CN109879963A - 一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体及其制备方法和应用，所述单克隆抗体为抗人periostin单克隆抗体，所述抗人periostin单克隆抗体的抗体片段包括单链可变区片段、Fab、Fab’、F(ab’)2或纳米抗体。本发明的抗人periostin单克隆抗体可与人体内血液、体液中的periostin特异性结合，抑制periostin促进细胞形成微管作用，具有预防及治疗组织器官纤维化、新生血管形成的作用，适用于制备治疗组织器官纤维化的单克隆抗体药物以及制备治疗肿瘤的药物。

Description

一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体及其 制备方法和应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的 单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

Periostin又被称为骨膜素(Osteoblast-specific factor 2)或骨膜蛋白，是参与组织器官纤 维化的重要内源性细胞因子。人periostin基因位于染色体13q13.3，cDNA全长为3187bp， 编码区为2433bp，人periostin蛋白含有836个氨基酸残基，分子量约为93.3kDa。Periostin 含一个氨基端分泌性的信号肽，一个富半胱氨酸的氨基末端，四个同源性重复区以及亲水的 羧基端。Periostin是一种独特的细胞外基质蛋白，其表达主要集中在体内机械应力大的富含 胶原的结缔组织中，例如骨外膜、牙周韧带、肌腱、角膜、成熟的心脏瓣膜以及发育的心脏 的心内膜垫等。Periostin属于fasciclin家族，不仅与细胞外基质相互作用，还作为配体与整 合素相互作用，通过这些相互作用进行组织发育以及重构。

Periostin在多种癌症中都中过表达，能够促进肿瘤内血管形成，并促使肿瘤细胞迁移和 侵袭。此外，Periostin与各种纤维化病(例如，视网膜纤维化、肺纤维化、神经纤维化、肝 纤维化、眼组织纤维化等)和肾脏损伤等相关。Periostin能促进组织器官纤维化的形成，因 此，阻断periostin这种纤维化作用已成为治疗纤维化性疾病的新靶点。

眼组织纤维化在眼科疾病中较为常见，而periostin是纤维化过程中关键因素之一，特别 是手术和外伤造成血眼屏障破坏，血管通透性增加，使纤维蛋白原、炎性细胞、成纤维细胞 移行进入眼内，然后在凝血酶作用下转变为纤维蛋白，常见于青光眼滤过性手术、眼外伤、 糖尿病性视网膜病变和玻璃体视网膜手术以后都涉及组织的纤维化。各种因素损伤所致眼组 织纤维化对视力的恢复有很大的副作用，所以抑制损伤组织的纤维化，减轻疤痕形成是保证 视力的关键，也是世界性的难题。目前，临床最常用的抗纤维化药物疗效有限，而且有许多 并发症和副作用；其他类型的治疗方法有的仅限于动物实验阶段，尚有待于进一步的临床研 究。

因此，寻找更有效的抗纤维化的治疗药物有重大社会意义和经济效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体及其制备 方法和应用，所述单克隆抗体能够有效抑制periostin引起的新生血管形成及组织器官纤维 化。

本发明的一方面提供一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体，所述单克 隆抗体为抗人periostin单克隆抗体，所述抗人periostin单克隆抗体的抗体片段包括单链可变 区片段、Fab、Fab’、F(ab’)2或纳米抗体。

进一步的，所述抗体片段与其他的肽或蛋白质融合、或者被修饰剂修饰。

本发明的另一方面提供一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体的制备方 法，包括：获得核酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组人periostin抗原蛋白；以所述重组人 priostin抗原蛋白免疫小鼠，并从免疫后的小鼠中分离获得小鼠脾细胞；将所述小鼠脾细胞 与同系骨髓瘤细胞进行混合，利用PEG进行膜融合，形成杂交瘤细胞；筛选成功膜融合的 杂交瘤细胞，进行体外增殖培养，在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，预定时间后从接种后的小 鼠的腹水中获得所述单克隆抗体。

进一步的，从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体的步骤包括：对所述腹水进行 粗提纯；对所述粗提纯的产物进行透析；利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化，其中， 所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3mL/min，利 用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；所述流动相A为三羟甲基氨基 甲烷缓冲液，所述流动相B为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氯化钠的混合溶液。

进一步的，以所述重组人periostin抗原蛋白免疫小鼠的步骤包括：在所述重组人periostin抗原蛋白中加入弗氏完全佐剂，对小鼠进行首次免疫注射；在所述重组人periostin 抗原蛋白中加入弗氏不完全佐剂，对首次免疫后的小鼠进行加强免疫注射。

进一步的，将1×10⁸个所述脾细胞和2～3×10⁷个同系骨髓瘤细胞进行混合。

本发明提供的单克隆抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述肿瘤包括：结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈部癌、甲状腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、肺癌、恶性胸膜间皮瘤、肝细胞癌、胆管细胞癌、食管癌和前列 腺癌。

本发明提供的单克隆抗体在制备抑制纤维化性疾病药物中的应用。

进一步的，所述纤维化疾病包括：眼玻璃体视网膜组织纤维化、肺纤维化、神经纤维 化、肾纤维化和肝纤维化。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体能够特异性地和 periostin结合，具有优良的结合活性和/或中和活性，能够很好的降低periostin活性，抑制periostin促进内皮细胞(HUVEC)细胞形成微管，阻断periostin在组织器官纤维化中的作 用，从而抑制新生血管形成及纤维形成，可以避免新生血管带来的癌症迁移与侵袭以及细胞 纤维化造成的各种疾病，适用于制备治疗组织器官纤维化病变的抗体类药物以及制备治疗肿 瘤的药物。

附图说明

图1为本发明实施例制备抗人periostin单克隆抗体的流程图。

图2A为periostin重组蛋白的表达与纯化的电泳结果图；

其中，MW为蛋白质Marker；FT为流穿液组分；W1-W3为低浓度洗脱液洗脱组分； E1-E9为目的蛋白periostin不同出峰时间电泳结果。

图2B为2μg目的蛋白periostin的定量电泳结果。

图3为纯化的单克隆抗体非还原SDS-PAGE电泳结果；

其中，1为单克隆抗体抗体1；2为单克隆抗体抗体2。

图4为单克隆抗体与重组蛋白特异性结合WB结果；

其中，1为单克隆抗体抗体1异性结合WB结果；2为单克隆抗体抗体2异性结合WB 结果。

图5为抗体1抑制periostin促进血管内皮细胞微管形成；

其中，A为加入periostin后血管内皮细胞成管情况，B为加入periostin及50ng抗体1 后血管内皮细胞成管情况，C为加入periostin及100ng抗体1后血管内皮细胞成管情况，D 为加入periostin及200ng抗体1后血管内皮细胞成管情况，E为不同用量抗体1作用下血管 内皮细胞微管形成数量对比，F为不同用量抗体1作用下对血管内皮细胞微管形成抑制率对 比。

图6为抗体2抑制periostin促进血管内皮细胞微管形成；

其中，A为加入periostin后血管内皮细胞成管情况，B为加入periostin及50ng抗体2 后血管内皮细胞成管情况，C为加入periostin及100ng抗体2后血管内皮细胞成管情况，D 为加入periostin及200ng抗体2后血管内皮细胞成管情况，E为不同用量抗体2作用下血管 内皮细胞微管形成数量对比，F为不同用量抗体2作用下对血管内皮细胞微管形成抑制率对 比。

具体实施方式

现在，将参照附图更充分地描述示例实施例，其中，一些示例性实施例在附图中示出。

本发明的实施例提供一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体，其特异性 抗原为核酸序列如SEQ ID NO:1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人periostin。

所述单克隆抗体为抗人periostin单克隆抗体，所述抗人periostin单克隆抗体的抗体片段 包括单链可变区片段、Fab、Fab’、F(ab’)2或纳米抗体。

所述抗体片段与其他的肽或蛋白质融合、或者被修饰剂修饰。

下面结合图1至图6详细描述抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体的制备 方法。参照图1，本发明的实施例提供一种抗人periostin单克隆抗体的制备方法，包括：

在步骤S10，获得核酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组人periostin抗原蛋白。

作为示例，重组人periostin抗原蛋白的获得方法如下：

1、通过生物信息学方法，在NCBI数据库中检索获得periostin核酸序列如SEQ IDNO:1所示。根据此核酸序列信息，人工合成periostin的DNA。

2、以所述DNA为模板，进行PCR扩增。

PCR引物如下：

P1：GAGCTCATGATTCCCTTTTTACCC

P2：GCGGCCGCACTCTGAGAACGACCTT

PCR体系如下：Ex Taq(5U/μL)0.25μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(2.5mM) 4μL，Template 1μL，上游引物P1(10μM)1μL，下游引物P2(10μM)1μL，ddH₂O补足至50μL。

PCR扩增条件：变性温度93℃，退火温度55℃，延伸温度72℃，30～40个循环，时间为2～3小时。

3、将得到的PCR产物以ScaI/Not I双酶切法链接到pATX2上，同时加入6*His标签，构建重组质粒。

4、将所述重组质粒转染HEK293细胞后进行培养，六天后收集样品并进行SDS-PAGE电泳检测和蛋白质免疫印迹(western blotting)检测，检测成果获得表达株。

5、大量培养所述表达株并经亲和层析纯化获得重组人periostin抗原蛋白。

将获得的重组人periostin抗原蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，电泳结果如图2A和图 2B所示。图2A中E1-E9为目的蛋白periostin抗原蛋白不同出峰时间电泳结果，图2B表示上样 量为2μg时，目的蛋白periostin的定量电泳结果，由图2B可见隐约条带，其浓度达到要求。

将获得的重组人periostin抗原蛋白送普健生物(武汉)科技有限公司进行基因检测，其 核酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，由此可见，成功合成了重 组人periostin抗原蛋白。

应当理解，可利用本领域常规的分子生物学方法获得重组人periostin抗原蛋白，本发明 对此不作限定。

在步骤S20，以获得的重组人periostin抗原蛋白免疫小鼠，并从免疫后的小鼠中分离获 得小鼠脾细胞。

作为示例，选用6～8周龄Balb/c小鼠为免疫动物，进行重组人periostin抗原蛋白免疫注 射，刺激相应的B淋巴细胞活化、增殖和分化为致敏B淋巴细胞。

优选地，以获得的重组人periostin抗原蛋白免疫8周龄Balb/c小鼠。

在一个实施例中，以所述重组人periostin抗原蛋白免疫小鼠的步骤包括：在所述重组人 periostin抗原蛋白中加入弗氏完全佐剂，对小鼠进行首次免疫注射；在所述重组人periostin 抗原蛋白中加入弗氏不完全佐剂，对首次免疫后的小鼠进行加强免疫注射。

作为示例，重组人periostin抗原蛋白加入弗氏完全佐剂，按每只小鼠10～100μg重组人 periostin抗原蛋白的剂量进行首次免疫，注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或腹腔内。

加强免疫采用首次免疫一半剂量的重组人periostin抗原蛋白，加入弗氏不完全佐剂，进 行加强免疫，注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或腹腔内。免疫后7～10天取血测效价，加 强免疫3～4次后，分离获得小鼠脾细胞。

优选地，按每只小鼠50μg重组人periostin抗原蛋白的剂量进行首次免疫，注射于小鼠 的颈背部皮下四点。按每只小鼠25μg重组人periostin抗原蛋白的剂量进行加强免疫，注射 于小鼠的颈背部皮下四点。免疫后8天取血测效价，加强免疫4次后，分离获得小鼠脾细 胞。

在步骤S30，将所述小鼠脾细胞与同系骨髓瘤细胞进行混合，利用PEG(聚乙二醇)进 行膜融合，形成杂交瘤细胞。

作为示例，采用杂交瘤细胞融合技术，将分离获得的小鼠脾细胞与同系骨髓瘤细胞进行 混合，利用PEG进行膜融合，形成杂交瘤细胞。

优选地，按1×10⁸个小鼠脾细胞和2～3×10⁷个同系骨髓瘤细胞进行混合。

作为示例，按1×10⁸个小鼠脾细胞和3×10⁷个同系骨髓瘤细胞进行混合。

应当理解，可以采用本领域常规的杂交瘤细胞融合技术和克隆化技术制备分泌抗目的抗 原periostin的杂交瘤细胞株。

在步骤S40，筛选成功膜融合的杂交瘤细胞，进行体外增殖培养，在小鼠腹腔内接种杂 交瘤细胞，预定时间后从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体。

优选地，经ELISA检测OD495大于1.5，是成功膜融合的杂交瘤细胞。

作为示例，杂交瘤阳性细胞进行阳性筛选与克隆化：在HAT(H—Hypoxanthine次黄嘌 呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T—Thymidine胸腺嘧啶核苷)选择性培养基上筛选成功膜 融合的杂交瘤细胞，体外增殖培养，并及时对小鼠(未免疫的常规小鼠，例如8周龄Balb/c 小鼠)腹腔内接种杂交瘤细胞，制备腹水，约1～2周后抽取腹水，获得大量粗单克隆抗体。这里，抽取的腹水为含有大量粗单克隆抗体的小鼠腹水。

此外，对粗单克隆抗体进行纯化。

优选地，从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体的步骤可包括：对所述腹水进行 粗提纯；对所述粗提纯的产物进行透析；利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化。

作为示例，基于盐析法采用饱和硫酸铵溶液对含有单克隆抗体的小鼠腹水进行盐析。

具体地，将含有大量粗单克隆抗体的小鼠腹水原液进行第一次低温离心处理(4℃， 10000rpm，15min)，从而除去细胞残渣及颗粒物等，将第一次低温离心所得上清液用0.02mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液稀释至5倍(即，所述第一次低温离心所得上清液 与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1:4，稀释至5倍后的总体积记为样品体积)后，在冰浴搅 拌下，加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为50％(v/v)(即，所述样品体积与所述饱和硫酸铵 溶液的体积比为1:1)，于4℃盐析4小时，并进行第二次低温离心(4℃，10000rpm， 15min)处理，弃上清液取固体物。然后，采用0.02mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液溶 解第二次低温离心所得固体物，所述磷酸盐缓冲液的体积与所述样品体积相等。在冰浴搅拌 下，逐滴加入饱和硫酸铵溶液(这里，饱和硫酸铵溶液的浓度的初始值为1g/mL)至终浓度 为33.33％(v/v)(即，溶解后的总体积与所述饱和硫酸铵溶液的体积比为2:1)，于4℃盐 析过夜，并进行第三次低温离心(4℃，10000rpm，15min)处理，弃上清液取固体物，将 第三次低温离心所得固体物作为盐析所得粗提纯样品，即粗提纯的产物。

作为示例，采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液对所述粗提纯的产物进行透析。

具体地，采用0.025mol/L、pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解盐析后所得粗 提纯样品，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的体积与所述样品体积相等；然后利用浓度为0.025mol/L，pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，于4℃透析过夜，期间需更换3次三 羟甲基氨基甲烷缓冲液，截留分子量为150KD，从而获得透析的产物。

作为示例，利用HPLC法(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱 法)对透析的产物进行纯化。所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1-3mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm； 所述流动相A是pH值为6.5～8.5，浓度为10～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液； 所述流动相B是pH值为6.5～8.5，三羟甲基氨基甲烷终浓度为10～50mmol/L和氯化钠终 浓度为0.5～1mol/L的混合溶液。

优选地，采用Thermo Propac-wax-10色谱柱，填料的颗粒度为约10μm，色谱柱规格为 250mm×4.6mm，选用流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温40℃，检测波长为280nm；所述流动相A为pH值为7，浓度为30mmol/L 的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；所述流动相B为pH值为7，三羟甲基氨基甲烷缓冲液终浓度 为30mmol/L和氯化钠终浓度为1mol/L的混合溶液。连接色谱柱，用流动相A对色谱柱进 行平衡。上样，上样后执行梯度程序对样品进行分离纯化，按表1的洗脱程序进行梯度洗 脱，收集保留时间10～11min样品为纯化后的抗人periostin单克隆抗体。收率为76.3％，纯 度为97.2％。

表1：梯度洗脱程序

时间(min)	流速(ml/min)	A％	B％
				0	1	100	0
5	1	100	0
				15	1	40	60
25	1	20	80
				29	1	100	0
30	1	100	0

应当理解，也可以采用本领域常规的纯化方法对单克隆抗体进行纯化，本发明对此不作 限定。

将获得的纯化后的抗人periostin单克隆抗体进行非还原SDS-PAGE电泳检测，结果如 图3所示。图3中，单克隆抗体抗体1和单克隆抗体抗体2为分别来自不同免疫小鼠腹水中 的抗体。由图3可见，电泳样品中无杂蛋白，且分子量为150KD，为本实验所述抗体，且 纯度达到实验要求。

下面详细描述本发明实施例的抗人periostin单克隆抗体的实验。

一、抗人periostin单克隆抗体效价检测。

利用ELISA实验方法将本实施例中获得的纯化后的抗人periostin单克隆抗体进行效价 检测，已知抗人periostin单克隆抗体浓度为100μg/mL，方法如下：

1、取适量孔数的酶标板进行抗原包埋，将适量的periostin蛋白包被到酶标板的每个 孔；

2、用漂洗液清洗酶标板3～5次，加入实施例1获得的纯化后的抗人periostin单克隆抗 体，37℃孵育1h；

3、漂洗液清洗5次，加入带有辣根过氧化物酶标或碱性磷酸酯酶标的二抗(例如，羊 抗鼠IgG)，37℃孵育1h，漂洗液清洗5次；

4、加入底物显色10～20min，加入终止液(例如，2M硫酸)，终止反应，利用酶标仪进行OD值读取，结果如表2所示。

表2：抗人periostin单克隆抗体效价检测结果

注：抗体1和抗体2为不同小鼠腹水中获得的抗人periostin单克隆抗体由表2可见，抗 体1效价可达1:128000，抗体2效价可达1:64000。抗体1效价高于抗体2。

二、蛋白免疫印迹实验检测抗人periostin单克隆抗体与periostin蛋白的结合活性。

1、制备periostin蛋白，进行SDS-PAGE电泳；

2、转膜，NC膜或者PVDF膜；

3、用BSA或者脱脂奶粉进行封闭2h；

4、加入一抗(本发明实施例制备的抗人periostin单克隆抗体)，37℃孵育1h；

5、用漂洗液清洗3～5次，每次10min，加入酶标二抗，37℃孵育40min；

6、加入底物反应显色或者ECL显色液压片显影。

结果如图4所示，由图4可见，抗体1与抗体2均与periostin蛋白特异性结合，且在上 样量相同的情况下，抗体1的特异性要高于抗体2。

三、微管形成实验检测抗人periostin单克隆抗体抑制periostin促进微管形成。

1、将HUVEC细胞悬液接种于6孔细胞培养板中，37℃5％CO₂培养箱培养。

2、Periostin蛋白(表3中记为细胞因子P)(选取50ng)加不同浓度的单克隆抗体，37℃ 孵育60min后加入细胞中，处理24h后进行微管形成实验培养，24小时后分别加入抗体1及抗 体2至终浓度如表3所示。

表3：微管形成实验的终浓度表

3、处理24h后，拍照记录，将细胞消化离心收集；

4、将细胞每孔50000个，100ul培养基铺入上述铺好基质胶的孔板中；

5、分别在HUVEC细胞铺入后2～6h后观察血管形成，拍照记录。

6、将血管形成图片进行测量分析。

结果如图5和图6所示，抗体1和抗体2为分别来自不同小鼠腹水中的抗人periostin单 克隆抗体。

图5为抗体1抑制periostin促进血管内皮细胞微管形成。A为加入periostin后血管内皮 细胞成管情况，B为加入periostin及50ng抗体1后血管内皮细胞成管情况，C为加入periostin及100ng抗体1后血管内皮细胞成管情况，D为加入periostin及200ng抗体1后血管内皮细胞成管情况。由图5可见，随着抗体1的含量增高，血管内皮细胞微管形成数量降低，抗体1对血管内皮细胞微管形成的抑制率提高，当抗体1含量达到200ng时，其抑制率 可达到86％。

图6为抗体2抑制periostin促进血管内皮细胞微管形成。A为加入periostin后血管内皮 细胞成管情况，B为加入periostin及50ng抗体2后血管内皮细胞成管情况，C为加入periostin及100ng抗体2后血管内皮细胞成管情况，D为加入periostin及200ng抗体2后血管内皮细胞成管情况。由图6可见，随着抗体2的含量增高，血管内皮细胞微管形成数量降低，抗体2对血管内皮细胞微管形成的抑制率提高，当抗体2含量达到200ng时，其抑制率 可达到97％。

通过上述实验结果，表明本发明实施例制备的抗人periostin单克隆抗体具有高活性，微 管抑制率随着单克隆抗体含量的增加而增加，在含量为200ng时，效果最为明显，可完全抑 制periostin的作用。

本发明实施例提供的抗人periostin单克隆抗体具有高活性，可以抑制periostin促进细胞 微管形成及细胞纤维化，从而避免新生血管带来的癌症迁移与侵袭以及细胞纤维化造成的各 种疾病。

尽管已经参照其示例性实施例具体显示和描述了本发明，但是本领域的技术人员应该理 解，在不脱离权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行形式和细节上 的各种改变。

<110> 辽宁何氏医学院

<120> 一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3214

<212> DNA

<213> 人periostin（Osteoblast-specific factor 2）

<400> 1

AGACTCTCAG GTTGATGCAG TGTTCCCTCC CACAACTCTG ACATGTATAT AAATTCTGAG 60

CTCTCCAAAG CCCACTGCCA GTTCTCTTCG GGGACTAACT GCAACGGAGA GACTCAAGAT 120

GATTCCCTTT TTACCCATGT TTTCTCTACT ATTGCTGCTT ATTGTTAACC CTATAAACGC 180

CAACAATCAT TATGACAAGA TCTTGGCTCA TAGTCGTATC AGGGGTCGGG ACCAAGGCCC 240

AAATGTCTGT GCCCTTCAAC AGATTTTGGG CACCAAAAAG AAATACTTCA GCACTTGTAA 300

GAACTGGTAT AAAAAGTCCA TCTGTGGACA GAAAACGACT GTGTTATATG AATGTTGCCC 360

TGGTTATATG AGAATGGAAG GAATGAAAGG CTGCCCAGCA GTTTTGCCCA TTGACCATGT 420

TTATGGCACT CTGGGCATCG TGGGAGCCAC CACAACGCAG CGCTATTCTG ACGCCTCAAA 480

ACTGAGGGAG GAGATCGAGG GAAAGGGATC CTTCACTTAC TTTGCACCGA GTAATGAGGC 540

TTGGGACAAC TTGGATTCTG ATATCCGTAG AGGTTTGGAG AGCAACGTGA ATGTTGAATT 600

ACTGAATGCT TTACATAGTC ACATGATTAA TAAGAGAATG TTGACCAAGG ACTTAAAAAA 660

TGGCATGATT ATTCCTTCAA TGTATAACAA TTTGGGGCTT TTCATTAACC ATTATCCTAA 720

TGGGGTTGTC ACTGTTAATT GTGCTCGAAT CATCCATGGG AACCAGATTG CAACAAATGG 780

TGTTGTCCAT GTCATTGACC GTGTGCTTAC ACAAATTGGT ACCTCAATTC AAGACTTCAT 840

TGAAGCAGAA GATGACCTTT CATCTTTTAG AGCAGCTGCC ATCACATCGG ACATATTGGA 900

GGCCCTTGGA AGAGACGGTC ACTTCACACT CTTTGCTCCC ACCAATGAGG CTTTTGAGAA 960

ACTTCCACGA GGTGTCCTAG AAAGGATCAT GGGAGACAAA GTGGCTTCCG AAGCTCTTAT 1020

GAAGTACCAC ATCTTAAATA CTCTCCAGTG TTCTGAGTCT ATTATGGGAG GAGCAGTCTT 1080

TGAGACGCTG GAAGGAAATA CAATTGAGAT AGGATGTGAC GGTGACAGTA TAACAGTAAA 1140

TGGAATCAAA ATGGTGAACA AAAAGGATAT TGTGACAAAT AATGGTGTGA TCCATTTGAT 1200

TGATCAGGTC CTAATTCCTG ATTCTGCCAA ACAAGTTATT GAGCTGGCTG GAAAACAGCA 1260

AACCACCTTC ACGGATCTTG TGGCCCAATT AGGCTTGGCA TCTGCTCTGA GGCCAGATGG 1320

AGAATACACT TTGCTGGCAC CTGTGAATAA TGCATTTTCT GATGATACTC TCAGCATGGA 1380

TCAGCGCCTC CTTAAATTAA TTCTGCAGAA TCACATATTG AAAGTAAAAG TTGGCCTTAA 1440

TGAGCTTTAC AACGGGCAAA TACTGGAAAC CATCGGAGGC AAACAGCTCA GAGTCTTCGT 1500

ATATCGTACA GCTGTCTGCA TTGAAAATTC ATGCATGGAG AAAGGGAGTA AGCAAGGGAG 1560

AAACGGTGCG ATTCACATAT TCCGCGAGAT CATCAAGCCA GCAGAGAAAT CCCTCCATGA 1620

AAAGTTAAAA CAAGATAAGC GCTTTAGCAC CTTCCTCAGC CTACTTGAAG CTGCAGACTT 1680

GAAAGAGCTC CTGACACAAC CTGGAGACTG GACATTATTT GTGCCAACCA ATGATGCTTT 1740

TAAGGGAATG ACTAGTGAAG AAAAAGAAAT TCTGATACGG GACAAAAATG CTCTTCAAAA 1800

CATCATTCTT TATCACCTGA CACCAGGAGT TTTCATTGGA AAAGGATTTG AACCTGGTGT 1860

TACTAACATT TTAAAGACCA CACAAGGAAG CAAAATCTTT CTGAAAGAAG TAAATGATAC 1920

ACTTCTGGTG AATGAATTGA AATCAAAAGA ATCTGACATC ATGACAACAA ATGGTGTAAT 1980

TCATGTTGTA GATAAACTCC TCTATCCAGC AGACACACCT GTTGGAAATG ATCAACTGCT 2040

GGAAATACTT AATAAATTAA TCAAATACAT CCAAATTAAG TTTGTTCGTG GTAGCACCTT 2100

CAAAGAAATC CCCGTGACTG TCTATAGACC CACACTAACA AAAGTCAAAA TTGAAGGTGA 2160

ACCTGAATTC AGACTGATTA AAGAAGGTGA AACAATAACT GAAGTGATCC ATGGAGAGCC 2220

AATTATTAAA AAATACACCA AAATCATTGA TGGAGTGCCT GTGGAAATAA CTGAAAAAGA 2280

GACACGAGAA GAACGAATCA TTACAGGTCC TGAAATAAAA TACACTAGGA TTTCTACTGG 2340

AGGTGGAGAA ACAGAAGAAA CTCTGAAGAA ATTGTTACAA GAAGACACAC CCGTGAGGAA 2400

GTTGCAAGCC AACAAAAAAG TTCAAGGATC TAGAAGACGA TTAAGGGAAG GTCGTTCTCA 2460

GTGAAAATCC AAAAACCAGA AAAAAATGTT TATACAACCC TAAGTCAATA ACCTGACCTT 2520

AGAAAATTGT GAGAGCCAAG TTGACTTCAG GAACTGAAAC ATCAGCACAA AGAAGCAATC 2580

ATCAAATAAT TCTGAACACA AATTTAATAT TTTTTTTTCT GAATGAGAAA CATGAGGGAA 2640

ATTGTGGAGT TAGCCTCCTG TGGTAAAGGA ATTGAAGAAA ATATAACACC TTACACCCTT 2700

TTTCATCTTG ACATTAAAAG TTCTGGCTAA CTTTGGAATC CATTAGAGAA AAATCCTTGT 2760

CACCAGATTC ATTACAATTC AAATCGAAGA GTTGTGAACT GTTATCCCAT TGAAAAGACC 2820

GAGCCTTGTA TGTATGTTAT GGATACATAA AATGCACGCA AGCCATTATC TCTCCATGGG 2880

AAGCTAAGTT ATAAAAATAG GTGCTTGGTG TACAAAACTT TTTATATCAA AAGGCTTTGC 2940

ACATTTCTAT ATGAGTGGGT TTACTGGTAA ATTATGTTAT TTTTTACAAC TAATTTTGTA 3000

CTCTCAGAAT GTTTGTCATA TGCTTCTTGC AATGCATATT TTTTAATCTC AAACGTTTCA 3060

ATAAAACCAT TTTTCAGATA TAAAGAGAAT TACTTCAAAT TGAGTAATTC AGAAAAACTC 3120

AAGATTTAAG TTAAAAAGTG GTTTGGACTT GGGAACAGGA CTTTATACCT CTTTTACTGT 3180

AACAAGTACT CATTAAAGGA AATTGAATGA AATT 3214

<210> 2

<211> 781

<212> PRT

<213> 人periostin（Osteoblast-specific factor 2）

<400> 2

Met Ile Pro Phe Leu Pro Met Phe Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ile Val Asn Pro

1 5 10 15

Ile Asn Ala Asn Asn His Tyr Asp Lys Ile Leu Ala His Ser Arg Ile Arg Gly

20 25 30 35

Arg Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gly Thr Lys Lys

40 45 50

Lys Tyr Phe Ser Thr Cys Lys Asn Trp Tyr Lys Lys Ser Ile Cys Gly Gln Lys

55 60 65 70

Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu Gly Met Lys

75 80 85 90

Gly Cys Pro Ala Val Leu Pro Ile Asp His Val Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val

95 100 105

Gly Ala Thr Thr Thr Gln Arg Tyr Ser Asp Ala Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile

110 115 120 125

Glu Gly Lys Gly Ser Phe Thr Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Asp Asn

130 135 140

Leu Asp Ser Asp Ile Arg Arg Gly Leu Glu Ser Asn Val Asn Val Glu Leu Leu

145 150 155 160

Asn Ala Leu His Ser His Met Ile Asn Lys Arg Met Leu Thr Lys Asp Leu Lys

165 170 175 180

Asn Gly Met Ile Ile Pro Ser Met Tyr Asn Asn Leu Gly Leu Phe Ile Asn His

185 190 195

Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Ile Ile His Gly Asn Gln

200 205 210 215

Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Asp Arg Val Leu Thr Gln Ile Gly

220 225 230

Thr Ser Ile Gln Asp Phe Ile Glu Ala Glu Asp Asp Leu Ser Ser Phe Arg Ala

235 240 245 250

Ala Ala Ile Thr Ser Asp Ile Leu Glu Ala Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr

255 260 265 270

Leu Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu

275 280 285

Arg Ile Met Gly Asp Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His Ile Leu

290 295 300 305

Asn Thr Leu Gln Cys Ser Glu Ser Ile Met Gly Gly Ala Val Phe Glu Thr Leu

310 315 320

Glu Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Asp Gly Asp Ser Ile Thr Val Asn Gly

325 330 335 340

Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val Thr Asn Asn Gly Val Ile His Leu

345 350 355 360

Ile Asp Gln Val Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu Leu Ala Gly

365 370 375

Lys Gln Gln Thr Thr Phe Thr Asp Leu Val Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ser Ala

380 385 390 395

Leu Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser

400 405 410

Asp Asp Thr Leu Ser Met Asp Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln Asn His

415 420 425 430

Ile Leu Lys Val Lys Val Gly Leu Asn Glu Leu Tyr Asn Gly Gln Ile Leu Glu

435 440 445 450

Thr Ile Gly Gly Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Thr Ala Val Cys Ile

455 460 465

Glu Asn Ser Cys Met Glu Lys Gly Ser Lys Gln Gly Arg Asn Gly Ala Ile His

470 475 480 485

Ile Phe Arg Glu Ile Ile Lys Pro Ala Glu Lys Ser Leu His Glu Lys Leu Lys

490 495 500

Gln Asp Lys Arg Phe Ser Thr Phe Leu Ser Leu Leu Glu Ala Ala Asp Leu Lys

505 510 515 520

Glu Leu Leu Thr Gln Pro Gly Asp Trp Thr Leu Phe Val Pro Thr Asn Asp Ala

525 530 535 540

Phe Lys Gly Met Thr Ser Glu Glu Lys Glu Ile Leu Ile Arg Asp Lys Asn Ala

545 550 555

Leu Gln Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu Thr Pro Gly Val Phe Ile Gly Lys Gly

560 565 570 575

Phe Glu Pro Gly Val Thr Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly Ser Lys Ile Phe

580 585 590

Leu Lys Glu Val Asn Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu Lys Ser Lys Glu Ser

595 600 605 610

Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val Asp Lys Leu Leu Tyr Pro

615 620 625 630

Ala Asp Thr Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu Leu Glu Ile Leu Asn Lys Leu Ile

635 640 645

Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Val

650 655 660 665

Thr Val Tyr Arg Pro Thr Leu Thr Lys Val Lys Ile Glu Gly Glu Pro Glu Phe

670 675 680

Arg Leu Ile Lys Glu Gly Glu Thr Ile Thr Glu Val Ile His Gly Glu Pro Ile

685 690 695 700

Ile Lys Lys Tyr Thr Lys Ile Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr Glu Lys

705 710 715 720

Glu Thr Arg Glu Glu Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu Ile Lys Tyr Thr Arg Ile

725 730 735

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Thr Glu Glu Thr Leu Lys Lys Leu Leu Gln Glu Asp

740 745 750 755

Thr Pro Val Arg Lys Leu Gln Ala Asn Lys Lys Val Gln Gly Ser Arg Arg Arg

760 765 770

Leu Arg Glu Gly Arg Ser Gln

775 780

Claims (10)

1.一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为抗人periostin单克隆抗体，所述抗人periostin单克隆抗体的抗体片段包括单链可变区片段、Fab、Fab’、F(ab’)2或纳米抗体。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体片段与其他的肽或蛋白质融合、或者被修饰剂修饰。

3.一种抑制组织器官纤维化和新生血管形成的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：

获得核酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组人periostin抗原蛋白；

以所述重组人periostin抗原蛋白免疫小鼠，并从免疫后的小鼠中分离获得小鼠脾细胞；

将所述小鼠脾细胞与同系骨髓瘤细胞进行混合，利用PEG进行膜融合，形成杂交瘤细胞；

筛选成功膜融合的杂交瘤细胞，进行体外增殖培养，在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，预定时间后从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体的步骤包括：

对所述腹水进行粗提纯；

对所述粗提纯的产物进行透析；

利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化，

其中，所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；

所述流动相A为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述流动相B为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氯化钠的混合溶液。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，以所述重组人periostin抗原蛋白免疫小鼠的步骤包括：

在所述重组人periostin抗原蛋白中加入弗氏完全佐剂，对小鼠进行首次免疫注射；

在所述重组人periostin抗原蛋白中加入弗氏不完全佐剂，对首次免疫后的小鼠进行加强免疫注射。

6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，将1×10⁸个所述小鼠脾细胞和2～3×10⁷个同系骨髓瘤细胞进行混合。

7.权利要求1所述的单克隆抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括：结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈部癌、甲状腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、肺癌、恶性胸膜间皮瘤、肝细胞癌、胆管细胞癌、食管癌和前列腺癌。

9.权利要求1所述的单克隆抗体在制备抑制纤维化性疾病药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述纤维化疾病包括：眼玻璃体视网膜组织纤维化、肺纤维化、神经纤维化、肾纤维化和肝纤维化。