CN101279092A

CN101279092A - Vegf受体融合蛋白在制备治疗与血管生成有关的疾病中的应用

Info

Publication number: CN101279092A
Application number: CNA2007100906552A
Authority: CN
Inventors: 俞德超; 陈川
Original assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd
Current assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd
Priority date: 2007-04-02
Filing date: 2007-04-02
Publication date: 2008-10-08
Anticipated expiration: 2027-04-02
Also published as: CN101279092B

Abstract

本发明涉及VEGF受体融合蛋白FP1－FP8在制备治疗与血管生成有关的疾病中的应用，所述与血管生成有关的疾病包括自身免疫疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化症、血管炎、全身性硬化症和其它由血管生成引发的疾病如血管生成引起的支气管哮喘，肥胖症，鼻息肉，鼻炎，肝硬化，子宫内膜异位，子宫出血，疣，伤疤，卵巢囊肿等。

Description

VEGF受体融合蛋白在制备治疗与血管生成有关的疾病中的应用

技术领域

本发明涉及一系列能有效抑制血管生成(angiogenesis)的蛋白质，具体地说，VEGF受体融合蛋白FP1-FP8在制备治疗与血管生成有关的疾病中的应用，所述与血管生成有关的疾病包括自身免疫疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化症、血管炎、全身性硬化症和其它由血管生成引发的疾病如血管生成引起的支气管哮喘，肥胖症，鼻息肉，鼻炎，肝硬化，子宫内膜异位，子宫出血，疣，伤疤，卵巢囊肿等。

背景技术

血管生成是指从已经存在的血管生长出新的血管的过程。成人体内的血管绝大多数处于静止状态，血管生成只见于少数病理或生理状态，例如肿瘤，糖尿病人的病变视网膜，关节炎，贫血器官，增生期子宫内膜等。在肿瘤的发生过程中，血管生成对肿瘤的快速生长起到关键的作用(Hanallan and Folkman(1996)Cell，86：353-364.)。动物肿瘤模型的研究和人体临床试验已经证明，抑制肿瘤内新生血管的形成可以有效地阻止肿瘤的生长和发展，从而延长病人的生命。血管生成受到多种生物活性物质的调节和控制。主导血管生成过程的主要细胞是构成血管壁最内层的血管内皮细胞。多种生长因子能与血管内皮细胞表面相应的受体结合，经细胞内的信号传递系统调节血管内皮细胞的活动，从而调控血管的生成。

在各种生长因子中，血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)是调节血管生成的最重要因子(Ferrara(2002)Nat Rev Cancer，10：795-803.Ferrara(2002)Semin Oncol，29(6sumppl)：10-14)。血管内皮细胞生长因子可由多种细胞分泌。内皮细胞生长因子通过与相应的受体(vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR)结合而起作用。与VEGF相结合的受体主要有两种：VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2(KDR)。在分子结构上，这两种受体均由三个不同的功能区组成。第一个功能区是位于细胞之外的细胞外部分。它由七个免疫球蛋白样区域(d1-d7)组成。这一部分对VEGF具有特异亲和性，是VEGF与受体相结合的关键部位。第二个功能区是由疏水性氨基酸组成的跨细胞膜部分。第三个功能区是细胞内部分，其中包括酪氨酸激酶基团。在受体被VEGF激活后，酪氨酸激酶基团发生磷酸化，从而启动细胞内部的信号传递系统，最终造成内皮细胞的功能变化，导致血管生成。VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2(KDR)主要分布于血管内皮细胞。因此，VEGF对于血管内皮细胞具有高度专一性的调节作用。VEGF具有促进内皮细胞分裂，引导内皮细胞迁移，抑制细胞调亡，和诱导血管形态发生等功能，是血管生成的高效诱导剂。

自身免疫是指在长期感染、物理或化学因素刺激下集体的免疫系统针对自身抗原发生免疫应答，形成自身抗体或自身致敏性淋巴细胞，所导致的免疫病理过程。只有自身免疫达到一定强度以致破坏机体正常组织或引起生理功能紊乱，并有相应临床表现时才发展为自身免疫疾病。

自身免疫疾病包括、但不限于类风湿，红斑狼疮，干燥综合征，类风湿性关节炎，硬皮病，皮肌炎，多肌炎(多发性肌炎)，结节性多动脉炎，成人斯帝尔(still)，嗜酸性筋膜炎，白塞氏病(白塞氏综合症)，脂膜炎，红皮病，肺间质纤维化，Wegener肉芽肿病，慢性淋巴性甲状腺炎，甲状腺功能亢进，原发性甲状腺机能减退，甲状旁腺功能减退症，甲状腺炎如自身免疫甲状腺炎，慢性甲状腺炎，亚急性的甲状腺炎，特发性甲状腺机能减退，艾迪生病：肾上腺皮质功能衰竭症，格雷夫症，突眼性甲状腺肿，多腺体综合征如自身免疫多腺体综合征等，胰岛素依赖型糖尿病，重症肌无力，慢性溃疡性结肠炎，恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎，肺出血肾炎综合征，寻常天皰疮，类天皰疮，原发性胆汁性肝硬变，多发性脑脊髓硬化症，急性特发性多神经炎，特发性血小板减少性紫癜，脱髓鞘疾病，慢性淋巴细胞性甲状腺炎，自身免疫性脑脊髓炎，自身免疫性睾丸炎，结节性多动脉炎，萎缩性胃炎，溃疡性结肠炎，自身免疫性溶血性贫血等等。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性系统性自身免疫疾病，该病发病率高，致残性强，危害大。目前RA病因不明，尚缺乏有效的治疗方法，但如不及时治疗，则严重影响患者的关节功能和生活质量(Malemud CJ(2006)Clin Chim Acta，10-19)。

现在治疗RA的方法主要包括物理治疗，药物治疗和手术治疗。

传统的抗风湿药分为三类，第一类非甾体类抗炎药NSAIDS(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS)，这类药物可以缓解RA的症状，是RA的常用药物。这类药物对RA的免疫病理机制并无影响，对关节破坏没有治疗效果，对疾病的进程和预后没有效果，副作用主要是胃肠道症状。第二类慢作用抗风湿药(SAARD)包括缓解药物(DMARDS)和细胞毒药物，这类药物起效时间较长，除了能改善症状外，还能抑制异常的免疫功能，但大多数药物有较大的副作用。该类药物可以与NSAIDS联合使用。第三类为糖皮质激素(SAIIDS)，它是目前最强的抗炎药物，但不能阻断RA的病程进展和关节破坏，而且有明显的副作用和药物依赖性。

在RA的滑膜液中和滑膜上，已发现巨噬细胞和成纤维细胞释放的白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)，可通过调节细胞迁移，活化T，B淋巴细胞，造成软骨破坏和滑膜增生，因而在RA发病机制中发挥重要作用。阻断TNF-α和其它炎症分子可以治疗RA。现已上市的这类新药有下列几种。

Etanercept(ENBREL)是在美国被批准用于治疗RA的药物，它是一种“免疫粘合素”融合蛋白，包含人肿瘤坏死因子受体的胞外部分和人的IgG的Fc片段。可以从关节和血液中移除TNFα，可以防止因TNFα所引起的炎症。

Infliximab(REMICADE)是一种免疫抑制嵌合型单克隆抗体，可用于治疗RA和克罗恩病，它可以结合TNFα。另一种治疗RA的人源化的单克隆抗体Adalimumab，同样可结合TNFα。

Actemra是一种人源化的抗人IL-6受体的单克隆抗体，它可竞争性的封闭IL-6与受体的结合从而抑制IL-6的生物学功能，最早Actemra是用来治疗巨大淋巴结增生症。IL-6同样是影响类风湿关节炎炎症的重要分子，在随后的增加的适应症中使用它来治疗类风湿性关节炎。

在RA患者的血清中VEGF浓度比正常人高，认为VEGF可能是参与了RA的形成。RA滑膜炎在组织学观察中发现单核细胞的侵入和大量的血管生成，大量的证据表明RA在早期发生时滑膜中伴随VEGF浓度升高和大量的血管生成，血管的生成为发病部位提供了大量营养，为炎性血管翳和炎症细胞的侵入提供了基础(Fitzgerald O andBresnihan B(1995)Ann Rheum Dis，54：511 15)。有研究表明血管生成与骨骼和软骨破坏的联系大于其与血管翳的肿胀的联系(Ostergaard M等，(1999)Arthritis Rheum，42：918 29)。以VEGF/VEGFR为靶点可能是治疗RA的一种新方法。

目前使用抑制血管增生在鼠关节炎模型中的研究主要用可溶性的血管内皮细胞生长因子受体、内皮抑素Endostatin、酪氨酸激酶抑制剂等在鼠模型中进行实验，但还没有进行临床实验。Matsuno等人把RA滑液组织移植到SCID-HuRAg小鼠中，构建新的RA鼠模型，使用10-50mg/kg人重组Endostatin直接经皮注射到滑膜腔内，注射7天后观察变化，对照组注射磷酸钠盐，移植的滑膜体积在使用药物后明显缩小，炎症细胞的数量也剂量依赖地显著减少(Matsuno H，et al.(2002)J Rheumatol，29(5)：890-5)；Murakami等发现使用VEGFR1的酪氨酸激酶抑制剂KRN951能减轻关节炎的发生(Murakami M等，(2006)Blood，5：108(6)：1849-56.Epub 2006May 18)；Grosios等发现KDR酪氨酸激酶的抑制剂PTK787/ZK222584能减轻关节炎症的发生(GrosiosK等，(2004)Inflamm Res，53(4)：133-42)；TNP-470是一种血管生成抑制剂，能抑制自发性的关节炎KRN/NOD鼠的关节炎发生和骨组织损伤(De Bandt M等，(2000)Arthritis Rheum，43(9)：2056-63)；YOO等人发现一种新型的富含精氨酸的六肽(dRK6)能阻止VEGF和它的受体反应。在RA小鼠关节炎模型中发现dRK6可以抑制炎症细胞对滑膜细胞侵袭，明显的抑制炎症的肿胀程度。血清中抗胶原的抗体明显减少。在体外实验中发现VEGF能增加PBMC细胞中TNF和IL-6的表达，RA滑膜中的单核细胞比健康人PBMC对VEGF反应更强(Yoo SA等，(2005)J Immunol 174：5845-55)。

支气管哮喘是一种炎性疾病，是以长期的间断性支气管收缩为特征。这个疾病的主要特征是气道壁的结构变化，同时符合组织的生长和慢性创伤愈合变化，包括血管生成。(Thomps on HG等，(2007)20(2)：141-148)。

现在治疗支气管哮喘的药物主要有：

1、糖皮质激素剂型，如二丙酸倍氯米松气雾剂、丁地去炎松气雾剂、丙酸氟替卡松、去氟肤轻松等；

2、复合型吸入剂舒里利迭，它是丙酸氟替卡松与沙美特罗的复合剂型；

3、白三稀调节剂如孟鲁司特，扎鲁司特、齐留通等；

4、长效β2受体激动剂如沙美特罗和福美特罗；

5、茶碱缓控释剂及选择性磷酸二酯酶同工酶抑制剂，如时尔平，舒弗美、茶喘平等；

6、M胆碱受体阻滞剂如异丙溴胺、氧托品、贝罗都尔等；

7、免疫抑制剂。

哮喘的发病机制相当复杂，是由多种细胞因子共同作用的结果，单一用药治疗往往不十分理想，支气管治疗需要联合用药。

Lee等发现VEGF对形成支气管炎症和支气管壁重塑有着非常重要的作用(Lee CG等，(2004)Nat Med，10(10)：1095-1103)。在慢性哮喘病中支气管的密度变化是气道重塑过程中的一部分。Mark发现在灵长类慢性哮喘病中，血管密度的增加的原因是气道上皮特异的VEGF剪接体数量增加(Mark V.Avdalovic等，(2006)Am.J.Respir.Crit.Care Med.174：1069-1076)。Lee的研究表明VEGF与MMP有紧密的联系，VEGF调节MMP-9的表达在哮喘的最初症状和维持中起着重要的作用(Lee KS等，(2006)Am J Respir Crit Care Med.174(2)：161-70)。Suzaki等使用卵清蛋白免疫后小鼠后，在气道的周围有大量的VEGF，血清中VEGF的含量也同时升高，在使用Endostatin/Fc后，由于抑制了气道的高反应性，减轻了肺过敏性炎症，卵清蛋白特异性的IgE和炎症分子水平减少了。研究表明血管生成的抑制剂Endostatin可以阻止鼠哮喘模型的哮喘症状(Suzaki Y等，(2005)J Allergy Clin Immunol，16(6)：1220-7)。使用抗VEGF途径的药物降低哮喘病人的VEGF水平可能是治疗哮喘病的新方法。

VEGF与动脉粥样硬化的进展和斑块不稳定性有密切关系。将人重组的VEGF转人动脉粥样硬化小鼠模型，发现VEGF可通过炎症浸润和新生血管的形成等机制促进动脉粥样硬化损伤的进展(Celleti FL等，(2001)Nat Med，7：425-429)。抑制血管形成的拮抗剂Endostatin作用于Apo E-/-的小鼠模型，可显著抑制粥样斑块损伤的发展，斑块体积也随之缩小，而对照组斑块中血管发生与斑块体积无明显改变。(Moulton KS等，(1999)Circulation，99：1726-1732)

在炎性肠病患者的血清中有高水平的VEGF表达，外周血中单核细胞被确认是循环的VEGF来源。在克罗恩病(Crohn′s disease)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis)疾病中发现粒细胞间隙黏膜中VEGF表达增强(Griga T等，(2002)Hepatogastroenterology，49(43)：116-23)。

在全身性红斑狼疮病人血清中VEGF和可溶性VEGFR1的浓度比正常人体内浓度高，但在有活性的全身性红斑狼疮病人体可溶性VEGFR2表达量降低(Robak E等，(2003)MediatorsInflamm，12(5)：293-8)

除了自身免疫疾病外，其它由血管生成的引起的疾病有血管生成引起的肥胖症，鼻息肉，鼻炎，肝硬化，子宫内膜异位，子宫出血，疣，伤疤，卵巢囊肿，门静脉高压等。

门静脉高压是一种以内脏血液循环过度为特征的疾病。门静脉系统的侧支循环形成被认为在门静脉高压所引起的并发症中起关键性作用。门静脉系统的侧支循环与VEGF诱导的新生血管生成紧密相关(Fernandez M(2005)J hepatol，43：98-103)。

SU5416为一种VEGFR2的特异抑制剂，使门静脉高压大鼠模型中门静脉血流量明显下降，并增加了内脏小动脉和门静脉的阻力。药物抑制了门静脉系统的侧支的形成，也减少了内脏CD31和VEGFR2的表达(Fernandez M(2005)J hepatol，43：98-103)。通过使用抗VEGFR2的单克隆抗体阻断VEGFR2研究小鼠门侧支循环的形成，使用VEGFR2自磷酸化抑制剂抑制VEGFR2的胞内信号传导研究大鼠门静脉高压，发现门侧支的形成是血管生成依赖性的，通过抑制血管生成可以影响内脏血流量和门侧支的形成(Fernandez M等，(2004)Gastroenterology，12(3)：886-94)。使用血管生成抑制剂可能是阻止门静脉高压并发症的一个新的途径。

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)是一种育龄妇女常见的良性病。血管形成机制在EMs发病机理中的重要地位已逐渐被证实。其中，血管内皮生长因子异常升高显示了主导作用。VEGF抗体及VEGF竞争性拮抗受体-VEGFR1等能抑制子宫内膜裸鼠模型的种植(Hull ML等人，(2003)J Clin Endocrinol Metab，88(6)：2889-2899.)。此外，其它血管拮抗剂，如：TNP-470，Endostatin等也能够明显减少异位灶在裸鼠动物模型中体内新生血管的形成(Nap AW等，(2004)JClin Endocrinol Metab，2004，89(3)：1089-1095)。

发明内容

本发明的目的是提供一种或多种选自以下VEGF受体融合蛋白FP1-FP8中的VEGF抑制剂在制备治疗由病变血管生长引起的各种疾病的药物中的应用：

FP1：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白FC组成；

FP2：由KDR的第1免疫球蛋白样区域、FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白FC组成；

FP3：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3和第4免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白FC组成；

FP4：由编码FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域、FLT-1的第4免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白FC组成；

FP5：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3-5免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白FC组成；

FP6：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域、FLT-1的第4-5免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白FC组成；

FP7：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3和第4免疫球蛋白样区域组成；

FP8：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3免疫球蛋白样区域组成。

所述由病变血管增生引起的人类疾病包括自身免疫疾病，支气管哮喘，血管增生引起的肥胖症，鼻息肉，鼻炎，肝硬化，子宫内膜异位，子宫出血，疣，伤疤，卵巢囊肿等。

所述自身免疫疾病包括、但不限于类风湿，红斑狼疮，干燥综合征，类风湿性关节炎，硬皮病，皮肌炎，多肌炎(多发性肌炎)，结节性多动脉炎，成人斯帝尔(still)，嗜酸性筋膜炎，白塞氏病(白塞氏综合症)，脂膜炎，红皮病，肺间质纤维化，Wegener肉芽肿病，慢性淋巴性甲状腺炎，甲状腺功能亢进，原发性甲状腺机能减退，甲状旁腺功能减退症，甲状腺炎如自身免疫甲状腺炎、慢性甲状腺炎、亚急性的甲状腺炎、特发性甲状腺机能减退，肾上腺皮质功能衰竭症，突眼性甲状腺肿，多腺体综合征如自身免疫多腺体综合征等，胰岛素依赖型糖尿病，重症肌无力，慢性溃疡性结肠炎，恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎，肺出血肾炎综合征，寻常天皰疮，类天皰疮，原发性胆汁性肝硬变，多发性脑脊髓硬化症，急性特发性多神经炎，特发性血小板减少性紫癜，脱髓鞘疾病，慢性淋巴细胞性甲状腺炎，自身免疫性脑脊髓炎，自身免疫性睾丸炎，结节性多动脉炎，萎缩性胃炎，溃疡性结肠炎，自身免疫性溶血性贫血等等。

本发明所述的VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5和FP6的氨基酸序列及其制备方法在同一申请人的中国专利申请CN200510073595.4(WO2005/121176A1，发明名称“抑制血管生成的融合蛋白质及其用途”)中被公开。本发明所述的VEGF受体融合蛋白FP7和FP8的氨基酸序列及其制备方法在同一申请人的中国专利申请CN200610066257.2(发明名称“VEGF受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用”)中被公开。这两个申请的公开内容作为本申请的一部分全文并入本申请。

FP3、FP7、FP8的氨基酸序列分别对应本发明序列表中的SEQ ID1-3，FP1、FP2、FP4、FP5、FP6的氨基酸序列可参考中国专利申请CN200510073595.4得到。

本发明所述的、可作为VEGF抑制剂的融合蛋白(FP1、FP2、FP 3、FP4、FP5、FP6)可以通过CN200510073595.4号专利申请说明书中记载的方法或相似方法制备。对于FP7、FP8，本发明提供了其制备方法和优选的实施例，其制备原理和上述CN200510073595.4号专利申请说明书中的记载相似。

本发明的另一个目的是提供一种或多种选自以下VEGF受体融合蛋白FP1-FP8中的VEGF抑制剂与其它缓解病情抗风湿药物DMARDs药物，优选氨甲喋呤(MTX)，硫唑嘌呤，羟基氯喹，金制剂，青霉胺，阿达木单抗等联合用于治疗自身免疫疾病的用途：

FP 3：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3和第4免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白FC组成；

所述自身免疫疾病包括、但不限于以上列举的那些。

本发明的另一个目的是提供一种或多种选自VEGF受体融合蛋白FP1-FP8中的VEGF抑制剂与糖皮质激素药物例如地塞米松联合用于治疗支气管哮喘的用途：

本发明的又一个目的是提供一种治疗由于病变血管增生引起的疾病的方法，所述由病变血管增生引起的人类疾病包括自身免疫疾病，支气管哮喘，血管增生引起的肥胖症，鼻息肉，鼻炎，肝硬化，子宫内膜异位，子宫出血，疣，伤疤，卵巢囊肿等，所述方法包括将治疗有效量的VEGF抑制剂，即VEGF受体融合蛋白FP1-FP8的一种或多种和任选的载体给药于患者。所述自身免疫疾病包括、但不限于以上列举的那些。

本发明的再一个目的是提供治疗自身免疫病的方法，包括将治疗有效量的选自VEGF受体融合蛋白FP1-FP8的一种或多种中的VEGF抑制剂与风湿病病情缓解药物例如氨甲喋呤(MTX)，硫唑嘌呤，羟基氯喹，金制剂，青霉胺，阿达木单抗联合给药于自身免疫病患者。所述自身免疫病选自以上列举的那些。

本发明的再一个目的是提供治疗支气管哮喘的方法，包括将治疗有效量的选自VEGF受体融合蛋白FP1-FP8的一种或多种中的VEGF抑制剂与糖皮质激素例如地塞米松联合给药于支气管哮喘患者。

本发明的VEGF受体融合蛋白包括它们的纯化合物形式、溶剂化物形式、盐形式或盐的溶剂化物形式。

本发明涉及的融合蛋白经过重组技术制成的制品经过纯化达到药用纯度后，可以根据制剂的需要制备成药物制剂，这些制剂应该特别适合于静脉注射给药、腹腔注射、皮下注射。

本发明融合蛋白药剂的制备工艺可以采用药物制剂的常规制法完成，优选的是溶液制剂或干粉制剂。作为干粉制剂，使用时将干粉溶解，使成为溶液。

本发明涉及的融合蛋白制剂，需要时可以加入药物可接受的载体，所述载体可以是任何适合本发明的制剂形式的药物载体，优选的载体选自：磷酸钠(sodium phosphate)、琥珀酸钠(sodiumsuccinate)、组氨酸(histidine)、甘露醇(mannitol)、海藻糖(trehalose dihydrate)、聚山梨醇酯(polysorbate 20)、氯化钠(sodium chloride)、蔗糖(sucrose)、三羟甲基氨基甲烷(trometamol)或乳糖。上述制剂的缓冲液(formulation buffer)，应含有pH缓冲系统如磷酸盐(phosphate)、柠檬酸盐(citrate)、乙酸盐(acetate)、琥珀酸盐(succinate)、三羟甲基氨基甲烷(trometamol，又名Tris)或组氨酸(histidine)等中的一种或多种，pH的范围在3至9；可含有渗透压调节剂如氯化钠(sodium chloride)、葡萄糖(dextrose)等；可含有稳定剂如氨基酸(amino acids)、甘油(glycerol)、环糊精(cyclodextrin)、蔗糖(sucrose)、海藻糖(trehalose dihydrate)等；可含有防腐剂如噻汞撒(thimerosal)、亚硫酸氢钠(sodiumbisulfite)、苯基乙醇(benzyl alcohol)等。对于冻干制剂，可含有赋形剂如甘露醇(mannitol)等；对于溶液制剂，可含有表面活性剂如聚山梨醇酯(polysorbate 20或80)、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在上述制剂中，融合蛋白的浓度范围在0.01mg/ml至1000mg/ml。

另外制剂中根据需要还可加入防腐剂，稳定剂，助溶剂等辅助成分，可以选自任何适宜的药剂学常规的辅助成分。溶剂选择水或其他等渗溶液，缓冲溶液等。

本发明融合蛋白的用量根据临床的需要、具体疾病、患者体重、病情、病程、临床医生的经验而定，作为指导，可以按照每次给药0.1mg-3000mg，优选1mg-2000mg，可以每日、每2日、每3日、每4日、每5日、每6日、每周、每两周、每三周等给药一次，或者每日给药一次以上。

本发明涉及的含有抑制血管生成的VEGF抑制剂可以通过多种不同的给药途径给予病人，其中包括(但不限于)静脉给药，皮下注射，腹腔内注射，肌注，局部给药和关节腔内注射等。

附图说明

图1是本发明涉及的八种融合蛋白的结构示意图。它们由不同的Flt-1片段、KDR片段以及免疫球蛋白FC片段用基因工程方法构建而成。

图2是本发明的FP3、FP7、FP8与VEGF的结合的亲和力比较。

具体实施方式

以下实施例对本发明所涉及的融合蛋白构建和应用作了详细说明。但是本发明的内容及用途并不限制于实施例的范围。

实施例1FP7的构建

融合蛋白FP7是在由引物Flt-1D2(F)5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’、Flt-1D2(R)5’-tatgattgtattggtttgtccat-3’、KDR D3(F)5’-gatgtggttctgagtccgtctca-3’和KDR D3-4(R)5’-cggtgggacatacacaaccaga-3’从HUVEC细胞提取到的mRNA作为模板合成的cDNA上得到的Flt-1和KDR基因片段重组而成。具体的条件是，在变性95℃、30分钟，退火56℃、45秒钟，延伸72℃、2分钟的条件下，进行PCR扩增，30个循环，获得Flt-1和KDR 1gG样结构域的PCR产物。用TA cloning试剂盒，把PCR产物克隆到PCR2.1质粒中，并转染E.coli，选取白色菌落，加入LB培养基，培养过夜。用Qiangen质粒提取试剂盒提取质粒后，酶切及测序鉴定。采用拼接PCR(Sewing PCR)方法，把Flt-1片段、KDR片段和IgG铰链区局部序列的核糖核酸一起连接。在两端引物中设计EcoR1酶切位点。PCR终产物在用EcoR1酶切后，经Qiangen纯化试剂盒纯化DNA片段，并插入pcDNA3.1质粒。重组质粒转染E.coli，选取阳性菌落，加入LB培养基，培养过夜。Qiangen质粒提取质粒后酶切，并测序鉴定。已获证实的质粒再转染CHO细胞，就得到稳定表达融合蛋白FP7的细胞系。

实施例2 FP8的构建

融合蛋白FP8是以FP7为模板直接用PCR扩增而成，PCR所用引物是flt-1D₂(F)5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’和KDR D3-hing(R)。后者的核苷酸序列为：5’-aggtgctgggcacagtgggcatgtgtgagttttgtctttttcatggaccctgacaaatg-3’。它包括与KDR第三免疫球蛋白样区相互补的序列和人IgG Fc绞链区的部分核苷酸序列。PCR扩增和基因克隆的方法与实例1相同。最终将插入了FP8的Pc DNA3.1质粒转染CHO细胞，并获得稳定细胞珠，用于蛋白质的表达。

实施例3融合蛋白FP3、FP7在小鼠类风湿性关节炎中的作用

CIA小鼠模型是最为广泛使用的类风湿性关节炎的动物模型，模型建立是使用牛胶原(CII)免疫小鼠。将2g/L的CII与完全福氏佐剂按1∶1的比例混合后，于DBA/1J小鼠(8-10周)的尾根部皮内注射，每只200μL。21天后，再于同上部位注射相同浓度的CII与完全福氏佐剂进行二次免疫，每只200μL。CIA模型的建立根据踝关节及足趾关节部位出现的红斑、肿胀和关节的变形程度来评定。关节肿胀程度根据厚度测量尺测量足厚度来评定：0分：关节正常；1分：轻度关节肿胀伴或不伴红斑，无关节变形；2分：明显关节肿胀，但无关节变形；3分：关节强直或变形。每只小鼠最高得分不超过12分。

将CIA模型小鼠分为4组，每组10只；各组均行CoII型免疫，再次免疫后，A：给CIA小鼠腹腔内注射生理盐水200μL次·只；B：CIA小鼠腹腔内注射人IgG(300μg/200μL次·只)；C：CIA小鼠腹腔内注射FP3(300μg/200μL次·只)；D：CIA小鼠腹腔内注射FP7(300μg/200μL次·只)。21天后检测关节炎指数。结果见表1。关节炎小鼠经融合蛋白FP3、FP7注射后，与对照组A，B相比体重相差不大，关节指数变化较显著，表明融合蛋白FP3和FP7能抑制CIA小鼠模型关节炎的发展。

表1融合蛋白FP3、FP7对CIA小鼠模型关节指数的影响

^*P＜0.05与对照组A，B相比

实施例4融合蛋白FP 3在系统性红斑狼疮小鼠模型中的作用

纯系昆明小鼠30只，20～22g，雌雄各半，参照WHO免疫研究教学中心报道造模方法，腹腔注射细菌脂多糖(LPS)构建系统性红斑狼疮动物模型。构建成功后，动物分为三组每组10只，A：小鼠腹腔内注射生理盐水200μL次·只；B：小鼠腹腔内注射人IgG(300μg/200μL次·只)；C：小鼠腹腔内注射FP3(300μg/200μL次·只)。间接免疫荧光法检测模型小鼠血清中抗核抗体(ANA)，各组间抗核抗体(ANA)荧光滴度分别为：A组5.12±0.28，B组4.90±0.36，C组3.38±0.56。经统计学学处理，A组与B组相比P＞0.05，差异不显著；A组与C组相比P＜0.05；B组与C组相比P＜0.05，差异显著。与对照相比注射FP3能显著降低小鼠血清中抗核抗体。表明融合蛋白FP3能抑制系统性红斑狼疮动物模型的发展。

实施例5 融合蛋白FP6在干燥综合症中的应用

40只小鼠随机分为4组：正常对照组10只；佐剂对照组10只，注射CFA 0.2mL/只鼠，模型组10只；治疗组10只，小鼠腹腔内注射FP6(300μg/200μL次·只)，取Lewis大鼠颌下腺制成匀浆，采用差速离心法进行抗原的纯化，取100000g×2h分离出的组分作为免疫用抗原，免疫Balb/c小鼠0.2mL/只，首次免疫后，每间隔15天加强一次，共加强3次。首次免疫第60天处死小鼠进行药效学评价。血清特异性抗体的检测，首次免疫后第60天眼眶取血，分离血清备用。ELISA法测定血清特异性抗体。唾液腺分泌功能的测定分别于给药后第60天测定小鼠唾液分泌量。将无菌的脱脂棉制成干重为5mg的棉球，放入小鼠口腔后颊部，3min后取出，测定湿重。结果见表2。与模型对照组相比，融合蛋白FP6能显著的降低抗自身特异性抗体的含量，增加唾液分泌，减轻干燥综合症的症状。

表2融合蛋白对干燥综合症小鼠特异性抗体和唾液分泌量的影响

^*P＜0.05与对照组相比

实施例6融合蛋白FP3在人类风湿性关节炎疾病中的应用

类风湿性关节炎患者要符合美国风湿病学院(American Collegeof Rheumatology，简称为ACR)拟定一套RA诊断标准。本组80例，女40例，男40例；年龄最大57岁，最小18岁。病程最长16.7年，最短2个月。随机分成两组，两组差异无显著性，具有可比性排除标准：有严重心、肝、肾等重要脏器和血液、内分泌系统病变及病史者；孕妇、哺乳期妇女；4周内关节腔内接受过皮质类固醇治疗的；正处于急、慢性感染期间，或既往有活动性结核病史者；恶性肿瘤患者或有家族史的易感人群；骨、关节严重畸形丧失劳动能力者。

诊断标准：

临床治愈：症状、体征全部或基本消失，功能活动恢复正常，主要理化指标结果基本正常；

显效：全部症状消除或主要症状消除，关节功能基本恢复，能参加正常工作和劳动，理化指标基本正常；

有效：主要症状、体征基本消除或部分消除，或明显进步，主要理化指标有所改善；

无效：和治疗前比较各方面均无改善。

治疗组受试者每周口服1次MTX(7.5mg/次起，8周内逐步加到15mg/次)，同时每周2次皮下注射FP 325mg次；对照组中受试者则每周1次口服MTX(7.5mg/次起，8周内逐步加到15mg/次)，连续用药24周。治疗组总有效率95％，对照组总有效率为72.5％，两组差异显著，P＜0.01，有统计学意义。血沉(Es R)、类风湿因子(RF)、C反应蛋白(CRP)指标(见表3)，治疗组与对照组相比差异显著。说明FP 3与MTX联合治疗比MTX单一治疗有效。

表3治疗前后两组各项理化指标统计对比

ESR 41.16±17.84 15.16±9.77^* 43.16±11.84 25.24±8.77^*

RF 46.27±7.86 28.12±6.73^* 52.18±6.37 40.16±9.27^*

CRP 31.46±3.78 11.16±3.97^* 26.16±9.57 16.23±3.26^*

注：治疗组与对照组治疗后比较，^*P＜0.05，差异显著

实施例7融合蛋白FP3、FP7在人哮喘疾病中的应用

这些融合蛋白在用于治疗与病变新生血管生长相关的哮喘时，不同严重程度的哮喘患者，使用不同剂量0.5-50mg/kg，通过静脉注射的方法将融合蛋白FP3或FP7注入体内。患者可能需要接受多次治疗，可以是每两到三周注射一次，同时根据2002年修订的全球哮喘防治议(GINA方案)治疗哮喘患者，药物包括(但不局限于)糖皮质激素剂型，如二丙酸倍氯米松气雾剂、丁地去炎松气雾剂、丙酸氟替卡松、去氟肤轻松等；复合型吸入剂舒里利迭；白三稀调节剂如孟鲁司特，扎鲁司特、齐留通等；长效β2受体激动剂如杀美特罗和福美特罗；茶碱缓控释剂及选择性磷酸二酯酶同工酶抑制剂，如时尔平，舒弗美、茶喘平等；M胆碱受体阻滞剂如异丙溴胺、氧托品、贝罗都尔等；免疫抑制剂MTX等。根据不同药物推荐剂量与融合蛋白来联合治疗。全部病例均符合病变新生血管生长相关的哮喘标准，排除先天性心脏病、结核感染、支气管异物、支气管肺发育不良等疾病，均无呼吸衰竭、心力衰竭等并发症等患者。随机分为2组：A组64例，男42例，女22例；B组56例，男32例，女24例，C组61例，男36例，女25例，年龄5岁到60岁。

疗效判定：

显效：治疗1周，咳嗽明显减轻或消失，无夜间或清晨咳嗽，支气管扩张试验阴性(FEV增加15以下)；

有效：用药2周咳嗽明显减轻，偶有夜间或清晨咳嗽，支气管扩张试验正常；

无效：用药2周以上咳嗽无明显减轻，仍有夜间或清晨咳嗽，支气管扩张试验异常。

A组加用地塞米松0.2～0.4mg/kg·次^-1。B组加用地塞米松0.2-0.4mg/kg·次^-1+FP 36mg/kg，C组加用地塞米松0.2-0.4mg/kg·次^-1+FP76.5mg/kg，疗程5-7天。A组有效率73.8％，B组有效率93.6％，C组有效率89.3％，B组和C组与A比较，P＜0.05差异显著，有统计学意义。表明FP 3和FP7在治疗与病变新生血管生长相关的哮喘时有效。

SEQUENCE LISTING

<110>成都康弘生物科技有限公司

<120>VEGF受体融合蛋白在制备治疗与血管生成有关的疾病中的应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>552

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>根据FLT-1和KDR的结构设计，以有利于和VEGF结合

<400>1

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu

20 25 30

Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile

65 70 75 80

Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu

85 90 95

Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys

100 105 110

Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val

115 120 125

Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val

130 135 140

Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn

145 150 155 160

Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg

165 170 175

Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr

180 185 190

Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys

195 200 205

Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg

210 215 220

Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu

225 230 235 240

Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Leu Pro Ala Lys Tyr Leu

245 250 255

Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu

260 265 270

Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu

275 280 285

Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro

290 295 300

Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val

305 310 315 320

Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala

325 330 335

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

340 345 350

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

355 360 365

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

370 375 380

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

385 390 395 400

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

405 410 415

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

420 425 430

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

435 440 445

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

450 455 460

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

465 470 475 480

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

485 490 495

Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

500 505 510

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

515 520 525

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

530 535 540

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550

<210>2

<211>308

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>根据FLT-1和KDR的结构设计，以有利于和VEGF结合

<400>2

Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His

1 5 10 15

Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro

20 25 30

Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro

35 40 45

Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser

50 55 60

Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val

65 70 75 80

Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn

85 90 95

Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser

100 105 110

Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn

115 120 125

Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His

130 135 140

Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met

145 150 155 160

Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val ThrArg Ser Asp

165 170 175

Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys

180 185 190

Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly

195 200 205

Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg

210 215 220

Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr

225 230 235 240

Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His

245 250 255

Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr

260 265 270

Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val

275 280 285

Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu

290 295 300

Cys Pro Ala Pro

305

<210>3

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>根据FLT-1和KDR的结构设计，以有利于和VEGF结合

<400>3

Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His

1 5 10 15

Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro

20 25 30

Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro

35 40 45

Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser

50 55 60

Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val

65 70 75 80

Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn

85 90 95

Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser

100 105 110

Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn

115 120 125

Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His

130 135 140

Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met

145 150 155 160

Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp

165 170 175

Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys

180 l85 190

Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys

195 200 205

Pro Leu Cys Pro Ala Pro

210

Claims

1. 一种或多种选自以下VEGF受体融合蛋白FP1-FP8中的VEGF抑制剂在制备治疗由病变血管生长引起的各种疾病的药物中的应用：

FP8：由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3免疫球蛋白样区域组成；

所述由病变血管增生引起的人类疾病选自自身免疫疾病，支气管哮喘，血管增生引起的肥胖症，鼻息肉，鼻炎，肝硬化，子宫内膜异位，子宫出血，疣，伤疤，卵巢囊肿。

2. 根据权利要求1所述的应用，其中所述自身免疫疾病选自类风湿，红斑狼疮，干燥综合征，类风湿性关节炎，硬皮病，皮肌炎，多肌炎，结节性多动脉炎，成人斯帝尔，嗜酸性筋膜炎，白塞氏病，脂膜炎，红皮病，肺间质纤维化，Wegener肉芽肿病，慢性淋巴性甲状腺炎，甲状腺功能亢进，原发性甲状腺机能减退，甲状旁腺功能减退症，甲状腺炎如自身免疫甲状腺炎、慢性甲状腺炎、亚急性的甲状腺炎、特发性甲状腺机能减退，肾上腺皮质功能衰竭症，突眼性甲状腺肿，多腺体综合征，胰岛素依赖型糖尿病，重症肌无力，慢性溃疡性结肠炎，恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎，肺出血肾炎综合征，寻常天皰疮，类天皰疮，原发性胆汁性肝硬变，多发性脑脊髓硬化症，急性特发性多神经炎，特发性血小板减少性紫癜，脱髓鞘疾病，慢性淋巴细胞性甲状腺炎，自身免疫性脑脊髓炎，自身免疫性睾丸炎，结节性多动脉炎，萎缩性胃炎，溃疡性结肠炎，自身免疫性溶血性贫血。

3. 一种或多种选自以下VEGF受体融合蛋白FP1-FP8中的VEGF抑制剂与其它缓解病情抗风湿药物联合用于治疗自身免疫疾病的用途：

4. 根据权利要求3所述的用途，其中所述病情缓解抗风湿药物选自氨甲喋呤，硫唑嘌呤，羟基氯喹，金制剂，青霉胺，阿达木单抗。

5. 一种或多种选自VEGF受体融合蛋白FP1-FP8中的VEGF抑制剂与糖皮质激素药物地塞米松联合用于治疗支气管哮喘的用途：

6. 一种治疗由于病变血管增生引起的疾病的方法，所述由病变血管增生引起的人类疾病选自自身免疫疾病，支气管哮喘，血管增生引起的肥胖症，鼻息肉，鼻炎，肝硬化，子宫内膜异位，子宫出血，疣，伤疤，卵巢囊肿，所述方法包括将治疗有效量的VEGF抑制剂，即VEGF受体融合蛋白FP1-FP8的一种或多种和任选的载体给药于患者。

7. 治疗自身免疫病的方法，包括将治疗有效量的选自VEGF受体融合蛋白FP1-FP8中的一种或多种与风湿病病情缓解药物给药于自身免疫病患者。

8. 治疗支气管哮喘的方法，包括将治疗有效量的选自VEGF受体融合蛋白FP1-FP8中的一种或多种与糖皮质激素给药于支气管哮喘患者。