人的IgG1的重链恒定区为模板PCR扩增人IgG1Fc基因片段，其中，用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列包括序列表中SEQ ID NO.2的基因序列、下游引物序列包括序列表中SEQ ID NO.3的基因序列，用于扩增所述人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因的上游引物序列包括序列表中的SEQ ID NO.4的基因序列、下游引物序列包括序列表中SEQ ID NO.5的基因序列，用于扩增人IgG1Fc基因片段的上游引物序列包括序列表中的SEQ ID NO.6的基因序列、下游引物序列包括序列表中SEQ ID NO.7的基因序列；

使用重叠PCR扩增技术扩增上述扩增得到的人血管内皮生长因子1的D2区域基因与人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因，得到人血管内皮生长因子1D2区域与人血管内皮生长因子2D3-D4区域连接的基因，其中，用于本步骤重叠PCR扩增的上游引物序列为用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列，下游引物序列为用于扩增所述人血管内皮生长因子2的D3-D4区域基因的下游引物序列；

使用重叠PCR技术扩增所述人血管内皮生长因子1D2区域与人血管内皮生长因子2D3-D4区域连接的基因及上述扩增得到的人IgG1Fc基因片段，得到所述用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因，其中，用于本步骤重叠PCR扩增的上游引物序列为用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列，下游引物序列为用于扩增人IgG1Fc基因片段的下游引物序列。

6.如权利要求5所述的用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于，所述用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列还包括第一限制性内切酶的酶切位点序列。

7.如权利要求6所述的用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于，所述第一限制性内切酶的酶切位点序列为EcoR I的酶切位点序列。

8.如权利要求7所述的用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于，所述用于扩增所述人血管内皮生长因子1的D2区域基因的上游引物序列是序列表中的SEQ ID NO.8的基因序列。

9.如权利要求5-8中任一项所述的用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于，所述用于扩增人IgG1Fc基因片段的下游引物序列还包括第二限制性内切酶的酶切位点序列。

10.如权利要求9所述的用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于，所述第二限制性内切酶的酶切位点序列为Not I的酶切位点序列。

11.如权利要求10所述的用于抑制肿瘤血管新生的融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于，所述用于扩增人IgG1Fc基因片段的下游引物序列是序列表中的SEQ ID NO.9的基因序列。